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Abstrato
A interao de 18 methoxycoronaridine (18-MC) com os receptores nicotnicos de acetilcolina (AChRs) foi comparada com a de ibogana e fenciclidina (PCP). Os resultados estabeleceram que a MC-18: (a) mais potente do que a ibogana e PCP inibio ()-epibatidina RACh induzida por Ca 2 + afluxo. A potncia de 18-MC aumentada aps perodos mais princubao, o que est de acordo com o aumento da [ 3 H] de ligao para repouso, mas activvel citisina Torpedo AChRs, (b) liga-se a um nico stio no torpedo RACh com alta afinidade e inibe a [ 3 H] ligao a AChRs dessensibilizadas de forma estrica de TCP, o que sugere a existncia de locais de sobreposio. Isto suportado pelos nossos resultados indicam que o encaixe 18-MC interage com um domnio localizado entre a serina (posio 6 ') e valina (posio 13'), anis, e (c) inibe a [ 3 H] TCP, [ 3 H] ibogana e [ 3 H] 18-MC ligao a AChRs dessensibilizadas com maior afinidade em relao ao AChRs repouso. Isto pode ser parcialmente atribudo a uma velocidade de dissociao mais lenta do RACh dessensibilizado comparado com o da AChR de repouso. A contribuio entlpica mais importante do que a contribuio entrpica MC-18 quando se liga ao RACh dessensibilizado comparado com o da AChR de repouso, e vice-versa. Ibogana anlogos inibem a AChR interagindo com um domnio luminal que partilhada com o PCP, e por induzir dessensibilizao.
1. Introduo
Receptores de acetilcolina nicotnicos (AChRs) so membros do ligando -gated ion canal superfamlia de circuito Cys que tambm inclui os tipos A e C, cido -aminobutrico (GABA), o tipo 3 a 5-hidroxitriptamina (serotonina), e receptores de glicina (revisto em [ 1] , [2] , [3] , [4] e [5] ). O alcalide ibogana e os seus anlogos naturais e sintticos farmacologicamente se comportam como antagonistas no competitivos (ANC) de vrios AChRs [6] , [7] e [8] . Postulase que esta atividade inibitria est relacionado com as suas propriedades anti -aditivas [8] , [9] , [10] , [11] e [12] . Em particular, 18-methoxycoronaridine (MC-18) tem uma maior especificidade para o 34 RACh [9] . Este subtipo de receptor expressa em quantidades relativamente elevadas no percurso habenulo -interpeduncular que modula a via mesocorticolmbica, o denominado "circuito de recompensa do cre bro" [8] , [9] , [10] e [11] . Considerando essas evidncias, possveis papis para AChRs no processo de dependncia de drogas e, conseqentemente, como alvos para a ao farmacolgica dos medicamentos anti-dependncia tem sido sugerido [10] . Uma melhor compreenso da interao de anlogos da ibogana com AChRs crucial para desenvolver novos compostos para terapias anti-aditivas mais seguras. No entanto, no temos a informao estrutural e funcional da interaco de MC 18 com o seu local de ligao (s) quando o RACh est em diferentes estados conformacionais, especialmente considerando que a dessensibilizao RACh parece desempenhar um papel importante no processo da dependncia de drogas (revisto em [13] ). Como uma primeira tentativa de estudar esta interaco que escolheu o tipo muscular RACh porque o arqutipo do ligando-gated ion canal superfamlia de circuito Cys e porque pode manipular os diferen tes estados conformacionais do receptor numa variedade de in vitro ensaios. Ns tambm usamos este tipo AChR particular, porque os locais do stio de ligao de vrias ANC j foram identificados, incluindo o de fenciclidina (PCP) [14] , [15] , [16] , [17] , [18] e [19] (revisto em [3] ). Aproveitando esse conhecimento prvio, a interao mtua entre 18-MC e PCP na CADH comparado. Para refinar nossa compreenso da interao entre MC e 18 da CADH, comparamos essa interao com a de ibogana, o arqutipo desta famlia de drogas. Para atingir estes objectivos, foi utilizado abordagens bioqumicas e funcionais, incluindo ensaios de ligao de radioligandos empregando vrias ANC {isto , [ 3 H] 18-MC, [ 3 H] ibogana, e [ 3 H] TCP, o anlogo de PCP [piperidil 3, 4 - 3 H ( N )] - N - (1 - (2 tienil) ciclo-hexil) -3,4piperidina} e o agonista [ 3 H] citisina, bem como Ca
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modelagem molecular e estudos de ancoragem. Embora este estudo no pretende determinar as propriedades antiaditivas da ibogana anlogos, os resultados deste trabalho ir pavimentar o caminho para uma melhor compreenso de como esses compostos interagem com a CADH.
2. Materiais e mtodos
2.1. Materiais
[Piperidil-3, 4 - 3 H ( N )] - ( N - (1 - (2 tienil) ciclo-hexil) -3,4-piperidina) ([ 3 H] TCP, 45 Ci / mmol) e [ 3 H ] citisina cloridrato (35,6 Ci / mmol) foram obtidos a partir da PerkinElmer Life Sciences Products, Inc. (Boston, MA, EUA), e armazenados em etanol a - 20 C. [ 3 H] 18-Methoxycoronaridine ([ 3 H] 18-MC, 25 Ci / mmol) foi preparado por American Radiolabeled Chemicals Inc. (St. Louis, MO, EUA), trtio rotulagem do sal de cloridrato de 18 -methoxycoronaridine sintetizado como anteriormente descrito [12] . [ 3 H] Ibogaine (23 Ci / mmol), hidrocloreto de ibogana, e cloridrato de fenciclidina (PCP) foram obtidos por meio do Instituto Nacional sobre Abuso de Drogas (NIDA) (NIH, Baltimore, EUA). Cloreto carbamilcolina (CCh), dicloreto suberyldicholine, pepstatina A, leupeptina, aprotinina, calpana I, calpana II, benzamidina, colesterol, fosfatidilserina, esf ingomielina, cido fosfatdico, fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF), polietilenoimina, colato de sd io, albumina de soro bovino (BSA) e ()-epibatidina foram adquiridos da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA). bungarotoxina (BTX-) foi obtido a partir de Invitrogen Co. (Carlsbad, CA, EUA). [1 - (dimetilamino)-naftaleno-5sulfonamido] perclorato ethyltrimethylammonium (dansyltrimethylamine) foi adquirido a partir de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL, EUA). De soro fetal bovino e tripsina / EDTA foram adquiridos a partir de Gibco BRL (Paisley, Reino Unido). Os sais foram de grau analtico.
