Ecotoxicologia

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Ecotoxicologia

Introduo

Testes de toxicidade Exemplos de bioensaios Manuteno dos peixes O teste gua reconstituida Concentraes - testes Controle positivo e controle negativo O que observar - endpoints Trabalho dos dados e resultados Referncias

INTRODUCO Ecotoxicidade um termo atualmente muito em voga, dada a necessidade de se conhecer os efeitos que produtos qumicos lanados no meio ambiente podem ter sobre indivduos, sobre populaes e comunidades de organismos, alm de se conhecer como o homem pode ser afetado. Nos ltimos anos, em especial no ps-Revoluo Industrial, uma imensa gama de substncias qumicas foram produzidas de forma intencional ou como sub-produto de atividades produtivas. Algumas dessas substncias so essencialmente artificiais, outras, apesar de terem ocorrncia natural, tiveram sua concentrao aumentada no meio ambiente. Muitos metais, hormnios, derivados do petrleo, dioxinas e furanos so exemplos de substncias de ocorrncia natural, mas que so motivo de preocupao dada a alta concentrao que so encontradas em alguns locais e dada a capacidade de provocar danos aos seres vivos. Metais no so degradveis, e podem se acumular no tecido de organismos vivos causando disfunes de metablicas e at mesmo m-formaes em fetos humanos. Hormnios podem causar desregulaes endcrinas com consequncias no crescimento, no desenvolvimento e na reproduos. Alguns HPAs (Hidrocarmonetos Policclicos Aromticos), encontrados em combustveis fsseis como carvo e petrleo, se acumulam nas gorduras de animais, e so carcinognicos, ou seja, provocam cncer.Dioxinas e furanos so produzidos na queima de carvo e tambm de florestas; so bastante txicas e comprovadamente carcinognicas. Outras substncias como pesticidas e substncias farmacuticas no existiam na natureza, mas foram criadas pelo homem. Outra classe de substncias com crescente preocupao so os chamados produtos de nanotecnologia, ou simplesmente nanopartculas. Estas so definidas como materiais particulados com pelo menos uma dimenso menos que 100 nanmetros (nm), sendo 1 nm igual a 10-9 m. Sua aplicao tem sido desde componente de drogas, passando por nanotubos com aplicao em tica, eletrnica e arquitetura. No entanto, existem relatos de danos sade humana e a efeitos txicos em microcrustceos e coppodas (CHAPMAN, 2006). Ecotoxicologia pode ser entendida com a juno de ecologia e toxicidade. Ecologia o estudo da interao dos seres vivos entre si e com o meio ambiente em que vivem; toxicologia uma cincia que procura entender os tipos de efeitos causados por substncias qumicas, bioqumicas e os processos biolgicos responsveis por tais efeitos, levando em conta a sensibilidade de diferentes tipos de organismos exposio de substncias qumicas e as relativas toxicidade de diferentes substncias. O objetivo da ecotoxicologia seria ento entender e prever efeitos de substncias qumicas em seres vivos e comunidades naturais (CHAPMAN, 2002). J h alguns anos, a ecotoxicologia tem sido usada tambm como parmetro legal de regulamentao de qualidade de gua, de efluentes e de sedimento. A Resoluo Conama n 344/04 instituiu testes ecotoxicolgicos para casos de disposio de sedimento a ser dragado quando a concentrao algumas substncias podem oferecer risco. J a Resoluo Conama no 357/05 instituiu o uso de testes ecotoxicolgicos tanto como parmetro de qualidade das guas como de efluentes. Alm dessas legislaes em nvel federal, diversos estados possuem suas legislaes prprias que regulamentarizam e do diretrizes para o uso desses testes, como os Estados do Rio Grande do Sul, Santa Catarina, Paran, Rio de Janeiro, So Paulo, dentro outros.
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TESTES DE TOXICIDADE A ecotoxicologia pressupes o uso de testes de toxicidade com organismos, tambm chamados bioensaios. Bioensaios so testes feitos em laboratrio que determinam o grau ou o efeito biolgico de uma substncia desconhecida ou de uma substncia-teste (como drogas, hormnio, qumicos, etc); o teste feito atravs de comparao experimental do efeito da substncia testada com efeitos causados por uma substncia conhecida, em uma cultura de clulas vivas ou em um organismo-teste (USEPA).

