CAPIT-ULO

Introduccin al estudio de la biologa celular

1-1 Descubrimiento de las clulas 1-2 Propiedades bsicas de las clulas 1-3 Dos tipos fundamentalmente diferentes de clulas 1-4 Virus La perspectiva humana: Bsqueda de una vacuna contra el SIDA La va experimental: Friones: solucin de un enigma mdico

as clulas, y las estructuras que las forman, son demasiado pequeas para verlas, escucharlas o tocarlas directamente. Pero a pesar de este tremendo inconveniente, las clulas son tema de miles de publicaciones cada ao, y prcticamente se han investigado todos los aspectos de su minscula estructura. De muchas maneras, el estudio de la biologa celular constituye un tributo a la curiosidad humana en su aspiracin de realizar descubrimientos, y a la inteligencia creativa del ser humano para disear los complejos instrumentos y las elaboradas tcnicas mediante las cuales se pueden efectuar esos descubrimientos. Esto no significa que los bilogos celulares sean los nicos dotados con estos nobles rasgos. En un extremo del espectro cientfico los astrnomos estudian objetos en la orilla ms alejada del universo con propiedades muy diferentes a las que se encuentran sobre la tierra. Y en el otro extremo del espectro, los fsicos nucleares dirigen su atencin sobre partculas de dimensiones subatmicas que tienen igualmente propiedades inconcebibles. Es muy claro, por lo tanto, que nuestro universo contiene mundos dentro de otros mundos, y el estudio de todos sus aspectos es fascinante. En este sentido, la finalidad ms aparente de este texto es generar entre sus lectores el inters por las clulas y por su estudio.

1-1 Descubrimiento de las clulas

No se sabe cundo el ser humano descubri por primera vez la notable propiedad de una superficie curva de vidrio para inclinar la luz y formar imgenes. Los anteojos se fabricaron por primera vez en Europa en el siglo XIII y el primer microscopio compuesto (de dos lentes) fue construido a fines del siglo XVI. A mediados del siglo XVII un puado de cientficos pioneros haba utilizado sus microscopios caseros para descubrir un mundo que nunca se haba revelado al ojo desnudo. El descubrimiento de las clulas (fig. 1-1) generalmente se acredita a Robert Hooke, microscopista ingls quien a los

FIGURA 1 -A. Micrografa electrnica de exploracin de agregados celulares del moho del fango Dictyostelium discoideum en el proceso deformacin de corpsculos fructificantes. (Cortesa de Mark Grimson, Texas Tech. University.)

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celular

27 aos de edad fue premiado con el puesto de Guardin de la Royal Society, la academia cientfica ms antigua de Inglaterra. Una de las muchas cuestiones que Hooke intent responder fue: por qu los tapones hechos de corcho (una parte del rbol de alcornoque) eran tan adecuados para retener aire dentro de una botella? En sus propias palabras: "tom un buen pedazo de corcho limpio y con un cuchillo tan bien afilado como una navaja de rasurar lo cort en pedazos y .. .luego lo examin con el microscopio. Me pareci percibir que tena una apariencia porosa... muy parecida a un panal de abejas". Hooke llam a los poros celdillas debido a que le recordaban las celdas habitadas por los monjes que vivan en un monasterio. En realidad, Hooke haba observado las paredes vacas de un tejido vegetal muerto, paredes que originalmente fueron producidas por las clulas vivas que as rodeaban. Entre tanto, Antn van Leeuwenhoek, un holands que se ganaba la vida vendiendo telas y botones, ocupaba sus ratos de ocio tallando lentes y construyendo microscopios

de notable calidad. Durante 50 aos, Leeuwenhoek envi cartas a la Royal Society de Londres describiendo sus observaciones microscpicas, junto con un vago discurso acerca de sus hbitos cotidianos y su estado de salud. Leeuwenhoek fue el primero en examinar una gota de agua del estanque y observar sorprendido la abundante cantidad de "animalillos" microscpicos que iban y venan ante sus ojos. Tambin fue el primero en describir las diferentes formas de bacterias que obtuvo de agua en la cual haba remojado pimienta y tambin material raspado de sus propios dientes. Sus primeras cartas a la Royal Society describiendo este mundo previamente jams visto despertaron tal escepticismo que la Sociedad despach a su Guardin, Robert Hooke, para confirmar las observaciones. Hooke hizo el viaje y pronto Leeuwenhoek fue una celebridad mundial, y recibi la visita en Holanda de Pedro el Grande de Rusia y de la reina de Inglaterra. No fue sino hasta el decenio de 1830 que se comprob la gran importancia de las clulas. En 1838, Matthias Schleiden, abogado alemn convertido en botnico, concluy que a pesar de diferencias en la estructura de diferentes tipos, las plantas estaban constituidas de clulas y que el embrin de la planta tuvo su origen en una sola clula. En 1839, Theodor Schwann, zologo alemn y colega de Schleiden, public un trabajo muy completo acerca de las bases celulares de la vida animal. Schwann concluy que las clulas de las plantas y los animales eran estructuras semejantes y propuso el primero de los dos dogmas de la teora celular: Todos los organismos estn compuestos de una o ms clulas La clula es la unidad estructural de la vida. Las ideas de Schleiden y de Schwann acerca del origen de las clulas fueron menos profundas; ambos concluyeron que las clulas podran originarse de materiales no celulares. Dada la posicin prominente que estos dos investigadores tenan en el mundo cientfico, tuvieron que pasar muchos aos antes que las observaciones de otros bilogos fueran aceptadas como demostracin de que las clulas no se originan de esa manera y que ios organismos tampoco se producen por generacin espontnea. Para 1855, Rudolf Virchow, patlogo alemn, propuso una hiptesis convincente para'el tercer dogma de la teora celular: Las clulas slo pueden originarse por divisin de una clula preexistente.

1-2 Propiedades bsicas de las clulas

As como las plantas y los animales son seres vivos, tambin lo son las clulas. De hecho, la vida es la propiedad fundamental de las clulas y ellas son las unidades ms pequeas que muestran esta propiedad. A diferencia de las partes de una clula, que simplemente se deterioran cuando se aislan, las clulas pueden ser extradas de una planta o de un animal y cultivar en el laboratorio, donde crecen y se reproducen durante tiempo prolongado. El primer cultivo de clulas

FIGURA 1 - 1 Descubrimiento de las clulas. Microscopio empleado por Robert Hooke, con lmpara y condensador para iluminar el objeto. (Recuadro) Dibujo hecho por Hooke de un corte delgado de corcho que muestra una red de "celdillas" semejante a un panal de abejas. (De Granger Collection; recuadro del archivo Bettmann.)

CAPITULO 1 Introduccin a! estudio de la biologa celular

humanas fue iniciado por George Cey, de la Universidad Johns Hopkins, en 1951. Se emplearon clulas obtenidas de un tumor maligno denominadas clulas HeLa, por su donador Henrietta Lacks. Las clulas HeLa, descendientes por divisin celular de la primera clula muestra, todava se desarrollan en la actualidad en laboratorios alrededor del mundo (fig. 1-2). Debido a que son mucho ms fciles de estudiar que las clulas situadas dentro del cuerpo, las clulas cultivadas in vitro (en cultivo fuera del cuerpo) se han convertido en una herramienta esencial de la biologa celular y molecular. En realidad, gran parte de la informacin que analizaremos en este libro se obtuvo utilizando clulas desarrolladas en cultivos de laboratorio. Iniciaremos nuestra exploracin de las clulas examinando algunas de sus propiedades ms fundamentales.

Las clulas muestran complejidad y organizacin elevadas

La complejidad es una propiedad evidente pero difcil de describir. En este momento podemos pensar en la complejidad en trminos de orden y regularidad. Cuanto ms compleja sea una estructura, mayor el nmero de partes que deben estar en posicin apropiada, menor la tolerancia de errores en la naturaleza e interaccin de las partes, y mayor la regulacin o control que se debe ejercer para conservar el sistema. A lo largo de este libro tendremos ocasin de considerar la complejidad de la vida a diferentes niveles. Analizaremos la organizacin de los tomos en molculas de tamao pequeo, la organizacin de estas molculas en polmeros gigantes y la organizacin de diferentes tipos de molculas polimricas en complejos que a su vez se organizan en organelos subceluiares y finalmente en clulas. Como se ver, hay una gran regularidad en cada nivel. Cada tipo de clula tiene apariencia consistente en el microscopio electrnico; o sea, sus organelos tienen forma y situacin particular en cada individuo de una especie y de una especie a otra. De manera similar, cada tipo de organelo tiene composicin concordante de macromolculas, las cuales estn dispuestas en un patrn predecible. Consideremos las clulas que revisten el intestino encargadas de eliminar nutrientes del conducto digestivo (fig. 1-3). Se puede predecir que los extremos apicales de las clulas que revisten el conducto intestinal poseen largas prolongaciones (microvellosidades) para facilitar la absorcin de nutrientes, en tanto que sus extremos bsales contienen un gran nmero de mitocondrias que suministran la energa necesaria como combustible para los diferentes procesos de transporte a travs de las membranas. Las microvellosidades pueden prolongarse hacia afuera de la superficie apical de la clula debido a que contienen un esqueleto interno de filamentos, que a su vez estn compuestos de la protena acuna dispuesta en forma regular de doble hlice. Cada mitocondria est compuesta por un patrn caracterstico de membranas internas, que por su parte constan de una disposicin regular de protenas, incluyendo enzimas sintetizadoras de ATP proyectadas desde la membrana interna como una pelota sobre una varilla. Cada uno de estos diferentes niveles de organizacin se ilustra en la serie de recuadros de la figura 1-3.

FIGUllA 1-2. Clulas HeLa, como las representadas aqu, fueron las primeras clulas humanas conservadas en cultivo durante largos periodos y que todava se encuentran en uso en la actualidad. A diferencia de las clulas normales, que tienen un periodo de vida finito en cultivo, las clulas (como las HeLa) derivadas de tumores cancerosos pueden vivir indefinidamente en cultivo en tanto las condiciones sean favorables para apoyar su crecimiento y divisin. (Nana/ Kedersha/Photo Researchers.)

Afortunadamente para la clula y los bilogos moleculares, la evolucin tiende a moverse ms bien lentamente hacia los niveles de organizacin biolgica con los cuales debemos tratar. Por ejemplo, aunque un ser humano y un gato tienen caractersticas anatmicas muy diferentes, las clulas que forman sus tejidos y los organelos que constituyen sus clulas son muy similares. El filamento de actina mostrado en la figura 1-3, recuadro 3, y la enzima sintetizadora de ATP del recuadro 6 son prcticamente idnticos a las estructuras similares que se observan en organismos tan diversos como levaduras, pjaros y rboles de pino rojo. La informacin obtenida por el estudio de las clulas de un tipo de organismo casi siempre tiene aplicacin directa en otras formas de vida. Muchos de los procesos ms bsicos, como la sntesis de protenas, la conservacin de la energa qumica, o la construccin de una membrana, son notablemente similares en todos los organismos vivos.

Las clulas poseen un programa gentico y los recursos para aplicarlo

Los organismos se generan a partir de la informacin codificada en un conjunto de genes. El programa gentico humano contiene suficiente informacin, si se convirtiera a palabras, para llenar millones de pginas de texto. Lo ms sorprendente es que esta vasta cantidad de informacin se encuentra empacada en un conjunto de cromosomas que

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10 un

0.3 um

\, Niveles de organizacin celular y molecular. Las fotografas de brillantes colores de un corte teido muestran la estructura microscpica de una vellosidad de la pared del intestino delgado segn se observa con el microscopio ce luz. El recuadro 1 muestra una micrografa electrnica de la capa epitelial de clulas que revisten la pared interna del intestino. La superficie apical de cada clula, que mira hacia el conducto intestinal, contiene numerosas microvellosidades que participan en la absorcin de nutrientes. La regin basal de cada clula contiene un gran nmero de mitocondrias donde la clula dispone de energa. El recuadro 2 muestra la regin apical de las microvellosidades; se puede observar que cada microvellosidad contiene un haz de microflamentos. El recuadro 3 muestra la doble fila de molculas de protena actina que constituyen cada filamento. En el recuadro 4 se muestra una mitocondria individual similar a las observadas en la regin basal de las clulas epiteliales; el recuadro 5 muestra una parte de la membrana interna de la mitocondria, incluyendo partculas pediculadas (flecha de arriba) que se prolongan a partir de la membrana (flecha de abajo) y corresponden a los sitios donde se sintetiza ATP; el recuadro 6 muestra un modelo molecular del aparato sintetizador de ATP que se analiza en mayor extensin en el captulo 5. (Micrografa de luz, Ced Fox/Photo Researchers; recuadro I cortesa de Shakti P. Kapur, Georgetown University Medical Center; recuadro 2 cortesa de Mark S. Mooseker y Lewis G. Tney, J. Cell Biol. 67:729,1975, con permiso de la Rockefeller University Press; recuadro 3 cortesa de Kenneth C, Holmes; recuadro 4 cortesa de Keith R. Porter/ Photo Researchers; recuadro 5 cortesa de Humberto Pemandez-Moran; recuadro 6 cortesa de Roderick A. Capaldi.)

ocupa el espacio de un ncleo celular, miles de veces ms pequeo que el punto sobre esta letra i. Los genes son algo ms que gavetas para almacenar informacin: constituyen las plantillas para construir estructuras celulares, y contienen instrucciones para poner en marcha las actividades de la clula y el programa para reproducirse a s mismos. Descubrir los mecanismos mediante los cuales las clulas emplean su informacin gentica para efectuar estas funciones es uno de los ms grandes ogros de la ciencia en los ltimos aos.

Las clulas tienen capacidad para reproducirse a s mismas

As como se generan nuevos individuos por reproduccin, lo mismo ocurre con las clulas nuevas. Las clulas se producen por divisin, proceso en el cual el contenido de una clula "madre" se distribuye entre dos clulas "hijas". Antes de la divisin, el material gentico se duplica con toda fidelidad y cada clula hija recibe una dotacin completa e igual de informacin gentica. En la mayor parte de los casos, las dos clulas hijas producidas durante la divisin poseen aproximadamente el mismo volumen. Sin embargo, en algunos casos, como ocurre durante la divisin del oocito humano, una de las clulas puede retener casi todo el citoplasma aunque reciba slo la mitad del material gentico (fig. 1-4).

20;im FIGURA I -4. Reproduccin celular. Este huevo de mamfero sufri recientemente una divisin celular bastante desigual en la cual la mayor parte del citoplasma qued retenida dentro del huevo grande, en tanto que la otra clula slo consta casi exclusivamente de material nuclear en su totalidad (indicado por los cromosomas teidos de azul). (Cortesa de Jonathan van Blerkom.)

Las clulas captan y consumen energa

El desarrollo y la operacin de funciones complejas requiere el ingreso continuo de energa (fig. 1-5). Prcticamente toda la energa que requiere la vida del planeta proviene en ltimo trmino de la radiacin electromagntica del sol. Los pigmentos que absorben luz presentes en las membranas de clulas fotosintticas atrapan la energa de la luz. La energa lumnica se convierte por fotosntesis en energa qumica almacenada en carbohidratos ricos en energa, como la sucrosa o el almidn. La energa atrapada en estas molculas durante la fotosntesis suministra el combustible que sirve para poner en marcha casi todas las actividades de los organismos sobre la tierra. A la mayor parte de las clulas animales la energa les llega ya empaquetada, por lo general en forma del azcar glucosa. En el ser humano, el hgado libera glucosa a la sangre y este azcar circula a travs del cuerpo suministrando energa qumica a todas las clulas. Una vez dentro de la clula, la glucosa se descompone en tal forma que su contenido energtico se puede almacenar en una forma rpidamente disponible (de ordinario como ATP), que posteriormente se emplea para poner en marcha las mltiples actividades que requieren energa dentro de la clula.

efectuar cientos de diferentes transformaciones qumicas, ninguna de las cuales ocurre a una tasa significativa en el mundo inanimado. Prcticamente todos los cambios qumicos que ocurren en las clulas requieren enzimas: molculas que incrementan mucho la velocidad de una reaccin qumica. La suma total de las reacciones qumicas que ocurren dentro de una clula representa el metabolismo celular.

Las clulas participan en numerosas actividades mecnicas

Las clulas son sitios de actividad infatigable. Los materiales son transportados de un sitio a otro, se sintetizan y descomponen con rapidez algunas estructuras, y en muchos casos toda la clula se desplaza de un lugar a otro (fig. 1-6). Estas diferentes actividades dependen de cambios mecnicos dinmicos que ocurren en el interior de la clula, la

Las clulas efectan variadas reacciones qumicas

Las clulas funcionan como plantas qumicas en miniatura. Incluso la clula bacteriana ms sencilla es capaz de

FIGURA 1-5. Captacin de energa. Una clula viva del alga filamentosa Spirogyra. El cloroplasto en forma de listn que se observa en zig-zag a travs de la clula es el sitio donde se captura la energa de la luz solar y se convierte en energa qumica durante la fotosntesis. (M.L Walker/Photo Researchers, Inc.)

CAPITULO 1 introduccin a! estudio de la biologa celular

mayor parte iniciados por alteraciones en la forma de ciertas protenas "motoras".

Las clulas tienen capacidad para responder a los estmulos

Algunas clulas presentan respuestas obvias a los estmulos; por ejemplo, una clula ciliada nica se aparta de un objeto situado en su camino o se desplaza hacia una fuente de nutrientes. Las clulas dentro de una planta o animal multicelular responden a os estmulos en forma menos evidente, pero de todas maneras responden. La mayor parte de las clulas estn cubiertas con receptores que interactan con las sustancias del medio de manera muy especfica. Las clulas poseen receptores a hormonas, factores de crecimiento, materiales extracelulares y tambin sustancias situadas en la superficie de otras clulas. Los receptores de una clula constituyen una puerta de entrada a travs de la cual los agentes externos pueden generar respuestas especficas. A veces las clulas responden a un estmulo especfico alterando sus actividades metablicas, preparndose para la divisin celular, desplazndose de un lugar a otro o incluso "suicidndose".

Las clulas tienen capacidad de autorregulacin

Adems de sus necesidades energticas para mantener un estado complejo ordenado se requiere regulacin continua. Igual que en el cuerpo ntegro, dentro de cada clula viva operan muchos mecanismos de control diferentes. La importancia de los mecanismos reguladores de la clula es ms evidente cuando fallan. Por ejemplo, la insuficiencia de la clula para corregir un error cuando duplica su DNA puede

Autorregulacin. El diagrama de la izquierda muestra el desarrollo normal de un erizo de mar en el cual un huevo fertilizado da lugar a un solo embrin. El esquema de la derecha muestra un experimento en el cual se separan entre s las clulas de un embrin despus de la primera divisin y se permite que cada clula se desarrolle por su cuenta. En vez de desarrollarse en la mitad de un embrin como ocurrira si no se le hubiera alterado, cada clula aislada reconoce la ausencia de su vecino y regula su desarrollo para formar un embrin completo (aunque ms pequeo).

FIGURA 1-6. Locomocin celular. Este fibroblasto (tipo de clula do tejido conectivo) fue sorprendido en el acto de desplazarse sobre la superficie de una caja de cultivo. ! 3 clula est teida con anticuerpos fluorescentes para revelar la distribucin de !os filamentos de actina y los microtbulos (cap. 9). El bord redondeado de la clula va por delante; los agrupamientos de filamentos de actina en el borde delantero son sitios donde se genera la fuerza del movimiento. (Cortesa de . Vctor Small.)

producir una mutacin nociva o trastornos en el control del crecimiento celular que pueden transformar a la clula en una clula cancerosa con capacidad para destruir a todo el organismo. Poco a poco hemos aprendido cada vez ms acerca de cmo la clula controla' sus actividades, pero an queda mucho ms por descubrir. Consideremos el siguiente experimento efectuado en 1891 por el embrilogo alemn Hans Driesch, quien observ que poda separar por completo las primeras dos o cuatro clulas del embrin de un erizo de mar y cada una de las clulas aisladas prosegua su desarrollo hasta convertirse en embriones normales (fig. 1-7). Cmo puede una clula normalmente destinada slo a formar parte de un embrin regular sus propias actividades y formar otro embrin entero? Cmo puede la clula aislada reconocer la ausencia de sus clulas vecinas y de qu manera este hecho puede reorientar el curso del desarrollo celular? Cmo puede la parte de un embrin adquirir el sentido de totalidad? En la actualidad no estamos en mejor posicin para responder estas preguntas, planteadas hace ms de 200 aos cuando se efectu el experimento. A lo largo de este libro analizaremos procesos que requieren una serie de pasos ordenados, muy semejantes a la lnea de ensamblado para construir automviles en la cual

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Mquina exprimidera para jugo de naranja

FIGURA 1-8. Las actividades de la clula con frecuencia son anlogas a esta mquina de Rube Goldberg, en la cual un paso "automtico" dispara el siguiente paso en una reaccin secuencia!. La figura 15-27 suministra un buen ejemplo de este concepto. (Reimpreso con permiso especial de King Fentures Syndicate.)

E! profesor Butts cay por el foso abierto de un elevador y cuando lleg tierra abajo slo encontr una mquina para exprimir naranjas, El lechero toma la botella de leche vaca (A) y tira de la cuerda (B), lo que provoca que la espada (C) corte la cuerda (D). Esto permite que la hoja de la guillotina (E) caiga y corte la soga (F), que libera el ariete de tronco (G). El ariete golpea la puerta abierta (H) y la cierra. La hoz (I) corta la naranja |J), y al mismo tiempo la espina (K) hiere al "halcn-ciruelero" (L). Este

abre la boca gritando de dolor y por lo tanto suelta la ciruela y permite que el zapato (M) caiga y se zambulla sobre la cabeza de un pulpo (N). El pulpo despierta iracundo y ve la cara del buzo dibujada sobre la naranja, la ataca y la oprime con sus tentculos, de esta manera el jugo de la naranja cae al vaso (O). Posteriormente el tronco puede emplearse para construir una cabana en donde puede desarrollarse su hijo, quien podr ser presidente corno Abraham Lincoln.

los trabajadores aaden, quitan o hacen ajustes especficos conforme el automvil se mueve a lo largo de la lnea. En la clula, la plantilla para elaborar productos se encuentra en los cidos nucleicos y los trabajadores que los construyen son principalmente protenas. La presencia de estos dos tipos de macromolculas, ms que cualquier otro factor, confiere a la qumica de la clula sus caractersticas distintivas nicas diferentes del mundo no vivo, En la clula, los trabajadores deben actuar sin !a ventaja de un control externo. Cada paso del proceso debe ocurrir de manera espontnea y en forma tal que el siguiente paso se inicie automticamente. Toda la informacin para dirigir una actividad particular, sea la sntesis de una protena, la secrecin de una hormona o la contraccin de una fibra muscular, ya debe estar presente dentro del propio sistema. En gran medida, las funciones de una clula operan de manera anloga al artefacto inventado por el profesor Butts para exprimir naranjas que se muestra en la figura 1-8.

y eucariotas, que pueden distinguirse por su tamao y el tipo de sus estructuras internas u organelos que contienen (fig. 1-9). La existencia de dos tipos distintos de clulas, sin intermediarios conocidos, representa una de las ms fundamentales brechas de discontinuidad en la evolucin del mundo biolgico. Las clulas procariotas, estructuralmente ms simples, slo se encuentran entre las bacterias y recprocamente todas las bacterias constan de clulas procariotas. Todos los otros tipos de organismos: protstas, hongos, plantas y animales, constan estructuralmente de clulas eucariotas ms complejas. Las clulas procariotas vivas en la actualidad son notablemente semejantes a las clulas fosilizadas que se encuentran en rocas desde Australia hasta Sudfrica y que datan de hace ms de 3 500 millones de aos (fig. 1-10). En realidad, se piensa que las clulas procariotas fueron los nicos seres vivos sobre el planeta durante casi 2 000 millones de aos antes de la aparicin de los primeros eucariotes.

1-3 Dos tipos fundamentalmente diferentes de clulas

Cuando el microscopio electrnico estuvo disponible en casi todo el mundo, los bilogos pudieron examinar la estructura interna de una gran variedad de clulas. Estos estudios revelaron que hay dos tipos bsicos de clulas, procariotas

Caractersticas que distinguen a las clulas procariotas y a las eucariotas

La siguiente comparacin breve entre clulas eucariotas y procariotas revela muchas diferencias bsicas, pero tambin similitudes (fig. 1-9). Las similitudes reflejan el hecho de que las clulas eucariotas casi con certeza evolucionaron

CAPITULO 1 Introduccin al estudio de la biologa celular

Ribosomas FIGURA 1-9. La estructura de la clula. Diagramas esquemticos de una bacteria "generalizada" (a), vegetal (b) y animal fe). Ntese que los organelos no estn dibujados a escala.

DNAde nucletido

Membrana plasmtica Pared celular

Cpsula

(a)

Ncleo

Cubierta del ncleo Nucleoplasma Nuclolo Retculo endoplsmco rugoso Pared celular-

Cloroplasto
Retculo endoplsmico

Peroxisoma Membrana plasmtica Plasmodesma M tocn dra -Vacuola Ribosomas Vescula Citosol Complejo de Golgi

Microtbulos

(b)

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Cubierta nuclear

Ribosomas Mitocondria
Complejo de Golgi Lisosoma Retculo endoplsmico rugoso
;*

Nucleoplasma Ncleo

Nuclolo

, ".*.

>^ )J !

Retculo endoplsmico rugoso

Microflamentos
Peroxisoma

Membrana plasmtica

Centrolo

Citosol

Microtbulo

Vescula

fe)

FIGURA 1-9. Continuacin.

a partir de ancestros procariotes. Debido a su linaje comn, ambos tipos de clulas comparten un lenguaje gentico idntico, un conjunto comn de vas metablicas y muchos rasgos estructurales comunes. Por ejemplo, ambos tipos de clulas estn rodeadas por una membrana plasmtica de estructura similar que sirve como barrera selectivamente permeable entre ios mundos vivo y no vivo. Ambos tipos

FIGURA 1-10. La forma de vida ms antigua sobre el planeta. Molde de una cianobacteria filamentosa de 3 500 millones de aos de edad tomada en e oeste de Australia. (Cortesa de SM. Awramik.)

de clulas pueden rodearse de una pared celular rgida, no viva, que protege la delicada forma de vida de su interior. Aunque las paredes celulares de los procariotes y los eucariotes pueden tener funciones semejantes, su composicin qumica es muy diferente. Internamente, las clulas eucariotas son mucho ms complejas, tanto estructural como funcionalmente, en comparacin con las clulas procariotas (fig. 1-9). Ambas contienen una regin nuclear que alberga el material gentico de la clula, rodeada de citoplasma. El material gentico de una clula procariota se encuentra en un nucleoide, regin de la clula mal demarcada que carece de membrana limitante para separarla del citoplasma que la rodea. Por lo contrario, las clulas eucariotas poseen un ncleo, una regin rodeada por una estructura membranosa compleja denominada cubierta nuclear. Esta diferencia en la estructura del ncleo es la base de los trminos procariote (pro, antes; carian, ncleo) y encate (eu, verdadero; carian, ncleo). Las clulas procariotas contienen cantidades relativamente pequeas de DNA: la longitud total del DNA de una bacteria oscila entre 0.25 mm y casi 3 mm, cantidad suficiente para codificar unos pocos miles de protenas. Aunque las clulas eucariotas ms simples slo poseen un poco ms de DNA (4.6 mm en las levaduras) que los procariotes ms complejos, la mayor parte de las clulas eucariotas (incluso las de microorganismos eucariotes) contienen varios rdenes de magnitud ms de informacin gentica. Ambos tipos de clulas poseen cromosomas dentro del DNA, pero numerosos cromosomas de una clula eucarota constan de fibras

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CAPITULO 1

FIGURA ] -1 1. Estructura de una clula eucariota. La estructura interna vara mucho de un tipo de clula a otro. Esta clula epitelial particular reviste una. parte del conducto reproductivo masculino de las ratas. En los diagramas que rodean a la figura se muestran e indican algunos organelos diferentes. (Microgmffa electrnica por David Phillips/Visnals Unlimited.)

Retculo endopsmico

rugoso
2um

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que contienen DNA y protena, en tanto que el cromosoma nico de una clula procariota prcticamente slo contiene DNA "desnudo". El citoplasma de los dos tipos de clulas tambin es muy diferente. El citopolasma de una clula eucariota contiene una gran diversidad de estructuras, como puede observarse con facilidad por el examen ms superficial de una micrografa electrnica de casi cualquier clula eucariota (fig. 1-11). Lo ms notable es que las clulas eucariotas contienen un arreglo de organelos membranosos cubiertos por membranas. Por ejemplo, en condiciones tpicas, las clulas animales y las vegetales contienen mitocondrias, donde se encuentra disponible la energa qumica para abastecer de combustible a todas las actividades celulares; un retculo endoplsmico, donde se elaboran la mayor parte de los lpidos y protenas de las clulas; complejos Golgi, donde los materiales se clasifican, modifican y envan a su destino celular especfico; y una gran variedad de vesculas simples de dimensiones variables envueltas por membranas. Las clulas vegetales contienen organelos membranosos adicionales, incluyendo cloroplastos, que son sitios de la fotosntesis y con frecuencia una sola vacuola grande que a veces ocupa la mayor parte del volumen celular. Consideradas en conjunto, las membranas de la clula eucariota sirven para dividir el citoplasma en compartimientos dentro de los cuales pueden efectuarse actividades especializadas. Por lo contrario, el citoplasma de las clulas procariotas est prcticamente desprovisto de estructuras membranosas. Las excepciones a esta generalizacin incluyen a los mesosomas, derivados de pliegues simples de la membrana plasmtica (fig. 1-9), y las membranas fotosintticas complejas de las cianobacterias (fig. 1-15). Las membranas citoplsmicas de las clulas eucariotas forman un sistema de conductos y vesculas interconectadas cuya funcin es dirigir el transporte de sustancias de una parte a otra de la clula y tambin entre el interior de la clula y su entorno. Debido a su pequeo tamao, la comunicacin intracitoplsmica dirigida tiene menor importancia en las clulas procariotas, donde los movimientos necesarios de materiales se pueden efectuar por simple difusin. Las clulas eucariotas tambin contienen numerosas estructuras que carecen de membrana. En este grupo se incluyen los tbulos alargados y filamentos del citoesqueleto que participan en la contractilidad y los movimientos de la clula, y tambin sirven como apoyo. Las clulas procariotas en general carecen de estructuras comparables. Sin embargo, tanto las clulas eucariotas como las procariotas poseen ribosomas que son partculas no membranosas que funcionan como "mesas de trabajo" sobre las cuales se elaboran las protenas celulares. Aunque los ribosomas de las clulas procariotas y eucariotas tienen dimensiones considerablemente diferentes (los ribosomas de los procariotes son ms pequeos y contienen menor nmero de elementos), estos organelos participan en el ensamblado de protenas mediante un mecanismo similar en ambos tipos de clulas. Se pueden observar otras diferencias importantes entre las clulas eucariotas y las procariotas. Las clulas eucariotas se dividen por un complicado proceso de mitosis en el cual los cromosomas duplicados se condensan en estructu-

ras compactas y son separados por un elaborado aparato que contiene microtbulos (fig. 1-12). En los procariotes, el cromosoma no se condensa y tampoco hay aparato fusiforme. El DNA se duplica y las dos copias simplemente se separan por el crecimiento de una membrana celular interpuesta. Este mecanismo de divisin ms simple permite a las clulas procariotas proliferar a una velocidad mucho ms rpida que las clulas eucariotas; una poblacin de bacterias bien alimentada puede duplicar su nmero cada 20 a 40 minutos. Los procariotes en su mayor parte son microorganismos asexuados. Slo contienen una copia de su nico cromosoma y no cuentan con ningn proceso comparable a la meiosis, formacin de gameto o verdadera fertilizacin. Aunque no hay verdadera reproduccin sexual entre los procariotes, algunos son capaces de conjugacin, en la cual un fragmento de DNA pasa de una clula a otra (fig. 1-13). Sin embargo, la clula receptora casi nunca recibe un cromosoma completo del donador y la situacin en la cual la clula receptora contiene tanto su propio DNA como el de su pareja es fugaz. La clula pronto vuelve a la situacin en la cual posee un solo cromosoma. Aunque las clulas eucariotas poseen gran variedad de complejos mecanismos locomotores, los correspondientes a los procariotes son muy simples. El movimiento de una clula procariota se puede efectuar mediante un delgado filamento protenico denominado flagelo, que sobresale de la clula y posee movimientos de rotacin (fig. 1-14, a). Los giros del flagelo ejercen presin contra el lquido que lo rodea y como resultado la clula avanza hacia adelante. Ciertas clulas eucariotas, incluyendo muchos protistas y clulas espermticas, tambin poseen flagelos, pero la versin eucariota es mucho ms complicada que el simple filamento

- La divisin celular en los eucariotes requiere el ensamblado de un aparato especializado separador de cromosomas denominado huso mittico, construido principalmente de microtbulos cilindricos. En esta micrografa los microtbulos aparecen de color verde debido a que se unen especficamente a un anticuerpo relacionado con un colorante verde fluorescente. Los cromosomas,- que casi estaban separados en dos clulas hijas cuando se fij esta clula, estn teidos de azul. (Cortesa de Conhj L Rieder.)

12

CAPITULO 1 Introduccin al estudio de la biologa celular

,*

fo)

l/im

30 nm

1 pm

FIGURA 1-13. Conjugacin bacteriana. Micrografa electrnica que muestra bacterias "macho" y "hembra" unidas por una estructura procedente de la clula macho, denominada F pilus, a travs de la cual le pasa DNA a la hembra. (Cortesa de Charles C. Brinton.)

protenico de la bacteria y emplea mecanismos diferentes para generar movimiento (fig. 1-14, b). En los prrafos precedentes se mencionaron muchas de las diferencias ms importantes entre los niveles procariota y eucariota de organizacin celular. En los siguientes captulos ampliaremos muchos de esos puntos. Antes de calificar a los procariotes como "inferiores" hay que recordar que estos microorganismos han permanecido sobre la tierra durante ms de 3 000 millones de aos, y en este mismo instante millones de ellos se estn adhiriendo a la superficie externa de nuestro propio cuerpo y compartiendo los nutrientes en nuestro conducto digestivo. Tambin debemos considerar que metablicamente los procariotes son microorganismos muy especializados. Por ejemplo, una bacteria como Escherichia coli, habitante comn del conducto digestivo del ser humano y de las placas de cultivo en los laborato-

0.5 um

FIGURA 1-14. Diferencia entre flagelados procariotas y eucariotas. a) La bacteria Salmonella con sus numerosos flagelos. El recuadro muestra una vista muy amplificada de una parte del flagelo bacteriano nico, que consta principalmente de una sola protena denominada flagelina. b) Cada uno de estos espermatozoides humanos est provisto de movimientos ondulatorios efectuados con un solo flagelo. El recuadro muestra una seccin transversal del flagelo de un espermatozoide que revela una estructura compleja que consta de cientos de protenas diferentes, (a: Segn Bernard R. Gerber, Lewis M. Routledge y Shiro Takashima, J. Mol. Biol. 71:322, 1972, copyright: Academia Press, Inc.; recuadro cortesa de Julius Adler y M.L. DePamphilis; b: micrografia cortesa de David M.. Phillips/Visuals Unlimited, recuadro cortesa de Don W. Fawcett.)

CAPITULO 1 Introduccin al estudio de la biologa celular

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rios, tiene la capacidad de vivir y prosperar en un medio que slo contiene alguna fuente de carbono y nitrgeno y unos cuantos iones inorgnicos. Estas clulas bacterianas contienen todas las enzimas necesarias para convertir uno o dos compuestos orgnicos de bajo peso molecular en cientos de sustancias que la clula debe contener. Otras bacterias son capaces de vivir con una "dieta" a base de puras sustancias inorgnicas. Por lo contrario, incluso las clulas metablicamente mejor dotadas de nuestro cuerpo requieren gran variedad de compuestos orgnicos, incluyendo numerosas vitaminas y otras sustancias esenciales que no pueden elaborar por s mismas. En realidad, muchos de estos ingredientes dietticos esenciales son producidos por bacterias que normalmente viven en el intestino grueso. Tipos de clulas procariotas Segn los esquemas actuales de clasificacin, los procariotes se dividen en dos grupos principales o subreinos: las arqueobacterias y las eubacterias. Las arqueobacterias incluyen tres grupos de bacterias primitivas cuyos vnculos evolutivos entre s se manifiestan por la similitud en la secuencia de nucletidos de sus cidos nucleicos. Las arqueobacterias vivas estn representadas por los metangenos [bacterias capaces de convertir el C2 y el gas de 2 a gas metano (CH4)]; los halfilos (bacterias que viven en medios sumamente salinos, como el Mar Muerto o el Gran Lago Salado), y los termoacidfilos (bacterias que viven en manantiales calientes y muy cidos). Se piensa que las arqueobacterias incluyen a los parientes vivos ms cercanos de las primeras clulas que evolucionaron sobre la tierra. Todos los otros tipos de bacterias se clasifican en el subreino Eubacteria. Este subreino incluye la clula viva ms pequea, el micoplasma (0.2^01 de dimetro) que es tambin el nico procariote que carece de pared celular. Los procariotes ms complejos son las cianobacterias (antiguamente conocidas como algas azul verdosas debido a la espuma verde azulosa que pueden formar en la superficie de lagos y estanques). La cianobacterias contienen arreglos muy elaborados de membranas citopsmicas que sirven como sitios para la fotosntesis (fig. 1-15, a). Las membranas citopsmicas de las cianobacterias son muy similares a las membranas fotosintticas presentes en los cloroplastos de las clulas vegetales. Igual que las plantas y a diferencia de otras bacterias, en las cianobacterias la fotosntesis se efecta por desdoblamiento de molculas de agua que libera oxgeno molecular. Antes de la evolucin de las cianobacterias, hace unos 3 000 millones de aos, la atmsfera terrestre estaba prcticamente desprovista de oxgeno y la vida sobre la tierra slo consista de procariotes independientes de oxgeno (anaerobios). Como se describe en el captulo 2, el oxgeno molecular puede ser una sustancia sumamente txica. Conforme las cianobacterias se convirtieron en la forma dominante de vida, llenaron las aguas y la atmsfera de la tierra con el mortfero C>2, que empuj a la mayor parte de los otros microorganismos procariotes hacia habitat anaerobios remotos. La presencia de 2 en la atmsfera seleccion nuevos tipos de microorganismos que no slo

resistieron los efectos destructivos de este gas, sino que en realidad dependan del mismo para extraer su energa qumica. Muchas cianobacterias son capaces no slo de la fotosntesis, sino tambin de fijar nitrgeno, o sea, convertir el gas nitrgeno (Ni), de otro modo intil, en formas reducidas de nitrgeno (como el amonio, NHs) que las clulas pueden emplear para sintetizar compuestos orgnicos que contienen nitrgeno, incluyendo aminocidos y nucletidos. Las especies con capacidad de fotosntesis y de fijar nitrgeno pueden sobrevivir con los recursos, ms simples, como luz, N2, COo y H2. Por lo tanto, no es sorprendente

FIGURA 1-15. Cianobacteria. a) Micrografa electrnica de una cianobacteria que muestra la membrana ctoplsmica donde se efecta la fotosntesis. Estos apilamientos de membranas fotosintticas recuerdan los de las membranas tilacoides presentes dentro de cloroplastos de clulas vegetales, una caracterstica que apoya la hiptesis de que los cloroplastos evolucionaron a partir de cianobacterias simbiticas, b) Las cianobacterias que viven entre los pelos de los osos polares causan el color verdoso poco habitual de su pelaje, (a: Cortesa de C.C. Remsen, S.W. Watson, .B. Waterbury y H.S. Truper, en J. Bacteriol. 95:2374, 1968, b: cortesa de Zoological Society o/Sn. Diego.)

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CAPITULO 1 Introduccin al estudio de la biologa celular

que las cianobacterias de ordinario sean los primeros microorganismos en colonizar las rocas desnudas desprovistas de formas vivas gracias a la ardiente lava de una erupcin volcnica. En la figura 1-15, b, se lustra otro habitat poco comn ocupado por las cianobacterias. Tipos de clulas eucariotas: especializacin celular En muchos aspectos las clulas ms complejas no se encuentran en los grandes organismos vegetales o animales, sino ms bien en algunos de los microorganismos eucariotas ms pequeos, como los protozoarios ciliados que se muestran en la figura 1-16. Estas clulas son complejas debido a que una sola clula constituye un organismo unicelular (de una sola clula) completo. Todos los mecanismos necesarios para las complejas actividades en las cuales participan estos microorganismos, como percibir el ambiente, procurarse alimento, excretar el exceso de lquido, evadir a los depredadores, deben alojarse en los confines de una sola clula. La formacin de microorganismos unicelulares muy complejos representa una va de la evolucin. Otra va alterna fue la evolucin de microorganismos multicelulares en los cuales las diferentes actividades son efectuadas por diferentes tipos de clulas especializadas. Algunas de las ventajas de la divisin del trabajo entre las clulas se puede apreciar si se examina el ciclo de vida de uno de los eucariotes ms simples, el moho celular del fango, Dz'cfyostlium. Durante la mayor parte de su ciclo de vida, las clulas del moho del limo existen como amibas solitarias independientes que se arrastran sobre su sustrato. Cada clula es un organismo completo autosuficiente (fig. 1-17, a). Sin embargo, cuando el suministro de alimento escasea, aparece un nuevo tipo de actividad entre las clulas y se renen para formar un agregado llamado seudoplasmodio, o simplemente babosa (fig. 1-17, b), que se desplaza lentamente sobre el sustrato dejando un rastro de "limo o baba". Los organismos simples previamente aislados son ahora pequeas partes de un individuo multicelular mucho mayor. El examen del interior de la babosa revela que las clulas ya no son una poblacin homognea. Ms bien, las clulas situadas en el tercio anterior de la babosa (llamadas clulas precursoras del tallo) se pueden distinguir de las situadas en la seccin posterior (llamadas clulas precursoras de esporas) mediante variados criterios (fig. 1-17, b, recuadro). Si se espera un poco ms ocurren una serie de hechos espectaculares: el seudoplasmodio detiene su desplazamiento, gira sobre el sustrato (fig. 1-17, c) y luego se extiende hacia arriba, al aire, como el cuerpo de un fruto alargado (fig. 1-17, d). El cuerpo de este fruto est compuesto de un delgado tallo (derivado de las clulas precursoras del tallo) que apoya una masa redondeada de esporas encapsuladas latentes (derivados de clulas precursoras de esporas). Las clulas del tallo y de las esporas tienen una funcin muy diferente que requiere diversos tipos de especializacin citoplsmica. Las clulas del tallo suministran apoyo mecnico para sostener la masa de esporas arriba del sustrato, en tanto que las clulas de esporas estn destinadas a "dispersarse en el viento" y transformarse en

FIGURA 1-16. Vorticea, un protista complejo ciliado. Cierto nmero de individuos se juntan; la mayora han perdido sus "cabezas" debido al acortamiento de la banda contrctil en el tallo. (Carolina Biological Supply Co./Phototike.)

la siguiente generacin de amibas. El proceso mediante el cual una clula relativamente no especializada, como el moho amibiano del fango, se convierte en una clula altamente especializada, como las clulas del tallo o de las esporas, se denomina diferenciacin. Una clula amibiana del moho de! fango dispone de dos vas alternas de diferenciacin cuando entra en la etapa de agregacin. Por lo contrario, cuando el vulo de un vertebrado es fertilizado y avanza en su desarrollo embrionario tiene a su disposicin cientos de posibles vas de diferenciacin. Algunas clulas se convierten en parte de una glndula digestiva particular, otras en parte de un msculo esqueltico largo y otras en parte de un hueso (fig. 1-18). La va de diferenciacin que sigue cada clula embrionaria depende principalmente de las seales que recibe de su entorno, que a su vez dependen de la posicin de dicha clula dentro del embrin. Como resultado de la diferenciacin, distintos tipos de clulas adquieren un aspecto distintivo y contienen materia-

Clulas precursoras del tallo fa)

FIGURA 1-17. Ciclo de vida de un moho del fango, a) Amibas que se van agregando por desplazamiento hacia un centro comn. (Cortesa re John Ti/Ser Bor.ncr.) b) Despus de la agregacin, las clulas forman una masa (o seudoplasmodio) que se desplaza sobre el sustrato dejando un rastro de "fango" en su camino. Las clulas del extremo delantero de la masa (que se convertirn en clulas del tallo) se pueden distinguir de las clulas del extremo posterior (que se convertirn en clulas esporas). Como se muestra en el recuadro, las clulas precursoras de las esporas del extremo posterior de la masa incorporan 3 H-fucosa, un azcar marcado con istopos radiactivos que formarn parte de la cubierta de la espora, en tanto que las clulas precursoras del tallo carecen de esta actividad. La incorporacin de azcar radiactivo se manifiesta por la presencia de granos negros plateados sobre las clulas precursoras de esporas. (Cortesa de David Francis, recuadro por G. Karp.) c) La migracin de la masa cesa, se redondea y comienza a desprenderse del sustrato. Se observan las clulas que entraron a formar parte del tallo en el extremo superior. (Cortesa re Kennsth B. Rapa:) d) El frutal consiste en un tallo alargado que sostiene una masa de esporas en su extremo superior. Cada espora dar lugar a una amiba independiente que vuelve a iniciar el ciclo de vida. (Cortesa de ohn Tyler Bonner.)

(d)

les nicos. Las clulas del msculo esqueltico contienen una red de filamentos alineados con precisin y compuestos de protenas contrctiles peculiares; las clulas del cartlago se rodean de una matriz caracterstica que contiene polisacridos y la protena colgena, que juntos suministran apoyo mecnico; los eritrocitos se convierten en sacos de forma discoide llenos de una protena nica, !a hemoglobina, que transporta oxgeno, y as sucesivamente. Sin embargo, a pesar de sus muchas diferencias, las diversas clulas de una planta o animal multicelular estn formadas de organelos similares. Por ejemplo, se encuentran mitocondrias en prcticamente todos los tipos de clulas. No obstante, en un tipo pueden ser redondas en tanto que en otro a veces adoptan forma fibrilar muy alargada. De manera similar, las mitocondrias de una clula pueden estar dispersas por todo e! citoplasma, en tanto que en otra las clulas se concentran cerca de una superficie particular donde ocurre el transporte dependiente de energa. En cada caso, el nmero, aspecto

y ubicacin del organelo se puede correlacionar con las actividades del tipo de clula particular. Se puede establecer una analoga con las diferentes piezas que interpreta una orquesta: todas estn compuestas de las mismas notas, pero los diferentes arreglos confieren a cada una sus caractersticas y belleza nicas. El tamao de las clulas y de sus elementos La figura 1-19 muestra comparativamente el tamao relativo de algunas estructuras de inters en biologa celular. Casi todas las clulas son microscpicas; por lo tanto, las unidades ms comnmente empleadas en este libro corresponden a dimensiones lineales muy pequeas. De ordinario se emplean dos unidades de medida lineal para describir estructuras del interior de la clula: el micrmetro (/mi) y el nanmetro (nm). Un/m es igual a 10~6 metros y un nm

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CAPITULO 1 Introduccin al estudio de la biologa celular Clulas nerviosas

Tejido conectivo laxo con fibroblastos "1

Tejido seo con osteocitos

Msculo liso

Clulas grasas (adiposas)

Clulas del msculo estriado Clulas epiteliales del intestino FIGURA 1-18. Vas de diferenciacin celular. Se presentan unos pocos de los tipos de diferenciacin celular en el feto humano.

es igual a 10~9 metros. Aunque ya no se acepta formalmente en la nomenclatura mtrica, el angstrom (A), que es igual a un dcimo de nm, todava se emplea con frecuencia en biologa molecular para describir dimensiones atmicas. Un angstrom por lo general equivale al dimetro de un tomo de hidrgeno. Una molcula protenica globular tpica (como la mioglobina) tiene 4.5 nm x 3.5 nm X 2.5 mm y las protenas alargadas {como la colgena o la miosina) tienen ms de 100 nm de longitud, y el DNA tiene ms o menos 2.0 nm de ancho. Complejos de molculas grandes, como los ribosomas, microtbulos y microfilamentos, poseen dimetro entre 5 y 25 nm. Organelos ms grandes, como los ncleos (unos 10 m) o las mitocondrias (alrededor de 2 m) son ms fciles de definir en micrmetros.

El tamao de las bacterias tpicas vara entre 1 y 5//m de longitud, en tanto que las clulas eucariotas de ordinario tienen entre 10 y 30 /m. Hay bastantes razones para que las clulas sean tan pequeas. Consideremos las siguientes: Independientemente del tamao de la clula, el ncleo nico slo contiene dos copias de la mayor parte de los genes. Puesto que los genes actan como moldes para la produccin de RNA mensajeros transportadores de informacin, una clula slo puede producir un nmero limitado de RNA mensajeros en determinado tiempo. Cuanto mayor sea el volumen del citoplasma celular ms difcil ser sintetizar el nmero requerido de mensajes nucleares.

CAPITULO 1 Introduccin al estudio de la biologa celular

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Conforme el tamao de la clula se incrementa, la proporcin entre superficie/volumen disminuye.1 La capacidad de una clula para intercambiar sustancias en su ambiente es proporcional a la superficie. Si una clula crece ms de cierto tamao, su superficie no sera suficiente para captar sustancias (p. ej., oxgeno, nutrientes) necesarios, para apoyar sus actividades metablicas. Una clula depende en gran medida del movimiento al azar de las molculas (difusin). Por ejemplo, el oxgeno debe difundir desde la superficie de la clula a travs del citoplasma hasta el interior de las mitocondrias. Conforme la clula aumenta de tamao y la distancia de la superficie al interior tambin crece, el tiempo

requerido para que la difusin desplace las sustancias hacia adentro y hacia afuera de la clula metablicamente activa puede ser prohibitivamente prolongado. Las clulas que tienen dimensiones excepcionalmente grandes, como el huevo de avestruz y la clula nerviosa de la jirafa, en la figura 1-19, tienen propiedades poco habituales. El huevo del avestruz, y los huevos de muchos otros peces, reptiles y aves, en realidad contienen una cantidad muy pequea de protoplasma vivo que se sita por encima de una gran cantidad de yema inerte, empleada como nutriente para el embrin en desarrollo. Aunque la clula nerviosa de la jirafa y las clulas nerviosas de otros animales grandes pueden ser muy largas, su dimetro todava es microscpicamente pequeo.

Se puede comprobar esta afirmacin calculando rea y volumen de un cubo cuyas aristas sean de 1 cm de longitud en comparacin con otro cuyas aristas sean de 10 cm de longitud. La proporcin rea/ volumen del cubo ms pequeo es considerablemente mayor que la del cubo ms grande.
1

1-4 Virus
En los ltimos decenios del siglo XIX, el trabajo de Louis Pasteur y de otros investigadores convenci al mundo cientfico de que las enfermedades infecciosas de plantas y ani-

Clula nerviosa de jirafa

Yema de huevo de avestruz

Amiba

Clula humana

Ncleo de la clula heptica humana

Bacteria

Ribosotna

Poro nuclear

Membrana plasmtica

0.000,0000001 de metro 000000001 de metro 0.00000001 de metro 0.0000001 de metro 0.000001 de metro 0.00001 de metro 0.0001 de metro 0.001 de metro 0.01 de metro 0.1 de metro 1 metro 1.0 metro

10 metros

Disminucin en potencias de 10

10 metros

FIGURA 1 - L'*. Tamaos relativos de las clulas y de los componentes celulares. Cada unidad de medida es un dcimo mayor que la unidad precedente. Aunque el huevo completo de avestruz es tcnicamente una clula, la porcin viva slo se encuentra como un delgado disco microscpico situado sobre el borde de una gran masa inerte de yema de huevo.

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CAPITULO 1 Introduccin al estudio de la biologa celular Cubierta protenica de la capsmera Acido nucleico

males eran causadas por bacterias. Pero el estudio de la enfermedad del mosaico del tabaco y la fiebre aftosa del ganado pronto indicaron la existencia de otro tipo de agentes infecciosos. Por ejemplo, se observ que la savia de una planta de tabaco enferma era capaz de transmitir ia enfermedad del mosaico a una planta saludable, aun cuando la savia no demostr contener bacterias cuando se examin al microscopio de luz. Adems, la savia de una planta continuaba siendo infecciosa aun despus de pasar a travs de filtros cuyos poros eran tan pequeos que retardaban e! paso de las bacterias ms pequeas conocidas. Estudios adicionales demostraron que, a diferencia de las bacterias, el agente infeccioso no poda crecer en medios de cultivo a menos que tambin estuvieran presentes clulas vegetales vivas. Los investigadores concluyeron que ciertas enfermedades eran causadas por patgenos an ms pequeos y quiz ms simples que las bacterias ms pequeas. Estos patgenos recibieron el nombre de virus. En 1935, Wendell Stanley, del Instituto Rockefeller, public que el virus causante de la enfermedad del mosaico del tabaco se poda cristalizar y que los cristales eran infecciosos. Los cristales poseen una estructura interna regularmente repetitiva. Las sustancias que forman cristales tienen una estructura bien definida muy ordenada y son mucho menos complejas que las clulas ms simples. Stanley concluy errneamente que el virus del mosaico del tabaco (VMT) era una protena. En realidad, el VMT es una partcula en forma de bastoncillo que consta de una sola molcula de RNA rodeada por una cubierta helicoidal compuesta de subunidades de protena (fig. 1-20). Los virus causan docenas de enfermedades en el ser humano, incluyendo SIDA., poliomielitis, influenza, herpes labial, sarampin y unos pocos tipos de cncer (vase seccin 16-3). Los virus presentan una gran variedad de formas, tamaos y estructuras muy diferentes, pero todos comparten ciertas propiedades comunes. Todos los virus son parsitos intracelulares obligatorios, o sea, no pueden reproducirse a menos que se encuentren dentro de una clula husped, la cual, segn el virus especfico, puede ser una clula vegetal, animal o bacteriana. Fuera de una clula viva, el virus existe como partcula, o virin, que no es ms que un paquete de macromolculas. El virin contiene una pequea cantidad de material gentico que, segn el virus, puede ser RNA o DNA de cadena simple o doble. Es notable que algunos virus contienen escasos genes diferentes, tres o cuatro, pero otros pueden tener hasta varios cientos de ellos. Cuanto menor el nmero de genes ms depende el virus de las enzimas y de otras protenas codificadas por los genes de su clula husped. El material gentico del virin est rodeado por una cpsula protenica, o cpside, por lo general constituida por un nmero especfico de subunidades. Entre las ventajas de construir con subunidades una de las ms aparentes es economizar informacin gentica. Si la cubierta del virus est formada por muchas copias de una sola protena, como en el VMT, o de unas pocas protenas como las cubiertas de muchos otros virus, slo se necesita uno o unos cuantos genes para codificar las protenas de la cubierta. Muchos virus poseen una cpside cuyas subunidades se organizan en formas polidricas, una estructura con la-

Nucieocpside

(b)

50 nm

FIGURA 1-20. Virus del mosaico del tabaco (VMT). a) Diagrama de una porcin de la partcula del VMT. Las subunidades de protena en forma de bastn (capsmera) que son idnticas en toda la longitud de la partcula incluyen una sola molcula helicoidal de RNA. Se muestra el RNA que sobresale en el extremo donde se ha desprendido la protena. La cpside protenica con el RNA incluido se denomina nucleocpside. b) Micrografa electrnica de partculas del VMT luego de tratamiento con fenol para eliminar las subunidades de protena de la porcin media de la partcula de arriba y de los extremos de la partcula de abajo. Los bastones ntegros tienen unos 300 nm de longitud y 18 nm de dimetro, (b: Cortesa de M.K. Corbet.)

dos planos. Una forma polidrica particularmente comn en los virus es el icosaedro de 20 caras. Por ejemplo, e! adenovirus que provoca infecciones respiratorias en mamferos tiene una cpside icosadrica (fig. 1-21, a). En muchos virus de animales, incluyendo el virus de la inmitnodefciencia humana (HIV) causante del SIDA, la cpside protenica est rodeada por una cubierta externa que contiene lpidos derivados de la membrana plasmtica de la clula husped conforme las yemas virales se forman en la superficie de la clula husped (fig. 1-21, b). Integrada a la cubierta lpida se encuentran las protenas virales localizadas en la membrana plasmtica de la clula husped antes de la gemacin. Los virus de bacterias, o bacterifagos, son de los ms complejos (fig. 1-21, c). El bacterifago T (utilizado en experimentos clave que revelaron la estructura y propiedades del mate-

CAPITULO 1 Introduccin al estudio de la biologa celular

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rial gentico) consta de una cabeza polidrica que contiene DNA, un tallo cilindrico a travs del cual se inyecta DNA al interior de la clula bacteriana, y una cola de fibras que juntas dan a la partcula el aspecto de un mdulo que aterriza sobre la luna. Cada virus tiene sobre su superficie una protena capaz de enlazarse a un componente particular de la superficie de su clula husped. Por ejemplo, la protena que se proyecta desde a superficie de la partcula del HIV (marcada gp!20 en la figura 1-21, b, recibe ese nombre por glucoprotena con peso molecular de 120 000 daltons2) interacta con una protena sobre la superficie del leucocito humano, lo que facilita la entrada del virus al interior de su clula husped. Corno se analiza en el ensayo La perspectiva humana, la partcula gpl20 es la base de la primera generacin de vacunas anti SIDA que en la actualidad estn en prueba. La interaccin entre las protenas virales y las del husped determina la especificidad del virus, o sea, el tipo de clulas husped'a las cuales el virus puede penetrar e infec-

2 El Dalton equivale a una unidad de masa atmica, el peso de un solo tomo de hidrgeno ^H).

tar. Algunos virus tienen un conjunto muy limitado de posibles huspedes, slo tienen capacidad para infectar algunas clulas de ciertos huspedes. Esto es cierto, por ejemplo, para la mayor parte de los virus del resfriado comn que slo pueden infectar clulas epiteliales respiratorias del ser humano. Otros virus, como el de la rabia, pueden infectar a una variedad de diferentes especies de huspedes, incluyendo perros, murcilagos y el hombre. Los virones son agregados macromoleculares, partculas inanimadas que por s mismas son incapaces de reproducirse, efectuar actividades metablicas o cualquiera otra actividad relacionada con la vida. Por esta razn, no se considera organismos a los virus y no se describen corno "seres vivos". No obstante, una vez que se fijan a la superficie externa de un husped y pasan al interior de la membrana externa de la clula el virus contiene la informacin necesaria para alterar totalmente las acitividades de la clula husped. Hay dos tipos bsicos de infeccin viral: 1) En la mayor parte de los casos el virus detiene las actividades normales de sntesis en el husped y reorienta a la clula para emplear sus materiales disponibles en la elaboracin de cidos nucleicos y protenas virales, que se ensamblan para formar nuevos viriones. En otras palabras, los virus no crecen como

Protena gp120 de la cubierta

(a)

RNA

Cubierta protenica

Acido nucleico Transcriptasa inversa

Bicapa de lpidos

(c)

(b)

FIGURA 1-21. Diversidad de los virus. Estructuras de: a) un adenovirus, b) un virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), y c) un bacterifago T-homogneo.

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CAPITULO 1 ntroduccin al estudio de la biologa celular

clulas; se ensamblan directamente a partir de sus elementos para formar viriones de tamao maduro. Por ltimo, la clula infectada se rompe (lisis) y libera una nueva generacin de partculas virales capaces de infectar a las clulas vecinas. Un ejemplo de este tipo de infeccin ltica se muestra en el recuadro a la izquierda de la figura 1-22, a, y en la fotografa de la figura 1-22, b. 2) En otros casos, el virus infectante no provoca la muerte de la clula husped, sino en vez de ello introduce (integra) su DNA al DNA de los cromosomas de la clula husped. El DNA viral integrado se denomina provirus. Un provirus integrado puede tener varios tipos de efectos segn el tipo de virus y de clula husped. Por ejemplo:

Las clulas bacterianas que contienen un provirus se comportan normalmente en tanto no se expongan a algn tipo de estmulo, como la radiacin ultravioleta (UV) que activa al DNA viral "latente", lo que provoca la lisis celular y libera a la progenie viral. El virus lambda es un virus bacteriano capaz de integrar su DNA a los cromosomas de la clula del husped, como se indica en la figura 1-22, a, recuadro a la derecha. Algunas clulas animales que contienen un provirus producen una nueva progenie viral por gemacin en la superficie de la clula sin lisis de la clula infectada. El virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) acta de esta manera; una clula infectada puede permanecer

Virus unido a la superficie de la clula

DNA viral inyectado al interior de la clula El DNA viral permanece separado del cromosoma del husped El ONA viral se integra al cromosoma

del husped
como provirus

DNA degradado del husped y protenas virales y DNA sintetizado

Bacteria proliferante con provirus integrado

t
Ensamblado de las partculas virales

0.2 pm

Partculas virales liberadas cuando la clula es lisa

(?~) V/
VA LITIGA
VA LISOGENA

FIGURA 1-22. Infeccin con un virus, a) Cuando el virus bacteriano (bacterifago) lambda inyecta su DNA en una clula husped el resultado puede ser una de dos tipos de infeccin. La mayor parte de los agentes infecciosos siguen una va ltica ilustrada en el recuadro izquierdo, donde la clula bacteriana sirve como mquina para producir la progenie viral que se libera despus que la clula sufre lisis. En otros casos, el virus entra a una llamada va lisgena (recuadro derecho) en la cual el DNA del virus se integra a los cromosomas de la clula de! husped como un provirus reprimido. El provirus latente puede ser inducido a iniciar una infeccin ltica por diferentes tipos de estmulo, incluyendo radiacin por luz UV (indicado por la clula de color ms claro a la izquierda), b) Una ltima etapa de la infeccin de una clula bacteriana por un bacterifago, que muestra la acumulacin ordenada de numerosas partculas virales y la cubierta vaca del fago sobre la superficie celular, (b: Cortesa de onathan King y Erika Hartwig.)

(a)

CAPITULO 1 Introduccin al estudio de la biologa celular

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viva mientras acte como fbrica para producir nuevos vriones. Algunas clulas animales que contiene un provirus pierden el control de su propio crecimiento y divisin y se convierten en malignas. Este fenmeno se puede estudiar con facilidad en el laboratorio al infectar clulas cultivadas con el virus tumoral apropiado. Debido a su estructura sencilla, se podra concluir que los virus representan una forma primitiva de vida, tal vez similar a las que existieron sobre la tierra antes de la evolucin de las clulas procariotas. Sin embargo, cuando se considera que la "vida de los virus" depende por completo de las clulas que invade, es evidente que los virus no pudieron aparecer en el escenario antes que sus huspedes. Puesto que los virus comparten el mismo lenguaje gentico entre s y tambin con clulas procariotas y eucariotas, no pudieron originarse de manera independiente como forma primitiva despus que otras clulas haban evolucionado. Es rns razonable asumir que los virus representan una forma degenerada, o sea, derivada de un organismo ms complejo. Los virus al parecer evolucionaron a partir de pequeos fragmentos de cromosomas celulares capaces de mantener algn tipo de existencia autnoma dentro de las clulas. Con el tiempo, estos elementos genticos autnomos adquirieron una cubierta protenica y se convirtieron en agentes capaces de infectar a otras clulas. Considerando la tremenda diversidad de los virus es probable que diferentes grupos evolucionaran de manera independiente a partir de diferentes organismos celulares. Esta conclusin se corrobora por el hecho de que los genes presentes en cada grupo de virus son muy diferentes de los correspondientes a otros grupos, pero son similares a los genes que infectan dentro de la clula husped. El hecho de que los virus humanos utilicen las enzimas del husped para efectuar casi todas sus actividades metablicas hace muy difcil encontrar frmacos que impidan los pasos del ciclo viral sin daar al husped humano. Los virus no carecen de virtudes; puesto que la actividad de los genes virales imita a la de los genes del husped, los investigadores han utilizado por decenios a los virus

como herramientas para estudiar el mecanismo de duplicacin del DNA y la expresin de los genes en huspedes mucho ms complejos. Adems, en la actualidad los virus se emplean como medio para introducir genes extraos a las clulas humanas, tcnica que ser la base para el tratamiento de enfermedades humanas mediante genoterapia. Por ltimo, los virus que matan insectos en el futuro podrn desempear un papel cada vez mayor en la guerra contra plagas de insectos.

Viroides
En 1971, sorpresivamente se descubri que los virus no eran los tipos ms simples de agentes infecciosos. En aquel ao, T.O. Diener, del Departamento de Agricultura de Estados Unidos, comunic que la enfermedad por adelgazamiento de los tubrculos de la patata que produce patatas nudosas y agrietadas era causada por un agente infeccioso que consista en una molcula circular pequea de RNA desprovista totalmente de cubierta protenica. Diener denomin a este patgeno un viroide. El tamao del RNA de los viroides oscila entre 240 y 600 nucletidos aproximadamente, la dcima parte del tamao de los virus ms pequeos. No se ha demostrado que el RNA viroide desnudo codifique para alguna protena. Ms bien, cualquier actividad bioqumica en la cual participan los viroides se efecta utilizando protenas de la clula husped. Por ejemplo, para duplicarse dentro de una clula infectada el RNA viroide utiliza el RNA polimerasa II del husped, una enzima que normalmente transcribe el DNA del husped en RNA mensajero. Se cree que los viroides provocan enfermedades al intervenir en la va normal de expresin gentica de las clulas. Los efectos sobre las cosechas pueden ser graves; una enfermedad viroide llamada cadang-cadang devast las palmeras cocoteras en plantac ones de las Islas Filipinas y otro viroide provoc grandes estragos a la industria de los crisantemos en Estados Unidos. En el ensayo La va experimental se relata el descubrimiento de un tipo diferente de agente infeccioso aun ms simple que el viroide.

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CAPITULO 1 Introduccin a! estudio de la biologa celular

LA PERSPECTIVA

HUMANA

La bsqueda de una vacuna contra el SIDA

A la mitad del decenio de 1980 haba grandes esperanzas de desarrollar una vacuna para prevenir la infeccin con HIV, el virus causante del SIDA. La mayor parte de las vacunas contra enfermedades virales, como la poliomielitis, la viruela negra y el sarampin, contienen virus muertos ntegros o virus vivos atenuados (virus modificados que ya no son capaces de provocar infeccin grave). La inyeccin de estos virus inofensivos engaa al sistema inmunolgico del cuerpo para producir anticuerpos especficos y clulas de inmunidad que permanecen a la espera, listas para atacar al autntico virus causante de la enfermedad si logra penetrar al organismo. Una de las ventajas de utilizar virus vivos atenuados como parte de una vacuna es que se estimula a las vas humoral y celular del sistema inmunolgico. La inmunidad humoral es mediada por anticuerpos solubles disueltos en la sangre. Estos anticuerpos son sintetizados por clulas derivadas de linfocitos B. Por lo contrario, los infocitos T se encargan de la inmunidad mediada por clulas, clulas capaces de reconocer y destruir a las clulas del cuerpo infectadas por virus. Durante el decenio de 1980, prcticamente haba acuerdo unnime de que una vacuna contra el SIDA, dependiente de virus muertos o atenuados, era segura. A diferencia de la mayor parte de los virus infecciosos, el HIV integra su material gentico a los cromosomas del husped, donde permanece durante aos destruyendo gradualmente la salud de una persona. Toda vacuna contra el SIDA que contenga partculas virales tambin contiene RNA viral, el cual puede copiarse a DNA e intregrarse a los cromosomas celulares. Aun si pudiera alterarse el material gentico del virus de modo que no tuviera posibilidad de causar SIDA, tal vacuna an podra ser peligrosa porque la integracin de cualquier material gentico al DNA de una clula tiene el riesgo de convertirla en una clula cancerosa maligna. Haba acuerdo de que el camino ms seguro era desarrollar una vacuna a partir de la protena del virus proyectada hacia afuera de la cubierta viral. Esta protena de la cubierta, denominada gp!20 (fig. 1-21, b) es el componente de la partcula viral que se enlaza a la superficie externa de la clula husped antes de infectarla. La protena viral empleada para la vacuna tendra que elaborarse a partir de un gen sintetizado en el laboratorio. El gen se introducira a clulas de mamferos que pueden desarrollarse en gran cantidad en el laboratorio. Las clulas sometidas a procesos de ingeniera gentica produciran una gran cantidad de la protena que deba purificarse y emplearse para fabricar la vacuna. Se esperaba que la vacuna constituida por la protena de la cubierta del HIV obligara a la persona a sintetizar anticuerpos neutralizantes, o sea anticuerpos capaces de bloquear la entrada del virus a la clula y por lo tanto de prevenir que las personas expuestas al virus se infectaran. Una desventaja de la vacuna basada slo en la protena de la cubierta es que no se esperaba que estimulara la va del sistema inmunolgico mediada por clulas, la cual tal vez se necesitaba para destruir una clula que fuera infectada por el virus. Numerosas compaas en colaboracin con varas agencias gubernamentales alrededor del mundo produjeron vacunas a base de protenas de la cubierta del HIV. Las primeras dos fases de prueba clnica de una nueva vacuna estn diseadas para determinar si la vacuna es segura y capaz de inducir una respuesta inmunolgica. Aunque todas las vacunas parecieron seguras por no producir efectos colaterales aparentes en los individuos sometidos a la prueba, su xito para producir una respuesta de inmunidad fue variable. Por ltimo, se determin que las vacunas elaboradas por dos compaas, Genentech y Chiron/ Ciba-Geigy, inducen un nivel aceptable de anticuerpos en individuos vacunados durante un periodo razonable. De igual importancia, se demostr que estos anticuerpos in vitro evitan que el virus infecte clulas. Se programaron estudios en gran escala para iniciarlos en 1994 para probar la eficacia de la vacuna, esto es, si era capaz de prevenir la infeccin con HIV en miembros de poblaciones de alto riesgo. Pero hubo una serie de acontecimientos que cambiaron los planes. Se descubri que los anticuerpos producidos por las personas en respuesta a la vacuna no eran tan eficaces como se pens para prevenir la infeccin. Se haban llevado a cabo pruebas anteriores de actividad neutralizante empleando virus desarrollados en el laboratorio en lneas de clulas cultivadas. Cuando se probaron anticuerpos contra el virus aislados de personas infectadas con HIV mostraron ineficacia casi total para prevenir la infeccin de las clulas. A diferencia de casi todos los virus, el HIV puede mutar con rapidez y provocar cambios en la estructura de su cubierta protenica. Por lo tanto, los anticuerpos aparentemente fueron producidos contra una versin de la cubierta protenica presente en los virus de las clulas cultivadas, pero no del virus residente en la mayora de los individuos infectados. Este resultado produjo gran pesimismo en muchos investigadores respecto de que la vacuna fuera eficaz para prevenir la infec-

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cin por HIV en la poblacin general. Adems, era realmente difcil conseguir voluntarios para el estudio. No slo a un nmero significativo de voluntarios se les administrara vacuna placebo, y los que recibieran la verdadera vacuna en adelante tendran que ser positivos al HIV, debido a que la prueba para determinar el estado HIV depende de la presencia de anticuerpos para los cuales se dise la vacuna. Para empeorar las cosas, hubo informes de que al menos 10 individuos que haban participado en las primeros estudios diseados para determinar la seguridad y potencia inmunolgicas de la vacuna se haban infectado con el virus. Estas noticias confirmaron la idea cada vez ms extendida de que la vacuna no era lo suficientemente eficaz para justificar un estudio en gran escala en Estados Unidos. Por ltimo, se observ que normalmente un individuo infectado produce anticuerpos contra las protenas de la cubierta viral despus de unos cuantos meses de la infeccin, pero al parecer tienen poco valor para alterar el curso de la enfermedad. En junio de 1994, luego de considerar todos estos factores en conjunto, los National Institutes of Health tomaron la decisin de no seguir adelante con las pruebas en gran escala para probar la eficacia de vacunas basadas en gp!20 en Estados Unidos. Poco despus de esta decisin, la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) decidi proseguir las pruebas en una regin del mundo donde el riesgo de contraer SIDA es muy alto. Se estim que para el ao 2000 unos 40 millones de personas estarn infectadas con el HIV; ms de 90% de esos individuos vivirn en pases pobres del tercer mundo. La vacuna ya lista para probar se prepar contra protenas de la cubierta de la cepa B del HIV prevaleciente en Estados Unidos y Europa, pero no en el resto del mundo donde predominan otras cepas. Por lo tanto, los estudios de la OMS tendrn que esperar el desarrollo de una nueva vacuna basada en protenas de las cepas del HIV en-

dmicas en la regin del mundo dnde se efectuarn las pruebas. Mientras tanto, los inconvenientes que acompaan a la primera generacin de vacunas HIV, adems de la creencia general de que la biologa de la enfermedad es demasiado compleja para desmantelarla mediante una simple vacuna, llevaron a muchos investigadores del SIDA a reconsiderar la posibilidad de desarrollar una vacuna basada en virus vivo atenuado. Como se hizo notar antes, una de las ventajas de emplear virus atenuado es estimular ambas vas del sistema inmunolgico: la humoral y la mediada por clulas incrementando, por lo tanto, su probable eficacia. Aunque esta vacuna presenta una posibilidad finita de inducir cncer o de causar SIDA, ese riesgo est bastante bien equilibrado en una poblacin con probabilidad elevada de contraer la enfermedad. En la actualidad, varias compaas de biotecnologa estn trabajando sobre vacunas elaboradas con virus atenuados que muestran eficacia para prevenir la enfermedad en animales de laboratorio. Otro mtodo para inducir inmunidad es introducir el gen de la protena de la cubierta del HIV en el DNA de otro virus, por ejemplo el virus de la vacuna, y emplear el virus vivo as manipulado como agente inmunizante. Por ejemplo, el virus de la vacuna manipulado causara una infeccin leve y estimulara al cuerpo a producir anticuerpos y clulas inmunes contra la protena HIV generada durante la infeccin con el virus de la vacuna. Los investigadores del SIDA se muestran muy pesimistas acerca de la probabilidad de desarrollar una vacuna eficaz en el futuro cercano. Hay muchas razones para ese pesimismo, pero lo ms importante es que los investigadores todava no comprenden por completo cmo opera el virus dentro del cuerpo o por qu razn la respuesta inmunolgica normal es tan ineficaz contra la infeccin. Otra complicacin se origina en la capacidad del virus para rnutar con demasiada rapi-

dez, incluso mientras se est propagando dentro de un individuo infectado. Como resultado, un individuo infectado porta mltiples variantes del virus, cada una con diferentes propiedades. Estas diferencias se amplan cuando se examina la estructura del virus en los diferentes miembros de una poblacin (fig. PH 1-1). Puesto que una vacuna eficaz contra una cepa de virus puede ser totalmente intil contra otra cepa, el problema de desarrollar una cepa de virus para elaborar una vacuna eficaz contra todos es muy complicado. Otra forma alternativa para la prevencin y tratamiento del SIDA se analizar en La perspectiva humana del captulo 11.

FI<;iKA l'Il l - l . rbol filogentko del HIV. Las tres ramas de este rbol reflejan las diferencias en la estructura de las protenas del HIV en tres diferentes grupos de individuos infectados que viven en Amsterdam; stos son: adictos a drogas intravenosas (amarillo), homosexuales masculinos (verde) y hemoflicos (prpura). Las diferentes ramificaciones dentro de cada color ilustran el grado de variacin viral dentro de estas subpoblaciones holandesas. Para que una vacuna basada en protenas virales pueda ser til contra el HIV tiene que estar dirigida contra partes de la protena con el menor grado de variabilidad dentro de la poblacin. (Cortesa de nap Coudsmit.)