2.2. Preparao de torpedo de membranas nativas RACh, coluna de cromatografia de afinidade de membrana celular (CMAC), e sistema de cromatografia
Membranas nativas RACh foram preparados a partir de congelados Torpedo californica rgos eltricos obtidos a partir Aquatic Research Consultants (San Pedro, CA, EUA), diferencial e sacarose centrifugao em gradiente de densidade, como descrito anteriormente [20] . Protena de membrana total RACh foi determinada usando o ensaio de protena do cido bicinconnico (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EUA). As actividades especficas destas preparaes de membrana foi determinada pelo decrscimo em dansyltrimethylamine (6,6 uM) a fluorescncia produzida pela titulao de suberyldicholine em suspenses de receptores (0,3 mg / mL), na presena de 100 uM PCP e variou 1,0 -1,2 nmol de ligao suberyldicholine sites / mg de protenas totais (RACh 0,5 -0,6 nmol / mg de protena). As preparaes de membrana RACh foram armazenadas a - 80 C em 20% de sacarose. O CMAC- torpedo coluna RACh foi preparado pela imobilizao de solubilizadas Torpedo membranas RACh seguindo um protocolo previamente descrito [21] e [22] . Torpedo membranas RACh (500 mg) foram homogeneizados em tampo A primeira (mM de tampo Tris-HCl 50, pH 7,4, contendo 1 mM de pepstatina A, 20 mM de leupeptina, 1 mM de aprotinina, 1 mM de calpana I, calpana II, 1 mM, benzamidina 1 mM, 2 mM de MgCl 2 , 3 mM de CaCl 2 , NaCl 100 mM, KCl 5 mM, e 0,2 mM de PMSF), e, subsequentemente, solubilizado em tampo A contendo colato de 2% (w / v) de sdio e 10% (v / v) de glicerol, na presena de 100 nM de colesterol, fosfatidilserina 60 uM, 20 uM esfingomielina, e 60 uM fosfatdico cido. Ento, 200 mg da monocamada artificial imobilizada (IAM) fase estacionria por cromatografia lquida (ID = 12 uM, 300 de um poro; Regis Chemical Co.) foi suspenso no sobrenadante, e a mistura foi rodada a temperatura ambiente (TA) durante 1 h. A suspenso foi dialisada durante 1 dia contra 1 L de mM de tampo Tris -soluo salina 50, a pH 7,4, contendo 5 mM de EDTA, 100 mM de NaCl, 0,1 mM de CaCl 2 e 0,1 mM de PMSF. A suspenso foi ento centrifugada a 700 x g a 4 C e o sedimento ( Torpedo -IAM) foi lavada trs vezes com tampo de acetato de amnio 10 mM, pH 7,4. A fase estacionria foi empacotada numa HR 5/2 coluna (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA) para se obter um 150 mm x 5 mm (ID) de cama cromatogrfica, o CMAC- torpedocoluna RACh.
Finalmente, o CMAC- torpedo coluna RACh foi ligado ao sistema cromatogrfico Srie 1100 Liquid Chromatography / Mass Selective Detector (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EUA), equipado com um vcuo de -gaseador (L 1322 D), uma bomba de binrio ( 1312 A), um amostrador automtico (G1313 A) com uma ansa de injeco de 20 uL, de um detector selectivo de massa (G1946 B) fornecido com ionizao a presso atmosfrica electropulverizao e um sistema de gerao de azoto em linha (Whatman, Haverhill, MA, EUA). O sistema cromatogrfico foi conectado a um computador MHz Kayak XA 250 (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA, EUA) rodando software ChemStation (Rev B.10.00, HewlettPackard). Uma amostra de 10 mL de 10 fiM de MC-18 foi injectada na CMAC- torpedo coluna RACh, e o alcalide foi monitoriza da no modo de io positivo com monitorizao de ies nico a m / z = 369,1 [PM + H] + io com o capilar tenso a 3000 V, a presso do nebulizador a 35 psi e o fluxo de gs de secagem a 11 L / min a uma temperatura de 350 C.
2.3. Ca 2 + medies influxo TE671 em clulas que expressam AChRs msculo fetais humanos
A linha de clulas TE671 uma linha celular rabdomiossarcoma humano (obtidas da American Type Culture Collection, EUA), que expressa endogenamente o RACh msculo fetal humano (isto , 11). Este subtipo de receptor tem a mesma composio como a subunidade do torpedo AChR e, assim, as correlaes comparativos podem ser avaliadas. TE671 clulas foram cultivadas numa mistura 1:1 de Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) e de Ham F12 Mistura de Nutrientes (Seromed, Biochrom, Berlim, Alemanha), suplementado com 10% (v / v) de soro fetal bovino, como previamente descrito [22] , [23] e [24]. DMEM / Ham 's F-12 contm 1,2 g / l de NaHCO 3 , 3,2 g / L de sacarose, e glutamina estvel ( L -alanil- L -glutamina, 524 mg / L). As clulas foram incubadas a 37 C, 5% de CO 2 e 95% de humidade relativa. As clulas foram passadas a cada 3 dias, ao dissociar as clulas do frasco de cultura por lavagem com tampo fosfato salino e incubao breve (3-5 min), com tripsina (0,5 mg / ml) / EDTA (0,2 mg / mL). Ca 2 + influxo foi determinada como descrito anteriormente [22] , [23] e [24] . Resumidamente, 5 x 10 4 culas por po TE671 foram inoculadas 72 horas antes do ensaio em placas pretas de 96 poos (Costar, Nova Iorque, EUA) e incubou -se a 37 C numa atmosfera humidificada (5% de CO 2 / 95% ar). 16-24 h antes da experincia, o meio foi mudado para BSA a 1% em soluo salina tamponada com Hepes (HBSS) (NaCl 130 mM, KCl 5,4 mM, 2 mM de CaCl 2 , 0,8 mM de MgSO 4 , 0,9 mM de NaH 2 PO 4 , glucose 25 mM, HEPES 20 mM, pH 7,4). No dia do ensaio, o meio foi removido sacudindo as placas e substitudo por 100 uL de HBSS / BSA a 1% contendo 2 pM de Fluo -4 (Molecular Probes, Eugene, Oregon, EUA) na presena de 2,5 mM de probenecida (Sigma , Buchs, Sua). As clulas foram ento incubadas a 37 C numa atmosfera humidificada (5% de CO 2 / 95% ar) durante 1 h. As placas foram desviaram-se para remover o excesso de Fluo-4, lavadas duas vezes com HBSS / BSA a 1% e, finalmente, de novo com 100 mL de HBSS contendo diferentes concentraes do ligando em estudo, e pr-incubado durante 5 minutos, ou durante 4 e 24 h no caso de 18-MC. Para determinar o mecanismo de inibio para 18-MC, experincias adicionais foram realizados atravs da pr -incubao das clulas com 1, 10 e 100 fiM de MC-18, respectivamente, antes da ()-epibatidina induzida por Ca
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determinaes influxo.
