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UNIVERSIDAD AUTONOMA DE BUCRAMANGA FACULTAD DE MEDICINA BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR LABORATORIO DE REGISTROS QUMICOS
DETERMINACIN DE PROTEINAS SERICAS Y UREA ELECTROFORESIS IMPORTANCIA EN MEDICINA 1. OBJETIVOS 1. Evaluar la concentracin plasmtica de urea y cierto grupo de protenas: albmina, globulina. 2. Resaltar la importancia fisiolgica de las protenas plasmticas. 3. Reforzar los conocimientos referentes al metabolismo proteico. 4. Estudiar el comportamiento de las protenas en un campo elctrico. 5. Hacer nfasis sobre la relacin existente entre las protenas y numerosos estados patolgicos mediante el empleo del proteinograma. 2. INTRODUCCIN

Muchas de las protenas localizadas en el plasma, que ascienden a ms de doscientas, no son protenas plasmticas en el sentido estricto, si no que su presencia en este medio es transitoria, bien por ser transportadas desde el tejido de sntesis hasta la clulas donde ejercen su funcin o porque experimentan en el plasma parte del catabolismo. De todas ellas solo una cincuenta encajan en este termino. Por lo tanto se plantea la necesidad de establecer criterios que permitan decidir si una protena es intrnsicamente plasmtica. En general, se trata de molculas secretadas activamente a la sangre, y cuya presencia no se debe a una lesin tisular o a la alteracin de la permeabilidad capilar. Salvo las inmunoglobulinas y algunas -globulinas, se sintetizan en el retculo endoplasmatico de las clulas hepticas. Suelen ejercer una funcin primaria en el sistema vascular y por ello su concentracin es mayor en el plasma que en los tejidos o en otros fluidos corporales. 3. DETERMINACIN DE PROTEINAS TOTALES

IMPORTANCIA EN MEDICINA La sangre est constituida por formas celulares en suspensin en un lquido que es el plasma, mezcla muy compleja de sustancias inorgnicas y orgnicas simples y complejas disueltas en agua. Al recoger sangre usando un anticoagulante como oxalato, citrato, EDTA o heparina, se obtiene un plasma que ligeramente difiere del natural por estar modificado por las sustancia agregadas y prdida parcial del calcio que se une al anticoagulante, y si no se usa anticoagulante al coagular la sangre el lquido que se separa se llama suero; ste carece de fibringeno presente en el plasma, el cual se ha transformado en fibrina durante el proceso de coagulacin. Del 92 al 93% de plasma o suero es el agua disolvente, del 7 al 8% del total de solutos presentes las protenas son las que estn en mxima concentracin aproximadamente de 6.5 a 8.5 gramos/dl de agua del plasma o suero. Las protenas en el sistema vascular ejercen una presin osmtica coloidal la cual sirve para mantener un volumen normal de sangre y un contenido normal de agua en el lquido intersticial y los tejidos. La fraccin de albmina es la principal en el mantenimiento de la presin onctica en la sangre; si la concentracin de albmina desciende deja escapar agua de los vasos capilares y entrar el lquido extracelular a los tejidos originando edema. Las protenas del plasma no tienen un origen comn; el hgado es el rgano principal para la produccin del albmina y globulinas alfa y beta como las protenas de la coagulacin y transporte de la sangre; las clulas del sistema retculo-endotelial son la fuente de gamaglobulinas y de algunas globulinas Beta.

El nivel total de protenas hallado en el suero de jvenes y adultos de edad media es 6,0 a 8,2 g/dl de suero. En plasma la presencia de Fibringeno aumenta este valor en 0,2 a 0,4 gramos/dl. En estado de deshidratacin el total de protenas puede aumentar en un 10 a

15%, ascenso que se refleja en todas las fracciones protenicas. La cantidad absoluta de protenas no vara pero su concentracin aumenta a causa de la disminucin del agua como disolvente. En mieloma mltiple el total de protenas puede aumentar a ms de 10 g/100 ml y esto se debe a la presencia de niveles elevados de protenas del mieloma; las cuales son formas anormales de gama globulinas.

