CONCEPTO DE CRIOPRESERVACIN Y CONCEPTOS RELACIONADOS La criopreservacin es el proceso en el cual clulas, tejidos, rganos o individuos completos son congelados a muy

bajas temperaturas, generalmente entre -80C y -196C (el punto de ebullicin del nitrgeno lquido) para disminuir las funciones vitales de una clula o un organismo y poderlo mantener en condiciones de vida suspendida por mucho tiempo. A esas temperaturas, cualquier actividad biolgica, incluidas las reacciones bioqumicas que produciran la muerte de una clula, quedan efectivamente detenidas. Normalmente para preservar una muestra biolgica durante el mayor tiempo posible sin que pierda su calidad se utiliza nitrgeno lquido. De esta manera sumergiendo la muestra en nitrgeno lquido se alcanzan temperaturas de hasta -195,79C, la temperatura de ebullicin del nitrgeno lquido. La utilizacin de helio lquido permite alcanzar temperaturas incluso menores de hasta -268,93C (temperatura de ebullicin del helio). Las muestras criopreservadas en nitrgeno lquido slo estarn afectadas por las radiaciones que puedan incidir sobre ellas puesto que la congelacin impide todo movimiento molecular en la muestra. Se ha realizado recientemente una revisin a la terminologa empleada para los procesos criobiolgicos implicados en la vitrificacin. Shaw y Jones, en 2003, establecieron claramente el significado en criobiologa de los trminos congelacin (freezing) y descongelacin (thawing), y afirmaron que slo podan usarse para procedimientos donde se formaran o derritieran cristales de hielo (como sinnimo de deshielo o derretimiento). Cooling y warming, cuyo significado en ingls es enfriamiento y calentamiento, slo se refieren a cambios de temperatura y pueden utilizarse indistintamente para la congelacin tradicional y para la vitrificacin. El consenso actual entre los criobilogos es usar los trminos congelacin-descongelacin para la congelacin lenta y procesos relacionados, y calentamiento-enfriamiento para la vitrificacin, es decir, trminos vinculados con los cambios de temperatura y no de formacin y derretimiento de cristales de hielo. Con base en estos argumentos, se ha propuesto, como primer paso en la direccin correcta, reemplazar de manera adecuada los trminos en las etiquetas de los medios de vitrificacin, como soluciones de calentamiento (warming solutions) en lugar de soluciones de descongelacin (thawing solutions). Slow freezing: criopreservacin mediante formacin de hielo en el medio extracelular. Es el mtodo tradicional utilizado para criopreservacin de clulas aisladas. Se basa en velocidades lentas de enfriamiento, al formarse hielo en el medio extracelular la clula se deshidrata mediante procesos osmticos lo cual hace que aumente la concentracin de sales en el interior de la clula. Este aumento de concentracin provoca lo que se conoce como un descenso crioscpico, que consiste en una disminucin del punto de congelacin de la clula. Esto permite un descenso de temperatura sin formacin de hielo intracelular. Vitrificacin: criopreservacin sin formacin de hielo intra o extracelular. Hay sistemas que en determinadas condiciones responden a la disminucin de temperatura con la formacin de un slido amorfo, en lugar de formar una estructura cristalina como es el hielo en el caso del agua pura. La formacin de este slido, que se conoce tambin como estado vtreo, evita la movilidad de las molculas que provocan las reacciones metablicas, y con ello el envejecimiento o muerte celular. DESCRIPCIN DE ESTE PROCESO FSICO SOBRE SISTEMAS BIOLGICOS Bastan dos principios fsicos para explicar lo que le ocurre a la clula mientras se enfra: el principio de smosis y el principio de descenso del punto de congelacin. El principio de smosis nos dice que cuando tenemos un saco (clula) semipermeable de este tipo sumergido en otra disolucin salina, entonces el agua empieza a fluir en un sentido tal que tiende a igualar las concentraciones de las disoluciones. O sea, si sumergimos la clula en una disolucin de sales ms concentrada que el interior celular, entonces el agua (y slo el agua) sale de la clula; esta, por lo tanto, se encoge y reduce de volumen. Si, por el contrario, sumergimos la clula en una disolucin ms diluida que el interior celular, entonces empezar a entrar agua dentro de la clula intentando diluir tambin la disolucin salina de su interior; el resultado es que la clula se hincha. El principio de descenso del punto de congelacin nos dice que si tenemos agua pura y disolvemos sales en ella, entonces el agua no se congelar a 0C, sino por debajo de esta temperatura; a una temperatura tanto ms baja cuanta ms cantidad de sal hayamos disuelto en ella. Un ejemplo de este fenmeno, por todos conocidos, es el que se produce cuando evitamos el deterioro del radiador de nuestro automvil al aadirle anticongelante.