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CAPITULO 1 Introduccin al estudio de la biologa celular

LA VIA

EXPERIMENTAL

friones: solucin de un enigma mdico

En 1957, Carleton Gajdusek trabajaba como cientfico visitante en Australia estudiando gentica viral e inmunologa. Su inters en los problemas mdicos de las culturas nativas lo haba llevado a las cercanas de Nueva Guinea para lo que ) esperaba sera una visita breve antes de regresar a casa en Estados Unidos. Un par de das despus de su llegada a Nueva Guinea, Gajdusek habl con Vincent Zigas, mdico local, quien le habl acerca de una misteriosa enfermedad que causaba ms de la mitad de las muertes entre los pobladores de unas remotas montaas de la isla. Los nativos llamaban a la enfermedad kuru, que significaba "sacudidas o temblores", debido a que en las primeras etapas las vctimas presentaban temblores involuntarios. En los siguientes meses, las vctimas (principalmente mujeres y nios) evolucionaban pasando por etapas de debilidad creciente, demencia y parlisis, que finalmente les arrancaba la existencia. Gajdusek decidi abandonar sus planes de viaje y permanecer en Nueva Guinea para estudiar la enfermedad. Al escuchar los sntomas de la enfermedad, Gajdusek concluy que las personas de la regin probablemente sufran encefalitis viral epidmica. La enfermedad tal vez se propagaba entre la poblacin por la prctica ritual de comer ciertas partes del cuerpo de los parientes muertos. Como en las aldeas las mujeres eran quienes preparaban los cuerpos, tenan oportunidad de participar en esta forma de canibalismo y seran ellas las que estuvieran en mayor peligro de contraer la infeccin. En los meses subsecuentes, Gajdusek ayud a cuidar a los aldeanos enfermos en un hospital improvisado, efectu autopsias de los pacientes muertos y prepar muestras de tejidos y de lquidos para enviar a los laboratorios de Australia. En una de sus primeras cartas al exterior, Gajdusek escribi: "Tuvimos un paciente muerto de kuru y efectuamos autopsia completa. La practiqu a las 2:00 a.m. bajo el rugido de una tempestad en una choza nativa con la luz de una linterna; seccion el cerebro sin bistur."1 Los cortes del cerebro revelaron que las vctimas de kuru moran como resultado de un extenso proceso degenerativo en el cerebro. Se comenzaron a acumular pruebas de que el kuru no era una infeccin viral. Los pacientes muertos de Kuru no mostraban ninguno de los sntomas que normalmente acompaan a las infeciones del sistema nervioso central, como fiebre, inflamacin enceflica y cambios en la composicin del lquido cefalorraqudeo. Adems, los mejores laboratorios de virologa de Australia no pudieron cultivar agente infeccioso alguno en las muestras de tejido enfermo. Gajdusek empez a considerar explicaciones alternativas como causa del kuru. Haba la posibilidad de que los aldeanos muertos se hubieran expuesto a algn tipo de sustancia txica en su dieta. Se efectuaron anlisis de sangre con la esperanza de hallar concentraciones elevadas de metales, grasas o de otras toxinas comunes, pero no se encontr anomala clnica alguna. En este punto, Gajdusek pens que el kuru poda ser una enfermedad hereditaria, pero a partir de comentarios con los genetistas concluy que era muy improbable. Por ejemplo, para una enfermedad hereditaria sera prcticamente imposible lo siguiente: 1) una mortalidad tan elevada de origen al parecer reciente y que alcanzara una frecuencia tan alta en la poblacin; 2) que se manifestara en individuos de grupos de edad tan diversa, desde nios de corta edad hasta adultos de edad avanzada; 3) que afectara en igual nmero a hombres y a mujeres jvenes, pero que atacara a mujeres adultas en proporcin 13 veces mayor que a los hombres; 4) que ocurriera en una persona nacida en otra regin de la isla que se haba mudado a vivir a la poblacin afectada. No pareca haber una explicacin razonable de la causa del kuru. Gajdusek incluso consider la posibilidad de que el kuru era una enfermedad mental. "Puesto que en la etapa temprana de la enfermedad muchas cosas sugieren histeria..., no puedo desechar de mi mente la idea de la psicosis. Pero el parkinsonismo tpico avanzado y los trastornos de los ganglios bsales que por ltimo producen la muerte no se pueden vincular fcilmente con psicosis, a pesar del papel que esta enfermedad desempea en la brujera, los asesinatos, las guerras locales, etc." William Hadlow, veterinario patlogo estadounidense, haba trabajado sobre una enfermedad neurolgica degenerativa llamada "scrapie" (encefalitis espongiforme), comn en ovejas y cabras. En 1959, Hadlow visit una exposicin en Londres, auspiciada por una compaa farmacutica britnica, donde vio muestras de neuropatologa preparadas por Carleton Gajdusek de una persona muerta de kuru. Hadlow qued impresionado por el notable parecido entre las anomalas del cerebro de las vctimas de kuru y las observadas en cerebros de ovejas muertas por encefalitis espongiforme. Se saba que la encefalitis espongiforme era causada por un agente infeccioso; esto se haba demostrado por transmisin de la enfermedad a ovejas saludables inyectndoles extractos preparados de animales muertos. El agente causante del "scrapie" era capaz de atravesar filtros que retardaban el paso de bacterias y por esa razn se asumi que se trataba de un virus. Sin embargo, a diferencia de otras enfermedades virales, los sntomas del "scrapie" no aparecan sino despus de meses que el animal se haba infectado con el patgeno, por lo que se le dio el nombre de "virus lento", Hadlow concluy que el kuru y la encefalitis espongiforme eran causadas por el mismo tipo de agente infeccioso y public su especulacin en una carta a la revista mdica britnica Lancet.2 Luego de leer la carta publicada y de hablar con Hadlow, Gajdusek qued convencido de que su primera idea acerca del kuru como enfermedad infecciosa era correcta. Luego de varios aos de trabajo finalmente Gajdusek pudo demostrar que el kuru se transmita por extractos de tejido humano a primates de laboratorio.3 El periodo de incu-

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bacin entre la inoculacin de los animales y la aparicin de los sntomas de la enfermedad era de casi dos aos. El kuru vino a ser as la primera enfermedad humana en la cual se demostr que la causa era un virus lento. Varios aos antes, Igor Klatzo, perspicaz neuropatiogo de los National Institutes of Health (NIH) haba dicho a Gajdusek que una rara enfermedad hereditaria llamada enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ) produca anomalas en el cerebro que recordaban las del kuru. Tres aos despus de haber confirmado que el kuru poda transmitirse del hombre a los animales, Gajdusek y sus colaboradores demostraron mediante extractos preparados por biopsia del cerebro de una persona muerta por ECJ que sta poda transmitirse a los animales.4 Tambin haba varios casos comprobados en los cuales la ECJ era transmitida de un ser humano a otro durante procedimientos quirrgicos, como trasplante de crnea, o en extractos de hormona de crecimiento preparada a partir de glndula hipfisis de cadveres. Cmo se poda vincular una enfermedad hereditaria, como la de Creutzfeldt-Jacob, con la presencia de un agente infeccioso? La respuesta a esta pregunta se ha revelado en los ltimos 15 aos, principalmente a travs del trabajo de Stanley Prusiner y sus colegas de la Universidad de Californa, en San Francisco. Prusiner comenz estudiando las propiedades del agente causal de la encefalitis espongiforme y pronto lleg a dos conclusiones muy estimulantes.5 Primero, el agente era muy pequeo, mucho ms pequeo que cualquier virus conocido, con peso molecular total de 27 000 a 30 000 daltons. Segundo, al parecer el agente careca de un cido nucleico entre sus elementos y estaba compuesto exclusivamente de protenas. Esta segunda conclusin se basaba en el tratamiento exhaustivo de extractos de cerebros infectados con enzimas y otras sustancias capaces de digerir o destruir protenas o cidos nucleicos. El tratamiento con enzimas destructoras de protenas, como enzimas proteolticas o fenol, produca extractos inofensivos, en tanto que el tratamiento con agentes destructores de cidos nucleicos, incluyendo diferentes tipos de nucleasas y radiacin ultravioleta, no mostraba efecto alguno sobre la infecciosidad. La resistencia del agente de la encefalitis espongiforme a la radiacin ultravioleta en comparacin con la de los virus se muestra en el cuadro VE 1-1. Prusiner llam al agente causal de la encefalitis espongiforme, y presumiblemente tambin del kuru y de la ECJ, un prin, derivado de partcula proteincea infecciosa. La idea de un patgeno infeccioso constituido exclusivamente de protenas fue vista con gran escepticismo, pero estudios subsecuentes de Prusiner y otros no han demostrado manera alguna de modificar la conclusin original. En 1985 se demostr que la protena prin es codificada por un gen situado dentro de los propios cromosomas de la clula.6 El gen se expresa en el tejido cerebral normal y codifica una protena de 254 aminocidos designada PrPc (por protena prin celular), cuya funcin an se desconoce. Una forma modificada de la protena (designada PrP^, por protena prin scrapie) se encuentra en el cerebro de animales con "scrapie". A diferencia de la PrPc normal, la versin modificada de la protena se acumula dentro de las clulas nerviosas formando agregados que aparentemente matan a la clulas. La PrP^ no slo provo-

ca los cambios degenerativos caractersticos del scrapie en el cerebro, sino tambin se presume que es el agente infeccioso capaz de transmitir la enfermedad de un animal a otro. Luego que se descubri que el scrapie poda ser resultado de la modificacin del producto de un gen normal, fue posible explicar cmo una enfermedad gentica, como la de Creutzfeldt-Jacob, poda transmitirse de un individuo a otro. Casi todos los genes presentes en el ser humano tambin lo estn en otros mamferos, y por lo tanto hay una versin humana del PrP. Presumiblemente, si este gen humano sufre algn tipo de mutacin, producira una protena PrP50 anloga a la protena modificada de la oveja en cuanto a su actividad. Como es de esperarse, el anlisis del DNA aislado de cierto nmero de pacientes humanos con ECJ revel a presencia de mutaciones especficas en el gen que codifica PrP (fig. VE l-l).7 En los ltimos aos, el anlisis gentico de la susceptibilidad a enfermedades causadas por priones depende de ratones sometidos a procesos particulares de ingeniera gentica. Se han desarrollado dos tipos de ratones modificados: unos que carecen por completo del gen PrP (a los cuales se denomina ratones "sin sentido" carentes de PrP) y otros que contienen una o ms copias de la forma mutada del gen PrP humano (a los que se les da el nombre de ratones transgnicos PrP). Puesto que la protena PrP se produce normalmente en el cerebro (y otros rganos de los ratones), podra esperarse que la ausencia del gen causara consecuencias terribles con desarrollo de la conducta de ratones carentes de PrP. Sin embargo, a pesar de esta expectativa los ratones que carecen del gen PrP no muestran los efectos de la enfermedad.8 Hay varias explicaciones razonables para este resultado, incluyendo la posibilidad de que la funcin normal de la protena PrP sea sustituida por otra protena producida por un gen relacionado; en otras palabras, el ratn tiene un sistema "de respaldo" que puede dispensar la protena PrP. De cualquier manera, los ratones que carecen del gen PrP y por lo tanto no pueden sintetizar protena PrPc, no desarrollan el scrapie cuando se inyectan en su cerebro priones de ratones con scrapie (fig. VE 1-2).9 As pues, para que un ratn sea susceptible a la enfermedad, el
CUADRO VE 1-!. Inactivacin de agentes infecciosos pequeos por radiacin UV a 254 nm Ejemplo Bacterifago T2 Bacterifago S13 Bacterifago 3>X174 Virus del sarcoma de Rous Poliornavirus Virus de la leucemia de Friend Virus de la leucemia murina Viroide de los tubrculos fusiformes de la patata Agente del "scrapie" (encefalitis espongiforme)

D37 4 20 20 150 240 500 1400 5000 42000

* Dj? es la dosis de radiacin que permite una supervivencia de 37 por ciento. Reimpreso, con permiso, segn S.B. Prusiner, Science 26:140,1982. Copyright 1982 American Association for the Advancement of Science.

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CAPITULO! Introduccin a estudio de la biologa celular

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FIGURA VE 1-1. Esta figura muestra la fotografa de un gel en el cual e! DNA del gen PrP de algunas personas diferentes se trat con una enzima (llamada BsmAl), que desdobla el DNA en cualquier punto donde encuentra una secuencia particular de nucletidos. Luego de incubar el DNA con la enzima, el gel es sometido a electroforesis, que separa todos los segmentos presentes en la mezcla de reac-. cin. Las marcas en la parte de arriba indican los individuos de los cuales se obtuvo el DNA y los nmeros a la derecha indican la longitud de los fragmentos de DNA (expresada en pares de bases) visibles dentro del gel. {El DNA se hace visible incubando el gel con un DNA unido a un colorante fluorescente.) La va indicada por C muestra el DNA de un individuo saludable, las siguientes tres vas (marcadas KO-S, KO-B y JU) muestran el DNA de pacientes con ECJ miembros de familias en las cuales la enfermedad es comn. Las dos ltimas vas muestran el DNA de dos pacientes con casos espordicos de ECJ, o sea, casos donde no hay muestras de la enfermedad en otros miembros de la familia. Cuando el DNA del gen PrP de cada uno de los pacientes con ECJ se trata con la enzima, se observa que la mitad del DNA es resistente a la enzima. Esta resistencia est indicada por la presencia de fragmentos de DNA ms largos, 803 pares de bases. Por lo contrario, todo el DNA PrP de la persona saludable es desdoblado por la enzima segn se manifiesta por la ausencia de los 803 fragmentos de pares de bases. En lugar de eso, este segmento de DNA se fragmenta en dos pedazos, uno de 621 pares de bases y el otro de 182 pares de bases de longitud. La mitad del PrP DNA (que representa un alelo) de los pacientes con ECJ no es fragmentada por la enzima debido a que su secuencia de nucletidos cambi por una mutacin. El alelo mutado ya no contiene la secuencia que la enzima reconoce como un sitio potencial de fragmentacin. Todos estos pacientes con ECJ tienen la misma mutacin: un cambio del nucletido G a nucletido A en el codn 200 que provoca un cambio de glutamina a Usina en la protena codificada. ste cambio en la secuencia de aminocidos causa la enfermedad. (Cortesa de Lev Goldfarb.)

FIGURA VE 1-2. a) Aspecto microscpico de la porcin talmica del cerebro de un ratn afectado de encefalitis espongiforme como resultado de la inoculacin previa con prionss de "scrapie". El tejido cerebral muestra degeneracin espongiforme, b) Aspecto de una porcin correspondiente del cerebro de un ratn manipulado genticamente que carece del gen PrP normal. Igual que el ratn en a, este ratn tambin fue inyectado con priones de "scrapie" 20 semanas antes, pero debido a que carece de) gen PrP y por lo tanto no tiene capacidad para producir la protena PrP, no es susceptible al agente infeccioso y su tejido cerebral aparece normal. (Cortesa de Adriano Aguzzi y C. Weissmann.)

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animal debe ser capaz de producir la protena PrP en sus propios genes; no es suficiente que se introduzca en su cuerpo la protena anormal. Estos datos apoyan la hiptesis de que la protena PrP es indispensable para la propagacin del prin durante la infeccin. Como se hizo notar antes, tambin se han efectuado estudios empleando ratones transgnicos; o sea, ratones sometidos a ingeniera gentica para que sean portadores de genes extraos entre sus cromosomas. Cuando se transfiere a los ratones un gen PrP humano mutado, los animales transgnicos desarrollan el mismo tipo de enfermedad cerebral neuropatolgica como la observada en el hombre.10 Este experimento demuestra que la presencia de un solo gen mutado, que codifica una sola protena anormal, es suficiente para causar todos los sntomas que acompaan a la devastadora enfermedad neurolgica.
PREGUNTAS SIN RESPUESTA

protena normalmente existe en la forma PrPc. Sin embargo, en el ser humano o los animales que desarrollan enfermedades prin se favorece la formacin de la estructura PrP50 y se acumula la protena anormal. En el caso de enfermedades infecciosas por prin, como el kuru o el scrapie, Prusiner sugiere que la duplicacin se inicia cuando una versin scrapie de la protena PrP se une a la protena PrP normal (o una versin no desplegada de la protena), que transforma la protena normal en la forma modificada.13 Por lo tanto, si una molcula PrP^ se une a una PrPc, este hecho generara dos molculas PrP50 que podran entonces enlazarse a dos molculas ms de PrPc produciendo cuatro molculas PrP50, y as sucesivamente. Aunque las enfermedades prin son muy raras, otros trastornos degenerativos nerviosos, como las enfermedades de Alzheimer y de Parkinson, son muy comunes. Se espera que el estudio de las enfermedades prin ser til para entender la base de padecimientos humanos ms comunes.
BIBLIOGRAFA 1. Farquhar, J. y Gajdusek, D.C. 1981. Kuru. Raven Press. 2. Hadlow, W.J. 1959. Scrapie and kuru. Lancet 2:289-290. 3. Gajdusek, D.C. y cois. 1966. Experimental transmission of a kuru like syndrome to chimpanzees. Naiure 209:794-796. 4. Gibbs, C.J. Jr. y cois. 1968. Creutzfeld-Jakob disease (spongiform encephalopathy): Transmission to the chimpanzee. Science 161: 388-389. 5. Prusiner, S.B. 1982. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science 216:136-144. 6. Oesch, B. y cois. 1985. A cellular gene encodes scrapie PrP 27-39 protein. Cell 40:735-746. 7. Goldfarb, L.G. 1990. Identical mutations in unrelated patients with Creutzfeldt-Jakob disease. Lancet 336:174-175. 8. Beler, H. y cois. 1992. Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein. Nature 336: 577-582. 9. Beler, H. y cois. 1993. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell 73:1339-1347 (updated in Cell 77:967-968.) 10. Hsiao, K.K. y cois. 1990. Spdntaneous neurodegeneration in transgenic mice with mutant prin protein of Gerstmann-Straussler syndrome. Science 250:1587-1590. 11. Hsiao, K.K. y cois. 1994. Serial transmission in rodents of neurodegeneration from transgenic mice expressing mutant prin protein. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 91:9126-9130. 12. Pan, K.M. y cois. 1993. Conversin of alpha-helices into betasheets features in the formation of the scrapie prin proteins. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 90:10962-10966. 13. Cohn, F.E. y cois. 1994. Stmctural clues to prin replication. Science 264:530-531.

Todava est sujeta a controversia la idea de que un agente formado por una sola protena puede provocar una enfermedad infecciosa. Algunos bilogos opinan que la protena prin se acompaa de pequeos fragmentos de un cido nucleico todava por descubrirse; otros piensan que la protena prin hace que el individuo sea susceptible a la infeccin por un segundo agente, por ejemplo, un virus que realmente causa la enfermedad. El desarrollo de la enfermedad en los ratones transgnicos por un gen mutante que codifica la protena prin es un argumento para que la protena sea la nica causa, pero este dato reforzara mucho la hiptesis si se pudiera demostrar que los extractos de cerebro de ratones transgnicos pueden transmitir la enfermedad a ratones normales no transgnicos. En la actualidad, los intentos para transmitir la enfermedad de esta manera slo han tenido xito limitado y el asunto todava permanece confuso.11 Otro tema que permanece sin respuesta es el mecanismo mediante el cual el agente infeccioso incrementa su nmero (duplicacin) dentro de un individuo infectado, como claramente ocurre, En general, slo se atribuye duplicacin a los cidos nucleicos. Cmo es posible que una protena produzca ms de s misma? Esta pregunta sin respuesta todava es uno de los principales "puntos dbiles" en el concepto ntegro de los priones como agentes infecciosos. Prusiner y sus colegas han reunido pruebas que sugieren que las dos versiones de la protena PrP, PrPc y PrP*, difieren en su estructura tridimensional (conformacin). En otras palabras, la misma protena puede existir en dos formas diferentes.12 Segn esta hiptesis, la

SINOPSIS
La teora celular tiene tres dogmas. 1) Todos los organismos se componen de una o ms clulas; 2) la clula es la unidad de organizacin bsica de la vida, y 3) todas las clulas se originan de clulas previas (p. 2). Las caractersticas de la vida, segn se manifiestan en las clulas, se pueden describir mediante un conjunto de propiedades. Las clulas son muy complejas, su estructura est altamente organizada y es predecibte. La informacin para construir una clula est codificada en sus genes. Las clulas se reproducen por divisin celular; el suministro de energa para sus actividades proviene de la energa qumica; ejecutan reacciones qumicas controladas por enzimas; participan en un gran nmero de actividades mecnicas; responden a estmulos, y son capaces de un notable nivel de autorregulacin

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CAPITULO 1 Introduccin al estudio de la biologa celular

Las clulas pueden ser procariotas o eucariotas. Las clulas procariotas slo se encuentran entre las bacterias, en tanto que todos los otros tipos de organismos, protistas, hongos, plantas y animales, estn compuestos de clulas eucariotas. Las clulas procariotas y las eucariotas comparten muchas caractersticas comunes, incluyendo una membrana celular similar, un sistema comn para almacenar y utilizar informacin gentica y vas metablicas similares. Las clulas procariotas son el tipo ms simple, carecen de organelos membranosos complejos (p. ej., retculo endoplsmico, complejo de Golgi, mitocondras y cloroplastos), cromosomas y estructuras citoesquelticas caractersticas de las clulas eucariotas. Los dos tipos de clulas tambin se pueden distinguir por sus mecanismos de divisin celular, sus estructuras locomotoras y el tipo de pared celular que producen {en caso de que hubiera alguna pared celular) (p. 7). Los organismos eucariotes multicelulares se componen de clulas especializadas en diferentes actividades. Las clulas del moho del fango son un sistema til para estudiar la diferenciacin celular debido a que su etapa multicelular consta de slo dos tipos bsicos de clulas: las que producen el tallo del cuerpo frutal y las que producen las esporas. Por lo contrario, la mayor parte de las plantas y animales constan de docenas de diferentes tipos de clulas, cada una de las cuales tiene su propia estructura y funcin distinta Casi todas las clulas siempre son de tamao microscpico. Las clulas bacterianas tpicamente son de uno a 5//m de lon-

gitud, en tanto que las clulas eucariotas en condiciones tpicas son de 10 a 30um. Las clulas son de tamao microscpico por algunas razones: su ncleo posee un nmero limitado de copias de cada gen, la superficie (que sirve como rea de intercambio entre la clula) se convierte en un factor limitante a medida que la clula aumenta de tamao y la distancia entre la superficie de la clula y su interior tambin sera demasiado grande para que la clula satisfaga sus necesidades mediante simple difusin :p. 15 >. Los virus son patgenos no celulares que slo pueden reproducirse cuando estn presentes dentro de una clula viva. Fuera de la clula, el virus existe como un paquete de macromolculas, o virin. Los viriones presentan gran variedad de formas y tamaos, pero todos ellos constan de cido nucleico viral encerrado en una cubierta que contiene protenas virales. Las infecciones virales pueden producir: 1) destruccin de la clula husped con produccin acompaante de cepas virales, o 2) integracin del cido nucleico viral al DNA de la clula husped que con frecuencia altera las actividades de dicha clula. Los virus no son una forma primitiva de vida, sino ms bien han evolucionado secundariamente a partir de fragmentos de cromosomas celulares (p- Los viroides y priones son patgenos que se cree contienen slo RNA y protena, respectivamente. Los viroides causan cierto nmero de enfermedades en las plantas, en tanto que los priones producen enfermedades neurolgicas mortales en el ser humano y otros mamferos i,< ! . 21).

PREGUNTAS DE REPASO
1. Cules son las propiedades fundamentales que comparten todas las clulas? Describir la importancia de cada una de estas propiedades. 2. Describir algunas de las caractersticas de las clulas que sugieren que todos los organismos vivos se derivan de un ancestro comn. 3. Cul es la fuente de energa que apoya la vida sobre la tierra? Como se pasa la energa de un organismo al siguiente? 4. Comparar las clulas procariotas y las eucariotas segn diferencias estructurales, funcionales y metablicas. 5. Cul es la importancia de la diferenciacin celular? 6. Por qu casi todas las clulas siempre son microscpicas? 7. Qu propiedades distinguen a un virus de una bacteria? 8. Por qu se piensa que los virus evolucionaron a partir de formas de vida celular en vez de lo inverso? 9. Si una mitocondria tiene 2 ftm de longitud, cuntos angstroms tendra?, cuntos nanmetros?, cuntos milmetros? 10. Comparar y contrastar: nuclotido y ncleo; flagelo de una bacteria y de un espermatozoide; miembros del subreino Archaeobacteria y una cianobacteria; clulas precursoras de esporas y precursoras del tallo de una clula del moho del fango; fijacin de nitrgeno y fotosntesis; bacterifagos y virus del mosaico del tabaco; provirus y virin; viroides y priones.

PREGUNTAS ANALTICAS
1. Considere alguna pregunta acerca de la estructura o la funcin de las clulas que le interese responder. Los datos requeridos para responder la pregunta seran ms fciles de recolectar trabajando en un animal o en una planta ntegros o en una poblacin de clulas cultivadas? Cules seran las ventajas y desventajas de trabajar en un organismo ntegro en comparacin con un cultivo de clulas? 2. La figura 1-3 muestra una clula epitelial del intestino con numerosas microvellosidades. Cul es la ventaja del organismo de poseer estas microvellosidades? Qu se esperara que le ocurriera a un individuo que carezca de dichas microvellosidades como resultado de una mutacin hereditaria? 3. Las primeras clulas humanas que se cultivaron con xito se derivaron de un tumor maligno Cree usted que esto slo refleja la disponibilidad de clulas cancerosas, o que estas clulas son mejores sujetos para cultivo celular? Por qu? 4. Los esquemas de las clulas vegetales y animales de la figura 1-9, b,c, indican ciertas estructuras presentes en las

CAPITULO 1 Introduccin al estudio de la biologa celular

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clulas vegetales pero ausentes en las animales. Cmo piensa usted que afecta la vida de la planta cada una de estas estructuras? 5. Habr usted notado que las clulas poseen receptores sobre su superficie que les permiten responder a estmulos especficos. Muchas clulas del cuerpo humano tienen receptores que les permiten enlazar hormonas especficas que circulan en la sangre. Por qu cree usted que estos receptores hormonales son importantes? Cul sera el efecto sobre las actividades fisiolgicas del cuerpo si las clulas carecieran de estos receptores, o si todas las clulas tuvieran los mismos receptores? 6. Hans Driesch no fue el primero en comprobar la potencialidad de una de las dos primeras clulas de un embrin. Unos pocos aos antes, el embrilogo alemn Wilhelrn Roux mat una de las primeras dos clulas de un huevo de rana con una aguja caliente y luego observ el destino de la clula viva. Not que la clula se desarroll en lo que prcticamente era la mitad de un embrin. Cree usted que estos experimentos indican que los mecanismos que gobiernan el desarrollo de las ranas son fundamentalmente diferentes de los que gobiernan el desarrollo de los erizos de mar? Hay alguna manera de reconciliar estos dos experimentos segn la forma en que se efectuaron? 7. Si asumimos que las actividades dentro de las clulas ocurren de manera anloga a la demostrada en la caricatura de

Rube Goldberg en la figura 1-8, en qu difieren de una actividad humana, como construir un carro en una lnea de ensamblado o encestar un tiro libre en un juego de baloncesto? 8. A diferencia de las clulas bacterianas, el ncleo de una clula eucariota est rodeado de una membrana de doble capa tachonada con poros complejos. Cmo piensa usted que esto pueda afectar al trfico entre el DNA y el citoplasma de una clula eucariota en comparacin con una clula procariota? 9. Examinar la fotografa del protozoario ciliado de la figura 1-16 y considerar algunas de las actividades en las cuales participa esta clula y en las cuales no participa una clula muscular o una nerviosa de su propio cuerpo. 10. Qu tipo de clulas pensara usted que alcanzaran el mayor volumen: una clula muy aplanada o una esfrica? Por qu? 11. Observe la estructura del adenovirus y del HIV esquematizada en la figura 1-21. Piensa usted que sera ms fcil desarrollar una vacuna utilizando la cubierta protenica del adenovirus en comparacin con la protena gp!20 del HIV? Por qu s o por qu no? 12. Si usted tuviera que argumentar acerca de que los virus son organismos vivos, qu caractersticas estructurales y funcionales del virus podra utilizar para apoyar su argumentacin?

BIBLIOGRAFA
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CAPITULO

Bases qumicas de la vida

2-1 Enlaces covalentes La perspectiva humana: Radicales libres como causa de envejecimiento y enfermedad Enlaces no covalentes 2-5 Cuatro familias de molculas biolgicas 2-6 Formacin de estructuras macromoleculares complejas La va experimental: Construccin de la estructura de una protena

cidos, bases y amortiguadores

Naturaleza de las molculas biolgicas

2-A. Complejo formado por dos macromolculas diferentes. Una parte de la molcula de DNA (mostrada en azul) se une para formar un complejo a una protena que consta de dos subunidades de polipptidos, una roja y la otra amarilla. Las partes de la proteina que se observan dentro de los surcos del DNA han reconocido una secuencia especfica de nucletidos en la molcula del cido nucleico y se enlazan a ella. (Cortesa de A.R. FerrD'Amar y Stephen K. Burley, Tie Rockefeller University.)

ste captulo se inicia con una breve exposicin de las bases atmicas de la materia, un tema que puede parecer fuera de lugar en un libro de texto de biologa. Pero el nivel de organizacin celular slo es un pequeo avance despus del nivel atmico, como veremos al examinar la importancia de los movimientos de algunos tomos de las molculas durante actividades como contraccin muscular o transporte de sustancias a travs de membranas celulares. Las actividades de-las clulas y sus organelos se derivan directamente de la actividad de las molculas que las constituyen. Consideremos un proceso como la divisin celular, que puede seguirse en sus detalles ms minuciosos bajo el simple microscopio de luz. Para entender las actividades que tienen lugar cuando una clula se divide es necesario conocer, por ejemplo, algo acerca de las interacciones entre DNA y molculas de protena cuyo resultado es la condensacin de los cromosomas en paquetes con forma de bastoncillos que pueden ser separados en clulas diferentes; la construccin molecular de microtbulos que contienen protenas que permite a estas estructuras en forma de bastoncillos huecos desensamblarse en determinado momento y volverse a ensamblar en el siguiente instante en un sitio por completo diferente de la clula; y las propiedades de las molculas de lpidos que confieren a la membrana celular externa su plasticidad, de modo que pueda ser empujada a la mitad de la clula y seccionarla en dos. Es imposible incluso tratar de entender la fisiologa celular bsica sin un conocimiento razonable de la estructura y las propiedades de los principales tipos de molculas biolgicas. Este es el objetivo del presente captulo: suministrar la informacin necesaria acerca de la qumica de la vida para que el lector comprenda las bases de la vida. Iniciaremos considerando los tipos de enlaces que pueden formar los tomos entre s.

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CAPITULO 2 Bases qumicas de la vida

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2-1 Enlaces covalentes

Los tomos que constituyen una molcula se mantienen unidos por enlaces covalentes, en los cuales los pares de tomos comparten pares de electrones. La formacin de un enlace covalente entre dos tomos obedece el principio fundamental de que un tomo es ms estable cuando su capa electrnica ms externa est completa. Por consiguiente, el nmero de enlaces que un tomo puede formar depende del nmero de electrones necesarios para completar dicha capa externa. En la figura 2-1 se muestra la estructura electrnica de algunos tomos. La capa exterior (nica) de los

tomos de hidrgeno o de helio se llena cuando contiene dos electrones; la capa externa de los otros tomos de la figura 2-1 se llena cuando contiene 8 electrones. As, un tomo de oxgeno con seis electrones en su capa externa puede llenar esta capa combinndose con dos tomos de hidrgeno para formar una molcula de agua. Los tomos de oxgeno y de hidrgeno se unen mediante un enlace covalente simple (representado por H:O o HO). En la formacin de un enlace covalente se libera energa que posteriormente debe reabsorberse cuando se rompe el enlace. La energa requerida para desdoblar los enlaces covalentes CH, CC o CO es muy grande, en general entre 80 y

Primera capa de electrones

O.
, ^L7 F i

Segunda capa de electrones

4-18

Na Tercera capa de electrones

Si

Cl

Ar

+4 +2 -1-1 EN CADA COLUMNA SE PRESENTAN LOS ELECTRONES NECESARIOS PARA QUE LOS TOMOS ALCANCEN ESTABILIDAD

T
Elementos inertes

FIGURA 2-1. Representacin de la disposicin de los electrones en algunos tomos comunes. Los electrones rodean al ncleo de un tomo formando una "nube" u orbitales, generalmente definidos por sus lmites, los cuales pueden tener forma esfrica o de mancuerna. Cada orbital contiene un mximo de dos electrones y por esa razn los electrones se agrupan en pares (puntos oscuros en la figura). La capa ms interna contiene un solo orbital {por lo tanto, dos electrones); la segunda capa contiene cuatro orbitales {por lo tanto, 8 electrones); la tercera capa tambin contiene cuatro orbitales, y as sucesivamente. El nmero de electrones en la capa ms externa es el determinante principal de las propiedades qumicas de un elemento. Los tomos con nmero similar de electrones en su capa externa tienen propiedades semejantes. Por ejemplo, litio (Li) y sodio (Na) tienen un electrn en su capa ms externa y ambos son metales muy reactivos. Los tomos de carbono (C) y de slice (Si) se unen cada uno con cuatro diferentes tomos. Sin embargo, debido a su tamao, un tomo de carbono se puede unir a otros tomos de carbono y formar molculas orgnicas de cadena larga, en tanto que el slice no puede formar molculas comparables. El nen (Ne) y el argn (Ar) tienen llenas sus capas externas y por consiguiente estos tomos son muy poco reactivos; se les conoce como gases inertes.

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CAPITULO 2 Bases qumicas de la vida

100 kilocaloras por mol (kcal/mol)1 de molculas, por lo que estos enlaces son estables en casi cualquier situacin. En muchos casos, dos tomos pueden unirse mediante enlaces en los cuales se comparte ms de un par de electrones. Cuando se comparten dos pares de electrones, como ocurre en la molcula de oxgeno (O-), el enlace covalente es un doble enlace, y si se comparten tres pares de electrones (como en el nitrgeno molecular, N2), es un triple enlace. No hay enlaces cudruples. El tipo de enlace entre los tomos tiene importantes consecuencias para definir la forma de las molculas. Por ejemplo, los tomos con un solo enlace pueden girar entre s, en tanto que los tomos con doble (y triple) enlace carecen de esa capacidad. Cuando los tomos unidos son del mismo tipo, como en H2, el par de electrones de la capa externa se comparten por igual entre los dos tomos de la pareja. Sin embargo, cuando dos tomos diferentes se enlazan en forma covalente, es inevitable que el ncleo de un tomo con carga positiva ejerza mayor fuerza de atraccin sobre los electrones externos que la fuerza ejercida por el tomo al cual estn enlazados. En consecuencia, los tomos compartidos tienden a localizarse ms cerca del tomo con mayor fuerza de atraccin, o sea, el tomo ms electronegativo. La electronegatividad de un tomo depende de dos factores: 1) El nmero de cargas positivas en su ncleo (ms protones, ms electronegatividad) y 2) la distancia del ncleo a los electrones externos (a mayor distancia menor electronegatividad). En el cuadro 2-1 se ordena la electronegatividad de tomos comunes en una escala de O a 4. Entre los tomos ms frecuentes en las molculas biolgicas, nitrgeno y oxgeno son fuertemente electronegativos. Molculas polares y no polares Examinemos una molcula de agua. Los tomos de oxgeno del agua atraen a los electrones con mucha mayor fuerza que los tomos de hidrgeno. Como resultado, se dice que os enlaces OH de la molcula de agua estn polarizados, de modo que uno de los tomos tiene carga parcial negativa
1 Una calora es la cantidad de energa trmica requerida para elevar la temperatura de un gramo de agua un grado centgrado. La Calora (gran calora) es igual a 1 000 caloras (o kilocalora). La energa expresada en caloras tambin puede expresarse en joules, trmino histrico utilizado para medir energa en forma de trabajo. Una kilocalora equivale a 4 186 joules. Una mola es igual al nmero de Avogadro (6 x 1023) de molculas. Una mola de cualquier sustancia es su peso molecular expresado en gramos.

y el otro carga parcial positiva. Esto generalmente se expresa de la siguiente manera:

extremos con carga negativa

extremos con carga positiva

Molculas como las del agua, con distribucin asimtrica de carga elctrica, se dice que son molculas polares. Las molculas polares de importancia biolgica contienen uno o ms tomos electronegativos, de ordinario O, N, S o P. Las molculas que carecen de enlaces polarizados, como las que contienen casi exclusivamente tomos de carbono e hidrgeno, se dice que son no polares. La presencia de enlaces polarizados tiene gran importancia para determinar la reactividad de las molculas. Las molculas que carecen de tomos electronegativos, como ceras y grasas, tienden a ser relativamente inertes. Algunas molculas de mayor inters biolgico, incluyendo protenas y fosfolpidos, que estudiaremos ms adelante, contienen porciones polares y no polares que se comportan de manera muy diferente. Ionizacin Hay tomos tan fuertemente electronegativos que durante una reaccin qumica pueden capturar electrones de otros tomos, por ejemplo, cuando' los elementos sodio (un metal de color plateado) y cloro (un gas txico) se mezclan, el nico electrn en la capa ms externa de cada tomo de Na se desplaza a la capa externa del tomo de cloro deficiente de un electrn. Como consecuencia, estos dos elementos se transforman en tomos cargados, o sea iones.
2Na'

2NaO

2 0-

CUADRO 2-1. Electronegatividad de los tomos

+1*
H 2.2

+4 C 2.5 Si 1.9

+5 N 3.0 P 2.2

+6 0 3.5 5 2.5

+7 F 4.0 CI 3.0

* Los nmeros + corresponden al rengln del tomo en la tabla peridica.

Puesto que el ion cloro tiene un electrn extra (en relacin con el nmero de protones de su ncleo), posee carga negativa (Cl~) y se denomina anin. El tomo de sodio que ha perdido un electrn tiene una carga positiva extra (Na + ) y se denomina catin. Cuando ambos iones se presentan en forma cristalina forman cloruro de sodio, la sal de mesa comn. Los iones Na+ y Cl~ mencionados antes son relativamente estables porque sus capas ms externas estn completas. Una disposicin diferente de electrones dentro del tomo puede producir especies muy reactivas denominadas radicales Ubres. En el ensayo siguiente La perspectiva humana se considera la estructura de los radicales libres y su importancia en biologa.

CAPITULO 2 Bases qumicas de la vida

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2-2 Enlaces no covalentes

Las uniones covalentes son enlaces fuertes formados entre los tomos de una molcula. Las interacciones entre molculas (o entre las diferentes partes de una molcula biolgica grande) estn gobernadas por una gran variedad de uniones ms dbiles denominadas enlaces no covalentes. Los enlaces no covalentes no dependen de electrones compartidos, sino ms bien de fuerzas de atraccin entre regiones con diferente carga elctrica, negativa o positiva, dentro de la misma molcula o entre dos molculas cercanas. Los enlaces no covalentes individuales son dbiles (casi 1 a 5 kilocaloras por mol) y por lo tanto se rompen y se vuelven a formar con rapidez. Esta caracterstica permite a los enlaces no covalentes mediar interacciones dinmicas que ocurren entre las molculas del interior de la clula. Sin enlaces no covalentes no podran ocurrir actividades vitales como las reacciones metablicas, la duplicacin del DNA y el movimiento de materiales dentro de la clula. Aunque individualmente los enlaces no covalentes son dbiles, cuando un gran nmero de ellos ocurren juntos, como entre las dos cadenas del DNA o entre las diferentes partes de una protena grande, sus fuerzas de atraccin son aditivas y consideradas en conjunto confieren gran estabilidad a la estructura. Los enlaces no covalentes son de varios tipos. Enlaces inicos: atraccin entre tomos cargados Un cristal de sal de mesa se mantiene unido por atraccin electrosttica entre los iones Na + cargados positivamente y

los iones Cl~ cargados negativamente. Este tipo de atraccin entre componentes con carga neta se denomina enlace inico (o puente salino). Los enlaces inicos dentro de un cristal de sal pueden ser muy fuertes, pero la presencia de agua impide la formacin de enlaces inicos fuertes. Por ejemplo, si se disuelve en agua un cristal de sal, cada uno de los iones individuales queda rodeado por molculas de agua que impiden la aproximacin de iones con carga opuesta (fig. 2-2). Puesto que las clulas se componen principalmente de agua, el enlace entre iones libres es de poca importancia. En contraste, pueden formarse enlaces inicos dbiles entre grupos con carga opuesta que forman parte de molculas biolgicas ms grandes. Por ejemplo, cuando los radicales fosfato de la molcula de DNA cargados negativamente se aproximan mucho a grupos cargados positivamente de la superficie de una protena (fig. 2-3), los grupos con carga opuesta forman enlaces inicos que ayudan a mantener unido al complejo. (Inversamente, los grupos con carga similar se repelen entre s y evitan una aproximacin estrecha.) En una clula, la fuerza de los enlaces inicos generalmente es dbil debido a la presencia de agua, pero en la profundidad del ncleo de una protena, donde casi siempre no hay agua, estos enlaces pueden ejercer gran influencia. Enlaces de hidrgeno Cuando un tomo de hidrgeno se enlaza en forma covalente a un tomo electronegativo, en particular a un tomo de oxgeno o de nitrgeno, el nico par de electrones compartidos se desplaza mucho hacia el ncleo del tomo electronegativo, dejando con carga parcial positiva al tomo de

FIGURA 2-2. Disolucin de un cristal de sal. Cuando se coloca un cristal de sal en agua, los iones Na+ y Cl~ quedan rodeados por molculas de agua que separan los enlaces inicos entre los dos iones. A medida que la sal se disuelve, los tomos de oxgeno con carga negativa de las molculas de agua se asocian a los iones sodio con carga positiva y los tomos de hidrgeno con carga positiva de las molculas de agua se asocian a los iones cloro con carga negativa.

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CAPITULO 2 Bases qumicas de la vida

LA PERSPECTIVA HUMANA
Radicales libres como causa de envejecimiento y enfermedad
Por qu los seres humanos tienen un periodo de vida mximo de casi 100 aos, en tanto que sus parientes cercanos, los chimpancs, slo viven como la mitad de ese tiempo? Muchos bilogos piensan que el envejecimiento es resultado de un dao gradual que se va acumulando sobre los tejidos de nuestro cuerpo. El dao ms destructivo probablemente ocurra en el DNA. Las alteraciones del DNA tienden a producir fallas en los mensajes genticos que paulatinamente promueven el deterioro celular. Cmo ocurre entonces el dao celular y por qu razn es ms rpido en el chimpanc que en el ser humano? La respuesta puede residir a nivel atmico. Los tomos son estables cuando sus capas estn llenas de electrones. Las capas de electrones constan de orbitales, cada uno de los cuales slo puede sostener un mximo de dos electrones. Los tomos o molculas que tienen orbitales con un solo electrn impar tienden a ser muy inestables y se les denomina radicales libres. Los radicales libres pueden formarse al romperse un enlace covalente de modo que cada porcin conserve la mitad de los electrones compartidos, o tambin se generan cuando un tomo o molcula acepta un solo electrn transferido durante una reaccin de oxidorreduccin. Por ejemplo, el agua puede convertirse en radicales Ubres cuando se expone a la radiacin solar H2O -> HO- + Hradical hidroxilo

que la luz del sol sea tan nociva para la piel. En 1956, Denham Harman, de la Universidad de Nebraska, propuso que el envejecimiento era resultado del dao a los tejidos causado por radicales libres. Puesto que el tema de los radicales libres no era familiar para los bilogos y los mdicos, la propuesta no despert gran inters. Despus, en 1969, Joe McCord e Irwin Fridovich, de la Universidad de Duke, descubrieron una enzima, la superxido dismutasa (SOD), cuya nica funcin era destruir radicales superxido (O2*~), un tipo de radical libre formado cuando el oxgeno capta un electrn extra. La SOD cataliza la siguiente reaccin: <V - + O2- ~ + 2H+ -H2O2 + O2
perxido de hidrgeno

(" " indica radical libre) Los radicales-libres son en extremo reactivos debido a su inestabilidad y pueden alterar qumicamente muchos tipos de molculas, incluyendo protenas, cidos nucleicos y lpidos. La formacin de radicales hidroxilo tal vez sea una de las principales razones de

El perxido de hidrgeno, una sustancia muy destructiva, es descompuesto de inmediato por otra enzima, la catalasa. Investigaciones subsecuentes han revelado que los radicales superxido se forman dentro de las clulas durante el proceso oxidativo normal y que en las clulas de diversos organismos, desde bacterias hasta el ser humano, hay enzimas capaces de destruir estas nocivas sustancias. La importancia de la SOD se aprecia mejor en estudios de bacterias mulantes que carecen de esta enzima; estas clulas no pueden sobrevivir en presencia de oxgeno. Aunque el potencial destructivo de los radicales libres, como el superxido, es incuestionable, la importancia de estos agentes como factor de envejecimiento an est sujeta a controversia. La hiptesis de Harman en relacin con radicales libres y envejecimiento permite hacer ciertas predicciones. Por ejemplo, sera de esperar que los animales con periodos de vida ms largos produjeran menor cantidad de radicales libres, posean una mejor capacidad

para destruir radicales libres, o mayor eficiencia para reparar el dao celular producido por las reacciones entre radicales libres. Los datos relacionados con estas predicciones son contradictorios. En tanto que algunos estudios muestran correlacin entre concentracin elevada de SOD o actividad de enzimas reparadoras y aumento del periodo mximo de vida, otros estudios, en su mayor parte, no concuerdan con eso. El papel de los radicales libres en el envejecimiento todava es dudoso, pero cada vez gana mayor aceptacin la idea de que estos reactivos agentes desempean un papel importante en la aparicin de ciertas enfermedades, como cncer, aterosclerosis y esclerosis lateral amiotrfica (ELA, o enfermedad de Lou Gehrig). Como se analiza en los ltimos captulos, el cncer casi siempre es resultado de la mutacin de ciertos genes claves. Puesto que la mutacin gentica es resultado de alteraciones en el DNA y los radicales Ubres pueden daar al DNA, no es sorprendente que los radicales libres promuevan la formacin y crecimiento del cncer. La aterosclerosis es una enfermedad cardiovascular causada por el depsito de placas de lpidos sobre la pared interna de las arterias, Hay suficientes datos que sugieren que la formacin de estas placas ocurre en sitios donde el revestimiento celular de los vasos ha sufrido dao, hecho que puede ser causado por radicales libres, La esclerosis lateral amiotrfica es una enfermedad degenerativa caracterizada por parlisis gradual de las motoneuronas que estimulan los msculos del cuerpo. Aunque la mayor parte de los casos de ELA ocurren de manera espordica, o sea, la enfermedad no se hereda de padres portadores de un gen defectuoso, casi 10% de los casos sigue un patrn familiar. El vnculo entre dao por radicales libres y ELA fue suge.'ido por primera vez en 1993 cuan-

CAPITULO 2 Bases qumicas de la vida

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do se descubri que los miembros de cierto nmero de familias afectadas por la enfermedad posean un gen que codifica una superxido dismutasa (SOD) defectuosa. A partir de esta observacin, los investigadores introdujeron un gen que codifica una SOD imitante en el ratn y demostraron que los ratones desarrollan una enfermedad neurodegenerativa grave cuyos sntomas recuerdan estrechamente a los de ELA. Puesto que los animales manipulados genticamente continan produciendo SOD normal (codificado por los genes normales que conservan) junto con la enzima mutante (codificada por el gen aadido), al parecer el dao no es resultado de la prdida de actividad de una enzima. Se especula que la enzima mutante quiz posea alguna nueva actividad nociva que tiende a producir nuevos tipos de radicales libres que daan a las neuronas.

En otra va de investigacin se han empleado sustancias denominadas antioxidantes capaces de destruir radicales libres. Los antioxidantes comunes incluyen glutatin, vitaminas E y C, y ^-caroteno (el pigmento de color naranja de las zanahorias y de otros vegetales y compuestos precursores de vitamina A). Aunque estas sustancias pueden ser muy benficas en la dieta debido a su capacidad para destruir radicales libres, estudios en ratas y ratones no suministraron datos convincentes de que retardan el proceso de envejecimiento o que prolongan la vida. En realidad, un estudio reciente, efectuado en Finlandia, en el cual durante ocho aos se control cuidadosamente a casi 30 000 fumadores empedernidos, se observ que los sujetos a quienes se administr complemento de ^-caroteno mostraron un porcentaje 18 veces ms elevado

de ocurrencia de cncer pulmonar que aquellos que no recibieron el antioxidante. Este dato es muy difcil de explicar y la mayora de los investigadores en este campo se resisten a hacer conclusiones, sobre todo porque otros estudios sugieren que las dietas ricas en antioxidantes se relacionan con disminucin del cncer en poblaciones humanas. Estos datos slo ilustran la complicada relacin entre dieta humana y salud, y la dificultad de emplear seres humanos en estudios experimentales. Para simplificar el tema, tambin se efectuaron estudios en cultivos de clulas. Ni la adicin de antioxidantes al medio de cultivo, ni la reduccin de oxgeno en la atmsfera (que podra disminuir la formacin de radicales libres) parece incrementar la capacidad de crecimiento de las clulas.

hidrgeno. En consecuencia, el ncleo desnudo del tomo de hidrgeno, cargado positivamente, puede aproximarse lo bastante para establecer una interaccin de atraccin con el par de electrones externos no compartidos de un segundo tomo electronegativo (fig. 2-4). Esta dbil atraccin recproca se denomina enlace de hidrgeno. Los enlaces de hidrgeno se forman entre la mayor parte de las molculas polares y tienen particular importancia para determinar la estructura y propiedades del agua (que estudiaremos despus). Los enlaces de hidrgeno tambin se forman entre grupos polares presentes en molculas biolgicas grandes, como ocurre entre las dos cadenas de la molcula de DNA (fig. 2-3). La fuerza de los enlaces de hidrgeno es aditiva, por lo tanto su gran nmero entre las cadenas de la doble hlice de DNA le confiere gran estabilidad. Sin embargo, puesto que los enlaces de hidrgeno individuales son dbiles (2 a 5 kcal/mol), las dos cadenas pueden separarse para permitir el acceso de las enzimas a sitios particulares de la molcula de DNA. Interacciones hidrofbicas y fuerzas de van der Waals Debido a su capacidad para interactuar con el agua, se dice que las molculas polares, como azcares y aminocidos, que pronto describiremos, son hidroflicas o "amantes del agua". Molculas no polares, como esteroides o grasas, son prcticamente insolubles en agua debido a que carecen

de regiones cargadas que seran atradas hacia los polos de las molculas de agua. Cuando los compuestos no polares se mezclan con agua, la sustancia no polar hidrofbica ("que le teme al agua"), se ven forzados a formar agregados para reducir al mnimo la exposicin a sus vecinos polares (fig. 2-5). El agrupamiento de molculas no polares se denomina interaccin hidrofbica. Es la razn por la cual las gotas de grasa reaparecen con rapidez sobre la superficie de una sopa de res o de pollo aun despus de agitar el lquido con una cuchara. Como se expone en la pgina 54, tambin es la causa de que los grupos no polares tiendan a localizarse en el interior de la mayor parte de las protenas solubles y en el exterior de casi todas las membranas protenicas (seccin 4-2). Las interacciones hidrofbicas del tipo que acabamos de describir no se consideran verdaderos enlaces, puesto que no son consecuencia de una atraccin entre molculas hidrofbicas. Adems de este tipo de interaccin, los grupos hidrofbicos pueden formar enlaces dbiles entre s basados en atracciones electrostticas. Las molculas polares se renen debido a que siempre contienen dentro de sus estructuras una carga distribuida asimtricamente. Un examen ms detallado de los enlaces covalentes en una molcula no polar (como H2 o ChL;) revela que los electrones no siempre se distribuyen de manera simtrica. La distribucin de electrones en cualquier momento dado alrededor de un tomo es estadstica, y por lo tanto vara de un instante a otro. En consecuencia, en un momento dado, la densidad de electrones puede ser mayor en un lado del tomo,

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CAPITULO 2 Bases qumicas de a vida Enlace de hidrgeno

FIGURA 2-4. Enlaces de hidrgeno. Se forman entre un tomo electronegativo, como nitrgeno u oxgeno, que posee carga negativa parcial, y un tomo de hidrgeno con carga positiva parcial. Se muestran varios ejemplos de enlaces de hidrgeno.

s y orientadas de la manera apropiada experimentan una fuerza de atraccin denominada fuerza de van der Waals, que puede servir para unirlas. Ms an, la separacin transitoria de cargas en una molcula tambin puede inducir una separacin similar de cargas en molculas vecinas. As

Enlace de hidrgeno

\A

FIGURA 2-.H. Los enlaces inicos no covalentes desempean un papel importante para trasladar la molcula de protena de la derecha (tomos amarillos) a la molcula de DNA de la izquierda. Los enlaces inico^ se forman entre tomos de nitrgeno con carga positiva en la protena y los tomos de oxgeno con carga negativa en el DNA. La molcula de DNA en s consta de dos cadenas separadas reunidas por enlaces de hidrgeno no covalentes (que analizaremos en la siguiente seccin). Un solo enlace no covalente es relativamente dbil y fcil de romper, pero, un gran nmero de estos enlaces entre dos molculas, como entre dos cadenas de DNA, constituyen un complejo muy estable. (Fotografa cortesa de Stephen Harrison.)

aunque el tomo comparta por igual los electrones con algn otro tomo. Esta asimetra transitoria en la distribucin de electrones da como resultado una separacin momentnea de cargas (dipolos) entre la molcula. Si dos molculas con dipolos transitorios se encuentran muy prximas entre

FIGURA 2-5. En una interaccin hidrofbica, las molculas no polares (hidrofbicas) se renen en agregados para reducir al mnimo su superficie expuesta a las molculas de agua que las rodean.

CAPITULO 2 Bases qumicas de la vida

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Separacin (A) 2 4

nica que confiere a esta molcula propiedades extraordinarias.2 Entre las ms importantes se hallan: 1. El agua es una molcula muy asimtrica con un tomo O en un lado y dos tomos H en el lado opuesto. 2. Cada uno de los dos enlaces covalentes de la molcula est altamente polarizado. 3. Los tres tomos de la molcula de agua pueden formar enlaces de hidrgeno.

o f

(a)

(b)
FIGURA 2-6. Fuerzas de van der Waals. a) Conforme se aproximan dos tomos, experimentan una dbil fuerza de atraccin que se incrementa hasta una distancia especfica, generalmente cerca de 2 A. Si los tomos se aproximan ms, sus nubes electrnicas se rechazan entre s y esto provoca la separacin de los tomos, b) Aunque individualmente las fuerzas de van der Waals son muy dbiles, se puede formar un gran nmero de dichas fuerzas de atraccin cuando dos macromolculas tienen una superficie complementaria, corno se indica esquemticamente en esta figura.

Las propiedades de la molcula del agua que apoyan la vida se originan en estas caractersticas. Cada molcula de agua puede formar enlaces de hidrgeno hasta con otras cuatro molculas de agua, generando una red de molculas ntimamente interconectadas (fig. 2-7). Cada enlace de hidrgeno se forma cuando el hidrgeno con carga parcialmente positiva de una molcula se alinea junto a un tomo de oxgeno con carga parcialmente negativa de otra molcula de agua. Debido a su gran nmero de enlaces de hidrgeno, las molculas de agua tienden de manera inusitada a adherirse entre s. Esta caracterstica es ms evidente al considerar las propiedades trmicas del agua. Por ejemplo, cuando se calienta agua, la mayor parte de la energa trmica se consume para romper enlaces de hidrgeno en vez de contribuir al movimiento de las molculas (que se mide como incremento de temperatura). De manera similar, la evaporacin desde el estado lquido al
2 Una manera de apreciar la estructura del agua es compararla con H^S. Igual que el oxgeno, el azufre tiene seis electrones en su capa externa y forma enlaces simples con dos tomos de hidrgeno. Pero el tomo de azufre es ms grande y por lo tanto menos electronegativo que el oxgeno y su capacidad para formar enlaces de hidrgeno es muy reducida. A temperatura ambiente, el F2S es un gas, no un lquido. En realidad, la temperatura debe descender a -86C antes que el f-yS se congele para formar un slido.

se pueden generar fuerzas adicionales de atraccin entre molculas no polares. Incluso en el instante de mxima fuerza de atraccin, un solo enlace de van der Waals es muy dbil (casi 1 kcal/mol) y muy sensible a la distancia que separa los dos tomos (fig. 2-6, a). Sin embargo, como veremos en los ltimos captulos, las molculas biolgicas que interactan, por ejemplo, un anticuerpo y una protena sobre la superficie de un virus, a menudo poseen formas complementarias entre s. Como resultado, muchos tomos de las molculas interactuantes tienen oportunidad de aproximarse muy cerca (fig. 2-6, b), y por lo tanto las fuerzas de van der Waals contituyen un factor importante en las interacciones biolgicas. Las propiedades del agua apoyan la vida La vida sobre la tierra depende totalmente del agua y el agua puede ser indispensable para la existencia de vida en cualquier otro punto del universo. Aunque slo contiene tres tomos, una molcula de agua tiene una estructura
FIGURA 2-7. Formacin de enlaces de hidrgeno entre molculas de agua vecinas. La longitud de un enlace qumico se relaciona con su fuerza, o sea, la energa necesaria para romperlo. El enlace de hidrgeno entre un tomo de H y un tomo de O es ms largo que el enlace covalente entre un tomo de H y un tomo de O debido a que es un enlace mucho ms dbil.

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CAPITULO 2 Bases qumicas de la vida Enlace de hidrgeno

Agua

un tomo de hidrgeno pierde un electrn. Consideremos el cido actico, ingrediente caracterstico del vinagre, que puede sufrir la siguiente reaccin descrita como disociacin.

H:CC:

H .-Q: H ':0: H
Acido actico

o
H
Ion acetato

H+

Protn (ion hidrgeno)

FIGURA 2-8. Vista esquemtica de los tipos de enlace de hidrgeno que pueden formarse entre una molcula de azcar y el agua en la cual se disuelve. Se muestran las molculas de azcar udlizando un modelo de espacio lleno, una manera comn de representar la estructura de una molcula.

Una molcula capaz de liberar (donar) un ion hidrgeno se denomina cido. El protn liberado por la molcula de cido actico en la reaccin previa no permanece en estado libre; se combina con otra molcula. Las posibles reacciones en las cuales participa un protn incluyen: Combinacin con una molcula de agua para formar un ion hidronio (H.3O+). H+ + H2O -> H3O+ Combinacin con un ion hidroxilo (OH~) para formar una molcula de agua. H+ + OH H20

estado gaseoso requiere romper los enlaces de hidrgeno que mantienen unidas a las molculas de agua con sus vecinas, y por esta razn se necesita tanta energa para convertir agua en vapor. Los mamferos sacan provecho de esta propiedad cuando sudan, puesto que el calor requerido para evaporar el sudor se absorbe del cuerpo, que de esta manera se enfra. El pequeo volumen de agua lquida presente en una clula contiene una mezcla notablemente compleja de sustancias disueltas, o solutos. En realidad, el agua tiene capacidad para disolver numerosas sustancias, mayor que cualquier otro solvente. Pero el agua es mucho ms que un simple solvente; es un factor determinante de la estructura de las molculas biolgicas y de los tipos de interacciones en las cuales pueden participar. El agua es el lquido matriz alrededor del cual se construye la estructura insoluble de la clula. Tambin es el medio a travs del cual los materiales se transportan de un compartimiento a otro de la clula; es reactante o producto en muchas reacciones celulares; protege a la clula de muchas maneras: del calor, del fro o de la radiacin nociva excesivos. El agua es un factor de tal importancia en la clula debido a su capacidad para formar interacciones dbiles con mltiples tipos diferentes de grupos qumicos. Recordemos, de la pgina 32, cmo las molculas de agua, con sus enlaces OH fuertemente polarizados, forman una capa alrededor de los iones y los separan entre s. De manera similar, las molculas de agua forman enlaces de hidrgeno con molculas orgnicas, como azcares y aminocidos, que contienen grupos polares (fig. 2-8). Debido a su capacidad para formar enlaces dbiles no covalentes con el agua, las molculas polares tienden a separarse entre s incrementando su solubilidad.

Combinacin con un grupo amino ( NHa) en una protena para formar una amina con carga neta H+ NH2 NH3

Cualquier molcula capaz de aceptar un ion hidrgeno se define como una base. Los cidos y las bases existen en pares, o parejas. Cuando el cido pierde un protn (como cuando el cido actico dona un ion hidrgeno), se forma una base (en este caso, ion acetato), denominada la base conjugada del cido. De manera similar, cuando una base (como un grupo NH2) acepta un protn, se forma un cido (en este caso NH3+), el cual se denomina cido conjugado de dicha base. As, el cido siempre contiene una carga positiva ms que su base conjugada. El agua es ejemplo de una molcula anfotrica, o sea, aquella que puede servir como cido o como base.* H3O H+ + H2O ^ OH- + H+
Acido Molcula anfotrica Base

2-3 cidos, bases y amortiguadores

Los protones no slo se encuentran dentro de los ncleos atmicos, sino que tambin se liberan al medio siempre que

En la pgina 51 analizaremos otro importante grupo de molculas anfotricas, los aminocidos. Los cidos varan mucho respecto de la facilidad con la cual la molcula cede un protn. Cuanto ms fcil se pierda el protn, o sea, cuanto menor sea la fuerza de atraccin de la base conjugada por su protn, ms fuerte es el cido. El cloruro de hidrgeno es un cido muy fuerte que transfiere con rapidez su protn a las molculas de agua cuando se disuelve. La base conjugada de un cido fuerte, como el HC1, es una base dbil (cuadro 2-2). Por lo contrario, el cido actico es un cido relativamente dbil porque en su mayor parte permanece sin disociarse cuando se disuelve en agua.

CAPITULO 2 * Bases qumicas de la vida CUADRO 2-2. Fuerza de cidos y bases

cidos Bases

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Muy dbil Dbil

Fuerte

H2O NIV H2S CH3COOH H2C03 H30+ HCI H2SO4

OHNH3 S2CH3COHC03H2O

Fuerte Dbil

Muy dbil

ciso42-

Se puede considerar el grado de disociacin de un cido como la competencia por protones entre los componentes de una solucin. El agua es un buen competidor, o sea, una base ms fuerte en comparacin con el ion cloro, de modo que el HCI se disocia por completo. Por lo contrario, el ion acetato es una base ms fuerte que el agua y por lo tanto permanece principalmente sin disociarse. La acidez de una solucin se mide por la concentracin de iones hidrgeno3 y se expresa en trminos de pH. pH = -log [H+] Por ejemplo, una solucin con pH de 5 tiene una concentracin de iones hidrgeno de 10~5 M. Debido a que la escala es logartmica, un incremento de una unidad de pH corresponde a un incremento de 10 veces la concentracin de OH~ (o una disminucin de 10 veces la concentracin de H+). Por ejemplo, la concentracin de H + en el cido del estmago es casi un milln de veces mayor que la concentracin de este ion en la sangre. Cuando una molcula de agua se disocia en un ion hidroxilo y un protn, H2 - H + + OH~ (o con mayor precisin, 2 H2 -> HsO+ + OH~), la constante de equilibrio para la reaccin se puede expresar como:
= eq

protones para formar agua), de modo que el producto inico permanece en lO^14, La mayor parte de los procesos biolgicos son muy sensibles al pH debido a que los cambios en la concentracin de ion hidrgeno afectan el estado inico de las molculas biolgicas. Por ejemplo, conforme aumenta la concentracin de ion hidrgeno, los grupos NH2 del aminocido histidina se protonan para formiar NH3+, que puede alterar la forma y actividad de toda protena. Incluso cambios ligeros en pH pueden impedir reacciones biolgicas. Los organismos, y las clulas que los forman, estn protegidos de variaciones de pH por amortiguadores, compuestos que reaccionan con iones hidrgeno o hidroxilo libres, y por lo tanto resisten los cambios de pH. Las soluciones amortiguadoras de ordinario contienen un cido dbil junto con su base conjugada. Por ejemplo, la sangre est amortiguada por cido carbnico y iones carbonato que normalmente mantienen el pH sanguneo en una cifra cercana a 7.4. HCCy + H+ ^ H2CO3
Ion Ion Acido bicarbonato hidrgeno carbnico

Si la concentracin de ion hidrgeno se eleva (como ocurre durante el ejercicio), los iones bicarbonato se combinan con el exceso de protones y los eliminan de la solucin. Inversamente, el exceso de iones OH (que se generan durante la hiperventilacin) es neutralizado por protones derivados del cido carbnico. El pH del lquido intracelular est regulado de manera similar por un sistema amortiguador de fosfatos que consiste en H2PO4~ y HPO42~.

2-4 Naturaleza de las molculas biolgicas

La masa de un organismo es agua. Si se evapora el agua, la mayor parte del peso seco consta de molculas que contienen tomos de carbono. Cuando se descubri esto se pens que las molculas que contienen carbono slo estaban presentes en los organismos vivos y por lo tanto se les denomin molculas orgnicas, para distinguirlas de las molculas inorgnicas observadas en el mundo inanimado. Conforme los qumicos aprendieron a sintetizar ms y ms molculas compuestas de carbono en el laboratorio, se perdi la mstica relacionada con los compuestos orgnicos. Los compuestos producidos por organismos vivientes se denominan bioqumicos. La qumica de la vida se centra alrededor de la qumica del tomo de carbono. La cualidad esencial del carbono que le permite desempear este papel es el increble nmero de molculas que puede formar. El tomo de carbono posee cuatro electrones en su capa externa y por lo tanto puede enlazarse a otros cuatro tomos (vase fig. 2-1). Adems, cada tomo de carbono puede formar enlaces con otros tomos de carbono y de esta manera construir molculas con esqueletos que contienen largas cadenas de tomos de carbn. Los esqueletos de carbono pueden ser lineales, ramificados o cclicos.

[H+] [OH-] [H20]

Puesto que la concentracin de agua pura siempre es de 55.51 M, podemos generar una nueva constante, KW, o producto inico constante para el agua.

igual a 10~14 a 25C. La concentracin de ambas especies en el agua pura es de aproximadamente 10~7 M. El grado sumamente bajo de disociacin del agua indica que es un cido muy dbil. En presencia de un cido, la concentracin de iones hidrgeno se eleva y la concentracin de iones hidroxilo desciende (como resultado de la combinacin con

3 En solucin acuosa los protones no existen en estado libre, sino ms bien como iones hidronio (HsO"1"). En aras de la sencillez, nos referimos a ellos simplemente como protones o iones hidrgeno.

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CAPITULO 2 Bases qumicas de la vida

c / \
C Lineal Cclico

c ccc

Conforme se aaden ms tomos de carbono, el esqueleto de las molculas orgnicas aumenta de longitud y su estructura es cada vez ms compleja. Un hidrocarburo con la frmula C4Hio puede existir con dos molculas diferentes H
H H H H H
H -H

Ramificado

H H

:H
El colesterol, cuya estructura se muestra en la figura 2-9, ilustra varios arreglos de tomos de carbono. Tanto el tamao como la estructura electrnica del carbono le confieren caractersticas particularmente adecuadas para generar numerosas molculas, de las cuales se conocen varios cientos de miles. En contraste, el slice, que se encuentra justo por debajo del carbono en la tabla peridica y que tambin posee cuatro electrones en su capa externa (vase fig. 2-1), es demasiado grande para que la carga positiva de su ncleo atraiga electrones de la capa externa de los tomos vecinos con fuerza suficiente para mantener unida la estructura de molculas grandes.
H H H H Butano

HH H Isobutano

Estas molculas tienen propiedades diferentes como resultado de la manera de unirse los diferentes tomos entre s. Dos molculas que tienen la misma frmula (p. ej., C4Hio) pero estructuras diferentes se dice que son ismeros estructurales entre s. Las molculas constituidas por un mayor nmero de tomos tienen un nmero cada vez mayor de ismeros estructurales.

Grupos funcionales Hidro c arburos

Podemos entender la naturaleza de las molculas biolgicas iniciando el estudio con el grupo ms simple de molculas orgnicas, los hidrocarburos, que slo contienen tomos de carbono y de hidrgeno. La molcula de etano ^Hg) es un hidrocarburo simple que consta de dos tomos de carbono unidos entre s y adems tres tomos de hidrgeno.
H H

:H
H H

Colesterol

Los hidrocarburos no se encuentran en cantidad significativa en la mayor parte de las clulas vivas (aunque constituyen la masa de los combustibles fsiles formados a partir de los restos de plantas y animales antiguos). Las molculas orgnicas de importancia biolgica contienen cadenas de tomos de carbono, como los hidrocarburos, pero en las cuales ciertos tomos de hidrgeno son sustituidos por diferentes grupos funcionales. Los grupos funcionales son agrupamientos particulares de tomos que casi siempre se comportan como una unidad y confieren a las molculas orgnicas sus propiedades fsicas, reactividad qumica y solubilidad en solucin acuosa. En el cuadro 2-3 se presenta una lista de los grupos funcionales ms comunes. Dos de las uniones ms frecuentes entre grupos funcionales son los enlaces ster, los cuales se forman entre cidos carboxlicos y alcoholes, y los enlaces amido, formados entre cidos carboxlicos y aminas.

COH + HOCAcido Alcohol

:oc
Ester

FICTIRA 2-') El colesterol, cuya estructura ilustra cmo los tomos de carbono (representados por esferas negras) pueden formar enlaces covalentes hasta con otros cuatro tomos de carbono. Como resultado, los tomos de carbono se pueden unir entre s para formar esqueletos de un nmero prcticamente ilimitado de molculas orgnicas. El esqueleto de carbono de una molcula de colesterol incluye cuatro anillos, caracterstica de los esteroides (p. ej., estrgenos, testosterona, cortisol). La molcula de colesterol se muestra aqu como un modelo de esferas y palitos, otra manera de mostrar la estructura molecular.

La mayor parte de los grupos del cuadro 2-3 contiene uno o ms tomos electronegativos (N, P, O o S) y est constituido por molculas orgnicas ms polares, ms solubles en agua y ms reactivas. Muchos de los grupos funcionales pueden ionizarse y por lo tanto convertirse en partculas con carga negativa o positiva. Se puede demostrar fcilmente el efecto de sustituir varios grupos funcionales.

CAPITULO 2 Bases qumicas de la vida CUADRO 2-3. Grupos funcionales

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Metilo

Hidroxilo

Carboxilo

Amino

Fosfato

Carbomlo

Sulfhidrilo

El hidrocarburo etano (CHaCHa) es un gas inflamable txico. Si se sustituye uno de los hidrgenos con un grupo hidroxilo (OH), la molcula resultante (CH3CH2OH) se convierte en algo agradable al paladar, o sea alcohol etlico. Si se sustituye un grupo carboxlo (COOH) la molcula se convierte en cido actico (CHsCOOH), mejor conocido como vinagre. Si se sustituye un grupo sulfhidrilo {SH) se obtiene CHsCHsSH, compuesto de olor ftido intenso, el etilmercaptano, empleado por los bioqumicos en el estudio de reacciones enzimticas. Clasificacin de las molculas biolgicas segn su funcin Las molculas orgnicas comnmente observadas dentro de las clulas vivas se pueden dividir en varias categoras, segn su papel en el metabolismo. 1. Macromolculas. Las molculas que forman la estructura y ejecutan las actividades de las clulas son molculas grandes, altamente organizadas, llamadas macromolculas, que en todos los casos contienen docenas a millones de tomos de carbono. Debido a su tamao y a las intrincadas formas que las macromolculas pueden adoptar, algunas de estas gigantescas molculas pueden ejecutar tareas complejas con gran precisin y eficiencia. La presencia de macromolculas, ms que cualquier otra caracterstica, confiere a los organismos las propiedades de la vida y las singulariza qumicamente dentro del mundo inanimado. Las macromolculas se pueden dividir en cuatro categoras principales: protenas, cidos nucleicos, polisacridos y lpidos. Los primeros tres tipos sonpolmeros compuestos de gran nmero de elementos de bajo peso molecular o monmeros. Estas macromolculas se construyen a partir de monmeros mediante un proceso que recuerda.el acoplamiento de vagones de ferrocarril (ftg. 2-10). La estructura bsica y funcin de cada familia de macromolculas es muy similar en todos los organismos, desde bacterias hasta el ser humano. Hay que observar con atencin las secuencias especficas de los monmeros que constituyen las diferentes macromolculas para apreciar la diversidad entre los organismos. 2. Elementos unitarios para construir macromolculas. Dentro de una clula, la mayor parte de las macromolculas tienen un periodo de vida breve en comparacin con la propia clula; con excepcin del DNA celular, las macromolculas se rompen y sustituyen continuamente por nue-

vas macromolculas. En consecuencia, casi todas las clulas contienen un almacn (o fondo comn) de precursores de bajo peso molecular listos para incorporarse a las macromolcuas. Estos incluyen azcares, precursores de polisacridos; aminocidos, precursores de protenas; nucletidos, precursores de cidos nucleicos, y cidos grasos que se incorporan a fpidos. 3. Intermediarios metablicos (metabolitos). Las molculas empleadas por una clula poseen una estructura qumica compleja y deben sintetizarse paso a paso en secuencias iniciadas con materias primas especficas. Cada serie de reacciones qumicas dentro de la clula se denomina va metablica. La clula convierte un compuesto A en un compuesto B, luego en un compuesto C, y as sucesivamente, hasta formar algn tipo de producto final que la propia clula puede utilizar (por ejemplo un aminocido para construir una protena). Los compuestos formados a lo largo de las vas metablicas pueden generar productos que no tienen por s mismos una funcin y a los cuales se es denomina intermediarios metablicos. 4. Molculas con diversas funciones. Evidentemente, sta es una categora muy amplia de molculas, pero no tan grande como se podra esperar; gran parte de la masa del peso seco de una clula est formada de macromolculas y sus precursores directos. Las molculas de funcin diversa incluyen sustancias como vitaminas, cuya funcin primaria es la de coadyuvantes de protenas; ciertas hormonas esferoides o aminocidos; molculas que participan en el almacenamiento de energa, como ATP o fosfato de creatina; molculas reguladoras como el AMP cclico, y productos de desperdicio metabco como la urea.

2-5 Cuatro familias de molculas biolgicas

Las molculas descritas antes se pueden dividir en cuatro clases o familias de molculas orgnicas: carbohidratos, lpidos, aminocidos y protenas, y nucletidos y cidos nucleicos. Carbohidratos Los carbohidratos son un grupo de sustancias que incluyen azcares simples (o monosacridos) y todas las molculas ms grandes construidas con bloques de azcares. La principal funcin de los carbohidratos es almacenar energa

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CAPITULO 2 Bases qumicas de la vida

Transportador Monmero

Extremo del polmero en crecimiento

Polmero con subunidad aadida

Transportador reciclado Transportador libre Monmero

(a)

Hidrlisis
H-t-OH

(b)

H2O

FIGURA 2-10. Monmeros y polmeros, a) Los polisacridos, protenas y cidos nucleicos constan de monmeros (subunidades) unidos por enlaces covalentes. Los monmeros libres no reaccionan entre s para convertirse en macromolculas. Ms bien, cada monmero primero debe activarse fijndose a una molcula transportadora que luego transfiere el monmero al extremo de la macromolcula en crecimiento, b) Una macromolcula se puede descomponer mediante hidrlisis de los enlaces que juntan a los monmeros. Hidrlisis es la separacin de un enlace por una molcula de agua. Todas estas reacciones son catalizadas por enzimas especficas.

qumica y como material de construccin durable para estructuras biolgicas. Casi todos los azcares tienen la frmula general (CH.2O)n. Los valores de n para los azcares importantes en el metabolismo celular varan de 3 a 7. Los azcares con tres carbonos se conocen como triosas; los de cuatro carbonos como tetrosas; los de cinco carbonos como pentosas; los de seis, hexosas, y los de siete, heptosas. Estructura de los azcares simples Cada molcula de azcar contiene un esqueleto de tomos de carbono unidos en disposicin lineal mediante enlaces sencillos. Cada tomo de carbono del esqueleto se une a un solo grupo hidroxilo, excepto los que poseen un grupo carbonilo (C=O). Si el grupo carbonilo se localiza en una posicin interna (forma un grupo cetona), el azcar es una cetosa, como la fructuosa mostrada en la figura 2-11, a. Si el carbonilo se localiza en un extremo del azcar, forma un grupo aldehido y la molcula se conoce como una aldosa, segn se ejemplifica con la glucosa, que se muestra en la figura 2-11, b-f. Aunque las frmulas de cadena recta mostradas en la figura 2-11, a,b, son tiles para comparar las estructuras de varios azcares, no reflejan el hecho de que los azcares con cinco o mas tomos de carbono sufran una

autorreaccin (fig. 2-11, c) que las convierte en molculas cerradas o con un anillo. Los azcares con anillos de ordinario se representan como estructuras planas Aplanares) (g. 2-11, d) situadas perpendicularmente al plano del papel con la lnea gruesa situada ms cerca del lector. Los grupos H y OH se ubican en el plano del papel proyectndose hacia arriba o hacia abajo del anillo del azcar. En realidad, el anillo del azcar no es una estructura planar, sino que casi siempre existe en una conformacin tridimensional que recuerda una silla (fig. 2-11, e,j). Estereoisomerismo Como se mencion antes, un tomo de carbono puede formar uniones simples con otros cuatro tomos. La disposicin de los grupos alrededor del tomo de carbono se puede representar como en la figura 2-12, a, con el carbono colocado en el centro de un tetraedro y los grupos enlazados proyectndose en sus cuatro esquinas. La figura 2-12, b, muestra una molcula de gliceraldehido, la nica aldotriosa. El segundo tomo de carbono del gliceraldehido se une a cuatro grupos diferentes (H, OH, CHO y CH2OH). Si los cuatro grupos enlazados a un tomo de carbono son todos diferentes, como en el gliceraldehido, entonces exis-

CAPITULO 2 Bases qumicas de la vida

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D-Fructuosa

D-Glucosa

D-Glucosa (formacin de un anillo)

cr-D-glucosa
(proyeccin Haworth)

H I H - C - OH 1 C=0
f HO - C - H I H - C - OH I H-C-OH I H-C-OH
!
H

a-D-glucosa (conformacin en silla)

a-0-glucosa
(silla con modelo de esferas y palitos)

c-o
I
H-C-OH

H I

CH2OH

H'

I HO - C - H
I H-C-OH I H-C-OH I H-C-OH I H

\n OH n / H
HO

A' 3C I

2C

i/ I

OH

(a)

(O

(d)

(f)

FIGURA 2-11. Estructuras de los azcares, a) La frmula de cadena recta de la fructosa, una cetohexosa [ceto indica el carbonilo (amarillo) localizado internamente y hexosa debido a que contiene seis carbonos], b) Frmula de cadena recta de la glucosa, una aldohexosa (aldo porque el carbonilo se localiza al final de la molcula), c) Autorreaccin en la cual la glucosa se convierte de cadena abierta en un anillo cerrado (anillo de pranosa). d) La glucosa comnmente se muestra en forma de anillo plano (planar) con la lnea gruesa situada ms prxima al lector y los grupos H y OH proyectndose hacia arriba o hacia abajo del anillo. Las bases de la designacin cr-D-glucosa se analizan en la siguiente seccin. e) Conformacin de la glucosa en silla, que muestra su estructura tridimensional con mayor precisin que el anillo plano del inciso d.f) Modelo de esferas y varillas de la glucosa en conformacin de silla, mostrando la posicin de los diferentes tomos de la molcula.

ten dos posibles configuraciones que no pueden superponerse. Estas dos molculas (llamadas estereoismeros o enantimeros) tienen prcticamente la misma reactividad qumica, pero estructuralmente son imgenes en espejo entre s. Por convencin, la molcula se llama D-gliceraldehido si el grupo hidroxilo del carbono 2 se proyecta a la derecha y L-gliceraldehido si se proyecta a la izquierda (fig. 2-12, c). Debido a que acta corno sitio de estereoisomerismo, el carbono 2 se denomina tomo de carbono asimtrico. Conforme el esqueleto de las molculas de azcar aumenta de longitud, ocurre lo mismo con el nmero de tomos de carbono asimtrico y, por consiguiente, con el numero de ismeros. Las aldotetrosas tienen dos carbonos asimtricos y por lo tanto pueden existir en cuatro configuraciones diferentes (fig. 2-13). De manera similar, hay ocho aldopentosas diferentes y 16 aldohexosas distintas. La designacin de cada uno de estos azcares como D o L se basa por convencin en la disposicin de los grupos unidos al tomo de carbono asimtrico ms alejado del aldehido, al cual se designa Cl. Si el grupo hidroxilo de este carbono se proyecta a la derecha, la aldosa es un D-azcar; si se proyecta a la izquierda es un L-azcar. Las enzimas presentes en las clulas vivas pueden distinguir entre las formas D y L de un azcar. En condiciones tpicas, slo uno de los estereoismeros (como la D-glucosa y la L-fucosa) es utilizado por las clulas. En la figura 2-11, c, se muestra la autorreaccin mediante la cual una molcula de glucosa de cadena recta se convierte en un anillo de seis miembros (piranosa). A diferencia de su precursor de cadena abierta, el Cl del anillo posee cuatro grupos diferentes y por lo tanto se convierte en nuevo centro de asimetra dentro de la molcula del azcar. Debido a este tomo extra de carbono asimtrico,

cada tipo de piranosa existe como estereoismero a y (3 (fig. 2-14). Por convencin, la molcula es una ce-piranosa cuando el grupo OH del primer carbono se proyecta por debajo del plano del anillo y una /3-piranosa cuando el grupo hidroxilo se proyecta hacia arriba. La diferencia entre las dos formas tiene consecuencias biolgicas importantes; por ejemplo, explica la forma compacta de las molculas de glucgeno y almidn, y la conformacin extendida de la celulosa (que analizaremos ms adelante). Unin de azcares entre s Los azcares se unen entre s mediante enlaces glucosdicos covalentes para formar molculas ms grandes. Estos enlaces se forman por una reaccin entre el tomo de carbono Cl de un azcar y el grupo hidroxilo de otro azcar, generando un enlace COC entre los dos azcares (como en la figura 2-15). Las molculas compuestas slo de dos unidades de azcar, como las mostradas en la figura 2-15, son disacridos. Los disacridos sirven principalmente como almacn de energa rpidamente'disponible. La sucrosa, o azcar de mesa, es uno de los principales componentes de la savia de las plantas y lleva energa qumica de una parte de la planta a otra. La lactosa, presente en la leche de la mayor parte de los mamferos, suministra a los mamferos recin nacidos el combustible para su crecimiento y desarrollo inicial. La lactosa de la dieta se hidroliza mediante una enzima lactasa, presente en la membrana plasmtica de las clulas que revisten el intestino. Muchas personas pierden esta enzima despus de la infancia y se dan cuenta que la ingestin de productos lcteos, que contienen lactosa, les causa malestar digestivo. Los azcares tambin se pueden unir para formar cadenas ms pequeas llamadas oligosacridos (aligo = esca-

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CAPITULO 2 Bases qumicas de a vida

CHO

CHO

HCOH I HCOH I CH?OH

HOCH I HCOH 1 CH2OH

CHO ! HCOH I HOCH 1 CH2OH

CHO

HOCH ! HOCH I CH2OH

D-eritrosa
(a)
D-gliceraldehdo

D-treosa

L-eritrosa

L-treosa

L-gliceraldehido

FIGURA 2-13. Aldotetrosas. Las aldotetrosas pueden existir en cuatro configuraciones debido a que poseen dos tomos de carbono asimtricos.

