UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEAR

CENTRO DE CINCIAS DA SADE MESTRADO ACADMICO EM CINCIAS FISIOLGICAS

ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA, EM DORES AGUDAS, DE UM NOVO FATOR OPIIDE DA SECREO CUTNEA DE Rhinella schneideri

ISABELLA FERNANDES CARVALHO

Orientador: Prof. Dr. Bruno Andrade Cardi

Fortaleza - CEAR 2008

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ISABELLA FERNANDES CARVALHO

ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA, EM DORES AGUDAS, DE UM NOVO FATOR OPIIDE DA SECREO CUTNEA DE Rhinella schneideri

Dissertao apresentada ao curso de Ps-Graduao em Cincias Fisiolgicas, do Centro de Cincias da Sade da Universidade Estadual do Cear, como requisito parcial para a obteno do ttulo de Mestre em Fisiologia.

Orientador: Prof. Dr. Bruno Andrade Cardi

Fortaleza CEAR 2008

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A citao de qualquer trecho desta tese permitida, desde que seja de conformidade com as normas da tica cientfica.

_____________________________________ ISABELLA FERNANDES CARVALHO

Banca Examinadora

_____________________________________ Prof. Dr. Bruno Andrade Cardi (Orientador/Presidente da Comisso)

_____________________________________ Prof. Dra. Gisela Costa Camaro

____________________________________ Prof. Dra. Silvnia Maria Mendes Vasconcelos

Fortaleza, 4 de abril de 2008.

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Ele, que me deu bem mais do que eu pensaria que poderia merecer... DEUS

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Aos meus pais Krishnamurti e Dris. Sem esse encontro sublime eu jamais teria existido... s minhas irms Denise, Anna e Ellaine... eternas amigas. Ao meu marido Paulo Trcio... pela admirao e amor construdos juntos.

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AGRADECIMENTOS

A Deus, fora sublime, energia plena, significado maior da existncia humana sinto sua presena. Ao Prof. Dr. Krishnamurti de Morais Carvalho, pela admirao ao seu potencial cientfico, sempre motivando seus alunos a amar a cincia de forma tica. Ao Prof. Bruno Cardi, pela orientao e competncia cientfica, sempre disposto a ajudar. Pelos seus conselhos na hora certa. Prof. Gisela, por ter aceito prontamente o convite para participar da minha banca, contribuindo com a sua competncia e seriedade. Prof. Silvnia, por ter aceito prontamente o convite para participar da minha banca, colaborando com a sua riqueza cientifica. Ao Paulo Trcio, meu grande amor e eterna inspirao para realizao de minhas conquistas. Dris, minha querida e amada me: meu grande espelho profissional e emocional. Denise, Anna Elise e Ellaine... irms amadas que souberam me incentivar para mais essa realizao; souberam entender muitas vezes o meu cansao. Aos colegas, Ana Carolina e Rebouas que no incio, alunos de iniciao cientfica, e hoje colegas de mestrado. Meu muito obrigada pelo apoio durante os experimentos, mostrando-se pessoas competentes, assduas e responsveis pelos seus propsitos. Aos colegas de mestrado, pelo companheirismo e amizade durante todo o curso. Aos professores do Mestrado conhecimentos cientficos de Fisiologia. que transmitiram grandes

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Rosa Germana pela grande colaborao nos experimentos do laboratrio. FUNCAP, pelo financiamento que gerou esse trabalho.

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SUMRIO

LISTA DE ABREVIAES LISTA DE FIGURAS RESUMO ABSTRACT

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1. INTRODUO 1.1 Nocicepo 1.2 Vias neuronais envolvidas na percepo da dor 1.3 Principais mecanismos e neurotransmissores envolvidos na modulao da dor 1.4 Analgsicos opiides 1.5 Venenos de anfbios como fonte de novas substncias biologicamente ativas 1.5.1 Generalidades 1.5.2 A pele, os produtos secretados da pele e as glndulas cutneas dos anfbios 1.5.3 Bufadienoldeos 1.5.4 Os bufadienoldeos so substncias endgenas do homem? 2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral 2.2 Objetivos especficos 3. METODOLOGIA

Pg 01 Pg 01 Pg 02 Pg 09 Pg 14 Pg 22 pg 22 pg 24 pg 30 pg 30 Pg 32 Pg 32 Pg 32 Pg 33

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3.1. Materiais 3.1.1 Substncias e reagentes 3.1.2 Aparelhos e Instrumentos 3.2. Mtodos 3.2.1 Animais 3.2.2 Extrao da secreo das glndulas parotides de Rhinella schneideri 3.2.3 Purificao 3.2.4 Preparao de soluo da frao analgsica para ensaios in vivo 3.2.5 Determinao parcial da estrutura qumica do fator 3.3. Modelos experimentais 3.3.1 Teste de contores abdominais induzidas por cido actico 3.3.2 Teste da formalina 3.3.3 Teste da placa quente 3.3.4 Teste do tail flick 4. ANLISE ESTATSTICA 5. RESULTADOS 5.1 Teste de contores abdominais induzidas por cido actico 5.2 Teste da formalina

Pg 33 Pg 33 Pg 33 Pg 34 Pg 34 Pg 35 Pg 37 Pg 40 Pg 40 Pg 40 Pg 40 Pg 43 Pg 45 Pg 48 Pg.49 Pg.50 Pg.50

Pg.54

5.3 Teste da placa quente

Pg.62

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5.4. Teste do tail flick 6. DISCUSSO 7. CONCLUSES 8. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

Pg.66 Pg.70 Pg.78 Pg.79

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LISTA DE ABREVIATURAS

C - graus Clsius 5-HT serotonina AMPc - adenosina monofosfato cclico ATP adenosina trifosfato Ca+ - clcio DMSO - dimetil sulfxido - delta g - grama (s) GLU - glutamato h - hora (s) HPLC - cromatografia lquida de alta eficincia iv - intravenosa k kappa K+ - potssio Kg - quilograma (s) mg - miligrama (s) min - minuto (s) ml - mililitro (s) ms - milisegundo (s) NRM - ncleo da rafe magna NO - xido ntrico NRPG - ncleo reticular paragigantocelular PAG - rea cinzenta periaquedutal PG prostaglandinas p:p peso por peso p:v - peso por volume seg - segundo (s)
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SG - substncia gelatinosa SNC - sistema nervoso central SP - substncia P - mu l - microlitro (s)

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1.

Terminao de fibras aferentes nas seis lminas do corno

posterior da medula espinhal.

Figura 2. Resumo dos mecanismos modulatrios na via nociceptiva.

Figura 3. Localizao dos neurnios aferentes.

Figura 4. Diagrama esquemtico do sistema de controle da comporta.

Figura 5. Sistema de controle descendente.

Figura 6. Sistema descendente de vias opiides que podem diminuir os sinais aferentes.

Figura 7. Locais de ao dos opiides na medula espinhal.

Figura 8. Os opiides ativam pr e ps-sinapticamente os RaPGs-7 transmembrana ao longo das vias transmissoras da dor.

Figura 9. A morfina e os compostos relacionados (opides).

Figura 10. Sapo Rhinella schneideri.

Figura 11. Extrao da secreo cutnea de Rhinella schneideri por compresso das glndulas parotides.

Figura 12A. HPLC: Cromatografia Lquida da Alta Performance.

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Figura 12B. Cromatografia Lquida de Alta Performance (HPLC). Figura 13. Injeo intraperitoneal de cido actico (0,8%).

Figura 14. Contoro abdominal induzida pelo cido actico (0,8%).

Figura 15. Injeo intraplantar de formalina (4%) na pata de camundongo.

Figura 16. Placa Quente sendo calibrada para 51 C +1 C.

Figura 17. Animal lambendo a pata no teste da placa quente.

Figura 18. Efeito do fator no teste de contores abdominais (i.p.).

Figura 19. Efeito do naloxone na ao antinociceptiva do fator no teste de contores abdominais.

Figura 20. Efeito do fator no teste de contores abdominais (v.o.).

Figura 21: Efeito do fator no teste da formalina na fase 1 (i.p.).

Figura 22: Efeito do naloxone na ao antinociceptiva da morfina e do fator no teste da formalina na fase 1.

Figura 23: Efeito do fator no teste da formalina na fase 1 (v.o.).

Figura 24: Efeito do fator no teste da formalina na fase 2 (i.p.).

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Figura 25: Efeito do naloxone na ao antinociceptiva da morfina e do fator no teste da formalina na fase 2.

Figura 26: Efeito do fator no teste da formalina na fase 2 (v.o.).

Figura 27: Efeito do fator no teste da placa quente (i.p.).

Figura 28: Efeito do naloxone na ao antinociceptiva da morfina e do fator no teste da placa quente.

Figura 29: Efeito do fator no teste da placa quente (v.o.).

Figura 30: Efeito do fator no teste do tail flick (i.p.).

Figura 31: Efeito do naloxone na ao antinociceptiva da morfina e do fator no teste do tail flick .

Figura 32: Efeito do fator no teste do tail flick (v.o.).

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RESUMO Os agonistas opiides representam um grupo de drogas utilizado terapeuticamente para aliviar as dores agudas intensas e crnicas em pacientes terminais, apesar de apresentarem efeitos colaterais de tolerncia e dependncia psicolgica e fsica. Os pesquisadores continuam na busca de novas drogas analgsicas to potentes quanto a morfina e com menos efeitos colaterais. O veneno dos anfbios Rhinella schneideri extremamente rico em substncias biologicamente ativas secretadas das glndulas parotodes, que tm sido bastante estudadas na tentativa de desenvolvimento de novas drogas teraputicas. Este estudo teve como objetivo estudar os efeitos antinociceptivos, em dores agudas, de um fator isolado da secreo das glndulas parotides de Rhinella schneideri. No presente trabalho, purificamos um novo fator da secreo cutnea de Rhinella schneideri e testamos sua atividade antinociceptiva em quatro modelos experimentais clssicos de dores agudas em camundongos: o teste de contores abdominais, o teste da formalina, o teste da placa quente e o teste do tail flick. Em todos os testes foram utilizadas as vias de administrao intraperitoneal, onde as doses do fator utilizadas foram de 1, 2 e 5mg/Kg; e a via oral com doses de 2, 5 e 10mg/Kg. No teste de contores abdominais por cido actico, o fator inibiu significativamente o nmero de contores abdominais em relao ao controle, de forma dosedependente e foi cerca de 50% mais potente do que a morfina (5mg/Kg), quando comprado mol a mol. No teste da formalina, o fator diminuiu significativamente o tempo de reao em relao ao controle, nas fases 1 e 2, observando-se um efeito dose-dependente e foi cerca de 114% mais potente na fase 1 e 61% mais potente na fase 2 do que a morfina. No teste da placa quente, o fator aumentou significativamente o tempo de permanncia do animal sobre a placa, em relao ao controle, observandose um efeito dose-dependente com provvel ao no SNC e foi cerca de 252% mais potente que a morfina. No teste do tail flick, o fator aumentou significativamente o tempo de imerso da cauda em Banho Maria em relao ao controle, observando-se um efeito dose-dependente e de ao medular, e foi cerca de 80% mais potente que a morfina. Os efeitos antinociceptivos do fator foram revertidos pelo naloxone (5mg/Kg) em todos os testes usados acima, mostrando o envolvimento do sistema opiide em seu mecanismo de ao. Os efeitos antinociceptivos foram tanto perifricos como centrais (crebro e medula) e atuaram em dores agudas de origem neurognica e inflamatria. Este fator poder, no futuro, ser utilizado como modelo para desenvolvimento de novas drogas analgsicas.

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Palavras-chaves: Antinocicepo, dor aguda, anfbios.

