TEMA 16.

TRANSCRIPCIN
Introduccin. ARN: tipos y funciones. Transcripcin en procariotas. Enzimologa de la transcripcin: ARN polimerasa. Fases de la transcripcin: Iniciacin. Elongacin. Terminacin. Transcripcin en eucariotas: diferencias con procariotas. Tipos de ARN polimerasas: ARNpol-I, ARNpol-II. ARNpol-III. Inhibidores de la transcripcin.

Introduccin.
Replicacin Transcripcin Traduccin

DNA

RNA

Protenas

Retrotranscripcin

Transcripcin:
- Mecanismo celular por el cual la informacin gentica contenida en el ADN es transferida a una molcula de ARN. - Ocurre mediante la polimerizacin de ribonuclesidos trifosfato a lo largo de una cadena molde de DNA. - La sntesis de ARN est catalizada por la ARN polimerasa.

DNA molde

n1ATP+n2GTP+n3CTP+n4UTP
Mg2+, RNA polimerasa

RNA + (n1+n2+n3+n4) PPi

Introduccin.

Nomenclatura transcripcional.

Gen: segmento del DNA que codifica una protena (mRNA) u otro RNA (rRNA, tRNA) Unidad Transcripcional: Segmento del DNA comprendido entre la iniciacin y la
terminacin de la Transcripcin. Puede ser:

- Monocistrnica- unidad transcripcional con un slo gen

- Policistrnica- unidad transcripcional con ms de un gen

DNA

Hebra sentido Hebra antisentido (molde) RNA polimerasa

Hebra Sentido: Hebra del DNA con la

misma secuencia que el RNA (codificante, informativa, no molde, no transcrita, +)

Hebra Antisentido: Hebra molde de la

Trnscrito RNA

RNA polimerasa (no codificante,transcrita, no informativa, -)

La RNA polimerasa aade nucletidos en sentido 5-3

Introduccin.

Nomenclatura transcripcional.

Hebra Sentido, no-molde. Hebra Antisentido o molde.

La RNA polimerasa aade nucletidos en sentido 5-3

Introduccin.

cido Ribonucleico

- Macromolcula sintetizada por las RNA polimerasas a partir del ADN (molde) en el proceso de transcripcin. Generalmente son de cadena sencilla. - Compuesto por ribonucletidos unidos por enlaces fosfodiester. Azcar: ribosa. (-D-ribosa) Bases: A, U, G y C.
(Uracilo) O

HN O N

Niveles estructurales de los ARN

-La estructura primaria viene determinada por la secuencia de nucletidos
- Pueden presentar formas variadas de estructuras secundarias (uniones intracatenarias).

La estructura secundaria de las regiones de doble cadena, se asemeja al A-DNA.

La forma B no puede ser adoptada debido a impedimentos estricos del O extra en el C2de la ribosa (ver modelo de Watson y Crick).

-Tambin han sido observadas estructuras terciarias para ciertos tRNA y rRNA.

Introduccin.

cido Ribonucleico

Tipos de ARN
ARN funcionales (no se traducen a protenas)
- ARN ribosmico (rRNA). - ARN de transferencia (tRNA). - ARN pequeo nuclear (snRNA) - ARN citoplasmtico pequeo (scRNA)

ARN informativos (se traducen a protenas) - ARN mensajero (mRNA).

- ARN heterogneo nuclear (hnRNA).

Transcripcin en procariotas.
La enzima clave es la ARN polimerasa
(Descubierta por J. Hurwitz y S. Weiss independientemente)

Holoenzima de unos 500 kDa formada por 5 clases de subunidades: Polimeriza en sentido 5-3 No tiene actividad exonucleasa (no es correctora). No necesitan cebadores. Es procesativa: no abandona el molde de ADN hasta la terminacin

(11 kD) sin funcin conocida

Transcripcin en procariotas.
Un slo tipo de RNA polimerasa para todos los tipos de ARN

Subunidad Mr (kD)

n
2 1 1 1 1

Funcin
Iniciacin de la cadena. Interaccin con protenas reguladoras y promotores Iniciacin y elongacin. Centro cataltico. Unin al DNA Desconocida Reconocimiento del promotor

36.5 151 155 11 70

2
holoenzima

2
ncleo polimerasa

+
sub sigma

Transcripcin en procariotas.