FIGURA 2-12. Estereoisomerismo del gliceraldehido. a) Los cuatro grupos unidos al tomo de carbono (marcados a, b, c, y d) ocupan las cuatro aristas de un tetraedro que tiene un tomo de carbono en su centro, b) El gliceraldehido es la nica aldosa de tres carbonos: su segundo tomo de carbono se enlaza a cuatro grupos diferentes (H, OH, CHO y CH2OH). Como resultado, el gliceraldehido puede existir en dos configuraciones posibles que no se pueden superponer entre s, ms bien son imgenes en espejo, como se indica en la figura. Estos dos estereoismeros (o enantimeros) se pueden distinguir por la configuracin de los cuatro grupos que rodean al tomo de carbono asimtrico (o quiral). Las soluciones de estos dos ismeros giran el plano de luz polarizada en direcciones opuestas y por lo tanto se dice que son "pticamente activos", c) Frmulas de cadena recta del gliceraldehido. Por convencin, se muestra el D-ismero con el tomo OH a la derecha.

so). Casi siempre estas cadenas se unen mediante enlaces covalentes a Hipidos y protenas convirtindolos en glucolpidos y glucoprotenas, respectivamente. Los oligosacridos son de particular importancia como glucolpidos y glucoprotenas de la membrana plasmtica donde se proyectan por encima de la superficie celular (vase fig. 4-15). Puesto que los oligosacridos se componen de muchas unidades de azcar en combinaciones diferentes, estos carbohidratos pueden desempear un papel informativo, o sea, pueden servir para distinguir un tipo de clula de otro y ayudar a mediar interacciones especficas de una clula con sus vecinos (seccin 7-1).

Polisacridos A mediados del siglo XIX se descubri que la sangre de las personas que sufran diabetes tena sabor dulce debido a una elevada concentracin de glucosa, el azcar clave del metabolismo energtico. Claude Bernard, prominente fisilogo francs de esa poca, estudi la causa de la diabetes investigando la fuente del azcar sanguneo. En aquella poca se asuma que todo azcar presente en la sangre de un ser humano o de un animal deba haberse consumido previamente en la dieta. Trabajando con perros, Bernard encontr que aun si los animales consuman una dieta totalmente carente de carbohidratos, su sangre todava contena una cantidad normal de glucosa. Claramente, la glucosa poda formarse en el cuerpo a partir de otros tipos de compuestos. Despus de nuevas investigaciones, Bernard encontr que la glucosa penetra a la sangre procedente del hgado. Observ que el tejido heptico contiene un polmero insolub!e de la glucosa al que llam glucgeno. Bernard concluy que varios materiales nutrientes (como las protenas) llegaban al hgado donde qumicamente eran convertidas en glucosa y se almacenaban como glucgeno. A continuacin, conforme el cuerpo necesitaba azcar como combustible, el glucgeno del hgado se transformaba en glucosa y se liberaba al torrente sanguneo para satisfacer las necesidades de glucosa de los tejidos con deplecin. En la hiptesis de Bernard, el equilibrio entre la formacin y la descomposicin de glucgeno en el hgado era el principal factor determinante para mantener la concentracin relativamente constante (homeosttica) de glucosa en la sangre. La hiptesis de Bernard era correcta. La molcula a la cual llam glucgeno es un tipo de polisacrido: un polmero de unidades de azcar juntas mediante enlaces glucosdicos. Glucgeno y almidn: polisacridos nurricionales. El glucgeno es un polmero que slo contiene un tipo de monmero: la glucosa (fig. 2-16, a). Casi todas las unidades de azcar de una molcula de glucgeno estn unidas entre s mediante enlaces glucosdicos a(1>4) (enlace tipo 2 en la figura 2-16, a). Ms o menos cada 10 unidades de azcar hay puntos de ramificacin; cada punto de ramificacin contiene un azcar unido a tres unidades vecinas en vez de dos, como en los segmentos no ramificados del polmero. El vecino extra, que forma la rama, est unido mediante un enlace glucosdico a(l->6) (enlace tipo 1 en la figura 2-16, o).

CAPITULO 2 Bases qumicas de la vida

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FIGURA 2-14. Formacin de una piranosa a y una/i. Cuando una molcula de glucosa sufre una autorreaccin para formar un anillo de piranosa (o sea un anillo de seis miembros), se generan dos estereoismeros. Los dos ismeros estn en equilibrio a travs de la forma de cadena abierta de la molcula. Por convencin, la molcula es una piranosa a cuando el grupo OH del primer carbono se proyecta por debajo del plano del anillo y una piranosa / cuando el grupo hidroxilo se proyecta hacia arriba.

CHOH
CH2OH

CH2OH
0. OH 0. H

OH

/f-D-glucopiranosa

a-D-glucopiranosa

En la mayor parte de los animales, el glucgeno sirve como almacn del exceso de energa qumica; por ejemplo, el msculo esqueltico del ser humano por lo general contiene suficiente glucgeno para sostener una actividad moderada durante casi 30 minutos. En condiciones tpicas y dependiendo de varios factores, el peso molecular del glucgeno vara de uno a cuatro millones de daltons. El glucgeno se almacena en las clulas en forma muy concentrada; se observa como granulos irregulares teidos de color oscuro en las micrografas electrnicas (fig. 2-16, a, lado derecho). La mayor parte de las plantas almacenan su excedente de energa qumica en forma de almidn, un polmero de la

Sucrosa
CH2OH

OH

Lactosa CH2OH CH2OH

OH

OH

(b)
FIGURA 2-15. Disacridos. Sucrosa y lactosa son dos de los disacridos ms comunes. La sucrosa se compone de glucosa y fructosa juntas por una unin a(l2), en tanto que la lactosa se compone de glucosa y galactosa juntas porua unin /(l->4). Estos disacridos no se forman en la clula por reaccin simple, sino que requieren la transferencia de uno de los azcares a partir de un transportador (especficamente un azcar nucletido, como la UDP-glucosa o la UDP-galactosa).

glucosa igual que el glucgeno. Las patatas y los cereales, por ejemplo, contienen principalmente almidn. En realidad, el almidn es una mezcla de dos polmeros diferentes, amilosa y amilopectina. La anulosa es una molcula helicoidal no ramificada cuyos azcares estn unidos por enlaces a(l-4) (fig. 2-16, b), en tanto que la amilopectina es ramificada. La amilopectina difiere del glucgeno por ser mucho menos ramificada y con peso molecular total tambin mucho ms bajo (unos 500 000 daltons). El almidn se almacena en forma de granos incluidos en la membrana que rodea los organelos (plsmdos) dentro de la clula vegetal (fig. 2-16, b, lado derecho). Aunque los animales no sintetizan almidn, poseen una enzima (amilasa) que hidroliza rpidamente las molculas de almidn. Celulosa, quitina y glucosaminglicanes: polisacridos estructurales. Algunos polisacridos constituyen almacenes de energa fcilmente digerible, en tanto que otros forman materiales estructurales resistentes y durables. El algodn y el lino, por ejemplo, constan sobre todo de celulosa, un polisacrido estructural que constituye el principal componente de la pared de las clulas vegetales. Las telas de algodn deben su durabilidad a molculas de celulosa no ramificadas y largas que se ordenan en agregados lado con lado para formar cordones moleculares (lado derecho de la figura 2-16, c), idealmente construidos para resistir fuerzas de tensin (tnsiles). Igual que el glucgeno y el almidn, la celulosa slo contiene monmeros de glucosa; sus propiedades difieren de manera espectacular de las de otros polisacridos debido a que las unidades de glucosa estn unidas por enlaces /3(l-4) (enlace 3 en la figura 2-16, c) en vez de enlaces a(l-4). Irnicamente, los animales multicelulares (con raras excepciones) carecen de la enzima necesaria para descomponer la celulosa, que es el material orgnico ms abundante sobre la tierra y rico en energa qumica, Los animales que "pueden vivir" digiriendo celulosa, como las termitas y las ovejas, pueden hacerlo porque albergan bacterias y protozoarios (fig. 2-17) que sintetizan la enzima necesaria, celulosa. No todos los polisacridos biolgicos contienen monmeros de glucosa. La quitina es un polmero no ramificado del azcar Af-acetilglucosamina, similar en estructura a la glucosa, pero que tiene un grupo acetilamina en vez de un grupo hidroxilo enlazado al segundo tomo del anillo.

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CAPITULO 2 Bases qumicas de la vida

(a)

Glucgeno

(b)

Almidn

Celulosa

FIGURA 2-16. Tres polisacridos con idnticos monomeros de azcar, pero con propiedades espectacularmente diferentes. Glucgeno (a), almidn (b) y celulosa (c), cada uno compuesto totalmente de subunidades de glucosa, pero sus propiedades fsicas y qumicas son muy diferentes debido a las distintas formas en que los monomeros se unen (los nmeros dentro de los crculos indican tres tipos diferentes de uniones). Las molculas de glucgeno son las ms ampliamente ramificadas, las molculas de almidn adoptan disposicin helicoidal y las de celulosa no estn ramificadas, pero s muy extendidas. El glucgeno y el almidn son almacenes de energa, en tanto que las molculas de celulosa se unen formando haces apretados de fibras adecuados para su papel estructural. Las micrografas electrnicas muestran granulos de glucgeno en una clula heptica, granos de almidn (amiloplastos) en una semilla vegetal y fibras de celulosa en la pared de una clula vegetal. (Fotografas de los recuadros: arriba, Don Faivcett/Visuals Unlimited; centro, Jeremy Burgess/Photo Researchers; abajo, Cabisco/Visuals Unlimied.)

CH2OH

HNCOCH, A/-Acetlglucosamna

La quitina es un material estructural ampliamente distribuido entre los invertebrados, particularmente en la cubier-

ta externa de insectos, araas y crustceos. Es correosa, resistente pero flexible, no muy diferente a ciertos plsticos. Los insectos deben gran parte de su xito a este polisacrido altamente adaptable que los cubre (fig. 2-18). Otro grupo de polisacridos con una estructura ms compleja son los glucosaminglicanes (o GAG). A diferencia de otros polisacridos, poseen la estructura AB AB, donde A y B representan dos azcares diferentes. Estos polisacridos se encuentran principalmente en los espacios que rodean la clula, y su estructura y funcin sern consideradas con mayor detalle en la seccin 7-1, donde se analiza el tema del espacio extracelular.

CAPITULO 2 Bases qumicas de la vida

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Fraccin glicerol

Fragmento de cido graso

FIGURA 2-17. Frotista flagelado aislado del intestino de una termita. Estos microorganismos poseen la celulasa Requerida para digerir las partculas de madera ingeridas por el insecto. (Tomado de Ee Grave/Phototake.)

Lpidos
Los lpidos son un grupo de diversas molculas biolgicas no polares cuya nica propiedad comn es su capacidad para disolverse en solventes orgnicos, como cloroformo y benzeno, y su incapacidad para disolverse en agua, propie-

O H H H H H H H H H H H H H H H H H II i I i t I I < I I I I I I I I I I HO-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-H I l I I l I I I I I I I I ! I I I H H H H H H H H H H H H H H H H H

Triestearato

(c)

Aceite de linaza

(d)
FIGURA 2-19. Grasas y cidos grasos, a) Estructura bsica de un triacilglicerol (tambin llamado triglcrido o grasa neutra). El radical glicerol indicado en color naranja est unido mediante tres enlaces ster al grupo carboxilo de tres cidos grasos cuyos extremos se indican en verde, b) Acido esterico, un cido graso saturado de 18 carbonos comn en grasas de animales, c) Modelo de espacios llenos del triestearato, un triacilglicerol que contiene tres cadenas idnticas de cido esterico, d) Modelo de espacio lleno del aceite de linaza, un triacilglicerol que contiene dos cidos grasos insaturados diferentes derivados de las semillas del lino. Los sitios de insaturacin, que producen enrollamientos en la molcula, se indica por barras de color amarillo-naranja.

FIGURA 2-18. La quitina es el componente primario del reluciente esqueleto externo de este saltamontes. (Segn Robert y Linda Mitchell.)

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CAPITULO 2 - Bases qumicas de la vida

dad que explica muchas de sus variadas funciones biolgicas. Los lpidos importantes en la funcin celular incluyen grasas, esferoides y fosfolpidos. Aunque ninguna de estas molculas lpidas es lo bastante grande para llamarse rnacromolcula, con frecuencia se agregan (como en las gotas de grasa o en las membranas) para formar complejos suficientemente grandes que pueden verse con el microscopio de luz. Grasas Las grasas constan de una molcula de glicerol unida mediante un enlace ster a tres cidos grasos; la molcula as formada se denomina triacilgHcerol (fig. 2-19, a). Iniciaremos considerando la estructura de los cidos grasos. Los cidos grasos son hidrocarburos de cadena larga no ramificada con un solo grupo carboxilo en un extremo (fig. 2-19, b). Puesto que los dos extremos de la molcula de un cido graso tienen estructura muy diferente, tambin tienen propiedades diferentes, La cadena del hidrocarburo es hidrofbica, en tanto que el grupo carboxilo (COOH) que posee una carga negativa a pH fisiolgico es hidroflica. Las molculas que tienen regiones hidrofbicas e hidroflicas se denominan anfipticas; estas molculas tienen propiedades biolgicas importantes poco comunes. Las propiedades de los cidos grasos se pueden apreciar considerando el empleo de un producto familiar, el jabn, que contiene cidos grasos. Antiguamente, los jabones se elaboraban calentando grasa de animales en un lcali fuerte (NaOH o KOH) para romper los enlaces entre los cidos grasos y el glicerol. En la actualidad, la mayor parte de los jabones se elaboran por sntesis. Los jabones deben su gran capacidad para disolver grasas al hecho de que el extremo hidrofbico de cada cido graso puede integrarse a la grasa, en tanto que el extremo hidroflico puede interactuar con el agua que lo rodea. Como resultado, los materiales grasos se convierten en complejos (micelas) dispersables por el agua (fig. 2-20). Los cidos grasos difieren entre s en la longitud de su cadena hidrocarbonada y la presencia o ausencia de dobles enlaces. En condiciones tpicas, los cidos grasos presentes en las clulas tienen una longitud que vara de 14 a 20 carbonos. Los cidos grasos que carecen de dobles enlaces, como el cido esterico (fig. 2-19, b) se describe como saturados; los que poseen dobles enlaces son no saturados. Que las unidades para construir el cido graso sean saturadas o no saturadas y el grado de insaturacin (nmero de dobles enlaces) tienen consecuencias importantes. Los dobles enlaces (de configuracin cis)

Agua

FIGURA 2-20. Los jabones constan de cidos grasos. En este dibujo esquematizado de una micela de jabn, los extremos no polares de los cidos grasos se dirigen hacia adentro, donde interactan con la materia grasa que deben disolver. Las cabezas con carga negativa se localizan en la superficie de la micela donde interactan con el agua que las rodea. Las membranas de protenas, que tambin tienden a ser insoluoles en agua, se pueden solubilizar en esta forma mediante la extraccin de membranas con detergentes.

componente comn de las grasas animales y se conserva en estado slido a temperaturas muy por arriba de la ambiental. Por lo contrario, la abundancia de dobles enlaces en las grasas vegetales explica su estado lquido, tanto dentro de las clulas vegetales como en los armarios de las tiendas, as como el principio de la etiqueta de "poliinsaturadas". Las grasas lquidas a temperatura ambiente se denominan aceites. La figura 2-19, d, muestra la estructura del aceite de linaza, un lpido muy voltil extrado de las semillas de lino que se conserva en estado lquido a temperatura mucho ms baja que el triestearato. Grasas slidas, como la margarina, estn formadas por aceites vegetales insaturados mediante la reduccin qumica de los dobles enlaces por tomos de hidrgeno (proceso denominado hidrogenacin). Una molcula de grasa puede contener tres cidos grasos idnticos (como en la figura 2-19, c), o puede ser una grasa mixta que contiene ms de una especie de cido graso (como H H H C en la 2-19, d). La mayor parte de las grasas naturales, \C como opuesto a figura CC como el aceite de oliva o la mantequilla, son mezclas de molculas que poseen diferentes especies de cidos grasos. C C H C Las grasas son muy ricas en energa qumica; un gramo ris trans de grasa contiene el doble de la energa de un gramo de producen enrollamientos en una cadena de cidos grasos. carbohidrato (por razones que se analizan en la seccin 3-1). Por consiguiente, cuanto ms dobles enlaces posea la cadeLos carbohidratos funcionan principalmente como fuente na de cidos grasos, ms difcil ser empacar estas largas de energa rpidamente disponible a corto plazo, en tanto cadenas. Esto disminuye la temperatura de fusin de un que las reservas de grasa almacenan energa a largo plazo. cido graso que contiene lpidos. El triestearato, cuyos ciSe estima que una persona de estatura promedio contiene dos grasos carecen de dobles enlaces (fig. 2-19, c), es un cerca de 0.5 de kilogramo (kg) de carbohidratos, principal-

CAPITULO 2 Bases qumicas de la vida

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mente en forma de glucgeno. Esta cantidad de carbohidratos suministra unas 2 000 kcal de energa total. En el curso de un da de ejercicio extenuante una persona puede agotar casi toda la reserva de carbohidratos de su cuerpo. Por lo contrario, la persona promedio contiene cerca de 16 kg de grasa (equivalente a 144 000 kcal de energa), y como todos sabemos, puede tomar mucho tiempo agotar nuestra reserva de este material. Puesto que las grasas carecen de grupos polares, son sumamente insolubles en agua y se almacenan en las clulas en forma de gotas de lpidos secos. Como las gotas de lpidos no contienen agua como los granulos de glucosa, representan un almacn de combustible muy concentrado. En muchos animales, las grasas se almacenan en clulas especiales (adipocitos) cuyo citoplasma se llena con una sola gota de grasa. Los adipocitos muestran una notable capacidad para cambiar de volumen y adaptarse a cantidades variables de grasa.
Esteroides

contienen grandes cantidades de compuestos relacionados con colesterol.

Fosfolpidos

Los esteroides se construyen alrededor de un esqueleto caracterstico de cuatro anillos de hidrocarburo. Unos de los esteroides ms importantes es el colesterol, componente de las membranas celulares de animales y precursor para las sntesis de numerosas hormonas esteroides, como testosterona, progesterona y estrgenos (fig. 2-21). El colesterol est ausente principalmente en clulas vegetales, y por esta razn los aceites vegetales se consideran "libres de colesterol", pero las membranas celulares de las plantas a veces

En la figura 2-22 se muestra la estructura de un fosfolpido comn. La molcula recuerda una grasa (triacilglicerol) pero slo tiene dos cadenas de cidos grasos en vez de tres; es un diacglicerol. El tercer grupo hidroxilo del esqueleto del glicerol est unido mediante un enlace covalente a un grupo fosfato (en vez de un tercer cido graso), que a su vez mantiene un enlace covalente con un pequeo grupo polar como la colina, segn se muestra en la figura 2-22. As, las molculas de grasa, a diferencia de los fosfolpidos, contienen dos extremos con propiedades muy diferentes: un extremo que contiene el grupo fosfato y tiene carcter claramente hidroflico, en tanto que el otro extremo compuesto de dos colas de cido graso tiene carcter distintivamente hidrofbico. Puesto que la nica y principal funcin celular de los fosfolpidos se deriva de su presencia en la membrana celular, y dado que las propiedades de las membranas celulares dependen de sus elementos fosfolpidos, estudiaremos la estructura de otros fosfolpidos y sus funciones en relacin con las membranas celulares en la seccin 4-2.

Protenas
Las protenas son las macromolculas que ejecutan prcticamente todas las actividades de la clula; son las molculas encargadas de que las cosas ocurran. Se estima que una clula tpica de un mamfero puede tener hasta 10 000 protenas diferentes en diversas disposiciones y funciones. Como enzimas, las protenas aceleran grandemente la velocidad de las reacciones metablicas; como fibras estructurales, las protenas suministran apoyo mecnico dentro de las clulas y en su permetro exterior (fig. 2-23, a); como hormonas, factores de crecimiento y activadores de gen, las protenas

Colesterol

Fosfato

Testosterona Colina

o HC-O-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-H HHHHHHH.HHHHHHHHHH ?HHH'HHH'HHHHHHHHHHH H2c-o-c-c-c-c-c-c-c-c-c-c-c-c-c-c-c-c-c-c-H

HHHHHHHH.HHHHHHHHH

Estrgeno

Grupo de la cabeza polar

Esqueleto del glicerol

Cadenas de cidos grasos

FIGURA 2-21. Estructura de los esteroides. Todos los esteroides comparten el mismo esqueleto bsico de cuatro anillos. Diferencias aparentemente mnimas de estructura qumica entre colesterol, testosterona y estrgenos generan profundas diferencias biolgicas.

FIGURA 2-22. Fosfatidilcolina, un fosfolpido comn. La molcula consta de un esqueleto de glicerol cuyos grupos hidroxilo se enlazan en forma covalente a dos cidos grasos y un grupo fosfato. El grupo fosfato posee carga negativa y tambin se enlaza a un grupo colina pequeo con carga positiva. El extremo de la molcula que contiene la fosforilcolina es muy hidrosoluble, en tanto que el extremo opuesto, que consta de un cido graso, es insoluble en agua. La estructura y funcin de la fosfatidilcolina y de otros fosfolpidos se analiza en deltalle en la seccin 4-2.

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CAPITULO 2 Bases qumicas de a vida

(a)

(b)

FIGURA 2-23. Dos ejemplos de los miles de estructuras biolgicas compuestas de manera predominante por protenas. Estas incluyen: a) plumas, empleadas para aislamiento trmico, para volar y para reconocer el sexo de la aves, y b) el cristalino del ojo, como el de esta araa, que le sirve para enfocar los rayos de luz. (a: Tomado de Frans Lanting/Allstcck, Inc/Tony Stone Images. New York; b: Mantis Wildlife Films/Oxford Sdeniific FUms/Animals Animis.)

ejecutan una gran variedad de funciones reguladoras; como receptores y transportadores en la membrana, las protenas determinan cules clulas reaccionan y qu tipos de sustancias penetran o salen de la clula; como elementos contrctiles, las protenas constituyen el mecanismo biolgico del movimiento. Entre sus muchas y diversas funciones, las protenas actan como anticuerpos, sirven como toxinas, forman cogulos sanguneos, absorben o refractan la luz (fig, 2-23, b) y transportan sustancias de una parte del cuerpo a otra. Cmo puede un tipo de molcula tener tan variadas funciones? La explicacin reside en las formas prcticamente ilimitadas que pueden adoptar las protenas como grupo. En otras palabras, las protenas son capaces de una variedad tan amplia de actividades debido a la gran diversidad de estructuras que pueden formar. Sin embargo, dentro de este grupo cada protena tiene una estructura nica altamente ordenada que le permite efectuar una funcin particular. Lo ms importante es que las protenas tienen formas que les permiten interactuar de manera selectiva con otras molculas. En otras palabras, las protenas muestran un alto grado de especificidad, propiedad que les ayuda a mantener el orden y la complejidad caractersticos de la vida.
Unidades estructurales de las protenas

Las protenas son polmeros formados por monmeros aminocidos. Cada protena tiene una secuencia nica de aminocidos que confiere a la molcula sus propiedades nicas. Gran parte de las propiedades de una protena se pueden entender examinando las propiedades qumicas de

los aminocidos que las constituyen. En las protenas se encuentran comnmente 20 aminocidos diferentes, sean protenas de un virus o de un ser humano. Hay dos aspectos de la estructura de los aminocidos que deben considerarse: las que son comunes a todos ellos y las que son nicas para cada uno. Empezaremos con las propiedades compartidas. Estructura de los aminocidos. Todos los aminocidos poseen un grupo amino y un grupo carboxilo separados entre s por un solo tomo de carbono, el carbono a {fig. 2-24, a,b). En la pgina 43 vimos que el tomo de carbono de las molculas de azcar se enlaza a cuatro grupos diferentes en dos configuraciones (estereoismeros) que no pueden superponerse entre s. Lo mismo es cierto para los aminocidos. Con excepcin de la glicina, el carbono a de los aminocidos se enlaza a cuatro grupos diferentes, de modo que cada aminocido existe en una forma D y una L (fig. 2-25). Los aminocidos aislados de las protenas, cualquiera que sea su origen, son aminocidos L. Por qu no se encuentran aminocidos D de las protenas? Esta es una pregunta interesante y debatida desde hace mucho tiempo. Durante el proceso de sntesis de protenas, cada aminocido se une a otros dos aminocidos formando un polmero largo, continuo, no ramificado, denominado cadena de polipptidos. Los aminocidos que componen una cadena de polipptidos se juntan por enlaces peptdicos como resultado de la unin del grupo carboxilo de un aminocido con el grupo amino de su vecino, eliminando una molcula de agua (fig. 2-24, c). Una cadena de polipptidos compuesta de una cadena de aminocidos unidos por enlaces peptdicos tiene el siguiente esqueleto:

CAPITULO 2 Bases qumicas de la vida

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o-A!anina

L-Alanina

(a)

Cadena lateral

R '^

Grupo amino

Grupo carboxilo

(b)
R R

FIGURA 2-25. Estereoisomerismo de aminocidos. Puesto que el carbono a de todos los aminocidos, excepto la glicina, se encuentra unido a cuatro grupos diferentes, puede haber dos estereoismeros. Se muestran las formas D y L de la alanina.

H NC COH HNC COH I II + I II H H O H H O

-C' II O

Enlace peptdico
(c)

FIGURA 2-24. Estructura de los aminocidos. Modelo de esferas y palitos (a) y frmula qumica (b) de un aminocido generalizado en el cual R puede ser cualquiera de un gran nmero de grupos qumicos (vase figura 2-26). En solucin neutra, el grupo a carboxilo pierde su protn y existe cargado negativamente (COO~), y el grupo a amino acepta un protn y existe cargado positivamente (NH3+). c) La condensacin de dos aminocidos produce un enlace peptdico dibujado aqu en su estado sin carga. En la clula, esta reaccin ocurre sobre un ribosoma conforme se transfiere un aminocido del transportador (una molcula RNAt) sobre el extremo de una cadena de polipptidos en crecimiento.

del extremo opuesto, el C-terminal, tiene un grupo a-carboxilo libre. Propiedades de los grupos R. El esqueleto de una cadena de polipptidos est compuesto por la parte comn de cada aminocido entre ellos. l resto de cada aminocido, el grupo R o cadena lateral (vase fig. 2-26), es muy variable entre los 20 bloques de construccin y esta variabilidad confiere a las protenas su versatilidad. Si se consideran todos los aminocidos en conjunto, hay una gran variedad de reacciones orgnicas en las cuales pueden participar y formar una variedad mucho mayor de tipos de enlace. Las variadas caractersticas de los grupos R de los aminocidos son importantes en las interacciones intramoleculares que determinan la estructura de la molcula y en las interacciones mfermoleculares que determinan las actividades que puede efectuar la protena. Los aminocidos se clasifican convenientemente segn las caractersticas polar y no polar de sus grupos R. Por lo regular pertenecen a cuatro categoras: polar con carga, polar sin carga, no polar y aquellos con propiedades nicas (fig. 2-26). 1. Polar con carga. Los aminocidos de este grupo incluyen cido asprtico, cido glutmico, usina y arginina. Estos cuatro aminocidos contienen grupos R capaces de contener carga neta; o sea, los grupos R contienen cidos y bases orgnicos relativamente fuertes. Las reacciones de ionizacin del cido glutmico y de la Usina se muestran en la figura 2-27. A pH fisiolgico, os grupos R de estos aminocidos casi siempre presentan carga neta. Por consiguiente, son capaces de formar enlaces inicos con otras especies cargadas dentro de las clulas. Por ejemplo, los residuos de arginina con carga positiva de las protenas histona se unen mediante enlaces inicos con los grupos fosfato cargados negativamente de DNA (vase fig. 2-3). La histidina tambin se considera un aminocido polar cargado, aunque en la mayor parte de los casos slo presenta carga parcial a pH fisiolgico. En realidad, debido a su capacidad para ganar o perder un protn en el intervalo de pH fisiolgico, la histidina es un residuo particularmente importante en la regin activa de muchas protenas.

Enlace peptdico

Una vez incorporados a una cadena de polipptidos los aminocidos se llaman residuos. El residuo del extremo de la cadena, el N-terminal, contiene un aminocido con un grupo a-amino libre (no enlazado), en tanto que el residuo

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CAPITULO 2 Bases qumicas de la vida

Polar con carga neta

H2-NH2

C-NH

Acido asprtico

Acido glutmico

Usina

Arginina

(Asp o D)
Propiedades del grupo R:

(Glu o E)

(Lis o K)

(Arg o R)

Histidina (HisoH)

Los grupos hidroflicos R actan como cidos o bases con tendencia a mostrar caiga completa (+ o en condiciones fisiolgicas. Los grupos R forman enlaces inicos y con frecuencia participan en reacciones qumicas.

Polar sin carga neta

OH CH, H-(f -(-OH

Serina (SeroS) Propiedades del grupo R:

Treonina (TroT)

Glutamina (G!n o Q)

Asparagna (Asn o N)

Tirosina (Tir o Y)

Los grupos hidroflicos R tienden a mostrar carga parcial + o - que les permite participar en reacciones qumicas, forman enlaces H y se asocian al agua No polar

XCH3

H2N-C-C-OH Alantna (AlaoA)

H2N-C~C-OH

H,N-C~C-OH Leucma Isoieucina le o) Metionina (Me o M) Fenifalanina (Fen o F) Triptfano

ama
(ValoV)

(Leu o L)

(Trp o W)

Propiedades del grupo R: Los grupos hidrofbicos R constan casi por completo de tomos de C y H. Estos aminocidos tienden a formar el ncleo ms interno de las protenas solubles, ocultos del medio acuoso. Desempean un papel importante en las membranas porque se asocian a la bicapa de lpidos. Grupos R con propiedades nicas
H

CH 5 CHo i I
2

Glicina (Gii o G) El grupo R slo contiene un tomo de hidrgeno y puede adaptarse a un ambiente hidroflico o hidrofbico. La glicina a menudo reside en sitios donde dos polipptidos entran en contacto ntimo.

Cistena (Gis o C} Aunque el grupo R es polar, presenta caractersticas de grupo no cargado, tiene la propiedad especial de formar un enlace covalente con otra cistena para formar una unin disulfuro.

Prolina (Pro o P) Aunque el grupo R es de carcter hidrofbico tiene la propiedad especial de crear enrollamientos en las cadenas de polipptidos y romper estructuras secundarias ordenadas.

CAPITULO 2 Bases qumicas de la vida

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Vo
CH

V"
CH

-N-C-CI I II H H O

-N-C-CI 1 II H H O

(a)
H
+NH,

I z CH, I 2 CH? I 2 CH2

CH2

NHI 2 CH2 CH2

CH,,

I 2 CH2

-N-C-CI 1 II H H O

-N-C-C1 I 11 H H O

(b)

FIGURA 2-27. Ionizacin de aminocidos polares cargados, a) El grupo R del cido glutmico pierde un protn cuando su grupo cido carboxlico se ioniza. El grado de ionizacin del grupo carboxilo depende del pH del medio: cuanto mayor sea la concentracin de hidrgenos (pH ms bajo), menor es el porcentaje de grupos carboxilo presentes en estado ionizado. Inversamente, una elevacin del pH incrementa la ionizacin del protn del grupo carboxilo, aumentando el porcentaje de grupos R con carga negativa del cido glutmico. El pH al cual 50% ce los grupos R se ionizan y 50% no lo estn se denomina pK, que para el grupo R del cido glutmico libre es de 4.4. A pH fisiolgico prcticamente todos los residuos de cido glutmico poseen carga negativa, b) El grupo R de la Usina se ioniza cuando su grupo amino gana un protn. Cuanto mayor sea la concentracin de ion hdroxilo (pH ms alto) menor el porcentaje de grupos amino con carga positiva. El pH al cual 50% de los grupos R de lisina estn cargados y 50% no lo estn es 10.0, ei pK para el grupo R de lisina libre. A pH fisiolgico, prcticamente todos Jos residuos de usina poseen carga positiva.

3. No polar. En el otro extremo, aparte de los incluidos en la primera categora se encuentran los aminocidos cuyas cadenas laterales son hidrofbicas y no tienen capacidad para formar enlaces electrostticos o interactuar con el agua. Los aminocidos de esta categora son alanina, valina, leucina, isoleucina, triptfano, fenilalanina y metionina. Las cadenas laterales de los aminocidos no polares por lo general carecen de oxgeno y nitrgeno. Varan sobre todo en forma y tamao, esto permite a algunos de ellos introducirse apretadamente en un espacio particular dentro del ncleo de una protena, reunindose entre s como consecuencia de las fuerzas de van der Waals y de interacciones hidrofbicas. 4. Los otros tres aminocidos, glicina, prolina y cisterna, tienen propiedades nicas que los distinguen de los dems. El grupo R de la glicina consta de un solo tomo de hidrgeno y slo por esta razn la glicina es un aminocido muy importante. Debido a la falta de una cadena lateral, los residuos de glicina permiten que los esqueletos de dos polipptidos (o de dos segmentos del mismo polipptido) se aproximen entre s muy estrechamente. Adems, la glicina es ms flexible que otros aminocidos y es til en las porciones del esqueleto que necesitan moverse o formar articulaciones. La prolina es nica porque tiene sus grupos a-amino como parte de un anillo (convirtindola en un iminocido). La prolina es un aminocido hidrofbico que no adopta con facilidad una estructura secundaria ordenada (que analizaremos posteriormente). La cistena contiene un grupo sulfhidrilo (SH) reactivo que con frecuencia aparece unido a otro residuo de cistena mediante un enlace covalente, como un puente disulfuro (SS).

Cisterna

H H O I I II -N-C-CI CH? I SH

H I

H I I
CH, I

O II

N-C-C-

Oxidacin

2. Polar sin carga. Los grupos R de estos aminocidos slo son dbilmente cidos o bsicos. Aunque estos grupos no tienen carga completa a pH fisiolgico, contienen tomos con carga parcial negativa o positiva y por lo tanto pueden formar enlaces de hidrgeno con otras molculas, incluyendo el agua. Estos aminocidos casi siempre son muy reactivos. En esta categora se incluyen asparagina y glutamina (amidas del cido asprtico y del cido glutmico), treonina, serina y tirosna

SH Reduccin I I CH2 CH2 I -N-C-C -N-C-CI I II I I II H H O H H O

S I S

2H' + 2e*

FIGURA 2-26 Estructura qumica de los aminocidos. Estos 20 aminocidos representan a los que se encuentran con mayor frecuencia en las protenas y, ms especficamente, a los codificados por DNA. Puede haber otros aminocidos corno consecuencia de la modificacin de alguno de los aqu mostrados. Los aminocidos se disponen en cuatro grupos, como se describe en el texto, y se muestran en su estado no ionizado.

Los puentes de disulfuro casi siempre se forman entre dos cistenas distantes entre s en el esqueleto del polipptido o incluso en dos polipptidos separados. Estos puentes disulfuro ayudan a estabilizar las intrincadas formas de protenas, particularmente las que se presentan fuera de las clulas donde estn sujetas a tensin fsica adicional.

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CAPITULO 2 Bases qumicas de la vida

No todos los aminocidos descritos antes se encuentran en todas las protenas, ni todos los aminocidos presentes estn distribuidos de manera equivalente. Tambin hay algunos otros aminocidos en las protenas, pero son resultado de la alteracin de uno de los 20 aminocidos bsicos despus de incorporarse a la cadena del polipptido. El carcter inico, polar o no polar, de la cadena lateral de los aminocidos es muy importante en la estructura y funcin de la protena. Las protenas ms solubles (es decir, que no forman parte de la membrana) estn construidas de modo que los residuos polares se siten en la superficie de la molcula donde puedan unirse con las molculas de agua circunvecinas y contribuir a la solubilidad de la protena en solucin acuosa (fig. 2-28, a). Por lo contrario, los residuos no polares se encuentran empacados en el ncleo central de la molcula, lejos del medio acuoso (fig. 2-28, b). En muchas enzimas, grupos polares reactivos se proyectan en el interior no polar y confieren a la protena su actividad cataltica. Por ejemplo, un medio no polar incrementa mucho las interacciones inicas entre grupos cargados que en un ambiente acuoso se reduciran por competencia con el agua. Algunas reacciones que proceden a una velocidad imperceptible en el agua ocurren en milsimas de segundo dentro de una protena. Cuando se consideren las protenas de la membrana en el captulo 4 ser ms evidente la importancia de la localiza-

cin de los residuos hidrofbico e hidroflico. El arreglo de hidrofbco adentro e hidroflico afuera es una adaptacin al medio acuoso. Si se altera mucho este ambiente, como ocurre dentro de las membranas biolgicas, la organizacin de las protenas puede invertirse. Muchas protenas contienen otras sustancias adems de aminocidos; stas se denominan protenas conjugadas. Las protenas conjugadas incluyen las unidas mediante enlaces covalentes o no covalentes a los cidos nucleicos, las nudeoprotenas; a lpidos, las lipoprotenas; a carbohidratos, las glucoprotenas; o a diferentes materiales de bajo peso molecular, incluyendo metales y grupos que contienen metales.
Estructura de las protenas

En ninguna otra parte de la biologa se ilustra mejor la relacin ntima entre forma y funcin que en las protenas. Las protenas son molculas enormes, complejas, pero su estructura en cualquier ambiente dado es completamente definible y predecible. Cada aminocido de una protena se localiza en un sitio especfico dentro de estas molculas gigantes confiriendo a la protena la estructura y reactividad necesarias para la funcin que debe desempear. La estructura de la protena se puede describir a diferentes niveles de organizacin, cada uno remarcando un aspecto diferente y a su vez cada uno dependiente de diferentes

FIURA 2-28. Disposicin de los aminocidos hidroflicos e hidrofbicos en la protena soluble citocromo c. ) Las cadenas laterales hidroflicas, mostradas en color verde, se localizan principalmente en la superficie de la protena donde entran en contacto con el medio acuoso que las rodea, b) Los residuos hidrofbicos, mostrados en rojo, se localizan sobre todo en el centro de la protena, en especial en la vecindad del grupo hem central. (Copyright rving Geis.)

CAPITULO 2 - Bases qumicas de la vida

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tipos de interacciones. De ordinario se describen cuatro niveles: primario, secundario, terciario y cuaternario. El primero, la estructura primaria, se refiere a la secuencia de aminocidos de una protena, en tanto que los otros tres niveles se relacionan con la organizacin de la molcula en el espacio. Estructura primaria. La estructura primaria de un polipptido es la secuencia lineal de aminocidos especficos que constituyen !a cadena. Con 20 diferentes bloques de construccin, el nmero de polipptidos variados que puede formarse es 20", donde n es el nmero de aminocidos en la cadena. Puesto que la mayor parte de los polipptidos contienen ms de 100 aminocidos (y algunos miles), la variedad de posibles secuencias es prcticamente ilimitada. La informacin del orden preciso de los aminocidos en cada protena que un organismo puede producir se incluye en la herencia gentica de dicho organismo. Como veremos despus, la secuencia de aminocidos suministra la mayor parte, si es que no toda, la informacin requerida para determinar la configuracin tridimensional de la molcula y por lo tanto su funcin. Por consiguiente, la secuencia de aminocidos es de la mayor importancia y los cambios que se originan en dicha secuencia como resultado de mutaciones genticas del DNA no se pueden tolerar fcilmente. El primer ejemplo y mejor estudiado de esta relacin es el cambio en la secuencia de aminocidos de la hemoglobina que da como resultado la enfermedad anemia drepanoctica. Esta anemia grave, hereditaria, es resultado de un solo cambio en la secuencia de aminocidos dentro de la molcula ffig. 2-29, a, b); en el sitio donde normalmente se encuentra un cido glutmico hay una valina. Esto corresponde a la sustitucin de un aminocido polar con carga por uno no polar (vase fig. 2-26). Todos los problemas relacionados con la forma del eritrocito (fig. 2-29, c] y la disminucin de la capacidad para transportar oxgeno en las personas con anemia drepanoctica son consecuencia

de este nico cambio. En muchos otros casos los cambios de los aminocidos tienen poco efecto, segn puede observarse por las diferencias en la secuencia de aminocidos de una misma protena entre organismos relacionados. El grado de tolerancia de los cambios en la secuencia primaria dependen de la magnitud de la alteracin en la forma de la protena o de los residuos funcionales criticos. La secuencia de aminocidos de una protena fue determinada por primera vez a principios de los aos 1950 por Frederick Sanger y sus colaboradores, en la Universidad de Cambridge, empleando una hormona, la protena insulina. Para trabajar se eligi la insulina de ternera debido a su disponibilidad y a su pequeo tamao: dos cadenas de polipptidos de 21 y 30 aminocidos cada una. La secuenciacin de la insulina fue una verdadera proeza en el reciente campo de la biologa molecular. Revel que las protenas, las molculas ms complejas de la clula, tenan una subestructura especfica definible que no era regular ni repetitiva, como la de los polsacridos. En la actualidad se ha logrado la secuenciacin de varios mies de protenas, o que ha suministrado informacin valiosa acerca de sus estructuras, mecanismos de accin y evolucin. Estructura secundaria. Toda la materia existe en el espacio y por lo tanto tiene una estructura tridimensionai. Las protenas se forman mediante uniones entre un gran nmero de tomos; por consiguiente, su forma es compleja. El trmino conformacin se refiere al arreglo tridimensional de los tomos de la molcula, o sea, su organizacin espacial. La estructura secundaria describe la conformacin de partes de la cadena de polipptidos. Los primeros estudios acerca de la estructura secundaria de las protenas fueron efectuados por Linus Pauling y Robert Corey del Cali-

(a)

(b)

FIGURA 2-29. Bases moleculares de la anemia drepanoctica. a,b) Cromatografas que muestran la separacin de pptidos obtenidos mediante tratamiento de la hemoglobina normal (a) o de la hemoglobina de un drepanocito (b) con la enzima proteoltica tripsina. Las dos cromatografas son idnticas, con excepcin de un pptido (marcado) que contiene un solo aminocido diferente, c) Micrografa de exploracin electrnica de eritrocitos de una persona con anemia drepanoctica. Comprese con la micrografa de un eritrocito de sangre normal de la figura 4-31, a. Debido a su forma anormal, estos drepanocitos de la sangre pueden taponar vasos de pequeo calibre, causar dolor y provocar crisis que ponen en peligro la vida. (a,b: segn Carrada Baglioni, Biochim. Biophys. Acta 48:2394, 1961; c. cortesa de J.T. Thormvaite, B.F. Cameron y R.C. Uif.)

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CAPITULO 2 Bases qumicas de a vida

3.6 residuos

(a)

(b)

FIGURA 2-30. La hlice alfa, a) Trayecto helicoidal alrededor de un eje central que adopta el esqueleto de un polipptido en una regin de la hlice alfa. Cada vuelta completa (360) de la hlice corresponde a 3.6 residuos de aminocidos, b) Disposicin de los tomos del esqueleto de una hlice alfa y el enlace de hidrgeno que se forma entre aminocidos. Debido a la rotacin helicoidal, los enlaces peptdicos de cada cuarto aminocido se ponen en estrecha vecindad. El acercamiento del grupo carbonilo (C=O) de un enlace pcptido al grupo mina (HN) de otro enlace pptido da como resultado la formacin de un enlace de hidrgeno entre ellos. Los enlaces de hidrgeno (barras de color naranja) son prcticamente paralelos al eje del cilindro y por lo tanto sostienen las vueltas de la cadena, c) Vista desde abajo del centro de una hlice a con las cadenas laterales proyectndose hacia afuera del esqueleto del polipptido. La cara de la hlice proyectada hacia el medio externo acuoso consta de residuos de aminocidos polares, en tanto que la cara expuesta al ambiente interior de la protena consta de residuos hidrofbicos. Una hlice con este tipo de estructura se denomina antiptica.

fornia Institute of Technology. Estudiando la estructura de pptidos simples que consisten en unos pocos aminocidos unidos, Pauiing y Corey concluyeron que las cadenas de polipptidos existen en conformaciones preferidas que suministran el nmero mximo posible de enlaces de hidrgeno entre aminocidos vecinos. Se propusieron dos conformaciones. En una conformacin el esqueleto del polipptido adopta la forma de una espiral cilindrica denominada hlice alfa (a) (fg. 2-30, a). El esqueleto corresponde a! interior de la hlice y las cadenas laterales se proyectan hacia afuera. La estructura helicoidal se estabiliza mediante un gran nmero de enlaces de hidrgeno entre los tomos de un pptido enlazado y los situados justo arriba y debajo a lo largo de la espiral (fig. 2-30, b). Los patrones de difraccin de rayos X de protenas verdaderas, determinados durante el decenio de 1950, revelaron la existencia de hlices a, primero en la protena queratina del cabello y despus en varias protenas que se enlazan a oxgeno, como la mioglobina y la hemoglobina (vase fig. 2-35). Las superficies opuestas de una hlice a pueden tener propiedades contrastantes. En las hidrosolubles, la superficie externa de una hlice alfa con frecuencia contiene residuos polares en contacto con el solvente, en tanto que la superficie enfrentada al interior contiene grupos R no polares (fig. 2-30, c). Esta disposicin de residuos polares y no polares con frecuencia se invierte en las hlices alfa de protenas de la membrana que atraviesan la bicapa lipida hidrofbica (vase fig. 4-16). Una hlice a se encuentra enrollada y fija mediante enlaces no covalentes dbiles, y por lo tanto puede extenderse cuando es sometida a fuerzas de estiramiento. Esto se puede ilustrar con la lana, cuyas fibras de protena consisten principalmente en hlices alfa. Cuando las fibras de lana se estiran, se rompen los enlaces de hidrgeno y las fibras se alargan. Cuando se libera la tensin, los enlaces vuelven a formarse y la fibra se acorta a su longitud original. El cabello humano es menos extensibe que la lana, debido a que los polipptidos tambin estn estabilizados por puentes disulfuro covalentes. La otra conformacin propuesta por Pauiing y Corey fue la lmina plegada beta ($), que consiste en varios polipptidos paralelos entre s. A diferencia de la forma cilindrica helicoidal de la hlice a, el esqueleto de cada polipptido (o fibra /) en una lmina /3 asume una conformacin con pliegues o dobleces (fig. 2-31, a). Igual que la hlice alfa, la lmina/? tambin se caracteriza por un gran nmero de enlaces de hidrgeno, pero estas uniones no covalentes son perpendiculares al eje largo de la cadena de polipptidos y se proyecta rransversalmente desde un lado de la cadena hacia el otro (fig. 2-31, b). Como la hlice alfa, la lmina /} tambin se encuentra en muchas protenas diferentes. As, la cadena de aminocidos casi est completamente extendida y por lo tanto la lmina /3 resiste las fuerzas de tensin (tnsiles). La seda es una protena que consiste sobre todo en lminas /?; las fibras de seda deben su resistencia a esta caracterstica arquitectnica. Las porciones de una cadena de polipptidos no organizada en hlices a o lminas / pueden consistir en bisagras, vueltas, asas o extensiones digitiformes. Con frecuencia estas son las partes ms sensibles de una cadena de

CAPITULO 2 Bases qumicas de la vida

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FIGURA 2-31. Lmina J plegada, a) Cada polipptido de una lmina fi asume una conformacin extendida pero plegada a la cual se le denomina banda /!. Los pliegues son resultado de la localizacin de los carbonos a arriba y abajo del plano de la lmina. Los grupos R sucesivos se proyectan hacia arriba y hacia abajo del esqueleto, b) Una lmina j plegada consta de algunas bandas fi situadas paralelamente entre s y reunidas en disposicin regular de enlaces hidrgeno entre los grupos carbonilo e imino de esqueletos vecinos. Los segmentos vecinos del esqueleto del polipptido pueden situarse en posicin paralela (en la misma direccin N-terminal -> C-terminal) o aniparalela (en direccin opuesta N-terminal > C-terminal). FIGURA 2-32. Modelo de listn de la ribonucleasa. Se muestran las regiones de una hlice a como espirales y bandas por medio de listones aplanados con flechas que indican la direccin N-terminal ~> C-terminal del polipptido. (Segn un dibujo efectuado por eme S. Richardson.)

polipptido y los sitios de mayor actividad biolgica. En la figura 2-32 se muestran los diferentes tipos de estructura secundaria de la manera ms simple; las hlices alfa se representan mediante listones helicoidales, las fibras fi se muestran como flechas aplanadas que conectan los segmentos como delgados alambres. Estructura terciaria. En tanto la estructiura secundaria se relaciona principalmente con la conformacin de aminocidos adyacentes en la cadena de polipptidos, la estructura terciaria describe la conformacin de la protena ntegra. La mayor parte de las protenas se pueden clasificar segn su conformacin ntegra como protenas fibrosas, que tienen una forma muy alargada, o protenas globulares, que poseen una forma compacta. La mayor parte de las protenas que actan como materiales estructurales fuera de las clulas vivientes son protenas fibrosas, como la colgena y la elastina de los tejidos conectivos; la queratina de cabellos, piel y uas; y la seda. Estas protenas constan de fibras largas o de hojas aplanadas que resisten fuerzas de tensin o de corte a las cuales estn expuestas. Por lo contrario, la mayor parte de las protenas dentro de las clulas son protenas globulares. Colgena: una abundante protena fibrosa. La colgena consta de fibras que actan como cables para resistir las fuerzas de tensin que se desarrollan en los espacios que rodean a las clulas (analizados ampliamente en la seccin 7-1). Se estima que una fibra de colgena de 1 mm de dimetro es capaz de sostener un peso mayor de 10 kilogramos (22 libras). La colgena es un elemento caracterstico de los tejidos conectivos en todo el reino animal y est presente en los vertebrados como uno de los principales componentes

de la piel, cartlago, hueso, tendones y la crnea. Las fibras de colgena son polmeros construidos a partir de monmeros compuestos de tres cadenas alargadas de polipptidos helicoidales (llamadas cadenas a) enrolladas sobre s mismas para formar una triple hlice (fig. 2-33, a), muy diferente de una hlice alfa. Los monmeros de colgena se organizan en disposicin escalforme para formar microbrillas (fig. 2-33, b}, que a su vez se organizan en fibras de mayor calibre que muestran un patrn caracterstico de bandas en el microscopio electrnico (fig. 2-33, c). La composicin de los aminocidos de las cadenas a de colgena es poco comn. Cada cadena tiene casi 1 000 aminocidos de longitud y la glicina constituye prcticamente cada tercer residuo. Las glicinas se localizan en el punto donde cada cadena gira hacia el borde interno, o sea, donde hay la menor cantidad de espacio disponible para una cadena lateral de aminocidos. En realidad, la glicina es el nico aminocido que puede adaptarse a la organizacin triple helicoidal de la colgena. Hay otras dos caractersticas poco comunes de las cadenas a de la colgena: contienen grandes cantidades de prolina, y gran parte de los residuos de prolina y lisina son hidroxilados. Las prolinas son importantes para generar la hlice tipo colgena y los aminocidos hidroxilados son importantes para mantener la estabilidad de la triple hlice formando puentes hidrgeno de una cadena a otra dentro

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CAPITULO 2 Bases qumicas de la vida

(a)

(c)

FIGURA 2-33. Colgena, un ejemplo de protena fibrosa. Esta figura muestra varios niveles de organizacin de la colgena, a) El monmero bsico de colgena es una triple hlice compuesta de tres cadenas de polippridos helicoidales distintos, b) Los monmeros se alinean en filas en las cuales las molculas de una fila se encuentran escalonadas en relacin con las de la fila vecina, c) Micrografa electrnica de fibras de colgena humana que muestran su patrn caracterstico de bandas como resultado de la disposicin de los monmeros de colgena. Las bandas se repiten a lo largo de la fila con una periodicidad de 64 a 70 nm. (c: Cortesa de erme Cross y Francis O. Schrnitt.)

de un monmero. La hidroxilacin de los residuos de prolina y lisina tiene lugar enzmticamente despus que los aminocidos se han incorporado a la cadena del polipptido. La falta de hidroxilacin de las cadenas de colgena tiene consecuencias graves para la estructura y funcin de los tejidos conectivos. Esto es evidente en los sntomas del escorbuto, una enfermedad producida por deficiencia de vitamina C (cido ascrbico), caracterizada por inflamacin de las encas y prdida de los dientes, cicatrizacin deficiente de las heridas, huesos quebradizos y debilitamiento del revestimiento de los vasos sanguneos, que provoca sangrado interno. Las enzimas que aaden grupos hidroxilo a los aminocidos lisina y prolina de la colgena requieren cido ascrbico como coenzima. Mioglobina: la primera protena globular en la cual se determin la estructura terciaria. A diferencia de las protenas fibrosas que muestran una estructura muy extendida, las cadenas de polipptidos de la mayor parte de las protenas estn plegadas y torcidas formando estructuras complejas. Puntos distantes de la secuencia lineal de aminocidos se aproximan y unen mediante diferentes tipos de enlace. No fue sino hasta 1957 que se dispuso de un modelo

de estructura terciaria para una protena globular. El trabajo lo realiz John Kendrew y sus colegas, en la Universidad de Cambridge, empleando la protena mioglobina y con la tcnica de cristalografa de rayos X. En esta tcnica (descrita aqu en la seccin 17-8) se bombardea un cristal de la protena con un delgado haz de rayos X y se permite que la radiacin dispersada (difraccin) por los tomos de la protena incida sobre una placa fotogrfica donde se forman puntos como los mostrados en la figura 2-34. Segn la intensidad y posicin de los puntos, un investigador puede trabajar en retrospectiva para deducir la estructura capaz de producir dicho patrn. Cuanto ms informacin se analiza, ms detalles se obtienen para describir la molcula. La mioglobina funciona en el tejido muscular corno sitio para almacenar oxgeno; la molcula de oxgeno se une a un tomo de hierro en el centro de un grupo hem. (El grupo hem es un ejemplo de grupo prosttico, o sea, una parte de la protena no compuesta de aminocidos, aadida a la cadena de polipptidos despus de ensamblarse en el ribosoma.) El grupo hem de la mioglobina confiere al tejido muscular su color rojo. La primera publicacin, en 1957, acerca de la estructura de la mioglobina suministr un per-

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FIGURA 2-34. Patrn de difraccin de rayos X de la mioglobina.

(Cortesa de John C. Kendrew.)

fil de baja resolucin suficiente para revelar que la molcula era compacta (globular) y que la cadena de polipptidos estaba doblada sobre s misma en un arreglo complicado (fig. 2-35, a). No se encontraron datos de regularidad o simetra dentro de la molcula. El perfil relativamente burdo de la protena revel la presencia de ocho prolongaciones de la hlice a en forma de bastn cuya longitud oscilaba entre 7 y 24 aminocidos. En conjunto, casi 75% de los 153 aminocidos de la cadena de polipptidos se encuentra en la conformacin de hlice alfa. Este es un porcentaje inusitadamente alto en comparacin con el de otras protenas examinadas hasta ahora. No se encontraron lminas/3 plegadas. Anlisis subsecuentes de la mioglobina empleando nuevos datos de difraccin de rayos X suministraron una descripcin mucho ms detallada de la molcula (fig. 2-35, fc). Por ejemplo, se demostr que el grupo hem est situado dentro de una bolsa de grupos R hidrofbicos que promueven el enlace del oxgeno sin oxidar el tomo de hierro (prdida de electrones). La mioglobina no contiene enlaces disuifuro; la estructura terciaria de la protena se mantiene exclusivamente por interacciones no covalentes. Se piensa que todos los enlaces no covalentes (enlaces de hidrgeno, enlaces inicos e interacciones hidrofbicas) observados ocurren entre las cadenas laterales dentro de las protenas (fig. 2-36). El modelo de mioglobina dibujado en la figura 2-35, c, muestra la posicin relativa de cada tomo de la molcula. A diferencia de la mioglobina, la mayor parte de las protenas globulares contienen hlices a y lminas /3. Sin embargo, algunas protenas (como la isomerasa triosa fosfato, mostrada en la figura 2-38, b) consta principalmente de lminas/? plegadas. Cada protena tiene una estructura ter-

ciaria nica que puede correlacionarse con su secuencia de aminocidos y su funcin biolgica. Dominios y motivos de las protenas. Un anlisis estructural ms reciente ha revelado que muchas protenas, particularmente las grandes, se componen de dos o ms regiones compactas distintas que funcionan de manera semiindependiente. En la mayor parte de los casos, las regiones individuales, o dominios, se unen entre s mediante una porcin flexible de la cadena de polipptidos que sirve como bisagra (fig. 2-37). Los dominios de un polipptido con frecuencia representan partes que se unen a factores diferentes (como una coenzima y un sustrato), o slo partes que se mueven de manera relativamente independiente entre s. Se cree que algunos polipptidos con ms de un dominio se originaron durante la evolucin por la fusin de genes que codificaban diferentes protenas ancestrales, y cada dominio representa una parte que alguna vez fue una molcula separada. A primera vista, la arquitectura tridimensional de las protenas parece casi irremediablemente compleja. Sin embargo, conforme se fueron determinando las estructuras terciaras, los bioqumicos descubrieron subestructuras recurrentes, o motivos. En la figura 2-38 se muestran dos ejemplos. En la espiral enrollada que se encuentra en varias protenas fibrosas, pares de hlices a se enrollan una sobre otra igual que las dos fibras trenzadas de un cable. Las hlices a que interactan como espirales enrolladas tienen una estructura primaria distintiva caracterizada por una secuencia de siete aminocidos repetida regularmente. Los residuos primero y cuarto (denominados a y d) de la secuencia repetida son hidrofbicos y se sitan a un lado de la hlice donde pueden formar interacciones hidrofbicas con sus contrapartes de la hlice vecina. Es como si una hlice tuviera una fila de "botones" y la otra hlice una fila de "agujeros" en los cuales se pueden introducir los botones. En conjunto, las hlices trenzadas forman una estructura rgida parecida a una barra. Uno de los motivos ms complejos es el barril a//?, originalmente descubierto en la enzima isomerasa triosa fosfato (fig. 2-38, b), y desde entonces se ha encontrado en casi 20 enzimas diferentes. Cada una de las ocho duelas del barril consta de una cadena /?. Reunidas las ocho cadenas/3 paralelas forman el barril cerrado que se sita en el ncleo de la protena. El barril se conecta al resto de la protena por secciones de hlice alfa. Pueden ocurrir motivos comunes en protenas evolutivamente relacionadas que desempean funciones similares o pueden aparecer en protenas no relacionadas que tienen funciones muy diferentes. Cambios dinmicos dentro de las protenas. Las protenas no son rgidas e inflexibles, ms bien poseen gran capacidad de movimiento interno. Los pequeos cambios en la disposicin de las uniones dentro de una protena generan movimiento interno en la molcula que puede captarse mediante simuladores computadorizados (fig. 2-39, a). Los estudios de protenas tambin revelan la ocurrencia de cambios en los enlaces de hidrgeno, movimientos ondulatorios de las cadenas laterales externas y rotacin completa alrededor de una sola unin de los anilios aromticos de la tirosina y ios residuos de fenilalanina. Los movimientos predecibles (no al azar) dentro de una protena

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CAPITULO 2 Bases qumicas de la vida

Hem

relacionados con las funciones de la molcula se describen como cambios de conformacin. Prcticamente toda actividad en la cual participa una protena se acompaa de cambios de conformacin dentro de la molcula. Por ejemplo, en la mioglobina, el C>2 una vez liberado de su sitio de enlace en el grupo hem, sale desde el interior de la protena y se requiere un cambio de conformacin para abrir una va de salida a la molcula de 2- En general, es ms fcil estudiar los cambios de conformacin empleando un inhibidor parecido a la molcula que normalmente se enlaza a la pro-

FIGURA 2-35. Estructura tridimensional de la mioglobina de ballena, a) Primer modelo relativamente burdo de la protena basado en los datos de difraccin de rayos X a baja resolucin. Se observa la conformacin general de la molcula, pero hay poca informacin respecto de los tipos de interacciones entre los residuos de aminocidos, (En este primer diagrama, el plano del grupo hem es incorrecto.) b) Modelo de mioglobina a mayor resolucin que en el inciso a. Se observa que la mayor parte de los aminocidos residen dentro de las regiones de la hlice alfa. Las regiones no helicoidales ocupan principalmente los ngulos donde cambia la direccin de la cadena de polipptido. Se indica la posicin del grupo hem. c) Modelo fsico de la mioglobina que ilustra la enorme complejidad de una protena, (b: Copyright por Jrving Geis; c: cortesa de ]. Kendreiv.)

FIGURA 2-36. Tipos de enlace covalente que mantienen la conformacin de las protenas.

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FIGURA 2-37. Dominios de una protena. Dibujo de una fosfogliceratocinasa nativa de msculo de caballo que muestra dos distintos dominios conectados por una bisagra. Las hlices a se definen con cilindros y las fibras fi por flechas, que adems denotan su direccin. (Segn R.D. Banks y cois. Reproducido con permiso de Nature 279:775, 1979. Copyright 1979, Macmillan Magazines Limited.)

tena. Los cambios que ocurren en una molcula de mioglobina durante la unin y liberacin de monxido de carbono, un gas que inhibe el enlace de OT, se muestra en la figura 2-39, b. En las figuras 3-14 y 9-39 se muestran otros dos ejemplos de cambios de conformacin que ocurren entre las protenas. La importancia de los cambios de conformacin se puede apreciar considerando que los movimientos de nuestro cuerpo son resultado del efecto aditivo de millones de cambios de conformacin que tienen lugar entre las protenas contrctiles de los msculos. Estructura cuaternaria. Aunque numerosas protenas, como la mioglobina, se componen de una sola cadena de polipptidos, muchas otras estn formadas por ms de una cadena o subunidad. Las subunidades pueden unirse mediante enlaces covalentes de disulfuro, pero con mayor frecuencia se mantienen juntas por enlaces no covalentes, como puede ocurrir, por ejemplo, entre las "placas" hidrofbicas de las superficies de polipptidos vecinos. Se dice que las protenas compuestas de subunidades tienen una estructura cuaternaria. Segn la protena, las cadenas de polipptidos pueden ser idnticas o no idnticas. Una protena compuesta de dos subunidades idnticas se describe como homodmero, en tanto que una protena compuesta de dos subunidades no idnticas es un heterodmero. En la figura 2-40, a, se muestra una protena homodmera representada como un listn. Las dos subunidades de la protena se presentan con colores diferentes y se indican los residuos hidrofbicos que forman los sitios de contacto. Una protena de mltiples subunidades bastante bien estudiada es la hemoglobina, la protena que transporta 2 en los eritrocitos. La molcula de la hemoglobina humana consta de dos polipptidos de globina a y dos polipptidos de globina/? (fig. 2-40, b); cada uno enlaza una sola molcula de oxgeno. Individualmente, cada polipptido de la globina tiene una estructura terciaria similar a la mioglobina, hecho que apoya la nocin de que evolucionaron a partir de un polipptido ancestral comn con una funcin comn, como la de enlazar protena a 2Multiprotenas complejas. Aunque la hemoglobina consta de cuatro subunidades, todava se considera una pro-

tena simple con una sola funcin. Se conocen muchos ejemplos en los cuales diferentes protenas, cada una con una funcin especfica, se renen fsicamente para formar una multiprotena compleja mucho ms grande. Una de las primeras multiprotenas complejas que se describieron y estudiaron fue la piruvato deshidrogenasa de la bacteria E. coli, que consta de 60 cadenas de polipptidos correspondientes a tres enzimas diferentes ffig. 2-41). Las enzimas

95nm

(a)

(b)
FIGURA 2-38. Motivos de la protena, a) La espiral enrollada, corno se observa en a porcin en forma de barra de una molcula de miosina, consta de dos hlices a. enrolladas una sobre la otra para formar un dominio en forma de bastn. Esta parte del filamento de miosina desempea un papel clave en la formacin de los filamentos musculares gruesos (seccin 9-6). b) Barril a//? de la enzima isomerasa triosa fosfato segn se ve desde arriba. El dibujo a la derecha muestra la disposicin de las cadenas /? en los barriles vistas lateralmente, (b: Segn el dibujo de Jane S. Richardson.)

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CAPITULO 2 Bases qumicas de a vida

Arg CD3

(a)

(b)

FIGURA 2-39. Movimientos dinmicos de una molcula de mioglobina. a) Movimientos internos de ia mioglobina simulados por medio de clculos computadorizados. Se superponen varias "tomas instantneas" de la molcula calculadas a intervalos de 5xlO'12 segundos. El esqueleto del polipptido se muestra en azul, el grupo hem en amarillo y una de las histidinas que juegan un papel crucial en la funcin de la hemoglobina aparece de color naranja. Se cree que estos tipos de movimientos tienen un papel importante en las actividades de la protena, incluyendo la entrada y la salida de la molcula de O- b) Sitio activo de una molcula de mioglobina que muestra tres diferentes etapas: 1) con una molcula de monxido de carbono enlazada al grupo hem de la protena (azul), 2) en el momento que se libera la molcula de monxido de carbono (rojo) y 3) con el sitio no ocupado (verde). Las diferencias de conformacin entre estos tres estados se notan comparando la posicin de los tres colores. Este tipo de imagen se puede captar utilizando cristalografa de rayos X a baja temperatura, (a: Cortesa de Martin Karplus; b: cortesa de Joel Berendzen.)

que constituyen este complejo catalizan una serie de reacciones para acoplar dos vas metablicas, la gluclisis y el ciclo del cido tricarboxlico (vase fig. 5-8). Debido a que as enzimas estn asociadas fsicamente, el producto de una enzima se puede orientar directamente a la siguiente enzima de la secuencia sin diluirse en el medio acuoso de la clula. Las multiprotenas complejas formadas dentro de la clula, como la piruvato deshidrogenasa, no son estructuras necesariamente estables. En realidad, la mayor parte de las protenas interactan con otras protenas en patrones sumamente dinmicos, reunindose y separndose en todo momento segn las condiciones dentro de la clula. Las protenas que interactan tienden a mostrar superficies complementarias. A menudo la prolongacin de una molcula se adapta dentro de un agujero sobre su pareja. Una vez que las dos molculas se ponen en contacto estrecho, su interaccin se estabiliza mediante la formacin de uniones no covalentes. Estos principios de interaccin protena-protena se ilustran con los modelos moleculares presentados en la figura 2-42. Conforme se van descubriendo actividades moleculares ms y ms complejas, cada vez es ms evidente la importancia de las interacciones transitorias entre protenas. Por ejemplo, procesos tan diversos como sntesis de DNA, formacin de ATP y procesamiento de RNA son efectuados por complejos que constan de una gran cantidad de protenas en interaccin.

Estructura y funcin de los anticuerpos

Antes de abandonar el tema de la estructura y funcin de las protenas merece consideracin especial un ltimo grupo de stas, las inmunoglobulinas o simplemente anticuerpos. Los anticuerpos son protenas solubles producidas por los vertebrados que sirven como arsenal molecular en la guerra del cuerpo contra patgenos invasores. La interaccin de los anticuerpos con la superficie de un virus o de una clula bacteriana neutraliza la capacidad del patgeno para infectar una clula husped y facilita la ingestin de dicho patgeno y su destruccin por los fagocitos errantes. El sistema inmunolgico puede producir millones de molculas de diferentes anticuerpos, que consideradas en conjunto pueden reconocer y unirse a prcticamente todo tipo de sustancia extraa, o antgeno, a la cual se puede exponer el cuerpo. Una de las caractersticas ms notables de la respuesta inmunolgica es su especificidad. Consideremos una protena comn en los mamferos, como la actina del msculo esqueltico. Aunque todos los mamferos producen esta protena, su secuencia de aminocidos vara algo de una especie a otra. Incluso ligeras diferencias de esta protena entre dos especies diferentes son suficientes para permitir que una preparacin activa de msculo de un miembro de una especie sea reconocida como extraa si se inyecta a un miembro de otra especie. Los anticuerpos producidos en respuesta a la inyeccin son muy especficos; slo se combi-

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20 nm

(b)

FIGURA 2-41. Piruvato deshidrogenasa; una multiprotena compleja, a) Micrografa electrnica de un complejo de piruvato deshidrogenasa teido aislado de E. cali. Cada complejo contiene 60 cadenas de polipptidos que forman tres enzimas diferentes. Su peso molecular se aproxima a cinco millones de daltons. b) Modelo del complejo de piruvato deshidrogenasa. El ncleo del complejo consta de un agrupamiento cuboide de molculas de dihidrolipoil transacetilasa. El dmero piruvato deshidrogenasa (esferas negras) se distribuye simtricamente a lo largo de las aristas del cubo y los dmeros dihidrolipoil deshidrogenasa (esferas grises pequeas) se colocan en las caras del cubo. (Cortesa de Lester /. Reed.)

C9

A'

FIGURA 2-40. Protenas con estructura cuaternaria, q.) Esquema del factor de transformacin del crecimiento $2 (TGF-/2), una protena que ocurre como dmero compuesto de dos subunidades idnticas. Las dos subunidades estn coloreadas de amarillo y azul, respectivamente. La cadena lateral de cistena y los enlaces disulfuro se muestran en blanco. Las esferas que aparecen en amarillo y azul son los residuos hidrofbkos que forman la inferase entre las dos subunidades. b) Esquema de una molcula de hemoglobina que consta de dos cadenas de globina f y dos cadenas de globina fi unidas por enlaces no covalentes. Cuando se ensamblan los cuatro polipptidos de globina en una molcula completa de hemoglobina, la cintica de la unin y liberacin de O es muy diferente de la que muestran los polipptidos aislados. Esto se debe a que la unin del C>2 a un polipptido provoca un cambio de conformacin en los otros polipptidos que altera su afinidad por las molculas de C>2. (a: Reimpreso con permiso de S. Daopin y cois., Science 257:372 3992, cortesa de David R. Davies. Copyright 1992 American Assodation for the Advcmcement of Science; b: copyright por Irving Geis.)

nan con actina y con ningn otro tipo de protena presente en la solucin de prueba. Los bilogos celulares y moleculares sacan ventaja de la especificidad de los anticuerpos y los emplean como herramienta analtica para identificar protenas especficas de inters y determinar su localizacin dentro de la clula. En todo este libro se hace notar el empleo de anticuerpos en

esta bsqueda a travs de las fotografas a color que muestran molculas de anticuerpos dentro de las clulas unidas mediante enlaces covalentes a colorantes fluorescentes de brillantes colores. En el presente anlisis slo se intentar responder preguntas acerca de las molculas de anticuerpos. Cmo pueden enlazarse a otras molculas con tan alto grado de especificidad? Los anticuerpos estn formados por dos tipos de cadenas de polipptidos, as cadenas pesadas de mayor tamao (peso molecular de 50 000 a 70 000 daltons) y las cadenas ligeras ms pequeas (peso molecular de 23 000 daltons o 23 kD). Los dos tipos de cadenas se renen entre s para formar pares mediante enlaces disulfuro. Se han identificado cinco clases diferentes de inmunoglobulinas (IgA, IgD, IgE, IgG e IgM). Las diferentes inmunoglobulinas aparecen en distintos momentos luego de la exposicin a una sustancia extraa o en diferentes lquidos corporales (cuadro 2-4). Hay dos tipos de cadenas ligeras: cadenas kappa (/c) y cadenas lambda (A), ambas presentes en las cinco clases de inmunoglobulinas. Por lo contrario, cada tipo de inmunoglobulina tiene su propia cadena pesada nica que define dicho tipo. El anlisis siguiente se restringe a las IgG que son las inmunoglobulinas ms abundantes. Una molcula individual de IgG est compuesta de dos cadenas ligeras idnticas y dos cadenas pesadas idnticas dispuestas como se muestra en la figura 2-43, y se describe a continuacin. Para determinar la base de la especificidad de los anticuerpos fue necesario establecer la secuencia de aminocidos de algunos anticuerpos especficos. Normalmente, el primer paso para lograr este objetivo sera purificar las protenas particulares que van a formar la secuencia. Sin embargo, en condiciones normales es imposible obtener una preparacin purificada del anticuerpo especfico a partir de la sangre debido a que cada individuo produce un gran nmero de diferentes molculas de anticuerpos de estruc-

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CAPITULO 2 Bases qumicas de la vida

FIGURA 2-42. Interacciones protena-protena. a) Modelo que ilustra las superficies moleculares complementarias de porciones de protena que interactan entre s. La molcula de color rojo es un dominio de la enzima fosfatidilinositol 3-OH cinasa, cuyas funciones se analizan en el captulo 15. Este dominio se une especficamente a una variedad de pptidos que contienen prolina, como el que se muestra en e! modelo de espacio lleno en la parte superior de la figura. Se indican los residuos de prolina del pptido que ocupan las bolsas de la superficie de la enzima. El esqueleto del pptido presenta color amarillo y las cadenas laterales color verde, b) Vista amplificada de los tipos de interaccin no covalente que ocurren entre dos pptidos que poseen superficies complementarias. Las lneas punteadas indican enlaces de hidrgeno formados: 1) entre residuos de aminocidos en las dos protenas y 2) entre residuos de aminocidos y una molcula de agua (esfera de color magenta) que se colocan entre los dos pptidos. (a: Tomado de Hongato Yu y cois., Cell 76:940, 1994, con permiso de copyright de Cell Press; b: reimpreso con permiso de Masazumi Matsumura y cois., Science 257:930, 1992, cortesa de an A. Wilson. Copyright 1992 American Association for the Advancement of Science.)

tura muy similar, lo bastante para impedir su separacin. El problema se resolvi al descubrir que la sangre de pacientes que sufren un tipo de cncer linfoide, denominado mieloma, contiene gran cantidad de una sola especie de anticuerpo. Como se describe en el captulo 16, el cncer es una enfermedad monoclonal; o sea, las clulas del tumor se originan a partir de la proliferacin de una sola clula descarriada. Puesto que un solo lnf ocito normalmen te slo produce una especie molecular de anticuerpo, el paciente con mieloma mltiple produce grandes cantidades del anticuerpo especfico sintetizado por la clula particular malignizada. Aunque un paciente individual slo produce una especie de anticuerpo, diferentes pacientes dan lugar a diferentes anticuerpos. Como resultado, los investigadores pudieron purificar cantidades sustanciales de varios anticuerpos procedentes de diversos pacientes y comparar sus secuencias de aminocidos. Pronto se revel un patrn importante. Se observ que la mitad de cada cadena kappa ligera (110 aminocidos en el extremo amno del polipptido) era constante en la secuencia de aminocidos de todas las cadenas kappa, en tanto que la otra mitad variaba de un paciente a otro. De manera similar, la comparacin de las secuencias de aminocidos de varias cadenas lambda procedentes de diferentes pacientes revel que tambin constaban de una seccin de secuencia constante y una seccin cuya secuencia variaba de una rnmunoglobulina a la siguiente. Las cadenas pesadas de IgG purificadas tambin contenan una porcin variable (V) y una constante (C). Aunque casi la mitad de cada cadena ligera constaba de una regin variable (V^), slo una cuarta parte de cada cadena ligera era variable (Vn) entre diferentes pacientes; los restantes tres cuartos de la cadena pesada (CH) eran constantes para todas las IgG. La porcin constante de la cadena pesada se puede dividir en tres secciones de longitud aproximadamente igual claramente homologas entre s (fig. 2-43). Parecera que cada una de las tres secciones de la parte C de la cadena pesada IgG (y tambin de las cadenas pesadas de las otras clases de Ig y las porciones C de ambas cadenas ligeras kappa y lambda) se originaran durante la evolucin por duplicacin de un gen ancestral que codificaba para una unidad Ig de unos 110 aminocidos. Tambin se piensa que las regiones variables (VH o VL) se originaron por evolucin de la misma unidad Ig ancestral. Los anlisis estructurales indican que cada una de las unidades homologas de una cadena ligera o pesada se pliega independientemente para formar su propio dominio compacto. Los dos dominios de una cadena ligera se muestran en la figura 244. En la molcula IgG intacta, cada uno de los dominios de las cadenas ligeras se relaciona con uno de los dominios de las cadenas pesadas, como se muestra en la figura 2-43. Un examen ms estrecho de los polipptidos de las inmuno globulinas revela que las porciones variables de las cadenas ligeras y pesadas contiene subregiones especialmente variables, o sea hipervariables, de una molcula de anticuerpo a otra (marcadas Hv en la figura 2-44). Las porciones hipervariables de las cadenas contienen delecciones e inserciones de aminocidos y tambin sustituciones de un aminocido por otro. Las cadenas ligeras y pesadas contienen ambas tres fragmentos hipervariables.

CAPITULO 2 Bases qumicas de la vida CUADRO 2-4. Tipos de inmunoglobulinas humanas Tipo Cadena pesada Cadena ligera
KOX
K O K

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Peso molecular (kD) 360-720 160 190 150 950

Propiedades Presente en lgrimas, moco nasal, leche materna, secreciones intestinales Presente en varias membranas plasmticas celulares; funcin desconocida Se enlaza a casi todas las clulas; libera hstamina, causa de reacciones alrgicas Anticuerpos solubles primarios de origen sanguneo; atraviesan la placenta Presente en membranas plasmticas de clulas B, media la respuesta inmunolgica inicial; activa el complemento microbicida

IgA IgD IgE IgG IgM

a
E

K O/l K O K O-l

La especificidad de la molcula de un anticuerpo particular es determinada por los aminocidos presentes en los dos sitios para combinacin de antgenos situados en los extremos de la molcula en forma de Y (fig. 2-43). Los dos sitios de combinacin de una molcula IgG son idnticos y cada uno se forma por la asociacin de la porcin variable de una cadena ligera con la porcin variable de una cadena pesada a la cual est unida. La construccin de anticuerpos a partir de pares de cadenas ligeras y pesadas permite a un individuo producir una tremenda variedad de anticuerpos a partir de un nmero relativamente moderado de polipptidos diferentes. Por ejemplo, s hay 1 000 cadenas ligeras diferentes y 1 000 cadenas pesadas distintas, se puede formar un milln (103 X 103) de anticuerpos diferentes, cada uno con un sitio distinto para combinarse con un antgeno. El sitio de combinacin de una molcula de anticuerpo tiene una estructura estereoqumica complementaria a la del antgeno al cual se va a enlazar. Como sera de esperar, las porciones hipervariables de cada cadena desempean

un papel prominente en la formacin de la superficie del sitio de combinacin y explican el mayor grado de especificidad que pueden mostrar las poblaciones de anticuerpos. La figura 2-45 muestra la naturaleza precisa de la interaccin entre un antgeno particular y un anticuerpo, segn se puede determinar mediante estudios de difraccin de rayos X. El anlisis de la estructura de los sitios para combinacin de diferentes anticuerpos revela una gran variedad de formas y tamaos, todas originadas en diferencias de conformacin de las regiones hipervariables de cadenas ligeras y pesadas. Los dominios variables de un anticuerpo determinan la especificidad del sitio de combinacin de la molcula, en tanto que los dominios constantes proporcionan un marco estructural para toda la molcula y tambin efectan una gran variedad de importantes funciones efectoras. Estas incluyen fijacin del anticuerpo en la membrana plasmtica, activacin del sistema de complemento mediante el cual las clulas bacterianas son puncionadas y destruidas, paso de anticuerpos a travs de la placenta del feto en desarrollo y estimulacin de la proliferacin de linfocitos.