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ABSTRACT

The opioid agonists are used in treatment of intense acute pains and chronic pains in terminal patients, although they present important side effects, such as tolerance and physical and psychological addiction. Thus, several researches are take care actually to development new opioids more potent than morphine and without these side effects. The venom of amphibians Rhinella schneideri is extremely rich in biological activity substances secreted from parotoid glands, that have been extensively studied to development of new therapeutics. This paper objective study antinociceptive effects in intense acute pains and chronic pains of a new factor from skin secretions of Rhinella schneideri. We purified a new factor from skin secretions of Rhinella schneideri, which presented intense antinociceptive activity in animal models of experimental acute pain: the acid acetic writing assay, the formalin test, the hot plate test and the tail flick test. In these tests, it was used 1, 2 and 5mg/Kg from the factor by oral route and 2, 5 and 10mg/Kg by intraperitoneal route. In the acid acetic writing assay, the factor reduced significantly the number of contortions, showing a dose-dependent effect, and it was 50% more potent than morphine (5mg/Kg), mol to mol. In the formalin test, the factor reduced significantly the time of response in phases 1 and 2, showing dosedependent effects and it was 114 and 61% more potent than morphine in phases 1 and 2, respectively. In the hot plate test, the factor increased significantly the time of permanence on the hot plate, showing a dosedependent effect and it was 252 % more potent than morphine. In the tail flick test, the factor increased significantly the time of permanence of the tail in hot water, showing a dose-dependent effect and it was 80 % more potent than morphine. These results show that the factor injected by i.p. and v.o. routes presented antinocicetive action involving the opioid system in experimental models of acute pains in mice. These antinocicetive effects were peripheral and central and acted in neurogenic and inflammatory acute pains. In the future, this factor could be used for development of new therapeutics.

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Key Words: antinociception, acute pain, amphibians.

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1. INTRODUO

1.1 Nocicepo

A Associao Internacional para o Estudo da Dor (IASP) descreve a dor como uma experincia sensorial e emocional desagradvel, com leso tecidual ativa ou potencial, ou descrita em termos de tal dano. Essa sensao desagradvel faz parte da percepo da dor, sendo altamente subjetiva e influenciada por fatores comportamentais, fisiolgicos, sensoriais e emocionais, o que responsvel pela grande variao individual na resposta sensao de dor (MESRKEY et al., 1979; GOODMAN & GILMAN'S, 2007).

A dor um sinal de alarme que o Sistema Nervoso Central utiliza para sinalizar um processo de agresso ao organismo, com risco para sua integridade fsica. Esse alarme desencadeia um conjunto de reaes de adaptao, de ordem psicofisiolgica, autnoma e motora, visando afastar o organismo do agente agressor. A percepo da dor tambm chamada de nocicepo, sendo um alerta individual de percepo ou sensao de dor (CHAPMAN et al., 1999; GOZZANI, 2002).

De acordo com a durao, a dor pode ser classificada em aguda ou crnica. A dor aguda de curta durao e est relacionada leso recente nos tecidos do corpo e a sua intensidade geralmente proporcional extenso dessa leso. Neste tipo de dor, o sistema nervoso simptico ativado, causando aumento da freqncia cardaca e respiratria, elevao da presso arterial, dilatao pupilar e hiperglicemia. A dor crnica persiste por mais de seis meses alm do tempo esperado de resoluo da condio

clnica que motivou a ocorrncia da dor (MELZACK et al., 1999; FRST, 1999; CLAYTON & STOCK, 2006).

Fisiopatologicamente, a dor tambm pode ser classificada em nociceptiva, neuroptica e idioptica. A dor nociceptiva o resultado de um estmulo (p.ex., trmico, qumico) nos receptores de dor, podendo ser somtica, se sua origem for a pele, ossos ou msculos, ou pode ser visceral se for originada nos rgos abdominais e torcicos. A dor neuroptica resulta da leso no sistema nervoso central ou perifrico. J a dor idioptica, uma dor inespecfica de origem desconhecida (BOWSHER, 1999; MILLAN, 1999; GALLUZZI, 2007).

1.2 Vias neuronais envolvidas na percepo da dor

As vias da transmisso lgica do local da injria at o crebro para o processamento e a ao reflexa, ainda no foram totalmente identificadas. Sabe-se que a dor relaciona-se atividade eltrica nas fibras aferentes primrias de pequeno dimetro dos nervos perifricos, chamados nociceptores - estruturas ramificadas e no-mielinizadas, que sinalizam quando o tecido corporal est sendo lesionado ou em risco de sofrer leso. Os nociceptores podem ser ativados por vrios estmulos, tais como: trmicos, mecnicos e qumicos. Eles esto presentes na maioria dos tecidos corporais, incluindo a pele, os ossos, os msculos, a maior parte dos rgos internos, os vasos sanguneos e o corao, estando ausentes no encfalo, embora sejam encontrados nas meninges (CESARE & MCNAUGHTON, 1997; BEAR et al., 2002; HOPLEY & SCHALKWYK, 2006).

A sensibilizao dos nociceptores aferentes acontece quando algumas substncias como a serotonina, a bradicinina, a histamina e os eicosanides so liberados nos terminais dos receptores, em resposta a leses teciduais. Estas substncias se ligam membrana do nociceptor e ativam um sistema de segundo mensageiro, que por sua vez sensibiliza a terminao (FRST, 1999; BERNE & LEVY, 2004).

Existem dois tipos principais de fibras aferentes que conduzem os estmulos gerados nos nociceptores at a medula espinhal: as fibras C nomielinizadas ou nociceptores polimodais C e as fibras mielinizadas A-delta (A). Os corpos celulares dessas fibras situam-se nos gnglios da raiz dorsal da medula espinhal. As fibras A-delta so mielinizadas e de conduo rpida. J as fibras C so amielinnicas e tm velocidade de conduo mais lenta, com algumas atuando como quimiorreceptores. As fibras A esto distribudas pela pele e nas membranas mucosas e as fibras C esto largamente distribudas nos tecidos e na pele (Figura 1) (CARVALHO & VIANNA, 1994; GRUBB, 1998).

Figura 1. Terminao de fibras aferentes nas seis lminas do corno posterior da medula espinhal (RANG et al., 2008).

A ativao do terminal do nociceptor envolve a liberao de algumas substncias qumicas que atuam sobre as terminaes nervosas, seja ativando-as diretamente ou potencializando sua sensibilidade a outras formas de estimulao. As fibras aferentes sintetizam uma variedade de substncias envolvidas na transmisso central e na modulao da informao nociceptiva. Esto includos: o glutamato (GLU) e outros aminocidos excitatrios; os neuropeptdeos, como a substncia P (SP) e o peptdeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP); a universal fonte de energia celular, adenosina-trifosfato (ATP); o gs difusvel, xido ntrico (NO); os metablitos fosfolipdicos, como as prostaglandinas (PGs) e as neurotrofinas (fatores de crescimento); dentre outros (AZKUE et al, 1997; MILLAN, 1999).

A substncia P membro da famlia das taquicininas e se expressa em neurnios aferentes nociceptivos, sendo liberada em suas terminaes perifricas e centrais. Na periferia, participa da inflamao neurognica e, no corno posterior, est envolvida na sensibilizao central. A substncia P apresenta-se algumas vezes ligada a receptores acoplados protena G e associados com a formao de segundos mensageiros, como as protenas quinases A, C e G, o monofosfato cclico de adenosina (AMPc) e o clcio mobilizado (Figura 2) (MILLAN, 1999; HOPLEY & SCHALKWYK, 2006).

Figura 2. Resumo dos mecanismos modulatrios na via nociceptiva (RANG et al., 2008).

O estmulo das fibras aferentes primrias promove rpidos potenciais ps-sinpticos nos neurnios do corno dorsal da medula, os quais so mediados principalmente pelo glutamato. Este o principal

neurotransmissor que comunica os neurnios aferentes perifricos com os neurnios do corno dorsal. O GABA liberado por interneurnios da medula espinhal e inibe a liberao de transmissor por terminaes aferentes primrias no corno posterior. A noradrenalina o transmissor da via inibitria. A adenosina desempenha papel duplo: ativa os receptores A1, causando analgesia, e ativa os receptores A2 causando o inverso (AZKUE et al, 1997; NESTLER et al., 2001).

A transmisso da dor explicada classicamente, atravs de uma via bastante conhecida. Os neurnios nociceptivos primrios fazem sinapse com os neurnios de segunda ordem no corno dorsal da medula espinhal, predominantemente na lmina II. Os neurnios de segunda ordem cruzam a medula espinhal para ascender o trato espinotalmico, projetando suas fibras terminais principalmente ao tlamo. No tlamo, os neurnios de terceira ordem emitem axnios atravs da cpsula interna ao crtex somatosensor, aonde a somatizao do estmulo nocivo ocorre, ou emitem axnios ao giro cingulado anterior, aonde existe o componente emocional da dor (Figura 3) (RUSSO & BROSE, 1998; GOODMAN & GILMAN'S, 2007).

Figura 3. Localizao dos neurnios aferentes. Os neurnios aferentes primrios terminam, principalmente, no corno dorsal da medula espinhal. Os neurnios secundrios atravessam a medula espinhal e ascendem em vias para o tlamo, o crtex cerebral e outros locais (BEYZAROV, 2006).

1.3 Principais mecanismos e neurotransmissores envolvidos na modulao da dor

Os estmulos nociceptivos podem ter sua transmisso controlada ou regulada, no intuito de reduzir o excesso de dor em algumas circunstncias. Dessa forma, existem dois tipos de controle: a regulao aferente que ocorre da transmisso perifrica para o crebro - e a regulao descendente na transmisso da resposta central para a periferia. Essa regulao vai determinar a intensidade com que a dor se manifestar (YAKSH et al., 1994; BERNE & LEVY, 2004).

O sistema de controle aferente regula a passagem de impulsos das fibras aferentes perifricas para o tlamo por intermdio de neurnios de transmisso oriundos do corno posterior da medula. Estes neurnios so denominados interneurnios inibitrios e esta funo deu origem ao termo Teoria do controle da comporta, proposta por Ronald MELZACK e Patrick WALL em 1965. A substncia gelatinosa do corno posterior rica em peptdeos opiides e receptores para opiides, podendo ser importante local de ao de frmacos semelhantes morfina (Figura 4).

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Figura 4. Diagrama esquemtico do sistema de controle da comporta. Este sistema regula a passagem de impulsos das fibras aferentes perifricas para o tlamo atravs de neurnios de transmisso originados no corno posterior (RANG et al., 2008).

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O outro sistema de regulao da transmisso da dor compreende a participao de vias descendentes no "mecanismo de controle da comporta", que controlam a transmisso de impulsos no corno dorsal. Uma parte essencial desse sistema descendente a rea cinzenta periaquedutal (PAG) do mesencfalo, pequena rea cinzenta que envolve o canal central, e que recebe impulsos de muitas regies cerebrais, incluindo o hipotlamo, o crtex e o tlamo. A principal via neuronal ativada pela estimulao da rea PAG dirige-se inicialmente para uma rea do bulbo prxima linha mdia, conhecida como ncleo da rafe magna (NRM). Todos os neurotransmissores envolvidos no controle inibitrio descendente da dor (tais como opiides endgenos, serotonina, encefalinas e noradrenalina) atuam nesta via diretamente ou atravs de interneurnios e, a partir da, percorre o funculo dorsolateral da medula espinhal, formando conexes sinpticas com os interneurnios do corno dorsal, inibindo a descarga dos neurnios espinotalmicos atravs do ncleo reticular paragigantocelular (NRPG). Dessa forma, esse sistema inibitrio descendente faz parte de uma ala de retroalimentao reguladora, atravs da qual a transmisso pelo corno dorsal seja controlada de acordo com a quantidade de atividade que alcana o tlamo. Esta via provavelmente tambm local de importante ao de analgsicos opiides. Como o efeito impedido pela administrao concomitante do bloqueador naloxona, especfico para receptores opiides, interpreta-se que as drogas analgsicas administradas atuem ligando-se a receptores opiides daquelas reas (Figura 5 e 6) (BROMM & LORENZ, 1998; FURST, 1999; BEAR et al., 2002).