Cuando tenemos un conjunto de clulas que queremos conservar en fro, inicialmente las clulas se tienen sumergidas dentro de un recipiente que contiene una solucin salina isotnica, es decir, con la misma concentracin que el interior celular. Cuando se empieza a enfriar ste preparado, el fro alcanza antes la solucin exterior que el interior celular. Esto trae como consecuencia que se empiece a formar hielo en el medio extracelular cuando an no se ha formado hielo dentro de la clula. A medida que se forma el hielo extracelular el agua lquida va desapareciendo. Al disminuir la cantidad de agua exterior, en base al principio de smosis antes enunciado, empezar a salir agua de la clula para compensar la posible diferencia entre las concentraciones intra y extracelulares. Al salir agua de la clula, la sal que estaba disuelta en su interior empezar a estar ms concentrada: tanto ms concentrada cuanto ms agua salga. Y es aqu cuando interviene el segundo principio, el principio de descenso del punto de congelacin. Y es que al estar ms concentrada la disolucin salina intracelular, la temperatura a la que se formar hielo desciende: ser ms difcil que el agua de dentro de la clula se congele y dae sus estructuras. As, mientras enfriemos poco a poco, el proceso continuar indefinidamente: crecer el hielo extracelular, saldr agua de la clula para compensar las concentraciones salinas dentro y fuera, se concentrar la sal dentro de la clula y descender an ms la temperatura necesaria para que se forme hielo dentro. Por ello, con una velocidad de enfriamiento suficientemente lenta podemos evitar por completo la formacin del daino hielo intracelular. TEORA CRIOBIOLGICA: En 1866 Mantegazza observo que los espermatozoides sobrevivan el enfriamiento a -17C. Pero no fue hasta 1949 (83 aos despus) en que Polge, Smith y Parkes descubrieron los efectos crioprotectores del glicerol sobre los espermatozoides y otras clulas de varias especies. Esto abri el campo a una serie de descubrimientos subsecuentes que formaron la base de la actual teora criobiolgica. En sntesis, criopreservar una clula cualquiera consiste en exponerla primero a una solucin salina hipertnica simple que contiene una sustancia crioprotectora permeable (por ejemplo, glicerol) y una no permeable (la sacarosa, por ejemplo). Esta exposicin breve va a hacer que la clula se deshidrate y que el agua intercelular sea reemplazada por la sustancia crioprotectora permeable. Luego la clula ser enfriada en una mquina hasta -7C (entre -6C y -9C segn cada protocolo y el material que se desee congelar). En este punto el contenido ser enfriado abruptamente y se disparar la formacin de hielo en la solucin extracelular. A partir de aqu se iniciar un descenso lento hasta por debajo de -30C donde ir aumentando paulatinamente la tonicidad de la solucin (es decir, se har cada vez ms hipertnica porque habr cada vez ms hielo y la sal se ira concentrando en el crioprotector remanente aun en estado lquido, lo que deshidratara an ms la clula). Luego de -30C se podr sumergir directamente en nitrgeno lquido (-196C) para ser almacenada casi, en trminos prcticos, indefinidamente. Esta temperatura vitrificar la pequea cantidad de agua remanente, evitando la formacin de los peligrosos cristales de hielo. El hielo tiene otra oportunidad de formarse: cuando se quiera descongelar el material. Para evitarlo habr que, a la inversa del congelamiento, hacerlo lo ms rpido posible para no dar lugar a que el agua vitrificada que se est licuando se convierta en cristales de hielo. Luego habr que rehidratar el material pasndolo por sucesivas soluciones cada vez ms isotnicas. La formacin de hielo comienza en el exterior celular (de -2C a -5C). Tras ello, dependiendo de la velocidad de enfriamiento, se pueden producir distintos resultados: a) Si el proceso de enfriamiento es suficientemente lento, entonces no se forma hielo dentro de la clula. Sin embargo las causas de la muerte celular vienen provocadas por una excesiva deshidratacin de esta, que da lugar a una reduccin de su volumen (en algunos casos irreversible). b) Si se enfra a una velocidad intermedia entonces s se produce hielo intracelular, ya que la clula no se deshidrata suficientemente y por tanto el descenso del punto de congelacin no llega a ser el necesario. c) Cuando se enfra a velocidades muy altas se produce la vitrificacin. El rgimen de velocidades de enfriamiento ocurre velocidades desde unidades a decenas de miles de grados por segundo. Estas velocidades tan altas consiguen la vitrificacin, lo que conlleva la no formacin de hielo a la vez que la no deshidratacin celular. Aun cuando esta tcnica no es en principio aplicable a un rgano

