Temat 6: Metody posiewu i hodowli drobnoustrojw (1)

Literatura:
Kocwowa E.: wiczenia z mikrobiologii oglnej dla wyszych szk technicznych. PWN
1984, str. 50-58 (Poywki mikrobiologiczne), 86-92 (Wyosabnianie czystych kultur
drobnoustrojw), 101-103 (Hodowla kuta, stosunek do tlenu), 135-141 (Metody hodowli
drobnoustrojw).
Aby zaliczy to wiczenie student powinien:
zna podstawowe wymagania pokarmowe mikroorganizmw auto- i heterotroficznych;
wiedzie, w jakim celu wykonuje si poszczeglne typy posiewu; zna kryteria podziau
poywek z podaniem przykadw i krtk charakterystyk; wiedzie, czym jest agar, agar
odywczy, bulion i elatyna; umie scharakteryzowa mikroorganizmy pod wzgldem ich
wymaga wobec temperatury, odczynu, natlenienia i cinienia osmotycznego; zna metody
hodowli w warunkach beztlenowych; umie scharakteryzowa podstawowe typy hodowli, w
tym fazy hodowli statycznej; rozumie rnic midzy hodowl statyczn a cig;
rozumie pojcia: posiew, inokulum, szczep, izolacja szczepu, czysto w sensie
mikrobiologicznym, kolonia, inkubacja, autotrofy, heterotrofy, prototrofy, auksotrofy,
mikroorganizmy psychrofilne, mezofile, termofilne, tlenowce, beztlenowce, wzgldne
beztlenowce, mikroaerofile, czas generacji, wzrost logarytmiczny, chemostat, jednostka
tworzca koloni (jtk, cfu);
umie wykona podstawowe typy posiewu, w tym wyizolowa czysty szczep; umie
wykona cig rozciecze.
Dziki hodowli mona w warunkach laboratoryjnych (in vitro) namnaa drobnoustroje
yjce w rodowisku naturalnym. Aby zaoy hodowl drobnoustrojw naley wprowadzi
je do sterylnej poywki, czyli posia. Posiewane mikroorganizmy okrela si mianem
inokulum lub zaszczepu. Nie zawsze znamy skad drobnoustrojw tworzcych zaszczep, np.
kiedy posiewamy prb rodowiskow, w ktrej zwykle znajduje si wiele rnorodnych
bakterii i grzybw (woda, cieki, gleba itp.). Posiane drobnoustroje inkubuje si, czyli
przetrzymuje w poywce okrelony czas (czas inkubacji), w okrelonej temperaturze
(temperatura inkubacji). Podczas inkubacji posiane komrki rosn i dziel si. Trzeba jednak
wspomnie, e s drobnoustroje, ktre nie rosn na adnych poywkach i nie mona ich
hodowa, np. krtek blady, wywoujcy ki lub prtek trdu.
Rne mog by cele posiewu, a wic i zaoonej hodowli:
wyizolowanie okrelonych drobnoustrojw z prb rodowiskowych (wody, gleby), w
tym uzyskanie czystych szczepw, czyli zbiorw komrek pochodzcych z jednej
komrki macierzystej, z zamiarem ich dalszych bada (m.in. identyfikacji),
namnoenie komrek ju wyizolowanego i zidentyfikowanego szczepu, np. w celu
pozyskania pewnych produktw jego metabolizmu, lub zbadania jego zdolnoci do
rozkadu okrelonych zanieczyszcze,
policzenie komrek wchodzcych w skad posiewanej prby.
Poywka, w ktrej prowadzi si hodowl okrelonych drobnoustrojw musi zaspokaja
ich wymagania odywcze. Poza tym hodowla powinna by prowadzona w optymalnych dla

wzrostu warunkach rodowiskowych, takich jak temperatura, odczyn, natlenienie, cinienie

