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CATEDRA DE BIOINGENIERA

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TRABAJO PRCTICO N: 1 ESTERILIZACIN. USO DE ESTUFA Y AUTOCLAVE. En la prctica microbiolgica es necesario tener todo el material experimental exento de microorganismos vivos, de forma tal que al sembrar un microorganismo (m. o.) determinado en un cierto medio de cultivo, las manifestaciones de vida que se evidencien podamos asignarlas con seguridad a dicho m. o. y no a una mezcla con otros, puesto que los g rmenes contaminantes pululan en todos los ambientes y en todos los ob!etos y sustancias. "ara destruir toda clase de m. o. se esterilizan los materiales a emplear. #os principales m todos de esterilizacin son los siguientes$ 1. FISICOS: %& 'alor$ (irecto$ combustin, flameado a) 'alor )eco *ndirecto$ aire caliente (estufa) Ebullicin +apor fluente b) 'alor ,-medo +apor saturado a presin (autoclave) .indalizacin /& '& (& 0iltracin 1ayos 2ltravioleta +ibraciones 2ltrasnicas

2. QUIMICOS %ntis pticos y desinfectantes. 1- MTODOS DE ESTERILIZACIN FSICOS

A- Calor a) Calor Seco:

Combustin/Flameado (Directo) )e utiliza para esterilizar agu!as histolgicas, ansas, etc., las que se colocan en la zona caliente de la llama del mechero (cono azul) hasta ro!o vivo. "ara bistur3s, pinzas y todo otro instrumental que puede ser da4ado por la combustin directa se aplica la t cnica de flamearlos tres a cuatro veces sobre la llama del mechero pero sin llegar a calentar como en el primer caso. .ambi n los morteros pueden ser esterilizados por este m todo, pero quemando alcohol en su interior. Aire Caliente (Indirecto) )e utiliza para esterilizar instrumental, ca!as de "etri, tubos de ensayo, pipetas, o en general, materiales de vidrio, todos los cuales son envueltos previamente con papel, protegi ndolos de una posterior contaminacin. )e lleva a cabo en estufas u hornos de esterilizacin.

b) Calor Hmedo:
Ebullicin$ 'onsiste en hacer que sobre el material a esterilizar act-e agua hirviente, cuya eficiencia puede elevarse por el agregado de algunas sales, como 5a 6'78, 5a578, 96'78, etc. Este m todo ofrece seguridad relativa, pues algunas bacterias esporuladas resisten a la accin del agua hirviente. +apor saturado a presin (autoclave)$

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Este m todo es el ideal para la esterilizacin de soluciones acuosas, pues es rpido y seguro. 'omo dispositivo especial requiere el uso del autoclave, aparato que permite elevar la presin hasta 8&: atm sobre la presin atmosf rica del lugar de funcionamiento, elevando as3 la temperatura de ebullicin del agua (vapor). +apor fluente (autoclave)$ Es una t cnica corrientemente usada para esterilizar medios de cultivo que no pueden someterse a una temperatura mayor de ;<< =' sin perder alguna propiedad. 'alor discontinuo o tindalizacin$ Esta t cnica se emplea cuando se desea esterilizar sustancias que se descomponen o alteran a cierta temperatura, como en el caso de ciertos az-cares o compuestos de naturaleza proteica, e!emplos$ sueros de leche, solucin de sacarosa, etc. 'olocando el material en recipientes adecuados, se calientan al ba4o >ar3a a una temperatura que var3an entre ?? =' y ;<< =', durante una hora. )e de!a enfriar y se mantiene a la temperatura ambiente, durante 6: horas, repitiendo el calentamiento al cabo de ese lapso y otra vez a las :@ horas. 'alentando a una temperatura menor a la de ebullicin del agua se hace necesario aumentar el n-mero de calentamientos. (urante el primer calentamiento se destruyen las formas vegetativas, quedando con vida las esporas, que germinan luego a temperatura ambiente. #as formas vegetativas por ellos producidas son las que se destruyen en los posteriores calentamientos. B- Filtracin: %quellas soluciones que se descomponen o inactivan al someterse a las temperaturas del autoclave (termolbil), se esterilizan en fr3o pasndolas a trav s de filtros de poros peque4os que impiden el paso de todas las bacterias y microorganismos de mayor tama4o. #os l3quidos as3 filtrados quedan completamente est riles y no es necesario someterlos al calor o a la accin de sustancias bactericidas. )e pueden emplear tanto el filtro )eitz (hecho de asbesto) como el filtro de membrana de celulosa. 2- METODOS DE ESTERILIZACIN UMICOS:

.ambi n conocido como desinfeccin, este m todo se basa en el hecho de que la c lula microbiana, como toda c lula viva, necesita para permanecer como tal, condiciones adecuadas. %lterando algunos de estos factores se produce una perturbacin y, si la alteracin se prolonga o es intensa, llega a causar la muerte de la c lula. %provechando este hecho se han proporcionado los medios para eliminar los g rmenes o para inhibir su crecimiento, provocando ya sea una alteracin de la composicin qu3mica del protoplasma o destruyendo su estado coloidal. #a t cnica consiste en someter el material a esterilizar, a lava!es con soluciones desinfectantes o antis pticas, eliminando luego los restos de stos mediante repetidos lavados con agua destilada est ril. #os productos que pueden utilizarse con este fin son muy diversos, variando tambi n su modo de actuar con relacin a su actividad antis ptica. El bicloruro de mercurio, alcohol, sulfato de cobre cido f nico, sales de metales pesados, etc. act-an rompiendo el equilibrio coloidal. #a actividad de estos desinfectantes es ms eficaz cuando son usados en soluciones acuosas, pues la hidratacin previa facilita la coagulacin de las alb-minas, as3 por e!emplo, es me!or desinfectante el alcohol de A<= que el alcohol puro. 7tros como el yodo, cloro, agua oxigenada, permanganato de potasio, por su gran actividad qu3mica act-an oxidando algunos componentes sensibles del protoplasma.

PREPARACIN DE LOS MATERIALES PARA ESTERILIZAR

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El material de vidrio a esterilizar se lava previamente muy bien, se en!uaga con agua destilada y se de!a escurrir para secarlo (o se seca en estufa). "*"E.%)$ )e envuelven en tiras de papel apergaminado o papel de diario de : a ? cm de ancho y de largo unos cent3metros ms que la longitud de la pipeta. El papel se coloca !unto con la pipeta en un ngulo de :?= aproximadamente y se va enrollando el papel sobre la pipeta, no muy apretado. Existe tambi n la posibilidad de preparar paquetes con varias pipetas. Es muy importante marcar el volumen de las pipetas sobre el paquete, se4alando la orientacin de las mismas. E1#E5>BCE1E)$ )e tapa con tapones de algodn y se cubren stos con capuchones de papel que se atan con piol3n. .2/7) (E E5)%C7$ )e les coloca tapn de algodn, se agrupan de a ? D y se les hace un capuchn de papel, como en el caso anterior. 'E")2#%) 7 '%F%) (E "E.1*$ )e envuelven con papel y se atan o no con piol3n. ESTERILIZACIN CON AIRE CALIENTE: ESTUFA )e usa para esterilizar vidrio o materiales slidos estables al calor, envueltos en papel o protegidos de otra forma contra la posterior contaminacin, para lo cual se puede emplear una estufa especial o un horno de cocina ordinario.