As placas foram ento colocados em placa de clulas na fase do leitor fluorimtrico imagiologia placa (FLIPR) (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Uma linha de base consistindo de 5 medies de 0,4 de cada um foi gravado. ()Epibatidina (1 | iM) foi ento adicionada a partir da placa de agonista para a placa de clulas utilizando o pipetador de 96 FLIPR ponta simultaneamente s gravaes de fluorescncia para um comprimento total de 3 min. O laser de excitao e emisso de comprimentos de onda so 488 e 510 nm, em um W, e uma abertura cmera CCD de 0,4 s.
alquotas e concentraes crescentes de [ 3 H]-18-18 + MC MC (ou seja, 0,07 nM, 1,2-uM) foram adicionados a cada tubo e incubou-se durante 2 h TA. A ligao no especfica foi determinada na presena de 100 uM de MC -18. A ligao especfica foi calculada como a ligao total (sem 18-MC) menos a ligao no especfica (na presena de 18MC). RACh-bound [ 3 H] 18-MC foi ento separado do radioligando livre por filtrao, utilizando um ensaio de uma amostra de 48 colhedora com filtros GF / B Whatman Inc. (Brandel, Gaithersburg, MD, EUA), previamente embebidos com 0,5% polietilenimina durante 30 min. Os filtros de membrana contendo foram transferidos para frascos de cintilao com 3 ml de Bio-Safe II (Research International Product Corp, Mount Prospect, IL, EUA), e a radioactividade foi determinada utilizando um contador de cintilao Beckman 6500 (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, EUA). Utilizando o software Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA), os dados de ligao foram aj ustados de acordo com a equao de Rosenthal-Scatchard [25] : Equao( 1 )
[ B ] / [ F ] = - ([ B ] / K d) + ( B max / K d)
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onde a constante de dissociao ( K d ) para o [ 3 H] 18-MC obtido a partir da recproca negativa do declive. A estequiometria de [ 3 H] 18-MC stios de ligao na preparao de membrana pode ser calculado a partir do x -intersectam (quando y = 0) da parcela [ B ] / [ F ] vs [ B ], em que o valor obtido corresponde com o nmero de [ 3 H] 18-MC locais de ligao ( B max ) por a concentrao utilizada de protenas totais (0,5 uM).
2.5. Experimentos de ligao radioligante usando Torpedo AChRs em diferentes estados conformacionais
Para determinar a afinidade de ligao dos anlogos da ibogana para o torpedo AChR de canal inico, a influncia de 18MC em [ 3 H] TCP de ligao, o efeito do PCP, ibogana, e 18-MC em [ 3 H] 18-MC de ligao, e o efeito de 18-MC em [ 3 H] ligao a ibogana Torpedo AChRs em diferentes estados conformacionais foi estudada. A este respeito, as membranas nativas RACh (0,3 uM) foram suspensos em tampo de BS com 7 nM de [ 3 H] TCP 3,6 nM ou [ 3 H] 18-MC ou 19 nM de [ 3 H] ibogana, na presena de 1 mM de (CCh insensveis / estado CCh -bound), ou com 15 nm [ 3 H] TCP ou 5,5 nM de [ 3 H] 18-MC, na presena de 1 mM -BTX (repouso / estado -BTX-bound) e pre- incubou-se durante 30 min TA. -bungarotoxina um antagonista competitivo que mantm a AChR no estado de repouso (fechado) [26] . A ligao no especfica foi determinada na presena de 50 uM PCP (para a [ 3 H] TCP e [ 3 H] experincias ibogana no estado insensveis / CCh acoplado), 50 uM de MC -18 (para a [ 3 H] 18 - MC experimentos no estado insensveis / CCh Bound), ou de 100 uM PCP ou 100 uM de MC-18 (para a [ 3 H] TCP e [ 3 H] 18-MC experimentos no estado de repouso / -BTX-bound , respectivamente), tal como foi usado anteriormente[14] , [15] , [16] , [17] , [22] e [24] . Para determinar se o 18-MC e modular a ligao a ibogana AChRs agonista, Torpedo membranas RACh (0,3 uM) foram incubadas com 7,7 nM de [ 3 H] citisina no estado de repouso, mas activvel (nenhum outro ligando presente), como descrito anteriormente [24] . A ligao no especfica foi determinada na presena de 1 mM CCh. O volume total foi dividida em aliquotas, e concentraes crescentes do ligando em estudo f oram adicionados a cada tubo e incubou-se durante 2 h TA. RACh radioligando ligado foi ento separado do radioligando livre por filtrao, utilizando o ensaio descrito na Seco 2.4 . Os dados concentrao-resposta foram curva montado por meio de anlise de mnimos quadrados no -linear utilizando o software Prism. O IC correspondentes a 50 valores foram calculados utilizando a seguinte equao: equao( 2 )
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onde a quantidade fraccionada de radioligando ligado na presena de inibidor na concentrao [ L ] em comparao com a quantidade de radioligando ligado na ausncia de inibidor (ligao total). IC 50representa a concentrao de inibidor em que = 0,5 (50% de ligao), e n H o coeficiente de Hill. Os nH valores foram resumidos na Tabela 2 . O IC observados 50 valores dos ensaios de competio descritos acima foram transformados em constantes de inibio ( K i valores) usando a relao de Cheng-Prusoff [27] : equao( 3 )
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em que [ligando] a concentrao inicial do radioligando utilizado (isto , [ 3 H] TCP, [ 3 H] 18-MC, [ 3 H] ibogana), e K d ligando a constante de dissociao de [ 3 H] TCP em repouso (0,83 uM; [15] ) e insensveis (0,25 uM; [28] ) afirma, [ 3 H] ibogana (5,4 uM; [29] ) e [ 3 H] 18-MC no estado insensveis ( 0,23 uM, ver fig. 2 ). O valor de [ 3 H] 18-MC no estado de repouso foi tirado do [ 3 H] experimentos TCP concorrncia (1,4 mM, ver Tabela 2 ). Alm disso, a variao de energia livre ( L ) para a interaco entre as ANC com o receptor foi determinada usando a seguinte equao (revisto em [1] ): equao( 4 )
L = R T ln K i
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-1
das tramas de acordo com a eq. (2) . Em seguida, marcamos a proporo entre os IC
50
/ IC
50 de
controlo
ver [14] ). Uma relao linear desta trama do tipo de Schild modificado poderia indicar uma interaco competitiva, enquanto que uma relao no-linear, sugeriria um mecanismo alostrico de inibio [14] e [30] .