osmotyczne.
Wymagania pokarmowe.
Wszystkie bakterie i grzyby potrzebuj do wzrostu i rozmnaania si rda energii,
wgla, azotu i wielu innych skadnikw pokarmowych. Okrela to atwy do zapamitania
skrt CHOPKNS, bdcy szeregiem symboli chemicznych najwaniejszych pierwiastkw.
Oprcz wymienionych skadnikw, w kadej poywce niezbdna jest rwnie obecno
elaza, magnezu oraz tzw. pierwiastkw ladowych, koniecznych w bardzo maych steniach
(np. Co, Mn, Zn, Cu, Mo, Ca).
Na szczegln uwag zasuguje zapotrzebowanie na rdo energii i wgla. W przypadku
mikroorganizmw autotroficznych rdem energii jest promieniowanie soneczne
(fotoautotrofy) lub energia utleniania zredukowanych zwizkw nieorganicznych
(chemoautotrofy), rdem wgla natomiast obecny w atmosferze CO2. Dlatego poywki do
hodowli autotrofw nie musz zawiera zwizkw wgla.
Dla heterotrofw natomiast rdem energii i wgla s zwizki organiczne. Pod
wzgldem zapotrzebowania na zwizki organiczne mikroorganizmy dzieli si na dwie grupy:
prototrofy, wymagajce do wzrostu tylko jednego rodzaju zwizku wgla,
auksotrofy, wymagajce przynajmniej dwch rodzajw zwizkw wgla.
Prototrofy s wyjtkowo uzdolnione metabolicznie, gdy potrafi wszystkie potrzebne
skadniki komrkowe zsyntetyzowa z czsto bardzo prostych, nawet jednowglowych
zwizkw wyjciowych, np. metanu czy mrwczanu. S to przede wszystkim drobnoustroje
yjce w rodowisku ubogim w skadniki pokarmowe (woda, gleba), ale s wrd nich
rwnie mieszkacy rodowisk bogatych w pokarm, np. wystpujca powszechnie w jelicie
czowieka paeczka okrnicy (Escherichia coli).
Auksotrofami s czsto drobnoustroje yjce w innych organizmach, np. liczne bakterie i
grzyby chorobotwrcze. Wystpuje wrd nich dua rozpito wymaga pokarmowych, od
jednego dodatkowego zwizku (np. paeczka duru brzusznego Salmonella typhi wymaga
aminokwasu tryptofanu) po liczne aminokwasy, zasady purynowe, pirymidynowe i witaminy
potrzebne bakteriom fermentacji mlekowej.
W mikrobiologii stosuje si rne rodzaje poywek, w zalenoci od celu bada. Ze
wzgldu na konsystencj mona je podzieli na:
pynne,
stae,
ppynne.
Poywki pynne stosowane s zwykle do namnaania w celu otrzymania duej biomasy
komrek i pozyskiwania produktw ich metabolizmu. Przykadem moe by bulion
odywczy, jedna z najczciej uywanych poywek. Bulion jest mieszanin peptonu
(produktu enzymatycznej hydrolizy biaek), wycigu misnego (ekstraktu zawierajcego m.in.
zasady organiczne i witaminy) i NaCl, dodawanego dla zapewnienia odpowiedniego cinienia
osmotycznego. Na bulionie dobrze rosn mikroorganizmy o rednich wymaganiach
pokarmowych, jednak dla wielu drobnoustrojw yjcych w rodowiskach ubogich w pokarm
(glebowych i wodnych), jest on zbyt bogat poywk, hamujc ich rozwj. Z kolei dla
bardzo wymagajcych bakterii chorobotwrczych bulion jest zbyt ubogi i musi by
wzbogacony, np. o krew lub wycig drodowy. Tego typu poywki okrela si mianem
wzbogaconych (patrz niej).

Poywki stae stosuje si gwnie do izolacji czystych szczepw, przechowywania ich, do