(dada la conductividad trmica finita de este), si que ha podido ser implementada en unos casos muy concretos, comprobndose la validez de dicha hiptesis. El Cryotop es un contenedor especial que consiste en una fina lmina para lograr el mnimo volumen a ser sometido a enfriamiento y descongelacin que permite un resultado superior al 99% de supervivencia. Posee una tapa plstica para proteger a ovocitos y embriones de daos fsicos y contaminacin de todo tipo durante su almacenamiento en nitrgeno lquido. El Mtodo Cryotop es simple, repetible, seguro y fcil para todos. Este mtodo est actualmente siendo usado en 50 pases y ha sido aplicado a ms de 100.000 casos clnicos para ovocitos y embriones desde hace 8 aos. Es el mtodo ms usado de criopreservacin que ha demostrado las mejores tasas de supervivencia. Fue desarrollado por el Dr. Kuwayama en Advanced Medical Research Institute of Kato Ladies Clinic, el centro de IVF ms grande del mundo actualmente. En la vitrificacin las clulas son equilibradas durante 15 minutos en solucin de etilenglicol; posteriormente, durante 45 segundos como mximo se sumergen en solucin de vitrificacin, se toman con poca solucin de vitrificacin y se cargan en el Cryotop u otros; inmediatamente, ste se sumerge en nitrgeno lquido para almacenarlo hasta el da de la transferencia. Para la desvitrificacin, el Cryotop se sumerge durante un minuto en solucin de desvitrificacin a 37C, luego se coloca durante tres minutos en solucin diluyente y, finalmente, se lava por 10 minutos en solucin de lavado. CRIOPROTECTORES Solucin base. La solucin de criopreservacin es preparada usualmente en medios con un pH estable que oscila entre 7,2 y 7,4. Para tal fin, se usan con xito medios de cultivo embrionarios como el medio de cultivo TCM-199 (1996) el medio HEPES-buffered Ham's F-10 (2003). Sin embargo, el medio simple de Buffer Fosfato Salino (PBS) es el ms utilizado, muchos autores reportan una mayor tasa de desarrollo in vitro en embriones vitrificados con medio a base de PBS suplementado con un medio h-CM (2003). Agentes crioprotectores. Los embriones sobreviven a la vitrificacin solamente cuando son suspendidos en una solucin con uno o varios solutos crioprotectores, ya que el enfriamiento a temperaturas subcero sin proteccin, matara a la mayora de las clulas inmediatamente, debido a daos causados por el crecimiento intracelular de cristales de hielo. Dicha solucin crioprotectora debe vitrificar a una tasa repetible al enfriarse, permanecer vtrea al calentarse y no debe ser txica para los embriones durante el perodo de exposicin antes de la vitrificacin y durante el calentamiento. Es necesario incluir los agentes crioprotectores en la solucin de vitrificacin, ya que previenen el dao celular tanto en el proceso de enfriamiento como en el de calentamiento. En general, cuando los embriones son expuestos a un crioprotector, estos inicialmente se contraen por prdida de agua, es decir, se deshidratan debido a la hiperosmolaridad inicial de la solucin extracelular, y adems porque los embriones son ms permeables al agua que a los crioprotectores. Para tal fin, existen tres grupos de agentes crioprotectores: Un primer grupo de crioprotectores de bajos pesos moleculares y permeables; entre ellos se encuentra el metanol, el etilenglicol, el propilenglicol, el dimetilsulfxido, el 2,3 butanediol, el glicerol, y otros alcoholes. Un segundo grupo de crioprotectores de bajos pesos moleculares y no permeables, como la galactosa, la glucosa, la sacarosa, la trehalosa y otros azcares. El tercer grupo est constituido por crioprotectores de alto peso molecular y no permeable, entre los que resaltan la polivinilpirrolidona, el alcohol polivinlico, el hialuronidato de sodio y otros polmeros. La presencia de crioprotectores permeables de bajo peso molecular es absolutamente necesaria durante el proceso de criopreservacin. La mayora de stos, son capaces de penetrar al embrin a temperatura ambiente o superiores, siendo su penetracin parcial, requisito indispensable para su proteccin. Sin embargo, la penetracin completa del crioprotector dentro de la clula no es necesaria, ya que puede provocar toxicidad qumica y dao osmtico. Para alcanzar la vitrificacin a ciertas velocidades de enfriamiento, la concentracin de los solutos requerida debe ser alta, por lo tanto, la toxicidad de los solutos es de gran importancia. La toxicidad puede ser