D!"#$%&#%'( ) *+(#%,(-.%!(/,:
#a estufa u horno de esterilizacin consta de una doble pared por donde circula aire caliente y una puerta frontal. #a pared exterior est revestida con amianto, los ob!etos se colocan sobre un estante enre!ado. El aire calentado por la llama de un quemador, como en los hornos de 9och y "asteur, o mediante una resistencia el ctrica como en las estufas de esterilizacin. ,7157 "%).E21 ,7157 (E 97',

U",:
'olocar el material en la estufa y esperar que la temperatura alcance y se mantenga en 101 C (esto demora aproximadamente entre G< min. y ;6< min.). (esde entonces, cronometrar 21 .%(+/,". Esperar que la estufa se enfr3e, una vez desconectada, para reci n retirar el material esterilizado. "ara esterilizar con calor en seco es necesario mantener altas temperaturas por per3odos de tiempo mayores de los que requiere el autoclave. El ciclo de esterilizacin ordinario en un horno de aire seco es de ;A< = ', por G< minutos a ;@< minutos. ESTERILIZACIN CON VAPOR: AUTOCLAVE

D!"#$%&#%'(:
"ara esterilizar en ambiente h-medo, se emplea el autoclaveH que es un aparato seme!ante a una gran olla de presin, en la cual se logran temperaturas superiores a la temperatura de ebullicin del agua por medio de un aumento de presin. 'onsta de un recipiente cil3ndrico dividido por una placa perforada en dos partes, la inferior es el reservorio del agua y la superior es la cmara de vapor donde se coloca el material a esterilizar recubierto de papel. .iene una tapa que se fi!a mediante bulones de tuerca mariposa, logrndose el cierre herm tico mediante la

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interposicin de una arandela de caucho. %dems hay en la tapa un manmetro, una vlvula de seguridad y otra de purga (espita). El sistema de calefaccin est colocado deba!o de la caldera. En el autoclave se logra que la temperatura del vapor sea superior a la de ebullicin en el lugar de traba!o, al aumentar la presin luego de la eliminacin del aire por la espita, la que se cierra cuando la atmsfera es de vapor. 'om-nmente el autoclave funciona a una presin absoluta de 6 atm la que corresponde una temperatura de ebullicin del agua de ;6<='. El tiempo de esterilizacin depende de la temperatura de esterilizacin y del volumen a esterilizar. %s3, para vol-menes inferiores a ;<< ml, se puede destruir toda forma de vida aplicando ;6<=' durante ;? minutos, o ;;?=' durante 6< minutos, o ;;< =' durante 8< minutos. #os medios slidos o viscosos (papa, etc.) deber ser calentados a 121C 3+$-(/! 21 .%(+/,". )i el autoclave est muy cargado o los vol-menes son mayores es necesario prolongar el tiempo de calentamiento. Es importante recordar que$ a) #a temperatura de ebullicin de un l3quido (en este caso$ agua) depende de la presin absoluta a la que est sometido. b) #a presin absoluta dentro del autoclave est dada por la suma de la presin atmosf rica y la sobrepresin (o presin manom trica) aplicada, o sea la que el operador elige para traba!ar. c) #a presin atmosf rica de un lugar depende la su altura sobre el nivel del mar (Is.n.m.J). (e modo que, si estamos a nivel del mar (por e!emplo, /uenos %ires) con una presin atmosf rica de ; atm, para lograr una temperatura de ;6<=' se deber3a aplicar, una sobrepresin de ; atm,, y as3 se llegar3a a las 6 atm de presin absoluta, en tanto para )an )alvador de Fu!uy, a aproximadamente ;6?< m s.n.m., con un presin promedio de <,@? atm, la sobrepresin a aplicar ser mayor (;,;? atm), y ser3a a-n mayor para localidades ms altas, tales como .ilcara, ,umahuaca, #a Kuiaca. 'umplido el tiempo de esterilizacin, se cierra el gas y se espera que la agu!a del manmetro llegue a cero, reci n se abre la espita y luego se quita la tapa. 5o debe abrirse antes la vlvula de purga, pues una brusca descompresin produce una ebullicin en los l3quidos que los proyecta fuera de los recipientes. .ampoco debe abrirse demasiado tarde porque el vapor de agua se condensa sobre los papeles y algodones, y adems la !unta de caucho sometida al vac3o formado se deteriora rpidamente.