COOH

Dominio

Dominio

FIGU1A 2-4%. Estructura de un anticuerpo. Este modelo en forma de listn de una molcula de IgG muestra que contiene cuatro cadenas de polipptidos, dos cadenas ligeras idnticas y dos cadenas pesadas idnticas. Una de las cadenas pesadas se muestra en azul, la otra en amarillo, en tanto que ambas cadenas ligeras se muestran en rojo. Los dominios de cada cadena (dos por cadena ligera y cuatro por cadena pesada) son evidentes. Las regiones variables de una cadena ligera y de una pesada (dominios VL y VH) se juntan en la porcin Nterminal de los dos polipptidos, formando un sitio para combinar antgenos. Cada molcula de IgG tiene dos sitios de combinacin que poseen estructuras idnticas. (Cortesa de Alexander McPherson.)

FIGURA 2-44. Dominios de un anticuerpo. Dibujo esquemtico de una cadena ligera lambda humana sintetizada por las clulas de un paciente con mieloma mltiple. El polipptido sufre un plegamiento, de modo que las porciones constante y variable se presentan en dominios separados. Las flechas gruesas representan fibras /? ensambladas en lminas /i. Cada dominio tiene dos lminas 0 que se pueden distinguir por los colores rojo y naranja. Los tres segmentos hipervariables (Hv) de la cadena se agrupan en un extremo de dominio variable que forma parte del sitio para la combinacin del antgeno en anticuerpo. (Segn Manarme Schiffcr y cois., reimpreso con permiso de Biochemistry 12:4628, 1973. Copyright 1973, American Chemical Society.)

66

CAPITULO 2 Bases qumicas de la vida

AsnSO

105

Ser 93

FIGURA 2-45. Interaccin antgeno-anticuerpo. Dibujo esquemtico de un derivado de vitamina KI (color naranja) unido a la regin para combinacin de una molcula de IgG. LI y 1,3 indican el lugar aproximado de las regiones hipervariables primera y tercera de la cadena ligera. HI, H y HB indican las regiones hipervariables de la cadena pesada. (Segn L. M, Anzel y cois., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 71:1429, 1974.)

que gobiernan la relacin entre estructura primaria y estructura terciaria de una protena. En aos recientes se lograron grandes avances en la sntesis de genes artificiales cuyos productos pptidos pueden plegarse en estructuras secundarias relativamente simples, como haces de hlices a o lminas /J. Sin embargo, los intentos para crear una estructura ms compleja de polipptidos a partir de la inicial son mucho ms difciles. Otra manera de conocer el estado actual de conocimiento de las protenas por parte de los bioqumicos es suministrarles la secuencia primaria de una protena cuya estructura terciaria est a punto de conocerse y permitirles que hagan predicciones respecto del aspecto tridimensional que tendr dicha protena; luego se pueden comparar las predicciones con la verdadera estructura. Hasta ahora, estas predicciones no han sido muy precisas, lo cual sirve para recordarnos el alto nivel de complejidad de las protenas y nuestra limitada comprensin de la manera como la naturaleza transforma un mensaje gentico lineal en una protena funcional tridimensional. Un mtodo alternativo para la produccin de nuevas protenas es modificar las producidas por las clulas. Avances recientes en la tecnologa del DNA han permitido a los investigadores aislar un gen individual de los cromosomas humanos, alterar su contenido de informacin en forma precisa y luego sintetizar la protena modificada con la secuencia de aminocidos alterada. Esta tcnica, a la cual se denomina mutagnesis dirigida al sitio, tiene gran variedad de usos, tanto en investigacin bsica como en biologa aplicada. Por ejemplo, si un investigador desea saber el papel de un residuo particular en el plegamiento de un polipptido, se puede mutar al gene de manera que sustituya a un residuo con diferencias de carga, caractersticas hidrofbicas o propiedades para formar enlaces de hidrgeno, y a continuacin se puede determinar la capacidad del polipptido modificado para lograr su estructura terciaria normal. Como veremos a lo largo de este libro, la mutagnesis dirigida al sitio es una invaluable herramienta en el anlisis de las funciones especficas de partes mnimas de casi todas las protenas de inters biolgico. cidos nucleicos Los cidos nucleicos son macromolculas construidas en forma de cadena larga (hebra) de monmeros llamados nucletidos. La funcin principal de los cidos nucleicos es almacenar y transmitir informacin gentica, pero tambin pueden desempear funciones estructurales o catalticas. Hay dos tipos de cidos nucleicos en los organismos vivos, cido desoxirribonucleico (DNA) y cido ribonucleico (RNA). Como se mencion en el captulo 1, el DNA es el material gentico de todos los organismos celulares y el RNA efecta este papel para muchos virus. En las clulas, la informacin almacenada en la plantilla de DNA se emplea para dirigir las actividades celulares durante la formacin de mensajes de RNA. En el presente anlisis describiremos la estructura bsic. de los cidos nucleicos empleando el RNA como molcula representativa. En el captulo 10 se describir la estructura ms compleja de la doble cadena

Ingeniera de protenas Los avances en biologa molecular permitieron disear y producir en masa nuevas protenas diferentes de las sintetizadas por los organismos vivos. Con las tcnicas actuales para sintetizar DNA es posible crear un gen artificial que se puede emplear para producir protenas que tengan una secuencia deseada de aminocidos. El problema reside en saber cul de todas las posibles protenas, entre una variedad prcticamente infinita, se podra manufacturar que tuviera alguna funcin til. Por ejemplo, consideremos una compaa de biotecnologa que quiere manufacturar una protena que se enlace a la superficie del virus del SIDA para eliminarlo de una solucin acuosa o del torrente sanguneo. Asumiendo que un programa de simulacin en computadora puede predecir la forma que debe tener tal protena para enlazarse a la superficie del virus, qu secuencia de aminocidos se debe reunir para producir dicha protena? La respuesta requiere un conocimiento detallado de las reglas

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Fosfato

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N-H

OH (a)

OH

Base

Azcar

Esqueleto de fosfato de azcar

2) un grupo fosfato, y 3) una base nitrogenada (as llamada porque en los anillos de su molcula se encuentran tomos de nitrgeno). El fosfato est unido al carbono 5' del azcar y la base nitrogenada se junta al carbono 1' de los azcares. Durante el ensamblado de una cadena de cido nucleico, el grupo hidroxilo fijado al carbono 3' del azcar de un nucletido queda unido mediante una unin ster al grupo fosfato unido al carbono 5' del siguiente nucletido de la cadena. As, los nucletidos de una cadena de RNA (o DNA) estn conectados por enlaces azcar-fosfato (fig. 2-46, b), que se describen como enlaces 3 '-5'-fosfodister debido a que el tomo de fosfato est esterificado con los dos tomos de oxgeno, uno de cada azcar adyacente. Una cadena de RNA (o de DNA) contiene cuatro tipos diferentes de nucletido que se distinguen por su base nitrogenada. Dos tipos de bases se encuentran en los cidos nucleicos; pirimidinas y purinas (fig. 2-47). Las pirimidinas son molculas ms pequeas que constan de un solo anillo; las purinas son ms grandes y poseen dos anillos. El RNA contiene dos diferentes purinas, adenina y guanina, y dos pirimidinas diferentes, citosina y uracilo. En el DNA, el uracilo se sustituye por timina, una pirimidina con un grupo metilo extra pegado al anillo (fig. 2-47). En condiciones tpicas el RNA consta de una sola cadena, pero a menudo se pliega para formar molculas con extensos segmentos de doble cadena. Esto lo ilustra el RNA presente dentro de una subunidad pequea del ribosoma bacteriano (fig. 2-48). Los RNA ribosmicos son molculas que no contienen informacin gentica; ms bien sirven como armazones estructurales sobre las cuales pueden unirse as protenas del ribosoma y como elementos que se fijan a diferentes componentes solubles requeridos para la sntesis de protenas. Un RNA ribosrrco de subunidad grande acta como catalizador en la reaccin para unir aminocidos mediante enlaces covalentes durante la sntesis de protenas. Los RNA catalizadores se denominan ribosomas, y

(b)
FIGURA 2-46. Nucletidos y fibras de nucletido. a) Los ncleoticlos son los monmeros a partir de los cuales se construyen las cadenas de cidos nucleicos. Un nucletido consta de tres partes: un azcar, una base nitrogenada y un fosfato. Los nucletidos de RNA contienen el azcar ribosa que posee un grupo hidroxilo enlazado al segundo tomo de carbono. En contraste, los nucletidos de DNA contienen el azcar desoxirribosa, que tiene un tomo de hidrgeno en vez de un grupo hidroxilo fijado al segundo tomo de carbono. Cada nucletido est polarizado, tiene un extremo 5' (correspondiente al lado 5' del azcar) y un extremo 3'. b) Los nucletidos se renen para formar cadenas mediante enlaces covalentes que unen al grupo hidroxilo 3' de un azcar con el grupo fosfato 5' del azcar adyacente.

NH N=< H
Adenina

CH,

H-fNH
H O Tirnina H O Uracilo

de DNA, donde se puede vincular con su papel central en las bases qumicas de la vida. En una cadena de RNA cada nucletido consta de tres partes {fig. 2-46, ); 1) un azcar de cinco carbonos, ribosa;

FIGURA 2-47. Bases nitrogenadas en los cidos nucleicos. De Jas cuatro bases estndar que se encuentran en el RNA, adenina y guanina son purinas y uracilo y citosina son pirimidinas. En el DNA, las pirimidinas son citosina y timina, que difieren del uraciio por un grupo metilo unido al anillo.

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CAPITULO 2 Bases qumicas de la vida

reacciones enzimticas necesarias. Slo en una etapa posterior de ia evolucin se "encargaron" estas actividades al DNA y a las protenas (vase seccin 11-3).

2-6 Formacin de estructuras macromoleculares complejas

Como se describe en La va experimental al final de este captulo, mediante varios estudios se ha establecido que la compleja estructura tridimensional de una protena puede formarse en forma espontnea por autoensamblado o con ayuda de un pequeo nmero de "chaperones" inespecficos presentes en la clula. Por lo tanto, la secuencia de aminocidos de una protena es el determinante primario de la forma tridimensional final de la protena. Hasta qu grado se pueden aplicar los conocimientos adquiridos del estudio de la arquitectura de protenas a estructuras ms complejas en la clula? Estructuras como membranas, ribosomas y elementos citoesquelticos que constan de diferentes tipos de subunidades, tambin pueden ensamblarse por s solas? Hasta qu punto se puede explicar la organizacin subcelular simplemente colocando pedazos unidos para formar el arreglo ms estable? El ensamblado de los organelos celulares todava es mal comprendido, pero de los siguientes ejemplos se puede concluir que diferentes tipos de subunidades son capaces de autoensamblarse para formar arreglos de orden ms elevado. Ensamblado de las partculas virales del mosaico del tabaco y de sus subunidades ribosmicas La prueba ms convincente de que un proceso particular de ensamblado puede ser autodirigido es demostrar que bajo condiciones fisiolgicas puede ocurrir fuera de la clula (in vitro) cuando las nicas macromolculas presentes son aquellas que constituyen la estructura final. En 1955, Heinz Fraenkel-Conrat y Robley Williams, de la Universidad de California en Berkeley, demostraron que las partculas del VMT, que constan de una molcula de RNA larga (unos 6 600 nucletidos) arrollados dentro de una cpsula helicoidal formada por 2 130 subunidades protenicas idnticas tenan capacidad de autoensamblarse. En sus experimentos purificaron protenas del VMT y de RNA por separado, las mezclaron bajo condiciones adecuadas y recuperaron partculas infecciosas maduras luego de un breve periodo de incubacin. Aunque la secuencia de hechos que conducen al ensamblado del VMT fue motivo de controversia en aos recientes, hay poco desacuerdo acerca de que los dos componentes contienen toda la informacin necesaria para la formacin de partculas. Los ribosomas, como las partculas del VMT, se forman de RNA y protenas. A diferencia del VMT ms simple, los ribosomas contienen varios tipos diferentes de RNA y un conjunto considerable de diferentes protenas. Todos los ribosomas, cualquiera que sea su origen, se componen de dos subunidades de diferente tamao. Aunque los ribosomas en general se consideran estructuras simtricas, en realidad

FIGURA 2-48. El RNA puede asumir formas complejas, como la ilustrada en el RNA ribosmico aqu mostrado, el cual es un componente integral de la subunidad ribosmica ms pequea. La cadena de RNA se pliega sobre s misma en un patrn muy ordenado, de modo que la mayor parte de la molcula forma una doble cadena. Las sombras de color naranja indican regiones donde dos porciones de la cadena se enlazan entre s por un enlace de hidrgeno.

en La va experimental del captulo 11 se estudian en detalle su estructura y funcin. Los nucletidos no slo son elementos importantes para construir cidos nucleicos, sino que tambin tienen funciones significativas por s mismos. La mayor parte de la energa utilizable por todo organismo viviente en cualquier momento se deriva del nucletido trifosfato de adenosina (ATP). La estructura del ATP y su papel clave en el metabolismo celular se estudian en el siguiente captulo.
Un inunde de RNA

En los ltimos 50 aos los estudios de investigacin han revelado notables avances en diferentes tipos de protenas, y la importancia del DNA como almacn y para controlar la actividad de las clulas. Por lo contrario, el RNA ha sido relegado principalmente a un papel de mensajero, un intermediario del flujo de informacin gentica procedente del DNA (a travs del RNA) hacia las protenas. Este concepto cambi en los ltimos aos cuando se supo que en el ribosoma el RNA se encarga de unir aminocidos para formar un polipptido y es tambin el RNA de las partculas nucleares el que probablemente se encargue de cortar y unir los mensajes genticos. Estos datos llevaron a especular que en algn momento, en las primeras etapas de la evolucin biolgica, no existan sobre el planeta ni DNA ni protenas. En vez de ellos, las molculas de RNA efectuaban una doble tarea; servan como material gentico y catalizaban las

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FIGURA 2-19. Formas aparentes de las subunidades ribosmicas. Modelos de las subunidades ribosmicas pequea (305) y grande (SOS) de la bacteria E. coli mostrando la ubicacin de algunas protenas ribosmicas. Las dos subunidades no se muestran en la misma escala. (Cortesa de H. G. Wittmann.)

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tienen una forma muy irregular, como se indica en la figura 2-49. La unidad ribosmica grande (o SOS) de E. coli contiene dos molculas de RNA y 32 protenas diferentes. La subunidad ribosmica pequea (o SOS) contiene una molcula de RNA y 21 protenas diferentes. Uno de los acontecimientos fundamentales en el estudio de los ribosomas ocurri a mediados del decenio de 1960, cuando Masayasu Nornura y sus colaboradores, de la Universidad de Wisconsin, lograron reconstituir subunidades 30S completas y totalmente funcionales mezclando las 21 protenas purificadas de la subunidad pequea con RNA ribosmico purificado del mismo tipo de subunidad. Al parecer, los componentes de la subunidad pequea contienen completa la informacin necesaria para ensamblar toda la partcula. El anlisis de los intermediarios que se forman en diferentes etapas de la reconstruccin in vitro indica que el ensamblado de la subunidad ocurre de manera secuencial, paso a paso, muy parecido al proceso in vivo. Este ensamblado del VMT sugiere que la incorporacin de protenas individuales parece modificar la conformacin de la partcula en crecimiento hacindola ms reactiva a la fijacin de protenas adicionales. Cuando menos una de las protenas de la subunidad pequea (516) parece funcionar exclusivamente en el ensamblado del ribosoma; la deleccin

de esta protena en la mezcla de reconstitucin disminuye mucho la tasa del proceso de ensamblado, pero no bloquea la formacin de los ribosomas funcionales completos. Muchas otras protenas de la subunidad pequea funcionan principalmente para estabilizar la estructura ensamblada. La reconstitucin de una subunidad grande del ribosoma bacteriano se logr en el decenio siguiente. Debe recordarse que en tanto la reconstitucin in vitro del ribosoma tarda aproximadamente dos horas a 50C, la bacteria puede ensamblar la misma estructura en unos pocos minutos a temperaturas tan bajas corno 10C Puede ser que la bacteria utilice "trucos" especiales no disponibles al investigador que inicia con componentes purificados. Por ejemplo, la formacin del ribosoma dentro de la clula puede incluir la participacin de factores accesorios que funcionan en el plegamiento de la protena como los chaperones descritos en la pgina 72. En realidad, la formacin de ribosomas dentro de una clula encala implica la asociacin transitoria de varias protenas que no terminan en la partcula final y tambin la eliminacin de casi la mitad de los nucletidos del precursor de RNA ribosmico grande (seccin 11-3). Como resultado, los componentes del ribosoma eucariota maduro ya no poseen la informacin para reconstituirse por s mismos in vitro.

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CAPITULO 2 Bases qumicas de la vida

LA VIA E X P E R I M E N T A L

Construccin de la estructura de una protena

A fines del decenio de 1950 se dilucid la estructura terciaria de la mioglobina al demostrar la complejidad de la arquitectura de las protenas. De inmediato se origin una pregunta importante: cmo puede una estructura tan compleja, plegada y retorcida, organizarse en la clula? En 1958, Francis Crick sugiri que "el plegamiento simplemente es una funcin del orden de los aminocidos".1 En otras palabras, una vez que se sintetiza un polipptido a partir de una secuencia particular de aminocidos codificados en el DNA, el polipptido se pliega espontneamente en su organizacin tridimensional apropiada. Como se analiza en el siguiente captulo, los acontecimientos tienden a progresar hacia estados de menor energa. Segn la hiptesis de Crick, la estructura terciaria particular que adopta un polipptido es la que posee la menor energa y confiere a la estructura la mayor estabilidad. La primera prueba de esta hiptesis fue realizada por Christian Anfinsen y sus colegas en los National Institutes of Health al usar la proteinrribonucleasa A. La ribonucleasa A es una pequea enzima que consta de una sola cadena de polipptidos de 124 aminocidos con cuatro enlaces disutfuro que unen varias partes de la cadena (fig. VE 2-1). Como era imposible aislar cadenas de ribonucleasa antes que sufriera su plegamiento dentro de la clula, Anfinsen tuvo que seguir el siguiente mtodo. Purific la enzima activa a partir de clulas, a continuacin trat la protena con agentes capaces de destruir las estructuras secundaria y terciaria del polipptido, y luego estudi la capacidad de la protena para restablecer su conformacin activa (nativa). El desplegarniento o desorganizacin de una protena se denomina desnaturalizacin y se puede efectuar mediante varios agentes, incluyendo detergentes, solventes orgnicos, radiaciones, calor y compuestos como la urea y el cloruro de guanidina, los cuales bloquean diferentes interacciones que estabilizan la estructura terciaria de una protena. Para desnaturalizar la ribonucleasa Anfinsen trat primero la molcula con/?-mercaptoetanol, agente reductor que rompe los puentes disulfuro y los convierte en grupos sulfhidrilo (SH) de cisterna; y con urea concentrada capaz de romper enlaces no covalentes. Juntos estos agentes pueden desorganizar por completo la protena. Una vez eliminados el mercaptoetanol y la urea, Anfinsen observ que las molculas activas de la enzima se reconstruyeron (fig. VE 2-1}, molculas estructural y funcionalmente indistinguibles de las presentes al principio del experimento.2 Anfinsen concluy que la secuencia de aminocidos de un polipptido contiene toda la informacin requerida para ensamblar la conformacin tridimensional de las protenas, y por lo tanto el proceso de plegamiento ocurre por autoensamblado. La conclusin de que el replegamiento de la ribonucleasa ocurre por autoensamblado se apoya en la presuncin de que la urea provoca desorganizacin total de la protema, lo cual es imposible de verificar. Si el polipptido retiene un mnimo de

Desplegamiento (urea + mercaptoeanol)

KICUKA VE 2-1 .Una molcula nativa de ribonucleasa (con enlaces disulfuro intramoleculares) es reducida y desplegada con /3-mercaptoetanol y urea M8. Luego de eliminar estos reactivos la protena sufre replegamiento espontneo. (Tomado de C./. Epstein, R.F. Goldberger y C.B. Anfinsen, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 23:439, 1963.)

orden en presencia de la urea, podra argirse que eso facilita el replegamiento de la molcula despus de quitar el agente desnaturalizador. Posteriormente se confirm la capacidad de la ribonucleasa para autoensamblarse con la demostracin de que la ribonucleasa se puede sintetizar en el laboratorio, aminocido por aminocido, y que el producto sintetizado todava tiene capacidad para plegarse sobre s mismo y producir una molcula de enzima activa.3 Cuando Anfinsen y otros investigadores intentaron ampliar sus observaciones a otras protenas lograron resultados mixtos.4 Algunos polipptidos desnaturalizados se volvieron a plegar a sus conformaciones nativas, otros no. Incluso las protenas que se autoensarnblaron, lo hicieron mucho ms lentamente de lo que ocurre dentro de la clula. Adems, el autoensamblado ocurri mucho ms extensamente cuando la protena estaba presente en concentracin mucho menor (0.01 a 0.1 mg/ml) y temperaturas ms bajas que las observadas en la clula. Anfinsen concluy que la concentracin y temperatura menores reducan la probabilidad de formacin de agregados moleculares interactivos. Aunque el plegamiento de los polipptidos fue menos eficaz en el tubo de ensaye que en a clula, los resultados de estos estudios sugieren fuertemente

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FIGURA VE 2-2. Etapas propuestas en el proceso de plegamento de una protena. Los segmentos enrollados representan una hlice a y las flechas representan fibras /f. (Segn Jane S. Richardson, Adv. Prot. Chem. 34:326, 1981.)

que la estructura terciara de un polipptido puede originarse de manera espontnea a partir de su estructura primaria. En los ltimos 30 aos se han publicado cientos de trabajos acerca de las vas de plegamiento de protenas. En un polipptido determinado de 100 aminocidos hay ms de 1 000 enlaces que pueden girar y los clculos indican que si el plegamiento ocurre de manera totalmente al azar, podra requerirse mayor tiempo que la edad del universo en la bsqueda de todas las conformaciones posibles. Claramente, debe haber alguna direccin ("abreviaturas" moleculares) para el proce-

so. Los estudios de Jane Richardson y sus colegas, en la Universidad de Duke, y de otros indican que el proceso de plegamiento ocurre en pasos ordenados (fig. VE 2-2) con formacin de intermediarios bien definidos.5 Una vez que se logra un intermediario plegado aparecen guas que dirigen el proceso hacia la siguiente etapa intermedia y por lo tanto eliminan la necesidad de probar muchas conformaciones inestables. El proceso puede compararse a caminar por una playa rocosa o subir una cuesta empinada. A cada paso la persona busca una roca plana o un apoyo firme que lo gue hacia el siguiente sitio. Las primeras etapas del plegamiento generan, en condiciones tpicas, gran parte de la estructura secundaria de la protena, las hlices a y las lminas/?, que forman una armazn estable para los pasos subsecuentes. Se piensa que durante la evolucin se seleccionaron secuencias de aminocidos que forman con mayor rapidez a estos intermediaros relativamente estables. El plegamiento subsecuente de la mayor parte de las protenas solubles se gua por interacciones hidrofbicas que obligan a los residuos no polares a juntarse en el ncleo central de la protena formando una molcula compacta estabilizada por fuerzas de van der Waals. El ltimo paso, cuando se requiere, es la formacin de puentes disulfuro. Durante el decenio de 1980 se lograron nuevos conocimientos en el proceso de plegamiento dependientes de los resultados obtenidos a partir de una lnea de investigacin inesperada. En 1962, el bilogo italiano F.M. Ritossa estudiaba el desarrollo de la mosca de la fruta Drosopha y public un dato curioso.6 Cuando la temperatura a la cual se desarrollaban las larvas de la mosca de la fruta se elevaba de los 25C normales a 32C, se activaban algunos sitios nuevos en los cromosomas gigantes de las larvas. Como veremos en el captulo 10, los cromosomas gigantes de las larvas de estos insectos suministran una manera de visualizar la expresin del gen. Los resultados sugieren que el incremento de temperatura induce la expresin de nuevos genes, dato que se confirm 10 aos ms tarde con la caracterizacin de varias protenas nuevas presentes en la larva luego de elevar la termperatura.7 Pronto se observ que esta respuesta, denominada respuesta al choque de calor, no se limita a la mosca de la fruta, sino que tambin puede iniciarse en muchas otras clulas diferentes de prcticamente cualquier tipo de organismo, desde bacterias hasta plantas y mamferos.8 Un examen ms detenido revel que las protenas caracterizadas no slo se encontraban en las clulas sometidas al choque de calor, sino tambin en concentracin menor en clulas bajo condiciones normales. Cul es la funcin de estas protenas por choque de calor? La estructura de muchas protenas es muy sensible a la temperatura; una ligera elevacin de temperatura puede iniciar el desdoblamiento de estas protenas. Este desdoblamiento expone residuos hidrofbicos previamente ocultos en el ncleo de la protena. Igual que las molculas de grasa en un plato de sopa se renen en gotas, lo mismo ocurre a protenas con placas hidrofbicas en su superficie. Cuando se somete una clula al choque de calor, las protenas solubles tienden a desnaturalizarse y formar agregados. En 1985 se public un trabajo donde se demostraba que luego de la elevacin de la temperatura penetraba al ncleo de las clulas afectadas un tipo de protenas de choque de calor y se enlazaban a los agre-

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CAPITULO 2 Bases qumicas de la vida

gados de protenas nucleares, donde actuaban como "pata de cabra molecular" que favorece la disgregacin.9 Estudios adicionales indican que las protenas producidas por el choque de calor funcionan durante e! proceso normal de plegamiento enlazndose a las placas hidrofbicajs expuestas sobre la superficie de intermediarios parcialmente plegados, evitando su agregacin. Debido al papel auxiliar de estas protenas en el proceso de plegamiento para evitar interacciones indeseables, se les denomin chapetones moleculares.10 Se han descrito diferentes tipos de chaperones moleculares, y se ha demostrado que actan en secuencias muy parecidas a un equipo de relevos. Un tipo de chapern se une a un polpptido conforme se sintetiza sobre el ribosoma; luego el polipptido pasa a otro tipo de chapern que lo protege durante la siguiente etapa de plegamiento. La molcula chapern

FIGURA VE 2-3. Modelo de uno de los dos anillos del complejo GroEL. Cada anillo se compone de siete subunidades. Las hlices a se muestran en azul, la fibras/ en verde y los segmentos de conexin en naranja. La proena forma un cilindro hueco, segn se indica en la siguiente figura. (Tomado de K. Braig y cois., Nature 371:589, 1994, cortesa de Paul B. Siglcr. Copyright 1994, Macmillan Magazines Limited.)

mejor estudiada se denomina GroEL y se encuentra en el citoplasma de la bacteria E. coli; una-protena homologa denominada hsp60 se observ en mitocondrias y cloroplastos. Las clulas bacterianas que poseen un muante GroEL no funcional carecen de varias actividades enzimticas. Estas enzimas se sintetizan en los ribosomas de la clula, pero son incapaces de plegarse en la forma nativa, requisito para lograr un estado activo.11 GroEL es un complejo molecular enorme de 14 subunidades idnticas de polipptidos dispuestos en dos anillos apilados que recuerdan una "dona doble". La determinacin de la estructura tridimensional GroEL revel que en cada anillo se agrupan 7 subunidades que rodean una cavidad central (fig. VE 2-3).12 Se cree que en el proceso de plegamiento las protenas de as etapas intermedias quedan secuestradas dentro de la cavidad central para evitar un plegamiento errneo o que se unan a otras protenas. Una vez dentro de la cavidad GroEL, los polipptidos parcialmente plegados pueden sufrir ciclos alternados entre dos estados: enlazados a las paredes de la cmara y libres dentro del espacio de la cmara (fig. VE 2-4). Cada vez que el polipptido se libera de las paredes de la cmara presumiblemente avanza otro paso hacia su conformacin final. Cuando concluyen los pasos de plegamiento, el polipptido pierde su capacidad para enlazarse a la pared de la cmara y abandona el complejo GroEL. Puesto que los chaperones moleculares como GroEL slo suministran el ambiente para el plegamiento del polipptido y no poseen informacin indispensable para el proceso, todava el plegamiento de un polipptido se considera "autoensamblado". Los chaperones moleculares no slo ayudan al autoensamblado, sino que tambin participan en desplazar protenas a travs de las membranas para colocarlas en su posicin apropiada dentro de organelos especficos, como mitocondrias y cloroplastos.13 Dado que los mismos chaperones pueden facilitar el plegamiento de una gran variedad de polipptidos, se presume que los intermediarios parcialmente plegados deben compartir caractersticas comunes que les permiten enlazarse a los mismos chaperones. Una vez que la protena asume su conformacin final, estos sitios de enlace al parecer se ocultan en el interior de la protena y sta pierde su capacidad de interactuar de nuevo con un chapern.

SINOPSIS
Los enlaces covalentes juntan tomos para formar molculas. Los enlaces covalentes son estructuras estables formadas cuando los tomos comparten los electrones de su capa externa, y cada participante gana una capa llena. Los enlaces covalentes pueden ser simples, dobles o triples segn el nmero de pares de electrones compartidos. Si los electrones en el enlace son compartidos de manera desigual por los tomos que forman los electrones, el tomo con mayor atraccin por electrones (el ms electronegativo) posee carga parcial negativa, en tanto que el otro tomo posee carga parcial positiva. Las molculas sin enlaces polarizados tienen carcter no polar o hidrofbico que las hace insolubles en agua. Las molculas con enlaces polarizados tienen carcter polar o hidroflico que las hace hidrosolubles. Las molculas polares de importancia biolgica contienen uno o ms tomos electronegativos, de ordinario O, N, S o P (p. 37). Dbiles fuerzas de atraccin forman enlaces no covalentes dentro de la misma molcula o entre dos molculas cercanas entre regiones con carga positiva y negativa. Los enlaces no covalentes desempean un papel clave para conservar la estructura de las molculas biolgicas y mediar sus actividades dinmicas. Los enlaces no covalentes incluyen enlaces inicos, enlaces de hidrgeno y fuerzas de van der Waals. Los enlaces inicos se forman entre grupos con carga positiva y negativa; los enlaces de hidrgeno se establecen entre un tomo de hidr-

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O
GroEL

e
Enlace a GroEL

O
Liberacin Y plegamiento

O
Enlace a GroEl

e
Liberacin y plegamiento Plegamiento completo, no se enlaza, liberado

FIGURA VE 2-4. Modelo esquematizado de las etapas del plegamiento de una protena que pueden ocurrir dentro del complejo GroEL. Los segmentos amarillos del polipptido representan secuencias de residuos hidrofbicos expuestos sobre el polipptido parcialmente plegado. Placas hidrofbicas de este tipo pueden actuar como sitios de enlace para otros popptidos parcialmente plegados, lo que conduce a la formacin de agregados. Esto se puede evitar mediante interacciones entre estos sitios y la pared interna de la cmara del GroEL. Durante su estancia en la cavidad GroEL, el polipptido parcialmente plegado puede alternar entre dos estados: enlazado a la pared de la cmara y libre. Se piensa que estos cambios en las propiedades de enlace del GroEL son resultado de cambios de conformacin provocados por hidrlisis de ATP. El plegamiento producido por la internalizacin de las placas hidrofbicas ocurre por pasos durante los periodos en que el polipptido se libera de la pared de la cmara. Se puede notar que otra protena llamada GroES (no mostrada) a veces se enlaza a la parte de arriba o de abajo de GroEL y excluye la cmara durante el proceso de plegado.

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geno unido mediante enlace covalente (con carga parcial positiva) y un tomo de nitrgeno o de oxgeno unido mediante enlace covalente (con carga parcial negativa); las fuerzas de van der Waals se ejercen entre dos tomos con carga transitoria debido a asimetra momentnea en la distribucin de los electrones que rodean a los tomos. Molculas no polares o porciones no polares de molculas ms grandes en medios acuosos tienden a juntarse para establecer interacciones hidrofbicas. Ejemplos de diferentes tipos de interacciones no covalentes incluyen la asociacin de DNA y protenas mediante enlaces inicos, el agrupamiento de cadenas pares de DNA a travs de enlaces de hidrgeno y la formacin de un ncleo hidrofbico en protenas solubles corno resultado de interacciones hidrofbicas y fuerzas de van der Waals (;>. 33).

El agua posee propiedades nicas de las cuales depende la vida. Los enlaces covalentes para constituir una molcula de agua estn muy polarizados. Como resultado, el agua es un excelente solvente capaz de formar enlaces de hidrgeno prcticamente con toda molcula polar. El agua tambin es un determinante principal de la estructura de las molculas biolgicas y de los tipos de interacciones en las cuales participan. El pH de una solucin es una medida de la concentracin de iones hidrgeno (o hidronio). La mayor parte de los procesos biolgicos son muy sensibles a pH porque los cambios en la concentracin de ion hidrgeno alteran el estado inico de las molculas biolgicas. Las clulas estn protegidas de las variaciones de pH por amortiguadores, compuestos que reaccionan con iones hidrgeno o hidroxilo (p. 37).

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CAPITULO 2 Bases qumicas de la vida

Los tomos de carbono desempean un papel clave en la formacin de molculas biolgicas. Cada tomo de carbono tiene capacidad para enlazarse hasta con otros cuatro tomos, incluyendo otros tomos de carbono. Esta propiedad le permite formar molculas grandes cuyo esqueleto consiste en una cadena de tomos de carbono. Las molculas que slo contienen hidrgeno y carbono se denominan hidrocarburos. La mayor parte de las molculas de importancia biolgica contienen grupos funcionales que incluyen uno o ms tomos electronegativos que hacen a la molcula ms polar, ms hidrosoluble y ms reactiva (p, 39). Algunas molculas biolgicas son molculas pequeas; otras son macromolculas formadas a partir de elementos de construccin ms pequeos. Las macromolculas constituyen el material de un organismo y efectan las funciones requeridas. Casi todas las macromolculas son polmeros construidos por unin de subunidades monmeras en cadenas largas. Las macromolcuas se descomponen por hidrlisis (p. 41). Las molculas biolgicas son miembros de cuatro familias distintas: carbohidratos, lpidos, protenas y cidos nucleicos. Los carbohidratos incluyen azcares simples y molculas ms grandes (polisacridos) construidos con monmeros de azcar. La funcin primaria de los carbohidratos es almacenar energa qumica y servir como material de construccin durable para estructuras biolgicas. Los azcares biolgicos simples constan de un esqueleto de tres a siete tomos de carbono, cada carbono se une a un grupo hidroxilo, excepto uno que posee un grupo carbonilo. Los azcares con cinco o ms tomos de carbono pueden formar molculas en forma de anillo mediante autorreaccin. Los tomos de carbono situados a lo largo del esqueleto del azcar unidos a cuatro grupos diferentes son sitios de estereoisomerismo y generan pares de ismeros que no pueden superponerse. El carbono asimtrico ms alejado del carbonilo determina si el azcar es D o L. Los azcares se unen entre s mediante enlaces glucosdicos para formar disacacridos, oligosacridos y polisacridos. En animales, el azcar se almacena principalmente como glucgeno, un polisacrido ramificado que constituye una fuente de energa rpidamente disponible. En las plantas, las reservas de glucosa se almacenan como almidn, una mezcla de anulosa no ramificada y amilopectina ramificada. La mayor parte de los azcares, tanto en el glucgeno como en el almidn, estn juntos por uniones a(l>4). La celulosa es un polisacrido estructural elaborado por clulas vegetales que constituye el principal componente de la pared celular. En la celulosa, los monmeros de la glucosa se juntan mediante uniones /?(l->4), que pueden romperse por accin de la celulosa, enzima ausente en casi todos los animales. La quitina es un polisacrido estructural compuesto de monmeros de N-acetilglucosamina (p. 44). Los lpidos corresponden a diversos arreglos de molculas hidrofbicas que poseen estructura y funciones muy diferentes. Las grasas constan de una molcula de glicerol esterificado que forma tres cidos grasos. Los cidos grasos difieren en la longitud de la cadena, nmero y posicin de los dobles enlaces (sitios de insaturacin). Las grasas son muy ricas en energa qumica; un gramo de grasa contienen ms del doble

de la energa que un gramo de carbohidratos. Los esteroides son un grupo de lpidos que contienen un esqueleto de hidrocarburos caracterstico de cuatro anillos. Los esteroides incluyen el colesterol y tambin numerosas hormonas {p. ej., testosterona, estrgenos y progesterona) sintetizadas a partir de colesterol. Los fosfolpidos son molculas de lpidos que contienen fosfato, tanto en su extremo hidrofbico como en el hidroflico y desempean un papel vital en la estructura y funcin de las membranas celulares (v. 49). Las protenas son macromolculas de funcin diversa que contienen aminocidos unidos por enlaces peptdicos para formar cadenas de polipptidos. Los diversos arreglos de protenas incluyen enzimas, materiales estructurales, receptores de membrana, factores reguladores de genes, hormonas, agentes de transporte y anticuerpos. El orden en el cual se pueden incorporar los 20 aminocidos diferentes a una protena est codificado en la secuencia de nucletidos del DNA. Los 20 aminocidos comparten una organizacin estructural comn que consiste en un carbono a unido a un grupo amino, un grupo carboxilo y un grupo R de estructura variable. En el presente esquema, los grupos R se clasifican en cuatro categoras: con carga neta a pH fisiolgico; polares sin carga pero capaces de formar enlaces de hidrgeno; no polares que interactan a travs de fuerzas de van der Waals, y tres aminocidos (proiina, cisterna y glicina) con propiedades nicas (p. 50). La estructura de una protena se puede describir en cuatro niveles de complejidad creciente. La estructura primaria es descrita por la secuencia de aminocidos de un polipptido; la estructura secundaria correspondiente al arreglo tridimensional (conformacin) de las secciones de un esqueleto de polipptidos; la estructura terciaria dada por la conformacin de todo el polipptido, y la estructura cuaternaria que corresponde al arreglo de las subunidades si la protena consta de ms de una cadena de polipptidos. La hlice a y la lmina plegada fi son estables, y la mxima estabilidad se observa en estructuras secundarias unidas con enlaces de hidrgeno comunes en muchas protenas. La estructura terciaria de una protena es muy compleja y nica para cada tipo individual de protena. La mayor parte de las protenas poseen una forma globular en la cual e polipptido se pliega para formar una molcula compacta con residuos especficos situados estratgicamente para permitir a la protena efectuar su funcin especfica. El anlisis de un gran nmero de protenas revela que muchas contienen dominios que les confieren independencia estructural y funcional (p, 54). Las actividades de las protenas se acompaan de cambios de conformacin. Algunos movimientos se pueden clasificar como vibraciones moleculares al azar, en tanto que otros son cambios dirigidos en la posicin relativa entre grupos particulares de la protena (p. 62) Los cidos nucleicos son molculas principalmente de informacin que constan de cadenas de nucletidos monmeros. Cada nucletido en una cadena consta de un azcar, fosfato y base nitrogenada. Los nucletidos estn unidos por enlaces entre los grupos hidroxilo 3' del azcar de un nucletido y el

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grupo fosfato 5' del nucletido adyacente. El RNA y el DNA estn ensamblados a partir de cuatro nucletidos diferentes; los nucletidos se distinguen por sus bases, que pueden ser una pirimidina (citosina o uracilo/timina) o una purina fadenina o guanina). El DNA es una cadena doble de cido nucleico, y el RNA por lo general es una cadena nica, aunque a menudo la cadena nica se pliega sobre s misma para formar secciones de doble cadena. En los cidos nucleicos, la informacin est codificada en la secuencia especfica de nucletidos que componen una cadena (p, 66).

La informacin requerida para que una cadena de polipptidos adopte su conformacin nativa est codificada en la estructura primaria. Algunas protenas adoptan su conformacin final por s mismas, otras requieren la ayuda de chaperones inespecficos. Algunos complejos macromoleculares, como VMT y las subunidades ribosmicas de las bacterias, tambin son capaces de autoensamblado, corno se puede observar en experimentos con partculas funcionalmente activas que pueden reconstituirse a partir de mezclas de componentes purificados (p. 68).

PREGUNTAS DE REPASO
1. Describir algunas de las propiedades que distinguen a los enlaces covalentes de los no covalentes. 2. Por qu las molculas polares, como las del azcar de mesa, se disuelven con facilidad en el agua? Por qu se forman gotas de grasa sobre la superficie de una solucin acuosa? Por qu el sudor enfra al cuerpo? 3. Si se aade cido clorhdrico al agua, cul es el efecto sobre la concentracin de ion hidrgeno?; sobre el pH?; sobre la carga inica de cualquier protena en la solucin? 4. Qu propiedades del tomo de carbono son cruciales para la vida? 5. Qu macromolculas son polmeros? Cul es la estructura bsica de cada tipo de monmero? Cmo varan entre s los diferentes monmeros de cada tipo de rnacromolcula? 6. Describir la estructura de los nucletidos y cmo se juntan estos rnonmeros para formar una cadena de polinucletidos. Por qu sera sumamente simplista describir el RNA como un cido nucleico de una sola cadena? 7. Cul es la relacin entre una base y su cido conjugado? 8. Los tomos de oxgeno tienen ocho protones en su ncleo. Cuntos electrones tienen? Cuntos orbitales se encuentran en la capa ms interna de electrones? Cuntos electrones hay en la capa externa? Cuntos electrones ms puede contener la capa externa antes de llenarse? 9. Nombrar tres polisacridos compuestos de monrneros de glucosa. En qu difieren estas macromolculas entre s? 10. Describir las propiedades de tres tipos diferentes de molculas de lpidos. Cules son sus respectivos papeles biolgicos? 11. Cul es la principal propiedad que distingue a los diferentes aminocidos entre s? Qu papel desempean estas diferencias en la estructura y funcin de las protenas? 12. Cules son las propiedades de la glicina, la prolina y la cistena que distinguen a estos aminocidos de todos los dems? 13. Cules son las propiedades diferentes de una hlice a respecto de una lmina /?? Cmo afecta cada una de estas estructuras secundarias a las propiedades de una protena corno a-queratina o seda? 14. Puesto que las protenas actan como mecanismos moleculares, explicar porqu los cambios de conformacin son tan importantes en la funcin de las protenas. 15. Qu tipo de pruebas sugieren que las subunidades ribosmicas bacterianas son capaces de autoensamblado pero las subunidades eucariotas no lo son?

PREGUNTAS ANALTICAS
1. La anemia drepanoctica es resultado de la sustitucin de una valina por un cido glutmico. Cul sera el efecto esperado si la mutacin fuera colocar una leucina en ese sitio? Un cido asprtico? 2. Elabore una lista con los siguientes compuestos respecto de la solubilidad esperada en agua: CHaC^Cr^CF^OH, glucosa, CH3{CH2)5CH3. 3. Cuntos ismeros estructurales se pueden formar a partir de una molcula con la frmula CsH^? Con C^g? 4. El gliceraldehido es la nica aldotetrosa de tres carbonos y puede haber dos estereoismeros. Cul es la estructura de la dihidroxiacetona, la nica cetotriosa? Cuntos estereoismeros la forman? 5. Se conocen bacterias que cambian el tipo de cidos grasos que producen conforme se modifica la temperatura de su ambiente externo. Qu tipo de cambio se esperara en los cidos grasos cuando la temperatura desciende? Por qu este cambio sera adaptativo? 6. Cul de los siguientes compuestos, si\es el caso, consta de cadenas no ramificadas: polipptidos, cidos grasos, celulosa, glucgeno? 7. Identificar el carbono a en el esqueleto del polipptido CCNCCNCCNH2. 8. Cul de las siguientes afirmaciones es cierta? Incrementando el pH de una solucin: 1) se suprime la disociacin de un cido carboxlico; 2) aumenta la carga de un grupo amino; 3) aumenta la disociacin de un cido carboxlico; 4) se suprime la carga de un grupo amino. 9. Cul de los cuatro tipos de aminocidos posee grupos R con el mayor potencial para formar enlaces de hidrgeno? Cul tiene el mayor potencial para formar enlaces inicos? Para formar interacciones hidrofbicas? 10. Si las tres enzimas del complejo piruvato deshidrogenase existieran como protenas fsicamente separadas en vez de complejo, qu efecto tendra eso sobre la velocidad de las reacciones catalizadas por estas enzimas? Por qu?

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CAPITULO 2 Bases qumicas de la vida figura 2-27, si el pK del grupo R de lisina es 10 y el pK del grupo carboxilo terminal es 4, cul es la estructura del pptido a pH 7? A pH 12? 14. Por qu sera de esperar que la histidina con pK 6.5 participe en muchas reacciones enzimticas? 15. Sera de esperar que una solucin salina muy concentrada fuera capaz de desnaturalizar ribonucleasa? En caso afirmativo, por qu s y en caso negativo por qu no?

11. Est usted de acuerdo en que la ribonucleasa ni la mioglobina tienen estructura cuaternaria? Por qu s o por

qu no?
12. Cuntos tripptidos diferentes son posibles? Cuntos carboxilos terminales estn presentes en las cadenas de polipptidos de una molula de hemoglobina? 13. Usted aisl un pentapptido compuesto de cuatro residuos de glicina y un residuo de lisina en el C terminal del pptido. Utilizando la informacin suministrada en el pie de la

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CAPITULO

Energa, enzimas y metabolismo

3-1 Energa 3-2 Enzimas La perspectiva humana: El creciente problema de la resistencia a los antibiticos Metabolismo La va experimental: Determinacin del mecanismo de accin de la lisozima

a relacin entre estructura y funcin es evidente en todos los niveles de organizacin biolgica, desde el molecular hasta el orgnico. En el captulo precedente vimos que las protenas tienen una estructura tridimensaional intrincada que depende de los fragmentos particulares de la molcula presentes precisamente en el sitio correcto. En este captulo consideraremos con ms detalle un amplio grupo de protenas, las enzimas, y veremos cmo su compleja arquitectura les confiere la capacidad de acelerar ampliamente la velocidad de las reacciones biolgicas. Para comprender de qu manera las enzimas pueden lograr esto es necesario considerar el flujo de energa que ocurre durante una reaccin qumica, lo que conduce al tema de la termodinmica. Una breve revisin de los principios de la termodinmica nos ayudar a explicar muchos de los procesos celulares que analizaremos en ste y los siguientes captulos, incluyendo el movimiento de iones a travs de las membranas, la formacin de ATP y la sntesis de rnacr o molculas. Como veremos, el anlisis termodrimico de un sistema particular puede revelar si los acontecimientos pueden ocurrir o no de manera espontnea, y en caso contrario suministra una medida de la energa que la clula debe gastar para que tenga lugar el proceso. En la ltima seccin de este captulo veremos cmo se vinculan las reacciones individuales para formar vas metablicas y cmo se puede controlar el flujo de energa y de materia prima a travs de ciertas vas,

FIGURA ;--A. Modelo generado por computadora de. una versin modificada genticamente de a enzima superxido dismutasa. La enzima se muestra en verde; los iones metlicos (cobre y zinc) del sitio activo se muestran como esferas, la va de llegada del sustrato (un radical superxido) se muestra en prpura i/ el potencial electrosttico que rodea al sitio activo se representa mediante una rejilla. (Cortesa de Ezabetli Gctzoff, J.Tainer y M. Pique, del Scripps Researcli Institutc.)

3-1 Energa
Una clula viva hierve en actividad. Las rnacromolculas de todos los tipos son ensambladas a partir de materias primas, se producen y excretan productos de desperdicio, fluyen instrucciones genticas desde el ncleo hacia el cito77

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CAPITULO 3 Energa, enzimas y metabolismo CUADRO 3-1. Factores de potencia y capacidad en las mediciones de energa Tipo de energa Mecnica Cada de una roca Compresin Estiramiento Elctrica Movimiento de iones Osmtica Movimiento de agua hacia el interior de una clula Energa no disponible para efectuar trabajo factor de potencia Factor de capacidad

plasma, las vesculas se mueven desde el complejo Golgi hacia la membrana plasmtica, los iones son bombeados a travs de las membranas celulares, y as sucesivamente. Para mantener este elevado nivel de actividad, la clula necesita energa. Por ltimo, la energa empleada como combustible para la vida se deriva de la energa luminosa atrapada por las clulas vegetales y convertida en compuestos orgnicos ricos en energa. La mayor parte de los organismos obtiene su energa alimentndose de plantas o de organismos que se alimentan de plantas. Energa se define como la capacidad para hacer trabajo, o sea, capacidad para cambiar o mover alguna cosa. La energa existe en dos estados alternativos: potencial y cintica. La roca sostenida sobre el borde de un risco posee energa potencial debido a que tiene la posibilidad de efectuar trabajo. Este potencial se debe a que se encuentra dentro de un campo de fuerzas, en este caso el campo gravitacional. Si se empuja la roca ms all de la orilla entonces la fuerza puede actuar y hacerla caer. Durante la cada, la roca tiene energa cintica y puede efectuar trabajo, por ejemplo, levantando otro objeto, como se muestra en la figura 3-1. De manera similar, una clula nerviosa en reposo tiene energa potencial cuando mantiene una elevada concentracin de iones sodio en el lado externo de su membrana plasmtica y una baja concentracin de estos mismos iones en su lado interno. Igual que el flujo de agua a travs de una presa, al abrirse conductos especficos en la membrana plasmtica los iones sodio fluyen a travs de la membrana hacia el interior de la clula. El movimiento de iones sodio en direccin al interior de la clula es una forma de energa cintica que se puede emplear para realizar trabajo, como ocurre cuando un impulso nervioso viaja a lo largo de la membrana de una clula nerviosa. En los dos casos descritos (la roca que cae y el movimiento de los iones sodio en direccin al interior de la clu-

Altura Presin Tensin Potencial elctrico (voltaje) Concentracin de solutos

Masa Volumen Longitud Carga

Masa

Temperatura

Entropa

la), como siempre que se mide la energa durante el trabajo, se deben considerar dos factores: un factor de potencia y un factor de capacidad (cuadro 3-1). El factor de potencia es proporcional a la intensidad del campo de fuerzas, en tanto que el factor de capacidad suministra cierta medida de la "magnitud" de la materia considerada. En el caso de la roca que cae, el factor de potencia es la distancia que recorre y el factor de capacidad es la masa de la roca. Para el movimiento de iones cargados, el factor de potencia es el voltaje y el factor de capacidad es la carga de las partculas. El trabajo, o energa liberada durante estos acontecimientos, es un mltiplo de estos dos factores; conforme un factor crece, tambin se incrementa la cantidad de energa.

La roca posee energa potencia!

Al caer, la roca tiene energa cintica

La roca ha realizado trabajo

FIGURA 3-1. Realizacin de trabajo, tn esta caprichosa composicin fotogrfica, la roca suspendida en lo alto de la muralla tiene energa potencial. La energa disponible para efectuar trabajo es proporcional a la masa de la roca y a la distancia que puede caer. Una vez que abandona el borde de la muralla, la roca posee energa cintica que se puede emplear para efectuar trabajo, en este caso elevando al pez.

CAPITULO 3 Energa, enzimas y metabolismo

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Leyes de la termodinmica y concepto de entropa Termodinmica es el estudio de los cambios energticos que acompaan a los acontecimientos del universo. En las siguientes pginas centraremos nuestra atencin en un conjunto de conceptos que nos permitirn predecir la direccin que seguirn los hechos y si un acontecimiento requiere o no del ingreso de energa para que ocurra. Sin embargo, los principios de la termodinmica no ayudan a determinar con qu rapidez ocurrir un proceso especfico ni el mecanismo que la clula emplea para llevarlo a cabo. Primera ley de la termodinmica La primera ley de la termodinmica se refiere a la conservacin de la energa. Afirma que la energa no se puede crear ni destruir. Sin embargo, se puede convertir (transformar) de una forma a otra. La energa elctrica se convierte en energa mecnica cuando la aplicamos a un reloj, y la energa qumica se convierte en energa trmica cuando sirve como combustible y se quema en un calentador de petrleo. Las clulas son capaces de transformar energa. La energa qumica presente en polisacridos y grasas almacenados se emplea sobre todo para efectuar reacciones qumicas que requieren energa, pero tambin se convierte en energa mecnica cuando los organelos se desplazan de un lugar a otro dentro de la clula; a energa qumica cuando se libera calor durante la contraccin muscular, o a energa elctrica cuando fluyen iones a travs de una membrana. La transformacin ms importante de energa en el mundo biolgico es la conversin de energa solar en energa qumica: el proceso de la fotosntesis, que suministra el combustible que de manera directa o indirecta constituye la fuerza motriz para casi todas las formas de vida.1 Algunos animales, incluyendo lucirnagas y peces luminosos, pueden convertir una parte de su energa qumica otra vez en luz. Sin embargo, cualquiera que sea el proceso de transformacin, la cantidad de energa total permanece constante en el universo. A fines del siglo XIX, la primera ley de la termodinmica se extendi a los organismos vivos a travs de experimentos en los cuales se mantena a sujetos en un ambiente controlado y se llevaba el registro del consumo de energa. Se observ que la energa consumida por estos individuos en forma de nutrientes se equilibraba por la energa liberada en forma de productos de desperdicio y calor. Para analizar las transformaciones de energa que afectan a la materia es necesario dividir el universo en dos partes: el sistema bajo estudio y el resto del universo, al cual nos referiremos como el entorno. Un sistema se puede definir de varias maneras. Puede ser cierto espacio en el universo o cierta cantidad de materia. Por ejemplo, el sistema puede ser una clula viva. En la mayor parte de los siste-

1 Las nicas comunidades de organismos independientes de la fotosntesis residen en los respiraderos de las fuentes termales en el fondo del ocano y dependen de la energa obtenida por quimiosntesis bacteriana.

mas termodinmicos es necesario estipular que no intercambia materia con su entorno; es un sistema cerrado. Por lo contrario, el sistema puede intercambiar energa con su entorno. Los cambios de energa de un sistema que ocurren durante un acontecimiento se manifiestan de dos maneras: como cambio en el contenido de calor del sistema y en la ejecucin de trabajo. Aunque el sistema puede ganar o perder energa, la primera ley de la termodinmica indica que la prdida o ganancia debe ser equilibrada por una prdida o ganancia correspondiente en el entorno, de modo que la cantidad total de energa en el universo permanezca constante. La energa del sistema se llama energa interna (E), y el cambio de la energa interna durante una transformacin es AE. Una manera de describir la primera ley de la termodinmica es que AE = Q W, donde Q es la energa calorfica y Wes la energa de trabajo. Si durante el acontecimiento se absorbe calor del entorno al interior del sistema, entonces Q es positiva; si se pierde calor hacia el entorno, Q es negativa. Si el sistema efecta trabajo sobre el entorno (incrementando en volumen y comprimiendo el entorno), entonces W es positiva; cuando se efecta trabajo sobre el sistema, Wes negativa. La ecuacin precedente indica que la cantidad de trabajo realizado y de calor intercambiado pueden variar durante una transformacin particular (como la cada de la roca de la figura 3-1), pero la diferencia entre estas dos cantidades cuantificables no vara. En el caso de la roca que cae, el cambio de esa cantidad de masa a travs de una altura determinada da como resultado un cambio especfico de la energa interna del sistema; por ejemplo, no hace diferencia lo que ocurra a la roca durante el trayecto. Las diferencias de energa son independientes de la va que sigue el sistema conforme pasa desde el estado de energa inicial hasta el estado de energa final (p. ej., desde el borde del risco hasta abajo). Lo mismo es cierto para las transformaciones biolgicas de la energa, como ocurre, por ejemplo, cuando se convierte glucosa a C2 y H2O. La misma cantidad de energa se libera cuando se quema la glucosa en una llama como cuando se oxida paso a paso dentro de una clula. Esto es conveniente para los bioqumicos, ya que la energa liberada durante la descomposicin de la glucosa se determina con mayor facilidad quemndola en una cmara de laboratorio (calormetro) que midindola dentro de la clula. Segn el proceso, la energa interna del sistema al final puede ser mayor, igual o menor que al principio, dependiendo de su relacin con el entorno (fig. 3-2). En otras palabras, AE puede ser positiva, cero o negativa. Consideremos que el sistema sea el contenido de un vaso de reaccin (no diferente a una clula viva). Mientras no haya cambios de presin o de volumen del contenido, el sistema no efecta trabajo sobre su entorno, y viceversa. En este caso, AE = AQ, y la energa al final de la transformacin ser mayor que al principio si se absorbi calor (ganancia) y menor si se liber calor (prdida). En condiciones de volumen y presin constantes, las reacciones que pierden calor se denominan exotrmicas y las que ganan calor son endotrmicas. Hay muchas reacciones de ambos tipos. Puesto que AE para un proceso particular puede ser positiva o negati-

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CAPITULO 3 Energa, enzimas y metabolismo

(a)

(b)

FIGURA 3-2. Cambio en la energa interna del sistema. En este ejemplo, el sistema se define como la hoja particular de una planta, a) En el da, pigmentos fotosintticos de los cloroplastos de la hoja absorben la luz del sol y la emplean para convertir CO2 en carbohidratos, como la molcula de glucosa que se muestra en el dibujo (la cual despus se incorpora a sucrosa y almidn). Conforme la clula absorbe la luz, su energa interna aumenta; la energa presente en el resto del universo tiene que disminuir, b) En la noche se invierte la relacin energtica entre la clula y su entorno a medida que los carbohidratos producidos durante el da se oxidan para formar CC>2 en las mitocondrias y la energa se emplea para poner en marcha las actividades nocturnas de la clula.

va, nos suministra informacin en cuanto a la probabilidad de que ocurra cierto acontecimiento, Para determinar la probabilidad de una transformacin particular necesitamos considerar algunos conceptos adicionales.
Segunda ley de la termodinmica

La segunda ley de la termodinmica expresa el concepto de que los acontecimientos en el universo tienen una direccin; siempre proceden "cuesta abajo" desde un estado de energa ms alta a un estado de energa ms baja. As, en una transformacin energtica cada vez hay menor energa disponible para efectuar trabajo adicional. Las rocas que caen desde el risco hasta el piso, una vez en el piso se reduce su capacidad para efectuar ms trabajo; es muy poco probable que puedan elevarse otra vez por s mismas hasta la cumbre del risco. De manera similar, las cargas opuestas normalmente se mueven para unirse, no para separarse, y el calor fluye desde los puntos ms calientes a los cuerpos ms fros, no a la inversa. Se dice que estos acontecimientos son espontneos, trmino que indica que la termodinmica los favorece y pueden ocurrir sin el aporte de energa externa. El concepto de la segunda ley de la termodinmica originalmente se formul para mquinas operadas con calor y lleva implcita la idea de que es termodinmicamente imposible construir una mquina de movimiento perpetuo. En otras palabras, es imposible que una mquina rinda 100% de eficacia, condicin requerida si la mquina contina funcionando sin ingreso de energa externa. Inevitablemente se pierde algo de energa conforme la mquina efecta su ac-

tividad. Una relacin similar tambin es cierta para los organismos vivos. Por ejemplo, cuando una jirafa ramonea las hojas de un rbol o un len atrapa a la jirafa, la mayor parte de la energa qumica contenida en el alimento nunca estar disponible para el anima! que lo comi. La energa no disponible para efectuar trabajo adicional luego de un acontecimiento tiene un factor de intensidad y un factor de capacidad, igual que los otros trminos energticos (vase cuadro 3-1). El factor de intensidad es la temperatura fen grados) y el factor de capacidad es la entropa (S), que tiene las dimensiones de energa por grado (o sea, caloras por grado). El trmino para energa no disponible es TAS, donde AS es el cambio de entropa entre los estados inicial y final. La prdida de energa disponible durante un proceso es resultado de la tendencia del universo a incrementar el azar o el desorden cada vez que se transfiere energa. La entropa suministra una medida del desorden; se relaciona con los movimientos al azar de las partculas de la materia, los cuales, debido a que son al azar, no se pueden aprovechar para ejecutar un proceso dirigido de trabajo. Segn la segunda ley de la termodinmica, cada acontecimiento se acompaa de un incremento en la entropa del universo. Por ejemplo, cuando se deja caer un cubito de azcar en una taza de agua caliente hay un cambio espontneo de las molculas, desde un estado ordenado en el cristal a una condicin de mucho mayor desorden cuando las molculas de azcar se dispersan por toda la solucin {fig. 3-3, a). A medida que las molculas del cubo de azcar se disuelven

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en la solucin, su libertad de movimiento se incrementa igual que la entropa del sistema. El cambio desde el estado concentrado hasta el disperso es resultado de los movimientos al azar de las molculas. Finalmente, la dispersin de las molculas de azcar es igual en todo el volumen disponible porque el estado de distribucin uniforme es el estado ms probable. La liberacin de calor, como ocurre, por ejemplo, en la oxidacin de la glucosa dentro de una clula o por la friccin generada conforme la sangre fluye a travs de un vaso, es otro ejemplo de incremento de la entropa. La liberacin de energa trmica por organismos vivos slo sirve para incrementar la velocidad de los movimientos al azar de los tomos y las molculas; no se puede reorientar para efectuar trabajo adicional. La energa de los movimientos molecular y atmico aumenta con la temperatura y as tambin se incrementa la entropa. Slo en el cero absoluto (QK), cuando todo movimiento cesa, la entropa es igual a cero. Igual que con otros acontecimientos espontneos, se debe distinguir entre el sistema y su entorno. La segunda ley de la termodinmica slo indica que la entropa total del universo debe incrementarse; el desorden dentro de una parte del universo (sistema) puede disminuir a expensas de su entorno. La entropa del azcar disuelta puede disminuir; se puede recristazar evaporando el agua (fig. 3-3, b). Sin embargo, la consecuencia de este proceso es un incremento en la entropa del entorno. El incremento de la libertad de movimiento de las molculas de agua en fase gaseosa compensa con mucho la disminucin de la libertad de las molculas en los cristales de azcar. La vida opera sobre un principio similar. Los organismos vivos tienen capacidad para disminuir su propia entropa incrementando la entropa de su ambiente. La entropa disminuye en un organismo cuando molculas relativamente simples, como los aminocidos, se ordenan en molculas ms complejas, como la protena mioglobina de una clula muscular. Sin embargo, al mismo tiempo, la entropa del ambiente aumenta cuando molculas complejas ordenadas como el glucgeno almacenado en el hgado o en el tejido muscular se convierten en calor y en compuestos ms pequeos menos ordenados (como CC2 y HjO} que se liberan al ambiente. Esta caracterstica del metabolismo es lo que permite a los organismos vivos mantener un estado altamente ordenado e improbable, Otra medida del estado energtico de un organismo vivo es la informacin contenida en sus macromolculas. La informacin es algo difcil de definir, pero fcil de reconocer. La informacin se puede medir en trminos de la disposicin ordenada de las subunidades de una estructura. Por ejemplo, protenas y cidos nucleicos, en los cuales la disposicin lineal especfica de las subunidades es muy ordenada, es baja en entropa y alta en contenido de informacin. Conservar un estado con alto contenido de informacin (baja entropa) requiere el ingreso de energa. Consideremos una sola molcula de DNA localizada en una clula heptica. Esta clula tiene docenas de diferentes enzimas cuya nica funcin es determinar la aparicin de daos en el DNA y repararlos (seccin 13-2). El dao a un nucletido de una clula activa puede ser tan nocivo que sin este

(a)

FIGURA 3-3. Los acontecimientos se acompaan de un incremento en la entropa dei universo, a) Un cubo de azcar contiene molculas de sucrosa en disposicin altamente ordenada, en la cual la libertad de movimiento de las molculas individuales est bastante restringida. Conforme el cubo se disuelve, la libertad de movimiento de las molculas de sucrosa aumenta mucho y sus movimientos al azar causan que al final sus molculas se distribuyan uniformemente en todo el espacio disponible. Una vez que esto ocurre, no hay tendencia adicional a la redistribucin y la entropa del sistema est en un mximo, b) Las molculas de azcar distribuidas al azar en toda la solucin pueden retornar a un estado de orden, pero slo si la entropa del entorno aumenta, como ocurre cuando las molculas de agua ordenadas de la fase lquida se desordenan mediante evaporacin.

gasto de energa el contenido de informacin del DNA rpidamente se deteriora. Energa libre En conjunto, las dos leyes de la termodinmica, primera y segunda, indican que la energa del universo es constante pero la entropa contina aumentando hasta un mximo. Los conceptos inherentes en las primeras dos leyes fueron reunidos por el qumico estadunidense }. Willard Gibbs, en 1878, en la expresin Af = AG + TAS, donde AG es el cambio en energa libre, o sea, el cambio de energa disponible durante un proceso para efectuar trabajo; AH es el cambio en entalpia o contenido total de energa del sistema (para nuestros propsitos equivalente a AE); T es la temperatura absoluta (K = C + 273); y AS es el cambio de entropa del sistema. La ecuacin afirma que el cambio total

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CAPITULO 3 Energa, enzimas y metabolismo

de energa es igual a la suma de los cambios en energa til (AG) y la energa que no est disponible para hacer trabajo adicional (TAS). Despejando AT y volviendo a plantear la ecuacin tenemos AG = AH - TAS; esta ecuacin suministra una medida de la espontaneidad de un proceso particular. Nos permite predecir 3a direccin en la cual proceder un proceso y la extensin de dicho proceso. Todas las transformaciones espontneas de energa deben tener AG negativa; o sea, el proceso debe proceder desde un estado de mayor energa libre a un estado de menor energa libre. La magnitud de AG indica la mxima cantidad de energa que se puede liberar para emplear en otro proceso. Los procesos que pueden ocurrir espontneamente, p. ej-, los favorecidos termodinmicamente, se decriben como exergnicos. Estos procesos tienen AG. Por lo contrario, si AG para un proceso dado es positiva, entonces no puede ocurrir de manera espontnea. Estos procesos son desfavorecidos en forma termodinmica y se describen como endergnicos. Como veremos, las reacciones normalmente endergnicas pueden producirse acoplndolas a procesos que liberan energa. Los signos AH y AS pueden ser positivos o negativos, segn la relacin entre el sistema y su entorno. (AH ser positivo si el sistema gana calor y negativo si pierde calor; AS ser positivo si el sistema tiende a mayor desorden y negativo cuando suele ser menos desordenado.) La interrelacin entre AH y AS se ilustra en la transformacin del agua en hielo. La conversin del agua del estado lquido al estado slido se acompaa de disminucin de la entropa (AS es negativa, segn se ilustra en la figura 3-4) y disminucin en la entalpia (AH es negativa). Para que esta transformacin ocurra (o sea para que AG sea negativa), AH debe ser ms negativa que TAS, condicin que slo ocurre bajo 0C. Esta relacin se puede observar en el cuadro 3-2, que indica los valores para los diferentes trminos s un mol de

agua se convierte en hielo a 10C, 0C o -10C. En todos los casos, cualquiera que sea la temperatura, el nivel energtico del hielo es menor que el del agua lquida (AH es negativa). Sin embargo, a temperaturas ms elevadas, el trmino de la ecuacin correspondiente a la entropa (TAS) es ms negativo que el trmino de la entalpia, y por lo tanto el cambio de energa libre es positivo y el proceso no puede ocurrir espontneamente. A 0C, el sistema se encuentra en equilibrio, en tanto que a 10C el proceso de solidificacin es muy favorecido; o sea, AG es negativa. Cambios de energa libre en las reacciones qumicas Una vez analizado el concepto de energa libre en trminos generales, podemos aplicar la informacin a las reacciones qumicas que ocurren dentro de la clula. Todas las reacciones qumicas dentro de la clula son reversibles y por lo tanto consideraremos dos reacciones que ocurren en forma simultnea, una hacia adelante y la otra en sentido inverso. Segn la ley de accin de las masas, la velocidad de una reaccin es proporcional a la concentracin de los reactantes. Por ejemplo, consideremos esta reaccin hipottica: A + B==C + D La velocidad de la reaccin hacia adelante es directamente proporcional al producto de las concentraciones molares de A y B. Esto puede expresarse como velocidad de la reaccin hacia adelante igual a /i[A][B], donde k\s una velocidad constante para la reaccin hacia adelante. La velocidad de la reaccin inversa es igual a 2[C][Dj. Sin embargo, todas las reacciones proceden lentamente hacia un estado de equilibrio; o sea, un punto en el cual las velocidades de reaccin en uno y otro sentido son iguales. En el equilibrio, igual nmero de molculas A y B sern convertidas en molculas C y D por unidad de tiempo. Por lo tanto, en el equilibrio *i[A][B]=* 2 [C][D] ecuacin que se puede replantear de la siguiente manera

En otras palabras, en el equilibrio hay una proporcin predecible entre concentracin de productos y concentracin de reactantes. Esta proporcin, igual a ki/kz, se denomina constante de equilibrio, K e q. La constante de equilibrio permite predecir la direccin favorecida (hacia adelante o inversa) de la reaccin en un conjunto de condiciones determinadas. Supongamos, por ejemplo, que estudiamos la reaccin de arriba y acabamos de mezclar los cuatro componentes (A, B, C, D) de modo que cada uno est presente en concentracin 0.5 M.
=

[API
FIGURA 3-4. Cuando el agua se congela su entropa disminuye debido a que las molculas de agua del hielo existen en estado ms ordenado, con menos libertad de movimiento que en el estado lquido. La disminucin de entropa es particularmente notable en la formacin de un cristal de nieve. ( Nuridsany and Perentwu/Photo Researches.)

[0.5][0.51 [0.5] [0.5]

-i

La direccin de esta reaccin depende de la constante de equilibrio. Si la Keq es mayor que uno, la reaccin proceder a mayor velocidad en \z direccin de formar los productos C y D que en la direccin inversa. Por ejemplo, si Keq es 9.0, entonces en el equilibrio la concentracin de reactantes y

CAPITULO 3 Energa, enzimas y metabolismo CUADRO 3-2. Termodinmica de la transformacin hielo-agua Temperatura (Q -10 0 + 10 AE (cal/mol) -1343 -1436 -1529 AH (cal/mol) -1343 -1436 -1529 AS (cal/mol ") -4.9 -5.2 -5.6 TAS (cal/mol) -1292 -1436 -1583 AG (cal/mol) -51 0 +5.4

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FUENTE: I. M. Klotz, "Energy in Biochemical Reactions". Academic Press, 1967.

productos en esta mezcla particular de reaccin ser de 0.25 M y 0.75 M, respectivamente. [C][D] = [0.75] [0.75] [A][B] [0.25] [0.25] Por otro lado, si Keq es menor que uno, la reaccin inversa proceder a mayor velocidad que la reaccin hacia adelante, de modo que la concentracin de A y B se elevar a expensas de C y D. De esto se deduce que la direccin de una reaccin en cualquier momento depende de la concentracin relativa de todas las molculas en ese momento y que puede predecirse por la Keq. Retornemos al asunto de la energtica. La proporcin entre reactantes y productos presentes en el equilibrio es determinada por los niveles relativos de energa libre de las sustancias en cada miembro de la ecuacin. En tanto la energa libre total de los reactantes sea mayor que la energa libre total de los productos, AG tendr valor negativo y la reaccin proceder en la direccin de formar productos. Cuanto mayor sea la AG, ms alejada estar la reaccin del equilibrio. Conforme la reaccin procede, la diferencia del contenido de energa libre entre reactantes y productos disminuye (AG se hace menos negativa), hasta que en el equilibrio la diferencia es cero (AG = 0). Puesto que AG para una reaccin dada depende de la mezcla de reaccin presente en todo momento, no es un trmino til para comparar la energa de diferentes reacciones. Para obtener reacciones sobre bases comparables y efectuar varios tipos de clculos, se adopt una convencin considerando la diferencia de energa libre entre reactantes y productos en un conjunto determinado de condiciones estndar. Para reacciones bioqumicas, las condiciones se establecen arbitrariamente usando una mezcla de reaccin a 25C (298K) y una atmsfera de presin con todos los reactantes y productos a concentracin 1.0 M, excepto el agua, presente a 55.6 M y H + a 10~7 M (pH 7.0).2 La diferencia de energa libre estndar (AG') describe la diferencia de energa libre cuando un mol de cada reactante se convierte en un mol de producto en esas condiciones. Recordemos que en una clula no prevalecen condiciones estndar, y por lo tanto hay que ser cauteloso al emplear valores para diferencias de energa libre estndar en clculos de energtica celular.
2 AG 0 ' indica condiciones estndar que incluyen pH 7, en tanto que AG indica condiciones estndar a 1 M H + (pH 0.0). La designacin K'eq tambin indica una mezcla de reaccin a pH 7.

La relacin entre constante de equilibrio y diferencia de energa libre estndar est dada por la ecuacin AG 0 ' = -RTlnK'eq Si el logaritmo natural (In) se convierte a logio, la ecuacin se convierte en AG 0 ' = -2.303 RTlogK'eq donde R es la constante de los gases (1.987 ca!/mol*K) y T es la temperatura absoluta (298K).3 Recordemos que el log de 1.0 es cero. Por consiguiente, de la ecuacin de arriba se deduce que las reacciones cuya constante de equilibrio es mayor que uno tendrn valores AG0' negativos, lo que indica que pueden ocurrir espontneamente en condiciones estndar. Las reacciones cuya constante de equilibrio es menor que uno tendrn valores AG 0 ' positivos y no pueden ocurrir espontneamente en condiciones estndar. En otras palabras, en una reaccin que se puede escribir: A + B==C + D, si AG0' es negativo, la reaccin ocurrir hacia la derecha cuando reactantes y productos estn presentes en concentracin 1.0 M a pH 7. Cuanto ms negativo sea el valor, la reaccin ocurrir en mayor extensin hacia la derecha antes de alcanzar el equilibrio. En las mismas condiciones, si AG 0 ' es positiva, la reaccin proceder a la izquierda; o sea, se favorece la reaccin inversa. La relacin entre AG or y K'eq se muestra en el cuadro 3-3.

3 El trmino a la derecha de esta ecuacin equivale a la cantidad de energa libre perdida conforme la reaccin procede desde condiciones estndar hasta el equilibrio.

CUADRO 3-.t. Relacin entre AG 0 ' y K'eq a 25C

K'eq
106 104
10=

DG' (kcd/mol) -8.2 -5.5 -2.7 -1.4 0.0 1.4 2.7 5.5 8.2

101
10

10-1
10-2

10-" 10~6

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CAPITULO 3 Energa, enzimas y metabolismo

Cambios de energa libre en las reacciones mctablicas Una de las reacciones qumicas ms importantes en la clula es la hidrlisis del ATP (fig. 3-5). En la reaccin

ATP + H2O -> ADP + P

la diferencia de energa libre estndar entre productos y reactantes es -7.3 kcai/mol. Con base en esta informacin, es evidente que en condiciones estndar la hidrlisis de ATP es una reaccin muy favorecida (exergnica), o sea, tiende a una proporcin [ADP]/[ATP] mayor en el equilibrio. Hay varias razones por las cuales esta reaccin es tan favorecida; una es evidente en la figura 3-5. La repulsin electrosttica creada por las cuatro cargas negativas muy prximas en el espacio situadas sobre ATP4" se liberan parcialmente por la formacin de ADP3~. Es importante tener muy clara la diferencia entre AG y AG0'. AG 0 ' es un valor fijo que describe la direccin en la cual procede una reaccin cuando la mezcla reaccionante se encuentra en condiciones estndar. Puesto que en la clula no prevalecen condiciones estndar, los valores AG0' no pueden emplearse para predecir la direccin de una reaccin particular en un momento dado dentro de un compartimiento celular particular. Para esto, es necesario conocer AG, determinada por la concentracin de reactantes y productos para la reaccin presente en ese momento. [AJ[B] AG = AG 0 ' + 2.303 (1.987 cal/mol- 0 K) (298K)
log

la reaccin dentro de la clula y qu tan cerca se encuentra del equilibrio la reaccin particular. Por ejemplo, la concentracin celular tpica de reactantes y productos en la hidrlisis de ATP puede ser [ATP] = 10 mM; [ADP] = 1 mM; [P] = 10 mM. Sustituyendo estos valores en la ecuacin, [ADP][Pi] [ATP] AG = -7.3 kcal/mol + (1.4 kcal/rnol) log AG = AG 0 ' + 2.303RTIog [10-2] AG = -7.3 kcal/mol + (1.4 kcal/mol} (-3) AG = -11.5 kcal/mol Por lo tanto, aunque AG 0 ' para la hidrlisis de ATP es -7.3 kcal/mol, en la clula la AG tpica para esta reaccin es de casi 12 kcal/mol debido a que la clula mantiene una elevada proporcin [ATP]/ [ADP]. Las clulas efectan muchas reacciones con valores AG0' positivos porque son capaces de mantener condiciones que favorecen el avance de las reacciones. Esto puede ocurrir de dos maneras. La primera ilustra la importante diferencia entre AG y AG0', y la segunda revela cmo pueden sustituirse reacciones con valor AG' positivo por diferentes reacciones con valor AG 0 ' negativo empleando la energa qumica almacenada en la clula. Consideremos la reaccin de la gluclisis (vase figura 3-23) en la cual el fosfato de dihidroxiacetona se convierte en gceraldehido 3-fosfato. AG 0 ' para esta reaccin es +1.8 kcal/mol, aunque la formacin del producto esta reaccin ocurre en la clula. La reaccin procede debido a que otras reacciones celulares mantienen la relacin entre reactante y producto por arriba de la relacin definida por la constante de equilibrio. En tanto esta condicin se mantiene, la AG 0 ' ser negativa y la reaccin continuar espontneamente en la direccin de formar gliceraidehido 3-fosfato. Esto revela

AG = AG 0 ' + 2.303RTlog

AG = AG 0 ' + (1.4 kcal/mol) log donde [A], [B], [C] y [D] son las verdaderas concentraciones en el momento dado. Los valores AG revelan la direccin de

H-C

Adenina
AG" = -7. 3 kcal/mol H,0 + 0-P-O-P-O-P-O CH Rlbosa " = +7.3 kcal/mol

0~ 0~ I I "0-P-O-P-O O O

CH

OH 0~

OH

HJV. OH

ty

Difosfato de adenosina [ADP] + T>-P-0~ I O Fosfato inorgnico (P,)

OH

Trifosfato de adenosma (ATP|

FIGURA 3-,. Hidrlisis del ATP. Como parte de muchos procesos Dirrurmeos se hidroliza el trifosfato de adenosina (ATP). En casi todas las reacciones, como la que se muestra aqu, el ATP se hidroliza para formar ADP y fosfato inorgnico (P), pero en algunos casos (no mostrados] se hidroliza para formar AMP, un compuesto con un solo grupo fosfato y pirofosfato (PPi). Ambas reacciones tienen prcticamente la misma AG0' de -7.3 kcal/mol.

