Universidade do Vale do Paraba

Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento

PRISCILA HARCKBART COSTA









ALTERAES OCORRIDAS NO TECIDO ADIPOSO APS A UTILIZAO DO
ULTRASSOM TERAPUTICO COM E SEM CAFENA EM SUNOS




















So Jos dos Campos, SP
2010




Priscila Harckbart Costa






ALTERAES OCORRIDAS NO TECIDO ADIPOSO APS A UTILIZAO DO
ULTRASSOM TERAPUTICO COM E SEM CAFENA EM SUNOS.






Dissertao apresentada ao programa de Ps-
Graduao em Bioengenharia da Universidade
do Vale do Paraba, como complementao dos
crditos necessrios para obteno do ttulo de
Mestre em Bioengenharia.

Orientadora: Prof. Dra. Josane Mittmann






















So Jos dos Campos, SP
2010
PRISCILA HARCKBART COSTA
.ALTERAES
OCORRDAS NO TECIDO ADIPOSO APS A UTILIZAO DO
ULTRSSOM TERAPUTICO COM E SEM CAFEiNA EM SUNOS'
Dissertao aprcvada como requisito parcial obteno do grau de Meste em Engenaria
Biomdica, do Programa de Ps-Graduao ern Bioengenharia, do Instituto de Pesqusa e
Desenvolmento da Universidade do Vale do Paraba, So Jos dos Campos, SP, pela seguinte
banca examinadora:
Prof. Dr. LEANDRO JOSE RANIERO GTNIVAP)
Prof. Dm. JOSANE MITTMANN (UNIVAP)
Prcf. Dr. RODRIGO FRANCO DE OLM (trNoPAR)
Prcf. Dra. Sandm Maria Fonsca da Costa
Direto do IP&D
-
Univap
So Jos dos Campos, 1 de setembro de 2010.





















Dedico este trabalho a toda a minha famlia,
especialmente ao meu marido Gustavo da Silva
Miranda, pelo carinho, apoio, pacincia e
incentivo. E a Deus por mais esta conquista em
minha vida.

















Agradecimentos







A minha orientadora prof. Dra Josane Mittman pelo apoio e por acreditar no meu trabalho.

Ao professor Dr. Leandro Raniero pela orientao, pacincia e por me fazer conhecer um
pouco mais sobre a tcnica Raman.

A Maira Gaspar Tosato pela orientao, dedicao e pacincia.

Aos professores e amigos da UVV:
Ary Gomes pela orientao, disponibilidade e dedicao; urea pelas indicaes, orientaes,
apoio e pacincia; Luiz Carlos Cavalcanti pelo apoio; Tatiane Moura da Silva pelo apoio e
compreenso e Valria Roseto Lemos pela disponibilidade.

Aos colegas do curso de medicina veterinria da UVV:
Professor Gustavo Cancian Baiotto por acreditar que seria possvel e por tornar possvel;
professor Eduardo pela colaborao e aos alunos do curso que atuaram durante e aps a
cirurgia cuidando dos animais tratados.

Ao colega Edney Leandro da Vitria pelo auxlio estatstico.












Alteraes ocorridas no tecido adiposo aps a utilizao do ultrassom teraputico com e
sem cafena em sunos.


RESUMO



Vrios estudos tm sido realizados para elucidar as aes e efeitos do ultrassom,
principalmente na tcnica de fonoforese, que tem como finalidade a permeao cutnea de
diferentes princpios ativos. Apesar da fonoforese ser uma das tcnicas mais usadas na
fisioterapia dermato-funcional, principalmente para tratamento das alteraes estticas do
tecido adiposo, ainda existe muita controvrsia em relao a sua utilizao. Este trabalho tem
como objetivos analisar as alteraes ocorridas no tecido adiposo de sunos e a permeao da
cafena, frente aplicao do ultrassom teraputico e a massagem cutnea. Foram utilizados 5
leites fmeas hbridas, pesando de 25 a 35 Kg, nos quais foram realizadas tricotomias dos
dorsos que foram divididos em 4 reas de 25cm
2
cada: controle (controle - C), ultrassom sem
ativo (ultrassom - US), fonoforese com gel de cafena a 4% (ultrassom e ativo - US/A) e
massagem com o mesmo gel de cafena (ativo - A). Foi utilizado o ultrassom teraputico com
frequncia de 3 MHz e intensidade de 1 W/cm
2
, por 7 minutos no modo contnuo. Aps 25
minutos, foi feita a bipsia das reas, que posteriormente foram analisadas pelas tcnicas de
espectroscopia Ramam, citometria e histologia. Os resultados mostraram que o ultrassom no
promove a liplise imediata e que apesar da permeao da cafena ter sido demonstrada pela
espectroscopia Raman, o seu tempo de ao no foi suficiente para promover qualquer
alterao morfolgica no adipcito. O que foi observado foi uma alterao reversvel da
camada crnea demonstrada pela histologia e pela espectroscopia. Sendo a espectroscopia
Raman um excelente recurso para a avaliao bioqumica dos tecidos tratados.









Palavras Chaves: Ultrassom, Tecido adiposo, Fonoforese, Cafena.


Changes in adipose tissue after the use of therapeutic ultrasound with and without
caffeine in swine.


ABSTRACT




Several studies have been performed to elucidate the actions and effects of ultrasound,
especially in the technique of phonophoresis, which aims to permeation of different active
ingredients. Despite being one of phonophoresis techniques used in physiotherapy dermato-
functional, especially for treatment of cosmetic changes of adipose tissue, there is still much
controversy regarding their use. This study aims to analyze the changes in adipose tissue of
pigs and the permeation of caffeine, compared to the application of therapeutic ultrasound and
massage the skin. We used five female hybrid pigs weighing 25 the 35 Kg, which were
submitted trichotomies of the backs who were divided into four areas of 25 cm
2
each: control
(control C), without active ultrasound (ultrasound USS), phonophoresis with caffeine gel
4% (ultrasound and active USA) and massage gel with the same caffeine (active A). Was
used therapeutic ultrasound with 3 MHz frequency and intensity of 1W/cm
2
, for 7 minutes in
the continuous mode. After 25 minutes, was biopsied from areas that later were analyzed by
spectroscopy techniques Ramam, cytometry and histology. The results showed that ultrasound
does not promote lipolysis immediately and that despite the permeation of caffeine have been
shown by Raman spectroscopy, its time for action was not sufficient to cause any
morphological changes in adipocytes. What was observed was a reversible alteration of the
stratum corneum demonstrated by histology and by spectroscopy. Raman spectroscopy is an
excellent resource for biochemical evaluation of the treated tissues.








Key-words: Ultrasound, Adipose tissue, Phonophoresis, Caffeine.






LISTA DE ILUSTRAES

Figura 1: Ondas de compresso e rarefao
Figura 2: Transmisso da energia mecnica do ultrassom
Figura 3: Profundidade do ultrassom em relao freqncia
Figura 4: Cavitao
Figura 5: Vias de permeao do frmaco atravs do estrato crneo, via intercelular e via
transcelular
Figura 6: Estrutura geomtrica molecular da cafena
Figura 7: Estruturas das metilxantinas numeradas
Figura 8: Estrutura da pele
Figura 9: Espalhamento de luz. (a) Espalhamento inelstico (Stokes), (b) Espalhamento
elstico (Rayleigh), (c) Espelhamento inelstico (Anti-Stokes)
Figura 10: Relao entre os espalhamentos
Figura 11: Representao esquemtica in vivo confocal Raman sobre a pele
Figura 12: Espectro Raman do estrato crneo da pele normal de diferentes voluntrias
Figura 13: Leitoa utilizada no experimento
Figura 14: Gel de cafena a 4%
Figura 15: (A) Tricotomia da regio dorsal, (B) Aplicao do ultra-som, (C) Massagem com
gel de cafena, (D) Remoo da rea tratada
Figura 16: Armazenamento das amostras em gelo seco
Figura 17: Equipamento de ultra-som utilizado no experimento
Figura 18: (A) Aplicao do soro fisiolgico, (B) Descongelamento, (C) Amostra
descongelada pronta para anlise
Figura 19: Corte da pele demonstrando as localizaes das emisses do laser
Figura 20: Aplicao do laser na amostra
Figura 21: Equipamentos utilizados na anlise atravs de espectroscopia Raman
Figura 22: Gel da cafena no porta-amostra para ser analisado pelo laser
Figura 23: Dendograma
Figura 24: Grfico de espalhamento de PC1 vs PC2
Figura 25: Loading plot da anlise das componentes principais utilizando s duas primeiras
PCs, uma vez que os dados so classificados corretamente atravs delas
Figura 26: Espectro da cafena presente no gel (grfico da mdia)
Figura 27: Espectros dos tratamentos na superfcie
Figura 28: Espectros dos tratamentos na profundidade de 50 m
Figura 29: Espectros dos tratamentos na profundidade de 100 m
Figura 30: Variao da rea da amida I
Figura 31: Variao grfica da rea da amida I
Figura 32: Variao da rea de protena e lipdio
Figura 33: Variao grfica da rea de protena e lipdio
Figura 34: Variao da rea da fenilalanina
Figura 35: Variao grfica da rea da fenilalanina
Figura 36: Espectros dos tratamentos realizados na hipoderme
Figura 37: Variao da rea da protena e lipdio da hipoderme
Figura 38: Variao grfica da rea protena e lipdio da hipoderme
Figura 39: Diagrama de Box-whisker evidenciando a distribuio em quartis percentuais das
reas dos adipcitos no tratamento controle (C) e expostos cafena (Caf - A), ultra-som e
cafena (USA) e somente ao ultra-som (USS)
Figura 40: Diagrama de Box-whisker evidenciando a distribuio em quartis percentuais das
reas dos adipcitos transformadas em seu logaritmo decimal, no tratamento controle (C) e
expostos cafena (Caf - A), ultra-som e cafena (USA) e somente ao ultra-som (USS)
Figura 41: Imagens das amostras do tecido adiposo. A - Tecido adiposo do Controle (C), B -
Tecido adiposo do Ativo (A), C - Tecido adiposo do Ultra-som com ativo (USA), D- Tecido
adiposo do Ultra-som (USS)
Figura 42: Imagem da camada crnea do grupo controle (C)
Figura 43: Imagem da camada crnea do grupo ativo cafena (A)
Figura 44: Imagem da camada crnea do grupo ultra-som com ativo - cafena (USA)
Figura 45: Imagem da camada crnea do grupo ultra-som sem ativo (USS)
Figura 46: Exemplo da imagem do tecido adiposo utilizado para a medida da rea dos lbulos
de adipcitos


LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Nmero de ondas do espectro Raman e as atribuies de cafena anidra hidratada,
teobromina, cafena e teofilina
Tabela 2: Resultados da Anlise Discriminante Linear em funo dos grupos (A, C, H, USS e
USA)
Tabela 3: Atribuies presentes no loading plot
Tabela 4: Anlise de varincia da resposta na rea de adipcitos transformada em base
logartmica, produzida pela exposio do modelo biolgico de pele, aps uma aplicao de
cafena e de ultra-som isoladamente e associados, comparados a um controle que no recebeu
tratamento
Tabela 5: Anlise de Varincia para as espessuras das camadas crneas
Tabela 6: Matriz de diferenas e sua significncia entre as mdias da espessura do estrato
crneo nos tratamentos realizados em pele de suno, segundo o teste de Fisher para as
diferenas mnimas significativas
Tabela 7: Anlise de varincia para a rea dos lbulos dos tecidos adiposos

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

MHz Megahertz
UST Ultrassom teraputico
AMPc Monofosfato de adenosina cclico
Hz Hertz
Cm Centmetros
W/cm
2
watts por centmetro ao quadrado

AGNE cidos graxos no esterificados
UVV Universidade Vila Velha
LEVB - Laboratrio de Espectroscopia Vibracional Biomdica
UNIVAP Universidade do Vale do Paraba
Ca F
2
Fluoreto de clcio
HE Hematoxilina-eosina
US Ultra-som
C Controle
USA Ultra-som com ativo
USS Ultra-som sem ativo
A Ativo
ASP Protena de estimulao da acilao
ACRP30/AdipoQ Protenas relacionadas ao complemento dos adipcitos
TNF- Fator de necrose tumoral
MIF Fator inibidor da migrao de macrfagos
PAI-I Plasminognio ativador/Inibidor-I
LHS Lpase hormnio sensvel
PEE Panculopatia esclero edematosa
VO
2
Volume de oxignio
Mx. Mximo
TAG Triacilglicerol
GH Hormnio do crescimento
Alfa
Beta
CO
2
Gs carbnico
H
2
0 gua
m Micrmetros
S. P. So Paulo
NMF Fator de hidratao natural
ANOVA Anlise de varincia
W watts
S segundos
mg - miligrama
SUMRIO

1 INTRODUO....................................................................................................................... 5
2 OBJETIVOS............................................................................................................................ 7
3 REVISO DE LITERATURA ............................................................................................... 8
3.1 ULTRASSOM...................................................................................................................... 8
3.1.1 Propriedades Fsicas do Ultrassom ......................................................................... 8
3.1.2 Efeitos Fsicos do Ultrassom.................................................................................. 14
3.1.3 Agentes de Acoplamento ....................................................................................... 16
3.1.4 Fonoforese.............................................................................................................. 17
3.2 CAFENA........................................................................................................................... 21
3.3 TECIDO ADIPOSO........................................................................................................... 25
3.4 ESPECTROSCOPIA RAMAN.......................................................................................... 29
4 MATERIAL E MTODOS................................................................................................... 33
4.1 Animais ..................................................................................................................... 33
4.2 Princpio Ativo.......................................................................................................... 34
4.3 Preparao................................................................................................................. 34
4.4 Tratamento ................................................................................................................ 34
4.5 Aplicao do Ultrassom............................................................................................ 36
4.6 Espectroscopia Raman .............................................................................................. 37
4.7 Anlise Histolgica e Morfometria........................................................................... 39
5 RESULTADOS..................................................................................................................... 41
5.1 Avaliao pela Espectroscopia Raman ..................................................................... 41
5.2 Avaliao Morfomtrica ........................................................................................... 51
5.3 Avaliao Histolgica ............................................................................................... 53
6 DISCUSSO......................................................................................................................... 57
7 CONCLUSO....................................................................................................................... 62
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS..................................................................................... 63
ANEXO A: Aprovao do Comit de tica em Pesquisa........................................................ 74



5

1 INTRODUO


Embora utilizado desde a dcada de 30, os resultados da aplicao do ultrassom
teraputico UST ainda objeto de muita controvrsia. Seus resultados, principalmente os
ligados s alteraes bioqumicas promovidas nos adipcitos e permeao cutnea de
diferentes princpios ativos ainda no esto totalmente claros. Na prtica clnica, so
utilizados diversos parmetros para sua aplicao, entretanto, a incerteza em relao aos seus
reais efeitos, proporcionados pelas diferentes aplicaes e dosimetrias, ainda persistem.