LA TRANSCRIPCIN TIENE 3 FASES: -Iniciacin: tiene lugar en secuencias promotoras o promotores. -Elongacin: ARN polimerasa -Terminacin:

-independiente -dependiente

Transcripcin en procariotas.

INICIACIN

- Identificacin del inicio de la Unidad Transcripcional - Definicin del sentido de la transcripcin

La transcripcin comienza en distintas secuencias promotoras: Secuencias del DNA localizadas en el extremo 5 de la unidad transcripcional, que determinan la localizacin y el sentido de la transcripcin. La subunidad de la ARN polimerasa reconoce y se une a las secuencias promotoras.
Genes Regin -35 Regin -10 (caja de Pribnow) Sitio de iniciacin (+1)

Secuencias promotoras consenso

El estudio de muchas regiones promotoras de diferentes genes permite determinar secuencias que aparecen con mayor frecuencia : Secuencias promotoras consenso

Transcripcin en procariotas.

INICIACIN
Existen en E. coli mltiples factores promotores contenidos en su ADN:
-

que reconocen los diversos tipos de

70 (70kd) reconoce las regiones -35 y -10. - 32 reconoce el promotor de los genes de choque trmico - 54 reconoce el promotor de los genes implicados en la asimilacin

de N , .

El factor

desempea un papel crucial en la determinacin del inicio de la transcripcin por la RNA polimerasa.

Transcripcin en procariotas.

INICIACIN

1. Unin dbil de la ARN polimerasa al ADN y desplazamiento por el ADN en bsqueda de promotores. 2. Deteccin de las secuencias 35 y 10

(subunidad ). Proceso rpido (complejo promotor cerrado ,ADN sin desenrollar). 3. La ARN polimerasa comienza a separar las dos hlices por la regin -10 (rica en pares AT). El desenrollamiento implica a 17 bases. 4. Formacin del complejo promotor abierto (muy estable) e inicio de la transcripcin: - La subunidad se une a secuencias reguladoras.

- La subunidad se une a los ribonucletidos trifosfatos y forma enlaces fosfodisteres.

- La subunidad se une al molde de ADN. Hebra sin sentido (-). 2 sitios de unin de NTPs: Sitio de iniciacin (preferentemente A,G) y Sitio de elongacin

5. Tras la polimerizacin de 6-10 nucletidos la subunidad se separa de la holoenzima y va en busca de nuevos promotores, mientras que el ncleo de la polimerasa sigue aadiendo nucletidos.

Transcripcin en procariotas.

INICIACIN

La ARN polimerasa no necesita un cebador para iniciar la polimerizacin. Las cadenas de RNA comienzan en el extremo 5con una purina triP, pppG o pppA.

G o A P P 5 P 5 P

X 3 3

Mecanismo: El grupo 3-OH de nucletido de la cadena naciente ataca al P del nucletido entrante y se forma un enlace fosfodiester 5-3.
enlace fosfodiester 5-3 Cadena RNA naciente

Transcripcin en procariotas.

ELONGACIN

La elongacin comienza tras la formacin del primer enlace fosfodister. Tras la polimerizacin de 6-10 nucletidos la subunidad se separa de la holoenzima.
Despeje del promotor

Hbrido ADN-ARN (8-10 pb).(Estructura de A-DNA)

La BURBUJA DE TRANSCRIPCIN (ARN polimerasa, ADN molde y ARN naciente), se desplaza a lo largo de la molcula de ADN. La longitud del hbrido ADN-ARN y del ADN desenrollado permanecen constantes a medida que la burbuja avanza

La molcula de ADN debe de ir desenrollndose por delante de la burbuja y enrollndose por detrs. Catalizado por la topoisomerasa II (DNA girasa).