CAPITULO 3

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una caracterstica importante del metabolismo celular; a saber, las reacciones especficas no pueden considerarse de manera independiente como si ocurrieran aisladas en un tubo de ensaye. Cientos de reacciones ocurren de manera simultnea dentro de una clula. Todas se relacionan entre s porque el producto de una reaccin es el sustrato para la siguiente reaccin de la secuencia, y as sucesivamente a lo largo de una va metablica y en las subsecuentes. Para mantener la produccin de gliceraldehido 3-fosfato a expensas del fosfato de dihidroxiacetona, la reaccin debe ocurrir de modo que la siguiente reaccin de la secuencia elimine el producto a una velocidad bastante rpida para conservar una relacin favorable entre las concentraciones de estas dos molculas.
Acoplamiento de reacciones endergnicas y exergnicas

de las clulas contienen concentraciones ms altas de ATP que de ADP. Este es un punto crucial; lo importante no es la cantidad de ATP que una clula contiene, sino lo que interesa es su concentracin relativa de ADP y de P. Si en el equlibrio una clula contiene una mezcla de ATP, ADP y P, no importara cunto ATP estuviera presente, sino la capacidad para ejecutar trabajo. La hidrlisis del ATP se emplea para impulsar la mayor parte de los procesos endergnicos dentro de la clula, incluyendo reacciones qumicas como la que acabamos de describir, separacin de cargas a travs de una membrana, concentracin de un soluto, movimiento de las fibrillas de una clula muscular y generacin de calor (fig. 3-6). En la

Las reacciones con valor positivo alto AG 0 ', en condiciones tpicas se "inician" por ingreso de energa. Consideremos a formacin del aminocido glutamina a partir de cido glutmico: Acido glutmico + NHs -> glutamina AG or = +3.4 kcal/mol

Esta reaccin aparentemente endergnica tiene lugar en la clula porque la formacin de glutamina a partir de cido glutmico ocurre en dos reacciones secuenciales, ambas favorecidas: la. reaccin: 2a. reaccin: Reaccin total: Acido glutmico + ATP > fosfato de glutamilo + ADP Fosfato de glutamilo + NHs -> glutamina + P Acido glutmico + ATP + NH3 > glutamina + ADP + P AG' = -3.9 kcal/mol

ib)

Acido glutmico + NHa Acido glutmico + ATP + NH3 (O

Glutamina Glutamina + ADP + P

Se dice que la formacin de glutamina est acoplada a la hidrlisis de ATP. Puesto que AG para la hidrlisis de ATP es ms negativa en comparacin con AG para la sntesis de glutamina a partir de cido glutmico, que es positiva, se puede emplear la reaccin de la hidrlisis de ATP "cuesta abajo" para iniciar la sntesis "cuesta arriba" de glutamina. Todo lo que se requiere para acoplar las dos reacciones qumicas es que el producto de la primera reaccin se utilice como sustrato para la segunda. E' puente entre las dos molculas, fosfato de glutamilo en este caso, se denomina intermediario comn. Lo que en realidad ocurre es que la hidrlisis exergnica del ATP se lleva a cabo en dos pasos. En el primero, la glutamina acta como aceptor del grupo fosfato, en tanto que en el segundo el agua se convierte en aceptor de fosfato y la hidrlisis se completa. La hidrlisis del ATP puede usarse en las clulas para iniciar reacciones que conducen a la formacin de molculas como la glutamina, debido a que la concentracin de ATP se mantiene en cifras 108 veces aproximadamente ms altas (en relacin con la concentracin de ADP) de las que se encontraran en el equilibrio. Podra esperarse que la concentracin de ADP en el equilibrio fuera mucho mayor que la concentracin de ATP, pero en realidad la mayor parte

(d)

FIGURA 3-6. Algunas funciones de la hidrlisis del ATP. En la clula, el ATP se puede usar para: a) separar cargas a travs de una membrana; b) concentrar un soluto particular dentro la clula; c) iniciar una reaccin qumica desfavorecida; d) deslizar filamentos uno sobre otro, como ocurre durante el acortamiento de una clula muscular; e) aumentar la temperatura de la clula como resultado de un incremento de la velocidad de los movimientos moleculares.

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CAPITULO 3 Energa, enzimas y metabolismo

mayor parte de las reacciones acopladas el grupo fosfato se transfiere del ATP a un aceptor (como el cido glutmico, un azcar, o a menudo una protena) y despus, en un segundo paso, se elimina (como ejemplo, vase la fig. 4-42).
Equilibrio comparado con el metabolismo en estado estacionario

Estado estacionario

En tanto las reacciones tiendan hacia el equilibrio, la energa libre disponible para hacer trabajo disminuye hasta un mnimo y la entropa aumenta hasta un mximo. Por lo tanto, cuanto ms alejada se mantenga una reaccin de su estado de equilibrio, menor ser la prdida de su capacidad para hacer trabajo causada por el incremento de entropa. El metabolismo celular es prcticamente un metabolismo en desequilibrio; o sea, se caracteriza por reacciones en desequilibrio de productos respecto de reactantes. Esto no significa ausencia de reacciones en equilibrio o cerca del mismo dentro de la clula. En realidad, muchas reacciones de una va metablica pueden estar prximas al equilibrio (fig. 3-24). Sin embargo, cuando menos una y con frecuencia varias reacciones de una va se colocan lejos del equilibrio y esto las hace prcticamente irreversibles. Son las reacciones que conservan la va al ir en una sola direccin. Los principios bsicos de la termodinmica se formularon utilizando sistemas cerrados, no vivos (sin intercambio de materia entre el sistema y su entorno), bajo condiciones de equilibrio reversible. Las caractersticas nicas del metabolismo celular requieren una perspectiva diferente. El metabolismo celular se puede mantener por s mismo en condiciones irreversibles de desequilibrio debido a que, a diferencia del medio en un tubo de ensaye, la clula es un sistema abierto. Los materiales fluyen continuamente al interior de la clula procedentes de la corriente sangunea o de un medio de cultivo. Lo extenso del ingreso de materia al interior de las clulas desde el exterior se manifiesta con slo contener la respiracin durante un minuto o dos. Minuto a minuto dependemos de la fuente externa del oxgeno porque ste es un reactante muy importante en el metabolismo celular. Como consecuencia del flujo continuo de oxgeno y de otros materiales hacia adentro y afuera de las clulas y las relaciones entre las reacciones bioqumicas, se dice que el metabolismo celular transcurre en estado estacionario (fig. 3-7). En estado estacionario la concentracin de reactantes y productos permanece prcticamente constante, aunque las reacciones individuales no necesariamente se encuentren en equilibrio. Puesto que los productos de una reaccin se emplean como sustratos de la siguiente reaccin, la concentracin de cada intermediario metablico puede permanecer prcticamente constante en tanto nuevos sustratos lleguen hacia adentro procedentes del exterior y se eliminen los productos terminales en el otro extremo.

ADP ATP

(a)

Estado estacionario

Equilibrio

AOP ATP

Equilibrio

FIGURA 3-7. Estado estacionario en comparacin con equilibrio. a) En tanto esta amiba pueda captar nutrientes procedentes del mundo exterior dispondr de la energa necesaria para mantener la concentracin de los compuestos en estado estacionario, que puede estar bastante lejos del equilibrio. Las concentraciones de ATP y ADP en el estado estacionario se indican por los puntos coloreados y el histograma. b) Cuando la amiba muere, las concentraciones de ATP y ADP (y tambin otras sustancias bioqumicas) tienden hacia sus proporciones de equilibrio.

-2 Enzimas
Justo antes de iniciarse el presente siglo, comenz un acalorado debate acerca de si el proceso de formacin de etanol requera o no la presencia de clulas intactas de levadura. Por un lado se encontraba el qumico orgnico Justus von

Liebig, quien argumentaba que las reacciones de fermentacin que producan alcohol no eran diferentes de las reacciones orgnicas estudiadas en un tubo de ensaye. Por otra parte, el bilogo Louis Pasteur opinaba que el proceso de fermentacin slo poda ocurrir en los confines de una clula viva intacta altamente organizada. En 1897, dos aos despus de la muerte de Pasteur, el bacterilogo Hans Bchner y su hermano, el qumico Eduard, prepararon un "jugo de levaduras", extracto elaborado machacando clulas de levadura con granos de arena y luego filtrando la mezcla a travs de papel filtro. Deseaban preservar el jugo de levaduras para uso posterior. Luego de fallar en sus intentos de preservar el extracto con antispticos, intentaron proteger de la putrefaccin la preparacin aadiendo azcar, el mismo procedimiento empleado para preservar jamones y compotas. En vez de preservar la solucin, el jugo de levadura produjo gas a partir del azcar y sigui burbujeando durante varios das. Luego de un nuevo anlisis, Eduard descubri que haba ocurrido

CAPITULO 3 Energa, enzimas y metabolismo

87

una fermentacin, produciendo etanol y burbujas de dixido de carbono. Bchner haba demostrado que la fermentacin no requiere la presencia de clulas intactas. Sin embargo, pronto se observ que ia fermentacin era muy diferente de los tipos de reaccin efectuados por los qumicos orgnicos. La fermentacin requiere la presencia de un conjunto nico de catalizadores sin equivalentes en el mundo no vivo. A estos catalizadores se les denomin enzimas (que significa en griego "en la levadura"). Las enzimas son mediadoras del metabolismo encargadas prcticamente de toda reaccin que ocurra en una clula. Sin enzimas, las reacciones metablicas procederan tan lentamente que seran imperceptibles; en ausencia de enzimas, la vida sera imposible. La primera demostracin de que las enzimas eran protenas fue lograda por James Sumner en 1926, cuando cristaliz la enzima ureasa de frijoles saltarines y determin su composicin. Aunque este dato no fue apreciado muy positivamente en aquella poca, pronto se demostr que varias enzimas eran protenas, y en los siguientes decenios se acept que todo catalizador biolgico era una protena. Sin embargo, recientemente se ha demostrado que ciertas reacciones biolgicas son catalizadas por molculas de RNA. En aras de ia claridad, todava se reserva el trmino "enzima" generalmente para protenas catalizadoras, en tanto que para los catalizadores de RNA se emplea el trmino "ribozima". Aunque las enzimas son protenas, muchas son protenas conjugadas; o sea, contienen elementos no protenicos denominados cofactores, que pueden ser inorgnicos (metales) u orgnicos (coenzimas). Los cofactores participan de manera importante en la funcin de la enzima, y casi siempre cumplen tareas para las cuales los aminocidos son inadecuados. Por ejemplo, como se analiz en el captulo precedente, en la mioglobina el tomo de hierro del grupo hem es e sitio donde se une y almacena el oxgeno hasta que el metabolismo celular lo requiera. Propiedades de las enzimas Como todo verdadero catalizador, las enzimas muestran las siguientes propiedades: 1) presentes en pequea cantidad; 2) no sufren alteraciones irreversibles en el curso de la reaccin, y por lo tanto cada molcula de enzima puede participar en muchas reacciones individuales, y 3) no tienen efecto sobre la termodinmica de la reaccin. Este ltimo punto tiene particular importancia. Las enzimas no determinan si una reaccin es termodinmicamente favorable (exergnica) o desfavorable (endergnica) y tampoco determinan cul es la relacin en el equilibrio entre productos y reactantes. Estas son propiedades inherentes de los reactantes qumicos. Como catalizadores, las enzimas slo pueden acelerar la velocidad de una reaccin qumica termodinmicamente favorecida. No hay una relacin necesaria entre la magnitud de AG para una reaccin particular y la velocidad de dicha reaccin, La magnitud de AG slo informa de la diferencia de energa libre entre el estado inicial y el equilibrio. Es totalmente independiente de la va o de! tiempo que toma la reaccin para alcanzar el equilibrio. Por ejemplo, considere-

mos la glucosa. La oxidacin de este carbohidrato es un proceso termodinmicamente muy favorecido, segn se puede determinar por la cantidad de energa liberada durante su combustin. Sin embargo, se pueden exponer al ambiente cristales de glucosa indefinidamente sin que ocurra una conversin notable en materiales menos energticos. En otras palabras, la glucosa es cinticamente estable, aunque sea inestable de manera termodinmica. Incluso si el azcar estuviera disuelta, en tanto la solucin se mantenga estril no se deteriora con rapidez. Sin embargo, si se aaden unas pocas bacterias, en poco tiempo el azcar sera captado por las clulas y sometido a degradacin enzimatica. Las enzimas son catalizadores notablemente eficaces. Los catalizadores empleados por los qumicos en el laboratorio, como calor, cido, platino y magnesio metlicos, por lo general aceleran la reaccin cien a mil veces en relacin con la velocidad no catalizada. Por lo contrario, las enzimas incrementan tpicamente la velocidad de una reaccin un milln a un trilln de veces (1012). Todava ms notable es que esto se logra a temperaturas y pH sumamente bajos presentes en la clula. Adems, a diferencia de los catalizadores inorgnicos empleados por los qumicos, la mayor parte de las enzimas son muy especficas en relacin con los reactantes a los que pueden unirse y la reaccin que catalizan. Los reactantes que se unen a una enzima se denominan sustratos. Por ejemplo, si la enzima hexocinasa est presente en una solucin junto con cientos de compuestos de bajo peso molecular adems del sustrato, la glucosa y slo molculas de glucosa se combinarn con la enzima y sufrirn la reaccin (vase fig. 3-14). Para todo propsito prctico, las otras sustancias bien podran estar ausentes. Este tipo de especificidad, sea entre enzima y sustrato o con otros tipos de protenas y sustancias a las cuales se unen, es crucia! para mantener el orden requerido para sustentar a vida. Adems de su elevado nivel de actividad y especificidad, las enzimas actan como "directores del trfico metablico" en el sentido de que las reacciones catalizadas por enzimas son rnuy ordenadas: los nicos productos formados son los apropiados. Esto es muy importante, ya que la produccin de compuestos no deseados rpidamente acabara con la vida de una frgil clula. Por ltimo, a diferencia de otros catalizadores, la actividad de las enzimas puede regularse para satisfacer necesidades particulares de la clula en un momento determinado. Venciendo la barrera de la energa de activacin Cmo pueden las enzimas efectuar una catlisis tan eficaz? La primera cuestin que debe considerarse es porqu las reacciones favorables en forma termodinmica no proceden por s mismas a velocidades relativamente rpidas en ausencia de enzimas. Incluso el ATP, cuya hidrlisis es tan favorecida, de hecho es estable dentro de la clula en tanto su descomposicin ocurra en una reaccin enzimtica controlada. Si ste no fuera el caso, el ATP sera de poca utilidad para la clula.

CAPITULO 3 * Energa, enzimas \j metabolismo

Las transformaciones qumicas requieren romper ciertos enlaces covalentes dentro de los reactantes. Para esto los reactantes deben contener suficiente energa cintica (energa de movimiento) que supere la barrera llamada energa de activacin. Esto se expresa en el diagrama de la figura 3-8, donde la energa de activacin est representada por la altura de la barrera. Con frecuencia la analoga es la de un objeto situado en lo alto de una roca listo para caer hacia abajo. S depende de sus propios medios, es muy probable que el objeto permanezca all de manera indefinida. Sin embargo, si ocurre algo que suministre al objeto energa suficiente para superar la friccin o cualquier otro pequeo obstculo en su camino y que le ayude a alcanzar el borde de la roca, espontneamente caer hacia abajo; una vez activado, el objeto tiene la posibilidad de caer hasta un estado de menor energa. En una solucin a temperatura ambiente las molculas existen en estado de movimiento al azar, y cada una posee cierta cantidad de energa en un instante dado. Entre la poblacin de molculas, su energa se distribuye siguiendo una curva en forma de campana (fig. 3-9), algunas poseen energa muy baja y otras muy alta. Las molculas de alta energa ("molculas activadas") permanecen como tales slo durante breves periodos y pierden su exceso de energa al chocar con otras molculas. Consideremos una reaccin en la cual una molcula reactante se desdobla en dos molculas de producto como en la figura 3-8. Si determinada molcula reactante adquiere suficiente energa para rebasar la barrera de activacin, entonces es posible que se desdoble en dos molculas de producto. La velocidad de reaccin depende del nmero de molculas reactantes con la energa cintica necesaria en cualquier momento dado. Una forma de incrementar la velocidad de reaccin es aumentar la energa de los reactantes. Esto se logra con mayor

rapidez en el laboratorio calentando la mezcla de reaccin. Por lo contrario, si se aplica calor a una reaccin mediada por enzimas rpidamente se inactiva la enzima debido a su desnaturalizacin. Cuando los reactantes se encuentran en la cresta de la onda de energa y listos para convertirse en productos, se dice que estn en estado de transicin. En este punto, los reactantes han formado un "complejo activado" transitorio en el cual se estn formando y rompiendo enlaces. A diferencia de la energa libre estndar para una reaccin, la energa de activacin no tiene valor fijo, sino ms bien vara con el mecanismo particular de reaccin utilizado para alcanzar el estado de transicin. Algunas vas requieren menos energa que otras; las enzimticas son las que menos la requieren. Por consiguiente, a diferencia de la catlisis por calor, las enzimas aumentan grandemente la reactividad del sustrato sin elevar demasidado los niveles de energa. En otras palabras, las enzimas catalizan reacciones disminuyendo la magnitud de la barrera de energa de activacin. En la figura 3-9 se compara el porcentaje de molculas capaces de reaccionar en una reaccin catalizada por enzimas y en una reaccin no catalizada. Sitio activo y especificidad molecular Como catalizadoras, las enzimas aceleran el proceso de formacin y rompimiento de enlaces. Para cumplir esta tarea las enzimas deben participar estrechamente en las actividades que tienen lugar entre los reactantes. Las enzimas forman un complejo con los reactantes, llamado complejo enzima-sustrato (ES) (fig. 3-10, a). En muchos casos, la asociacin entre enzima y sustrato es de naturaleza no covalente, aunque se conocen muchos ejemplos en los cuales se forma un enlace covalente transitorio.

La enzima baja la energa de activacin por esta cantidad

FK;l KA :{-. Energa de activacin y reacciones enzimticas. Aunque una reaccin puede ser termodinmica mente favorecida, los reactantes deben poseer suficiente energa para alcanzar un estado de activacin en el cual pueda ocurrir el reordenamiento atmico necesario para la reaccin. La cantidad de energa requerida se denomina energa de activacin (E/n) y est representada por la altura de la barrera. La energa de activacin se reduce mucho cuando los reactantes se combinan con una enzima catalizadora.

Reactante

Productos

CAPITULO 3 Energa, enzimas y metabolismo

Energa mnima en las molculas requerida para una reaccin cafa/izada Energa mnima en las molculas requerida para una reaccin no catalizada

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la enzima? En un sentido, la participacin de una macromolcula grande en las interacciones entre sustancias de bajo peso molecular desplaza a estas sustancias fuera de la solucin y las mantiene sobre la superficie de las grandes molculas catalizadoras. Una vez all, el sustrato puede ser afectado de varias maneras, como se describe a continuacon. Orientacin del sustrato Supongamos que se coloca cierta cantidad de tuercas y tornillos en una bolsa y sacudimos la bolsa durante 15 minutos. Es muy poco probable que alguna de las tuercas se enrosque firmemente en un tornillo al concluir el plazo. Por lo contrario, si se toma un tornillo con una mano y una tuerca con la otra rpidamente se puede guiar el tornillo dentro de la tuerca. Lo mismo es cierto para enzimas y sustratos. Una vez que la enzima forma un complejo con el sustrato, las molculas de sustrato pueden aproximarse mucho justo con la orientacin apropiada para facilitar la reaccin (fig. 3-12, a). A la inversa, lus reactantes en solucin son libres de sufrir movimientos de traslacin y rotacin e incluso molculas con suficiente energa no necesariamente sufren una colisin que d como resultado la formacin de complejos en estado de transicin.
Modificacin de la reactividad del sustrato

25'C

Molculas capaces de reaccionar en presencia de un catalizador Molculas capaces de reaccionar a temperatura elevada Molculas capaces de reaccionar a temperatura baja, sin catalizador

Energa -

FIGURA 3-9. Efecto del descenso de energa de activacin sobre la velocidad de una reaccin. Las curvas en forma de campana indican el contenido de energa de una poblacin de molculas presente en una mezcla de reaccin. El nmero de molculas reactantes que contienen energa suficiente para sufrir la reaccin aumenta calentando la mezcla o aadiendo una enzima catalizadora. El calor aumenta la velocidad de reaccin incrementando el contenido de energa de las molculas, en tanto que la enzima hace lo mismo descendiendo la energa de activacin requerida para que ocurra la reaccin.

La parte de la molcula de la enzima directamente implicada en el enlace al sustrato se denomina sitio activo. El sitio activo y el sustrato(s) tienen formas complementarias que les permiten unirse con alto grado de precisin, como las piezas de un rompecabezas. Adems de enlazarse al sustrato, el sitio activo contiene un arreglo particular de aminocidos cuya presencia desciende la energa de activacin requerida por el sustrato para sufrir la reaccin (fig. 310, b). Tpicamente, el sitio activo se localiza en una hendidura o grieta que va del entorno acuoso a la profundidad de la protena. Los aminocidos que constituyen el sitio activo de ordinario se ubican en sitios distantes a lo largo de la cadena del polipptido extendido, pero se renen en estrecha proximidad cuando el polipptido se pliega para adoptar su estructura terciaria final. La estructura del sitio activo no slo explica la actividad catalizadora de la enzima, sino tambin su especificidad (fig. 3-11). Como se hizo notar antes, la mayor parte de las enzimas tienen capacidad para unirse slo a uno o a un pequeo nmero de molculas estrechamente relacionadas desde el punto de vista biolgico. Mecanismos de catlisis enzimtica Cmo puede una enzima hacer que una reaccin ocurra miles de veces por segundo cuando esa misma reaccin slo puede ocurrir a velocidad indetectable en ausencia de

Las enzimas se componen de aminocidos provistos de una gran variedad de diferentes tipos de grupos R, desde aquellos con carga neta intensa hasta molculas totalmente no polares. Una molcula de sustrato enlazada a la superficie de una enzima, inevitablemente sufrir influencia de loa grupos R vecinos de la enzima (fig. 3-12, &). El efecto es activar al sustrato y estabilizar el complejo de transicin. La activacin del sustrato se logra sin ingreso de energa externa, por ejemplo calor. Varios mecanismos generales pueden incrementar la reactividad del sustrato luego que se asocia a una enzima. Estos mecanismos bsicamente son similares a los caracterizados por los qumicos cuando estudian el mecanismo de una reaccin orgnica en un tubo de ensaye. Por ejemplo, los cambios de pH pueden afectar intensamente la velocidad de reaccin. Las enzimas poseen numerosos aminocidos con cadenas laterales acidas o bsicas (grupos R) capaces de donar o aceptar protones del sustrato y por lo tanto de alterar la carga del sustrato, hacindolo ms reactivo. Puesto que el ncleo de las enzimas ms solubles (situadas fuera de la membrana) consta principalmente de residuos no polares (pg. 53), las cadenas laterales de aminocidos, acidas o bsicas, se proyectan dentro de regiones hidrofbicas y pueden efectuar interacciones inicas particularmente fuertes con los grupos polares del sustrato. Los sitios activos de muchas enzimas contienen grupos R con carga parcial positiva o negativa. Estos grupos tienen capacidad de atacar qumicamente a un sustrato y como resultado se puede formar un enlace covalente transitorio entre enzima y sustrato. La quimotripsina, una enzima que digiere las protenas de los alimentos dentro del intestino delgado, acta de esta manera. La serie de reacciones que ocurren conforme la quimotripsina hidroliza un enlace peptdico en una protena sustrato se muestran en la figura

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CAPITULO 3 Energa, enzimas y metabolismo

FIGURA 3-10. Sitio activo de una enzima, a) Modelo generado en una computadora de una molcula de RNA enlazada al sitio activo localizado en una grieta de la enzima ribonuclcasa. b) Representacin diagramtica del sitio activo de la enzima lcrate deshidrogenasa mostrando los diferentes sitios de interaccin entre el sustrato enlazado (mostrado en color marrn) y ciertas cadenas laterales de aminocidos de la enzima. Adems de definir las propiedades del enlace al sustrato sobre el sitio activo, estas interacciones no covalentes alteran las propiedades del sustrato para acelerar la conversin a productos. (El sustrato aqu mostrado es una molcula sinttica, llamada S-lac-NAD+, parecida al verdadero sustrato que es cido lctico y NAD + . El anlogo se emple en estudios de difraccin de rayos X de la enzima debido a que permanece enlazado a dicha enzima.) (a: Cortesa de S. Koszelek; b: segn J.J. Holbrook y cois., en P.D. Boyer, ed., The Enzymes, 3a. ed., Vol. 11, p. 240, Academic Press, 1975.)

Tyr85

Asp53

Lis 58 Piruvato H-N

His195

Lactato deshidrogenasa Arg171

(b)

CAPITULO 3 Energa, enzimas y metabolismo Sustratos Enzima

91

Complejo enzima-sustrato

FIGURA 3-11. Esquema de una reaccin catalizada por enzimas en la cual dos molculas diferentes del reactante se unen para formar una sola molcula de producto. El sitio activo muestra una forma complementaria con las dos molculas reactantes.

La enzima es reciclada

Sitio activo

Modificacin del sustrato Producto C

3-13. Los tres aminocidos dentro del sitio activo de la enzima: serina, histidina y cido asprtico, desempean un papel prominente. En la figura 3-13 se muestra la reaccin en dos pasos. En el primer paso, el tomo de oxgeno electronegativo de la cadena lateral de una serina de la enzima ataca al tomo de carbono del sustrato. En consecuencia, el enlace peptdico del sustrato se hidroliza y se forma una unin covalente entre la serina y el sustrato desplazando el resto del sustrato como uno de los productos. En el segundo paso, una molcula de agua rompe el enlace covalente entre enzima y sustrato, y la enzima retorna a su estado original no enlazada y libera el resto del sustrato como un segundo producto.
Induciendo tensin en el sustrato

Aunque el sitio activo de una enzima puede ser complementario con su sustrato(s), algunos estudios revelan un cambio en la posicin relativa de algunos de los tomos de la enzima luego de la unin. Presumiblemente, una vez que la enzima se une al sustrato apropiado ocurre un cambio de conformacin para mejorar la adaptacin complementaria entre enzima y sustrato (adaptacin inducida) y los grupos reactivos apropiados de la enzima se desplazan hacia el lugar donde puede ocurrir la reaccin. En la figura 3-14 se da un ejemplo de cambio de conformacin luego del enlace del sustrato. Una vez "agarrados" por la enzima, ciertos enlaces dentro de la molcula del sustrato sufren tensin fsica o electrnica, lo que debilita los enlaces y desciende la energa necesaria para romperlos (fig. 3-12, c). Un ejemplo de este mecanismo se analiza en detalle en La va experimental acerca de la enzima catalizadora lisozima, al final de este captulo. La capacidad de las enzimas para cambiar de forma y ejercer fuerzas sobre los sustratos ilustra una importante caracterstica de estas molculas: no son rgidas e inflexibles, ms bien muestran una capacidad considerable de movimiento interno. Durante aos se han descrito cambios de conformacin en las enzimas mediante tcnicas de di-

fraccin de rayos X en las cuales la estructura de la enzima en estado no enlazado se compara con la estructura de la enzima cuando se une al sustrato dentro del sitio activo. Estas tcnicas han producido ios modelos mostrados en la figura 3-14. En aos recientes se ha dispuesto de nuevas tcnicas que permiten a los investigadores seguir verdaderamente los movimientos de las molculas de una enzima conforme cataliza una reaccin. Con una de estas tcnicas se puede determinar el contorno de la superficie atmica de una sola molcula de enzima a medida que cataliza su reaccin tomando "instantneas" de la molcula cada 50 microsegundos mediante un microscopio de fuerza atmica (MFA). Con otra tcnica, los cristales de la enzima (que todava retiene actividad cataltica) se enfran a temperaturas prximas a 40 del cero absoluto y luego se bombardean con un haz sumamente intenso de rayos X. El enfriamiento de los cristales hasta esta temperatura hace ms lenta la reaccin por un factor mayor de 10 000 millones, lo que alarga el proceso de unin y liberacin del sustrato a segundos en vez de nanosegundos o microsegundos, como ocurre de ordinario. Empleando este nuevo tipo de cristalografa, los investigadores esperan obtener imgenes de la molcula de la enzima en diferentes etapas de la reaccin cataltica. Las primeras pelculas de rayos X producidas por esta tcnica revelaron los cambios que ocurren conforme la protena mioglobina que capta oxgeno se enlaza y libera una molcula de monxido de carbono (vase fig. 2-39, b). Cintica enzimtica Ya vimos que la velocidad de una reaccin qumica no es determinada por ia energa libre de reactantes y productos (la AG de la reaccin) sino por la capacidad de una enzima particular para descender la barrera de la energa de activacin. Diferentes tipos de reaccin suministran distintos tipos de barreras y como consecuencia las enzimas varan mucho en su capacidad para catalizar reacciones. La activi-

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CAPITULO 3 * Energa, enzimas y metabolismo

Sustrato alineado

(ni

FIGURA 3-12. Tres mecanismos enzimticos para acelerar reacciones: a) mantener al sustrato en una orientacin precisa; b) modificar la reactividad del sustrato alterando su estructura inica; c) someter a los enlaces del sustrato a tensin fsica para desdoblarlos.

dad cataltica de una enzima puede conocerse estudiando su cintica, o sea, la velocidad de reaccin en diferentes condiciones experimentales. En 1913, Leonor Michaelis y Maud Menten publicaron la relacin matemtica entre concentracin de sustrato y velocidad de reaccin enzimtica medida por la cantidad de producto formado (o de sustrato consumido) en determinado tiempo. Esta relacin se puede expresar mediante la ecuacin que genera una hiprbola, como se muestra en la figura 3-15. En vez de considerar aspectos tericos de la cintica enzimtica podemos obtener la misma curva de manera prctica, como se hace con cada enzima estudiada. Para determinar la velocidad de una reaccin se incuba a la temperatura deseada una mezcla que contenga todos los ingredientes requeridos, excepto uno, el cual inicie la reaccin cuando se aada. Si al inicio de la reaccin no se

encuentran productos en la mezcla, entonces la velocidad de aparicin del producto suministra una medida de la velocidad de reaccin. Hay factores que pueden complicar este procedimiento. Si el tiempo de incubacin es muy prolongado, la concentracin del sustrato se reduce en forma cuantitativa. Adems, conforme aparecen los productos pueden volver a convertirse en sustrato mediante la reaccin inversa, tambin catalizada por la enzima. En condiciones ideales, lo que se desea determinar es la velocidad inicial, o sea, la velocidad en el instante en que an no se forma producto. Para obtener valores precisos de la velocidad inicial de la reaccin se emplean periodos breves de incubacin y tcnicas sensibles de medicin. Para generar una curva como la que se muestra en la figura 3-15 se determina la velocidad inicial para una serie de mezclas incubadas que contienen la misma cantidad de enzima pero una concentracin creciente de sustrato. De esta curva se puede concluir que la velocidad inicial de reaccin vara notablemente con la concentracin de sustrato. La base de este efecto reside en la capacidad de cada molcula de la enzima. Cada reaccin catalizada requiere cierto tiempo que limita el nmero de reacciones que pueden catalizarse en determinado momento. Con concentraciones bajas de sustrato la enzima es capaz de trabajar a una velocidad ms rpida que el nmero de colisiones eficaces a las cuales est sujeta. En otras palabras, la enzima "dispone de tiempo"; las molculas del sustrato son as limitantes de la velocidad. Con concentraciones ms altas de sustrato la enzima trabaja a su mxima capacidad, y est sujeta a ms colisiones con molculas de sustrato que puede convertir a producto. En concentraciones elevadas de sustrato la enzima se convierte en limitante de la velocidad. Por lo tanto, conforme crece la concentracin de sustrato en la mezcla de reaccin, la enzima se aproxima a un estado de saturacin. En este punto terico de saturacin la velocidad se denomina velocidad mxima (Vmx)Si se conocen el peso molecular y la concentracin de la enzima en la mezcla de reaccin, entonces se puede calcular el nmero de recambios para la enzima a partir de VVnx- Este nmero de recambios es el nmero mximo de molculas de sustrato que una molcula de enzima puede convertir en producto cada minuto. El nmero de recambio tpico de las enzimas es 1 000, aunque se conocen valores tan grandes como 107 (para la anhidrasa carbnica). A partir de estos valores se nota que unas pocas molculas de enzima pueden convertir con suma rapidez una cantidad relativamente grande de molculas de sustrato en producto. El valor de Vm^x slo es un trmino til obtenido a partir de una grfica, como la mostrada en la figura 3-15; otro valor til es la constante de Michaelis (KM)/ que es igual a la concentracin de sustrato cuando la velocidad de reaccin corresponde a la mitad de Vmx ffig- 3-15). En ciertos casos, segn las velocidades relativas de formacin y desdoblamiento del complejo enzima-sustrato, el valor de KM proporciona una medida de la afinidad de la enzima por el sustratro. Cuanto mayor sea el valor, menor ser la afinidad; un valor tpico de KM es cercano a 10~4 M. En el cuadro 3-4 se consignan valores KM para varias enzimas. Otros factores que influyen fuertemente en la cintica enzimtica son pH y temperatura del medio de incubacin. Cada

CAPITULO 3 Energa, enzimas y metabolismo

93

R-CH *0>__ :t N') H H

HC-R' C=0 NH I R'-CH

H
PROTEINA

:-C:0-CA
Agua

Ser 195

PROTEINA Ser 195

0-H V

Acil-enzima intermedia

FIGURA 3-13. Mecanismo catalizador de la quimotripsina. La reaccin se divide en dos pasos, a) El tomo de oxgeno electronegativo de un residuo de serina (Ser 195) de la enzima, que posee carga parcial negativa, efecta un ataque (nucleoflico) sobre un tomo de carbono carbonilo provisto de carga parcial positiva, rompiendo la unin peptdica. La serina se vuelve ms reactiva gracias a un residuo de histidina en ntima aposicin que separa el protn de la serina y despus dona el protn al tomo de nitrgeno del enlace peptdico desdoblado. Parte del sustrato forma un enlace covalente transitorio con la enzima por medio de la cadena lateral de serina, en tanto que el resto del sustrato se libera. (Ntese que los residuos serina e histidina estn separados en la secuencia primaria por 138 aminocidos, pero se juntan dentro de la enzima gracias al plegamiento del polipptido. Un cido asprtico, el residuo 102, que no se muestra, tambin desempea un papel en la catlisis por influencia al estado inico de la histidina.) b) En el segundo paso, el tomo de oxgeno electronegativo de la molcula de agua desplaza el sustrato unido mediante enlace covalente a la enzima y regenera la molcula de enzima no enlazada. Igual que en el primer paso, la histidina participa para transferir el protn; en este caso, el protn se elimina del agua y se transfiere al residuo serina de la enzima.

HC:
PROTEINA His57

HC

-N-CH

**N-C

CH2 y

I
-C-C:0-C

r
PROTEINA Ser 195

PROTEINA

His57

Producto

O H a

/ H^

-C-C-OH I R + '

H
U ! ^ ^ M ^ M

Ser 195

Acil-enzima intermedia

HC

-N-CH
H.

His57

f^ I

PROTEINA His 57

(a)

(b)

FIGL'IA 3-14. Ejemplo de adaptacin inducida. El enlace de una molcula de glucosa a la enzima hexocinasa provoca un cambio de conformacin mediante el cual la enzima atrapa al sustrato con mayor firmeza; se asume que esto incrementa la reactividad del sustrato. (Cortesa de Thomas A. Steitz.)

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CAPITULO 3 Energa, enzimas y metabolismo

Reaccin catalizada por enzimas

Reaccin no catalizada por enzimas

Concentracin de sustrato [S] FIGURA S-15. Relacin entre la velocidad de una reaccin catalizada por enzimas y la concentracin del sustrato. Puesto que cada molcula de enzima slo tiene capacidad para catalizar cierto nmero de reacciones en un tiempo determinado, la velocidad de la reaccin se acerca a su velocidad mxima conforme la concentracin de sustrato aumenta. La concentracin de sustrato en que la velocidad de reaccin corresponde a la mitad de la velocidad mxima (Vmx/2) se denomina constante de Michaelis o KM-

enzima tiene un pH y temperatura ptimos en los cuales opera con mxima actividad (fig. 3-16). Para generar una hiprbola como en la figura 3-15 y hacer determinaciones precisas de los valores Vmx y KM se debe graficar un nmero considerable de puntos. Se puede lograr una descripcin ms fcil y ms precisa graneando los recprocos de la velocidad y la concentracin de sustrato entre s, segn lo formul Hans Lineweaver y Dean Burk. Cuando se traza esta grfica, la hiprbola se convierte en una lnea recta (fig. 3-17) cuya abscisa al origen x es igual a -I/KM, la ordenada al origen y es igual a I/V mx y la pendiente es igual a KM/ V7mx. Por lo tanto, los valores de KM y Vmx se pueden determinar con rapidez extrapolando la lnea recta a partir de unos pocos puntos.
Inhibidores enzimticos

Los inhibidores enzimticos son molculas con capacidad para enlazarse a una enzima y disminuir su actividad. La

clula depende de inhibidores para regular la actividad de gran parte de sus enzimas; los bioqumicos emplean inhibidores para estudiar las propiedades de las enzimas y muchas compaas bioqumicas producen inhibidores enzimticos que actan corno frmacos, antibiticos o plaguicidas. Los inhibidores enzimticos se pueden dividir en dos tipos: reversibles o irreversibles. A su vez, los inhibidores reversibles se pueden considerar competitivos o no competitivos. Los inhibidores irreversibles son aquellos que se enlazan fuertemente a una enzima, a menudo formando un enlace covalente con alguno de sus residuos aminocidos. Algunos gases nerviosos, como el diisopropilfosfofluoridato y los plaguicidas organofosforados actan como inhibidores reversibles de acetilcolinesterasa, una enzima que desempea un papel crucial para destruir acetilcolina, el neurotransmisor encargado de provocar la contraccin muscular. Con la enzima inhibida, el msculo sufre estimulacin continua y permanece en estado de contraccin prolongada. Segn se analiza en el ensayo La perspectiva humana, la penicilina debe su actividad antibitica a su accin como inhibidor irreversible de una enzima clave para sintetizar la pared celular bacteriana. Los inhibidores reversibles slo se unen laxamente a la enzima, lo que permite desplazarlos con facilidad. Los inhibidores competitivos compiten con el sustrato por el acceso al sitio activo de una enzima. Puesto que los sustratos tienen estructuras complementarias para el sitio activo a! cual deben enlazarse, los inhibidores competitivos deben parecerse al sustrato para competir por el mismo sitio de enlace, pero diferir de alguna manera para impedir que se transforme en producto (fig. 3-18). El anlisis de los tipos de molcula que pueden competir con el sustrato por el sitio de enlace sobre una enzima suministra una idea de la estructura interior del sitio activo y la naturaleza misma de la interaccin entre el sustrato natural y su enzima. La eficacia de un inhibidor competitivo depende de su afinidad relativa por la enzima. No obstante, la inhibicin competitiva se puede superar si la proporcin sustrato/ inhibidor es bastante grande. En otras palabras, si el nmero de colisiones entre la enzima y el inhibidor es insignificante en comparacin con las colisiones entre la enzima y su sustrato, entonces el efecto inhibidor ser mnimo. Con una concentracin de sustrato lo bastante grande todava es

CUADRO 3-4. Valores de KM de varias enzimas Enzima Acetilcolinesterasa Anhidrasa carbnica Catalasa Quimotripsina
.

Sustrato Acetilcolina CO2 HCO3H2O2 N-Acetilgcina etilster N-Acetilvalina etilster N-Acetiltirosina etilster Fumarato Malato Urea

KM(M) 9.5 1.2 2.6 2.5 4.4 8.8 6.6 5.0 2.5 2.5 x 10-5 x 10-2 x 10-2 X 10-2 x 10-1 x 10-2 x 10-* x 10-6 x 10-5 x 10-2

Fumarasa Ureasa

CAPITULO 3 Energa, enzimas y metabolismo

95

100

80

60 -

60

.>

40 -

>

40

20

20

10

20

40

60

80

100

Temperatura de reaccin, C

(a)

(b)

FIGURA 3-16. Dependencia de la velocidad de una reaccin catalizada por enzimas sobre: a) pH y b) temperatura. La forma de las curvas, y el pH y la temperatura ptimos varan con la reaccin particular. Los cambios del pH afectan las propiedades inicas del sustrato y de la enzima, y tambin la conformacin de sta. A temperaturas ms bajas la velocidad de reaccin se eleva con los incrementos de temperatura debido al aumento de energa de los reactantes. A temperaturas ms altas este aspecto positivo se contrarresta por la desnaturalizacin de la enzima, (a: Tomado de E.A. Moelwyn-Hughes, en The enzymes, ].B. Sumner y K. Myrback, eds., vol. 1, Academic press, 1950; b: de K. Hayashi y cois. }. Biochern. 64:93, 1968.)

tericamente posible lograr la velocidad mxima de la enzima aun en presencia de un inhibidor competitivo. En la inhibicin no competitiva, sustrato e inhibidor no compiten por un sitio de enlace disponible; por lo general e! inhibidor acta en un sitio diferente del sitio activo de la enzima. El nivel de inhibicin slo depende de la concentracin del inhibidor y no puede superarse incrementando la concentracin del sustrato. Por lo tanto, en presencia de un inhibidor no competitivo, cierta fraccin de las molculas de la enzima estn necesariamente inactivas en cualquier instante dado y no es posible alcanzar mxima velocidad en la poblacin de molculas de la enzima. Los efectos de la presencia de inhibidores no competitivos y

Sustratos (S) Inhibidor (I)

Complejo enzima-inhibidor (bloqueo del sitio activo) FIGURA 3-18, Inhibicin competitiva. Debido a su simlaridad molecular, los inhibidores competitivos pueden competir con el sustrato por el sitio de enlace sobre la enzima. El efecto de un inhibidor competitivo depende de las concentraciones relativas del inhibidor y del sustrato.

FIGURA 3-17. Grfica de Burk-Lineweaver de los recprocos dla velocidad y concentracin del sustrato a partir de la cual se calculan con facilidad los valores Vm^ y KM.

96

CAPITULO 3 Energa, enzimas y metabolismo Enzima no inhibida \

.'
X

' ^Inhibicin competitiva

Inhibicin .-' x x no competitiva etitiva , - ' " ,x Inhibicin _.-' x competitiva .-' x
.
' -' X

Inhibicin no competitiva

,-'

x ^^"^

Enzima no inhibida

[S]

FIGURA 3-19. Efecto de los inhibidores sobre la cintica enzimtica. El efecto de los inhibidores competitivos y los no competitivos se muestra al hacer una grfica de la cintica de la reaccin como velocidad de reaccin contra concentracin del sustrato (a) o como la recproca; grfica de Burk-Lineweaver (b). El inhibidor no competitivo reduce la Vm)t sin afectar la KM, en tanto que el inhibidor competitivo asumenta la KM sin afectar la Vm&x.

competitivos sobre la cintica de las enzimas se muestran en la figura 3-19. En un caso, la Vmx desciende y en el otro la KM aumenta. En ambos tipos, la pendiente (KM/Vm&c) aumenta.

3-3 Metabolismo
Metabolismo es el conjunto de reacciones bioqumicas que ocurren dentro de una clula, el cual incluye gran diversidad de conversiones moleculares. Estas reacciones se pueden agrupar en vas metablicas que contienen una secuencia de reacciones qumicas, en las cuales cada reaccin es catalizada por una enzima especfica.

Los compuestos formados en cada paso a lo largo de la va son intermediarios metablicos (o metabolitos) que en ltimo trmino conducen a la formacin de un producto final. Los productos finales son molculas con un papel particular en la clula, como un aminocido que puede incorporarse a un polipptido, o un azcar que se puede consumir por su contenido energtico. Las vas metablicas de una clula estn interconectadas en diferentes puntos, de modo que un compuesto generado en una va se puede repartir en varias direcciones segn las necesidades de la clula en ese momento. En esta seccin nos centraremos en aspectos del metabolismo que conducen a la transferencia y empleo de la energa qumica dentro de la clula, porque insistiremos en este tema a lo largo de todo el libro. Perspectiva general del metabolismo Las vas metablicas se pueden dividir en dos tipos muy amplios. Vas catablicas, que conducen a la descomposicin de molculas complejas para formar productos ms simples. Las vas catablicas tienen dos funciones: poner a disponibilidad la materia prima a partir de la cual se pueden sintetizar otras molculas y suministrar la energa qumica requerida para muchas actividades de la clula. Como estudiaremos en mayor extensin, la energa liberada por las vas catablicas se almacena transitoriamente en dos formas: como fosfatos de alta energa (sobre todo ATP) y como electrones de alta energa (en particular en el NADPH). Vas anablicas, que conducen a la sntesis de compuestos ms complejos. Las vas anablicas requieren energa y utilizan a energa qumica almacenada que se libera en vas catablicas exergnicas. La figura 3-20 muestra un perfil muy simplificado de la interconexin entre las principales vas anablicas y las catablicas. La descomposicin de los materiales biolgicos ocurre por pasos. Las macromolculas primero se descom-

Las enzimas que constituyen una va metablica de ordinario se confinan a una porcin especfica de la clula, como las mitocondrias y el citoplasma. Cada vez hay ms pruebas que sugieren que las enzimas de una va metablica estn fsicamente unidas entre s, caracterstica que permite entregar el producto de una enzima directamente como sustrato al sitio activo de la siguiente enzima en la secuencia de reacciones.

CAPITULO 3 Energa, enzimas y metabolismo

97

Aminocidos

Hexosas-pentosas

cidos grasos, glicerof

todas estas molculas se convierten en una variedad de pequeos compuestos (etapa II, figura 3-20) que se metabolizan de manera similar. As, aunque las sustancias empiezan como macromolculas con estructuras muy diferentes a travs de las vas catablicas, se convierten en los mismos metabolitos de bajo peso molecular. Por esta razn, se dice que las vas catablicas son convergentes. Notablemente, las reacciones qumicas y las vas metablicas descritas en este captulo se observan casi en toda clula viva, desde la bacteria ms simple hasta el animal o vegetal ms complejo. Es evidente que estas vas aparecieron muy pronto en la evolucin de las clulas procariotas y se han retenido durante todo el curso de la evolucin biolgica. Oxidacin y reduccin: cuestin de electrones Ambas vas, catablica y anablica, incluyen reacciones clave en las cuales se transfieren electrones de un reactante al otro. Las reacciones que implican cambios en el estado electrnico de los reactantes se denominan reacciones de oxidorreduccin (o redox). Los cambios de este tipo se acompaan de ganancia o prdida de electrones. Consideremos la conversin del hierro metlico (Fe) al estado ferroso (Fe2+). Esta conversin significa que el tomo de hierro pierde un par de electrones y por lo tanto alcanza un estado ms positivo; cuando un tomo pierde uno o ms electrones se dice que se oxida. La reaccin es reversible. Los iones ferrosos se pueden convertir a hierro metlico, un estado ms negativo, adquiriendo un par de electrones; cuando un tomo gana uno o ms electrones se dice que se reduce. Para que el hierro metlico se oxide debe haber alguna sustancia que acepte los electrones liberados. Por lo contrario, para que los iones ferrosos se reduzcan debe haber alguna sustancia que done los electrones necesarios. En otras palabaras, la oxidacin de un reactante debe acompaarse de la reduccin simultnea de algn otro reactante, y viceversa. Una posible reaccin en la cual participe el hierro poda ser
Fe Cu

\o ile! cido
tricarboxlico j

FIGURA 3-20. Las tres etapas del metabolismo. Las vas catablicas (flechas verdes hacia abajo) convergen para formar metabolitos comunes y conducen a la sntesis de ATP en la etapa III. Las vas anablicas (flechas azules hacia arriba) parten de unos cuantos precursores en la etapa III y utilizan ATP para sintetizar una gran variedad de materiales celulares. (Tomado de A.L. Lehninger, Biochemistry, 2a. ed., 1975 Worth Publishers, Nueva York.)

ponen (hidrlisis) en los bloques unitarios que las forman (etapa I, figura 3-20). Una vez hidrolzadas las macromolculas en sus componentes (aminocidos, nucletidos, azcares y cidos grasos), la clula puede reutilizar los componentes directamente para formar otras macromolculas de la misma clase, convertirlas en compuestos diferentes para elaborar otros productos o descomponerlos an ms (etapas II y III, figura 3-20) y extraer una parte de su contenido de energa libre. El curso que sigue depende de varios mecanismos reguladores sensibles a las necesidades de la clula en ese momento. Las vas para la degradacin de los diversos componentes de las macromolculas varan segn el compuesto particular que debe catabolizarse. Sin embargo, finalmente

La sustancia que pierde electrones durante una reaccin de oxidorreduccin, o sea, la que se oxida, se denomina agente reductor, y la sustancia que gana electrones, o sea, la que se reduce, se denomina agente oxidante. La oxidacin o reduccin de metales, como el hierro o el cobre, implica prdida o ganancia de electrones ntegros. La oxidacin y la reduccin de sustratos orgnicos durante el metabolismo celular implica tomos de carbono enlazados en forma covalente a otros tomos. Segn se analiza en el captulo 2, cuando dos tomos diferentes comparten un par de electrones, los electrones por lo general son atrados con mayor fuerza hacia uno de los dos tomos del enlace polarizado. En un enlace C H, el tomo de carbono tira con mayor fuerza de los electrones, por lo que se puede decir que el tomo de carbono se encuentra en estado reducido. Por lo contrario, si un tomo de carbono est enlazado a un tomo ms electronegativo como en los enlaces C O

98

CAPITULO 3 Energa, enzimas y metabolismo

LA PERSPECTIVA HUMANA
El creciente problema de la resistencia a los antibiticos
No hace mucho tiempo era una idea bastante extendida que la salud del ser humano ya nunca ms sera amenazada por infecciones bacterianas graves. Las enfermedades bacterianas, como tuberculosis, neumona, gonorrea y docenas de otras ms, ya no causaran ms muertes gracias a la administracin de cualquiera de numerosos antibiticos, compuestos que destruyen selectivamente a las bacterias sin provocar dao al husped humano en el que se desarrollan dichas bacterias. En el decenio pasado fue muy doloroso reconocer que el anuncio del exterminio de las bacterias infecciosas fue prematuro. Bacterias alguna vez susceptibles a varios antibiticos presentan resistencia cada vez mayor a esos frmacos. El desarrollo de la resistencia bacteriana suministra un excelente ejemplo de seleccin natural; el uso ampliamente extendido de estos frmacos destruy a las clulas susceptibles y dej sobrevivir a los raros individuos capaces de resistirlos para repoblar las colonias. El resultado fue un notable cambio en la ocurrencia y virulencia de muchas enfermedades, incluyendo neumona, tuberculosis y nuevas enfermedades causadas por bacterias, estafilococos y estreptococos. Los especialistas predicen que e problema de las enfermedades infecciosas se agudizar en los prximos aos y las muertes por enfermedades alguna vez curables aumentarn notablemente. Aqu consideraremos brevemente el mecanismo de accin de los antibiticos, en particular los orientados a enzimas, tema de este captulo, y al desarrollo de resistencia bacteriana. Los antibiticos trabajan debido a su capacidad para atacar actividades bacterianas sin afectar a las de las clulas eucariotas. En las clulas bacterianas son vulnerables varias actividades especificas. Entre stas se incluyen: 1. Enzimas que participan en la formacin de la pared celular bacteriana. La penicilina y sus derivados son anlogos estructurales de los sustratos de una familia de transpeptidasas que catalizan la reaccin final para formar enlaces cruzados que confieren a la pared celular sus propiedades protectoras. S estas reacciones no ocurren, la pared celular se destruye. La penicilina es un inhibidor irreversible de las transpeptidasas; el antibitico ocupa el sitio activo de la enzima y forma un complejo irreversible que no puede desplazarse. La vancomicina, que induce poca resistencia en la mayor parte de las bacterias, inhibe a una enzima que acta en las primeras etapas de formacin de la pared celular. 2. Elementos del sistema mediante los cuales la bacteria duplica, transcribe y traduce su informacin gentica. Aunque las clulas procariotas y las eucariotas presentan un sistema similar de almacenamiento y empleo de la informacin gentica, hay muchas diferencias bsicas entre los dos tipos de clulas, de las cuales se aprovechan los farmaclogos. Por ejemplo, la rifamicina es un antibitico que inhibe selectivamente la RNA polimerasa, la enzima que transcribe el DNA en RNA. De manera similar, la estreptomicina y las tetraciclinas se enlazan a los ribosomas procariotas, pero no a los ribosomas eucariotas. 3. Enzimas que catalizan reacciones metablicas que ocurren especficamente en la bacteria. Por ejemplo, las sulfas son antibiticos eficaces por su gran parecido con el compuesto cido p-aminobenzoco (PABA),

COOH
PABA

S02-NH-R Sulfas

que la bacteria convierte enzimticamente en cido flico, una coenzima esencial. Puesto que el hombre carece de una enzima sintetizadora de cido flico, deben obtener esta coenzima

o CN, los electrones son empujados con mayor fuerza para separarse del tomo de carbono, que por lo tanto se encuentra en estado oxidado. Puesto que el carbono tiene cuatro electrones en su capa ms externa que puede compartir con otros tomos, puede existir en varios estados de oxidacin. Esto se ilustra por el tomo de carbono en una serie de molculas con un solo carbono (fig. 3-21) que van desde el estado completamente reducido en un metano (CH4) hasta un estado completamente oxidado en el dixido de carbono (CC>2). El estado de oxidacin relativo de una molcula orgnica por lo general se puede determinar contando el n-

mero de tomos de hidrgeno en comparacin con los tomos de oxgeno y de nitrgeno por cada tomo de carbono. Como pronto veremos, el estado de oxidacin de los tomos de carbono en una molcula orgnica constituye una medida del contenido de energa libre de la molcula.

Captacin y consumo de energa

Los compuestos que utilizamos como combustibles qumicos para poner en marcha nuestros hornos y automviles

CAPITULO 3 Energa, enzimas y metabolismo

99

indispensable en la dieta y por consiguiente las sulfas no tienen efecto en el metabolismo humano. Las bacterias adquieren resistencia a los antibiticos mediante algunos mecanismos diferentes, muchos de los cuales se pueden ilustrar empleando como ejemplo la penicilina. Igual que la mayor parte de los antibiticos, la penicilina es un compuesto natural, o sea, producido normalmente por un organismo vivo, en este caso un hongo. La penicilina protege al hongo de bacterias patgenas de igual manera que protege {o alguna vez protegi) al ser humano. Las clulas bacterianas tal vez se han expuesto a compuestos similares a la penicilina durante cientos de millones de aos, por lo que no es sorprendente que hayan desarrollado armas para defenderse contra esos compuestos. La penicilina es un/?-Iactam, o sea, contiene un anillo /-lactam caracterstico de cuatro miembros (mostrado por la flecha).

c =o
HX CH

'

CH

coc

Desde 1940, los investigadores descubrieron que ciertas bacterias poseen una enzima llamada /-lactamasa (o penicilinasa) capaz de romper al

anillo lactam e inactivar al compuesto en relacin con su actividad contra la bacteria. Durante la Segunda Guerra Mundial, poca en que se introdujo la penicilina como antibitico, ninguna de las principales bacterias patgenas posea genes para sintetizar /-lactamasa. Esto se verific examinando material gentico de bacterias descendientes de cultivos de laboratorio iniciados en la era preantibitica. En la actualidad, el gen /-lactamasa se encuentra en una gran variedad de bacterias infecciosas y la produccin de /3-1 acta masa por estas clulas es la principal causa de su resistencia a penicilina. La ocurrencia tan extendida de genes /-lactamasa ilustra con cunta rapidez se pueden propagar los genes de una bacteria a otra, no slo entre clulas de una especie determinada, sino entre diferentes especies. Hay varias formas en que esto puede ocurrir, incluyendo conjugacin (mostrada en la figura 1-13), en la cual el DNA pasa de una clula bacteriana a otra; transduccin, en la cual un virus transporta un gen bacteriano de una clula a otra; y transformacin, en la cual una clula bacteriana es capaz de recoger del medio que la rodea un DNA desnudo. Los farmaclogos intentan contrarrestar la propagacin de/3-lactamasa sintetizando derivados de penicilina ms resistentes a la enzima hidroltca. Como es de esperarse, la seleccin natural rpidamente produce bacterias cuya /-lactamasa pueda inactivar las nuevas formas del antibitico. Como hizo notar Julin Davies: "el cambio de una sola base en un gen que codifica una /-lactamasa bacteriana puede

causar prdidas por 100 millones de dlares de esfuerzos en investigacin farmacolgica." Un mtodo que alcanz xito limitado fue tratar pacientes con dos frmacos separados: un antibitico parecido a la penicilina para inhibir la transpeptidasa y un inhibidor enzimatico separado (p. ej., cido clavulnico) para inhibir la /Mactamasa. No todas las bacterias resistentes a penicilina poseen un gen/Mactamasa. Algunas son resistentes porque desarrollan modificaciones en su pared celular para bloquear la entrada del antibitico; otras son resistentes porque tienen capacidad para expulsar selectivamente al antibitico una vez que ha penetrado a la clula; incluso otras son resistentes debido a que poseen transpeptidasas modificadas que no se enlazan al antibitico. Por ejemplo, la meningitis bacteriana causada por la bacteria Nesseria meningitidis todava no ha demostrado que contiene /3lactamasa. Aun as, estas bacterias cada vez son ms resistentes a la penicilina porque sus transpeptidasas van perdiendo su afinidad por los antibiticos. Comparando los genes que codifican transpeptidasas resistentes con genes que codifican a las correspondientes enzimas en cepas susceptibles (aisladas de cultivos iniciados en la era preantibitica), se encuentran diferencias mayores en las secuencias de nucletdos. Los datos anteriores indican que las clulas bacterianas se vuelven resistentes a los frmacos, no como resultado de mutacin gentica, que producira cambios genticos mnimos, sino ms bien al adquirir nuevos genes de otras especies.

son compuestos orgnicos altamente reducidos, como el gas natural (CH^ y los derivados del petrleo. Cuando estos compuestos se queman en presencia de oxgeno se libera energa y los tomos se convierten a estados de mayor oxidacin, como los gases dixido y monxido de carbono. El grado de reduccin de un compuesto tambin se mide a partir de su capacidad para efectuar trabajo qumico dentro de la clula. Cuanto mayor sea el nmero de tomos de hidrgeno que se puedan separar de una molcula "combustible", mayor ser la cantidad de ATP que finalmente se forma. Los carbohidratos son ricos en energa qumica debi-

do a que contienen hileras de unidades (HCOH). Las grasas tienen mayor cantidad de energa por unidad de peso debido a sus hileras de unidades (HCH) ms reducidas. En el siguiente anlisis nos centraremos en los carbohidratos. Como nico componente, tanto del almidn como del glucgeno, la glucosa es una molcula clave en el metabo-

100

CAPITULO 3 Energa, enzimas y metabolismo

HO H C OH H Metano H Metanol <CH3OH)

H C ^^ O

c=o
Dixido de carbono (CO2) Estado ms oxidado

II

Formaldehido (CH20)

Acido frmico (HCOOH)

Estado

ms
reducido

Unin envalente en la cual el tomo de carbono comparte ms el par de electrones Unin covalente en la cual el tomo de oxgeno comparte ms el par de electrones FIGURA 3-21. Estado de oxidacin del tomo de carbono. El estado de oxidacin de un tomo de carbono depende de los otros tomos a los cuales est enlazado. Cada tomo de carbono puede formar un mximo de cuatro enlaces con otros tomos. Esta serie de molculas simples de un carbono ilustra los diferentes estados de oxidacin en los cuales puede existir el tomo de carbono. En su estado ms reducido, el carbono se enlaza a cuatro hidrgenos (formando metano); en su estado ms oxidado se enlaza a dos oxgenos (para formar dixido de carbono).

lsmo energtico tanto de plantas como de animales. La energa libre que se libera por oxidacin completa de la glucosa es muy grande:
C6Hi2O6 + 6 O2 -> 6 CO2 + 6 H2O
AG' - -686 kcal/mol

En comparacin, la energa libre requerida para formar ATP a partir de ADP es relativamente pequea: ADP + P -> ATP + H2O AG' = +7.3 kcal/mol De estas cifras es evidente que la oxidacin completa de una molcula de glucosa para formar CC>2 y H2 puede liberar bastante energa para formar ATP en gran cantidad. Como se ver en el captulo 5, en las condiciones presentes

en la mayor parte de las clulas se pueden formar hasta ms de 35 molculas de ATP por molcula de glucosa oxidada. Para que esto ocurra, la descomposicin de las molculas de azcar debe ocurrir en muchos pasos pequeos (f ig. 3-22). Los pasos en los cuales la diferencia de energa libre entre reactantes y productos es relativamente grande se pueden acoplar a reacciones que conducen a la formacin de ATP. Bsicamente hay dos etapas en el catabolismo de la glucosa que son casi idnticas en todos los organismos aerobios. La primera etapa, gluclisis, ocurre en la fase soluble del citoplasma (el citosol) y conduce a la formacin de piruvato. La segunda etapa es el ciclo del cido tricarboxlico (o ATC), que ocurre dentro de la mitocondria de las clulas eucariotas y el citoplasma soluble de los procariotes y que conduce a la oxidacin final de tomos de carbono para producir dixido de carbono. La mayor parte de la energa qumica de la glucosa se almacena en forma de electrones de alta energa eliminados de las molculas del sustrato conforme se oxidan durante la gluclisis y el ciclo del cido tricarboxlico. La energa de estos electrones es la que finalmente se conserva durante la formacin de ATP. En las siguientes pginas nos centraremos en los pasos de la gluclisis, la primera etapa en la oxidacin de la glucosa que ocurre sin participacin de oxgeno. Concluiremos la historia de la oxidacin de la glucosa en el captulo 5, cuando estudiemos la estructura de las mitocondrias y su papel en la respiracin aerobia.
Gluclisis y formacin de ATP

FIGURA 3-22. Formacin de ATP durante el desdoblamiento oxidativo de la glucosa para formar COj y H2O. Esta figura ilustra la naturaleza gradual de la liberacin de energa libre conforme los tomos de carbono de la molcula original de glucosa se oxidan paso a paso y por ltimo se liberan como CO2- Una porcin mayor de la energa libre liberada por oxidacin se conserva en el ATP.

Las reacciones de gluclisis y las enzimas que las catalizan se muestran en la figura 3-23. Antes de analizar las reacciones especficas se debe puntualizar lo relativo a la termodinmica del metabolismo. En un anlisis previo se subray la diferencia entre AG y AG'; la AG de una reaccin particular determina su direccin en la clula. Mediciones reales de la concentracin de metabolitos en la clula pueden revelar el valor de AG para una reaccin en cualquier momento dado. La figura 3-24 muestra valores tpicos de AG

CAPITULO 3 Energa, enzimas y metabolismo

101

H OH Glucosa

OH

OH

OH

Glucosa 6-fosfato

Fructosa 6-fosfato

Fructosa 1,6-d fosfato

O
Aldolasa O U

c-oHCOPOf

o
Fosfogliceromutasa <

O II

c-oCH2OPOf

O
Fosfqglicerato

CH2OH 2-Fosfoglicerato

G--+1.1

HCOH ATP ADP

COPOf | HCOH

Gliceraldehido fosfato deshidrogenasa

1CH2OPOf

y c=o '

NAD<

3! CH2OH
Fosfato de dihidroxiacetona

3-Fosfoglicerato

G" = -4.5

Gliceraldehido 3-fosfato

0
II
C-0i

Piruvatocinasa
/fi"--7li Ll /.J

0 II

c-o1
c=o 1
CH,

C-0II
CH,

PC^"

' x^v.> ' ^l

ADP ATP

Fosfoenolpiruvato

Piruvato FIGURA 3-23. Pasos de la gluclisis.

medidos para reacciones de gluclisis. En contraste con los valores AG' de la figura 3-23, todas, menos tres reacciones, tienen valores AG cercanos a cero; o sea, estn casi en equilibrio. Las tres reacciones separadas del equilibrio, que las hace prcticamente irreversibles en la clula, suministran la "fuerza impulsora" que conduce a los metabolitos a travs de la va glucoltica de manera determinada. En 1905, dos qumicos ingleses, Arthur Harden y William Young, estudiaron la descomposicin de la glucosa por clulas de levadura, proceso que genera las burbujas del gas CO2- Harden y Young notaron que el burbujeo al final se haca ms lento y se detena, aun cuando hubiera abundante glucosa para metabolzar. Aparentemente, algn otro componente esencial del caldo de cultivo se estaba agotando. Luego de experimentar con algunas sustancias, los qumicos observaron que aadiendo fosfato inorgnico la reaccin se iniciaba otra vez. Concluyeron que la reaccin agotaba el fosfato, primer indicio de que los grupos fosfato participaban en las vas metablicas. La importancia del grupo fosfato se ilustra en la primera reaccin de gluclisis. La gluclisis se inicia con la unin del azcar a grupos fosfato (paso 1, figura 3-23) a expensas de una molcula de ATP. El empleo de ATP en esta etapa se puede considerar una inversin de energa, el costo de meterse al negocio de la oxidacin de la glucosa. La fosforilacin activa el azcar

y le confiere capacidad para participar en reacciones subsecuentes donde grupos fosfato lo rodean y lo transfieren a otros aceptores. La glucosa 6-fosfato se convierte en fructosa 6-fosfato y en seguida a fructosa 1,6-bisfosfato a expensas de una segunda molcula de ATP (pasos 2, 3). El difosfato de seis carbonos se separa en dos rnonofosfatos de tres carbonos (paso 4), que constituye la primera etapa de las reacciones exergnicas a las cuales se puede acoplar la formacin de ATP. El ATP se forma bsicamente de dos maneras, ambas ilustradas por una reaccin qumica de gluclisis: la conversin de gliceraldehido 3-fosfato a 3-fosfoglicerato (pasos 6 y 7, figura 3-23). La reaccin completa es la oxidacin de un aldehido para convertirlo en cido carboxlico (como en la figura 3-21) y ocurre en dos pasos catalizados por dos enzimas diferentes (fig. 3-25). La primera de estas enzimas requiere un cofactor no protenico (una coenzima), denominado dinucletido de adenina nicotinamida (NAD), para catalizar la reaccin. Como se ver en ste y en los siguientes captulos, el dinucletido de adenina nicotinamida desempea un papel clave en el metabolismo energtico porque acepta y dona electrones. La primera reaccin (fig. 3-25, a,b) es una oxidorreduccin, en la cual dos electrones y un protn (equivalente a un ion hidruro, :H~) se transfiere del gliceraldehido 3-fosfato (que entonces se oxida) al NAD + (que se reduce). La forma reducida de la coenzima es NADH

102

CAPITULO 3 Energa, enzimas y metabolismo

kcal

- 4.0 kcal

FHl'RA 3-2 Perfil de la energa libre de la gluclisis en el eritrocito humano. Todas las reacciones estn en equilibrio o cerca del mismo, excepto las catalizadas por hexocinasa, fosfofructocinasa y piruvatocinasa, que muestran grandes diferencias de energa libre. En la clula, todas las reacciones deben proceder con disminucin de la energa libre; el ligero incremento de energa libre mostrado aqu para varios pasos debe considerarse como derivado de errores en las mediciones experimentales de la concentracin de metabolitos. (Tomado de A.L. Lehninger, Biochemistry, 2a. ed., 1975 Worth Publishers, Nueva York.)

(fig. 3-26). La enzima que cataliza este tipo de reaccin se denomina deshidrogenasa; la que cataliza la reaccin mencionada antes es la glceraldehido fosfato deshidrogenasa. El NAD+ derivado de la vitamina niacina acta como coenzirna asociada laxamente a la deshidrogenasa en posicin para aceptar el ion hidruro (o sea, ambos electrones y el protn). A continuacin el NADH formado en la reaccin se libera de la enzima mediante intercambio con una molcula fresca de NAD+. Volveremos a esta reaccin en un momento, pero primero continuaremos con las consecuencias de la formacin de NADH. El NADH se considera un compuesto de "alta energa" debido a la facilidad con que transfiere electrones a otras molculas que atraen electrones. (Se dice que el NADH tiene potencial elevado para transferir electrones en relacin con aceptores de electrones de las clulas, vase cuadro 5-2.) Los electrones se transfieren del NADH de ordinario mediante una serie de transportadores de electrones integrados a la membrana que constituyen una cadena transportadora de electrones. Conforme los electrones se desplazan a lo largo de esta cadena descienden a un estado de energa libre cada vez ms bajo y por ltimo pasan al oxgeno molecular reducindolo a agua. La energa liberada durante el transporte de electrones se utiliza para formar ATP a travs de un proceso denominado fosforilacin oxidativa. El

transporte de electrones y la fosforilacin oxidativa se estudiarn en detalle en el captulo 5. Adems de la ruta "indirecta" para formar ATP, que implica NADH y una cadena de transporte de electrones, la conversin de gliceraldehido 3-fosfato a 3-fosfoglicerato incluye una va "directa" para sintetizar ATP. En el segundo paso de la reaccin completa {fig. 3-25, c) se transfiere un grupo fosfato del 1,3-dfosfoglicerato al ADP para formar una molcula de ATP. La enzima fosfogliceratocinasa cataliza la reaccin. Esta ruta directa para formar ATP se conoce como fosforilacin a nivel de sustrato, debido a que se transfiere un grupo fosfato del sustrato (en este caso, 1,3difosfoglicerato) al ADP. La fosforilacin a nivel del sustrato debe distinguirse de la formacin de ATP que requiere una cadena de transporte de electrones. La fosforilacin de ADP a nivel de sustrato ilustra un punto importante acerca del ADP. Su sntesis no es endergnica; en otras palabras, el ATP no es una molcula tan energtica que no pueda formarse con rapidez mediante reacciones metablicas. Hay numerosas molculas fosforiladas cuya hidrlisis tiene AG' ms negativa en comparacin con la de ATP. La figura 3-27 ilustra el AG' relativo para la hidrlisis de varios compuestos fosforilados. Se puede usar cualquier donador de la parte ms alta de la lista para formar cualquier molcula situada ms abajo en la lista. El AG' de esta reaccin ser igual a la diferencia entre los dos valores mostrados en la figura. Por ejemplo, AG' para transferir un grupo fosfato del 1,3-difosfoglicerato al ADP y formar ATP es igual a -4.5 kcal/mol (-11.8 kcal/mol + 7.3 kcal/mol). Este concepto de potencial de transferencia es til para comparar cualquier serie de donadores y aceptores independientemente del grupo que se transfiera, sean protones, electrones, oxgeno o grupos fosfato. Las molculas ms altas de la lista, o sea aquellas con mayor energa libre (AG' mayor) son molculas con menos afinidad para el grupo que se transfiere en comparacin con las situadas ms abajo en la lista. Cuanto menor afinidad, mejor ser el donador; a mayor afinidad, mejor ser el aceptor. La formacin de ATP no requiere tanta energa y puede formarse con rapidez mediante fosforilacin a nivel de sustrato (o transporte de electrones); de igual modo, las reacciones metablicas endergnicas, como la formacin de glutamina, no requieren tanta energa que no puedan acoplarse a la hidrlisis de ATP. As como se pueden fragmentar las vas catablicas en pasos sucesivos ms pequeos para conservar la energa en "paquetes" de ATP, de igual manera las vas anablicas se pueden dividir en una serie de reacciones menos endergnicas que puedan iniciarse por hidrlisis de ATP. Una caracterstica importante de la gluclisis es que puede generar un nmero limitado de molculas de ATP incluso en ausencia de oxgeno. Ni la fosforilacin a nivel de sustrato del ADP por 1,3-difosfoglicerato, ni una reaccin posterior por fosfoenolpiruvato (paso 10, figura 3-23) requieren cadena transportadora de electrones y oxgeno. Por lo tanto, la gluclisis se puede considerar una va anaerobia para producir ATP, lo que significa que puede proceder en ausencia de oxgeno y continuar suministrando ATP. Durante la gluclisis, por cada molcula de gliceraldehido 3-fosfato oxidada a piruvato se producen dos molculas de

CAPITULO 3 Energa, enzimas y metabolismo

103

Fijacin del sustrato a la enzima

. \H \

Oxidacin del aldehido por transferencia de un protn y un par de _ electrones al NAD+ CH.OPO TWl WT

C .

Enzima

Gliceraldehido 3-fosfato

Liberacin de NADH por intercambio con I\IADH

s c=o I

HCOH I r CH2OPO

Acilenzima (enlace covalente)

(a)
C=0 I

HCOH

O Ataque por P, sobre la enzima acilada

C-OPOf HCOH I T CH2OPOf

Acilenzima

1,3-Difosfoglicerato

(b)

, C-OPf
HCOH

O
Fosforilacin a nivel del sustrato

c-cr
HCOH I ?_ CH2OPO^ 3-Fosfoglicerato

+ ADP

ATP

1,3-Difosfoglicerato

(O
FIGURA 3-2.1.Transferencia de energa durante una oxidacin qumica. La oxidacin de gliceraldehido 3-fosfato a 3-fosfoglicerato, que es un ejemplo de la oxidacin de un aldehido a cido carboxlico, ocurre en dos pasos catalizados por dos enzimas. La primera reaccin (partes a y b) es catalizada por la enzima gliceraldehido fosfato deshidrogenasa, que transfiere un par de electrones del NAD+ al NADH. Una vez reducidas, las molculas NADH son desplazadas por las molculas NAD+ de la fase soluble del citoplasma, c) La segunda reaccin, catalizada por la enzima osfogliceratocinasa, es un ejemplo de fosforilacin a nivel de sustrato en la cual un grupo fosfato se transfiere desde la molcula del sustrato, en este caso 1,3-difosfoglicerato, al ADP para formar ATP.

ATP por fosforilacin a nivel de sustrato. Puesto que cada molcula de glucosa produce dos molculas de gliceraldehido 3-fosfato, se generan cuatro molculas de ATP por molcula de glucosa oxidada a piruvato. Por otra parte, se deben hidrolizar dos molculas de ATP para iniciar la gluclisis. Esto genera una ganancia neta para la clula de dos molculas de ATP por cada molcula de glucosa oxidada. La ecuacin neta para la gluclisis se puede escribir

Glucosa + 2ADP + 2 P + 2NAD+ -> 2 Piruvato + 2ATP + 2NADH + 2H+ + 2H2O El piruvato, producto final de la gluclisis, es un compuesto clave porque se sita en el punto donde se unen las vas anaerobia (independeiente de oxgeno} y aerobia (dependiente de oxgeno). En ausencia de oxgeno, el piruvato sufre fermentacin; en presencia de oxgeno, se descompo-

104

CAPITULO 3 Energa, enzimas y metabolismo

FIGURA 3-26. Estructura del NAD+ y su reduccin a NADH. [Cuando el 2' OH del fragmento ribosa (indicado por el recuadro de color prpura) se enlaza en forma covalente al grupo fosfato, la molcula es NADP+/NADPH, cuya funcin se analiza posteriormente en este captulo.]

ne por respiracin aerobia. Continuaremos este anlisis de las vas metablicas en el captulo 5. Poder reductor La energa empleada para formar molculas biolgicas complejas, como protenas, grasas y cidos nucleicos, se deriva principalmente del ATP generado por la gluclisis y el transporte de electrones. Pero gran parte de estos materiales, en particular grasas y otros lpidos, estn ms reducidos

que los metabolitos a partir de los cuales se construyen. La formacin de grasas requiere la formacin de metabolitos, que se efecta por transferencia de electrones de alta energa del NADPH, un compuesto de estructura similar al NADH, pero que contiene un grupo fosfato adicional (descrito en el pie de la figura 3-26). La reserva de NADPH de la clula representa su poder reductor, una importante medida del contenido de energa aprovechable en la clula. El empleo de NADPH se puede ilustrar por una de las reacciones clave de fotosntesis:
O

Fosfoenolpiruvato

O CH

-12.5 _

1,3-Disfosfoglicerato Fosfocreatina

HCOH CH2OPCf"

+ NADPH

HCOH

+ NADP+

CH2OPO|Gliceraldehido 3-fosfato

Compuestos fosfato de "alta energa"

1,3-difosfoglicerato

Compuestos fosfato de "baja energa"

En esta reaccin se transfiere un par de electrones (junto con un protn) del NADPH al sustrato 1,3-difosfoglicerato, reduciendo un tomo de carbono (indicado en rojo). El NADP+, la forma oxidada del NADPH, se forma a partir de NAD + en la siguiente reaccin: NAD+ + ATP = NADP+ + ADP A continuacin se puede formar NADPH mediante reduccin de NADP+. Igual que el NADH, el NADPH es un compuesto de "alta energa" debido a su elevado potencial de transferencia de electrones; la prdida de electrones a partir de NADPH hacia un aceptor apropiado es una reaccin muy favorecida. La transferencia de energa libre a travs de estos electrones eleva el aceptor a un estado ms energtico, ms reducido. La separacin del "poder reductor" en dos molculas distintas pero relacionadas, NADH y NADPH, refleja una

Glucosa 6-fosfato Glucosa 3-fosfato FIGURA 3-27. Clasificacin de compuestos segn su potencial para transferir fosfato. Los compuestos fosfato ms altos en la escala (con mayor AG DI de hidrlisis) tienen menor afinidad por su grupo fosfato que los compuestos situados abajo en la escala. Como resultado, los compuestos ms altos en la escala transfieren con rapidez su grupo fosfato para formar compuestos situados rns abajo en la escala. As, se pueden transferir grupos fosfato desde 1,3-difosfato o fosfoenolpiruvato al ADP durante la gluclisis. (Nota: 1 kcal - 4184 kj.)

