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cidos nuclicos: estructura y

funcin
INTRODUCCIN
El dogma central de la biologa
molecular incluye los tres procesos en los
que se usa la informacin gentica del
organismo, replicacin, transcripcin y
traduccin. Son mecanismos gracias a los
cuales se generar una nueva copia del adn a partir del material inicial. As se podr
transmitir este a la siguiente generacin
Mediante la transcripcin pasaremos el DNA a RNA, una molcula intermediaria
que, mediante la traduccin, producir la sntesis de protenas.
Los dos primeros procesos, la replicacin y la
transcripcin se darn en el ncleo. El RNA ira al
citoplasma donde se va a dar la traduccin. Las
protenas sintetizadas formarn la maquinaria celular
que llevar a cabo las funciones del organismo.
Esta transmisin de la informacin desde el DNA
hasta la formacin de protenas se conoce como
dogma central de la biologa molecular.
En algunos virus tambin se podr dar la
transcripcin desde el RNA al DNA y la replicacin
del propio RNA (lneas discontinuas)
CONCEPTOS I MPORTANTES
Genoma: es el material que contiene la informacin gentica completa de un
organismo. Generalmente es DNA (hay excepciones como algunos virus). En el genoma
puede haber una sola molcula o puede estar distribuida la informacin en muchas
molculas de DNA. Este genoma puede ser nuclear si est en el ncleo, aunque tambin
hay que tener en cuenta el DNA que se encuentra en las mitocondrias
El genoma se divide en unidades funcionales o segmentos, son los genes. Estos
genes son unidades funcionales del genoma. Se transcriben para dirigir la sntesis de
productos funcionales, RNA o protenas que forman parte de la maquinaria celular.
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Se ha visto que hay RNA que no necesita transcripcin y que tambin puede tener
funciones.
Los cidos nucleicos tendrn un papel fundamental en estos procesos como soporte
fsico y transmisor de la informacin gentica.
CARACTERSTICAS DE LOS CIDOS
NUCLEICOS, DNA y RNA
Los cidos nucleicos estn constituidos por monmeros, los nucletidos. Estos se
agrupan y forman polinucletidos, los cidos nucleicos.
Cuando se une una base nitrogenada y un azcar se formar un nuclesido. Al
unirse un fosfato a este se formar un nucletido. Estos nucletidos son los monmeros
de los cidos nuclicos.

Bases nitrogenadas: son compuestos cclicos. Se repiten en los cidos
nucleicos dando lugar a diferentes secuencias. Hay dos tipos:
Purnicas: tiene dos anillos. Son la adenina y la guanina. Ambas aparecen
tanto en el DNA como RNA
Pirimidnicas: estn formadas por un solo anillo. Son la citosina, timina y
uracilo. La timina solo estar en el DNA y el uracilo solo en el RNA

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Azcar: son pentosas, se encuentran en forma cclica al reaccionar el carbonilo y
el grupo alcohol del carbono 4. Los carbonos de las pentosas se denominan prima
para diferenciarlos de los tomos de las bases nitrogenadas.
Ribosa: Se encuentra en el RNA, tiene un grupo OH en el carbono 2
2 desoxirribosa: Se encuentra en el DNA, tiene un grupo H en el carbono 2
Debido a esta diferencia el RNA es mucho ms reactivo y ms fcil de degradar (ej:
condiciones alcalinas). El DNA ser ms estable, lo que permite que se transmita de
forma intacta y con los menos cambios posibles a la siguiente generacin.








NOMENCLATURA

+ fosfato
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Con bases pricas para nombrar los nucleosidos se aade osina y en las
pirimidnicas se aade idina.
Para nombrar los nucletidos se aade el nmero de fosfatos al nombre del
nuclesido.
POLI MERI ZACI ON DE NUCLEOTI DOS
Tiene lugar por la reaccin del un grupo 3OH de uno de los nucletidos con el
5fosfato de un nucletido trifosfato mediante la DNA polimerasa (o RNA polimerasa).
El fosfato que permanece ser el que se encuentra en posicin alfa, y se libera
pirofosfato Se genera un enlace fosfodiester. El grupo fosfato genera un puente entre
dos nucletidos.
Tan en el RNA como DNA tendremos cadenas en las cuales hay un esqueleto lineal
de azcar-fosfato de los que salen las bases como si fueran ramas (adenina, citosina,
guanina).

CARACTER STI CAS
Estas cadenas sern hidroflicas y se encuentran ionizados en condiciones
fisiolgicas.
Tendrn una polaridad porque hay un sentido 3y 5. Siempre se nombrara 5-3
porque es la direccin de sntesis.
Tambin podrn formar puentes de hidrgeno con las molculas de agua y las
cargas de los fosfatos reaccionan con iones y protenas de forma que queden
neutralizadas en el contexto de la clula.

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CONVENCI ONES PARA NOMBRAR EL DNA
Una secuencia de nucletidos posee un sentido o direccin y siempre se escribe de
5 a 3 ya que es la direccin de transcripcin y la traduccin. En el extremo 5 hay
fosfato y en el 3 un grupo OH perteneciente a la ribosa.
Suele utilizarse la abreviatura en ingles de cido (desoxi)ribonucleico (DNA y
RNA, NO ARN y ADN)
Se utilizarn las abreviaturas de las 5 bases para definir la secuencia codificante de
un gen A, G, C, T y U
La longitud de las molculas de DNA y RNA suele medirse en pares de bases
Un cido nucleico corto (<50 nucletidos) se denomina oligonucletido y uno largo
polinucletido.
Se usaran distintas representaciones ms o menos simples. Lo ms frecuente es dar
la secuencia de bases de nucletidos.

HISTORIA DEL DESCUBRIMIENTO
1871: Descubrimiento de los cidos nucleicos.
Friedrich Miescher aisl una sustancia rica en fosfato (nucleina) del ncleo de
glbulos blancos. Pudo separar en el ncleo dos fracciones, una acida (nuclena) y una
bsica (protenas). Se pens que la nuclena podra tener algo que ver con el DNA. Se
desech la idea porque se pens que con solo 4 monmeros no se podra generar todo el
material gentico

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Existen dos cepas de neumococo, una virulenta y otra no (porque est recubierta
por una cpsula). Produce neumona
Experimento de Griffith
a) Inyectaba cepa virulenta y la rata moria
b) Inyectaba la cepa no virulenta y la rata viva
c) Calentaba la cepa virulenta hasta que mora y lo inyectaba. La rata no muere
d) Inyecta cepa no virulenta ms la cepa virulenta muerta, la rata muere. Se piensa
que hay algn tipo de transferencia de la informacin de la virulenta a la no
virulenta.
Experimento de Avery, McLeod y McCarty
d) Mezclaba el DNA de las clulas muertas virulentas con las cepas no virulentas.
Todo el cultivo se transforma en virulenta. La rata muere. Haba habido una
transferencia del material gentico de unas a otras.
CONCLUSIN: el DNA es el portador del material gentico
1928: Prueba experimental de la funcin gentica del DNA.
Peter Griffith llev a cabo experimentos que demostraban que el DNA era el
material gentico. El consigui transferirlo de una bacteria a otra. Vio como la segunda
bacteria se transformaba y adquira ciertas caractersticas de la primera. No se pudo
explicar en ese momento.
1944: El DNA es el material gentico.
Avery, McLeod y McCarty llevaron a cabo experimentos que complementaban los
experimentos anteriores:

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1950: Relaciones cuantitativas entre las bases de DNA
Erwin Chargaff llev a cabo experimentos pero no
tenan claro que queran decir. Trataba distintos tipos
de clulas (bacterias, humanos) y distintos tejidos para
que se rompiese el enlace fosfodiester del DNA y
mediante cromatografa purificaba los nucletidos y los
cuantificaba..
Segn l siempre haba una relacin entre las
bases, en humanos la cantidad de adenina era igual a la
de tmina y lo mismo pasaba con la guanina y citosina.
A raz de esto se establecen las reglas de Chargaff
1) La composicin de bases del DNA varia de una
especie a otra
2) El DNA aislado de distintos tejidos de la misma
especie tiene siempre la misma composicin de bases
3) La composicin de bases de una especie no
cambia con la edad o las condiciones nutricionales o
ambientales.
4) En el DNA humano A=T y G=C, y por lo tanto A+G = T+C

1952: Difraccin de rayos X de DNA.
Rosalind Franklin obtuvo la primera imagen de difraccin de rayos x del DNA. La
cruz central indicaba que deba haber una hlice en el centro y las manchas arriba y
abajo eran las bases
1953: estructura secundaria del DNA
James Watson y Francis Crick propusieron un modelo basndose en las imgenes
por difraccin y en las reglas de Chargaff. Segn ellos el DNA est compuesto por dos
hebras que forman una hlice con azcar y fosfato en el exterior y las bases en el
interior.
Supuso el comienzo de la biologa molecular. A parte de sugerir la estructura
tambin daba datos sobre el posible modelo de replicacin. Cada una de las cadenas
servir como molde para sintetizar una nueva


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ESTRUCTURA SECUNDARIA: LA DOBLE
HLICE
MODELO DE LA DOBLE HLI CE DE WATSON Y CRI CK
Est formada por dos cadenas de nucletidos de orientaciones opuestas enrolladas
a lo largo de un eje comn. Una 5-3y otra a la inversa. Esto acomodar los
apareamientos de las bases.
El esqueleto exterior est formado por las pentosas-fosfato y el interior por las
bases nitrogenadas
El dimetro de la hlice es de 20 A, repitindose la estructura helicoidal cada 10.4
nucletidos. El apareamiento completo de bases solo se pueden establecer si los
pares de bases van girando unos con respecto a otros, aproximadamente 36 grados.
Las dos cadenas permanecen unidas por puentes de H
Solamente ciertos apareamientos entre las bases permiten la formacin de puentes
de h. El emparejamiento de bases es siempre A-T (dos puentes) G-C (3 puentes de
h) Este apareamiento explicara las reglas de Chargaff.
Estos pares de bases tendrn siempre la misma longitud (1,08 nm) lo que estabiliza
la doble hlice. Adems tendr un estructura similar en los dos pares, importante
a la hora de copiar el DNA por las DNA polimerasa, a la hora de corregir los fallos
de traduccin o transcripcin.

CARACTER STI CAS DE LA DOBLE HLI CE
El interior es hidrofbico y el exterior hidrofilico.
Es la estructura ms estable en condiciones fisiolgicas
Se generan unos surcos originados por la geometra de los pares de bases. Son
importantes en la interaccin con protenas, estas tienen que tener acceso para que
tenga lugar el metabolismo de la molcula (DNA o RNA), entrarn por los surcos
1. Surco mayor 22
2. Surco menor 12
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Est unida por:
1. Puentes de hidrgeno: una base con otra
2. Fuerzas de Van der Waals: entre pares de bases (apiladas)
3. Puentes de hidrgeno: en las cadenas fosfato
4. Interaccin con iones positivos o protenas debido a la carga negativa de
los fosfatos
Dado que A se aparea siempre con T y G se aparea siempre con C, las dos cadenas
antiparalelas son complementarias y por lo tanto una acta como molde para la otra. Por
ello se pens en un mecanismo de replicacin, mediante el cual separaban las cadenas
y se construa a partir de una de ella que serva como molde

ESTRUCTURAS ALTERNATIVAS DEL DNA
La forma comentada es la ms habitual, corresponde a la forma B. Tambin se dan
otras dos formas como la A y la Z que fue descubierta posteriormente.

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FORMA A:
Aparece en
o Condiciones de baja humedad
o Regiones de polipurinas
o Duplex DNA-RNA o RNA-RNA.
No forma nucleosomas ya que no fija histonas de modo eficiente y
dejara zonas expuestas para un mayor acceso de las protenas de
regulacin.
Se encarga de la regulacin de la expresin gnica
FORMA B:

Es la ms estable en condiciones fisiolgicas
Corresponde a la estructura descrita por Watson y Crick
FORMA Z:
Aparece en:
o La metilacin de DNA
o Concentracin inica elevada
Tiene regiones alternantes de purinas/pirimidinas
Regular la expresin gnica.

DIFERENCIAS DEL RNA CON EL DNA
RNA DNA
Ribosa: OH en C. 2 Desoxirribosa: H en C.2 (+ estable)
Base especial: Uracilo
*se pueden encontrar bases tipicas
Base especial: Timina
Longitud: 10
2
-10
3
nucletidos Longitud: 10
3
-10
8
nucletidos
Cadena lineal Forma la doble hlice
No cumple la regla de Chargaff (AU y
CG)
Cumple la regla de Chargaff (A=U y
C=G)
Muchas funciones nica funcin: depsito de la informacin
gentica.
Las funciones del RNA aparecen reflejadas en al siguiente tabla en funcin de los
distintos tipos de RNA. Los tres primeros son universales, se encuentran tanto en
organismos eucariotas como procariotas
Hay que tener en cuenta que a partir de DNA se genera el hnRNA y luego, a partir
de este el mensajero
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ESTRUCTURA SECUNDARIA Y TERCIARIA DEL RNA
En funcin de la complementariedad de las bases se puede formar una estructura
secundaria u otra. Si se unen al azar formaran el ovillo aleatorio. Tambin se podra
general una estructura de bases apiladas o un bucle autocomplementario.
Esto da lugar estructuras complejas. Son muy variadas, depender de la secuencia
del RNA del que se trate

Cuando la estructura secundaria se pliega sobre si misma origina la estructura
terciaria


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Ejemplos de la variabilidad de la estructura del RNA


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Organizacin del genoma en
procariotas y eucariotas
a) Tamao y complejidad de los genomas
b) Estructura de los genes en organismos procarioticos y eucarioticos
c) Tipos de secuencias en organismos eucarioticos
d) Organizacin fsica del genoma:
a. En procariotas: nucleoide
b. En eucariotas: cromosomas
TAMAO Y COMPLEJIDAD DE LOS GENOMAS
Hay diferencias en la organizacin en la clula.
Clula eucariotica:
Tiene compartimentos celulares rodeados de membrana. El material gentico est
en todas las clulas del organismo. El genoma estar incluido en el ncleo o en
mitocondrias (y cloroplastos en plantas). En las mitocondrias existen copias de un ADN
circular.
Clula procariota:
Suele aparecer en organismos unicelulares, vive en condiciones limitadas, no tiene
tanta informacin como la clula de un organismo eucariota. No hay ncleo y lo que se
conoce como cromosoma o nucleoide es una molcula nica generalmente y se
encuentra en el citoplasma pero no rodeado de membrana. Adems en muchas bacterias
puede haber elementos adicionales, pequeas molculas de doble cadenas conocidas
como plsmidos.
El tamao del genoma y el nmero de genes dependen del organismo.
Genoma
Las levaduras son los organismos que menos informacin gentica necesitan
porque son unicelulares y no necesitan tanta especializacin.
En funcin de la complejidad del organismo aumenta el genoma. Los anfibios
tienen una cantidad elevada y algunas plantas iguales (lirio es ms que ser humano)
Nmero de genes
6000 genes: levaduras
Hombre y ratn: alrededor de 30000
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El hombre tiene 5 veces ms genes y 200 veces ms genoma. NO hay relacin entre
nmero de genes y genoma.
ESTRUCTURA DE LOS GENES EN
ORGANISMOS PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS
La estructura de los genes es la razn por la que hay mas genes en organismos
complejos
ADN procariota:
Todos los genes con funciones relacionadas
estarn agrupados en operones habiendo muy poca
separacin entre ellos. Los elementos reguladores
estaran delante y son nicos para todos ellos, se
regula de forma sincronizada. Esto dar lugar a un
mensajero policistrnico que en un mismo mensajero
estarn incluidos todos los genes.
El genoma en organismos procariticos es muy
compacto, el DNA estar muy aprovechado y no se
pierde espacio en secuencias sin sentido. Todo es
codificante por eso es necesario menos genoma
Organismo eucarioticos pluricelulares:
No solo no estn juntos los genes
sino que adems cada gen est
interrumpido, la secuencia codificante
no se encuentra continua sino que hay
exones (zonas rojas, secuencias con
informacin) e intrones (zonas grises,
parte de un gen no codificante. Se transcriben pero no se traduce). Los intrones pueden
ser ms grandes que los exones.
Ej:



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Organizacin en distintos organismos

En las bacterias en un segmento de 20kb hay 13 genes, mientras que en el caso de
humanos en 200kb de bases solo hay tres genes debido a los intrones y a los espacios
entre genes
TIPOS DE SECUENCIAS EN LOS GENOMAS
EUCARIOTICOS.
Secuencias repetitivas:
o DNA satlite: son secuencias cortas que se repiten agrupadas multiples veces.
Se encuentran en las regiones de centrmeros y telmeros, con funcin
estructural.
o Duplicacin de genes funcionales: puede haber muchas copias de rRNA,
tRNA, genes de las histonas porque tienen que estar en gran abundancia
o Elementos de DNA mviles: son secuencias que no se encuentran juntas en una
regin sino que estn dispersas por el genoma. Podran variar de regin por el
genoma. Parece que juega un papel importante en evolucin, porque puede dar
lugar a mutaciones o cambios del genoma
Intrones y exones
Familias gnicas
o Variantes mltiples de un gen: familias que dan lugar a protenas parecidas que
tienen funciones similares pero que son diferentes. Ej: hemoglobina fetal y
adulta
o Pseudogenes: genes que no tienen funcin, sern consecuencias de evolucin,
duplicaciones o mutaciones que hacen que el gen no sea funcional pero que se
quede ah.
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Todos estos tipos de secuencias forma el genoma humano. Solo un 1% del total
sern exones, secuencias con informacin.

Tanto en procarioticos como eucarioticos las molculas de a. nucleicos son grandes
en relacin al compartimento donde estarn incluidas. En el caso del ser humano 1.8 m
de DNA entra en un ncleo de 6m
Para solucionar el problema el DNA se empaquetar, teniendo en cuenta que tiene
que ser de una forma organizada para que se pueda acceder al DNA
ORGANIZACIN FSICA DEL GENOMA
EMPAQUETAMIENTO DEL DNA EN PROCARIOTICOS: nucleoide
El material gentico se denomina nucleoide. Es un DNA circular de doble cadena
que se dispone formando lazos independientes sujetos por protenas en su base. A su
vez estos lazos interaccionan con protenas bsicas.
El lazo se enrollar sobre s mismo interaccionando con esas protenas.

EMPAQUETAMIENTO DEL DNA EN EUCARIOTICOS
Se forman nucleosomas. El DNA interacciona con protenas formando la
cromatina. Reaciona con un octamero de histonas formando el nucleosoma, que
sepliega sobre si mismo para dar lugar a las fibras de 30nm
Habr distintos niveles de plegamiento y organizacin.
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Tras los 30nm se generan lazos que interaccionan on un esqueleto central que se
van plegando
Las histonas son muy parecidas de unos organismos a otros.

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Ingeniera gentica, enzimas
a) Ingeniera gentica y sus aplicaciones
b) Estrategia general de clonacin
c) Enzimas utilizados
d) Enzimas de restriccin.
e) Estrategias que facilitan la clonacin
INGENIERA GENTICA Y SUS
APLICACIONES
La ingeniera gentica incluye las tcnicas que se encargan de la manipulacin del
DNA.
Para conocer las bases moleculares de un proceso biolgico antes se utilizaba la
bioqumica y la gentica clsica.
Gracias a la ingeniera gentica se ha llevado a cabo la unin de estas dos
aproximaciones. Se estudiarn los genes o las protenas. El objetivo final es siempre el
estudio de la funcin de la protena o gen.

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Para llevar a cabo todos los protocolos utilizamos unas tcnicas surgidas tras el
conocimiento de la forma del DNA y a partir de ah se empez a estudiar el
metabolismo del DNA
APLI CACI ONES BI OMDI CAS DE LA I NGENI ER A
GENTI CA
Conocimiento de las bases moleculares de enfermedades
Hipercolesterolemia familiar, fibrosis qusticas
Produccin de grandes cantidades de protenas humanas para terapia
Insulina, hormona de crecimiento
Obtencin de protenas para produccin de vacunas (hepatitis B) o diagnostico
(Sida)
Diagnstico de enfermedades y prediccin de riesgo de desarrollarlas
Cncer de mama asociado al BRCA, fibrosis qusticas, sndrome de Down
Medicina forense
Determinacin de identidad
Terapia gnica
Deficiencia adenosina desanimasa, talasemias, fibrosis qustica.
ESTRATEGIA GENERAL DE
CLONACION DEL DNA
La clonacin del DNA es generar copias idnticas de un fragmento de DNA.
Necesitamos seguir unos pasos:
Enzimas
Necesitamos disponer de enzimas que nos permitan cortar el DNA en fragmentos,
aislar esos fragmentos y poderlos unir a otras molculas de DNA
Vectores
Necesitamos disponer de un vector, una molcula de DNA que tiene la capacidad
de replicarse de forma autnoma. Si en una clula metes un fragmento que no se replica
por si mismo, tras la divisin celular una hija tendr el fragmento y otra no.
Generaremos el DNA recombinante. Tienen fragmentos de distinta procedencia,
por ejemplo el vector puede ser bacteriano y haber metido el DNA del ser humano.
Introduccin en la clula.
Necesitamos mtodos para introducir el ADN en una clula. Se utiliza
generalmente el escherichia coli, una bacteria que se duplica rpidamente y se conoce
todo su metabolismo, por lo que sabemos cmo actua.
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Al introducirlo en la bacteria buscamos que se duplique aumentando el nmero
Seleccin
Luego seleccionaremos las clulas que tengan en su interior el DNA recombinante
porque no siempre se introduce.
Habremos producido miles de copias de ese DNA, a veces ms de una por clula.
ENZIMAS UTILIZADOS
Hay miles de enzimas que influyen. Son aquellos que intervienen en alguna etapa
del metabolismo del DNA.

ENZIMAS DE RESTRICCIN
Los enzimas de restriccin son las utilizadas en los sistemas de modificacin-
restriccin. Estos sistemas se encuentran
en organismos bacterianos y se encargan
de la modificacin del DNA y eliminan
el DNA exgeno.
El enzima de restriccin corta el
DNA en una secuencia especfica y
genera dos fragmentos de DNA. El
enzima de modificacin modificar la
secuencia metilando alguno de los
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residuos de forma que cuando la secuencia est metilada el enzima de restriccin no
puede cortar el DNA.
En las bacterias, el sistema de modificacin cambia su DNA y no es sustrato de la
restriccin pero el que viene desde fuera s que se corta con el de restriccin. Es una
forma de la que las bacterias se protegen de sus encimas de restriccin pero si que
atacan a los que vienen de fuera.
Nosotros utilizaremos el de restriccin purificado y modificado, que lo aislamos del
de modificacin.
TIPOS DE ENZIMAS DE RESTRICCIN
Podemos encontrar varios tipos de enzimas de restriccin.
Tipo I: corta al azar en sitios a 1000 bp de la secuencia de reconocimiento. Requiere
Atp. Se encarga de la actividad endonucleasa y metilasa
Tipo II: es el nico que tiene importancia desde el punto de vista de la ingeniera
gentica, ya que corta exactamente por la secuencia de reconocimiento. No requiere
ATP. Solo actividad endonucleasa.
Tipo III: corta al azar a 25 bp de la secuencia de reconocimiento. Requiere ATP, es
un complejo que conlleva la actividad endonucleasa y metilasa.
SECUENCIA DE RECONOCIMIENTO
Las secuencias que reconocen estas enzimas son secuencias palindrmicas
(palabras o frases que se pueden leer igual desde cualquier lado). Estas secuencias
pueden variar entre 4 y 8 bases, lo ms frecuente es que sean de 6.

Estas secuencias polindrmicas generalmente se denominan con 3 o 4 letras que
indican la cepa bacteriana de la que se aisl el DNA
La flecha indica el lugar de corte de las enzimas. Algunas cortan en el eje de
simetra, en ambas cadenas en el mismo punto; y otras en cualquier otro punto.
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Las digestiones del DNA por los enzimas de restriccin generan fragmentos que
podemos separar por ejemplo mediante electroforesis. Generalmente en la electroforesis
de DNA se lleva a cabo en geles de agarosa. La acrilamida tambin se usa
para separar las protenas.
En estas electroforesis se distribuyen en bandas los fragmentos y para
poderlos visualizar se pueden marcar o teir, por ejemplo con bromuro de
etidio.
Como cualquier DNA tiene una secuencia especfica y la enzima siempre corta en
el mismo punto se generar siempre el mismo patrn de bandas. Si cambiamos de
enzima cambiarn los fragmentos obtenidos, por eso con cada enzima saldr un patrn
de bandas correspondiente a cada caso, y permite hacer un mapeo de restriccin.
Esto permite comparar DNA diferentes. Permite saber si un ADN esta mutado o no,
en funcin de si esta mutacin cambia los puntos de restriccin.



EXTREMOS RESULTANTES
Si cortan en el eje de simetra genera dos fragmentos que tienen la misma longitud,
se denominan extremos romos.

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Si el enzima no corta en la misma posicin tenemos dos situaciones (Corta entre la
primera y segunda o Corta entre la ltima y penltima) y quedan dos fragmentos con
diferente longitud, quedando fragmentos de cadena sencilla, son los extremos
cohesivos. Podrn ser 3o 5

UNIN DE FRAGMENTOS
A la hora de unir los fragmentos sern importantes
los extremos que dejan. Para la unin de extremos
cohesivos, se van a aparear los extremos de cadena
sencilla con aquellos que son complementarios.
La DNA ligasa se encargar de forma el enlace
covalente entre estas dos cadenas. Necesitar una
molcula de ATP para hidrolizarse por cada enlace
formado.
Para unir fragmentos con extremos romos habr
que modificar un poco las condiciones pero tambin
podr llevarlo a cabo la DNA ligasa.
Ser ms complicado porque no hay nada que las mantenga unidas mientras se
lleva a cabo el enlace.
Experimentalmente ser ms complicado.
En este caso los extremos no tienen que
proceder de la digestin con el mismo enzima,
pueden provenir de diferentes enzimas porque
no tienen que reconocerse. Por eso tras la
unin el resultado tendra una secuencia no
reconocida por las enzimas que lo haban
cortado antes.
Tambin lo lleva a cabo la DNA
ligasa!!
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ESTRATEGIAS QUE FACILITAN LA
CLONACIN
Creacin de sitios de clonacin mltiple
Es frecuente la creacin de sitios de clonacin
mltiple (polilinker). Consisten en un fragmento de
DNA sinttico en el que se han incluido las
secuencias de reconocimientos para muchas enzimas
de restriccin. Estas secuencias suelen ir unas al lado
de las otras y cuando se puede solapan las bases.
Este polilinker se introduce en el vector o en un
fragmento de DNA de forma que un DNA que no
reconoca las enzimas, ahora tendr muchos sitios de
reconocimiento para enzimas diversas.
Se intenta que haya un nico sitio de restriccin
para que al hacer la digestin no corte el DNA en
varios fragmentos y asi se pueda introducir posteriormente el material que queremos
clonar
Creacin de extremos cohesivos
Es ms fcil para la DNA ligasa si hay extremos cohesivos. Para conseguirlo
podemos modificar dos fragmentos con extremos romos. Se pueden usar enzimas como
la transferasa terminal, que aade nucletidos de timina en el extremo 3. Mientras
tanto en el otro fragmento, uniendo ATP a la transferasa terminal esta aade adenina,
y as se generan dos fragmentos complementarios
En el caso de que queden huecos porque no se hayan generado el mimo nmero de
nucletidos la DNA polimerasa I completara a cadena.

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Ingeniera gentica: vectores y
huspedes de clonacin
Los huspedes de clonacin son las clulas en las que se aade el gen de clonacin.
Los vectores de clonacin son los DNA en los que se introducen los genes para que
no se pierdan. Hay distintos tipos de vectores segn la longitud de los fragmentos de
DNA que queramos introducir, ya que no todos admiten la misma:

Los vectores son molculas que permiten la replicacin del fragmento de DNA que
queremos clonar. Hay que elegir el que mejor se ajuste a la longitud del gen, ya que
cuanto mayor es el DNA, ms complejo ser el trabajo con l en el laboratorio.
Los vectores tienen que tener unas caractersticas mnimas:
- Ser capaces de reproducirse de forma autnoma, es decir, que cuando la clula
se duplica el DNA tambin lo hace.
- Tener un marcador gentico de seleccin.
- Tener sitios nicos de restriccin.
- Tener DNA no esencial en cantidad mnima necesaria.
PLSMIDOS
Plsmidos bacterianos
Son molculas de DNA bicatenario circular. Los plsmidos de origen natural se
modifican para que mantengan las caractersticas bsicas esenciales de un vector y se
eliminan los fragmentos intiles de DNA para poder aadir mayor cantidad de DNA
para clonar.
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El DNA dentro de la clula puede estar de forma simbitica (utilizando la
maquinaria celular para replicarse y aportando ventajas a la clula como resistencia a
antibiticos) o de forma parasitaria (no aporta nada a la clula).
Los plsmidos tienen que tener unas caractersticas importantes:
- Un origen de replicacin en el cual los enzimas celulares inician la replicacin.
Esta secuencia es necesaria para propagar el plsmido y mantenerlo en un nivel
de 10 a 20 copias por clula.
- Dos genes que confieren resistencia a diferentes antibiticos, que permitirn la
seleccin de las clulas que contengan el plsmido intacto o una versin
recombinante del mismo.
- Varias secuencias nicas de reconocimiento (polilinker) para diferentes
endonucleasas de restriccin, que suministran los sitios por los cuales cortar el
plsmido para insertar las secuencias de DNA exgeno.
- Tener pequeo tamao, que facilita la entrada en la clula y la manipulacin
bioqumica del DNA.

Plsmidos de levaduras
Cuando se necesitan modificaciones que no pueden llevar a cabo las bacterias pero s
clulas eucariotas se utilizan los plsmidos de levaduras. Hay que encontrar un
plsmido con las mismas caractersticas bsicas y con otras adicionales:
- Origen de replicacin para eucariotas (ARS), que sea reconocido en levaduras.
- Secuencia de replicacin autnoma.
- Secuencias centromricas para que pueda repartirse el material a las clulas
hijas.
- Marcador de seleccin para el organismo en el que se vaya a introducir
posteriormente.
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Laura Esteban Luca 28
Tambin llevan el marcador y el origen de replicacin para bacterias. En levaduras se
utilizan mucho los genes como marcadores: URA3 (uracilo), HIS3 (histidina), TRP1
(triptfano), LEU2 (leucina).

Proceso
Una vez tenemos el DNA recombinante, es necesario introducirlo en la clula, lo que no
es tan fcil, ya que las clulas tienen que ser competentes.
1. Se utilizan distintos mtodos para facilitar la entrada:
a. Incubacin con iones (calcio, litio)
b. Choque trmico para hacer la membrana
ms permeable y que permita la entrada
del plsmido.
El DNA recombinante entra en la clula por
transformacin.
2. Se ponen a crecer las clulas en un medio con
ampicilina y se van creando clones. Se forman
colonias de clulas y todas llevan la misma
molcula de plsmido recombinante.
Esto nos permite separar las distintas molculas de DNA recombinante. En la
transformacin de bacterias, stas slo toman una molcula de DNA, un plsmido. De
esta forma, donde caiga una clula transformada aparecer una colonia y todas las
clulas que la forman tendrn el mismo plsmido. As se obtienen colonias distintas con
plsmidos recombinantes por separado para trabajar con ellas.
Deteccin de la colonia con el recombinante deseado
Con independencia del mtodo utilizado para introducir el recombinante en la clula, no
todas las clulas lo captan, adems de que el DNA se puede religar o unirse con otros
fragmentos y no ser ya el que fragmento que nos interesaba.
1. Inactivacin insercional: los fragmentos de DNA se introducen en el plsmido
en un lugar donde inactivan un gen del vector, de forma que as podamos
reconocerlo.
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Laura Esteban Luca 29
Normalmente se introducen dos genes de resistencia a antibiticos o sustancias y
se deja el polilinker en medio.
2. Dejamos que se produzca la tranformacin y plaqueamos en un medio de
ampicilina. Las clulas que llevan el gen de resistencia a ampicilina intacto
podrn crecer en este medio, mientras que las otras no.

3. Hacemos una rplica de las clulas que han crecido en una placa con tetraciclina.
En este caso, las clulas con el DNA recombinante no pueden crecer porque el
gen de resistencia a tetraciclina est inactivado.

4. Se comparan las dos placas y se buscan las colonias que han crecido con
ampicilina pero no con tetraciclina. Las clulas que conservan la resistencia y no
tienen DNA forneo crecern en ambas placas.
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BACTERIFAGOS (FAGOS)
El fago es un fago que infecta bacterias E. Coli. Es ms eficiente a la hora de producir
DNA recombinante y acepta fragmentos ms grandes de DNA forneo. Su utilidad se
basa en dos caractersticas principales.
- Alrededor de un tercio del genoma de no es esencial y puede ser reemplazado
por DNA forneo.
- El DNA se empaqueta en partculas de fago infecciosas slo si su tamao se
encuentra entre 40000
El fago est formado por cabeza y cola. La cabeza es una estructura proteica que
contiene el genoma (DNA bicatenario lineal). Cuando el virus va a infectar una bacteria,
interacciona con ella por la cola mediante receptores e introduce su DNA en el
citoplasma bacteriano. Una vez en el interior, el DNA se hace circular, quedando similar
a un plsmido pero ms pequeo.
Los bacterifagos tienen dos ciclos vitales segn las condiciones del medio:
Ltico: se da condiciones favorables. El DNA del fago se transcribe y se traduce
empleando la maquinaria celular para sintetizar las protenas necesarias para
formar ms cadenas vricas. Se forman nuevos fagos que, una vez formados,
salen de la clula por lisis para infectar a otras bacterias.
Lisognico: se da en condiciones alimentarias desfavorables. El DNA se integra
en el cromosoma bacteriano de forma que cada vez que la bacteria se replica, l
se replica tambin, pero sin generar nuevos virus, simplemente replicndose.
Cuando las condiciones mejoran, se retoma el ciclo ltico y, entonces, se
producir la lisis de las bacterias.









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Los vectores derivados de los bacterifagos tienen tres regiones, dos de las cuales son
indispensables. Lo que se hace es modificar el DNA del fago para que slo mantenga
las partes de su cromosoma que permiten el ciclo ltico, las dos esenciales de su
cromosoma, mientras que la parte central reemplazable es la responsable del ciclo
lisognico, que en clonacin no nos interesa. De esta forma, se reemplazan los genes de
la zona central por el DNA que queremos clonar.

Inicialmente el DNA del fago es de cadena lineal, pero luego se circulariza. Sus
extremos son cadenas lineales complementarias (como los extremos cohesivos). El
ensamblaje de virus nuevos se forma uniendo las protenas de la cabeza y de la cola,
quedando cabezas vacas y colas. Adems, aparecen concatmeros, que son molculas
con varias cadenas de DNA separadas por marcadores llamados COS.

Para llenar las cabezas con DNA, las protenas Un
y A interaccionan con los extremos COS del
concatmero e introducen la molcula en la cabeza
hasta llegar al siguiente COS, donde corta la
cadena de DNA. Entonces la cola se ensambla con
la cabeza y tenemos una partcula vrica madura.
Esta operacin puede realizarse in vitro.
Para formar DNA recombinante digerimos el DNA
de la bacteria con enzimas de restriccin que
corten el DNA de relleno, lo sustituimos por el
DNA que queremos clonar y reensamblamos la
cadena para que nuevas partculas vricas con
DNA recombinante puedan infectar otras
bacterias.
La ligasa une los fragmentos de DNA, pero no
todos los recombinantes resultantes son tiles, la
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Laura Esteban Luca 32
cadena resultante tiene que tener la misma longitud que la original del fago. Si es ms
larga o ms corta, no producir partculas vricas al entrar en la cabeza.

Deteccin de fagos
Se deja que infecten a otras bacterias y slo aquellos que las maten tendrn el DNA
recombinante, puesto que los virus que no funcionan es porque tienen cadenas de
longitud inapropiada.
A la placa con bacterias aadimos los fagos en distintos puntos. Cuando infectan a
una bacteria, los fagos replicados salen e infectan a otras, de forma que donde caiga un
fago con el DNA recombinante se producir la lisis de bacterias. El proceso de
infeccin es muy eficiente (10
9
placas de lisis/g de DNA) y ms rpido que la
transformacin en plsmidos (10
6
transformaciones/g de DNA).

CSMIDOS
Son una mezcla de plsmido y fago y permiten insertar mayores cantidades de
DNA. Se genera un vector que pueda infectar a la clula pero que no produzca fagos
nuevos y se le selecciona por resistencia a distintas condiciones.
El vector es como un plsmido normal al que se le introduce un sitio COS.
Podemos aadir DNA desde 5kb hasta fragmentos de 45 kb, quedando de forma
circular. Se da forma lineal al vector cortando por COS, de forma que podamos unir
distintos fragmentos por sus extremos COS para formar el concatmero.
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Es ms fcil que interaccionen los extremos de cada molcula con los de la otra a
que una molcula se circularice.
Se corta por los sitios COS y se va metiendo cada fragmento en una cabeza para
formar fagos que infecten un plsmido y se introduzcan en el DNA.
CLONACIN DE CROMOSOMAS
ARTIFICIALES BACTERIANOS (BACS)
Los cromosomas bacterianos artificiales
son plsmidos diseados para la clonacin de
fragmentos de DNA muy largos (100 kb
350 kb). El plsmido ya tiene de forma natural
un origen de replicacin muy estable que
mantiene una o dos copias del plsmido por
clula.
Estas grandes molculas de DNA se
introducen en las bacterias husped por
electroporacin. Las bacterias husped tienen
muchas mutaciones que afectan a la estructura
de la pared bacteriana, lo que facilita la
incorporacin de estas grandes molculas de
DNA.



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CROMOSOMA ARTIFICIAL
DE LEVADURA (YAC)
Los vectores YAC contienen todos los elementos necesarios para mantener un
cromosoma eucaritico en el ncleo de la levadura: un origen de replicacin de
levadura, dos marcadores de seleccin y secuencias especializadas. Entre estas
secuencias se encuentran las centromricas para segregacin correcta de los
cromosomas en la divisin celular y las telomricas para la estabilidad.
El corte con una endonucleasa de restriccin elimina un trozo de DNA entre dos
secuencias telomricas, linealizando el DNA y dejando los telmeros en los extremos.
El DNA del gen que queremos clonar se prepara por digestin parcial con
endonucleasas de restriccin para obtener un fragmento del tamao adecuado
El vector ha sufrido otro corte en un sitio interno, quedando dividido en dos
fragmentos de DNA, cada uno con un marcador seleccionable distinto. Entre estos dos
fragmentos se introduce el DNA del gen ya cortado con tamao adecuado.
Para seleccionar el DNA recombinante que queremos eliminamos la pared de la
levadura dejando un esferoplasto. De esta forma la clula se puede transformar gracias
al YAC. Las clulas que sobreviven son las que tienen los dos marcadores, y as se
seleccionarn.

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36
Genotecas

Una genoteca es una coleccin de clones de DNA reunidos con objeto de disponer de
una fuente de DNA para secuenciar, descubrir nuevos genes o para estudios de la
funcin gnica. Hay distintos tipos de genotecas segn el origen del DNA.
- Genmicas: el genoma completo de un organismo particular se corta en millares
de fragmentos y todos ellos son clonados por insercin en un vector de
clonacin.
- cDNA: es DNA complementario a los RNA mensajeros, de forma que slo
encontramos las secuencias de DNA que se transcriben a mRNA. Para poder
hacer la coleccin se sintetiza cDNA a partir de mRNA mediante transcriptasas
inversas y luego esas secuencias se clonan para tener varias.
Hay genotecas de cDNA especficas segn el tejido, el rgano, etc.
o De expresin: slo los clones que son capaces de dar lugar a una
protena.

GENOTECAS GENMICAS
Para construirlas aislamos el DNA genmico total, que es igual en todas las clulas del
organismo. Para ello llevamos a cabo una digestin parcial del DNA ajustando las
condiciones de concentracin de la enzima para evitar cortar fragmentos demasiado
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Laura Esteban Luca 37
pequeos. Los fragmentos resultantes los incluimos en distintas molculas de vector
(fago). Obtenemos as las secuencias reguladoras, secuencias codificantes (genes),
secuencias no codificantes (que estn repetidas), etc.
GENOTECAS DE cDNA
Su construccin es ms complicada que la de las genotecas genmicas. Hemos de
seleccionar slo el DNA complementario a los mRNA (cDNA).

Lo primero que tenemos que hacer es aislar los mensajeros a partir del tejido que nos
interese, ya que segn el tejido se expresarn unos genes u otros.
Una caracterstica que tienen los mRNA eucariotas es que en su extremo 3 tienen una
cola de poli A. Gracias a esto podemos aislar todo el RNA con una cromatografa de
afinidad con agarosa unida a dT (desoxitimina), a la cual se unen los mensajeros por su
cola de poli A.



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A partir de las cadenas sencillas de mRNA se llevar a
cabo la sntesis de la cadena doble de cDNA siguiendo
varios pasos.
1) A partir de la primera cadena de mRNA
obtendremos su complementaria en DNA gracias a
la enzima transcriptasa inversa (o transcriptasa en
reverso). Este tipo de enzima se asla de virus y es
capaz de sintetizar DNA a partir de RNA. Para
llevar a cabo su funcin necesita un iniciador, que
consiste en un oligonucletido iniciador con dT,
que liga con la poli A y a partir de ah comienza la
sntesis de la nueva cadena.
2) Se elimina la cadena de RNA tratndolo con lcali,
ya que el RNA es ms sensible a medios alcalinos
que el DNA).
3) Una vez liberado el DNA, se sintetiza la cadena
complementaria mediante una DNA polimerasa. Para que la enzima pueda
comenzar se aade una cola de G para luego aadir un oligonucletido de C.
4) Metilacin del NDA y adiccin de enzimas de restriccin.
Una vez tenemos la doble cadena de cDNA, hemos de clonarlo en un vector. Para ello
necesitamos colocarlo en un sitio de restriccin del vector. No podemos utilizar enzimas
digestivas, pues provocarn su degradacin. De forma que se metilan todas las
posiciones posibles para evitar que las enzimas de restriccin corten la cadena y en los
extremos aadimos los sitios de restriccin que queramos.
Posteriormente lo introducimos en el vector y plaqueamos para que se reproduzca. As
se genera una poblacin de clones denominada genoteca.