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Figura 5. Sistema de controle descendente, mostrando os principais locais de ao de opiides na transmisso dolorosa (RANG et al., 2008).

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Figura 6. Sistema descendente de vias opiides (endorfinas, encefalinas), 5-HT (p. ex., dos ncleos da rafe) e noradrenrgicas (p. ex., do lcus ceruleus) que podem diminuir os sinais aferentes (BEYZAROV et al, 2006).

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JESSEL & IVERSEN (1977) propuseram um modelo celular para explicar a modulao de neurnios da dor no corno dorsal da medula por neurnios serotoninrgicos do tronco cerebral. Os interneurnios encefalinrgicos, que estariam ligados via descendente serotoninrgica, exerceriam um controle pr-sinptico inibitrio sobre as fibras aferentes primrias que contm substncia P e seriam responsveis pelo estmulo doloroso. Com o bloqueio encefalinrgico sobre o neurnio aferente contendo substncia P, esta no seria liberada e no haveria o estmulo doloroso sobre as estruturas talmicas.

1.4 Analgsicos opiides

O termo opiide se refere a qualquer substncia, endgena ou sinttica, com efeitos similares aos da morfina, e que sejam bloqueados pelo antagonista narctico naloxona. Por conseguinte, utiliza-se a naloxona para verificar se a analgesia mediada ou no por mecanismo opiide (ARVIDSSON et al., 1995 a,b).

Os opiides endgenos so neuropeptdeos que ativam um dos vrios tipos de receptores para opiceos. So exemplos destes, a encefalina, a dinorfina e a -endorfina. Apesar de os opiceos apresentarem amplo espectro de ao, seu uso principal incide sobre o alvio da dor intensa e a ansiedade que a acompanha, em casos de ato cirrgico, leso ou molstia como o cncer (HARVEY & CHAMPE, 1998).

Os opiceos interagem especfica - e estereotacicamente com receptores proticos situados nas membranas de certas clulas do Sistema Nervoso Central, em terminais nervosos perifricos e em clulas do trato
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gastrintestinal. Esses receptores so divididos em trs principais grupos: receptores mu (), delta () e kappa () que respondem aos agonistas opiides. Acredita-se que os receptores sejam responsveis pela maioria dos efeitos analgsicos dos opiides; os receptores , provavelmente so mais importantes na periferia, mas tambm podem contribuir para a analgesia e os receptores k contribuem para a analgesia no stio espinhal. Em nvel molecular, os receptores opiides se acoplam s protenas G e assim, afetam a regulao dos canais inicos, modulam o processamento do Ca++ e alteram a fosforilao das protenas. Os opiides agem sobre os neurnios atravs de duas aes: fechando os canais de Ca++ regulados por voltagem nas terminaes nervosas pr-sinpticas e, portanto, reduzem a liberao de transmissor; e hiperpolarizam e, assim, inibem neurnios pssinpticos atravs da abertura dos canais de K+ (Figura 7 e 8) (GUTSTEIN et al., 1998; KATZUNG, 2006).

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Figura 7. Locais de ao dos opiides na medula espinhal. Os agonistas , , e reduzem a liberao de transmissor das terminaes pr-sinpticas de aferentes primrios nociceptivos. Os agonistas tambm hiperpolarizam os neurnios transmissores de dor de segunda ordem, ao aumentar a condutncia do potssio, produzindo um potencial ps-sinptico inibitrio (KATZUNG, 2006).

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Figura 8. Os opiides ativam pr e ps-sinapticamente os RaPGs-7 transmembrana ao longo das vias transmissoras da dor. Altas densidades de receptores opiides do tipo , , e so encontradas no corno dorsal da medula espinhal e nos centros superiores do SNC. Os efeitos celulares envolvem o aumento do efluxo de K+ neuronal (hiperpolarizao dos neurnios, tornando menos provvel sua resposta a estmulos dolorosos) e a inibio do influxo de Ca++ (diminuio da liberao de neurotransmissores pelos neurnios localizados ao longo da via transmissora da dor) (BEYZAROV et al, 2006).

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A morfina o principal frmaco analgsico encontrado no pio bruto e por isso o agonista prottipo dos receptores opiides. O mecanismo de ao da morfina envolve a interao da mesma com receptores opiides situados no sistema nervoso central e no trato gastrointestinal. Os opiceos causam hiperpolarizao das clulas neuronais, inibio do disparo nervoso e inibio pr-sinptica da liberao de transmissor. A morfina age em receptores, nas lminas I e II da substncia gelatinosa da medula espinhal, e diminui a liberao de substncia P, a qual modula a percepo da dor na medula espinhal. Ela tambm perece inibir a liberao de muitos transmissores dos neurnios terminais que recebem estmulos nociceptivos dor (Figura 9) (DHAWAN et al., 1996; HARVEY & CHAMPE, 1998).

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Figura 9. A morfina e os compostos relacionados (opides) imitam os efeitos dos neurotransmissores opioides endgenos endorfinas e encefalinas. Os receptores de opioides endgenos esto localizados ao longo das vias que transmitem o sinal de dor, dede sua fonte ate os centros nervosos superiores para processamento, avaliao e resposta. Vias descendentes, incluindo opiides endgenos, NE e 5-HT, modulam a transmisso do sinal de dor. Essas vias podem ser ativadas subconscientemente ou inconscientemente, o que pode contribuir para um grande efeito analgsico de placebo (BEYZAROV et al, 2006).

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Os principais efeitos farmacolgicos da morfina so: analgesia, euforia e sedao, depresso respiratria e supresso da tosse, nuseas e vmitos, constrio pupilar (miose), reduo da motilidade gstrica, levando constipao, e liberao de histamina, causando constrio brnquica e hipotenso. Os efeitos adversos mais problemticos so a constipao e a depresso respiratria (McQUAY, 1999; RANG et al., 2008).

Os opiides variam no apenas na sua especificidade para receptores, mas tambm na sua eficcia sobre os diferentes tipos de receptores. Assim, alguns agentes atuam como agonistas em um tipo de receptor e como antagonistas ou agonistas parciais em outros, produzindo um quadro farmacolgico muito complicado (SMITH & REYNARD, 1995; RANG et al., 2008), que pode ser dividido assim:

Agonistas puros possuem um efeito mximo para analgesia, e incluem a maioria das drogas tpicas semelhantes morfina. Ex: codena, metadona e dextropropoxifeno;

Antagonistas - drogas que no possuem atividade farmacolgica intrnseca, porm bloqueiam os efeitos dos agonistas. Ex: naloxona, naltrexona;

Agonistas parciais e agonistas-antagonistas mistos possuem baixa eficcia, combinam certo grau de atividade agonista e antagonista em diferentes receptores. Ex: nalorfina e pentazocina (KRAYCHETE, 2002; RANG et al., 2008).

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O desenvolvimento de tolerncia e dependncia fsica devido ao uso prolongado so caractersticas presentes em todas as drogas opiides conhecidas, e essas so as principais limitaes clnicas aos seus usos (JEFFE & MARTIN, 1996; OSSIPOV et al., 2003). Os opiides induzem tolerncia muito rapidamente, dependendo da dose, repetio e regularidade com que so administrados. Esse problema estende-se maioria dos efeitos farmacolgicos gerados, incluindo a analgesia (SMITH & REYNARD, 1995). Exposies prolongadas e repetidas aos agonistas opiides reduzem a responsividade da protena G acoplada a receptores opiides. Essa reduo na funo do receptor responsabilizada por contribuir para a tolerncia e a dependncia a opiides (NESTLER, 1992; VARGA et al., 2003).

A dependncia fsica est associada a uma sndrome de abstinncia fisiolgica, que se caracteriza por um quadro de variada sintomatologia refletindo um rebote exagerado dos efeitos farmacolgicos agudos dos opiides (CARVALHO & VIANNA, 1994). Os sinais e sintomas incluem rinorria, lacrimejamento, bocejos, calafrios, arrepios (piloereo), hiperventilao, hipertermia, midrase, dores musculares, vmitos, diarria, ansiedade e hostilidade (WAY et al., 2002).

A tolerncia e a dependncia a morfina so explicadas atravs do mecanismo bioqumico. A morfina inibe a adenilil-ciclase, reduzindo assim a formao do AMPc. Porm, com o desenvolvimento da tolerncia, ocorre elevao secundria da expresso da adenilil-ciclase, de modo que se recupera a produo de AMPc, ainda na presena da morfina. Com a suspenso do tratamento com a morfina, ocorre produo excessiva de AMPc, causando os sintomas de abstinncia, at que o nvel de expresso

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da adenilil ciclase retorne ao normal (McQUAY, 1999; RANG et al., 2008).

A morfina tambm produz acentuada dependncia psicolgica, manifestada na forma de desejo mrbido pela droga, que provavelmente mais importante do que a sndrome da abstinncia fsica como fator responsvel pela dependncia do ser humano - apesar de ser muito mais difcil de estudar (McQUAY, 1999; RANG et al, 2001).

1.5

Venenos

de

anfbios

como

fonte

de

novas

substncias

biologicamente ativas

1.5.1 Generalidades

O nome Anfbio provm do grego amphibio (amphi, dual e bios, vida) e corresponde s duas fases da vida dessa espcie de animais, uma na gua e outra na terra (DUELLMAN, 1992).

Os anfbios, filogeneticamente, localizam-se entre os peixes e os rpteis, sendo estes, os primeiros e os mais inferiores dos Tetrapoda e os primeiros Chordata a viver fora da gua (DUELLMAN, 1992; LAZARUS & ATTILA, 1993).

Os anfbios so membros da Classe Amphibia, Subfilo Vertebrata, Filo Chordata e Reino Animalia e se subdividem nas seguintes ordens: Anura ou Salientia (sapos, rs e pererecas), Urodela ou Caudata (salamandras e trites) e Apoda ou Gymnophiona (cobras-cegas ou Ceclias) (DUELLMAN & TRUEB, 1986, SEBBEN et al, 1993).
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Esses animais desenvolveram modificaes morfofisiolgicas para possibilitar sua incurso a terra. Desse modo, houve o desenvolvimento de pernas no lugar de nadadeiras, mesmo retendo ainda a capacidade de nadar; modificaes na pele para facilitar a respirao, embora com maior nfase na respirao pulmonar, geralmente com perda das brnquias nos adultos; modificaes no aparelho circulatrio para permitir a respirao pelos pulmes e pele; modificaes no metabolismo e na excreo para formar menos produtos nitrogenados txicos e aquisio de rgos dos sentidos, que funcionam tanto no ar como na gua (DUELLMAN, 1992).

Os anfbios possuem a capacidade de sobreviver em vrios tipos de habitat, o que pode ser atribuda evoluo de diferentes adaptaes morfolgicas, fisiolgicas, bioqumicas e comportamentais (CLARKE, 1996).

Estes animais so desprovidos de estruturas de defesa como espinhos, garras e dentes afiados, dessa forma desenvolveram um sistema especializado de glndulas cutneas que secretam veneno como proteo contra os predadores e microrganismos (MONTI & CARDELLO, 1994). Durante sua evoluo, esses mecanismos secretores foram essenciais para sua sobrevivncia em um novo habitat (LAZARUS & ATILLA, 1993).

Apesar da existncia de mecanismo secretor, os anfbios no possuem aparelho inoculador, sendo assim, do ponto de vista mdico, inofensivos ao homem, desde que no ingeridos ou que no haja contato direto do animal ou suas secrees, com mucosas. Entretanto, sabe-se que alguns anfbios secretam toxinas extremamente potentes (DUELLMAN, 1992; LAZARUS & ATTILA, 1993; SEBBEN et al., 1993; KARALLIEDDE, 1995), sendo os sapos da famlia Bufonidae; as rs, das famlias Atelopodidade,
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Dendrobatidae, Discoglossidae, Hylidae, Pipidae, Ranidae e certas salamandras do gnero Salamandra exemplos de tal toxicidade (DUELLMAN, 1992).

