Vous êtes sur la page 1sur 5

Chapitre 1 : Outils enzymatiques du gnie gntique

LES ENZYMES UTILISEES EN ENDONUCLEASES DE RESTRICTION

GENIE

GENETIQUE :

LES

1-1/ Dfinition : Ce sont des enzymes, principalement dorigine bactrienne, capables de couper lADN double brin (et ce quelque soit son origine) des endroits spcifiques (squences nuclotidiques) appels sites de restriction gnralement de 4 6 paires de bases. 1-2/ La coupure ou phnomne de restriction: Le phnomne de restriction a t observ bien avant que les enzymes de restriction ne fussent mises en vidence. En effet, lorsquun bactriophage colonise une bactrie, le phnomne de lyse bactrienne, aprs multiplication du phage par le biais de la machinerie enzymatique de la bactrie hte peut ne pas avoir lieu. Ceci est expliqu par le fait que : 1. lADN phagique est intgr, sous forme silencieuse, dans celui de la bactrie : cycle lysognique 2. lADN phagique est compltement dtruit (hydrolys) par les enzymes de la bactrie hte : les enzymes de restriction (Werner Arber). Lorsquune endonuclase de restriction coupe un ADN, le rsultat peut tre : 1. soit une coupure franche c'est--dire au mme niveau sur les deux brins ; ce sont les bords ou les bouts francs : la coupure a lieu au milieu du site de restriction. Il ne peut pas y avoir de liaison spontane entre les fragments qui ont rsult de cette coupure. Seule une T4 ligase peut rtablir la ligation des deux brins dADN rsultant de la coupure.

ADN avant la coupure ADN1 ADN2 5CCCGGG 3 5CCC 3 5 GGG 3 3GGGCCC 5 3GGG 5 3 CCC 5
2. soit une coupure dcale sur les deux brins. On parlera alors dextrmits cohsives. Les bouts des deux ADN obtenus ne sont plus francs ; ce sont des bouts collants ou bouts cohsifs. Les coupures sont dcales lune par rapport lautre sur les deux brins. Les parties simples brins peuvent sapparier, do la possibilit de lier des fragments dADN dorigine diffrentes : cest le phnomne de la recombinaison gntique.

ADN avant la coupure ADN1 ADN2 5GAATTC 3 5G 3 5 AATTC 3 3 CTTAAG 5 3CTTAA 5 3 G 5


Voici un exemple (http://ead.univ-angers.fr/~jalouzot/genetique/courshtm/chap4/chap4-1.htm) qui regroupe les deux types de coupure : En bleu ( gauche) coupure cohsive, en rouge ( droite) coupure franche :

Chapitre 1 : Outils enzymatiques du gnie gntique

1-3/ Nomenclature des enzymes de restriction : Cette nomenclature nobit pas aux rgles de lIUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry), mais dpend de rgles spcifiques qui tiennent compte de la bactrie dont a t isole lenzyme de restriction :

La premire lettre, en majuscule, reprsente linitiale du genre bactrien Les deux lettres, minuscules, qui suivent la premire sont reprsentatives de lespce. Le chiffre romain qui suit ces trois lettres est le numro dordre de dcouverte de lenzyme pour la mme bactrie source. La dernire lettre majuscule nest pas obligatoire pour toutes les endonuclases de restriction. Elle est reprsentative de la souche de la bactrie do lenzyme a t isole. La bactrie Escherichia coli Ry13 EcoR I : premire enzyme isole chez Escherichia coli Ry13 Les enzymes EcoR V : cinquime enzyme isole chez Escherichia coli Ry13

REMARQUE 1: Il existe trois types dendonuclases classs en fonction des sites quelles reconnaissent : 1. enzymes de type I : lenzyme reconnat un site particulier qui na aucune symtrie, ne coupe pas lADN ce niveau mais environ 1000 jusqu 5000 nuclotides plus loin et libre plusieurs dizaines de nuclotides. 2. enzymes de type II : ce sont les plus nombreuses et les plus utilises aux laboratoires de gnie gntique. Leurs sites de restrictions de 4 8 paires de bases sont des squences palindromiques (se lisent de droite gauche et inversement, comme le mot radar et la phrase "esope reste ici et se repose"). Elles coupent au niveau de leurs sites de restriction. 3. enzymes de type III : Lenzyme reconnat une squence mais coupe une vingtaine de paires de bases plus loin. REMARQUE 2: Les ADN bactriens, pour chapper laction de leurs propres endonuclases de restriction, sont mthyls sur le C5 de certaines Cytosines et sur le N7 de quelques Adnines. Les enzymes sont des mthylases qui reconnaissent les mmes sites que les endonuclases de restriction et leur nomenclature ne diffre de celle des endonuclases de restriction que par lajout dune lettre M au dbut du nom : M. EcoR I.

