8. El manitol y la sacarosa le dan las mismas caractersticas al producto liofilizado si ste es diferente? En qu te basas para tu respuesta?

Si, debido a los resultados obtenidos en Long (2009) y Cao (2013), ya que para la estabilidad de la actividad hidroperxido liasa de Amaranthus tricolor Long (2009), la sacarosa demostr ser un lioprotector ms eficaz mejorando la termoestabilidad del producto liofilizado, en cambio el manitol disminuye la estabilidad trmica inactivando la hidroperxido liasa que se encuentra en el extracto de Amaranthus tricolor. Por otra parte el manitol resulto ser un mejor aditivo en el diseo racional de liofilizado de alta concentracin de protenas Cao (2013), ya que brindaba menores tiempos de reconstitucin de las tortas liofilizadas parcialmente cristalinas, es decir, las tortas con manitol parcialmente cristalinas tienen una mejor capacidad de humectacin durante la reconstitucin. Por lo tanto la sacarosa y el manitol si proporcionan las mismas caractersticas y son mejores aditivos cuanto se trata de un producto liofilizado diferente. Aqu est la traduccin de algunos prrafos de los 2 artculos por si tiene dudas o quieren agregarle ms a la respuesta jeje.. PD: la traduccin esta medio fea pero si les sirve :p Estabilidad de la actividad hidroperxido liasa de Amaranthus tricolor (Amaranthus mangostanus L.) hojas: la influencia de los aditivos seleccionados RESULTADOS: hojas Amaranthus tricolor fueron identificados como fuente particularmente rica de la actividad 13-HPL. La adicin de 100 g L-1 de sacarosa y trehalosa a HPL microsomal antes de la liofilizacin podra retener la actividad enzimtica casi el 100%, en comparacin con slo el 20% para el control liofilizado. El HPL microsomal liofilizado que contiene sacarosa mantiene plena actividad, incluso para 40 das de almacenamiento a -20 C. Para la solucin HPL, glicerol fue eficaz para la estabilidad a largo plazo a -20 C. Por otra parte, Poyols (sacarosa y trehalosa) y de aminocidos (glicina) mejoran la termoestabilidad de laminado de alta presin, mientras que KCl y poliol manitol disminuyeron la termoestabilidad de HPL. Efecto del aditivo durante la liofilizacin de HPL microsomal Parece que la crioproteccin con glicerol no puede asegurar la estabilidad de almacenamiento a largo plazo de HPL, por consiguiente, la liofilizacin se considera para lograr un laminado de alta presin estabilizada. Como es sabido, laminado de alta presin se localiza en las membranas de los cloroplastos del sobre 12, y 0,5% (v / v) de Triton X-100 (usado como un detergente) se ha aadido para solubilizar la enzima de las membranas. Nuestros experimentos preliminares revelaron que la liofilizacin de detergente que contiene extracto de laminado de alta presin con algunos aditivos lioprotectores tradicionales no podra mejorar significativamente la recuperacin de la enzima despus de la redisolucin en buffer, la prdida de 60% de su actividad. Por lo tanto, los efectos de diferentes aditivos lioprotectores se investigaron en el mantenimiento de la actividad HPL microsomal de Amaranthus tricolor durante la liofilizacin. La figura 2 resume el efecto de diferentes aditivos selectivos sobre las actividades de HPL microsomales durante liofilizacin. En cuanto a la recuperacin de la actividad HPL, el orden de los efectos protectores de los aditivos estudiados fue de sacarosa, trehalosa, lactosa, dextrano 20 000, y manitol. La serie PEG (PEG 4000 y 6000), que cristalizan fcilmente durante la liofilizacin, Sin embargo, inactiva Amaranthus tricolor HPL microsomal. En la mayora de los casos, sacarosa y trehalosa eran los estabilizadores ms eficaces entre los aditivos lioprotectores seleccionados. La presencia de los 100 g L-1 de sacarosa y trehalosa podran mantener 98,50% y 94.87% de actividad de HPL, respectivamente, en comparacin con slo el 19% de themicrosomal HPL liofilizado control. Teniendo en cuenta las