La ARN polimerasa tiene una pobre actividad nucleasa y su tasa de error es de 1/104-105 bases.

Transcripcin en procariotas.

TERMINACIN

- Se paraliza la formacin de enlaces fosfodisteres. - Se separa el hbrido ARN-ADN. - Se rebobina el ADN y se libera la ARN polimerasa.

Cmo ocurre la terminacin de la transcripcin ?

Dos formas diferentes segn sea o no dependiente del factor proteico rho ()

Transcripcin en procariotas.

TERMINACIN
A: Terminacin independiente de rho () Existen secuencias de parada en el ADN: Regin palindrmica rica en GC que precede a otra rica en AT.

Molde de DNA RNA trascrito

El transcrito forma una estructura en horquilla (debido a la complementariedad de bases en la regin palindrmica), seguida de una cola de poli U acta como seal para la separacin de la ARN polimerasa y terminacin de la trascripcin

Transcripcin en procariotas.

TERMINACIN
A: Terminacin independiente de rho ()

Separacin del hbrido ADN-ARN y liberacin de la molcula de ARN.

Uniones U-A (RNA-DNA) poco estables Cierre de la burbuja de transcripcin. Holoenzima sin la subunidad menos afinidad por el ADN bicatenario, por lo que se separa del ADN.

El transcrito forma una estructura en horquilla, seguida de una cola de poli U

Transcripcin en procariotas.

TERMINACIN
A: Terminacin dependiente de rho ()

El factor rho tiene una estructura hexamrica y actividad ATPasa

Unin de rho al ARN Unin a una secuencia de 72 nucletidos (12 por subunidad) y se activa.

La actividad ATPasa permite su desplazamiento a lo largo de la hebra de ARN Debilita la interaccin entre el molde y el transcrito provocando su separacin

Transcripcin en eucariotas
Mucho mas compleja que en procaritas:
- En la clula eucariota, la transcripcin tiene lugar en el ncleo (membrana nuclear) y la traduccin en el citoplasma. - En eucariotas la cromatina que contiene la secuencia promotora tiene que ser accesible a la maquinaria de transcripcin. - En eucariotas la transcripcin la realizan 3 tipos de RNA polimerasas - La clula eucariota tiene una regulacin de la transcipcin mas compleja, en la que participan numerosos factores de transcripcin. - El ARN eucariota sufre un extenso proceso de procesamiento y maduracin.

La transcripcin y la traduccin son procesos simultneos.

La transcripcin y la traduccin no son procesos simultneos.

Transcripcin en eucariotas

RNA polimerasas

En eucariotas la transcripcin la realizan 3 tipos de RNA polimerasas.

* RNA polimerasa I

Nucleolo

ARNr de 18S, 5,8S y 28S

* RNA polimerasa II

Nucleoplasma

Precursores del mRNA y snRNA

* RNA polimerasa III

Nucleoplasma

ARNt y ARNr de 5S

Cada polimerasa reconoce promotores con caractersticas especficas

Transcripcin en eucariotas

RNA polimerasas

RNA polimerasa II
RPB1 RPB2

Complejos grandes con 8 a 12 subunidades y >500 kd.