La hipoproteinemia ocurre cuando los niveles del total de protenas estn por debajo de 6 gramos/dl, se encuentra en muchos estados patolgicos no relacionados entre s. En el sndrome nefrtico pueden perderse en orina grandes cantidades de albmina a travs del rin daado; en sndrome de retencin de sal hay dilucin de protenas plasmticas; en quemaduras graves, hemorragias extensas y heridas abiertas se pierden grandes cantidades; un perodo largo de baja ingestin o absorcin deficiente de protenas puede afectar tanto el nivel como la composicin de protenas del suero, esto pasa en el esprue y otras formas de mala absorcin al igual que en carencia aguda de protenas como el KWASHIORKOR. El hgado en estas condiciones no tiene materia prima suficiente para sintetizar protenas del suero para reemplazar las que se pierden en recambio normal. En general pueden ocurrir cambios en la concentracin total, en una, varias o en todas las fracciones. Tambin pueden ocurrir cambios en diferentes fracciones sin cambio en la concentracin total de protenas. FUNDAMENTO DEL METODO. (Mtodo de Biuret modificado) Los grupos CO-NH- unidos entre si dan una reaccin con formacin de color violeta con las sales cpricas en medio alcalino, siendo la ms representativa y simple la que da con el Biuret-NH2-CO-NH-CO-NH2 . Es en la actualidad el mtodo colorimtrico ms exacto y simple para la determinacin de Protenas Totales. COMPOSICION DEL REACTIVO Tartrato k-Na 15 mmol/L Ioduro de Na 100 mmol/L Ioduro de K 15 mmol/L Sulfato de cobre 5 mmo/L PATRN: MUESTRA: Sol. Protenas Suero, plasma 7 g/dL

PIPETEAR EN TUBOS DE ENSAYO: Tubos de ensayo Reactivo de protenas Patrn Muestra (suero, Plasma) Blanco 1 ml Patrn 1 ml 25 l Muestra 1 ml 25 l

Mezclar e Incubar los 3 tubos a 37 C por 15 minut os Mantener 5 minutos a temperatura ambiente. Leer, frente a blanco de reactivo, a 540 nm en el espectrofotmetro. Coloracin estable por 30 minutos. Haga los clculos y exprese sus resultados en grs./100 ml de plasma. Concentracin Muestra = Absorbancia Muestra Absorbancia Patrn Recin nacidos : Adultos: x concentracin patrn (7 g/dL)

VALORES DEREFERENCIA:

5.2-9.1 g/dl 6,7-8,7 g/dl

REPORTE SU RESULTADOS. _____________________

4.

DETERMINACIN DE ALBUMINA

IMPORTANCIA EN MEDICINA La albmina es la protena ms abundante en el plasma humano. Tiene tres funciones principales: contribuye en el mantenimiento de la presin onctica del plasma, acta como transportador no especfico para muchos componentes apolares y es una fuente endgena de aminocidos. La hiperalbuminemia tiene poco significado diagnstico excepto en la deshidratacin. La hipoalbuminemia se encuentra como resultado de diversos factores: sntesis reducida causada por enfermedades hepticas; absorcin reducida de aminocidos debida a sndromes de malabsorcin o malnutricin; aumento del catabolismo como consecuencia de inflamacin o dao tisular; distribucin alterada entre el espacio intravascular y extravascular causada por permeabilidad capilar aumentada, sobrehidratacin o ascitis; prdidas anormales debidas a enfermedades renales (sndrome nefrtico, diabetes mellitus, glomerulonefritis crnica, lupus eritematoso sistmico), enfermedades del tubo digestivo (colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn) o alteraciones de la piel (dermatitis exfoliativa, quemadas extensas); ausencia congnita de albmina o analbuminemia. Las concentraciones plasmticas de albmina, aunque importantes para el control y seguimiento, tienen muy poco valor diagnstico. El diagnstico clnico no debe realizarse teniendo en cuenta el resultado de un nico ensayo, sino que debe integrar los datos clnicos y de laboratorio. FUNDAMENTO DEL MTODO: (Mtodo BCG) La albmina presente en la muestra reacciona con el verde de bromocresol en medio cido, originando un complejo coloreado que se cuantifica por espectrofotometra. COMPOSICIN Reactivo. Tampn acetato Verde de bromocresol Detergente PH Patrn de Albmina:

100 mmol/L 0,27 mmol/L 4,1. 4,55 g/dL

PROCEDIMIENTO: Preparar un patrn y un blanco para cada serie de determinaciones. PIPETEAR EN TUBOS DE ENSAYO: Tubos de ensayo Reactivo de albmina Patrn (4,55 g/dl) Muestra (suero, Plasma) Blanco 1 ml Patrn 1 ml 15 ul Muestra 1 ml 15 ul

Agitar bien y dejar los tubos durante un minuto a temperatura ambiente Leer la absorbancia del patrn y de la muestra a 630 nm frente a blanco de reactivo. El color es estable durante al menos 30 minutos.