Os bufondeos pertencem famlia mais amplamente distribuda por todos os continentes, exceto na Austrlia, Madagascar e regies ocenicas e uma das mais numerosas famlias em espcies da classe Amphibia (ROSSI et al, 1997).

1.5.2 A pele, os produtos secretados da pele e as glndulas cutneas dos anfbios

A pele dos anfbios exerce vrias funes importantes, como a respirao, o transporte de gua e solutos, a regulao da temperatura corprea e a defesa contra microorganismos e predadores, constituindo-se um rgo (HABERMEHL, 1981; SEBBEN et al., 1993; CLARKE, 1996). Em funo de tais caractersticas, considera-se a pele dos anfbios como um dos principais fatores que garantiu a permanncia desses animais no ambiente terrestre (STEBBINS E COHEN, 1995).

Assim, a pele dos anfbios possui mecanismos fisiolgicos adaptativos voltados a evitar a dessecao e controlar a presso arterial, bem como componentes bioativos com atividade antibitica protegendo os animais de infeces bacterianas, virais e fngicas. Alm disso, alguns componentes atuam como mecanismo qumico de defesa frente a predadores (DUELLMAN, 1992).

A maioria dos componentes bioativos presentes na pele dos anfbios sintetizada pela pele. A exceo dos alcalides, que sofrem apenas
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elaborao e direcionamento cutneo aps virem da dieta (DALY, 1995), as demais substncias so sintetizadas por glndulas cutneas distribudas por toda a pele. As glndulas cutneas so de dois tipos, as mucosas e as granulosas (DUELLMAN, 1992). As mucosas normalmente so menores e mais numerosas que as granulosas e secretam um muco altamente hidroflico, facilitando a troca de gases entre a pele e o meio (TOLEDO E JARED, 1995). Esse muco possui um efeito defensivo, pois a sua viscosidade dificulta a apreenso do animal por predadores e tambm ser como camuflagem para ninhos contendo ovos. Apesar de no ter a funo de proteo qumica, em algumas dessas secrees verifica-se certa toxicidade (HABERMEHL, 1981, TOLEDO, 1984; MONTI &

CARDELLO, 1994). Alm disso, o muco controla o pH e o grau de umidade da pele, proporcionando condies adequadas para a respirao cutnea (TOLEDO E JARED, 1995).

As glndulas granulares localizam-se em diferentes reas do corpo do animal, podendo estar dispersas ou concentradas em uma determinada regio da pele, dependendo da espcie de anfbio (WHITEAR, 1977; TOLEDO & VILLA, 1987; REILLY et al., 1994). Nos sapos, como Rhinella Schneideri (sapo cururu, nordeste brasileiro), as glndulas parotides so evidentes atrs dos olhos e representam um acmulo de glndulas granulosas que estocam grande quantidade de secreo (Figura 10). Essas glndulas granulares parotides produzem e armazenam substncias bioativas que so liberadas sobre a pele do animal quando de sua compresso (SEBBEN et al., 1993).

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Figura 10. Sapo Rhinella schneideri. Observa-se, posteriormente abertura timpnica e aos olhos, a presena de um aglomerado de glndulas serosas, denominada glndula parotide (seta) (Foto realizada pelo grupo de coleta Laboratrio de Toxinologia e Neurofamacologia Molecular ISBM/UECE).

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A secreo granulosa a principal responsvel pela defesa qumica passiva dos anfbios pela sua toxicidade para algumas espcies de vertebrados (TOLEDO, 1984). As glndulas depletam 80-90% de seus contedos, como defesa comportamental frente a predadores, sendo tal secreo regulada por hormnios e mediada por neuropeptdeos. Aps a secreo do contedo glandular, mecanismos regenerativos na regio sincicial das glndulas iniciam imediatamente a reposio do contedo luminal, sendo que este processo pode levar de trs a quatro semanas, a depender da espcie em questo, bem como das condies ambientais e nutricionais dos animais (GIOVANNINI et al, 1987; IWAMURO et al, 1991).

Os produtos que estas glndulas granulares sintetizam e estocam incluem: aminas biognicas, alcalides, protenas, enzimas, peptdios e esterides (ERSPAMER, 1984; LAZARUS & ATTILA, 1993; REILLY et al., 1994; DALY, 1995; CARVALHO, 1995).

A classe das aminas biognicas inclui as indoalquilaminas, imidazolalquilaminas e fenilalquilaminas (ERSPAMER, 1984; LAZARUS et al., 1994; CLARKE, 1996). Destacam-se entre outras aminas biognicas, os derivados feniletilamnicos, que incluem adrenalina, noradrenalina e dopamina (LAZARUS et al., 1994) e derivados triptamnicos como a 5hidroxitriptamina ou serotonina (ERSPAMER, 1984; LAZARUS & ATTILA, 1993).

Os alcalides, na sua maioria, vm de rs neotropicais do gnero Dendrobates e Phyllobates, pertencentes famlia Dentrobatidae. Como citado anteriormente, tais componentes, at o momento, no possuem evidncias de serem sintetizados pelos anfbios, sendo oriundos da dieta
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base de insetos que se alimentam de plantas que sintetizam os alcalides (DALY et al, 1987). Neste grupo podemos encontrar as batracotoxinas, histrionicotoxinas, indolizidinas, pumiliotoxinas-A, decaidroquinilonas e numerosas classes menores, como gefirotoxinas, alcalides pirrolidnicos, piridil-piperidinas, indolalcalides, azatriciclododecenos, alcalides

amidnicos, morfina e tetrodotoxinas. Destaca-se a epibatidina purificada da pele do Epidedobates tricolor, e que apresenta ao analgsica cerca de duzentas vezes mais potente que a da morfina. (DALY et al, 1987; LAZARUS et al, 1994; DALY, 1995).

As protenas secretadas pela pele dos anfbios so responsveis por vrios efeitos farmacolgicos e servem muitas vezes de modelo para a descoberta de novas funes fisiolgicas de mamferos (CARVALHO et al., 1992). Existem trs principais grupos (LAZARUS & ATTILA, 1993): a) aquelas presentes nos grnulos secretrios, tais como, FIM-A1, B1 e C1, APEG-protena, e -galactosdeo-lectina; b) protenas txicas, tais como as toxinas do sapo Pelobates fuscus, do trito Triturus cristarus e das salamandras Pseudotriton ruber, Pseudotriton diastictus e Pseudotriton montanuse.e c) enzimas, tais como as amidases, (peptidil-glicina-a-hidroximonooxigenase e peptidil-hidroxi-glicina N-C ligase), as exopeptidases, (dipeptidil-aminopeptidase e carboxi-peptidase) e as endopeptidases, (uma endopeptidase que cliva seletivamente pares de aminocidos bsicos, uma cistena-endopeptidase que hidrolisa a ligao Xaa hidrofbico-Xaa bsico, uma endopeptidase que atua seletivamente na sequncia Arg-Xaa-Val-ArgGly, outra que hidrolisa as ligaes peptdicas da-hlice dos peptdeos e aquelas famlia da dactylysin (EC 3.4.24.60), isoladas em nosso laboratrio e que inativam diversos hormnio-peptdeos com grande eficincia, como veremos adiante.

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A maioria dos peptdeos possui potente atividade biolgica em mamferos, incluindo, taquicininas, bradicininas, cerulenas, bombesinas, opiides, xenopsinas, hormnio liberador de tireotropina, angiotensina. Um grupo apresenta atividade antimicrobiana, tais como as magaininas, PGLa, XPF, LPF, CPF (REILLY et al., 1994; CARVALHO, 1995) e Leptoglicina (SOUSA, 2009), os quais esto envolvidos na proteo desses animais contra a ao de microrganismos. Outros peptdeos, apresentando atividade antinociceptiva, foram isolados da pele de rs da sub-famlia

Phyllomedusinae: as demorfinas, mostrando efeitos seletivos para receptores opiides do tipo (ERSPAMER et al., 1989) e as deltorfinas, uma famlia de peptdeos com alta seletividade para receptores opiides do tipo (ZADINA et al., 1997). A descoberta desses peptdeos opiides em anfbios proporcionou melhores esclarecimentos a respeito das funes dos sistemas opiides e , e abriu a perspectiva para o desenvolvimento de novos analgsicos com benefcios teraputicos.

De particular importncia neste veneno, podemos citar os esterides que podem ser divididos quanto ao seu mecanismo de ao em cardiotnicos e no-cardiotnicos. Os esterides no-cardiotnicos incluem o ergosterol, o colesterol e o -sitosterol (ZELNIK et al., 1964; CHEN & KOVARIKOVA, 1967; TOLEDO & JARED, 1995). Os cardiotnicos incluem as bufotoxinas que so os mais abundantes no veneno dos sapos e so produzidos atravs do metabolismo do colesterol e as bufogeninas, tambm denominadas bufaginas ou bufadienoldeos (TOLEDO & JARED, 1995), conforme descreveremos em maiores detalhes a seguir.

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1.5.3 Bufadienoldeos

Os bufadienoldeos pertencem classe de esterides que esto presentes no veneno da pele de alguns anfbios, e em extratos teciduais de plantas, vegetais, frutas e serpentes (ROSSI et al. 1997).

Estes compostos esto amplamente difundidos na famlia Bufonidae e vrios deles j foram isolados da secreo cutnea de sapos do gnero Rhinella, sendo na sua maioria derivados de esterides (PORTO & GROSS, 1971; ROSSI et al, 1997). Como exemplo, podemos citar os seguintes compostos: sistosterol, argentinogenina, bufalina, bufotalinina, gamabufotalina, helebrigenina, helebrigenol, marinobufogenina,

resinobufogenina e telecinobufagina (ROSSI et al, 1997).

Os bufadienoldeos consistem de um anel esteride ligado ao grupo lactona (MEYER, 1996). A estrutura dos bufadienoldeos em Rhinella schneideri similar aos esterides cardioativos encontrados em plantas, exceto que em R. schneideri, os bufadienoldeos no possuem acares ligados ao C-3 do anel. Eles tm um anel lactnico de seis membros, ao invs do anel de cinco membros, duplamente insaturados no anel na posio do C-17 (BROWLEE et al, 1990).

1.5.4 Os bufadienoldeos so substncias endgenas do homem?

Embora inicialmente os bufadienoldeos tenham sido descritos como compostos presentes em venenos de anfbios e plantas (STEYN & VAN HEERDEN, 1998; KRENN & KOPP, 1998), trabalhos realizados nos ltimos anos mostraram que esses esterides tambm so encontrados em tecidos de mamferos, tais como a marinobufagina em aorta de ratos
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(BAGROV et al., 1995) e a proscilaridina A na adrenal bovina (LI et al., 1998; SCHNEIDER et al., 1998).

Outros trabalhos mostraram que os bufadienoldeos tambm so encontrados no prprio homem, possivelmente desempenhando funes fisiolgicas ou patolgicas, tais como: 19-Norbufalin, no cristalino, capaz de iniciar a formao de catarata (LICHTSTEIN et al. 1993); imunoreatividade na placenta (HILTON et al., 1996) e no soro contra proscilaridina A (SICH et al., 1996) e bufalin, (ODA et al., 2001); telecinobufagina, encontrada em altos nveis no plasma de pacientes com insuficincia renal terminal (KOMIYAMA et al., 2005) e marinobufagina isolada da urina de pacientes com infarto do miocrdio (BAGROV et al., 1998) e insuficincia renal (KENNEDY et al., 2006).

Foi a descoberta dessas substncias com atividade biolgica ativa nos anfbios, que nos estimulou a buscar a existncia de novas substncias com a atividade antinociceptiva no sapo curur Rhinella schneideri, largamente encontrado no semi-rido do Nordeste brasileiro.

