Tecnologia do DNA recombinante

DNA recombinante Clonagem

DNA recombinante
DNA recombinante: as molculas de DNA que contm segmentos ligados covalentemente, derivados de duas ou mais fontes de DNA A produo de DNA recombinante requer corte e emenda de duas fitas de DNA de maneiras muito especficas O corte realizado por endonucleases de restrio

CLONAGEM o processo de produo de cpias idnticas de um DNA

1) Enzimas de restrio
- Fenmeno de modificao de restrio controlada pelo hospedeiro - Bacterifagos x bactrias -1962: modelo para explicar o fenmeno de restrio: DNA no protegido era degradado (restringido) por endonucleases -Proteo = Metilao (adio de um grupo metila na base A e/ou C)

Enzimas de restrio descobertas em 1970 (Prmio Nobel, 1986)

Endonuclease de restrio [ou enzima de restrio(ER)] Endo = dentro; nuclease= quebra, cliva ou corta cidos nuclicos (DNA)

Enzimas que catalisam a clivagem de ligaes fosfato dentro da molcula de DNA.

DNA so duas fitas de polinucleotdeos onde os monmeros so ligados por pontes fosfodisteres. Estas ligaes ligam o carbono 3' na ribose de um deoxinucleotdeo com o carbono 5' da ribose adjacente. Extremidades geradas por Enzimas de Restrio: Geralmente geram extremidades 5-fosfato e 3-hidroxila As extremidades protusas 5fosfato ou 3-hidroxila podem ser posteriormente aneladas e ligadas se os finais so compatveis

Nomenclatura das Enzimas de Restrio:

Primeira Letra maiscula = gnero Segunda e terceira letras = espcie Letra adicional = cepa da bactria se no for tipo selvagem Nmero em algarismo romano = nmero da enzima descoberta Ex.: a enzima EcoRI foi descoberta em Escherichia coli, cpa RY13, e foi a primeira enzima de restrio identificada naquela espcie (por isto a designao I).

Propriedade das ER = Palndrome

blunt

sticky

Iso-esquismero
Enzimas derivadas de espcies diferentes mas que reconhecem a mesma sequncia XmaI (Xanthomonas malvacaerum) C^CCGGG PspAI (Pseudomonas species) C^CCGGG SacII CCGC/GG = Cfr42I, KspI, Sfr303I, SgrBI

http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/restriction.html

Frequncia de corte das enzimas de restrio

Se assumirmos que as quatro bases (A,T,G e C) nucleotdicas esto distribudas ao acaso dentro do DNA 4n, onde n o nmero de bases que a enzima reconhece Ex.: reconhece 4 pares de base, corta 1 vez a cada 64 nucleotdeos reconhece 8 pares de base, corta 1 vez a cada 65536 nucleotdeos

Verificao em Gel de Agarose

2) Vetores

- O que so? So fragmentos de DNA que se replicam em clulas vivas e foram engenheirados para poderem carregar um fragmento exgeno de DNA

Plasmdeo

2) Vetores
- Quais so os tipos de vetores?

CLONAGEM: se utilizados para multiplicar um fragmento de DNA: Plasmdeos, cosmdeos, bacterifagos, BACs e YACs EXPRESSO: se utilizados para expressar um certo gene (expresso de protenas recombinantes) Plasmdeos, baculovrus, leveduras...

Componentes principais de um Plasmdeo Quais as caractersticas principais? ORI (para sua replicao na bactria) MCS ou polylinker gene de resistncia antibitico(s)

Componentes principais de um vetor de expresso

* XhoI * XbaI * SmaI AMPr PROMOTOR Origem de replicao -Galactosidase

Stio de poliadenilao

* NotI

* stios nicos de clonagem

Bacterifago Lmbda ()
Proximidade de relao entre o fago e E. coli Alta capacidade de clonagem: 10 a 25kb Muito utilizado para confeco de bibliotecas de DNA genmico
45 kb

Left arm 15 kb

Right arm

Cosmdeos
E se um gene tem mais de 1000 kb ? Vetores hbridos, derivados de plasmdeos e fagos e podem carregar cerca de 45 kb de DNA exgeno

Muito utilizado para confeco de bibliotecas de DNA genmico

YACs
YAC = Yeast Artifitial Chromosome Vetor possui: Centrmero da levedura Sequncia para replicao do DNA da levedura iniciada Duas sequncias do telmero da levedura Marcador de seleo Stio de clonagem Sequncias so montadas num plasmdeo, digeridas e os fragmentos clonados e faz-se a transfeco em clulas de levedura YACs se comportam como cromossomos da levedura, seguindo a mitose da clula

BACs
BAC = Bacterial Artificial Chromosome Vetor Baseado num plasmdeo e usado para clonar em bactria geralmente E. coli, de 100 a 300 kb

Muito utilizado em vrios projetos Genoma

CAPACIDADE DE CLONAGEM DOS VETORES Vetor Plasmdeo Cosmdeo BAC YAC Inserto (pb) 2.000 - 10.000 40.000 70.000 - 300.000 > 300.000

Etapas da clonagem
1) Digesto

2) Ligao

DNA Ligase
Envolvida na replicao de DNA e de origem bacteriana ou viral sendo usada na clonagem (Ex. T4 DNA ligase) Liga a hidroxila e o grupo fosfato para formar uma ligao fosfodister (cada ligao requer 1 ATP para a reao) 5' -- G - OH DNA LIGASE ATP, Mg P - GATCC -- 3' >5'- GGATCC -- 3 HO- G 5' > 3' - CCTAGG -- 5

3' -- CCTAG - P

A reao funciona independentemente da fonte de DNA, se os finais podem ser ligados.

CLCULO DA RAZO MOLAR

1. Decidir quanto de vetor ser usado na ligao(ex.: 20ng) 2. Ver o quanto o vetor maior que o inserto Exemplo: voc tem 0,5kb do inserto e um vetor de 7,7kb 7,7kb/ 0,5 kb= 15 (como o vetor 15X maior que o inserto voc precisar 15X menos) 3. Ver quantas ng de inserto voc precisa para uma razo 1:3 de vetor: inserto Exemplo: 20ng/ 15X (tanto de vetor que voc est usando numa ligao) = 1,3ng de inserto para razo de 1:1, ento multiplicar por 3 para ter uma razo de 1:3)

Adaptadores ou Linkers:
ApaI ATCTGGGCC CGTCAG TAGAC CCGGGCAGTC SalI ATCTG TCGACGTCAG TAGACAGCT GCAGTC

ATCTGGGCC TAGAC

TCGACGTCAG GCAGTC

ATCTGGGCC TCGACGTCAG TAGACCCGGAGCTGCAGTC CCGGAGCT LINKER Apa-Sal

3) Transformao

+ antibiotic

Clonagem: condies para o sucesso

Nmero de fragmentos a serem clonados

Compatibilidade das extremidades: coesivas ou cegas

Nmero de stios de restrio /complementariedade: ligao direcional

Razo molar vetor: inserto

Clonagem via PCR

Clonagem via PCR

A A
3 5

4) Seleo de Transformantes Blue white screening

Vetor com LacZ -Galactosidase ( + = funcional) + IPTG (ativador da transcrio)

Sem inserto

Converte o substrato x-gal em cor azul

PARA CHECAR A CLONAGEM

PCR

Digesto com enzimas de restrio

Sequenciamento