bada morfologii kolonii, oraz w badaniach ilociowych (okrelaniu liczby komrek w
prbie). Do zestalania poywek pynnych uywa si gwnie agar, a take elatyn. W
przypadku hodowli niektrych bakterii autotroficznych, wraliwych na wiksze stenia
zwizkw organicznych, stosuje si el krzemionkowy, ktrym zestala si poywk
mineraln.
Agar jest mieszanin dwch polisacharydw: agarozy i agaropektyny, ktre s polimerami
galaktozy. Jest on wytwarzany przez pewne glony morskie z grupy krasnorostw, jako
skadnik ich cian komrkowych. Produkuje si go w postaci proszku lub granulek. Po
wymieszaniu z wod i podgrzaniu do temp. 95-98 0C agar rozpuszcza si, a w trakcie
schadzania zachowuje swoj pynn konsystencj do temperatury ok. 45-48 0C, kiedy
krzepnie przechodzc w galaretowaty el. Sam agar (tzw. agar-agar) nie jest poywk dla
wikszoci bakterii, gdy nie potrafi go rozkada. Jest on uywany wycznie do zestalania
poywek pynnych (w iloci 1,5-2 %). Dodany do bulionu odywczego tworzy tzw. agar
odywczy, w skrcie MPA.
elatyna, czyli tzw. klej kostny, jest biakiem otrzymywanym w wyniku duszego
gotowania odpadkw zawierajcych kolagen (skra, koci). Wad elatyny jako podoa
mikrobiologicznego jest to, e rozpuszcza si ona ju w temp. ok. 30-350C, a wic poniej
temperatury inkubacji wielu drobnoustrojw. Niektre bakterie i grzyby potrafi rozkada
elatyn upynniajc j, co jest wykorzystywane w badaniach diagnostycznych
(identyfikacyjnych).
Poywki ppynne maj konsystencj poredni midzy poywkami pynnymi a staymi,
i zawieraj 0,15-0,2 % agaru. Su one do badania zdolnoci ruchu u bakterii. Po
zaszczepieniu supka z agarem ppynnym, bakterie zdolne do ruchu bd si przemieszcza
i, dziki maej gstoci agaru, zasiedl ca objto poywki. W efekcie licznych podziaw,
po okresie inkubacji powstanie zmtnienie w caej objtoci supka agarowego. W przypadku
bakterii nie zdolnych do ruchu, ich podziay komrkowe spowoduj jedynie wzrost wzdu
linii wkucia.
Inny podzia poywek uwzgldnia wymagania odywcze drobnoustrojw:
poywki proste,
poywki wzbogacone,
poywki specjalne,
poywki wybircze (selektywne),
poywki wybirczo-namnaajce,
poywki wybirczo-rnicujce.
Poywki proste zaspokajaj niskie i rednie wymagania pokarmowe mikroorganizmw.
Nale tu m.in. omwione wyej bulion i agar odywczy. Stanowi one podstaw dla innych,
bardziej zoonych poywek.
Poywki wzbogacone stosuje si do hodowli bardziej wymagajcych drobnoustrojw
chorobotwrczych (np. paciorkowcw i gronkowcw), przystosowanych do ycia w bogatym
w substancje odywcze rodowisku wntrza organizmu ywiciela. Czynnikiem
wzbogacajcym moe by odwkniona krew (czsto barania), wycigi z narzdw
zwierzcych, np. wtroby, wycig z drody, hydrolizat kazeiny gwnego biaka mleka i
inne.
Poywki specjalne su do hodowli drobnoustrojw o szczeglnych wymaganiach
odywczych, takich jak prtki grulicy, dwoinki rzeczki czy maczugowce bonicy. Uywa
si w nich wysokowartociowych skadnikw odywczych (tka jaj kurzych, surowice,
witaminy).

Poywki wybircze umoliwiaj wzrost okrelonym drobnoustrojom (ktre chcemy

wyizolowa z prby) dziki stworzeniu im sprzyjajcych warunkw wzrostu lub dodanie
skadnika hamujcego wzrost niepodanych mikroorganizmw. Przykadem moe by
poywka umoliwiajca wyosobnienie z gleby bakterii Azotobacter, wicej azot
atmosferyczny. W poywce tej nie ma zwizku zawierajcego azot, pierwiastek niezbdny do
wzrostu wszystkim komrkom. Tylko drobnoustroje zdolne do asymilacji (przyswojenia)
azotu czsteczkowego (N2) z powietrza mog na takiej poywce rosn. Poza tym, zawiera
ona mannitol, ulubione rdo wgla bakterii Azotobacter. Innym przykadem mog by
poywki zakwaszone, ktre s wybiorcze dla grzybw. Obniony odczyn hamuje wzrost
wikszoci bakterii, ktre zwykle preferuj odczyn obojtny lub lekko zasadowy, natomiast
grzyby jako mikroorganizmy kwasolubne dobrze rosn i dziel si na takich podoach.
Poywki wybirczo-namnaajce s czsto poywkami pynnymi i umoliwiaj nie tylko
wyosobnienie okrelonego drobnoustroju (ktry zwykle wystpuje w znikomej iloci), ale te
namnoenie go do duej biomasy umoliwiajcej dalsze badania (np. identyfikacyjne).
Przykadem moe by podoe z kwanym selenianem sodowym, stosowane do izolacji
paeczek Salmonella np. z produktw ywnociowych lub gleby (selenian jest tu czynnikiem
hamujcym wzrost drobnoustrojw gramdodatnich, a zwaszcza ziarniakw).
Poywki wybirczo-rnicujce umoliwiaj nie tylko wzrost wybranym drobnoustrojom,
ale te pozwalaj je zrnicowa. Przykadem moe by poywka Endo, czsto stosowana w
sanitarnych badaniach rodowiska. Pozwala ona rosn jedynie bakteriom gramujemnym,
czyli jest dla nich wybircza (obecno w podou fuksyny hamuje rozwj bakterii
gramdodatnich), ale te umoliwia zrnicowanie wyrosych bakterii na zdolne, i nie zdolne
do fermentacji laktozy. Podczas fermentacji tego cukru powstaje bowiem aldehyd octowy,
ktry daje czerwone zabarwienie po poczeniu si z fuksyn (dotd bezbarwn, bo
zredukowan przez siarczyn sodu, rwnie dodawany do poywki). Dlatego bakterie
fermentujce laktoz (jak paeczka okrnicy) tworz kolonie koloru czerwonego z
metalicznym (tzw. fuksynowym) poyskiem, a nie zdolne do fermentacji koloru rowego
lub bezbarwne.
Poywki dzieli si te na:
syntetyczne (o cile zdefiniowanym skadzie ilociowym i jakociowym),
naturalne (o nie znanym dokadnie skadzie, na bazie skadnikw pochodzenia
naturalnego, np. wycig z tkanek rolinnych lub zwierzcych, krew, mleko itp.),
psyntetyczne (poywka mineralna o znanym skadzie, plus skadniki pochodzenia
naturalnego, o nie sprecyzowanym dokadnie skadzie).
Temperatura
Drobnoustroje wykazuj due zrnicowanie wymaga termicznych, ktre musz by
uwzgldnione podczas hodowli. Dla kadego mikroorganizmu mona okreli trzy tzw.
temperatury kardynalne:
minimaln, poniej ktrej wzrost komrek i podziay nie wystpuj,
optymaln, w ktrej komrki rosn i dziel si najszybciej,
maksymaln, powyej ktrej wzrost i podziay nie zachodz.
Temperatury nisze od minimalnych i wysze od maksymalnych nie musz by dla
drobnoustrojw zabjcze, zawsze jednak hamuj ich rozwj. Punkty kardynalne nie zawsze
oznaczaj cile okrelonej temperatury. Moe to by pewien (zwykle wski) zakres
temperatur, zaleny od innych czynnikw, np. od odczynu podoa. Temperatura inkubacji
hodowli zwykle pokrywa si z temperatur optymaln dla danego drobnoustroju. Aby
zachowa waciw temperatur podczas rozwoju hodowli, prowadzi si j w tzw.