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2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Estudar os efeitos antinociceptivos, em dores agudas, de um fator isolado da secreo das glndulas parotides de Rhinella schneideri.

2.2 Objetivos especficos

Purificar em larga escala um fator da secreo das glndulas

parotides de Rhinella schneideri, atravs de cromatografia lquida de alta performance (HPLC). Realizar estudos antinociceptivos em modelos de dores agudas em

camundongos, visando quantificar o efeito dessas substncias, atravs das vias de administrao intraperitoneal e oral; Estudar os efeitos antinociceptivos sobre as dores agudas

neurognica e inflamatria; Determinar se os efeitos analgsicos decorrem de ao central e/ou

perifrica; Estudar se o mecanismo de ao antinociceptivo envolve o sistema

opiide.

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3. METODOLOGIA

3.1 Materiais

3.1.1 Substncias e reagentes cido actico glacial; Merck, Brasil Formaldedo 37%; Merck, Brasil Cloreto de Sdio; Reagen, Brasil lcool etlico P.A.; Merck, Brasil Metanol; Merck, Brasil Acetonitrila: Carlo Erba, Brasil Acrilamida; Sigma, EUA Bis-acrilamida; Sigma, EUA Soluo Tris-HCl (pH 8,4) SDS; Sigma, Brasil gua bidestilada; Universidade Estadual do Cear, Brasil Morfina; Sigma, EUA Naloxona; Sigma, EUA 3.1.2 Aparelhos e instrumentos Agitador de tubos; Phoenix AP56, Brasil Balana Analtica; Marte- AM550, Brasil Balana de preciso; Mettler- Balance, USA Centrfuga refrigerada; Annita I, Eslovnia Cronmetro; Lenidas Trackmater, Alemanha Coluna preparativa; C18(2,4x 5cm)Vydac

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HPLC; Shimadzu LC- 10AS, Japo Liofilizador; Edwards- Modulyo, Inglaterra Medidor de pH ; Micronal, Brasil Pipetas automticas; Gilson, Frana Placa Quente; Socrel DS37 Refrigerador Termmetro; ASPIN 09654.10, Brasil Banho-Maria Tubos Eppendorf ; Gilson Frana

3.2 Mtodos

3.2.1 Animais

Foram utilizados camundongos Swiss (Mus musculus) machos, com peso entre 25-30g, provenientes do Biotrio do Instituto Superior de Cincias Biomdicas da Universidade Estadual do Cear (UECE). Os animais ficaram mantidos em gaiolas de plstico com maravalha de pinho autoclavada, com rao e gua ad libitum. Nas 24 horas antes dos ensaios, os animais foram colocados na sala onde o estudo foi desenvolvido, a fim de adapt-los ao ambiente experimental. A manipulao dos animais, antes, durante e depois dos experimentos, foi conduzida de acordo com as regras de manipulao de animais de laboratrio, preconizadas pelo Colgio Brasileiro de Experimentao Animal (COBEA) e foi submetido posterior aprovao junto ao Comit de tica no Uso de Animais da Universidade Estadual do Cear.

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3.2.2 Extrao da secreo das glndulas parotides de rhinella schneideri

Foram utilizados sapos Rhinella schneideri (Figura 10) coletados em diferentes pocas do ano e em diferentes locais do interior do Cear. Os animais, aps a extrao da secreo por compresso das glndulas parotides (Figura 11), foram devolvidos ao seu habitat natural.

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Figura 11. Extrao da secreo cutnea de Rhinella schneideri por compresso das glndulas parotides (Foto realizada pelo grupo de coleta Laboratrio de Toxinologia e Neurofamacologia Molecular ISBM/UECE).

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A secreo obtida foi macerada em gral com pistilo aps adio de etanol (1:3; p:v), at sua total homogeneizao, sendo, em seguida, mantida a 4o C durante 24 horas. A mistura foi, ento, centrifugada a 500 x g por 20 minutos, sendo o sobrenadante armazenado a -80 C, por no mximo uma semana, at a purificao em HPLC.

3.2.3 Purificao

O sobrenadante obtido na etapa anterior foi fracionado por cromatografia lquida da alta performance (HPLC) (Figuras 12A e B) utilizando-se uma coluna preparativa C-18 de fase reversa, eluda com fluxo de 5ml/min e um gradiente de acetonitrila entre 0 e 80%. O pico contendo atividade analgsica foi eludo em 45 minutos e foi coletado, liofilizado e armazenado a -80 C. Obteve-se um rendimento de 5% (p:p) (50 mg do fator purificado de cada grama de veneno bruto).

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Figura 12A. Cromatgrafo Lquido de Alta Eficincia.

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Figuras 12B. Cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC) preparativa de 1,7 ml da frao sobrenadante do veneno bruto, ressuspendido previamente em etanol (1:3; p:v) (ver mtodos), utilizando-se uma coluna preparativa de fase reversa C18 (Shim pack prep. ODS 2,5 x 30 cm) com um fluxo de 5 ml/min e uma eluio de acetonitrila com um gradiente de 0 a 80%. O pico, contendo o fator (ver seta) foi coletado, liofilizado e congelado a 80 C at o momento do uso.

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3.2.4 Preparao de soluo da frao analgsica para ensaios in vivo

Para a realizao dos testes farmacolgicos, o p liofilizado proveniente das fraes purificadas do HPLC foi ressuspendido em soluo de DMSO (10%) em gua bidestilada.

3.2.5 Determinao parcial da estrutura qumica do fator

A determinao da estrutura qumica do fator est sendo parcialmente elucidada atravs de Ressonncia Magntica Nuclear (RMN).

A anlise da RMN de alta resoluo do fator purificado foi realizada atravs de seqncias modernas de pulsos tais como 1H, 1H-COSY e NOESY, correlao heteronuclear (inversa) de carbono e hidrognio do carbono-hidrognio acoplados (Hector e HMQC), assim como as seqnciais equivalentes de longa extenso (COLOC e HMBC). Os detalhes da metodologia utilizados foram anteriormente descritos (CARVALHO et al, 1999).

3.3 Modelos experimentais

3.3.1 Teste de contores abdominais induzidas por cido actico

O teste de contores abdominais em camundongos induzidas por cido actico 0,8% foi utilizado para avaliao da atividade antinociceptiva do fator (KOSTER et al., 1959; BARS, 2001). Este teste apesar de no apresentar grande especificidade, altamente sensvel (COLLIER et al.,

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1968). Doses de 1mg/Kg, 2mg/Kg e 5mg/Kg do fator, em volume final de 10l/g de peso do animal, foram administradas por via intraperitoneal no grupo teste (n=6) e gua bidestilada (10l/g de peso do animal, i.p.) no grupo controle (n=6). Na via oral, foram testadas as doses de 2, 5 e 10mg/Kg do fator, em um volume de 5l/g de peso do animal tanto para o fator, como para o controle. Na via i.p. aguardou-se 20 minutos do tratamento com essas doses para os animais serem submetidos a uma injeo i.p. de soluo de cido actico 0,8% (10l/g de peso do animal). Na v.o. esperou-se 1 hora (Figura 13).

A contagem do nmero de contores foi realizada aps 5 minutos da administrao do cido actico, sendo as mesmas contabilizadas por 20 minutos. A contoro foi identificada como uma extenso das patas traseiras acompanhada por contrao do abdome (VANDER WENDE & MARGOLIN, 1956) (Figura 14). A reao de dor ocorre por meio da liberao de substncias endgenas que estimulam os terminais nociceptivos (DUARTE et al., 1988; DRAY, 1995; MILLAN, 1999).

Como controle positivo foi utilizada a morfina na concentrao de 5mg/Kg, administrada no volume de 10l/g de peso do animal pela via intraperitoneal. Tanto o fator quanto a morfina foram testados

posteriormente em relao ao envolvimento no sistema opiide, atravs do pr-tratamento com a naloxona (5mg/Kg) pela via intraperitoneal, 10l/g de peso do animal, 20 minutos antes das substncias supracitadas.

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Figura 13 Injeo intraperitoneal de cido actico (0,8%).

Figura 14 Contoro abdominal induzida pelo cido actico (0,8%).

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3.3.2 Teste da formalina

O teste da formalina consiste na injeo subplantar de formalina (4% diluda em gua bidestilada) na pata traseira direita do animal (Figura 15), num volume de 20 l, aonde foi induzida a nocicepo qumica, segundo o mtodo de HUNSKAAR & HOLE (1987). Este mtodo muito especifico, permitindo avaliar dois tipos de dor: a dor neurognica (estimulao direta dos neurnios nociceptivos) e a dor inflamatria (caracterizada pela liberao de mediadores inflamatrios) (BARS, 2001). Doses de 1mg/Kg, 2mg/Kg e 5mg/Kg do fator, em volume final de 10l/g de peso do animal, foram administradas por via intraperitoneal no grupo teste (n=6) e gua bidestilada (10l/g de peso do animal, i.p.) no grupo controle (n=6). Na via oral, foram testadas as doses de 2, 5 e 10mg/Kg do fator, em um volume de 5l/g de peso do animal tanto para o fator, como para o controle. Na via i.p., aps 20 minutos do tratamento as doses, os animais foram submetidos, a uma injeo subplantar de formalina. J na v.o., aguardou-se 1 hora.

Logo aps a injeo da formalina, os animais foram observados e foi registrado o tempo que o animal permaneceu lambendo ou mordendo a pata. Os animais foram observados por um tempo total de 30 minutos. A dor neurognica (primeira fase) ocorre nos primeiros 5 minutos aps a injeo da formalina e a dor inflamatria (segunda fase), entre 15 a 30 minutos, representando a resposta tnica dor, acompanhada de uma resposta inflamatria relacionada liberao de mediadores inflamatrios (TJOLSEN et al., 1992).

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Figura 15. Injeo subplantar de formalina (4%) na pata de camundongo.

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Como controle positivo foi utilizada a morfina na concentrao de 5mg/Kg, administrada no volume de 10l/g de peso do animal, pela via intraperitoneal. Tanto o fator quanto a morfina foram testados posteriormente, no teste da formalina, em relao ao envolvimento no sistema opiide, atravs do pr-tratamento com a naloxona (5mg/Kg) pela via intraperitoneal, 10l/g de peso do animal, 20 minutos antes das substncias supracitadas.

3.3.3 Teste da placa quente

O mtodo de JACOB & RAMABADRAN (1978) foi utilizado para verificar a eficcia do fator frente nocicepo trmica e sua possvel ao central. Neste teste, os camundongos foram colocados sobre uma placa quente (51 C +1 C) (Figura 16) (AINKIER, 1974; PLONE et al., 1996; BARS, 2001). Os animais que mostraram tempo de reao (saltar ou lamber as patas anteriores ou posteriores) superior a 20 segundos foram descartados (Figura 16).

Doses de 1mg/Kg, 2mg/Kg e 5mg/Kg do fator, em volume final de 10l/g de peso do animal, foram administradas por via intraperitoneal no grupo teste (n=6) e gua bidestilada (10l/g de peso do animal, i.p.) no grupo controle (n=6). Na via oral, foram testadas as doses de 2, 5 e 10mg/Kg do fator, em um volume de 5l/g de peso do animal tanto para o fator, como para o controle. Na via i.p., aps 20 minutos do tratamento as doses, os animais foram colocados sobre a placa quente a fim de contar o tempo de reao dos mesmos (saltar ou lamber as patas anteriores ou posteriores). J na v.o., aguardou-se 1 hora. (Figura 17).

45

46

Como controle positivo foi utilizada a morfina na concentrao de 5mg/Kg, administrada no volume de 10l/g de peso do animal pela via intraperitoneal. Tanto o fator quanto a morfina foram testados posteriormente, no teste da placa quente, em relao ao envolvimento no sistema opiide, atravs do pr-tratamento com a naloxona (5mg/Kg) pela via intraperitoneal, 20 minutos antes das substncias supracitadas.