Os bioensaios diferem principalmente quanto ao tempo de exposio do organismo-teste ao agente ou substncia a ser testado. Portanto, os bioensaios podem ser agudo ou crnicos. Teste de toxicidade aguda so estudos experimentais feitos com organismos-teste que determinam se um efeito adverso observado ocorre em um curto perodo de tempo (em geral at 14 dias) aps administrao de uma nica dose da substncia testada ou aps mltiplas dosagem administradas em at 24 horas. J nos testes de toxicidade crnica, os organismos-teste so observados durante uma grande parte do seu tempo de vida, quando acontece a exposio ao agente-teste; os efeitos crnicos persistem por um longo perodo de tempo, e podem ser evidentes imediatamente aps a exposio ou no (DUFFUS, 1993).
Atravs dos bioensaios pode-se chegar a diversas concluses, por exemplo:

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Concentrao na qual a substncia provoca efeito adverso observado em 50% dos indivduos observados (EC50) A substncia capaz de provocar cncer (carcinogenia) A substncia capaz de provocar danos ao feto (teratogenia) A substncia capaz de desregular a atividade endcrina (desruptor endcrino) A substncia capaz de deformar alguma estrutura do tecido (ex. calcificaes) ou da clula (ex. deformaes no retculo endosplasmtico, lisossomo, etc). A substncia tem tendncia a se acumular em tecido especfico (ex. adiposo, nervoso) ou rgo (ex. fgado, rim).

EXEMPLOS DE BIOENSAIOS

Bioensaio com peixe paulistinha (Danio rerio)

Dentre os organismos-teste mais amplamente utilizado est o peixe popularmente conhecido como paulistinha (Danio rerio), em ingls zebrafish. Esse peixe atinge de 3 a 5 cm quando adulto, de origem indiana e possui um ciclo de vida rpido, que se completa em 3 meses. Em laboratrio de fcil manuteno e produz grande quantidade de ovos translcidos, portanto de fcil observao sob lupa. A fmea carrega os vulos no fertilizados no abdmen e os deposita no fundo logo aps o amanhecer. O macho ento libera os espermas que fertilizam os vulos, dando incio ao desenvolvimento embrionrio.

MANUTENO DOS PEIXES Peixes adultos podem ser mantidos em aqurios de 160L, com 30 indivduos, dos quais metade devem ser machos e metade fmeas (Figura 1A). A tabela abaixo resume algumas condies a serem mantidas:

Tabela 1. Condies a serem mantidas nos aqurios de criao de paulistinha.

Parmetro

Condio

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Temperatura CaCO3 (dureza) pH Oxignio dissolvido Amnia Nitrito Nitrato Fotoperodo Alimentao

27 C 379 mg/L CaCO3 7,36 95% saturao 10,5 mg/L 0 a 5 mg/L 0,025 a 1,00 mg/L 0 a 140 mg/L 12 h de luz/ 12 h de escuro 2 vezes por dia com rao em flocos, tipo TetraMin; nuplios de Atermia, especialmente antes de postos para desovar. De carvo Restos de comida e fezes removidos 2 x por dia

Filtro Limpeza

Quando se deseja a produo dos ovos, os peixes so estimulados na tarde do dia anterior, com a colocao de plantas artificiais. necessria a colocao de uma bandeja no fundo do aqurio coberta por uma tela com malha tamanho suficiente para deixar passar os ovos, mas no os peixes. Esse cuidado necessrio, pois o paulistinha pode comer os prprio ovos (Figura 1B). As fmeas depositam os ovos logo ao raiar do dia, ou com a luz se acendendo. Os machos liberam os espermas na gua, e os ovos so fecundados, permanecendo no fundo.

A)

B)

C)

Figura 1. A) Sistema de manuteno de paulistinhas em laboratrio; B) Aqurio para onde os peixes adultos so transferidos visando produo de ovos; C) paulistinha: fmea grvida(acima) e macho (abaixo). Fonte: (BRAUNBECK et al., 2005).

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O TESTE Os ovos so ento recolhido em uma bandeja e levados para o laboratrio. O experimento comea com a separao dos ovos fecundados dos no fecundados. Os ovos no fecundados permanecem com aparncia de zigoto ps-fecundao (Figura 2A); j nos ovos fecundados possvel observar mais de uma clula no plo animal (Figura 2C).