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GENOTECAS DE cDNA DE EXPRESIN
Para que un gen pueda expresarse en un organismo (bacteria) tenemos que utilizar
vectores especiales de expresin que lleven:
- Parte de una secuencia para una protena bacteriana (-galactosidasa).
- Sitios nicos de restriccin (EcoRI).
- Una secuencia (promotor) que dirija la transcripcin y la traduccin en bacterias,
porque si no la maquinaria bacteriana no reconocer el promotor humano.
Simplemente replicara el DNA, pero ste nunca llegara a expresarse.
Si utilizamos levaduras en lugar de bacterias, se utiliza el promotor de levaduras, etc.
Con esta tcnica obtenemos una protena ms estable que la clula reconoce como
suya. Despus de obtener los fagos recombinantes se produce la infeccin.

DESNATURALIZACIN Y
RENATURALIZACIN DEL DNA
Es importante para la hibridacin DNA-DNA y DNA-RNA (por
complementariedad).
Se basa en la capacidad de los nucletidos de desnaturalizarse reversiblemente.
En condiciones naturales, la molcula de DNA es una doble hlice. En medio
alcalino la doble hlice se desnaturaliza, se rompen los puentes de hidrgeno y se
separan las dos hebras. Si se vuelve a las condiciones nativas se pueden volver a
renaturalizar al asociarse de nuevo las dos hebras.

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El nivel de absorcin aumenta al aumentar la temperatura hasta alcanzar el nivel de
absorcin mximo, que tendra un DNA de cadena nica. A una temperatura entre 80-
87 se produce la transicin del DNA y se rompen las cadenas.

Cuanto mayor es el nmero de enlaces entre las bases mayor es la temperatura que
necesitamos para desnaturalizar. Tambin depende las bases: los enlaces entre A y T
son dobles, mientras que entre C y G son triples, de forma que se necesita ms energa
para romper estos ltimos. La Tm (temperatura de fusin) depende de la secuencia que
tenga el DNA.


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42
Hibridacin de cidos nuclicos.
Sondas y aplicaciones.

ENSAYO DE HIBRIDACIN
Se utiliza para detectar una secuencia especfica
de DNA de entre muchos fragmentos distintos.
El proceso es el siguiente:
1. Desnaturalizacin de las dobles cadenas
de DNA a cadenas simples.
2. Unin de la cadena sencilla a un filtro de
nitrocelulosa.
3. Irradiamos con luz ultravioleta para que
las molculas de DNA reaccionen con la
membrana de nitro celulosa y se quedan
unidas a ella.
4. Incubacin con una sonda. Por lo
general suele ser DNA marcado
radiactivamente.
5. Hibridacin.
6. Lavado para determinar la sonda
marcada que no se ha hibridado con el
DNA.
7. Autorradiografa para ver dnde se ha
unido la sonda.

ANLISIS DE GENOTECAS
1. Repartir millones de clones en placas de lisis.
2. Replicar en una membrana de nitro celulosa.
3. Tratamiento en medio alcalino. Cada colonia con DNA recombinante diferente
se pega al filtro (alguna de sus clulas para desnaturalizar y liberar el DNA.
4. Tratamiento con una sonda que slo se una en la placa de lisis con su cDNA. As
aislamos el gen de inters.
Necesitamos una sonda especfica para que slo hibride con el DNA de inters. Debe
tener alrededor de 20 nucletidos. La analizamos mediante una autorradiografa.
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SONDAS
Pueden ser de DNA o RNA.
Tienen que ser lo ms especficas posible.
o Su tamao mnimo es de unos 20 nucletidos porque las posibilidades de
secuencias son de 4
20
= 10
12
.
Diseo
o Tiene que ser una secuencia conocida.
o Si no se conoce la secuencia pero s la de un gen homlogo habr ciertas
regiones iguales.
o Conociendo la secuencia de la protena podemos deducir la secuencia de
nucletidos a partir de ella.
Obtencin
o Con DNA celular (clonacin)
o Sntesis qumica (oligonucletidos)
o Mediante la sntesis por PCR se pueden conseguir grandes cantidades
sintetizadas.
o Transcripcin in vitro (RNA).
Marcaje
o Radiactivo
o Qumico
o Anlogos fluorescentes





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MARCAJE DE UNA SONDA
Aleatorio: tenemos un fragmento de
DNA y lo usaremos como sonda. Se
marca con anlogos qumicos de
nucletidos o con flor. Se separan las
cadenas y se unen pequeos fragmentos
de 6 nucletidos que actan como
promotores de la DNA polimerasa para
que polimerice en direccin 3-5. Se
unen los fragmentos con ligasa.
Terminal: marcamos de forma qumica
o radiactiva un fragmento de DNA con
la polinucletido quinasa y ATP
marcado radiactivamente en la posicin
. El fosfato que se encuentra en esa
posicin es transferido al extremos 5
del oligonucletidos. El resultado es un
oligonucletido 5 fosfato que podemos
detectar mediante una autorradiografa.









ANLISIS DE UNA GENOTECA DE
EXPRESIN
Si tenemos una genoteca de expresin pero no tenemos sonda, podemos detectar el
clon de inters si tenemos una protena con anticuerpos, cAMP o DNA (segn el
ligando con el que interaccione la protena que se est expresando en los clones).
Si disponemos de anticuerpos que reconozcan las protenas podemos hacer una
rplica de nitrocelulosa, incubar la membrana con un anticuerpo primario que reconozca
a la protena y luego encontrar ese anticuerpo primario con un anticuerpo secundario
marcado.
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ANLISIS DE SECUENCIAS ESPECFICAS DE
DNA EN MEZCLAS
Southern
Es una tcnica de
hibridacin que nos
permite identificar un
fragmento especfico de
DNA dentro de una
mezcla de fragmentos o de
una secuencia compleja.
Tenemos un DNA
genmico y lo cortamos
con enzimas de restriccin obteniendo distintos fragmentos. Los ordenamos segn su
tamao por electroforesis y los transferimos a un papel de filtro de nitrocelulosa.
Nos permite comparar los mapas de restriccin de distintas muestras. Se asla el
DNA de las muestras y se realiza una digestin enzimtica. Posterior mente se separan
los fragmentos por electroforesis.
La primera capa del papel de filtro se sumerge en una solucin alcalina que arrastra
por capilaridad al DNA. As los fragmentos de DNA quedan pegados a la membrana de
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Laura Esteban Luca 46
nitrocelulosa (que est encima). Esta membrana se puede incubar con una sonda
(normalmente marcada radiactivamente para detectarla luego) para cada una de las
secuencias del DNA (slo se une al fragmento que tiene una secuencia
complementaria).
Esta tcnica requiere cantidades relativamente grandes de DNA.

TCNICAS DE TRANSFERENCIA
Northern para RNA.
Western para protenas. No se hibrida el DNA con una sonda, sino que se
usan anticuerpos.










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MICRORRAYS DE DNA O CHIPS DE DNA
En los chips pueden estar representados todos los genes de un
organismo. En un cuadradito (2x2) hay distintos puntos con un
fragmento de DNA con la secuencia de un gen distinto.
Tenemos sondas que representan a todos los genes del organismo.

Estos chips nos permiten ver cmo se expresan mltiples genes a la vez y nos
permite comparar dos situaciones y ver qu genes se expresan en una y no en otra.
*Ejemplo: comparar el comportamiento de clulas normales con el de clulas
cancerosas.
1) Aislar RNA de unas clulas y otras.
2) Obtener los cDNA y se marcan con una sonda fluorescente para distinguir las
muestras.
3) Los cDNA se juntan y se ponen en el array, cuando se hace la fluorescencia se
ven los genes que se expresan en cada una o en las dos.


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Reaccin en cadena de la RNA
polimerasa (PCR)

Amplificacin un fragmento de DNA. La PCR permite obtener grandes cantidades
de DNA y clonarlo a partir de una sola molcula. En ocasiones se usa como
procedimiento alternativo a la clonacin. Amplificamos una regin especfica de DNA.
Se preparan dos oligonucletidos sintticos, cada uno complementario de
secuencias en las hebras opuestas del DNA diana, situadas justo en los extremos del
segmento que se quiere amplificar. Los oligonucletidos sirven de cebadores para la
repliclacin.
El procedimiento de la PCR tiene tres pasos:
1. Se separan las cadenas de DNA por calentndolas brevemente a 95.
2. Aadimos oligonucletidos especficos para la regin que queremos amplificar.
Se unen especficamente por complementariedad de bases. Los oligonucletidos
sirven de cebadores en la replicacin.
3. Aadimos la DNA polimerasa, que es termoestable, y los cuatro
desoxirribonucletidos, y bajamos la temperatura para que el cebador se una a la
secuencia correspondiente.
La enzima permanece activa despus de cada paso y no tiene que ser reemplazada. Unos
25-30 ciclos son suficientes para que la secuencia se haya multiplicado hasta un milln
de veces.

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En el extremo de los oligonucletidos podemos poner una cola con una secuencia de
restriccin especfica. Esto nos va a facilitar la clonacin.
APLICACIONES CLNICAS DE LA PCR
Cada ciclo lleva unos 15 minutos, y tiene distintas aplicaciones
Deteccin de VIH o cualquier otro patgeno: requiere la deteccin temprana y
absoluto control sobre la sangre de los pacientes.
o Mtodos convencionales: Southern, anlisis con antgenos, etc.
Laboriosos
Poco sensibles
Falsos negativos
o PCR (DNA aislado de leucocitos para VIH)
Deteccin en estado seronegativo
Deteccin de mutaciones para el diagnstico de enfermedades
Identificaciones en medicina forense
ANLISIS DE ALTERACIONES EN UNA
REGIN DEL DNA POR PCR MLTIPLE
Para ello necesitamos DNA control y DNA problema.
1. Amplificamos con cebadores (PCR).
2. Parejas de oligonucletidos para distintas regiones (PCR). Como resultado
obtenemos 3 regionres (esto se hace en el DNA control).
3. Hacemos una PCR con el DNA problema. Si falta una regin no s amplificar,
pues el cebador no se unir al no haber secuencia complementaria.
4. Corremos todos los fragmentos en un gel de agarosa.
*Ejemplo: Deteccin del VIH (o cualquier otro patgeno) y de mutaciones para el
diagnstico de enfermedades.
CLONACIN DE DNA AMPLIFICADO POR PCR
El DNA amplificado por la PCR puede ser clonado. Los cebadores pueden
incorporar DNA no complementario en los extremos que tengan el sitio de corte de una
endonucleasa de restriccin. Aunque estas partes de los cebadores no se aparean con el
DNA diana, el proceso de la PCR los incorpora al DNA que es amplificado. El corte de
los fragmentos amplificados en estos sitios crea extremos cohesivos que facilitan la
ligacin del DNA amplificado a un vector de clonacin.
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**PCR: mtodo alternativo de clonacin que permite clonar fragmentos de DNA in
vitro (sin clulas). A partir del poco DNA de la muestra podemos amplificarlo y obtener
una gran cantidad de DNA.

El crecimiento del nmero de molculas es exponencial. El nmero de fragmentos
de DNA es 2
n
y donde: n = n de ciclos; y = n inicial de fragmentos.
En un gel de agarosa podemos ver cmo se va amplificando la secuencia a medida
que aumentamos el nmero de ciclos.


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Secuenciacin del dna
Manuales: permiten secuenciar unos pocos nucletidos.
o Se utiliza Sanger porque se ha podido adaptar a mtodos automticos.
Consiste en generar una serie de fragmentos mediante una sntesis
enzimtica y usar desoxi-NTP.
Automtica: variacin del mtodo Sanger.
ESTRUCTURA DE LOS
DESOXIRRIBONUCLETIDOS
Un ribonucletido tiene una ribosa con OH en sus carbonos 2 y 3.
Un desoxirribonucletido tiene un H en su carbono 3.
Un didesoxirribonucletido tiene dos H en sus carbonos 2 y 3.

MTODO DE SANGER (DIDESOXI)
Reaccin de la DNA polimerasa
Necesita un oligonucletido iniciador. La
reaccin que lleva a cabo es incorporar un
desoxioligonucletido al grupo OH del
oligonucletido iniciador. Se une el 5-P al 3-OH por
complementariedad de bases. Si se trata de un
didesoxinucletido le falta el OH, por lo que no deja el
OH libre, sino un H y se acaba la reaccin, ya que la
DNA polimerasa no tiene donde formar el enlace.
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Laura Esteban Luca 53
Aadimos los 4 desoxinucletidos
y separamos en 4 reacciones.
Aadimos ddNTP en una pequea
proporcin (1ddNTP por cada 100
dNTP) para que entren de vez en
cuando y paren la sntesis que lleva a
cabo la DNA polimerasa. Se sintetizan
una serie de cadenas que se van
parando prematuramente. Corremos los
fragmentos en un gel por electroforesis
para ordenarlos. La lectura del gel es la
complementaria a la del molde.
A consecuencia de la mayor cantidad
de dNTP en relacin a la de ddNTP, la probabilidad de incorporar este en lugar de un
dNTP es pequea, pero sin embargo es suficiente para asegurar que cada nueva hebra
sintetizada incorpora al menos un ddNTP en algn punto durante su sntesis.
SECUENCIACIN AUTOMTICA DEL DNA
Permite secuenciar fragmentos ms grandes (alrededor de 1000 pb).
Es un modelo derivado del mtodo Sanger. La diferencia est en que, en este caso,
aadimos los 4 desoxirribonucletidos a la vez. Cada uno est marcado con un grupo
fluorescente determinado. Realizamos una electroforesis capilar y hay un detector que
detecta el color de la banda y va haciendo cromatograma con un registro de esos picos
de color.

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Laura Esteban Luca 54

ESTRATEGIAS UTILIZADAS EN LA
SECUENCIACIN DEL GENOMA HUMANO
1. Pblica: se plante mapear el genoma entero, tener posiciones localizadas para
construir clones, BACs y YACs con fragmentos grandes de DNA ensamblados.
El proceso dur 5-6 aos.
2. Privada: empez a competir con el pblico pero termin ms tarde. Se basaba en
fragmentar el DNA, secuenciar los fragmentos al azar y luego ordenarlos y
ensamblarlos.


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56
Preguntas de repaso 1 parte
QUESTION 1
Las enzimas de restriccin y la DNA ligasa desempean papeles esenciales en la clonacin de
DNA. Por qu la bacteria que produce un enzima de restriccin no corta su propio DNA?
Describir las caractersticas generales de los sitios de restriccin. Cules son los tres tipos de
extremos que se pueden producir al cortar un DNA con un enzima de restriccin? Qu reaccin
es catalizada por la DNA ligasa?
QUESTION 2
Cules de las enzimas de restriccin que se indican en la tabla generan fragmentos de extremos
romos? En las que generan extremos cohesivos, cules de estos cortes no pueden convertirse en
romos por la accin de la DNA polimerasa? Por qu?












Pu = purina, Py = pirimidina, N = cualquier nucletido
QUESTION 3
Se muestra a continuacin la mitad de un sitio de restriccin.
a) Dibuje la otra mitad.

b) Identifique mediante flechas gruesas ( ) los puntos de ruptura de tipo II que daran lugar
a productos de doble cadena con extremos romos.
ENZIMA SECUENCIA DE RESTRICCION

BamHI G/GATCC
BglII A/GATCT
EcoRI G/AATTC
EcoRII CC/GG
HaeIII GG/CC
HhaI GCG/C
HindII GTPy/PuAC
HindIII A/AGCTT
HinfI G/ANTC
HpaI GTT/AAC
MspI C/CGG
NotI GC/GGCCGC
PstI CTGCA/G
SalI G/TCGAC
SmaI CCC/GGG
XbaI T/CTAGA
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Laura Esteban Luca 57
c) Identifique mediante flechas finas ( ) los puntos de ruptura de tipo II que dan cortes
cohesivos que podran convertirse directamente en molculas de DNA recombinante por
la DNA ligasa, sin la participacin de otras enzimas.
d) Si ste fuera el lugar de reconocimiento de una endonucleasa de restriccin de tipo I, en
dnde se producira el corte de la doble cadena?
e) Si las secuencias de DNA fueran totalmente aleatorias, qu longitud (en kpb) tendra el
intervalo previsto entre copias idnticas de esta secuencia de DNA?
QUESTION 4
Los plsmidos bacterianos a menudo sirven como vectores de clonacin. Describir las
caractersticas esenciales de un vector plasmdico. Cules son las ventajas y las aplicaciones de
los plsmidos como vectores de clonacin?
QUESTION 5
Resuma los pasos de clonacin de un gen.
QUESTION 6
El plsmido pBR322 contiene los genes amp
R
y tet
R
, que confieren resistencia a los antibiticos
ampicilina y tetraciclina respectivamente. El gen tet
R
contiene un sitio de restriccin para el
enzima SalI, que adems es nico en el plsmido. Describir cmo se puede seleccionar una
bacteria E.coli que ha sido transformada por pBR322 que contiene un inserto de DNA en su sitio
SalI.
QUESTION 7
a) Por qu es ms grande una genoteca genmica que una genoteca de cDNA para un
organismo dado?
b) Por qu difieren entre s las genotecas de cDNA obtenidas de diferentes tipos celulares
del mismo organismo?
QUESTION 8
Explique el procedimiento de terminacin de la cadena (didesoxi) para secuenciar DNA.
QUESTION 9
Describa los resultados obtenidos en el procedimiento de secuenciacin por terminacin de la
cadena en el cual (a) se agrega muy poco ddNTP; (b) se agrega demasiado ddNTP; (c) estn
presentes muy pocos cebadores; (d) estn presentes demasiados cebadores.
QUESTION 10
Se secuenci el siguiente fragmento de DNA por el mtodo de Sanger. El * significa un marcaje
fluorescente.

*5_______3-OH 3_______ATTACGCAAGGACATTAGAC---5
Bioqumica y biologa molecular cidos nucleicos e ingeniera gentica
Laura Esteban Luca 58
Se trat una muestra con DNA polimerasa y una de las cuatro mezclas de nucletidos indicadas
a continuacin. Los didesoxinucletidos se aadieron en proporcin mucho ms baja que los
desoxinucletidos.
1. dATP, dTTP, dCTP, dGTP, ddTTP
2. dATP, dTTP, dCTP, dGTP, ddGTP
3. dATP, dCTP, dGTP, ddTTP
4. dATP, dTTP, dCTP, Dgtp
El DNA resultante se separ por electroforesis en un gel de acrilamida y se localizaron las bandas
fluorescentes en el gel. Se muestra el patrn resultante con la mezcla 1. Qu patrn de bandas se
obtendra con las restantes mezclas?
1. Describir los tres pasos esenciales en cada ciclo de una reaccin de
PCR. Por qu fue tan importante para el desarrollo de la PCR el
descubrimiento de una DNA polimerasa termoestable?
2. Describa los resultados posibles de un experimento de PCR en el cual
(a) uno de los cebadores se omite inadvertidamente en la mezcla de
reaccin; (b) uno de los cebadores es complementario con varios
sitios de la muestra inicial de DNA; (c) hay un corte en una sola de las
cadenas de DNA en la secuencia de DNA diana, que est presente en
una sola copia en la muestra inicial; (d) hay un corte en las dos
cadenas de la secuencia de DNA diana que est presente en una sola copia en la muestra
inicial.
3. Escriba las secuencias de los dos cebadores de 12 residuos que podran utilizarse para
amplificar el siguiente segmento de DNA mediante la tcnica de PCR.
ATAGGCATAGGCCCATATGGCATAAGGCTTTATAATATGCGATAGGC
GCTGGTCAG
4. Southern y Northern son dos tcnicas en Biologa Molecular basadas en la hibridacin de
cidos nucleicos. En qu se parecen? En qu difieren? Mencionar alguna aplicacin
especfica de cada una de ellas.
5. En bacterias se han expresado multitud de protenas de otros organismos. Describir las
caractersticas esenciales que se requieren en un plsmido recombinante para la expresin de
un gen forneo.
6. Qu es un microarray de DNA? Cmo se utilizan para estudiar la expresin gnica? En qu
se diferencian los experimentos con microarrays de los experimentos que usan el Northern?

Bioqumica y biologa molecular cidos nucleicos e ingeniera gentica
Laura Esteban Luca 59

60












Replicacin y reparacin del DNA
CARACTERSTICAS GENERALES DE LA
REPLICACIN DEL DNA
El modelo de la doble hlice implicaba necesariamente un modelo de replicacin.
Esta hiptesis fue confirmada mediante una serie de experimentos diseados por
Meselson y Stahl en 1957.
Los primeros estudios sobre la replicacin del DNA bacteriano y sus enzimas
contribuyeron al establecimiento de varias propiedades bsicas que han resultado se
aplicables a la sntesis de DNA de todos los organismos.
1. Semiconservativa
2. Bidireccional desde puntos fijos (orgenes de replicacin)
3. Semidiscontinua en direccin 5 3
4. La llevan a cabo DNA polimerasas
5. Gran fidelidad
La replicacin del DNA es semiconservativa
Cada cadena del DNA acta de molde para la sntesis de una nueva cadena. El resultado
son dos molculas de DNA nuevas, cada una con una cadena nueva y otra vieja. Este
proceso se denomina replicacin semiconservativa.
Al principio se planteaban tres posibles modelos de replicacin:
1. Semiconservativa: la primera generacin filial se
compone de dos dobles hlices hbridas con una
cadena antigua y otra nueva.
2. Conservativa: la primera generacin filial se
compone de dos dobles hlices. Una doble hlice
tiene las dos cadenas antiguas y la otra la dos
cadenas nuevas.
3. Dispersiva: se produce el entre cruzamiento de
fragmentos de cadena nueva y cadena vieja, de
manera que ambas hlices tienen fragmentos de las dos.
Experimento de Meselson-Stahl para demostrar la replicacin semiconservativa
1. Crecer bacterias en un medio con
15
N (istopo pesado del N), que pasa a formar
parte del DNA. As se originan clulas con una densidad un 1% mayor que el
DNA normal (
15
N).
[Se asla el DNA de las clulas]
Bioqumica y biologa molecular Replicacin y reparacin del DNA
Laura Esteban Luca 61
2. Aunque la diferencia es pequea, es posible separar la mezcla de [
15
N]DNA
pesado y [
14
N]DNA ligero por equilibrio de
sedimentacin en un gradiente de densidad
como cloruro de cesio mediante
centrifugacin.
La concentracin del cloruro de cesio es
mayor hacia el fondo del tubo. Las molculas
se disponen en la superficie y van cayendo
hasta llegar a su densidad, donde se paran.
Los DNAs ligeros se quedan formando una
banda ms superior, mientras que los DNA
pesados precipitan ms abajo.
3. Las bacterias pasan a un medio con
14
N y se
deja que se dupliquen una sola vez.
4. Se realiza una centrifugacin de la primera
generacin filial y se encuentra una banda
intermedia entre 14 y 15.
5. Se deja que las bacterias vuelvan a duplicarse
y se realiza el mismo proceso con la segunda generacin filial, obtenindose esta
vez una banda de DNA hbrido y otra de DNA ligero, pero ninguna de DNA
pesado.
6. Se deja a las bacterias que se dupliquen de nuevo y repetimos el proceso. Esta
vez el resultado de la centrifugacin es un aumento de la banda de DNA ligero.
Este experimento demuestra que la replicacin del DNA es semiconservativa.
- Si hubiese sido conservativa, la banda ligera hubiera sido ms densa y nunca
habra aparecido la banda intermedia de DNA hbrido.
- Si hubiese sido dispersiva, habramos encontrado DNA hbrido en cualquier
generacin (ya en el paso dos aparecera).
La replicacin del DNA es bidireccional
Las cadenas se copian en dos
direcciones opuestas partiendo desde un
punto fijo (origen de replicacin = oriC)
generndose dos horquillas de
replicacin que forman una burbuja de
replicacin.
Llamamos replicn a la cantidad de
DNA que se puede replicar en un mismo
origen.
Bioqumica y biologa molecular Replicacin y reparacin del DNA
Laura Esteban Luca 62
En bacterias encontramos un solo
replicn porque slo hay un
cromosoma. En eucariotas hay ms de
una porque hay varios cromosomas y
en ellos encontramos varios orgenes
de replicacin. No tienen por qu
replicarse todos a la vez, sino que la
sntesis comienza en orgenes distintos
hasta que se juntan las dos burbujas de
replicacin.
Evidencia experimental que apoya el
crecimiento bidireccional de la hebra de DNA
Se tomaba un cromosoma bacteriano circular y se haca lineal. A partir del OriC
empezaba a abrirse la burbuja de replicacin y, al medir la distancia entre cada extremo
y el OriC, se comprob que siempre era la misma.
La replicacin del DNA siempre progresa en
direccin 53 y es semidiscontinua
Las cadenas de DNA siempre son sintetizadas en la direccin 53, siendo el 3 OH
libre el punto de elongacin del DNA. Debido a que las dos cadenas son antiparalelas,
la cadena que acta de molde se lee del extremo 3 al 5. Como la sntesis se realiza en
las dos direcciones opuestas, encontramos dos tipos de hebras segn si son sintetizadas
o no de modo continuo:
- Hebra conductora es aquella cuya sntesis en
direccin 53 transcurre en la misma direccin
que el movimiento de la horquilla de replicacin.
- Hebra rezagada es aquella cuya sntesis en
direccin 53 transcurre en direccin opuesta a
la direccin de movimiento de la horquilla y, por
eso, es sintetizada en fragmentos.
Ambas hebras comienzan sintetizndose a partir de un
oligonucletido iniciador sintetizado por la primasa. En
bacterias son iniciadores de RNA.
En la cadena rezagada se sintetizan varios iniciadores a
intervalos y luego la DNA polimerasa III contina la
sntesis desde el extremo de un cebador al siguiente. Se forman as fragmentos hbridos:
iniciador de RNA y nucletidos de DNA. Estos fragmentos se llaman fragmentos de
Okazaki. La DNA polimerasa I elimina los cebadores y los sustituye por DNA, y la
DNA ligasa une los fragmentos que se van generando.
Bioqumica y biologa molecular Replicacin y reparacin del DNA
Laura Esteban Luca 63
Reaccin de la DNA polimerasa
Aunque en cada organismo hay varias, podemos describir una serie de caractersticas
generales:
- Todas llevan a cabo la sntesis en sentido 5 3.
La reaccin fundamental es la transferencia de un grupo fosforilo. El nuclefilo
es el grupo 3 OH del nucletido situado en el extremo 3 de la cadena en
crecimiento (extremo terminal). El ataque nucleoflico se produce sobre el
fsforo del desoxinucletido 5 trifosfato entrante. En la reaccin se libera
pirofosfato inorgnico. La ecuacin general de la reaccin es:
(dNTP)
n
+ dNTP (dNTP)
n+1
+ PP
i


DNA DNA (alargado)
- Todas necesitan de un oligonucletido iniciador (cebador) de DNA, RNA o
hbrido de ambos.
- Presentan diferente procesividad: es el nmero medio de nucletidos aadidos
antes de que una polimerasa se disocie de la cadena de DNA.






La replicacin del DNA tiene una gran fidelidad
La replicacin tiene lugar con un grado extraordinario de fidelidad. En E. Coli se
comete un error cada 10
9
10
10
nucletidos incorporados.
El proceso se controla de dos formas:
- La DNA polimerasa controla la geometra de los nucletidos que aade y el
nmero de puentes de hidrgeno. De esta forma cuida de que haya la misma
distancia ribosa-ribosa cada vez que coloca un nuevo nucletido.
- La DNA polimerasa cuenta con un mecanismo de autocorreccin (no todas). Va
controlando la simetra de los nucletidos que coloca y si no es el correcto
elimina el ltimo nucletido aadido pasando al su otro dominio, el de
exonucleasa 35 y digiere en la otra direccin. Posteriormente aade el
nucletido correcto.
**No se considera reparacin porque sta ocurre despus de la replicacin.
Bioqumica y biologa molecular Replicacin y reparacin del DNA
Laura Esteban Luca 64
ENZIMAS QUE INTERVIENEN EN LA
REPLICACIN
Replisoma es el conjunto de todas las protenas que intervienen de alguna manera en el
proceso de sntesis. Se clasifican segn su actividad en:
Helicasas: separa las dos hebras de la cadena molde de DNA movindose a lo
largo de ella rompiendo los puentes de hidrgeno que unen las bases
nitrogenadas utilizando la energa qumica del ATP.
Topoisomerasas: son las enzimas que eliminan los superenrollamientos y las
tensiones que se generan en las dos hebras de DNA cuando se van separando. Si
no se llevara a cabo esta funcin, la sntesis de una nueva cadena se detendra.
Protenas de unin al DNA: estabilizan las cadenas separadas y evitan que se
vuelvan a unir.
*Ejemplo: Las SSB son protenas de unin a cadena simple.
Primasas: sintetizan los oligonucletidos de RNA iniciadores o primers
(cebadores). Llevan a cabo esta funcin tanto en la cadena continua como en
cada fragmento de Okazaki de la cadena rezagada.
DNA ligasas: cierran las cadenas nuevas uniendo los fragmentos separados por
mellas en ambas cadenas.
DNA polimerasas
Bioqumica y biologa molecular Replicacin y reparacin del DNA
Laura Esteban Luca 65
DNA polimerasa I
Est constituida por un solo polipptido que presenta dos dominios funcionales distintos
que pueden separarse por
proteasas y que conservan sus
propiedades.
El dominio de mayor tamao es
el llamado fragmento Klenow, y
en l se encuentra el sitio de
polimerizacin (sntesis) y el de
correccin, en el que se
encuentra la actividad
exonucleasa 3-5. El otro
dominio es el que contiene el
sitio de degradacin, la
exonucleasa 5-3.
Traslacin de la mella o nick-translation
La sntesis del DNA comienza en una mella, un enlace fosfodiester roto que deja un 3-
OH y un 5-P libres. La DNA polimerasa I extiende la hebra de DNA que no hace de
molde eliminando un nucletido de RNA y aadiendo otro de DNA, esto hace que se
desplace la mella a lo largo de la cadena de DNA.

Bioqumica y biologa molecular Replicacin y reparacin del DNA
Laura Esteban Luca 66
DNA polimerasa III
Es un complejo ms grade formado por 10 subunidades diferentes.

El complejo est formado por cinco polipptidos distintos y es el cargador de la pinza
sobre el DNA en un proceso que requiere ATP.
La pinza est formada por dos subunidades que dejan un agujero en el centro. La
molcula de DNA pasa por ese agujero y mejora enormemente la procesividad de la
enzima. Suele haber dos pinzas.
El ncleo de la enzima es donde se lleva a cabo la sntesis y est formado por tres
subunidades:
- Subunidad : lleva a cabo la actividad de polimerizacin.
- Subunidad : lleva a cabo la actividad 3-5 correctora.
- Subunidad : supone la unin entre y .
El complejo final est formado por dos ncleos, dos pinzas, un cargador y don
subunidades Tau () que mantienen unidos los ncleos.
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Laura Esteban Luca 67

68
Etapas de la replicacin
INICIACIN
La replicacin se lleva a cabo a partir de puntos nicos y slo una vez por ciclo.
El punto de inici es el OriC. En bacterias es una secuencia de unos 200 pares de
bases con una serie de secuencias repetidas: tres secuencias de 13 pares de bases y
cuatro de 9 pares de bases. Hay once secuencias de metilacin (GATC), que son
reconocidas por la Dam metilasa.

Para que se pueda iniciar la replicacin, las 11 secuencias de metilacin deben estar
metiladas tanto en una cadena como en la otra. Esto constituye una forma de impedir
que la nueva cadena de DNA que se forme se duplique de nuevo ya que no est
metilada.
La iniciacin se da cuando la protena DNA-A
interacciona con las secuencias de 9 pares de bases,
unindose entre 9 y 20 subunidades de la protena. Esto
provoca una torsin del DNA. A continuacin entra la
protena HU (histona), que interacciona con el DNA.
Gracias a la torsin del DNA, a la protena HU y al
gasto de ATP, las regiones de 13 pares de bases (ricas
en A-T y por ello ms fciles de separar) se separan, es
decir, las dos hebras de DNA se separan en esa regin.
Posteriormente, entran las protenas DNA-B
(helicasa) y DNA-C. son dos hexmeros en forma de
anillo de DNA-B los que se unen a cada una de las
cadenas de DNA y actan como helicasas eliminando
los puentes de hidrgeno entre las dos cadenas: inicio
de la burbuja de replicacin.
A este complejo de DNA y protenas se le
denomina complejo precebador. Todos estos procesos requieren ATP.
La iniciacin es un proceso comn a las dos cadenas.
Bioqumica y biologa molecular Replicacin y reparacin del DNA
Laura Esteban Luca 69
Protenas que intervienen en la iniciacin
- DNA A: reconoce la secuencia origen y abre en ese sitio la doble cadena
- DNA B: desenrolla el DNA
- DNA C: requerida para la unin de DNA B en el origen
- HU: se une al DNA y estimula el inicio
- Primasa: sintetiza cebadores de RNA
- Protena de unin a DNA de cadena sencilla (SSB): se une al DNA de cadena
sencilla evitando que se vuelvan a unir las cadenas
- RNA polimerasa: facilita la actividad de la DNA A
- DNA topoisomerasa II: libera la tensin generada por el desenrollamiento del
DNA
- Dam metilasa: metila las secuencias 5 (GATC) en el origen de replicacin
ELONGACIN
Cadena conductora
Se sintetiza un corto cebador de RNA por la primasa en el origen de replicacin. A
continuacin, la DNA polimerasa III aade nucletidos de desoxirribosa a ese cebador
de forma continua. La topoisomerasa II o girasa va lierando la tensin y acompaando
ir la helicasa o DNA B abriendo la doble hlice.
Cadena rezagada
Se sintetiza por fragmentos. La SSB son protenas que se van a unir al DNA de la
cadena simple para que se mantenga la burbuja de replicacin con ambas cadenas
separadas.
Un nico complejo de DNA polimerasa III lleva a cabo la sntesis de ambas
cadenas (sntesis antiparalela).
La primasa sintetiza un cebador de RNA y la DNA polimerasa III aade
desoxirribonucletidos. El ncleo de la DNA polimerasa va saltando de iniciador en
iniciador.

Bioqumica y biologa molecular Replicacin y reparacin del DNA
Laura Esteban Luca 70

De vez en cuando la primasa interacciona con el DNA y va aadiendo cebadores a
intervalos, segn se va abriendo la hlice. Se forma un lazo, que aproxima los dos
puntos de polimerizacin.
El avance de la sntesis es 5-3 de un extremo al otro del fragmento de Okazaki.
Donde hay un nuevo iniciador, la pinza o dmero carga ese punto (reciclaje de
pinzas que estn en exceso) y esto provoca que el ncleo de la DNA polimerasa salte a
esa pinza y sintetice ese hueco a partir del nuevo cebador. Este proceso se repite
sucesivamente.


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Eliminacin de los cebadores de RNA
Gracias a su actividad exonucleasa 5-3,
la DNA polimerasa I va degradando los
ribonucletidos y los va sustituyendo por
desoxirribonucletidos gracias a su actividad
polimerasa. Aade el nucletido en el extremo
3 y la DNA ligasa lo une al resto de la
cadena.
El mecanismo de accin del DNA ligasa
implica la adenilacin del enzima: el enzima
se une a AMP. Despus el AMP pasa al 5-P
del sustrato, se desplaza y ya queda formando
el enlace fosfodister (5-3).
Protenas que intervienen en la elongacin
- SSB: unin a DNA de cadena sencilla para mantener separadas las hebras.
- Helicasa: desenrollamiento del DNA.
- Primasa: sntesis del RNA cebador.
- DNA pol III: elongacin de la nueva cadena.
- DNA pol I: rellena los huecos, elimina los cebadores sustituyendo el RNA por
DNA.
- DNA ligasa: une los fragmentos.
- DNA topoisomerasa II: evita el superenrollamiento.
Cada hebra molde origina una cadena conductora en un extremo y retardada en el otro.
Por eso el proceso de replicacin es bidireccional.

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TERMINACIN
Tiene lugar en el lado opuesto al origen de
replicacin. Cada horquilla replica la mitad de
las cadenas en una direccin o en otra (+ -). Si
una horquilla se acelera, encuentra una serie de
secuencias trampa de terminacin, que son Ter
A, B, C, D Estn formadas por 23 pares de
bases cada una. Las hay en las dos direcciones
con orientaciones opuestas. Actan en el
cromosoma para que la polimerasa no pueda seguir replicando.
A estas secuencias se unen protenas Tus, orientadas de forma opuesta a las
secuencias Ter. El complejo DNA polimerasa puede pasar por encima de estas
secuencias si estn en la misma orientacin que ella, pero si estn en orientacin
opuesta se queda anclado.
Cuando se encuentran los dos complejos quedan dos cromosomas nuevos
enrollados (cromosomas concatenados) y no se sabe cmo termina la replicacin.

El DNA puede encontrarse relajado (en su conformacin ms estable) o estresado
(cando hay vueltas de ms o de menos con respecto a la forma relajada). Para liberar las
tensiones se forman superenrollamientos, que pueden ser positivos (derecha) o
negativos (izquierda).

Bioqumica y biologa molecular Replicacin y reparacin del DNA
Laura Esteban Luca 73
Las enzimas que eliminan estos enrollamientos son las topoisomerasas I y II. Su
mecanismo de accin es diferente:
- Tipo I: corta una de las dos
cadenas y forma unin entre
el 5-P a un resto de tirosina
de su cadena. El DNA queda
unido a la enzima. Da la
vuelta sobre la otra cadena
para quitar una vuelta y
vuelve a unir el corte inicial

- Tipo II: se da en zonas donde se cruzan las dobles
hlices. Corta la hlice completa, sujeta un extremo y cruza
la otra hlice por el hueco. Despus vuelve a unir la
primera hlice.
La enzima tiene dos subunidades y una zona de unin. Este
proceso requiere una hidrlisis de ATP, que se necesita
para llevar a cabo una serie de cambios conformacionales
en la enzima para pasar una cadena sobre la otra. La unin
a ATP hace que se corte una cadena, se produzca el
cambio conformacional y la unin a tirosina.







Bioqumica y biologa molecular Replicacin y reparacin del DNA
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Funciones de las topoisomerasas
- Tipo I: manteniemiento del nivel adecuado de enrollamiento del DNA.
- Topoisomerasa II (tipo II): eliminacin de superenrollamientos delante de la
horquilla de replicacin.

- Topoisomerasa IV (tipo II): separacin de dos molculas de DNA circular.



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TOPOISOMERASA TIPO I TOPOISOMERASA TIPO II
Actan solo sobre una de las cadenas de la
doble hlice
Actan sobre la doble hlice completa
No necesita ATP Necesita ATP
Corta una de las cadenas de la doble
hlice. Forma una unin del 5fosfato
libre a un resto de tirosina de la propia
molcula. El 3OH da una vuelta por
encima de la cadena, se vuelve a unir.
RESULTADO: ha quitado una vuelta o ha
puesto una, en funcin de cual fuese la
razn del superenrollamiento, si haba ms
o menos vueltas.
Esta formada por dos subunidades en las
cuales hay un dominio de unin e
hidrlisis de ATP. Formar dos enlaces
fosfotirosina, uno con cada extremo de la
cadena cortada. El ATP se necesita para
llevar a cabo el cambio de conformacin
del encima para que pase una cadena por
encima de otra. (la no cortada atraviesa la
cortad). Se vuelve a unir la cadena cortado
Mantener el nivel adecuado de
enrollamiento del DNA
2: elimina los superenrollamientos por
delante de la horquilla de replicacin:
girasa
4: separacin de dos molculas de DNA
circular

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Replicacin en procariotas y eucariotas
SIMILITUDES
1. Iniciacin altamente regulada en sitios especficos.
2. Mecanismo general similar (tipos de actividades enzimticas, horquillas de
replicacin, sntesis de cebadores, sntesis discontinua de la cadena rezagada,
eliminacin de cebadores, etc.).
DIFERENCIAS
- En procariotas ocupa todo el ciclo celular. En eucariotas est restringida a la fase
S.
- En procariotas hay 5 DNA polimerasas, mientras que en eucariotas hay
alrededor de 13 DNA polimerasas. Adems encontramos polimerasas
mitocondriales y de cloroplastos
En eucariticos:
- El proceso es mucho ms lento por el desensamblaje de la cromatina.
- Hay mltiples orgenes de replicacin.
- Activacin ordenada y regulada de los distintos orgenes de replicacin.
- Mayor nmero de copias DNA pol.
- Replicacin de los extremos de los cromosomas: telmeros.
PROPIEDADES GENERALES DE LOS ORGENES DE
REPLICACIN
- Son secuencias nicas con elementos mltiples repetidos.
- Son zonas ricas en AT, que permiten la separacin de las dos cadenas.
- Son elementos reconocidos por protenas multimricas (reconocen las zonas
AT).
- Las protenas de unin al origen controlan la iniciacin de la replicacin.
DNA polimerasas eucariotas
Bioqumica y biologa molecular Replicacin y reparacin del DNA
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PROBLEMA: replicacin de los telmeros.
El hecho de que sea lineal hace
que las nuevas molculas se vayan
acortando. En la hebra retardada
queda el extremo 3 sin
complementarios, de forma que se
ira perdiendo poco a poco ese
extremo.
Los telmeros contienen una
secuencia repetida mltiples veces
(5-15 kb) y que es especfica pero
parecida en cada individuo.
En la replicacin de estas zonas interviene la telomerasa. La telomerasa es una
riboprotena que, como la transcriptasa inversa, puede sintetizar DNA a partir de RNA.
Contiene RNA complementario al DNA de los telmeros y sintetiza un fragmento que
sirve de cebador y as va aadiendo secuencias repetidas hasta el extremo.
Este mecanismo hace que,
aunque siempre quede una cadena
simple al final, no se pierda DNA
esencial.
Los telmeros forman lazos que
evitan la unin de los extremos de
cadena simple, que la clula tiende a
unir si encuentra en cualquier otra
regin del DNA una cadena
complementaria.
De esta forma mantienen la estabilidad del cromosoma, ya que si unieran los
extremos del cromosoma, aumentara la inestabilidad.