caractersticas de datos y coste, se utiliza la adicin de sacarosa (100 g L-1) en el estudio de estabilidad a largo plazo. Muchos estudios han indicado que la sacarosa y la trehalosa son lioprotectores eficaces para ambas actividades enzimticas y organismo membranes.17, 19 Leslie et al.17 indic que la adicin de 100 mmol L-1 trehalosa a Escherichia coli, antes de la liofilizacin, dio como resultado casi un aumento de 10 veces en las clulas supervivientes en comparacin con la de su correspondiente control de liofilizado. Chefson et al.19 inform de que a muy alta relacin de azcar 5-10 g kg-1 enzima permite la retencin de ms del 90% de la actividad enzimtica de CYP3A4 tanto para sacarosa y trehalosa despus de la liofilizacin. Estos autores tambin reportaron que el manitol tuvo un efecto lioprotector mucho ms dbil, que apenas aument la actividad residual de la enzima CYP3A4, en comparacin con otros disacridos. Tambin se investig el efecto de diferentes aditivos, incluidos los disacridos, polioles, listones arena aminocido, en HPL de Amaranthus tricolor (fig. 3). Glicina, sacarosa y trehalosa, lo que podra mejorar la termoestabilidad de la enzima y glicina, fueron los ms efectivos, y con un 58% de actividad enzimtica residual a 50 C. Por otro lado, el glicerol no tena casi ninguna i nfluencia en la termoestabilidad. Sin embargo, manitol y KCl mostraron un efecto de inactivacin en HPL durante el tratamiento temperatura. En particular, la adicin de KCl no slo actividad HPL inactivo pero tambin disminuy significativamente su termoestabilidad. El efecto termoestabilizador de sacarosa ha sido reportado para la proteccin de soya Tipo de LOX1B (72,5 C, 2 min) 33 y LOX semilla de guisante (70 C, 8 min) 36 como debido al aumento de las interacciones hidrfobas en la ausencia de la aditivo. La trehalosa fue demostrado ser un aditivo notable en la estabilizacin de la estructura de la enzima y la funcin contra la inactivacin trmica. Sola-Penna y Meyer-Fernandes34 propusieron que la trehalosa podra aumentar la temperatura de transicin (? Tm) a una medida mxima y por lo tanto preservar la actividad enzimtica durante el tratamiento trmico. El mecanismo de proteccin de estos protectores tradicionalmente se ha atribuido a 'hydration'37 preferencial de la enzima, lo que sugiere que la exclusin de los cosolventmolecules de la superficie de la protena condujo a una reduccin al mnimo de la superficie de la protena sin cambiar su conformacin. Por otro lado, la inactivacin de manitol y KCl en HPL podra ser debido a la agregacin de laminado de alta presin en la solucin acuosa, el cual fue causado por la excesiva concentracin de los aditivos. La presencia de 100 g L-1 de KCl, que podra quitar la capa de agua esencial que rodea la molcula de enzima, 28 condujo a una visible precipitacin enzimtica que se produjo despus de incubacin a 45 C durante 10 min. El efecto directo de las estructuras moleculares de los aditivos en la propia enzima, al unirse, ya sea en o cerca de su sitio activo en vez de excluir de su superficie, tambin puede explicar la disminucin de las actividades de HPL. CONCLUSIN Hojas Amaranthus tricolor son una excelente nueva fuente de actividad 13 - HPL . La estabilidad de extracto de HPL se mejor en presencia de glicerol , con aproximadamente 80 % de retencin de actividad despus de 20 das de almacenamiento a -20 C. Por la adicin de 100 g L - 1 de sacarosa y trehalosa antes de la liofilizacin , la actividad HPL microsomal se mantuvo casi sin cambios , mientras que se observ inactivacin significativa en enzima y sin aditivos . Por otra parte , HPL microsomal liofilizado con sacarosa retuvo 86 % de la actividad de residuo despus de 50 das . El estudio trmico sugiri que 100 g L - 1 de glicina era el aditivo ms adecuada para la estabilizacin de la actividad laminado de alta presin, mientras que la misma concentracin de KCl y manitol disminuye la estabilidad trmica del laminado de alta presin . Estos resultados sugirieron que el glicerol, sacarosa y glicina son alternativas potencialmente superiores para la estabilizacin de enzimas para producir saborizante , a saber, HPL . Este conocimiento es esencial para facilitar su

purificacin andutilisation asabiocatalyst inproducing aldehdos notas verdes, que ahora estn siendo investigados por nuestro grupo de investigacin.