cieplarkach, czyli szafkach zaopatrzonych w urzdzenie termostatowe umoliwiajce

nastawienie odpowiedniej temperatury i utrzymanie jej.
Punkty kardynalne s podstaw do podziau mikroorganizmw na trzy podstawowe
grupy:
psychrofilne (zimnolubne), o temperaturze optymalnej ok. 20 0C (minimum ok. -100C,
maksimum ok. 300C),
mezofilne (redniotemperaturowe), o optimum w 370C (minimum 150C, maksimum
450C),
termofilne (ciepolubne), o optimum w 550C (minimum 300C, maksimum 750C).
Psychrofilami jest wikszo drobnoustrojw yjcych w rodowisku wodnym i
glebowym.
Mezofilami s gwnie drobnoustroje yjce w ciele (i na ciele) zwierzt staocieplnych
(ptaki i ssaki). S wrd nich zarwno gatunki chorobotwrcze, jak i niechorobotwrcze
(saprofityczne) tworzce tzw. mikroflor organizmu.
Do mikroorganizmw termofilnych nale gwnie gramdodatnie laseczki i
ziarenkowce. Wystpuj one np. w fermentujcych resztkach rolinnych, np. w oborniku,
kompocie, stogach siana, w nawozie, gorcych rdach itp. Istnieje te grupa
mikroorganizmw prokariotycznych zwana archeonami (do niedawna zaliczana do bakterii),
ktra yje w warunkach ekstremalnych, gdzie temperatura przekracza 100 0C. Chodzi o tzw.
kominy termalne na dnie oceanw. Drobnoustroje yjce w tak wysokich temperaturach
okrela si mianem ekstremalnych termofili.
Odczyn
Podobnie jak w przypadku temperatury (i innych czynnikw rodowiska), tu rwnie
wyrnia si dla kadego drobnoustroju warto optymaln odczynu, jego minimum i
maksimum. Odpowiednie stenie jonw wodorowych (ktrego ujemny logarytm oznacza si
jako pH) ma powany wpyw na rozwj komrek. Wikszo bakterii preferuje odczyn
obojtny lub lekko zasadowy (pH ok. 7 7,5), grzyby natomiast lepiej rosn w rodowisku
kwanym (pH ok. 5,2 5,6). W trakcie hodowli, jej odczyn do szybko si zmienia, z
powodu powstawania produktw przemiany materii. Aby utrzyma optymalny odczyn,
poywki przygotowuje si na bazie odpowiednich buforw
Natlenienie
Pod wzgldem stosunku do tlenu mikroorganizmy dzieli si na:
Bezwzgldne tlenowce (bezwzgldne aeroby),
Bezwzgldne beztlenowce (bezwzgldne anaeroby),
Wzgldne beztlenowce (wzgldne anaeroby),
Mikroaerofile.
Bezwzgldne tlenowce, jak sugeruje ich nazwa, wymagaj warunkw tlenowych w
steniu atmosferycznym (20%). W hodowli nie napowietrzanej na poywce pynnej (np.
bulionie), rosn tylko na powierzchni, w postaci kouszka, pozostawiajc poywk
przezroczyst (np. laseczki z rodzaju Bacillus i wiele grzybw). W gbi poywki mog one
rosn jedynie w warunkach napowietrzania.
Bezwzgldne beztlenowce nie toleruj tlenu, poniewa w jego obecnoci powstaje w
procesach metabolizmu nadtlenek wodoru (H2O2), zwizek silnie utleniajcy, a drobnoustroje
te nie wykazuj aktywnoci katalazowej (katalaza jest enzymem rozkadajcym H2O2).
Przykadem bezwzgldnych beztlenowcw s niektre laseczki z rodzaju Clostridium, np.
laseczka tca (C. tetani). Hodowla takich bakterii wymaga usunicia tlenu z poywki, co
mona osign rnymi metodami (patrz niej).

