ANEXO IV PROCEDIMENTOS PARA CONTAGEM DE COLNIAS 1.

INTRODUO A aplicao de procedimentos de controle durante o processo analtico visa garantia da confiabilidade do resultado final, assegurando a sua repetibilidade, preciso e exatido. A preciso e a exatido do mtodo tambm dependero da correta observao e aplicao dos procedimentos padronizados estabelecidos para a rea analtica. A garantia da validade dos resultados da contagem estar assegurada quando os resultados dos controles indicarem no haver qualquer falha em nenhuma etapa do processo analtico. 2. RECOMENDAES GERAIS 2.1. Sempre utilizar mais de uma placa, seja uma duplicata da mesma diluio, seja duas ou mais diluies diferentes. 2.2. As contagens devero ser realizadas imediatamente aps o perodo de incubao das placas. 2.3. Na impossibilidade de realizar a contagem imediatamente aps o perodo de incubao, manter as placas sob refrigerao em temperatura de 4C a 7C por um perodo no superior a 24 horas. Esse procedimento no deve tornar-se uma prtica rotineira. 2.4. Para a contagem, selecionar placas que contenham um nmero de colnias que se encontre dentro do intervalo de preciso e repetibilidade estabelecido pelo mtodo em uso (por exemplo, 20 a 200 colnias, 25 a 250 colnias, etc). 2.5. As colnias devero ser contadas com o auxlio de contador de colnias equipado com placa de vidro ou acrlico, com dimetro compatvel com o das placas utilizadas, dividido milimetricamente em quadrantes com 1 cm2 de rea e com iluminao artificial uniforme. 2.6. O contador de colnias dever ter capacidade para aumento de 1 a 2 vezes, com dispositivo de regulagem de altura para melhor ajuste do foco, podendo ainda dispor de sistema eletrnico ou manual de registro das contagens. 2.7. O contador de colnias dever estar localizado em local onde no haja incidncia direta de luz sobre a plataforma de apoio da placa, para evitar possveis enganos na identificao das colnias. 2.8. Utilizar o estereoscpio para observao de caractersticas morfolgicas das colnias, para diferenciar microrganismos de partculas da amostra ou do meio e para seleo e isolamento de colnias. 2.9 Verificar sempre a proporcionalidade dos resultados obtidos nas diluies sucessivas. 3. REGRAS GERAIS PARA CLCULO E REGISTROS 3.1 Expresso de resultados de contagem; No clculo das contagens, o resultado final ser expresso emUFC/g ou mL, levando-se em conta a diluio empregada, da seguinte maneira: R = a x 10b UFC/g ou mL R = resultado a = os dois primeiros algarismos significativos, nmeros de 0 a 9 b = expoente (0 a 10) UFC = unidade formadora de colnias g = grama e mL= mililitro Exemplos: Diluio 10-2 (1:100)

