TCNICAS DE ANLISIS DEL ADN EN GENTICA FORENSE

Carmen Entrala, Dra. En Biologa Laboratorio e ADN !oren"e, De#to. e $e i%ina Legal &ni'er"i a e Grana a, E"#a(a

Indice:
). E'ol*%i+n e la" t,%ni%a" e e"t* io e lo" #olimor!i"mo" e ADN -. An.li"i" #or la rea%%i+n en %a ena e la #olimera"a /0CR1 -.) Generali a e" -.- Com#onente" e la 0CR 2. F*t*ra" te%nologa"3 bio%4i#" 2.) A#li%a%ione" e lo" bio%4i#"

S*mario
La identificacin con ADN o huella gentica se basa en el estudio de una serie de fragmentos de ADN presentes en todos los individuos pero que poseen la caracter stica de ser altamente variables o polimrficos entre los mismos! "l an#lisis de un determinado n$mero de estas secuencias o fragmentos de ADN permite identificar a un individuo con una probabilidad mu% cercana al &''(! Adem#s de ser mu% polimrfico) el ADN que se utili*a para la identificacin en +entica ,orense es un ADN no codificante o no e-presivo) por lo que no revela caracter sticas fenot picas de los individuos. este hecho es de gran importancia a la hora de considerar la creacin de las bases de datos genticas! /ara anali*ar dichos polimorfismos del ADN) los laboratorios de +entica ,orense utili*an una serie de tcnicas que est#n en continua evolucin) consiguiendo que cada ve* la identificacin por medio del ADN sea m#s precisa % r#pida!

). E'ol*%i+n e la" t,%ni%a" e e"t* io e lo" #olimor!i"mo" e ADN

La Hemogentica Forense nace a principios de siglo) cuando 0arl Landsteiner describe el sistema A12 de los hemat es % 3on Durgen % 4irschfeld descubren su transmisin hereditaria! "sta ciencia surgi como una rama de la 5riminal stica cu%o ob6etivo era la identificacin gentica tanto en casos de investigacin criminal como en estudios biolgicos de la paternidad! Inicialmente) las investigaciones se centraban en el estudio de ant genos eritrocitarios 7sistema A12) 8h) 9N:) prote nas sricas) en*imas eritrocitarias % sistema 4LA! 5on el estudio de dichos marcadores pod a incluirse o e-cluirse una persona como posible sospechoso por poseer una

combinacin gentica igual o diferente a la del vestigio biolgico hallado en el lugar de los hechos! /ero fue a mediados de siglo cuando gracias al descubrimiento del ADN % de su estructura % al posterior avance en las tcnicas de an#lisis de dicha molcula la 4emogentica ,orense evolucion considerablemente hasta el punto de que ho% en d a puede hablarse de una nueva subespecialidad dentro de la 9edicina ,orense: la Gentica Forense! Dicha ciencia estudia b#sicamente unas regiones del ADN que presentan variabilidad entre los distintos individuos) es decir) estudia regiones polimrficas del ADN! As ) anali*ando un determinado n$mero de regiones polimrficas) la probabilidad de que dos individuos sean genticamente iguales es pr#cticamente nula 7e-cepto en el caso de gemelos univitelinos:! Aunque la 5iencia pose a las herramientas necesarias para el estudio del ADN) su aplicacin en la resolucin de casos 6udiciales no se produ6o hasta &;<=) cuando el 9inisterio del Interior 1rit#nico solicit la a%uda de Alec >! >effre%s) profesor de +entica de la ?niversidad de Leicester! Los primeros casos de 5riminal stica fueron resueltos gracias a la tcnica de los RFL0" 7,ragmentos de 8estriccin de Longitud /olimrfica:! >effre%s descubri la e-istencia de unas regiones minisatlites hipervariables dispersas por el genoma humano que al ser tratadas con en*imas de restriccin generaban fragmentos de longitud variable! "studios posteriores reali*ados el mismo >effre%s demostraron que las diferencias en el tama@o de estos fragmentos se deb an a que estas regiones consist an en un determinado n$mero de repeticiones en t#ndem de una secuencia central) el cual variaba de unos individuos a otros! "l primer locus de ADN polimrfico fu descubierto por A%man % Ahite en &;<' usando una sonda de ADN arbitraria! De esta manera observaron fragmentos de m#s de &= longitudes diferentes en una peque@a muestra de individuos! /osteriormente se encontraron otros loci hipervariables como en la secuencia del gen de la insulina humana) en el oncogen ras) en el pseudogen de la *etaBglobina % en el gen de la mioglobina! "stos loci hipervariables constaban de repeticiones en t#ndem de una secuencia de oligonucletidos 7&& a C' pb:) de manera que las diferentes longitudes de los fragmentos originados depend an del n$mero de dichas repeticiones % se les denomin 5NTR 73ariable Number of Dandem 8epeat:! Dras el descubrimiento de los primeros 3ND8s se vio que stos pod an ser aplicados a la medicina forense % sustituir a los marcadores cl#sicos! "n un principio la manera de estudiar dichos marcadores se hi*o por medio de la tcnica llamada hibridacin con sondas o Southern blot! "sta tcnica consta b#sicamente de las siguientes etapas: Digestin del ADN con en*imas de restriccin tras conseguir e-traer un ADN de alta molecularidad!