Wzgldne beztlenowce mog rozwija si zarwno w warunkach tlenowych, jak i

beztlenowych. Przykadem moe by paeczka okrnicy (Escherichia coli), pospolity
mieszkaniec jelita grubego czowieka. W nie napowietrzanej hodowli bulionowej ronie ona
w caej objtoci poywki (a wic w miejscach o rnym stopniu natlenienia) tworzc
jednolite zmtnienie. Ten typ wzrostu okrela si jako dyfuzyjny.
Mikroaerofile to drobnoustroje wymagajce do wzrostu tlenu, ale w niewielkim steniu,
dlatego w nie napowietrzanej hodowli na poywce pynnej tworz zmtnienie tylko na pewnej
gbokoci poywki, gdzie stenie tlenu jest odpowiednio niskie. Przykadem mog by
bakterie fermentacji mlekowej z rodzaju Lactobacillus.
Aby zapewni dobre natlenienie hodowli, stosuje si wytrzsanie (w hodowlach
pynnych), doprowadzanie powietrza za pomoc pompki membranowej (w kadym typie
hodowli) oraz zapewnienie moliwie duych powierzchni wymiany gazw (szczeglnie w
przypadku hodowli na podoach staych).
Warunki beztlenowe w hodowli mona osign rnymi metodami, m.in. przez:
zagotowanie poywki bezporednio przed posiewem,
wprowadzenie na powierzchni poywki pynnej warstwy sterylnej parafiny,
posiew wgbny w podou zestalonym,
dodanie do poywki zwizkw redukujcych, ktre obniaj potencja oksydacyjnoredukcyjny (kwas askorbinowy, tioglikolan sodu),
hodowl w jednym naczyniu hodowlanym (szczelnie zamknitym) tlenowcw i
beztlenowcw (tlenowce zuywaj tlen i stwarzaj warunki beztlenowe),
hodowl w tzw. anerostatach, w ktrych powietrze jest usuwane np. pompk wodn, a
w jego miejsce wprowadzany gaz obojtny, np. azot,
Cinienie osmotyczne
Wikszo drobnoustrojw moe rosn tylko przy okrelonym steniu soli, w roztworze
izotonicznym (stenie soli na zewntrz i wewntrz komrki s sobie rwne). Komrki w
roztworze hipotonicznym, gdy stenie soli na zewntrz komrki jest mniejsze i woda ma
tendencje do wnikania do wntrza, mog ulec pkniciu (dziki cianie komrkowej udaje im
si jednak wytrzyma okrelony napr wody). Z tego powodu do rozcieczania prb w
mikrobiologii nie stosuje si wody destylowanej, lecz roztwr fizjologiczny bdcy 0,85%
roztworem NaCl. W roztworach hipertonicznych (stenie na zewntrz jest wiksze)
przeywalno komrek zaley od zdolnoci do przeciwstawiania si wypywowi wody i
wysuszeniu. Drobnoustroje zdolne do wytrzymywania wikszych ste soli (do ok. 15%)
okrelane s mianem osmotolerancyjnych (np. gronkowce), natomiast te, ktre wytrzymuj
jeszcze wysze stenia to tzw. osmofile lub halofile (niektre archeony).
Rodzaje hodowli.
Hodowle dzieli si zwykle na:
statyczne (okresowe),
cige,
zsynchronizowane.
W hodowli statycznej mikroorganizmy posiane do poywki rosn i rozmnaaj si do
czasu wyczerpania si skadnikw pokarmowych lub (i) nagromadzenia si toksycznych
produktw przemiany materii. W tego typu hodowli rozwj populacji bakterii przebiega w
kilku charakterystycznych fazach, ktre mona zobrazowa na wykresie w postaci tzw.
krzywej wzrostu:
faza zastoju,