Mdia das contagens: 25 UFC Resultado: 25 x 100 = 2.500 = 2,5 x 103 UFC/g ou mL Diluio 10-3 (1:1.000) Mdia das contagens: 38 UFC Resultado: 38 x 1.000 = 38.000 = 3,8 x 104 UFC/g ou mL O resultado final ser expresso considerando-se os dois primeiros algarismos representativos, separados por vrgula. Os algarismos subseqentes, quando existirem, devero ser arredondados e transformados em potncia de 10. 3.2 Arredondamento de resultados: Quando se fizer necessrio, e visando no criar uma falsa idia de preciso, aplicar a seguinte regra para a aproximao dos resultados: 3.2.1 Arredondar para cima o segundo algarismo ou o subseqente quando o algarismo imediatamente aps for superior a 5. Exemplo: Diluio 10-2 Mdia das contagens: 186 UFC Arredondando-se o terceiro algarismo para cima tem-se como resultado: 190 x 100 = 19.000 = 1,9 x 104 UFC/g ou mL 3.2.2 Arredondar para baixo o segundo algarismo ou o subseqente quando o algarismo imediatamente aps for inferior a 5. Exemplo: Diluio 10-2 Mdia das contagens: 184 UFC Arredondando o terceiro algarismo para baixo tem-se como resultado: 180 x 100 = 18.000 = 1,8 x 104 UFC/g ou mL 3.2.3 Nos casos em que o terceiro algarismo ou o subseqente for igual a cinco, arredondar para baixo quando o segundo ou o subseqente for menor ou igual a 5 e para cima quando for maior que 5. Exemplos: Diluio 10-2 Mdia das contagens: 185 UFC Arredondando o terceiro algarismo para cima tem-se como resultado: 190 x 100 = 19.000 = 1,9 x 104 UFC/g ou mL Mdia das contagens: 145 UFC Arredondando o terceiro algarismo para baixo tem-se como resultado: 140 x 100 = 14.000 = 1,4 x 104 UFC/g ou mL Mdia das contagens: 155 UFC Arredondando o terceiro algarismo para baixo tem-se como resultado: 150 x 100 = 15.000 = 1,5 x 104 UFC/g ou mL 3.2.4 Arredondamento de resultados obtidos pela contagem de placas em duplicata de duas diluies diferentes. Nas contagens de placas de duas diluies diferentes, o procedimento de arredondamento semelhante ao da contagem de mesma diluio, isto , s poder ser efetuado aps o clculo da mdia das contagens, que ser explicado a seguir nas regras especficas para contagem de colnias. 3.3 Resultados estimados Nas contagens, em que em todas as placas o nmero de colnias encontrado estiver fora do intervalo de preciso e repetibilidade da metodologia aplicada, incluir no registro do resultado final a expresso "estimado" ou "por estimativa, por meio da abreviatura " est.", aps o g ou mL. Quando houver condies para efetuar a contagem, expressar o nmero obtido. Pode-se ainda expressar o resultado como o limite inferior com o sinal de menor ou o superior com o

sinal de maior, por estimativa ou estimado. Exemplos, com limite entre 15 e 150: Diluio 10-2 Mdia das contagens:160 UFC Resultado: 160 x 100 = 16.000 = 1,6 x 104 UFC/g ou mL est. ou >1,5 x 104 UFC/g ou mL est. Mdia das contagens: 11 UFC Resultado: 11 x 100 = 1.100 = 1,1 x 103 UFC/g ou mL est. ou <1,5 x 103 UFC/g ou mL est. Nas contagens de amostras lquidas inoculadas diretamente, ou seja, diluio 100, quando no houver crescimento ou a contagem for menor que 10 UFC, o resultado ser expresso por estimativa e na potncia 100. Caso a contagem seja superior a 10 UFC o resultado ser expresso de acordo com o nmero obtido, ou seja, potncia de 101 ou 102. Exemplo 1 Diluio 100: Intervalo de seleo: 15 a 150 N de colnias contadas:12 Resultado: 12 x 1 = 12 = 1,2 x 101 UFC/mL est. ou <1,5 x 101 UCF/mL est. Exemplo 2 Diluio 100: Intervalo de seleo: 15 e 150 N de colnias contadas: 232 Resultado: 232 x 1 = 232 = 2,3 x 102 UFC/mL est. ou > 1,5 x 102 UFC/mL est. 4. REGRAS ESPECFICAS PARA CONTAGEM DE COLNIAS As contagens se realizam de maneira similar para os casos em que os limites de nmeros de colnias para as placas selecionadas se encontram em diversos intervalos como 15 a 150, 20 a 200, 30 a 300 ou outro. 4.1 Situaes nas quais o nmero de colnias, nas diversas diluies, se encontra dentro dos limites do intervalo de preciso e de respetibilidade. Para os exemplos abaixo, foi considerada a seleo de placas com nmero de colnias contido no intervalo de preciso e repetibilidade de 25 a 250 colnias. 4.1.1 Mesma diluio - placas em duplicata. Calcular a mdia aritmtica dos resultados encontrados e multiplicar pela diluio correspondente. Exemplo: Dil: 10-3 = 130 colnias Dil: 103 = 224 colnias (130 + 224) /2 = 177 x 1.000 = 177.000 > 180.000 UFC Resultado: 1,8 x 105 UFC/g ou mL 4.1.2 Diluies Diferentes Multiplicar o resultado encontrado em cada placa pela respectiva diluio e calcular a mdia aritmtica. Exemplo: Dil: 10-3 = 210 colnias 210 x 1.000 = 210.000