Diseo racional de liofilizado alta concentracin de protenas formulaciones de atenuar el problema de la reconstitucin lento con estrategias multidisciplinarias Un nmero creciente de terapias de protenas requieren la administracin crnica a dosis altas ( > 200 mg ) por inyeccin subcutnea ( sc ) . Debido a la limitacin de inyeccin de volumen ( < 1,5 ml ) asociada con la administracin sc , las formulaciones de alta concentracin de protenas en o superior a 100 mg / ml se requieren para lograr la dosis . Desarrollo de una formulacin de protena de alta concentracin puede ser un reto debido a aumento de la agregacin en mayor concentracin y / o la inestabilidad qumica , que hace necesario el desarrollo de la formulacin liofilizada para los productos farmacuticos de alta concentracin de protenas . Desafos nicos , como el tiempo de reconstitucin largo para un producto farmacutico de alta concentracin de protenas liofilizadas , pueden limitar el uso prctico y comercializacin comercial del producto . En este trabajo se presenta un enfoque sistemtico para desarrollar una formulacin de protena liofilizada alta concentracin . La atencin se centra en lograr tiempos de reconstitucin razonables con estrategias multidisciplinarias . Muchas estrategias han demostrado proporcionar una mejora nominal en tiempos de reconstitucin , tales como la adicin de agentes humectantes en los diluyentes , la incorporacin de etapas de annealing de alta en el ciclo de liofilizacin y la reconstitucin de bajo vaco . La estrategia de la reconstitucin de la reduccin de volumen de diluyente , sin embargo , ha permitido a disminucin significativa en el tiempo de reconstitucin (4 a 7 veces ) de las formulaciones liofilizadas de alta concentracin de protenas . El estabilizador y el agente de aglomeracin fueron sacarosa y manitol, respectivamente, en los niveles de ambos sacarosa 2% (w / v) y manitol al 4% (w / v) o 4,5% de sacarosa (w / v), manitol 2,5% (w / v ). Todas las formulaciones contenan 0,01% de polisorbato 20 como surfactante. Agua estril para irrigacin (WFI) (Baxter, Deerfield, IL, EE.UU.) se utiliz como diluyente para reconstituir las tortas de protenas liofilizadas. 3.1. estrategias de Estabilidad Las formulaciones de protenas liofilizadas de alta concentracin por lo general incluyen la protena, un estabilizador de disacrido, tal como sacarosa, tampn, y a veces un pequeo poliol de peso molecular. Excipientes tales como azcares y polioles se utilizan para mitigar la agregacin de protenas mediante la estabilizacin de la conformacin nativa de la protena. Shire et al. se describe un mAb1 liofilizado, que mostr aumento de la estabilidad con el aumento de cantidad de sacarosa a temperatura ambiente controlada (30 C). La alta cantidad de sacarosa en la formulacin se preferidos dados sus efectos estabilizadores en la inhibicin de la agregacin . Sin embargo , la alta concentracin de protenas y alta en sacarosa inevitablemente llevaron a largos tiempos de reconstitucin y los ciclos de liofilizacin prolongados para asegurar un secado completo . El impacto de la concentracin de protena en los tiempos de reconstitucin se observa claramente en la figura . 2 . A medida que la concentracin de protena aument de 10 mg / ml a 100 mg / ml , el tiempo de reconstitucin aument exponencialmente desde menos de 1 min a 12-15 min . Curiosamente , a mayor sacarosa y la combinacin de menor manitol tambin afectaron la cintica de la reconstitucin de tortas liofilizadas de alta concentracin de protenas . Para la formulacin que contiene menos sacarosa y ms manitol ( 2 % de sacarosa y manitol al 4% frente a 4,5 % de sacarosa y 2 % de manitol ) , el tiempo de reconstitucin fue significativamente menor , 3 min frente a 12-15 minutos , incluso a la misma concentracin alta en

protenas de 100 mg / ml . Esto indic un efecto sinrgico de la concentracin de protena y el excipiente en el tiempo de reconstitucin . No se prefirieron El tiempo de reconstitucin de largo y una variabilidad significativa de la formulacin de alta concentracin liofilizado , que nos llev a investigar estrategias multidisciplinares para mejorar el tiempo de reconstitucin . Tres analistas realizaron los estudios de reconstitucin utilizando los tres procedimientos de reconstitucin basado en el programa de rotacin en la Tabla 1. Cada procedimiento se repiti cuatro veces en el mismo tipo de muestra por el mismo analista para evaluar la repetibilidad del procedimiento. Por otra parte, tambin se evaluaron los efectos de concentracin de protena sobre el tiempo de reconstitucin en tres concentraciones diferentes de protenas, 80 mg / ml, 85 mg / ml, y 100 mg / ml. Las soluciones se formularon con 4,5% de sacarosa (w / v) y 2,5% de manitol (w / v). El anlisis (Fig. 3) mostr los procedimientos de reconstitucin tuvieron un impacto significativo sobre el tiempo de reconstitucin. Como era de esperar, la variabilidad de los tiempos de reconstitucin siguiendo diferentes procedimientos fue ms prominente para las formulaciones de mayor concentracin de protenas, que tenan un tiempo ms largo promedio de la reconstitucin. 