bioqumica (causante de desnaturalizacin enzimtica) o por estrs osmtico, siendo afectadas ambas formas de toxicidad por la concentracin de los crioprotectores y por su tasa de permeabilidad. El crioprotector etilenglicol es ms permeable al embrin que el propilenglicol y ste a su vez es ms permeable que el glicerol. Este orden se relaciona inversamente con la embriotoxicidad, lo cual es una evidencia de la relacin de los componentes bioqumicos con la embriotoxicidad de los crioprotectores. En pruebas de vitrificacin, se evidenci que el etilenglicol vitrific a una concentracin de 6,5 M, el dimetilsulfxido y el glicerol vitrificaron a 5,0 M, el propilenglicol vitrific a 4,0 M y por ltimo el butilenglicol vitrific a 3,0 M. Como se observa, existen considerables diferencias entre las distintas molaridades a las cuales los crioprotectores son vitrificados. Una tasa aceptable de vitrificacin puede ser obtenida con altas concentraciones de un solo crioprotector, pero estas concentraciones son frecuentemente txicas para los embriones. El desafo, entonces, es encontrar solutos o una mezcla de solutos que permita obtener una solucin vitrificable y que no sea txica a las clulas. Generalmente, mezclas de crioprotectores vitrifican a concentraciones bajas, siendo as probablemente menos txicas. La ventaja en el uso de mezclas crioprotectoras es que se combinan las propiedades vitrificantes de un crioprotector con la baja toxicidad de otro. En una serie de estudios han seleccionado la mezcla de etilenglicol y glicerol como la adecuada para la vitrificacin. Se ha demostrado que los blastocitos bovinos son ms permeables a altas concentraciones de etilenglicol que de glicerol, la concentracin intracelular de etilenglicol aumenta muy rpidamente debido a su bajo peso molecular lo cual podra tornarse txico. En otro estudio, al evaluar la viabilidad in vivo de embriones de conejo post vitrificacin, de igual forma las mezclas presentan un porcentaje mayor de nacimientos. La adicin a la solucin de vitrificacin de agentes crioprotectores no permeables como los polmeros y los sacridos ha reseado que reduce la concentracin intracelular de etilenglicol a temperatura ambiente, mejora la tasa de supervivencia de embriones bovinos vitrificados, independientemente del estadio de desarrollo que presenten. La sacarosa confiere un efecto protector adicional, ya que este crioprotector, no permeable, causa una deshidratacin al embrin, con lo cual se reduce la probabilidad de formacin de hielo intracelular, concentrando macromolculas en el citoplasma y facilitando la vitrificacin intracelular. Azcares como la dextrosa y la sacarosa previenen la penetracin excesiva de otros crioprotectores al embrin, a travs de una penetracin ligera de estos sacridos a la clula a la vez que ocasionan contraccin celular. RIESGOS Durante estos dos procesos, el enfriamiento y la descongelacin, las clulas son expuestas a un nmero de factores estresantes que pueden infligir diferentes grados de dao, a saber: la toxicidad de los medios o agentes crioprotectores, las modificaciones osmticas y el efecto del enfriamiento. Citotoxicidad: Cada crioprotector tiene un mximo de concentracin en el que daa a las estructuras celulares o del tejido, debido a la excesiva deshidratacin celular o a la desnaturalizacin de protenas. Se ha comprobado que la combinacin de varios tipos de crioprotectores hace descender la citotoxicidad de estos. Formacin de cristales de hielo: Estos cristales se forman tanto fuera como dentro de la clula y son los cristales intracelulares los que comportndose como cuchillas cortan las estructuras internas de la clula, especialmente las membranas. Entre los 0C y los -30C el hielo cambia continuamente de conformacin lo que provoca que se acente el efecto "cuchilla" del mismo. Debido a estos efectos durante la congelacin se debe evitar la formacin de hielo intracelular siguiendo una serie de reglas: Deshidratar la clula. Hay que extraer el agua de la clula y sustituirla por crioprotectores que mantengan el equilibrio osmtico. Controlar la velocidad de congelacin. Hay que controlar la velocidad de congelacin para que la formacin de los cristales intracelulares sea lo menos daina posible. Si la congelacin se produce demasiado rpido se forma el hielo intracelular y si se da demasiado lento se produce el colapso celular. Ralentizar el metabolismo celular. Para ellos se trabaja a temperatura ambiente o a 4C.

