Cultivos Sumergidos

Cultivos de lneas celulares en suspensin: suspensin:

Conjunto de clulas homogneas o agregados celulares, suspendidas en medio lquido que constituyen una lnea celular

Cultivo de clones en suspensin :

Cuando la lnea celular se establece a partir de una sola clula

Obtencin

Disgregacin mecnica de callos friables

Para obtener clulas finamente suspendidas son necesarios varios repiques y generaciones celulares

Tamiz (300 a 500 m)

Callo friable

1st repique

2nd Repique

Las clulas en suspensin son generalmente similares a clulas de tipo parenquimticas: presentan grandes vacuolas poco citoplasma estn rodeadas de una pared celular fina Gran tamao (10-100M) Tienden a la formacin de agregados Presentan crecimiento lento Presentan baja demanda de oxgeno pero no pueden vivir en anaerobiosis

A filamentous cell of a shoot cell suspension of Erythrina

A filamentous septated cell dividing actively at one end to form an aggregate

A giant filamentous cell (G) Note the difference in the size between the giant cell, the smaller generally occurring filamentious cells and the isodiametric cell.

A giant (G) and normal (N) isodiametric cell in a shoot cell suspension culture of Erythrina.

Los agregados de cientos de clulas son el resultado de la no dehiscencia luego de la divisin celular. Se pueden presentar inconvenientes como la generacin de gradientes en el suministro de nutrientes.

A typical aggregate of small, viable, isodiametric cells of a shoot cell suspension culture of Erythrina which occurs in the the exponential and linear growth phases

Agitacin

entre 70 y 150 rpm

asegurar la aireacin evitar la ruptura de las paredes celulares rgidas debido al alto porcentaje de celulosa y al gran tamao de las clulas vegetales (de 10 a 100mm).

formas de cultivar suspensiones

Cultivos en Batch Se utiliza un volumen de medio finito durante cada ciclo de cultivo que se preolonga hasta que algun nutriente se convierta en limitante (frecuentemente la fuente de C)

Cultivos continuos o semicontinuos El medio de cultivo es rellenado o reeemplazado durante el ciclo

Agitadores orbitales

Orbital shaker 30-150 rpm

Parmetros para expresar la tasa de crecimiento:

Peso Seco: Consiste en filtrar el volumen de suspensin tomado como muestra, secarlo, con vaco, a 50 C hasta peso constante. La desventaja que presenta este mtodo es que se destruye el material vegetal. Peso Fresco: En este caso se filtra el material vegetal y se pesa. La desventaja es que este dato puede ser falso, si el aumento de peso se debe a aumento de volumen celular y no a un aumento irreversible de masa celular. Volumen de empaquetamiento (VPC): Relacin de volumen de clulas referido al volumen de suspensin. Se basa en centrifugar en tubo graduado a 3000 r.p.m. durante 5 minutos una fraccin de suspensin celular. VPC = volumen de clulas volumen de suspensin

Comparacin entre peso fresco y peso seco

Las clulas en suspensin presentan

Tiempos de duplicacin de 24-72 h superiores ndices de crecimiento que los callos

Posibilidad de perder la totipotencia

Habituacin hormonal

Cambios en niveles de ploida

Baja resistencia al stress mecnico

Cultivos contnuos

Cultivos contnuos
Cultivos contnuos cerrados: Se remueve parte del medio metabolizado y se reemplaza con medio fresco en forma contnua o peridica. Al finalizar el ciclo se cosechan clulas y medio. Cultivos contnuos abiertos Se remueve medio de cultivo pero tambin clulas se mantiene la densidad celular a niveles ptimos.

Cultivos contnuos cerrados: Presentan fases exponencial, lineal y estacionaria muy extendida Se mantiene la viabilidad celular en fase estacionaria

Cultivos contnuos abiertos: El cultivo puede ser sostenido en cualquier fase de crecimiento por aos

Cultivo contnuo cerrado

Crecimiento Cultivo en batch

10

15

20

25

Tiempo (das)

Cultivos en suspensin

Embriogenesis Biotransformaciones

Protoplastos Metabolitos secundarios Modificacin celular

Semillas artificiales

Transferencia de genes

Fusin