3.4. Modificacin del proceso de liofilizacin Annealing muestras durante la etapa de congelacin se ha demostrado para promover la cristalizacin de excipientes aglutinantes (por ejemplo, manitol y glicina) y ofrece mejoras en las caractersticas del producto y la tasa de secado primaria [19]. Tambin hay evidencia anecdtica de que el annealing puede mejorar el tiempo de reconstitucin de la formulacin de alta concentracin de liofilizado [6]. Azul et al. mostrar mediante la incorporacin de una etapa de annealing durante la congelacin que pueden reducir el tiempo de reconstitucin de un mAb liofilizado 68 a 47 min a una concentracin de 100 mg / ml. Manitol puede cristalizar durante la liofilizacin, y este excipiente se incluye en la formulacin como un agente de aglutinacin. La literatura ha demostrado protena ms alta y las concentraciones de sacarosa puede inhibir la cristalizacin manitol durante la liofilizacin [20,21]. Nuestros estudios confirman estas observaciones, como hemos visto disminuido cristalinidad de los medicamentos liofilizados en protenas y concentraciones de sacarosa (Tabla 2). Entre los datos ms interesantes fueron los tiempos de reconstitucin de 100 mg / ml de protena formulaciones con dos manitol diferente a las relaciones de sacarosa (resaltado en la Tabla 2). Se observ una diferencia de 4 veces en los tiempos de reconstitucin entre las dos formulaciones a 100 mg / ml nivel de protena. La formulacin con una alta relacin de manitol a sacarosa (02:01) tena un tiempo de reconstitucin mucho ms rpido de una torta parcialmente cristalino, mientras que la formulacin con baja relacin de manitol a sacarosa (aproximadamente 1:2) se tom el tiempo mucho ms largo para reconstituir la torta amorfa. Con base en estos resultados, se hipotetiz que la cristalizacin manitol podra ayudar a reducir el tiempo de reconstitucin. Para probar esta teora, se intent inducir la cristalizacin de manitol a travs de annealing a temperaturas ms altas en los ciclos de liofilizacin en dos etapas diferentes: la etapa de congelacin y la fase de secado secundaria. En la etapa de congelacin, se estudiaron tres diferentes temperaturas de recocido y evaluamos su impacto en tiempo de reconstitucin. Para la etapa de recocido, se llevaron a cabo las muestras durante 4 horas a? 15? C,? 12? C,? 10? C antes del secado primario dentro de los ciclos de liofilizacin. Las muestras generadas usando un ciclo liofilizado sin el annealing se utilizaron como control. Formulaciones de alta concentracin de protenas por lo general requieren cantidades relativamente grandes de estabilizador, tal como sacarosa, para una estabilidad ptima. Sin embargo, los tiempos de reconstitucin lentas se observan comnmente en las formulaciones de alta concentracin de protenas que contienen alta sacarosa niveles. En este artculo se presenta un enfoque para acelerar la reconstitucin de protenas de alta concentracin tortas liofilizadas disolviendo inferiores de concentracin de protenas tortas

liofilizadas con menos volumen de diluyente que la del volumen de llenado preliofilizada originales. Una revisin tcnica de los fundamentos de la reconstitucin de las tortas liofilizadas se justifica con el fin de entender cmo funciona este mtodo. Nuestra observacin indica los tiempos de reconstitucin estn altamente correlacionados con la cristalinidad de las tortas liofilizadas. Las tortas liofilizadas que eran al menos parcialmente cristalinos se reconstituyeron mucho ms rpido que las tortas que eran amorfos. Las tortas cristalinas parecan absorber el medio de disolucin inmediatamente durante la reconstitucin. El componente de formulacin que se cristaliz en la torta liofilizada fue manitol, conocida por proporcionar la aglutinacin para componentes de la formulacin amorfos a colapsar durante el annealing y para mantener la integridad de la torta. Tortas con manitol parcialmente cristalinas tienen una mejor capacidad de humectacin, y durante la reconstitucin, la estructura de la torta del ncleo era ms accesible por medio de la reconstitucin de los amorfos. Tenga en cuenta que la correlacin entre parcialmente cristalinidad de las tortas liofilizadas y mejoradas propiedades de reconstitucin como se describe anteriormente est predominantemente restringido a formulaciones con concentraciones muy bajas de protena o con baja relacin de manitol a sacarosa , que puede no tener una estabilidad aceptable . Las formulaciones a altas concentraciones de protena y alta de sacarosa a proporciones manitol inhiben la cristalizacin manitol , lo que conduce a las tortas liofilizadas tpicamente amorfos . Desde tortas amorfos generalmente se disuelven significativamente ms lenta en comparacin con las tortas cristalinas , se requiere otra estrategia para la mejora de la reconstitucin . Para una concentracin de protenas de alta tortas amorfos , hemos demostrado que el tiempo de reconstitucin podra reducirse significativamente mediante la disolucin inferiores de concentracin de protenas tortas liofilizadas con un volumen de menos diluyente que la del volumen de llenado de pre - liofilizada originales . Este enfoque ha demostrado ser eficaz incluso para muestras liofilizadas completamente amorfas que no contienen manitol en la formulacin .