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REPARACIN DEL DNA
Es importante la replicacin precisa y la reparacin del DNA para evitar cambios en la
informacin gentica contenida. El DNA puede ser daado por fallo en la replicacin o
por agentes qumicos.
ORIGEN DE LAS MUTACIONES EN EL DNA
1. Alteraciones espontneas
a. Despurinizaciones o desaminaciones
b. Ataques hidrolticos
c. Dao oxidativo
d. Metilaciones descontroladas
Rotura de enlaces, prdida de bases Se puede romper el enlace entre la pentosa y la
base, entre la pentosa y el fosfato, dentro de las propias bases se pueden romper
enlaces
2. Agentes fsicos
a. Radiacin ultravioleta: dmeros de timina
b. Radiacin : roturas de la doble cadena
Debido a la luz UV se pueden formar enlaces covalentes entre timinas adyacentes (caso
ms frecuente). Tambin se puede formar dmeros de citosina y de citosina-timina
3. Agentes qumicos
a. Mutgenos (muchos de ellos carcingenos)
i. Directos: reaccionan directamente con el DNA.
*Ejemplo: dimetil sulfato, -propiolactona, etc.
ii. Indirectos: el producto de una modificacin que lleva acabo el
organismo es mutagnico. Deben ser metabolizados antes de que
puedan reaccionar con el DNA.
*Ejemplo: dimetil nitrosamina, cloruro de vinilo, etc.
iii. Intercalacin de bases: estructuras de anillos planos que se
introducen entre las bases.
*Ejemplo: bromuro de etidio, proflavina, etc.
4. Replicacin
a. Errores de la DNA polimerasa
5. Recombinacin
a. Errores en el intercambio de fragmentos entre distintas molculas de
DNA


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Laura Esteban Luca 81
TIPOS DE DAOS EN EL DNA
Se clasifican en funcin de la magnitud del dao.
1. Alteraciones de una sola base. Las ms frecuentes son: despurinizacin,
desaminacin de citosina y uracilo, desaminacin de adenina a hipoxantina,
alquilacin de una base, insercin o delecin de un nucletido, incorporacin de
un anlogo de una base.
2. Alteraciones de dos bases: dmeros de timina (pirimidinas) inducidos por luz
ultravioleta, unin de dos bases por agentes alquilantes bifuncionales.
3. Rotura de cadenas: radiaciones ionizantes, formacin de radicales libres
oxidativos.
4. Entrecruzamientos: entre las bases de la misma o distinta cadena, entre el DNA
y protenas (como histonas).
El mecanismo de reparacin vara en funcin del tipo de dao. Slo se llama mutacin
cuando el cambio es estable. Para ello necesitamos dos rondas de replicacin para que
perpete la mutacin.

TIPOS DE SISTEMAS DE REPARACIN
Bioqumica y biologa molecular Replicacin y reparacin del DNA
Laura Esteban Luca 82
La reparacin pre-replicativa presenta sistemas de reparacin que se llevan a cabo antes
de que se produzca la siguiente replicacin. Mientras que la post-replicativa se da
despus y no existe una cadena molde correcta.
METILACIN DEL DNA
Una vez se replica el DNA tenemos dos molculas hbridas. Hay un tiempo en el
que slo est metilada la cadena parental. Cuando pasa un tiempo, la Dam metilasa
metila la cadena nueva.
La reparacin se tiene que dar cuando el DNA est hemimetilada ya que se pueden
distinguir las dos cadenas en funcin del grado de metilacin.

REPARACIN DE APAREAMIENTOS
ERRNEOS
Los apareamientos incorrectos se corrigen casi siempre de acuerdo a la informacin
contenida en la cadena molde, de manera que el sistema tiene que distinguir entre la
cadena molde y la recin sintetizada. La discriminacin se basa en la metilacin de las
cadenas.
En el tiempo antes de que Dam metilasa metile a las nuevas cadenas es cuando se
produce la reparacin.
Bioqumica y biologa molecular Replicacin y reparacin del DNA
Laura Esteban Luca 83

Intervienen varias protenas:
- Mut S: reconoce el apareamiento incorrecto.
- Mut L: se une a Mut S para formar el complejo proteco.
Los pasos de la reparacin requieren ATP.
El complejo Mut L Mut S se une donde est el apareamiento incorrecto. A
continuacin acta Mut H. hay un deslizamiento de la doble cadena a travs de este
complejo. Mut H interacciona con las secuencias de metilacin (se mantiene inactiva
hasta que el complejo encuentra una secuencia GATC
semimetilada) de forma que cuando encuentra una secuencia de
metilacin el complejo deja de tirar del DNA. La Mut H tiene
actividad endonucleasa y pega un corte en la secuencia que no
est metilada, marcando la hebra que se debe separar.
Posteriormente intervienen distintas protenas segn el
extremo donde se produce el corte: extremo 3 o 5 desde donde
est la lesin.
Una vez que se elimina el fragmento con el apareamiento
incorrecto intervienen protenas que rellenan el hueco y as se
sustituye el fragmento.
En eucariotas el proceso es ms complejo. Para reconocer
la cadena recin sintetizada no vemos la metilacin, sino que en
la cadena retardada se observan roturas en los extremos de los
fragmentos de Okazaki y la conductora por su extremo 3 en
crecimiento.
Enzimas que eliminan las bases mal apareadas: actividad exonucleasa 5 3, 3 5
- Extremo 5
o Mut L Mut S
o Helicasa II
o Exonucleasa VII
- Extremo 3
o Mut L Mut S
o Helicasa II
o Exonucleasa I
En la adicin de nuevas bases intervienen la DNA polimerasa III y la SSB.
Finalmente acta la DNA ligasa para unir las nuevas bases al resto de la cadena.

Bioqumica y biologa molecular Replicacin y reparacin del DNA
Laura Esteban Luca 84


REPARACIN POR ESCISIN DE BASES
Hay una base que normalmente no est en el DNA (ejemplo: uracilo). Existen una
serie de enzimas que reconocen daos en el DNA: las DNA glucosilasas. Son
especficas para cada base.
Existen tanto en bacterias como en eucariotas. Eliminan la base afectada rompiendo
el enlace N-glucosdico. Eliminan slo esa base, no el nucletido. El corte crea sitios
AP: apurnicos o apirimidnicos. Una AP endonucleasa elimina el azcar fosfato
(desoxirribosa 5-P) que queda en el sitio AP.
La DNA polimerasa I elimina nucletidos a partir de ese punto y los reemplaza. La
DNA ligasa los une y se elimina el segmento de DNA que contiene el sitio AP.


Bioqumica y biologa molecular Replicacin y reparacin del DNA
Laura Esteban Luca 85

REPARACIN POR ESCISIN DE NUCLETIDO
Se da cuando el dao afecta a ms de una base (ejemplo: dmero de timina). Un
enzima multimrico hidroliza dos enlaces fosfodiester en los extremos 3 y 5 a ambos
lados de ese dao. Se elimina ese fragmento y la DNA polimerasa rellena el hueco. La
DNA ligasa une el nuevo fragmento.
El enzima multimrico que lleva a cabo este corte es la escinucleasa, que en
humanos elimina un fragmento mayor que en bacterias.
ABC escinucleasa de E. Coli
Es un complejo de varias subunidades
llamadas UVR (porque son sensibles a UV).
El dmero de UVR-A reconoce el dmero de
timina. A un dmero de UVR-A se une otro de
UVR-B (monmero). Estas 3 subunidades (A
2
B)
se unen al sitio de lesin, y esto provoca que el
DNA se doble en este punto. Entra la subunidad
UVR-C y se disocia el dmero UVR-A. El dmero
UVR-B/UVR-C tiene actividad exonucleasa:
UVR-B corta en el extremo 3 y UVR-C corta el
extremo 5.
Una vez que se produce el corte, la helicasa
separa el fragmento, la DNA polimerasa sintetiza
un fragmento nuevo y la DNA ligasa lo une.
Reparacin directa
DNA fotoliasas: rompen los enlaces de los dmeros de pirimidinas. Llevan grupos que
absorben la luz UV (folatos derivados de FAD, etc) e hidrolizan los enlaces que se
forman entre timinas contiguas. El mecanismo de accin conlleva la generacin de
radicales libres.
Bioqumica y biologa molecular Replicacin y reparacin del DNA
Laura Esteban Luca 86

Metiltransferasa: slo acta en el caso de la 6-metil guanina. Cada molcula acta una
nica vez. Se transfiere el grupo metilo a un residuo de cistena en el centro activo de la
metiltransferasa y se inactiva, por ello slo acta una vez (no tiene actividad de un
enzima propiamente dicha).

REPARACIN POST-REPLICATIVA



Bioqumica y biologa molecular Replicacin y reparacin del DNA
Laura Esteban Luca 87
Recombinacin
El sistema de reparacin es distinto si es un dao o si
es una rotura en cuanto a las protenas que intervienen,
pero el proceso es similar.
La protena Rec-A interviene en ambos casos. Es
una protena multifuncional que se activa por unin a
DNA. Tiene actividad proteasa, regula la expresin
gnica e interviene en procesos de recombinacin.
Se da un entrecruzamiento de las distintas hebras de
la horquilla de replicacin. De esta forma, en el lugar de
la lesin donde falta la informacin para la replicacin se
copia una nueva hija de la cadena complementaria
(misma secuencia que la parental daada). Luego hay
una nueva reorganizacin.
No es un fenmeno de reparacin tal como lo
consideramos porque la lesin contina. Slo se consigue
que no se pare la replicacin. Luego tienen que intervenir
los sistemas de replicacin anteriores.
SOS
Cuando ha habido un dao masivo en el DNA, cundo se replica la DNA pol III
puede sortear algn error y si est muy daada la hebra, se para y se inicia la respuesta
SOS. Se induce la expresin coordinada de mltiples genes para protenas de reparacin
del DNA: polimerasas que no tienen mecanismo corrector y as no se paran y
sobrepasan la zona daada aunque cometiendo errores de replicacin.
Habr clulas que si no tienen mutaciones letales puedan sobrevivir. Despus de la
respuesta SOS, pueden entrar los sistemas de reparacin cuyas protenas tambin han
sido sobreexpresadas.





Bioqumica y biologa molecular Replicacin y reparacin del DNA
Laura Esteban Luca 88

ENFERMEDADES ASOCIADAS AL PROCESO
DE REPARACIN DE DNA
Reparacin por escisin nucleotdica: mutaciones en distintas subunidades de la
escinucleasa humana y otras protenas asociadas.
- Xeroderma pigmentoso
- Sndrome de Cockayne
- Tricotiodistrofia
Reparacin de apareamientos de errneos: mutaciones en protenas homlogas a Mut S
- Cncer colorrectal no poliposo hereditario.
Distintos sistemas de reparacin

Bioqumica y biologa molecular Replicacin y reparacin del DNA
Laura Esteban Luca 89

90
Preguntas de repaso. Replicacin
1) La siguiente afirmacin parece claramente falsa: No hay dos clulas de tu cuerpo que tengan la
secuencia nucleotdica idntica. Proporciona un argumento que explique por qu podra ser verdadera.
2) Es verdadero o falso? Explicar por qu. Cuando se leen en el mismo sentido (de 5 a 3), la secuencia
de nucletidos en una cadena recin sintetizada de DNA es la misma que en la cadena original utilizada
como patrn para su sntesis.
3) Qu caracterstica del DNA hace necesario que su sntesis sea parcialmente discontinua? Qu papel
desempean en este proceso los fragmentos de Okazaki y la DNA ligasa? Se podra decir que cada vez
que se replica el genoma, la mitad del DNA recin sintetizado se hace a partir de la unin de fragmentos
de Okazaki? Explicar por qu.
4) Resumir el papel del RNA en la replicacin de la hebra rezagada y de los extremos de los cromosomas
lineales.
5) Describir las funciones de las tres actividades catalticas de la DNA polimerasa I de E.coli. Explicar si
podran encontrarse clulas mutantes con una DNA pol I con una actividad de polimerizacin muy
reducida y con una actividad normal exo 5 3. Y mutantes con una DNA pol I carente por completo
de actividad exo 5 3?
6) Cmo puede aumentarse la procesividad de una DNA polimerasa?
7) Cules son las causas de la alta fidelidad de replicacin del DNA?
8) La bacteria E. coli tiene un tiempo de generacin de 30 minutos siendo el tamao de su genoma de 4
x10
6
pb. La levadura en cambio tiene un tiempo de generacin de 60 minutos siendo su genoma 5 veces
mayor, 2 x10
7
pb. Qu caractersticas del proceso de replicacin en ambos organismos explicaran
estos datos?
9) Describir la estructura y funcin de los telmeros.
10) Resumir los pasos de la reparacin por escisin de base (BER) y la reparacin por escisin nucleotdica
(NER). Comparar y contrastar la NER en bacterias y eucariotas.
11) Cules son las ventajas y desventajas de las polimerasas proclives al error?
12) Es verdadero o falso? Explicar por qu. El sistema de correccin de errores de apareamiento en E. coli
puede distinguir entre la cadena original y la cadena hija hasta que una o las dos se metilen, pero no si
ambas cadenas no estn metiladas.
13) Es verdadero o falso? Explicar por qu. La horquilla de replicacin es asimtrica porque contiene dos
molculas de DNA polimerasa, que son estructuralmente distintas.
14) La desaminacin de la adenina produce la base hipoxantina, que puede aparearse con citosina. Qu
tipo de sistema de reparacin utilizaran ms probablemente las clulas para reparar el DNA con una
adenina desaminada?
15) Para cada proceso de reparacin del DNA indicados (a-g) marcar en la tabla con una X la casilla de
TODAS las caractersticas (1-9) que describen correctamente ese proceso.
Bioqumica y biologa molecular Replicacin y reparacin del DNA
Laura Esteban Luca 91
Caractersticas:
1) Interviene la protena RecA.
2) Los nucletidos daados se eliminan mediante traslacin de mella.
3) La enzima de reparacin acta una sola vez.
4) La enzima clave contiene dos grupos prostticos, uno de los cuales es siempre FADH
-
.
5) No se eliminan bases ni nucletidos del DNA.
6) Este proceso se inicia a una distancia de hasta 1 kb del lugar a reparar.
7) La DNA ligasa cataliza la ltima reaccin.
8) El dficit de este sistema en el ser humano aumenta enormemente el riesgo de cncer de piel.
9) La primera enzima de esta ruta rompe dos enlaces fosfodister.

Caractersticas
PROCESOS DE
REPARACIN
1 2 3 4 5 6 7 8 9
a) Reparacin por escisin
de nucletidos

b) Fotorreactivacin
(fotoliasa)

c) Reparacin por escisin
de bases

d) Reparacin por
recombinacin

e) Reparacin SOS
propensa a errores

f) Reparacin mediante
metiltransferasa

g) Reparacin de
apareamientos errneos


Bioqumica y biologa molecular Replicacin y reparacin del DNA
Laura Esteban Luca 92












Transcripcin en procariotas
a) Introduccin
b) Conceptos bsicos
c) Terminologa
d) Proceso de transcripcin
e) Regulacin de la transcripcin en procariontes
INTRODUCCIN
La cantidad de informacin de los organismos es muy
grande, habr unos 3000 millones de pares de bases. En su
interior estarn los genes, la mayor parte de los millones
de bases no son genes, sino secuencias intergnicas que no
se transcriben pero puede que intervengan en la regulacin
de la transcripcin.
Se calcula que hay unos 30000 genes en el genoma
humano. Otros organismos como los gusanos tienen ms genes. Cul es la razn por la
que un organismo ms complejo tiene menos genes? Depende en gran medida de las
diferencias de regulacin de la informacin.
PROCESO

La informacin es la misma
pero cada clula est especializada
en distintas funciones


EXPERIMENTO
Eliminaron el ncleo de un ovocito de
rana. Dejaron el citoplasma sin informacin
gentica. Le aadieron el ncleo de una clula
de intestino (muy especializada) para ver si
realmente se llevara a cabo el desarrollo de la
rana. La respuesta fue afirmativa.

Bioqumica y biologa molecular Transcripcin del DNA
Laura Esteban Luca 93
Todas las clulas tienen la misma informacin gentica.
cmo son capaces las clulas de leer la informacin de un
modo tan selectivo? REGULANDO LA EXPRESIN DE SUS
GENES.
Habr dos tipos de genes:
Constitutivos: bsicos para las clulas, todas los expresan, son aquellos que codifican
para el mantenimiento de la clula, glicolisis
Especializados: expresados por algn tipo de clula o subgrupo. Luxury genes
La expresin variara en:
Se expresa o no
Cuanto se expresa
Cuando se expresa
El resultado es LA DIFERENCIACIN CELULAR
CONCEPTOS BSICOS
DOGMA DE LA BIOLOGA MOLECULAR:. La informacin se transforma en
accin por un ciclo.
DNA RNA protena

GEN: es una unidad que codifica para un fragmento de protena.
TIPOS DE RNAs: mensajeros (codifican), transferencia (no da lugar a protena),
ribosmicos (no dan protenas), pequeos (nuclear, nucleolares y microRNAs todos
desempean un papel funcional muy importante a nivel celular. Estn en la base de
muchos procesos patolgicos)
EXPRESIN GNICA EN PROCARIONTES VS EUCARIONTES: la expresin
en procariontes es muy sencillas, DNA RNA protenas. En eucariontes es muy
compleja. Est determinado por el ncleo que tendr modificaciones de las protenas.
DIFERENCIAS ENTRE RNA Y DNA
El RNA est formado por ribonucletdos (tiene OH) y los DNA de
desoxirribonucletidos
Las bases tambin se diferencian: el uracilo solo est en el RNA y la timina en el DNA
El RNA es siempre un polmero de enlaces entre 3OH y 5.
Tendrn una polaridad, podremos identificar los extremos 3 y 5
5 3
Bioqumica y biologa molecular Transcripcin del DNA
Laura Esteban Luca 94
TERMINOLOGA
CADENA CODIFICANTE
Codifica al RNA, ya que es la que da la ausencia.
CADENA SIN SENTIDO O MOLDE:
No da RNA, sirve de molde sobre el que se copia la otra cadena.
UNIDADES DE TRANSCRIPCIN
No todo el genoma se transcribe sino solo un 5%, se selecciona el fragmento a
traducir. Por eso el RNA tiene un comienzo (+1) y un fin (nmero que toque). El
fragmento de DNA entre ambos puntos es la unidad de transcripcin
ORIENTACIN DE LOS GENES
Los genes pueden tener cualquier
orientacin, cada gen puede estar en una
direccin. Cada gen tendr como cadena
codificante una, la superior o la inferior.
PRE-RENAS Y RNAS MADUROS
Normalmente se sintetiza el RNA por precursores, no se sintetiza uno maduro, sino
que se modifica posteriormente. Los que ms modificacin sufren son los mensajeros.
En estos precursores tenemos que tener en cuenta que si hablamos de procariontes
no habr intrones y si son eucariontes s que tienen (los intrones y exones del DNA se
transcriben al preRNA).
Este precursor (pre-mRNA) sufre un procesamiento en el que se eliminan los
intrones pasando a un RNA maduro.
Esto no significa que se traduzca desde el primer al ltimo nucletido del mRNA.
Todos los mRNA maduros tendr una parte 5UTR, una regin codificante para una
protena y una parte 3UTR
REGIONES NO CODIFICANTES
Son las regiones UTR, ya sean 5o 3dependiendo del extremo donde se
encuentran.


Bioqumica y biologa molecular Transcripcin del DNA
Laura Esteban Luca 95
PROCESO DE TRANSCRIPCIN
Al no tener intrones de la transcripcin se obtiene un RNA mensajero que se
traduce sin necesidad de procesamiento.
PROCESO
Se van uniendo nucletidos a los extremos libres, liberando pirofosfato
Crecimiento de las cadenas siempre 53

QUIEN
La sntesis la realiza la RNA polimerasa bacteriana. Es un complejo con distintas
subunidades [
2
]
70
. Tiene una masa aproximada de 450 kDa
a) [2 ]. Core: ncleo enzimtico. Realiza la catlisis
b) : no es importante desde el punto de vista enzimtico
c) 70: inicio de la reaccin

COMO ENCUENTRAN LA RNA POLIMERASA EL INICIO DE LA
TRANSCRIPCIN
Tendr una interaccin especfica con el punto 1 del ADN que tiene que transcribir.
DNA inespecfico DNA (+1)
[
2
] 1 1 No distinguen qu tipo de DNA es. Se
une simple y sintetiza RNA

70
----- ----- Por si misma no es capaz de unirse a
DNA
[
2
]
70
10
-3
10
4
Holoenzima: tiene preferencia por
unirse solamente a los sitios donde se
encuentra la posicin +1

Bioqumica y biologa molecular Transcripcin del DNA
Laura Esteban Luca 96
Delante de los genes habr una secuencia
concreta. Alrededor de una distancia -10 est la
secuencia TATAAT (en bacterias conocido
como PRIBNEW) y -35 TGTTGACA. Estas
secuencias forman la "regin promotora, ser
la regin de unin de la RNA polimerasa
Al unirse
70
interacciona especficamente con estas dos zonas. Depender de la
secuencia, si no es la misma interaccionara peor o directamente no interaccionara.
FASES DE LA TRANSCPCIN
Inicio de la transcripcin
Se une la RNA polimerasa a la zona donde se
tiene que llevar a cabo la transcripcin. Esa zona
comienza a abrirse y la RNA polimerasa identifica el
primer nucletido (10 ms all) y aade el primer
ribonucletido necesario.
La RNA polimerasa no necesita primer o
cebador
Ser una unin muy dbil con el promotor hasta
que han unido ms ribonucletidos que se estabiliza.
En este momento se engancha la RNA polimerasa
totalmente a la cadena.
Cuando la fase de inicio ha terminado, la subunidad
70
se separa para que s que
pueda transcribir el DNA inespecfico.
Fase de elongacin
Es un proceso mecnico de adiccin de nucletidos sobre el molde de DNA. Se
polimerizan unos 50 nucletidos por segundo.
La lleva a cabo el core enzimtico.
Burbuja de transcripcin: zona separada del DNA donde
se est transcribiendo una cadena.

Bioqumica y biologa molecular Transcripcin del DNA
Laura Esteban Luca 97
Fase de terminacin
Hay dos tipos de seales de terminacin
Frecuente: independiente de
Infrecuente: dependiente de
FRECUENTE
Se encuentra una zona con muchas GC seguida por A-T. Suele ir asociada a
formar una estructura secundaria tipo lazo. Se separa la RNA polimerasa porque es ms
estable la estructura RNA-RNA que DNA-RNA

El punto de terminacin no es tan preciso como el punto +1, terminar en U

REGULACIN DE LA TRASCRIPCIN EN
PROCARIOTAS
Se regula la expresin para que crezca ms rpido que las dems, quiere aprovechar
la fuente de nutrientes que tiene. Hay tres mecanismos de regulacin diferentes:

Bioqumica y biologa molecular Transcripcin del DNA
Laura Esteban Luca 98
o Diferentes factores
Existen distintos factores que interaccionan con diferentes promotores.
Por ejemplo hay protenas de choque trmico que se sintetizan cuando se eleva la
temperatura para evitar el plegamiento del resto de protenas. No se tienen que sintetizar
continuamente, por eso se sintetiza HS que se une a unos promotores determinados a
partir de los cuales se empiezan a sintetizar unas protenas de choque trmico.
o Fuerza del promotor
Si el promotor tiene su secuencia un peln cambiada,
70
lo reconoce pero con menor
afinidad, aunque mayor que al DNA inespecfico.

o Protenas reguladoras: activadores y
represores.
MEDIO CON LACTOSA
Jacob y Monod descubrieron que en las
bacterias haba una serie de represores e
inductores, y los operones. Estudiaron la B
galactosidasa y vieron que la formacin de la
galactosidasa estaba unida a la formacin de la
permeasa y a la trasacetilasa. Estaban expresados
en un nico RNA llamado policistrnico. Tendr un solo promotor. La estructura
completa ser conocida como opern. La mayor parte de los genes de procariontes
estn estructurados en operones que controlan sustancias dedicadas a actividades
parecidas.
Estructura del opern de la lactosa
SITIOS DE CONTROL:
o Promotor (p): contiene las regiones -10 y -35 que sern reconocidas
por el factor sigma. Ser un promotor dbil.
o Operador (o): unin del represor (proteico). Solapa con el promotor.
LAC i: codifica para un represor, se encuentra por delante del promotor.
Genes dedicados a la lactosa (galactosidasa, permeasa y transcetilasa)
Bioqumica y biologa molecular Transcripcin del DNA
Laura Esteban Luca 99

FUNCIONAMIENTO del OPERON de la LACTOSA
SIN LACTOSA
Normalmente no hay lactosa en el medio. Para maximizar el esfuerzo gentico
usualmente las bacterias tienen apagado el
opern de la lactosa, ya que no estarn sintetizando
los encimas.
El represor estar unido al operador para evitar
que la RNA polimerasa se instale (no puede porque
el operador solapa con el promotor). Al no
instalarse no se lleva a cabo la transcripcin y no se
formarn las enzimas del operon.
El represor solo tendr afinidad por el operador porque si no fuera as no tendra
sentido
CON LACTOSA
Siempre habr represor en el medio pero puede
tener dos estados:
1) Alta afinidad por el operador y por lo tanto unido
a el. PROTEINA ACTIVA
2) Unido a un inductor que cambia su conformacin
de forma que pierde la afinidad que tena por la
regin operadora. PROTEINA INACTIVA.
a. El inductor es un pequeo producto parecido a la lactosa, es la allolactosa.
Cuando la protena est inactiva la DNA polimerasa s que puede transcribir el
DNA y generara la galactosidasa, la permeasa y la transacetilasa.


Bioqumica y biologa molecular Transcripcin del DNA
Laura Esteban Luca 100
MEDIO CON GLUCOSA Y LACTOSA
En la zona de control existe un elemento adicional (por delante del promotor). Es
una secuencia de ADN capaz de unir otra protena, la CRP (protena represora del
catabolismo).

Existe en dos estados conformacionales
o unido a cAMP (CRP-cAMP): estado activo
o solo: estado inactivo
Los niveles de cAMP se regulan:
Alta concentracin de glucosa: baja concentracin de cAMP. El cAMP es un sensor
de la glucosa ya que permite modificar su concentracin a nivel que lo hace la glucosa.
Con poca glucosa el CRP est activo porque hay mucho cAMP. El CRP estabilizar
la unin de la RNA polimerasa al promotor ya que este enlace era dbil.
Por lo tanto cuando hay poca glucosa se favorecer la unin de la RNA polimerasa
a la cadena de DNA, en cambio si tenemos mucha glucosa no necesitaremos lactosa, por
lo que el CRP estar inactivo y no favorece la unin de la polimerasa al DNA


Bioqumica y biologa molecular Transcripcin del DNA
Laura Esteban Luca 101

102
Transcripcin en eucariontes
CARACTERSTICAS GENERALES

CARACTERSTICAS Y
DIFERENCIAS CON PROCARIOTAS
El proceso se lleva a cabo en el ncleo, mientras que en procariotas se realizaba en el
citoplasma.
En el ncleo encontramos al DNA unido a unas protenas llamadas histonas
formando una estructura compacta.
El DNA eucariota es mucho ms largo que en procariotas.
Existen varias RNA polimerasas.
La localizacin de promotores requiere muchas protenas y una regulacin ms
compleja.
No hay policistrones, sino unidades de transcripcin monognicas o monocistrnicas,
lo que quiere decir que a partir de un gen se codifica una protena.
Los mRNAs eucariticos sufren un fuerte procesamiento.
RNA POLIMERASAS
En eucariotas existen cuatro tipos de RNA polimerasas:
- RNA pol I: sintetiza los rRNAs 28, 18 y 5,8 s
- RNA pol II: sintetiza los mRNAs, miRNAs y snRNAs
- RNA pol III: sintetiza los tRNAs, snRNAs y rRNAs 5s
- RNA pol mitocondrial: sintetiza los mtRNA y se encuentra en las mitocondrias.
Lo mismo ocurre con la RNA pol de cloroplastos en clulas vegetales.
ESTRUCTURA DE LAS RNA POLIMERASAS
EUCARIOTAS
Las RNA polimerasas I, II y III presentan estructuras catalticas L y L, que son
similares a las y de los procariotas, y son las encargadas de la polimerizacin del
RNA. Adems, estas tres polimerasas tienen dos subunidades parecidas a la de
procariotas y otras pequeas subunidades especficas, que varan de una a otra de la
siguiente forma:
- RNA pol I: tiene 5 subunidades pequeas propias.
- RNA pol II: tiene 4 subunidades pequeas propias.
- RNA pol III: tiene 7 subunidades pequeas propias.


Bioqumica y biologa molecular Transcripcin del DNA
Laura Esteban Luca 103
RNA pol I
Lleva a cabo la sntesis de los rRNA de 28, 18 y 5,8 s. Los genes se encuentran en 5
cromosomas y son de los pocos genes eucariticos con estructura parecida a la de los
operones. La transcripcin se inicia en el punto I hasta el punto T. El DNA codificante
se encuentra intercalado por DNA intergnico.

Las unidades que se transcriben son zonas muy repetidas (100-200
repeticiones) separadas por secuencias que no se transcriben. Hay
muchas repeticiones porque los ribosomas son muy necesarios para
una sntesis de protenas constante.
Reconocimiento de la secuencia
En eucariotas no existen los factores (sigma), pero encontramos
una serie de protenas denominadas factores de transcripcin que
forman un complejo que reconoce al promotor para que luego pueda
unirse la RNA pol I a la cadena de DNA.
- UBF: potencia la unin de SL-1
- SL1 factor de posicionamiento, es un tetrmero
RNA pol I I I
Lleva a cabo la sntesis de tRNA. Los genes que codifican estos RNAs son diferentes
y tienen promotores diferentes. El promotor est en el interior del gen.
Existen distintos factores de transcripcin que reconocen los elementos de la cadena
de DNA y se colocan en sta hasta la llegada de la RNA pol III.
- TF III C: tiene ms de 5 subunidades y permite la entrada de TF III C.
- TF III A: es el dedo de cinc y est formado por un solo monmero.
- TF III B: factor de posicionamiento (como sigma). Es un trmero formado por
TBP y dos TAFsIII.
Los tRNA son muy necesarios. La RNA pol III est sintetizndolos continuamente y
est muy poco regulada. La cantidad de tRNA y de RNA 5s depende de la muerte
programada de los tRNAs.
Los tRNA tambin se procesan (en procariotas tambin). Tienen una estructura
secundaria en forma de trbol, que tiene seales para las RNAasas, que actuarn
dependiendo de la regin del RNA:
- Extremo 3: adiccin de CCA
(nucleosidil transferasa)
- Modificaciones de bases
- Extremo 5: RNAasa P
- Extremo 3: RNAasa D
La estructura secundaria es muy estable y se forma inmediatamente despus de la
sntesis.
Bioqumica y biologa molecular Transcripcin del DNA
Laura Esteban Luca 104
BIOGNESIS DE RIBOSOMAS
Est regulada por control de la estequiometria de los rRNAs y las protenas
ribosmicas S y L.
Los ribosomas se sintetizan en el nuclolo. La RNA pol I transcribe fuertemente sus
RNA, que rpidamente son modificados (procesamiento). Esto conlleva la modificacin
de las bases y el corte de trozos de RNA que sobran.

RNA pol I I
En esta polimerasa encontramos una extensin, un dominio carboxiterminal (CTD)
que es una repeticin de una pequea secuencia de 7 aminocidos fosforilables. Estos
aminocidos son sustratos de las quinasas, y como son fosforilables, se pueden regular.
La RNA pol II tiene que regular su actividad de modo muy preciso. La
diferenciacin celular es la regulacin de la expresin de los mRNAs. La diferenciacin
celular dota a cada clula de los mRNAs adecuados.
Maduracion de mRNA
Existen grandes diferencias en el proceso entre eucariotas y procariotas. En este caso
se sintetizar primero un pre-mRNA, cuya maduracin se producir en el ncleo.

Bioqumica y biologa molecular Transcripcin del DNA
Laura Esteban Luca 105
PROMOTORES
Son seales que marcan el sitio de inicio de la transcripcin. Tienen al menos dos
elementos que forman el promotor proximal:
- Promotor basal: se encuentra cerca del punto +1 por la parte 5
- Zona reguladora

Juegan un papel muy importante las zonas reguladoras distales, que pueden estar a
cualquier distancia del promotor proximal y localizarse tanto en la parte 5 como en 3
respecto al mismo. Son esenciales para la actividad del promotor y pueden ser
potenciadores (enhancers) o silenciadores segn si activan o inhiben la transcripcin.
Los promotores basales son seales que marcan el sitio de inicio de la transcripcin.
La RNA polimerasa II no puede encontrar la secuencia de DNA por s sola, necesita
protenas auxiliares. El conjunto de protenas auxiliares forma el aparato basal de
transcripcin.
Tiene que haber una serie de mecanismos que aseguran que este proceso sucede de
una forma especfica, de manera que cuando la RNA pol tiene que comenzar la sntesis
es porque se dan las condiciones fisiolgicas para que ocurra.
Los elementos que regulan son los elementos de control en la regin proximal y el
promotor proximal y otros potenciadores en cualquier posicin (hasta en 5).

Bioqumica y biologa molecular Transcripcin del DNA
Laura Esteban Luca 106
Regulacin por protenas de unin al
DNA en sitios especficos
Son protenas que se unen a secuencias de DNA para transcribir la secuencia de un
determinado gen. En eucariontes el concepto es bsicamente idntico pero con mayor
cantidad de protenas. Tienen afinidad con una determinada secuencia de DNA y se
unen a ella en un proceso altamente especfico.
Su funcin es unirse a la zona proximal y estabilizar a la RNA pol II. Todos los
promotores de la RNA pol II en eucariontes son dbiles porque la zona de unin de la
RNA pol II es una zona con poca afinidad, pero existen una gran cantidad de protenas
que se unen a fragmentos de DNA en secuencias especficas para estabilizar el enlace de
la enzima en la posicin +1.

Su funcin reside en el ncleo y tiene una capacidad de interaccionar
especficamente con el DNA. Es muy frecuente que acten como dmeros, pero no es
indispensable. Cada factor interacciona con una secuencia especfica.
El nmero de factores de transcripcin es de miles en eucariotas. No podemos hablar
de factores de transcripcin como un ente independiente sino de un factor y de una
secuencia reconocida (motivo secuencia especfica) siempre.
CARACTERSTICAS DE LOS
FACTORES DE TRANSCRIPCIN
Su estructura de un modo global consiste en un dominio de activacin y un dominio
de unin al DNA. Pueden distribuirse aleatoriamente a lo largo de la cadena pero tiene
que haber al menos uno de cada tipo.
- Dominio de unin al DNA: zona que tiene la capacidad de interaccionar con el
DNA en secuencias especficas.
- Dominio activador: interacciona con el mecanismo basal de transcripcin.
Bioqumica y biologa molecular Transcripcin del DNA
Laura Esteban Luca 107

El dominio que da verdaderamente la especificidad es el dominio de unin al DNA.
Se puede hacer un experimento en laboratorio de forma que se observa que los dominios
activadores son inespecficos y funcionan con cualquier dominio de unin.
Aunque hay miles de factores todos se pueden clasificar en familias con motivos
estructurales relativamente parecidos. El nmero de familias son decenas.
*Ejemplo: Zinc Finger, bZIP, homeodominio, bHLH (hlice-giro-hlice).

- Dedos de zinc: hay dos zonas que son como dos dedos que se introducen en el
DNA y dependiendo de los aa que haya en el dedo de zinc se unir a una
secuencia o a otra.
- Las cremalleras de leucina son dos colas largas de leucina capaces de
interaccionar con el DNA.
La estructura estar seleccionada por la evolucin.
Hay cientos de protenas con funciones diferentes pero que se pueden agrupar en
dominios con estructura y funciones parecidas.

Bioqumica y biologa molecular Transcripcin del DNA
Laura Esteban Luca 108
FACTORES DE TRANSCRIPCIN (TF)
GENERALES EN EUCARIOTAS
TF II A y TF II B: ayudan a formar el complejo de inicio de la transcripcin.
TF II D: es la parte ms importante y tiene muchas subunidades, entre las cuales
encontramos:
o TBP: protena de unin a la caja TATA.
o TAFs: protenas o factores asociados a la TBP. Son alrededor de 14
protenas.
TF II E: recluta la TF II H y tiene actividad helicasa y ATPasa.
TF II F: tiene 3 subunidades. Se une a la RNA pol II y la lleva al lugar de inicio
de la transcripcin. Se forma el complejo de preiniciacin.
TF II H: consta de 9 subunidades, de la cuales 3 son muy importantes:
o Subunidad con actividad helicasa
o Subunidad con actividad ATPasa
o Subunidad con actividad kinasa: fosforila la cola CTD a expensas de
ATP, lo que supone una seal para el inicio de la transcripcin.














Bioqumica y biologa molecular Transcripcin del DNA
Laura Esteban Luca 109
En toda la zona proximal existe un conjunto de motivos reconocidos por protenas
reguladoras que son esenciales para estabilizar a la RNA pol II. Sin los factores, la RNA
pol II nunca podr iniciar la transcripcin, se unir a la caja TATA pero se soltar
pronto.
Si estn unidas las protenas reguladoras = transcripcin del gen.
Si no estn unidas las protenas reguladoras = no transcripcin del gen.
Un factor de transcripcin puede regular la expresin de muchos genes porque no es
especfico de un gen, sino de un motivo reconocido de secuencia de DNA que puede
estar en un gen o en cientos.
REGULACIN DE LA ACTIVIDAD DE LOS
FACTORES DE TRANSCRIPCIN
- La va ms importante de regulacin es que se sintetice el factor de
transcripcin.
- Puede que el factor de transcripcin est en la clula pero en estado inactivo.
Una seal de fosforilacin puede activar o inactivar el factor.
- Puede que cuando se una un ligando se active, o se inhiba.
- Hay seales externas que influyen en los factores de transcripcin y los activan e
inactivan.
- Regulacin por separacin de un inhibidor
- Regulacin por separacin de subunidades de un dmero.
Un patrn de expresin gnica no puede ser inflexible sino que cuando llegan seales
externas la clula cambia su patrn de expresin. Los factores pueden cambiar su estado
en un determinado momento.
LOS PATRONES DE EXPRESIN GNICA SON MUY MODULABLES SEGN
LAS CONDICIONES FISIOLGICAS DEL ORGANISMO.
La regulacin de la expresin gnica es especfica de tejido (combinacin de factores
de transcripcin).

Bioqumica y biologa molecular Transcripcin del DNA
Laura Esteban Luca 110
En la zona reguladora de los genes se pueden unir un nmero indeterminado de
factores de transcripcin. Normalmente, la zona reguladora de la expresin gnica tiene
muchos sitios especficos que se unen a factores de transcripcin.
Los promotores tienen que integrar la respuesta de la zona reguladora y lo hacen
constantemente. Es la zona que tiene la capacidad de unir un gran nmero de protenas
de transcripcin.
[No suele haber una reaccin de todo o nada, sino que es una escala segn la
cantidad de factores de transcripcin activos.]
Una clula tiene un comportamiento fisiolgico especfico porque tiene un patrn de
expresin determinado.
ENHANCERS (POTENCIADORES)
Son zonas que regulan la expresin gnica pero que estn situadas en zonas bastante
alejadas de los genes (-200, -1000) y que son capaces de activar fuertemente la
expresin del gen.
- Activan la transcripcin.
- Los potenciadores actan sobre el promotor proximal. Para que exista regulacin
de la transcripcin de una zona lejana tiene que existir un promotor.
- Un enhancer puede situarse en cualquier posicin (3 o 5) antes o despus del
promotor o del inicio del gen.
- Independientes de la orientacin.
RECUERDA: la nomenclatura de estos factores de transcripcin es BRBARA, es un
nombre no racional que le puso cada descubridor al suyo.
Funcionamiento
Los enhancer son zonas de DNA donde hay una alta concentracin de motivos
reconocidos por factores de transcripcin. Tiene varios motivos de secuencia. En
principio acta slo como un atractor de protenas. Existe la posibilidad de que se doble
el DNA de forma que el complejo de protenas del enhancer interaccione con una zona
reguladora proximal.

La estabilizacin de la maquinaria basal depende de las protenas reguladoras, del
promotor y de los enhancer. Dependiendo de la regulacin de la seales, la expresin
ser de una forma u otra.
Bioqumica y biologa molecular Transcripcin del DNA
Laura Esteban Luca 111

La maquinaria basal ha sido capaz de unirse al DNA, pero si no hay nada ms no
ser estable y la expresin sera floja. Se han unido protenas que interaccionan con el
DNA y por su parte reguladora e interaccionan con la maquinaria basal estabilizndola
y mantenindola unida. Lo mismo ocurre con el enhancer desde el plegamiento del
DNA. La frecuencia de inicio de transcripcin ser muy alta.
La regulacin de la expresin gnica se basa en la existencia de un conjunto de
protenas reguladoras. En un contexto fisiolgico supone un gran nmero de protenas
que intervienen en cada proceso.
INTEGRACIN DE LAS SEALES EN UN
PROMOTOR
La maquinaria basal integrar todas las seales (transcipcin y enhancer). Cuantos
ms seales integren mayor estabilidad tendr la RNA polimerasa, si no hubiera todas
estas uniones de factores de transcripcin se disminuira gravemente la transcripcin
CO-ACTIVADORES
La interaccin la mayor parte de las veces es indirecta. Los co-activadores son
protenas que median la unin entre la maquinara basal de transcripcin y el factor de
transcripcin.
La unin de los factores de transcripcin al DNA es siempre directa.
CO-REPRESORES.
Existe la posibilidad de desestabilizar la maquinaria basal de transcripcin. Se
conseguira mediante los co-represores.
Usualmente las protenas se encargarn de estabilizar la maquinara basal pero en
ciertas condiciones podrn ser represores. De esta forma da mayor estabilidad al
sistema.