Eeparacin de los fragmentos obtenidos por medio de una electroforesis en gel de agarosa! Desnaturalizacin de los fragmentos separados % cortados! Transferencia de las cadenas simples a una membrana de nitrocelulosa o n%lon % fi6acin de las mismas por medio de calor 7<'F5:! Prehibridacin con sondas de ADN inespec fico para bloquear los lugares de unin inespec ficos que pudiera haber en la membrana! Marcaje de la sonda con nucletidos radioactivos 7GH / normalmente:! Hibridacin de la sonda marcada % desnaturali*ada con los fragmentos de ADN fi6ados a la membrana) % lavado de la membrana para eliminar el e-ceso de sonda o aquellas que ha%an hibridado mal! Re elado en placa radiogr#fica e inter!retacin de los resultados!

La" "on a" *tili6a a" #*e e "er e o" ti#o"3

Son a" $ono7lo%*" /SL01: son espec ficas para una regin de un determinado cromosoma! Ee unen a secuencias largas de nucletidos % presentan ma%or variabilidad que las sondas multiBlocus! 5omo resultado se observan una o dos bandas por individuo) seg$n sea homocigoto o heterocigoto! "l patrn de bandas obtenido con estas sondas se denomina perfil unilocus de ADN o 8DNA #ro!iling9 Son a" $*lti7lo%*" /$L01: hibridan con secuencias minisatlites presentes en varios loci de diferentes cromosomas! Eon sondas de &' a &= nucletidos que se repiten m$ltiples veces % tras el revelado se observan de &' a H' bandas por persona! "ste patrn de m$ltiples bandas se conoce como huella gentica multilocus o 8DNA !inger#rint9.

Las sondas multi % monoBlocus presentan una serie de venta6as e inconvenientes con respecto a una serie de par#metros como son:
In!orma%i+n a#orta a: las sondas multiBlocus tienen una ma%or capacidad discriminativa al aparecer m$ltiples bandas! No obstante) las monoBlocus son m#s espec ficas %a que el fragmento de ADN con el que hibridan es de ma%or tama@o! Canti a : %ali a el ADN: cuando se usan sondas multiBlocus se requiere apro-imadamente un microgramo de ADN sin degradar mientras que en el caso de las monoBlocus se necesita menos de &'' ng % este ADN no necesariamente debe estar en perfecto estado) siempre % cuando el fragmento complementario a la sonda est intacto! E"#e%i!i%i a entre e"#e%ie" : las sondas multiBlocus permiten su uso sobre el ADN humano % de cientos de animales superiores) mientras que las monoBlocus son e-clusivas de ADN humano!