 faza wzrostu logarytmicznego (wykadniczego),

faza stacjonarna,
faza zamierania.
W fazie zastoju w zaszczepionych komrkach (inokulum) zachodz procesy adaptacji
polegajce na syntezie potrzebnych enzymw, replikacji DNA, syntezie biaek i w efekcie
komrki zwikszaj swoje rozmiary. Dugo tej fazy zaley od podobiestwa warunkw
hodowli poprzedniej (z ktrej pochodzi inokulum) do warunkw panujcych w nowej
hodowli. Im jest ono wiksze, tym faza jest krtsza.
W fazie wzrostu logarytmicznego komrki zaczynaj si dzieli. Sygnaem do podziaw
jest osignicie przez komrki odpowiedniej dugoci. Kada komrka dzieli si na dwie. Po
okrelonym czasie wzrostu powstae komrki znowu dziel si na dwie, std liczb
powstaych komrek (czyli wzrost populacji) okrela wzr 2n, gdzie n to liczba podziaw,
ktra jest rwnoznaczna z liczb pokole. Czas midzy dwoma kolejnymi podziaami, to tzw.
czas generacji lub wiek osobniczy. Zaley on od warunkw hodowli i od cech gatunkowych
drobnoustroju. W konkretnej hodowli jest on wic stay. Jeli liczba komrek w inokulum
wynosi N0, to powstaa liczba komrek N po n pokoleniach wyniesie N = N 0 x 2n. Liczba
bakterii podwaja si co kady okres generacji, ronie wic wykadniczo z upywem czasu. Do
czasu hodowli proporcjonalny jest wic logarytm liczby bakterii, a nie sama ich liczba. Std
nazwa faza logarytmiczna.
W fazie stacjonarnej obserwuje si spadek przyrostu liczby bakterii, w wyniku
zamierania czci komrek z powodu wyczerpywania si skadnikw pokarmowych, tlenu i
wytwarzania produktw przemiany materii. Zamieranie to jest w pewnej rwnowadze z
dzieleniem si innych komrek
Z czasem komrek zamierajcych jest wicej i dochodzi do spadku oglnej liczby
komrek hodowla si przerzedza i z czasem zamiera.
Jednak opisana sekwencja zdarze w hodowli moe by inna. Jeli tylko zapewni si
usuwanie zuytego podoa i zastpowanie go wieym, to moliwe jest utrzymywanie fazy
wzrostu logarytmicznego praktycznie w nieskoczono. Na tym wanie polega hodowla
ciga. Jest wic ona, w przeciwiestwie do hodowli statycznej, ukadem otwartym, z cigym
przepywem poywki (zuytej i wieej). Prowadzi si j w tzw. chemostatach,
umoliwiajcych kontrolowanie wzrostu komrek za pomoc dozowania odpowiednich iloci
poywki i regulowania szybkoci przepywu. Dziki temu moliwe jest uzyskanie stanu
rwnowagi, w ktrym zagszczenie komrek jest stae. Ma to due znaczenie w badaniach
procesw fizjologicznych drobnoustrojw, kiedy niezbdne s warunki stabilne. Hodowle
cige s wykorzystywane m.in. w przemyle spoywczym i farmaceutycznym, do produkcji
okrelonych substancji (np. kwasu octowego, antybiotykw) i biomasy (np. drody).
Hodowle w procesach produkcyjnych prowadzi si w bioreaktorach (fermentorach).
Rodzajem hodowli cigej jest rwnie biologiczna oczyszczalnia ciekw, w ktrej hoduje
si bakterie (jako tzw. osad czynny) na bazie poywki, jak stanowi cigle dopywajce
cieki.
Hodowla zsynchronizowana to hodowla, w ktrej komrki dziel si rwnoczenie (czyli
synchronicznie), w przeciwiestwie do innych hodowli, gdzie podziay komrek s
nieskoordynowane. Dziki jednoczesnoci podziaw, zmiany w hodowli synchronicznej s
odzwierciedleniem (zwielokrotnieniem) zmian w pojedynczej komrce. Umoliwia to
badanie przemian zachodzcych w cyklu yciowym komrki, zwykle nieuchwytnych ze
wzgldu na zbyt ma czuo metod badawczych. Zsynchronizowanie podziaw mona
osign wieloma metodami, m.in. przez szok wywoany nisk temperatur. Bakterie
przenosi si na ok. 15 60 min. do temperatury duo niszej od optymalnej. W tych
warunkach dochodzi do zrwnania stanu fizjologicznego komrek, ktre przeniesione do

temperatury optymalnej, rwnoczenie zaczynaj podziay komrkowe. Osignita

synchronizacja nie jest trwaa i, jeli nie jest utrzymywana, szybko spontanicznie zanika.