O ultrassom definido como um som com frequncias superiores a 20.000 ciclos por
segundo (Hertz - Hz), que consiste em ondas transmitentes de energia, alternando compresso
e descompresso do material. As ondas ultrassnicas geram uma variedade de efeitos fsicos,
responsveis por uma srie de alteraes fisiolgicas ocorridas no tecido tratado, podendo ser
classificados em trmicos e no trmicos (CAMERON, 2003).

Na fisioterapia dermato-funcional o UST utilizado na frequncia de 3 MHz, que
alm de proporcionar vrios efeitos fisiolgicos nos tecidos, usado principalmente para
promover a permeao de vrios princpios ativos, tcnica chamada de fonoforese. A filosofia
da fonoforese semelhante iontoforese, entretanto como esta tcnica no usa corrente
eltrica, no necessita que a substncia utilizada seja eletricamente carregada. Os efeitos da
energia ultrassnica abrem caminhos para a difuso da medicao atravs da pele, penetrando
mais profundamente no tecido (STARKEY, 2001). O efeito de permeao cutnea pelas
ondas ultrassnicas um tipo de aplicao clnica que vem ganhando confiabilidade
(PARIZOTTO et al., 2003).

A propriedade de barreira da pele atribuda camada crnea que formada por
cornecitos, cuja bicamada lipdica aumenta a resistncia ao transporte de ons. Assim, o
fluxo atravs da pele depende da natureza qumica da substncia: frmacos lipoflicos so
absorvidos em toda a rea lipdica do estrato crneo, com coeficientes de permeao
variveis; enquanto que a absoro de frmacos hidroflicos se d quase que exclusivamente
por poros de passagem sendo que o coeficiente de permeao quase constante (PIRES-DE-
CAMPOS, 2004).
6

Segundo Fandos (2005) as substncias ativas so os princpios ativos de ao ou efeito
cosmtico que se incorporam ao excipiente para dot-lo de uma funo especfica. Por ter
ao lipoltica, a cafena um dos princpios ativos mais utilizados em formulaes
cosmticas para tratamento do tecido adiposo. A cafena, um derivado das metilxantinas,
largamente utilizada como um potencializador da resposta lipoltica, pois inibe a
fosfodiesterase, degradando o AMPc (PIRES-DE-CAMPOS et al., 2008).

Guirro; Guirro (2002) citam que as clulas adiposas surgem isoladamente ou em grupo
nas malhas de muitos tecidos conjuntivos e so especialmente numerosas no tecido adiposo.
medida que a gordura se acumula, as clulas aumentam de tamanho e tornam-se globosas, a
gordura aparece primeiramente como pequenas gotas, que aps juntam-se para formar uma s
gota. A mobilizao desta gordura est sob o controle nervoso e hormonal que leva
liberao de cidos graxos e glicerol, os quais passam para o sangue.

Apesar de pesquisas relatarem efeito positivo do UST em vrias publicaes, h
algumas inconsistncias na literatura relacionadas a intensificao da permeabilidade da droga
na pele. Aproximadamente 75% dos estudos relatam efeito positivo da fonoforese, enquanto
outros 25% obtiveram resultados negativos (PARIZOTTO et al., 2003).

Devido s controvrsias em relao utilizao do UST como desencadeador da
liplise e como promovedor da permeao cutnea, optou-se por realizar esta pesquisa com o
intuito de tornar mais clara a sua ao no tecido adiposo, confirmar a permeao da cafena e
sua ao no tecido adiposo.
7
2 OBJETIVOS


Analisar as alteraes que podem ocorrer na clula adiposa frente ao do UST com
e sem cafena.
Avaliar a permeao da cafena utilizando o UST.
Avaliar a permeao da cafena devido ao atrito com a pele.
Analisar alteraes do nmero e do tamanho das clulas adiposas aps a aplicao do
ultrassom sem e com cafena.
8
3 REVISO DE LITERATURA


3.1 ULTRASSOM


No incio da dcada de 30, o ultrassom comeou a ser utilizado em medicina fsica,
reumatologia e ortopedia. A partir da dcada de 50, a ser aplicado em fisioterapia. Na dcada
de 70, este equipamento era utilizado para tratamento de celulite, sendo introduzido na
esttica (SILVA, 1997; MAIO, 2004).

Ultrassom refere-se s vibraes mecnicas, longitudinais, que so essencialmente as
mesmas das ondas sonoras, porm com frequncia mais alta. A energia ultrassonora descreve
qualquer vibrao a uma frequncia acima da faixa do som (16 a 20.000 Hz). Os sons com
frequncias abaixo ou acima desta faixa de frequncia so inaudveis ao ouvido humano,
sendo denominados, respectivamente, infrassons e ultrassons (LOW; RED, 2001; STARKEY,
2001; BORGES, 2006). A energia ultrassnica transmitida pelas vibraes das molculas do
meio pelo qual a onda est se propagando (GUIRRO; GUIRRO, 2004).

Segundo a ABNT, a frequncia do UST situa-se entre 0,5 a 5 MHz, sendo as mais
utilizadas as de 1 e 3 MHz. As intensidades teraputicas situam-se entre 0,1 e 3 W/cm
2
.
Intensidades menores que 0,1 W/cm
2
so utilizadas para diagnstico e maiores que 10 W/cm
2

para destruio tecidual. O UST de 5 MHz atua muito superficialmente na pele, por isso, caiu
em desuso na prtica clnica.


3.1.1 Propriedades Fsicas do Ultrassom


O equipamento de UST consiste em um gerador de corrente eltrica de alta frequncia,
conectado a uma cermica piezoeltrica sinttica que se deforma na presena de um campo
eltrico (GUIRRO; GUIRRO, 2004).

9
Segundo Agnes (2005), transdutor o termo que designa todo dispositivo que
converte um tipo de energia em outro. O transdutor ultrassnico converte energia eltrica em
mecnica e vice-versa, sendo constitudos na sua base de contato com a pele de um material
piezoeltrico, ou seja, certos tipos de cristais (quartzo) ou outros minerais policristalinos de
fcil obteno como o Zirconato-Titanato de Chumbo (ZTP) e Titanato de Brio. Estes
sofrem variaes na suas dimenses fsicas quando submetidos a campos eltricos (GUIRRO;
GUIRRO, 2004; AGNES, 2005).

Os cristais piezoeltricos produzem cargas eltricas negativas e positivas quando se
contraem e se expandem. Ocorre um efeito piezoeltrico inverso (indireto) quando uma
corrente alternada passa atravs do cristal piezoeltrico, resultando na contrao e expanso
do cristal, produzindo as ondas ultrassnicas, figura 1. A vibrao dos cristais causa a
produo mecnica de ondas sonoras de alta frequncia (STARKEY, 2001).


Figura 1: Ondas de compresso e rarefao.
Fonte: Guirro & Guirro (2004).

O transdutor que emite a onda ultrassnica geralmente menor que o cabeote que o
contm. A rea efetiva de emisso ou ERA (Effective Radiating rea) da cabea de
tratamento um parmetro importante que determina a intensidade da onda ultrassnica.
Como o elemento piezoeltrico no vibra uniformemente, a ERA ser sempre menor (10 a
20%) que a rea geomtrica do cabeote de tratamento (AGNES, 2005).

As ondas sonoras necessitam de um meio para se propagarem (lquido, slido ou
gasoso); ou seja, o som no se propaga no vcuo. A velocidade de propagao dessas ondas
maior nos meios onde h maior agregao molecular, ou seja, onde as molculas esto mais
10
prximas umas das outras (maior densidade de massa). Nos tecidos orgnicos, a velocidade de
propagao do ultrassom pode variar de acordo com as caractersticas dos tecidos (maior ou
menor agregao molecular), ou seja, o som se propaga mais rpido no tecido sseo do que no
msculo, assim como no msculo mais rpido do que na gordura (BORGES, 2006).

De acordo com Martines, Davolos e Jafelicci Jnior (2000) para que haja propagao
das ondas ultrassnicas necessrio que o meio de propagao tenha propriedades elsticas.
Ento, o movimento de um corpo vibrando transmitido s molculas adjacentes, as quais,
antes de retornarem posio de equilbrio, transmitem esse movimento para as molculas
que esto ao redor (figura 2).


Figura 2: Transmisso da energia mecnica do ultrassom
Fonte: Borges (2006)

A propagao da energia ultrassnica depende da frequncia das ondas sonoras e da
densidade dos tecidos. A passagem de ultrassom pelo corpo faz o tecido adquirir energia
cintica, resultando em vibrao celular. Quando o feixe de ultrassom atinge uma interface
acstica (como diferentes camadas de tecido), parte da energia refletida ou refratada. A
quantidade de reflexo e refrao depende do grau de alterao da densidade na juno entre
os dois tecidos. Quando o ultrassom entra em contato com o ar, produz uma reflexo quase
que total de energia. Ao contrrio da energia infravermelha, o ultrassom, no muito afetado
pelo tecido adiposo e passa facilmente por ele (STARKEY, 2001).
11

Segundo Koeke (2003), ao entrar em contato com determinado meio, as vibraes
podem sofrer diferentes comportamentos em relao sua propagao. Podem penetrar no
meio e serem retidas, produzindo calor (absoro). Podem ocorrer mudanas na direo das
ondas mecnicas quando atingem uma superfcie a um determinado ngulo e com certa
frequncia e so devolvidas para outra direo. Nesses casos, se o emissor de ondas
permanecer fixo, uma onda estacionria firmada, em que a soma de seu trajeto incide com a
onda refletida. Este fato mostra o crescimento das presses e rarefaes resultando em
potncias muito superiores original (reflexo). As ondas podem, ainda, sofrer desvio de sua
trajetria ao atravessar a superfcie de separao de dois meios nos quais as velocidades de
propagao diferem de um meio para outro (refrao) ou sofrer desvio sobre sua propagao
quando encontram um obstculo (difrao).

medida que a onda ultrassnica atravessa um meio homogneo, como um tecido, h
uma reduo de sua intensidade com a distncia, a chamada atenuao, que decorrente da
divergncia do feixe sonoro e, bem como da sua absoro, a qual convertida em calor
(GUIRRO; GUIRRO, 2004).

A emisso das ondas ultrassnicas pode ser contnua ou pulsada e quanto mais alta as
frequncias, por exemplo, 3 MHz, mais superficialmente vo atuar (PEREIRA, 2007). Para
Carvalho (2002) o UST aplicado com uma frequncia de sada de 1 MHz pode afetar tecidos
localizados abaixo de 5 cm de profundidade, sendo que quando este aplicado com
frequncia de 3 MHz, apresenta eficcia em tecidos de at 2 cm de profundidade (figura 3).



Figura 3: Profundidade do ultrassom em relao frequncia.
Fonte: Borges (2006).

12
Segundo Starkey (2001), a frequncia de sada do ultrassom determina a profundidade
de penetrao da energia, com uma correlao linear entre a frequncia do ultrassom e a
profundidade na qual a energia absorvida pelo tecido. A taxa de absoro e,
consequentemente, a atenuao aumentam conforme a frequncia do ultrassom aumenta, por
causa da frico entre as molculas que as ondas sonoras devem superar para passar atravs
dos tecidos. Por causa disso h menos energia para penetrar nos tecidos. Geradores de
ultrassom de alta frequncia (3 MHz) so empregados para tratamentos de tecidos
superficiais, pois a energia rapidamente absorvida.

Borges (2006) afirma que quanto maior a frequncia do ultrassom, menor o tempo de
relaxamento das estruturas sonadas (molculas, fibras, clulas, dentre outras), e
conseqentemente absorvem maior quantidade de energia.

A onda ultrassnica sofre atenuao medida que se propaga pelos tecidos. Ela
causada primeiramente pela converso da energia ultrassnica em calor por meio da absoro
e de alguma reflexo e refrao do feixe. O aumento de temperatura pode provocar dentre
outros efeitos o aumento da extensibilidade do colgeno, aumento do fluxo sanguneo e
aumento da permeabilidade da pele (KOEKE, 2003).

A quantidade de energia que incide em uma determinada superfcie chamada de
potncia, expressa em watts (W). Essa energia dependente de algumas caractersticas do
ultrassom (frequncia, intensidade, amplitude, foco e uniformidade do feixe) e do tipo de
tecido em que ocorre a propagao da onda (SPEED, 2001).

Segundo Ferreira e Mendona (2007) a intensidade definida como a quantidade de
energia que passa atravs da unidade de rea em uma unidade de tempo, expressa em watts
por centmetro ao quadrado (W/cm).