anteriormente [21] e [22] . A primeira srie de experincias foi realizada na presena de 1 nM -BTX (a AChR principalmente no estado de repouso, ver [26] ), e um segundo conjunto de experincias foi determinada em paralelo, na presena de 0,1 uM ( )-epibatidina (CADH principalmente no estado insensveis). Na abordagem da cromatografia no-linear, traos cromatogrficas assimtricos dependentes de concentrao so observadas devido lenta velocidade de adsoro / dessoro. A abordagem matemtica utilizada neste estudo para resolver essas condies no-linear era o impulso de entrada da soluo [31] .Os dados foram analisados por meio de cromatografia PeakFit v4.12 para Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA), seguindo um protocolo previamente relatada [21] e [32] . Foram apresentados os detalhes desta abordagem e sua aplicao para a determinao da cintica de ligao da ANC para AChRs neuronais anteriormente [21] , [32] e [33] . Resumidamente, os picos resultantes foram ajustados ao modelo de soluo de entrada de impulso, ajustando quatro variveis, ou seja, uma 0 - um 3 . A uma 2 varivel foi directamente usado para o clculo da taxa constante de dissociao ( k off ) de acordo com a seguinte equao: equao( 5 )
k off = 1 / ( a
)
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em que o tempo morto da coluna, t 0 , determinado como o tempo necessrio para a eluio da gua. Aum 3 valor foi utilizada para calcular a constante de associao ( K a ) para a formao do complexo ligando-receptor em equilbrio utilizando esta relao: equao( 6 )
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onde [18-MC] a concentrao de 18-MC. Tanto K um e k off valores podem ser usados para calcular a velocidade de associao mais constante, k em ( k on = K um k off ).
ln K a = ( S / R ) - ( H / R ) (1 / T ),
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onde o K um valores foram obtidos usando eq. (6) , e S e H a variao de entropia padro e variao de entalpia padro, respectivamente. Estes parmetros foram calculados utilizando a inclinao ( H = - Declive R ) e Y intersectam-( S = y -intersectam R ) valores das parcelas. Alm disso, a contribuio entrpica foi calculada como - T S , e a mudana na energia livre de 293K ( L 20 ) foi calculada utilizando a equao de Gibbs-Helmholtz (revisto em [1] ):
equao( 8 )
20
= H - t S .
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O k off . valores obtidos usando a equao (5) , tambm foram utilizados para construir as tramas de Arrhenius para determinar a energia de activao ( E a ) do processo de dissociao, de acordo com a equao de Arrhenius (revisto em [1] ): equao( 9 )
ln k off = ln A - ( E a / R ) (1 / T ),
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onde A o factor de Arrhenius ou pr-exponencial, e E um foi determinado a partir do declive do grfico (E um = - Declive R ). Por sua vez, a E a valores foram utilizados para calcular a variao da entalpia do estado de transio ( H + ), de acordo com a seguinte equao (revisto em [1] ): a equao( 10 )
= E a- R T .
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2.9. Acoplagem molecular de 18-MC RACh nos canais inicos do tipo muscular
As sequncias de aminocidos dos segmentos transmembranares M2 do canal inico RACh so altamente conservadas entre espcies diferentes e subunidades. No entanto, a numerao absoluta dos resduos de aminocidos varia grandemente entre as subunidades, assim, os resduos em M2 do RACh subunidades so referidos aqui utilizando o Prime nomenclatura (1 'a 20') que corresponde aos resduos Met
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metas vinculativas para a modelagem foram utilizados pela primeira vez um modelo estrutural da regio do poro de AChR com base na estrutura do microscpio crio-eletrnico Torpedo AChR determinado em ~ 4 de resoluo (PDB ID 2BG9 ) [34] e [35] . Posteriormente, um modelo da CADH msculo humano subtipo foi construda a aplicao de mtodos de modelagem de homologia / comparativa sobre o Torpedo 2BG9 como um modelo. As simulaes computacionais foram realizadas utilizando o mesmo protocolo como relatado recentemente[17] e [22] . No primeiro passo, as molculas de 18-MC em qualquer forma protonada ou neutro foram esboado usando HyperChem 6,0 (HyperCube Inc., Gainesville, FL), utilizando o mtodo optimizado semiemprico AM1 (Polak-Ribiere algoritmo para um gradiente inferior a 0,1 kcal / / mol), e, em seguida, transferidos para o passo subsequente de ligando de ancoragem. O Molegro virtual encaixe (MVD 2008.2.4.0 Molegro ApS Aarhus, Dinamarca) foi usado para o encaixe simulaes de ligandos flexveis no modelo RACh alvo rgida. O espao de encaixe era limitado e centrado no meio do canal de ies e alargado suficiente para assegurar a cobertura do canal de todo o domnio de simulaes de amostragem (espao de encaixe foi definida como uma esfera de 21 de dimetro). O encaixe simulaes reais foram realizados usando as seguintes configuraes: nmeros de roda = 100, nmero mximo de iteraes = 10000,
nmero mximo de poses = 10, e a pose representa o valor mais baixo da funo de pontuao (MolDockScore) para 18 MC foi posteriormente analisadas.