Dil: 10-4 = 32 colnias 32 x 10.000 = 320.000 Fazer a mdia das diluies diferentes (210.000 + 320.000) /2 = 265.000 > 270.000 Resultado: 2,7 x 105 UFC/g ou mL 4.2 Situaes nas quais o nmero de colnias se encontra dentro dos limites do intervalo de preciso e de repetibilidade em uma s diluio. Para os exemplos abaixo, foi considerada a seleo de placas com nmero de colnias contido no intervalo de preciso e repetibilidade de 25 a 250 colnias. Quando, nas diversas diluies, o nmero de colnias em uma diluio encontra-se dentro do limite de 25 a 250 colnias e na outra diluio encontra-se fora deste limite, o resultado no ser expresso como estimado. 4.2.1 Mesma Diluio - placas em duplicata Calcular a mdia aritmtica dos resultados encontrados e multiplicar pela diluio correspondente. Exemplo: Dil: 10-3 = 230 colnias Dil: 10-3 = 261 colnias (230+261) /2 = 245,5 x 1.000 = 245.500 _ 240.000 Resultado: 2,4 x 10-5 UFC/g ou mL 4.2.2 Diluies diferentes Exemplo 1: Dil: 10-3 = 232 colnias 232 x 1.000 = 232.000 Dil: 10-4 = 15 colnias 15 x 10.000 = 150.000 (232.000 + 150.000) /2 = 191.000 Resultado final: 1,9 x 105 UFC/g ou mL Exemplo 2: Dil: 10-3 = 270 colnias 270 x 1.000 = 270.000 Dil: 10-4 = 29 colnias 29 x 10.000 = 290.000 (270.000 + 290.000) /2 = 280.000 Resultado final: 2,8 x 105 UFC/g ou mL 4.3 Situaes nas quais as placas apresentam resultados de contagem acima do intervalo de preciso e repetibilidade 4.3.1 Quando for possvel realizar a contagem em pelo menos uma das placas: Para os exemplos abaixo, foi considerada a seleo de placas com nmero de colnias contido no intervalo de preciso e repetibilidade de 25 a 250 colnias. Quando todas as placas apresentarem mais de 250 colnias na maior diluio, multiplicar o resultado encontrado em cada placa pelas respectivas diluies e calcular a mdia aritmtica. Expressar o resultado como estimado. Exemplo: Dil: 10-4 = 380 colnias 380 x 10.000 = 3.800.000 Resultado: 3,8 x 106 UFC/g ou mL est. 4.3.2 Quando o nmero for excessivamente alto para contar Nunca expressar o

resultado como muito numeroso para contar ou TNTC (too numerous to count). Escolher pores da placa que sejam representativas da distribuio das colnias em toda placa e estimar o nmero de colnias presentes. 4.3.2.1 Se houver menos de 10 colnias por cm2 Contar as colnias em 12 cm2 selecionando 6 quadrados consecutivos dispostos horizontalmente e 6 quadrados consecutivos dispostos em ngulo reto com os quadrados horizontais escolhidos. Somar as contagens obtidas nos 12 quadrados e dividir o valor obtido por 12, de forma a obter a mdia de colnias por cm2 da placa. Multiplicar o valor encontrado para cada cm2 pela rea da placa utilizada (placas padro de plstico de 15 x 100 mm possuem rea aproximada de 56 cm2) e, finalmente, multiplicar pela diluio usada. Expressar o resultado como estimado. Exemplo: rea das placas: 56 cm2 Maior diluio inoculada: 10-3 Quadrado Quadrado Quadrado Quadrado 1: 2: 3: 4: 7 7 6 8 colnias colnias colnias colnias Quadrado Quadrado Quadrado Quadrado 5: 6: 7: 8: 6 8 8 8 colnias colnias colnias colnias Quadrado 9: 8 colnias Quadrado 10: 6 colnias Quadrado 11: 9 colnias Quadrado 12: 7 colnias