De acordo com Olsson et al. (2008) a intensidade da radiao ultrassnica fator
essencial para o sucesso de qualquer terapia, bem como o seu tempo de aplicao. A
quantidade de energia total depositada sobre um determinado tecido biolgico o produto da
intensidade com o tempo de aplicao que, convencionalmente, na terapia ultrassnica, varia
de 0,01 a 3 W/cm
2
e emprega uma frequncia de 1 a 3 MHz. No existem dados cientficos ou
clnicos quantitativos que indiquem a utilizao de nveis acima de 1 W/cm
2
para promover
13
um efeito significativo em tecidos lesionados. Efeitos trmicos significativos podem ser
obtidos usando intensidade entre 0,5 e 1 W/cm
2
, independente da frequncia (KITCHEN,
2003). Experimentos de Goraj-Szczypiorowska, Zajac e Skalska-Izdebska (2007)
demonstraram que a alta intensidade do campo (3 W/cm
2
) causou queimaduras de segundo
grau no tecido a uma profundidade de 1 cm.

O tempo de aplicao do ultrassom est relacionado com a rea a ser irradiada, isto ,
quanto maior rea a ser tratada, maior o tempo gasto para a terapia (GUIRRO; GUIRRO,
2004). O tempo de aplicao do ultrassom pode ser calculado dividindo-se a rea a ser tratada
pela ERA (BORGES, 2006). Ento, quando a ERA do transdutor citada, possvel
determinar a durao do tratamento (PARIZOTO, et al., 2003).

Um dos fenmenos que acontece durante a aplicao do ultrassom a cavitao,
formao de cavidades ou bolhas no meio lquido, contendo quantidades variveis de gs ou
vapor (GUIRRO;GUIRRO, 2004). A cavitao ocorre em toda aplicao de ultrassom, pois os
pulsos individuais liberados pelo gerador de ultrassom fazem com que as clulas e molculas
situadas no caminho do feixe oscilem de maneira cclica, e diretamente proporcional
intensidade de sada da unidade geradora de ultra-som. Essas oscilaes estimulam a
formao de bolhas. A partir disto, podem ocorrer dois tipos de cavitao: cavitao estvel e
instvel (transitria; temporria; ou de colapso), conforme figura 4. Os benefcios da terapia
ultrassnica derivam somente da cavitao estvel (BORGES, 2006).

Figura 4: Representao esquemtica do processo de cavitao
Fonte: Cameron (2003)

14
No caso das clulas ou macromolculas em suspenso aquosa, o ultrassom pode
alter-las estrutural e/ou funcionalmente atravs da cavitao. O uso do ultrassom teraputico
baseia-se, em parte, em seu efeito de aquecimento (efeito trmico) promovido pela absoro
da energia da onda ultrassnica. Embora genericamente os resultados benficos dos efeitos do
ultra-som apontem para os efeitos trmicos, os efeitos no-trmicos resultantes principalmente
da cavitao, exercem efeitos marcantes na estimulao celular e em microrganismos,
alterando a permeabilidade de membranas (GUIRRO; GUIRRO, 2004).

Agnes (2005) relata que o processo da cavitao explicado tambm como
responsvel pela resposta teraputica do ultrassom sobre as pseudofibroses e no tratamento do
fibro edema gelide. Existe referncia que a cavitao seja tambm responsvel pela
liquefao de um gel, processo conhecido como tixotropia, melhorando a extensibilidade do
tendo e talvez quebrando a molcula de gordura.

De acordo com Kitchen (2003) amplitudes de baixa presso resultam na formao de
bolhas que vibram at um grau em que so produzidas alteraes reversveis na
permeabilidade das membranas celulares perto do evento cavitacional. As alteraes na
permeabilidade celular a vrios ons, como clcio, podem ter um efeito profundo na atividade
da clula.


3.1.2 Efeitos Fsicos do Ultrassom


Os efeitos do ultrassom em tecidos biolgicos podem ser divididos em duas
categorias: efeitos trmicos e no trmicos (MAIO, 2004). Quando a corrente eltrica
aplicada ao material piezeltrico de forma ininterrupta, ele ir se comprimir e dilatar-se
continuamente, produzindo ondas contnuas. Quando optamos pelo regime pulsado, o
aparelho interrompe momentaneamente a chegada de eletricidade no material, interrompendo
parcialmente a emisso de ondas sonoras, produzindo assim, ondas sonoras pulsadas
(BORGES, 2006). Esta interrupo propicia a dissipao do mnimo calor gerado durante o
impulso. Para que o efeito seja mais ou menos trmico depender do ciclo de trabalho,
tambm conhecido como relao impulso-pausa, que pode ser selecionado em alguns
aparelhos, permitindo uma regulao da dissipao do calor (AGNES, 2004).
15
Sua capacidade de aumento da temperatura do tecido o seu efeito trmico, sua
capacidade de causar fluxo acstico, microfluxo e cavitao que podem alterar a
permeabilidade da membrana celular, so os seus efeitos no trmicos (CAMERON, 2003). O
microfluxo corresponde a movimentos unidirecionais que ocorre em fludos submetidos a um
campo ultrassnico e que originam foras e tenses que podem, por um lado, danificar
macromolculas e clulas e, por outro, modificar a posio de partculas intra e extracelulares.
Consequentemente podem afetar a atividade celular, estimulando o metabolismo e a
multiplicao (DYSON; SUCKLING, 1978).

No modo pulsado o efeito trmico menos pronunciado e o efeito mecnico
superior, possibilitando a abertura de campos de tratamentos onde no desejvel o efeito
predominantemente trmico, como exemplo, o tratamento para a dor (OLSSON, et al., 2008).
Segundo Low e Reed (2001) e Starkey (2001), os efeitos atrmicos auxiliam a difuso da
droga pela oscilao de partculas nos tecidos e do medicamento, alterando o potencial de
repouso da membrana. Promovem ainda, alteraes transitrias, como a desnaturao da
estrutura protica de queratina no estrato crneo, alterando a estrutura lipdica intercelular
entre os cornecitos, aumentando a permeabilidade celular e a condutncia inica ou
rompendo a membrana celular.

Na emisso contnua, busca-se a produo de efeitos qumicos, mecnicos e trmicos.
A emisso pulsada indicada como efeito antiinflamatrio, antilgico e antiedematoso, porm
evitando a produo de efeitos trmicos (MAIO, 2004). De acordo com Griffi e Karsalis
(1978) e Borges (2006), os efeitos trmicos do ultrassom aumentam o fluxo sanguneo, a
extensibilidade dos tecidos ricos em fibras colgenas, a permeabilidade dos tecidos e a
presso acstica, criada pela transmisso do ultrassom mobiliza o medicamento/cosmticos
atravs da pele. O aquecimento produzido pelo ultrassom dilata os locais de entrada, como os
folculos pilosos e as glndulas sudorparas e aumenta a circulao da rea tratada. Estas
mudanas fisiolgicas aumentam a capacidade das molculas dos medicamentos se
difundirem atravs do estrato crneo e serem recolhidas pela rede de capilares da derme
(BYL, 1995).

Dependendo dos parmetros de entrada, os efeitos da aplicao de ultrassom podem
incluir o aumento da velocidade de reparo do tecido e da cura de leses, aumento da
extensibilidade do tecido, dissoluo de depsitos de clcio, reduo da dor e de espasmo
16
muscular por meio da alterao da conduo nervosa. A energia ultrassnica tambm
utilizada para liberar medicamentos em tecidos subcutneos e para ajudar a cura de fraturas
(STARKEY, 2001).

Cagnie et al. (2003) em seu estudo avaliando a permeao de cetoprofeno atravs do
UST, nos modos contnuo e pulsado, ambos com frequncia de 1 MHz e intensidade de 1,5
W/cm
2
por 5 minutos, demonstraram a permeao da substncia no tecido sinovial e no
tecido adiposo dos joelhos dos pacientes tratados. Apesar de no apresentar diferenas
estatsticas, o autor afirma que a permeao no modo pulsado foi maior do que no modo
contnuo.


3.1.3 Agentes de Acoplamento


O bom desempenho do equipamento de ultrassom depende de um acoplamento correto
entre o transdutor e o tecido a ser tratado. Os tecidos so caracterizados por apresentarem
impedncia acstica, e as aplicaes feitas em contato direto com eles necessitam de um
agente acoplador que tambm excluir as bolhas de ar que podem se formar entre o transdutor
e o paciente (FERREIRA; MENDONA, 2007).

Segundo Guirro e Guirro (2004), os agentes de acoplamento so utilizados nas
aplicaes do ultrassom teraputico em virtude deste no se propagar no ar, fazendo com que
o coeficiente de atenuao entre os dois meios envolvidos metal/pele tornem-se similares,
e assim quase toda intensidade incidente seja transmitida. Os materiais com maior eficincia
so o gel hidrossolvel e a gua desgaseificada, dependendo do ensaio ou da rea a ser
irradiada.

Casarotto et al. (2004) relataram que a gua e o gel apresentam os menores
coeficientes de reflexo e atenuao, os maiores coeficientes de transmisso e uma
impedncia acstica mais prxima da pele, causando uma reflexo menor nesta interface.

Na fisioterapia dermato-funcional o melhor meio de acoplamento o gel com
princpios ativos, pois o principal objetivo da utilizao do ultrassom proporcionar a
17
permeao cutnea destes ativos. Com o avano tecnolgico nas indstrias farmacuticas e
cosmticas, tm-se cada vez mais diferentes matrias-primas disponveis para formulao de
bases de gis. Dentre as bases mais utilizadas na elaborao de um gel, tm-se o cido
carboxivinlico (Carbopol 940

C940 e Carbopol Ultrez

- CULT) e a hidroxietilcelulose
(Natrosol

) (CHORILLI et al., 2007).

3.1.4 Fonoforese


A fonoforese definida como o movimento de drogas introduzidas, sob a influncia de
ondas ultrassnicas, em tecidos moles atravs da pele intacta (SKAUEN; ZENTNER, 1984;
YOUNG, 2003). Para Low e Reed (2001), esse tratamento tem sido usado desde a dcada de
50, mas no por muitos fisioterapeutas.

Uma das vantagens da fonoforese que o medicamento no precisa ser introduzido de
forma invasiva, alm, de ser espalhado sobre uma rea maior e, dessa forma, o medicamento
que penetra nos tecidos no passa pelo fgado, diminuindo, portanto, a eliminao metablica
das substncias (BRASILEIRO; ALVES; ESCSSIA, 2003).

Uma vez que a difuso ocorra atravs do estrato crneo, as molculas permeiam at a
derme, sendo absorvidas no plexo capilar e transferidas para o sangue circulante (BYL, 1995).

Segundo Agnes (2005), o UST aumenta a penetrao transcutnea por presso
somtica, podendo atingir 4 a 5 cm de profundidade. Para tratamentos superficiais,
considerando o limite mximo de 2 a 3 cm, utiliza-se a frequncia de 3 MHz e os mais
profundos 1 MHz.

A profundidade na qual se pode fazer com que as drogas penetrem uma questo
particularmente incerta. Do mesmo modo que com a iontoforese, assim que a droga passa pela
epiderme, provvel que seja dispersada na circulao por uma extenso que depende da
vascularidade dos tecidos em questo e da facilidade com que as molculas da droga podem
entrar nos vasos sanguneos (LOW; REED, 2001).

18
De acordo com Jesus, Ferreira e Mendona (2006), embora seja mais fcil visualizar a
fonoforese como um processo de ondas de ultrassom que levam fisicamente o medicamento
pela pele, no isso que ocorre. Os efeitos da energia ultrassnica abrem caminhos que
permitem que a medicao se difunda pela pele e penetre mais profundamente nos tecidos. As
substncias utilizadas como veiculo na fonoforese so enzimas de difuso
mucopolissacardases, entre outras (PEREIRA, 2007).

Os efeitos trmicos e no-trmicos associados com a aplicao de UST padro podem
aumentar a velocidade e a quantidade de medicamento absorvido. Os efeitos trmicos do UST
elevam a energia cintica das clulas da rea e do medicamento, dilatando os pontos de
entrada (folculos pilosos, glndulas sudorparas, etc...), aumentando a circulao, a
permeabilidade capilar e desordenando os lipdios estruturados no estrato crneo. Dentre os
efeitos no-trmicos que melhoram a difuso pelas membranas podemos citar a alterao do
potencial de repouso da clula, a mudana da permeabilidade de molculas ionizadas e no-
ionizadas e a elevao da permeabilidade da membrana celular. Ocorrem tambm mudanas
qumicas como, reaes de oxidao, inativao de enzimas e a prpria cavitao, alm de
possivelmente ocorrer aumento da atividade do trifosfato de adenosina e da permeabilidade da
membrana celular (STARKEY, 2001; POLACOW, 2005).

Os mecanismos que podem intensificar a absoro de drogas atravs da pele so
numerosos. Acredita-se que o mecanismo que envolve a deposio de droga o fenmeno de
cavitao, resultando na formao de microbolhas gasosas na camada externa da pele (estrato
crneo) podendo se romper violentamente e permitir a passagem da droga. Considerando este
fato, possvel que haja desorganizao da regio lipdica da camada crnea, podendo
aumentar sua permeabilidade (PARIZOTTO et al., 2003).

Ueda et al.(2009) em seu trabalho sobre sonoforese, demonstrou que a ao indireta
dos eventos cavitacionais em soluo desempenham um papel importante para aumento na
permeao de substncias, em particular, a cavitao instvel; e que a cavitao
inversamente proporcional a freqncia do ultrassom.