Bioqumica y biologa molecular Transcripcin del DNA
Laura Esteban Luca 112
Regulacin de la transcripcin

El DNA est unido a unas protenas llamadas histonas que van
empaquetando el DNA de una manera ms o menos compleja y
que tienen la capacidad de unirse a otra serie de protenas con un
empaquetamiento algo mayor. Cuando el cromosoma se encuentra
en metafase el empaquetamiento es mucho mayor.
La situacin en la que nos encontramos el ncleo es
empaquetado sobre s mismo, por lo que las enzimas necesitan un
mecanismo para acceder a los nucletidos. Es necesario pasar de la
estructura condensada a una estructura con huecos donde poder
interaccionar. Necesitan que se desestructure la cromatina.
- Procesos de modificacin covalente de histonas. Pueden ser
modificadas y esa interaccin interviene en abrir y hacer
accesible el DNA.
- Factores de remodelacin de la cromatina.
- Regulacin de la metilacin (islas CpG) metilacin del DNA
MODIFICACIONES COVALENTES
DE HISTONAS
Hay una gran cantidad de enzimas que son capaces de modificar las histonas, de
acetilarlas y desacetilarlas, metilarlas y desmetilarlas (metilacin de las histonas),
fosforilacin, ADP-ribosilacin o ubiquitinacin.
Los ms importantes son la acetilacin y la desacetilacin.

Existen dos tipos de actividades: acetiltransferasa (HATs) se encarga de transmitir
grupos acetilos y abren la estructura de los nucleosomas y permite que el DNA est ms
relajado, ms libre. Esto conlleva la activacin de la transcripcin.
Hay otra actividad, la desacetilasa (HDACs) que retira los grupos acetilos de las
histonas y favorece la conformacin inactiva. Esto es un proceso de represin.
Bioqumica y biologa molecular Transcripcin del DNA
Laura Esteban Luca 113
A nivel de cromatina uno de los elementos claves son las actividades
acetiltransferasas.

La acetilacin de histonas es llevada a cabo por una familia de enzimas llamadas
histona acetil transferasa (HAT). PCAF y Gen 5 son las ms importantes.

Aparte de interaccionar con los factores de transcripcin, son capaces de activar a las
histonas, por eso fueron definidos como importantes coactivadores.
La acetilacin de las histonas es uno de los mecanismos que abre la cadena de DNA.
Bioqumica y biologa molecular Transcripcin del DNA
Laura Esteban Luca 114
Desacetilasas humanas: se pueden agrupar en familias y se nombran con nmeros.
Hay una familia importante que est relacionada con la desacetilacin de las histonas
para reprimir la cromatina. Los represores tienen actividad histona represora.

Se va pasando por conformaciones cada vez ms abiertas hasta liberar el DNA.
FACTORES DE REMODELACIN DE
CROMATINA
Grupo de enzimas que hidrolizan ATP y se unen a la zona permitiendo que las
histonas se vayan moviendo. No incide directamente sobre la actividad de la histona,
sino que permite que se vaya deslizando por la hebra de DNA.
Es necesaria una protena ATPasa en el complejo.

Bioqumica y biologa molecular Transcripcin del DNA
Laura Esteban Luca 115
Hasta ahora hemos visto cmo se modifican las histonas, pero tambin se puede
modificar el DNA en s. Un ejemplo es la metilacin del DNA, que est asociada a una
cromatina inactiva, reprime la expresin gnica.
Islas CpG
En el genoma existe CpG. Hay zonas que tienen una alta presencia de estos
nucletidos CpG y son zonas cercanas a muchos promotores, de manera que cuando su
concentracin es muy alta se denominan islas CpG.
Existe la posibilidad de que a la citosina le entre un metilo y pase a formar 5-
metilcitosina. El dmero CpG puede estar en dos estados diferentes:
a) Sin metilar activa
b) En un estado metilado inactiva
Cuando est en un estado desmetilado, esto es una zona activa en transcripcin,
mientras que cuando la citosina est metilada, es una cromatina inactiva en
transcripcin. Todo esto sucede porque hay enzimas que reconocen este nucletido y no
otro.
Al principio se vio que todos los organismos tienen un grado de metilacin variable
en su DNA.
*Ejemplo: hay dos genes que codifican a la globina: globina y globina . Hay una
temporada en la vida del neonato en que se producen cambios importantes, hasta en la
expresin gnica. Se produce una transicin del gen de la globina al gen de la globina
. Primero el de la globina gamma est altamente metilado e inactivado, mientras que el
psilon est activo. Luego se invierte la situacin.
Hay determinados genes que estn sometidos a fenmenos de imprinting es decir
que slo se expresa un alelo. Es un mecanismo de la metilacin selectiva de uno de los
alelos en su promotor, lo metilan, y hacen que sean inactivos el resto de su vida.
La metilacin se hereda: el estado de metilacin se transmite de clula a clula.
Existen fenmenos patolgicos en los cuales hay cambios de expresin gnica como
en el cncer, que lleva asociados unos cambios muy importantes en los patrones de
expresin gnica y muchos de ellos son cambios de metilacin. Durante el proceso
cancergeno, se activan mecanismos de metilacin y desmetilacin.
Cualquier intervencin de metilacin provoca un cambio en los patrones de
expresin gnica y produce los fenmenos epigenticos (con un mismo genotipo puede
haber distintos fenotipos y patrones de expresin). Pueden producirse por fenmenos
patolgicos y ambientales.
*Ejemplo: durante la 2 guerra mundial, una poblacin de Holanda estuvo sometida a un
periodo de hambre muy prolongada. Cambi su metabolismo para adaptarse a las
nuevas condiciones. Esto provoc un cambio en la metilacin de su DNA y se
transmiti a los hijos. Al estudiar la alta incidencia de la obesidad en esta poblacin, se
vio que la reaccin era distinta a otras poblaciones porque en lugar de una mutacin, se
daba una metilacin diferente.
Bioqumica y biologa molecular Transcripcin del DNA
Laura Esteban Luca 116
LOS FACTORES DE
TRANSCRIPCIN EN ACCIN
Receptores nucleares (ejemplo)
Las clulas no slo son capaces de mantener sus genes en un estado de metilacin o
no metilacin, sino que tambin pueden cambiarlo.
- Factores de transcripcin inducibles por ligando.
- Activadores o represores transcripcionales.
- Intracelulares. Ejercen su funcin en el ncleo.
- Superfamilia: 50 familias de receptores nucleares, 150 protenas diferentes.
- Ligandos: pequeas molculas lipoflicas (hormonas, vitaminas, seales de
fosforilacin, etc)
*Ejemplo: el propio receptor de la hormona era un factor de trascripcin. Se unen
esterioides, vitamina D, progesterona, glucocorticoides, retinoles, incluso cidos grasos.
Los receptores de sustancias lipdicas se encuentra en el ncleo.

La estructura de estos receptores es una estructura tradicional: tiene una zona de
unin de DNA, dos zonas de activacin y una zona para que se una el ligando. Cuando
llega el ligando cambia su conformacin, y esto es lo que hace que cambie su actividad.

Siempre una protena para pasar de estado activo a inactivo y viceversa requiere un
cambio conformacional.
El receptor est normalmente en el citoplasma, ante una seal entra en el ncleo, se
une a su ligando y provoca su accin.
Bioqumica y biologa molecular Transcripcin del DNA
Laura Esteban Luca 117
Si el receptor tiene un inhibidor, llega el ligando, releva al inhibidor y activa al
receptor.

Cuando llega el ligando entra en el interior, se une al DNA y recluta a toda la
maquinaria que acetila la cromatina, que est permitiendo que la polimerasa funcione.
Hay receptores que estn en el ncleo o que estn en el citoplasma. Los receptores no
necesitan transportadores, son lipoflicos y entran por difusin.
La hormona est rodeada de zonas de DNA condensado y segn va desplazndose
cambia su conformacin y as va abriendo y llevando a cabo su funcin.
Esto hace al sistema fcilmente modulable.

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Otras fotos





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Bioqumica y biologa molecular Transcripcin del DNA
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Bioqumica y biologa molecular Transcripcin del DNA
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122
Procesamiento de pre-mRNAs
La transcripcin de los mRNA conlleva la transcripcin completa del DNA desde el
punto +1 hasta el final. El procesamiento dura desde que se sintetiza el pre-mRNA hasta
que se termina el mRNA maduro

Todos los procesos se realizan en el interior del ncleo.
Procesamiento de pre-mRNA
Existen cuatro niveles de modificacin del mRNA:
1. Hay que modificar su extremo 5 aadiendo una CAP
2. Modificacin del extremo 3 aadiendo una cola de poli A
3. Eliminacin de los intrones (splicing)
4. Edicin de RNAs
ADICIN DE UN GORRITO A LOS PRE-MRNAS
Los mRNA cuando se sintetizan lo hacen con polaridad 5 3 y el primer
nucletido que hay tiene todava el trifosfato porque no ha formado ningn enlace
fosfodiester en su 5.
Esta situacin es tremendamente inestable. Por eso, se le aade 7-metilguanina, que
forma un enlace 5-5 con el primer nucletido.
Bioqumica y biologa molecular Transcripcin del DNA
Laura Esteban Luca 123
La presencia de la guanina invertida es lo que se conoce como gorrito y es la
proteccin que tienen todos los mRNAs eucariticos contra las ribonucleasas y participa
en la unin al ribosoma. Sin ella no se pueden traducir.

Se libera un fosfato del nucletido 5y la guaniltransfersa aade el grupo Gp de un
GTP, liberando PPi. Posteriormente se metilar esta guanina quedando el residuo de 7-
metilguanina que forma la gorrita
ADICIN DE LA COLA DE POLI-A
El RNA mensajero se sigue sintetizando en forma de pre-mRNA hasta que se finaliza
la sntesis. Todos, a parte de la proteccin de CAP en 5, tienen una cola de poli-
adenilacin (poli-A). Pueden tener distintas longitudes, pero no hay casi ningn
mensajero que no la tenga. Este proceso se realiza bsicamente por la adicin de
adeninas por la poli A polimerasa. Es un proceso complicadsimo donde intervienen
numerosas enzimas.
La secuencia AAUAAA es una seal de
reconocimiento para la maquinaria de
transcripcin. Una endonucleasa cortar a
unos 30 nucletidos por delante de la
secuencia AAUAAA y una poli A polimerasa
aadir la cola de poli A a expensas ATP.
La cola de poli A sirve de sitio de unin de
una o varias protenas (PABP) especficas. La
cola y sus protenas asociadas protegen al
mRNA de la destruccin enzimtica.

Bioqumica y biologa molecular Transcripcin del DNA
Laura Esteban Luca 124
Ambas modificaciones, tanto la de 5 como la de 3, tienen varias
funciones:
- Importante para la estabilidad de los mRNA desde su situacin como pre-
mRNA. Aquellos que no las tienen son muy inestables y se degradan.
- Importante para la salida o transporte al citoplasma. El transporte de los mRNA
desde el ncleo al citoplasma est bastante controlado por los poros nucleares y
es fundamental que tanto 5 como 3 tengan sus modificaciones.
- Importante para su traducibilidad.
SPLICING: PROCESO DE ELIMINACIN DE
INTRONES
Se observ que los mRNA eran molculas muy largas y que en lugar de ser lineales
tenan una serie de lazos. Si se purificaban los mensajeros del citoplasma, todos tenan
un tamao relativamente pequeo, pero si se purificaban los del ncleo se vea que eran
muy grandes. Por eso, se pens que el mRNA del ncleo y del citoplasma no eran
iguales y al del ncleo se le llam RNA heterogneo nuclear (RNAhn).
Casi todos los genes tienen intrones y exones.
*Ejemplo: El gen de la distrofina ocupa un
tamao de 2,5 millones de nucletidos y, cuando
se sintetiza el mRNA primario, lo que ha tenido
que suceder es la sntesis de un mRNA de 2,5
millones de nucletidos, pero luego el mRNA que
de verdad se traduce es mucho ms corto porque
se han eliminado los intrones. Este proceso puede
llevar horas.
Funcionamiento
La eliminacin de un intrn tiene que ser increblemente precisa, no se puede
producir un error ni siquiera de un nucletido, ya que es un grave problema en la
sntesis de protenas. Un fallo de un solo nucletido en el corte del intrn supone la
degradacin del pre-mRNA.
El funcionamiento del splicing depende de la precisin de la maquinaria a la hora de
seleccionar el nucletido donde cortar.
A) Reconocimiento del intrn
Un intrn es una secuencia de DNA que no se diferencia de una secuencia
codificante. La maquinaria de splicing lo reconoce por medio de secuencias definidas
que indica un borde intrn-exn. Lo primero que se hizo fue buscar los bordes intrn-
exn.

Bioqumica y biologa molecular Transcripcin del DNA
Laura Esteban Luca 125
Lo que necesitan las nucleasas para localizar el borde exn-intrn (borde 5 del
intrn) es la combinacin GU.
A continuacin se encuentra el intrn, que puede tener muy distinta longitud:
puede ser desde 3 nucletidos a 30000, no tiene un tamao definido, es
simplemente una zona que sobra en el pre-mRNA.
Lo que tiene que haber en el otro borde del intrn (extremo 3) es AG.
Todos los intrones se eliminan por la regla GU/AG. Hay una serie de secuencias que
tienen que estar conservadas y stas son unas de ellas. Si no se encuentra la seal de
splicing no se producen.
Suele haber una secuencia alrededor del borde que puede ser AG-GU-AAGU en
el extremo 5 y (Py)
n
NC-AG-G, pero esto es variable.
AG GU AAGU -----------------------A-------------------------(Py)
n
NC AG G
A una distancia cerca del extremo 3 tiene que haber una A, que es conocida
como sitio de ramificacin.

B) Eliminacin de intrones: reaccin de splicing
La maquinaria es muy sencilla y siempre igual. Se produce un pequeo doblez y la
adenina de la zona de ramificacin (cercana al extremo 3 del intrn) lleva a cabo un
ataque nucleoflico desde su grupo OH (posicin 2) al enlace fosfodiester entre el
ltimo nucletido del primer exn y la G primera del intrn. Entonces la adenina queda
unida con la G de la secuencia GU formando un lazo (que son los lazos que se ven con
microscopa electrnica).
Como el OH que ha quedado en el 1 exn es muy reactivo, hace reaccin con el
primer nucletido del 2 exn formando un enlace fosfodiester y expulsando al intrn
por su secuencia AG. El intrn con forma de lazo se degrada rpidamente ya que es
muy inestable.

Bioqumica y biologa molecular Transcripcin del DNA
Laura Esteban Luca 126
Por eso se dice que la eliminacin de intrones se realiza mediante dos reacciones de
transesterificacin. Son las dos nicas reacciones qumicas que tienen lugar durante el
procesamiento del mRNA.
1 transesterificacin 2 transesterificacin

Maquinaria de eliminacin de intrones
La maquinaria de eliminacin de intrones es la que media estas reacciones catalticas
y es un complejo macromolecular enorme en el que intervienen muchsimos
componentes. Se encuentra en el ncleo y se denomina espliceosoma o maquinaria de
splicing (conjunto de todos los factores implicados en la eliminacin de los intrones).
Est formada por 5 snRNAs unidos a protenas (Sm y otras), formndose una
ribonucleoprotena llamada snRNP. Se las llama snUs.
Espliceosoma = snRNP (snRNAs + Sm) + factores de splicing
snRNP Tamao
snRNA
(nucletidos)
Papel
U1 165 Se une al sitio de splicing 5 y luego al 3.
U2 185 Se une al sitio de ramificacin y forma parte del centro
cataltico.
U4 145 Colabora en la actividad cataltica de U6.
U5 116 Se une al sitio de splicing 5.
U6 106 Cataliza el splicing.
Bioqumica y biologa molecular Transcripcin del DNA
Laura Esteban Luca 127
Para que se lleve a cabo correctamente ha de haber una serie de protenas llamadas
factores de splicing.
Son RNAs muy pequeos con una estructura secundaria ms o menos fija y todos
ellos tienen unida al menos una protena llamada Sm.
Proceso
1. Identificacin del sitio donador de splicing (GU). Sitio que separa el intrn y el
exn.
2. Llega la ribonucleoprotena U1 e identifica la zona de borde exn-intrn (sitio
donador del splicing). La identifica porque se puede aparear la colita CA con la
GU. Esta unin puede ser ms o menos fuerte. Si la unin fuera muy fuerte, este
proceso no se podra regular, pero si la reaccin es variable, se puede ayudar.
3. La adenina del punto de ramificacin tiene una peculiaridad y es que cuando se
aparea la cadena con el mRNA U2, ella queda un poco fuera de la cadena y no
se aparea. Esta es la seal de que ese fragmento es el intrn.
[Esa posicin permite a la A del sitio de ramificacin formar el enlace con la G del
sitio donador de splicing.]
4. Una vez se reconocen los extremos 5 y 3 del intrn se unen todas las
ribonucleoprotenas del complejo y finalmente hay una salida de U1 y U4 y se
quedan dentro la U6, U2 y U5. La pareja U6 U2 es muy importante.

El reconocimiento depende de U1 en 5 y U2 en 3 y el resto de protenas del complejo
entran por reacciones protena-protena formando una macroenzima que permite las dos
reacciones de transesterificacin. Dos snRNAs para identificar y tres snRNAs para
llevar a cabo la actividad cataltica.






Bioqumica y biologa molecular Transcripcin del DNA
Laura Esteban Luca 128
MECNICA DEL PROCESO: TRANSCRIPCIN
Y PROCESAMIENTO EN ACCIN
Los procesos de transformacin del 5 y 3 son procesos que se van produciendo
secuencialmente segn el RNA se va sintetizando. El RNA se suele unir rpidamente a
protenas nucleares llamadas SR o SRr. Cuando estamos cerca del borde exn-intrn
encontramos el factor ASF/SF2 que se une a una secuencia del exn.
La zona de transcripcin tambin es capaz de unir otro de los factores de splicing. En
la zona rica en pirimidinas tambin se une un factor de splicing.
La unin de las ribonucleoprotenas se est realizando sobre un sustrato de RNA al
que se unen de forma ms o menos especfica o inespecfica.
Los complejos comienzan a interaccionar entre s y esto es lo que hace que los dos
bordes que parece que estn muy lejos se vayan acercando entre s. Se forma una
estructura muy grande de un tamao parecido al del ribosoma
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Bioqumica y biologa molecular Transcripcin del DNA
Laura Esteban Luca 133
SPLICING ALTERNATIVO
El genoma humano es muy grande (alrededor de 30000 genes), pero los exones
ocupan slo un 1,5%, el resto se encuentra como secuencias intergnicas o en intrones.
Se generan unas 100000 o 200000 protenas de los 30000 genes que hay. Esto se
explica por el llamado splicing alternativo, que es parte de la regulacin del
procesamiento.
E1 --------------------- E2 --------------------- E3 E1 E2 E3 E1 E3 E2 E3
E1 E2

La maquinaria de splicing reconoce los puntos de interaccin. Reconoce una serie de
secuencias conservadas. Los sitios aceptores de splicing pueden reconocerse de un
modo distinto y as se pueden generar distintas protenas porque se forma mRNA
diferente en cada caso. Esto es una importante herramienta para la regulacin del
splicing, esto es, que cada mRNA originado a partir de una cadena de DNA puede tener
sitios de splicing iguales y diferentes. En este momento es donde juega un papel
definitivo que los sitios de splicing sean fuertes o no.
Es un mecanismo de regulacin de la expresin gnica a nivel post-transcripcional.
Puede ser constitutivo si se da en todas las clulas del organismo.
El splicing alternativo es muy frecuente en mamfero e indica que de un nico gen se
puede generar cientos de isoformas diferentes. Ms del 50% de los genes humanos
sufren splicing alternativo.



Bioqumica y biologa molecular Transcripcin del DNA
Laura Esteban Luca 134
REGULACIN DEL PROCESAMIENTO DE PRE-MRNAS
Existen los intersificadores y los silenciadores de splicing.
- Intensificadores (enhancer): suelen ser protenas de la familia SR y estimulan el
reconocimiento de los sitios de splicing para que se procese ah el pre-mRNA.
- Silenciadores (silencers): ocultan los sitios de procesamiento del pre-mRNA.
o Silenciadores exnicos
o Silenciadores intrnicos: familia hnRPN
La vida media de las protenas de sealizacin es corta porque la reaccin que se
requiere ha de ser rpida y no prolongarse indefinidamente.
Los diferentes tejidos expresan un determinado mRNA a partir del mismo gen.
Existen casos extremos en los que a partir de un mRNA se pueden generar miles de
protenas diferentes. Si no existiera este proceso, de un mRNA se formara una protena
como ocurre en bacterias. Esto permite que, con un nico genoma, tengamos un
proteoma enorme.

El sitio de splicing que se usa en unas determinadas clulas pero no en otras se
denomina sitio crptico.
EDICIN DE RNAS (MAMFEROS)
Slo se han encontrado dos casos en el hombre: apo B y el
receptor del glutamato.
Apo B
Se sintetiza su mRNA mensajero y en un determinado
momento existe una secuencia que es CAA y se expresa la
protena Apo B 100. En el otro tejido existe un mecanismo que
cambia la C por una U y se da la secuencia UAA. Esto lo lleva a
cabo una maquinaria que no es sencilla. Esto es una seal de
terminacin de la traduccin y por tanto se forma una protena
de 1252 kDa frente a los 4536 kDa de la otra protena. Se pierde
la seccin que se une a LDL porque no es necesaria en ese
tejido.
Bioqumica y biologa molecular Transcripcin del DNA
Laura Esteban Luca 135
Receptor de glutamato: en neuronas.

Hoy en da se ha puesto en marcha el proyecto exoma: en enfermos de una determinada
enfermedad gentica se obtienen los exones para ver qu elementos tienen en comn.





Bioqumica y biologa molecular Transcripcin del DNA
Laura Esteban Luca 136












Conceptos generales de la traduccin
Transcripcin: transmisin de informacin gentica del DNA a RNA (mismo lenguaje:
nucletidos). Se utiliza un cdigo de cuatro letras: ACTG, ACUG.
Traduccin: transmisin de informacin gentica de mRNA a protenas (distinto
leguaje: 4 nucletidos a 20 aas).
La mayor parte de la energa celular (casi el 90%) se utiliza en la sntesis de
protenas y se forman a una velocidad aproximada de un milln de enlaces peptdicos
por segundo.
CARACTERSTICAS DEL CDIGO GENTICO
- 3 letras: cuando se pudo determinar mediante experimentos el resultado final fue
(tabla) que existan 64 tripletes y que existan familias de tripletes relacionados
que especifican un mismo aminocido.
- Degenerado: redundante, pero especfico.

- No solapante: los tripletes slo se pueden leer de una manera y siempre son los
mismos.
- Sin puntuacin: no se puede saltar ningn nucletido una vez empezada la
lectura.
- Prcticamente universal: el cdigo gentico mitocondrial es algo distinto.
Existe una regla general en la sntesis de protenas y es que todas las protenas
empiezan con metionina, lo cual quiere decir que el primer triplete, el primer codn que
se lee cuando va a ser traducido es AUG. Hay tres de parada UAA, UAG y UGA
Podemos encontrar una secuencia de DNA cualquiera y predecir si tiene o no
capacidad de codificar una protena. No tendra sentido si estuviera lleno de seales de
parada mezcladas con aminocidos dejando muy pocos entre ellas.
Fase de lectura abierta (ORF): en una secuencia de DNA existe la posibilidad de que
estemos en un fragmento codificante. El genoma est lleno de ORFs que son secuencias
potencialmente codificantes y funcionales que todava estn a la espera de que se
compruebe si lo son o no. El problema es que hay 6 fases de lectura y hay que ver si en
alguna de ellas existe alguna fase abierta.
1


1
Cualquier secuencia de DNA tiene 6 fases de lectura, 3 para una hebra en direccin
5-3 y para la otra hebra otras 3 en la misma direccin.
Bioqumica y biologa molecular Biosntesis de protenas
Laura Esteban Luca 137
tRNA: LA MOLCULA ADAPTADORA
Un mRNA tiene una estructura determinada y la secuencia codificante queda en el
interior de los extremos 5 UTR y 3 UTR.
La molcula capaz de leer el mRNA y traducir esa secuencia es el tRNA. Tienen una
estructura muy conservada y son pequeos. Tienen alrededor de 70 nucletidos y la
habilidad de aparearse entre s.
Los tRNAs son los adaptadores del lenguaje de 4 bases del DNA al lenguaje de 20
aminocidos.
Partes:
- Un brazo aceptor del aminocidos.
- Zona que es el lazo o el loop con dihidrouridina.
- Zona del anticodn: 3 nucletidos en posicin estratgica.
- TC loop.
Los tRNA cargados llevan el amionocido en la posicin con
cadena simple.
En trminos generales las modificaciones son pequeas. Encontramos bases
modificadas qumicamente, entre ellas inosina y dihidrouridina.
La estructura secundaria en forma de trbol es la primera que toma, pero rpidamente
se dan interacciones entre los brazos y toma una forma de L, que es la estructura que
permite que los tRNA entren en la estructura del ribosoma. Esta estructura
tridimensional es fundamental para la realizacin de su funcin.
Los apareamientos de todos los cidos nuclicos son antiparalelos, por lo que si una
cadena se lee 3-AGU-5 de mRNA, el triplete del anticodn ser 3-ACU-5.






Cuando el anticodn se ha unido con el codn, el aminocido que lleva unido tiene
que ser el apropiado.
El cdigo gentico tiene 61 codones con sentido (se quitan los de terminacin). Cada
clula tiene 61 tRNAs, pero tiene varias copias de cada una, adems de que habr varios
tRNAs con anticodones diferentes que sirvan para el mismo aminocido.
Bioqumica y biologa molecular Biosntesis de protenas
Laura Esteban Luca 138

Los tRNAs isoaceptores son aquellos capaces de aceptar el mismo aminocido.
Cuando estn cargados con aminocidos se llaman aminoacil-tRNA (*ejemplo:
isoleucil-tRNA
Ile
).
Puede que existan ms o menos tRNA. En la especie humana se expresan unos 70
tRNAs, es decir, hay ms de los que tericamente se necesitan. En otras especies hay
menos tRNAs de los necesarios.
Crick determin que los dos primeros nucletidos son imprescindibles porque
cambian totalmente el aminocido, pero el tercer nucletido no es tan importante, de
forma que existan tRNAs que leen dos codones, colocando siempre el mismo
aminocido. Y esto experimentalmente se ha demostrado y se ha visto que los
apareamientos entre codn y anticodn no tienen por qu ser del tipo que describieron
Watson y Crick, sino que se dan casos en los que aparean C-T.

HIPTESIS DEL BALANCEO
*Ejemplo: si hay un G en la tercera posicin y el tRNA identifica dos codones (porque
aparea con la C y con la U).
Esta es la hiptesis del balanceo de Crick. Un mismo tRNA puede aparear con dos y
con tres codones.
Al ser posible que dos tRNA distintos apareen con secuencias cuyo ltimo
nucletido sea U o G, pueden ser reconocidas por dos tRNA diferentes, lo que hace que
sean ms de 61. Esto puede ser causado como mtodo de prevencin de mutaciones,
Bioqumica y biologa molecular Biosntesis de protenas
Laura Esteban Luca 139
pero fundamentalmente porque dependiendo de la composicin del genoma de cada
organismo habr tRNAs especficos en cada especie para leer codones que se relacionan
con el mismo aa. Esta variabilidad permite que el cdigo gentico sea degenerado.

RECONOCIMIENTO DEL AMINOCIDO
Es la clave de la fidelidad de la sntesis de protenas. Este proceso lo llevan a cabo
las aminoacil-tRNA sintetasas (ARS). Se piensa que son de las primeras enzimas
catalticas, ya que se cree que la evolucin se basa en una traduccin adecuada mediante
tRNAs.

Son una familia que se organiza en dos grandes grupos segn su estructura. Surgieron
rpidamente en la evolucin ambos grupos y se han mantenido hasta nuestros das.
Cada aminoacil-tRNA sintetasa es especfica para cada aminocido, para cada tRNA o
grupo de tRNAs con el mismo amionocido (reconoce a toda la familia de tRNAs
isoaceptores). Son enzimas nicas para cada aminocido y, por lo tanto, hay 20.
Caractersticas de las manioacil-tRNA sintetasas (ARS)
Bioqumica y biologa molecular Biosntesis de protenas
Laura Esteban Luca 140
- Son las enzimas responsables de la unin covalente de aminocidos especficos
a sus tRNA correspondientes. Leen el cdigo gentico.
- Son esenciales para asegurar la fidelidad el proceso de traduccin.
- Familia de aminoacil-tRNA sintetasas
o Cada ARS es especfica para cada aminocido.
o Existe una ARS para cada aminocido y para cada tRNA o grupos de
tRNAs (isoaceptores) especficos.
- Se clasifican en dos grandes grupos segn su estructura:
o Clase I
o Clase II
Reaccin
Funcionan con una reaccin enzimtica muy sencilla.
ARS + aa + ATP + tRNA
aa
aa-tRNA
aa
+ AMP + ARS + PPi
Se realiza en dos fases:
1. Activacin del aminocido: adenilacin
El aminocido pasa por un estado intermedio: aminoacil-AMP y se libera PPi.
ARS + aa + ATP (entra Mg
++
) ARS (aa-AMP) + PPi
PPi 2 Pi
Cuando el PPi desaparece porque la pirofosfatasa lo degrada, se acelera la
reaccin de activacin del aminocido.
2. Carga del tRNA: aminoacilacin
Reconocimiento del tRNA especfico y formacin del aminoacil-tRNA.
tRNA
aa
+ ARS aa-AMP) aa-tRNA
aa
+ AMP + ARS
Bioqumica y biologa molecular Biosntesis de protenas
Laura Esteban Luca 141

La reaccin se da en el interior del enzima. Pueden unir el tRNA por la posicin 2 o
3
Estas enzimas no se equivocan porque tienen tres sitios de unin muy estrictos:
- Un sitio de unin de ATP.
- Un sitio de unin del aminocido: slo acepta un aminocido y ningn otro.
- Un sitio donde encaja el tRNA: tambin es esencial en la reaccin.


Si el tRNA que se ha unido al aminocido que no es el correcto lo hidroliza
inmediatamente.
Bioqumica y biologa molecular Biosntesis de protenas
Laura Esteban Luca 142
Al unirse al aminocido, la enzima cambia de conformacin. Esto permite que se una
el tRNA correspondiente, se cargue y se suelte.
Tiene actividad correctora: si entra un aminocido incorrecto y lo carga, el enzima
hidroliza la unin y corrige el error. Si esta actividad correctora falla, cuando se une el
tRNA tambin se hidroliza esta unin.

Los tRNAs son muy parecidos y cada ARS tiene sus propios mecanismos para
reconocer los tRNAs que tiene que cargar.
A veces se basa en las posiciones del anticodn y de las regiones prximas a l. Pero
tambin puede ser que reconozca nucletidos situados en la zona del brazo
aminoaceptor.

RIBOSOMA PROCARIOTA
Los ribosomas estn formados por dos subunidades: una mayor y una menor. Ambas
contienen tanto protenas como rRNAs. Los ribosomas son un conjunto de
ribonucleoprotenas con una estructura muy conservada.
- Procariotas: 70s
o Subunidad mayor: 50s
o Subunidad menor: 30s
- Eucariota: 80s
o Subunidad mayor: 60s
o Subunidad menor: 40s



Bioqumica y biologa molecular Biosntesis de protenas
Laura Esteban Luca 143
El ribosoma tiene tres sitios funcionales que ocupan parte de cada subunidad.
1. Sitio A: al que se une el aminoacil-tRNA
2. Sitio P: donde se forma el pptido
3. Sitio E: por el que sale el tRNA, es el ms pequeo.




Bioqumica y biologa molecular Biosntesis de protenas
Laura Esteban Luca 144
Biosntesis de protenas en
procariotas
INTRODUCCIN
(Procariotas y eucariotas)
La traduccin consiste en la adicin
sucesiva de aminocidos desde el
extremo N-terminal al extremo C-
terminal por formacin de enlaces
peptdicos entre los grupos NH
2
y
COOH.
Etapas del proceso
Iniciacin: procesos previos a la formacin del primer enlace peptdico.
Determina la velocidad global del proceso.
Elongacin: crecimiento de la cadena polipeptdica. Se dan ciclos sucesivos de
formacin de enlaces peptdicos. Controla la precisin y fidelidad del proceso.
Terminacin: liberacin del polipptido del mRNA y los ribosomas.
Todas las etapas requieren mRNA, ribosomas y aa-tRNAs. Adems, en cada etapa
intervienen otros factores proteicos especficos.
INICIACIN
Son las etapas previas a la formacin del primer enlace peptdico y requieren:
- Un aa-tRNA iniciador especfico.
- El reconocimiento del AUG iniciador.
- La subunidad pequea del ribosoma (30s/40s).
- Factores de iniciacin especficos:
o En procariotas: IF1, IF2, IF3.
Reconocimiento del mRNA
Lo primero que sucede en el proceso de traduccin procariota es la unin de la
unidad pequea del ribosoma mediante el apareamiento con una secuencia especfica
llamada secuencia de Shine-Dalgarno en el extremo 5 del mRNA. De esta forma deja
el AUG estratgicamente colocado para que se d la iniciacin.
La secuencia Shine-Dalgarno es una secuencia muy conservada en todos los
procariotas que consiste en: UAAGGAGG. Esta seal tiene un apareamiento bastante
estricto con el 16 srRNA de la subunidad pequea del ribosoma.
5 ----UAAGGAGG---AUG--------------UAG-----------3 [mensajero]
3-----AUUCCACC
Bioqumica y biologa molecular Biosntesis de protenas
Laura Esteban Luca 145
Factores de iniciacin
Para que se d la iniciacin se necesitan 3 factores proteicos: IF1, IF2 e IF3.
Los dos que juegan un papel importante manteniendo disociadas las dos subunidades
del ribosomas son IF3 e IF1, que se unen a la subunidad pequea y evitan que se una a
la subunidad grande. Se les llama factores de disociacin y, adems, tienen otra serie de
funciones:
- Estabilizan la unin al mRNA
- Evita que se una cualquier tRNA que no sea el tRNA iniciador
aa-tRNA iniciador
Se tiene que iniciar con un tRNA cargado con formilmetionina, que es el tRNA
iniciador (tRNA
met
i
), el nico capaz de unirse al sitio P de la subunidad ribosmica
pequea. Las metioninas de iniciacin de la cadena polipeptdica estn unidas a un
tRNA
met
distinto, que slo interviene en el proceso de inicio de la traduccin del RNA.
Eso permite que el tRNA sea capaz de unirse a la subunidad pequea (unida al mRNA y
asociada a IF1 e IF3).
Todos los ribosomas tienen que estar unidos a un factor de iniciacin. Cuando se une
el tRNA interviene la IF2 unida a GTP, que une el tRNA y, posteriormente, hidroliza el
GTP a GDP, por lo que esta protena es una GTPasa. Al ocurrir esto, los IP1 e IP3 se
disocian y al subunidad grande se une.

Cuando se une el mRNA por el sitio Shine-Dalgarno, el AUG se coloca
automticamente en la posicin P.
La estructura del ribosoma es una estructura muy precisa, de forma que los codones
van ocupando siempre 3 posiciones especficas.
Bioqumica y biologa molecular Biosntesis de protenas
Laura Esteban Luca 146
ELONGACIN
Se necesitan tambin una serie de factores, los aa-tRNA y que se formen enlaces
peptdicos. En esta etapa se necesitan los siguientes factores de traduccin:
- EF-Tu: transporta aa-tRNA al sitio A.
- EF-Ts: juega un papel secundario, recicla el EF-Tu.
- EF-G: ayuda al EF-Tu a moverse por el mensajero. Translocacin del ribosoma.

1. Los aminoacil-tRNA llegan al sitio A del ribosoma siempre unidos a EF-Tu, que
lleva unido GTP. Se introduce en el sitio A, se queda unido y se libera el EF-Tu
con la hidrlisis de GTP.
2. Formacin del enlace. El enlace peptdico se realiza siempre mediante el ataque
de la cadena polipptdica ya formada al siguiente aminocido que se encuentra
en la posicin A.
3. Ahora se encuentra el ribosoma: el sitio P descargado, el A tiene todo el
polipptido que va creciendo, una situacin que no puede mantenerse. El
ribosoma ha de moverse y para ello interviene la EF-G, que con la hidrlisis de
GTP facilita la energa para el movimiento del ribosoma, volviendo a un estado
en el que se ha desplazado un codn a la derecha.
La elongacin consiste en la repeticin de este ciclo sucesivas veces hasta que se
forma la protena.
La EF-Ts es necesaria para que el EF-Tu unido a GDP se recupere. Es una protena
de intercambio de GDP por GTP.
La clave del proceso es que el apareamiento sea correcto. La formacin del enlace
peptdico la lleva a cabo la peptidil sintetasa, el 23srRNA, es decir, la enzima que forma
enlaces peptdicos es parte de la cadena de srRNA de la subunidad pequea del
ribosoma. Es un ejemplo de ribozima, un catalizador que facilita que el entorno sea el
ms propicio para que tenga lugar la reaccin.
Todos los aa-tRNA intentarn entrar en el sitio A, pero slo aquel que sea
complementario al codn podr entrar al final. Todos los tRNA van entrando y cuando
se hidroliza el GTP se comprueba si el apareamiento es el correcto, si lo es, el tRNA se
queda y se forma el enlace peptdico; si no lo es se separan tanto el tRNA como la EF-
Ts-GDP. El EF-G, cuando se hidroliza el GTP a GDP, comprueba el apareamiento.
Bioqumica y biologa molecular Biosntesis de protenas
Laura Esteban Luca 147

Papel de los factores de elongacin
1. El complejo EF-Tu-GTP transporta el aa-tRNA al sitio A del ribosoma,
formndose el complejo ternario: EF-Tu-GTP-aa-tRNA.
2. Se produce el apareamiento codn-anticodn. Hidrlisis del EFTu-GTP, que
pasa a EF-Tu-GDP + Pi. El EF-Tu-GDP se disocia del aa-tRNA.
La hidrlisis del GTP introduce un primer control del apareamiento codn-
anticodn, ya que la velocidad de hidrlisis es menor para los apareamientos
incorrectos: el codn-anticodn puede separarse porque la unin es inestable.
3. Salida del EF-Tu-GDP del ribosoma. Permite una nueva revisin del
apareamiento. Salida de aa-tRNAs incorrectos. El EF-Tu-GDP se queda en el
ribosoma hasta que sale el aa-tRNA incorrecto.
4. El aa-tRNA queda correctamente apareado al codn y localizado en el sitio A
del ribosoma. Se forma el enlace peptdico y entra el factor EF-G-GTP, que
aporta la energa para desplazar a la subunidad grande, dejando libre el sitio A.
5. Hidrlisis de EF-G-GTP, que pasa a EF-G-GDP + Pi. Se produce la salida del
EF-G-GDP acoplada a la translocacin de la subunidad pequea. El peptidil-
tRNA se localiza ahora en el sitio P del ribosoma. El tRNA se coloca en el sitio
E y se libera.
Bioqumica y biologa molecular Biosntesis de protenas
Laura Esteban Luca 148
TERMINACIN
La finalizacin de la cadena polipeptdica est sealada por un codn de terminacin
del mRNA. A continuacin, la cadena polipeptdica se desprende del ribosoma con
ayuda de factores de liberacin o terminacin.
Las clulas no tienen tRNAs complementarios a los codones de parada (UAA, UGA,
UAG)
Tambin existen una serie de factores: son 4 factores en el caso de procariotas. En
esta fase se va buscando la seal de terminacin.
Los factores de terminacin entran en el sitio A del ribosoma cuando se encuentran
la secuencia de terminacin.
- RF1: muy parecido estructuralmente al tRNA y reconoce a UAA y UAG.
- RF2: muy parecido estructuralmente al tRNA y reconoce UAA o UGA.
- RF3: es otra GTPasa que ayuda a que los otros factores entren.
- RRF: es el factor de liberacin. Permite que se desestructure el ribosoma para
que se produzca la salida del mRNA, el tRNA y las subunidades ribosmicas.
Acta junto a EF-G.

1. Los factores RF1 o RF2 se unen en el sitio A al triplete de parada, facilitado esto por
la asociacin con RF3-GTP.
2. Se hidroliza el RF3-GTP a RF-GDP, facilitando la hidrlisis del enlace peptidil-tRNA
en el sitio P. El polipptido formado sale del ribosoma.
3. La unin del RRF junto a EF-G-GTP permite la salida del mRNA y del tRNA, as
como la disociacin del ribosoma en sus dos subunidades.
Bioqumica y biologa molecular Biosntesis de protenas
Laura Esteban Luca 149

150
Biosntesis de protenas en
eucariotas

TRADUCCIN EN EUCARIOTAS
El proceso es tremendamente similar al de procariotas. Todo es exactamente igual,
pero la fase de iniciacin es un poco ms complicada.
INICIACIN
Diferencias
Lo que es diferente frente a procariotas es el proceso de iniciacin.
1. El reconocimiento del AUG iniciador es completamente diferente.
2. El aminoacil que inicia siempre la cadena es metionina. Slo interviene en la
metionina inicial, pero no es formilmetionina.
3. Los factores de iniciacin son distintos. Todos los factores eucariotas se
nombran con una e al principio.
*Ejemplo: eIF1
4. Existen una serie de factores eIF4s que se encargan de reconocer e interaccionar
con el mRNA.
Factores de iniciacin
- eIF1, eIF3, eIF6: disociacin de ribosoma en 40s y 60s.
- eIF2-GTP:
o Unin del met-tRNA (iniciador)
o Formacin del complejo ternario met-tRNAi-IF2-GTP
o Transporte a la subunidad 40s
- eIF4: reconocimiento e interaccin con el mRNA.
- eIF5: interaccin con 60s y asociacin a 40s.
Proceso
1. El mecanismo de reconocimiento del mRNA por parte de la subunidad pequea
del ribosoma (40s) se lleva a cabo mediante el reconocimiento de la gorrita que
lleva el mRNA. Esto significa que el AUG queda ms alejado de la subunidad
pequea, porque los 5-UTR de los RNA eucariticos son largos (150-200
nucletidos).