CAPITULO 3 Energa, enzimas y metabolismo

105

separacin de su papel metablico primario. Diferentes enzimas reconocen al NADH y al NADPH como coenzimas. Las enzimas que tienen un papel reductor en las vas anablicas reconocen al NADPH como su coenzima, en tanto que las enzimas que actan como deshidrogenasas en las vas catablkas reconocen al NAD+. Aunque se emplean de manera diferente, las dos coenzimas son interconvertibles. La enzima transhidrogenasa cataliza la reaccin NADH + NADP+==NAD+ + NADPH Cuando la energa es abundante, la produccin de NADPH es favorecida, lo que suministra el aporte de electrones necesarios para la biosntesis de nuevas macromolcuas esenciales para el crecimiento. Sin embargo, cuando los recursos energticos son escasos, la mayor parte de los electrones de alta energa del NADH se "cambian a monedas circulantes" de ATP y slo se genera suficiente NADPH para satisfacer los requerimientos mnimos biosintticos de la clula. Como resultado de esta regulacin, un organismo integra sus procesos metablicos a un "patrn de mercado" para satisfacer las necesidades del momento. Regulacin metablica La cantidad de ATP presente en una clula en un momento determinado es sorprendentemente pequea. Por ejemplo, una clula bacteriana contiene aproximadamente un milln de molculas de ATP cuya vida media es muy breve (entre uno y dos segundos). Con tan limitado suministro es evidente que el ATP no es una molcula para almacenar gran cantidad de energa libre. Las reservas energticas de una clula se almacenan como polisacridos y grasas. Cuando la concentracin de ATP desciende se ponen en marcha las reacciones para incrementar la formacin del mismo a expensas de formas almacenadas ricas en energa. De manera similar, cuando la concentracin de ATP es alta se inhiben las reacciones que normalmente producen ATP. Las clulas tienen capacidad para regular estas importantes reacciones que liberan energa mediante el control de ciertas enzimas clave en algunas vas metablicas. Los cambios en la actividad de una enzima de ordinario se efectan modificando la enzima de modo que se altere la forma de su sitio activo. Dos de los mecanismos ms comunes para lograrlo son la modificacin covalente y la modulacin alostrica; ambas desempean un papel regulador clave en la oxidacin de la glucosa.4
Alteracin de la actividad de las enzimas mediante modificacin covalente

y Krebs prepararon un extracto crudo de clulas musculares y observaron que las molculas de enzima inactiva del extracto podan convertirse en activas simplemente aadiendo ATP al tubo de ensaye. Un anlisis posterior revel una segunda enzima en el extracto, la "enzima convertidora", como ellos la llamaron, que transfiere un grupo fosfato del ATP a uno de los 841 aminocidos que constituyen la molcula de la fosforilasa. La presencia del grupo fosfato altera la forma del sitio activo en la molcula de la enzima e incrementa su actividad cataltica. Una investigacin subsecuente demostr que la modificacin covalente de las enzimas, segn se ilustra por la adicin de fosfatos, es un mecanismo general para activar (o inactivar) enzimas. Las enzimas que transfieren grupos fosfato a otras protenas se denominan proteincinasas y participan en la regulacin de actividades tan diversas como la accin de hormonas, la divisin celular y la expresin de genes. Hay dos tipos bsicamente diferentes de proteincinasas: un tipo aade grupos fosfato a residuos especficos de tirosina en una protena de sustrato, el otro tipo aade fosfatos a residuos especficos de serina o treonina en el sustrato. Como se analiza en la seccin 15-2, la activacin de fosforilasa por la proteincinasa/os/n/flSfl cinasa puede iniciarse incrementando la concentracin de las hormonas glucagon y epinefrina circulantes. Alteracin de la actividad ensimtica mediante modulacin alostrica La modulacin alostrica es un mecanismo que puede inhibir o estimular la actividad de una enzima por medio de un compuesto que se enlaza a un sitio alostrico, el cual es un sitio especial distinto del sitio activo de la enzima. Igual que el colapso secuencial de una fila de dominios, la unin de un compuesto al sitio alostrico enva una "ondulacin" a todo lo largo de la protena que provoca un cambio definido en la forma del sitio activo, el cual puede localizarse en el lado opuesto de la enzima o incluso en un polipptido diferente dentro de la molcula de la protena. Segn la enzima y el modulador alostrico particulares, el cambio en la forma del sitio activo puede estimular o inhibir su capacidad para catalizar la reaccin. La modulacin alostrica ilustra la ntima relacin entre estructura molecular y funcin. Cambios muy pequeos en la estructura de la enzima inducidos por el modulador alostrico pueden causar modificaciones notables en la actividad enzimtica. Las clulas son muy eficaces para fabricar plantas que no desperdician energa ni materiales produciendo compuestos innecesarios. Uno de los principales mecanismos que emplea la clula para interrumpir el ensamblado en las lneas anablicas es un tipo de modulacin alostrica denominado inhibicin por retroalimentacin, en el cual la primera enzima de una va metablica se inactiva en forma transitoria cuando la concentracin del producto final de dicha va (por ejemplo, un aminocido) se eleva. Esto se ilustra en la simple va mostrada en la figura 3-28, en la cual dos sustratos, A y B, se convierten al producto final E. Conforme se eleva la concentracin del producto E, ste se enlaza al sitio alostrico de la enzima BC y provoca un cambio de conformacin en el sitio activo, que disminuye la actividad de la enzima. La inhibicin por retroalimentacin pro-

A mediados del decenio de 1950, Edmond Fischer y Edwin Krebs, de la Universidad de Washington, estudiaron la/osforilnsa, una enzima presente en clulas musculares que descompone el glucgeno en subunidades de glucosa. La enzima poda existir en sus formas activa e inactiva. Fischer

4 Tambin se puede regular el metabolismo controlando la concentracin de las enzimas. La velocidad relativa de sntesis y la degradacin de enzimas se consideran en captulos posteriores.

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CAPITULO 3 Energa, enzimas y metabolismo

porciona un medio para que la clula ejerza control inmediato y sensible sobre la actividad anablica de la clula. Separacin de las vas catablica y anablica Un breve examen de la va anablica que conduce a la formacin de glucosa (gluconeognesis) ilustra algunos aspectos importantes acerca de las vas sintticas. Cmo se puede sintetizar glucosa a partir de piruvato en una clula que normalmente oxida glucosa como su principal fuente de energa qumica? El primer punto importante es: aunque las enzimas pueden catalizar una reaccin en ambas direcciones, la formacin de glucosa no puede iniciarse simplemente invirtiendo las reacciones de la gluclisis. La va glucoltica contiene tres reacciones termodinmicamente irreversibles (fig. 3-24), y de alguna manera se deben superar estos pasos. Aun si se pudieran invertir todas las reacciones de la gluclisis, sera una manera indeseable de que la clula ejecute sus actividades metablicas, puesto que no pueden controlarse por separado las dos vas. As, una clula no puede disminuir la sntesis de glucosa y aumentar su desdoblamiento porque las mismas enzimas estaran activas en ambas direcciones.

Si se comparan las vas para degradar la glucosa (gluclisis) con la va para sintetizarla (gluconeognesis), se observa que algunas reacciones son idnticas aunque ocurran en direcciones opuestas, en tanto que otras son muy diferentes (pasos 1 a 3, figura 3-29). Empleando enzimas diferentes para catalizar distintas reacciones clave en dos vas opuestas, la clula puede resolver los problemas termodnmicos y de regulacin inherentes a su capacidad para elaborar y degradar a las molculas mismas. Podemos ilustrar estos puntos considerando en mayor detalle una de las enzimas clave de ambas reacciones, la gluclisis y la gluconeognesis. Como se indica en el paso 2 de la figura 3-29, la fosfofructocinasa, una enzima de la gluclisis, cataliza la reaccin Fructosa 6-fosfato + ATP=Fructosa 1,6-difosf ato + ADP que tiene una AG' de -3.4 kcal/mol, que la convierte en una reaccin prcticamente irreversible. La reaccin tiene un -AG' tan grande porque est acoplada a la hidrlisis de ATP. En la gluconeognesis, la formacin de fructosa 6-

Sitio para retroalirnentacin Sustratos A Enzima BC Producto

Sitio activo ENZIMA ACTIVA (Concentracin elevada de producto) (Concentracin baja de producto}

Sitio para retroalimentacin

FIGURA 3-21t. Inhibicin por retroalimentacin. El flujo de metabolitos a lo largo de una va metablica se detiene cuando la primera enzima de la va (enzima BC) es inhibida por el producto final de la va (compuesto E) que se enlaza a un sitio alostrico de la enzima. La inhibicin por retroalimentacin evita que una clula desperdicie recursos continuando la produccin de compuestos no necesarios y que incluso pueden ser txicos si se permite que se acumulen. Ciclo activo deformado ENZIMA INACTIVA la reaccin se detiene)

CAPITULO 3 Energa, enzimas y metabolismo

107

fosfato es catalizada por la enzima fructosa mediante la simple hidrlisis Fructosa 1,6-difosfato + H2O== Fructosa 6-fosfato + P

1,6-difosfatasa
Glucosa

ATP

AG' = -3.9 kcal/mol

i" = -4.0 kcal/mol

ADP'

jG" = -2.9teal/mol Glucosa 6-fosfatasa Glucosa 6-fosfato

Las enzimas particulares de la gluclsis y la gluconeogness descritas antes son enzimas reguladoras clave en sus respectivas vas. Aunque el ATP es un sustrato de la fosfofructocnasa, tambin es un inhibidor alostrico, en tanto que el ADP y el AMP son activadores alostricos. Cuando la concentracin de ATP se eleva, la actividad de la enzima disminuye de modo que no puede formarse ATP adicional mediante gluclisis. Inversamente, cuando las concentraciones de ADP y AMP se elevan respecto de las de ATP, la actividad de la enzima aumenta para promover la formacin adicional de ATP. Por lo contrario, la actividad de la fructuosa 1,6-difosfatasa, una enzima clave de la gluconeognesis, se regula por modificacin covalente. Cuando la concentracin de glucosa es alta, la enzima se inhibe por fijacin de un grupo fosfato a uno de sus residuos aminocidos. Como resultado de este tipo de regulacin, la concentracin de ATP por lo general no vara, pero permanece alta a pesar de grandes variaciones en la demanda para su consumo. Es importante que la clula mantenga concentraciones altas de ATP en relacin con las de ADP y AMP, porque slo de esa manera la ~AG de la hidrlisis de ATP permanece lo bastante grande para efectuar reacciones endergnicas. El descubrimiento y anlisis de la modulacin alosrica y la modificacin covalente revel que los cambios en el ambiente qumico del interior de la clula pueden provocar cambios de conformacin y la consecuente actividad de una macromolcula protenica compleja. En este captulo nos concentramos en la conservacin de la energa qumica en forma de ATP y su consumo en e! metabolismo. La energa almacenada en el ATP se emplea en gran variedad de procesos (p. ej., figura 3-6). Analizaremos muchos a lo largo de este texto. Aqu subrayaremos que el ATP no siempre se emplea para generar intermediarios fosforilados, como glutamilfosfato en la forma descrita en este captulo, En algunos casos, el fosfato se transfiere a un residuo aminocido de una protena para inducir un cambio de conformacin, como ocurre, por ejemplo, durante el movimiento de iones sodio y potasio a travs de la membrana plasmtica (vase figura 4-42). En otros casos, el ATP se emplea sin formar molculas fosforiladas; en lugar

Hexocinasa*

Fructosa 6-fosfato

I t

ATP

" = -3.4 kcal/mol ^ ADPr| Fosfofructocnasa V

1
Fructosa 1,6 difosfato

G" =-3.9 kcal/mol Fructosa difosfatasa

II i I it Fosfoenolpiruvato
O
JG"--7.5kcat,'mol

-GDP
dG" = +0.2 kcal/mol
-GTP

ADP
ATP

Fosfoetiolpiruvato carboxicinasa Oxalacetalo ADP

Pinivatocinasa

ATP Pimvato carboxilasa

Pruvato

FIGUKA 3-2'). Gluclisis en comparacin con gluconeognesis. La mayor parte de las reacciones son las mismas en las dos vas, aunque corren en direcciones opuestas, pero las tres reacciones irreversibles de la gluclisis (pasos 1 al 3) en la va de la gluconeognesis son reemplazadas por reacciones diferentes termodinmicamente favorecidas.

de ello, el enlace del ATP (o liberacin de ADP y P) a un sitio de enlace dentro de una proena provoca el cambio de conformacin requerido (vase figura 9-62).

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CAPITULO 3 Energa, enzimas y metabolismo

LA VIA E X P E R I M E N T A L

Determinacin del mecanismo de accin de la lisozima

Un da de 1922, el bacterilogo escocs Alexander Fleming, quien sufra de catarro, descubri que una gota de moco nasal aadida a un cultivo de bacterias provoca lisis de las clulas. Se descubri que el agente del moco causante de la muerte de las bacterias era una enzima a la cual Fleming denomin lisozima. Los ensayos de Fleming para buscar sustancias con actividad microbicida no eran casualidad. Luego de ver morir a cientos de soldados por heridas infectadas durante la Primera Guerra Mundial, Fleming decidi dedicar su vida a la bsqueda de un agente microbicida eficaz y que al mismo tiempo fuera relativamente no txico para el ser humano. A diferencia de la penicilina, que Fleming descubri en 1928, la lisozima no tuvo aplicaciones clnicas. Sin embargo, desempe un papel importante en el estudio de los mecanismos enzimticos. En 1966, David Phillips y sus colegas, de la Universidad de Oxford, publicaron un detallado modelo de la estructura terciaria de la lisozima, la primera enzima cuya estructura tridimensional se demostr utilizando cristalografa de rayos X.1'2 La lisozima se purific de la clara del huevo de gallina, donde sirve para proteger de infecciones bacterianas al embrin en desarrollo. La lisozima provoca lisis de bacterias hidrolizando los enlaces glucosdicos dentro del polisacrido de Ea pared celular bacteriana. La pared celular de las bacterias sensibles (bacterias grampositivas) se compone de un copolmero en donde alternan dos aminoazcares, N-acetilglucosamina y cido N-acetilmurmico (fg. VE 3-1). Este sustrato normal para la lisozima es un polisacrido polirnrico de gran tamao. No es fcil estudiar la enzima en tanto permanezca enlazada a su sustrato normal, de modo que Phillips y sus colegas emprendieron la bsqueda de un inhibidor de bajo peso molecular parecido al sustrato pero que no fuera hidrolizado. Encontraron que la cadena ms larga de azcares que poda ocupar el sitio activo correspondiente a las molculas de lisozima en su forma cristalina consista en tres unidades unidas de A-acetilglucosamina, a a cual nos referiremos como (NAG)s. Cuando se prepararon cristales de la enzima en presencia de (NAGJs y luego se sometieron a difraccin de rayos X, se observ la molcula (NAGJs ocupando una hendidura oval dentro de la enzima llenando casi la mitad de la longitud de la hendidura. Tambin se observ que el trisacrido se enlazaba a la enzima mediante enlaces de hidrgeno y fuerzas de van der Waals. Segn datos obtenidos mediante la construccin de modelos del complejo enzimasustrato, Phillips extrapol los resultados con (NAG)s a molculas de mayor tamao y propuso que el sitio activo de la enzima contena seis subsitios (A a F), cada uno unido a un solo azcar a lo largo de la cadena del polisacrido. En otras palabras, la hendidura estara normalmente ocupada por seis unidades adyacentes de azcar de la pared celular del polisacrido (fig. VE 3-2). El anlisis de la estructura del complejo enzima-(NAG)3 sugiri un mecanismo para explicar la actividad hidroltica de la enzima.2-3 Cuando se enlazan seis unidades adyacentes de azcar en la hendidura de la enzima, uno de los azcares (e! cuarto o azcar D de la figura VE 3-2) no se acomoda con facilidad en el espacio disponible. Para acomodar este azcar deba forzarse la conformacin normal de silla fpg. 43) y aplanarla a una forma aproximada de media silla (fig. VE 3-3). Debido a la tensin fsica a que est sujeta esta parte del sustrato, y por otras razones, Phillips propuso que el enlace glucosdico que une a los azcares residentes en los subsitios D y E (azcares 4 y 5) sera el enlace hidrolizado. Un examen ms detallado de la regin de la enzima vecina al enlace giucosdico revel que los dos residuos aminocidos se encontraban a una distancia del enlace de unos 0.3 nm a cada lado. Uno de los residuos era cido asprtico y el otro cido glutmico, ambos con cadenas laterales que contienen carboxilos. Cuando se consider el medio de estos dos residuos se esperaba que los estados de ionizacin de los dos grupos carboxilo eran muy diferentes. El medio del cido glutmico es no polar, lo cual deba impedir la disociacin de su protn, en tanto que el cido asprtico es polar, lo cual deba

-OH

CH,

NAG

NAM

NAG

FIGURA VE 3-1. El polisacrido de la pared celular bacteriana, el sustrato de la lisozima, consta de residuos alternados de cido N-acetilmurmico (NAM) y N-acetilglucosamina (NAG).

CAPITULO 3 Energa, enzimas y metabolismo

109

Principal cadena de la lisozima

FIGURA VE 3-2. Modelo simplificado de una molcula de lisozima que muestra un hexasacrido enlazado a la grieta de la enzima. Se indica la ubicacin de aminocidos clave en la enzima. FIGURA VE 3-3. Mecanismo de accin de la lisozima propuesto por Phillips. El enlace entre los azcares cuarto (D) y quinto (E) del hexasacrido que reside en la hendidura de la molcula de la lisozima se desdobla por hidrlisis acida utilizando un protn donado por el grupo carboxilo del residuo de cido glutmico en ntima aposicin. La formacin del ion carbonio con carga positiva en la posicin Cl del azcar D se facilita por la deformacin del azcar mostrada en la figura y estabilizada por el residuo de cido asprtico cercano de la enzima. En el paso final el ion carbonio reacciona con un grupo OH~ del solvente.

promover la disociacin del protn dejando el residuo aspartil con carga negativa. Empleando esta informacin basada slo en la estructura de la protena, Phillips propuso el siguiente mecanismo cataltico (fig. VE 3-3). En el primer paso del mecanismo de reaccin propuesto, la separacin del enlace glucosdico se lleva a cabo por interaccin del enlace con el cido giutmico en ntima aposicin. Debido a la polaridad del enlace glucosdico, el tomo de oxgeno dei sustrato es suficientemente electronegativo para separar al protn desde su grupo carbonilo no disociado del cido glutmico y provocar hidrlisis acida del enlace con el sustrato. El rompimiento del enlace por el protn deja al tomo de carbono del sustrato con exceso de carga positiva; un carbono cargado positivamente se denomina ion carbonio. La formacin del ion carbonio se facilita por la deformacin del azcar luego de su enlace a la enzima. Esta molcula deformada y con carga positiva corresponde a la molcula del sustrato corno existe en el estado de transicin (pg. 88). Se observ que las enzimas actan estabilizando el estado de transicin, y por lo tanto favoreciendo la formacin de producto. En el caso de la lisozima, el carbonio con carga positiva se estabiliza por la presencia cercana de un cido asprtico cargado negativamen-

te en la enzima. La reaccin del ion carbonio con el ion hidroxilo del solvente concluye la hidrlisis. Como es caracterstico de todo buen modelo, con el mecanismo propuesto para la lisozima se podan hacer muchas predicciones, las cuales pronto fueron sometidas a prueba. El anlisis de la capacidad de la lisozima para atacar sustratos de diferente longitud suministr el primer apoyo para el modelo.4 Los oligosacridos compuestos de dos, tres o cuatro unidades NAG no fueron hidrolizados por la enzima (cuadro VE 3-1). Cuando se le ofreci un sustrato de cinco unidades se observ hidrlisis lenta. Por lo contrario, un oligosacrido de seis unidades (un hexmero) fue hidrolizado por la enzima

110

CAPITULO 3 Energa, enzimas y metabolismo

CUADRO VE 3-1. Velocidades relativas de hidrlisis para el oligosacrido JV-acetilglucosamina Sacando (NAG}2 {NAG)4 (NAG)3 (NAG)6 Velocidad relativa 0.003

1.0
4000 30000

FUENTE: J.A. Rupley y V. Gates, Proc. Nati Acad. Sci. U.S.A. 57:500, 1967.

con eficacia comparable a la hidrlisis de una preparacin de polisacridos de la pared celular. El oligosacrido de seis unidades es lo bastante grande para ocupar el sitio activo. Como se predijo, el hexasacrido fue desdoblado entre el cuarto y el quinto azcares generando productos que constaban de cuatro y dos unidades de azcar. (NAG}6 -> (NAG)4 + {NAG)2 Un aspecto clave del modelo es la incapacidad del sustrato natural para enlazarse a la enzima sin sufrir deformacin. Esta ltima es resultado de la presencia de un voluminoso grupo hidroximetilo (Ct^OH) sobre el carbono seis del cuarto azcar del sustrato (fig. VE 3-3). En caso de eliminar el hidroximetilo, el sustrato debe enlazarse a la enzima con mayor facilidad. Esto es precisamente lo que se observ cuando se incub la enzima con una versin modificada de (NAG)4 en la cual el cuarto NAG se alter suprimiendo el grupo C2OH (el cuarto grupo era una N-acetilxilosamina en vez de una Nacetilglucosamina). Segn la prediccin, este oligosacrido modificado se enlaz a una fuerza 40 a 50 veces mayor que la enzima con (NAG)4.5 Si el modelo de Phillips para la lisozima es correcto y slo el cuarto de los seis azcares en el sitio activo est sujeto a tensin fsica, entonces el enlace de este azcar a su subsitio en la enzima debe tener propiedades termodinmicas diferentes en comparacin con el enlace de otros azcares. Mediante estudios de cintica en los cuales se enlazaron docenas de diferentes azcares a la lisozima fue posible medir si la unin de cada azcar a! sustrato en su respectivo subsitio era favorecida (-AG) o desfavorecida (+AG). 6 Cuando esto se llev a cabo se observ que slo era desfavoracido el enlace del residuo de azcar al subsitio D (+2.9 kcal/mol como mnimo), lo cual, una vez ms, apoya el modelo propuesto. La energa requerida para enlazar el cuarto azcar est ms que compensada por la energa liberada cuando los otros azcares se enlazan a la enzima. En el modelo de Phillips, la distorsin del cuarto azcar en el sustrato pone a tensin el enlace glucosdico, lo que ayu-

da en la hidrlisis del enlace. Este azcar deformado es un elemento importante en la estructura propuesta para el sustrato durante el estado de transicin. En 1948, Linus Pauling sugiri que "las enzimas son molculas con estructura complementaria para los complejos activados de las reacciones que catalizan". En otras palabras, no es el sustrato inicial con el cual la enzima es ms complementaria, sino con los estados de transicin de arta energa formados conforme los reactantes estn listos para convertirse en producto. Si esto es cierto, entonces los inhibidores parecidos a la molcula en estado de transicin deben enlazarse a la enzima con mucha mayor fuerza que los inhibidores parecidos al sustrato original. Los inhibidores de este tipo se denominan anlogos del estado de transicin (AET).7 En 1972 se prob un anlogo del estado de transicin para la lisozima denominado TACL (tetra-N-acetilquitotetrosa).8 E! anlogo recuerda al (NAG)4, excepto porque su residuo azcar terminal se oxida para formar una lactona delta, CH2OH

NAG (en estado de transicin)

que por lo tanto simula la conformacin deformada del azcar D propuesta por Phillips como estructura del estado de transicin. El enlace de TACL a lisozima se cuantific por su capacidad para inhibir la lisis catalizada por la lisozima de un cultivo de clulas bacterianas sensibles. Cuando se prob a pH cercano al de a enzima ptimamente activa se requiri una concentracin 100 veces mayor de (NAG)4 (un inhibidor que recuerda al sustrato) en comparacin con TACL (un inhibidor parecido al estado de transicin) para lograr el mismo grado de inhibicin de la lisis celular. Estos resultados apoyan la sugerencia de que el sustrato deformado corresponde a un estado de transicin. Los clculos efectuados a partir de los datos indicaron que TACL se enlaza aproximadamente con fuerza 3 600 veces mayor a la enzima que el tetrasacrido no modificado (NAG)4. Estos investigadores concluyeron que la tensin causada por el enlace al sustrato poda incrementar la velocidad de catlisis por un factor de 103 a 104. Otra prediccin hecha por el modelo de Phillips es que dos aminocidos clave, Asp 52 y Glu 35, deben tener propiedades de ionizacin muy diferentes debido a diferencias en la

CAPITULO 3 Energa, enzimas y metabolismo

111

polaridad de su medio. La lisozima muestra actividad ptima a pH 5. A ese pH el modelo propone que el grupo carboxilo de Glu 35 debe permanecer sobre su protn, ya que es el protn donado durante la catlisis acida. Sin embargo, a este mismo pH, Asp 52 debe tener carga negativa y ser capaz de estabilizar el ion carbonio con carga positiva. La mejor medida del estado de ionizacin de estos dos grupos carboxilo se logra con una tcnica llamada dicrosmo circular, que depende de la absorcin de luz poarizada y es muy sensible a cambios en el estado de una protena. El espectro del dicrosmo circular de la lisozima muestra una fuerte banda de absorcin en la longitud de onda de 305 nm, que puede trazarse hasta un residuo de triptfano especfico (Trp 108) en la protena. Trp 108 est muy prximo a Glu 35, el cual a su vez est cercano a Asp 52. Debido a esta proximidad, los cambios en el pH que alteran el estado de ionizacin de los grupos carboxilo de Glu 35 o Asp 52 tienen efecto sobre el espectro de dicrosmo circular derivado de Trp 108. La comparacin de los datos del dicrosmo circular obtenidos con diferentes pH indican que el pK de Glu 35 (pH en el cual la mitad de los grupos estn protonados y la otra mitad ionizados) es de 6.1, inusitadamente alto (un valor tpico sera 4.4).9 Por lo contrario, el pK de Asp 52 es de casi 3.4. De conformidad con lo predicho por el modelo, el grupo glutamilcarboxilo retiene su protn a pH 5, en tanto que el aspartilcarboxilo est cargado negativamente. Otros medios para estudiar aminocidos clave es modificar selectivamente dichos residuos y medir el efecto sobre la actividad cataltica de la enzima. La modificacin qumica de enzimas nos lleva de inmediato a considerar las tcnicas con las cuales han trabajado los qumicos orgnicos en los ltimos 150 aos, justo para modificar cualquier residuo de aminocidos. Una vez modificado el residuo y cuantificada la actividad de la enzima se puede digerir la enzima en fragmentos y verificar a modificacin precisa. La primera publicacin de la actividad de una isozima modificada qumicamente se public en 1969.10 Estos investigadores encontraron que cuando trataban la lisozima con un agente (trietiloxonioflouroborato) que "elimin" el grupo carboxilo de Asp 52 (conviertindolo en un etilster), la enzima modificada perda toda actividad cataltica aunque segua enlazada al sustrato con elevada afinidad. Experimentos subsiguientes en os cuales se modificaron qumicamente Asp 52 y Glu 35 confirmaron la expectativa de que ambos residuos deben permanecer en su estado nativo para que la enzima permanezca activa.11 En contraste, si los otros grupos carboxilo de la enzima se esterifican aunque los grupos carboxilo de Asp 52 y Glu 35 no se afecten (lo cual se logra efectuando la esterificacin mientras la enzima est unida al sustrato), la enzima retiene su actividad. Con el desarrollo de nuevas tcnicas del DNA es posible hacer delecciones, adiciones o sustituciones a cualquier polipptido cuyo gen haya sido previamente aislado. Mediante esta tcnica, denominada mutagnesis dirigida al sitio (MDS),

se puede alterar especficamente la secuencia de nucletidos de modo que se reemplaza un aminocido en el polipptido por otro aminocido elegido por el investigador. Cualquier aminocido de la protena se puede reemplazar y el investigador puede tener la certeza de que todas las molculas de protenas producidas tienen la alteracin. El primer uso de MDS en el estudio de la lisozima se public en 1989.12 En este trabajo se estudiaron los papeles de Asp 52 y Glu 35 probando la actividad de protenas mutantes en las cuales se haban reemplazado estos residuos de aminocidos. Como era de esperar de los estudios previos, las protenas imitantes en las cuales se reemplazaron ambos aminocidos eran catalticamente inactivas. En un estudio subsecuente se prob la importancia del residuo hidrofbico en contacto con Glu 35 sustituyendo Trp 108 por un aminocido polar (una asparagina, pg. 52}. La enzima modificada perdi ms de 98% de su actividad.13 Podemos concluir que el mecanismo de reaccin propuesto por Phillips hace 30 aos ha resistido la prueba del tiempo de manera notablemente satisfactoria.

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CAPITULO 3 Energa, enzimas y metabolismo

SINOPSIS
Energa es la capacidad para hacer trabajo. La energa puede ocurrir en diferentes formas, incluyendo qumica, mecnica, luminosa, elctrica y trmica, que pueden convertirse una en otra. Siempre que ocurre intercambio de energa, la cantidad total de energa en el universo permanece constante, pero se pierde energa libre, o sea, energa disponible para efectuar trabajo. La energa utilizable perdida como entropa es resultado de incremento de los movimientos al azar y el desorden del universo. Los organismos vivos son sistemas con poca entropa y se mantienen gracias al ingreso constante de energa externa derivada en ltimo trmino del sol (p. 78), Todas las transformaciones energticas espontneas (exergnicas) proceden desde un estado de mayor energa libre a un estado de menor energa libre; la AG debe ser negativa. En una reaccin qumica, AG equivale a la diferencia en el contenido de energa libre entre los reactantes y los productos. Cuanto mayor sea AG ms alejada se encuentra la reaccin de equilibrio. Conforme la reaccin procede, AG disminuye y llega a cero en equilibrio. Para comparar los cambios de energa que ocurren durante distintas reacciones qumicas se determinan las diferencias de energa libre entre reactantes y productos en un conjunto de condiciones estndar denotadas como AG 0 '. AG 0 ' = -2.303 RT log K'eq; las reacciones con constante de equilibrio mayor que la unidad tienen valores AG 0 ' negativos. Debe recordarse que AG0' es un valor fijo que describe la direccin en la cual procede una reaccin cuando la mezcla de reaccin se encuentra en condiciones estndar. Esta no tiene valor para determinar la direccin de una reaccin que ocurre en un momento particular en la clula, gobernada por AG y que depende de la concentracin de reactantes y productos en ese momento. Las reacciones dentro de las clulas con valores AG 0 ' positivos (como la reaccin en la cual el fosfato de dihidroxiacetona se convierte en gliceraldehido 3-fosfato) pueden ocurrir en la clula porque la relacin entre reactantes y productos se mantiene en un valor mayor que el predicho por Keq clula desde el medio externo y los productos de desecho se eliminan continuamente (p. 86). Las enzimas son protenas que aceleran mucho la velocidad de reacciones qumicas especficas al enlazarse a los reactantes e incrementando la posibilidad de que se conviertan en productos. Como todo verdadero catalizador, las enzimas estn presentes en pequea cantidad, no se alteran de manera irreversible en el curso de la reaccin y no tienen efecto sobre la termodinmica de la reaccin. Por lo tanto, las enzimas no pueden iniciar reacciones no favorables (+AG) para que procedan hacia delante, ni pueden cambiar la proporcin entre productos y reactantes en el equilibrio. Como catalizadores, las enzimas slo pueden acelerar la velocidad de reacciones favorecidas que ocurren en las condiciones de temperatura y pH leves observadas en las clulas. Las enzimas tambin se caracterizan por un alto grado de especificidad respecto de sus sustratos, catlisis muy eficaz prcticamente sin efectos indeseables, y la oportunidad de regular su actividad cataltica

Las enzimas actan al descender la energa de activacin (EA)/ la energa cintica requerida por los reactantes para someterse a la reaccin. Como resultado, un porcentaje mucho mayor de las molculas reactantes posee la energa necesaria para convertirse en productos en presencia de una enzima. Las enzimas descienden EA por la formacin de un complejo enzima-sustrato. La parte de la enzima que se enlaza al sustrato se denomina sitio activo, que tambin contiene las cadenas necesarias de aminocidos, cofactores, o ambos, que influyen en el sustrato de modo que facilite la transformacin qumica. Entre los mecanismos que facilitan la catlisis, las enzimas tienen capacidad para mantener a los reactantes en la orientacin apropiada, y tambin poseen la capacidad de hacer ms reactivos a los sustratos al influir en sus caractersticas electrnicas y ejercer tensin fsica que debilita ciertos enlaces dentro del sustrato (p. 89). Metabolismo es el conjunto de reacciones bioqumicas que ocurren dentro de la clula. Estas reacciones se pueden agrupar en vas metablicas que contienen una secuencia de reacciones qumicas en la cual cada reaccin es catalizada por una enzima especfica. Las vas metablicas se dividen en dos tipos muy amplios: vas catablicas, en las cuales los compuestos se descomponen y se libera energa, y vas anablicas, que llevan a la sntesis de compuestos ms complejos empleando la energa almacenada en las clulas. Las macromolculas de diversas estructuras son degradadas por las vas catablicas a metabolitos pequeos de peso molecular relativamente bajo que constituyen la materia prima para la va anablica divergente. Ambos tipos de vas incluyen reacciones de oxidorreduccin, en las cuales se transfieren electrones de un sustrato a otro incrementando el estado de reduccin del recipiente y el estado de oxidacin del donador (p. 96). El estado de reduccin de una molcula orgnica, segn puede medirse por el nmero de hidrgenos por tomo de car-

La hidrlisis de ATP es una reaccin muy favorecida (DG01 = 7.3 kcal/mol) y se puede usar para efectuar reacciones que de otro modo no seran favorables. El empleo de la hidrlisis de ATP para efectuar reacciones no favorables se ilustra con la sntesis de glutamina a partir de cido glutmico y NHs (AG0' = +3.4 kcal/mol). La reaccin ocurre por la formacin de un intermediario comn, fosfato de glutamilo. La hidrlisis de ATP puede participar en procesos como stos debido a que las clulas mantienen una elevada proporcin [ATP]/[ADP] bastante arriba del equilibrio, lo que indica que el metabolismo de ordinario opera bajo condiciones de no equilibrio. Esto no significa que cada reaccin deba mantenerse en equilibrio. Ms bien, ciertas reacciones clave en una va metablica ocurren con valores AG negativos grandes, que las hace esencialmente irreversibles dentro de la clula y permiten operar toda la va completa. La concentracin de reactantes y productos puede mantenerse en cifras relativamente constantes de no equilibrio (estado estacionario) dentro de la clula debido a que los materiales fluyen en forma continua al interior de la

CAPITULO 3 Energa, enzimas i/ metabolismo

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bono, regularmente suministra una medida del contenido energtico de la molcula. Un mol de glucosa completamente oxidada hasta CC2 y H^O libera 686 kcal, en tanto que la conversin de un mol de ADP en ATP slo requiere 7.3 kcal. Por lo tanto, la oxidacin de una molcula de glucosa puede producir suficiente energa para generar numerosas molculas de ATP. La primera etapa del catabolismo de la glucosa es la

gluclisis, en la cual se convierte glucosa a piruvato con una ganancia neta de dos molculas de ATP y dos molculas de NADH. Las molculas de ATP se producen por fosforilacin a nivel de sustrato mediante la transferencia de un grupo fosfato del sustrato al ADP. En presencia de C>2, la mayor parte de las clulas oxidan NADH mediante una cadena transportadora de electrones, formando ATP por respiracin aerobia (p. 100).

PREGUNTAS DE REPASO
1. Describa las diferencias entre la primera y la segunda ley de la termodinmica y explique por qu, cuando se consideran juntas, pueden describir los acontecimientos que ocurren en el universo. 2. De qu manera concuerda la conservacin del orden en el estado vivo con la segunda ley de la termodinmica? 3. Describir dos ejemplos en los cuales la entropa de un sistema disminuye y dos ejemplos en los cuales la entropa del sistema aumenta. 4. Analizar las diferencias entre AG y AG'; entre AG y AG'; entre la velocidad de reacciones hacia adelante y a la inversa cuando AG es negativo, cero o positivo. Cul es la relacin entre AG 0 ' y K' eq ? Cmo puede una clula efectuar una reaccin que tiene +AG 0 ' ? 5. Cmo puede una clula mantener una proporcin [ATP]/ [ADP] mayor que uno? Cmo difiere esta relacin de la esperada en el equilibrio? 6. Por qu no se puede formar hielo a temperaturas mayores de 0C? 7. Cules reacciones de gluclisis se acoplan a la hidrlisis del ATP? Cules reacciones implican fosforilacin a nivel de sustrato? Qu reacciones dependen de fermentacin o de respiracin aerobia para continuar? 8. Cmo es posible lograr una reaccin caracterizada por un AG grande y una EA pequea? Una E A grande y una AG pequea? 9. Explicar cmo las enzimas pueden ser tan especficas en relacin con el sustrato al cual se unen. 10. Examinar una de las figuras que ilustran los pasos en una reaccin catalizada enzimticamente y describir qu est ocurriendo, sin leer el pie de la figura ni el texto correspondiente. 11. Por qu se describen las vas catablicas como convergentes, en tanto que las vas anablicas se describen como divergentes? 12. Comparar la energa obtenida por clulas que oxidan glucosa de manera anaerobia y de manera aerobia. Cul es la diferencia en los productos finales de estos dos tipos de metabolismo? 13. Explicar qu significa potencial de transferencia de fosfatos. Cmo se compara el potencial de transferencia de fosfatos del fosfoenolpiruvato contra el de ATP? Qu significa esto termodinmicarnente (o sea, en trminos de AG' relativa de hidrlisis)? Qu significa en trminos de afinidad para grupos fosfato? 14. Por qu se considera el poder reductor como una forma de energa? 15. Distinguir entre nmero de recambio y Vmx.

PREGUNTAS ANALTICAS
1. Cmo se espera que un descenso de pH afecte una reaccin catalizada por quimotripsina? Por lisozima? Cmo puede un incremento de pH afectar estas dos reacciones? 2. Por qu esperara usted que la inhibicin por retroalirnentacin en condiciones tpicas altere la actividad de la primera enzima de una va metablica en vez de una de las ltimas enzimas de la va? 3. Despus de revisar las reacciones de la formacin de glutamina en la pgina 85, cul de las siguientes afirmaciones es cierta en relacin con la tercera reaccin (o completa}? Explicar por qu su respuesta es verdadera o falsa. a. Si la reaccin se escribiera en sentido inverso, su AG0' sera 4-3.9 kcal/mol. b. Si todos los reactantes y productos se encontraran en condiciones estndar al iniciar el experimento, luego de cierto tiempo la proporcin [NHjj/tADP] disminuira. c. Conforme la reaccin procede, el AG' se aproxima cada vez ms a cero. d. En el equilibrio, as reacciones hacia adelante y a la inversa son iguales y la proporcin [ATP]/[ADP] se convierte en la unidad. e. Es posible formar glutamina en la clula cuando la proporcin [glutamina]/[cido glutmico] es mayor que uno. 4. Se acaba de aislar una nueva enzima y tiene determinada velocidad de reaccin para tres diferentes concentraciones de sustratos. Estara usted de acuerdo en que la pendiente de la curva del producto contra el tiempo es igual para las tres concentraciones? Qu podra usted concluir acerca de las condiciones de la mezcla de reaccin? 5. Clasifique los siguientes tres compuestos en relacin con su potencial para transferir fosfato: ATP, fosfoenolpiruvato, glutamilfosfato. 6. En la reaccin R-= P, si un mol de producto tiene la misma energa libre que un mol de reactante, cul es el valor de la fCgq de esta reaccin? Cul es el valor de AG7

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CAPITULO 3 Energa, enzimas y metabolismo 12. En una serie de reaciones, A -> B > C > D, se determin que la constante de equilibrio para la segunda reaccin (B a C) es de 0.1. En una clula viva, esperara usted que la concentracin de C sea: 1) igual a B; 2) Un dcimo de B; 3) menos de un dcimo de B; 4) 10 veces la de B; 5) ms de 10 veces la de B? (Encerrar en un crculo todas las respuestas correctas.) 13. La reaccin del compuesto X con el compuesto. Y para producir el compuesto Z es una reaccin no favorecida (AG D = +5 kcal/mol). Escribir la reaccin qumica que ocurrira si se utiliza ATP para manejar la reaccin. 14. El ATP evolucion como la molcula central en el metabolismo energtico. Podra el 1,3-difosfoglicerato servir para la misma funcin? Por qu s o por qu no? 15. Calcular la AG para la hidrlisis del ATP en una clula en la cual la proporcin [ATP]/[ADP] se ha elevado hasta 100:1, en tanto que la concentracin de P permanece igual a 10 mM. Cmo se puede comparar la proporcin [ATP]/ [ADP] cuando la reaccin est en equilibrio y la concentracin de P permanece en 10 mM? Cul ser el valor para AG cuando reactantes y productos se encuentren en condiciones estndar (1 M}?

7. Qu se quiere decir en trminos de relaciones de concentracin cuando se expresa que la AG de la hidrlisis de ATP es aproximadamente -12 kcal/mol, en tanto que la AG 0 ' es -7.3 kcal/mol? 8. Cul es la fuente de los dos grupos fosfato en la molcula 1,3-difosfoglicerato, un intermediario merabico de la gluclisis? 9. Si en la reaccin A ; =B se determin que la K'eq es 103, cul sera la AG 0 ' para la reaccin? Cul sera la AG 0 ' si a K'eq se hubiera determinado que es 10~3? Cul es la K' eq de la reaccin de hexocinasa indicada en la figura 3-23? 10. La AG 0 ' de la reaccin acetilfosfato + ADP = acetato + ATP es 2.8 kcal/mol. Molcula por molcula, el acetilfosfato tiene (mayor, menor, igual) energa libre que el ATP en relacin con su compuesto desfosforilado; el ADP tiene (mayor, menor, igual) afinidad para el fosfato en comparacin con el acetato). (Encerrar en un crculo las respuestas correctas.) 11. Si la reaccin XA + Y = XY + A tiene una AG 0 ' de +7.3 kcal/mol, podra ocurrir esta reaccin en la clula mediante acoplamiento a hidrlisis de ATP? Por qu s o por

qu no?

BIBLIOGRAFA
Energa

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CAPITULO

Estructura y Juncin de la membrana plasmtica

Resumen de las funciones de la membrana Conceptos generales de la estructura de la membrana plasmtica 4-:i Lpidos y fluidez de la membrana 4-1 Naturaleza dinmica de la membrana plasmtica 1-.", Movimiento de sustancias a travs de membranas celulares La perspectiva humana: Fibrosis qustica: importancia clnica del transporte de membrana Potenciales de membrana e impulsos nerviosos La va experimental: El receptor para acetcolina

as paredes externas de una casa o de un automvil L constituyen una barrera fuerte y rgida que protege a los habitantes de un mundo externo impredecible y spero. Se podra esperar que el lmite exterior de una clula viviente consistiera igualmente de una barrera dura e impenetrable, puesto que tambin debe proteger al delicado contenido interno contra los rigores de un inhspito mundo no viviente. Aun as, las clulas estn separadas del ambiente externo por una estructura denominada membrana plasmtica, que slo tiene unas cuantas molculas de espesor (5 a 10 nm). Se necesitaran 1 000 membranas plasmticas apiladas una sobre otra para igualar el espesor de una sola pgina de este libro. Debido a su delgadez, cuando se examina un corte de la clula con microscopio de luz no se descubre signo alguno de la membrana plasmtica. En realidad, no fue sino hasta finales del decenio de 1950 que las tcnicas para preparar y teir tejidos haban progresado hasta el punto que permitieron observar con claridad la membrana plasmtica mediante microscopio electrnico. Las primeras micrografas electrnicas, como las logradas por J.D. Robertson, de la Universidad Duke, mostraron la membrana plasmtica como una estructura de tres capas compuesta por-dos capas de color oscuro orientadas hacia afuera y enmedio una capa de color claro (fig. 4-1, a). Todas las membranas que se examinaron con detalle, ya fueran plasmticas, nucleares o citoplsmicas (fig. 4-1, b], o las tomadas de plantas, animales o microorganismos, mostraron esta misma ultraestruCtura. Adems de suministrar una imagen visible de est importante y vital estructura celular, esas micrografas electrnicas generaron un acalorado debate respecto de la composicin molecular de las diferentes capas de una membra115

FIGURA 4-A- Disposicin tridimensional de los polipptidos que constituyen el centro de reaccin fotosintetica residente en a membrana plasmtica de una bacteria. Se muestran en amarillo, azul y verde los diferentes plipcptidos situados en el centro de reaccin. (Tomado de G. Feher, J.P. Alien, M..Y. Okamura y D.C. Ree$. Reimpreso, con permiso, de Nature 339:313, 1989. Copyright 1989, Macmlan Magazines Limited.)

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CAPITULO 4 Estructura y funcin de la membrana plasmtica

na, discusin que lleg al punto medular del tema referente a la estructura y funcin de la membrana. Ms adelante retornaremos a la estructura de la membrana, pero primero examinaremos algunas de las principales funciones de la membrana en una clula viva (fig. 4-2).

4-1 Resumen de las funciones de la membrana

1. Compartamentalizacin. Las membranas son hojas continuas, sin aberturas, como las que encierran los compartimientos intracelulares. La membrana plasmtica rodea todo el contenido de la clula, en tanto que las membranas nuclear y citoplsmica incluyen varios espacios celulares internos en los cuates tienen lugar actividades especializadas. Igual que el espacio dentro de un edificio debe dividirse para tener actividades de diferente tipo en sus compartimientos con un mnimo de interferencia externa, as tambin debe dividirse la clula. En la clula, la compartamentalizacin es particularmente importante debido a que los diferentes espacios estn llenos de lquido, y si estos lquidos se mezclaran sera desastroso. 2. Las membranas constituyen barreras selectivamente permeables. Las membranas impiden el libre intercam-

bio de materiales de un lado a otro, pero al mismo tiempo proporcionan el medio para comunicar un espacio con otro. La membrana plasmtica debe garantizar que las sustancias apropiadas penetren al citoplasma desde el espacio externo y las sustancias napropiadas salgan de la clula. En esta funcin, la membrana plasmtica acta como barrera selectivamente permeable. 3. Transporte de solutos. La membrana plasmtica contiene los mecanismos para transportar fsicamente sustancias de un lado al otro de la membrana, con frecuencia.de una regin donde un soluto se encuentra en baja concentracin a otra donde dicho soluto muestra concentracin ms alta. Los mecanismos de transporte de la membrana permiten que la clula acumule azcares y aminocidos, necesarios como energticos de su metabolismo y para construir sus macromolculas. La membrana plasmtica tiene otra funcin relacionada con el transporte de solutos, que consiste en separar iones con carga opuesta y establecer gradientes inicos. Esta capacidad es crucial para las clulas nerviosas y musculares, pero tambin puede desempear un pape! en la respuesta de cualquier clula a su ambiente. 4. Respuesta a seales externas. La membrana plasmtica tiene una funcin rnuy importante en la respuesta de una clula a los estmulos externos, proceso conocido como transduccin de seales. Las membranas poseen re-

FIGURA 4-1. Aspecto trilaminar de las membranas, a) Micrografa electrnica que muestra la estructura en tres capas (trilaminar) de la membrana plasmtica de un eritrocito. Las flechas indican los bordes interno y externo, b) Borde externo de una clula muscular diferenciada desarrollada en un cultivo que muestra la estructura trilaminar similar a la de la membrana plasmtica (MP) y la membrana del retculo endoplsmico liso (REL). (a: Cortesa de /.D, Robertson; b: segn Ancirew R. Murks y cois. J. Cell Biol. 114:307, 1991; con autorizacin de RockefeHer Univers'y Press.)

(a)

(b)

CAPITULO 4 Estructura y funcin de la membrana plasmtica

(4)

117

Hormona

FIGURA 4-2. Resumen de las funciones de la membrana en una clula vegetal. 1) Ejemplo de una membrana compartamentalizada en la cual las enzimas hidrolticas (hidrolasas acidas) quedan encerradas dentro de una vacuola rodeada por una membrana. 2) Ejemplo del papel de las membramas como barrera selectivamente permeable. Las molculas de agua pueden penetrar rpidamente a travs de la membrana plasmtica llenando el espacio disponible dentro ce la clula vegetal y ejerciendo presin contra su pared celular. 3) Ejemplo de transporte de soluto. Los iones hidrgeno producidos por varios procesos metablicos en el citoplasma son bombeados fuera de las clulas vegetales hacia el espacio extracelular por una protena de transporte localizada en la membrana plasmtica. 4) Ejemplo de la participacin de una membrana en la transferencia de informacin de un lado a otro (transduccin de seales). En este caso, una hormona (p. ej., cido abscsico) se enlaza a la superficie externa de la membrana plasmtica y desencadena la liberacin de un mensaje qumico (como IPs) dentro del citoplasma. En este caso, 1?3 provoca la liberacin de Ca2+ de un almacn citoplsmico. 5) Ejemplo del papel de la membrana en la comunicacin de clula a clula. Los orificios entre clulas vegetales adyacentes, denominados plasmodesmata, permiten que los materiales se desplacen directamente del citoplasma de una clula a sus vecinas. 6) Ejemplo del papel de las membranas citoplsmicas como sitio de localizacin de enzimas. La fijacin de C2 por la clula vegetal es catalizada por una enzima que se relaciona con la superficie exterior de las membranas tilacoides del cloroplasto. 7) Ejemplo del papel de las membranas en la transduccin de energa. La conversin de ADP a ATP ocurre en ntima conexin con la membrana externa de la mitocondria.

ceptores que se combinan con molculas especficas (ligandos) con estructura complementaria. Diferentes tipos de clulas tienen membranas con distintos tipos de receptores, y por lo tanto pueden reconocer y responder a diferentes ligandos de su ambiente. Los ligandos mejor estudiados son hormonas, factores de crecimiento y neurotransmisores, todos unidos a la membrana plasmtica pero"qe'hoT" atraviesan. La interaccin de un receptor de membrana plasmtica con un ligando externo a veces.provoca que la membrana genere una nueva seal que estimula o inhibe actividades internas. Por ejemplo, las seales generadas en la membrana plasmtica pueden indicar a la clula que elabore ms glucgeno, se prepare para la divisin celular, se

desplace hacia los puntos de mayor concentracin de un compuesto particular, libere calcio de sus reservas internas o posiblemente que se suicide. 5. Interaccin intercelular. Situada en la frontera de la clula viviente, la membrana plasmtica media las interacciones que ocurren entre las clulas de un organismo multicelular. La membrana tambin permite a las clulas reconocerse entre s, adherirse cuando es apropiado e intercambiar materiales e informacin. 6. Sitios para actividades bioqumicas. Las membranas proporcionan un medio para organizar las actividades celulares. Puesto que los reactantes se encuentran en solucin, sus posiciones no son estables y su interaccin depen-

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CAPITULO 4 Estructura y funcin de la membrana plasmtica

de de colisiones al azar. En la pgina 61 del captulo 2 se hizo notar que la unin de enzimas en complejos multienzimticos facilita mucho la secuencia de una reaccin, debido a que cada enzima se sita en el lugar correcto en el momento adecuado. De igual manera, las membranas suministran a la clula una extensa armazn o andamiaje dentro del cual se pueden ordenar los componentes para una interaccin eficaz. Una parte significativa de los mecanismos enzimticos de una clula se relaciona con sus diferentes membranas. 7. Transduccin de energa. Las membranas participan estrechamente en los procesos que convierten un tipo de energa en otro (transduccin de energa). La ms fundamental transduccin de energa ocurre durante la fotosntesis, cuando los pigmentos unidos a la membrana absorben energa de la luz solar, la convierten en energa qumica y la almacenan en carbohidratos. Las membranas tambin participan en la transferencia de energa qumica de grasas y carbohidratos al ATP. En eucariotes, los mecanismos para estas conversiones energticas se encuentran dentro de las membranas de los cloroplastos y las mitocondrias. Las membranas tambin sirven como sitios para almacenar energa cuando mantienen concentraciones diferentes de iones especficos o de otros solutos a travs de su superficie. La energa almacenada en estos gradientes es igual a la acumulada en una pila elctrica y se emplea para ejecutar muchas de las actividades ms importantes de la clula. Este captulo se refiere principalmente a la estructura y funciones de la membrana plasmtica, con excepcin de su papel mediador en las interacciones intercelulares, que analizaremos en el captulo 7. La estructura y funciones de las membranas citoplsmicas se estudian en el captulo 8.

Bicapa de lpidos. El centro de una membrana contiene una capa bimolecular de fosfolpidos orientada con sus grupos hidrosolubles hacia el frente de la superficie externa y sus colas de cidos grasos hidrfobos hacia el interior.

Conceptos generales de la estructura de la membrana plasmtica

Desde hace ms de 50 aos se sabe que la membrana est compuesta principalmente por lpidos y protenas. El verdadero ncleo de la membrana consiste en una vaina de fosfolpidos dispuestos un una capa bimolecular, una bicapa de lpidos (fig. 4-3). Las bicapas de lpidos sirven principalmente como armazn estructural para la membrana y como barrera que impide movimientos desordenados de materiales hidrosolubles hacia adentro y afuera de la clula. Las protenas de la membrana, por otra parte, efectan la mayor parte de las funciones especficas resumidas en la seccin previa. . Los primeros modelos de la estructura de la membrana, en particular el propuesto en 1935 por Hugh Davson, del University College de Londres, y por James Danielli, de la Universidad de Princeton, propusieron que las protenas de la membrana se encontraban en la superficie externa de la bicapa de lpidos. Los experimentos efectuados a fines del decenio de 1960 condujeron a un concepto radicalmente diferente de la estructura de la membrana, segn se detall en el modelo de mosaico fluido propuesto, en 1972, por S. Jonathan Singer y Garth Nicolson, de la Universidad de California. En el modelo de mosaico fluido, el "dogma cen-

tral" de la biologa de la membrana durante ms de dos decenios, la bicapa de lpido se retiene como ncleo de la membrana, pero se presta gran atencin al estado fsico de los lpidos (fig. 4-4). En vez de consistir en una bicapa inmvil esttica, las molculas de lpido se presentan en estado lquido capaces de girar y efectuar desplazamientos laterales dentro de la membrana. La estructura y disposicin de las protenas de la membrana en el modelo de mosaico fluido son notablemente diferentes de las propuestas en modelos previos. Las protenas del mosaico fluido se presentan como "un mosaico" de partculas discontinuas que penetran profundamente hacia el interior y atraviesan por completo la capa de lpidos (fig. 4-4). Pero lo ms importante del modelo de mosaico fluido es que considera las membranas celulares como estructuras dinmicas cuyos componentes son movibles^ con capacidad para reunirse y participar en interacciones transitorias o semipermanentes de diferentes tipos. En las siguientes secciones examinaremos parte de las pruebas empleadas para formular y apoyar este modelo dinmico de la estructura de la membrana y consideraremos algunos datos recientes que an confirman este modelo.

Composicin de la membrana
Todas las membranas son estructuras de lpidos. y protenas cuyos componentes se mantienen unidos formando una delgada capa por medio de enlaces no covalentes. Adems

CAPITULO 4 Estructura y funcin de la membrana plasmtica

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Protena integral

FIGURA - 1 - 1 Estructura de la membrana plasmtica, a) Modelo del mosaico fluido de la estructura de la membrana segn lo propusieron inicialmente Singer y Nicolson, en 1972. A diferencia de modelos previos, las protenas penetran y atraviesan la bicapa de lpidos. b) Representacin actual de la membrana que muestra la misma organizacin bsica propuesta por Singer y Nicolson. Ahora se sabe que la superficie externa de la mayor parte de las protenas de la membrana, y tambin un pequeo porcentaje de los fosfolpidos, contienen cadenas cortas de azcares (cadenas con cuentas amarillas y verdes) que constituyen glucoprotenas y glucolpidos. Estas porciones de las cadenas de polipptidos se extienden a travs de todo el espesor de la bicapa de lpidos; en condiciones tpicas se presentan como hlices alfa compuestas de aminocidos hidrfobos, (a: Reimpreso con permiso de S.). Singer y G.L. Nicolson, Science 175:720, 1972. American Association for Advancement of Science.)

de lpidos y protenas, la membrana tambin contiene carbohidratos (fig. 4-4, b). La proporcin entre lpidos y protenas vara considerablemente (cuadro 4-1) segn el tipo de membrana celular (plasmtica, reticuloendoplsmica, complejo Golgi), tipo de organismo (procarote, vegetal, animal) y tipo de clula (cartilaginosa, muscular, heptica). Por ejemplo, en la membrana interna de las mtocondrias, la relacin protena/lpidos es muy alta en comparacin con la membrana plasmtica del eritrocito, que a su vez es alta comparada con las membranas de la vaina de mielina

que rodean una clula nerviosa. Estas diferencias pueden correlacionarse en gran medida con la funcin particular de estas membranas. La membrana interna de las mitocondrias contiene protenas transportadoras de la cadena de transporte de electrones y su contenido de lpidos es menor en relacin con otras membranas. La mejor manera de describir la vaina de mielina es como un aislante elctrico que envuelve la neurona (fig. 4-5),_juna funcin que es mejor realizada por una gruesa capa de lpidos de resistencia elctrica elevada y contenido mnimo de protenas.

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CAPITULO 4 Estructura y funcin de la membrana plasmtica CUADRO 4-1. Contenido de lpidos y protenas de las membranas Membrana Mielina Membranas plasmticas Clula heptica Ascitis de Ehrlich Vellosidad intestinal Fastasma de eritrocito Retculo endoplsmico Mitocondrias Membrana externa Membrana interna Bastoncillos de la retina Laminillas del cloroplasto Bacterias Grampositivas Gramnegativas Micoplasrna Halfila Protena/lpidos (peso/peso) Colesterol/Ipidos polares (mol/mol) 0.7-1.2 0.3-0.5 0.5-1.2 0.9-1.0 0.03-0.08 0.03-0.09 0.02-0.04 0.13 0 Principales lpidos polares*
Cer, PE, PC PC, PE, PS, Efm

0.25

1.0-1.4
2.2 4.6 1.5-4.0 0.7-1.2 1.2 3.6 1.5 0.8
2.0-4.0

Efm, PE, PC, PS PC, PE, Efm

DPG, PC, PE, Pas

PC, PE, PS GalDG, SL, PS

DPG, PG, , PE, aaPG PE, PG, DPG, AP PGP anlogo del ter

2.3 1.8

0 0 0 0

* Las abreviaturas son: Cer, cerebrsidos: DPG, difosfatidilglicerol, GalDG, galactosildiglicrido; AP, cido fosfatdico; PC, fosfatidilcolina; PE, fosfatidiletanolamina: aaPG, esteres aminoacil de fosfatidilglicerol; Pas, plasmalgeno; SL, sulfolpido; Efm, esfingomielina. FUENTE: E.D. Korn, Reproducido, con permiso, de ANNUAL REVIEW OF B1OCHEMISTRY, val 38, 1969, por Annual Reviews Inc.

Lpidos de la membrana

Las membranas contienen varios tipos de lpidos, todos anfipticos; o sea, contienen regiones hidrfilas e hidrfobas (como se ilustra en la figura 4-3). La mayor parte de los lpidos de la membrana contienen un grupo fosfato, y las principales excepciones son colesterol y glucolpidos. Puesto que casi todos los fosfolpidos de la membrana poseen un esqueleto glicerol, se les denomina fosfoglicridos (fig. 4-6). A diferencia de los triglicridos, que poseen tres cidos grasos (pg. 47, cap. 2), los glicridos de la membrana son diglicridos: slo dos grupos hidroxilo del glicerol se esterifican para formar cidos grasos; el tercero se esterifica para formar un grupo fosfato. La molcula sin otras sustituciones, adems del fosfato y las dos cadenas lpidas acilo, se denomina cido fosfatdico y prcticamente est ausente en la membrana. En vez de esto, los diglicridos de la membrana contienen un grupo adicional unido al fosfato, por lo general en forma de colina (para formar la fosfatidilcolina), etanolamina (la fosfatidiletanolamina), serina (la fosfatidiserina), o nositol (el fosfatidilinositol). Cada uno de estos grupos es pequeo e hidrfilo y, junto con el fosfato elctricamente cargado al cual se unen, forman un dominio muy hidrosoiuble en un extremo de la molcula denominado grupo de la cabeza. Por lo contrario, las cadenas lpidas acilo son largas, no ramificadas, formadas por hidrocarburos hidrfobos (fig. 4-6). Un cido graso de la membrana puede estar completamente saturado (o sea, carecer de dobles enlaces), monoinsaturado (un solo doble enlace) o poliinsaturado (ms de un doble enlace). A menudo los fosfoglicridos contienen una cadena lpida acilo insaturada y una saturada.

FIGURA 4-5, Vaina de mielina. Micrografa electrnica del axn de una clula nerviosa rodeada por una vaina de mielina que consta de capas concntricas de membrana plasmtica. La vaina de mielina aisla la clula nerviosa de su entorno y como resultado aumenta la velocidad a la cual pueden viajar los impulsos a lo largo del axn (analizado en la pgina 156). (Tomado de Leonard Napolitano, Francis LeBaron y Joseph Scaletti, }. Cell Biol. 34:820, 1967. Con permiso de Rockefeller University Press.)

CAPITULO 4 FIGURA 4-0. Estructura qumica de los lpidos de la membrana, a) Estructura de ios lpidos derivados de glicerol, todos los cuales son fosfolpidos (vase tambin figura 2-22). b) Lpidos derivados de esfingosina. La csfingomielina es un fosfolpido, los ganglisdos son glucolpidos. Un tercer lpido de la membrana es el colesterol, que se muestra en la siguiente figura (R = cadena lipoacil).

Un tipo menos abundante de lpidos de membrana, denominados esfingolpidos, se derivan de esfingosina, un alcohol aminadp que contiene una larga cadena de hidrocarburo (fig. 4-6). Los esfingolpidos contienen esfingosina unida a un cido graso (R en la figura 4-6, b) a travs de su grupo amino. Esta molcula es un ceramido. Los diferentes lpidos formados por esfingosina contienen grupos adicionales esterificados en el alcohol terminal de la fraccin esfingosina. Si el resultado de la sustitucin es la introduccin de un grupo fosforilcolina, entonces la molcula es una esfingomielina, el otro fosfolpido de la membrana. La molcula ser un glucolpido si la sustitucin introduce un carbohidrato. Si el carbohidrato es un azcar simple, el glucolpido se denomina cerebrsido; si es un oligosacrido, el glucolpido se llama ganglisido. Puesto que todos los esfingolpidos tienen dos largas cadenas de hidrocarburos hidrfobas en un extremo y una regin hidrfla en el otro, tambin son anfipticos y con estructura total bsicamente similar a la de fosfoglicridos. Otro componente lpido de ciertas membranas es el esterol colesterol (vase fig. 2-9), que en ciertas clulas animales puede constituir hasta 50% de las molculas pidas de la membrana plasmtica. Las membranas plasmticas de la mayor parte de las clulas vegetales y de todas las clulas bacterianas carecen de colesterol. El colesterol es ms pequeo que los otros lpidos de la membrana y menos antiptico. Como se muestra en la figura 4-7, las molculas de colesterol se orientan con sus grupos hidroxilo hidrfobos hacia la superficie de la membrana y su extremo hidrfobo integrado a la bicapa de lpidos. Ms adelante analizaremos el efecto de estas molculas sobre las propiedades de la bicapa. En el cuadro 4-2 se presentan los lpidos que componen diferentes membranas. Bicapa de lpidos. En 1925, dos cientficos holandeses, E. Gorter y F. Grendel, propusieron por primera vez que las membranas celulares podan contener una bicapa de lpidos. Estos investigadores extrajeron lpidos de eritrocitos humanos y midieron la superficie cubierta por dichos lpidos al extenderlos sobre la superficie del agua (fig. 4-8, a). Puesto que los eritrocitos de mamfero carecen de ncleo y de organelds citoplsmicos, la membrana plasmtica es la nica estructura que contiene lpidos; por lo tanto, se puede asumir que todos los lpidos del eritrocito corresponden a la membrana plasmtica (pgina 140). La proporcin entre la superficie de agua cubierta por los lpidos extrados de eritrocitos y 3a superficie calculada para los eritrocitos de los cuales se extrajeron dichos lpidos vari entre 1.8 y 2.2 a 1. Gorter y Grendel concluyeron que la verdadera proporcin era 2:1 y que la membrana plasmtica contena una capa bimolecular de lpidos o simplemente una bicapa de lpidos. Tambin sugirieron que los grupos polares de cada capa molecular (hoja) se dirigen al exterior de la bicapa (como se muestra en la figura 4-8, b). Esta sera la dispo-

H 2 C-0-O (CH;)7CH>CHCH,),CH, i 9 HC-0-C-(CH2)7CH.CH(CH;)7CH3

Acido dioleoil fosfatdico Acido fosfatdico Fosfatidilcolina (lecitina) Fosfatidilserina Fosfatidiletanolamina (cefalina) Fosfatidilinositol
H OH H-

O--P-O-CH; -

o
HjC-0-C-R
| O HC-O-C-R 1

COQHj-CH f CH r

O-P-O-CH-,

<r

o
H,C-0-C-R HC-O-C-R

Difosfatidilg (i cero I (cardiolipina)

CH i ' ;-0-P-0-CH, i ' HO-O-H o0*

! !

CH,-0-P-0-CH, 1 ' O HC-O-C-RI O C-O-C-RH,

(a)
H H

Esfingosina

HO-CH,-C C NH, OH H H

Ceramida

HO-CHr - CNH OH 0*C - R H

Esfingomielina
H H 0C R

Un cerebrsido
Un ganglisido (Givra)

(b)

122

CAPITULO 4 Estructura y funcin de la membrana plasmtica

FIGURA 4-7. Las molculas de colesterol de una membrana se orientan con sus extremos hidrfilos pequeos hacia la superficie externa de la bicapa y la masa de su estructura empacada dentro de las colas de cidos grasos de los fosfolpidos. La colocacin de las molculas de colesterol impide el apretado empacamiento de los fosfolpidos, que tiende a incrementar la fluidez de la bicapa.

sicin termodinmicamente favorecida, puesto que los grupos polares de la cabeza de los lpidos podan interactuar con las molculas de agua que los rodean, en tanto que las cadenas hidrfobas de ipidos acilo estaran protegidas del medio acuoso. Por lo tanto, los grupos de las cabezas polares enfrentan al citoplasma en un borde y el plasma sanguneo en el otro. Aunque Gorter y Grendel efectuaron varios clculos errneos (compensados entre s por casualidad), llegaron a la conclusin correcta de que las membranas naturales contienen una bicapa de lpidos. La presencia en las membranas de una capa bimolecular de molculas lpidas anfipticas tiene consecuencias importantes para las propiedades fisiolgicas de la membrana. Esto se manifiesta claramente cuando se comparan las propiedades de una bicapa artificial de lpidos con las propiedades de una membrana celular verdadera. En el aparato cuyo diagrama se muestra en la figura 4-9, a, se puede

preparar con facilidad una bicapa artificial. Los lpidos empleados se recogen con la punta de un pincel fino y luego se aplican en los pequeos agujeros de una hoja de plstico que separa dos cmaras acuosas. Los lquidos colocados a travs de las aberturas forman una delgada pelcula que espontneamente se adelgaza hasta un espesor menor de 10 nm (fig. 4-9, b). Muchos criterios demuestran que esta pelcula es una bicapa de lpidos con la misma organizacin mostrada en la figura 4-3. La formacin espontnea de una bicapa indica que esta disposicin de las molculas lpidas es la organizacin termodinmicamente preferida. Las bicapas artificiales tambin pueden adoptar la forma de vesculas esfricas llamadas liposomas; segn el mtodo de formacin, pueden consistir en un nido de esferas membranosas concntricas o en una simple bicapa continua de lpidos que rodea un compartimiento acuoso (fig. 4-10). Los liposomas son invaluabies para investigar las propiedades de las membranas. Se pueden introducir protenas de la membrana en los liposomas y estudiar su funcin en un ambiente mucho ms simple que el de una membrana natural, Tambin se han probado liposomas que contienen DNA o diferentes frmacos dentro de su compartimiento central como sistemas potencialmente transportadores para entregar materiales a clulas especficas del cuerpo (pgina 153). En el cuadro 4-3 se comparan las propiedades de una bicapa artificial de lpidos con las de una membrana natural. Es evidente que son notablemente similares. Incluso el aspecto de una bicapa artificial en el microscopio electrnico (fig. 4-9, c] revela la misma imagen de tres capas observada en las membranas naturales. Sin duda, gran parte de la estructura y comportamiento de las membranas es resultado de la presencia de una bicapa de lpidos. Las propiedades no similares entre las dos, en particular de permeabilidad y resistencia elctrica, se atribuyen a las protenas de la membrana. La presencia de una bicapa de lpidos tiene muchas consecuencias en la estructura y funcionamiento de a clula. Debido a la cohesin y formacin espontnea de las bicapas nunca se observan membranas con bordes libres; siempre son estructuras ntegras continuas. Como resultado, las membranas forman extensas redes interconectadas que se

CUADRO l-'2. Composicin de los lpidos de algunas membranas biolgicas*

Lpido3 Eritrocito humano Mielina humana Mitocondrias de corazn de ternera

E. coli
0 0

Acido fosfatdico Jico Fosfatidilcolina na lolamina Fosfatidiletanol ?rol Fosfatidilglicero Fosfatidilserina na Cardiolipina Esfingomielina la Glucolpidos Colesterol

1.5 19 18 0
8.5

0.5 10
20 0

0
17.5

10 25

8.5 0 8.5 26 26

0 39 27 '0 0.5
22.5 0 0

65 18 0 12 0

0
0

* Los valores expresados son porcentaje en peso de los lpidos totales. FUENTE: C. Tanford, The Hydrophobic Effect, p. 109, Wiley, 1980.

CAPITULO 4

123

FIGURA 4-i Clculo de la superficie de una preparacin de lpidos. a) Cuando se disuelve una muestra de fosfolpidos en un solvente orgnico, como el hexano, y se extiende sobre una superficie acuosa, las molculas de fosfolpidos forman una capa sobre el agua cuyo espesor es de una sola molcula: capa monomolecular. En esta capa las molculas se orientan con sus grupos hidrfilos enlazados a la superficie del agua y sus cadenas hidrfobas dirigidas al aire. Para estimar la superficie que los lpidos cubriran si fueran parte de una membrana, se comprimen las molculas de dichos lpidos en el rea ms pequea posible por medio de barreras desplazables. Mediante este tipo de aparato, Gorter y Grendel concluyeron que los eritrocitos contenan suficientes lpidos para formar una capa sobre su superficie de dos molculas de espesor: una bicapa. b) Naturaleza de la bicapa de lpidos, segn la propusieron Gorter y Grendel. Los grupos polares se dirigen hacia afuera y las colas de cidos grasos hacia adentro.

Barrera fija

Lpidos

\a \e

Agua limpia

(a)

(b)

Distribucin inicial de la solucin de lpidos

Procedimiento experimental para la preparacin de bicapas artificiales, a) Los lpidos disueltos en un solvente se aplican con una brocha a travs de un agujero practicado en una placa que separa dos cmaras acuosas, b) Inicialmente, la capa de lpidos es gruesa pero pronto se adelgaza de manera espontnea para formar la bicapa. c) Micrografa electrnica de una bicapa artificial de lpidos fijada con permanganato de potasio y nitrato de lantano que muestra el aspecto trilaminar en ausencia de protenas. El borde oscuro y las lneas exteriores al parecer son los sitios de las cabezas polares, (c: Cortesa de Cien L. Decker.)

Detalle de la membrana

124

CAPITULO 4 Estructura y fundn de a membrana plasmtica

mocin (fig. 4-11, a) o la divisin celular (fig. 4-11, b). Se cree que la bicapa de lpidos facilita la fusin o el desdoblamiento de las membranas. Por ejemplo, durante la secrecin, cuando las vesculas citoplsmicas se funden con la membrana plasmtica, o la fertilizacin, cuando dos clulas se unen para formar una sola clula {fig. 4-11, c], participan procesos en los cuales dos membranas separadas se renen para constituir una capa continua. La formacin espontnea de bicapas de lpidos tambin es importante en las teoras de la evolucin celular. Una capa externa que contiene lpidos proporciona la barrera necesaria para aislar el medio interno viviente cuyas propiedades son muy diferentes a las del medio externo. Segn estudios de bicapas artificiales, puede esperarse que dicha barrera se forme de manera espontnea. La formacin de una'barrera alrededor del primer conjunto de molculas autoduplicantes, al parecer fue el primer paso esencial en la evolucin de las clulas.
Carbohidratos de la membrana

FIGURA 4-10. Un liposoma. Micrografa electrnica de un liposoma, que es una vescula esfrica cuya pared externa est compuesta de una sola bicapa continua de lpidos que rodea una cmara llena de lquido. Los liposomas se forman al suspender fosfolpidos en solucin acuosa y luego sometiendo la suspensin a sonicacin, lo que provoca que los lpidos se autoensamblen formando esas vesculas cerradas. (Cortesa de Walter Stoeckenius.)

ramifican a travs de las clulas. Gracias a la flexibilidad de la bicapa de lpidos, las membranas son deformables y pueden cambiar toda su forma, como ocurre durante la loco-

Las membranas plasmticas de clulas eucariotas poseen carbohidratos unidos mediante enlaces covalentes a los componentes lpidos y protenicos (fig. 4-4, b). Segn la especie y el tipo de clula, el contenido de carbohidratos de la membrana plasmtica vara entre 2 y 10% del peso. Por ejemplo, la membrana plasmtica del eritrocito, mostrada en la figura 4-1, a, contiene alrededor de 52% de protena, 40% de lpidos y 8% de carbohidratos. Del 8% de carbohidratos, cerca de 7% se une a lpidos mediante enlaces covalentes para formar glucolpidos, y el restante 93% se une a protenas con enlaces covalentes para formar glucoprotenas. Como se indica en la figura 4-4, b, todos los carbohidratos de la membrana plasmtica se enfrentan en el espacio extracelular. Los carbohidratos de las membranas celulares internas tambin suelen alejarse del citosol (la razn de esta orientacin se ilustra en la figura 8-10). En las glucoprotenas, el carbohidrato se presenta como un oligosacrido corto ramificado que en condiciones tpicas posee menos de 15 azcares por cadena. Los azcares

CUADRO 4-3. Propiedades fsicas de las membranas biolgicas y de las bicapas de lpidos simples no modificadas Propiedades Espesor (): Por microscopa electrnica Por difraccin de rayos X Por mtodo ptico Por capacitancia y constante dielctrica Resistencia (Q/cm) Capacitancia (wF/cm2) Potencial de reposo fmV) Voltaje de desintegracin (mV) ndice de refraccin Tensin interfacial (ergios/cm2) Permeabilidad al agua (10~4 cm/seg) Membranas biolgicas 60-130 75-100 30-150 102-105 0.5-1.3 10-90 100 1.6 0.03-3.0 0.25-58
Bicapa

60-90 40-80 40-130 10-10R 0.3-1.3 0-140 100-550 1.56-1.66 0.2-6.0 2.3-24

FUENTE: F. Vandenheuvel, Adv. Lipid Res. 9:173,1971.

CAPITULO 4 Estructura y funcin de la membrana plasmtica

125

--

(a)
FIGURA 4-11. Propiedades dinmicas de la membrana plasmtica, a) El borde delantero de una clula en movimiento casi siempre contiene sitios donde la membrana plasmtica muestra surcos ondulantes, b) La divisin de una clula se acompaa de deformacin de la membrana plasmtica conforme es tirada hacia el centro de la clula. A diferencia de la mayor parte de las clulas en etapa de divisin, el surco de desdoblamiento de este huevo ctenforo en divisin comienza en un polo y se desplaza undireccionalmonte a travs del huevo, c) Las membranas pueden fusionarse con otras membranas. Este espermatozoide se encuentra en el proceso de fusionar su membrana plasmtica con la del vulo, (a: Cortesa de Jean Paul Revel; b: cortesa de Ganj Freeman; c: cortesa de A.L. y L.H. Colivin.)

observados con mayor frecuencia en estas cadenas de carbohidratos se muestran en la figura 4-12, a. El cido silico por lo comn es el azcar terminal de los oligosacridos y confiere carga negativa a las cadenas de carbohidratos. Los oligosacridos pueden unirse a diferentes aminocidos mediante dos tipos principales de ligaduras (fig. 4-12, b). Se piensa que estos carbohidratos ramificados participan en la mediacin de las interacciones de la clua con otras clulas y tambin con su entorno no viviente (esto se analiza en el captulo 7). Todava no se comprenden bien las funciones de los glucolpdos de la membrana, aunque se les pueden asignar ciertas propiedades. Por ejemplo, los carbohidratos de los glucolpidos de la membrana plasmtica de eritrocitos determinan si el grupo sanguneo de una persona es A, B, AB u O. Los determinantes ABO son cadenas cortas ramificadas de oligosacridos (fig1. 4-13). La persona con tipo sanguneo A posee una enzima con una -acetilgalactosamina en el extremo de la cadena, en tanto que una persona con sangre tipo B tiene una enzima que se une a galactosa en la cadena terminal. Las personas con tipo sanguneo AB poseen ambas enzimas, en tanto que las personas con sangre tipo O carecen de enzimas capaces de unirse a cualquier azcar terminal. Tambin se ha demostrado que los glucolpidos participan en ciertas enfermedades infecciosas; la toxina del clera y el virus de la influenza penetran en su clula especfica unindose primero a los ganglisidos de la superficie celular. Si los glucolpidos pueden funcionar como "compuertas" para la entrada de patgenos, tal vez tengan algn tipo de funcin receptora en las clulas normales. En contraste con la mayor parte de los carbohidratos de peso molecular elevado (como glucgeno, almidn o celulosa), los cuales son polmeros de un solo azcar, los oligosacridos unidos a protenas y lpidos de la membra-

na muestran considerable variabilidad estructural. Por consiguiente, estas cadenas de oligosacridos pueden mostrar especificidad en sus propias interacciones y con otros tipos de molculas.
Protenas de la membrana

Segn el tipo de clula y el organelo particular del interior de dicha clula, una membrana puede contener desde una docena hasta ms de 50 protenas diferentes. Estas protenas no se disponen al azar dentro de la membrana, sino que cada una se localiza y orienta en una posicin particular respecto de la bicapa de lpidos. Es digno de notar que todas las protenas de la membrana se sitan asimtricamente de modo que las propiedades de la porcin externa de la membrana son muy diferentes a las de la porcin interna. Como resultado de esta "lateralidad" de la membrana, las protenas de partes de la membrana que interactan con otras clulas o con Hgandos extracelulares, como hormonas o factores de crecimiento, se enfrentan al exterior, en tanto que las protenas de las partes de la membrana que interactan con molculas citoplsmicas, como protenas G o proteincinasas (captulo 15), enfrentan el interior de la clula. Las protenas de la membrana se pueden agrupar en tres tipos distintos segn la intimidad de su relacin con la bicapa de lpidos (fig. 4-14). Estos grupos son: 1. Protenas integrales, que penetran en la bicapa de lpidos. En realidad, prcticamente todas las protenas integrales atraviesan por completo la bicapa de lpidos y por lo tanto tienen dominios que sobresalen en ambos lados de la membrana, el extracelular y el citoplsmico. 2. Protenas perifricas, que se localizan por completo fuera de la bicapa de lpidos, sobre la superficie extracelular o citopsmica, pero todava relacionadas con la

126

CAPITULO 4 Estructura y funcin de la membrana plasmtica FHJL'KA -1-12. Carbohidratos de la membrana, a) Estructura qumica de los azcares predominantes en la membrana, b) Los dos tipos de enlace que unen azcares a una cadena de polipptidos. La unin N-glucosdica entre asparagina y N-acetilglucosamina es ms comn que la unin O-glucosdica entre serina o treonina y N-acetilgalactosamina.