Segundo Guirro (1999), estudos sobre a fonoforese demonstram que o fator
temperatura tem uma pequena importncia na penetrao de frmacos, sendo mais evidentes
os efeitos da fora de radiao, cavitao estvel e microfluxo acstico. Vrios autores
19
apontam os efeitos no-trmicos como os responsveis pela perturbao da membrana com
consequente incremento da permeao de substncias. Para Bommannan et al. (1992) as
mudanas de temperatura acima de 5 C so necessrias para causar aumentos razoveis na
permeabilidade da pele.

A utilizao da onda ultrassnica para a penetrao de drogas atravs da pele
pressupe a utilizao do modo contnuo (GUIRRO; GUIRRO, 2004; PARIZOTTO, et al.,
2003).

De acordo com Polacow et al. (2004) tanto o efeito trmico quanto o mecnico, bem
como as alteraes qumicas dos tecidos biolgicos, aceleram a difuso dos princpios ativos
presentes nos medicamentos de uso tpico. A camada crnea produz alta resistncia
penetrao de substncias atravs da pele, e o ultrassom, desorganizando o estrato crneo,
pode reduzir em 30% essa resistncia.

Para Pires-de-Campos et al. (2008) o uso do ultrassom na permeao cutnea fornece
vantagens adicionais. Alm do reforo localizado e reduo dos efeitos sistmicos, o uso da
administrao por ultrassom reduz o nmero de sesses necessrias, pois os efeitos da
medicao so combinados com os efeitos fisiolgicos do ultrassom.

A transmissividade das diferentes preparaes farmacolgicas tpicas podem variar
significativamente, podendo interferir na penetrao dos seus princpios ativos. Embora
cientificamente no seja comprovado, parece lgico que somente alguns produtos com boas
caractersticas de transmisso ultrassnica possuam condies fsicas necessrias para a
fonoforese, sendo que as preparaes tpicas com baixo ndice de transmisso podem
diminuir a efetividade da terapia ultrassnica (GUIRRO; GUIRRO, 2004). Para Borges et al.
(2002) para realizar-se a fonoforese deve-se usar drogas em gel.

A literatura mais recente tem demonstrado maior eficcia da fonoforese utilizando
UST de baixa frequncia, principalmente entre 20 e 40 KHz. Polacow et al. (2005) cite em
seu trabalho que Polacow et al. demonstraram por meio de estudo in vivo a permeao
cutnea do tiratricol utilizando ultrassom de 3 MHz, no modo contnuo com intensidade de
0,2 W/cm
2
. Pires-de-Campos (2004) demonstrou atravs de anlises de permeao,
20
morfomtricas e funcionais do tecido adiposo, que o UST de alta freqncia (3 MHz), no
modo contnuo, com intensidade de 0,2 W/cm
2
, aumentou e acelerou a permeao da cafena.

Goraj-Szczypiorowska, Zajac e Skalska-Izdebska (2007) afirmam atravs de um
estudo citado em seu trabalho, que a frequncia do UST no tem qualquer efeito sobre a
presena de drogas no tecido.

Alguns estudos constataram o efeito da sonoforese aumentando a penetrao de
pequenas molculas atravs da pele, aplicando o UST com frequncias teraputicas (1 a 3
MHz). Porm, o aumento dos nveis do transporte de drogas atravs da pele foi observado
somente com drogas especficas. Devido grande variao entre as drogas, ainda existem
controvrsias sobre a eficcia da sonoforese em aumentar a penetrao de drogas atravs da
pele. Uma explicao para essa variao foi apresentada recentemente baseada nas diferenas
fsico-qumicas das drogas, por exemplo, lipofilicidade e peso molecular (ALFREDO, 2008).
A fonoforese varia significativamente de droga para droga. (BORGES et al., 2002).

Byl (1995) cita em seu trabalho um estudo realizado, no qual foi utilizada a
microscopia eletrnica para controlar a permeao cutnea de nitrato de lantnio, onde se
verificou a permeao do ativo por uma rota intercelular e aps 5 minutos de tratamento.

Meshali et al. (2008) realizaram um teste in vitro no qual eles avaliaram a permeao
de trs drogas, ibuprofeno, piroxicam e diclofenaco de sdio, atravs de uma membrana de
celulose, constatando que quanto maior a intensidade aplicada no modo contnuo maior o
transporte destas trs substncias pela membrana.


3.2 CAFENA


Uma formulao cosmtica composta por veculo, aditivos e princpios ativos. Os
veculos, alm de carreadores dos princpios ativos, do forma ao cosmtico e devem ser
adequados ao tipo de pele; os aditivos so utilizados para conservar, colorir e ou perfumar, e
algumas vezes tanto os veculos como os aditivos, por possurem certas propriedades como
antioxidantes, fungicidas, cicatrizantes, entre outras, se comportam como adjuvantes na
21
formulao cosmtica potencializando a eficcia do produto; e finalmente os princpios ativos
que, atravs de seus constituintes, indicam o modo de ao, a indicao ou a finalidade do
produto (GOMES; DAMAZIO, 2009).

A transposio do estrato crneo, que representa a principal barreira penetrao dos
ingredientes cosmticos, essencial para que o ingrediente cosmtico ativo exera a sua ao
nas camadas mais internas da pele. O estrato crneo a camada mais externa da epiderme,
composta por clulas achatadas queratinizadas incorporadas em uma matriz de lipdios
multilamelares, lipdios neutros e ceramidas (HERKENNE et al., 2008). No sentido de
ultrapassar o estrato crneo penetrao da cafena e atingir o tecido subcutneo,
desenvolvem-se formulaes tpicas, constitudas por substncias que promovam a
permeao cutnea. Outra estratgia atualmente utilizada para aumentar a permeao cutnea
de substncias como a cafena a sonoforese, isto , a utilizao de UST, que se verificou
acelerar e acentuar a penetrao da cafena, originando uma reduo significativa da espessura
da hipoderme, relacionada com uma diminuio do nmero de adipcitos presentes na regio
(RAMALHO; CURVELO, 2006).

Molculas de medicamentos e cosmticos podem penetrar no epitlio transcelular e
intercelular atravs de canais entre as clulas, entretanto mais fcil a difuso atravs dos
folculos pilosos, glndulas sebceas e ductos de suor (BYL, 1995), conforme figura 5.

22

Figura 5: Vias de permeao do frmaco atravs do estrato crneo, via intercelular e via transcelular
Fonte: Martins e Veiga (2002)


Segundo Pires-de-Campos (2004), o nico tratamento que mostrou uma reduo
estatisticamente significante na espessura da hipoderme e do nmero de adipcitos foi o uso
da associao da aplicao do ultrassom com o uso do gel de cafena.

A cafena um alcalide pertencente ao grupo das drogas classificadas como as
metilxantinas (1,3,7- trimetilxantina), conforme na figura 6 (BRAGA; ALVES, 2000;
BARBOSA et al., 2008).
23


Figura 6: Estrutura geomtrica molecular da cafena
Fonte: Pavel et al. (2003)

Teofilina, cafena e teobromina tm efeitos bioqumicos diferentes e esto presentes
em diferentes propores nas plantas fontes. Eles so facilmente oxidados a cido rico e
metil cido rico. A cafena ocorre no caf, ch, coca-cola, castanhas, erva mate, guaran, j a
teofilina encontrada principalmente no ch. As poucas teobrominas esto presentes em gros
de cacau, cola e ch (GUNASEKARAN; SANKARI; PONNUSAMY, 2005), conforme
figura 7.


Figura 7: Estruturas das metilxantinas numeradas
Fonte: Edwards, Munshi e Anstis (2005)

Em formulaes cosmticas podem ser utilizadas as metilxantinas isoladas ou
derivados como a Cafeisilane C

e o Theophysilane C

, que so derivados de cafena e

teofilina, respectivamente. Cafena, teofilina e aminofilina possuem efeito lipoltico in vitro
atuando como inibidores de fosdiesterases e, portanto, permitem que a estimulao de
receptores adrenrgicos induzam a hidrlise de triglicerdeos, como conseqncia ocorre a
liberao de cidos graxos e glicerol (RIBEIRO; GONALVES, 2006).

24
As metilxantinas tambm possuem a capacidade de antagonizar as aes mediadas por
receptores de adenosina inibindo o seu efeito anti-lipoltico (HARDMAN, 1996; PIRES-DE
CAMPOS, 2004).

De acordo com Braga e Alves (2000); Chorilli et al. (2005); Fredholm (1985), a
cafena inibe a ao da enzima fosfodiesterase, que responsvel pela degradao do
mediador qumico intracelular, denominado adenosinamonofosfato (AMP cclico)
transformando-o em 5AMP inativo, acarretando na manuteno da taxa de AMPc. A
disponibilidade de AMPc ativa a proteinoquinase A e consequentemente a lpase hormnio
sensvel (LHS), induzindo a liplise atravs da mobilizao de cidos graxos e glicerol. Essa
ao s foi observada em experimentos realizados in vitro, atravs de concentraes
plasmticas de cafena, consideradas suprafisiolgicas (~0,1-1mM).

A cafena usada em formulaes cosmticas tpicas para o tratamento da
paniculopatia esclero edematosa (PEE), em concentraes de 1 a 2%, embora existam no
mercado formulaes com 5% (RAMALHO; CURVELO, 2006).

Os efeitos farmacolgicos do uso constante de cafena por via oral incluem desde o
aumento na concentrao plasmtica de cidos graxos livres e de catecolaminas, at efeitos
psicomotores, tanto em homens como em animais (ALTIMARI et al., 2001). As
catecolaminas so ativadores da liplise que atuam via 1, 2 e 3 adrenorreceptores,
estimulando a ao da lpase hormnio sensvel (LHS), regulada pelo AMPc, e inibindo a
lpase lipoproteica (HERMSDORFF; MONTEIRO, 2004).

Andrade, Ribeiro e Carmo (2006) afirmam que a cafena aumenta a concentrao
plasmtica de adrenalina e noradrenalina. As catecolaminas estimulam a ao do glucagon
promovendo liplise no tecido adiposo e aumentando o nvel de glicose plasmtica, ou seja,
favorecem a converso das reservas energticas (glicognio e gordura) em combustveis de
fcil disponibilidade (glicose e cidos graxos) (MARZZOCO; TORRES, 2007).

Costill, Dalsky e Fink (1978) realizaram uma srie de estudos relacionando os efeitos
da cafena como recurso ergognico nos exerccios de endurance. Em um dos estudos foram
examinados os efeitos da ingesto de 330mg de cafena 1 hora antes do exerccio em bicicleta
ergomtrica a 80% VO
2
mx. at exausto, mostrando um aumento de 19,5% no tempo de
25
endurance. De acordo com Ivy et al. (1979) em outro estudo, foi demonstrado que a ingesto
de 250mg de cafena resultou num aumento de 7% na quantidade de trabalho produzida em 2
horas de exerccios em bicicleta isocintica. Esses estudos sugeriram que a cafena causou um
aumento na disponibilidade de cidos graxos livres para o msculo, resultando em um
aumento da taxa de oxidao de lipdios. Dessa forma, iniciando-se a utilizao de lipdios
mais cedo para a produo de energia, o glicognio muscular poderia ser poupado, retardando
a fadiga (BRAGA; ALVES, 2000; SILVEIRA et al., 2004).

Segundo Altimori et al. (2001) acredita-se que a cafena gera um aumento na
mobilizao de cidos graxos livres nos tecidos e/ou nos estoques intramusculares,
aumentando a oxidao da gordura muscular e reduzindo a oxidao de carboidratos.


3.3 TECIDO ADIPOSO


A hipoderme, ou panculo adiposo, a camada mais profunda da pele, de espessura
varivel, composta exclusivamente por tecido adiposo, isto , clulas repletas de gordura,
formando lbulos subdivididos por traves conjuntivo-vasculares. Relacionase, em sua
poro superior, com a derme profunda, constituindo-se a poro dermo-hipodrmica, em
geral, sede das pores secretoras das glndulas apcrinas ou crinas e de plos, vasos e
nervos, conforme figura 8 (SAMPAIO; RIVITTI, 2008).


Figura 8: Estrutura da pele
Fonte: Bear, Connors e Paradiso (2002)
26


O tecido adiposo distingue-se em duas camadas separadas por uma fscia superficial.
A camada mais externa (em contato com a derme), chamada de areolar composta por
adipcitos globulares e volumosos, em disposio vertical, onde os vasos sanguneos so
numerosos e delicados. Na camada mais profunda, chamada de lamelar, as clulas so
fusiformes, menores e dispostas horizontalmente, onde os vasos so de maior calibre (PIRES-
DE-CAMPOS, 2004). Alm dos adipcitos, o tecido adiposo contm uma matriz de tecido
conjuntivo (fibras colgenas e reticulares), tecido nervoso, clulas do estroma vascular,
ndulos linfticos, clulas imunes (leuccitos, macrfagos), fibroblastos e pr-adipcitos
(clulas adiposas indiferenciadas) (FONSECA-ALANZ et al., 2006).

A quantidade desse tecido varia nas diferentes partes do corpo, no existindo em
algumas regies, como nas plpebras e no prepcio. Geralmente, ela mais espessa no sexo
feminino do que no masculino e sua distribuio diferente nos dois sexos, determinando
carter sexual secundrio. Essa variao regulada pelos hormnios sexuais e adrenocorticais
(MAIO, 2004).

Segundo Vieira (1995) a quantidade de gordura existente no tecido adiposo depende
primordialmente do balano entre ingesto e gasto de energia. O gasto de energia resultante
de trs vetores principais: metabolismo basal, termognese e atividade fsica.