A)

B)

C)

Figura 2. Fotos do desenvolvimento embrionrio do paulistinha: A) Zigoto, logo aps fecundao; B) Zigoto, com plo animal 1 clula; C) Clivagem: primeira diviso celular 2 clulas. Os ovos so colocados em diferentes concentraes da substncia a ser testada. Alm disso, so feitos dois controles: o controle negativo (onde se espera que no seja observado efeito adverso) e o controle negativo (onde se espera que acontea efeito adverso). Os controles so muito importantes, garantem a qualidade do teste. Se for observado efeito adverso no controle negativo, significa que ou h algum problema com o organismo-teste ou com o material utilizado (ex. contaminao dos frascos utilizados); por outro lado, se no observado efeito adverso no controle positivo, significa que existe o organismo-teste desenvolveu resistncia, portanto, no mais um bom parmetro. Com o intuito de garantir a reproducibilidade dos testes (ou seja, que o mesmo teste possa ser repetido sob condies semelhantes), os ovos so encubados em estufa, sob temperatura constante de 26 oC. Alm disso, usada gua reconstituda, ou gua artificial, para produzir o controle negativo e para se fazer as diluies. Essa gua feita misturando-se diversos sais necessrios ao desenvolvimento do embrio a gua destilada, ou seja, livre de impurezas. Os ovos so observados aps 24 e 48 horas, contando a partir da fertilizao.

GUA RECONSTITUIDA Para fazer gua reconstituida necessrio as seguintes solues padres: 58,8 mg/ L CaCl2 x 2H2O 24,6 mg/ L MgSO4 x 7H2O

12,6 mg/L NaHCO3

5,5 mg/L KCl Para cada 1 L de gua reconstituda, so adicionados 10 mL de cada uma das solues padres, e o volume completado com gua bidestilada. A gua deve ser preparada no dia anterior ao teste e deixada durante a noite borbulhando ar e a 27 oC.

CONCENTRAES-TESTE

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Para prepara as concentraes a serem testadas, sugere-se 1:1 ; 1:2 ; 1:4 ; 1:8 e 1:16. Isso representa 50% de gua reconstituda e 50% de substncia-teste; 75% gua e 25% de substncia-teste; 87,5% e 12,5% substncia-teste; etc. No entanto, desejvel que se faa um teste piloto para se ter uma ideia da faixa de concentrao que atinge 50% dos indivduos. Leia Trabalho dos dados para mais explicaes.

CONTROLE POSITIVO E CONTROLE NEGATIVO Existem muitas substncias que podem ser usadas como controle positivo para biotestes com paulistinha. Dois exemplos so etanol e 3,4 dicloroanilina (3,4 DCA). No caso do 3,4 DCA, usada uma soluo de 3,7 mg/L. Para o etanol, feita uma soluo com 1,75%, usando etanol PA (98,9%). Em ambos os casos, deve ser observada mortalidade entre 20 e 80% dos embries. Para o controle negativo deve ser usada a gua aritificial, e a mortalidade no pode exceder 10% dos embries. Caso o controle positivo no provoque o efeito esperado, ou o controle negativo tenha mortalidade superior a 10%, o teste considerado no vlido e seu resultado no deve ser usado.

O QUE OBSERVAR ENDPOINTS O teste pensado de modo que haja um padro naquilo que observado. Algumas observaes so consideradas sinais de morte do embrio, outras observaes so apenas anotadas, e podem auxiliar posteriormente para se caracterizar os efeitos provocados pela substncia-teste. A Tabela 2 apresenta os endpoints (ou seja, aquilo que deve ser observado) aps 24 e 28 horas de desenvolvimento embrionrio, e a Figura 3 apresenta fotos do desenvolvimento normal de um embrio de paulistinha aps 24 e 48 horas de desenvolvimento.