A pesar de que el an#lisis EL/ ha sido % es bastante $til en estudios de paternidad no puede decirse lo mismo de su aplicacin a la 5riminal stica %a que presenta una serie de inconvenientes como son:
La %anti a e ADN que se necesita est# entre H' % &'' ng) cantidad dif cil de conseguir en casos de criminal stica en los que los indicios biolgicos encontrados son m nimos! "n cuanto a la %ali a el ADN) en la pr#ctica forense es mu% dif cil encontrar en estado no degradado toda la cantidad de ADN que se necesita para un an#lisis con sondas monoBlocus! "l tiempo requerido para este tipo de an#lisis es de dos o tres d as! "l hecho de que se requieran cantidades elevadas de ADN hacen que normalmente) con el primer an#lisis se consume la totalidad de la muestra) con lo que se dificultan contrapericias % una posterior revisin del caso! Dodas estas limitaciones fueron superadas gracias a la aplicacin en +entica ,orense de una tcnica) la Rea%%i+n en Ca ena e la 0olimera"a 7/58:) que supuso una revolucin en muchos campos de la 1iolog a % de la 9edicina! "l estudio de indicios biolgicos por /58 ha permitido la resolucin de un gran n$mero de casos en 5riminal stica que hasta entonces eran desestimados por no poseer la suficiente cantidad de muestra para su an#lisis por 8,L/! 5on el uso de la /58 muestras tan m nimas como pueden ser un !elo con ra"z# una min$scula mancha de sangre o semen e incluso cas!a son suficientes en muchos casos para llevar a cabo un an#lisis de identificacin gentica!

-. An.li"i" #or la rea%%i+n en %a ena e la #olimera"a /0CR1

-.) General La reaccin en cadena de la polimerasa 7conocida como 0CR por sus siglas en ingls) Pol%merase &hain Reaction: permite amplificar m#s de un milln de veces un ADN obtenido a partir de una regin seleccionada del genoma) siempre % cuando se cono*ca una parte de su secuencia de nucletidos! "sta tcnica fue ideada en &;<; por 0ar% 1! 9ullis que obtuvo el premio Nobel de Iu mica en &;;G por dicho invento! /ara la 0CR se utili*an dos oligonucletidos sintticos de unos &=BH' nucletidos que son complementarios a las *onas flanqueantes de la regin que se quiere amplificar! "stos oligonucletidos 7habitualmente conocidos por su nombre en ingls) JprimersJ: act$an como cebadores para la s ntesis in vitro de ADN la cual est# habitualmente catali*ada por una en*ima llamada Ta' !olimerasa! Dicha en*ima se a sla de una bacteria termfila) denominada Thermus ('u)ticus, que es capa* de crecer a temperaturas elevadas 7K; B <= F 5:! A esta temperatura dicha en*ima es capa* de mantener una media de e-tensin de m#s de C' nucletidos por segundo en regiones ricas en uniones +B5! La temperatura optima a la que act$a la Ta' !olimerasa permite el uso de elevadas temperaturas para la unin de los primers %

para la e-tensin) de esta manera se aumenta el nivel de e-igencia de la reaccin % se reduce la e-tensin de los primers unidos inespec ficamente al ADN!

La rea%%i+n "e lle'a a %abo en *na "erie %*ale" in%l*:e tre" !a"e" o #a"o"3

e %i%lo" %a a *no

e lo"

D*S+(T,R(-./(&.0+: /ara que comience la reaccin es necesario que el ADN molde se encuentre en forma de cadena sencilla! "sto se consigue aplicando temperaturas de ;' a ;=F5 que producen la rotura de los puentes de hidrgeno intercatenarios % por lo tanto la separacin de ambas cadenas! /ara conseguir la completa separacin de las hebras de toda la muestra esta temperatura debe mantenerse unos minutos! Ei el ADN solo se desnaturali*a parcialmente ste tender# a renaturali*arse r#pidamente) evitando as una eficiente hibridacin de los primers % una posterior e-tensin! H.1R.D(&.0+: "sta fase se denomina tambin fase de annealing o de empare6amiento! ?na ve* que el ADN est# desnaturali*ado se disminu%e la temperatura hasta un rango comprendido entre los L' % los C'F5 para que se pueda producir la unin de los primers a las secuencias flanqueantes del fragmento que se va a amplificar! La temperatura de fusin o annealing 7Dm) melting temperature: depende de varios factores % es relativamente espec fica para cada primer! La longitud de los primers % la secuencia son cr ticas en la designacin de los par#metros de una amplificacin) una frmula simple para calcular la Tm es la siguiente: Tm ; </G=C1 = - /A=T1. No obstante) cada primer e-ige una serie de estudios e-perimentales para determinar su temperatura de annealing espec fica %a que si la temperatura es mu% ba6a la unin se har# de forma inespec fica % si es mu% alta no se producir# una unin completa! *2T*+S.0+3 Durante este paso la Ta' !olimerasa incorpora nucletidos en el e-tremo GM del primer utili*ando como molde la cadena de ADN previamente desnaturali*ada! La temperatura a la que se lleva a cabo este paso suele ser de KHF5 %a que es la temperatura a la que la Ta' !olimerasa alcan*a su m#-ima actividad! Normalmente una e-tensin de H' segundos es suficiente para fragmentos menores de ='' pb) % L' segundos para fragmentos por encima de &!H0b! ?n factor importante en el transcurso de las diferentes fases es el tiem#o e ram#a! "ste se define como el tiempo invertido en pasar de una temperatura a otra % depende del dise@o % de las caracter sticas del aparato donde se reali*a autom#ticamente este proceso) el termociclador! "n las nuevas generaciones de termocicladores este factor se ha ido optimi*ando para hacerlo m nimo!