H duas variedades de tecido adiposo: amarelo (unilocular) e pardo (multilocular). No
primeiro as clulas, quando desenvolvidas, contm apenas uma gotcula de gordura no
citoplasma e, no segundo, as clulas contm numerosas gotculas lipdicas. O tecido adiposo
amarelo distribui-se por todo o corpo do homem adulto, de acordo com o bitipo, sexo e
idade. A cor amarela deve-se ao acmulo de carotenides dissolvidos nas gorduras. O tecido
adiposo pardo apresenta esta cor em razo de sua vascularizao abundante e de suas
numerosas mitocndrias existentes em suas clulas. Sua funo principal produzir calor. A
quantidade significativa somente no recm-nascido, auxiliando-o na termorregulao,
protegendo-o contra o frio excessivo (CORMACK, 2003; MAIO, 2004). O tecido adiposo
unilocular e o multilocular so inervados por fibras simpticas do sistema nervoso autnomo
(JUNQUEIRA; CARNEIRO, 1995).

27
A principal funo do tecido adiposo pardo a termognese, enquanto que o tecido
amarelo apresenta um papel mais complexo e dinmico, pois o responsvel pelo
armazenamento e balano energtico, secreo de fatores na resposta imunitra, como
adipsina, protena de estimulao de acilao (ASP), Acrp30/AdipoQ (adipocyte complement-
related protein), fator de necrose tumoral (TNF-) e fator inibidor da migrao de
macrfagos (MIF); em doenas vasculares pela secreo de angiotensinognio e PAI-I
(plasminogen activador/inibitor-I), e regulao do apetite, atravs da leptina (FRHBECK et
al., 2001; CURI et al., 2002).

De acordo com Curi et al. (2002) o tecido adiposo tambm um amortecedor de
choques mecnicos em certas regies do corpo, como os coxins absorventes de choque na
planta dos ps e na palma das mos, e se dispe e torno dos rgos, dando suporte e proteo
aos mesmos.

Segundo Fonseca-Alanz et al. (2006), o tecido adiposo o principal reservatrio
energtico do organismo. Os adipcitos so as nicas clulas especializadas no
armazenamento de lipdios na forma de triacilglicerol (TAG) em seu citoplasma, sem que isto
seja nocivo para sua integridade funcional. Essas clulas possuem todas as enzimas e
protenas reguladoras necessrias para sintetizar cidos graxos (lipognese) e estocar TAG em
perodos em que a oferta de energia abundante, e para mobiliz-los pela liplise quando h
dficit calrico. A regulao desses processos ocorre por meio de nutrientes e sinais aferentes
dos tradicionais sistemas neurais e hormonais, e depende das necessidades energticas do
indivduo.

Lipdios tm muitas funes biolgicas importantes, os triacilgliceris so os
principais combustveis de reserva de energia do corpo, outros lipdios, incluindo
fosfolipdeos, glicolipdeos e colesterol, so constituintes cruciais de membranas biolgicas;
as singulares propriedades de superfcie ativa dessas molculas permitem a elas formarem
esqueletos de membranas, separando e definindo compartimentos aquosos em clulas. A
maioria dos cidos graxos no homem encontrada em triacilgliceris, nos quais todos os trs
grupos hidroxila do glicerol esto esterificados com cidos graxos. Compostos com um
(monoacilgliceris) ou dois (diacilgliceris) cidos graxos esterificados ocorrem em
quantidades relativamente pequenas, em grande parte como intermedirios metablicos de
sntese e degradao de lipdios contendo glicerol (DEVLIN, 2007).
28

De acordo com Pires-de-Campos et al. (2008), fatores fisiolgicos como, alimentao,
exerccio fsico e idade; bem como patolgicos, entre eles, a obesidade, o diabetes e as
dislipidemias; podem interferir na liplise. Alm disso, a heterogeneidade nos depsitos de
gordura e as diferenas ligadas ao sexo e diversidade de hormnios (GH, cortisol, glucagon,
alm dos j citados) promovem uma complexidade na regulao da liplise.

A liplise um processo metablico elevado feito pelos adipcitos em perodos de
carncia e estresse, em que os trs cidos graxos esterificados do esqueleto do glicerol so
hidrolizados do triacilglicerol e liberados da clula. Os cidos graxos livres (cidos graxos
no esterificados, com um grupo carboxila livre) circulam pelo sangue unidos de uma forma
no covalente a uma protena portadora, a albumina srica. Os cidos graxos no esterificados
(AGNE) no plasma, junto com o glicerol so produtos da hidrlise do triacilglicerol e a fonte
de energia mais importante para um grande nmero de rgos. Dependendo do tecido e a
demanda metablica, os cidos graxos so convertidos em triacilgliceris ou em fosfolipdios
de membrana ou, ainda, oxidados a CO
2
e H
2
O (CURI et al., 2002). Os cidos graxos no
esterificados so metabolizados mediante a -oxidao e a cetognese, mostrando que o
glicerol canalizado para uma via gliconeognica heptica (SALAZAR, 2006). O glicerol
pode ser oxidado para obteno de energia ou transformado em glicose (MARANGON;
WELKER, 2003).

A liberao de cidos graxos a partir de triacilgliceris nos adipcitos controlada por
hormnios, que se ligam a um receptor na membrana plasmtica de um adipcito. Essa
ligao hormonal ativa a adenilato ciclase, levando a produo da protena quinase A ativa
(protena quinase dependente de AMPc). A protena quinase fosforila a triacilglicerol lpase,
que realiza a clivagem de cidos graxos a partir do esqueleto de glicerol. O principal
hormnio que possui este efeito a epinefrina (CAMPBELL; FARRELL, 2007).

No trabalho desenvolvido por Polacow et al. (2004) o suno foi escolhido como
modelo experimental, j que Wester & Maibach, aps reviso de diversos estudos de
penetrao cutnea em animais, concluram que o nvel de permeao desse tipo de pele
muito prximo a permeao da pele humana. Apresenta camada crnea com espessura
semelhante em relao humana e menor quantidade de plos comparada a de outros animais.
Alm disso, a quantidade de receptores -adrenrgicos dos sunos semelhante a dos seres
29
humanos. A camada crnea considerada a principal barreira a permeao. Segundo dados da
literatura, a espessura dessa camada no suno de 26,4 m, sendo a mais prxima a do
homem (16,8 m), entre vrios animais estudados.


3.4 ESPECTROSCOPIA RAMAN


Espectroscopia refere-se ao conjunto de mtodos e tcnicas, baseados na interpretao
dos espectros de emisso, absoro e/ou espalhamento de radiaes eletromagnticas de uma
amostra (DEMTRDER, 1996).

A espectroscopia Raman estuda a interao da radiao eletromagntica (laser) com a
matria, tendo como objetivo conhecer os nveis de energia de tomos e molculas (SALA,
1996). Quando a luz irradia uma molcula, a maioria dos ftons so espalhados elasticamente.
Esta luz espalhada elasticamente, que tem a mesma frequncia da luz incidente, chamada de
espalhamento Rayleigh. Uma pequena quantidade de luz, no entanto, espalhada
inelasticamente. A luz espalhada inelasticamente, denominada Raman, apresenta mudanas na
frequncia em relao luz incidente. Essas mudanas correspondem exatamente s
transies de energia vibracional da molcula (TFAYLI et al., 2007). Uma pequena frao da
luz incidente pode ter a sua energia diminuda (Stokes) ou aumentada (Anti-Stokes). Visto
que a energia da luz proporcional a frequncia, a mudana de frequncia da luz espalhada
inelasticamente igual frequncia vibracional da molcula espalhada. O processo de
espalhamento Raman pode ser descrito, do ponto de vista energtico, como a transio de
uma molcula do seu estado fundamental para um estado vibracional excitado, acompanhada
por uma absoro de um fton incidente e emisso de um fton espalhado (Raman), como
observado na figura 9 (SOUZA, et al., 2003). Para Van der Pol e Caspers (2009) a medio da
intensidade energtica e da luz reemitida de diferentes frequncias gera o espectro.


30

Figura 9: Espalhamento de luz. (a) Espalhamento inelstico (Stokes), (b) Espalhamento
elstico (Rayleigh), (c) Espelhamento inelstico (Anti-Stokes)
Fonte: Faria, Santos e Gonalves (1997)


Na figura 10 ilustramos o diagrama da figura 9, onde visualizamos a diferena entre o
espalhamento inelstico Stokes, no qual a energia da radiao espalhada menor do que a
energia da radiao incidente, e o espalhamento inelstico anti-Stokes, onde a energia da
radiao espalhada maior que a energia de radiao incidente.


Figura 10: Relao entre os espalhamentos


Espectroscopia Raman uma tcnica de caracterizao ptica conhecida para avaliar a
composio molecular, estrutura e interaes em uma amostra. Esta tcnica, no destrutiva
baseado no espalhamento inelstico da luz e pode ser aplicado diretamente, com pouca ou
nenhuma preparao da amostra. Estudos mais recentes em desenvolvimento utilizam a
microscopia Raman confocal in vivo, que prev informaes detalhadas sobre a composio
molecular da pele humana com alta resoluo espacial, conforme figura 11 (WASCOTTE et
al., 2007, VAN DER POL, RIGGS e CASPERS, 2007). Vrios trabalhos tm utilizado a
espectroscopia Raman para o estudo da composio da pele, hidratao da pele atravs dos
perfis de gua e fatores de hidratao, avaliao da permeao de substncias, dentre outras
(TFAYLI et al, 2007). Xiao et al. (2005) utilizou a microscopia no infravermelho para o
estudo a permeabilidade de diferentes tipos de vesculas lipdicas em peles de sunos e a
microscopia Raman confocal para gerar perfis de profundidade de penetrao destas
vesculas, da superfcie da pele at 50-100 m. A capacidade de medir a composio qumica
31
de forma no invasiva uma ferramenta valiosa para a investigao farmacutica,
dermatolgica e esttica (VAN DER POL; RIGGS; CARSPERS, 2007; HADJUR, et a.,
2005).


Figura 11: Representao esquemtica in vivo confocal Raman sobre a pele
Fonte: Wascotte et al. (2007)

Uma anlise minuciosa das posies, intensidades e larguras das bandas no espectro
Raman possibilita caracterizar a impresso digital da estrutura molecular estudada (SMITH;
REHMAN, 1995). Podemos desta forma, identificar os componentes da pele, conforme a
figura 12.


Figura 12: Espectro Raman do estrato crneo da pele normal de diferentes voluntrias
Fonte: Hadjur et al. (2005)

Vrias substncias, como a cafena, tm sido estudadas atravs da espectroscopia
Raman com o objetivo principal de avaliar a sua permeao. Edwards, Munshi e Anstis
32
(2005), demonstraram a identificao das bandas espectrais caractersticas da cafena pelo
Raman, conforme tabela 1, possibilitando a identificao da cafena em cosmticos, na pele, a
concentrao em plantas, dentre outros.


Tabela 1: Nmero de ondas do espectro Raman e as atribuies de cafena anidra hidratada, teobromina, cafena
e teofilina
Fonte: Edwards, Munshi e Anstis (2005)
Teobromina Teofilina Cafena hidratada Cafena anidra Atribuies
3121 m 3113 m (C=CH)
2954 ms 2968 ms 2955 ms 2957 ms (CH
3
)
2892 ms (CH
3
)
1683 w 1707 s 1698 ms 1698 ms (C=O)
1664 s 1654 m (C=O) +(C=C)
1594 s 1611 s 1605 ms 1600 ms (C=C) +(C-N) +(CH
3
)
1553 s 1570 m 1551 mw 1554 mw (pirimidina) +(CH
3
)
1489 mw 1484 mw (CH
3
)
1475 w 1470 w (CH
3
)
1426 s 1425 m 1445 w 1456 w (CH
3
)
1394 m 1409 m 1408 m (CN) +(CH
3
)
1360 m 1361 m 1360 m (C=N) +(C-N)
1334 s 1315 s 1333 s 1328 s (anel imidazlico)
1298 ms 1286 ms 1290 m 1284 m (C-N) +(CH
3
)
1249 s 1255 m 1251 m (CH-N) +(CH
3
)
1226 m 1242 m 1241 m (CH-N) +(CH
3
)
1189 mw
117 w 1085 mw 1076 mw 1073 mw (CH-N)
1040 mw 1052 mw
970 m (CH
3
)
946 mw 847 w 930 w 928 w (CH
3
)
928 m
890 w liberao H
2
O
777 mw 764 mw
734 w 744 m 741 m (pirimidina, anel imidazlico) +(CH
3
) +(CH
3
)
668 s 647 m 644 m (OCN) +(pirimidina, anel imidazlico)
620 s
555 s 555 s 556 s (pirimidina) +(CNC) +(CH
3
)
510 ms 504 ms
493 mw 483 m 484 m (pirimidina) +(CNO)+(CH)
460 m 447 m 442 m 442 m (pirimidina) +(CNO)+(CH)
390 vw, 375
mw 390 vw 391 mw 390 mw (CO) +(anel imidazlico)





33
4 MATERIAL E MTODOS


Este trabalho foi realizado seguindo as normas ticas das pesquisas realizadas em
animais, com a aprovao do comit de tica em pesquisa CEP da Universidade do Vale do
Paraba - UNIVAP, So Jos dos Campos / S.P., Protocolo n A035/CEP/2009.


4.1 Animais


Foram utilizados 05 leites fmeas, hbridos, de pelagem branca, pesando de 25 a 35
Kg, tratados na fazenda experimental do Centro Universitrio Vila Velha UVV, onde
permaneceram confinados e alimentados com rao e gua (figura 13). Os animais foram
transportados para o hospital veterinrio da UVV, local em que foram realizados os
procedimentos relacionados pesquisa, tratamentos com ultrassom com cafena, ultrassom
sem ativo, cafena tpica e controle.


Figura 13: Leitoa utilizada no experimento.







34
4.2 Princpio ativo


O gel utilizado foi base de natrosol com cafena anidra a 4% preparada em farmcia
de manipulao, ph em torno de 6,0 para ser utilizado tanto com o UST quanto com a
manipulao manual. Foram preparadas embalagens de 5 gramas cada (figura 14).