Chapitre 1 : Outils enzymatiques du gnie gntique

Tableau N1: Liste non exhaustive des enzymes de restriction Enzyme Alu I Bam HI Bgl II Eco RI Hind III Hea III Hpa II Mbo I Pst I Taq I Wba I Origine bactrienne Athrobacter luteus Bacillus amyloliquefaciens Bacillus blobiggi Escherichia coli Haemophilus influenzae Haemophilus aegyptus Haemophilus parainfluenzae Moraxella bovis Providentia stuartii Thermophilus aquaticus Xanthomonas badrii Site de restriction AG/CT G/GATCC A/GATCT G/AATTC A/AGCTT GG/CC C/CGG GA/TC CTGCA/G T/CGA T/CTAGA

On peut consulter des moteurs de recherches pour plus dinformations concernant les enzymes de restriction et leurs sites de clivage, ainsi que leurs caractristiques. Par exemple, on peut consulter la base de donnes REBASE (Restriction Enzyme data BASE) sur le site : http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html

Figure N1: Interface principale de la base de donnes REBASE

Chapitre 1 : Outils enzymatiques du gnie gntique

Figure N2: Interface de la base de donnes REBASE Lists pour lenzyme Eco 147 I

Figure N3: Interface de la base de donnes REBASE Lists pour lenzyme Xba I

Chapitre 1 : Outils enzymatiques du gnie gntique

1-4/ Exemple de protocole exprimental de restriction (http://pedagogie.ac-limoges.fr/svt/accueil/html/tp-spe-limosin/TP_manip_elem_bio_mol_tech.doc)

enzymatique

FICHE TECHNIQUE : ACTION DES ENZYMES DE RESTRICTION Protocole :


Dans un microtube mettre : 1. X l de la solution dADN plasmidique, X dpendant de la concentration en ADN de lextrait qui peut tre value par spectrophotomtrie 260 nm grce la relation : 1 DO = 50 g dADN (diluer lADN au 1/200me dans lED avant de lire la DO) 2. 1,5 l du tampon de restriction 3. 1 l de chaque enzyme de restriction 10 U/l 4. QSP 15 l : ED strile 5. Mlanger brivement 6. Centrifuger 4000 g quelques secondes 7. Placer lincubation 2 H 37C 1-5/ Autres outils enzymatiques utiliss en gnie-gntique : Il ny a pas que les endonuclases de restriction qui soient utilises. Il existe une panoplie denzymes pour les techniques de clonage, pour la dtermination des squences dADN, etc. 1. Les mthylases : Ces enzymes reconnaissent les mmes sites que les endonuclases de restriction. Elles catalysent la mthylation du carbone N5 de certaines cytosines et de lazote N6 des adnines pour empcher la coupure par lendonuclase de restriction. 2. Les polymrases : Plusieurs enzymes possdent une activit polymrisante des acides nucliques. La transcriptase rverse transcrit lARN en ADN complmentaire (ADNc) en activant dans le sens 53. La DNA polymrase I, quant elle, possde trois activits : (i)- activit ADN polymrasique 53 partir dune amorce 3OH. (ii)une actvit exonuclasique dans le sens 35. (iii)- une activit exonuclasique dans le sens 53. Le fragment de Klenow, obtenu partir de la DNA polymrase I et possde une activit exonuclasique dans les sens 53 et 35. La Taq polymrase est une enzyme qui amplifie lADN in vitro. Les ARN polymrases transcrivent lun des deux brins de lADN en ARN. La T4 DNA polymrase produite au sein des bactries infectes par le phage T4. Ses activits sont semblables celles du fragment de Klenow. 3. Les ligases : On distingue la DNA lligase dEcoli qui catalyse la raction de formation des liaisons phosphodiesters entre deux nuclotides, lun extrmit 3OH, lautre 5 phosphate. La T4 DNA ligase a la m^me activit que la DNA lligase dEcoli. La RNA ligase produite au sein des bactries infectes par le phage T4 catalyse la raction de liaison (ligation) de deux ARN.

Vous aimerez peut-être aussi