CZ PRAKTYCZNA:
Zadanie 1. Posiew izolacyjny na podoe stae (agar odywczy)
Celem tego posiewu jest wyizolowanie czystych szczepw drobnoustrojw w postaci
kolonii. Czysty szczep to zbir komrek pochodzcych od jednej komrki macierzystej.
Posiew izolacyjny, zwany te redukcyjnym, polega na rozprowadzaniu zawiesiny komrek za
pomoc ezy, po powierzchni poywki agarowej. W miar przecigania ezy po poywce,
liczba drobnoustrojw przenoszonych na powierzchni podoa bdzie coraz mniejsza, a w
kocu na oczku ezy pozostan nieliczne komrki, ktre bd si pojedynczo przykleja do
poywki. Kada z tych oddzielonych od siebie komrek zacznie si dzieli i utworzy odrbn
koloni wyizolowany czysty szczep.
W celu wykonania posiewu, naley:
1. Wyarzy i schodzi ez
2. Pobra ez zawiesin bakterii i delikatnie rozprowadzi j po powierzchni agaru
stosujc jedn z wybranych technik
3. Po posiewie ponownie wyarzy ez
4. Posiane hodowle inkubowa w temperaturze pokojowej przez kilka dni
5. Po inkubacji oceni, czy udao si wyizolowa czyste szczepy i ile rnych szczepw
znajdowao si w posiewanej zawiesinie.
Zadanie 2. Posiew ez na skos agarowy
Hodowle na skosie agarowym stosuje si gwnie do przechowywania szczepw.
W celu wykonania posiewu, naley:
1. Wyarzy i schodzi ez
2. Pobra ez zawiesin okrelonego szczepu bakterii i delikatnie rozprowadzi j po
powierzchni skosu agarowego zaczynajc od dou i prowadzc ez zygzakiem ku grze
skosu
6. Po posiewie ponownie wyarzy ez

7. Posian hodowl inkubowa w temperaturze pokojowej przez kilka dni

Po inkubacji opisa efekty posiewu (intensywno wzrostu, kolor, poyskliwo itp.)

Zadanie 3. Posiew na podoe pynne (bulion odywczy).

Posiew stosuje si w celu okrelenia stosunku do tlenu danej bakterii (czy jest ona
tlenowcem czy wzgldnym beztlenowcem).
1. Pobra ez zawiesin okrelonego szczepu bakterii i przenie do probwki z bulionem
odywczym lekko wstrzsajc ez po woeniu do bulionu
2. Posian hodowl inkubowa w temperaturze pokojowej przez kilka dni.
Po inkubacji, na podstawie obserwowanego typu wzrostu hodowli okreli, czy posiany
szczep jest tlenowcem czy wzgldnym beztlenowcem.
Zadanie 4. Posiew na podoe pynne fermentacyjne
Posiew ten suy do badania zdolnoci danego szczepu do fermentacji okrelonego cukru,
co przejawia si zmian zabarwienia poywki i wytworzeniem gazu zbieranego w rurce
Durhama.
1. Pobra ez zawiesin okrelonego szczepu bakterii i przenie do probwki z poywk
2. Posian hodowl inkubowa w odpowiedniej temperaturze.
Po inkubacji okreli zdolno posianego szczepu do fermentacji cukru zawartego w
poywce.
Zadanie 5. Posiew metod kut na supek agarowy z TTC
Posiew ten stosuje si do zbadania zdolnoci bakterii do ruchu (nie wszystkie bakterie
potrafi si czynnie przemieszcza). Jeli badany szczep wykazuje zdolno poruszania si, to
zostawia po sobie lad koloru czerwonego, jako efekt enzymatycznego przeksztacenia
obecnego w poywce bezbarwnego zwizku TTC w czerwony TF. Reakcj t katalizuje
enzym dehydrogenaza, aktywny w procesach energetycznych.
1. Pobra ig mikrobiologiczn (eza bez oczka) zawiesin okrelonego szczepu
bakterii poprzez zwyke zanurzenie jej w zawiesinie.
2. Zaszczepi supek agarowy przez wkucie igy a do dna supka (mona to wykona

trzymajc probwk ze supkiem dnem do gry i wkuwajc si od dou)