Figura 14: Gel de cafena a 4%.


4.3 Preparao


Os sunos receberam a administrao de xilazina (1 mg/kg), morfina (0,2 mg/kg) e
midazolam (1 mg/kg) como medicao pr-anestsica. Todos os 3 frmacos numa mesma
seringa, pela via intramuscular. Aps 15 minutos, um cateter 22 G foi introduzido na veia
marginal da orelha por puno percutnea e a induo anestsica foi realizada pela
administrao intravenosa de cetamina (5 mg/kg). A seguir foi realizada a intubao
orotraqueal e a manuteno da anestesia foi realizada com isoflurano administrado por meio
de um circuito circular valvular com fluxo de oxignio de 2 l/min. Aps a anestesia a regio
dorsal foi depilada com mquina n 0 para os plos no interferirem na permeao cutnea.

4.4 Tratamento

A regio dorsal dos sunos foi dividida em quatro partes (grupos), sendo realizados os
tratamentos, figura 15:
35
Ultrassom de 3 MHz com 5 gramas de gel sem princpio ativo (grupo ultrassom
USS),
Fonoforese, ou seja, ultrassom de 3MHz com 5 gramas de gel contendo cafena a 4%
(grupo ultrassom e ativo US/A) ,
Aplicao de cafena a 4% em gel, 5 gramas, com movimentos de massagem (grupo
ativo A) durante 7 minutos e
Controle (grupo controle C).

Aps vinte e cinco minutos da finalizao dos procedimentos, 04 amostras foram
coletadas de cada animal, uma de cada rea, contendo 25 cm
2
cada. Aps, as amostras foram
divididas, sendo metade dos grupos armazenadas em formol a 10%, para a realizao da
anlise histolgica no Laboratrio do Centro Universitrio de Vila Velha UVV, e metade
em gelo seco, para a anlise bioqumica com a espectroscopia Raman, que foi realizado no
laboratrio de Espectroscopia Vibracional Biomdica (LEVB) da UNIVAP. As amostras
foram armazenadas separadas por grupos, de acordo com a regio da qual foi removida, sendo
quatro grupos com cinco amostras cada, totalizando 20 amostras.





















Figura 15: (A) Tricotomia da regio dorsal, (B) Aplicao do ultrassom, (C) Massagem com gel de
cafena, (D) Remoo da rea tratada.

36
As amostras foram transportadas, armazenadas em gelo seco, at a UNIVAP, figura
16. No laboratrio elas foram transferidas para o freezer a uma temperatura de 86
o
C.


Figura 16: Armazenamento das amostras em gelo seco.


4.5 Aplicao do ultrassom


O equipamento de ultrassom teraputico utilizado no tratamento foi, anteriormente,
devidamente calibrado para total credibilidade no procedimento realizado. Foi utilizado o
ultrassom da marca Ibramed, modelo sonopulse compact, com frequncia de 3 MHz devido
superficialidade do tecido adiposo, no modo contnuo, por ser o melhor para permeao
cutnea, realizando movimentos circulares curtos e lentos, com uma intensidade de 1,0
W/cm
2
, por um tempo de 7 minutos, numa rea de 25 cm
2
com era de 3,5 cm
2
, conforme
utilizado no trabalho sobre e aferio a transmissividade de ondas ultrassnicas em produtos
cosmticos (BORGES et al., 2002), figura 17.


Figura 17: Equipamento de ultrassom utilizado no experimento.
37

4.6 Espectroscopia Raman


Para a coleta dos dados da espectroscopia Raman, os grupos de amostras foram
descongelados em sequncia de -86
o
C temperatura ambiente. Para evitar a desidratao, as
amostras foram descongeladas com auxlio de soro fisiolgico a 0,9%. Aps, foram colocadas
uma a uma em lminas, para serem levadas at o laser, figura 18.















Figura 18: (A) Aplicao do soro fisiolgico, (B) Descongelamento, (C) Amostra na lmina,
descongelada, pronta para anlise.

Foram escolhidos dois pontos de cada amostra para emisso do laser e coleta do sinal
Raman, sendo que em cada ponto foram analisadas trs profundidades (superfcie, 50 m e
100 m). Depois a amostra foi virada para anlise da hipoderme em dois pontos distintos,
totalizando oito pontos analisados em cada amostra (Figura 19).


Figura 19: Corte da pele demonstrando as localizaes das emisses do laser.

38
A fonte de excitao utilizada foi um laser diodo com comprimento de onda de 785
nm, Sacher Lasertechnik. A radiao foi conduzida at a amostra atravs de fibra ptica e
coletada pelo equipamento Raman Confocal, modelo Confocal Super Head, Horiba Jobin
Yvon, figura 20.


Figura 20: Aplicao do laser na amostra.

A potncia de chegada na amostra foi de 24 1 mW e tempo de exposio de 30 seg.
com 3 acumulaes, gerando um tempo total de integrao de 90 seg. em cada ponto.


Figura 21: Equipamentos utilizados na anlise atravs de espectroscopia Raman.

Para anlise do gel de natrosol com cafena a 4%, o mesmo foi colocado em uma
janela de fluoreto de clcio (janela de CaF
2
) pois esta no apresenta sinal Raman (figura 22).

39

Figura 22: Gel da cafena na janela de fluoreto de clcio.

Aps a obteno dos espectros foi realizada a subtrao da fluorescncia ajustando
uma linha de base. Para isto utilizou-se uma rotina matemtica atravs do software Matlab 6.0
. Para o pr-processamento dos dados, determinou-se a faixa de interesse de 6801760 cm
-1
e grau do polinmio de ajuste ao espectro igual a 4. Aps a subtrao da fluorescncia, usou-
se o software Oringi 7.5 para suavizao dos espectros com o objetivo de minimizar os
rudos espectrais. Os espectros de cada grupo foram normalizados em relao ao pico de
maior intensidade e posteriormente foram calculadas as mdias entre os dois pontos para cada
profundidade e para cada amostra. Atravs do programa Minitab 15 utilizou-se a estatstica
multivariada de Anlise de Componentes Principais (PCA) para anlise dos dados. Esta
tcnica permite identificar semelhanas e diferenas espectrais classificando os espectros.

O dendograma foi construdo a partir do algoritmo de Ward (mtodo de agrupaento do
dados) utilizando o coeficiente de Pearson (coeficiente de correlao para os pares de
variveis, o coeficiente de correlao uma medida do grau de relao linear entre duas
variveis) (DINIZ E CLARKE, 2001; JUNIOR, et. al., 2007).


4.7 Anlise Histolgica e Morfometria


Aps a remoo cirrgica, metade das amostras retiradas foram fixadas em formol a
10%. Aps fixao, o material foi desidratado em srie etanlica crescente e diafanizado em
xilol com trs imerses. Para incluso em parafina, foram realizadas duas imerses por um
perodo de duas horas, antes de serem emblocados. As amostras foram processadas
manualmente em micrtomo Leica 2125, em cortes semi-finos axiais seriados, com
aproximadamente 3m de espessura cada, os quais foram posicionados em lminas de vidro,
para serem corados com hematoxilina-eosina (HE).
40

Para as anlises foram capturadas 5 imagens de cada lmina atravs da mquina
fotogrfica digital Motican acoplada ao microscpio Leica Galen 4, ampliadas 10 vezes. As
imagens obtidas foram analisadas quanto a sua morfologia e perfil numrico do tecido
adiposo atravs do programa Cellprofiler. Foram medidas as reas de todos os elementos
celulares do tecido adiposo cujos ncleos estivessem presentes na sesso de anlise.

A anlise da camada crnea foi feita atravs da medio de sua espessura e a do tecido
adiposo atravs da medio de sua rea. Utilizando o programa Image Tool 3.0, foi feita a
mdia de cada amostra atravs de trs medidas, da espessura para a camada crnea e da rea
para o tecido adiposo. Para a avaliao do tecido adiposo foi utilizado como critrio de
incluso e excluso, a utilizao somente dos lbulos ntegros nas imagens.

As suposies de normalidade foram verificadas pelos valores dos coeficientes de
assimetria e curtose, e a homocedasticidade pelo teste de Bartlett, posteriormente em funo
da necessidade os valores das variveis foram transformados de tal forma que os testes
paramtricos pudessem ser aplicados (ZAR, 2008).

A hiptese de nulidade testada foi a de que a rea ocupada por tecido adiposo no foi
afetada pela utilizao da cafena ou do ultra-som, aplicados independentemente ou
associados atravs da anlise de varincia ANOVA. A consistncia ANOVA diagnstico foi
feita considerando a anlise de resduos, e a estimativa de ambos os simples e os coeficientes
de correlao mltiplo quadrado, r
2
e r, respectivamente. Em caso de deteco de diferenas
significativas entre as mdias dos tratamentos, foi utilizado o teste de Scheff, para
comparao delas a posteriori pelo fato do nmero de replicatas entre os tratamentos no ser
igual. A hiptese de nulidade testada foi que no havia diferenas entre resultados
demonstrados pelos grupos controle (C) e ativo cafena tpica (A), ultrassom sem ativo
(USS) e ultrassom e cafena (USA). O nvel de significncia () utilizado para rejeitar a
hiptese nula foi p para valores estatsticos t inferiores ou iguais a 0,05 (ZAR, 2008).

Testes de normalidade foram realizados usando o Microsoft Excel folha eletrnica,
verso 2003. Testes t pareados e no pareados para homoedasticidade foram realizados
utilizando o programa SYSTAT 9.0 .

41


5 RESULTADOS


5.1 Avaliao pela Espectroscopia Raman


Para conseguirmos identificar pequenas alteraes espectrais utilizamos o mtodo
estatstico baseado nas componentes principais, formadas pela varincia das observaes
retendo o mximo possvel da informao presente nas variveis originais.

No dendograma construdo, cada observao representa a mdia de todos os espectros
do grupo, na profundidade: 0, 50, 100 e hipoderme. O eixo y representa a similaridade dos
espectros, o diagrama em rvore representa a similaridade entre os espectros daquele grupo.

A anlise das componentes principais (PCA), calculada pela matriz de covarincia,
utilizou a primeira e a segunda componente principal (PC1 e PC2). Anlise de componentes
principais uma metodologia da anlise estatstica multivariada cujos principais objetivos
so: reduzir o nmero de dados de um problema e explicar a estrutura da matriz varincia-
covarincia pelas poucas combinaes das variveis originais (CARVALHO et al., 2009).
Este procedimento acentua com mais eficincia caractersticas espectrais importantes, uma
vez que a PCA importante na remoo de rudos que poderiam levar a informaes
errneas.

O dendograma (figura 23) mostra uma separao dos grupos controle (C), hipoderme
(H), ativo (A), ultrassom sem ativo (USS) e ultrassom com ativo (USA), agrupados de acordo
com as semelhanas espectrais. Os resultados demonstraram 100% de separao de cada
grupo. Ocorreu a separao dos grupos controle e hipoderme em relao aos grupos dos
tratamentos (A, USS e USA), mostrando uma diferena das caractersticas bioqumicas destes
dois conjuntos de grupos. Tambm visualizamos uma separao do grupo do ultrassom sem
ativo do ultrassom com ativo cafena, mostrando caractersticas espectrais diferentes dos
tecidos tratados com ultrassom que esto associados presena ou no da cafena.

42
U
S
A
1
0
0
U
S
A
5
0
U
S
A
0
U
S
1
0
0
U
S
5
0
U
S
0
A
1
0
0
A
5
0
A
0
U
S
A
H
U
S
H
A
H
C
1
0
0
C
H
C
5
0
C
0
-89.53
-26.35
36.82
100.00
Observaes
S
i
m
i
l
a
r
i
d
a
d
e
Dendrograma
Ward Linkage; Pearson Distance

Figura 23: Dendograma de similaridade

A anlise discriminante linear foi calculada utilizando as componentes principais,
verificando-se os ndices de classificao correta do espectro, onde se obteve 100% de
separao entre os grupos, conforme tabela 2.

Tabela 2: Resultados da Anlise Discriminante Linear em funo dos grupos (A, C, H, USS e USA)
Resultados da Anlise Discriminante
Grupos Verdadeiros
Colocados
nos Grupos
A C H USS USA
A 3 0 0 0 0
C 0 3 0 0 0
H 0 0 4 0 0
USS 0 0 0 3 0
USA 0 0 0 0 3
Total 3 3 4 3 3
Proporo 100% 100% 100% 100% 100%
43

De acordo com a anlise discriminante, que foi feita atravs da PC1 e PC2, obteve
100% de separao, devido s diferentes caractersticas bioqumicas de cada tecido analisado.
O grfico de espalhamento de PC1 versus PC2 mostra isto claramente (Figura 24). Todos os
grupos foram agrupados em aglomerados, relacionados aos espectros obtidos de cada grupo.
Os espectros Raman de cada grupo apresentaram alta correlao com os elementos do mesmo
grupo. O grupo do ultrassom sem ativo (USS) se apresentou separado do grupo do ultrassom
com cafena (USA), provavelmente pela presena da cafena, sugerindo a presena do ativo na
pele ao utiliz-lo com o ultrassom.

0.3 0.2 0.1 0.0 -0.1 -0.2 -0.3 -0.4 -0.5 -0.6
0.2
0.1
0.0
-0.1
-0.2
-0.3
-0.4
-0.5
PC2
P
C
1
A
C
H
US
USA
Legenda
Espalhamento de PC1 vs PC2

Figura 24: Grfico de espalhamento de PC1 vs PC2

O loading plot (figura 25) foi construdo a partir das componentes principais, e mostra
as diferenas das componentes principais em funo do nmero de ondas, atravs das relaes
entre variveis. Os picos da PC1 e PC2 representam as variaes em funo do deslocamento
Raman que possibilitou a classificao dos grupos.