Bioqumica y biologa molecular Biosntesis de protenas
Laura Esteban Luca 151
2. Para que se reconozca el primer AUG correcto y no los otros est la secuencia
Kozak, que se encuentra a 5 del AUG: GCCACCAUG. Una vez reconocido el
extremo 5 comienza un mecanismo de scanning que lleva a cabo el
reconocimiento o barrido del mRNA en busca del AUG que inicia la traduccin.

3. Unin del complejo ternario a la subunidad pequea del ribosoma en su sitio
P. Esta unin se realiza en ausencia de que se haya reconocido el mRNA.

Bioqumica y biologa molecular Biosntesis de protenas
Laura Esteban Luca 152

El mecanismo de traduccin implica que haya una interaccin entre las protenas y la
subunidad pequea del ribosoma unida a su tRNA iniciador.
El conjunto de protenas tienen una serie de actividades que hidrolizan GTP
(GTPasas) y permiten a la subunidad pequea del ribosoma avanzar a lo largo del
mRNA hasta encontrar el AUG. Cuando lo encuentra, hidroliza el GTP para liberar
energa que permita que se fije la subunidad y comience la traduccin.
Los mRNA se traducen de forma circular, de manera que los extremos 3 y 5
pueden interaccionar entre s por medio de la interaccin del IF4-G que se une a la
colita de poli-A.

Bioqumica y biologa molecular Biosntesis de protenas
Laura Esteban Luca 153
ELONGACIN
La elongacin es exactamente igual que en procariotas, la nica diferencia es que
existe otro factor en lugar de EF-G, que es eEF-2, en lugar de EF-Tu tenemos eEF-1, y
en lugar de EF-Ts encontramos eEF-1. Sus nombres son distintos, pero su funcin es
la misma.

TERMINACIN
Tiene factores de terminacin, factor que hidroliza GTP y otro factor que
desensambla el ribosoma. El proceso es el mismo en procariotas y eucariotas.
Los mRNA normalmente estn enganchados a muchos ribosomas, pero cada uno se
encuentra en un sitio del mRNA y en una fase de la traduccin. Este mecanismo lo que
permite es que la traduccin sea muy eficaz porque estn entrando ribosomas
constantemente.
FIDELIDAD DEL PROCESO DE BIOSNTESIS
DE PROTENAS
Los dos sitios crticos que permiten que el proceso sea muy fiel son:
1. La aminoacil-tRNA sintetasa, que es la enzima que se encarga de cargar cada
tRNA con su aminocido correspondiente. Va corrigiendo a dos niveles:
a. Si el aminoacil-AMP no es correcto, lo hidroliza.
Bioqumica y biologa molecular Biosntesis de protenas
Laura Esteban Luca 154
b. Si el aa-tRNA no es correcto, lo hidroliza.
Es un proceso muy fiable y es muy infrecuente encontrar un tRNA mal cargado.
2. Alta especificidad de la unin codn-anticodn en el ribosoma. Una hibridacin
de 3 con 3 supone muy pocos de puentes de hidrgeno, luego es una interaccin
dbil y sera muy sensible a errores si sucediera en el citoplasma (error del
10%). Sin embargo, al realizarse en el interior del ribosoma, hay un momento en
el cual, hasta que se hidroliza el GTP, no se realiza la formacin del enlace
peptdico. En el tiempo en el que no se ha hidrolizado el GTP hay un proceso de
correccin tremendamente preciso.
La fidelidad del proceso est en el rango de las polimerasas ms eficaces, en un nivel de
10
-8
a 10
-9
.
ANTIBITICOS
La biosntesis de protenas es el punto ms importante donde actan varios agentes
que distinguen los elementos procariotas de los eucariotas. Se han encontrado diversos
antibiticos que slo intervienen en la sntesis de protenas de procariotas y es un punto
diana de los antibiticos que se utiliza para tratar las enfermedades.

Algunas toxinas tambin inhiben la traduccin en eucariotas:
- Ricina: inhibe la unin de aminoacil-tRNA.
- Toxina diftrica: inactiva al factor de elongacin eEF2

Bioqumica y biologa molecular Biosntesis de protenas
Laura Esteban Luca 155

156
Regulacin de la biosntesis de
protenas
PROCARIOTAS
En procariotas no es necesario regular la sntesis de protenas. Los procariotas tienen
que dividirse a la mayor velocidad posible para poder dominar en el medio. Lo principal
para estos organismos es que se absorba la mayor cantidad posible de nutrientes.
En procariotas la regulacin de la expresin gnica depende fundamentalmente del
control transcripcional, est acoplada a la transcripcin. Un mRNA procariota se est
uniendo a ribosomas y a protenas. Es una transcripcin y traduccin acoplada, porque
una vez que el mRNA sale es inmediatamente tratado con ribosomas.
EUCARIOTAS
En eucariotas la traduccin es un proceso fuertemente regulado. Puede ser regulado a
varios niveles:
- ?
- Splicing
- Traduccin
La traduccin se regula a dos grandes niveles:
1. Regulacin general del proceso: hace que un mRNA se traduzca muy bien o
muy mal. Una clula puede estar traduciendo muy eficazmente todo lo que tiene
y otra que lo est haciendo muy mal. Esto est regulado, en general, por
quinasas que fosforilan factores de iniciacin.
a. eIF2 kinasas
b. mTOR: proten kinasa que regula varios procesos celulares, incluida la
biosntesis de protenas (a nivel de eIF4E).
2. Regulacin de la traduccin de mRNA especficos.
a. Presencia de varios AUGs en la regin 5 UTR.
b. ORFs reguladores en la regin 5 UTR.
c. Protenas reguladoras que se unen especficamente
d. MicroRNA



Bioqumica y biologa molecular Biosntesis de protenas
Laura Esteban Luca 157
REGULACIN POR PROTEN KINASAS
a) Cuando est el factor en forma de eIF2-GDP lo fosforila y hace que la protena
est inactiva. La accin de la kinasa secuestra al eIF2 para mantenerlo en su
forma inactiva y se bloquea el inicio de la traduccin porque los tRNAs de inicio
no pueden llegar a la subunidad menor. Cuando la kinasa est activa el nivel de
traduccin es bajo y cuando est inactiva es alto.

Una clula que est proliferando tiene que estar continuamente sintetizando protenas
porque las necesita para poder generar otra clula, por eso es importante tener una
sntesis de protenas muy activa.
Cuando las clulas entran en una fase G0 ya no tienen que aprovechar la mxima
capacidad de sntesis que tienen, slo tienen que mantener funcionando unos niveles
determinados de la maquinaria de la clula.
Esta quinasa es capaz de regular la traduccin.
b) mTOR: existe una protena (4E-BP 1) que inhibe la unin de eIF-4E a la gorrita
del extremo 5 del mRNA. La quinasa mTOR fosforila a 4E-BP1 y permite que
se produzca la unin.
Cuando esta quinasa acta hay biosntesis de protenas muy activa, sin embargo,
cuando la quinasa mTOR no est activa no hay disponibles factores 4E y no se
traducen mensajeros.
Es importante la actividad quinasa porque tiene un control sobre la sntesis de
protenas bastante eficaz.
Los inhibidores de la quinasa mTOR inhiben la biosntesis de protenas. Una
biosntesis de protenas baja impide la proliferacin celular, luego los frmacos que
estn siendo investigados para que tengan mTOR como diana estn dirigidos al
tratamiento del cncer, ya que no permite una proliferacin celular activa.
Bioqumica y biologa molecular Biosntesis de protenas
Laura Esteban Luca 158

REGULACIN POR CONTROL CON
SECUENCIAS 5 UTR Y 3 UTR
Si en la regin 5 UTR hay varias secuencias AUG, la traduccin no es correcta
porque el ribosoma se entretiene en cada AUG que se encuentra en la parte 5 UTR y,
finalmente, se suelta, luego los ribosomas que sintetizan la protena entera son pocos.
Tanto la presencia de pequeas fases de lectura abierta como las secuencias AUG
hacen que la traduccin no sea muy adecuada, a pesar de que haya muchos mRNA.
Mecanismos activos
Hay protenas que se unen a las regiones UTR y regulan su traductibilidad.
Hay dos protenas que intervienen en el metabolismo del hierro.
- Ferritina: elimina el exceso de hierro presente en el interior celular unindose a
l. Tiene unas secuencias en su mensajero que forman una estructura secundaria
reconocida por la protena por la IRE-BP de la aconitasa (protena que tambin
interviene en el ciclo de Krebs). Esa protena es capaz de unir hierro y, unida a
l, no reconoce la secuencia de mRNA, por lo que est libre para que se le una el
ribosoma.
En condiciones de hierro bajo, no se une a l y reconoce las partes UTR, de
forma que se queda unida a esas secuencias evitando el paso del ribosoma y la
traduccin.

Bioqumica y biologa molecular Biosntesis de protenas
Laura Esteban Luca 159
- Transferrina: ante una concentracin de hierro alta poca protena porque el
mRNA se traduce muy mal, para evitar que se introduzca ms hierro en la
clula. Cuando la concentracin es baja, las protenas estn libres de hierro, se
traduce bien para que se sintetice la protena (receptor de transferrina) y que, as,
pueda entrar ms hierro en la clula.

SILENCIAMIENTO GNICO
En el fenmeno de interferencia se descubrieron los microRNAs.
Experimento: se inhibe la expresin de un mRNA haciendo un RNA que hibride con
el mRNa de la clula, lo que impedir que se traduzca. Al introducir un RNA de cadena
simple no pasaba nada, pero cuando se introduca un RNA de doble cadena se
producan alteraciones.
El RNA de doble cadena es un importante inhibidor de la expresin gnica. Esto
abri la puerta al mecanismo de accin de la clula. Cuando entra un RNA de doble
cadena, la doble cadena se separa y se hibrida con aquellos mRNA con cadena
complementaria haciendo que se inhibiera su expresin.
As se descubrieron los microRNA. Se sintetizan un poco ms grandes, se procesan
en el ncleo y luego salen al citoplasma donde se selecciona slo una hebra que se
aparea con ciertos mRNA inactivndolos. Tenemos en nuestras clulas miles de
microRNAs que son unos importantes reguladores de la expresin gnica. De su
expresin depende la expresin gnica de cada clula.
Este mecanismo est muy conservado en casi todos los organismos.
Bioqumica y biologa molecular Biosntesis de protenas
Laura Esteban Luca 160

Ahora hay un campo muy importante de investigacin sobre este tema de la
regulacin de la expresin gnica asociado a patologa, sobre todo al cncer.
Cada clula de nuestro organismo tiene un programa de diferenciacin gnica nico
y preciso. Y es esto lo que se regula en el tratamiento de las patologas humanas.
Algunas caractersticas
- Hay ms de 1000 microRNAs en humanos, que potencialmente pueden regular
la expresin de ms de 10000 genes.
- Son transcritos por la RNApol II.
- Degradacin de la horquilla (ncleo): RNAasa II (Drosha) / DGCR8 (RNA
binding protein).
- Citoplasma: DICER (+TRB).
- Diana casi invariablemente localizada en 3-UTRs.
- RISC: dirigido a la degradacin (apareamiento perfecto) o inhibicin de
biosntesis de protenas (algunos nucletidos desapareados).




Bioqumica y biologa molecular Biosntesis de protenas
Laura Esteban Luca 161

162
Maduracin de protenas
Podemos considerar la maduracin de las protenas como los cambios que han de sufrir
stas desde que se sintetizan en los ribosomas hasta alcanzar una situacin de
disponibilidad funcional.
Modificaciones que pueden sufrir las protenas eucariotas:
- Modificaciones de plegamiento gracias a la intervercin intervienen chaperonas
- Modificacin del plegamiento gracias a la formacin de enlaces intracelulares
- Protelisis
- Adicin de grupos qumicos: fosfato, metilo, azcares, etc.
Localizacin subcelular de especfica: ncleo, mitocondria, peroxisomas, retculo,
Golgi, membrana plasmtica, lisosomas.
MODIFICACIN DEL PLEGAMIENTO GRACIAS
A LA INTERVENCIN DE CHAPERONAS
Las chaperonas son nanomquinas biolgicas cuya funcin es plegar las protenas para
obtener su forma ptima de funcionamiento.

Las chaperonas reconocen protenas mal plegadas y va modificando su estructura hasta
que la pliega correctamente.
- Son agregados multiproteicos: como las protenas tienen partes hidrofbicas
pueden interaccionar entre s y formar agregados proteicos.
- Facilitan el plegamiento de la protena
- Previenen la agregacin de protenas mal plegadas
- Ayudan al ensamblaje de complejos multiprotecos
- Consumen ATP
- Se unen a regiones hidrofbicas
- Muchas son de respuesta a estrs (heat shock proteins Hsp70)
Bioqumica y biologa molecular Biosntesis de protenas
Laura Esteban Luca 163
Las chaperoninas son un tipo de chaperonas ms pequeas y hacen un tipo de
plegamiento concreto pero que tienen las mismas caractersticas.
Patologa
Fibrosis qustica, Creutzfeld-Jakob, alzheimar, Huntington.
MODIFICACIN DEL PLEGAMIENTO GRACIAS
A LA FORMACIN DE ENLACES INTRA E
INTERCATENARIOS
Ejemplo: insulina (intracatenarios).
Entre los ms importantes estn el puente bisulfuro y el puente de hidrgeno.
El enlace disulfuro es un enlace covalente que se forma entre los grupos SH de dos
cistenas (enlace estable). Estos grupos suelen estar reducidos en parte debido a los
sistemas de control que tiene la clula para evitar las reacciones que generan especies de
oxgeno radiactivo.
Tiene actividad importante en el retculo endoplasmtico.
Disulfuro isomerasa tienen un puente disulfuro y puede tanto generarlos como
modificarlos. Si encuentra protenas que estn mal plegadas porque han formado
puentes disulfuro que no son correctos, los cambia.

PROTELISIS
Supone la eliminacin de trozos de protenas. Hay secuencias en las protenas cuya
nica funcin es determinar el destino de la protena, de forma que sta es transportada
y madura en el orgnulo determinado.
Hay protenas que se sintetizan en forma de zimgenos inactivos y que despus de una
protelisis por una proteasa se activan y muchos de ellos son, a su vez, proteasas del
siguiente factor de coagulacin (factores de coagulacin, procaspasas, tripsinogeno,
etc.).
Est la posibilidad de que ocurran las dos cosas: se sintetizan como zimgenos y se
transportan a un orgnulo y maduran all.
Bioqumica y biologa molecular Biosntesis de protenas
Laura Esteban Luca 164
*Ejemplo: la insulina se forma en el pncreas como pre-insulina con una seal para RE.
Cuando llega sufre una maduracin por protelisis y se forman puentes disulfuro, luego
es cortada formando dos subunidades unidas por puentes disulfuro.

MODIFICACIONES POR ADICIN
COVALENTE DE GRUPOS QUMICOS
(fosfato, metilo, azcares, etc)
La modificacin que sufren las protenas es tan verstil que se pueden encontrar
muchsimos tipos de protenas. Para determinar cmo han sido modificadas se requieren
tcnicas muy pesadas, aunque hay regiones consenso que se conservan en distintas
ocasiones.
Fosforilacin: serina, treonina, tirosina. Es una de las
modificaciones ms comunes. Hay un enorme nmero.
*Ejemplo: cascadas de quinasas, que es una cascada de
fosforilaciones de enzimas.
El domino carboxilo termina de la polimerasa II es el dominio ms
importante. Es la repeticin de un heptapptido muy conservado
en eucariotas y que contiene aminocidos fosforilables.
Dependiendo del trocito que est fosforilado y en qu posicin se
determina dnde se va a unir la maquinaria de fosforilacin.
Gen bidimensional: separacin de protenas por peso molecular y por punto
isoelctrico.
Cada punto del cuadrito es una protena que ha madurado por fosforilacin.
Glicosilaciones: protegen frente a la accin de proteasas (fundamental en el caso
de los lisosomas que son grandes bolsas de enzimas hidrolticas, por lo que las
protenas de membrana han de estar protegidas mediante la unin de un azcar),
implicada en la sealizacin (reconocimiento clula-clula, glicocliz). Tambin
influye en el adecuado plegamiento de las protenas.
o N-glicosilaciones: en el RE.
Bioqumica y biologa molecular Biosntesis de protenas
Laura Esteban Luca 165

o O-glicosilaciones: en el Golgi. Entre el grupo OH-.
Carboxilacin: adicin de un grupo carboxilo. Es muy iportante en la
maduracin de los factores de coagulacin dependientes de vitamina K. se
carboxilan residuos de cido glutmico.


Bioqumica y biologa molecular Biosntesis de protenas
Laura Esteban Luca 166
Existen protenas con un gran nmero de modificaciones.
COLGENO
- Supone el 25-30% de las protenas de un mamfero.
- Est en todas las formas de tejido conectivo.
- Se encuentra formando fibras de tropocolgeno (unidad estructural) formadas
por superhlices de tres molculas.
- Alrededor del 30% de los aminocidos son glicina y otro 30% son prolinas o
hidroxiprolinas (HyPro, potencial puente de H).
- Tambin tiene 5-hidroxilisina (HysLys), que puede glicosilarse (glucosa o
galactosa).
- La hidroxilacin de prolina y lisina requiere de vitamina C (escorbuto es defecto
de colgeno).
- Con numerosos en laces covalentes intracatenarios.
- Con numerosos enlaces por puentes de hidrgeno intracatenarios.
- Sufre protelisis en el exterior celular.

Para que la protena llegue a ser funcional ha de llegar a su destino. Una clula eucariota
est compartimentalizada en muchos orgnulos.
Las protenas destinadas al ncleo, a la mitocondria, al cloroplasto o al peroxisoma se
sintetizan en el citoplasma de forma soluble y tienen una secuencia de destino
(secuencia seal) que las dirige.
Las protenas destinadas a la membrana plasmtica, aparato de Golgi, lisososomas o al
retculo endoplasmtico se sintetizan en el RE y siguen la va secretora.
Bioqumica y biologa molecular Biosntesis de protenas
Laura Esteban Luca 167

Transporte al interior nuclear
El poro nuclear es un monstruo. Es 30 veces el tamao de un ribosoma y est formado
por una gran cantidad de protenas.
Las protenas se dirigen al ncleo gracias a una seal NLS (secuencia de localizacin
nuclear).
El trfico est mediado por importinas y exportinas. Ambas estn reguladas por la
protena Ran en funcin de la afinidad de esta protena por GTP (en el ncleo, afinidad
por exportinas) o por su forma hidrolizada GDP (en el citoplasma, afinidad por
importinas).

- Tema de RE - sntesis

Bioqumica y biologa molecular Biosntesis de protenas
Laura Esteban Luca 168
ESTABILIDAD DE PROTENAS
Hay dos grandes caminos de degradacin:
- Lisosomal
o No especfica.
o Asociada a la degradacin de protenas de vida media larga.
o Se incorporan al lisosoma por autofagia (el lisosoma engloba una
porcin de citoplasma).
o La degradacin de protenas endgenas en lisosomas aumenta en
situaciones de deprivacin de nutrientes y puede llegar a l5-10% de la
protena total celular por hora.
- Ubiquitinacin
o Especfica
o Asociada a la degradacin de protenas de vida media o corta.
o Poseen secuencias de reconocimiento de ubiquitn ligasas.
o La ubiquitina est formada por 76 aminocidos (9KD) y est muy
conservada en todas las clulas eucariotas.
o La ubiquitina se une covalentemente a lisina y recluta la maquinaria de
degradacin: el proteasoma.
o El proteasoma es un complejo multiproteico que reconoce protenas
marcadas y, con gasto de ATP, las degrada en el citosol.
o Existen seales similares a la ubiquitinacin.
PROTEASOMA
Dos subunidades reguladoras. En funcin de los
cambio coformacionales se abre o se cierra un poro
en la parte superior. Normalmente est cerrado
cuando se unen las subunidades reguladoras. Cuando
reconoce la protena ubiquitinizada, a protena
empieza a desplegarse con hidrlisis de ATP y se va
degradando. Es reconocida la protena por una serie
de protenas entre ellas la ubiquitn ligasa y esa una
seal para que sea reconocida por el proteasoma, la
despliegue y la degrade.
: estructurales, anillo cerrado, interacciona
con reguladoras.
: catalticas.
19s: 10 protenas, 6 con actividad ATPasas.
Bioqumica y biologa molecular Biosntesis de protenas
Laura Esteban Luca 169

170












Mecanismo de accin hormonal
Comunicacin entre las clulas
Se tardaron 2500 millones de aos en que apareciera el primer organismo pluricelular.
Y esto es debido a que para poder mantener la organizacin y la vida de un organismo
pluricelular es imprescindible que sus clulas se puedan comunicar entre s. Las clulas
tienen mltiples maneras de comunicarse.
- La principal forma es aquella en la que la clula emisora de la seal emite
seales (molculas solubles) que viajan
por el plasma hasta llegar a la clula
diana, que son clulas capacitadas para
recibir esa seal qumica.
El requisito para que reciba la seal es que
la clula receptora posea receptores especficos con gran afinidad con las
molculas secretadas. Pueden ser receptores transmembrana o intracelulares.
- Hay otra forma, si ambas clulas se comunican a travs de protenas unidas a
membrana de la clula emisora que interaccionan con
un receptor presente en la membrana de la clula
diana. Se requiere una proximidad suficiente para que
una pueda recibir la seal de la otra.
- Uniones gap: mediante este tipo de unin estas dos
clulas muy prximas permite solamente el paso de
molculas pequeas difusibles (de bajo peso
molecular) de una a otra, como iones.
*Ejemplo: los hepatocitos del hgado estn inervados por
neuronas que, ante una seal emitida por la neurona, se libera
una molcula como el cAMP, que puede pasar a la clula vecina por uniones tipo gap,
permitiendo que llegue la seal hasta los hepatocitos no inervados.
La caracterstica esencial para que una clula receptora pueda recibir las seales es que
posesa receptores especficos. Estos receptores son fundamentalmente de dos tipos:
- Receptores presentes en la membrana plasmtica.

Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 171
- Receptores intracelulares: la molcula receptora est dentro de la clula en el
citoplasma o el ncleo.

[Necesita la clula diana de manera indispensable tener un receptor molecular?]
Una vez que el ligando se une a molculas receptoras especficas, desencadena una
respuesta que consiste en la activacin de una serie de molculas que, eventualmente,
pueden llegar al ncleo celular. Los cambios que puede generar son:
- Si el efecto tiene como resultado la modificacin de una enzima del
metabolismo o de una protena del citoesqueleto, se pueden detectar cambios
muy rpidos: desde segundos a minutos.
*Ejemplo: la activacin de las enzimas intracelulares produce el movimiento de
la clula mediante la formacin de pseudpodos o su retraccin.
- Si la seal, una vez ha entrado, tiene que comunicarse al ncleo provocando
cambios en la actividad de los factores de transcripcin o en la cantidad de genes
que se transcriben. Se tiene que unir a los ncleos de los factores determinados y
producir la sntesis de RNA. Estos procesos son lentos: desde bastantes minutos
a horas.


Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 172
Distintas clulas pueden responder de forma diferente a la misma
seal.
Si la acetilcolina se une a su receptor en la clula cardiaca provoca la
disminucin de la fuerza de contraccin muscular.
La misma sustancia en msculo esqueltico produce la contraccin muscular.

Aunque el ligando es el mismo, las molculas intracelulares que lo reconocen son
diferentes.
El tipo de molculas sealizadoras son muy variadas, siendo las hormonas solamente un
grupo de las molculas involucradas en ese proceso.
Hormonas
Las hormonas son molculas que portan seales capaces de producir un cambio en la
clula diana. Trataremos especialmente los efectos metablicos.
Dentro de la sealizacin hormonal tenemos distintos tipos:
- Endocrina: la molcula emisora puede estar situada bastante lejos de la clula
diana. Las sustancias viajan por el torrente sanguneo hasta llegar a la clula
diana con receptor especfico para la sustancia.
o Puede operar a distancias largas
o La clula emisora emite la seal, que se diluye en el torrente sanguneo y
cuando llega a la clula diana es necesario que sta sea capaz de detectar
un nmero bajo de molculas. Este receptor tiene una gran especificidad,
su constante es de 10
-8
M.
- Paracrina: la clula emisora y la clula receptora son vecinas. La seal recorre
una distancia corta, por lo que la afinidad no tiene que ser tan alta.
- Neuroendocrina: en ella las neuronas a travs de sus axones emiten
neurotransmisores que son recibidos por una clula diana. En este caso la
especificidad se consigue sobre quin es inervado por la neurona. La neurona
establece una conexin con una determinada clula.
Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 173
- Sealizacin autocrina: la propia clula emisora tiene receptores para esta seal.
Este concepto se entiende en el contexto del desarrollo, en cuyos primeros
estados se necesita que un determinado grupo de clulas se dirijan a un
determinado destino celular en el proceso de diferenciacin.

Clasificacin de las hormonas
Podemos utilizar dos criterios:
- Estructura
o Formadas por aminocidos: son pptidos pequeos
o Esteroideas: molculas derivadas del colesterol y tienen carcter
hidrofbico y lipoflico.
o Derivadas de aminocidos: como la tiroidea.
Unas son hidroflicas y otras hidrofbicas.
- Dependiendo del receptor
o Peptdicas: se unen a receptores de membrana plasmtica
o Esteroideas: receptores intracelulares (factores de transcripcin
dependientes de ligando).
o Derivados de tirosina: receptores intracelulares o receptores de
membrana plasmtica (adrenalina).
Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 174

Sntesis de hormonas
Hormonas peptdicas: se generan a partir de precursores mayores: pro-hormonas,
que tienen que sufrir el corte proteoltico para dar lugar a la hormona.
Esteroideas: se sintetizan a partir de colesterol en varios tejidos endocrinos.
Las catecolaminas como la adrenalina y la noradrenalina, se sintetizan a partir de
tirosina.
Hormonas tiroideas: son derivados yodados de tirosina y se sintetizan sobre el
esqueleto de tiroglobulina.
Funciones generales
- Reproduccin, crecimiento y desarrollo: hormonas sexuales, hormonas
tiroideas, hormona del crecimiento.
- Mantenimiento del ambiente interno: aldosterona (papel importante en el
equilibrio de Na/K), vitamina D (necesaria para la captacin de calcio), PTH.
- Produccin, utilizacin y almacenamiento de energa: insulina, glucagn,
hormonas tiroideas, cortisol.
Fases de la accin hormonal
- Sntesis
- Secrecin
- Transporte
o Lipoflicas: unidas a protenas y atraviesan la membrana.
o Hidroflicas: se transportan disueltas en la sangre.
Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 175
- Deteccin por receptores especficos.
- Cambio en el metabolismo celular
- Eliminacin: dependiendo de la naturaleza qumica de la hormona. En el hgado
se modifican las hormonas que no son hidrosolubles para que lo sean y puedan
ser expulsadas en el rin.
Principales glndulas endocrinas
Existe un eje llamado hipotlamo-hipfisis (pituitaria)
- Hipotlamo: Es el centro de coordinacin del sistema endocrino. Es una pequea
regin del cerebro que recibe e integra mensajes del SNC. Es una glndula
neuroendocrina. Est inervado por neuronas que recibe diversos estmulos tanto
externos como internos. Esto provoca la liberacin de factores liberadores e
inhibidores de la sntesis hormonal. Si se produce, se activa la sntesis en la
hipfisis de una nueva hormona.
- Tiroides: libera triyodotironina (T3) y tiroxina (T4).
- Paratiroides: liberan hormonas que controlan la homeostasis de Ca
++
.
- Suprarrenales: en la corteza se producen glucocorticoides y mineralocorticoides
[esteroides (cortisol, aldosterona)] y en la mdula de la glndula renal se
produce adrenalina (catecolaminas).
- Hormonas sexuales: en los rganos sexuales de ambos sexos (ovarios y
testculos), en la corteza adrenal un poco, en el tero durante el embarazo.
- Hipfisis: libera hormonas como la ACTH o la TSH. Recibe seales del
hipotlamo.
- Pncreas: libera insulina, glucagn. Controla la homeostasis de glucosa.
Algunas hormonas regulan el metabolismo segn las necesidades precisas de la clula
en distintas situaciones.
*Ejemplo: tejido adiposo, msculo e
hgado.
Hay veces que las hormonas tienen
que regular ciertas situaciones no
fisiolgicas, por ejemplo un ayuno. En
esta situacin, el cerebro, que utiliza
120g de glucosa al da, es un pozo de
consumir glucosa. Mientras puede
utiliza glucosa y cuando ya no puede
utiliza otra sustancia, y lo que ocurre
es que se degrada la protena muscular
para obtener aminocidos. Tambin se
pueden degradar aminocidos en el
hgado y, en ayuno extremo, formar
Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 176
cuerpos cetnicos. Como hay que mantener los
niveles de glucosa en sangre estables, se genera en
el pncreas una hormona, la insulina. Gracias a la
presencia de receptores para insulina en tejido
adiposo e hgado, la insulina no se acumula en los
vasos.
Existe una jerarqua de accin hormonal. En
respuesta a un estmulo externo, el hipotlamo libera
factores de liberacin (slo ng) que en la pituitaria
tiene receptores. Al unirse a estos produce la liberacin de otra hormona, la ACTH. Se
produce un aumento de 1000 veces en la segunda reaccin. Esta hormona, llega a la
glndula final en la corteza renal, que es el cortisol. ste se libera en cantidades de mg.
Respuesta al estrs
Para que seamos capaces de soportar una situacin de estrs, necesitamos disponer de
un esteroide llamado cortisol. En presencia de un estmulo continuado, se activan
factores para la liberacin de corticotropina, que es reconocida por receptores en la
pituitaria anterior y el producto de esto (ACTH) se dirige a la corteza suprarrenal y
provoca una reaccin final.
Un estrs muy prologado en el tiempo es deletreo porque puede dar lugar a casos de
diabetes o una bajada del sistema inmune, porque el cortisol es un inmunodepresor.
Este sistema est perfectamente regulado. Existe lo que se llama un control negativo o
de feed-back. Cuando ya se ha cumplido la funcin, el propio cortisol acta sobre la
pituitaria y el hipotlamo deteniendo el proceso. Esto es til para no gastar insulina. As
acta de forma fisiolgica el sistema.


Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 177
- Camino corto: acta sobre la ltima glndula que sintetiza al final de la reaccin
en cadena.
- Camino largo: acta sobre el hipotlamo.
Sntesis de hormonas proteicas
La mayor parte de las hormonas se forman a partir
de un gen que se transcribe y que da lugar a un
mRNA (exones+intrones). Posteriormente ocurre un
proceso de splicing por el cual se pierden los
intrones para dar lugar al mRNA maduro. Luego
tiene lugar la traduccin por parte de los ribosomas.
Esto da lugar a una protena que, en la mayor parte
de los casos, es una pro-hormona, que requiere de
cortes proteolticos que la conviertan en hormona.
*Excepcin: sistema de proopiomelanocortina
(POMC) en la glndula pituitaria.
Lo que ocurre es que un nico gen es transcrito para
dar lugar a un mRNA que da lugar a una
poliprotena formada por distintos fragmentos de
aminocidos que pueden dar lugar a distintas
protenas activas.
Dependiendo del estmulo que provoca los cortes en
el mRNA se activan unas cantidades distintas de
proteasas que generan unos cortes determinados.
Esto da lugar a pre-hormonas.
En otra regin diferente de la pituitaria se genera otro set de proteasas que dan lugar a
cortes distintos en esa zona de la glndula.
MSH: produce la pigmentacin por medio de melanina en la piel.

Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 178
Radioinmunoensayo
La cantidad circulante de hormona es muy baja y se han diseado ensayos que nos
permiten conocer la concentracin de hormona para conocer la concentracin final.
1. En una placa de plstico se pegan unos anticuerpos especficos para una
determinada hormona.
2. Se aade una cantidad constante y efectiva de la hormona radioactiva.
3. Se van aadiendo cantidades conocidas de hormona fra (no radiactiva). El
anticuerpo tendr afinidad por la hormona fra.
4. Eliminamos la hormona que no se ha unido (lavado).
5. Medimos la cantidad de marcaje unido.
6. Medimos la cantidad de marcaje sin unir.
Si aado cantidades crecientes de hormona fra encontrar menos radiactividad porque
la hormona va a consumir. De esta manera se construye una tabla patrn.

Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 179

180
Hormonas esteroideas
Una caracterstica de las hormonas esteroideas es que se sintetiza primero pregnenolona
y progesterona y a partir de ah se sintetizan las otras hormonas.

Su transporte en la sangre lo efectan acompaados de protenas plasmticas.
La regulacin se ejerce mediante el control de su sntesis, se regulan producindose.
En su sntesis intervienen una serie de enzimas llamadas monooxigenasas u oxidasas de
funcin mixta. El paso limitante en la sntesis es el corte de la cadena lateral del
colesterol en la mitocondria.
Algunas caractersticas estructurales
En todas las hormonas se ha perdido la cadena lateral del colesterol. Todas ellas tienen
entre 19 y 21 tomos de carbono frente a los 27 del colesterol.
En el anillo dos el doble enlace est en una determinada posicin y va cambiando en
unas respecto a otras. Esto sucede
por la accin de las aromatasas
que se encargan de ir cambiando
los enlaces.
Hay muchos grupos OH en
distintas posiciones. Estn ah
gracias a la actuacin de unas
enzimas llamadas oxidasas de
funcin mixta o citocromo p450
(desmolasa). Estn ubicadas
fundamentalmente en el retculo
endoplasmtico y en la
mitocondria.

Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 181
NADP/NADPH
En las reacciones de red-ox se pierden dos electrones y dos protones. Un protn queda
libre y se va al medio y el resto son transferidos al anillo de nicotinamida del NADPH,
ganando dos electrones y un protn. El NADH y el NADPH son muy inestables, esto
quiere decir que transfieren con mucha facilidad los electrones a otro elemento.
La va de las pentosas fosfato es la fuente de NADPH, que es esencial en las biosntesis
reductoras. La biosntesis de los esteroides es una biosntesis reductora porque se
necesitan NADPH.
Citocromo p450
Es una protena oxidasa de funcin mixta que tiene un grupo hemo. La parte cromo
viene de su capacidad para absorber luz a una frecuencia de 450 nm. Este tipo de
enzimas estn fundamentalmente en la membrana del RE y de la mitocondria y participa
en las biosntesis reductoras.

La fuente que oxida un sustrato es el oxigeno molecular. En la reaccin se necesitan
electrones que son cedidos por el NADPH. A este tipo de enzimas se les llama de
oxidasas funcin mixta o monooxigensas porque catalizan la transferencia de uno de los
tomos de oxgeno, que va a parar al sustrato, y el otro tomo va dirigido a la formacin
de agua.

Tiene la posibilidad de que el grupo hemo que tiene asociado est en forma oxidada o
en forma reducida.
1) El sustrato se une al citocromo p450 colocndose prximo al grupo hemo.
2) Se empiezan a necesitar los electrones que vienen del NADPH, que dona dos.
Pero el citocromo slo puede recibirlos de uno en uno. Por eso se requiere una
cadena de transporte de electrones.
El NADPH transfiere uno de los electrones a una protena, y esta lo transfiere al
sustrato.
El primer electrn sirve para cambiar el estado del hierro de frrico (Fe
3+
) a
ferroso (Fe
2+
).
Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 182
3) Se une el oxgeno molecular y el hierro pasa otra vez de ferroso a frrico. [Fe
2+

Fe
3+
]
4) Entra el 2 electrn, que es necesario para que se forme una especie reactiva de
oxgeno, que es (Fe-O)
3+
.
5) Se forma un superxido y uno de los tomos se libera formando el agua.
6) El superxido es capaz de oxidar al sustrato.
7) En el ltimo paso se libera el sustrato oxidado y volvemos a encontrar el grupo
hemo en estado oxidado.

[Pregunta: quin es el donador de electrones en la reaccin del citocromo p450? El
NADPH]
Regulacin a nivel de sntesis
El paso limitante en la sntesis de hormonas esteroideas es el corte de la cadena lateral
del colesterol. Este corte ocurre en la mitocondria y es llevado a cabo por una serie de
reaccin en las que est implicado el citocromo p450. Se consumen 3 molculas de
NADPH y 3 molculas de O
2
.
Lo primero que tiene que ocurrir es una hidroxilacin en los carbonos 20 y 22.
Posteriormente ocurre el corte en el enlace dando lugar a pregnenolona. La enzima que
Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 183
lleva a cabo la primera reaccin se denomina desmolasa
1
. ACTH estimula el paso de
colesterol a pregnenolona.

Existe una jerarqua de accin hormonal.
1. En muchos casos la seal procede del hipotlamo. En este caso se va a producir
hormona corticotropa (ACTH).
2. En una clula de la corteza renal, el ACTH se une a un receptor especfico de
membrana y, al unirse a l, se produce un aumento en la concentracin
intracelular de cAMP, activndose la protena quinasa A, que tiene varias
funciones en la regulacin del proceso de sntesis del colesterol.
3. El colesterol se encuentra en gotas concentradas formando steres de colesterol.
La protena quinasa A una de las funciones que tiene es activar una hidrolasa
que libera las molculas de colesterol.
4. El colesterol sale de la gota conservando la cadena lateral con 27 carbonos. Esta
ser la molcula que entre en la mitocondria y el siguiente paso es catalizado por
la desmolasa, que promueve el corte de la cadena. Esta enzima est regulada a
nivel de sntesis y esta positivamente regulada a nivel de sntesis por la quinasa
A.
Una serie de reacciones en la que estn implicadas una serie de enzimas tanto del
citoplasma como de la mitocondrial van a dar lugar al cortisol (hormona). Sale fuera del
tejido y puede viajar por la sangre hacia el tejido diana y, naturalmente, no puede viajar
libre, sino que tiene que estar asociado a protenas que lo transporten.


1
Desmolasa: tipo de enzima que cataliza la eliminacin del grupo qumico de un compuesto pero sin la
necesidad de la hidrlisis de agua.
Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 184


Propiedades caractersticas de los esteroles
PROPIEDAD ESTEROIDES
Regulacin feedback de la sntesis S
Almacenamiento de hormona preformada Muy poco.
Mecanismo de secrecin Difusin a travs de la membrana
plasmtica
Unin a protenas plasmticas S
Vida media en el plasma sanguneo Horas
Tiempo de accin Horas a das
Receptores Citoslico o nuclear
Mecanismo de accin El complejo hormona-receptor controla la
transcripcin y estabilidad de mRNAs
Inactivacin Conjugacin con sulfatos o glucurnidos
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Laura Esteban Luca 185

Funciones de las hormonas esteroideas
HORMONA FUNCIN
Estradiol
(folculo ovrico, cuerpo lteo, clulas de
Sertoli)
Regula la secrecin de gonadotropinas en
el ciclo.
Mantiene el endometrio.
Diferenciacin de las glndulas mamarias.
Testosterona
(clulas de Leydig, glndula suprarrenal,
ovarios)
Produccin de protenas del esperma en
las clulas de Sertoli.
Caractersticas sexuales secundarias.
Cortisol
(corteza adrenal)
Adaptacin al estrs.
Apoptosis de linfocitos T.
Efectos antiinflamatorios.
Efectos sobre el metabolismo.
Aldosterona
(corteza adrenal)
Promueve la absorcin de Na
+
en el rin
y la eliminacin de K
+
en la orina.
Aumenta la presin sangunea y el
volumen de los fluidos.
[Regulan el equilibrio hidroelctrico del
organismo]
Progesterona
(cuerpo lteo)
Mantiene el endometrio para la
implantacin del huevo.

Efecto de los glucocorticoides sobre el
metabolismo
Transforman los almacenes energticos en materiales que puedan ser rpidamente
usadas. Aumentan la degradacin de protenas en el msculo: aumentan la
gluconeognesis porque al aumentar la degradacin de las protenas aumenta la cantidad
de aminocidos. Tambin aumenta la liplisis.
La glucosa y los cidos grasos pueden utilizarse para fabricar ATP.

Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 186
Cortisol
Tenemos el caso del cortisol que es una hormona esencial para la supervivencia y para
adaptarnos a situaciones donde acta la adrenalina.
Siempre vamos a contemplar la accin conjunta de los tres elementos:
- Msculo: si se aumenta la degradacin de protenas puede generar aminocidos.
- Tejido adiposo: almacn de cidos grasos en forma de triacilgliceroles. Se
liberarn los cidos grasos y el glicerol, que tambin puede ser utilizado como
fuente de gluconeognesis.
- rgano
Para comprender la accin del
cortisol hemos de preguntarnos
cul es el mecanismo de
accin.
El mecanismo de accin de
todos los receptores de
hormonas esteroides es
bsicamente el mismo. Son
factores de transcripcin. La
diferencia con los anteriores
factores es que estos son
dependientes de ligando, en
presencia de la hormona se produce el proceso.
El cortisol difunde dentro de la clula y se asocia, se une a factores de transcripcin que
estn unidos a los genes que regulan aumentando o favoreciendo la sntesis de
protenas.
La fosfoenolpiruvato carboxikinasa es una enzima reguladora que interviene en la
gluconeognesis. Esta protena se regula a nivel de sntesis y degradacin. Como el
cortisol est regulando expresin gnica, puede aumentar la sntesis de esta enzima
favoreciendo la gluconeognesis.
Vitamina D
La vitamina D es esencial para el mantenimiento de la homeostasis de calcio y fosfato
dentro del organismo. La concentracin de calcio dentro del organismo, en el plasma, es
del orden de 2,5 mM.
En el caso de la sntesis de la vitamina D, la diferencia esencial es que en este caso no se
pierde la cadena lateral del colesterol, sino que el primer lugar de sntesis (que es en la
piel) donde llega la radiacin ultravioleta de la luz solar, rompe uno de los anillos para
dar lugar a un compuesto llamado colecalciferol o 7-dihidrocolesterol. Esto da lugar a la
vitamina D activa. Ese compuesto es procesado en el hgado y se produce una
hidroxilacin en posicin 25 y, posteriormente, en el rin, se produce otra
hidroxilacin en el carbono 1.
Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 187

Otra fuente de vitamina D es la dieta. Es importante la exposicin a la luz solar para la
sntesis de vitamina D, muy importante en la produccin y el mantenimiento de los
huesos. Su deficiencia produce raquitismo.
El papel esencial de la vitamina D es
la absorcin de calcio en el intestino
delgado o la reabsorcin de calcio en
el rin. Su funcin principal es
mantener la homeostasis en unos
niveles estrechos de concentracin.
El calcio se requiere para el
funcionamiento adecuado de muchas
funciones: coagulacin, contraccin
muscular, etc.
El precursor de vitamina D, gracias
a la accin conjunta del efecto de la
luz ultravioleta sobre la piel y de las
enzimas. El papel fundamental es
absorber calcio y fosfato de la dieta
en el intestino.
Con unas cantidades normales del
calcio y fosfato en la sangre se
produce la absorcin sea. En situaciones normales se utiliza el calcio para el hueso o
para funcin neuromuscular. Se ha de tener una ingesta normal de calcio y fosfato.
El Ca
++
se requiere para la adecuada funcin de la contraccin muscular, conduccin
nerviosa, liberacin de hormonas y coagulacin sangunea entre otros procesos.
La vitamina D ejerce su funcin en el ncleo, lo hace a travs de un factor de
transcripcin. La vitamina D
difunde en las clulas de la
mucosa intestinal, entra en el
ncleo, promueve la transcripcin
de enzimas y protenas ligantes de
calcio, ATPasas para calcio,
protenas que facilitan la
formacin de vesculas, etc.
Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 188

Cuando hay una concentracin alta de Ca
++
en la sangre se libera otra hormona llamada
calcitonina que se forma en unas clulas especficas del tiroides llamadas clulas T. Esto
va a provocar una serie de cambios en el rin y en el hueso.