Po tygodniowej inkubacji oceni zdolno posianego szczepu do aktywnego ruchu na
podstawie stwierdzenia zaczerwienienia poywki poza miejscem wkucia.
Zadanie 6. Posiew metod kut na supek elatynowy
Posiew stosuje si do badania zdolnoci danego szczepu do hydrolizy biaka, czyli
proteolizy (elatyna to biako kostne) co przejawia si upynnieniem elatyny.
Wykona posiew jak w zadaniu 5.
Po tygodniowej inkubacji w temperaturze pokojowej oceni zdolno szczepu do
upynniania elatyny.
Zadanie 7. Posiew metod wgbn na pytki Petriego
Ten typ posiewu jest czsto stosowany w badaniach ilociowych (do okrelenia liczby
komrek w badanym materiale). Przed posiewem naley prb rozcieczy.
Wykonanie rozcieczenia (schemat):
1. Ustawi w statywie szeregowo 6 probwek zawierajcych kada po 9 cm 3 roztworu
fizjologicznego (liczba probwek jest proporcjonalna do spodziewanego zagszczenia
drobnoustrojw w prbie wyjciowej)
2. Do

pierwszej

probwki

wprowadzi

pipet

1cm3

wyjciowej

zawiesiny

drobnoustrojw i wymiesza na mikrowytrzsarce. Uzyska si w ten sposb 10-krotne

rozcieczenie prby
3. Zmieni kocwk pipety, pobra 1cm3 10-krotnego rozcieczenia i przenie do
nastpnej probwki z roztworem fizjologicznym, a nastpnie wymiesza w celu
otrzymania rozcieczenia 100x
4. Postpujc podobnie, wykona kolejne rozcieczenia: 103x, 104x , 105x i 106x.
Wykonanie posiewu:
1. Przygotowa 6 sterylnych szalek Petriego, przeznaczajc kad na inne rozcieczenie,
i odpowiednio opisa
2. Zaczynajc od najwikszego rozcieczenia (106x), pobra pipet (uywajc jednej
kocwki) po 1cm3 z kadego rozcieczenia i wla do odpowiednich szalek Petriego
3. Do wszystkich szalek wla pynny agar (schodzony do temp. ok. 450C) i wymiesza z
wprowadzonymi uprzednio rozcieczeniami. Pozostawi do zastygnicia

4. Inkubowa przez kilka dni w temp. pokojowej

Po inkubacji okreli liczb komrek drobnoustrojw w 1cm3 prby wyjciowej. W
tym celu policzy wszystkie wyrose kolonie z pytek, na ktrych jest ich od 30 do 300
(zwrci uwag na dwa typy kolonii: wgbne i powierzchniowe) Uwzgldni
rozcieczenie posianej prby oraz jej objto, i ostatecznie wyrazi liczebno w
jednostkach tworzcych koloni na cm3 badanej zawiesiny (jtk/cm3 lub cfu/cm3; skrt cfu
oznacza wanie jednostk tworzc koloni, z ang. colony forming unit). Porwna z
wynikami uzyskanymi metod posiewu powierzchniowego (Zad.8).
.
Zadanie 8. Posiew metod powierzchniow gaszczk na podoe stae.
Ten typ posiewu, podobnie jak poprzedni, jest czsto stosowany w badaniach
ilociowych. Ma on jednak t przewag nad posiewem wgbnym, e nie dochodzi tu do
szoku temperaturowego powodowanego wylewaniem gorcego agaru. Poza tym, metoda ta
lepiej nadaje si do hodowli mikroorganizmw tlenowych, np. grzybw.
Przed posiewem wykona rozcieczenie prby, podobnie jak w Zad.7.
Posiew wykona na pytki Petriego z ju wylanym, zastygym agarem odywczym.
Wykonanie posiewu:
1. Przygotowa 6 pytek Petriego z agarem odywczym, przeznaczajc kad na inne
rozcieczenie, i odpowiednio opisa.
2.

Jedn pipet pobra po 0,1 cm3 z kadego rozcieczenia, zaczynajc od

najwikszego, i wyla na powierzchni agaru odpowiedniej pytki.

3. Wysterylizowa gaszczk w pomieniu palnika i odczeka a ostygnie.

4. Wylan zawiesin rozprowadzi rwnomiernie steryln gaszczk po caej
powierzchni agaru. Odoy gaszczk do zlewki z alkoholem.
5. Posiane pytki inkubowa przez tydzie w temp. pokojowej.
Po inkubacji okreli liczb komrek drobnoustrojw w 1cm3 prby wyjciowej. W
tym celu policzy wyrose kolonie z pytek, na ktrych jest ich od 30 do 300. Uwzgldni
rozcieczenie posianej prby oraz jej objto, i wyrazi liczebno w jtk/cm 3 (lub
cfu/cm3). Porwna z wynikami uzyskanymi metod posiewu wgbnego (Zad.7).