Realizar los clculos de la muestra segn la frmula:

Concentracin Muestra =

Absorbancia Muestra Absorbancia Patrn

C patrn (4,55 g/dl)

VALOR DE REFERENCIA(SUERO, PLASMA):

3,5 5 gr/dl

REPORTE SUS RESULTADOS: ________________

5. DETERMINACIN DE LA UREA IMPORTANCIA EN MEDICINA La urea se sintetiza en el hgado como un producto de la desaminacin de los aminocidos. Su eliminacin en la orina representa la principal va de excrecin del nitrgeno. Se encuentran concentraciones elevadas de urea en plasma como consecuencia de una dieta hiperproteica, aumento del catabolismo proteico, despus de una hemorragia gastrointestinal, ligera deshidratacin, shock e insuficiencia cardiaca o tratamiento con glucocorticoides (uremia prerrenal). La uremia postrenal est causada por condiciones que obstruyen el flujo urinario: nefrolitiasis, tumor o hipertrofia prosttica. La utilidad de la urea como indicador de la funcin renal est limitada por la variabilidad de su concentracin plasmtica como consecuencia de factores no renales. El diagnstico clnico no debe realizarse teniendo en cuenta el resultado de un nico ensayo, sino que debe integrar los datos clnicos y de laboratorio. FUNDAMENTO DEL METODO: (Mtodo de la Ureasa) La urea se hidroliza por accin de la ureasa en presencia de agua para producir amonaco y dixido de carbono. En una reaccin de Berthelot modificada, los iones amonio reaccionan con hipoclorito y salicilato para formar un complejo verde. El aumento de la absorbancia a 578 nm es proporcional a la concentracin de urea en la muestra MUESTRA: Suero, plasma ( no usar sueros lipemicos) PROCEDIMIENTO Longitud de onda: 578 nm Paso de luz: 1 cm Temperatura: 20...25 C, 37 C Medicin: Frente a un blanco de reactivo. Slo se requiere un blanco de reactivo por serie. PIPETEAR EN TUBOS DE ENSAYO: Paso 1. Tubos de ensayo Reactivo de urea (Solucin 1) Patrn (80 mg/dl) Muestra (suero Plasma) Blanco 1 ml Patrn 1 ml 10 ul Muestra 1 ml 10 ul

Mezclar e incubar por 3 minutos a 37 grados centgrados. Paso 2. Reactivo de urea (Solucin 2) 1 ml 1 ml 1 ml

Mezclar e incubar por 5 minutos a 37 C. Leer la absorbancia del patrn y de la muestra contra el blanco de reactivo a 578 nm antes de 60 minutos. Analizar los clculos de la muestra segn la frmula: Concentracin Muestra = Absorbancia Muestra Absorbancia Patrn x factor

Factor para Suero o plasma

c(UREA) 80 mg/dl 13,3 mmol/l

c(BUN) 37,28 mg/dl 6,2 mmol/l

FACTOR DE CONVERSIN DE BUN, UREA C (BUN) = 0,466 x C (Urea) C (Urea) = 2,14 x (BUN) VALOR DE REFERENCIA: Suero (urea): 10 - 50 mg/dl 1,7 - 8,3 mmol/l REPORTE SUS RESULTADOS: ___________ 6. ELECTROFORESIS DE LAS PROTEINAS