Cuando la concentracin de calcio es baja en la sangre acta la hormona paratiroidea
ubicada en la glndula paratiroidea. Estas glndulas liberan hormona paratiroidea, que
favorece la sntesis de vitamina D aumentando la absorcin de calcio por el intestino.
En caso de que no se encuentre en la dieta, el calcio necesario de sacar del hueso.
Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 189

Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 190
Hormonas tiroideas
Estn sintetizadas en la glndula tiroidea, que tiene forma de mariposa y se encuentra en
la zona inferior de la faringe. Est formada por
folculos tiroideos y por clulas especializadas o
clulas C, que secretan calcitonina. La hormona
tiroidea es secretada por los folculos, que estn
formados por clulas epiteliales y el coloide, el
espacio interno del folculo donde se almacena
una protena de alto peso molecular llamada
tiroglobulina.
La caracterstica esencial de la tiroglobulina es
que tiene un peso molecular muy alto y en su
estructura tiene muchos residuos de tirosina
(hasta 115). Estas tirosinas son susceptibles de
ser yodadas. El yodo, que entra a la glndula
tiroidea a travs de capilares en forma de yoduro (I
-
), es transportado en contra de
gradiente con un transportador en el que se contransporta el yodo con el Na
++
.
Sntesis de hormonas tiroideas


Gracias a la accin de la tiroperoxidasa (TPO), el yodo se oxida, de forma que puede
yodar los residuos de tirosina de la tiroglobulina. Sobre el esqueleto de tiroglobulina
yodada se forman las hormonas T3 y T4. Se fundir con los endosomas y se generan las
hormonas T3 y T4 que salen al exterior para ejercer su accin sobre el tejido diana.
Del intestino captamos el yodo en forma de yoduro con el plasma. El proceso de
captacin de yodo est catalizado por una hormona que procede de la pituitaria. Esta
1. Las clulas del folculo sintetizan
enzimas y tiroglobulina.
2. El yoduro es cotransportado con Na
+
a
la clula.
3. Las enzimas (TPO) aaden el yodo a la
tiroglobulina para producir T3 y T4
unido a tiroglobulina.
4. La tiroglobulina es captada por
endocitosis.
5. Las proteasas de los lisosomas liberan
T3 y T4 de la tiroglobulina.
6. T3 y T4 libres entran en la circulacin.

T3 y T4 son lipoflicas y pueden entrar en las
membranas de las clulas diana. T4 es la forma
que se libera en mayor cantidad, aunque T3 es
5 veces ms activa.
Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 191
hormona es la TSH y favorece los diversos pasos de la formacin de hormonas
tiroideas. En diversos residuos de la tiro-peroxidasa se une el yodo formando:
monoyodotiro-preoxidasa, etc. Algunos residuos se van a ver conjugados para formar
T3 y T4. Se va a dar un proceso proteoltico con lisosomas dando lugar a T3, T4 y
tambin se producirn cortes de monoyodo-tirosina, etc. Para ser transportadas por el
organismo tienen que unirse a clulas plasmticas.

1 Captacin del yodo.
2 Oxidacin del I y yodacin de
residuos de Tyr y TG.
3 Acoplamiento de residuos
yodados mediante enlaces ter.
4 Protelisis.
5 Salida de hormonas al plasma.

Las hormonas tiroideas tienen un papel fundamental en muchos procesos, sobre todo en
el desarrollo del cerebro durante el perodo embrionario.
Formacin de MIT, DIT y condensacin entre tirosinas yodadas.
Se puede yodar en dos posiciones, dando lugar a diyodo tirosina. Tambin puede tener
lugar en una sola posicin, producindose mono yodo tirosina.
En los residuos vecinos se puede producir la conjugacin para formar por condensacin
oxidativa lo que posteriormente sern las hormonas tiroideas.

Al producirse la conjugacin se forma un ter entre dos residuos que quedan prximos
en la estructura, dando lugar a una conjugacin con dos anillos (externo e interno) que
son de tirosina y que estn yodados en las posiciones 3 y 5 (interno) y 3 y 5 (externo).
La conjugacin puede ser entre dos diyodo-tirosinas o entre una diyodo-tirosina y una
yodo-tirosina.
Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 192

En los ribosomas se forma la tiroglobulina, que se almacena en el coloide y all se
yodan las posiciones. Luego se da un proceso de endocitosis de la tiroglobulina ya
yodada. Se produce una protelisis y:
- Se forman T3 y T4
- La tiroglobulina sufre procesos de deyodacin para
volver a aportar yodo libre.
La hormona final NO es la tiroglobulina, sino que sern
los dos anillos yodados y la parte correspondiente del
enlace peptdico.
Las hormonas tiroideas son muy poco solubles en agua y
necesitan ser transportadas. Se inactivan por desyodacin
y conjugacin.
La T4 puede pasar a T3 por accin de una desyodasa, que
se da tanto en la glndula tiroidea como en otros tejidos.
Posiblemente se pueda producir T2, pero es una estructura
mucho ms inestable debido a la posicin que ocupan los
anillos en la hormona.

T4 y T3 son dos hormonas que actan como las hormonas esteroideas y la vitamina D
unindose a receptores celulares para aumentar o reprimir la sntesis de protenas.
La hormona estimuladora del tiroides (TSH) ejerce un papel muy importante en la
produccin de hormonas tiroideas.
1. En respuesta a un requerimiento de la subida de los niveles de hormonas
tiroideas se activa TSH en las clulas del folculo tiroideo.
Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 193
2. En este caso, TSH se une a un
receptor de membrana plasmtica
unidos a protena G.
3. La unin al receptor activa la
adenilato ciclasa, que cataliza el paso
de ATP a cAMP.
4. La subida de cAMP activa a la
protena quinasa A o protena
dependiente de cAMP.
La PKA est implicada en distintos procesos importantes para que se produzca la
sntesis de hormonas tiroideas:
- Aumenta la velocidad de endocitosis, lo que conlleva una degradacin
aumentada de la tiroglobulina.
- Aumenta la sntesis de transportadores, lo que conlleva una actividad aumentada
de la bomba de yodo, que es el cotransportador que permite la captacin de yodo
al mismo tiempo que capta sodio.
- Aumenta la sntesis de tiroperoxidasa, por lo que la tirosina es yodada ms
rpidamente.
Efectos sobre el metabolismo
- Las hormonas tiroideas tienen un papel relevante porque aceleran el
metabolismo basal
1
. Aumentan el metabolismo de muchos tejidos y, con ello,
aumentan el consumo de oxgeno.
- Son esenciales en el desarrollo del cerebro.
- Regulan el metabolismo de carbohidratos, grasas y protenas.
o Glcidos: estimulan casi todos los aspectos del metabolismo de glcidos,
aumenta la entrada de glucosa dependiente de insulina y aumenta la
gluconeognesis y la glucgenolisis para generar glucosa libre.
o Lpidos: aumenta la degradacin de grasas, produciendo un aumento en
la concentracin de cidos grasos en el plasma. Aumenta la oxidacin de
cidos grasos.
La concentracin de colesterol y triglicridos en plasma est inversamente
relacionada con los niveles de hormonas tiroideas.
La relevancia que tienen las hormonas tiroideas, que afectan a muchsimos tejidos, se
pone de manifiesto en dos patologas que estn asociadas a un exceso o defecto de la
produccin de hormona tiroidea:

1
Energa que una persona consume sin hacer ninguna actividad (exceptuando respirar, los mecanismos
del cerebro, etc).
Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 194
- Hipotiroidismo: metabolismo basal reducido, piel fra, apetito reducido y un
habla pobre y lenta.
- Hipertiroidismo: metabolismo basal acelerado, temperatura corporal alta, piel
caliente, prdida de peso, aumento de la actividad gastrointestinal e
hiperactividad.

Caractersticas generales de las hormonas
tiroideas
El mecanismo de accin de estas hormonas es similar al de las esteroideas y la vitamina
D: a nivel genmico, ya que la hormona tiroidea se une a un receptor que es un factor de
transcripcin dependiente de ligando.
PROPIEDAD TIROXINA
Regulacin feedback de la sntesis S
Almacenamiento de hormona preformada Varias semanas
Mecanismo de secrecin Protelisis de tiroglobulina
Unin a protenas plasmticas S
Vida media en el plasma sanguneo Das
Tiempo de accin Das
Receptores Nuclear
Mecanismo de accin El complejo hormona-receptor controla la
transcripcin y estabilidad de mRNAs
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Laura Esteban Luca 195
Eicosanoides
Es difcil encajarlos en lipoflicos completamente o hidroflicos completamente. Son
aquellas molculas que tienen 20 tomos de carbono. Su estructura es lipoflica pero
actan unindose a receptores de membrana (hay evidencias de que tambin lo hace
unindose a receptores intracelulares).
Son las prostaglandinas, los leucotrienos y los tromboxanos. Actan de forma paracrina
y autocrina. Todos ellos se forman del cido araquidnico, un cido graso presente en
los fosfolpidos. Dependiendo de la fosfolipasa que acta sobre el fosfolpido se forman
unos u otros. La fosfolipasa A2 corta en el 2 carbono que, en muchos fosfolpidos, es el
cido araquidnico.
El cido araquidnico tiene 20 carbonos y procede del cido linoleico, que es un cido
graso esencial. Una vez se ha liberado el araquidnico. Segn la va que siga el cido
araquidnico (ciclooxigenasas o lipoxigenasas) actan sobre l unas determinadas
enzimas que van a producir prostaglandinas, leucotrienos y tromboxanos.
Todos ellos tienen 20 tomos de carbono.
- Leucotrienos: son acclicos pero tienen 3 dobles enlaces conjugados.
- Tromboxanos: tienen un anillo de oxano.
- Prostaglandinas: dos ciclos.
Sntesis de eicosanoides
Se sintetizan a partir del aumento de la actividad de la fosfolipasa A2 para liberar el
cido araquidnico del fosfolpido. Una vez activado el araquidnico, por accin de
diferentes enzimas se forman prostaglandinas, leucotrienos y tromboxanos.
Los corticoides inhiben la actividad de la fosfolipasa A, inhibiendo la formacin de
estos compuestos y, como uno de sus efectos es la inflamancin, los corticoides se
utilizan como antiinflamatorios.

Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 196
Aspirina
La aspirina es cido acetil saliclico, que
promueve la acetilacin de un resto de serina
de la sintetasa. La aspirina aporta el residuo
de acetilo inactivando la enzima de la sntesis
de prostaglandinas.
El cortisol es una molcula que aumenta la
expresin de protenas. Una de la sprotenas
que aumenta su expresin es la lipocortina,
que bloquea la produccin de eicosanoides
porque inhibe a la fosfolipasa A2.
Las prostaglandinas se sintetizan en respuesta a estmulos inflamatorios locales.
Sensibilizan a los receptores del dolor a otras sustancias implicadas en dolor.

Signos de la inflamacin
1. Calor
2. Dolor
3. Hinchazn
4. Rojez
Los eicosanoides estn implicados en cada uno de estos signos.
Picadura de un insecto
Se liberan tromboxanos que median la liberacin de prostaglandinas y leucotrienos
(vasodilatadores). Los vasos aumentan y la picadura enrojece. Los leucotrienos hacen
los vasos ms permeables, se libera plasma y citoquinas al tejido conectivo y se produce
inflamacin.
Las citoquinas aumentan los niveles de prostaglandinas que sensibilizan neuronas de
dolor.
Algunas prostaglandinas son tambin potentes agentes pirticos, por eso se produce
calor.
Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 197

198
xido ntrico como mensajero
intracelulares
Existen mensajeros intracelulares que son gases como el NO. Este mensajero se conoce
como xido ntrico. Este compuesto se produce en respuesta a estmulos y su vida
media es muy corta (unos segundos), luego su actividad es paracrina.
El NO es un gas poco soluble en agua, difunde a travs de las membranas y acta como
mensajero intracelular de forma paracrina, dando lugar a muchas respuestas biolgicas.
El xido ntrico se forma a partir de arginina al actuar sobre ella la xido ntrico
sintetasa, que va a producir una hidroxilacin para dar lugar a citrulina y a la liberacin
de cido ctrico. Es una enzima compleja parecida a la monoxigenasa de funcin mixta.

Sistemas en los que acta el NO
- Msculo liso: vascular, vasorrelajacin.
- Sistema nervioso central: en neurotransmisin, el control del apetito.
- Sistema nervioso perifrico: ereccin del pene, vascular, vaciado gstrico.
- Respuesta inmune: el NO secretado en una respuesta inmune es txico para
bacterias.
Efecto a nivel vascular
En la luz del vaso tenemos una capa de clulas endoteliales y una capa de clulas
musculares ms externa. Donde se est produciendo el xido ntrico es en la capa de
clulas endoteliales. Se produce mediante la oxidacin de la xido ntrico sintetasa y a
partir de arginina.
Existen distintos tipos de sintetasas:
- Constitutiva: est expresada siempre a un determinado nivel sin ser regulada.
- Inducible (iNOS): en el caso del sistema inmune, esta enzima se expresa a bajo
nivel, pero aumenta su cantidad en respuesta a una determinada citoquina
(ejemplo: en los macrfagos).
Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 199
Por accin de la NOS se libera cido ntrico que difunde en la musculatura del vaso que
acta sobre la guanilato ciclasa inhibiendo la agregacin de las plaquetas. La guanilato
ciclasa forma cGMP y acta sobre la musculatura y la guanilato ciclasa soluble
produciendo cGMP, provocando que se produzca vasorrelajacin.
Sistema cardiovascular. La liberacin de NO a partir de frmacos se ha usado en el
tratamiento de la angina de pecho desde 1867.

Acetilcolina xido ntrico cGMP relajacin del msculo
La viagra es un inhibidor de la fosfodiesterasa. Los aumentos en los niveles de cGMP
son transitorios y de esto se encarga una isoforma de fosfodiesterasa.
Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 200
Receptores de hormonas
esteroideas, tiroideas y vitamina d
Mecanismo general
La hormona se une al receptor produciendo un cambio
conformacional. Este complejo hormona-receptor se une a
sus promotores en los genes que controlan, produciendo un
cambio en la expresin gnica.
Los receptores son protenas con distintos dominios para
poder llevar a cabo su accin.
Uno de los dominios esenciales (azul oscuro) es el
dominio de unin al DNA. Por definicin todos los
receptores tienen este dominio porque son factores
de transcripcin.
Este dominio de unin tiene una afinidad de
aminocidos con los distintos receptores muy alta.
Esta regin dentro de la estructura est muy
conservada porque en todos los receptores se
encarga de lo mismo.
En la parte amino-terminal hay poca similitud de
secuencia. Se encarga de la activacin de la
transcripcin (dominio de transactivacin).
La parte carboxilo-terminal es el dominio en el que
estn los determinantes de unin al ligando. Esta regin tiene ms homologa de
secuencia pero menos que la unin al DNA:
El dominio de transactivacin est implicado en la interaccin con otras
protenas necesarias para que se produzca la activacin de la transcripcin. Har
falta la accin de muchas protenas para que se produzca la accin de la
transcripcin.

Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 201


Actan sobre receptores intracelulares en los que la unin produce un cambio
conformacional. A las regiones en el DNA a las que se unen los receptor se las conoce
como elementos de respuesta (elemento de respuesta a hormona = HRE).
Para que se produzca transcripcin dependiente de hormonas 3 elementos: hormona,
receptor y elemento de respuesta.
Organizacin estructural de los receptores
nucleares
Si amplificamos la regin de unin al DNA la encontramos formada por lo que
denominamos dos dedos de zinc que contienen un zinc coordinado con cistenas. Los
receptores que tienen los dedos de zinc suelen actuar de forma dimrica. Los sitios de
DNA a los que se unen los receptores se llaman elementos de respuesta y en funcin de
la hormona a la que responden ser:
- GRE: elemento de respuesta a glucocorticoide.
- ERE: elemento de respuesta a estradiol.
- VDRE: elemento de respuesta a vitamina D.
- TRE: elemento de respuesta a testosterona.
El primer dedo de zinc est implicado en la unin al DNA y fundamentalmente los
aminocidos que se encuentran en su base. Segn los aminocidos que quedan libres en
la base se adquiere una especificidad determinada.
Si los aminocidos de la base son EG se adquiere especificidad de estrgeno. Si son G S
se adquiere especificidad de glucocorticoide.
El segundo dedo de zinc est implicado en la dimerizacin, es decir, actan de forma
dimrica. Esto quiere decir que una molcula de receptor se une a otra molcula de
receptor y este dmero es el que se une a secuencias especficas del DNA.
Son dos molculas de receptor con dos dedos de zinc. Estos dos dedos se unen a la
secuencia de DNA.
Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 202

Anlisis de promotores
Tenemos un cultivo celular y hacemos unos experimentos en los cuales introducimos en
esta clula el plsmido A (codifica para la protena GR) y el plsmido B (elemento de
respuesta para GR).
La protena para la que codifica es la luciferasa, que al sintetizarse una gran
concentracin de ella adquiere fotlisis. Damos tiempo para que se sintetice la protena
y despus aadimos el glucocorticoide, que se une a su receptor que se encuentra en el
citoplasma, viaja al ncleo para unirse al elemento de respuesta y activar el promotor
para la luciferasa. As veremos si ante el glucocorticoide la sntesis de luciferasa se ha
estimulado.
As podemos ver qu secuencias son las que intervienen en la protena. Cambiamos
algunos elementos para ver lo que ocurre.

Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 203
Clasificacin de los receptores
Receptores de hormonas esteroideas
Los receptores de hormonas esteroideas actan de forma homodimrica. Los sitios a los
que se une cada receptor en el DNA son hemisitios y son secuencias invertidas o
palndromos invertidos y estn separados por tres nucletidos cualquiera.

AAGAACA _ _ _
_ _ _ ACAAGAA
Receptores de hormonas tiroideas
Actan de forma heterodimrica y su compaero en la
formacin del heterodmero es el 9-zinc retinoico. El receptor
para el 9-zinc retinoico se suele encontrar asociado al receptor
para hormona tiroidea. Se unen fundamentalmente a
repeticiones directas y no a invertidas.
Para diferenciar los sitios de unin de estos receptores al
DNA son:
- Vitamina D: 3 nucletidos en medio.
- Retinoico: 4 nucletidos en medio.
Lo que va a determinar la unin de un receptor u otro es el
nmero de nucletidos que separan las dos secuencias
repetidas.
Hay un paso importante a la hora de permitir la expresin
gnica y es que la cromatina est muy empaquetada.

Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 204
Es necesario que la protena tenga acceso a las secuencias de DNA y, para que esto sea
posible, tiene que sufrir distintos tipos de modificaciones.
- Remodelacin de la cromatina dependiente de ATP.
- Intercambio de variantes de histonas.
- Modificaciones post-traduccionales de las histonas.
o Acetilacin en lisina.
o Fosforilacin en serina.
o Metilaciones de lisina y arginina.
De esta forma se consigue remodelar la cromatina
para permitir que los factores de transcripcin, unindose a sus elementos de respuesta,
sean capaces de llevar a cabo la transcripcin.

Mecanismo de accin por el que actan los
glucocorticoides
Su receptor se encuentra en el citoplasma (GR). En ausencia de la hormona, este
receptor se encuentra asociado a una serie de protenas y esto impide que ejerza su
funcin en el ncleo donde promueve la expresin gnica.
Cuando se une la hormona, sta difunde en la membrana, se une a su sitio en el receptor
y eso le induce un cambio conformacional que le incapacita para seguir unido con las
otras protenas citoplasmticas. Ahora el receptor dimeriza formando el homodmero,
que viajar al ncleo para promover la transcripcin.
Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 205

Mecanismo de accin de los receptores que
forman heterodmeros
Estos receptores estn unidos a DNA incluso en ausencia de hormona. Lo que ocurre es
que en ausencia de hormona estn unidos a
un complejo proteico de represin.
Cuando se une la hormona se produce un
cambio conformacional y se rompe la
interaccin con el complejo cor-represor, de
forma que se une a unas protenas que son
el complejo coactivador, que mantienen la
cromatina laxa para que pueda producirse la
expresin del gen.
Los casos paradigmticos de receptores son los hormona tiroidea y RAR.










Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 206
Algunas protenas tienen actividad histona acetil transferasa para que puedan mantener
su funcin.
En el caso de los glucocorticoides cuando se unen a DNA tambin se unen a complejos
coactivadores para descompactar la cromatina y que se pueda producir la expresin
gnica.

El conocimiento del funcionamiento de los mecanismos bsicos mediante los cuales
funcionan estos tipos de receptores es muy importante para el tratamiento mediante
antagonistas de enfermedades tan importantes como el cncer.
En el caso del cncer de mama se utiliza el tamoxifen. Es una molcula que se puede
unir al receptor de estrgenos pero no induce el cambio conformacional, por lo que no
se puede unir el complejo coactivador y las clulas cuyo crecimiento depende de esta
hormona no pueden continuar dividindose.

Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 207

208
Receptores de membrana plasmtica
En el caso de las hormonas peptdicas, dependiendo del receptor al que se una el ligando
el mecanismo de accin es diferente. La consecuencia es la misma: cambios en la
expresin gnica.
Clasificacin de los receptores de membrana
plasmtica
1. Receptores acoplados a protenas G: el receptor, que sera el sensor de la seal
(ligando, hormona), es la protena que es capaz de recibir a la hormona (protena
transmembrana). Para transmitir la seal se necesitan los tres elementos para
llega a la parte clave que es la produccin de segundos mensajeros.

2. Canales inicos: implicados en neurotransmisin. Son protenas de membrana
que permiten el cambio de posicin de iones.

3. Receptores que no tienen actividad pero acoplados a receptores de tirosina
quinasa
a. Receptores de citoquinas: el propio receptor no tiene actividad pero se
asocia a tirosina quinasa.

Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 209
4. Receptor asociado a guanilato ciclasa. El xido ntrico que se une a un receptor
para producir la relajacin de los vasos y dar lugar a cGMP.
5. Receptores con actividad intrnseca
a. Guanilato ciclasa da lugar a cGMP.
b. Actividad tirosina quinasa. El propio receptor tiene un dominio cataltico
y fosforila protenas en residuos de tirosina.

Segundos mensajeros
Los principales son:
cAMP, cGMP (receptores de membrana).
diacilglicerol e inositol trifosfato: se general a partir de fosfatidil inositol 4, 5
difosfato. Esto se hidroliza y libera el azcar que es el inositol trifosfato.
Receptores acoplados a protenas g
En este tipo exiten tres elementos esenciales implicados en la seal:
o Sensor: recibe la seal. Es una protena de membrana con regiones
hidrofbicas que le permiten cruzar la
membrana plasmtica 7 veces. Dada esta
peculiar estructura, a este tipo de receptores
se les conoce como serpentina. La regin
extracelular est especializada en la
interaccin con el ligando y la parte
intracelular est implicada en la interaccin
con protenas que transmitan la seal.
o Transductor: no es una nica subunidad, sino que son tres subunidades
diferentes. Es una protena heterotrimrica y est formada por tres
subunidades diferentes , y .




Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 210
El transductor tendr una conformacin inactiva cuando no haya
hormona. En este caso las tres subunidades estn asociadas entre
s y la subunidad se encuentra unida a GDP. La subunidad
tiene una ligera actividad GTPasa.
La conformacin activa se caracteriza por una disociacin de las
subunidades. En este caso la subunidad est unida a GTP y la
conformacin activa se mantendr hasta que la propia subunidad
lleve a cabo la hidrlisis del GTP. Para la terminacin de las
seales es importante la actividad de la subunidad .

o Efectores:
En algunos tipos de receptores la adenilato ciclasa (cAMP).

Fosfolipasa C: se forman dos segundos mensajeros diacilglicerol
e inositol trifosfato.




Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 211
Receptores asociados a protenas g
adenilato ciclasa
Se unen los determinantes extracelulares al sensor y esto provoca que se disocien las 3
subunidades del transductor. As, la protena G unida a GTP interacciona con la
adenilato ciclasa, que forma cAMP. Hay dos tipos de subunidades G:
Gs: estimula la actividad de la adenilato ciclasa, aumentando la concentracin
de cAMP intracelular.

Gi: inhibe la actividad de la adenilato ciclasa.
Cada una se une a un sitio diferente de la adenilato ciclasa.
Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 212
Mecanismo de activacin de la adenilato ciclasa.
Tenemos el complejo de las protenas transductoras (trimrico).
La hormona se une a su sitio especfico de unin en el receptor y se produce un cambio
conformacional en el receptor. Una vez se ha producido este cambio, el complejo
hormona-receptor puede interaccionar con la hormona transductora. As aumenta la
velocidad de disociacin del GDP. La unin de la subunidad con GTP
1
le da la
conformacin activa necesaria para que interaccione con la adenilato ciclasa.
La subunidad tiene actividad intrnseca GTPasa, de forma que, como slo puede
activar a la adenilato ciclasa cuando est unida a GTP, es slo durante ese periodo de
tiempo cuando puede durar la seal. Rpidamente pasa de nuevo a GDP y recuperamos
la situacin inicial. La conformacin activa de la protena transductora se mantiene
mientras se mantenga el GTP.

Formacin del segundo mensajero cAMP
Lo que se consigue al activar la adenilato ciclasa es que se formen cAMP y PPi a partir
de ATP. En cuestin de 20 segundos aumenta la concentracin de cAMP de 5.10
-8
M a
10
-6
M.
Otro mecanismo que tambin garantiza la transitoriedad de la seal es una enzima
llamada fosfodiesterasa que hidroliza el cAMP generando 5-AMP. Es una enzima clave
en la terminacin de la seal de este tipo de va de sealizacin, ya que el 5-AMP no es
segundo mensajero. Al disminuir el cAMP se recupera la situacin inicial y el receptor
queda libre para que pueda recibir otro estmulo.

1
Favorecida por la diferencia de concentraciones: la concentracin intracelular de GTP es del orden de
10 veces mayor que la concentracin de GDP.
Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 213

Mecanismo de activacin de la PKA
Es activada por el cAMP. Se encarga de fosforilar residuos en las protenas. Hay tres
residuos aminoacdicos que son sustratos de la PKA que son serina, treonina y tirosina.
Dependiendo del residuo que fosforilan distinguimos dos grandes grupos:
- Sern treonn quinasas: capaces de fosforilar residuos de serina y/o treonina.
- Tirosina quinasas: slo fosforilan residuos de tirosina.
- Protenas quinasas duales: capaces de fosforilar residuos de serina, treonina y
tirosina. Son minoritarias dentro de la clula.
La mayor parte de estas enzimas necesitan un metal para su accin cataltica, de forma
que su sustrato no es slo ATP, sino ATP-Mg
++
. Al mecanismo entero lo podemos
clasificar como una modificacin post-traduccional irreversible, de manera que
necesitamos otra enzima que catalice la hidrlisis del fosfato para volver a la situacin
de protena desfosforilada.





Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 214

Lo que realmente produce la fosforilacin es un cambio conformacional en la protena
que puede conducir a una situacin activa o inactiva porque puede darse el caso de que
una conformacin sea ms activa o viceversa. El fosfato introduce en las molculas
cargas negativas y, ante un exceso de cargas negativas, a la protena le resulta imposible
mantener estable su conformacin porque los enlaces dbiles ya no aguantan.
Estructura de la PKA
La PKA es una protena formada por dos tipos de subunidades
diferentes:
- Cataltica: slo ella puede llevar a cabo la catlisis.
- Reguladora: controla que la subunidad cataltica pueda actar o
no.
En una situacin de no-estmulo las encontramos unidas, con la
subunidad reguladora evitando que la cataltica lleve a cabo su funcin.
La subunidad reguladora tiene unos sitios de afinidad para el cAMP.
Cuando interacciona con el cAMP cambia su conformacin y le es
imposible seguir unida a la subunidad cataltica, de forma que se
separan.
Las protenas fosfatasas tambin estn implicadas en la terminacin de
la seal. Estn implicadas en la reaccin de degradacin del glucgeno.
En uno de los eventos en los que se produce cAMP se activa PKA.
La activacin de PKA promueve cambios rpidos en el metabolismo
por fosforilacin de protenas intracelulares.
Estos son eventos muy rpidos y que cambian el metabolismo. En cuestin de segundos
cambia la concentracin intracelular de cAMP, luego tarda segundos la activacin de
PKA.


Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 215
Tambin promueve cambios ms lentos en el metabolismo, al fosforilar
factores de transcripcin que afectan a la expresin gnica.
Existen otros eventos ms lentos porque por la misma va se producen
cambios en la expresin gnica.
La protena PKA es capaz de viajar al ncleo donde lleva a cabo
fosforilaciones sobre dianas nucleares (protenas alojadas en el ncleo).
CRE = elemento de respuesta a cAMP.
CREB = que se une al elemento de respuesta a cAMP.
Los genes que contiene el elemento se ven modificados cuando la va
de sealizacin provoca un cambio en la concentracin intracelular de
cAMP.
La glucgeno sintasa se ve inactivada por la PKA.
Toxina colrica
Se une a la protena Gs y, utilizando NAD produce una modificacin covalente en ella
introducindole un resto de ADP ribosa. El resultado es que ahora el GTP no puede
hidrolizarse y se queda anclado en la situacin activa.
La PKA activa permanentemente canales de cloro e inhibe un intercambiador de
Na
+
/K
+
. Se produce un desbalance inico que conlleva una prdida masiva de lquido.

En este mecanismo encontramos dos elementos:
PROTE NA EFECTORA: ADENI LATO CI CLASA.
PROTE NA TRANSDUCTORA: PROTE NA G (HETEROTR MERO).



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Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 218
Receptores acoplados a protena g
fosfolipasa c
Los lpidos de membrana son muy importantes en estos procesos. El sustrato de la
fosfolipasa C es PIP2. Tiene dos sustituyentes cidos grasos, los fosfatos (4, 5) y el
azcar.
El PIP2 est anclado a la membrana porque dos de los cidos grasos sustituyentes le
permiten estarlo. La protena fosfolipasa C va a ser la que corta y deja un diacilglicerol
unido a la membrana y se genera un inositol 3P libre.
- El diacilglicerol cumple su funcin en la membrana ya que por su estructura no
puede salir.
- El inositol 3P ejerce su accin en el citoplasma.

El objetivo del I3P es la liberacin de calcio. Hay que mantener siempre baja la
concentracin de calcio (almacenndolo en orgnulos). El calcio sale y aumenta la
concentracin en el citoplasma. La funcin del Ca
++
y del diacilglicerol es fosforilar una
sern treonn quinasa, la protena quinasa C, que fosforila sus sustratos.

Existe una droga llamada ster de forbol que es anloga del diacilglicerol. Es una droga
capaz de activar directamente a protena quinasa C y, al ser un anlogo estructural del
diacilglicerol, se emplea para ver si la protena quinasa C est implicada en ciertos
procesos celulares. Produce una activacin de protena quinasa C mucho ms fuerte que
su sustrato habitual.
Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 219
La ionomizina es un tipo de droga que lo que hace es un canal en la membrana de la
clula para que entre el calcio y as aumente su concentracin intracelular.
Con ester de forbol e ionomizina se puede conseguir en el laboratorio la misma accin
que consiguen el diacilglicerol y el IP3.
La protena G implicada en la va de la fosfolipasa C es distinta: protena Gq.

Calmodulina
El calcio, aparte de activar las protenas quinasas, ejerce su accin
unindose a determinadas protenas intracelulares. Una de esas
protenas es calmodulina, de tamao pequeo y ubicua.
La calmodulina se caracteriza por tener 2 regiones globulares
unidas por una zona flexible y por tener 4 sitios de unin para
Ca
++
. El mecanismo por el que activa las protenas consiste en que
la protena quinasa dependiente de Ca
++
-calmodulina se une a las
protenas diana en su forma inactiva y cuando se une el complejo
Ca
++
-calmodulina, produce el cambio conformacional.
La protena que est siendo modulada por la calmodulina
mantiene el cambio mientras se mantiene la concentracin
intracelular de Ca
++
. Cuando esta concentracin baja, la
calmodulina se libera del Ca
++
y entonces finaliza su accin.

Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 220




Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 221
Terminacin de la seal
Mecanismos implicados en la terminacin de la seal
1. Disociacin ligando-receptor
2. Endocitosis del receptor
3. Degradacin o eliminacin de segundos mensajeros
4. Hidrlisis de GTP en las protenas G correspondientes

- Tenemos el receptor -adrenrgico
Existen protenas quinasas que fosforilan a los receptores en la regin intracelular. Una
vez estn fosforilados, los receptores pueden interaccionar con unas protenas: las -
arrestinas. Al interaccionar con ellas se bloquea la interaccin del receptor con la
protena G. Esta situacin se mantiene hasta que el receptor se defosforila.
Existen numerosos mecanismos implicados en que la seal sea transitoria. Si cualquiera
de estos mecanismos funciona mal se puede dar una situacin transitoria de patologa
que puede llevar a una situacin crnica.
Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 222
Hormonas peptdicas y
catecolaminas
Catecolaminas
Las catecolaminas se llaman as porque tienen un anillo catecol en su estructura y
derivan de tirosina. Se localizan en la glndula adrenal (en la corteza renal se producen
esteroides), en la mdula del rin. Algunos de estos compuestos son neurotransmisores
y se localizan en neuronas.
Adrenalina
Sntesis
Comienza desde tirosina, que deriva de fenilalanina.
1. El primer paso de la sntesis [tirosina L-dopa] lo lleva a cabo la tirosina
hidroxilasa.
2. Posteriormente se lleva a cabo una descarboxilacin de la L-dopa mediante la
dopa descarboxilasa y da lugar a dopamina.
3. La dopamina es transformada en norepinefrina o noradrenalina mediante la
dopamina hidroxilasa.
4. Finalmente, hay una metil transferasa que transforma la noradrenalina en
adrenalina aadiendo el grupo metilo.
La metil transferasa est fundamentalmente en la mdula adrenal, donde se tiene que
llevar a cabo la sntesis de adrenalina.


Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 223
Funcin
La adrenalina de una situacin de reposo tiene una concentracin bajsima de 10
-10
que
puede llegar a 10
-7
. Se estimula como respuesta ante un estrs inmediato (lucha y
huda). Hay que preparar al organismo de distintas formas para enfrentarse a ello. Al
aumentar la frecuencia de bombeo del corazn se puede transportar ms sangre y
oxgeno, se dilatan los conductos respiratorios y aumenta la presin sangunea. En los
tejidos ms perifricos ocurre lo contrario: relajacin de esfnteres, inhibicin de la
secrecin intestinal, vasoconstriccin de arteriolas en piel e intestino y vasodilatacin en
msculos, dilatacin de pupilas, etc.
Efecto sobre el metabolismo
Tambin tiene unos ciertos efectos sobre el metabolismo que se localizan en el hgado,
el msculo y el tejido adiposo.
Esta hormona afecta fundamentalmente al metabolismo del glucgeno.
Hay un efecto de refuerzo: aumenta la secrecin de glucagn e inhibe la de insulina. El
glucagn tiene una accin parecida a la de la adrenalina, pero no tiene receptores en
todos los lugares donde los tiene la adrenalina.
Receptores que median la accin de la adrenalina
En el caso de la adrenalina existen cuatro tipos de receptores que median sus efectos:
- 1: acoplado a Gq, activa fosfolipasa C (PLC) y genera Ca/diacilglicerol
hgado.
- 2: acoplado a Gi, inhibe la adenilato ciclasa y disminuye la concentracin de
cAMP.
- 1 y 2: acoplado a Gs, activa la adenilato ciclasa y aumenta la concentracin
de cAMP msculo, hgado, tejido adiposo.
En el hgado la recepcin est mediada fundamentalmente por receptores y .
Receptor
Se favorece fundamentalmente el proceso de formacin de glucosa 6P y,
posteriormente, de glucosa, que es expulsada y transporta a otros tejidos.

En los receptores acoplados a AC, aumenta la concentracin de
cAMP y se activa la PKA.
La PKA activa la glucogenolisis porque activa a la glucgeno
fosforilasa quinasa, que a su vez activa a la glucgeno
fosforilasa (que degrada glucgeno).
La PKA inhibe la gluconeognesis porque fosforila a la
glucgeno sintetasa, inactivndola.
Al liberarse, la adrenalina se une a receptores en el hgado
inhibiendo la sntesis de glucgeno y activando su degradacin.
Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 224
Receptor
Activa una fosfolipasa C.

Regulacin
La glucgeno sintetasa es una de las protenas regulada por ms protenas.
Inhibidor: PKA, fosforilasa quinasa
La glucgeno fosforilasa quinasa est formada por cuatro tipos de subunidades
diferentes que se llaman: , , y . Es un tetrmero formado por estas subunidades
distintas que pueden estar modificadas de la siguiente forma.
- Conformacin inactiva: antes de cualquier seal.
- Cuando se recibe la activacin por PKA, una de sus subunidades se fosforila.
Con lo cual tenemos una forma que es parcialmente activa.
- Hay otro tipo de seales (accin hormonal, accin muscular), se libera Ca
++
y da
la casualidad de que una de las subunidades de la fosforilasa quinasa es la
calmodulina, que se une a Ca
++
y se activa totalmente.
Para tener completamente activa la fosforilasa quinasa es necesario que se produzcan las
dos seales juntas: fosforilacin y activacin por calcio.
Mecanismos que justifican la accin en msculo (receptores ) y
en tejido adiposo ().
Los receptores actan a travs de Gs y aumenta la activacin de PKA. La glucosa
que se produce es utilizada para dar energa.





En los receptores aumenta la concentracin de Ca
++
y
de diacilglicerol, que activan la protena kinasa C.
La PKC fosforila a la glucgeno sintetasa (inactivndola),
inhibindose la glucogenognesis.
La fosforilasa quinasa es la diana del PKA cuando se
activa la va del cAMP y es fosforilada.
Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 225
En tejido adiposo tambin se produce activacin de PKA. Existe una lipasa sensible a
hormonas que es activada por PKA y entonces se produce una degradacin de
triacilgliceroles y cidos grasos.

Hay muchsimos tipos de adrenalina: en el corazn, en determinados tipos de vasos
sanguneos, etc.
Hormonas pancreticas
Las hormonas pancreticas son varias ubicadas en estructuras conocidas como islotes de
Langerans. El pncreas es una enzima tanto endocrina como exocrina. Tanto la insulina
como el glucagn se sintetizan en forma de pre-pro-hormona (pre=pptido seal). Una
vez se han sintetizado se corta el pptido seal y se forman enlaces disulfuro en la
propia molcula de pro-insulina. La pro-insulina es una molcula en la que se han
formado dos puentes disulfuro internos. Se corta entonces el pptido de conexin para
obtener la insulina como hormona activa.

Objetivo del glucagn: obtener glucosa para afrontar una situacin de ayuno.
Objetivo de la insulina: degradar glucosa de todas las formas posibles para mantener
en sangre la concentracin adecuada.

Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 226
Insulina
El receptor de la insulina es una protena de membrana formada
por dos tipos de subunidades diferentes y . Entre s estn
unidas por puentes disulfuro.
La subunidad est en la regin extracelular y contiene
los determinantes para la unin de la insulina.
Tiene una regin transmembrana en la subunidad , as
como una regin intracelular que tiene una actividad
enzimtica (tirosina quinasa).
Cuando se une la insulina a su receptor, se produce un cambio
conformacional en el receptor de manera que las regiones
citoplasmticas cambian de posicin y, entonces, se produce un
fenmeno conocido como transfosforilacin de forma que el
dominio quinasa de cada subunidad fosforila a la otra subunidad
beta.
La primera molcula que sufre fosforilaciones en residuos de
tirosina cuando se une la insulina es el propio receptor.
Se generan dos tipos de residuos de tirosina:
- Unos estn implicados en mantener al receptor activo durante un periodo de
tiempo.
- Otros estn implicados en permitir que interaccionen protenas de sealizacin
con el receptor.
Cuando el receptor no se une a la insulina, sus porciones citoplasmticas obstruyen la
tirosina quinasa. Cuando llega la insulina se produce un cambio conformacional de
forma que se apartan los dominios para interaccionar con otras porciones de la protena
con cargas positivas (porque las tirosinas tienen grupos fosfato que tienen carga
negativa) dejando libre el sitio cataltico de la tirosina quinasa.
Una vez que la protena se mantiene activa durante un tiempo, esta protena se va
fosforilando a s misma. La fosforilacin de las otras tirosinas permite la interaccin con
otras protenas que tienen que tener unos dominios llamados dominios SH2. Estos
dominos SH2 son dominios formados por unos 100 aminocidos en los que va a haber:
- Un sitio de reconocimiento de la fosfotirosina.
- En sitio de unin a los aminocidos de la cadena lateral. Si no se da este dominio
no se puede unir a fosfotirosina.
La fosfotirosina no est sola, lo que es muy importante son los aminocidos de su
entorno, que son los que le van a dar su especificidad (hay un determinante dentro del
domino SH2 para reconocer la cadena a la que se tiene que unir).
Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 227

Receptor de insulina
1. Interaccin con IRS1 y fosforilacin de la mima.
La primera protena que se une al receptor de
la insulina es la IRS1 (sustrato de receptor de
la insulina). Esta protena para unirse al
receptor activado tiene que tener un dominio
SH2. Esta protena no tiene ninguna actividad
enzimtica, lo que tiene en su estructura son
mltiples tirosinas para ser fosforiladas. Una
vez que interacciona con el receptor, la
protena es fosforilada en distintos residuos de
tirosina. IRS1 es una protena adaptadora a la
que se van a unir otras protenas.
2. Esto media la interaccin con otra protena llamada PI3 quinasa que tiene dos
subunidades:
- Cataltica
- Reguladora: tiene dominios SH2 para poder interaccionar y formar el
complejo.
Una vez ha interaccionado, genera un segundo mensajero fosforilando el PIP2 (mismo
sustrato de la fosfolipasa C, pero no es el mismo 2 mensajero). La PI3 quinasa (porque
fosforila en el 3) fosforila al PIP2 para dar PIP3. El PIP3 aumenta su concentracin en
una determinada regin de la membrana.
Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 228








Glucagn
El receptor del glucagn es un receptor transmembrana con 7 dominios y asociado a una
protena Gs.