Dominio CTD de RPB1

RPB1 220 kD RPB2

Dominio CTD: dominio carboxilo terminal de RPB1 con mltiples repeticiones de la secuencia
YSPTSPS, regulable por fosforilacin. Participan en el reconocimiento de seales de activacin y en la iniciacin de la Transcripcin. -CTD no fosforilado, RNApol II puede iniciar la transcripcin pero no puede elongar -CTD fosforilado, RNApol II puede elongar pero no iniciar

Transcripcin en eucariotas

INICIACIN

Factores Generales de iniciacin y Aparato Bsico de Transcripcin En eucariotas los nucleosomas reprimen la transcripcin de todos los genes. Slo los genes activados son transcritos Activacin de genes para la transcripcin:
1. Unin del Promotor al Aparato Bsico de Transcripcin. Intervencin de factores de transcripcin. 2. Accin de Coactivadores. Comunicacin entre RNA Pol II y Transactivadores

3. Accin de Transactivadores: Unin a Secuencias Potenciadoras (Enhancers)

Transcripcin en eucariotas

INICIACIN

Factores Generales de iniciacin y Aparato Bsico de Transcripcin Promotores Los promotores de la RNA poli II se localizan en el lado 5 del centro de inciacin
de la transcripcin:
-

TATA box

hacia el nucletido 25. En la mayora de los promotores de ARNm

- Otras secuencias entre las posiciones 40 y -110 (

caja GC

caja CAAT)

-110

-40

-25

CAAT

GC

TATA

La ARN polimerasa II no es capaz de reconocer a los promotores. Necesita factores de transcripcin para la iniciacin: TFII (A, B, C, D, ..) Los factores de transcripcin se unen primero a una secuencia especfica del DNA, y luego se unen entre ellos y a la RNA polimerasa.

Transcripcin en eucariotas
Iniciacin
La ARN polimerasa II no es capaz de reconocer a los promotores. En consecuencia necesita de factores de transcripcin para la iniciacin PASOS:

Para la INICIACIN es necesario el ensamblaje del APARATO BSICO de TRANSCRIPCIN

APARATO BSICO DE TRANSCRIPCIN: formado porla RNApolII y los FACTORES GENERALES DE TRANSCRIPCIN Estos factores se denominan TFII....

Transcripcin en eucariotas

INICIACIN

Factores Generales de iniciacin y Aparato Bsico de Transcripcin Factores de transcripcin e Iniciacin en TATA
Unin del factor TFIID al compartimento TATA.

Unin consecutiva de los factores TFIIA, IIB al compartimento TATA.

Reclutamiento de RNApol II unida a TFIIF

4. Formacin del complejo cerrado de transcripcin mediante la unin de TFIIE y de TFIIH

TFIIH

- Abre la doble hlice (helicasa) - Fosforila CTD (quinasa) - Promueve la separacin de la RNApol del promotor para iniciar la transcripcin

Transcripcin en eucariotas

INICIACIN

Factores Generales de iniciacin y Aparato Bsico de Transcripcin

CTD desfosforilado y unido a los mediadores y componentes del Aparato Bsico de Transcripcin. Tras la apertura del promotor se inicia la transcripcin.

Apertura del promotor

La fosforilacin del CTD promueve la separacin de la RNApol II del promotor. La elongacin del RNA naciente continua.

Fosforilacin del CTD

El Complejo de transcripcin basal no es suficiente para conseguir una alta velocidad en la sntesis de ARNm. En eucariotas, existen en el DNA secuencias intensificadoras (enhancers) que incrementan la expresin de un gen unas 100 veces participando en el inicio de la transcripcin. Tambin existen secuencias inhibidoras (represoras), con efecto opuesto. Estas secuencias pueden ejercer su efecto sobre promotores situados a miles de pares de bases de distancia.

Transactivadores Protenas Modulares que contienen;

1. Dominios de unin al DNA (enhancers ) 2. Dominios de unin a factores Transcripcionales Coactivadores

Coactivatores
Para el ensamblaje del Aparato bsico de Transcripcin son necesarios los coactivadores. 1. Interaccin con RNA pol. II y transactivadores 2. Modificacin de las histonas por: acetilacion (histone acetyle transferases or HATs.),metilacin, fosforilacn, etc.

Remodelan la cromatina
.