-.- Com#onente" e la 0CR

34345 1,FF*R D* (MP-.F.&(&.0+ Los buffer de 0CR que se utili*an normalmente contienen >Cl, Tri" : $gCl-! "l $gCl- es el componente que m#s influ%e en la especificidad % rendimiento de la reaccin %a que los iones 9gHN son necesarios para la actividad de la Ta' !olimerasa) es decir) act$an como cofactores de la polimerasa! La concentracin ptima de 9g5l H est# en torno a &!= m9 si se emplean concentraciones de H'' m9 de cada uno de los dND/s! No obstante) a veces es necesario probar con diferentes cantidades de 9g %a que un e-ceso del mismo origina una acumulacin de productos inespec ficos % una cantidad insuficiente hace que disminu%a el rendimiento de la amplificacin! 34343 PR.M*RS A la hora de elegir unos !rimers para amplificar un determinado fragmento de ADN ha% una serie de reglas a seguir: La longitud de cada uno de los !rimers debe estar comprendida entre &< % HL bases %a que se ha comprobado que primers de ma%or longitud 7G'BG= bases: no aumentan el rendimiento % los primers cortos carecen de suficiente especificidad! Ambos primers deben tener una Tm similar 7como mucho la diferencia entre ambas temperatura debe ser de =F5:! La relacin bases !$ricas6 bases !irimid"nicas debe ser &:& 7o como mucho L'B C'(:! La secuencia de los !rimers debe comen*ar % terminar con &BH bases p$ricas! /ara evitar la formacin de d"meros de !rimers es necesario comprobar que los primers no contengan secuencias complementarias entre s ! Los d"meros de !rimers consisten en fragmentos de doble cadena cu%a longitud es mu% pr-ima a la de la suma de los primers % se producen cuando un primer es e-tendido a continuacin del otro! "l mecanismo e-acto por el que se forman estos d meros no est# completamente determinado! La observacin de que primers con los e-tremos GM complementarios favorecen su formacin sugiere que el paso inicial se debe a interacciones transitorias que apro-iman los e-tremos complementarios! Algunas polimerasas) incluida la Daq) han mostrado una dbil actividad polimeri*adora no dirigida por un ADN patrn) la cual puede unir nucletidos adicionales al doble e-tremo apareado! Ei esta actividad puede producirse sobre una hebra sencilla de oligonucletidos) resultar a una buena oportunidad para que la e-tensin formara un corto solapamiento en el e-tremo GM con el otro primer) suficiente para promover la formacin del d mero! 34347 D*S82.+,&-*0T.D8S TR.F8SF(T8S