3. Resultados
3.1. Inibio de ()-epibatidina mediada por Ca 2 + afluxo em clulas TE671 por MC-18, ibogana, e fenciclidina
Uma vez que no existe informao anterior sobre a interaco de anlogos ibogana com AChRs musculares, Ca
+ 2
foram realizadas experincias de influxo para comparar a potncia inibidora de 18-MC com que, para a ibogana e
PCP. Primeiro, a potncia de activao de ()-epibatidina foi determinada (CE 50 = 0,26 0,04 uM; . Fig. 1 ), seguindo o aumento de fluorescncia em clulas TE671-RACh h11 produzido por ()-epibatidina induzida Ca 2 + afluxo tal como descrito anteriormente [22] e [24] . Para comparar a potncia inibidora (IC
50
foram pr-incubadas (5 min) com cada ligando e as suas propriedades inibidoras foram avaliadas por ()-epibatidina induzida por Ca 2 +experincias influxo ( Fig. 1 A). Os valores observados para a ibogana (17,0 3,0 uM) e PCP (31,0 2,0 mM) ( Tabela 1 ) foram estatisticamente idntico ao obtido por
86
msculo humano [7] . Os nossos resultados indicam que 18-MC (6,8 0,8 uM) de ~ 2 vezes mais potente do que a ibogana, o arqutipo membro desta famlia de drogas, e ~ 4 vezes ma is potente do que o PCP ( Tabela 1 ). Os resultados tambm indicam que a MC-18 inibe a AChR h11 de uma forma dependente da dose e no competitivos ( Fig. 1 C). Curiosamente, os perodos de tempo pr-incubao aumentar a potncia de 18-MC por ~ 2 vezes ( Fig. 1. B, Tabela 1 ). O mesmo efeito foi observado tanto em 4 ou 24 hor as de pr-incubao. Uma explicao bvia que os RACh insensvel na presena prolongada de 18-MC, e, assim, a afinidade e a potncia de 18-MC aumentada. No entanto, no podemos descartar outros mecanismos pleiotrpicos, como a modulao da AChR fosf orilao.
FIG. 1. Efeito de 18-methoxycoronaridine (MC-18), ibogaina, e PCP em ()-epibatidina induzida por influxo de clcio em clulas TE671 -h11. (A) aumento das concentraes de ()-epibatidina () ativar o AChR h11 com potncia EC 50 = 0,26 0,04 mM ( n H = 1,23 0,06). Subsequentemente, as clulas foram pr-tratadas durante 5 min com vrias concentraes de 18 -MC (), ibogana () e PCP (), seguido pela adio de 1 uM ()-epibatidina. (B) a mais de pr-tratamento aumenta a potncia inibidora de 18-MC em ()-epibatidina induzida por influxo de clcio em clulas TE671-h11. Perodos de pr-tratamento foram: 5 min (), 4 h () e 24 h (), respectivamente. Respostas em ambos os lotes foram normalizados para a resposta ( )-epibatidina mxima que foi definida como 100%. O IC calculado 50 e n H valores esto resumidos na Tabela 1 .(C) O pr-tratamento com 1 (), 10 (), e 100 ^ M 18-MC (), respectivamente, inibe a ()-epibatidina induzida por influxo de clcio em clulas TE671-h11 numa dose dependente e no competitivo maneira. As parcelas so representativos de vinte e sete (), nove (), seis (), trs () e trs (, , , ) determinaes, respectivamente, onde as barras de erro representam o desvio padro ( SD) valores Tabela 1. Potncia inibidora de 18-MC, ibogana, e PCP no msculo AChRs embrionrias humanas obtidas por Ca NCA 18-MC O tempo de pr-incubao (min) 5 240 1440 Ibogaine PCP um
Concentrao de droga necessria para produzir 50% de inibio do agonista activado RACh canal de fluxo de ies, obtida a par tir de fig.1 .
2+
medies influxo.
IC 50 (M)
um
nH
6,8 0,8 3,2 1,7 2,8 1,1 17,0 3,0 31,0 2,0
1,56 0,15 1,90 0,20 1,61 0,13 2,00 0,29 2,30 0,04
5 5
b
Coeficiente de Hill.
a Torpedo membranas RACh no insensveis / estado CCh-bound. Fig. 2 B mostra o grfico Rosenthal-Scatchard para esta ligao especfica. Os resultados indicam que o torpedo RACh canal inico tem um nico [ 3 H] 18-MC local de ligao (razo estequiomtrica = 0,86 0,13 stios de ligao / RACh) relativamente elevada afinidade ( K d = 0,23 0,04 uM).
FIG. 2. Vinculativo de equilbrio de [ 3 H] 18-MC para Torpedo AChRs no estado insensveis / CCh-bound. (A) total (), inespecfica () (na presena de 100 uM de MC-18), e especfico () (total - ligao no especfica) [ 3 H] 18.-MC ligao TorpedoRACh membranas nativas (0,5 fiM) foram suspensas em tampo de SB, na presena de 1 mM de CCh, e pr -incubadas durante 30 min TA. Em seguida, o volume total das suspenses de membrana (total e a ligao no especfica) foi dividido em alquotas e concentraes crescentes de [ 3 H]-18-18 + MC MC (ou seja, 0,07-1,2 uM) foram adicionados a cada tubo e incubou-se durante 2 h RT. Finalmente, a AChR-bound [ 3 H] 18-MC foi separado do ligando livre utilizando o ensaio de filtrao descritos na Seco 2.4 . (B)-Rosenthal trama de Scatchard para a [ 3 H] 18-MC de ligao especfica para otorpedo canal inico RACh. O K d de valor (0,23 0,04 uM) foi determinada a partir da recproca negativa do declive, de acordo com a eq. (1) . A proporo estequiomtrica (0,86 0,13 stios de ligao / RACh) foi obtido a partir do x -intersectam (quando y = 0) da parcela [ B ] / [ F ] vs [ B ], de acordo com a equao. (1) , tendo em conta a AChR a concentrao no ensaio. mostrada a combinao de duas experincias separadas.
Resting / estado -BTX-bound K i um (M) 1,4 0,1 ND 1,0 0,1 11 1 n Hb 0,89 0,06 ND 0,70 0,05 1,04 0,08 G c (kJ mol - 1 ) -33,4 0.2 ND -34,3 0.3 -28,3 0.2
G c (kJ mol - 1 ) -38,6 0.1 -35,5 0.3 -36,1 0.2 -28,7 0.2
[ 3 H] ibogana [ 3 H] 18-MC
Radioligante
NCA
Desensitized / estado CCh-bound K i um (M) n Hb 0,76 0,03 G c (kJ mol - 1 ) -36,4 0.1
Resting / estado -BTX-bound K i um (M) 0,73 0,05 n Hb 0,88 0,05 G c (kJ mol - 1 ) -35,0 0.2
0,41 0,03
Os valores foram calculados a partir de fig. 3 um grupo-C ([ 3 H] 18-MC experincias de competio), fig. 4 A ([ 3 H] TCP experincias de competio), e a FIG. 4 B ([ 3 H] ibogana experimentos de competio), respectivamente, utilizando eq. (3) .
b
Coeficiente de Hill.
c
Os valores foram calculados usando a equao. (4) , a temperatura experimental (298K).