Como regla general podemos afirmar que aproximadamente el 50% de las clulas que congelamos no sobrevivirn a la descongelacin por mtodos convencionales. Actualmente se ha logrado superar esta etapa y de la congelacin se ha pasado a la vitrificacin, de tal forma que con este nuevo mtodo se consigue que no se creen cristales de hielo y sobrevivan prcticamente todas las clulas inmersas en el proceso. Los principales problemas que se plantean en la actualidad son para la congelacin de vulos, entre el que destaca el desmontaje irreversible del huso meitico durante el enfriamiento: los ovocitos maduros estn bloqueados en Metafase II (segundo bloqueo meitico) donde los cromosomas estn unidos a los microtbulos del huso meitico. Este estadio es muy sensible al enfriamiento debido a que los microtbulos pueden ser despolimerizados. Esto puede conducir a un aumento de la poliploida y aneuploida cuando los ovocitos descongelados son fecundados. Pickering y col. encontraron que al enfriar ovocitos humanos a temperatura ambiente durante 10 minutos causaba danos irreversibles al huso meitico. Otros han argumentado que la perdida de cromosomas despus de congelar y descongelar ovocitos no sera tan importante como se pens, este argumento parece ser ms una crtica contra la falta de estudios de diagnstico gentico de preimplantacin en embriones generados a partir de ovocitos congelados que un argumento cientfico bien fundamentado.

Curiosamente, Songsassen et al. encontraron que haba diferencias significativas en la sensibilidad de los ovocitos al enfriamiento segn provinieran de diferentes hembras de monos Rhesus. Si esto es verdad tambin para humanos, podra explicarse entonces, en parte, porque ha sido tan difcil obtener niveles altos de supervivencia con ovocitos congelados de una manera reproducible. Los componentes del citoesqueleto se pueden despolimerizar y conducir a una alteracin en la forma y los movimientos de los orgnulos y protenas dentro de las clulas. La exocitosis espontnea de los grnulos corticales conduce a la reaccin prematura de la zona pelcida, impidiendo la entrada de espermatozoides. La fecundacin reducida debido a los efectos de los medios crioprotectores (que aumentan su toxicidad con el tiempo de exposicin y la temperatura), y el enfriamiento sobre la zona pelcida (produciendo el endurecimiento o la rotura de la zona). Activacin partenogentica debido al choque (shock) trmico o a la accin de los crioprotectores. Choque osmotico durante la deshidratacin y rehidratacin. Dao a la membrana celular. Diginia producto de la retencin del segundo cuerpo polar luego de la fecundacin. MEJORAS TECNOLGICAS Para comparar los procesos de slow-freezing y vitrificacin se realiz un estudio criopreservando blastocistos, especialmente los sometidos al trauma debido a la biopsia del blastmero para la investigacin de preimplantacin gentica (PGS). Los resultados clnicos y de laboratorio fueron comparados para determinar el efecto de las tcnicas de criopreservacin en el desarrollo e implantacin de embriones humanos. Los resultados se miden por la supervivencia despus de la descongelacin o recalentamiento, embarazo y la implantacin. La descongelacin de blastocistos congelados lentamente fue del 83% en comparacin con el 97% de blastocistos vitrificados. En 160 casos los embriones biopsiados se transfirieron y los resultados

fueron slow vs vitrificados: descongelacin (71% vs 95%), embarazo (23% vs 37%) e implantacin (26% vs 36%, P<0,05). En conclusin los resultados revelaron que la vitrificacin obtiene resultados siempre superiores en comparacin con la congelacin convencional.