Las concentraciones de NT0s que suelen usarse est#n en torno a H'' O9 para cada uno de ellos! "n un volumen de reaccin de H= Ol con esta concentracin de dND/s se sinteti*ar an entre CBC!= Og de ADN! La concentracin de dND/s % de 9g5l H va relacionadas %a que el 9g se une a los dND/s con lo que concentraciones elevadas de dND/s inhibir an la reaccin al no tener la Ta' !olimerasa suficiente 9g como para incorporar dND/s! /ara una concentracin de H'' O9 de cada dND/ se suele a@adir 9g5lH a una concentracin de &!= m9! 34349 T(:;P8-.M*R(S( Las cantidades ptimas de Taq polimerasa necesarias para la s ntesis de ADN est#n alrededor de H unidades en H= Ol de volumen final de reaccin! La actividad de este en*ima se ve influenciada por la concentracin de dND/s) de 9g HN % de algunos iones monovalentes de manera que concentraciones elevadas de los mismos inhiben dicha actividad! /or otro lado) peque@as concentraciones de 05l estimulan la actividad sinttica de la Daq en un ='BC'( con un m#-imo aparente cuando su concentracin es de =' m9! "-isten algunos datos relacionados con la influencia de ciertos reactivos que se emplean antes de la amplificacin % que alteran la actividad de la Daq! /or e6emplo concentraciones &9 de urea estimulan la actividad) el EDE a ba6as concentraciones que la inhibe al igual que concentraciones ma%ores del &'( de etanol! 3434< (D+ M8-D* 8 =T*MP-(T*? "s el ADN del cual queremos copiar un determinado fragmento) es) por tanto) el ADN que la Daq polimerasa utili*a como molde para la s ntesis de nuevas cadenas polinucleot dicas! La cantidad de ADN necesaria para la /58 depende de varios factores: Del marcador que se va a amplificar: ha% marcadores cu%os primers son m#s espec ficos o bien cu%as condiciones de amplificacin est#n me6or optimi*adas que las de otros! /or esta ra*n puede darse el caso de que cierta cantidad de ADN 7sobre todo cuando 6ugamos con cantidades m nimas: amplifique para unos marcadores pero no para otros! /or ello) cuando en un laboratorio se va a utili*ar un nuevo marcador es necesario hacer un estudio de validacin en l que se inclu%e un estudio de sensibilidad! De dicho estudio de sensibilidad puede sacarse como conclusin cu#l es la m nima cantidad de ADN que amplifica en condiciones est#ndar! De manera general) para casi todos los ED8 utili*ados en +entica ,orense la cantidad ptima de ADN que asegura un rendimiento adecuado est# en torno a los = ng! &alidad del (D+: 5uando se traba6a con ADN cu%a calidad es ptima no suele haber problemas en la amplificacin % cantidades del mismo por encima e incluso por deba6o de los = ng rinden buenos resultados! "l problema aparece cuando la calidad del ADN obtenido no es la idnea) bien porque est degradado o bien porque dicho ADN va%a

ligado a una serie de contaminantes que pueden inhibir la actividad de la polimerasa! Ei el ADN est# degradado por la accin de en*imas de restriccin el que obtengamos o no resultado en la amplificacin va a depender de que el fragmento a amplificar ha%a sido da@ado o no! "n el caso en el que tengamos ADN sin degradar pero unido a una serie de contaminantes habr a que intentar diluir al m#-imo la muestra para disminuir dichos contaminantes) pero siempre dentro de un rango de ADN que no est por deba6o del l mite de sensibilidad de la /58! "l problema de las cantidades m nimas de ADN % la presencia de contaminantes o inhibidores de la Daq es un hecho habitual en 5riminal stica % requiere un estudio pormenori*ado de la muestra antes de la amplificacin! AD@&5ANTES DE LA 0CR Eon elementos que me6oran el rendimiento % la especificidad de la /58! Aunque algunos autores han recomendado el uso del D$SO % del gli%erol) el ad%uvante m#s e-tendido % utili*ado es el BSA! A concentraciones por encima de '!< OgPOl el 1EA incrementa la eficiencia de la /58 %a act$a como una prote na captadora de iones que pueden ser inhibidores de la Daq polimerasa! La /58 ofrece una serie de venta6as) frente al uso de las tcnicas de an#lisis gentico utili*adas con anterioridad) como son: Eu capacidad para obtener resultados en casos en los que la cantidad de ADN es mnima o en casos en los que el ADN est parcialmente egra a o! +enera en un espacio corto de tiempo un ele'a o nAmero e %o#ia" de la secuencia de ADN que es ob6eto de estudio) lo cual permite utili*ar tcnicas de visuali*acin m#s sencillas % r#pidas que el uso de sondas marcadas radioactivamente! /ermite la determinacin % agrupacin allica en %la"e" i"%reta") lo que facilita la elaboracin de bases de datos al ser la estandari*acin inmediata % posibilitar la aplicacin de mtodos bioestad sticos % programas elaborados! "l uso de marcadores microsatlites de peque@o peso molecular aumenta las probabilidades de obtener resultados positivos de amplificacin cuando el ADN se encuentra degradado %a que puede ser que dichos fragmentos no ha%an sido digeridos! "sta venta6a es de gran importancia en 5riminal stica %a que normalmente los indicios biolgicos encontrados han estado sometidos a diversos factores 7calor % humedad: que favorecen el crecimiento bacteriano! Ein embargo) una de las grandes venta6as de la /58 que es su elevada sensibilidad puede) en ocasiones) convertirse en un gran problema %a que se podr a coamplificar un ADN e-tra@o o a6eno al que nos interesa! No obstante) en los laboratorios de +entica ,orense las medidas de precaucin que se toman para evitar problemas de contaminacin por manipulacin son e-tremas!