La insulina cuando se une a su receptor, activa a la PI3 kinasa y a
la adenosina kinasa.
La clula que es susceptible para receptores especficos de
insulina. En tejido adiposo tenemos en vesculas donde est
ubicado el transportador. Por accin de la Akt las vesculas se
funden con la membrana plasmtica y queda el receptor en la
membrana plasmtica para que la glucosa pueda ser captada por
los tejidos. Akt media tanto el almacenamiento de glucosa en
forma de glucgeno como el transporte de Glu4 para facilitar la
captacin de glucosa por los tejidos.











Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 229
Papeles que juega Akt en el mecanismo de accin de insulina sobre el metabolismo de
glcidos.
- Fosforila e inactiva GSK.
- Fosforila y activa PDE (se degrada cAMP). Como cAMP activa PKA, se
asegura que queda incapacidad la accin de PKA.
- Activa fosfatasas, que es el efecto contrario al glucagn (que las inactivaba).
Con estos efectos se justifican los efectos sobre el metabolismo.
--------------------------------------------------------------------ooooooo--------------------------------------------------------------------
Cuando la insulina se une al receptor, ste experimenta un cambio conformacional
desde fuera hacia dentro que promueve la conformacin idnea en la parte interna.
Entonces se lleva a cabo la fosforilacin: un receptor fosforila a otro.
Las kinasas bloquean el sitio cataltico. La fosforilacin del receptor crea sitios de unin
para otras protenas.
Los dominios SH
2
son mdulos dentro de las protenas que aportan una funcin
determinada: pueden interaccionar con fosfotirosinas especficas. Los residuos
aminoacdicos que hay alrededor de estos dominios tambin contribuyen a las
caractersticas de las fosfotirosinas.
Fosforilacin de IRS1 por el receptor de insulina
Se generan fosfotirosinas fosforiladas en el propio receptor y se une el sustrato que tiene
que tener dominios SH
2
.
IRS1:
- Sin ninguna actividad enzimtica.
- Muelle al que pueden anclarse otras protenas.
- Mltiples sitios de fosfotirosina para ser activados.
PI3 kinasa (fosfatidil inositol kinasa)
- Dos subunidaddes:
o P85: sin actividad enzimtica. Tiene dominios SH
2
para interaccionar
con IRS1.
o P110: con actividad enzimtica.
El PIP3 se queda anclado en la membrana. Es un segundo mensajero del mecanismo de
accin de la insulina. Permite que se unan protenas con dominios PH y que
determinadas protenas como AKT o PKB pueden ir desde el citoplasma a la membrana
para ser activadas.
Activan a AKT (o a PKB), que es una sern treonn quinasa con dos dominios. Tiene un
dominio PH que va a mediar su interaccin con regiones ricas en PIP3 (atrada a la
Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 230
membrana para interaccionar con PIP3 debido a la presencia del dominio P4) y otro
domino cataltico.
Existen proten quinasas en la vecindad de la membrana plasmtica que fosforilan y
activan a la AKT. Esta activacin es transitoria porque existen fosfatasas como PTEN
que bajan los niveles de PIP3. Cando la AKT est activa fosforila a la GSK3 (glucgeno
sintetasa kinasa 3), enzima que se inactiva con proten quinasas como la PKA (alto
cAMP) o la PKC (alto Ca
++
o DAG).
- La AKT puede inhibir a la GSD3 (no inactivarla).
- La GSK3 puede inhibir a la glucgeno sintetasa.
- Al activarse la AKT y fosforilar a GSK3 hace que sta ya no sea capaz de inhibir
a la glucgeno sintetasa, por lo que se da la sntesis de glucgeno.

Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 231

232

Efectos de las hormonas insulina y glucagn
Sobre el metabolismo
[El efecto peligroso del exceso de glucosa es a largo plazo (larga exposicin), hay una
gran glicosilacin de protenas en los tejidos y puede provocar cardiopatas, etc.]
RESERVAS ENERGTICAS DE UN ADULTO DE 70 KG [glucagn ayuno]
- 350g glucgeno muscular
- 85g glucgeno heptico
- 20g glucosa extracelular
- 15kg TAG en tejido adiposo
- 10kg protena muscular.
No se pueden movilizar ms de 2kg de protena muscular. El principal problema ayuno
extremo es la prdida de funcin muscular respiratoria (diafragma).
El glucgeno heptico se deplecciona gradualmente en 12-14 h de ayuno. Al principio
se utiliza protena y luego se empiezan a utilizar cidos grasos.
El cerebro consume diariamente 125g de glucosa.
TEJIDO ALMACN COMBUSTIBLE
PREFERIDO
EXPORTA
Cerebro Ninguno Glucosa Nada
Hgado Glucgeno
TAG
Glucosa
Aminocidos
cidos grasos
cidos grasos
Glucosa
Cuerpos cetnicos
Tejido adiposo TAG cidos grasos cidos grasos
Glicerol
Msculo
esqueltico
Reposo
Glucgeno cidos grasos Nada
Msculo
esqueltico
Ejercicio
Ninguno Glucosa Lactato
El mecanismo de recepcin de los receptores de glucagn es una protena
serpentina acoplada a Gs.
El mecanismo de insulina son receptores con actividad intrnseca TK
El glucagn tiene receptores en hgado y tejido adiposo pero no en msculo.
La insulina tiene receptores para la regulacin en hgado, tejido adiposo y
msculo.
Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 233

Glucagn- hgado - Activa glucogenolisis
- Inhibe glucogenognesis
- Inhibe glucolisis
- Activa gluconeognesis
- Activa liplisis
Glucagn adiposo - Activa liplisis
Insulina hgado - Inhibe glucogenolisis
- Activa glucogenognesis
- Activa glucolisis
- Inhibe gluconeognesis
- Inhibe lipolisis y favorece la formacin de
cidos grasos
Insulina tejido adiposo - Inhibe lipolisis
- Captacin de glucosa +
- Sntesis de cidos grasos +
Insulina msculo - Inhibe glucogenolisis
- Activa glucogenognesis
- Activa glucolisis
- Aumenta la captacin de glucosa, aa, sntesis
de protenas

Efectos del GLUCAGN en el HGADO
1. Activa glucogenolisis
Su diana es la glucgeno fosforilasa quinasa para desencadenar la degradacin del
glucgeno, liberando una glucosa 1P y quedando un polmero de glucgeno.




Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 234

2. Inhibe glucogenognesis
Su diana es la glucgeno sintetasa (protena que tambin oscila en dos conformaciones
activa = desfosforilada). Se produce almacenamiento o sntesis de glucgeno.

3. Activa la gluconeognesis
Las otras enzimas claves gluconeognicas son glucosa 6-fosfatasa y la fosfoenol
piruvato carboxikinasa.

Estas reacciones estn reguladas a nivel de sntesis, no activa la PKA de forma directa,
pues no hay modificacin post-traduccional, sino que estas enzimas tienen sitios de
unin a cAMP (sitios de CRE). Al fosforilarse estos sitios, se traducen los genes que
codifican para la glusosa 6-fosfatasa y la PEPCK.

4. Inhibe la glucolisis
El objetivo en una situacin de ayuno es obtener glucosa. Las dianas en este caso son:
Glucosa 1-fosfato Glucosa 6-fosfato
Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 235

Diana directa de la PKA: piruvato quinasa (heptica), que tambin oscila entre
dos conformaciones (activa = desfosforilada). Al ser fosforilada por la PKA, la
piruvato quinasa no es capaz de catalizar su reaccin y la glucolisis se corta a
este nivel.

Diana indirecta: la enzima capaz de formar fructosa 2,6-bisfosfato PFK II (6-
fosfofructo-2-kinasa). Esta enzima es bifuncional (quinasa y fosfatasa).
a. Desfosforilada = quinasa
b. Fosforilada = fosfatasa

Con PKA la conformacin favorecida es la fosforilada (actividad fosfatasa), por
lo que desaparece la fructosa 2, 6- bisfosfato, el modulador ms importante de la
PFK I.


Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 236

5. Activa la lipolisis (en el HGADO y en TEJIDO ADIPOSO)
Activa la lipolisis porque la PKA activa la actividad de la lipasa sensible a hormonas y
se producen cidos grasos libres a partir de triacilgliceroles.

Efectos de la INSULINA en el HGADO
1. Activa glucogenognesis
Al unirse al receptor la insulina activa la Akt.
a) Al activar Akt, se impide que GSK inactive a GS.
b) Al bajar los niveles de cAMP no se activa la PKA.
c) Activa las fosfatasas.

2. Inhibe glucgenolisis
a. Al bajar los niveles de cAMP no se activa PKA.
b. Activa fosfatasas.




Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 237

3. Inhibe gluconeognesis
Los niveles bajos de cAMP y la actividad aumentada de fosfatasa conducen a un
aumento en los niveles de fructosa 2, 6-bisfosfato, inhibindose la fructosa 1, 6-
bisfosfatasa.

4. Activa glucolisis
Por accin de las fosfatasas y la cada de cAMP se favorece la conformacin de la PFK
II, que est predominantemente defosforilada (actividad quinasa). Aumenta as la
fructosa 2, 6-bisfosfato y se activa la actividad de la PFK I.


La accin sobre la PK es directa.

5. Inhibe lipolisis
Una protena quinasa dependiente de AMP es la que fosforila a la acetil-CoA
carboxilasa (inactivndola), que cataliza:
acetil CoA malonil CoA
En situacin normal los niveles de AMP son bajos en la clula y la protena est
inactivada.

Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 238


Efectos de la INSULINA en el MSCULO
- Inhibe glucogenolisis
- Activa glucogenognesis
- Activa glucolisis
- Activa la captacin de glucosa
- Activa la sntesis de protenas
- Activa la captacin de aminocidos
Efectos de la INSULINA en el TEJIDO
ADIPOSO
- Inhibe la lipolisis
- Activa la sntesis de cidos grasos
- Activa la captacin de glucosa

Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 239



Enzimas afectadas por el par insulina-glucagn
Metabolismo del
glucgeno
ENZIMA REGULACIN
GLUCOGENOGNESIS
+I -G
Glucgeno sitetasa Cambio de actividad
GLUCOGENOLISIS
-I +G
Glucgeno fosforilasa
quinasa
Cambio de actividad
GLUCOLISIS
+I -G
Glucgeno quinasa
Piruvato quinasa
Fosfofructoquinasa II
Induccin
Cambio de actividad
Cambio de actividad
GLUCONEOGENESIS
-I +G
Glucosa 6-fosfatasa
Fosfoenol piruvato
carboxiquinasa
Fructosa 2, 6 fosfatasa
Induccin
Induccin

Cambio de actividad
Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 240

DEGRADACIN DE
TAG
-I +G
Lipasa Cambio de actividad
SNTESIS DE
ACILGLICRIDOS
+I
Acetil-CoA carboxilasa Cambio de actividad

La mayora de las enzimas afectadas por el par insulina glucagn sufren un cambio de
actividad que se debe a que la protena sufre un cambio a nivel de transcripcin.
En el caso de la diabetes el problema es una desregulacin en estos procesos.

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Laura Esteban Luca 241

242

Ayuno
Energa almacenada en un individuo de 70 Kg:
- 1600 Kcal de glucgeno
- 24000 Kcal en protenas usables
- 13500 Kcal en TAG
Uso en 24 horas: 1600-6000 Kcal
1 prioridad en el ayuno: suministrar glucosa al cerebro y eritrocitos.
- Energa almacenada en cidos grasos.
- La nica fuente de glucosa: los aminocidos.
2 prioridad en el ayuno: Preservar las protenas
- Hay que cambiar la fuente de energa a cidos grasos y cuerpos cetnicos.
- Msculo e hgado usan cidos grasos como combustible.
- El ciclo de Krebs es incapaz de oxidar todo el acetil-CoA que se produce en la
degradacin de los cidos grasos.
- Tras tres das de ayuno el hgado produce cantidades elevadas de cuerpos
cetnicos.

La energa almacenada a parte de glucosa son, fundamentalmente, los cidos grasos,
aunque tambin se pueden usar los aminocidos glucognicos para formar glucosa.
Llega un momento en que se hace peligroso seguir utilizando las protenas musculares,
entonces se empiezan a degradar cidos grasos, cuerpos cetnicos, etc. Al tercer da de
ayuno el cerebro cambia su consumo de glucosa por glucosa y cuerpos cetnicos.
No se puede sintetizar glucosa a partir de cidos grasos
1. La actividad de la piruvato deshidrogenasa es irreversible.
2. Los dos carbonos del acetil CoA se pierden en las descarboxilaciones del ciclo
de Krebs. Se marcan radiactivamente estos carbonos (carboxilo y metilo).
a. En dos vueltas el carbono del grupo carboxilo ya se ha perdido.
b. El carbono del metilo no se pierde en descarboxilaciones hasta la cuarta
vuelta. El carbono se pierde un 50% en la tercera vuelta y un 50% en la
cuarta.
Los cidos grasos forman acetil CoA cuyos carbonos se pierden a las pocas
vueltas del ciclo de Krebs.
3. En plantas y bacterias s se puede sintetizar glucosa por el ciclo del glioxilato.
Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 243


En el caso del ayuno en hgado la hormona que ser liberada fundamentalmente ser
glucagn. Se produce una degradacin del glucgeno y una inhibicin de glucolisis. La
glucosa 6-fosfatasa aumenta y se produce glucosa.
La vida del glucgeno es corta, de forma que cuando se agota tenemos que pasar a otra
fuente de energa. Esta segunda fuente son las protenas, que van entrando en el ciclo de
Krebs en distintos pasos y de ah se puede formar glucosa.
El acetil-CoA llega un momento en que deja de ser usable para el ciclo de Krebs. Esto
es debido a que el oxalacetetato tambin acaba siendo depleccionado (sus niveles son
ms bajos). Como el actil-CoA necesita unirse a oxalacetato para entrar en el ciclo,
acaba siendo usado para formar cuerpos cetnicos.
En una persona que no es diabtico el nivel de cuerpos cetnicos est perfectamente
regulada. Esto supone una adaptacin a condiciones de ayuno.
En la diabetes se sobreproduce glucosa en el hgado y no se usa de forma adecuada en
otros rganos.
Si, por alguna razn, no se llevan a cabo los procesos que dependen de insulina se da
una situacin de diabetes.
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Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 246
Diabetes
Se sobreproduce glucosa en el hgado y no se usa de forma adecuada en otros rganos.
Hay factores de predisposicin gentica.
Dos tipos:
Tipo I (10%): dependiente de insulina. Es una enfermedad autoinmune en la cual
llega un momento determinado en que el organismo deja de reconocer lo propio
como propio. Se empiezan a generar anticuerpos contra nuestras propias
protenas hasta que se destruyen las clulas del pncreas, que son las que
forman insulina.
Tipo II (90%): no dependiente de insulina.
- Puede producir un fenmeno conocido como resistencia a insulina esto
significa que una determinada cantidad de insulina circulante produce
una reaccin en el organismo. La obesidad suele ser la causa ms comn,
aunque tambin pueden darse.
- Defectos genticos. Las protenas necesarias para llevar a cabo los
distintos procesos no funcionan o estn afectadas. Los glut4 funcionan de
una manera muy poco o nada eficiente.
La diabetes tipo II est relacionada con obesidad. Como aunque haya insulina
los receptores no la reconocen, entonces la demanda del cuerpo es mayor y llega
un momento en que las clulas del pncreas se sobrecargan y dejan de
funcionar bien. Por eso algunas personas con este defecto acaban (a lo largo de
aos) volvindose insulino-dependientes.
Para que la glucosa sea captada y retirada del plasma existen distintos tipos de
transportadores de glucosa:
- Glut 1: en casi todas las clulas.
- Glut 2: en hepatocitos y clulas pancreticas.
- Glut 3: en neuronas.
- Glut 4: en msculo y tejido adiposo (regulado por insulina).
En la diabetes, aunque hay un exceso de glucosa no puede ser retirado por los tejidos
implicados. Se suma a este exceso el incremento producido por la accin del glucagn.
En la diabetes tipo I, la insulina est ausente, la persona diabtica est en ayuno
metablico a pesar de la alta concentracin de glucosa en sangre. Se produce ms
glucosa y en cuanto a los TAG se sobre produce acetil-CoA en cantidades muy
superiores a la cantidad de oxalacetato disponible. Entonces se empiezan a formar
cuerpos cetnicos que son tantos que superan la capacidad del rin para mantener el
balance cido/base del organismo. El diabtico sin tratar puede sufrir un coma (se da
una cetoacidosis).
Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 247


Alguna de la sintomatologa provocada por un cmulo extra de glucosa en sangre:
Se produce una hiperglucemia. Produce una glucosuria, que quiere decir que la
cantidad de glucosa en sangre es tan alta que se excreta glucosa en orina.
Esta enfermedad se conoce desde la Antigedad y se reconoca por el sabor
dulce de la orina. El exceso de glucosa en la orina provoca que sea acompaada
por una cantidad de agua.
Se tiene mucha sed. Te obliga por la noche a levantarte para ir al bao y a beber
agua.
Prdida de peso considerable sin hacer ni dietas ni ejercicio.
Cetosis
Acidosis
Coma
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Laura Esteban Luca 248
La diabetes es una enfermedad que muchos de los sntomas pueden ser explicados por
conceptos bioqumicos. Las personas que sufren la diabetes pueden comenzar a tenerla
desde la niez o en el adulto. Lo que es esencial es el tratamiento. Hay que llevar una
dieta determinada y administrarse insulina intravenosa.
- Hiperglucemia: aumento de la concentracin de glucosa en sangre, que es
filtrado por el rin junto con una gran cantidad de agua.
- Aumento de la formacin de cuerpos cetnicos, pudiendo producir acetosis,
acidosis y, en ltimo trmino, coma.
Los problemas ms graves son a largo plazo. Los niveles altos de glucosa durante
demasiado tiempo producen glicosilacin de protenas a largo plazo, lo cual afecta a la
funcin de las protenas: problemas renales, neurolgicos, en la retina, infartos, etc.
UNI N ESPEC FI CA DE UNA HORMONA A SU
RECEPTOR
Tenemos un receptor de membrana plasmtica especfico para una hormona. La
constante de asociacin (inversa a la de disociacin) mide la afinidad de la hormona por
su receptor. Existen mtodos para medir la constante de afinidad.

Los receptores son receptores de membrana plasmtica. Si tenemos una preparacin de
membrana (receptor no purificado) y empleo un compuesto radiactivo, la protena se va
a unir a su sitio especfico. Hay otro tipo de reacciones que facilitan que la radiactividad
se pegue a la muestra.
Se va aumentando la concentracin de la hormona marcada poco a poco. Si
manipulamos las reacciones se llega a una expresin que es la constante de Michaelis y
Menten.
Concentracin baja de hormona radiactiva. Segn se va aumentando, la concentracin
de complejos hormona-receptor aumenta drsticamente hasta que se estabiliza un
poco porque la nueva formacin de complejos de unin es muy baja.
Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 249
Los sitios inespecficos son aquellos a los que se une la hormona marcada pero que no
tienen las reacciones habituales para la asociacin ligando-receptor.
Para cuantificar se repite el experimento con una concentracin excesiva de hormona no
radiactiva. En este caso, la activa se va a unir ms la no activa, pero ya no se ve porque
se va disminuyendo mucho la afinidad.
En el caso de las uniones inespecficas, se mantendr que se unen protenas marcadas.
No es saturable la va.
El nmero de receptores se calcula con el punto en que se produce la estabilizacin. En
este tipo de curvas se puede calcular la constante de asociado (10
-8
molar). Aunque la
cantidad de sangre en plasma sea ms baja, el receptor es capaz de reconocer la insulina
en cualquiera de sus isoformas.


Bioqumica y biologa molecular Hormonas
Laura Esteban Luca 250













Bases moleculares de la
proliferacin celular
Ciclo celular: proceso mediante el cual las clulas replican su material gentico y lo
dividen entre las dos clulas hijas. Durante la mitosis ocurren efectos muy llamativos y
fcilmente visibles con el microscopio y esto ha facilitado su estudio.
El ciclo celular es un proceso tan relevante que est conservado en la evolucin desde
los organismos ms primitivos hasta el hombre.
El ciclo celular se lleva estudiando durante dcadas y, al principio, la parte que ms se
avanz en su conocimiento fue la mitosis porque en ella se rompe el ncleo, se
condensan los cromosomas, se reparte el material gentico y se generan las dos clulas
hijas. Este proceso es visible al microscopio y ya a principio del siglo XX ya se conoca
con bastantes detalles el proceso morfolgico de la mitosis.
Hoy en da sabemos que el ciclo celular de una clula somtica est dividido en las fases
de:
- Mitosis (M)
- G1: fase de sntesis de RNA y protenas.
- sntesis del DNA (S)
- G2
En G1 y G2 se consigue que la clula aumente de tamao y son procesos preparativos
para poder afrontar las dos fases fundamentales del ciclo que son S y M.

En unas clulas superiores este proceso dura aproximadamente entre 20 y 24 horas
(ciclo entero). La mitosis es la fase ms corta del ciclo y dura aproximadamente media
hora.
Una respuesta celular est determinada por muchos factores que proceden tanto del
exterior como del interior de la propia clula. Se producen interacciones entre las
Bioqumica y biologa molecular Bases moleculares de proliferacin celular
Laura Esteban Luca 251

clulas y tambin interacciones con la matriz extracelular. La informacin que llega de
todos estos eventos que ocurren en la clula llevan a sta a tomar un camino distinto
respecto a su destino. Para tomar estas decisiones las clulas tienen en cuenta el estado
metablico o el dao celular.
Si se produce un dao en el DNA las clulas paran la divisin para reparar el dao y
evitar que las clulas hijas arrastren el error.

La mayora de las clulas de un organismo adulto, no de un sistema embrionario, hay
una pequea cantidad de clulas en divisin activa (epitelios, clulas de la piel, clulas
que forman la raz del pelo, clulas del sistema inmune, clulas del sistema
hematopoytico). Sin embargo, hay otras que ya no se dividen una vez diferenciadas:
fibras musculares, neuronas, clulas hepticas.
Hay tres puntos de control en el ciclo celular:
1. Al final de la fase G1 hay un punto de restriccin controlado por los factores de
crecimiento. Este punto determina el destino de las clulas. Dependiendo de las
circunstancias, la clula podra no seguir en el ciclo y diferenciarse o morir
(apopotosis por senescencia).
2. Transicin de G2 a M: se comprueba si el DNA se ha replicado correctamente.
3. Salida de la mitosis: ver si todos los cromosomas estn bien alineados en el
huso.
Aportaciones de los modelos experimentales
1. Xenopus
Dentro del ovario de la madre crece un ovocito que se queda parado en la 1 meiosis
hasta que llega el macho, y se libera progesterona. Se da un proceso de maduracin en
el que el ovocito pasa a huevo. Cuando viene la fecundacin por el esperma ocurren una
Bioqumica y biologa molecular Bases moleculares de proliferacin celular
Laura Esteban Luca 252

serie de divisiones muy rpidas (la 1 tara 90 min y las dems 30 min), sin cambio de
tamao, hasta que dan lugar a todos los tipos celulares y formar el sapo.
Estas divisiones ocurren donde solamente hay fase S y M y no hay perodos G. esto
ocurre porque todos los mensajeros provienen de la madre y estn prealmacenados.
Es un sistema idneo para estudios bioqumicos debido a la gran cantidad de citoplasma
de la clula.

Experimento: se aisl citoplasma de la situacin huevo y se inyect en el ovocito que
an no haba sufrido la transformacin mediada por la hormona y se observ que se
consegua el mismo efecto que con la progesterona. Se lleg a la conclusin de que en
el citoplasma del huevo hay un factor que es capaz de promover maduracin. A ese
factor se le llamo MPF (factor promotor de la maduracin).
Posteriormente, tambin se vio que MPF tambin estaba implicado en el incremento de
la actividad mittica (tambin es factor promotor de la mitosis).
El factor MPF est formado por dos subunidades distintas: subunidad reguladora
(ciclina) y subunidad cataltica (protena quinasa).
A la subunidad reguladora se la llam ciclina porque se vio que la cantidad de ciclina
era lo determinante para el funcionamiento ciclina quinasa.

2. Levadura
Para estos experimentos se usa la levadura de fisin (las clulas se parten por la mitad).
Tiene una particularidad esencial y es que hay una fase en su ciclo celular en la que son
haploides (1 copia de un gen). Si en la levadura se consigue eliminar la copia de un gen
se elimina la posibilidad de que ese gen se haga protena.
Bioqumica y biologa molecular Bases moleculares de proliferacin celular
Laura Esteban Luca 253

Uno de los grandes logros fue conseguir mutantes de levadura a los que se les llamaba
mutantes CDC
1
.
- Uno de los mutantes CDC2 es la subunidad CDK de la ciclina quinasa.
En la levadura el fenotipo de una alteracin gnica
se poda ver al microscopio porque una clula
normal va aumentando de tamao hasta que hay
una serie de cambios qumicos que le indica
dividirse.
En un gen mutante no hay CDK y entonces las
clulas de levadura (como la CDK es determinante
para que se produzca la mitosis) no saben que se tienen que dividir y ves
las clulas cada vez ms grandes y no toman la decisin de dividirse.
Si por algn mtodo eres capaz de meter una CDK activa hasta saturar el
sistema, entonces la levadura empieza a dividirse muy rpidamente hasta
que las clulas hijas son tan pequeas que su tamao no es compatible con
la vida.

Utilizando mutantes de este tipo se lleg a la conclusin de la importancia que tiene la
CDK y de otras protenas que las estn regulando.
Se cogi una levadura y se intent rescatar la actividad de la levadura. Esto
demostr la universalidad del proceso.
Para poder realizar los experimentos se realizaban mutantes condicionales: descubrieron
un sistema en el cual una mutacin daba lugar a una protena que poda conservar parte
de su funcin (a una temperatura determinada). Se iba subiendo la temperatura hasta
que ya no sobrevivan.
Estudio del ciclo celular
La maquinaria del ciclo celular se forma bsicamente por dos protenas:
- Ciclina
- Kinasa CDK
Su funcin consiste en permitir la transicin a otras etapas del ciclo mediante la
fosforilacin de protenas.

1
CDC, CDC2 = CDK
Bioqumica y biologa molecular Bases moleculares de proliferacin celular
Laura Esteban Luca 254

En clulas superiores hay distintas CDKs y ciclinas que actan en diferentes fases del
ciclo. En clulas de mamfero: ciclina D, ciclina E, ciclina A y ciclina B. Su cantidad
aumenta en un determinado momento y luego su cantidad cae.

La ciclina no es sustrato de fosforilacin de CDK, sino que es imprescindible la
asociacin entre ambas para que la ciclina induzca un cambio de conformacin de la
CDK.
Hay una tercera protena que interviene en el
proceso que son los inhibidores del complejo
ciclina-CDK (CDKIs). Su tamao molecular es
de 27 kDa (p27). Estos inhibidores actan como
una especie de grapa y las dos subunidades fijan
al CDK de forma que no adopte la conformacin
idnea para llevar a cabo su actividad quinasa.
Uno de los requisitos para que el proceso funcione es la desaparicin de la clula de los
niveles de CDKIs.
La actividad de las CDKs viene determinada por la asociacin con ciclinas y CKIs y el
estado de fosforilacin de la subunidad cataltica.

Hay dos modificaciones post-traduccionales covalentes esenciales para el ciclo celular:
- Fosforilacin / desfosforilacin
- Protelisis: est mediada por el sistema de marcaje de protenas con ubiquitina.
Est constituido por tres enzimas (E1, E2, E3 apuntes 1 cuatri).
Bioqumica y biologa molecular Bases moleculares de proliferacin celular
Laura Esteban Luca 255

o E1: enzima activadora de ubiquitina. Hidroliza ATP y forma enlaces
tioester con ubiquitina. Suele ser escasa.
o E2: enzima conjugadora de ubiquitina. E1 pasa la ubiquitina activada a
E2. Hay ms.
o E3: une covalentemente al sustrato (Lis) la ubiquitina transferida por E2.
Hay muchas porque su funcin de reconocimiento de sustrato es muy
importante. Siempre es un complejo proteico formado por distintas
subunidades:
Determinante para reconocer al sustrato.
Posibilidad de unir E2 a otro sitio.

Las dos E3 ligasas importantes son APS (factor promotor de la anafase) y SCF (siglas
de algunas de las subunidades que forman ese complejo).
1. SCF marca la protena y la manda a degradar.
*Ejemplo: juega un papel esencial de la transicin G1/S y lo lleva a cabo una
protena CDKI. En respuesta a una seal proliferativa aumenta la actividad
ciclina CDK.

2. APC tiene que estar unida a determinadas subunidades que mandarn el sustrato
a degradacin.

Bioqumica y biologa molecular Bases moleculares de proliferacin celular
Laura Esteban Luca 256


Regulacin de G1/S

En humanos la seal son factores de
crecimiento que producen fosforilacin en
p27, que es reconocido por SCF. El
complejo CDK puede intervenir en la
transicin a otro compartimento donde el
DNA pueda ser procesado.



Regulacin G2/M
La fosforilacin de protenas en el ciclo tiene un factor regulador muy importante. La
regulacin se ejerce sobre la subunidad quinasa. El proceso es bastante complejo.
1. Adquisicin de complejo ciclina/CDK. Los dos residuos de su estructura
determinantes para su funcin son: tirosina 15 y treonina 161.
2. Tirosina 15 necesita estar defosforilada
para que pueda entrar ATP.
3. La treonina 161 est fosforilada para
que pueda entrar el sustrato.
Las clulas mantienen el residuo de tirosina 15
fosforilado hasta que llega el momento
adecuado para que entre el ATP, momento en
el que se activa la quinasa (CDC 25).
El complejo slo estar activo si tirosina 15
est desfosforilada y la protena Thr 161
fosforilada. As se mantiene la protena
controlada hasta que llega sustrato.
Bioqumica y biologa molecular Bases moleculares de proliferacin celular
Laura Esteban Luca 257

Transicin metafase/anafase
APC rompe la securina y deja libre a la separasa (activa ahora). La separasa rompe las
cohesinas para que se puedan separar las clulas hermanas.

Salida de la mitosis
Para salir de mitosis es necesario APC porque es necesaria la activacin de ciclina/APC.
Se inactiva el complejo ciclina/CDK degradando a la ciclina y as las clulas salen de
mitosis.

Bioqumica y biologa molecular Bases moleculares de proliferacin celular
Laura Esteban Luca 258


Fosfatasa CDC25 defosforila a CDC en la tirosina 15. Esto, junto con la unin del
complejo ciclina/CDC conlleva la entrada en la mitosis.
En el caso de entrada en M el factor necesario es la fosforilacin/defosforilacin
de la subunidad final.
Para la salida de la mitosis no puede haber ciclina.
En la entrada a G1 (salida de mitosis) el proceso es la degradacin del complejo
ciclina/CDK.
Regulacin
Los mecanismos fundamentales a la hora de regular el mismo son:
- Sobre la CDKI y la ciclina:
o Sntesis
o Degradacin
- Cdk: fosforilacin






Bioqumica y biologa molecular Bases moleculares de proliferacin celular
Laura Esteban Luca 259

El complejo controlador del ciclo celular es un organizador de seales. As se pregunta
si se ha aadido el fosfato y si est presente la ciclina, cules son los niveles de la CKI.
Si se ha dado en todas es que s.

Son las seales qumicas las que estn determinando que se ponga o no en marcha el
proceso.

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Laura Esteban Luca 260


Bases moleculares de la
proliferacin celular II
El papel de los factores de crecimiento es pasar el punto de restriccin al final de G1.
Factores que regulan el ciclo positiva y
negativamente
Positivamente: los complejos ciclina CDK
Negativamente: las protenas CDKIs y la familia de protenas de retinoblastoma.
Objetivo de los GF (factores de crecimiento):
aumentar los niveles de ciclina, disminuir los
de CDKIs y activar CDKs para eliminar los
controles negativos y activar los positivos.
Tenemos un factor de transcripcin llamado E2F y de
l depende la expresin de varias protenas que son
relevantes para que la protena pueda realizar la
replicacin. Aumenta la cantidad de protenas necesarias. En una situacin de
aquiescencia la protena E2F interacciona con las protenas retinoblastmicas y no
puede realizar su funcin.

Los complejos ciclina que actan para pasar el punto de restriccin son CDK4/5. Estos
complejos producen un cambio conformacional en las protenas retinoblastmicas (Rb)
que provoca que no se pueda seguir uniendo a E2F, que de esta forma queda liberada.
Se trata de un gen de represin tumoral. La deleccin de varias copias de este gen
produce un tumor en nios que es el retinoblastoma, un tumor en la retina. La
probabilidad de que produzca una mutacin en el otro alelo puede producirlo en los dos
ojos (retinoblastoma bilateral). Lo normal es un retinoblastoma unilateral.
Bioqumica y biologa molecular Bases moleculares de proliferacin celular
Laura Esteban Luca 261



Slo en una situacin concreta y en respuesta a un estmulo concreto se produce el ciclo
celular. Si se pierde el gen la protena retinoblastmica, se pierde el freno que regula
que se d una divisin celular demasiado rpida.
Las CDKIs son muy importantes para la regulacin del controlador del ciclo.
R es el punto de control.
Lo que hacen los mitgenos es activar ciclinas e inhibier los CDKIs y las
protenas retinoblastmicas.
Receptores que pueden promover la proliferacin
Los mitgenos se unen a receptores de distinto tipo.
- Citoquinas: la eritropoyetina acta mediante este tipo de receptores.
- Hormonas
- TGF : tiene actividad intrnseca. Dominio serina/treonina quinasa.
- PDGF: Hay que activar la tirosina quinasa, donde se unen adaptadores que
activan la protena Ras, que facilita la transmisin de la seal del citoplasma al
ncleo.

Bioqumica y biologa molecular Bases moleculares de proliferacin celular
Laura Esteban Luca 262


Lo que tienen en comn las distintas vas de sealizacin es el mecanismo, que es igual
en todas. El factor de crecimiento se une al receptor fuera, se activa y desencadena una
cascada de reacciones en el citoplasma. Alguno de los productos viaja al ncleo y
produce un cambio en la expresin gnica (entre otras cosas porque hay que activar
ciclina).


Receptor PDGF
Superfamilia de receptores cuya caracterstica comn es la presencia de un dominio
intracelular con actividad tirosina quinasa.
Tienen tres dominios:
- Extracelular
- Transmembrana: tiene determinantes distintos porque los ligandos son distintos
y son reconocidos por distintos receptores. La cascada de sealizacin que
activan es ms o menos igual.
Bioqumica y biologa molecular Bases moleculares de proliferacin celular
Laura Esteban Luca 263


- Intracelular
La insulina, aparte de ser una hormona, acta tambin como un factor de crecimiento.
NGF = factor de crecimiento nervioso.
Los factores de crecimiento pueden ser de cualquier tipo:
- Amplio espectro de accin
- Especficos: como la eritropoyetina, que actan facilitando la proliferacin de un
tipo celular.
Los GF se sintetizan como precursores mayores y son procesados por protelisis.
El PDGF se sintetiza en las plaquetas como precursor inactivo, en vesculas secretoras.
El EGF se sintetiza como precursor de 1200 aminocidos anclado a la membrana.
Contiene 9 motivos EGF. El motivo ms prximo a la membrana corresponde al factor
activo.
Transmisin de la seal
El mecanismo de accin es muy
parecido al de la insulina. El primer
paso en el mecanismo de accin es
la unin del ligando al receptor.
Estos receptores estn diseminados
de manera uniforme por la
membrana plasmtica. La unin del
factor de crecimiento promueve la
dimerizacin de receptores.
La dimerizacin lleva a una
aproximacin de los dominios
intracelulares del receptor. Esto
supone un cambio respecto a la
actividad cataltica. Esto lleva a un paso que es la
transfosforilacin de receptores. Primero se
generan fosfotirosinas implicadas en la
conformacin estable del receptor y luego
protenas que se encargan de la fosforilacin (SH2).
Aparte del SH2, est el dominio PTB que es un dominio con interaccin con
fosfotirosina.
El dominio SH3 es importante en el mecanismo de accin de los factores de crecimiento
y tiene la capacidad de unirse a regiones ricas en prolina.
Se activan tres protenas quinasas por fosforilacin (se fosforilan una a otra, reaccin en
cadena).

Bioqumica y biologa molecular Bases moleculares de proliferacin celular
Laura Esteban Luca 264



Los RTKs activan la sealizacin al unir protenas con dominios SH2.
1. La interaccin con la protena puede cambiar la
localizacin intracelular de sta. Tiene que estar
cerca de la membrana.
2. La interaccin puede producir cambios
conformacionales que afecten a su actividad
cataltica. Como el receptor es una tirosina quinasa
no es necesaria la fosforilacin de protenas.
3. La protena que interacciona puede ser fosforilada
por el receptor, cambiando su actividad.

Protenas que interaccionan con el receptor
Se pueden dividir en dos grandes grupos:
- Adaptadoras: son protenas que no tienen ninguna actividad enzimtica y que
estn formadas exclusivamente por dominios de unin protena-protena.
*Ejemplo: SHC; adaptadores como Grb2 permiten la activacin de la va de Ras.
- Actividad enzimtica: producen segundos mensajeros
que activan las protenas quinasas. Las PLC aqu son
PLC (no se unen al dominio serpentina).
*Ejemplo: PLC o PI3K producen segundos
mensajeros que activan proten quinasas.

Bioqumica y biologa molecular Bases moleculares de proliferacin celular
Laura Esteban Luca 265


La activacin de RTKs permite la activacin de Ras
1
(protena G monomrica).


Hay un receptor mitgeno y dos protenas en el citoplasma que interaccionan entre s
por un dominio SH3 (GRP2 y Sos).
La protena Ras es equivalente a una protena G monomrica. Se llama monomrica
pequea porque dentro de su familia hay cientos de protenas pero sta es ms pequea.
Funciona igual que la subunidad . Ras en forma GTP puede activar sus receptores.
Ras tiene una pequea actividad GTPasa para pasar de forma activa a inactiva.
Este complejo pertenece al grupo de adaptadores que tienen que ser transportados a la
membrana y esto es as porque Ras es el ligando de Sos. Sos, una vez que interacciona
con Ras, promueve un cambio conformacional y de actividad de Ras, que se une a
GTP.
2

Ciclo de ras
A Ras se le llama interruptor molecular porque puede tener sistema activado o
inactivado.
1. En respuesta a un estmulo se activa SOS, que tambin se llama GEF (factor
intercambiador de nucletidos). SOS promueve el cambio de GDP por GTP y
as se activa Ras.

1
Ras es un protooncogen que se encontr en un sarcoma en pollo.
2
Y todo esto SLO para activar a Ras.
Bioqumica y biologa molecular Bases moleculares de proliferacin celular
Laura Esteban Luca 266


2. Ras va a promover la lenta hidrlisis del GTP a GDP (proceso lento porque la
actividad GTPasa de Ras es muy pobre). Hay una protena activadora de la
actividad GTPasa de Ras que estimula esta funcin de Ras.

Efectores de Ras
Uno de ellos es una protena quinasa que se llama MAP-quinasa-quinasa-quinasa. Esta
es la diana de Ras. Una vez que est activa puede activar MAP-quinasa-quinasa y sta,
a su vez, activa a MAP-quinasa.

La 1 de la cascada, MAP-quinasa-quinasa-quinasa, es una sern treonn quinasa.
La 2, MAP-quinasa-quinasa, es una quinasa dual.
Y la ltima de la cascada, MAP-quinasa, se activa por fosforilacin en una
treonina y en una tirosina (accin de MAP-quinasa-quinasa).
Ras no es una protena quinasa.








Bioqumica y biologa molecular Bases moleculares de proliferacin celular
Laura Esteban Luca 267


Si MAP-quinasa-quinasa y MAP-quinasa se activan por fosforilacin, MAP-quinasa-
quinasa-quinasa no se activa por una quinasa. El papel de Ras es activar un poco y
transportar a la MAP-quinasa-quinasa-quinasa a una regin prxima a la membrana
donde abundan una serie de quinasas que la fosforilan y la activan.

ERK = quinasa regulada extracelularmente = MAP-quinasa
Mek = MAP-quinasa-quinasa
Raf-1 = MAP-quinasa-quinasa-quinasa
Una vez est activada, la ultima quinasa fosforila tanto protenas en el citoplasma como
en el ncleo. En el caso del ncleo activa protenas que llevan a cabo la transcripcin
gnica de un gen temprano, es decir, activa un factor de transcripcin.
Activacin en cascada de genes en G1
En el ncleo tiene que darse una cascada de activacin de factores de transcripcin.
1. El factor A est presente ya en G0, aunque inactivo. En respuesta a un mitgeno,
la MAP-quinasa lo activa.
2. Al factor A activo se une a los promotores del gen que regula, promoviendo la
expresin de la protena B que tambin es un factor de transcripcin.
3. La protena B se une al promotor de C (tambin un factor de transcripcin). As
se van expresando genes tempranos y tardos (D).
Ciclina D es un gen tardo. El objetivo del mitgeno es aumentar ciclina D, pero para
que esto ocurra tienen que sintetizarse otros factores de transcripcin.