46

47

Figura 16. Placa Quente sendo calibrada para 51 C +1 C.

Figura 17. Animal lambendo a pata no teste da placa quente.

47

48

3.3.4 Teste do tail flick

Este mtodo consiste na imerso do tero apical da cauda do camundongo em Banho Maria, numa temperatura em torno de 52C (SMITH et al., 1943; D'AMOUR & SMITH, 1941; BARS, 2001). Este estmulo trmico provoca uma reao de retirada da cauda dos animais atravs de um movimento reflexo de origem espinhal rpido e vigoroso. O aumento do tempo de retirada da cauda interpretado como uma ao analgsica (FARMER et al., 1986; RAFFA et al., 1992).

Doses de 1mg/Kg, 2mg/Kg e 5mg/Kg do fator, em volume final de 10l/g de peso do animal, foram administradas por via intraperitoneal no grupo teste (n=6) e gua bidestilada (10l/g de peso do animal, i.p.) no grupo controle (n=6). Na via oral, foram testadas as doses de 2, 5 e 10mg/Kg do fator, em um volume de 5l/g de peso do animal tanto para o fator, como para o controle. Na via i.p., aps 20 minutos do tratamento com as doses, as caudas dos animais foram imersas em Banho Maria, a fim de contar o tempo de reao dos mesmos (remoo da cauda). J na v.o., aguardou-se 1 hora.

Como controle positivo foi utilizada a morfina na concentrao de 5mg/Kg, administrada no volume de 10l/g de peso do animal, pela via intraperitoneal. Tanto o fator quanto a morfina foram testados posteriormente, no teste do tail flick, em relao ao envolvimento no sistema opiide, atravs do pr-tratamento com a naloxona (5mg/Kg), 10l/g de peso do animal, pela via intraperitoneal, 20 minutos antes das substncias supracitadas.

48

49

4. ANLISE ESTATSTICA

Os resultados foram analisados pelo teste ANOVA e posteriormente pelo teste de Tukey, com nvel de significncia de p< 0,05, utilizando o software GraphPad Prisma.

49

50

5. RESULTADOS 5.1 Teste de contores abdominais induzidas por cido actico

O fator, nas doses de 1, 2 e 5mg/Kg, i.p., inibiu significativamente o nmero de contores abdominais em relao ao controle, observando-se um efeito dose-dependente. A morfina (5mg/Kg, i.p.) foi usada como controle positivo, inibindo tambm de forma significativa o nmero de contores em relao ao controle negativo (Figura 18).

O naloxone (5mg/Kg, i.p.) administrado 20 minutos antes, bloqueou significativamente os efeitos antinociceptivos do fator (5mg/Kg, i.p.) e da morfina (5mg/Kg, i.p.) (Figura 19).

Por via oral, o fator tambm inibiu significativamente o nmero de contores abdominais em relao ao controle, quando administrado nas doses de 2, 5 e 10mg/Kg (Figura 20).

50

51

FIGURA 18

EFEITOS DO FATOR NO TESTE DE CONTORES ABDOMINAIS (i.p.)

50

N CONTORES

40 30 20 10 0 Controle Fator (1,0) Fator (2,0) Fator (5,0) Morfina (5,0)

a*** a*** b* a*** b*** c*

a***

DOSES (mg/Kg)

O fator (1, 2 e 5mg/Kg) e o controle (gua bidestilada) foram administrados por via i.p. 20 minutos antes do cido actico 0,8% (i.p.). Para todos os grupos foi utilizado n=6. A mdia E.P.M foi de 44,56 3,6 para o grupo controle, 26,25 3,28 para o fator 1mg/kg, 14,33 0,55 para fator 2mg/kg, 2,71 2,07 para o fator 5mg/kg e 5,0 0,92 para morfina 5mg/kg . Foi utilizado o teste de ANOVA seguido pelo teste de Tukey. a- quando comparado ao grupo controle, b- quando comparado ao fator 1mg/Kg, cquando comparado ao fator 2mg/Kg, d- quando comparado ao fator 5mg/Kg. *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001.

51

52

FIGURA 19

EFEITO DO NALOXONE NA AO ANTINOCICEPTIVA DO FATOR NO TESTE DE CONTORES ABDOMINAIS

No CONTORES

50 40 30 20

b*** c***

a***
10 0

a***
Nal+Morf Fator (5,0) Nal+Fator

Controle

Morfina (5,0)

DOSES (mg/kg)

O naloxone (5mg/Kg, i.p.) foi administrado 20 minutos antes do fator (5mg/Kg, i.p.) e da morfina (5mg/Kg, i.p.). Para todos os grupos foi utilizado n=6. A mdia E.P.M foi de 44,56 3,6 para o grupo controle, 6,2 1,82 para a morfina 5mg/kg, 36,4 4,47 para naloxone + morfina, 2,71 2,07 para o fator 5mg/kg e 29,17 2,89 para naloxone + fator. Foi utilizado o teste de ANOVA seguido pelo teste de Tukey. a- quando comparado ao grupo controle, b- quando comparado a morfina 5mg/Kg, c- quando comparado ao fator 5mg/Kg, *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001.

52

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FIGURA 20

EFEITOS DO FATOR NO TESTE DE CONTORES ABDOMINAIS (v.o.)

50

No CONTORES

40

a***
30 20 10 0 Controle Fator (2,0) Fator (5,0) Fator (10,0)

a*** b***

a*** b*** c**

DOSES (mg/Kg)

O fator (2, 5 e 10mg/Kg) e o controle (gua bidestilada) foram administrados via oral 1 hora antes do cido actico 0,8% (i.p.). Para todos os grupos foi utilizado n=6. A mdia E.P.M foi de 44,92 4,39 para o grupo controle, 27,25 1,90 para o fator 2mg/kg, 13,12 0,49 para fator 5mg/kg e 3,55 0,38 para o fator 10mg/kg. Foi utilizado o teste de ANOVA seguido pelo teste de Tukey. a- quando comparado ao grupo controle, b- quando comparado ao fator 2mg/Kg, c- quando comparado ao fator 5mg/Kg, d- quando comparado ao fator 10mg/Kg, **P<0,01 e ***P<0,001. *P<0,05,

53

54

5.2 Teste da formalina

Fase 1

O fator, nas doses de 1, 2 e 5mg/Kg, i.p., inibiu significativamente, na fase 1 o tempo de lambidas e/ou mordidas na pata injetada em relao ao controle, observando-se um efeito dose-dependente. A morfina (5mg/Kg, i.p.) foi usada como controle positivo, diminuindo tambm de forma significativa o tempo de lambidas e/ou mordidas em relao ao controle negativo (Figura 21).

A naloxona (5mg/Kg, i.p.) administrada 20 minutos antes, bloqueou significativamente os efeitos antinociceptivos do fator (5mg/Kg, i.p.) e da morfina (5mg/Kg, i.p.) (Figura 22).

Por via oral, o fator tambm inibiu, significativamente, o tempo de lambidas e/ou mordidas em relao ao controle, quando administrado nas doses de 5 e 10mg/Kg (Figura 23).

54

55

FIGURA 21
EFEITOS DO FATOR NO TESTE DA FORMALINA NA FASE 1 (i.p.) TEMPO (lambida/mordida) (s)

150 125 100 75 50 25 0

a***

a*** b**

a*** b*** c***

Fator (5,0)

a*** d***

Controle

Fator (1,0)

Fator (2,0)

Morfina 5,0)

DOSES (mg/Kg)

O fator (1, 2 e 5mg/Kg) e o controle (gua bidestilada) foram administrados por via i.p. 20 minutos antes da formalina 4% intraplantar. Para todos os grupos foi utilizado n=6. A mdia E.P.M foi de 128,8 10,04 para o grupo controle, 67,8 2,7 para o fator 1mg/kg, 36,67 1,35 para fator 2mg/kg, 4,0 0,66 para o fator 5mg/kg e 49,75 3,45 para morfina 5mg/kg. Foi utilizado o teste de ANOVA seguido pelo teste de Tukey. aquando comparado ao grupo controle, b- quando comparado ao fator 1mg/Kg, c- quando comparado ao fator 2mg/Kg, d- quando comparado ao fator 5mg/Kg, *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001.

55

56

FIGURA 22

EFEITO DO NALOXONE NA AO ANTINOCICEPTIVA DA MORFINA E DO FATOR NO TESTE DA FORMALINA NA FASE 1 TEMPO (lambida/mordida) (s)

150 125 100 75 50 25 0 Controle Fator (5,0) Nal+Fator Morfina (5,0) Nal + Morf

b*** d** a*** a***

DOSES (mg/Kg)

O naloxone (5mg/Kg, i.p.) foi administrado 20 minutos antes do fator (5mg/Kg, i.p.) e da morfina (5mg/Kg, i.p.). Para todos os grupos foi utilizado n=6. A mdia E.P.M foi de 128,8 10,04 para o grupo controle, 48 4,44 para a morfina 5mg/kg, 89 3,93 para naloxone + morfina, 4 0,66 para o fator 5mg/kg e 103,8 13,17 para naloxone + fator. Foi utilizado o teste de ANOVA seguido pelo teste de Tukey. a- quando comparado ao grupo controle, b- quando comparado ao fator 5mg/Kg, dquando comparado a morfina 5mg/Kg, *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001.

56

57

FIGURA 23

EFEITOS DO FATOR NO TESTE DA FORMALINA NA FASE 1 (v.o.) TEMPO (lambida/mordida) (s)

150 125 100 75 50 25 0 Controle Fator (2,0) Fator (5,0) Fator (10,0)

a** a*** a*** b** c*

DOSES (mg/Kg)

O fator (2, 5 e 10mg/Kg) e o controle (gua bidestilada) foram administrados via oral 1 hora antes da formalina. Para todos os grupos foi utilizado n=6. A mdia E.P.M foi de 133,8 12,01 para o grupo controle, 89,44 6,82 para o fator 2mg/kg, 75,78 2,32 para fator 5mg/kg e 36,6 4,84 para o fator 10mg/kg. Foi utilizado o teste de ANOVA seguido pelo teste de Tukey. a- quando comparado ao grupo controle, b- quando comparado ao fator 2mg/Kg, c- quando comparado ao fator 5mg/Kg, dquando comparado ao fator 10mg/Kg, *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001.

57

58

Fase 2 O fator, nas doses de 1, 2 e 5mg/Kg, i.p., inibiu significativamente, na fase 2 o tempo de lambidas e/ou mordidas na pata injetada em relao ao controle. A morfina (5mg/Kg, i.p.) foi usada como controle positivo, diminuindo tambm de forma significativa o tempo de lambidas e/ou mordidas em relao ao controle negativo (Figura 24).

A naloxona (5mg/Kg, i.p.) administrada 20 minutos antes, bloqueou significativamente os efeitos antinociceptivos do fator (5mg/Kg, i.p.) e da morfina (5mg/Kg, i.p.) (Figura 25).

Por via oral, o fator tambm inibiu, significativamente, o tempo de lambidas e/ou mordidas em relao ao controle, quando administrado nas doses de 2, 5 e 10mg/Kg (Figura 26).

58

59

FIGURA 24
EFEITOS DO FATOR NO TESTE DA FORMALINA NA FASE 2 (i.p.) TEMPO (lambina/mordida) (s)

200 150 100

a***
50 0 Controle Fator (1,0) Fator (2,0) Fator (5,0)

a*** a***

a***

Morfina (5,0)

DOSES (mg/Kg)

O fator (1, 2 e 5mg/Kg) e o controle (gua bidestilada) foram administrados por via i.p. 20 minutos antes da formalina 4% intraplantar. Para todos os grupos foi utilizado n=6. A mdia E.P.M foi de 167,9 22,21 para o grupo controle, 40,25 7,74 para o fator 1mg/kg, 16,0 9,73 para fator 2mg/kg, 0,25 0,16 para o fator 5mg/kg e 22,0 11,27 para morfina 5mg/kg. Foi utilizado o teste de ANOVA seguido pelo teste de Tukey. aquando comparado ao grupo controle, b- quando comparado ao fator 1mg/Kg, c- quando comparado ao fator 2mg/Kg, d- quando comparado ao fator 5mg/Kg, *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001.