7+7+6+8+6+8+8+8+8+6+9+7 = 88/12 = 7,3 UFC por cm2 7,3 x 56 x 1.000 = 408.800 Resultado final = 4,1 x 105 UFC/g ou mL estimado. 4.3.2.2 Quando o nmero de colnias por cm2 exceder a 10 Contar as colnias em 4 quadrados representativos, somar os valores encontrados e dividir por 4 para obter a mdia de colnias por cm2 da placa. Multiplicar o valor encontrado para cada cm2 pela rea da placa utilizada (placas padro de plstico de 15 x 100 mm possuem rea aproximada de 56 cm2) e, finalmente, multiplicar pela diluio usada. Expressar o resultado como estimado. Exemplo: rea das placas: 56 cm22 Maior diluio inoculada: 10-3 Quadrado 1: 35 colnias Quadrado 2: 40 colnias Quadrado 3: 32 colnias Quadrado 4: 37 colnias 35 + 40 + 32 + 37 = 144 / 4 = 36 UFC por cm2 36 x 56 x 1.000 = 2.016.000 Resultado final = 2,0 x 106 UFC/g ou mL est. 4.3.2.3 Quando o nmero de colnias por cm2 exceder a 100 Multiplicar a rea da placa por 100 e aps multiplicar pela maior diluio usada. Expressar o resultado como maior que (>) o nmero obtido. Exemplo: Placa de rea de 56 cm2. Diluies usadas: 10-2, 10-3 e 10-4. Observou-se mais de 100 colnias por cm2 nas placas onde foi inoculada a maior diluio. 56 x 100 x 10.000 = 56.000.000 Resultado final = > 5,6 x 107 UFC/g ou mL est. OBS: Nas situaes descritas acima, nos itens 4.2 e 4.3, o resultado tambm pode ser expresso como maior que 250 vezes amaior diluio utilizada. Expressar o resultado como nmero estimado. Exemplo:

10-2 (> 250) 10-3 (> 250) = > 2.500.000 10-4 (> 250) Resultado: > 2,5 x 106 UFC/g ou mL est. 4.4 Placas com colnias invasoras 4.4.1 Quando a rea invadida exceder 1/4 da rea total, expressar o resultado como "presena de colnias invasoras". 4.4.2 Quando a rea invadida for inferior a 1/4 da rea total, contar tanto as invasoras como as normais. Quando as colnias invasoras estiverem aglutinadas, contar como uma colnia e quando estiverem isoladas, contar uma a uma. 4.5 Contagem incoerentes Quando o resultado da contagem da maior diluio for duas ou mais vezes maior que o resultado obtido na diluio anterior, ou o da menor diluio for duas ou mais vezes maior que o resultado obtido na diluio posterior, considerar como resultado final o valor da menor diluio. Exemplo 1: Dil: 10-2 = 140 colnias (14.000) Dil: 10-3 = 52 colnias (52.000) Resultado: 1,4 x 104 UFC/g ou mL Exemplo 2: Dil: 10-2 = 95 colnias (9.500) Dil: 10-3 = 2 colnias (2.000) Resultado: 9,5 x 104 UFC/g ou mL 4.6 Situaes nas quais todas as placas encontram-se com nmeros de colnias abaixo dos limites do intervalo de preciso e repetibilidade. Para os exemplos abaixo, foi considerada a seleo de placas com nmero de colnias contido no intervalo de preciso e repetibilidade de 25 a 250 colnias. Neste caso, o resultado deve ser expresso pelo nmero de colnias da placa de menor diluio, por estimativa. Exemplo: Dil: 10-2 = 21 UFC Dil: 10-3 = 2 UFC 21 x 100 = 2.100 Resultado 2,1 x 103 UFC/g ou mL est. 4.6.1 Situaes nas quais todas as placas no apresentem crescimento de colnias, independente do intervalo de seleo Quando em nenhuma placa for observado o crescimento de colnias, emitir o resultado como estimado: <1,0 vezes a menor diluio utilizada. Ex.: <1,0 x 101 UFC/g ou mL est. 4.7 Clculo de contagens quando necessria a confirmao de colnias Tpicas (T) e Atpicas (A) Verificar qual das situaes descritas anteriormente dever ser aplicada. Seguir a regra especfica para cada caso, contando e registrando, separadamente, colnias tpicas (T) e atpicas (A). 4.7.1 Quando todas as colnias repicadas so confirmadas pelos testes confirmativos O resultado final da contagem ser igual ao nmero obtido na contagem inicial multiplicado pela diluio (de acordo com o determinado pela regra de contagem aplicada). 4.7.2 Quando no se confirmam todas as colnias repicadas Quando o nmero de colnias confirmadas diferente do nmero de colnias repicadas, calcular o resultado final utilizando a seguinte frmula: R=Cxcxd R