Otro estudio demostr que la vitrificacin en cuatro pasos fue mejor que en un solo paso y podra mantener la integridad de los cmulos de clulas que es necesario para la viabilidad, la madurez y la competencia de desarrollo de ovocitos. Al igual que en otras etapas de desarrollo las tasas despus de la vitrificacin de ovocitos lesionados fueron menores en comparacin con el grupo control. Nuevas investigaciones ayudarn a esclarecer los mecanismos celulares y moleculares de la criopreservacin de ovocitos. Para investigar los efectos del almacenamiento en nitrgeno lquido se realizaron pruebas con ovocitos midiendo la supervivencia, la fertilizacin y desarrollo embrionario posterior a la vitrificacin y el calentamiento. Los ovocitos maduros fueron vitrificados con Cryoleaf y almacenados en nitrgeno lquido durante un periodo de 8-10 das, 90-92 das y los das 180-182, respectivamente. Despus del calentamiento, los ovocitos que sobrevivieron fueron inseminados mediante ICSI y se cultivaron durante 120 h. Se redujo la tasa de supervivencia despus del almacenamiento de la duracin mxima (90,47,9%) en comparacin a la de los otros dos grupos (97,43,0% y 98,03,3%). La tasa de fertilizacin en el grupo de 180-182 das (66,622,0%) tambin se redujo (P<0,05) en comparacin con los grupos de 8-10 das (92,210,8%) y 90-92 das (94,79,1%). Adems, el nmero de embriones en estadio de blastocisto se redujo tambin significativamente (P<0,05) despus de mucho tiempo.

APLICACIONES a) Reproduccin asistida. Criopreservar gametos y embriones nos permite almacenar material gentico en un rango de usos muy variados, desde las necesidades de preservacin de la fertilidad de los pacientes con cncer, hasta la

reproduccin de especies de inters agropecuario o la preservacin de genomas en las especies animales y vegetales amenazadas de extincin. La reproduccin asistida permite manejar el tiempo de ocurrencia de los eventos (timing) de la fecundacin y las transferencias. La criopreservacin de espermatozoides esta estandarizada, pero la de ovocitos permanece an en su fase experimental. Su desarrollo significara un importante impacto clnico ya que: Permitira la preservacin de la fertilidad en pacientes oncolgicas o en aquellas mujeres sin pareja. Reducira o eliminara la necesidad de utilizar drogas de hiperestimulacin ovrica. Evitara entonces el sndrome de hiperestimulacin ovrica. Sera una opcin teraputica para las pacientes anovuladoras. Permitira estudiar el estatus de salud de las donantes de ovocitos seis meses despus de la donacin (como se hace actualmente con los donantes masculinos). Actualmente con los estudios sobre embriones se tiende a intentar mejorar los procesos en sus puntos dbiles, estos son los procesos relacionados con el desarrollo y la implantacin del embrin en el tero materno. A nuestro entender, poco se sabe del efecto polarizado y no polarizado de las clulas del epitelio uterino en cocultivo sobre el crecimiento del embrin criopreservado. Se establece para investigar el efecto de estas monocapas con medios secuenciales cultivo de embriones de ratn vitrificado y calentado en trminos del desarrollo y la calidad del blastocisto, incidencia de la apoptosis y la expresin de genes relacionados. Los embriones de ratn se cultivaron hasta la etapa de ocho clulas cuando que fueron asignados aleatoriamente a tres grupos de tratamiento: control, no polarizado y polarizado. Despus de 96 h en el tratamiento se evaluaron los resultados mediante un anlisis de varianza para datos continuos.

En el grupo de monocapa polarizada, la calidad y la formacin de los blastocistos haban mejorado significativamente respecto a los otros dos grupos (P<0,05). La incidencia de la apoptosis y la expresin de genes relacionados, tales como Bax fue mayor en los blastocistos del grupo control (P<0,05). La abundancia relativa de Bcl-2 era similar para todos los tratamientos. As pues, la incidencia de la apoptosis se ve reducida a causa del cocultivo de los embriones con las clulas epiteliales de tero de ratn.