?na ve* amplificado el ADN) los fragmentos resultantes son separados en funcin de su tama@o por medio de un proceso de ele%tro!ore"i"! A%t*almente "e *tili6an o" ti#o" e ele%tro!ore"i" en lo" laboratorio" e Gen,ti%a Foren"e3 Ele%tro!ore"i" en gele" 'erti%ale" e #olia%rilami a Ele%tro!ore"i" %a#ilar La ele%tro!ore"i" %a#ilar es una tcnica relativamente novedosa en el campo de la +entica ,orense pero que est# poco a poco sustitu%endo a los sistemas de electroforesis vertical! "n este caso el proceso electrofortico es llevado a cabo en un capilar de silica de unas =' mm de di#metro) lo cual hace que la cantidad de calor generado sea menor % que puedan aplicarse volta6es ma%ores! /ara que puedan ser anali*ados por electroforesis capilar los primers o los dideo-inucletidos 7en el caso de la secuenciacin: deben ser marcados fluorescentemente con unas molculas denominadas fluorocromos que emiten fluorescencia a una determinada longitud de onda cuando son e-citados por l#ser! "l equipo en el que se reali*a el proceso lleva acoplado un ordenador encargado de traducir los datos de emisiones fluorescentes en secuencias o fragmentos con sus correspondientes alelos asignados! La electroforesis capilar presenta una serie de venta6as frente a los sistemas de electroforesis vertical como son: Ra#i e6: %a que permite el an#lisis simult#neo de varios loci aunque stos posean alelos con tama@os solapantes! Sen"ibili a : hace posible detectar cantidades mu% peque@as de ADN amplificado! Los resultados se obtienen de manera informati*ada) lo que evita problemas de interpretacin de los resultados % facilita el an#lisis de los mismos a travs de programas inform#ticos!

2. F*t*ra" te%nologa"3 bio%4i#"

Las tcnicas de an#lisis gentico se encuentran ho% en d a en continuo desarrollo % evolucin! La necesidad de tcnicas que permitan el aislamiento % an#lisis de los casi cien mil genes que componen el genoma humano 6ustifica la e-istencia de l neas de investigacin destinadas al descubrimiento de nuevos mtodos que permitan monitori*ar elevados vol$menes de informacin gentica en paralelo % que redu*can tanto el tiempo empleado como el coste por an#lisis! Desde el an#lisis de los primeros polimorfismos de ADN con fines identificativos) la +entica ,orense ha sufrido una gran evolucin! Los e-pertos en la materia han sido testigos de cmo el descubrimiento de la /58 revolucion las tcnicas de identificacin gentica! "s probable que la pr-ima revolucin la constitu%an los llamados bio%4i#" o mi%roarra:"!