44

Figura 25: Loading plot da anlise das componentes principais utilizando as duas primeiras PCs,
uma vez que os dados so classificados corretamente atravs delas.


Os grupos se apresentaram bem definidos no grfico devido s diferentes
caractersticas estruturais dos grupos analisados, podendo-se atravs deles identificar e
classificar os tecidos tratados.

No espectro obtido do gel de cafena, figura 26, podemos identificar os picos que
representam a molcula da cafena 1656 cm
-1
(C=0), 1564 cm
-1
(HCN + imidazlico), 1470
cm
-1
(HCN + CH
3
), 1418 cm
-1
(CN + CH
3
), 1350 cm
-1
(HCN + imidazlico + CH
3
), 1278 cm
-
1
(pirimidina), 1251 cm
-1
(CN + CH
3
), 1241 cm
-1
(CH), 1131 cm
-1
(CH
3
), 1100 cm
-1
(CH
3
+
CH), 1063 cm
-1
(CH-N), 975 cm
-1
(N-CH
3
+ imidazlico + CH
3
), 938 cm
-1
(CH
3
), 850 cm
-1

(CH
3
+ N-CH
3
+ C=0), 755 cm
-1
(pirimidina + imidazlico), conforme a tabela 1
(EDWARDS; MUNSHI; ANSTIS, 2005) e o trabalho de Ucun, Saglan e Gl (2007).

45

Figura 26: Espectro da cafena presente no gel (grfico da mdia)

Nas figuras 27, 28 e 29, podemos observar picos que identificam a pele, em diferentes
profundidades (0, 50 e 100 m): 1695 cm
-1
(C=0, amida I), 1460 cm
-1
(CH
2
, lipdio e
protena), 1296 cm
-1
(CH
2
, amida III), 1215 cm
-1
(amida III), 1130 cm
-1
(C-C, lipdio), 1062
cm
-1
(lipdio cidos graxos), 1030 cm
-1
(lipdio), 1010 cm
-1
(C-C, fenilalanina), 956 cm
-1

(CH
3
, CCH), 870 cm
-1
(CCH, aromtico - triptofano), 835 cm
-1
(tirosina), 785 cm
-1
(citosina),
conforme Chrit et al. (2005), Hadjur et al. (2005) e Tfayli et al. (2007).


Figura 27: Espectros dos tratamentos na superfcie

Nos espectros da superfcie (0 m) da figura 27, todos os picos apresentaram
deslocamentos em relao ao controle. O pico da amida I do espectro do tratamento com
ultrassom e cafena (USA) apresentou um aumento da intensidade em relao aos demais
tratamentos e ao controle. No pico correspondente a amida III, 1296 cm
-1
, ocorreu um
46
aumento da intensidade do pico correspondente ao tratamento com o ativo e no pico 1215 cm
-
1
, que tambm corresponde amida III, ocorreu um aumento da intensidade dos picos dos
tratamentos com ativo e com ultrassom sem ativo. Os picos correspondentes ao lipdio (1130
cm
-1
) de todos os tratamentos tiveram aumento de suas intensidades em relao ao controle.
Os picos da fenilalanina (1010 cm
-1
) e da molcula de CH
3
e CCH (956 cm
-1
) tiveram
aumento de suas intensidades nos picos correspondentes aos tratamentos do ultrassom com e
sem ativo. Os picos correspondentes as molculas de triptofano (870 cm
-1
), tirosina (835 cm
-1
)
e citosina (785 cm
-1
), dos espectros dos trs tratamentos apresentaram aumento de suas
intensidades.


Figura 28: Espectros dos tratamentos na profundidade de 50 m

Nos espectros da profundidade de 50 m, todos os espectros apresentaram
deslocamentos. O pico correspondente a amida III, teve um aumento de sua intensidade no
espectro do tratamento com cafena (A). No pico correspondente a fenilalanina (1010 cm
-1
) do
tratamento com ultrassom sem ativo constatamos um aumento de sua intensidade.
Constatamos um aumento da intensidade do pico das molculas CH
3
e CCH (956 cm
-1
) do
espectro tratado com ultrassom associado cafena.

47

Figura 29: Espectros dos tratamentos na profundidade de 100 m

Todos os espectros da profundidade de 100 m apresentaram deslocamentos dos
picos, em relao ao controle. O pico correspondente a amida I (1695 cm
-1
) teve aumento de
sua intensidade no espectro tratado com ultrassom com cafena. O pico da amida III (1296
cm
-1
) teve aumento de sua intensidade no espectro tratado com cafena. Os picos 1130 cm
-1
do
lipdio e 1010 cm
-1
da fenilalanina, tiveram aumento de suas intensidades nos trs
tratamentos. O pico 835 cm
-1
correspondente a tirosina, s aparece no espectro do controle na
profundidade de 100 m.

Praticamente todos os grupos tratados apresentaram nas diferentes profundidades
variaes nas bandas caractersticas, com aumento ou diminuio das reas e das intensidades
dos picos evidenciados nos espectros. Alm de deslocamento dos picos tratados em relao ao
controle.

No pico correspondente a amida I verificou-se uma variao das reas tratadas em
relao ao controle, onde constatamos um aumento da rea nos trs tratamentos (cafena - A,
ultrassom sem - US e com cafena - USA), alm de um pequeno deslocamento, figuras 30 e
31.

48

Figura 30: Variao da rea da amida I


rea Amida I
34,5
35
35,5
36
36,5
37
37,5
38
38,5
C0 A0 US0 USA0
rea

Figura 31: Variao grfica da rea da amida I

No pico correspondente a protena e lipdio (1450 cm
-1
) tambm evidenciamos um
aumento da rea em todos os tratamentos e nas trs profundidades analisadas, figuras 32 e 33.



Figura 32: Variao da rea de protena e lipdio
49

rea Protena e Lipdio
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
C100 A100 US100 USA100
rea

Figura 33: Variao grfica da rea de protena e lipdio


No pico 1010 cm
-1
(fenilalanina), aminocido codificado pelo cdigo gentico,
observamos uma diminuio da rea e um deslocamento nos tratamentos nas profundidades 0,
50 e 100 m, figuras 34 e 35.

Figura 34: Variao da rea da fenilalanina

rea Fenilalanina
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
C50 A50 US50 USA50
rea

Figura 35: Variao grfica da rea da fenilalanina

50
Em todos os espectros tratados com ultrassom com ativo, nas profundidades 0, 50 e
100 m, observamos a presena de rudos, no sendo visualizados nos espectros dos outros
tratamentos, figuras 27, 30 e 31.

No espectro da hipoderme encontramos os seguintes picos: 1450 cm
-1
(lipdio e
protena), 1333 cm
-1
(anel imidazlico), 1296 cm
-1
(CH
2,
lipdio), 1126 cm
-1
(C-C, lipdio),
1078 cm
-1
(C-C), 883 cm
-1
(CH
2
, COC, CC, CN), figura 36.


Figura 36: Espectros dos tratamentos realizados na hipoderme

Nestes espectros (figura 36) s observamos deslocamentos dos picos, em relao ao
controle. No pico de 1450 cm
-1
(lipdio e protena), presente no espectro da hipoderme,
ocorreu uma diminuio de sua rea nos tratamentos realizados, figura 37 e 38.


Figura 37: Variao da rea da protena e lipdio da hipoderme

51
rea Protena e Lipdio
30
31
32
33
34
35
36
37
CH AH USH USAH
rea

Figura 38: Variao grfica da rea protena e lipdio da hipoderme


5.2 Avaliao Morfomtrica


No houve diferenas significativas entre as reas dos adipcitos expostos ao ativo
com e sem ultrassom, ou s ao ultrassom ou ao controle, quando so consideradas as mdias
para as reas dos adipcitos calculadas nos fragmentos de pele estudados (p>0,05, N=34,
r=0,14, r=0,02), como mostra a figura 39.


Figura 39: Diagrama de Box-whisker evidenciando a distribuio em quartis percentuais
das reas dos adipcitos no tratamento controle (C) e expostos cafena (Caf - A),
ultrassom e cafena (USA) e somente ao ultrassom (USS)

52
Tabela 3 Anlise de varincia da resposta na rea de adipcitos, produzida pela exposio do modelo biolgico
de pele, aps uma aplicao de cafena e de ultrassom isoladamente e associados, comparados a um controle que
no recebeu tratamento
Anlise de Varincia
Fonte de Variao Soma dos Quadrados gl Mdia Quadrtica F p
Tratamentos 17.9947 3 5.9982 0.1975 0.8972
Erro 910.9229 30 30.3641
Legenda: gl: graus de liberdade; F: razo de Fisher; p: nvel de significncia


Quando os dados brutos de rea foram transformados em seu logaritmo decimal para
evitar os valores discrepantes, ainda assim no foram observadas diferenas significativas
entre os tratamentos aplicados e o controle (p > 0,05, N=34, r=0,11, r=0,01), conforme figura
40.


Figura 40: Diagrama de Box-whisker evidenciando a distribuio em quartis percentuais
das reas dos adipcitos transformadas em seu logaritmo decimal, no tratamento controle
(C) e expostos cafena (Caf - A), ultrassom e cafena (USA) e somente ao ultrassom
(USS)

Tabela 4 Anlise de varincia da resposta na rea de adipcitos transformada em base logartmica, produzida
pela exposio do modelo biolgico de pele, aps uma aplicao de cafena e de ultrassom isoladamente e
associados, comparados a um controle que no recebeu tratamento
Anlise de Varincia
Fonte de Variao Soma dos Quadrados fl Mdia Quadrtica F p
Tratamento 0.0005 3 0.0002 0.1396 0.9355
Erro 0.0363 30 0.0012
Legenda: gl: graus de liberdade; F: razo de Fisher; p: nvel de significncia


53
Na figura 41 podemos observar as imagens analisadas pelo programa Cellprofiler para
a avaliao citomtrica das amostras, controle (C), ativo (A), ultrassom sem ativo (USS) e
ultrassom com cafena (USA).


Figura 41: Imagens das amostras do tecido adiposo. A - Tecido adiposo do Controle (C), B - Tecido
adiposo do Ativo (A), C - Tecido adiposo do Ultrassom com ativo (USA), D- Tecido adiposo do
Ultrassom (USS)


5.3 Avaliao Histolgica


Foram detectadas diferenas significativas entre as espessuras mdias do estrato
crneo dos tratamentos aplicados s peles dos sunos (Tabela 5, F = 4,35, p = 0,02; r = 0,68; r
= 0,47). Aps avaliao a posteriori, o tratamento com a cafena no se comportou de maneira
significativamente diferente do controle (Tabela 6, = -2,99, p = 0,65). Os dois tratamentos
com o ultrassom foram significativamente diferentes do controle, tanto o ultrassom sem ativo
(Tabela 6, = -16,26, p = 0,02), como o associado com a cafena (Tabela 6, = -19,95, p =
0,01), porm no houve diferenas importantes entre o ultrassom associado cafena e o
aplicado sem ativo (Tabela 6, = 3,69, p = 0,59).

54
Tabela 5: Anlise de Varincia para as espessuras das camadas crneas
Fonte de variao Soma dos Quadrados gl Varincia F-ratio p
Tratamentos 1327.66 3 442.55 4.35 0.02
Desvios 1525.62 15 101.71

Tabela 6: Matriz de diferenas e sua significncia entre as mdias da espessura do estrato crneo nos tratamentos
realizados em pele de suno, segundo o teste de Fisher para as diferenas mnimas significativas
TRATAMENTOS DIFERENA P
C AtivoCafena 2.9900 0.6460
C USA 19.9530 0.0099
C USS 16.2600 0.0222
AtivoCafena USA 16.9630 0.0242
AtivoCafena USS 13.2700 0.0550
USA USS 3.6930 0.5932

Na imagem da figura 42 (C), podemos observar uma camada crnea mais fina em
relao s figuras 44 (USA) e 45 (USS), onde visualizamos a queratina com aspecto de
escamas, mais dilatada. O aspecto da camada crnea do grupo ativo (A), na figura 43, no se
alterou em relao ao controle (C), figura 42, se apresentado com espessura semelhante, fina
em relao aos tratados com ultrassom.

Figura 42: Imagem da camada crnea do grupo controle (C)
55
Figura 43: Imagem da camada crnea do grupo ativo cafena (A)

Figura 44: Imagem da camada crnea do grupo ultrassom com ativo - cafena (USA)

Figura 45: Imagem da camada crnea do grupo ultrassom sem ativo (USS)

Ao medirmos as reas dos lbulos presentes nos tecidos adiposos das peles tratadas,
constatamos que estatisticamente, no houve diferenas significativas entre os tamanhos
56
mdios destes lbulos. Tanto quando todos foram comparados ao controle, como quando
foram comparados uns com os outros (Tabela 7, F = 1,18, p = 0,35; r = 0,42; r = 0,18).

Tabela 7: Anlise de varincia para a rea dos lbulos dos tecidos adiposos
Fonte de variao Soma dos Quadrados gl Varincia F-ratio p
Tratamentos 2.618.900.000 3 872.980.000 1,18 0,35
Desvios 11.886.000.000 15 742.860.000

Na figura 46 podemos visualizar a imagem do tecido adiposo, no exemplo, podemos
observar os lbulos de gordura da amostra tratada com ultrassom e cafena (USA). Estes
lbulos foram utilizados para a medio das reas para a anlise de possveis alteraes
promovidas pelos tratamentos realizados. Alteraes estas, que no foram evidenciadas
estatisticamente.