b) Criopreservacin de rganos y tejidos. Aunque los mtodos tradicionales de criopreservacin son efectivos para clulas y para muchos de los tejidos simples, para rganos artificiales y tejidos de estructuras ms complejas son inaceptables, vindose daados por la formacin de hielo. La vitrificacin, proceso por el cual la fase lquida de cualquier sistema vivo es convertido en un slido amorfo similar al vidrio, carente de estructura cristalina, parece ser a da de hoy la alternativa ms acertada para la criopreservacin de rganos evitando la formacin de hielo y sus consecuentes daos. Un vidrio es esencialmente un lquido que no puede fluir en rdenes de magnitud de inters para el observador, y un sistema biolgico vitrificado puede tericamente ser almacenado durante cualquier periodo de tiempo deseado debido a la ralentizacin extrema en todos los cambios en los procesos de difusin por debajo de la temperatura de transicin de estado vtreo (TG). En rganos, este proceso se consigue con la ayuda de altas concentraciones de crioprotectores. Las soluciones vitrificantes son soluciones de crioprotectores suficientemente concentrados para permitir la vitrificacin de un sistema biolgico a tasas de enfriamiento requeridas para rganos. Grandes avances han sido desarrollados en tecnologas de vitrificacin, y es posible vitrificar hoy en da un rgano entero. Sin embargo la recuperacin del rgano con completa de viabilidad tras el trasplante es todava difcil debido en gran parte a la devitrificacin. La devitrificacin es el proceso de formacin de hielo durante el recalentamiento. En el proceso de enfriamiento se forman ncleos de hielo que estn a temperaturas demasiado bajas para originar el crecimiento del cristal, sin embargo es durante el recalentamiento cuando estos ncleos encuentran temperaturas que maximizan el crecimiento del cristal de hielo. Los rganos ms estudiados han sido rin y corazn, pero ninguno ha sido recuperado de forma reproducible despus de un enfriamiento por debajo de temperaturas de -20C. Hasta la fecha, pequeos ovarios, conductos sanguneos, vlvulas de corazn, crneas y otras estructuras similares que pueden ser enfriadas y recalentadas tan rpidamente como para evitar la devitrificacin, son las nicas estructuras macroscpicas que se conocen que hayan sido recuperadas, al menos en parte, tras su vitrificacin (G. Fahy, 2009). Desde que los trabajos de Polge, Smith y Parkes demostrasen las propiedades crioprotectoras del glicerol en 1949, la criopreservacin de clulas, tejidos y rganos ha llegado a ser un rea de investigacin muy activa. Las tcnicas para preservacin de clulas en suspensin fueron aplicadas a sistemas multicelulares como piel (Billigham, 1952), crnea (Smith, 1963) y tejido endocrino (Huggins, 1968), obteniendo muy buenos resultados de recuperacin y viabilidad tras su recalentamiento. Este xito en tejidos hace que surjan intentos de desarrollar mtodos similares para criopreservacin de rganos enteros. En 1957 se perfunde por primera vez un rgano de mamfero con glicerol, enfriado y preservado a -20C de la mano de Audrey Smith (A.Smith, 1957). En estos experimentos pioneros un corazn de hmster fue