CH2OH

CH2OH

OH

D-glucosa CH2OH

HO
OH H

superficie de la membrana mediante enlaces no covalentes. 3. Protenas ancladas a lpidos, localizadas fuera de la bicapa de lpidos, pero unidas mediante enlaces cova1 en tes a una molcula pida situada dentro de la bicapa.
l-fucosa CH2OH

H
CH2OH

OH

D-galactosa

NH

/V-acetil-D-glucosamina

/V-acetil-D-galactosamina CH2OH CHOH

O H CHOH fi H | ) CH,-C-N

Protenas integrales de la membrana. Igual que los fosfolpidos de la bicapa, las protenas integrales de la membrana tambin son antipticas y presentan porciones hidrfilas e hidrfobas. A diferencia de las protenas solubles del citoplasma, que tienden a presentar un ncleo hidrfobo y una superficie hidrfila (fig. 2-28}, las protenas integrales de la membrana contienen residuos no polares en gran parte de su superficie expuesta. Estas regiones no polares de la protena se integran al interior de la bicapa de ipidos donde pueden sufrir interacciones hidrfobas con cadenas lpidas acilo (fig. 4-14}. La funcin de estos dominios hidrfobos para introducir protenas en la "pared" lpida de la membrana es muy parecida a la de ganchos que pueden introducirse en los orificios de un perchero. El resto de una protena integral se compone principalmente de aminocidos inicos y polares no integrados a la bicapa que sobresa-

OH

(a)

Acido /V-acetilneuramnico (cido silico) Antgeno O

Asparagina

CH2OH

N-C-CH2-CH

H u

L, O

NH

O
H

C=0
H
NHCOCH3
Esqueleto poiipeptfdico

Antgeno A

A/-acetilgucosamina
Serina |X = H)

Treonina |X=CH 3 ]

Antigeno B
CH2OH

NH

0-HCH

H
H NHCOCH3 A/-acetlgalactosamna

c-o

(i')

FIGI'IA -1-13. Antgenos de los grupos sanguneos. El tipo sanguneo de una persona (A, B, AB u O) es determinado por una corta cadena de azcares unidos mediante enlace covalente a lpidos y protenas de la membrana del eritrocito. Aqu se muestran los oligosacridos unidos a los lpidos de la membrana (que forman un gaiiglisido) que producen los tipos sanguneos A, B y O. Una persona con tipo sanguneo AB tiene ganglisidos con ambas estructuras, A yB.

CAPITULO 4 Tres clases de protenas de la membrana, a) Protenas integrales que pueden contener una o ms hlices que atraviesan la membrana, b) Protenas perifricas de la superficie interna de la membrana que mantienen uniones no covalentes con los grupos polares de la bicapa de lpidos o con alguna protena integral de la membrana, c) Protenas ancladas en lpidos, las cuales pueden enlazarse en forma covalente a un fosfolpido o a un cido graso integrado en la bicapa de lpidos.

127

len del borde de la bicapa en uno o ambos lados o forman un canal acuoso a travs de la misma. Estos dominios hidrfilos son las partes de una protena integral que pueden interactuar con sustancias hidrosolubles (iones, sustratos de bajo peso molecular, hormonas y otras protenas) en la superficie de la membrana o dentro de un canal central. Como veremos ms adelante, no es necesario que las protenas integrales sean estructuras fijas, sino ms bien deben tener capacidad para desplazarse lateralmente dentro de la propia membrana. Debido a su superficie hidrfoba, las protenas integraes de la membrana son difciles de extraer y de estudiar. La extraccin de estas protenas de membrana de ordinario se logra con ayuda de un detergente. Los detergentes son compuestos anfipticos (fig. 2-20) con un extremo polar y una cadena no polar de carbohidratos. Gracias a esta estructura, los detergentes pueden sustituir a los fosfolpidos estabilizantes de las protenas integrales en tanto mantienen su solubilidad en solucin acuosa. Una vez que las protenas se solubilizan por accin del detergente, se pueden efectuar varios procedimientos analticos para determinar los aminocidos que componen a la protena, su peso molecular, la secuencia de aminocidos, y algo ms. La orientacin de una protena dentro de la membrana se puede determinar experimentalmente utilizando agentes no penetrantes, como marcadores o modificadores de las protenas. Consideremos lo que ocurre cuando se trata una preparacin de clulas intactas con una enzima proteoltica como la tripsina, demasiado grande para atravesar la membrana plasmtica (fig. 4-15, a, recuadro superior). Las partes de las protenas de membrana situadas en el lado externo de la bicapa de lpidos sern digeridas por la enzima aadida, pero las partes situadas entre la bicapa o en la cara de la membrana enfrentada al citoplasma no sern afectadas. El efecto del tratamiento puede determinarse extrayendo las protenas y sometindolas a electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecilsulfato de sodio (fig. 4-15, b). La protena con parte de su estructura digerida se desplaza a una posicin diferente en el gel cuando se compara con la misma protena de una membrana no tratada. Para determinar si una parte de la protena sobresale de la cara citoplsmica de la membrana se puede incrementar la permeabilidad de las clulas mediante tratamiento con detergentes no inicos o por choque osmtico {fig. 4-31, b). En estas condiciones, la membrana plasmtica ya no acta como barrera para la penetracin de las enzimas proteolticas, de modo que las partes citoplsmicas de la protena tambin sufrirn la digestin enzimtica (parte inferior de la figura 4-15, a,b). Una manera alternativa de predecir la organizacin de una protena integral de membrana es a partir de la secuen-

(b)

(c)

128

CAPITULO 4 * Estructura y funcin de la membrana plasmtica

Clula ( intacta I

Se aade tripsina

Arriba
4 5

i Abajo

Exterior Bicapa de lpidos Interior

I I I

Testigo

I II
i i

Tratamiento de la clula testigo con tripsina

3 2

I I I
il

Tratamiento de la clula permeabilizada con tripsina

II

Clula permeabilizada

Aadir tripsina

(a)
FIGURA 4-15. Procedimiento experimental para determinar la orientacin de las protenas dentro de una membrana plasmtica. La hipottica membrana estudiada contiene cinco protenas distintas, a) Las clulas intactas se tratan con tripsina, una enzima no penetrante, para digerir las partes de la protena proyectadas al medio externo. Por to contrario, si la clula se vuelve permeable (por extraccin con detergentes no inicos o exposicin a un medio hipotnico), las partes de las protenas de membrana proyectadas al interior del citoplasma tambin son accesibles a la digestin proteoltica. b) Esquema de los resultados de la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (EGPADSS) que muestra el patrn de bandas que se obtiene en el experimento descrito en a. La velocidad de migracin de las protenas durante la electroforesis es inversamente proporcional a su peso molecular. Por lo tanto, las protenas a las que se suprime una parte se desplazan con mayor rapidez a travs del gel. Al concluir el expsrirnento, estas protenas estn ms cerca del borde inferior del gel, o sea, recorren una mayor distancia en comparacin con la que hubieran recorrido si no fueran tratadas con la enzima.

ca de aminocidos de dicha protena, que puede deducirse de la secuencia de nucletidos de un gen aislado. En condiciones tpicas se puede predecir que los segmentos de una protena que atraviesan la membrana constan de una cadena de 20 a 25 aminocidos no polares que tal vez formen una hlice alfa. Esta suposicin depende de numerosos estudios, os cuales han demostrado que esos segmentos de protena que atraviesan la bicapa de lpidos, los segmentos transmembrana, de ordinario consisten en aminocidos no polares organizados en conformacin alfa helicoidal. La glucoforina A, principal protena de la membrana plasmtica del eritrocito, es un ejemplo de protena integral con una sola hlice alfa hidrfoba transmembrana {fig. 4-16). Sin embargo, hay una importante excepcin a la rega de las hlices transmembrana predominantemente hidrfobas. Muchas protenas integrales de la membrana contienen un canal acuoso para permitir el paso de iones o de solutos polares a travs de la bicapa de lpidos. Se cree que las paredes de estos canales acuosos contienen: 1) hlices

anfipticas en las cuales una cara de cada hlice consta de aminocidos no polares enfrentados a la bicapa de lpidos, en tanto que la cara opuesta contiene principalmente residuos polares enfrentados al poro (fig. 4-17), o 2) un borde de lminas beta muy similar al barril beta ilustrado en la figura 5-3. Las protenas integrales se pueden clasificar de la siguiente manera: 1. Protenas monotpicas integradas a la bicapa de pidos y expuestas en una sola superficie de la membrana. Estas protenas son raras, si en realidad existen. Se cree que el citocromo b$, una proteina de las membranas citoplsmicas, es una protena monotpica, pero no hay acuerdo unnime. 2. Protenas bitpicas que poseen un segmento dentro de la membrana y por lo tanto la atraviesan una sola vez y estn expuestas en ambos lados de la membrana (fig. 4-16). Esta clase incluye gran variedad de receptores de

CAPITULO 4 Estructura y funcin de la membrana plasmtica

129

Superficie exterior

FIGURA 4-16. Glucoforina A, una protena integral con un solo dominio transmembrana. La hlice a simple que atraviesa la membrana contiene predominantemente residuos hidrfobos. (Los aminocidos de la hlice se muestran con un color codificado segn el carcter de su grupo R, igual que en la figura 2-26.) Se cree que los cuatro aminocidos con carga positiva del dominio citoplsmico de la protena de membrana forman enlaces inicos con grupos cargados negativamente en las cabezas de los lpidos. Los carbohidratos estn unidos a ciertos residuos de aminocidos en la superficie externa de la protena. Todos los oligosacridos, excepto uno, mantienen enlaces O (la excepcin es el oligosacrido unido al residuo de asparagina en la posicin 26). En la pgina 139 se analiza el papel de la glucoforina en la membrana del eritrocito.

Bcapa

Pro ,

Ser 'Lis t Lis 100

ArgiArg

Superficie interior (citoplasma)

(\\eiileu--

la membrana plasmtica que enlazan diferentes ligandos en su superficie externa (p. ej., un factor de crecimiento, un pptido hormona o un antgeno) y transmiten un mensaje a travs de la membrana hacia el citoplasma por medio del segmento que atraviesa dicha membrana (fig. 15-25). 3. Protenas politpicas que poseen ms de un segmento dentro de la membrana y por lo tanto se entrelazan avanzando y retrocediendo a lo largo de la membrana. Esta clase incluye las protenas que forman canales para el paso de iones y solutos a travs de la membrana plasmtica y tambin protenas con otras funciones (p. ej., el receptor para la partcula seal del receptor del retculo endoplsmico, el receptor adrenrgico que se enlaza a la epinefrina, el pigmento fotosensible de los bastoncillos de la retina, y los polipptdos M y L del centro de reaccin fotosinttica de las bacterias, que se muestra en la pgina 115). El centro de reaccin bacteriana contiene protenas integrales cuya disposicin precisa dentro de la membrana fue descrita por primera vez mediante cristalografa de rayos X. Protenas perifricas de la membrana. Las protenas perifricas se unen a la membrana mediante dbiles enlaces electrostticos, sea a grupos hidrfilos de la cabeza de los lpidos o a porciones hidrfilas de las protenas integrales que sobresalen de la bicapa (fig. 4-14). Las protenas perifricas de ordinario se solubilizan mediante extraccin con soluciones acuosas salinas concentradas o pH alcalino, En realidad, la distincin entre protenas integrales y perifricas es incierta, porque muchas protenas de membrana contienen varios polipptidos, algunos de los cuales penetran en la bicapa de lpidos y otros permanecen en la periferia.

Las protenas perifricas mejor estudiadas (principalmente de la familia espectrina) se localizan en la superficie interna de la membrana plasmtica (fig. 4-31). Estas protenas forman una red fibrilar que acta como "esqueleto" flexible para suministrar apoyo mecnico a la membrana cuando se producen cambios rpidos en la morfologa celular y tambin para fijar las protenas integrales de la membrana. Otras protenas perifricas sobre la superficie interna de la membrana funcionan como enzimas o factores transmisores de seales a travs de la membrana. La superficie

FIGURA 4-] 7. Representacin esquemtica de cuatro hlices a originadas como un haz dentro de la membrana. Los crculos pequeos en azul representan cadenas laterales polares (grupos R) asociadas al centro del complejo, en tanto que los pequeos crculos rojos representan residuos no polares relacionados con la bicapa de lpidos que los rodean. Ntese que las cadenas laterales en realidad se proyectan desde el esqueleto en toda lo longitud de cada hlice a diferentes niveles; para representarlos en la figura se reducen a un solo plano.

130

CAPITULO 4 Estructura y funcin de la membrana plasmtica

Exterior

Superficie de fractura E Superficie de fractura P

Sin relieve

Con relieve

Citoplasma

(a)

0.3 om

FIGURA 4-18.Fractura por congelacin: tcnica para investigar la estructura de la membrana celular, a) Cuando se golpea un bloque de tejido congelado con una hoja cortante, el plano de fractura que atraviesa el tejido casi siempre pasa por enmedio de la bicapa de lpidos. El plano de fractura rodea las protenas en vez de romperlas a la mitad y las separa en una de las dos mitades de la bicapa. b) Esta micrografa muestra la superficie de un eritrocito congelado y luego fracturado, pero en vez de preparar una rplica, se dej derretir y el tejido se colore con un marcador para los grupos carbohidratos que sobresalen en la superficie externa de la protena integral glucoforina (fig. 4-16). Se puede observar que la glucoforina al separarse muestra preferencia por la mitad externa de la membrana, (b: Segn Pedro Pinto da Silva y Mara R. Torrisi, ]. Cell Biol. 93:467, 1982; con permiso de Rockefeller University Press.)

extracelular de la membrana plasmtica tambin puede contener protenas perifricas, pero estas protenas estn menos bien definidas. Protenas de membrana ancladas a lpidos. Se distinguen dos tipos de protenas de membrana ancladas a lpidos, segn los tipos de anclaje al lpido y la superficie de la membrana sobre la cual estn expuestos. Varias protenas presentes en la cara externa de la membrana plasmtica se enlazan a sta mediante un oligosacrido corto unido a una molcula de glucofosfatidilinositol (GFI) integrada a la hoja externa de la bicapa de lpidos (fig. 4-14, c). La presencia de estas protenas ancladas al GFI fue descubierta cuando se demostr que ciertas protenas de la membrana podan liberarse mediante una fosfolipasa que reconoca y rompa especficamente a los fosfolpidos que contienen inositol.

FIfl'RA 4 - l < > . Efecto de la tcnica al "aguafuerte" sobre una preparacin de fractura por congelacin, a) En tanto el procedimiento de fractura expone el interior de la membrana (las superficies de fractura E y P, EF y PF), el proceso al aguafuerte expone una parte de las superficies interna y externa de la membrana (superficies E y P, ES y PS). b) Rplica de una parte del eritrocito humano tratado con la tcnica de fractura por congelacin. Se observa que la superficie de fractura P est cubierta con partculas de 8 nm de dimetro, aproximadamente. Un pequeo surco (flecha) marca el sitio ce unin de la superficie cubierta de partculas y el hielo que la rodea, c) Rplica de un eritrocito fracturado por congelacin y cuyo relieve se fij con tcnica al "aguafuerte". Durante el proceso, la sublimacin del hielo expone una superficie lisa (S) claramente demarcada en la superficie interna P de fractura, (a: Segn Pedro Pinto da Silva y Daniel Branton, J. Cell Biol. 45,599, 1970: b-c: segn Tilomas W. Tillack y Vinccnt T. Marchesi, J. Cell Biol. 45:649, 1970; con permiso de Rockefeller University Press,)

CAPITULO 4 Estructura y funcin de la membrana plasmtica

131

Otro grupo de protenas presentes en el lado dtoplnsmico de la membrana plasmtica se encuentra anclado a la membrana mediante largas cadenas de hidrocarburos integradas a la hoja interna de la bicapa de lpidos (fig. 4-14, c). AI menos dos protenas relacionadas en esta forma con la membrana plasmtica (Src y Ras) han sido implicadas en la transformacin de clulas normales a estados malignos.
Distribucin de las protenas integrales: anlisis de fracturas por congelacin y de imgenes por congelacin "al aguafuerte"

El concepto de que las protenas pueden atravesar todo el espesor de la membrana en vez de limitarse simplemente al exterior de la bicapa se origin principalmente de los resultados de una tcnica llamada duplicacin por fractura de muestras congeladas (vase seccin 17-2). En este procedimiento, el tejido se solidifica por congelacin y luego se golpea el bloque congelado con una hoja afilada para fracturarlo en dos pedazos. El plano de fractura se sita con mayor frecuencia entre las dos hojas de la bicapa de lpidos (fig. 4-18). Una vez abierta la membrana en esta forma se depositan metales sobre las superficies expuestas para formar una replica en relieve que puede observarse con el microscopio electrnico. Como se muestra en la figura 4-19, esta rplica parece un camino regado de grandes pedruzcos llamados partculas relacionadas con la membrana. Puesto que el plano de fractura pasa a travs del centro de la bicapa, estas partculas corresponden a protenas integrales de la membrana extendidas cuando menos hasta la mitad del espesor de la capa de lpidos situada en el centro de la membrana. Cuando el plano de fractura alcanza a determinada partcula, la rodea en vez de romperla a la mitad. En consecuencia, cada protena (partcula) se separa unida a una mitad de la membrana plasmtica y deja el correspondiente "hoyuelo" en la otra mitad. En la figura 4-19, a, se muestra la relacin entre fracturas en la cara interna P (protoplsmica] y fracturas en la cara externa E (ectoplsmica). En la figura 4-19, b, se muestra la naturaleza particular de la cara con fracturas P en la membrana del eritrocito humano. La tcnica de fractura por congelacin no slo permite visualizar las protenas integrales de la membrana, sino que tambin se puede modificar para revelar protenas perifricas o partes de las protenas integrales presentes en la superficie de las membranas interna (P) o externa (E). Para examinar las superficies de !a membrana se debe efectuar un paso adicional en el procedimiento antes de cubrir las caras fracturadas con metal (sombreado) para observarlas en el microscopio electrnico. La muestra congelada y fracturada se expone al vaco durante un corto tiempo, durante el cual una delgada capa de hielo de ambas superficies, superior e inferior, de la membrana se evapora sin pasar por el estado lquido (sublimacin) (fig. 4-19, n). Al cubrir esta superficie con el metal se puede observar su textura en la rplica (porcin marcada con S en la figura 4-19, c). Este procedimiento de sublimacin se denomina congelacin al "aguafuerte". El gran valor de las tcnicas de fractura por congelacin y congelacin al "aguafuerte" es que permiten investigar la heterogeneidad microscpica de la membrana. En la rplica aparecen y pueden identificarse diferencias localizadas en partes de la membrana, como se muestra en la figura 4-20

FIGURA 4-20. Distribucin heterognea de las protenas integrales de membrana. Cuando se expone la membrana plasmtica del flagelo de un espermatozoide de mamfero durante fractura por congelacin, se puede observar que contiene una doble fila de partculas denominadas "cierre automtico" (flecha). La tcnica de fractura por congelacin es ideal para revelar este tipo de heterogeneidad microscpica dentro de una membrana. En la figura 4-30 se muestra la distribucin de protenas especficas en la membrana del espermatozoide a una escala mayor. (Cortesa de Daniel 5. Friend.)

de una pequea porcin de! espermatozoide. A diferencia del anlisis bioqumico, las observaciones microscpicas no promedian a todos los individuos de la poblacin, sino que los muestran tal como pueden apreciarse.

4-3 Lpidos y fluidez de la membrana

El estado fsico de los lpidos de una membrana puede describirse por su fluidez (o viscosidad).1 Igual que muchas otras sustancias, los lpidos pueden existir en fase slida cristalina o en fase lquida de viscosidad variable, segn la temperatura. Por ejemplo, consideremos una sencilla bicapa artificial hecha de fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina cuyos cidos grasos son principalmente insaturados. Si la temperatura de la bicapa se mantiene relativamente alta (p. ej., 37C), el lpido existe en estado relativamente fluido,
1 Fluidez y viscosidad guardan relacin inversa; la fluidez es una medida de la facilidad para fluir y viscosidad es la resistencia a fluir,

132

CAPITULO 4 Estructura y fundn de la membrana plasmtica (a) Arriba de la temperatura de transicin (b) Abajo de la temperatura de transicin

FIGURA 4-21. La estructura de la bicapa de lpidos depende de la temperatura. La bicapa aqu mostrada se compone de dos fosfolpidos, fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina. o) Arriba de la temperatura de transicin, las molculas de lpidos y sus extremos hidrfobos tienen libertad de movimiento en ciertas direcciones, aunque retienen un grado de orden considerable, b) Por debajo de la temperatura de transicin el movimiento de las molculas se restringe en forma notable y toda la bicapa puede describirse como un gel cristalino congelado. (Segn R.N, Robsrtson, The Lively Membranes, Cambridge University Press, 1983. Reimpreso con autorizacin de Cambridge ilniversity Press.)

semejante al lquido (fig. 4-21, a). A esta temperatura, la bicapa de lpido se describe mejor como un cristal lquido bidimensional. Igual que en un cristal, las molculas an mantienen una orientacin especfica; en este caso, los ejes longitudinales de las molculas permanecen prcticamente paralelos entre s, pero los fosfolpidos individuales son capaces de girar o desplazarse lateralmente en el plano de la bicapa. Si la temperatura disminuye lentamente, se alcanza un punto donde ocurre un cambio distintivo en la naturaleza de la bicapa (fig. 4-21, b). El lpido pasa de su estado normal semejante a lquido a un gel cristalino "congelado" donde el movimiento de los fosfolpidos est muy restringido. La temperatura a la cual ocurre este cambio se denomina temperatura de transicin. La temperatura de transicin de una bicapa particular depende de los lpidos particulares que la constituyen. El determinante de mayor importancia es el grado de insaturacin de las cadenas acidas acilo de los fosfolpidos, o sea, su contenido en dobles enlaces (especficamente enlaces cis). La temperatura de transicin y la fluidez son determinadas por la capacidad de la molcula para compactarse. Aunque los cidos grasos saturados tienen forma de barras rectas y los cidos grasos cis insaturados presentan incurvaciones en la cadena donde se localizan los dobles enlaces (figs. 2-19

y 4-21), los fosfolpidos con cadenas saturadas pueden compactarse ms firmemente que los que contienen cadenas insaturadas. Cuanto mayor sea el grado de insaturacin de los cidos grasos de la bicapa, menor ser la temperatura necesaria para que la bicapa pase al estado de gel (cuadro 4-4). El lmite dentro del cual los diferentes lpidos cambian de fase es muy amplio. Por ejemplo, se pueden sintetizar varias fosfatidilcolinas y emplearlas para formar bicapas cuya temperatura de transicin vara desde temperaturas menores de 0C hasta mayores de 60C. Las molculas de colesterol alineadas con las cadenas lpidas acilo de los fosfolpidos de la bicapa (fig. 4-7) afectan la fluidez de la membrana al alterar la manera de compactarse de las cadenas de hidrocarburos. Como resultado, el colesterol tiende a evitar temperaturas de transicin bruscas y tambin puede incrementar la estabilidad y disminuir la permeabilidad de la membrana.

Importancia de la fluidez de la membrana Qu papel representa el estado fsico de la bicapa de lpidos en las propiedades biolgicas de la membrana? Al parecer, la fluidez de la membrana corresponde a un compromiso perfecto entre estructura rgida ordenada sin posibilidad de movimientos y lquido no viscoso totalmente fluido en el cual los componentes de la membrana no pueden mantener una orientacin determinada y carecen de oportunidad para organizarse y suministrar apoyo mecnico. La fluidez es importante porque permite que ocurran interacciones dentro de la membrana. Por ejemplo, gracias a la fluidez de la membrana algunas protenas se ensamblan en un sitio particular de la membrana y forman estructuras especializadas como uniones intercelulares, compuestos que captan luz y sinapsis. La transferencia de seales a travs de la

CUADRO 4-4. Punto de fusin de los cidos grasos comunes con funcin lpda en el carbono 18 Acido graso Acido esterico Acido oleico Acido -linolcico Acido Hnolnico Dobles enlaces

0 1
2

70

13 -9
-17

CAPITULO 4 Estructura y funcin de la membrana plasmtica

133

Capa interna Fosfolpidos totales Esfingomielina FIGURA 4-22. Distribucin asimtrica de fosfolpidos en la membrana plasmtica del eritrocito humano. Fosfatidilcolma Fosfatidiletanolamina Fosfatidilserina

Capa externa

50

40

30

20

10 O 10 Porcentaje del total

20

30

40

50

membrana plasmtica requiere de la interaccin de receptores transmembrana que se unen a ligandos sobre la superficie externa de la membrana y estimulan enzimas situadas en la superficie interna de la misma. Debido a la fluidez de la membrana, las molculas que interactan pueden reunirse, efectuar la reaccin necesaria y separarse. La fluidez tambin tiene relacin con el ensamblado de la membrana, tema que analizaremos en la seccin 8-3. Las membranas slo se originan a partir de membranas preexistentes y crecen mediante un proceso que aade componentes lpidos y protenas a la matriz lquida de una hoja membranosa. Muchos de los procesos celulares mas bsicos, incluyendo movimiento celular, crecimiento de la clula y divisin de la misma, formacin de uniones intercelulares, secrecin y endocitosis, dependen de movimientos de los componentes de la membrana y tal vez no seran posibles si la membrana fuera una estructura rgida no fluida. Conservacin de la fluidez de la membrana La temperatura interna de la mayor parte de los organismos (que no sean aves ni mamferos) vara con la temperatura ambiental. Para muchas actividades de la clula es indispensable que la membrana permanezca en estado fluido, por tanto las clulas deben tener capacidad para regular la fluidez de su membrana frente a condiciones variables controlando el tipo de fosfolpidos que las constituyen. La conservacin de la fluidez de la membrana es un ejemplo de homeostasis a nivel celular y puede demostrarse de varias maneras. Por ejemplo, cuando disminuye la temperatura de un cultivo de clulas, stas responden metablicamente. La respuesta inicial de "urgencia" est mediada por enzimas capaces de "remodelar" las membranas y hacer la clula ms resistente al fro. Esta remodelacin se lleva a cabo por desaturacin de enlaces simples en las cadenas lpidas acilo para formar dobles enlaces y reordenamiento (barajeo) de cadenas en las diferentes molculas para formar fosfolpidos con dos cidos grasos insaturados. El reordenamiento se lleva a cabo mediante fosfolipasas, que desdoblan al cido graso del esqueleto glicerol, y aciltransferasas, que los transfieren a fosfolpidos diferentes. Ade-

ms, las clulas cambian el tipo de fosfolpidos que sintetizan en favor de otros que contengan ms cidos grasos insaturados. Como consecuencia de la actividad de estas diferentes enzimas, las propiedades fsicas de una membrana celular coinciden con las condiciones prevalecientes en su entorno. En diversos organismos se ha demostrado la conservacin de fluidez de las membranas mediante ajustes en la composicin de las grasas acilo, incluyendo mamferos en estado de hibernacin, peces que viven en estanques y cuya temperatura corporal cambia notablemente del da a la noche, plantas resistentes al fro y bacterias que viven en aguas termales. Para comprobar que la insaturacin de los cidos grasos contribuye a la tolerancia de bajas temperaturas, se han efectuado experimentos empleando cianobacterias incapaces de efectuar ciertos tipos de desaturacin. Cuando se compara la velocidad de crecimiento de cepas nativas y de las mutantes a 34C, se observa poca diferencia, pero cuando la temperatura desciende a 22C, el tiempo de duplicacin de las clulas mutantes se eleva hasta 59 horas en comparacin con el tiempo de duplicacin de las cepas nativas, que es de 22 horas. Si experimentalmente se introduce en las clulas mutantes el gen que codifica la enzima (des A), se restablece la tolerancia al fro. Asimetra de los lpidos de la membrana La bicapa de lpidos consta de dos hojas distintas y no hay razn para suponer que la composicin de los lpidos en ambas mitades deba ser idntica. De hecho, hay numerosas pruebas que indican que los lpidos de la membrana plasmtica se distribuyen en un patrn muy asimtrico. Una serie de experimentos que han conducido a esta conclusin tiene la ventaja de que las enzimas que digieren lpidos no penetran la membrana plasmtica y, por consiguiente, slo digieren los lpidos que residen en la hoja externa de la bicapa. S se somete un eritrocito humano a la accin de una fosfolipasa que hidroliza fosfoglicridos, casi 70% de la fosfatidilcolina de la membrana se libera en el medio, pero slo se libera 20% de la fosfatidiletanolamina de la membrana y menos de 10% de la fosfatidilserina de dicha

134

CAPITULO 4 Estructura y funcin de a membrana plasmtica

membrana. Estos datos indican que, en comparacin con la hoja interna, la capa externa posee una concentracin desproporcionadamente alta de fosfatidilcolina (y de esfingomielina) y una baja concentracin de fosfatidiletanolamina y de fosfatidilserina (fig. 4-22). De esto se deduce que la bicapa de lpidos puede imaginarse como estructura compuesta de dos monocapas independientes, ms o menos estables, con diferentes propiedades fsicas y qumicas. Dada la asimetra de los fosfolpidos, surge la pregunta: hasta qu grado hay intercambio de fosfolpidos a travs de la bicapa? Mediciones de diferente tipo con fosfolpidos marcados indican que la vida media de una molcula de fosfolpido que permanece fija dentro de una capa, en oposicin a la que se mueve a travs de la otra capa, se mide en horas o das. En contraste, un fosfolpido puede desplazarse lateralmente dentro de la misma capa con bastante facilidad. Se estima que un fosfolpido puede difundir de un extremo al otro de una bacteria en uno o dos segundos. Por lo tanto, de todos los posibles movimientos que puede efectuar un fosfolpido, el paso desde un lado al otro de la membrana (flip-flop) es el ms restringido {fig. 4-23). Este dato no es sorprendente, pues para que eso ocurra, el grupo de la cabeza hidrfila del lpido tendra que pasar a travs de la capa hidrfoba interna de la membrana, lo cual es termo dinmicamente desfavorable. Sin embargo, hay clulas que contienen enzimas, llamad as flipasas, que mueven activamente ciertos fosfolpidos desde una capa de la membrana a la otra. Estas enzimas pueden participar en el establecimiento de la asimetra de los lpidos y tambin revertir la velocidad de los lentos movimientos pasivos que ocurren a travs de la membrana.

4-4 Naturaleza dinmica de la membrana plasmtica

A partir del anlisis previo se deduce que la bicapa de lpidos puede existir en un estado relativamente fluido. La movilidad de las molculas individuales de lpidos dentro de la bicapa de la membrana plasmtica puede observarse directamente uniendo partculas doradas a las Cabezas polares de los lpidos y siguiendo el movimiento de dichas partculas con el microscopio (fig. 4-24). Puesto que los lpidos constituyen la matriz en la cual estn embebidas las protenas integrales de las membranas, el estado fsico de estos lpidos tambin es un importante factor determinante de la movilidad de dichas protenas integrales. La demostracin de que las protenas integrales pueden moverse dentro de la membrana plasmtica fue una de las piedras angulares para formular el modelo de mosaico fluido. Las propiedades dinmicas de las protenas de la membrana se revelan de diferentes maneras.

Difusin ce las protenas de la membrana luego de la fusin celular

La fusin celular es una tcnica para unir dos clulas de diferente tipo o clulas de dos especies distintas y producir una clula con un citoplasma comn y una sola membrana plasmtica continua. La fusin se logra haciendo "pegajosa" la superficie externa de las clulas, de modo que sus membranas plasmticas se adhieran entre s. La fusin celular se puede inducir aadiendo ciertos virus inactivados

(a) Difusin transversa (flip-flop)

(b) Difusin lateral

13.2 seo

K H l ' K A 4-2,'. Movimientos posibles de los fosfolpidos en una membrana, a) El movimiento de un fosfolpido de una capa de la membrana a la otra (denominado "flip-flop") ocurre a una velocidad muy lenta debido a que es necesario desplazar el grupo polar de la cabeza a travs de los cidos grasos situados en el centro de la bicapa. b) Dentro de una capa los fosfolpidos pueden difundir lateralmente con rapidez.

FIGURA 1-2-1. Determinacin experimental de la movilidad de los fosfolpidos dentro de la bicapa de lpidos de la membrana plasmtica. Un pequeo nmero de fosfolpidos de la capa externa de la membrana plasmtica de un fibroblasto viviente fueron marcados con partculas de oro y sus movimientos se siguieron bajo microscopio en una pantalla de video. Pudo demostrarse que los lpidos marcados se mueven al azar dentro de la membrana segn lo indican los rastros trazados sobre la superficie de la clula. La barra representa 3 ftm. (Segn Greta, M. Lee y cois.: }. Cell Biol. 120:28, 1993; con permiso de Rockefeller University Press.)

CAPITULO 4 Estructura y fundn de la membrana plasmtica

135

que se unen a la superficie de la membrana o agregando el compuesto polietilenoglicol. La fusin de las clulas ha desempeado un importante papel en biologa celular y en la actualidad es parte de la tcnica para preparar anticuerpos especficos (seccin 17-13). En los primeros experimentos para demostrar que las protenas de la membrana tenan capacidad de movimiento en el plano de la membrana se emple la fusin celular, y fueron publicados en 1970 por L.D. Frye y Michael Edidin, de la Universidad Johns Hopkins. En estos experimentos se fusionaron clulas de ratn y de humanos, y luego se observ la localizacin de protenas especficas de la membrana plasmtica una vez que las dos membranas se volvieron continuas. Para seguir la distribucin de las protenas de la membrana, de ratn o humanas, en diferentes momentos despus de la fusin se prepararon anticuerpos contra uno u otro tipo de protenas y se unieron mediante enlaces covalentes a colorantes fluorescentes. Los anticuerpos contra protenas de ratn formaron complejos con un colorante que produce fluorescencia verde y los anticuerpos contra protenas humanas con uno que produce fluorescencia roja. Cuando se aadieron los anticuerpos a las clulas fusiona-

das se enlazaron a las protenas humanas o de ratn y pudo determinarse su localizacin bajo microscopio de fluorescencia (fig. 4-25, a). En el momento de la fusin, la membrana plasmtica poda considerarse mitad humana y mitad ratn; o sea, las dos protenas permanecieron separadas en su propio hemisferio (paso 3, fig. 4-25, a,b). Despus de la fusin, conforme transcurri el tiempo, se observ que las protenas de la membrana se desplazan lateralmente dentro de la misma hacia el hemisferio opuesto. Unos 40 minutos despus, las protenas de cada especie estaban distribuidas uniformemente alrededor de toda la membrana celular hbrida (paso 4, fig. 4-25, a). Cuando se efecta el mismo experimento a temperatura ms baja, la viscosidad de la bicapa de lpidos aumenta y la movilidad de las protenas de la membrana disminuye (fig. 4-25, c). Restricciones a la movilidad de las protenas La fusin celular mostr por primera vez las caractersticas dinmicas de las protenas integradas a la membrana, pero hay otras tcnicas ms adecuadas para medir la extensin y velocidad de los movimientos de las protenas. Las tcnicas

Clula humana

Adicin del virus Sendai (fusionante)

40 minutos

Clula de ratn

35

Temperatura de incubacin (C)

FIGURA 4-2,"). Con ayuda de la fusin celular se puede demostrar la movilidad de las protenas de la membrana, a) Diseo de un experimento en el cual se fusionaron clulas humanas y de ratn (pasos 1-2); posteriormente se sigui la distribucin de las protenas de cada clula durante cierto tiempo en los hbridos (pasos 3-4). Las protenas de la membrana de ratn se indican con crculos slidos, las protenas de la membrana humana en crculos abiertos. En los hbridos, las protenas humanas y de ratn se localizaron por su interaccin con anticuerpos fluorescentes rojos y verdes, respectivamente, b) Micrografa que muestra una clula fusionada en la cual las protenas de ratn y humanas an se encuentran en sus respectivos hemisferios (equivalente al hbrido de la parte a, paso 3). c) El efecto de temperatura sobre la difusin de las protenas de la membrana pudo observarse examinando el porcentaje de clulas donde aparecen mezcladas las protenas de las dos especies (que forman un mosaico) 40 minutos despus de la fusin. El porcentaje de clulas mosaico se incrementa de manera brusca cuando la temperatura se eleva a ms de 15C, lo que sugiere que los lpidos sufren una fase de transicin durante la cual pasan del estado de- gel al estado lquido. (b,c; Segn L.D. fnje \j Michael Edidin, ]. Cell Sci. 328:334, 1970; con permiso de Tlie Company of Biologists Lid.)

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CAPITULO 4 Estructura y funcin de la membrana plasmtica

Protenas marcadas con colorantes fluorescentes

Punto de fotosupresin con rayo lser

Recuperacin

(a)
Iluminado

Tiempo

(b)
FIGURA 4-26. Medicin de la velocidad de difusin de las protenas de membrana por recuperacin de la fluorescencia despus de fotoblanqueamiento (RFDF). a) En esta tcnica se marca un componente particular de la membrana con un colorante fluorescente (paso 1). A continuacin se irradia una pequea regin de la superficie para blanquear las molculas del colorante (paso 2) y se mide el tiempo para recuperar la fluorescencia en la regin blanqueada (paso 3). b) La velocidad de recuperacin de la fluorescencia dentro del punto iluminado puede variar dependiendo de la(s) protena(s). Esta velocidad de recuperacin se relaciona con el coeficiente de difusin de la especie fluorescente.

empleadas comnmente son recuperacin de la fluorescencia despus de fotoblanqueamiento (RFDF) y seguimiento de partcula nica (SPT). En la tcnica RFDF (fig. 4-26 a), primero se marcan los componentes de la membrana unindolos a un colorante fluorescente. Las protenas de la membrana pueden marcarse de manera indiscriminada tratando la clula con un colorante inespecfico (p. ej., isotiocianato de fluorescena) que reaccione con todas las molculas de protena expuestas, o alternativamente se puede marcar una protena particular de la membrana empleando sondas especficas, como anticuerpos fluorescentes. Una vez marcadas, las clulas se colocan bajo el microscopio y se irradian individualmente empleando un delgado rayo lser enfocado con gran precisin, el cual blanquea de manera irreversible las molculas fluorescentes que encuentra en su camino y deja un punto circular (tpicamente de 1 m de dimetro) sobre la superficie de la clula desprovista de fluorescencia. Si las protenas marcadas en la membrana son movibles, entonces los movimientos al azar de estas molculas provocan la reaparicin gradual de la fluorescencia en el crculo radiado. La velocidad de recuperacin de la fluorescencia {fig. 4-26, b) suministra una medida directa de la velocidad de difusin (expresada como coeficiente de difusin) de las molculas movibles. El grado de recuperacin de la fluorescencia (expresado como porcentaje de la intensidad original) proporciona una medida del porcentaje de molculas marcadas libres de difundir. La tcnica de recuperacin de la fluorescencia despus de fotoblanqueamiento tiene sus inconvenientes. Se emplea para seguir el movimiento de una extensa poblacin de molculas marcadas conforme difunden a travs de una distancia relativamente grande. Por consiguiente, esta tcnica no puede suministrar informacin acerca del trayecto que siguen las protenas individuales, ni tampoco si una molcula se mueve en una regin restringida (o dominio) dentro de la membrana, pero no sobre una distancia lo bastante grande para entrar al crculo radiado y ser registrada como movible. Para superar estas limitaciones se han desarrollado tcnicas para seguir una sola partcula, en las cuales se marcan protenas de la membrana con sustancias como partculas de oro coloidal (dimetro de 15 a 40 nm), que pueden observarse y seguir individualmente bajo microscopio, de la misma manera que las molculas individuales de lpidos se pudieron seguir en el experimento mostrado en la figura 4-24. La rapidez de difusin de las protenas dentro de una membrana depende de varios factores, incluyendo viscosidad de la matriz lpida a travs de la cual debe desplazarse la protena: cuanto ms fluida la bicapa, mayor la movilidad. Otro factor es la masa de la protena: a mayor peso molecular de la partcula menor ser la velocidad de difusin. Si la movilidad de la protena dependiera estrictamente de estos parmetros fsicos: viscosidad del lpido y tamao de la partcula, podra esperarse que las protenas se desplazaran con coeficientes de difusin cercanos a 10~9 cm2/se8undo (en comparacin con casi 10~8 cm2/segundo para las molculas de lpidos ms pequeas y ms mviles de la bicapa). Sin embargo, cuando se estudian los movimientos de las protenas en una membrana natural median-

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CAPITULO 4 Estructura y funcin de la membrana plasmtica

Protenas marcadas con colorantes fluorescentes

Punto de fotosupresin con rayo lser

Recuperacin

(a)
Iluminado

Tiempo

(b)
FIGURA 4-26. Medicin de la velocidad de difusin de las protenas de membrana por recuperacin de la fluorescencia despus de fotoblanqueamiento (RFDF). a) En esta tcnica se marca un componente particular de la membrana con un colorante fluorescente (paso 1). A continuacin se irradia una pequea regin de la superficie para blanquear las molculas del colorante (paso 2) y se mide el tiempo para recuperar la fluorescencia en la regin blanqueada (paso 3). b) La velocidad de recuperacin de la fluorescencia dentro del punto iluminado puede variar dependiendo de la(s) protena(s). Esta velocidad de recuperacin se relaciona con el coeficiente de difusin de la especie fluorescente.

empleadas comnmente son recuperacin de la fluorescencia despus de fotoblanqueamiento (RFDF) y seguimiento de partcula nica (SPT). En la tcnica RFDF (fig. 4-26 a), primero se marcan los componentes de la membrana unindolos a un colorante fluorescente. Las protenas de la membrana pueden marcarse de manera indiscriminada tratando la clula con un colorante inespecfico (p. ej., isotiocianato de fluorescena) que reaccione con todas las molculas de protena expuestas, o alternativamente se puede marcar una protena particular de la membrana empleando sondas especficas, como anticuerpos fluorescentes. Una vez marcadas, las clulas se colocan bajo el microscopio y se irradian individualmente empleando un delgado rayo lser enfocado con gran precisin, el cual blanquea de manera irreversible las molculas fluorescentes que encuentra en su camino y deja un punto circular (tpicamente de 1 m de dimetro) sobre la superficie de la clula desprovista de fluorescencia. Si las protenas marcadas en la membrana son movibles, entonces los movimientos al azar de estas molculas provocan la reaparicin gradual de la fluorescencia en el crculo radiado. La velocidad de recuperacin de la fluorescencia {fig. 4-26, b) suministra una medida directa de la velocidad de difusin (expresada como coeficiente de difusin) de las molculas movibles. El grado de recuperacin de la fluorescencia (expresado como porcentaje de la intensidad original) proporciona una medida del porcentaje de molculas marcadas libres de difundir. La tcnica de recuperacin de la fluorescencia despus de fotoblanqueamiento tiene sus inconvenientes. Se emplea para seguir el movimiento de una extensa poblacin de molculas marcadas conforme difunden a travs de una distancia relativamente grande. Por consiguiente, esta tcnica no puede suministrar informacin acerca del trayecto que siguen las protenas individuales, ni tampoco si una molcula se mueve en una regin restringida (o dominio) dentro de la membrana, pero no sobre una distancia lo bastante grande para entrar al crculo radiado y ser registrada como movible. Para superar estas limitaciones se han desarrollado tcnicas para seguir una sola partcula, en las cuales se marcan protenas de la membrana con sustancias como partculas de oro coloidal (dimetro de 15 a 40 nm), que pueden observarse y seguir individualmente bajo microscopio, de la misma manera que las molculas individuales de lpidos se pudieron seguir en el experimento mostrado en la figura 4-24. La rapidez de difusin de las protenas dentro de una membrana depende de varios factores, incluyendo viscosidad de la matriz lpida a travs de la cual debe desplazarse la protena: cuanto ms fluida la bicapa, mayor la movilidad. Otro factor es la masa de la protena: a mayor peso molecular de la partcula menor ser la velocidad de difusin. Si la movilidad de la protena dependiera estrictamente de estos parmetros fsicos: viscosidad del lpido y tamao de la partcula, podra esperarse que las protenas se desplazaran con coeficientes de difusin cercanos a 10~9 cm2/se8undo (en comparacin con casi 10~8 cm2/segundo para las molculas de lpidos ms pequeas y ms mviles de la bicapa). Sin embargo, cuando se estudian los movimientos de las protenas en una membrana natural median-

CAPITULO 4 Estructura y funcin de la membrana plasmtica

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te tcnicas RFDF y otras, de ordinario se observa que se mueven con mayor lentitud que la pronosticada antes. Los coeficientes de difusin tpicos para las protenas de la membrana varan de 10~10 a 10"12 cm2/segundo, segn la especie de protena y la membrana. En realidad, cierto porcentaje de las molculas de la protena parecen estar completamente inmviles e incapaces de difusin alguna.
Control de la motilidad de la membrana

Es evidente que las protenas de la membrana no son totalmente libres para moverse al azar en el "mar" lpido, sino que estn sujetas a influencias restrictivas que inhiben su movilidad. Algo de la restriccin puede ser resultado de interacciones en la propia membrana. Por ejemplo, muchas protenas integrales existen como complejos oligomricos (como el centro de reacciones de fotosntesis mostrado en la pgina 115) cuyo peso molecular puede ser muy grande, y en consecuencia su coeficiente de difusin pequeo. Otras veces, las protenas integrales se unen a materiales presentes en la superficie interna o la externa de la membrana. Como se analizar despus, las membranas plasmticas de muchas clulas poseen una cadena fibrilar o "esqueleto" de protenas perifricas situado en su superficie interna. Cierta proporcin de las protenas integrales de la membrana parece estar fija e inmovilizada en el esqueleto de la membrana (fig. 4-31). Aun si las protenas integrales no estuviesen firmemente ancladas, las protenas perifricas de la membrana pueden formar vallas alrededor de ciertas-partes de la membrana y establecer dominios que restringen la distancia que puede recorrer una protena (fig. 4-27). Al seguir la movilidad de protenas individuales se observa la presencia de estas barreras. Los dominios de membrana pueden mantener combinaciones especficas de protenas en estrecha proximidad, lo suficiente para facilitar su interaccin. La movilidad de las protenas integrales tambin puede ser restringida por materiales presentes en la superficie externa de la membrana (fig. 4-28). Esto se demuestra con mayor claridad en experimentos con clulas que poseen genes que codifican protenas de membrana alteradas. Por ejemplo, si mediante manipulaciones se introduce a la clula un gen que codifica un polipptido transmembrana que carece de la porcin que normalmente se proyecta fuera de la membrana, la velocidad de difusin lateral de la protena tante puede ser mucho mayor que su contraparte normal. Este resultado sugiere que el movimiento de una protena transmembrana a travs de la bicapa puede ser ms lento por la presencia de materiales extracelulares que se enredan en la porcin ms externa de la protena.
Dominios de membrana y polaridad celular

FICURA 4-27. Restriccin al movimiento de las protenas de membrana por las protenas perifricas internas. La membrana plasmtica de la clula a menudo contiene un esqueleto en su parte interna que puede restringir el movimiento de una protena integral. La membrana plasmtica del eritrocito aqu mostrada contiene una disposicin de molculas fibrosas de espectrina (vase figura 4-31, d) que puede actuar como valla para restringir el movimiento de las protenas. En este dibujo, las tres protenas (mostradas como crculos y trazos rojos) deben encontrar grietas en la red del esqueleto para desplazarse unos pocos cientos de nanmetros. (Segn M. Edidin, Trends Cell Biol. 2:378, 1992.)

do, la membrana plasmtica apical, que absorbe selectivamente sustancias de la luz del tbulo, posee enzimas diferentes en comparacin con la membrana plasmtica de la superficie lateral, que interacta con clulas epiteliales veci-

Incluso entre membranas que se caracterizan por difusin lateral extensa, hay muchos ejemplos en los cuales se mantiene una organizacin o disposicin particular de las protenas de membrana. Las diferencias topogrficas son particularmente evidentes en clulas de tejidos organizados, donde las diferentes superficies celulares tienen funciones distintas. Por ejemplo, las clulas epiteliales que revisten la pared intestinal o constituyen los microscpicos tbulos del rion son clulas muy polarizadas cuyas diferentes superficies efectan distintas funciones (fig. 4-29). Como resulta-

FIGURA 4-28. Restriccin al movimiento de las protenas de membrana por materiales extracelulares. La superficie externa de la membrana plasmtica contiene varias glucoprotenas y polisacridos extracelulares que pueden impedir el movimiento de las protenas integrales de la membrana al enredarse en el dominio extracelular de la protena.

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CAPITULO 4 Estructura y fundn de la membrana plasmtica

Glucosa Membrana plasmtica apical regulacin de la captacin de nutrientes y agua secrecin regulada proteccin

Membrana plasmtica lateral contacto y adherencia de la clula comunicacin celular

FIGURA 4-29.Dif erentes funciones de la membrana plasmtica de una clula epitelial, a) La superficie apical de esta clula epitelial del intestino contiene protenas integrales cuya funcin se relaciona con transporte de iones e hidrlisis de disacridos, como sacarosa y lactosa; la superficie lateral contiene protenas integrales funcionalmente relacionadas con interacciones entre las clulas; y la superficie basa! contiene protenas integrales que participan en la unin de la clula con la membrana basal subyacente, b) Micrografa electrnica que muestra la localizacin de las enzimas que separan sacarosa (invertina) en las microvellosidades de la clula epitelial intestinal. La localizacin de la enzima se manifiesta por la presencia de anticuerpos marcados dirigidos contra la misma. (b: Cortesa de J.A.M. Fransen y cois. J. Cell Biol. 115:50, 1991; con permiso de Rockefeller University Press.)

Membrana basal contacto de la clula con el sustrato generacin de gradientes inicos

(a)
entre las sinapsis (fig. 4-49) y los receptores para lipoproteas de baja densidad se concentran en placas de la membrana plasmtica especializada para facilitar su penetracin al interior (vase seccin 8-7). De los diferentes tipos de clulas de mamfero, los espermatozoides tienen la estructura ms altamente diferenciada. Un espermatozoide maduro se puede dividir en cabeza, cuerpo o pieza central y cola, cada uno con su propia funcin especializada. Aunque dividido en varias partes distintas, el espermatozoide est cubierto por una membrana plasmtica continua que, segn han revelado numerosas tcnicas, consta de un mosaico de diferentes tipos de dominios localizados. Por ejemplo, cuando el espermatozoide es tratado con varios anticuerpos especficos, cada anticuerpo se combina con la superficie de la clula en un patrn topogrfico nico que refleja la distribucin nica del antgeno particular en la membrana plasmtica (fig- 4-30).

Membrana plasmtica de los eritrocitos

De todos los diferentes tipos de membrana, la membrana plasmtica del eritrocito humano (glbulo rojo) es la ms estudiada y mejor comprendida (fig. 4-31, a). Hay varias razones para la popularidad de esta membrana. Las clulas son poco costosas y rpidamente disponibles en cantidades enormes a partir de sangre completa. Ya se encuentran aisladas como clulas nicas y no es necesario disociarlas de un tejido complejo. Las clulas son extremadamente simples en comparacin con otros tipos de ellas, carecen por completo de membranas nuclear y citoplsmica, que inevi-

(b)

0.5 pm

as o de la superficie basal que se adhiere a un sustrato extracelular subyacente (membrana basal) y cuya funcin es intercambiar sustancias con el torrente sanguneo. En otros ejemplos, los receptores para neurotransmisores se concentran en regiones de la membrana plasmtica localizadas

CAPITULO 4 Estructura y funcin de la membrana plasmtica

139

FIGURA 4-30. Diferenciacin de la membrana plasmtica del espermatozoide de mamfero segn puede observarse con la tcnica de anticuerpos fluorescentes, n-c) Tres pares de fotografas, cada una mostrando la distribucin de un antgcno particular en la superficie de la clula revelada por el enlace a un anticuerpo fluorescente. Los tres antgenos se localizan en diferentes porciones de la membrana del espermatozoide. Cada par de fotografas muestra el patrn de fluorescencia del anticuerpo enlazado y una micrografa de la misma clula con contraste de fases, d) Diagrama que resume la distribucin de antgenos. (a-c: Segn Diana Cola Myles, Pan! Pnmakoffy Anthony R. Bellv, Cell 23:434, 1981: con permiso de Ce!! Press.)

Parte anterior de la cabeza Parte posterior de la cabeza

Parte posterior de la cola

tablemente contaminan las membranas plasmticas preparadas a partir de otras clulas. Adems, se puede obtener la membrana plasmtica purificada intacta del eritrocito colocando simplemente las clulas en solucin salina diluida (hipertnica). Las clulas responden a este choque osmtico captando agua e hinchndose, fenmeno denominado hemolisis. Conforme aumenta la superficie celular, su contenido, compuesto casi en su totalidad por hemoglobina disuelta, fluye hacia afuera de la clula y deja un "fantasma" de la membrana plasmtica intacta (fig. 4-31, b). Una vez aislada la membrana plasmtica del eritrocito se pueden solubilizar y separar (fraccionar) las protenas para tener una mejor idea de su diversidad dentro de la membrana. El fraccionamiento de las protenas de membrana se efecta mejor empleando electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia del detergente inico dodecilsulfato de sodio (DSS). (En la seccin 17-7 se estudia la tcnica DSS-EGPA.) El DSS mantiene soluble la protena integral y adems aade gran nmero de cargas negativas a las protenas con las que se une. Aunque el nmero de molculas DSS por unidad de peso de protena tiende a ser relativamente constante, las molculas se separan segn su propio peso molecular. Las protenas de mayor tamao se desplazan ms lentamente a travs del tamiz molecular del gel. Cuando se aplica la tcnica DSS-EGPA, las principales protenas de la membrana del eritrocito se separan en casi una docena de bandas (fig. 4-31, c). Un examen ms detenido de la membrana plasmtica del eritrocito ilustrar los tipos de funciones que pueden desempear estas protenas. Entre ellas se encuentran varias enzimas {incluyendo gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa, una enzima necesaria para producir energa duran-

te la gluclisis), protenas de transporte (para iones, aminocidos y azcares) y protenas esquelticas (p. ej., espectrina). Las diferentes protenas de la membrana plasmtica del eritrocito se pueden correlacionar con el papel de estas clulas en el transporte de oxgeno y de dixido de carbono y con la resistencia fsica que estas clulas encuentran durante su circulacin a travs del cuerpo.
Protenas integrales de la membrana del eritrocito

En la figura 4-31, d, se muestra un modelo de membrana plasmtica del eritrocito y sus principales protenas. La membrana contiene dos protenas integrales principales; ambas son protenas que rodean a la membrana y que contienen carbohidratos, denominadas banda 3 y glucoforina A. La banda 3, que ocurre como dmero compuesto de dos subunidades idnticas, rodea a la membrana cuando menos una docena de veces y contiene una cantidad relativamente pequea de carbohidratos (6 a 8% del peso de la molcula). La banda 3 desempea una funcin en el movimiento de aniones. Conforme la sangre circula a travs de los tejidos, el dixido de carbono se disuelve en el lquido del torrente sanguneo (plasma) y luego se disocia segn la reaccin H2O -t- C02 - H2CO3 H+ Los iones bicarbonato (HCC>3~) penetran a los eritrocitos intercambindose por iones cloro, los cuales salen de la clula. En los pulmones, donde se libera dixido de carbono, ocurre la reaccin inversa y los iones bicarbonato abandonan el eritrocito intercambindose por iones cloro. El movimiento recproco de HCOs" y CI~ ocurre a travs de un canal situado en el centro de cada dmero de la banda 3.

140

CAPITULO 4 Estructura y funcin de la membrana plasmtica

PERIFRICA

INTEGRAL Mayor Menor

Espectrina Anquirina Banda 4.1 Banda 4.2 ATPasa Banda 3 AChe Glucoforina A

Actina G3PD Banda 7

(c)
Espectrina a

Banda 3

Glucoforina A

(d)
FIGURA 4-31. Membrana plasmtica del eritrocito humano, a) Gammagrafa electrnica de eritrocitos humanos, b) Micrografa de la membrana plasmtica de fantasmas de eritrocitos que fueron aislados al permitir que el eritrocito se hinchara y sufriera hemolisis, segn se describe en el texto, c) Resultado de la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (EGPA-DSS) empleada para fraccionar protenas de la membrana eritroctica, identificadas en el lado correspondiente al gel. El gel se tino con azul Coumassie para protenas, d) Modelo de membrana plasmtica del eritrocito vista desde la superficie interna que muestra las protenas integrales embebidas en la bicapa de lpidos y la disposicin de las protenas perifricas que constituyen el esqueleto interno de la membrana, c) Micrografa electrnica que muestra la disposicin de las protenas del esqueleto interno de la membrana (Ep - espectrina). (a: Segn Francois M.M. Morel, Richard F. Baker y Harold Wayland, J. Cell Biol. 48:91, 1971; b: cortesa de Josep/i F. Hoffmnn; c: rcpoducidn, con permiso, ce V.T. Marchesi, H. Furthmayr y M. Tomta, Ann. Rev. Biochem., vol. 45, 1976 por Annunl Reviews Inc; e: segn Shih-Chun Liu, Laura H. Dcrick y iri Pnlck, ]. Cell Biol. 104:527, 1987; con permiso de Rockefeller University Press.)

CAPITULO 4 Estructura y funcin de la membrana plasmtica

141

La glucoforna A fue la primera protena de membrana en la que se determin la secuencia de aminocidos. En la figura 4-16 se presenta la disposicin de la cadena de polipptidos de la glucoforina A en la membrana plasmtica. (Tambin se presentan otras tres glucoforinas relacionadas, B, C y D, presentes en la membrana en concentracin mucho menor.) A diferencia de la banda 3, la glucoforina A rodea la membrana slo una vez y contiene una porcin muy amplia de carbohidrato que consta de 16 cadenas de oligosacridos que en conjunto constituyen casi 60% del peso de la molcula. Se cree que la funcin primaria de las glucoforinas se deriva del gran nmero de cargas negativas que se originan en los extremos de sus cadenas de carbohidratos. Debido a estas cargas, los eritrocitos se repelen entre s, evitando la formacin de grumos conforme los eritrocitos circulan a travs de los vasos de menor calibre. Es digno de mencionar que las personas que carecen de las glucoforinas A y B en sus eritrocitos no muestran efectos patolgicos por su ausencia, pero las protenas de la banda 3 estn ms intensamente glucosiladas, lo que al parecer compensa la ausencia de cargas negativas necesarias para evitar la interaccin de clula a clula.
El esqueleto de la membrana del eritrocito

lidad necesarias para efectuar la funcin que se le demanda. Cuando se descubri por primera vez el esqueleto de la membrana del eritrocito se pens que era una estructura nica adecuada para la forma y necesidades mecnicas nicas de este tipo de clula. Sin embargo, conforme se examinaron otras clulas se observaron esqueletos de membrana de tipo similar que contenan miembros de la familia de la espectrina y la anquirina, lo que indica que el esqueleto interno de la membrana es una estructura ampliamente distribuida.

4-5 Movimiento de sustancias a travs de membranas celulares

Puesto que el contenido de una clula est rodeado en toda su extensin por la membrana plasmtica, toda comunicacin entre la clula y el medio extracelular debe ser a travs de esta estructura. En cierto sentido, la membrana plasmtica tiene doble "responsabilidad". Por un lado, debe retener los materiales disueltos dentro de la clula, de modo que no salgan de la misma por simple escurrimiento hacia el medio; por otra parte, debe permitir el intercambio necesario de materiales hacia adentro y afuera de las clulas. La bicapa de lpidos de la membrana es ideal para prevenir la prdida de solutos polares con carga elctrica de una clula, pero deben tenerse algunas precauciones en relacin con el ingreso de nutrientes y la salida de productos de desperdicio que pudieran ser bloqueados por la bicapa de pidos relativamente impermeable. Como se describir ms adelante, la membrana plasmtica es una barrera con permeabilidad selectiva; es decir, no es igualmente permeable a todo tipo de solutos. Esta selectividad permite que la concentracin de sustancias dentro de las clulas sea notablemente diferente de su concentracin en el exterior, condicin necesaria para la vida de una clula. Para entender la naturaleza selectivamente permeable de la membrana plasmtica es necesario considerar cmo atraviesan esta estructura las molculas individuales. Bsicamente hay dos medios para dicho movimiento: por difusin pasiva o por algn tipo de transporte activo acoplado a energa. Ambos tipos de movimiento pueden producir flujo neto de un ion o compuesto particular. El trmino flujo neto indica que el movimiento de la sustancia al interior de la clula (flujo interno) y hacia afuera de la misma (flujo externo) no est en equilibrio, sino que ms bien uno excede al otro. Se conocen varios procesos mediante los cuales se desplazan sustancias a travs de las membranas: difusin simple a travs de la bicapa de lpidos; difusin simple a travs de un canal acuoso revestido de protena; difusin facilitada, y transporte activo (fig. 4-32). Consideraremos cada uno por separado, pero primero analizaremos la energtica del movimiento de solutos.

Las protena perifricas de la membrana del eritrocito se localizan en su superficie interna y constituyen el esqueleto fibrilar de la membrana ffig. 4-31, d,e) que acta para mantener la forma del eritrocito y restringir el movimiento de las protenas integrales de la membrana. El principal componente del esqueleto es la espectrina, una protena fibrosa flexible de casi 100 nm de longitud compuesta de dos subunidades: una a y una b enrolladas una sobre la otra. En su estado nativo dentro de la membrana, dos molculas (cuatro subunidades) de espectrina se encuentran enlazadas cabeza con cabeza para formar un filamento de 200 nm. La espectrina se fija a la superficie interna de la membrana por medio de enlaces no covalentes a otra protena perifrica, la anquirina (esferas verdes de la figura 4-31, d), que a su vez se une por enlaces no covalentes a la porcin citoplsmica de una molcula de la banda 3. Las porciones correspondientes a la cola de las molculas de espectrina se unen entre s en disposicin pentagonal o hexagonal mediante una batera de protenas, incluyendo las protenas actna y tropomiosina, que en condiciones tpicas participan en actividades contrctiles. Numerosas enfermedades genticas caracterizadas por eritrocitos frgiles de forma anormal se atribuyen a mutaciones que alteran la estructura y funcin de la anquirina o de la espectrina. Cuando se retiran las protenas perifricas de los fantasmas de eritrocitos, las membranas se fragmentan y forman vesculas pequeas, lo que ndica que la red interna de protenas es necesaria para mantener la integridad de la membrana. Los eritrocitos son clulas circulantes que sufren considerable presin a! atravesar los microscpicos capilares cuyo dimetro es mucho menor que el de los propios eritrocitos. Para atravesar estas vas tan estrechas, y tener que hacerlo todos los das, el eritrocito debe ser muy deformable, durable y capaz de resistir fuerzas de corte que tienden a desintegrarlo. Se piensa que la red de espectrina y actina confiere a la clula la resistencia, rigidez y plegabi-

Energtica del movimiento de solutos

Difusin es un proceso espontneo mediante el cual una sustancia se desplaza desde una regin de concentracin

142

CAPITULO 4 Estructura y fundn de la membrana plasmtica Pasivo No mediado Activo Mediado por transportadores

FIGURA -1-32. Cuatro mecanismos bsicos para el desplazamiento de molculas de soluto a travs de membranas. El tamao relativo de las letras ndica la direccin de los gradientes de concentracin, a) Difusin simple a travs de la bicapa, la cual siempre procede de los sitios de mayor a menor concentracin, b) Difusin simple a travs de un canal acuoso formado dentro de una protena integral de membrana o un agrupamiento de dichas protenas. Igual que en a, el movimiento siempre es a favor del gradiente de concentracin, c) Difusin facilitada en la cual las molculas de soluto se enlazan especficamente a una protena transportadora de la membrana, pero igual que en a y b, el movimiento siempre es desde el punto de mayor al de menor concentracin, d) Transporte activo mediante una protena transportadora con un sitio especfico de enlace que sufre cambios de afinidad gracias a la energa liberada por un proceso exergnico, como la hidrlisis del ATP. El movimiento ocurre contra un gradiente de concentracin.

elevada a una regin de menor concentracin, y que por ltimo elimina la diferencia de concentracin entre las dos regiones. Como se analiz en la pgina 80 de captulo 3, la difusin depende del movimiento al azar de solutos y es un proceso exergnico debido al incremento de entropa representado por la distribucin al azar de las molculas. El siguiente anlisis se restringe a la difusin de sustancias a travs de membranas. El cambio de energa libre que ocurre cuando un soluto difunde a travs de una membrana depende de la magnitud del gradiente de concentracin, o sea, la diferencia de concentracin entre los dos compartimientos situados a cada lado de la membrana. Si el soluto no es un electrlito {partcula sin carga elctrica), se observa la siguiente relacin para el movimiento de una sustancia al interior de la clula:
AG = RT ln-

Si la proporcin entre [QJ/[C0] es menor de 1.0, entonces el log de la proporcin es negativo, AG es negativo y la entrada neta de soluto es termo dinmicamente favorecida (exergnica). Por ejemplo, si la concentracin externa de soluto equivale a 10 veces la concentracin interna, AG - -1.4kca!/rnol. Por lo tanto, mantener una concentracin 10 veces mayor de un lado es igual a almacenar 1.4 kcal/ mol. Conforme el soluto se desplaza al interior de la clula, el gradiente de concentracin disminuye y AG se reduce hasta que en el equilibrio se convierte en cero. Para calcular AG del movimiento de un soluto hacia afuera de la clula, el trmino correspondiente a la proporcin entre las concentraciones se convierte en [C0]/[Q]. Si el soluto es un electrlito fua especie con carga neta), tambin se debe considerar la diferencia total de carga entre los dos compartimientos. Como resultado de la mutua repulsin entre iones con carga semejante, para un electrlito es termodinmicamente desfavorable desplazarse de un compartimiento a otro a travs de una membrana con carga total del mismo signo. A la inversa, si la carga del electrlito es de signo opuesto a la del compartimiento hacia el cual se desplaza, el proceso es termodinmicamente favorecido. Cuanto mayor sea la diferencia de carga (diferencia de potencial o voltaje) entre los dos compartimientos, mayor ser la diferencia de energa libre. Por lo tanto, la capacidad de un electrlito para difundir de un compartimiento a otro depende de dos gradientes: un gradiente qumico determinado por la diferencia de concentracin de la sustancia entre los dos compartimientos y un gradiente de potencial elctrico determinado por la diferencia de cargas. Estas diferencias en conjunto se combinan para formar un gradiente electroqumico. La diferencia de energa libre para la difusin de un electrlito al interior de la clula es AG = R T I n + zFAEm

AG = 2.303 RT Iog10 [Q]

[c0;

donde z es la valencia del soluto, F es la constante de Faraday (23.06 kcal/V equivalente, donde un equivalente es la cantidad de electrlitos que posee un mol de carga), y AEm es la diferencia de potencial (en voltios) entre los dos compartimientos. La interrelacin entre diferencias de concentracin y de potencial se observa en la difusin de iones potasio (K + ) hacia afuera de la clula. La salida del ion es favorecida por el gradiente de concentracin de K + , que corresponde a una mayor concentracin de K + dentro de la clula, pero impedida por el gradiente elctrico que representa una carga elctrica negativa en el interior de la clula con relacin al exterior. Analizaremos este tema en detalle cuando se consideren los potenciales de membrana y los impulsos nerviosos, en la pgina 154. Difusin de sustancias a travs de membranas Un no electrlito debe satisfacer dos condiciones para difundir al interior de una clula a travs de la membrana plasmtica. La sustancia debe estar presente en concentracin ms elevada fuera de la clula y la membrana debe ser

donde AG es la diferencia de energa libre (seccin 3-1), R es la constante de los gases, T es la temperatura absoluta y [Q]/[C0] es la relacin entre las concentraciones del soluto en las superficies interna (i) y externa (o) de la membrana. A 25C, \r i AG = 1.4 kcal/mol-logK) [C0] (para los valores RT vase pg. 84)

CAPITULO 4 Estructura y fundn de la membrana plasmtica

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permeable a la sustancia. Una membrana puede ser permeable a un soluto determinado: 1) porque el soluto pasa directamente a travs de la bicapa de lpidos, o 2) porque dicho soluto es capaz de atravesar un poro acuoso situado en el espesor de la membrana que impide el contacto del soluto con las molculas lpidas de la bicapa. Consideraremos primero la ruta en la cual una sustancia se disuelve en la bicapa de lpidos para atravesar la membrana. El anlisis de esta ruta obliga a considerar la polaridad de un soluto. Una medida simple de la polaridad (o no polaridad) de una sustancia es su coeficiente de particin, o sea la proporcin entre su solubilidad en aceite y su solubilidad en agua. El coeficiente de particin para un compuesto se mide disolviendo la sustancia en aceite y en agua por separado, mezclando luego los dos solventes inmiscibles con la sustancia disuelta y agitndolos, lo que permite que se separen en dos fases y se mida la concentracin del soluto en cada fase. El coeficiente de particin es la concentracin en aceite dividida entre la concentracin en agua. La importancia de la liposolubilidad para la permeabilidad se muestra en el cuadro 4-5, donde se compara la penetracin de una serie de alcoholes con coeficiente de particin decreciente a travs de la membrana del eritrocito. La figura 4-33 muestra la relacin entre coeficiente de particin y permeabilidad para algunos compuestos. Es evidente que a mayor liposolubilidad la penetracin es ms rpida. A finales del siglo XIX, observaciones de este tipo suministraron el primer indicio de que la frontera externa de la clula poda contener una capa de lpidos. Otro factor que determina la velocidad de penetracin de un compuesto a travs de una membrana es su tamao. Si dos molculas tienen coeficientes de particin aproximadamente iguales, las molculas de menor tamao tienden a penetrar en la bicapa de lpidos de una membrana con mayor rapidez en comparacin con la molcula ms grande. Molculas sin carga y muy pequeas penetran rpidamente a travs de las membranas celulares. Por consiguiente, las membranas son muy permeables a molculas inorgnicas pequeas, como C>2, C2, NO y ttjO, que parecen deslizarse entre fosfolpidos adyacentes. En contraste, molculas polares ms grandes, como azcares, aminocidos e intermediarios fosforilados, muestran poca penetrabilidad en la membrana. Por consiguiente, la bicapa de lpidos de la membrana plasmtica suministra una eficaz barrera que evita la difusin de estos metabolitos esenciales hacia el exterior de la clula. Puesto
CUADRO 4-5. Relacin entre coeficiente de particin y tasa de penetracin de una sustancia Coeficiente de particin (xlO 2 ) Alcohol metlico Glicerol etil ter Propilenglicol Glicerol metil ter Etilenglicol Glicerol Eritritol Tasa relativa

10E u

o.

io-3
io-

lo-4

io-3

io-2

lo-1

Coeficiente de particin FIGURA 4-33. Determinacin de la relacin entre el coeficiente de particin y la permeabilidad. El coeficiente de particin se expresa como la solubilidad de un soluto en aceite y la solubilidad en agua. La permeabilidad se expresa como penetrancia (P) en cm/hora. Los valores se obtuvieron al estudiar la penetracin de solutos en clulas del alga Chara. El tamao de los crculos suministra una medida relativa del peso molecular del compuesto. Es evidente la notable importancia de la solubilidad de lpidos.

que algunas de estas molculas (p. ej., azcares y aminocidos) deben entrar a las clulas procedentes del torrente sanguneo, al parecer no lo hacen por simple difusin. En vez de eso deben disponer de mecanismos especiales para penetrar a travs de la membrana plasmtica. Estos mecanismos permiten a una clula controlar el movimiento de sustancias a travs de la barrera situada en su superficie. Posteriormente volveremos a esta caracterstica de las membranas.
Difusin de agua a travs de las membranas

0.78 0.74 0.57 0.26 0.049 0.007 0.003

0.99 0.077 0.087 0.043 0.043 0.00074 0.000046

Las molculas de agua se desplazan con mucha mayor rapidez a travs de una membrana celular que los iones y pequeos solutos polares comnmente presentes en las clulas, los cuales son casi impenetrables. Debido a esta diferencia de penetrabilidad del agua en comparacin con solutos se dice que las membranas son semipermeables. El agua se mueve rpidamente a travs de una membrana semipermeable desde una regin de baja concentracin hasta otra de alta de concentracin de soluto. Este proceso se denomina osmosis y puede demostrarse fcilmente colocando la clula en una solucin con una concentracin de soluto diferente de la presente en el interior de la propia clula. , Cuando una membrana semipermeable separa dos compartimientos con concentracin diferente de un soluto, se dice que el compartimiento de concentracin ms alta es hipertnico (o hiperosmtico) en relacin con el compartimiento de concentracin ms baja de soluto, que se describe como hipotnico (o hiposmtico). Si se coloca una clula en una solucin hipotnica, la clula gana agua con rapidez por osmosis y se hincha (fig. 4-34, a). A la inversa, una clula colocada en una solucin hipertnica rpidamente pierde agua por osmosis y se encoge (fig. 4-34, b). A partir de estas sencillas observaciones es evidente que el control

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CAPITULO 4 Estructura y funcin de la membrana plasmtica (b) Solucin hipertnica (c) Solucin isotnica

(a) Solucin hipertnica

FIGURA 4-34. Efectos de la diferencia de concentracin de solutos en lados opuestos de la membrana plasmtica, a) Una clula colocada en solucin hipotnica (con menor concentracin de soluto que la clula) se hincha debido a ganancia neta de agua por osmosis. b) Una clula en solucin hipertnica se encoge debido a prdida neta de agua por osmosis. c) Una clula colocada en solucin isotnica mantiene un volumen constante debido a que el flujo de agua por osmosis es igual al interior que al exterior. Ganancia neta de agua Las clulas se hinchan Prdida neta de agua Las clulas se encogen No hay prdida ni ganancia netas

del volumen celular depende sobre todo de la relacin entre concentracin de solutos en el interior de la clula en comparacin con la concentracin en el medio extracelular. La mayor parte de las clulas mantienen un volumen apropiado al desplazar iones hacia adentro y afuera de la clula hasta que la concentracin interna del soluto (incluyendo una concentracin elevada de protenas disueltas) sea igual a la concentracin del soluto externo. En estas condiciones, los lquidos interno y externo son isotnicos (isosmticos) y no hay movimiento neto de agua hacia adentro o afuera de la clula (fig. 4-34, c). La osmosis es un factor importante para numerosas funciones del cuerpo. Por ejemplo, el tubo digestivo secreta varios litros de lquido que se reabsorbe osmticamente en las clulas que revisten el intestino. Si este proceso de reabsorcin no ocurre, como en el caso de la diarrea intensa, se corre el riesgo de una rpida deshidratacin. Las plantas aprovechan la osmosis de diferentes maneras. Cuando una clula vegetal permanece en una solucin hipotnica, gana agua y se hincha, igual que una clula animal. La clula animal finalmente estalla en el medio hipotnico, pero la clula vegetal, que posee una pared celular externa rgida, alcanza un volumen mximo y en vez de estallar genera presin interna (turgencia) aplicada contra la pared que la rodea (fig. 4-35, u). Si la clula vegetal se coloca en un medio hipertnico, su volumen disminuye conforme la membrana plasmtica tira de la pared celular que la rodea, proceso conocido como plasmlisis ffig. 4-35, b}. La presin desarrollada gracias al fenmeno de la turgencia suministra apoyo a las plantas no leosas y a ciertas partes de las plantas leosas, como las hojas. La prdida de agua por osmosis hace que las plantas pierdan turgencia y se marchiten.
Difusin de iones a travs de las membranas

cias hacia el espacio extracelular, contraccin muscular, regulacin del volumen celular y abertura de los poros de los estomas situados en las hojas de la planta. Hace ms de 40 aos, Alan Hodgkin, Bernard Katz y Andrew Huxley, tres fisilogos ingleses, trabajando con un axn gigante de clulas nerviosas de calamar, propusieron por primera vez que las membranas celulares contenan canales inicos permeables a iones especficos. En la actualidad, los bilogos han identificado un sorprendente nmero de canales inicos, cada uno formado por protenas integrales de la membrana que rodean un poro acuoso. La mayor parte de los canales inicos son sumamente selectivos y slo permiten el paso de un tipo particular de ion. Igual que en la difusin de otros tipos de solutos a travs de membranas, la difusin de iones por un canal siempre es "cuesta abajo", o sea, desde un estado de mayor energa a otro de menor energa (pg. 80, cap. 3). Los canales inicos son bidireccionales, permiten el paso de iones en ambas direcciones y el flujo neto del ion depende del gradiente electroqumico. Nuestra comprensin de la estructura y la operacin de los canales inicos se ha desarrollado ms en aos recientes gracias al gran avance tecnolgico, que incluye: Aislamiento y clonacin de genes que codifican las protenas que constituyen los canales. Deduccin de la secuencia de aminocidos de las protenas codificadas y prediccin subsecuente por computadora de la forma de organizacin de estas protenas dentro de una membrana. Alteracin por mutagnesis dirigida a un sitio de la secuencia de nucletidos en el gen para producir un polipptido selectivamente alterado cuyas propiedades se pueden someter a prueba. Aislamiento de estas protenas y reconstitucin de las mismas dentro de liposomas donde su actividad pueda estudiarse aislada de otras protenas de la membrana. Inyeccin de genes (o de los correspondientes RNA mensajeros) que codifican para las protenas del canal a clulas extraas, como oocitos de anfibios, donde las protenas se sintetizan e integran a la membrana plas-

La bicapa de lpidos que forma el centro de las membranas biolgicas es muy permeable a sustancias con carga elctrica, incluyendo iones pequeos como Na + , K + , Ca2+ y Cl~. Incluso el movimiento (conductancia) de estos iones a travs de las membranas desempea un papel crtico en mltiples actividades celulares, que comprenden generacin y propagacin de impulsos nerviosos, secrecin de sustan-

CAPITULO 4 Estructura y funcin de la membrana plasmtica

145

HIPOTONICO: presin normal de turgencia

organismos tan diversos como bacterias, plantas y animales, s observa que todos los canales inicos pertenecen a un pequeo nmero de superfamilias gigantes. Aunque los miembros de una superfamila dada pueden mostrar selectividad muy diferente para cada ion, todas muestran bastante similitud en la secuencia de aminocidos y estructura total al indicar que provienen de una sola protena que alguna vez estuvo presente en un ancestro comn que existi hace miles de millones de aos. La mayor parte de estos canales inicos que se han identificado pueden tener conformacin abierta o cerrada; se dice que estos canales son las compuertas. El cambio de conformacin cerrada a abierta, o sea, la abertura de la compuerta, puede ser inducida por varios factores, que dependen del canal en particular. Se han identificado dos categoras principales: 1. Canales operados por voltaje cuyo estado de conformacin depende de la diferencia de carga inica en ambos lados de la membrana. 2. Canales operados por sustancias qumicas cuyo estado de conformacin depende del enlace con una sustancia particular. Algunos canales operados qumicamente se abren (o cierran) luego del enlace de un ligando a la superficie externa del canal, otros se abren (o cierran) luego que un ligando se enlaza a la superficie interna del canal. Por ejemplo, los neurotransmisores como acetilcolina actan sobre la superficie exterior de ciertos canales catinicos, en tanto que los nucletidos cclicos como AMPc actan sobre la superficie interna de ciertos canales inicos para calcio. Aunque los bilogos todava deben cristalizar la protena de un canal inico y por difraccin de rayos X obtener a imagen de su disposicin tridimensional en la membrana, ya es mucho lo que se sabe acerca de la estructura de estas molculas. El siguiente anlisis se centrar en los canales que median el paso del ion potasio. Se han aislado genes que codifican diferentes canales para K + y se ha investigado la anatoma molecular de sus protenas. La mayor parte de estas protenas poseen la estructura bsica bidimensional ilustrada en la figura 4-37, a. Los dominios Nterminal y C-terminal se sitan en el lado citoplsmico de la membrana, en tanto que la porcin media del polipptido contiene seis segmentos que rodean la membrana (SI a S6). Un canal de K + nico consta de cuatro polipptidos homlogos (subunidades) dispuestos simtricamente alrededor de un poro central conductor de iones, segn se muestra en la figura 4-37, b. Por lo contrario, los canales para Na + y Ca2+ de la misma superfamilia constan de un solo polipptido gigante con cuatro dominios hidrfilos separados, cada uno con seis segmentos que rodean la membrana. Los canales de potasio pueden existir en conformacin abierta o cerrada, segn el voltaje a travs de la membrana. Alterando sistemticamente la secuencia de aminocidos de la protena mediante mutagnesis dirigida a un sitio, Richard Aldrich y sus colegas, de la Universidad Stanford, obtuvieron pruebas de que el canal se cierra por medio de "una esfera atada a una cadena". Los 19 aminocidos que forman la porcin N-terminal del polipptido actan como

H,O

HIPERTNICO: no hay presin de turgencia

FIGURA 4-35. Efecto de la osmosis sobre una clula vegetal, a) Las plantas acuticas que viven en agua dulce estn rodeadas por un medio hipertnico. Por lo tanto, el agua tiende a fluir al interior de las clulas generando presin por turgencia, b) Si la planta se coloca en solucin hipertnica, como agua de mar, la clula pierde agua y la membrana plasmtica se separa de la pared celular. (Cortesa de Ed Reschke.)

mtica de la clula receptora y forman canales funcionales. Desarrollo de tcnicas mediante las cuales se pueda estudiar la conductancia de iones a travs de un solo canal inico. Esto se lleva a cabo utilizando como electrodos micropipetas fabricadas con vidrio pulido que se colocan en la superficie externa de la clula y sellan la membrana por succin. El voltaje a travs de la membrana se puede conservar (pinzar) en un valor determinado y medir la corriente originada en la pequea porcin de membrana que rodea a la pipeta (fig. 4-36). Comparando la secuencia de aminocidos en las protenas que forman diferentes tipos de canales inicos en

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CAPITULO 4 Estructura y funcin de la membrana plasmtica FIGURA 4-36. Medicin de la conductancia de un canal inico por la tcnica de la pinza de voltaje, a) En esta tcnica se coloca una micropipeta de vidrio altamente pulido contra una porcin de la superficie externa de la clula y luego se aplica succin para sellar el borde de la micropipeta contra la membrana plasmtica. Puesto que la pipeta contiene un alambre conductor que sirve como electrodo, se puede aplicar voltaje a travs de la porcin de membrana incluida en la pipeta y medir la respuesta representada por el flujo de iones a travs de !os canales de la membrana. Como se indica en la figura, la micropipeta puede incluir una porcin de membrana que contenga un solo canal inico, lo que permite a los investigadores estudiar la abertura y cierre de las compuertas de un solo canal y tambin su conductancia con diferentes voltajes aplicados, b) La mkrografa muestra el registro efectuado en la porcin pinzada de una sola clula fotorreceptora de la retina de salamandra. Una parte de la clula se arrastra al interior de la micropipeta-electrodo de vidrio mediante succin, en tanto que una segunda micropipeta-electrodo (abajo a la derecha) est sellada contra una pequea porcin de membrana plasmtica en otra regin de la clula, (b: Segn T.D. Lamb, H.R. Matthews y V. Torre, J. Physiology 372:319, 1986.)