En la actualidad esta tcnica se emplea para separar las diversas protenas de una mezcla, lo cual ha permitido por ejemplo, poder separar las protenas del plasma humano y correlacionar su presencia y concentracin con numerosas enfermedades. Las protenas son compuestos anfteros como los aminocidos, y unas y otros tienen cargas positivas y negativas en la misma molcula cuyo nmero depende del pH de la solucin. Ya vimos que el punto isoelectrico (PIE), es el pH en el cual el nmero de cargas positivas es igual al nmero de cargas negativas y por tanto, la protena no se desplaza ni al nodo ni al ctodo. Para la mayora de las protenas este pH est en el lado cido y vara desde 4,6 para las albminas hasta 5,1 a 6,2 para las globulinas. A pH por debajo de PIE las cargas positivas exceden en nmero a las cargas negativas y la protena se comporta como un in positivo o catin. A valores de pH fisiolgico las cargas negativas estarn en mayora y la protena se comportara como un anin (prot-), anlogo al Cl- o al HCO3-. Las protenas se mueven en un campo elctrico como consecuencia de su carga elctrica. En este proceso que se llama electroforesis, las protenas se separan unas de otras debido a las diferencias de su carga neta. Por ejemplo, las molculas con carga neta negativa migran hacia el electrodo con carga positiva (nodo), mientras las molculas con carga neta positiva migran hacia el electrodo con carga negativa (ctodo). Las molculas sin carga neta no se mueven. La electroforesis, es una de las tcnicas ms utilizadas en bioqumica se realiza siempre utilizando como soporte geles de agarosa o poliacrilamida. Existen variantes en las tcnicas de electroforesis que permiten separar, visualizar y cuantificar las protenas; en estas tcnicas de separacin de protenas se acostumbra a trabajar con tampn a pH de 8,6 con el fin de que las protenas con las respectivas cargas que presentan tiendan a migrar al polo positivo (nodo), o negativo (ctodo), dependiendo entre otras cosas de su contenido de aminocidos. La electroforesis de zona sobre acetato de agarosa permite la identificacin de cinco bandas (albumina, alfa-1-globulinas, alfa-2-globulinas, beta y gammaglobulinas). Despus de la electroforesis, las protenas en el gel se inmovilizan en una solucin fijadora. A continuacin se seca el gel, formando una placa. El modelo proteico se visualiza tiendo la placa con un colorante especifico (azul de Coomassie) en bandas (figura 1) y luego traducidas esas bandas en perfiles (picos) del respectivo patrn electroforetico (proteinograma), con un densitmetro, el cual permite la cuantificacin de las diferentes fracciones. La protena (fraccin) que ms migra desde el punto de aplicacin es la albmina. El proteinograma srico se utiliza para determinar las distintas concentraciones proteicas normalmente presentes en el suero. No se puede emplear plasma, pues contiene fibringeno que es detectable. La relacin porcentual entre estos componentes (albmina, alfa-1-globulinas, alfa-2-globulinas, beta y gammaglobulinas) se mantiene constante, dentro de unos lmites, en condiciones normales de salud (figura 2, proteinograma

normal), si se presenta un estado de enfermedad, se ve reflejada en el proteinograma (figuras 3 y 4, cirrosis y sndrome nefrtico).

Valores esperados: Fraccin Albmina Alfa 1 Alfa 2 Beta Gamma Porcentaje relativo 58.8 - 69.9 % 1.8 - 3.8 % 3.7 13.1 % 8.9 13.6 % 8.4 18.3 %

Figura 1. Acetato de agarosa observe las bandas normal

Figura 2. Proteinograma

Figuras 3 y 4, Proteinogramas cirrosis y sndrome nefrtico.

7.

CUESTIONARIO: 1. Cuales son las principales funciones que cumplen las protenas plasmticas? 2. Desde el punto de vista experimental, como Diferencia usted las albminas de las globulinas? 3. Que es un patrn electrofortico? 4. Esquematice el patrn electrofortico de las protenas plasmticas en un paciente con cirrosis heptica y con mieloma mltiple. 5. Que es fuerzas inica de una protena y que efecto tiene sobre su solubilidad? 6. Qu se entiende por relacin A y para qu sirve? G 7. Cuales son las principales protenas plasmticas? 8. Brevemente, explique el catabolismo proteico 9. La cirrosis qu consecuencias trae desde el punto de vista proteico? 10. Que valor clnico tiene la cuantificacin de las protenas plasmticas y de la urea? 11. Que factores afectan la vida media de una protena? 12. Cul es la vida media de las principales protenas plasmticas? 13. Que es proteinuria y que valor clnico tiene?