Os resultados das experincias complementares indicam que o PCP se liga ao [ 3 H] 18-MC local com praticamente a mesma afinidade ( K i = 0,41 0,03 uM no estado insensveis, e 0,73 0,05 uM no estado de repouso, ver Tabela 2 ), como observado anteriormente por [ 3 H] TCP experincias de ligao de equilbrio no insensveis (0,25 0,05 | iM; [28] ) e de repouso (0,83 0,05 uM; [15] ) AChRs, respectivamente. O facto de que os calculados n H valores de 18-MC, ibogana, e PCP esto prximas da unidade ( Tabela 2 ) indicam que a MC-18 inibe a [ 3 H] 18-MC, [ 3 H] TCP e [ 3 H] ibogana ligao, e que o PCP inibe [ 3 H] 18-MC de ligao, de uma forma no-cooperativa. Estes dados sugerem que a ibogana e anlogos de PCP interagir com um nico local de ligao, e que esses medicamentos provavelmente inibem a ligao de forma estrica radioligando.
calculados por mnimos quadrados no lineares de acordo com a Eq. encaixam. (2) . mostrada a mdia de ensaios realizados em triplicado. (B) Modificao Schild-trama para uma inibio de 18-MC-induzida de [ 3 H] TCP de ligao. A trama mostra uma relao linear com r 2 valor de 0,92. mostrado o resultado de experincias realizadas em triplicado, em que as barras de erro representam o desvio padro (DP) valores.
Parmetro k off (s - 1 ) c k on (s
-1
Epibatidina tratado coluna b 0,077 0,001 0,228 0,003 2,97 0,01 -36,3 0.1
uM )
O CMAC- torpedo RACh coluna foi pr-tratado com -BTX um (a AChR principalmente no estado de repouso), ou ()-epibatidina b (a AChR principalmente no estado insensveis).
c, d
constantes foram determinadas empiricamente utilizando as Equaes. (5) e (6) , respectivamente, ao passo que o Kem valores foram valores foram calculados usando a equao. (4) .
-BTX tratado coluna um -18,5 1.1 -15,5 1,1 -34,0 1.4 16,4 0,7 13,9 0,7
Epibatidina tratado coluna b -25,0 1,1 -11,2 1,2 -36,3 1.4 22,4 1,5 20,0 1,5
H + (kJ mol - 1 ) g
O CMAC- torpedo RACh eluio da coluna foi realizada na presena de uma das -BTX um (a AChR principalmente no estado de repouso), ou ()-epibatidina b (a AChR principalmente no estado insensveis).
c, d
A termodinmica parmetros H e S foram calculados a partir Fig. 1 A (ver dados complementares ) de acordo com a eq. (7) . valores foram calculados usando a equao. (8) .
de e
Os valores para o processo de dissociao da droga foram obtidos a partir de fig. 1 B (ver dados complementares ) de acordo com a eq. (9) . Os valores foram calculados usando a equao. (10) .
Os resultados indicam que o termodinmicos H e - T S Os valores obtidos para os 18-MC no RACh repouso esto praticamente no mesmo intervalo energtico, ao passo que a contribuio entlpica mais do que duas vezes maior do que a contribuio entrpica no insensveis RACh ( Tabela 4 ). Isto indica que a contribuio entlpica mais importante no estado dessensibilizado comparado com que, no estado de repouso. Desde negativos H valores sugerem a existncia de foras atrativas (eg, van der Waals, ligaes de hidrognio e interaes eletrostticas) (revisto em [1] ), as interaes entre os 18-MC e do canal de on so mais fortes quando o AChR torna -se insensveis, aumentando a estabilidade da molcula no interior do canal de ies neste estado particular. Isto est de acordo com maiores G valores para a AChR dessensibilizado comparado com o do RACh repouso obtida por ensaios de ligao de radioligandos ( Tabela 2 ). Por outro lado, as alteraes conformacionais locais ou reorganizao solvente na bolsa de ligao do RACh repouso induzida por 18-MC mais pronunciada do que no local de ligao do RACh insensveis. Uma vez que apenas pequenas mudanas nos parmetros cinticos de 18 -MC entre os estados de descanso / -BTXbound e insensveis / epibatidina-bound a 20 C foram observadas (ver Tabela 3 ), estudos adicionais foram realizados no 10-25 Temperatura C. A este respeito, grficos de Arrhenius foram construdos utilizando a determinada k off valores (ver
Eq.. (5) ) para 18-MC a diferentes temperaturas ( Fig.. S1B nos dados complementares ). Uma vez que as tramas de Arrhenius so diferentes de zero, o processo de dissociao da droga mediada, principalmente, por um componente de entalpia. Para quantificar esta componente, a E um primeiro valor foi calculado a partir das parcelas (v er a Equao de Arrhenius. (9) ), e o H + valor foi subsequentemente calculada usando eq. (10) ( Tabela 4 ). O facto de o E um valor no estado insensveis maior do que no estado de repouso, indica que a barreira de energia para a dissociao da droga a partir do canal de ies insensveis maior do que a do canal de ies de repouso. Isto correlaciona-se bem com uma maior H + valor no estado dessensibilizado comparado com que, no estado de repouso.
3.8. Acoplagem molecular de 18-MC no Torpedo e canais inicos RACh musculares humanas
18-MC nos estados neutros e protonados foi acoplado aos modelos de msculo humano ( Fig. 7 A) eTorpedo ( 7 fig. B) canais inicos, respectivamente. Molegro Virtual Docker gerou uma srie de encaixe poses e classificou -los usando critrio baseado em energia utilizando a funo de pontuao MolDockScore incorporado. Com base nessa classificao, representam a mais baixa energia dos complexos ligando-RACh foi seleccionado e apresentado na FIG. 7 . Em ambos os modelos, a molcula 18-MC ancorada exclusivamente interagiu com as hlices M2 fornecidos por cada subunidade, e no foram observadas interaes com outras hlices transmembrana. Mais especificamente, 18-MC interagiu com o domnio luminal formada entre a serina (posio 6 ') e valina (posio 13') anis. No entanto, as hlices M2 so bastante diferentes, quando as sequncias de aminocidos das respectivas subunidades RACh de torpedoe seres humanos so considerados, especialmente nos resduos dos anis expostos ao centro do canal.Por exemplo, no anel de serina (posio 6 '), ambos 1-Ser245 e Ser249- resduos de Torpedo RACh so trocados na respectiva Phe e os resduos de Asn no subtipo muscular humano, ao passo que o torpedo -Cys247 trocado em Sor no modelo humano. Docking resultados indicam que a orientao da ligao da molcula de 18 -MC no complexo varia dependendo do modelo utilizado ( torpedo contra humano).