perfundido con 2M de glicerol y expuesto a -20C, tras su recalentamiento y lavado del crioprotector, algunas contracciones dbiles podan apreciarse en el rgano. Sin embargo, en los grupos de control, donde el corazn no era perfundido con ningn crioprotector, los corazones no presentaban ningn sntoma de funcionalidad tras su recalentamiento. El glicerol se aada gradualmente porque los rganos sujetos a una perfusin inmediata eran daados severamente, mientras una perfusin gradual con la misma concentracin de glicerol era mucho mejor tolerada. No obstante, cuando los corazones se exponan a temperaturas menores de -20C no se observaba ningn signo de recuperacin. Poco tiempo despus, en 1961, Smith y J.E. Lovelock (Smith et al, 1961) mostraron como el tero de un conejillo de indias, tras ser enfriado hasta -79C con una concentracin del 20% de glicerol, presentaba una habilidad contrctil normal tras su recalentamiento. Durante los aos siguientes un gran nmero de experimentos fueron llevados a cabo con corazones y ms particularmente con riones, con resultados decepcionantes de prdida completa de viabilidad, o algunos con signos parciales de viabilidad tras su recalentamiento, y muy pocos que demostraran alguna funcionabilidad del rgano en su trasplante tras recalentamiento. Una pequea excepcin es el xito de recuperacin tras criopreservacin y almacenaje durante largo tiempo de pequeos segmentos de intestinos caninos (Hamilton et al, 1967). El hecho ms importante es probablemente que la criopreservacin de rganos es un proceso altamente complejo que envuelve variables inter-independientes, algunas muy difciles de controlar. Existen algunas diferencias importantes entre rganos y clulas en suspensin que explican porque no pueden aplicarse mtodos similares para su criopreservacin. La supervivencia de las clulas tras su criopreservacin y recalentamiento dependen bsicamente de las tasas de cambios de temperatura y concentracin de las soluciones crioprotectoras. En clulas estos parmetros pueden ser variados en un amplio rango y optimizados mediante la prctica de experimentos, mientras que en rganos existen una serie de propiedades diferentes que hacen menos viable la supervivencia que vamos a enumerar a continuacin: La adicin y lavado de crioprotector en rganos puede ser llevado a cabo slo por perfusin vascular. Los procesos de perfusin pueden daar los rganos, especialmente por las altas concentraciones de crioprotectores necesarias, debido a su toxicidad y a las diferencias de presiones osmticas creadas alrededor de las clulas. Estos problemas osmticos pueden ser resueltos en clulas fcilmente mediante dilucin del medio, pero en el caso del rgano son necesarias tcnicas que permitan una perfusin gradual. El volumen de los rganos afecta a la transferencia de calor de una manera negativa: mientras las clulas en suspensin pueden ser enfriadas en contenedores con una alta relacin superficie-volumen, en los rganos, con una pequea relacin superficie-volumen, no pueden excederse de tasas de 1C/min para evitar gradientes de temperaturas dainos. Existen teoras y experimentos que muestran evidencias de que en el caso de rganos bajas tasas de enfriamiento son preferibles, ya que el rgano est formado por varias clulas y no todas estn en contacto con el medio extracelular. Adems en el caso de los rganos, estn formados por distintos tipos de clulas, cada cual requiere una determinada velocidad de enfriamiento para su supervivencia ptima. Afortunadamente, la alta concentracin de crioprotectores necesaria hace que la supervivencia dependa en menor medida de las tasas de enfriamiento. Para clulas individuales el hielo extracelular no produce daos, pero no es as en el caso de los rganos. Los rganos estn formados por clulas que forman parte de estructuras y tienen conexiones que pueden ser daadas por cristales de hielo extracelulares, provocando as daos en el rgano. Todas estas diferencias hacen que se hayan tenido que desarrollar distintos mtodos distintos de criopreservacin han tenido que ser desarrollados en el caso de rganos. Hasta la fecha se han aplicado mtodos de vitrificacin en rganos enteros con pobres resultados. Sin embargo en un reciente trabajo (2009), Gregory Fahy present los resultados de un rin de conejo vitrificado que fue posteriormente trasplantado sin presentar rechazo alguno y con evidencias de funcionalidad. En 1998, Fahy empez a estudiar cmo obtener mejoras en el control de la toxicidad de los crioprotectores, del proceso de nucleacin y del crecimiento de hielo. Sus estudios se basan en la tolerancia de las muestras de distintas mezclas de crioprotectores perfundidas a distintas temperaturas, siempre probando la toxicidad en riones de conejo. Una de sus soluciones vitrificantes con mejores resultados es la denominada M22, donde el nmero hace referencia a la temperatura de incubacin de dicha solucin (-22C).

Segn la ONT, organismo que demanda de los bancos de tejidos espaoles, de las 768 bsquedas iniciadas en 2010, 13 fueron de sangre de cordn umbilical, 224 de medula sea/sangre perifrica y 531 de MO/SP y SCU simultneamente, la distribucin a lo largo de estos ltimos aos. Actualmente Espaa dispone de una tasa de 16,33 bsquedas de DNE iniciadas/pmp/ao.

Durante el ao 2010 se han realizado un total de 399 trasplantes alognicos no emparentados, en los que en 80 se emple mdula sea, en 178 sangre perifrica y en otros 141 sangre de cordn umbilical. Destaca el notable aumento del empleo de sangre de cordn umbilical durante los ltimos aos, as como el uso de sangre perifrica; respecto a los trasplantes de mdula sea, despus de unos aos en los que se poda observar una tendencia descendente, se ha ido produciendo un ligero aumento desde 2006, pasando de los 30 realizados en 2005 a los 80 de 2010.

Esta informacin corresponde a CryoBioTech, que es un grupo de investigacin centrado en la criopreservacin, situado en la Escuela Superior de Ingenieros de la Universidad de Sevilla, Espaa. Su objetivo es tratar de comprender mejor la fsica oculta tras el campo de la criobiologa. Fundado por el profesor Ramn Risco (Univ. Sevilla, Espaa) en 2004, este grupo estudia diferentes formas para lograr el almacenamiento a largo plazo de material biolgico: las clulas y tejidos. El grupo est formado por investigadores y alumnos con gran inters.