Los bio%4i#" surgen como consecuencia de una combinacin entre tcnicas microelectrnicas empleadas para la fabricacin de microprocesadores inform#ticos % materiales biolgicos! "n general puede decirse que la principal caracter stica de los chips es su capacidad para generar informacin en mu% poco espacio) %a que posibilitan el procesamiento de multitud de ensa%os simult#neamente! "sta caracter stica es la que hace que los biochips sean probablemente la tecnolog a del futuro en el campo de las investigaciones biomdicas! La fabricacin de los biochips es similar a la de los chips inform#ticos: por medio de la tcnica denominada !otolitogra!a se depositan circuitos microscpicos sobre l#minas de silicio! "n el caso concreto de los biochips) estas l#minas son de vidrio % lo que se deposita en dichas l#minas son cadenas de ADN! Las l#minas de vidrio presentan una serie de venta6as como son: /osibilidad de unir las cadenas de ADN a la superficie del cristal) convenientemente tratada) mediante enlaces covalente! Eu capacidad para aguantar altas temperaturas % lavados de elevada fuer*a inica! Al ser un material no poroso el volumen de hibridacin puede reducirse al m nimo! Eu ba6a fluorescencia evita ruidos de fondo! 4a% compa@ as comerciales que han desarrollado otras estrategias para la fabricacin de biochips! No obstante) los m#s usados actualmente % con ma%or n$mero de aplicaciones son los basados en tcnicas fotolitogr)ficas. "stos chips) como se di6o anteriormente) consisten en una peque@a l#mina de vidrio que posee unos grupos reactivos) a los que posteriormente se unir#n los nucletidos) protegidos mediante una pel cula reali*ada con un agente qu mico fotodegradable! 9ediante una m#scara que se sit$an sobre el chip) se logra enfocar un ha* de lu* hacia unas posiciones % regiones determinadas) degradando al agente qu mico protector en dichas *onas % de6#ndolo intacto en las *onas protegidas por la m#scara! A continuacin se a@ade al chip un medio que contiene uno de los cuatro nucletidos que se unir#) mediante enlace covalente) al cristal con los grupos reactivos que ha%an quedado desprotegidos! 5ada grupo a@adido lleva una molcula receptora fotodegradable! Dodo este proceso se va repitiendo con los diferentes nucletidos % m#scaras hasta generar unos oligonucletidos con las secuencias que nos interesen! "l siguiente esquema muestra el todo el proceso e-plicado anteriormente! 5ada casilla del chip posee una cadena de un oligonucletido de manera que solamente aquel fragmento de ADN que hibride perfectamente con ella permanecer# unido tras los diversos lavados!

/reviamente a la hibridacin) el ADN de la muestra a estudiar debe haber sido amplificado % marcado fluorescentemente en uno de sus e-tremos! ?na ve* marcado se incuba en el recipiente que contiene al chip tras lo cual se lava varias veces para eliminar los fragmentos que no ha%an hibridado % se introduce el chip en un esc#ner en el que se detectan los patrones de hibridacin! "sta deteccin se reali*a en base a la fluorescencia emitida por los fluorocromos de la muestra cuando son e-citados por lu* % en aquellos pocillos en los que la unin ha%a sido completa la fluorescencia ser# ma%or que los que contengan alguna base desapareada! ?n ordenador conectado al esc#ner es el que identifica las secuencias sonda por su posicin el chip! 2.) A#li%a%ione" e lo" bio%4i#" A pesar de ser una tecnolog a mu% reciente % que) por lo tanto) est# a$n en v as de e-perimentacin) actualmente los biochips est#n siendo aplicados en: $onitori6a%i+n e eB#re"i+n g,ni%a: permite determinar cual es el patrn de e-presin gnica % cuantificar el nivel de e-presin de manera simult#nea para un elevado n$mero de genes! "sto permite reali*ar estudios comparativos de activacin de determinados genes en te6idos sanos % enfermos % determinar as la funcin de los mismos! Dete%%i+n e m*ta%ione" : #olimor!i"mo" : /ermite el estudio de todos los posibles polimorfismos % la deteccin de mutaciones en genes comple6os! Se%*en%ia%i+n: 9ientras que se han dise@ando algunos biochips para secuenciacin de fragmentos cortos de ADN) no e-iste a$n en el mercado ning$n biochip que permita secuenciar de novo secuencias largas de ADN! Diagn+"ti%o %lni%o : ete%%i+n e mi%roorgani"mo" : /osibilitan la identificacin r#pida empleando unos marcadores genticos de los patgenos! S%reening : toBi%ologa e !.rma%o": el empleo de los biochips permite el anali*ar los cambios de e-presin gnica que se dan durante la administracin de un f#rmaco de forma r#pida) as como la locali*acin de nuevas posibles dianas teraputicas % los efectos to-icolgicos asociados! Seg*imiento e tera#ia: los biochips permiten valorar rasgos genticos que pueden tener incidencia en la respuesta a una terapia! $e i%ina #re'enti'a: "l conocimiento % posible diagnstico de ciertos caracteres genticos asociados a determinadas patolog as permite una prevencin de las mismas antes de que apare*can los s ntomas!