FIG. 7. Os complexos formados entre os 18 e os modelos de MC-RACh dos canais de ies obtida por acoplagem molecular. (A) Vista lateral do complexo energtico menor formado entre neutro 18-MC eo canal inico AChR msculo humano.Subunidades do receptor so mostrados no modo de estrutura secundria (hlices M2, amarelo; outras hlices transmembranares, azul), com os resduos que formam a serin a (Ser) (posio 6), a leucina (LEU) (posies 9 ') e valina (Val) (posio 13 '), anis mostrados explicitamente no modo da vara. Setas verdes indicam ligaes de hidrognio formadas entre o grupo amino e o pirrole 1-Ser252 resduo (posio 10 '), uma outra entre o ligando ionizvel grupo amino e -Asn257 no anel Ser, e uma terceira entre o carbonilo do grupo ster e 1-Thr263 (posio 10 '). A interao similar foi obtido para protonado 18-MC. (B) Vista lateral do complexo energtico menor formado entre protonado 18 -MC eo Torpedocanal inico AChR. A subunidade estava escondido para a clareza ea ordem dos restantes subunidades (a partir da esquerda): 1, 1, , 1. O ter e grupos ster a partir da Forma 18-MC ligaes de hidrognio com dois resduos de Ser, cada uma das respectivas subunidades 1 e 1, formando o anel de SER. Outra forte interao ligao de hidrognio observada entre o grupo amino carregada eo mesmo resduo 1-Ser. 18-MC interage com os anis e LEU VAL por outras mais fracas de van der Waals contatos. A interao similar foi obtido para neutro 18-MC.
No caso de a interaco entre o neutro 18-MC e o modelo de canal muscular RACh humano inica ( . Fig. 7A), trs pontes de hidrognio que interagem com MC-18 pode ser encontrado: uma entre o grupo amino e o resduo pirrole 1-Ser252 (posio 10 '), uma outra entre o grupo amino do ligando ionizvel e -Asn257 (posio 6'), e uma terceira entre o carbonilo do grupo ster e 1-Thr263 (posio 10 '). Os dois ltimos resduos no esto presentes nessas posies na Torpedo RACh modelo de canal de ies, e esta diferena parece ser responsvel pelas divergncias complexos observados. Uma orientao semelhante para a verso de protonada de MC -18 foi observada em encaixe com o modelo do msculo RACh humano. Uma posio diferente com as interaes otimizado encontrado para neutro 18 -MC ancorado no TorpedoAChR canal inico ( Fig. 7 B) em relao ao que para o msculo humano AChR canal inico ( Fig. 7 A). A energia de ancoragem calculada (valores MolDockScore) para o msculo RACh humano (-119,6 e -116,1 kj / mol para a forma protonada neutra e, respectivamente), muito semelhante que, para o torpedo RACh (-113,8 e -110,4 kj / mol para a forma protonada neutra e, respectivamente). Embora 18-MC interage com cada canal RACh praticamente com a mesma energia de ligao, a sua orientao da luz diferente em ambos os complexos. Nas Torpedo canal inico RACh, o ligante
orientada de forma a permitir o seu ter e grupos ster de modo a formar ligaes de hidrognio com os dois resduos de Ser, cada uma das respectivas subunidades 1 e 1, formando o anel de serina (posio 6 ') ( Fig. . 7 B). Outra forte interao ligao de hidrognio pode ser observada entre o grupo amino carregada eo mesmo resduo 1-Ser. Alm disso, a CM-18 interage com resduos no polares de van der Waals fraca contactos desde a leucina (posio 9 ') para a posio 13, valina (') anis. Essencialmente, o mesmo modo de interaco foi observada para a verso protonada da molcula.
4. Discusso
Ibogana anlogos farmacologicamente comportar como ANC de vrios AChRs [6] , [7] , [8] , [9] e [10] . No entanto, no temos uma compreenso completa da forma como estes frmacos interagem com o canal de ies RACh em diferentes estados conformacionais. Neste sentido, este estudo uma tentativa de caracterizar as interaes de 18 -MC com o arqutipo da malha Cys ligante-gated ion canais superfamlia, o tipo de msculo AChR, nos estados conformacionais distintos, e compar-los com isso para PCP, um NCA bem conhecida. Para este efeito, os ensaios de ligao de radioligandos, Ca 2 + afluxo, medies termodinmicas e cinticas, e modelao molecular e os estudos foram realizados de encaixe. Embora este estudo no aborda directamente as propriedades anti-aditivas da ibogana anlogos, os resultados deste trabalho deve, finalmente, fornecer uma melhor compreenso de como estes compostos interagem com os RACh, e ir conferir o conhecimento bsico para se obter o estudo da interaco de destes compostos com AChRs tipo neuronal, alvos mais adequados para a ao anti-dependncia destes compostos.