R = Resultado C = nmero de colnias contadas c = nmero de colnias confirmadas r = nmero de colnias repicadas d = diluio utilizada Exemplo: Diluio 10-2 = 30 colnias contadas, das quais 20 eram tpicas e 10 atpicas. Para confirmao, foram repicadas 5 colnias de cada tipo. Quatro colnias tpicas e duas atpicas apresentaram resultado positivo nos testes confirmativos. Aplicando-se a frmula, teremos para colnias tpicas: RT 20 x 4 x 100 = 1.600 5 Aplicando-se a frmula, teremos para colnias atpicas: RA = 10 x 2 x 100 5 = 400 =

O resultado final ser igual soma das colnias tpicas e atpicas confirmadas: Resultado final = RT + RA = 1600 + 400 = 2000 = 2,0 x 103 UFC/g ou mL. 4.7.3 Quando for necessrio contar colnias tpicas e atpicas em placas de diferentes diluies Nunca somar colnias tpicas ou atpicas de diferentes diluies, pois colnias atpicas em uma determinada diluio podero se apresentar tpicas em diluies subseqentes. Submeter aos testes confirmativos, segundo a metodologia especfica para cada caso, 3 a 5 colnias tpicas e 3 a 5 colnias atpicas da diluio escolhida. Calcular o nmero de UFC/g ou mL somente aps a confirmao de cada tipo (T e A) em uma mesma diluio. Exemplo: Diluio 10-2 = 240 colnias contadas, das quais 50 eram tpicas e 190 atpicas. Diluio 10-3 = 20 colnias tpicas e 5 atpicas. Como na diluio 10-3 o nmero de colnias se encontra fora do intervalo de preciso e repetibilidade, a diluio escolhida para confirmao foi 10-2. Destas, foram repicadas 5 colnias tpicas e 5 colnias atpicas. Todas as colnias tpicas e 4 atpicas apresentaram resultado positivo nos testes confirmativos. 10-2 RT = 50x5x100 = 5000 5 Aplicando-se a frmula, teremos para colnias atpicas: 10-2 RA = 190x4x100 = 15.200 5 Colnias confirmadas na diluio 10-2 = 20.200 colnias Resultado final ser a soma do nmero de colnias confirmadas Res final = 5.000 + 15.200 =

na diluio escolhida:

2,0 x104UFC/g ou mL.

5. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA BRASIL. Ministrio da Agricultura do Abastecimento e da Reforma Agrria. Secretaria de Defesa Agropecuria. Departamento de Defesa Animal. Manual de mtodos microbiolgicos para alimentos. Coordenao Geral de Laboratrio Animal. 1991/1992 2 reviso. 136p. SWANSON, K.M.J.; PETRAN, R.L.; HANLIN,J.H. Culture methods for enumeration of microorganisms In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p.53-62.