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BIBLIOGRAFA:

1. DAZ PORTILLO J. FERNNDEZ DEL BARRIO M. T. Aspectos Bsicos de la Bioqumica Clnica. Editorial Daz de Santos. Primera Edicin. Madrid 1997. 2. LAGUNA Jos. PIA Enrique. Bioqumica de laguna. Editorial Manual Moderno. 5 Edicin. Mxico 2002. 3. DELVIN Thomas. Biochemistry with Clinical Correlations. Ed. Wiley-Lis. New York 2002. 4. GAW Allan. COWAN Robert A. Bioqumica Clnica. Editorial Harcourt. Segunda Edicin. Madrid 2002. 5. BHAGAVAN N.V. Medical Biochemistry. Ed. Harcourt. Fourth Edition. San Diego 2001. 6. MARSHALL William J. Clinical Chemistry ED. Mosby. Third Edition. Great Britain 1997. 7. BURTIS Carl A. ASHWOOD Edward R. TIEZT Fundamentales of Chemistry. Fith Edition. Ed. Saunders. Philadelphia 2001. 8. KAPLAN, Lawrence, A. Pesce Amades L.. Clinical Chemistry. Editorial Mosby Third Edition. New York, . 1986. 9. TIETZ, Norbert W. Clinical Chemistry. Tercera Edicin. Editorial Saunders. Philadelphia 1999. 10. LEHNINGER A. L. Priciples of Biochemistry Worth. Ediciones Omega. S.A. Tercera Edicin. 11. PLUMMER, D. T. Introduccin a la Bioqumica. Prctica 1. Editorial MacGraw-Hill. Bogota 1991. 12. ANGEL, Gilberto. Interpretacin Clnica del Laboratorio. Editorial Panamericana. 3a. Edicin Mxico. 1990.

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CUESTIONARIO SOBRE PROTEINAS

1. Hablando de los aminocidos porqu desde el punto de vista qumico son anfteros?.

Explique lo anterior con un ejemplo.

2. Qu es un Zwitterin y cmo el pH influye en el equilibrio de esta ion dipolar sin

carga?. Ponga un ejemplo

3. Qu se entiende por pI de un aminocido. Cmo se encuentran a pH muy cido los

aminocidos y en soluciones muy bsicas?.

4. En general a pH superior en dos o ms unidades al valor de pI de un determinado

aminocido, este se encuentra predominantemente con carga negativa, porqu?. A dos o ms unidades de pH por debajo de su valor de pI, el aa se encuentra predominantemente con carga positiva. Porqu?. Qu pasa con un pH idntico a su pI?. Esta propiedad es la que va a causar la precipitacin aninica o catinica de las protenas de los lquidos biolgicos al tratarlas con sustancias como el TCA, cido fosfotngstico y cido pcrico(precipitantes aninicos) y cinc, cadmio, bario, etc., (precipitantees catinicos). Explique lo anterior. 5. Qu es lo que determina la funcin de una protena?. 6. Que entiende usted por una estructura primaria y estructura tridimensional de una protena? 7. Las protenas pueden clasificarse de diversas maneras atendiendo a su forma, funcin y composicin. Explique esto. 8. En cuanto a las protenas sricas cul es su concentracin. Especifique la concentracin de las albminas y Globulinas. Mediante tcnicas de electroforesis se han clasificado en fracciones o grupos, cules?. Cules son las funciones de estas protenas?. 9. De ejemplos de casos en que haya elevacin de las protenas sricas y en casos que haya una disminucin. 10. Cite los mtodos principales de que se dispone para determinar las protenas sricas. Ventajas y desventajas. 11. Protenas urinarias totales. La determinacin de protenas en orina es un claro ndice del estado del rin. Defina: proteinuria no patolgica, tubular, glomerular, por sobreproduccin. 12. Cul es la concentracin de protenas en el lquido cefalorraqudeo. Cul es la protena que predomina?. Y por qu?. Cul es la importancia de su determinacin?. 13. De ejemplos de alfa-globulinas, 1 y 2, beta-globulinas y gama Globulinas. 14. Qu es protena C reactiva y para qu sirve?. 15. Haga un trazado de un patrn electrofortico normal en acetato de celulosa y haga la diferencia entre una distribucin normal, y sndrome nefrtico, cirrosis heptica y mieloma mltiple. 16. Los cuatro factores principales que afectan la solubilidad de las protenas se relacionan todos con las estructuras primaria, secundaria y terciaria de las protenas. Son fuerza inica, pH, temperatura y constante dielctrica del solvente. Explicar cmo afectan la solubilidad proteica. Qu entiende usted por salting in y salting out?. Cul es la importancia de estos conceptos?. 17. Cules son las fuerzas inicas del NaCl 0.2M y del NaS04 0.2M?.

Profesor : MIGUEL MORENO RINCON