Figura 46: Exemplo da imagem do tecido adiposo utilizado para a medida da rea dos lbulos de adipcitos
57
6 DISCUSSO


O UST um recurso muito utilizado na fisioterapia dermato-funcional para tratar as
alteraes dos adipcitos e como promovedor da permeao cutnea de diferentes princpios
ativos. Na prtica clinica, o UST utilizado por vrios profissionais no intuito de promover a
liplise da clula adiposa, tratando com isso a adiposidade localizada. Apesar da preferncia
por este equipamento, existe ainda muita controvrsia sobre os parmetros a serem utilizados
e os seus reais efeitos sobre a pele e ao tecido subcutneo. Franco et al. (2005) afirma em seu
trabalho sobre a utilizao do UST em edema inflamatrio, que apesar do ultrassom ser um
recurso utilizado para uma srie de condies inflamatrias, sua eficcia ainda baseada em
experincias e em estudos clnicos. Nos trabalhos experimentais realizados com o ultrassom
h, muitas vezes, omisso e/ou grande variao de parmetros utilizados.

A capacidade de medir a composio qumica de tecidos biolgicos de forma no
invasiva uma informao valiosa (VAN DER POL, et al., 2007). A espectroscopia Raman
uma tcnica de caracterizao ptica conhecida para avaliar a composio molecular,
estrutura e interao entre as amostras (WASCOTTE, et al., 2007). Ela tem sido muito
estudada ultimamente devido a sua grande aplicabilidade.

Ao utilizarmos o diagnstico algoritmo baseado nas caractersticas espectrais,
extrados da anlise das componentes principais, evidenciamos total sensibilidade e
especificidade, devido completa separao dos grupos analisados no dendograma, indicando
a capacidade da espectroscopia Raman para classificar e analisar as diferenas bioqumicas
existentes entre os grupos experimentais (C, A, USA, USS e hipoderme). Chrit et al. (2005)
demonstraram em seu trabalho mudanas espectrais entre indivduos diferentes em toda a
gama de frequncia sobre o contedo lipdico, NMF e aminocidos. Usando essas diferenas
foi realizada uma anlise de clusters, que pode ser mostrada no dendograma, ajudando a
realar as diferenas observadas entre as diferentes voluntrias.

Supe-se que as variaes bioqumicas encontradas podem estar relacionadas com os
tratamentos realizados, aplicao da cafena tpica com movimentos de massagem, ultrassom
sem e com cafena. Estes tratamentos so capazes de promover alteraes transitrias nas
molculas da pele, por ter sido realizado apenas uma sesso.
58

Ao realizarmos o espectro da cafena em gel a 4% pudemos compar-lo aos picos
encontrados nos trabalhos de Edwards, Munshi e Anstis. (2005) e de Ucun, Saglan e Gl
(2007), alm de identific-los nos espectros da pele para anlise de sua permeao. Van der
Pol, Riggs e Caspers (2007) citam em seu trabalho a permeao da cafena atravs da
comparao do seu espectro com os principais componentes do espectro da pele. Eles
conseguiram classificar quantitativamente a cafena na pele atravs de uma relao de
intensidade entre a cafena e a queratina no espectro da pele tratado com substncia. Polacow
et. al. (2005) demonstraram a permeao de d-pantenol em peles de sunos em 2, 60 e 240
minutos. Para Jesus et al. (2006), o ultrassom teraputico, seja devido aos seus efeitos
trmicos e/ou mecnicos, favorece a permeao cutnea de produtos farmacolgicos e
cosmecuticos. Tfayli et al. (2007) mostrou a presena de Metronidazol na pele aps
aplicao tpica, atravs da espectroscopia Raman confocal, pela identificao de picos que
caracterizavam o medicamento.Vrios autores relatam a permeao cutnea de diferentes
substncias. Ao compararmos os espectros da cafena e da pele nas trs profundidades,
conseguimos identificar picos da substncia que se sobrepem aos da pele, como 1470 cm
-1
,
1131 cm
-1
, 1063 cm
-1
, 938 cm
-1
e 850 cm
-1
, em todos estes picos visualizamos aumento da
intensidade em espectros relacionados com a aplicao de cafena e de ultrassom com cafena,
sendo encontrados principalmente na superfcie. Na profundidade de 50 e 100 m
encontramos aumento da intensidade somente nos picos 1131 cm
-1
e 938 cm
-1
,
correspondentes cafena. Desta forma, conseguimos confirmar a permeao da cafena na
pele, principalmente na superfcie.

Alm de detectarmos as caractersticas da pele atravs dos espectros, tambm
conseguimos evidenciar a cafena, pela presena de picos que caracterizam o ativo em
questo, corroborando os achados de Van de Pol, Riggs e Caspers (2007). De acordo com
Pires-de Campos et al. (2004), em um dos seus trabalhos sobre a aplicao tpica e fonoforese
da cafena, o efeito do UST na permeao do gel de cafena atravs da pele, ocorreu
provavelmente devido aos seus efeitos mecnicos, j que a aplicao tpica do gel no
produziu alteraes morfomtricas no tecido adiposo, mesmo quando acompanhada de efeitos
trmicos da massagem. Em seu trabalho sobre sonoforese, Bommannan et. al. (1992) aplicou
o UST, de 10 e 16 MHz, associado a um marcador e visualizou o mesmo na pele, epiderme e
derme, aps 5 min. de aplicao. Ao aplicar o marcador topicamente sem o uso do UST no
foi observado presena do mesmo no interior da pele. Ao realizarmos as anlises dos
59
espectros constatamos alteraes das intensidades de picos correspondentes a cafena nas trs
profundidades para os trs tratamentos, sugerindo que a permeao da substncia se deu tanto
pela aplicao atravs de movimentos de massagem, quanto pela ao do ultrassom
teraputico. Desta forma, conseguimos afirmar a importncia da espectroscopia Raman para
anlise bioqumica da pele e da cafena e da comprovao de sua permeao.

Hadjur et al. (2005) demonstrou os constituintes bioqumicos da pele em seu trabalho,
pela espectroscopia Raman, mostrando que possvel que exista uma certa variao dos
espectros frente a diferentes indivduos. Em nossos achados visualizamos alteraes das reas
e deslocamento de picos correspondentes as molculas da pele. Provavelmente estas
alteraes so decorrentes dos tratamentos realizados, principalmente o ultrassom. Segundo
Borges (2006) quanto maior a agregao molecular melhor a atuao do UST, sugerindo uma
alterao das amidas I e III. Palero et al. (2007) afirmam que alteraes no colgeno so
manifestadas com mudanas no contorno da amida I. Koeke (2003) diz que o aumento da
temperatura da pele promove um aumento da extensibilidade do colgeno. Van der Pol e
Caspers (2007) citam em seu trabalho outro trabalho realizado por Caspers et al. (2002) sobre
o monitoramento da permeao de dimetilsulfxido na pele aplicado topicamente, onde
constatou alteraes na posio e forma na regio da banda amida I (principalmente devido a
queratina) detectados na superfcie da pele. No entanto, devido s pequenas doses aplicadas
no foi possvel afirmar conclusivamente que as mudanas conformacionais da queratina
foram devido a sua interao com a substncia aplicada. Zhang et al. (2007) afirmam que a
aplicao de solventes no estrato crneo proporcionou alteraes conformacionais da
queratina dos cornecitos. Chrit et al. (2005) dizem que a proporo da banda amida I ligada
hidratao do estrato crneo, permitindo uma melhor compreenso das alteraes das
protenas. Estas afirmaes confirmam os nossos achados, sugerindo que os tratamentos
realizados, principalmente o UST, alteram as protenas da pele.

Byl (1995) afirma que o UST gera uma desorganizao da camada crnea,
principalmente da bicamada lipdica, o que favorece a permeao de substncias,
sugestionando as modificaes dos picos correspondentes as molculas lipdicas. Chrit et al.
(2005) afirmam que os picos 1060 cm
-1
, 1125 cm
-1
e 1296 cm
-1
, so caractersticos das
ceramidas, componentes importantes dos lipdios do estrato crneo, encontrados nos espectros
e que sofreram alteraes de rea e deslocamento. Alm disso, o UST promove um
aquecimento do tecido, aumentando a vascularizao local e provavelmente um aumento da
60
quantidade de gua. Estas alteraes so decorrentes da utilizao do modo contnuo de
emisso de ondas. Corroborando os achados de Chrit et al. (2005), tambm constatamos a
presena de suor atravs do pico 855 cm
-1
da tirosina, que tem a sua quantidade aumentada
devido ao aumento da temperatura, que tambm gera dilatao do stio da glndula
sudorpara. O suor contribui para a hidratao da pele. Os aminocidos so fatores de
hidratao natural da pele. Foram identificados trs aminocidos: triptofano, tirosina e
citosina, que apresentaram aumento de suas intensidades nos espectros analisados da
superfcie, sugerindo mais um fator responsvel pela hidratao da camada crnea. O pico
835 cm
-1
correspondente a tirosina, s aparece no espectro do controle na profundidade de
100 m, no sendo visualizado nos espectros tratados. Nos espectros das profundidades de 0 e
50 m, a tirosina aparece menor no controle do que no controle da profundidade de 100 m e
maior em relao aos tratamentos nas mesmas profundidades.

Um dos efeitos do UST a cavitao, formao de bolhas no interior do tecido que
favorece segundo alguns autores, como Ueda (2009), a permeao das substncias aplicadas
com o auxlio das ondas sonoras. Na anlise pela espectroscopia Raman, evidenciamos no
grupo da aplicao do ultrassom com a cafena a presena de muitos rudos nos espectros, se
comparado aos outros grupos. O grupo do ultrassom sem ativo foi o segundo a apresentar a
maior taxa de rudos nos espetros. Os rudos podem ocorrer por alguns fatores, dentre eles,
quando h presena de ar, sugerindo a cavitao formada pela ao do ultrassom na pele.

Polacow et al. (2004) demonstrou em seu estudo sobre a permeao de tiratricol,
atravs de anlise histolgica, que o ultrassom isoladamente no promoveu nenhuma
alterao adipocitria, s ocorrendo mediante permeao do princpio ativo. Nas anlises
feitas com a citometria e histologia no foi evidenciado qualquer alterao nos adipcitos,
mostrando que o ultrassom no atua de forma eficaz no tecido adiposo, provavelmente devido
a uniformidade do tecido e pequena quantidade de protena existente nele, confirmando os
achados de Polacow et al. (2004). No ocorreram alteraes significativas do nmero dos
adipcitos, nem do tamanho dos lbulos de gordura presentes nos tecidos tratados nos
parmetros deste experimento. Na espectroscopia Raman da hipoderme foi constatado um
deslocamento dos picos encontrados no espectro, sugerindo que os tratamentos realizados
promovem pequenas alteraes das estruturas da hipoderme, no sendo estas identificadas
pelos outros mtodos de anlises utilizados. Provavelmente a cafena, por sua ao lipoltica,
poderia promover alteraes significativas nos adipcitos, mas o tempo de tratamento no foi
61
suficiente para ocorrer ao da mesma, nem mesmo a sua presena foi identificada nos
espectros da hipoderme.

Na anlise histolgica podemos constatar um aumento da espessura da camada crnea
das amostras de pele de suno tratadas com ultrassom sem e com cafena. A camada se
mostrou com um aspecto em escamas da queratina, mais espessa do que as demais,
provavelmente devido a uma hidratao desta camada promovida pela ao do ultrassom, j
que o tecido tratado somente com cafena no apresentou esta dilatao. Bielfeldt et al. (2009)
diz que existe uma acentuada queda da gua do interior (70%), estrato granuloso, para o
exterior (30%), estrato crneo, da epiderme da pele normal. Egawa e Kajikawa (2009)
demonstraram em seu trabalho, que o aumento da penetrao de gua na pele proporciona um
inchamento do estrato crneo. Van der Pol, Riggs e Caspers (2007) afirmam que tratamentos
feitos na pele podem provocar alteraes na sua dimenso, tais como o aumento da espessura
do estrato crneo devido a edema.

O aquecimento a partir do ultrassom aumenta a energia cintica das molculas do
frmaco e da membrana, dilata os pontos de entrada, como os folculos pilosos e as glndulas
sudorparas, e aumenta a circulao para a rea sonada (CAGNIE et al., 2003).
Provavelmente estas alteraes fisiolgicas promovem um aumento da quantidade de gua no
local tratado, promovendo o aumento da espessura da camada crnea visualizado no estudo.
Um aumento da quantidade de gua no estrato crneo aumenta a sua permeabilidade s
drogas aplicadas (BYL, 1995). Podemos constatar que, provavelmente, o ultrassom promove
uma alterao reversvel da camada crnea, ficando evidente mediante o aumento de sua
espessura, confirmada pelas alteraes encontradas nos espectros da pele. Sugerimos
evidncias da hidratao tambm pela anlise da espectroscopia Raman, em virtude do
aumento da tirosina e aminocidos citados anteriormente. Outro fator que pode ter contribudo
para o aumento da espessura do estrato crneo a cavitao, formao de bolhas que ocorre
principalmente na epiderme.
62
7 CONCLUSO


Por terem caractersticas espectrais distintas devido aos seus componentes, os grupos
estudados puderam ser analisados pela espectroscopia Raman de forma eficaz. Com isso,
conseguimos identificar alteraes reversveis dos componentes da pele e a permeao da
cafena, promovidas pelos tratamentos realizados, atravs deste mtodo de anlise. Tambm
foi possvel evidenciar a cavitao gerada pelo ultrassom. Constatamos que embora o UST
no promova a lise celular, capaz de promover alteraes na pele, evidenciadas atravs da
histologia. Verificamos que uma nica sesso no suficiente para promover alteraes
significativas no tecido adiposo.

Consideraes Finais

imprescindvel que novas discusses sejam apresentadas sobre este assunto na
tentativa de elucidar cada vez mais a ao do ultrassom, principalmente utilizando tcnicas
modernas de anlises como a espectroscopia Raman.

















63


REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS


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