Tabela 2. Endpoints observados em embries de peixes aps 24 e 48 horas de exposio. 24 horas Ovo no fertilizado Ovo coagulado* Estdio de epibolia Cauda no separada* Ausncia de movimento espontneo Ausncia de somitos* 48 horas Sem pigmentao Ovo coagulado* Ausncia de circulao sangunea* Ausncia de batimento cardaco* Edema Embrio mal-formado Embrio subdesenvolvido Ausncia de locus ocular * Endpoint letal (embries com essas caractersticas foram considerados mortos)

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Figura 3. Desenvolvimento normal de embrio de peixe paulistinha, A) aps 24 horas, e; B) aps 48 horas de incubao. As principais estruturas a serem observadas esto em destaque. Fonte: (KEITER et al., 2006) Tambm possvel dar continuidade ao teste e observar os embries aps 72 e 114 horas. Para mais detalhes dos endpoints ver Hollert et al. (2003). Para se conhecer melhor a respeito do desenvolvimento embrionrio do peixe paulistinha, indicamos a consulta dos links abaixo, onde esto disponibilizadas fotos, descries e filmes. http://zfin.org/zf_info/zfbook/stages/stages.html http://www.cas.vanderbilt.edu/bioimages/animals/danrer/zfish-devel.htm http://www.youtube.com/watch?v=ahJjLzyioWM&NR=1 http://www.youtube.com/watch?v=6PhnHYZ5-zg&NR=1

TRABALHO DOS DADOS E RESULTADOS Em geral, o objetivo de um bioensaido a gerao de uma curva dose-resposta, onde se tem no eixo x a dose (ou conceontrao da substncia) e no eixo y a resposta (ou endpoint). Essa curva possui uma forma usual, como mostra a Figura 4A a seguir.

A)

B)

Figura 4. A) Exemplo geral de uma curva dose-resposta. B) Exemplo de curva dose-resposta indicando o EC50. A concentrao da substncia geralmente dada em logartimos pois as concentraes testadas so geralmente preparadas em escala logartmica (1:1, 1:2, 1:4, etc).

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Curvas dose-resposta padres so definidas por 4 parmetros: a linha de base da resposta, o mximo da resposta, a inclinao e a concentrao da substncia-teste que provoca resposta no meio do caminho entre o mximo e a linha de base, ou EC50 (Figura 4B). No caso do teste com paulistinha, possvel calcular EC50 (Effect Concentration 50%), ou seja, a concentrao na qual o efeito observado em 50% dos indivduos testados. Isso porque se estabelece a linha de base como 0% de mortalidade e o mximo de resposta como 100% de mortalidade. De forma prtica, as observaes so transformadas em mortalidade e, para cada concentrao testada, calculada a porcentagem de mortalidade. A concentrao transformada em logaritmo, e so plotadas dose e resposta em um grfico. A partir da, os dados so comparados com uma curva-padro de dose-resposta, sendo possvel calcular a concentrao da substncia-teste que provoca 50% de mortalidade, ou seja, o EC50. A partir deste ponto, o EC50 comparado com EC50 de outros trabalhos desenvolvidos de forma semelhante, sendo possvel ter uma ideia se alto ou baixo, ou se equivalente a uma outra substncia conhecida. REFERNCIAS

CHAPMAN, P. M. Emerging substances Emerging problems? Environmental Toxicology and Chemistry, v.25, n.6, p.1445-1447. 2006. ______. Integrating toxicology and ecology: putting the "eco" into ecotoxicology. Marine Pollution Bulletim, v.44, p.7-15. 2002. BRAUNBECK, T.; M. BTTCHER; H. HOLLERT; T. KOSMEHL; E. LAMMER; E. LEIST; M. RUDOLF; N. SEITZ. Towards an alternative for the acute fisch LC50 test in chemical assessment: the fish enbryo toxicity test goes multi-species - an Uptdate. Altex, v.22, n.2, p.87-102. 2005. HOLLERT, H.; S. KEITER; N. KNIG; M. RUDOLF; M. ULRICH; T. BRAUNBECK. A new Sediment Contact Assay to assess particle-bound pollutants using zebrafish (Danio rerio) embryos. Journal of Soils & Sediments, v.3, n.3, p.197-207. 2003. KEITER, S.; A. C. RASTALL; T. KOSMEHL; K. WURM; L. ERDINGER; T. BRAUNBECK; H. HOLLERT. Ecotoxicological assessment of sediment, suspended matter and water samples in the Upper Danube River. Environ. Sci. and Pollut. Res., v.13, n.5, p.308-319. 2006.

Por Dra. Carolina F. Mariani Laboratrio de Limnologia, IB/USP

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