respectivamente, [8] e [9] . Esta a primeira vez em que a interaco da 18-MC com AChRs musculares demonstrada, apoiando a ideia de que ibogana anlogos inibem AChRs de uma forma no competitiva (ver fig. 1 C). Com base nos nossos prprios resultados e na potncia de inibio de 18 -MC para outros tipos RACh [8] e [9] , a seguinte seqncia especificidade AChR foi obtida: 34 (0,75-0,90 M)> 11 (6,8 M)> 42 ( > 20 uM). O facto de as n H valores de 18-MC, ibogana, e PCP so maiores do que a unidade (ver Tabela 1 ) indica que o processo de inibio produzida de uma forma cooperativa, o que sugere que existem potencialmente mais do que um stio de ligao para estes ANC no canal de ies RACh msculo activado ou que no so mais do que um mecanismo de inibio. A este respeito, as nossas [ 3 H] citisina resultados indicam que os anlogos da ibogana induzir um aumento da ligao para o agonista AChR de repouso, mas activvel ( Fig. 6. ), sugerindo que os anlogos podem induzir dessensibilizao RACh. Isto suportado pela observada uma potncia mais elevada de 18 -MC quando ele princubada durante longos perodos de tempo (4, 24 h) ( Tabela 1 ). Finalmente, h uma boa correlao entre a CI 50 ( Tabela 1 ) e aparentes EC 50 valores, o que indica que a MC-18 mais potente do que a ibogana inibio de Ca
+ 2
determinada pela equilbrio de ligao ( K d = 0,23 0,04 mM, ver Fig. 2. ). O observado maior afinidade de 18-MC para a [ 3 H] TCP lugar no AChR insensveis corroborado pelo [ 3 H] 18-MC resultados da concorrncia ( Tabela 2 ). O observado maior afinidade de 18-MC para a AChR insensveis corresponde muito bem com sua alta potncia de dessensibilizao. Neste sentido, um mecanismo potencial que pode ser visionado MC-18 induz a primeira dessensibilizao AChR e neste estado conformacional, a droga mantido durante mais tempo no estado ligado (isto , ver menor k off valor na Tabela 3 ). Uma vez que este esquema hipottico acrescenta uma nova dimenso aos mecanismos inibitrios suscitados pela ibogana anlogos, novas experincias merecem ser realizados para apoiar essa possibilidade. As experincias de competio de radioligandos tambm indicam que 18 -MC inibe a ligao de [ 3 H] TCP (o anlogo estrutural e funcional do PCP) e vice-versa, que o PCP inibe a ligao de [ 3 H] 18-MC para desensitized/CCh- AChRs preso com n H valores prximos unidade ( Tabela 2 ). Isto sugere que ambas as drogas podem estar interagindo com um nico stio de ligao no AChR insensveis. Embora esta evidncia sugere um modo estrico da concorrncia entre 18 -MC e PCP, no podemos descartar a possibilidade de um forte efeito alostrico bem. A este respeito, as anlises de Schild do tipo indicam que 18 desloca-MC [ 3H] a partir do seu local de ligao no insensveis / CCh RACh estado ligado por um mecanismo estrico TCP ( Fig. 5. ). Estes dados sugerem que os MC-18 sobrepe o local de ligao de alta afinidade no local PCP do RACh insensveis. Esta concluso apoiada pelos nossos encaixe resultados moleculares. A anlise dos complexos moleculares obtidos indicam claramente que a MC-18, quer na forma neutra ou protonada (verFig. 7. ) liga-se com a poro mdia dos dois canais musculares RACh ies (humana e Torpedo ) entre a serina (posio 6 ') e (posio 13 ') anis valina. Acoplagem resultados moleculares tambm demonstram a existncia de uma rede de interaces de ligaes de hidrognio entre as diferentes pores 18 -MC e vrios resduos localizados no anel serina (posio 6 ') e na posio 10', assim como de van der Waals com o adicional adjacente (posio 13 ') anis serina (posio 6'), leucina (posio 9 ') e valina (ver Fig. 7. B). Por sua vez, estes resultados esto em acordo com o postulado de localizao do local de ligao do PCP no canal inico RACh insensveis. Por exemplo, a marcao por fotoafinidade [18] e [38] e moleculares de encaixe [17], estudos indicaram que o locus PCP est localizado entre a treonina (posio 2 ') e leucina (posio 9') anis. Os mesmos resultados foram obtidos para a base de vrios antidepressivos musculares RACh nos canais de ies [17] , [22] e [24] . Em concluso, nossos dados concordam com um modelo em que existe sobreposio de stios de ligao para anlogos de ibogana, PCP e antidepressivos, no canal inico AChR insensveis. Os resultados de ligao de radioligandos usando AChRs no estado de repouso indicam que a MC -18 interage com o [ 3 H] 18-MC loco com praticamente a mesma afinidade (1,0 0,1 uM), que para a [ 3 H] TCP local (1,4 0,1 mM) (ver Tabela 2 ). Considerando-se que estes resultados concorrncia presentes n Hvalores prximos unidade, sugerimos que existe sobreposio de stios de ligao para anlogos de ibogana e PCP. Curiosamente, os estudos termodinmicos apoiar a noo de que a interao de 18-MC com o repouso AChR canal inico (ie, misto de entalpia-entropia) diferente do que com a desensitized AChR canal inico (ou seja, mais do que entlpica entrpica). Esta diferena sugere que as foras atrativas so mais importantes do que as mudanas conformacionais locais ou reorganizao solvente na bolsa de ligao 18-MC da CADH insensveis em relao AChR de descanso. Estudos anteriores indicaram que termodinmicos bupropiona [22] e PCP [39] interagir com o torpedo RACh canal de ies por meio de mecanismos de entropia orientadas. O resultado obtido contrastante no estado insens veis sugere que 18-MC interage com o seu local de ligao por meio de mecanismos diferentes para que, para a bupropiona e PCP. Considerando os resultados acima, prevemos um processo mecnico onde 18 -MC primeiro se liga ao seu stio no canal de ies AChR de repouso, com uma afinidade relativamente baixa. Posteriormente, 18-MC bloqueia o canal ativado (aberto) e induz dessensibilizao do receptor aumentando a sua afinidade com o canal inico insensveis. Neste estado conformacional, MC-18 interage com um domnio de ligao situado entre a serina e valina anis que compartilhado por antidepressivos e PCP. A formao de ligaes de hidrognio com o anel de serina e de van der Waals contactos adicionais com a serina, a leucina, valina e os anis, finalmente, diminui a dissociao do MC-18 a partir do canal de ies insensveis. Os nossos resultados tambm sugerem que os anlogos da ibogana pode inibir AChRs musculares por uma
combinao de vrios mecanismos, incluindo inibidores no competitivos, o bloqueio do canal de ies e RACh dessensibilizao.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi suportada por concesses do Arizona Science Foundation e Fundao Stardust e doEscritrio de Programas de Pesquisa e patrocinado, Midwestern University (para HRA), por uma concesso do Ministrio polons da Cincia e do Ensino Superior (n 405297036 NN ) e pelo subsdio pesquisa FOCUS e equipe da Fundao para a Cincia polons (a KJ) e pelo Instituto Nacional de Dependncia de Drogas (NIDA) concesso DA016283 (a SDG). Esta pesquisa tambm foi apoiado em parte pelo Programa de Pesquisa intramuros do NIH, National Institute on Aging. Os autores do graas a NIDA (NIH, Bethesda, Maryland, EUA), pelo dom da [ 3 H] ibogana, a ibogana, e fenciclidina, e Jorgelina L. Arias Castillo e Paulina Iacoban para a sua assistncia tcnic a.