Transcripcin en eucariotas

INICIACIN

Factores Generales de iniciacin y Aparato Bsico de Transcripcin Transactivadores:

Son protenas de unin a Secuencias Potenciadoras (Enhancers). Aumentan la frecuencia de iniciacin de Pol II via CO-ACTIVADORES Tienen 2 dominios: - dominio de unin a secuencia potenciadora del DNA - Dominio de unin a factores transcripcionales Co-Activadores

Coactivadores
Son necesarios para el ensamblaje del Aparato bsico de Transcripcin. Permiten la comunicacin entre RNA pol II y Transactivadores: Integran seales de los
activadores y represores de la transcripcin e interaccionan con los factores de transcripcin basal

2 tipos: a) Remodelan la cromatina: Modifican las histonas por acetilacion (histone acetyle
transferases or HATs) , metilacin, fosforilacin

b) Interaccin con RNA pol. II.

Transcripcin en eucariotas

INICIACIN

Factores Generales de iniciacin y Aparato Bsico de Transcripcin

Desacetilacin de histonas mediada por represores

Acetilacin de histonas mediada por activadores

Activacin de la transcripcin en eucariotas

Paso 1: DNA-binding transactivators (DBTs) se unen a las secuencias intensificadoras (enhancer sequences). Paso 2: DBTs unen a los coactivatores con actividad HAT (Histona Acetil Transferasa) permitiendo la remodelacin de la cromatina. Paso 3: DBTs tambin interactan con el TFIID permitiendo que la TBP se una a la TATA box.

Paso4: Unin de la RNA pol II y formacin del complejo bsico de transcripcin Paso 5: Iniciacin de la transcripcin

Transcripcin en eucariotas

Resumen de la activacin transcripcional de eucariotas

=Histonas =Enhancers =proteinas transactivadoras

TATA TATA

Transcripcin en eucariotas

Resumen de la activacin transcripcional de eucariotas

= proteinas HGM
AC AC AC AC AC AC AC Inr AC

TATA

HAT

Transcripcin en eucariotas

Resumen de la activacin transcripcional de eucariotas

AC

AC

AC

AC

TATA

AC AC AC

AC

HAT

Transcripcin en eucariotas

Resumen de la activacin transcripcional de eucariotas

P transcripcin P P TFIID P TFIIH

RNA Polymerasa TATA TBP y complejo basal

II de

Fosforilacion del CTD de RNA pol.II

Transcripcin en eucariotas

INICIACIN

Factores Generales de iniciacin y Aparato Bsico de Transcripcin

El modelo mas aceptado es la formacin de un bucle que permite que el potenciador y el Promotor se acerquen en espacio

(Bend DNA)

Coactivadores

Protenas transactivadoras

Transcripcin en Eucariotas
Elongacin y Terminacin
* La transcripcin en eucariotas tambin suele empezar por A o G.

* La terminacin es poco conocida en eucariotas.

* En algunos transcritos existe la estructura en horquilla seguida de la secuencia de residuos de uracilo.

* La mayora de los ARN mensajeros eucariotas experimentan procesos de maduracin como la adicin de una cola de poli-A en el extremo 3y otras modificaciones.

Inhibidores de la transcripcin
Rifamicina B (Streptomyces
mediterranei).Rifampicina (derivado semisinttico).

Antibitico que inhibe la RNA polimerasa procariota pero no la eucariota. Bloquea la elongacin por unin la subunidad e impide el desalojo del promotor.

-Amanitina.
Toxina contenida en la seta Amanita phalloides (octapptido). Inhibe predominantemente la RNA polimerasa II. Forma con ella un complejo 1:1 e impide la elongacin.

Cordicepina (hongo Cordyceps).

Antibitico antitumoral terminador de cadena de la transcripcin. Se incorpora a la cadena en crecimiento y la para, ya que carece del grupo 3-OH a partir del cul continuar la elongacin.

Actinomicina D (Streptomyces).
Se une al DNA de doble hlice de forma fuerte y especfica. Inhibe la transcripcin y la replicacin. Adems de su uso como antibitico tambin se usa en carcinoterapia.