59

60

FIGURA 25
EFEITO DO NALOXONE NA AO ANTINOCICEPTIVA DA MORFINA E DO FATOR NO TESTE DA FORMALINA NA FASE 2 TEMPO (lambida/mordida) (s)

200 175 150 125 100 75 50 25 0

d** b* a*** a***

Controle Fator (5,0) Nal+Fator Morfina (5,0) Nal+Morf

DOSES (mg/Kg)

O naloxone (5mg/Kg, i.p.) foi administrado 20 minutos antes do fator (5mg/Kg, i.p.) e da morfina (5mg/Kg, i.p.). Para todos os grupos foi utilizado n=6. A mdia E.P.M foi de 167,9 22,21 para o grupo controle, 22 7,51 para a morfina 5mg/kg, 115 12,97 para naloxone + morfina, 0,45 0,15 para o fator 5mg/kg e 72 4,61 para naloxone + fator. Foi utilizado o teste de ANOVA seguido pelo teste de Tukey. a- quando comparado ao grupo controle, b- quando comparado ao fator 5mg/Kg, dquando comparado a morfina 5mg/Kg, *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001.

60

61

FIGURA 26

EFEITOS DO FATOR NO TESTE DA FORMALINA NA FASE 2 (v.o.) TEMPO (lambina/mordida) (s)

200

a**
100

a*** b*

a*** b**
Fator (10,0)

0 Controle Fator (2,0) Fator (5,0)

DOSES (mg/Kg)

O fator (2, 5 e 10 mg/Kg) e o controle (gua bidestilada) foram administrados por v.o. 1 hora antes da formalina 4% intraplantar. Para todos os grupos foi utilizado n=6. A mdia E.P.M foi de 168,3 18,39 para o grupo controle, 105,7 13,32 para o fator 2mg/kg, 52,25 4,11 para fator 5mg/kg e 24,88 2,87 para o fator 10mg/kg. Foi utilizado o teste de ANOVA seguido pelo teste de Tukey. a- quando comparado ao grupo controle, b- quando comparado ao fator 2mg/Kg, c- quando comparado ao fator 5mg/Kg, d- quando comparado ao fator 10mg/Kg, **P<0,01 e ***P<0,001. *P<0,05,

61

62

5.3 Teste da placa quente

O fator, nas doses de 2 e 5mg/Kg, i.p., aumentou significantemente o tempo de reao dor em relao ao controle, observando-se um efeito dose-dependente. A morfina (5mg/Kg, i.p.) foi usada como controle positivo, aumentando tambm de forma significativa o tempo de reao dor em relao ao controle negativo (Figura 27). A naloxona (5mg/Kg, i.p.) administrada 20 minutos antes, bloqueou significativamente os efeitos antinociceptivos do fator (5mg/Kg, i.p.) e da morfina (5mg/Kg, i.p.) (Figura 28).

Por via oral, o fator tambm aumentou significantemente o tempo de reao dor em relao ao controle, quando administrado nas doses de 5 e 10mg/Kg (Figura 29).

62

63

FIGURA 27

EFEITOS DO FATOR NO TESTE DA PLACA QUENTE (i.p.)

TEMPO (Lambida/Pulo) (s)
a*** b*** c***

25 20 15 10 5 0

a*** b**

a*** d***

Controle

Fator (1,0)

Fator (2,0)

Fator (5,0) Morfina (5,0)

DOSES (mg/kg)

O fator (1, 2 e 5mg/Kg) e o controle (gua bidestilada) foram administrados porvia i.p. 20 minutos antes do teste da placa quente. Para todos os grupos foi utilizado n=6. A mdia E.P.M foi de 5,7 0,23 para o grupo controle, 6,42 0,84 para o fator 1mg/kg, 10,22 0,12 para fator 2mg/kg, 22,31 1,72 para o fator 5mg/kg e 11,83 0,97 para morfina 5mg/kg. Foi utilizado o teste de ANOVA seguido pelo teste de Tukey. a- quando comparado ao grupo controle, b- quando comparado ao fator 1mg/Kg, c- quando comparado ao fator 2mg/Kg, d- quando comparado ao fator 5mg/Kg, *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001.

63

64

FIGURA 28

EFEITO DO NALOXONE NA AO ANTINOCICEPTIVA DA MORFINA E DO FATOR NO TESTE DA PLACA QUENTE TEMPO (Lambida/Pulo) (s)

a***
20

a**
10

b*** d*

Controle

Fator (5,0)

Nal+fator

Morfina (5,0)

Nal+Morfina

DOSES (mg/kg)

O naloxone (5mg/Kg, i.p.) foi administrado 20 minutos antes do fator (5mg/Kg, i.p.) e da morfina (5mg/Kg, i.p.). Para todos os grupos foi utilizado n=6. A mdia E.P.M foi de 6,07 0,26 para o grupo controle, 11,83 0,97 para a morfina 5mg/kg, 5,5 0,95 para naloxone + morfina, 19,83 2,14 para o fator 5mg/kg e 6,75 1,05 para naloxone + fator. Foi utilizado o teste de ANOVA seguido pelo teste de Tukey. a- quando comparado ao grupo controle, b- quando comparado ao fator 5mg/Kg, dquando comparado a morfina 5mg/Kg, *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001.

64

65

FIGURA 29

EFEITOS DO FATOR
NO TESTE DA PLACA QUENTE (v.o.)
TEMPO (Lambida/Pulo) (s)

12.5 10.0 7.5 5.0 2.5 0.0

Controle Fator (2,0) Fator (5,0)

a*** b** a**

Fator (10,0)

DOSES (mg/kg)

O fator (2, 5 e 10mg/Kg) e o controle (gua bidestilada) foram administrados via oral 1 hora antes do teste da placa quente. Para todos os grupos foi utilizado n=6. A mdia E.P.M foi de 5,87 0,22 para o grupo controle, 6,45 0,44 para o fator 2mg/kg, 8,02 0,76 para fator 5mg/kg e 10,25 0,85 para o fator 10mg/kg. Foi utilizado o teste de ANOVA seguido pelo teste de Tukey. a- quando comparado ao grupo controle, bquando comparado ao fator 2mg/Kg, c- quando comparado ao fator 5mg/Kg, d- quando comparado ao fator 10mg/Kg, *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001.

65

66

5.4. Teste do tail flick O fator, nas doses de 2 e 5mg/Kg, i.p., aumentou significantemente o tempo de reao reflexa de retirada da cauda em relao ao controle. A morfina (5mg/Kg, i.p.) foi usada como controle positivo, inibindo tambm de forma significativa o tempo de reao reflexa de retirada da cauda em relao ao controle negativo (Figura 30).

A naloxona (5mg/Kg, i.p.) administrada 20 minutos antes, bloqueou significativamente os efeitos antinociceptivos do fator (5mg/Kg, i.p.) e da morfina (5mg/Kg, i.p.) (Figura 31).

Por via oral, o fator tambm aumentou significativamente o tempo de reao reflexa de retirada da cauda em relao ao controle, quando administrado nas doses de 5 e 10mg/Kg (Figura 32).

66

67

FIGURA 30

EFEITOS DO FATOR NO TESTE DO TAIL FLICK (i.p.) TEMPO (retirada da cauda) (s)
a*** b** a*** b*** a*** d**

20 15 10 5 0

Controle

Fator (1,0)

Fator (2,0)

Fator (5,0) Morfina (5,0)

DOSES (mg/Kg)

O fator (1, 2 e 5mg/Kg) e o controle (gua bidestilada) foram administrados por via i.p. 20 minutos antes do teste do tail flick. Para todos os grupos foi utilizado n=6. A mdia E.P.M foi de 6,26 0,54 para o grupo controle, 9,04 1,23 para o fator 1mg/kg, 14,4 1,62 para fator 2mg/kg, 19,02 0,67 para o fator 5mg/kg e 15,0 0,48 para morfina 5mg/kg. Foi utilizado o teste de ANOVA seguido pelo teste de Tukey. a- quando comparado ao grupo controle, b- quando comparado ao fator 1mg/Kg, c- quando comparado ao fator 2mg/Kg, d- quando comparado ao fator 5mg/Kg, *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001.

67

68

FIGURA 31
EFEITO DO NALOXONE NA AO ANTINOCICEPTIVA DA MORFINA E DO FATOR NO TESTE DO TAIL FLICK TEMPO (retirada da cauda) (s)
a***
20 15 10 5 0

a***

b***

d***

Controle

Fator (5,0)

Nal+Fator Morfina (5,0) Nal+Morf

DOSES (mg/kg)

O naloxone (5mg/Kg, i.p.) foi administrado 20 minutos antes do fator (5mg/Kg, i.p.) e da morfina (5mg/Kg, i.p.). Para todos os grupos foi utilizado n=6. A mdia E.P.M foi de 6,02 0,5 para o grupo controle, 15 1,08 para a morfina 5mg/kg, 7,6 0,67 para naloxone + morfina, 19,02 0,67 para o fator 5mg/kg e 6,96 0,93 para naloxone + fator. Foi utilizado o teste de ANOVA seguido pelo teste de Tukey. a- quando comparado ao grupo controle, b- quando comparado ao fator 5mg/Kg, d- quando comparado a morfina 5mg/Kg, *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001.

68

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FIGURA 32

EFEITOS DO FATOR NO TESTE DO TAIL FLICK (v.o.) TEMPO (retirada da cauda) (s)

15

a*** b** a*

10

0
Controle Fator (2,0) Fator (5,0) Fator (10,0)

DOSES (mg/Kg)

O fator (2, 5 e 10mg/Kg) e o controle (gua bidestilada) foram administrados via oral 1 hora antes do teste do tail flick. Para todos os grupos foi utilizado n=6. A mdia E.P.M foi de 6,26 0,54 para o grupo controle, 6,95 0,76 para o fator 2mg/kg, 8,8 0,44 para fator 5mg/kg e 10,50 0,62 para o fator 10mg/kg. Foi utilizado o teste de ANOVA seguido pelo teste de Tukey. a- quando comparado ao grupo controle, bquando comparado ao fator 2mg/Kg, c- quando comparado ao controle 5mg/Kg, d- quando comparado ao fator 10mg/Kg, *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001.

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6. DISCUSSO

A descoberta de peptdeos opiides em anfbios nos estimulou a buscar a existncia de novas substncias com a atividade antinociceptiva da secreo das glndulas parotides no sapo curur Rhinella schneideri, largamente encontrado no semi-rido do Nordeste brasileiro.

No presente trabalho, conseguimos purificar totalmente o fator em um nico passo cromatogrfico e em escala preparativa, o que nos permitiu obter quantidades suficientes deste composto para a realizao dos diversos ensaios clssicos para estudo das dores agudas in vivo. O rendimento de 5% (p:p) (50 mg do fator purificado de cada grama de veneno bruto) do fator pode ser considerado muito bom para realizao dos ensaios in vivo.

A estrutura qumica do fator est sendo parcialmente determinada, entretanto estudos complementares sero realizados para a elucidao da estrutura total deste fator.