M-(!4,:
)e coloca agua en el interior de la caldera hasta casi la altura de la bande!a o re!illa. )e coloca los medios y ob!etos a esterilizar. "osicionar la tapa y a!ustar los tornillos perfectamente, vali ndose de un llave si fuera necesario. El a!uste.

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A :T A PA B: BULONES DE T UERCAMA RIPOSA C: MA NMET RO D: V LV ULADE SEGURIDA D E: V LV ULADE PURGA!ESPIT A " G : CA LEFA CC IN #: C MA RADE EST ERILI$A CIN

)e observa que la espita est abierta. )e conecta la fuente de calor (gas, electricidad). )e de!a salir aire y vapor por la espita ? a ;< minutos aproximadamente (depende del tama4o y de la cantidad de material a esterilizar yLo volumen), purgado que se prolonga hasta que se establece una corriente de vapor continua (comprobar burbu!eando en vaso con agua). ara com!robar la eliminacin del aire" se #ace burbu$ear el esca!e de %a!or en un %aso con a&ua" obser%ando si #a' burbu$as de aire( se com!uta el tiem!o de esterili)acin desde *ue se alcan)a la !resin deseada. )e cierra la espita. )e observa que el manmetro llegue a la presin deseada y se regula la fuente de calor para que se mantenga en dicha presin. )e de!a el tiempo necesario (seg-n la presin fi!ada). .ranscurrido ese tiempo, se interrumpe la fuente de calor y se de!a enfriar hasta alcanzar aproximadamente cero de presin manom trica. 1eci n se igualan las presiones interna y externa abriendo la espita. )e aflo!an los bulones gradualmente para evitar que salten los tapones. )e sacan los ob!etos y se verifica en qu estado se encuentran.

CONTROL DE LA ESTERILIZACIN: a. P-$- !5 -+/,#5-6!: se colocan ampollas o tubos bien cerrados con una sustancia finamente pulverizada, cuyo punto de fusin sea aproximadamente igual a la temperatura que se desea alcanzar en el autoclave. )i se alcanza la temperatura de fusin de la misma quedar formada una masa homog nea dentro del recipiente. )i la temperatura de traba!o es ;6< =' se puede usar el cido benzoico que tiene un punto de fusin de ;6; = '. .ambi n pueden usarse pinturas indicadoras tal como la compuesta por carbonato de plomo, azufre precipitado y carbonato de litio (;<$;$8) sobre cartn u otro material. Esta mezcla vira al gris en 8< segundos. .oma color negro si est expuesta ms de 8< minutos a ;;< =', y a ;6< =' en ? minutos. b. P-$- 5- !"/+*-: en este caso tambi n se puede aplicar tambi n el principio del punto de fusin, colocando en el interior de la estufa una sustancia que funda a los ;A< =', pero preferentemente se proceder como sigue$ 'olocar un poco de tierra en cada uno de dos tubos, uno de los cuales ser sometido a esterilizacin con el material que vaya a estufa.

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Esterilizar 8 tubos conteniendo un caldo nutritivo (equivale al alimento para los posibles microorganismos presentes) de peptona en agua en el autoclave. %gregar el caldo de uno de los tubos a la tierra esterilizada, y el de otro a la tierra sin esterilizar. El tercer tubo con caldo queda como testigo. (e!ar los tres tubos resultantes en estufa o al ambiente a una temperatura de 6<='&8< ='. 7bservar si hubo o no crecimiento de m.o. luego de un cultivo de una semana. En presencia de desarrollo microbiano el l3quido sobrenadante de la suspensin con tierra aparecer enturbiado, pudiendo presentarse tambi n un crecimiento de m.o. en la superficie del l3quido yLo sedimento en el fondo del tubo (este crecimiento es ms dif3cil de distinguir por la presencia de tierra).