Bioqumica y biologa molecular Bases moleculares de proliferacin celular
Laura Esteban Luca 268



Uno de los objetivos es activar ciclina D y el otro es conseguir que p27 deje de
funcionar:
- Promover la degradacin de p27
- Salida de factor de transcripcin del ncleo
- Inhibicin de su expresin
Los factores de crecimiento tienen que ser mitgenos
3
y estar implicados en el
crecimiento.
Hay que aumentar la maquinaria de traduccin para que estn implicados en
crecimiento. La protena implicada en este proceso es mTOR (target of rapamizine). Es
un complejo que se ve inhibido por la droga rapamizina. Es un mecanismo complejo de
activacin: se fosforila un inhibidor del factor de traduccin (inhibido) y una protena
implicada en traduccin.

Los factores de crecimiento han de mandar seales de supervivencia

3
Aunque mitgeno lo estemos usando como sinnimo de factor de crecimiento, no es exactamente lo
mismo.
Bioqumica y biologa molecular Bases moleculares de proliferacin celular
Laura Esteban Luca 269


La maquinaria apopttica acta por defecto y ha de estar continuamente inhibida para
que la clula no muera. La va que mantiene la apoptosis inhibida es la va de la
protena PI3K.
Se activan protenas antiapoptticas y se inactivan las protenas proapoptticas.

Activar PI3K mediante la accin de RTKs:
1. Por unin al propio receptor.
2. Por unin a Ras-GTP (PI3K es un efector de ras).
La protena SKP2 aumenta con la va de Ras. Aunque quien est implicado en la
degradacin de p27 es un conjunto de tres liasas, hay otros complejos que intervienen.

Bioqumica y biologa molecular Bases moleculares de proliferacin celular
Laura Esteban Luca 270












Cuestionario 1
QUESTION 1
Cul de las siguientes afirmaciones sobre la DNA polimesara I de E.Coli es FALSA?
a) Funciona en reparacin del DNA
b) No es la DNA polimerasa que lleva a cabo la sntesis de ambas cadenas de DNA
de forma mayoritaria
c) El anlisis mutacional demuestra que su actividad no es necesaria para la clula
d) Tiene actividad exonucleasa 5 3
QUESTION 2
Indicar la opcin CORRECTA. En cada ciclo de la reaccin en cadena de la polimerasa
ocurre, por este orden, los siguientes eventos
a) Hibridacin, desnaturalizacin, polimerizacin
b) Desnaturalizacin, hibridacin, polimerizacin.
c) Polimerizacin, hibridacin, desnaturalizacin
d) Desnaturalizacin, polimerizacin, hibridacin
QUESTION 3
Indicar la opcin CORRECTA. Las endonucleasas de restriccin tipo II slo cortan el
DNA cuando:
a) Contiene una secuencia determinada
b) La molcula es circular de doble cadena
c) Cuando ciertas bases estn metiladas
d) La molcula es muy larga
QUESTION 4
Indicar la opcin CORRECTA. La iniciacin de la replicacin en E.Coli:
a) Empieza con la interaccin de DNA-A con el sitio OriC solo si ciertas bases
estn metiladas
b) Necesita que una topoisomerasa abra la horquilla de replicacin
c) Produce la formacin de varias burbujas, cada una de las cuales consiste en unos
poco nucletidos.
d) Requiere la accin de una helicasa, slo para iniciar la sntesis de la hebra
conductora.


Bioqumica y biologa molecular Cuestionarios
Laura Esteban Luca 271
QUESTION 5
Todos los siguientes son factores que estn implicados en el desenrrollamiento y
separacin de las cadenas EXCEPTO:
a) La actividad enzimtica de las protenas SSB
b) Energa en forma de ATP
c) La accin de las topoisomerasa
d) Desestabilizacin de las bases complementarias por medio de helicasas.
QUESTION 6
Indicar la opcin CORRECTA. En la doble hlice de DNA los pares de bases (pd)
a) Pueden tomar puentes de hidrgeno con los pb adyacentes
b) Pueden interaccionar con los pb adyacentes mediante fuerzas de Van Der Waals
c) Se orientan hacia el exterior de la molcula para poder interaccional con ciertas
protenas
d) Estn formados por dos bases nitrogenadas cualqueira.
QUESTION 7
Todas las afirmaciones siguientes sobre la reparacin por escisin nucletica son
VERDADERAS EXCEPTO
a) Se halla ausente en la enfermedad xerodema pigmentoso
b) Implica la actividad de una nucleasa con escisin, que es una endonucleasa.
c) Elimina dmeros de timina generados por la luz UV
d) No requiere la accin de la ligasa aunque si la de la DNA polimerasa I (E.Coli)
QUESTION 8
Indicar la opcin CORRECTA respecto a lo nucletidos:
a) Se sintetizan a partir de nucleosidos monofosfato
b) Son polmeros de nucletidos unidos mediante enlaces ester
c) Pueden adicionar nuevos nucletidos por cualquiera de sus extremos
d) Pueden estar ramificados
QUESTION 9
Indicar la opcin CORRECTA entre las siguientes afirmaciones sobre la DNA
polimerasa III de E. Coli:
a) Su frecuencia de error es mucho menor que la de la primasa
b) Contiene actividad exonucleasa 3 5
c) No contiene actividad exonucleasa 5 3
d) Las otras tres opciones son correctas
Bioqumica y biologa molecular Cuestionarios
Laura Esteban Luca 272
QUESTION 10
Indicar la opcin CORRECTA en relacin a los didesoxinuclesidos trifosfato_
a) Tienen un oxgeno en el carbono 3
b) Terminarn la sntesis cuando se incorporen a la cadena de DNA que se est
sintetizando
c) No se peden unir a la cadena de DNA que se est sintetizando
d) Pueden formar un enlace azcar fosfato con un nuevo nuclesido durante la
sntesis de DNA
QUESTION 11
Cul de las siguientes secuencias de DNA de doble cadena (solo se da una de las dos
cadenas de la molcula) sera ms difcil de separar para dar molculas de DNA de
cadena sencilla?
a) GGGCTTTAATCGAAG
b) AATCTAGGGCTTCATG
c) GGCGGTACGCGTAGG
d) AGCAAATATCGGTTC
QUESTION 12
Indicar la opcin CORRECTA. Los plsmidos
a) Suelen contener genes de resistencia a antibiticos
b) Son segmentos del cromosomas procariota que contienen varios genes que se
expresan de forma coordinada
c) Son el nico materal gentico de algunos organismos
d) Son segmentos lineales de DNA extracromosmico
QUESTION 13
Indicar la opcin CORRECTA. En la estabilizacin de la doble hlice de DNA
intervienen:
a) Enlaces covalentes
b) Interacciones electrostticas entre las bases
c) Ninguna de las otras tres opciones es correcta
d) Interacciones hidrofbicas
QUESTION 14
Indicar la opcin CORRECTA. La replicacin
a) Es conservativa
b) Precisa un cebador en eucariotas, pero no en procariotas
Bioqumica y biologa molecular Cuestionarios
Laura Esteban Luca 273
c) Utiliza la actividad polimerasa 5 3para sintetizar una hebra y la actividad
polimerasa 3 5para la complementaria
d) No solo requiere protenas con actividad DNA polimerasa
QUESTION 15
Indicar la opcin CORRECTA. Las dos hebras de DNA sirven de plantilla
simultneamente en:
a) La replicacin
b) Reparacin por escisin
c) Reparacin de apareamientos errneos
d) Reparacin catalizada por una fotoliasa
QUESTION 16
Indicar la opcin CORRECTA. Para preparar DNA recombinante se requiere siempre:
a) cDNA
b) poli(dT)
c) el corte por medio de endonucleasas de restriccin para generar fragmentos con
los extremos cohesivos
d) DNA ligasa
QUESTION 17
Indicar la opcin FALSA. En el modelo de la doble hlice de DNA propuesto por
Watson y Crick se cumple que:
a) [G]=[C]
b) [A]=[C]
c) [purinas]=[pirimidinas]
d) [A+G]=[T+C]
QUESTION 18
Indicar la opcin CORRECTA. En el modelo de la doble hlice de DNA propuesto por
Watson y Crick, las dos hebras del DNA:
a) Pueden ser paralelas o antiparalelas
b) Se mantienen unidas tanto por interacciones covalentes como por interacciones
no covalentes.
c) Se mantienen siempre a la misma distancia
d) Son iguales aunque se orientan de forma distinta


Bioqumica y biologa molecular Cuestionarios
Laura Esteban Luca 274
QUESTION 19
Indicar la opcin CORRECTA. Los microarrays de DNA han supuesto un gran avance
en los estudios genmicos ya que:
a) Se pueden usar para eliminar la funcin de cualquier gen del genoma
b) Se pueden usar para introducir genomas enteros en bacterias
c) Permiten ensamblar rpidamente un gran nmero de fragmentos para hacer un
mapa fsico del genoma
d) Permite comparar la expresin de muchos, o incluso todos, los genes de un
genoma a la vez
QUESTION 20
Indicar la opcin CORRECTA para completar la frase siguiente: la sntesis de los
telmeros requiere que es un tipo de
a) ribonucleasa, ribonucleoprotena
b) telomerasa, ribonucleoprotena
c) telomerasa, DNA polimerasa
QUESTION 21
Cul de las siguientes afirmaciones sobre las DNA polimerasas de E.Coli es
CORRECTA?
a) Todas tienen las dos actividades exonucleasa 3 5y 5 3
b) Todas requieren cebador y molde
c) La DNA polimerasa V sintetiza DNA con una gran fidelidad
d) La DNA polimerasa I es la de mayor procesividad
QUESTION 22
Indicar la opcin CORRECTA. En la secuenciacin de Sanger manual o automtica, la
secuencia de DNA obtenida de la lectura del gel corresponde a la secuencia.
a) Del cebador
b) De la hebra complementaria
c) De la hebra molde
QUESTION 23
Indicar la opcin FALSA. La comparacin del genoma de organismos con distinto
grado de complejidad en la escala filogentica revela que segn aumenta la complejidad
del organismo, en el genoma:
a) El nmero de intrones aumenta
b) La densidad gnica disminuye
c) Siempre aumenta el tamao en pares de bases
Bioqumica y biologa molecular Cuestionarios
Laura Esteban Luca 275
d) El tamao de los genes aumenta
QUESTION 24
Indicar la opcin CORRECTA. Cuando una endonucleasa de restriccin corta una
molcula de DNA plasmdico generan varios fragmentos de restriccin. Estos
fragmentos:
a) Tienen todos la misma longitud
b) Tienen todos los mismos extremos 3y 5
c) Tienen todos la misma secuencia
d) Ninguna de las otras tres opciones es correcta
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Laura Esteban Luca 276


Cuestionario 2
QUESTION 1
Cuando Escherichia coli crece en presencia de glucosa y lactosa:
a) Inhibe las rutas metablicas del metabolismo de la glucosa y la lactosa
b) Metaboliza preferentemente la glucosa
c) Metaboliza glucosa y lactosa con igual preferencia
d) Metaboliza preferentemente la lactosa
QUESTION 2
Indicar la opcin CORRECTA. El factor General de Transcripcin TFIIH:
a) Todas las respuestas son correctas
b) Tiene actividad helicasa
c) Fosforila al dominio CTD de la RNA polimerasa II
d) Forma parte del aparato basal de transcripcin
QUESTION 3
Indicar la opcin CORRECTA. El proceso de splicing alternativo:
a) Permite la generacin de una amplia variedad de mRNAs maduros en diferentes tejidos
b) Permite la alternancia y el procesamiento
c) No tienen ninguna importancia en la regulacin de la expresin gnica
d) Significa que unos premRNAs sufren spicing y otros no
QUESTION 4
Indicar la opcin CORRECTA. Los factores de transcripcin:
a) Son protenas que hidrolizan ATP para suministrar la energia necesaria en el proceso de
transcripcin
b) Son los RNAs que se acaban de sintetizar
c) Son protenas que se unen a secuencias especficas de DNA
d) Son protenas que se unen inespecficamente al DNA
QUESTION 5
Indicar la opcin CORRECTA. La protena mTOR es una quinasa:
a) Que fosforila al factor e-IF2
b) Que fosforila al factor 4E-BPI
c) Que fosforila al factor e-EF1
d) Que fosforila al factor e-IFI
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QUESTION 6
Indicar la opcin CORRECTA. El Factor General de transcripcin TFIID:
a) Est formado por dos subunidades llamadas D1 y D2
b) Est formado por la protena TBP y el factor D
c) Est formado por la protena TBP y los factores asociados a TBP (TAFs)
d) Est constituido por una nica subunidad llamada TBP
QUESTION 7
Indicar la opcin CORRECTA. Los ribosomas eucariticos tienen dos subunidades de tamao:
a) 60S y 50S
b) 60S y 40S
c) 70S y 50S
d) 50S y 30S
QUESTION 8
Indicar la opcin CORRECTA. El f-metionil-tRNA iniciador:
a) Entra en el sitio A de la subunidad pequea del ribosoma
b) Entra en el sitio A del ribosoma completo
c) Entra en el sitio P del ribosoma completo
d) Entra en el sitio P de la subunidad pequea del ribosoma
QUESTION 9
Indicar la opcin CORRECTA. La RNA polimerasa I:
a) Transcribe los RNAs mensajeros
b) Transcribe los genes ribosmicos 18S, 28S y 5S
c) Transcribe los genes ribosmicos 18S, 28S y 5.8S
d) Transcribe todos los genes que codifican los RNAs ribosmicos
QUESTION 10
Indicar la opcin CORRECTA. Cuando la concentracin de hierro es alta, la protena IRE-BP:
a) Se une a la regin 5-UTR del mRNA que codifica la ferritina y a la regin 3-UTR del
mRNA que codifica el receptor de transferrina
b) Se degrada
c) Se une a las regiones 5-UTR de los mRNAs que codifican la ferritina y el receptor de
transferrina.
d) Se une a la regin 3-UTR del mRNA que codifica la ferritina y a la regin 5-UTR del
mRNA que codifica el receptor de transferrina.
Bioqumica y biologa molecular Cuestionarios
Laura Esteban Luca 278


QUESTION 11
Indicar la opcin CORRECTA. Los coactivadores:
a) No tienen afinidad de unin al DNA
b) Se unen preferentemente a las islas CpG
c) Son protenas con una alta afinidad de unin a secuencias inespecficas de DNA
d) Son protenas con una alta afinidad de unin a secuencias especficas de DNA
QUESTION 12
Indicar la opcin CORRECTA. Un tRNA con anticodon 5'-GCA-3' puede reconocer el codon:
a) 5-CGU-3
b) 5-UGC-3
c) 5-GCA-3
d) 5-UGU-3
QUESTION 13
Indicar la opcin CORRECTA. Las chaperonas:
a) Son enzimas que glicosilan a las protenas en el retculo endoplsmico
b) Facilitan la degradacin de las protenas
c) Facilitan el correcto plegamiento de las protenas
d) Son enzimas que glicosilan a las protenas en el aparato de Golgi.
QUESTION 14
Indicar la opcin CORRECTA. El ncleo (core) de la RNA polimerasa bacteriana:
a) Se une al DNA del promotor con alta afinidad y al DNA inespecfico con baja afinidad
b) Se une al promotor y al DNA inespecfico con igual afinidad
c) No se une al DNA
d) Se une al DNA inespecfico con alta afinidad y al promotor con baja afinidad
QUESTION 15
Indicar la opcin CORRECTA. La acetilacin de las histonas:
a) Estabiliza a los mRNAs en el ncleo
b) Inhibe la transcripcin de los mRNAs
c) Es una modificacin que realiza la RNA polimerasa durante el proceso de transcripcin
d) Activa la transcripcin de los mRNAs



Bioqumica y biologa molecular Cuestionarios
Laura Esteban Luca 279


QUESTION 16
Indicar la opcin CORRECTA. Las islas CpG:
a) Forman parte del promotor basal
b) Se encuentran localizadas en la regin 3 de los genes eucariticos
c) Se encuentran localizadas en la regin 5`de los genes eucariticos
d) Se encuentran distribuidas al azar en el genoma eucaritico
QUESTION 17
Indicar la opcin CORRECTA. La protena de unin a caja TATA (TBP):
a) Participa en el reconocimiento de los promotores por la RNA polimerasa III
b) Participa en el reconocimiento de los promotores por la RNA polimerasa II
c) Participa en el reconocimiento de los promotores por la RNA polimerasa I
d) Todas las respuestas son correctas
QUESTION 18
Indicar la opcin CORRECTA. La edicin de los mRNAs:
a) Es un trmino equivalente al de splicing alternativo
b) Es la modificacin del extremo 3`de los mRNAs
c) Es un proceso especfico de protozoos
d) Es un proceso que modifica la secuencia de un mRNA
QUESTION 19
Indicar la opcin CORRECTA. Las protenas de la familia Sm:
a) Forman parte de las snRNPs
b) Se unen a la cola de poli(A)
c) Se unen al esxtremo 5' del mRNA
d) Son las que catalizan la reaccin de splicing
QUESTION 20
Indicar la opcin CORRECTA. La modificacin del extremo 5de los mRNAS:
a) Consiste en una adenina formando un enlace 5'-3' fosfodiester con el primer nucletido del mRNA
b) Consiste en una guanina formando un enlace 5'-5'' fosfodiester con el primer nucletido del
mRNA
c) Consiste en una guanina formando un enlace 5'-3' fosfodiester con el primer nucletido del mRNA
d) consiste en una guanina formando un enlace 3'-3' fosfodiester con el primer nucletido del mRNA


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QUESTION 21
Indicar la opcin CORRECTA. El reconocimiento del AUG iniciador en eucariotas:
a) Se realiza por la subunidad pequea del ribosoma que se mueve desde el extremo 5' del
mRNA a travs de la regin 5'-UTR
b) Se realiza por el ribosoma completo que se mueve desde el extremo 5' del mRNA a travs
de la regin 5'-UTR
c) Depende de la secuencia Pribnow
d) Depende de la secuencia de Shine-Dalgarno
QUESTION 22
Indicar la opcin CORRECTA. El promotor reconocido por la RNA polimerasa bacteriana:
a) Es bimodular, con dos secuencias conservadas en las posiciones -35 y -100
b) Se encuentra en el interior de los genes
c) Es bimodular, con dos secuencias conservadas en las posiciones de -10 y -35
d) Est formado por una secuencia de DNA llamada secuencia de Shine-Dalgarno
QUESTION 23
Indicar la opcin CORRECTA. El factor EF-Ts:
a) Es una GTPasa que lleva los aminoaciltRNAs al sitio P del ribosoma
b) Es un factor que recicla el EF-Tu-GTP en EF-Tu-GDP
c) Es una GTPasa que lleva los aminoaciltRNAs al sitio A del ribosoma
d) Es un factor que recicla el EF-Tu-GDP a en EF-Tu-GTP
QUESTION 24
Indicar la opcin CORRECTA. Dentro de las modificaciones que puede sufrir una protena:
a) La N-glicosilacin ocurre fundamentalmente en el retculo endoplsmico,
independientemente del destino final de la protena glicosilada
b) La adicin de grupos qumicos a las protenas como fosforilaciones o metilaciones generan
cambios en su estructura que activan su funcin
c) La fosforilacin de protenas en la clula es un fenmeno muy raro pero de gran relevancia
d) La proteolisis siempre est asociada a una activacin funcional como en el caso de algunos
factores de coagulacin




Bioqumica y biologa molecular Cuestionarios
Laura Esteban Luca 281


QUESTION 25
Indicar la opcin CORRECTA. En relacin con la degradacin de protenas intracelulares:
a) La ubicuitina es una protena de bajo peso molecular especfica de mamferos
b) Ocurre exclusivamente por la va del proteasoma
c) Para interaccionar con el proteasoma, las protenas se marcan usualmente con molculas de
ubicuitina
d) El proteasoma es una nica protena de gran tamao con estructura tubular
QUESTION 26
Indicar la opcin CORRECTA. La burbuja de transcripcin:
a) Tiene un tamao aproximado de 200 pares de bases
b) Tiene un tamao aproximado de 1000 pares de bases
c) Tiene un tamao aproximado de 20 pares de bases
d) Tiene un tamao aproximado de 500 pares de bases
QUESTION 27
Indicar la opcin CORRECTA. Los potenciadores (enhancers):
a) Se encuentran localizados a distancia variable del promotor basal en la regin 5 del gen
b) Se encuentran localizados a distancia variable en la regin 3 del gen
c) Se encuentran localizados a distancia variable tanto en 5 cmo en 3 del gen
d) Forman parte del promotor proximal
QUESTION 28
Indicar la opcin CORRECTA. Los dedos de Zinc:
a) Es un dominio estructural de la RNA polimerasa
b) Son genes que codifican los enzimas que unen Zinc
c) Es un dominio de unin a DNA presente en muchos factores de transcripcin
d) Es un dominio de la protena de unin a la caja TATA (TBP)
QUESTION 29
Indicar la opcin CORRECTA. Los tRNAs poseen una estructura tridimensional:
a) En forma de hoja de trbol
b) En forma de hoja de arce
c) En forma de H
d) En forma de L


Bioqumica y biologa molecular Cuestionarios
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QUESTION 30
Indicar la opcin CORRECTA. El snRNAU1:
a) Se une al borde intrn-exn (sitio aceptor de splicing)
b) Se une al snRNAU6
c) Se une a la secuencia de ramificacin
d) Se une al primer borde exn-intrn (sitio donador de splicing)
QUESTION 31
Indicar la opcin CORRECTA. Las aminoacil tRNA sintetasas:
a) Cargan un aminocido especfico a todos los tRNAs isoaceptores de ese aminocido
b) Son un conjunto de treinta enzimas diferentes
c) Son enzimas que reconocen dos aminocidos diferentes y dos tRNAs isoaceptores
d) Sintetizan todos los tRNAs
QUESTION 32
Indicar la opcin CORRECTA. Los receptores nucleares:
a) Constituyen una superfamilia de factores de transcripcin
b) Son dos, el receptor de histona y el receptor de cromatina
c) Son los receptores que unen ATP en el ncleo
d) Forman parte estructural de los poros nucleares
QUESTION 33
Indicar la opcin CORRECTA. El represor del opern de la lactosa:
a) Se une al operador del opern de la lactosa
b) Se une a la enzima betagalactosidasa
c) Se une a la enzima lactasa
d) Se une a la RNA polimerasa
QUESTION 34
Indicar la opcin CORRECTA. El holoenzima RNA polimerasa de Escherichia coli:
a) Est formada por el ncleo (core) enzimtico y un factor sigma, llamado sigma 70
b) Est formada por el ncleo (core) enzimtico, y un factor que se llama CRP
c) Est formado exclusivamente por el ncleo (core) enzimtico
d) Est formada por el ncleo (core) enzimtico, unido a uno de los factores sigma que
contiene E. coli

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284
Cuestionario 3. HORMONAS
QUESTION 1
Indicar la opcin CORRECTA. Cuanto un protooncogen sufre una mutacin puntual en
la regin codificante se puede transformar en oncogen si:
a) Da lugar a una protena hiperactiva, pero es necesario que se produzca en exceso
b) Da lugar a una protena hiperactiva, aunque se produzca en cantidades normales
c) Da lugar a una protena inactiva, pero es necesario que se produzca en exceso
d) Da lugar a una protena inactiva, aunque se produzca en cantidades normales.
QUESTION 2
Indicar la opcin CORRECTA. El principal mecanismo regulador en la transicin
G2/M es la fosorilacin/defosforilacin de la subunidad kinasa:
a) Solo existe una fosforilacin positiva que es necesaria para que pueda acceder el
sustrato
b) La fosforilacin positiva permite el acceso del ATP mientras que la fosforilacin
negativa impide el acceso del sustrato
c) La fosforilacin positiva permite el acceso del sustrato mientras que la
fosforilacin negativa impide el acceso del ATP
d) Solo existe una fosforilacin negativa que impide el acceso del ATP
QUESTION 3
Indicar la opcin CORRECTA. Respecto a la tiroglobulina
a) La tiroglobulina se hidroliza en el coloide del folculo tiroideo
b) La tiroglobulina se almacena en las clulas epiteliales del folculo tiroideo
c) La tiroglobulina es una glicoprotena que contiene en su estructura muchas
tirosinas
d) La tiroglobulina se sintetiza en el coloide del folculo tiroideo
QUESTION 4
Indicar la opcin CORRECTA. La adrenalina es una catecolamina
a) Que se sintetiza en la mdula adrenal mediante la accin de la tirosina
hidroxilasa sobre la noradrenalina
b) Que se sintetiza en la mdula adrenal mediante la accin de una metiltransferasa
sobre la noradrenalina
Bioqumica y biologa molecular Cuestionarios
Laura Esteban Luca 285
c) Que se sintetiza en la mdula adrenal mediante la accin de una metiltransferasa
sobre la Dopamina
d) Que se sintetiza en la mdula adrenal mediante la accin del enzima dopa
descarboxilasa sobre la DOPA
QUESTION 5
Indicar la opcin CORRECTA. La protena kinasa mTOR se activa en respuesta a
factores de crecimiento. Su funcin es importante ya que:
a) Activa la replicacin del DNA por DNA Pol delta
b) Aumenta la transcripcin por RNA Pol II de genes tempranos
c) Aumenta la traduccin al fosforilar a la MAP kinasa
d) Aumenta la traduccin al fosforilar a una protena kinasa y a un inhibidor del
inicio de traduccin
QUESTION 6
Indicar la opcin CORRECTA. En la diabetes se sobreproduce glucosa
a) En el hgado y se usa de forma adecuada en otros rganos
b) En el hgado y no se usa de forma adecuada en otros rganos
c) En el msculo y no se usa de forma adecuada en otros rganos
d) En el tejido adiposo y no se usa de forma adecuada de otros rganos.
QUESTION 7
Indicar la opcin CORRECTA. Respecto a las hormonas tiroideas y su sntesis
a) La tiroperoxidasa cataliza la iodacin de la tiroglobulina en restos de tirosinas
b) Las hormonas tiroideas viajan en el plasma libres y ejercen su accin en las
clulas diana unindose a receptores de membrana plasmtica
c) El yodo entra por difusin pasiva en las clulas epiteliales del folculo tiroideo
d) Las hormonas tiroideas son molculas de tiroglobulina yodada
QUESTION 8
Indicar la opcin CORRECTA. La proopiomelanocortina es la poliprotena que:
a) Se produce en la hipfisis y que puede dar lugar a distintas hormonas tras
fosforilaciones especficas
b) Va a dar lugar a distintas hormonas, siendo esta la norma general en la sntesis
de hormonas polipeptdicas
c) Puede dar lugar a diferentes hormonas dependiendo de las proteasas presentes en
la regin de la hipfisis en que se genere
Bioqumica y biologa molecular Cuestionarios
Laura Esteban Luca 286
d) Se produce en el pncreas y que puede dar lugar a distintas hormonas.
QUESTION 9
Indicar la opcin CORRECTA. En las reacciones catalizadas por las monooxigenasas
a) Se utiliza el oxgeno molecular para oxidar al sustrato
b) Se transfieren los electrones de dos en dos
c) El donador de electrones es el NADP
d) Las monooxigenasas implicadas son protenas citoplasmticas
QUESTION 10
Indicar la opcin CORRECTA. La toxina colrica cataliza la ADP ribosilacin de la
Gas
a) Y bloquea su actividad GTPasa
b) E impide la disociacin del GDP
c) E impide su interaccin con receptores serpentina
d) Y activa permanentemente su actividad GTPasa
QUESTION 11
Indicar la opcin CORRECTA. La protena transductora de la seal en los receptores
serpentina:
a) Es una protena homotrimrica
b) Es una protena heterotrimrica con actividad ATPasa
c) Es una protena kinasa
d) Es una protena heterotrimrica
QUESTION 12
Sealar la opcin CORRECTA. Los factores de crecimiento permiten el paso por punto
de restriccin, porque al unirse a sus receptores:
a) Promueven un aumento en la cantidad de CKIs, una disminucin en los niveles
de ciclina y eliminan el freno impuesto por Rb
b) Promueven aumento en la cantidad de ciclinas, disminucin en la cantidad de
CKIs y eliminan el freno
QUESTION 13
Indicar la opcin CORRECTA. Los eicosanoides
a) Los eicosanoides se sintetizan a partir del cido araquidnico tras la activacin
de la fosfolipasa C
Bioqumica y biologa molecular Cuestionarios
Laura Esteban Luca 287
b) Los eicosanoides se sintetizan a partir del cido araquidnico
c) Los eicosanoides estn muy disminuidos tras el tratamiento con aspirina porque
esta bloquea la actividad de la fosfolipasa
d) Los eicosanoides se denominan as porque derivan del cido eicosanoico
QUESTION 14
Indicar la opcin CORRECTA. La protena p53 se sintetiza en cantidades pequeas en
clulas no sometidas a estrs genotxico.
a) Su cantidad aumenta tras este estrs y promueve parada de ciclo ya que
disminuye la sntesis de ciclina
b) Su cantidad disminuye tras este estrs y promueve parada de ciclo ya que
aumenta la degradacin de p21 que es un inhibidor de los complejos
ciclina/CDK
c) Su cantidad aumenta tras el estrs y promueve para de ciclo ya que aumenta la
sntesis de retinoblastoma que es un freno en la entrada de S
d) Su cantidad aumenta tras este estrs genotxico y promueve para de ciclo ya que
aumenta la sntesis de p21 que es un inhibidor de los complejos ciclina/CDK
QUESTION 15
Indicar la opcin CORRECTA. En una situacin de ayuno prolongado
a) Se generan cuerpos cetnicos en el hgado debido a una excesiva produccin de
piruvato
b) Se generan cuerpos cetnicos en el hgado porque el AcetilCoa, que se produce
en exceso, se utiliza en el ciclo de Krebs
c) Se generan cuerpos cetnicos en el hgado
d) No se generan cuerpos cetnicos en el hgado
QUESTION 16
Indicar la opcin FALSA. Respecto a la vitamina D
a) La vitamina D promueve en aumento de la expresin de protenas ligantes de
Calcio
b) La Vitamina D se une a factores de transcripcin que actan de forma
heterodimrica
c) La vitamina D se une a factores de transcripcin que actan de forma
homodimrica
d) La vitamina D est implicada en el mantenimiento de la homeostasis del Calcio

Bioqumica y biologa molecular Cuestionarios
Laura Esteban Luca 288
QUESTION 17
Indicar la opcin CORRECTA. La adrenalina promueve
a) Un aumento de la glucogenolisis en el msculo
b) Un aumento de la glucogenognesis heptica
c) Una disminucin de la gluconeognesis heptica
d) Un aumento de la sntesis de cidos grasos en el hgado
QUESTION 18
Indicar la opcin INCORRECTA. La activacin de la MAP kinasa por factores de
crecimiento:
a) Permite la activacin en el ncleo de factores de transcripcin presentes en las
clulas en una conformacin inactiva
b) Permite la activacin en el ncleo de factores de transcripcin tempranos
c) Permite que se desencadene en el ncleo una cascada de activacin de factores
de transcripcin
d) No conduce a la activacin en el ncleo de factores de transcripcin.
QUESTION 19
Las siguientes afirmaciones son todas CORRECTAS EXCEPTO
a) La protena efectora de Gas es Adenilato ciclasa
b) La protena efectora de Gai es adenilato ciclasa
c) La protena efectora de Gaq es fosfolipasa C
d) La protena efectora de Gai es fosfolipasa C
QUESTION 20
Indicar la opcin CORRECTA. Las hormonas esteroideas se sintetizan:
a) A partir del colesterol y contienen 25 tomos de carbono
b) A partir del colesterol y contienen todas menos de 25 tomos de carbonos
c) A partir de fosfolpidos y contienen menos de 10 tomos de carbono
d) A partir del cido araquidnico y contienen todas menos de 25 tomos de
carbono



Bioqumica y biologa molecular Cuestionarios
Laura Esteban Luca 289
QUESTION 21
Indicar la opcin CORRECTA. La sealizacin paracrina se caracterizan porque las
clulas emisoras y receptoras
a) Estn en un entorno prximo y la afinidad del receptor por la seal es del orden
de 10
-4
M
b) Son las mismas y la afinidad del receptor por la seal es del orden de 10
-8
M
c) Estn prximas y la afinidad del receptor por la seal es del orden de 10
-8
M
d) Estn alejadas y la afinidad del receptor por la seal es del orden de 10
-4
M
QUESTION 22
Indicar la opcin CORRECTA. La protena Ras es un interruptor molecular que:
a) Activa a la protena kinasa Map kinasa kinasa kinasa por fosforilacin
b) Oscila en dos conformaciones diferentes, siendo la activa la que lleva unido
GDP
c) Oscila en dos conformaciones diferentes, siendo la activa la que lleva unido
GTP
d) Tras la adiccin de un factor de crecimiento la mayora de las molculas adoptan
la configuracin
QUESTION 23
Indicar la opcin CORRECTA. El dominio de unin al DNA de los receptores de
hormonas esteroideas y tiroideas.
a) Contienen dos dedos de zinc ambos implicados en unin a protenas inhibidoras
b) Contienen dos dedos de zinc implicados ambos en la unin del ligando
c) Ninguna de las otras tres opciones es correcta
d) Contienen dos dedos de zinc implicados ambos en la formacin de dmeros
QUESTION 24
Indicar la opcin CORRECTA. La fosforilacin en tirosina de los receptores tirosina
kinasa tras la unin de un factor de crecimiento.
a) Es llevada a cabo por protenas con dominios SH2
b) Es indispensable para la transmisin de la seal
c) Es permanente
d) No es indispensable para la transmisin de la seal.

Bioqumica y biologa molecular Cuestionarios
Laura Esteban Luca 290
QUESTION 25
Indicar la opcin correcta. el hipotlamo es una glndula neuroendocrina que:
a) Libera factores que actan unindose a receptores intracelulares en las clulas
diana
b) Libera factores en cantidades de microgramos en respuesta a un estmulo
c) Libera hormonas (factores) en respuesta a un estmulo
d) Libera hormonas en respuesta a seales emitidas desde la hipfisis
QUESTION 26
Indicar la opcin CORRECTA. El receptor de glucocorticoide:
a) Se une a los GRE aun en ausencia del ligando
b) Tras la adicin del ligando se une a los GRE en forma homodimrica
c) Se une a los CRE tras la aduccin del ligando
d) Se une a los GRE en forma heterodimrica
QUESTION 27
Indicar la opcin CORRECTA. Las protenas claves reguladoras de la transicin G1/S
en el ciclo celular son
a) Una CDK (subunidad reguladora del complejo), una ciclina (subunidad
cataltica del complejo, y una CKI que inhibe al complejo interaccionando con la
ciclina
b) Una CDK (subunidad reguladora del complejo), una ciclina (subunidad
cataltica del complejo) y una CKI que inhibe al complejo interaccionando con
ambas subunidades
c) Una CDK (subunidad cataltica del complejo), una ciclina (subunidad
reguladora del complejo) y una CKI que inhibe al complejo interaccionando con
ambas subunidades
d) Una CDK (subunidad cataltica del copmlejo), una ciclina (subunidad
reguladora del copmlejo) y una CKI que inhibe al complejo interaccionando con
la ciclina
QUESTION 28
Indicar la opcin CORRECTA. Despus del estmulo apropiado:
a) GDP se disocia de Gas y el GTP ocupa su lugar porque los niveles intracelulares
de GTP son mayores que los de GDP
b) Gas libera GDP y la protena Gas cataliza la incorporacin de GTP
Bioqumica y biologa molecular Cuestionarios
Laura Esteban Luca 291
c) GDP se disocia de Gas, posteriormente se necesita la colaboracin de la protena
SOS para que el GTP ocupe su lugar
d) GDP se disocia de Gas y el GTP ocupa su lugar de forma permanente
QUESTION 29
Indicar la opcin CORRECTA. Al unirse insulina a su recetor se fosforilan dos tipos de:
a) Residuos de tirosina, unos implicados en su activacin estable y otros
implicados en la unin con dominios SH3 y otros implicado sen
b) Residuos de tirosina, unos implicados en su activacin estable y otros
implicados en la unin de protenas con dominios SH2
QUESTION 30
Indicar la opcin CORRECTA. El glucagn inhibe la gluclisis en el hgado porque la
protena kinasa A, se activa en respuesta a la unin del glucagn a su receptor y
a) Fosforila e inhibe fosfoenopiruvato carboxikinasa
b) Fosforila e inhibe glucgeno sintetasa
c) Fosforila e inhibe fosfofructoquinasa I
d) Impide la activacin de fosfofructokinasa I
QUESTION 31
Cul de las siguientes afirmaciones es CORRECTA?
a) El cAMP activa PKA porque promueve un aumento en la sntesis de esta
protena
b) El cAMP activa PKA porque al unirse a la subunidad reguladora cambia su
conformacin y esta deja de bloquear la actividad de la cataltica
c) El cAMP activa a la protena kinasa A porque se une a la subunidad cataltica
d) El cAMP activa a PKA porque al unirse a la subunidad cataltica cambia su
conformacin y esta no puede unirse a la subunidad reguladora
QUESTION 32
Indicar la opcin CORRECTA:
a) La protena efectora de Gas/GTP es fosfolipasa C
b) La protena efectora de Gas/GTP es protena quinasa C
c) La conformacin activa de Gas (la que lleva unido GTP) tiene como protena
efectora Adenilato ciclasa
d) La protena efectora de Gas/GTP es protena kinasa A

Bioqumica y biologa molecular Cuestionarios
Laura Esteban Luca 292
QUESTION 33
Indicar la opcin CORRECTA. La unin de insulina a su receptor permite la activacin
de:
a) PKB/Akt que favorece la gluconeognesis mediante fosforilacin e inhibidicn
de GSK3
b) PKA que favorece la glucogenognesis mediante la fosforilacin e inhibicin de
GSK3
c) PKB/AKT que favorece la glucogenolisis mediante fosforilacin e inhibidicn
de GSK3
d) PKB/Akt que favorece la glucogenognsis mediante fosforilacin e inhibicin
de PKC
QUESTION 34
Iindicar la opcin CORRECTA. El calcio intracelular que se genera en respuesta un
estmulo:
a) Se une a calmodulina y el complejo Calmodulina calcio formado activa
exclusivamente a protena kinasas
b) Se une a calmodulina y el complejo calmodulina calcio formado, puede activar
distintas protenas, entre ellas protena quinasas
c) Se une a calmodulina y el complejo Calmodulina calcio formado activa
exclusivamente protena kinasa
Bioqumica y biologa molecular Cuestionarios
Laura Esteban Luca 293

294
Cuestionario de prcticas
QUESTION 1
Para el proceso de transformacin de bacterias es necesario
a) Bacterias competentes y DNA exgeno
b) Bacterias no competentes y choque trmico
c) Bacterias no competentes, DNA exgeno y choque trmico
d) Bacterias competentes, DNA exgeno y choque trmico.
QUESTION 2
En una transformacin bacteriana, el IPTG se usa como
a) Antibitico de seleccin, junto con la ampicilina
b) Inductor del promotor del gen LacZ
c) Activador del LB/agar
d) Sustrato de la actividad beta-galactosidasa
QUESTION 3
Las enzimas de restriccin, por norma general:
a) Reconocen 2 secuencias distintas de DNA
b) Reconocen una secuencia especifica del DNA
c) No reconocen DNA sino RNA
d) Reconocen secuencias aleatorias de DNA
QUESTION 4
Las placas LB/agar + ampicilina sirven para que crezcan
a) Las bacterias sin resistencia a ampicilina
b) Las bacterias con resistencia a ampicilina
c) Solamente las bacterias azules
d) Todas las bacterias.
QUESTION 5
El tampn de carga contiene glicerol para
a) Ninguna es correcta
b) Aumentar la velocidad de migracin del DNA
Bioqumica y biologa molecular Cuestionarios
Laura Esteban Luca 295
c) Dar color a la muestra y poder ver el frente
d) Evitar la degradacin del DNA
QUESTION 6
La eficiencia de transformacin se corresponde con el nmero de bacterias por
microgramo de DNA que han incorporado
a) Solo el plasmido recombinante
b) El plsmido recombinante y el plsmido vacio
c) Solo el plasmido vacio, sin inserto
d) Solo el plasmido con el inserto
QUESTION 7
Una mutacin puntual
a) Ninguna es correcta
b) Nunca conlleva un cambio de aa
c) Siempre conlleva un cambio de aa
d) Dependiendo del tipo de mutacion puede producir o no un cambio de aa
QUESTION 8
Elige la afirmacin correcta referente al cDNA de un gen
a) Solo contiene sus exones
b) Contiene todos sus exones y sus intrones
c) Solo contiene algunos de sus intrones
d) Solo contiene sus intrones.
QUESTION 9
Elige la opcin correcta en relacin con el poly-linker de un plsmido
a) Ninguna es correcta
b) Determinados plasmidos contienen mas de un poly-linker
c) Es una regin que contiene sitios de corte para diferentes enzimas de restriccin
d) Es una regin que contiene diferentes sitios de corte para un mismo enzima de
restriccin


Bioqumica y biologa molecular Cuestionarios
Laura Esteban Luca 296
QUESTION 10
En la electroforesis de DNA, el Bromuro de Etidio se utiliza
a) Como marcador del tamao de los fragmentos de DNA
b) Para visualizar con luz ultravioleta los fragmentos de DNA
c) Para dar densidad a las muestras al cargarlas en los pocillos
d) Como marcador del frente de migracin.

Bioqumica y biologa molecular Cuestionarios
Laura Esteban Luca 297

298
Cuestionario I Cuestionario II Cuestionario III Prcticas
1
C B B D
2
B A C B
3
A A C B
4
A C B B
5
D B D A
6
B C B B
7
D B A D
8
B D C A
9
B C A C
10
B A A B
11
C A D
12
A B B
13
D B
14
D B D
15
A D C
16
D C C
17
B D A
18
C D D
19
D A D
20
C B B
21
B A A
22
B C C
23
C D C
24
D A B
25
C C
26
C D
27
C C
28
C A
29
D B
30
D B
31
A B
32
A C
33
A A
34
D B
Respuestas a los cuestionarios
Bioqumica y biologa molecular Cuestionarios
Laura Esteban Luca 299

300