O primeiro ensaio de nocicepo utilizado no presente trabalho foi o teste contores abdominais (KOSTER et al., 1959; BARS, 2001) um modelo bastante utilizado para screening de substncias analgsicas que, apesar de no apresentar grande especificidade, ele altamente sensvel (COLLIER et al., 1968). A reao de dor posterior administrao do cido actico ocorre por meio da liberao de substncias endgenas que estimulam os terminais nociceptivos, como: a bradicinina, as

prostaglandinas, as prostaciclinas, as aminas simpatomimticas, as citocinas (IL-1 e IL-8), os neuropetdeos (substncia P), a serotonina, os prtons e o xido ntrico (DUARTE et al., 1988; DRAY, 1995; MILLAN, 1999).
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O fator administrado por via i.p., nas doses de 1, 2 e 5mg/Kg, inibiu significativamente o nmero de contores abdominais, em relao ao controle, o que demonstra claramente a existncia de efeito analgsico (Figura 18). Como o efeito antinociceptivo foi proporcional ao aumento da dose, identifica-se um efeito dose-dependente, sugerindo a atuao deste composto em receptores farmacolgicos.

Neste teste, os efeitos antinociceptivos do fator e da morfina obtidos com a mesma dose (5mg/Kg) no diferiram significativamente (Figura 18). Entretanto, comparando-se mol a mol, o efeito antinociceptivo do fator (x = 4,25, correspondendo a 90,5% de inibio em relao ao controle, com x = 44,56) com peso molecular (p.m.) de 400, foi cerca de 50% mais potente que a morfina com p.m. de 285,3 (x = 6.2, correspondendo a 86% de inibio em relao ao controle, com x = 44,56).

Neste teste, a naloxona (5mg/Kg, i.p.) administrada 20 minutos antes do fator, bloqueou significativamente os efeitos antinociceptivos do fator (5mg/Kg, i.p.) demonstrando que o seu mecanismo de ao envolve o sistema opide.

importante tambm ressaltar que por v.o., nas doses de 2, 5 e 10mg/Kg, o fator inibiu significativamente o nmero de contores abdominais em relao ao controle (Figura 20). As doses que causaram efeitos analgsicos foram maiores que aquelas utilizadas por via i.p., o que seria esperado, pois uma via de absoro mais lenta e as drogas passam pelo fgado sofrendo um processo de metabolizao antes de se distriburem nos demais tecidos. A demonstrao de que o fator sofre absoro por v.o., pode ser de grande importncia no futuro, caso venha a

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ser um modelo para o desenvolvimento de novos analgsicos de uso teraputico no homem. O prximo ensaio de dor utilizado neste estudo foi o teste da formalina. Vrios estudos disponveis na literatura mostram que a nocicepo causada pela injeo intraplantar de formalina 4%, envolve diferentes mediadores qumicos os quais, conseqentemente, ativam diversos receptores e induzem a formao de distintas sinalizaes intracelulares (HUNSKAAR & HOLE, 1987). Este mtodo muito especifico, permitindo avaliar dois tipos de dor: a dor neurognica (estimulao direta dos neurnios nociceptivos) e a dor inflamatria (caracterizada pela liberao de mediadores inflamatrios) (TJOLSEN et al., 1992; BARS, 2001). Dessa forma, esse modelo representa uma ferramenta farmacolgica muito interessante para o estudo de novas drogas antinociceptivas. Alm do mais, a dor induzida pela formalina possui vrios aspectos que a tornam de interesse, quando comparada com outros modelos de dor, sendo o mais relevante, sua semelhana com a dor clinica (HUNSKAAR & HOLE, 1987).

O fator administrado por via i.p., nas doses de 1, 2 e 5mg/Kg, inibiu significativamente o tempo de lambidas e/ou mordidas da pata injetada com formalina, tanto na fase neurognica, como na fase inflamatria, o que demonstra claramente a existncia de efeito analgsico (Figuras 21 e 24). Como o efeito antinociceptivo foi proporcional ao aumento da dose, identifica-se um efeito dose-dependente (na fase 1), sugerindo a atuao deste composto em receptores farmacolgicos.

Na fase 1, os efeitos antinociceptivos do fator e da morfina obtidos com a mesma dose (5mg/Kg, i.p.) diferiram significativamente. Nesta dose,

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o fator inibiu 95,7% do tempo de lambidas e/ou mordidas em relao ao controle, enquanto a morfina inibiu apenas 62,5% dessas respostas. Comparando-se mol a mol, o efeito antinociceptivo do fator (x = 5,5 e peso molecular de 400) foi cerca de 114 % mais potente que a morfina) (x = 48 e p.m. de 285,3).

Na fase 1, a naloxona (5mg/Kg, i.p.) administrada 20 minutos antes, bloqueou significativamente os efeitos antinociceptivos do fator (5mg/Kg, i.p.) demonstrando que o seu mecanismo de ao envolve o sistema opiide.

Na fase 2, os efeitos antinociceptivos do fator e da morfina obtidos com a mesma dose (5mg/Kg, i.p.) diferiram significativamente. Nesta dose, o fator inibiu 99,8% do tempo de lambidas e/ou mordidas em relao ao controle, enquanto a morfina inibiu apenas 86,8% dessas respostas. Comparando-se mol a mol, o efeito antinociceptivo do fator (x = 0,25 e peso molecular de 400) foi cerca de 61% mais potente que a morfina) (x = 22 e p.m. de 285,3).

Na fase 2, a naloxona (5mg/Kg, i.p.) administrada 20 minutos antes, bloqueou significativamente os efeitos antinociceptivos do fator (5mg/Kg, i.p.) demonstrando que o seu mecanismo de ao envolve o sistema opide.

importante tambm ressaltar que, por v.o., o fator diminuiu significativamente o tempo de lambidas e/ou mordidas da pata injetada com formalina, tanto na fase neurognica (nas doses de 5 e 10 mg/Kg), como na fase inflamatria (nas doses de 2, 5 e 10 mg/Kg), o que demonstra claramente a existncia de efeito analgsico (Figuras 23 e 26). A

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importncia da utilizao desta via foi analisada acima quando discutimos os resultados do teste de contores.

Na tentativa de se elucidar presena ou no de ao analgsica central a nvel cerebral, do fator, foi realizado o teste clssico da placa quente. Este teste largamente utilizado para testar drogas analgsicas que interferem na nocicepo atravs do sistema nervoso central, como os opiides (JACOB & RAMABADRAN, 1978; BARS, 2001), atravs de mecanismos de integrao espinhal e supra-espinhal, uma vez que o salto e o ato de lamber a pata so considerados os critrios de resposta (FARMER et al., 1986).

O fator administrado por via i.p., nas doses de 2 e 5mg/Kg, aumentou significativamente o tempo de reao dor, em relao ao controle, o que demonstra claramente a existncia de efeito analgsico a nvel cerebral no sistema nervoso central (Figura 27).

Neste teste, os efeitos antinociceptivos do fator e da morfina obtidos com a mesma dose (5mg/Kg) diferiram significativamente. Nesta dose, o fator aumentou em 269% o tempo de permanncia do animal sobre a placa quente, em relao ao controle, enquanto a morfina inibiu apenas 107% dessas respostas. Comparando-se mol a mol, o efeito antinociceptivo do fator (x = 21,03 e peso molecular de 400) foi cerca de 252% mais potente que a morfina) (x = 11,83 e p.m. de 285,3).

Neste teste, a naloxona (5mg/Kg, i.p.) administrada 20 minutos antes, bloqueou significativamente os efeitos antinociceptivos do fator (5mg/Kg, i.p.) demonstrando que o seu mecanismo de ao envolve o sistema opide.
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importante tambm ressaltar que por v.o, nas doses de 5 e 10 mg/Kg, o fator aumentou significativamente o tempo de reao dor em relao ao controle, o que demonstra claramente a existncia de efeito analgsico (Figura 29). A importncia da utilizao desta via foi analisada acima, quando discutimos os resultados do teste de contores.

O ltimo teste realizado no presente trabalho foi o teste do tail flick, com a finalidade de se esclarecer a presena ou no de ao analgsica medular no fator. Este teste largamente utilizado para testar drogas analgsicas que interferem na nocicepo espinhal (JACOB &

RAMABADRAN, 1978; BARS, 2001), envolvendo o movimento reflexo de origem espinhal rpido e vigoroso de retirada da cauda (RAFFA et al., 1992; SMITH et al., 1943; D'AMOUR & SMITH, 1941).

No teste do tail flick, o fator administrado por via i.p., nas doses de 2 e 5mg/Kg, aumentou significativamente o tempo de reao dor, em relao ao controle, o que demonstra claramente a existncia de efeito analgsico a nvel medular no sistema nervoso central (Figura 30). Como o efeito antinociceptivo foi proporcional ao aumento da dose, identifica-se um efeito dose-dependente, sugerindo a atuao deste composto em receptores farmacolgicos.

Neste teste, os efeitos antinociceptivos do fator e da morfina obtidos com a mesma dose (5mg/Kg) diferiram significativamente. Nesta dose, o fator aumentou em 306% o tempo de retirada da cauda do animal imersa em banho maria, em relao ao controle, enquanto a morfina inibiu 241% dessas respostas. Comparando-se mol a mol, o efeito antinociceptivo do fator (x = 19,02 e peso molecular de 400) foi cerca de 80% mais potente que a morfina (x = 15 e p.m. de 285,3).
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Neste teste, a naloxona (5mg/Kg, i.p.) administrada 20 minutos antes, bloqueou significativamente os efeitos antinociceptivos do fator (5mg/Kg, i.p.) demonstrando que o seu mecanismo de ao envolve o sistema opide.

importante tambm ressaltar que por v.o, nas doses de 5 e 10mg/Kg, o fator aumentou significativamente o tempo de reao dor em relao ao controle, o que demonstra claramente a existncia de efeito analgsico (Figura 32). A importncia da utilizao desta via foi analisada acima, quando discutimos os resultados do teste de contores.

Na atualidade, as dores agudas intensas vm sendo tratadas pela morfina e seus derivados opiides sintticos. Apesar de este tratamento ser considerado eficaz, a morfina apresenta importantes efeitos colaterais, como a depresso respiratria, constipao e dependncia fsica e psicolgica, efeitos envolvidos principalmente com a estimulao dos receptores opiides do tipo . Assim, a busca de novos derivados opiides mais potentes e que apresentem menos efeitos colaterais tem sido intensa nos ltimos anos (CHALMERS, 2005).

No presente estudo, purificamos uma nova substncia do veneno de Rhinella schneideri, que apresentou potncia analgsica superior da morfina em todos os testes de nocicepo utilizados por via i.p.. Os seus efeitos antinociceptivos foram tanto perifricos como centrais (crebro e medula) e atuaram em dores de origem neurognica e inflamatria. A ao analgsica do fator por v.o. pode ser considerada de grande importncia, uma vez que tal propriedade poder facilitar, no futuro, os testes teraputicos no homem.

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Embora o naloxone sugira o envolvimento do sistema opiide no mecanismo de ao do fator, estudos posteriores sero necessrios para determinar se realmente h participao dos receptores opides tipos , e , ou o envolvimento de outro mecanismo, como a estimulao da liberao endgena de encefalinas e endorfinas.

Concluindo, aps a determinao final da estrutura qumica do fator, podero ser abertas perspectivas para a sua sntese e utilizao como modelo para desenvolvimento de novas drogas analgsicas.

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7. CONCLUSES

1. Um novo fator foi purificado com sucesso em larga escala do veneno de Rhinella schneideri com um rendimento de 5%, que pode ser considerado bom, permitindo-se obter grandes quantidades para o estudo em pauta;

2. O fator mostrou efeitos antinociceptivos para dores agudas, nos testes clssicos de contores e placa quente, cerca de 50% e 252% mais potentes que a morfina (mol a mol), respectivamente;

3. O mesmo apresentou efeitos antinociceptivos contra dores neurognicas e inflamatrias 114% e 61% mais potentes que a morfina (mol a mol), respectivamente;

4. Todos os seus efeitos antinociceptivos foram revertidos pelo naloxone, mostrando o provvel envolvimento do sistema opioide no mecanismo de ao deste fator;

5. A sua ao analgsica por v.o. pode ser considerada de grande importncia, uma vez que tal propriedade poder facilitar, no futuro, os testes teraputicos no homem.

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