(a)

"esfera" oscilante que puede cerrar la boca del canal y bloquear el paso de iones (fig. 4-37, b). Se cree que una hlice S4 transmembrana (fig. 4-37, a, recuadro) que contiene 7 residuos aminocidos con carga positiva situados cada tercer residuo a lo largo de la cadena del polipptido regula la abertura y cierre del canal. Se ha determinado que esta porcin de la protena acta como sensor de voltaje. Los cambios de carga inica a travs de la membrana ateran las

interacciones de los residuos cargados positivamente situados en la hlice S4 con residuos con carga negativa situados sobre hlices vecinas, lo que provoca cambios de conformacin en el polipptido que conducen a liberar la "esfera" y abrir la boca del poro. Una vez abierto el poro pueden pasar a travs del canal ms de un milln de iones potasio por segundo. Debido a este gran flujo inico, la abertura de un nmero relativamente pequeo de canales K+ puede tener un impacto significativo sobre las propiedades elctricas de la membrana (pgina 156). Algunos estudios indican que el canal K + mide alrededor de 3 A (0.3 nm) de dimetro en su punto ms estrecho, justo el calibre suficiente para permitir el paso de un solo ion potasio (ms o menos 2 A de dimetro) luego de despojarse de la capa de agua que lo rodea. Se cree que cada canal tiene cuando menos tres sitios capaces de enlazarse selectivamente a un ion potasio. Estos sitios tal vez se localicen en el segmento H5 del polipptido (fig. 4-37, a], que puede formar parte de la pared del poro hidrfilo. La repulsin electrosttica entre varios iones K + sumamente prximos proporciona el mecanismo para impulsar los iones a travs del poro con tal rapidez. Una sola clula puede poseer varios canales K + diferentes que se abren y cierran en respuesta a diversos voltajes. Adems, el voltaje requerido para abrir o cerrar un canal K + particular puede variar segn si la protena del canal est f osf orilada o no, lo que a su vez es regulado por hormonas y otros factores. Es evidente que la funcin del canal inico se encuentra bajo control de un complicado conjunto de diversos agentes reguladores. Nuestra mejor comprensin de la estructura tridimensional de un canal inico se ha logrado por anlisis con microscopio electrnico de alta resolucin del receptor nicotnico para acetilcolina, un canal operado por ligando, que es el tema tratado en la seccin La va experimental, al final de este captulo.

Difusin facilitada
La difusin de una sustancia a travs de una membrana siempre ocurre desde una regin de mayor concentracin

CAPITULO 4 Estructura y funcin de la membrana plasmtica FIGURA 4-37. El canal del K + . a) Figura tridimensional de un canal de ion potasio que muestra los seis segmentos transrnembrana y una porcin del polipptido (llamada H5) que se insina en la bicapa para formar parte de la pared del canal. El recuadro muestra la secuencia de aminocidos del segmento transmembrana S4 del canal para ion K + de Drosophyla, el cual contiene siete cadenas laterales con carga positiva que pueden servir como sensores de voltaje. Las cadenas laterales con carga positiva se sitan cada tercer residuo a lo largo de la hlice, b) Mecanismo propuesto para manejar la compuerta del canal de K + en el cual una parte de la protena acta como una esfera sobre el extremo de una cadena para ocluir la abertura interna del canal. No se muestra uno de los cuatro polipptidos que constituyen el canal tetramrico.

147

H5

en un lado hacia otra de menor concentracin en el otro lado de la membrana, pero las sustancias no siempre difunden a travs de la bicapa de lpidos o de un canal abierto. Se conocen muchos ejemplos donde la sustancia que debe difundir primero se une selectivamente a una protena que atraviesa la membrana, denominada facilitador del transporte,2 encargada de facilitar el proceso de difusin. Se cree que el enlace del soluto a un facilitador de transporte sobre un lado de la membrana desencadena un cambio de conformacin en la protena que expone el soluto en la otra superficie de la membrana a partir de la cual puede difundir cuesta abajo siguiendo su gradiente de concentracin. En la figura 4-38 se ilustra un ejemplo de este mecanismo. La difusin facilitada, como se denomina a este proceso, se asemeja en gran parte a una reaccin catalizada por enzimas. Igual que las enzimas, los facilitadores de transporte son especficos para las molculas que transportan, por ejemplo pueden discriminar entre los estereoismeros D y L (pg. 43, cap. 2). Adems, tanto las enzimas como los transportadores muestran cintica de tipo saturacin (fig. 4-39). A diferencia de los canales inicos, que pueden conducir millones de iones por segundo, la mayor parte de los facilitadores de transporte slo pueden desplazar a travs de la membrana cientos o miles de molculas de soluto por segundo. Otra caracterstica importante de los facilitadores de transporte es que, igual que las enzimas y los canales inicos, su actividad puede regularse para satisfacer las necesidades de la clula en determinado momento. La difusin facilitada es particularmente importante para mediar la entrada y la salida de solutos polares como azcares y aminocidos que no pueden penetrar la bicapa de lpidos. Esto se ilustra en la siguiente seccin. Debido a que los facilitadores de transporte operan pasivamente, o sea, sin acoplarse a un sistema capaz de liberar energa, pueden mediar el movimiento en forma

(b)
El trmino facilitador de transporte se emplea aqu para distinguir estas protenas de los transportadores activos estudiados ms adelante en este captulo y cuya actividad se acopla a la liberacin de energa. Tcnicamente, el trmino transportador se aplica a una protena de la membrana que slo puede enlazarse cada vez a un soluto en un lado de la membrana y en la cual un cambio de conformacin acta como mecanismo para mover la sustancia a travs de la membrana. Esta definicin distingue los transportadores de los canales, los cuales, cuando se abren, pueden unirse al mismo tiempo a solutos en ambos lados de la membrana. Conforme se aprende ms acerca de estas protenas, la diferencia entre canales y transportadores va desapareciendo.
2

satisfactoria en ambas direcciones. La direccin del flujo neto depende slo de la concentracin relativa de la sustancia en ambos lados de la membrana.
El transportador de glucosa: un ejemplo de difusin facilitada

La glucosa es la principal fuente de energa directa para el cuerpo, y la mayor parte de las clulas contienen una pro-

148

CAPITULO 4 Estructura y funcin de la membrana plasmtica Glucosa

Enlace

Recuperacin

FIGURA 4-38. Difusin facilitada. Esquema de un modelo para la difusin facilitada de glucosa que implica un transportador con conformacin alternante para exponer el sitio de enlace a glucosa en el lado interno o en el lado externo de la membrana. (Segn S.A. Bildwin y G.G. lienhard, Trends in Biochem. Sci. 6:210, 1981.)

tena de membrana que facilita la difusin de glucosa desde la corriente sangunea al interior de la clula (como se muestra en la figura 4-38). El gradiente favorable para la difusin continua de glucosa hacia el interior de las clulas se mantiene por fosforilacin del azcar luego que penetra al

citopolasma, por lo que desciende la concentracin intracelular de glucosa. Los seres humanos y otros mamferos estudiados tienen cuando menos cinco protenas relacionadas que actan como facilitadoras del transporte de glucosa (estas variantes genticas se refieren como isoformns). Las isoformas denominadas GLUT1-GLUT5 se diferencian por los tejidos en los cuales se localizan y tambin por su cintica y caractersticas reguladoras. La insulina, hormona producida por las clulas endocrinas del pncreas, desempea un papel clave para mantener una concentracin apropiada de azcar en la sangre. Una de las principales acciones de la insulina es favorecer la captacin de glucosa proveniente de la sangre por las clulas musculares, en cuyo interior se almacena como glucgeno o se emplea directamente como combustible para la actividad muscular y por las clulas adiposas donde la glucosa se convierte en grasa. Los msculos cardiaco y esqueltico, y las clulas adiposas comparten una isoforma comn de protena facilitadora del transporte de glucosa, en especial GLUT4, S la concentracin de insulina es baja, estas clulas contienen relativamente pocos transportadores de glucosa en su superficie. Por lo contrario, dichos transportadores se encuentran en la membrana de las vesculas citoplsmicas (ftg. 4-40). Cuando la concentracin de insulina se eleva, esta hormona acta sobre clulas especficas para estimular la translocacin de las vesculas desde el citoplasma hasta la superficie celular. Como resultado, los transportadores se incorporan a la membrana plasmtica donde pueden actuar para eliminar glucosa de la sangre. La causa de la diabetes mellitus es un defecto de la actividad de la insulina. En pacientes que sufren la enfermedad desde la infancia (diabetes tipo I), por lo general hay deficiencia en la produccin de insulina debido a destruccin de las clulas productoras de insulina por el propio organismo. Por lo tanto, a los nios con diabetes tipo I de ordinario se les trata mediante inyeccin diaria de insulina. Por lo contrario, las personas que desarrollan diabetes en la edad adulta (diabetes tipo II), en general muestran concentracin normal de insulina; el problema estriba en la incapacidad de las clulas especficas para responder a la hormona, sea por deficiencia de los receptores de insulina o por deficiencia de los transportadores GLUT4.

Transporte mediado por protenas (difusin facilitada)

o

Transporte activo
En condiciones tpicas, la concentracin interna de K + en las clulas de mamferos es de casi 100 mM, en tanto que fuera de la clula slo es de unos 5 mM. En consecuencia, hay un gradiente de concentracin de K + muy pronunciado a travs de la membrana plasmtica que favorece la difusin de K + hacia afuera de la clula. Los iones sodio tambin se distribuyen de manera muy desigual a travs de la membrana plasmtica, pero el gradiente se establece en sentido opuesto: la concentracin de Na + es de casi 150 mM en el lado externo de la clula y de 10 a 20 mM en el lado interno de la membrana plasmtica. La diferencia de concentracin para Ca 2+ todava es mayor; la concentracin tpica de 10~7 M en el citoplasma es 1 000 a 10 000 veces menor que la concentracin en e! exterior de la clula. La

Difusin simple

(S)
FIGURA 4-39. Cintica de la difusin facilitada en comparacin con la simple difusin fsica.

CAPITULO 4 Estructura y funcin de la membrana plasmtica Glucosa Transportador de glucosa

149

Membrana plasmtica MGUKA I - 1 0 . La insulina regula la captacin de glucosa en el msculo y las clulas adiposas. Los transportadores de glucosa se almacenan en las paredes de las vesculas citoplsmicas formadas por gemacin de la membrana plasmtica (endocitosis). Cuando la concentracin de insulina aumenta, !as vesculas citoplsmicas se desplazan hacia la periferia de la clula. Las vesculas se fusionan con la membrana plasmtica (exocitosis) y liberan los transportadores a la superficie de la clula donde pueden captar glucosa.

capacidad de una clula para generar estos pronunciados gradientes de concentracin a travs de su membrana plasmtica no puede depender de difusin simple o facilitada. Estos gradientes se generan ms bien por transporte activo. Igual que la difusin facilitada, el transporte activo depende de protenas integradas a la membrana capaces de unirse selectivamente a un soluto particular y desplazar dicha sustancia a travs de la membrana impulsada por cambios en la conformacin de la protena. Sin embargo, a diferencia de la difusin facilitada, el movimiento de un soluto contra un gradiente requiere acoplar el ingreso de energa. En consecuencia, el movimiento endergnico de iones o de otros solutos a travs de la membrana contra un gradiente de concentracin debe acoplarse a un proceso exergnico, como hidrlisis de ATP, absorcin de luz, transporte de electrones o flujo de otras sustancias a favor de un gradiente.
Acoplamiento del transporte activo a la hidrlisis de ATP

En 1957, el fisilogo dans Jens Skou descubri una enzima que hidroliza ATP en las clulas nerviosas del cangrejo que

slo era activa en presencia de iones sodio y potasio (y tambin Mg 2+ , que acta como cofactor). Skou propuso, y estuvo en lo correcto, que esta enzima encargada de la hidrlisis de ATP era la misma protena que actuaba en el transporte activo de los dos iones; la enzima se denomin ATPasa Na+-K + , o bomba sodio y potasio. Los investigadores interesados en descubrir las propiedades de la ATPasa Na + -K + pronto volvieron su atencin a los fantasmas de eritrocitos. En la pgina 139 vimos que los eritrocitos se hinchan en soluciones hipotnicas hasta que la membrana plasmtica es tan permeable que el contenido interno de las clulas escurre al exterior. Estos fantasmas de eritrocitos permeabilizados (hemolizado) se pueden colocar en soluciones de diferente composicin inica, permitir que se encojan a su tamao original y entonces volverlos a sellar. Los fantasmas resellados pueden colocarse entonces en diferentes tipos de medio y evaluar las actividades de transporte de la membrana. Utilizando este sistema se observ que el transporte activo slo ocurre cuando hay iones potasio fuera de la clula y iones sodio dentro de la misma. Tambin debe haber ATP disponible dentro del fantasma restablecido; si el ATP se aplica externamente, la bomba no puede operar. De igual manera se determin que la uabana, un inhibidor del transporte activo de cationes ampliamente estudiado, slo era eficaz cuando se aplicaba de forma externa sobre los fantasmas recuperados. La uabana es un esferoide cardiotnico con estructura similar a la digital, un esferoide obtenido de la digital y empleado durante ms de 200 aos como tratamiento para insuficiencia cardiaca congestiva. La digital aumenta la fuerza de contraccin del corazn inhibiendo la bomba de Na + -K + , lo que desencadena una serie de acontecimientos que incrementan la disponibilidad de Ca2+ dentro de las clulas del msculo cardiaco. En aos recientes se han acumulado pruebas de que las clulas normalmente contienen tipos similares de compuestos denominados endouabanas. Los experimentos con fantasmas de eritrocitos ilustran claramente la naturaleza asimtrica de la bomba de sodio y potasio. Esta asimetra es una de las caractersticas ms importantes de todos los sistemas de transporte activo. A diferencia del movimiento mediado por protenas en los sistemas de difusin facilitada, que pueden transportar la sustancia igualmente bien en ambas direcciones, los sistemas de transporte activo se acoplan a una fuente de energa de tal manera que slo pueden impulsar el movimiento de iones en una sola direccin. Numerosos estudios indican que la proporcin de Na + :K + bombeada por la ATPasa Na + K + no es de 1:1, sino de 3:2 (fig. 4-42). En otras palabras, por cada ATP hidrolizado se bombean tres iones sodio afuera y slo dos iones potasio adentro de la clula. Debido a esta proporcin de bombeo, la ATPasa Na + -K + es electrgena, lo que significa que contribuye directamente a separar cargas elctricas a travs de la membrana. La ATPasa N + -K + es un tetrmero que consta de dos tipos de subunidades (fig, 4-41), una subunidad alfa de mayor tamao encargada de la actividad de transporte y una subunidad beta ms pequea que al parecer funciona sobre todo en la maduracin y ensamblado de la bomba dentro de la membrana. Ambas subunidades atraviesan la membrana; la subunidad alfa contiene 8 a 10 segmentos

150

CAPITULO 4 Estructura y funcin de la membrana plasmtica Carbohidratos Sitios de enlace de los asteroides cardiotnicos

producida por la mayor parte de las clulas animales y dos tercios de la energa producida por clulas nerviosas.
Otros sistemas de transporte de iones

Interior Sitios de enlace para ATP FIGURA 4-41. Modelo esquemtico de ATPasa de Na + -K+. La protena de transporte consta de dos subunidades, una a y una /3. Se indican los diferentes sitios funcionales sobre la subunidad alfa.

transmembrana semejantes, en tanto que la subunidad beta slo contiene uno. La ATPasa Na + -K + es un ejemplo de bomba tipo P para iones. La "P" significa "fosforilacin" e indica que durante el ciclo de bombeo la hidrlisis de ATP transfiere un grupo fosfato a uno de los aminocidos de la proteina de transporte, lo que a su vez provoca un cambio de conformacin esencial dentro de la protena. Los cambios de conformacin son necesarios para modificar la afinidad de la protena por los dos cationes que transporta. Consideremos la situacin que confronta la protena. Debe captar iones sodio o potasio en una regin donde estn presentes en concentracin baja, lo que significa que la protena debe poseer una afinidad relativamente alta por estos iones. A continuacin, la protena debe liberar los iones en el otro lado de la membrana frente a una concentracin mucho mayor de ion. Para esto, la afinidad de la protena por dicho ion debe disminuir. Por lo tanto, la afinidad para los iones debe ser diferente en ambos lados de la membrana, lo cual puede explicarse mejor mediante un cambio en la forma de la molcula de la protena. En la figura 4-42 se muestra un esquema del ciclo de bombeo de la ATPasa Na + -K + . Cuando la protena se une a tres iones Na + en el lado interno de la clula, sufre la fosforilacin y cambia de la conformacin EI a la conformacin 3. En ese momento, los sitios de enlace quedan expuestos al compartimiento extracelular y la protena pierde su afinidad por los iones Na + que entonces se liberan fuera de la clula. Una vez liberados los tres iones de sodio, la protena capta dos iones potasio, se desfosforila y regresa a su conformacin original EI. En ese estado, el sitio de enlace se abre en la superficie interna de la membrana y su afinidad por iones K + disminuye liberando estos iones dentro de la clula. Entonces el ciclo puede repetirse. La importancia de la bomba de sodio y potasio es evidente si consideramos que consume alrededor de un tercio de la energa

La bomba de sodio y potasio slo se encuentra en clulas animales. Se piensa que esta protena evolucion en los animales primitivos como principal medio para conservar el volumen celular y como mecanismo para generar los pronunciados gradientes de Na+ y K + que desempean un papel tan importante en la generacin de impulsos en clulas nerviosas y musculares. Las clulas vegetales dependen sobre todo del transporte de H + por medio de una bomba tipo P situada en la membrana plasmtica. Esta bomba de protones desempea en las plantas un papel clave en el transporte secundario de solutos (analizado posteriormente), en el control del pH del ctosol y tal vez en la regulacin del crecimiento celular mediante acidificacin de la pared de las clulas vegetales. Otro tipo de bomba P bien estudiado es la ATPasa Ca2+ presente en la membrana plasmtica y las membranas del retculo endoplsmico. La funcin de esta bomba Ca2+ es activar el transporte de iones calcio hacia afuera del citoplasma, ya sea al espacio extracelular o a la luz del retculo endoplasmico. A diferencia de las bombas tipo P, las bombas tipo V utilizan la energa del ATP sin formar una protena intermedia fosforilada. Las bombas tipo V transportan activamente iones hidrgeno a travs de las paredes de organelos y vacuolas del citoplasma (de all su nombre tipo V). Se presentan en membranas de revestimiento de lisosomas, granulos secretorios y vacuolas de las clulas vegetales. Otro grupo distinto de protenas que desempean una funcin en el transporte activo de iones se clasifica como transportadores del cartucho enlazado al ATP (CEA), debido a que todos los miembros de este grupo comparten un dominio homlogo de enlace al ATP. El transportador CEA mejor estudiado se describe en La perspectiva humana: Fibross qustica: importancia clnica del transporte de membrana, en este captulo. Como se analiza en la siguiente seccin, no todas las bombas inicas se acoplan directamente a la hidrlisis de ATP.
Aprovechamiento de la energa luminosa para el transporte activo de iones

Las bacterias del genero Halobacterium viven en ambientes extremadamente salinos, como el Gran Lago Salado. Cuando crecen en condiciones anaerobias, las membranas plasmticas de estas bacterias adquieren color prpura (fig. 4-43) debido a la presencia de una protena conjugada particular, la bacteriorrodopsna, que contiene retinal, el mismo grupo prosttico presente en la rodopsina, la protena conjugada de los bastoncillos de la retina de los vertebrados. La bacterorrodopsina funciona absorbiendo protones en lado interno de la membrana y liberndolos en el lado externo, proceso que slo ocurre cuando la bacteria crece en un ambiente iluminado. La absorcin de energa luminosa por el grupo retinal induce una serie de cambios de conformacin en la protena que obliga a los protones a desplazarse a travs de la molcula desde un residuo aminocido especfico a otro, lo que genera un gradiente de protones a travs de la membrana.

CAPITULO 4 Estructura y funcin de la membrana plasmtica Espacio extracelular

151

.111'.
ADP
Citoplasma Conformacin Conformacin Ei

FIGURA 4-42. Concepto esquemtico del ciclo de transporte de la ATPasa de Na + -K + . Los iones sodio: 1) se enlazan a la protena en el lado interno de la membrana; 2) se hidroliza el ATP y el fosfato se transfiere a la protena, 3) cambiando su conformacin, y permitiendo que los iones sodio sean 'sados hacia el espacio externo. A continuacin 4) se enlazan iones potasio a la protena, 5) en seguida se eliminan los grupos folate,, y 6) IE* . -Jtena vuelve con rapidez a su conformacin origina! desplazando iones potasio al interior de la clula. A diferencia de la difusin faciliiada, los cambios en la forma de la protena son inducidos por la energa liberada durante la hidrlisis de ATP, lo que permite que el sistema de transporte pueda desplazar iones contra sus gradientes de concentracin.

Acoplamiento del transporte activo a los gradientes inicos existentes

El establecimiento de gradientes de concentracin, como los de Na+, K+, H+, constituye un medio para almacenar energa en las clulas. La clula emplea de varias maneras la energa potencial almacenada en gradientes inicos para efectuar trabajo, incluyendo transporte de otros solutos. Considrense las funciones del intestino. En su luz, las enzimas desdoblan polisacrdos de peso molecular elevado para producir azcares ms simples, los cuales deben desplazarse a travs de todo el espesor de las clulas epiteliales que revisten al intestino y alcanzar la corriente sangunea. El movimiento de glucosa a travs de la membrana plasmtica apical (membrana de las clulas epiteliales frente a la luz del intestino) contra un gradiente de concentracin ocurre mediante cotransporte con iones sodio, segn se ilustra en la figura 4-44. La concentracin de Na + se mantiene muy baja dentro de las clulas por accin del sistema de transporte activo primario (ATPasa de Na + -K + ), localizado en la membrana plasmtica basal y lateral que bombea iones sodio fuera de la clula contra un gradiente de concentracin. La tendencia de los iones sodio para difundir hacia adentro a

KIGDKA 4-43. El color prpura del agua en este charco salino al este del Sahara se debe a la presencia de numerosas bacterias prpura de los gneros Halobacterium. (Cortesa de Walter Stoeckenius, Universidad de California, San Francisco.)

152

CAPITULO 4 Estructura y fundn de la membrana plasmtica

LA PERSPECTIVA HUMANA
Fibrosis qustica: importancia clnica del transporte de membrana
Una de cada 25 personas, en promedio, descendiente de ancestros del norte de Europa posee una copia del gen causante de la fibrosis qustica. En otras palabras, estas personas son heterocigotas en ese locus gentico. Puesto que no presentan sntomas del gen mutante, la mayor parte de los heterocigotos desconocen que son portadores (a menos que su UNA se someta a los procedimientos recientes de seleccin). En consecuencia, alrededor de uno de cada 2 500 lactantes de esa poblacin caucsica (1/25x1/25 x 1/4) son ho mocigotos recesivos en este locus y nacen con fibrosis qustica. La fibrosis qustica es una enfermedad por secrecin anormal de lquido. Aunque varios rganos estn afectados, incluyendo intestino, pncreas, glndulas sudorparas y el conducto reproductor, de ordinario en el sistema respiratorio es donde se observan los efectos ms graves. Las vctimas de fibrosis qustica producen moco viscoso, resistente, muy difcil de expulsar de las vas respiratorias. Como resultado, estos individuos sufren infeccin pulmonar crnica que progresivamente daa la funcin respiratoria. En 1984 se demostr que las clulas cultivadas procedentes de pacientes con fibrosis qustica muestran flujo externo anormalmente bajo de iones cloro, lo que sugiere que el defecto puede residir en un gen que codifica un canal o un transportador de iones. Puesto que el movimiento de agua hacia afuera de las clulas epiteliales por osmosis est directamente afectado por el movimiento de sales, no es sorprendente que una reduccin del flujo externo de cloro conduzca a un incremento de la concentracin y por lo tanto de la viscosidad de las secreciones corporales. En 1989 se aisl el gen de la fibrosis qustica. Por primera vez, las vctimas de esta enfermedad vieron un rayo de luz al final de un largo y oscuro tnel: surgi la esperanza de encontrar una cura para su incapacitante enfermedad. Una vez determinada la secuencia de! gen de la fibrosis qustica y la secuencia de aminocidos del correspondiente polipptido se comprob que el polipptido era un transportador ABC. Igual que otros transportadores de esta superfamilia, el polipptido contiene dos dominios situados entre la bicapa de lpidos, cada uno con seis segmentos que atraviesan la membrana y dos dominios que unen nucletidos (DUN) proyectados al interior del citoplasma ffig. PH 4-1). A diferencia de otros miembros de la superfamilia, la protena implicada en la fibrosis qustica incluye un dominio regulador (R) que contiene varios residuos de serina que pueden ser fosforilados por una proteincinasa (denominada PKA) activada por un AMP cclico segundo mensajero (seccin 15-2). Esta protena recibi el nombre de regulador de conductancia transmembrana de la fibrosis qustica (RTFQ), trmino ambiguo que refleja el hecho de que los investigadores an no estn seguros de su verdadera funcin, si es un canal de cloro (a diferencia de otros miembros de la superfamilia que son transportadores activos) o una protena que regula de alguna manera la conductancia del cloro a travs de otros canales de la membrana. El problema se resolvi slo despus de purificar la protena, incorporarla a bicapas de l-

C!

Membrana

DUN 1

FIGURA PH 4-1. Hiptesis para explicar el doble control del dmero RTFQ. El AMP cclico activa la proteincinasa, que fosforila residuos de serina del dominio K de la protena (paso 1). El cambio de conformacin inducido por la fosforilacin facilita el enlace del ATP al dominio que une nucletidos (DUN) de la protena (paso 2). La hidrlisis del enlace de ATP abre el canal de cloro (paso 3). (Reimpreso con permiso de F.S. Collins, Science 256:776, 1992; 1992 por American Assocititiou for thc Advancement of Science.)

CAPITULO 4 Estructura y funcin de la membrana plasmtica

153

pidos artificiales y demostrar que acta como canal de cloro regulado por AMP cclico. Para abrir la compuerta aparentemente se requieren dos hechos independientes: la fosforilacin del dominio R dependiente de AMP cclico y el enlace de ATP al dominio de enlace con el nucletido (fig. PH 4-1). La razn para este doble control sobre la conductancia del Cl~ todava es incierta. En aos recientes los investigadores aislaron alrededor de 200 mutaciones diferentes que ocasionan fibrosis qustica y se estudi el efecto de cada una de estas alteraciones sobre la estructura y funcin de la protena ffig. PH 4-2). Como resultado, ahora se sabe ms acerca de las bases moleculares de la enfermedad que de las bases fisiolgicas de la patologa acompaante en tejidos y rganos. En Estados Unidos, 70% de los alelos causantes de fibrosis qustica contienen la misma alteracin gentica (designada A508), y todos ellos carecen de tres pares de bases de DNA que codifican una fenilalanina en la posicin 508 dentro de uno de los dominios de unin a nucletidos del polipptido RTFQ. Investigaciones subsecuentes han revelado que los po-

lipptidos RTFQ que carecen de este aminocido particular no pueden procesarse normalmente dentro de las membranas del retculo endoplsmico y el complejo Golgi, y en realidad nunca alcanzan la superficie de las clulas epiteliales. En consecuencia, los pacientes con fibrosis qustica homocigotos para el alelo A508 carecen por completo del canal de cloro RTFQ y padecen una forma grave de la enfermedad. Otros pacientes con fibrosis qustica con formas menos graves poseen alelos murantes que codifican una RTFQ capaz de alcanzar la superficie de las clulas, pero slo pueden mediar una reducida conductancia al cloro. Las formas ms leves se caracterizan por infertilidad, con dao escaso o ausente a rganos mayores. A partir del aislamiento del gen causante de fibrosis qustica, la meta de los investigadores ha sido desarrollar una cura mediante geneterapia, o sea, sustituir el gen defectuoso por un gen normal. La fibrosis qustica es buen candidato para geneterapia debido a que los peores sntomas de la enfermedad son causados en clulas que revisten las vas respiratorias y, por lo tanto, son accesibles a sustancias sus-

ceptibles de administrar por inhalacin en aerosol. Hasta ahora, los ensayos clnicos iniciados utilizan dos diferentes sistemas de administracin. En un grupo de anlisis, el gen normal RTFQ se incorpor al DNA de un adenovirus defectuoso, un tipo de virus que normalmente produce infeccin en vas respiratorias superiores. A continuacin se permite que las partculas del virus recombinante infecten clulas de las vas respiratorias y enven el gen normal a clulas genticamente deficientes. En otros ensayos, el DNA que codifica al gen RTFQ normal se introduce a liposomas (pgina 124). Cuando se introducen en pulmones y vas respiratorias, los liposomas se fusionan con las membranas plasmticas de clulas epiteliales y liberan su contenido de DNA en el interior del citoplasma. Hasta ahora, ambos mtodos han tenido xito para corregir transitoriamente el defecto gentico en las clulas de vas respiratorias. Quiz los liposomas tengan ventaja sobre los virus como sistema de administracin por la menor probabilidad de estimular una respuesta inmunolgica destructiva dentro del paciente luego de tratamientos repetidos.

an.
Exn 1 23 4 5 6a 6b 7 8 9 10 11 12
> H> ) >

Dominio R

13

14al4b 15 1617a 176 18 19 20212223

24

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*''

*
FIGURA I'H -I -2. Identificacin de mutaciones causantes de fibrosis qustica. Se indica la localizacin y naturaleza de ms de 150 mutaciones diferentes de FQ identificadas por el Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium bajo el esquema de una protena RTFQ. (A.) supresin de estructura; () mutacin en sentido equivocado; () mutacin sin sentido; (O) mutacin de cambio de estructura, y (T) mutacin por empalme. La mayor parte de estos tipos de mutacin se analizan en el captulo 11. Esta figura suministra una indicacin de la variedad de alelos de un gen que pueden existir dentro de una poblacin. Los nmeros corresponden a los segmentos codificantes (exones) que constituyen al gen. La supresin A508, comn en personas del norte de Europa, ocurre a nivel del dcimo exn. (Reimpreso con permiso de F.S. Colins, Science 256:775, 1992; 1992 por American Association for the Advancement of Science.)

154

CAPITULO 4 Estructura y funcin de la membrana plasmtica Intestino delgado

Luz intestinal

Protenas de la membrana que cotransportan glucosa y Na+ Protenas de la membrana para la difusin facilitada de glucosa

Hacia la corriente sangunea FIGURA 4-44. Transporte secundario: empleo de energa almacenada en un gradiente inico. La ATPasa de Na+-K+ residente en la membrana plasmtica de la superficie basal mantiene una concentracin citoplsmica de Na + muy baja. El gradiente de Na+ a travs de la membrana plasmtica representa un almacn de energa que puede liberarse para efectuar trabajo como en el cotransporte de glucosa por un sistema smporte de Na*-glucosa localizado en la membrana plasmtica apical. Una vez transportadas a travs de la superficie apical al interior de la clula, las molculas de glucosa difunden a la superficie basal donde son llevadas por el transportador de glucosa, un sistema de difusin facilitada, al exterior de la clula y hacia el torrente sanguneo. El tamao relativo de Gl y Na + indica la direccin de los respectivos gradientes de concentracin.

travs de la membrana plasmtica apical siguiendo su gradiente de concentracin es "controlada" por las clulas epiteliales que dirigen el cotransporte de molculas de glucosa hacia adentro de la clula contra un gradiente de concentracin. Se dice que las molculas de glucosa son impulsadas por un sistema de transporte activo secundario. En este caso, la protena de transporte se enlaza tanto al sodio como a la glucosa en la superficie externa de la membrana plasmtica apical. Cuando el ion sodio se libera en la clula dentro de una solucin de menor concentracin, la conformacin de la protena aparentemente cambia, de modo que pierde su afinidad por la molcula de glucosa, la cual entonces es liberada dentro de la clula. Una vez adentro, las molculas de glucosa difunden por toda la clula y se desplazan a travs de la membrana basal mediante difusin facilitada. El transporte activo secundario de glucosa al interior de las clulas epiteliales del intestino (y al interior de las clulas que revisten los tbulos del rion mediante un sistema similar) es un ejemplo de simporte, en el cual las dos especies transportadas (Na + y glucosa) se mueven en la misma direccin. Se han aislado numerosas protenas de transporte secundario que participan en antipuerto, en el cual las dos especies transportadas se mueven en direcciones opuestas (vase la fig. 5-28 como ejemplo). Gran nmero de clulas conservan el pH citoplsmico apropiado aco-

plando el movimiento hacia adentro del Na + con el movimiento hacia fuera del H+.

4-6 Potenciales de membrana e impulsos nerviosos

Todos los organismos responden a los estmulos externos, propiedad conocida como irritabilidad. Incluso cuando se pica a una amiba unicelular con una fina aguja de vidrio, responde retirando sus seudpodos y adopta forma esfrica, desplazndose en otra direccin. Investigaciones acerca de la base subyacente a la irritabilidad han demostrado que su origen reside en actividades dentro de la membrana plasmtica de clulas excitables. Se cree que la irritabilidad de una amiba depende de las mismas propiedades bsicas de la membrana que conducen a la generacin y propagacin de impulsos nerviosos, tema que se trata en lo que resta de este captulo. Cuando hay separacin de cargas opuestas entre dos puntos, como el interior y el exterior de la membrana plasmtica, se genera una diferencia de voltaje o potencial elctrico entre dichos puntos. El voltaje a travs de la membrana plasmtica se puede medir introduciendo un fino electrodo de vidrio en el citoplasma de una clula, colocando otro electrodo en el lquido extracelular fuera de la clula y

CAPITULO 4 Estructura y fundn de a membrana plasmtica

+80 +60 +40 tu +20 JS o o > -20 ^0 -60 -80 -100 +40 +20 -20 -40 -60 -80 -100 +30

155

Potencial de equilibrio de sodio

penetra a la clula

tivos para K + y con frecuencia se les denomina canales para escurrimiento de K+. Utilizando la siguiente ecuacin3 se puede calcular el potencial de membrana (EK) que pudiera medirse en el equilibrio si la membrana plasmtica de una clula nerviosa slo fuera permeable a K+. EK = 2.303
RT zF

Potencial de equilibrio del potasio

logio

[K-

Tiempo Voltmetro

Tiempo

Para un axn gigante de calamar, la [K+] interna es de casi 350 mM, en tanto que la [K+0] externa es de unos 10 mM; por lo tanto, a 25C (298K) y z = +1 (para el ion K+ univalente)
EK = 59

0.028 = -91 mV

Electrodo de registro

Electrodo de referencia *++++ +++++

Axn

+ + + + -H

+ + + ++

***** Axn

(a)

(b)

FIGURA 4-15. Medicin del potencial de reposo de una membrana. El potencial se mide al determinar una diferencia de cargas entre los electrodos de referencia y de registro, a) Ambos electrodos se sitan fuera de la clula y no se mide diferencia de potencial (voltaje). b) Conforme el electrodo penetra en la membrana plasmtica del axn, el potencial cae de inmediato a -70 mV (interior negativo), lo cual se aproxima al potencial de equilibrio para iones potasio, o sea, el potencial que resultara si la membrana fuera impermeable a todos los iones,, excepto al potasio.

(Un calculo similar para el potencial de equilibrio de Na + producira un valor aproximado de +55 mV.) Puesto que las mediciones de voltaje a travs de la membrana de un nervio en reposo son similares en signo y magnitud (-70 mV) al potencial de equilibrio del potasio que acabamos de calcular, se presume que el movimiento de iones potasio a travs de la membrana es el factor ms importante para determinar el potencial de reposo. La diferencia entre el potencial de equilibrio calculado para K + (91 mV) y el potencial de reposo medido (70 mV, fig. 4-45) se debe a una ligera permeabilidad de la membrana al Na + y al Cl~. Potencial de accin Segn se mencion, ios fisilogos observaron por primera vez el potencial de membrana en el decenio de 1930 a partir de estudios sobre axones gigantes del calamar. Estos axones, que tienen aproximadamente 1 mm de dimetro, conducen impulsos a velocidad elevada, lo que permite al calamar escapar con rapidez de sus predadores. Cuando se estimula la membrana en reposo de un axn de calamar mediante piquetes con una aguja fina o sacudidas con una corriente elctrica de muy baja intensidad, el axn responde abriendo la compuerta de algunos canales de sodio y permite que penetren a la clula un nmero limitado de iones sodio. Este movimiento de cargas positivas al interior reduce el potencial de membrana, que se vuelve menos negativo. AI reducirse el voltaje disminuye la polaridad entre los dos lados de la membrana, lo que se denomina despolarizacin. Si el estmulo slo despolariza la membrana unos pocos milivoltios, por ejemplo -70 a -60 mV, la membrana rpidamente vuelve a su potencial de reposo tan pronto como cesa el estmulo (fig. 4-46, recuadro izquierdo). Sin embargo, cuando el estmulo es bastante intenso, la membrana se despolariza ms all de cierto punto, llamado umbral, situado cerca de -50 mV. Cuando esto ocurre, se desencadena una nueva serie de acontecimientos. El cambio de voltaje provoca que las compuertas de los canales de sodio operados por voltaje se abran y los iones de sodio

conectando ambos electrodos a un voltmetro, instrumento capaz de medir la diferencia de carga entre dos puntos (fig. 4-45). Cuando se realiz por primera vez este experimento en un axn gigante de calamar, se registr una diferencia de potencial de casi 70 milivoltios (mV), siendo el interior negativo respecto del exterior (indicado con signo menos, 70 mV). El potencial elctrico no es exclusivo de las clulas nerviosas; ocurre en todo tipo de clula y su magnitud vara entre 15 y -100 mV. Para clulas no excitables, o sea, diferentes de clulas nerviosas y musculares, este voltaje simplemente se llama potencial de membrana. En la clula nerviosa o muscular, este mismo potencial se denomina potencial de reposo, sujeto a un cambio espectacular, como analizaremos en la siguiente seccin. La magnitud y direccin del voltaje a travs de la membrana plasmtica se determina por la capacidad relativa de diferentes iones para desplazarse de un lado al otro de la membrana. Como se describi al principio del captulo, la ATPasa de Na + -K + bombea Na + fuera de la clula y K + al interior de la misma, y por lo tanto establece un pronunciado gradiente de estos iones a travs de la membrana plasmtica. Como resultado de su gradiente de concentracin, podra esperarse que los iones potasio salieran de la clula y los iones sodio entraran a la misma. Sin embargo, la mayor parte de los canales inicos abiertos en la membrana plasmtica de una clula nerviosa en reposo son selec-

3 Esta ecuacin, llamada ecuacin de Nernst, se deriva de la ecuacin planteada en la pgina 142, fijando AG como cero, que es el caso cuando los iones en movimiento estn en equilibrio.

156

CAPITULO 4 Estructura y funcin de la membrana plasmtica

Fase de despolarizacin, Fase de repolarizacin, las compuertas de sodio las compuertas de potasio se abren, voltaje = +50 mV se abren, voltaje = -80 mV

Potencial de reposo, las compuertas de sodio estn cerradas, voltaje = -70 mV

Canal para el escurr miento de potasio (siempre abierto

Tiempo Tiempo 1 2

Tiempo 3

Permeabilidad al

n
3
* "i ni

Permeabilidad al K+

1
Tiempo (ms)

FIGURA 4-4-6. Generacin de un potencial de accin. Tiempo 1, recuadro superior izquierdo: en esta regin del nervio, la membrana celular muestra el potencial de reposo en el cual slo los canales para escurrimiento de K+ estn abiertos y el voltaje de la membrana se aproxima a -70 mV. Tiempo 2, recuadro superior central: la membrana se ha despolarizado ms all del valor umbral, lo que provoca la abertura de las compuertas de sodio reguladas por voltaje que causan un flujo de Na + hacia adentro (indicado por el cambio de permeabilidad en la parte inferior del dibujo). El incremento de permeabilidad al Na+ provoca que el voitaje de la membrana se invierta transitoriamente y alcance un valor de casi +50 mV (tiempo 2). Esta inversin del potencial de membrana es lo que constituye el potencial de accin. Tiempo 3, recuadro superior derecho: en una breve fraccin de segundo la compuerta de sodio se cierra y se abren ahora las compuertas de potasio, lo que permite que el ion potasio difunda a travs de la membrana (parte inferior del dibujo) y se establezca en ese sitio un potencial incluso ms negativo (80 mV) que el potencial de reposo. Casi tan pronto como se abren, las compuertas de potasio se vuelven a cerrar y slo permanecen abiertos los canales para escurrimiento de potasio, como gua primaria para el movimiento de iones a travs de la membrana y el restablecimiento del potencial de reposo.

hacia adentro de Na + y los canales de potasio operados por voltaje se abren (fig. 4-46, recuadro derecho). Como resultado, los iones potasio fluyen al exterior de la clula siguiendo su gradiente electroqumico y el potencial de membrana vuelve al valor negativo cercano al potencial de equilibrio de K + (fig. 4-46). El potencial de membrana negativo provoca que los canales de potasio operados por voltaje se cierren, dejando abiertos slo los canales por donde escurre K + , que retornan la membrana a su potencial de reposo. En conjunto, estos cambios del potencial de membrana se denominan potencial de accin. Toda la serie de cambios durante un potencial de accin apenas dura 5 mseg en el axn de calamar y menos an en la clula nerviosa mielinizada de un mamfero. Como los canales de sodio no pueden reabrirse durante algunos milisegundos despus de que se cierran, la membrana entra en un breve periodo refractario despus de un potencial de accin durante el cual no responde a nuevos estmulos. El movimiento de iones a travs de la membrana plasmtica de clulas nerviosas es parte de la comunicacin neural. Ciertos anestsicos locales, como la procana (o novocana), actan cerrando las compuertas de los canales inicos en la membrana de clulas nerviosas y sensoriales. En tanto estos canales inicos permanezcan cerrados, las clulas afectadas son incapaces de generar potenciales de accin y por lo tanto no pueden informar al cerebro lo que ocurre en la piel o en los dientes. Es digno de notar que cuando la membrana de una neurona se despolariza hasta su valor umbral, se dispara un potencial de accin "completo" sin estimulacin adicional. Esta caracterstica funcional de la clula nerviosa se conoce como ley de todo o nada. No hay intermedios; la despolarizacin subumbral es incapaz de desencadenar un potencial de accin, en tanto que la despolarizacin umbral automticamente provoca una respuesta mxima. Tambin debe subrayarse que un potencial de accin no es un proceso que requiera energa, sino que es resultado del flujo de iones que siguen sus respectivos gradientes electroqumicos. La clula requiere energa para generar los pronunciados gradientes inicos a travs de la membrana plasmtica, pero una vez establecidos, los diferentes iones fluyen a travs de la membrana tan pronto como se abren sus respectivas compuertas. Propagacin del potencial de accin en forma de impulso Hasta este punto hemos restringido el anlisis a hechos que ocurren en un sitio particular de la membrana de la clula nerviosa, donde una despolarizacin experimental desencadena un potencial de accin. Una vez iniciado el potencial de accin no permanece localizado en un sitio particular, sino que se propaga a lo largo de la clula en forma de impulso nervioso. En condiciones normales, el potencial de accin se inicia en un extremo de la clula nerviosa (en el punto donde surge el axn del cuerpo celular) y desde all se desplaza hacia el extremo opuesto de la clula. En condiciones experimentales, como las que acabamos de describir, el potencial de accin se dispara en alguna parte a la mitad

difundan al interior de la clula (fig. 4-46, recuadro central siguiendo sus gradientes de concentracin y elctricos. Como resultado del ingreso de Na + a travs de los canales de Na+, el potencial de membrana se invierte brevemente (fig. 4-46) y llega a ser un potencial positivo de casi +50 mV, que se aproxima al potencial de equilibrio para Na + (fig. 4-45). Luego de 1 mseg, aproximadamente, los canales de sodio se cierran en forma espontnea e impiden mayor flujo

CAPITULO 4 Estructura y funcin de la membrana plasmtica

157

de la neurona y desde ese sitio se desplaza en ambas direcciones. Los impulsos nerviosos se propagan a lo largo de una membrana debido a que el potencial de accin generado en un sitio tiene efecto en el sitio adyacente. La gran despolarizacin que acompaa a un potencial de accin arrastra iones positivos hacia ese sitio sobre la superficie externa de la membrana y los aleja de dicho sitio sobre la superficie interna (fig. 4-47). Como consecuencia de este flujo de corriente, la membrana tambin se despolariza en la regin situada justo por delante del potencial de accin. Puesto que la despolarizacin que acompaa al potencial de accin es muy grande, la membrana de la regin adyacente se depolarza con rapidez hasta un nivel ms all del valor umbral y las compuertas de sodio se abren en este nuevo sitio generando otro potencial de accin. As, una vez desencadenado un potencial de accin, todo el trayecto de la neurona ser recorrido por una onda de potenciales de accin, que sin perder nada de intensidad llega a su clula especfica con igual intensidad a la del punto de origen. Aunque el potencial de accin implica un cambio espectacular en el voltaje de membrana, slo un mnimo porcentaje de los iones del axn participan en cualquier impulso determinado. Aunque la ATPasa de Na + -K + se inactiva, con frecuencia la neurona contina generando miles de impulsos antes que se disipen los gradientes inicos originalmente establecidos por la actividad de la bomba. Lo esencial es la rapidez Cuanto mayor sea el dimetro de un axn menor ser la resistencia al flujo de corriente local y un potencial de accin en un sitio con mayor rapidez puede activar regiones adyacentes de la membrana. Los invertebrados sacan el mayor provecho de esta relacin desarrollando axones gigantes que facilitan el escape del animal cuando encuentra algn peligro. Sin embargo, hay un lmite a este enfoque evolutivo. Puesto que la velocidad de conduccin aumenta con la raz cuadrada del incremento de dimetro, un axn con 480 /m de dimetro slo puede conducir un

potencial de accin cuatro veces ms rpido que uno que tenga 30 //m de dimetro. En la evolucin de los vertebrados, el aumento de la velocidad de conduccin se logr envolviendo el axn en una vaina de mielina formada por clulas accesorias denominadas clulas de Schwann (fig. 4-48, a). La vaina de mielina, compuesta casi exclusivamente por membranas que contienen lpidos, es ideal para prevenir el paso de iones a travs de la membrana plasmtica. Como resultado, los potenciales de accin slo pueden ocurrir en hendiduras descubiertas, o nodulos de Ranvier, entre las clulas de Schwann adyacentes que constituyen la vaina (fig. 4-48, a). Un potencial de accin en un nodulo desencadena otro potencial de accin en el siguiente nodulo (fig. 4-48, b), y

Ncleo de la clula de Schwann Dendritas

Ncleo Axn Cuerpo de la clula Axn Vaina de mielina

Botn terminal

(a)
Na
Nodulo subsecuente

El Rujo de corriente despolariza al siguiente nodulo de Ranvier

Direccin de la propagacin

Nodulo de Ranvier Regin en periodo refractario Hegion del potencial de accin Regin donae id aespoianzacin desencadena un potencial de accin

Vaina de mielina

(b)
FIGURA 4-4t. Conduccin saltatoria, a) Esquema de una neurona con su axn mielinizado que muestra los nodulos de Ranvier: sitios donde el axn carece de la envoltura de mielina. El recuadro muestra la vaina de mielina compuesta de clulas de Schwann individuales enrolladas alrededor del axn. b) Durante la conduccin saltatoria, slo la membrana de la regin nodal del axn se despolariza y es capaz de generar un potencial de accin. Esto se logra conforme la corriente fluye directamente desde un nodulo activado al siguiente nodulo en reposo a lo largo del axn.

FIGUKA 4-47. La propagacin de un impulso ocurre como resultado del flujo local de iones. Un potencial de accin en un sitio de la membrana despolariza la regin adyacente de dicha membrana y desencadena un segundo potencial de accin en ese sitio. El potencial de accin slo puede avanzar hacia adelante debido a que la porcin de la membrana que acaba de experimentar un potencial de accin permanece en periodo refractario.

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CAPITULO 4 Estructura y fundn de la membrana plasmtica

por lo tanto el impulso al viaje de nodulo en nodulo sin necesidad de activar la membrana interpuesta. La propagacin de un impulso por este mecanismo se denomina conduccin saltatoria. Los impulsos conducidos a lo largo de un axn mielinizado alcanzan velocidades de hasta de 120 metros por segundo, casi 20 veces ms rpida que la velocidad de los impulsos en una neurona no mielinizada del mismo dimetro. La importancia de la mielinizacn se ilustra notablemente en la esclerosis mltiple, enfermedad producida por el deterioro gradual de la vaina de mielina que rodea los axones en diferentes partes del sistema nervioso. Las manifestaciones de la enfermedad de ordinario se inician en el adulto joven; las vctimas experimentan debilidad en las manos, dificultad para caminar o problemas de la vista. El padecimiento se caracteriza por disfuncin muscular progresiva y casi siempre culmina en parlisis permanente.

Neurotransmisin: salto de la hendidura sinptica

Las neuronas se unen con sus clulas especficas en sitios especializados denominados sinapsis. El examen cuidadoso de una sinapsis revela que las dos clulas no entran en contacto directo, sino que estn separadas entre s por una estrecha abertura de casi 20 a 40 nm. Esta abertura se denomina hendidura sinptica. Una clula presinptica (siempre una neurona) conduce impulsos hacia la sinapsis, y una clula postsinptica (ya sea clula nerviosa, muscular o glandular} siempre se sita en el "lado receptor" de una sinapsis. La figura 4-49 muestra algunas sinapsis entre las ramas terminales de un axn y una clula de msculo esqueltico; la sinapsis de este tipo se denomina unin neuromuscular o placa motora terminal. Cmo puede el impulso de una neurona presinptica "saltar" a travs de la hendididura sinptica y afectar a la

Botn sinptico de la neurona presinptica Vesculas sinpticas

\a
de la clula especfica postsinptica Axn de la clula nervios

\e
sinptica

FIGURA 4-49. La unin neuromuscular es un sitio donde las ramificaciones terminales de un axn motor establecen sinapsis con las fibras musculares del msculo esqueltico. El recuadro a la izquierda muestra las vesculas sinpticas residentes dentro del botn terminal del axn y la estrecha hendidura sinptica entre el botn terminal y la clula especfica. El recuadro de la derecha muestra el botn terminal oprimido estrechamente contra la membrana plasmtica de la clula muscular. (Segn VufT. Reese y D.W. Faivcett/Visuals Unlimted; (recuadro) cortesa de Lennart Nsson.)

CAPITULO 4 Estructura y funcin de la membrana plasmtica

159

clula postsinptica? Estudios efectuados hace varios decenios indicaron la participacin de una sustancia qumica en la transmisin de un impulso de una clula a otra (fig. 4-50). El examen de las ramificaciones terminales de un axn (botones terminales) mediante microscopio electrnico muestra que contienen gran nmero de vesculas sinpticas (fig. 4-49, recuadro izquierdo) que almacenan molculas del transmisor qumico que acta en las clulas postsinpticas adyacentes. Dos de los neurotransmisores mejor estudiados son acetilcolina y noradrenalina,
O

CH3 C O CH2 CH2 N(CH3)3

Acetilcolina (ACh)

QH

HO

CCH,NHs OH
Noradrenalina

la membrana plasmtica de esta porcin de la clula nerviosa presinptica (paso 2, fig. 4-50). Normalmente, dentro de la neurona, igual que en todas las clulas, se encuentran concentraciones muy bajas de ion calcio. Cuando se abren las compuertas, los iones de calcio difunden desde el lquido extracelular al interior del botn terminal de la neurona, donde provocan la fusin de algunas membranas vesiculares sinpticas con la membrana plasmtica subyacente, liberando molculas del neurotransmisor en la hendidura sinptica (paso 3, fig. 4-50). (La fusin de las vesculas citoplsmicas con la membrana plasmtica se estudia en la seccin 8-4.) Una vez liberadas de las vesculas sinpticas, las molculas del neurotransmisor difunden a travs de la estrecha abertura y se enlazan selectivamente a molculas receptoras presentes en la membrana de la clula postsinptica (paso 4, fig. 4-50). Una molcula de neurotransmisor puede tener uno de dos efectos opuestos segn el tipo de receptor sobre las membranas de la clula especfica a la cual se enlaza. 1. El enlace del neurotransmisor puede inducir la abertura de canales catinicos en la membrana provocando flujo de iones sodio al interior de la clula con la consecuente disminucin del potencial de membrana. La despolarizacin de la membrana postsinptica excita a la clula y aumenta la posibilidad de que responda generando un potencial de accin (fig. 4-50, pasos 5a y 6). 2. El enlace del transmisor puede abrir canales de K + , lo que provoca la salida de iones potasio de la clula, o la

que transmiten impulsos a los msculos cardiaco y esqueltico. La secuencia de acontecimientos que ocurre durante la transmisin sinptica se puede resumir de la manera siguiente (fig. 4-50). Cuando un impulso alcanza un botn terminal (paso 1, fig. 4-50), la despolarizacin acompaante induce la abertura de canales Ca2+ operados por voltaje en

Impulso nervioso

Hendidura sinptica

Se abren las compuertas de Ca?+

O
Impulso nervioso

Membrana postsinptica

Se abren las compuertas para Na+

Se abren las compuertas para K +

FIGURA 4-50. Secuencia de acontecimientos durante la transmisin sinptica cuando el neurotransmisor es acetilcolina. Durante los pasos 1-4, un impulso nervioso alcanza el botn terminal del axn, Jas compuertas de calcio se abren y provocan flujo de Ca2+ hacia adentro, se libera acetilcolina de las vesculas sinpticas y se enlaza a los receptores situados en la membrana postsinptica. Si el enlace de las molculas del ncurotransmisor provoca despolarizacin de la membrana presinptica (como en 5a), se puede generar un impulso nervioso en ese punto (6). Sin embargo, si se provoca hiperpolarizacin en la membrana presinptica (5b), la clula especfica se inhibe y es ms difcil generar un impulso en dicha clula por otro estmulo excitatorio. No se muestra el desdoblamiento del neurotransmisor por acetilcolinesterasa.

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CAPITULO 4 Estructura y funcin de la membrana plasmtica

abertura de canales Cl~, causando flujo de iones cloro al interior de la clula. El movimiento de estos iones incrementa la negatividad en el lado interno de la membrana, y por lo tanto crece el potencial de membrana (hiperpolarizacin). La hiperpolarizacin de la membrana postsinptica inhibe a la clula y reduce la probabilidad de generar un potencial de accin {fig. 4-50, paso 5b). Todos los botones terminales de determinada neurona liberan la misma sustancia neurotransmisora, aunque dicha molcula puede tener efecto estimulador sobre una membrana postsinptica particular y efecto inhibidor sobre otra. Por ejemplo, la acetilcolina inhibe la contractilidad del

corazn, pero estimula la contractilidad del msculo esqueltico. La estructura del receptor de acetilcolina y su funcin como canal inico operado por ligandos se analiza con detalle en La va experimental. La vida media de un neurotransmisor despus de ser liberado por una neurona presinptica debe ser corta, porque de otra manera el efecto de la sustancia se prolonga y la neurona postsinptica no se recuperara. Esto se puede evitar de dos maneras: mediante enzimas que destruyen las molculas del neurotransmisor en la hendidura sinptica o por protenas que transportan las molculas del neurotransmisor de regreso a la neurona que originalmente las liber, proceso denominado recaptacin. Debido a la destruccin o

LA VIA

EXPERIMENTAL

El receptor para acetilcolina

En 1843, a la edad de 30 aos, Claudio Bernard se mud de un pequeo pueblo de Francia, donde era farmacutico y aspirante a escritor de obras de teatro, a Pars, donde planeaba seguir su carrera literaria. En vez de ello, Bernard se inscribi en la escuela de medicina y lleg a ser el ms notable fisilogo del siglo XIX. Entre sus muchas reas de inters se hallaba el mecanismo por el cual los nervios estimulaban la contraccin del msculo esqueltico. Sus estudios incluyeron el empleo del curare, un frmaco muy" txico aislado de plantas tropicales y utilizado durante siglos por cazadores nativos de Sudamrica para fabricar flechas envenenadas. Bernard observ que el curare poda paralizar un msculo esqueltico sin interferir con la capacidad de los nervios para conducir impulsos a dicho msculo o la capacidad del msculo para contraerse por estimulacin directa. Bernard concluy que el curare actuaba sobre alguna estructura situada en la regin de contacto entre nervio y msculo. Esta conclusin fue confirmada y ampliada por John Langley, fisilogo de la Universidad de Cambridge. Langley estaba estudiando la capacidad de la nicotina, otra sustancia derivada de plantas, para estimular la contraccin del msculo esqueltico aislado de rana y el efecto del curare para inhibir la accin de la nicotina. En 1906, Langley concluy que "el impulso nervioso no puede pasar de un nervio a un msculo por medio de una descarga elctrica, sino por la secrecin de una sustancia especial en el extremo del nervio".1 Tambin propuso que dicho "transmisor qumico" se una a una "sustancia receptora" sobre la superficie de la clula muscular, el mismo sitio donde se enlazan nicotina y curare. Posteriormente se demostr que estas proposiciones fueron profticas. La sugerencia de Langley de que el estmulo se transmite del nervio a msculo por una sustancia qumica fue confirmada en 1921 en un ingenioso experimento efectuado por el fisilogo austriaco Otto Loewi, el diseo del cual vino a su mente durante un sueo. La frecuencia cardiaca de un vertebrado es regulada por el equilibrio entre los impulsos de dos nervios de accin opuesta (antagonista). Loewi aisl el corazn de la rana junto con ambos nervios. La estimulacin del nervio inhibidor (vag) liber una sustancia qumica de la preparacin de corazn a una solucin salina que se permiti drenar hacia un segundo corazn aislado. La frecuencia del segundo corazn disminuy de manera espectacular, como si su propio nervio inhibidor se hubiera activado.2 Loewi llam "Vagustoff" a la sustancia procedente del corazn de rana. En pocos aos, Loewi demostr que las propiedades qumicas y fisiolgicas del Vagustoff eran idnticas a las de acetilcolina, y concluy que la sustancia liberada en el extremo de las clulas nerviosas que constituyen el nervio vago era acetilcolina.

Mantarrava elctrica *

0 0

rganos acumuladores de electricidad

FIGURA VE 4-1. Los rganos elctricos de Torpedo constan de pilas de uniones neuromusculares modificadas que se localizan a cada lado del cuerpo. (Segn Z.W. Hall, An Induction to Neurobiology, Sinauer Associates, Inc., Sunderand, MA. 1992.)

CAPITULO 4 Estructura y funcin de la membrana plasmtica

161

la recaptacin de las molculas del neurotransmisor, el efecto de cada impulso no dura ms de unos pocos milisegundos. Las sinapsis son algo ms que simples sitios de conexin entre neuronas adyacentes; son determinantes clave para orientar los impulsos a travs del sistema nervioso. Los miles de millones de sinapsis presentes en el sistema nervioso de un mamfero complejo actan como compuertas estticas a o largo de todas las diferentes vas, permitiendo que algunos segmentos de informacin codificada pasen de una neurona a otra en tanto que retienen otras piezas o las reorientan hacia otra direccin. Hay muchas otras razones para explicar la importancia que adquiri el estudio de las sinapsis en aos recientes. Por ejemplo, los cambios en la

estructura y actividad de las sinapsis desempean un papel importante en aprendizaje y memoria. De manera similar, varias enfermedades del sistema nervioso, incluyendo miastenia grave, enfermedad de Parkinson, esquizofrenia e incluso depresin, se cree que tienen sus races en el mal funcionamiento de las sinapsis. Durante muchos decenios se pens que el estudio de la transmisin sinptica implicaba un mecanismo de transferencia de informacin enteramente peculiar de las clulas nerviosas. En los ltimos dos decenios, la investigacin revel que los mecanismos mediados por receptores y seales transmembrana controlan una gran variedad de procesos celulares (analizados en el captulo 15).

En 1937, David Nachmanson, neurofisilogo en 3a Sorbona, se encontraba de visita en la Feria Mundial de Pars, donde observ varias especies vivas del pescado elctrico Torpedo marmarota que estaban en exhibicin. Estas mantarrayas poseen rganos elctricos capaces de producir fuertes descargas (40 a 60 voltios), que pueden matar a una posible presa. En aquel tiempo, Nachmanson estaba estudiando la enzima acetilcolinesterasa, que acta para destruir la acetilcolina liberada en los extremos de nervios motores. Nachmanson se dio cuenta de que los rganos elctricos de estos peces derivaban de tejido muscular esqueltico modificado (fig. VE 4-1) y solicit que le suministraran un par de peces para estudiar luego de concluida a Feria. Los resultados de sus primeros experimentos mostraron que el rgano elctrico era una fuente extraordinariamente rica de acetilcolinesterasa.3 Tambin contena gran cantidad del receptor nicotnico para acetilcolina (nAChR),* el receptor presente en as membranas postsinpticas de las clulas musculares esquelticas donde se unen las molculas de acetilcolina liberadas de las fibrillas terminales del nervio motor. Encontr as un sistema "ideal" que demostr ser invaluable en el estudio de aspectos particulares de estructura y funcin de la clula. Como veremos en las siguientes pginas, los rganos elctricos del pez fueron prcticamente el nico material para estudiar el nAChR. El nAChR es una protena integral de la membrana, y no fue sino hasta el decenio de 1970 que se desarrollaron tcnicas para aislar estas protenas. Como se analizar en el captulo 17, a purificacin de una protena particular requiere un procedimiento de ensayo adecuado capaz de determinar la cantidad presente de la protena en cualquier fraccin particular. El ensayo ideal para nAChR es un compuesto capaz de enlazarse de manera fuerte y selectiva a esta protena particular. Este

* El receptor se describe como nicotnico debido a que la nicotina puede activarlo igual que la acetilcolina. Esto contrasta con los receptores rnuscarnicos para acetilcolina de la sinapsis de los nervios parasimpticos, el cuai puede activarse por muscarina, pero no por nicotina, e inhibirse con atropina, pero no con curare. Una persona cuyo cuerpo est acostumbrado a niveles altos de nicotina debido a! hbito de fumar experimenta sntomas de abstinencia cuando deja de fumar, debido a que las neuronas postsinpticas que poseen nAChR ya no se estimulan a su nivel acostumbrado.

compuesto fue descubierto en 1963 por Chen Yuan Lee y sus colaboradores de la Universidad Nacional de Taiwn. El compuesto es la -bungarotoxina, sustancia presente en el veneno de una serpiente taiwanesa. La a-bungarotoxina provoca parlisis porque se enlaza fuertemente a los nAChR en la membrana postsinptica de la clula muscular esqueltica y bloquea la respuesta del msculo a la acetilcolina.4'5 Disponiendo de a-bungarotoxina marcada como sustancia de ensayo, rganos elctricos como fuente y un detergente capaz de solubilizar las protenas de la membrana, varios investigadores pudieron aislar los receptores para acetilcolina a principios de los aos 1970. En uno de estos estudios,6 las membranas que contenan nAChR se aislaron homogenizando los rganos elctricos en una licuadora y centrifugando la suspensin para formar pequeas esferas con fragmentos de la membrana. Luego de probar varios procedimientos para solubilizar las protenas de la membrana, se observ que el Tritn X-100 dio los mejores resultados. Tritn X-100 es un detergente no inico. Igual que otros detergentes, Tritn X-100 posee una porcin hidrfoba larga capaz de reubicar los fosfolpidos que normalmente rodean la porcin hidrfoba de una protena de membrana y un extremo hidrfilo hidrosoluble. A diferencia de la mayor parte de los detergentes, que poseen un grupo carboxilo con carga negativa, Tritn X-100 carece de carga neta (por lo tanto es no inico) y daa menos la estructura de la protena. Las protenas de membrana se extrajeron de los fragmentos de membrana empleando el detergente Tritn X-100, y la mezcla se pas a travs de una columna que contena pequeas cuentas recubiertas con un compuesto sinttico cuyo extremo posee semejanza estructural con acetilcolina {fig. VE 4-2, a). Conforme la mezcla de protenas disueltas pasa a travs de la columna, dos de las protenas, nAChR y acetilcolinef terasa (AChE), con sitios de enlace para acetilcolina quedaron pegadas a las cuentas. El restante 90% de las protenas del extracto no se enlaz a las cuentas, simplemente pas a travs de la columna y se recolect (fig. VE 4-2, b). Luego de las protenas, se pas a travs de la columna una solucin 10~3 M de flaxedil que elimin selectivamente los nAChR de las cuentas, dejando como residuo AChE. Con este procedimiento se purific el receptor de acetilcolina cuantiricado segn su enlace a bungarotoxina, con un rendimiento mayor de 150 veces en un solo paso. Este tipo de procedimien-

162

CAPITULO 4 Estructura y fundn de la membrana plasmtica

CH2-CH2-N-C2HS

o
SEFAROSA 2B

\ H H

II

NH(CH2I. -N-C-C-CH2-CH2-S-CH2-C-N-f VO-I

NH I 0=C I CH 3

(a)

cu

!-"

flaxedii

*I(T S M

IMNaCl

'i
* J *

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^^^ A_
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1.0

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\ \ \

o AChE

\
0.5
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FIGURA VE 4-2..a) Estructura de un compuesto sinttico CT5263 unido a cuentas de Sefarosa y empleado para formar una columna de afinidad. Los extremos del compuesto que sobresalen de las cuentas son similares a la acetilcolina y esto da lugar a que tanto la acetilcolinesterasa (AChE) como el receptor nicotnico para acetilcolina (nAChR) se unan a las cuentas, b) Pasos para aislar el nAChR. Cuando el extracto Tritn X-100 pasa a travs de la columna, ambas protenas enlazadas a la acetilcolina se fijan a las cuentas, en tanto que el resto de la protena disuelta (casi 90% de la protena total en el extracto) pasa directamente a travs de la columna. El paso subsecuente de una solucin 10~3 M de flaxedii a travs de la columna liber el nAChR enlazado, sin alterar la AChE enlazada (que posteriormente se eludi con una solucin 1 M de NaCl). (Segn R.W. Olsen, /.-C. Meunier y /.-P. Changeux, FEBS Lett. 28:99, 1972.)

*.* 4

k .

10
(b)

20

30

50

60

70

80

90

Nmero de f r a c c i n (2 m i )

to se conoce como cromatografa por afinidad y su empleo genera) se estudia en a seccin 17-7. El siguiente paso fue determinar con mayor precisin la estructura del receptor de acetilcolina. Los estudios efectuados en-el laboratorio de Arthur Karln, en la Universidad Columbia, determinaron que el receptor era un pentmero, una protena que consta de cinco subunidades. Cada receptor contiene dos copias de una subunidad llamada a, y una copia de cada una de las subunidades /3, y y . Las subunidades se pueden distinguir extrayendo protenas de la membrana en Tritn, purificando los nAChR mediante cromatografa por afinidad y luego sometiendo la protena purificada a electroforesis a travs de un gel de poliacrilamida (EGPA-DSS, segn se estudia en la seccin 17-7) que separa los polipptidos individuales segn su tamao, como se muestra en la figura VE 4-37 Otro punto importante en el estudio de los nAChR fue demostrar que el receptor purificado acta tanto como sitio de enlace para acetilcoina como canal para el paso de cationes. Aos antes, Jean-Pierre Changeux, del Instituto Pasteur en Pars, postul que el enlace de acetilcolina a receptor provoca un cambio de conformacin que abre un canal inico dentro de la protena. El flujo de iones Na + hacia el interior a travs del canal despolariza la membrana y activa la clula muscular. En la ltima mitad del decenio de 1970, Changeux y sus cole-

gas lograron1 incorporar molculas purificadas de nAChR en vesculas artificiales de lpidos.8'9 Empleando vesculas con diferentes concentraciones de iones sodio y potasio marcados, demostraron que el enlace de acetilcolina a receptores de la bicapa de lpidos inicia un flujo de cationes a travs de la "membrana". Es evidente que "la protena pura contiene todos los elementos estructurales necesarios para la transmisin qumica de la seal elctrica; a saber: un sitio para enlace de acetilcolina, un canal inico y un mecanismo para acoplar su actividad". En el decenio de 1980, los investigadores se dedicaron a determinar la estructura del nAChR y el mecanismo por el cual se concentran en una pequea porcin de la membrana muscular, la porcin adyacente a as fibrillas termnales de la neurona motora. El anlisis de la estructura ha tomado diferentes caminos. Un mtodo emplea genes purificados, determinacin de las secuencias de aminocidos y mutagnesis dirigida a un sitio para determinar las partes especficas de los polipptidos que atraviesan la membrana, se unen al neurotransmisor o forman el canal inico. Estos estudios acerca de la anatoma molecular de una protena son similares en principio a los descritos en la pgina 147 para el canal inico K + . Otro mtodo emplea microscopa electrnica. Las primeras imgenes del nAChR se observaron en micrografas elec-

CAPITULO 4 Estructura y funcin de a membrana plasmtica

163

58,000 X

/48000

,39000

Mil
20-

o-

20

40

60

80

100

Nmero de corte FIGURA VE 4-3. La parte superior de la figura muestra un gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sodio luego de electroforesis de una preparacin de nAChR purificada. Se observa que el receptor consta de cuatro subunidades diferentes cuyos pesos moleculares se indican. Antes de la electroforesis, la preparacin de receptor purificado se incub con un compuesto radiactivo (3H-MBTA) parecido a la acetilcolina y que se enlaza al sitio de unin para acetilcolina del nAChR. Luego de la electroforesis se practicaron cortes de 1 mm en el gel y se determin la radiactividad de cada rebanada. Toda la radiactividad se encontraba unida a la subunidad de 39 000 daltons, indicando que esta subunidad contiene el sitio de enlace para acetilcolina. La lnea punteada indica la absorbancia de luz de cada fraccin, la cual suministra una medida de !a cantidad total de protena presente en dicha fraccin. La altura de los picos proporciona una medida de la cantidad relativa de cada una de las subunidades en la protena. Todas las subunidades ocurren en igual cantidad, excepto la subunidad ms pequea (subunidad a, que contiene el sitio de enlace para ACh), de la cual hay un nmero doble de copias. (Segn C.L. Weill, M.G. McNamee y A. KarJin, Bioch. Biop. Res. Comm. 61:3002, 3974 J

trnicas de la membrana de rganos elctricos (fig. VE 4-4) .10 Los receptores aparecen como estructuras anulares, no diferentes a donas, con un dimetro de 8 nm y una depresin central de 2 nm que sobresale de la bicapa de lpidos hacia el espacio externo. En los ltimos aos ha ido apareciendo una imagen cada vez ms detallada del nAChR como resultado del trabajo de Nigel Unwin y sus colegas, del Medical Research Council of Engand.11"12 Utilizando un anlisis matemtico de micrografas electrnicas de membranas congeladas procedentes de rganos elctricos, Unwin describi la disposicin de las cinco subunidades que rodean al canal central (fig. VE 4-5). El canal inico consta de un estrecho poro que atraviesa la bicapa rodeado por paredes que se extienden 6 nm hacia la hendidura sinptica sobre un lado de la membrana y 2 nm hacia el citoplasma por el otro lado. Se cree que una bolsa situada sobre el dominio externo de cada subunidad a corresponde a un sitio de enlace para acetilcolina. Esta descripcin del nAChR se encuentra entre las mejores para cualquier protena integral de la membrana de una clula eucariota. Ya vimos cmo pueden disecarse las propiedades de un segmento particular de una protena mediante la preparacin de mutantes portadores de aminocidos sustituidos especficamente. Otra manera para disecar funcionalmente una protena es construir un gen que codifique parte de dos protenas diferentes, introducir el gen en una clula husped y permitir al gen que dirija la formacin de una protema hbrida (quimrica). Este mtodo se utiliza para estudiar ciertas propiedades del nAChR. En estos experimentos13 se produjo una protena quimrica funcional que contiene el dominio N-terminal del nAChR unido a los dominios transmembrana de un receptor diferente de la misma superfamia: el receptor para 5-hidroxi-

triptamina (SHTs). Las clulas que poseen este receptor quimrico generan una corriente como respuesta a la acetilcolina y no a 5HT3, lo cual confirma la prediccin de que el sitio de enlace para aceticolina se sita en el dominio N-terminal de la pro tena residente sobre la cara extraceular de la membrana.

0.1 ftm

FIGURA VE 4-4. Micrografa electrnica de una membrana teida en negativo rica en receptores procedente del rgano elctrico de un pez elctrico que muestra la densa disposicin de las molculas nAChR. (Segn Wcnier Schicbler y Ferdinand Hucho, Eur. J. Biochem. 85:53, 1978.)

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CAPITULO 4 Estructura y funcin de la membrana plasmtica

smapsis
---a) Mapa de densidad electrnica en un corte transversal del nAChR obtenido mediante anlisis de la imagen al microscopio electrnico de los cristales tubulares de membranas del rgano elctrico de Torpedo embebidas en hielo. Este anlisis permite a los investigadores reproducir el aspecto tridimensional de una sola protena nAChR que reside dentro de la membrana. El contorno continuo indica lneas de densidad similar mayores que las del agua. Las dos lneas oscuras en forma de barra representan hlices a que revisten el canal en su punto ms estrecho, b) Esquema del nAChR que muestra la disposicin de as subunidades y la representacin de un corte transversal de la protena. (Segn P.N.T. Unwin, J. Mol. Biol. 229:1118, 1993; b: tomado de Chemical Signaling in the Brain, por }.-P. Changeux. Noviembre 1993 por Scientific American, Jnc. Todos los derechos reservados.)

Canal inico

citoplasma
(a) (b)

Citoplasma

Ion polasio

El estudio tambin demuestra que el cambio de conformacin que ocurre cuando la ACh se enlaza al receptor quimrico es capaz de abrir el poro que conduce al interior de un canal SHTs; esto sugiere que a pesar de diferencias mayores en las secuencias de aminocidos, los dos canales operan por un mecanismo de compuerta de tipo similar. En la pgina 137 vimos cmo el movimiento de las protenas integrales de la membrana por lo general est restringido por otros componentes situados sobre la cara citoplsmica o extracelular de la membrana. Esta observacin est particularmente bien ilustrada por el nAChR. Durante las primeras etapas del desarrollo de una clula del msculo esqueltico, los receptores de acetilcolina pueden distribuirse ms bien de manera uniforme a travs de toda la membrana plasmtica de la clula. Sin embargo, con la maduracin de la clula muscular y la estrecha aproximacin de las fibrillas terminales de la neurona motora, estas mismas molculas receptoras se desplazan dentro de la membrana para concentrarse extremada-

mente en las regiones de la sinapsis que slo representa una fraccin muy pequea de la superficie de (a clula muscular. Se estima que ms de 90% de las molculas nAChR se concentran en menos de 0.1% de la membrana plasmtica de la clula. Probablemente haya varios factores que expliquen el agrupamiento espectacular de estas protenas integrales en un ambiente lpido relativamente fluido, pero una protena ha sido el tema de particular inters. En 1981 se demostr que el tratamiento con lcali fpH 11) de las membranas postsinpticas del tejido elctrico de Torpedo produce la liberacin de una protena especfica {peso molecular de 43 000 daltons) procedente de la cara interna de la membrana postsinptica. La liberacin de esta protema perifrica interna se acompaa de una dispersin de las molculas receptoras dentro de la membrana, como si la protena 43K sirviera para anclar los receptores dentro de la regin postsinptica.14 El papel de la protena 43K como medio para fijar los nAChR se demostr de manera convincente en experimentos

CAPITULO 4 Estructura y fundn de la membrana plasmtica

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FIGURA VE 4-6. <*) Se inyectaron oocitos con transcriptos RNAm de ratn codificando todas las subunidades receptoras de nAChR y se determin la distribucin de las molculas receptoras sobre la superficie del oocito mediante su eniace a a-bungarotoxina fluorescente marcada, b) Se sigui el mismo procedimiento que el descrito en a, excepto que junto con los transcriptos para las subunidades receptoras se inyectaron transcriptos RNAm para a protena 43K. Slo se observa agrupamiento del receptor sobre la superficie del oocito cuando se inyecta conjuntamente RNAm que codifica la protena 43K y RNAm que codifica las subunidades receptoras. (Segn Stanley C. Froehner y cois. Neuron 5:404, 1990; con permiso de Cell Press.)

Wfim

en los cuales se inyectan oocitos de anfibios.15 Cuando se inyecta RNA mensajero que slo codifica las subunidades nAChR dentro de un oocito, el RNAm se traduce al receptor, el cual se incorpora a la membrana plasmtica del oocito. Cuando subsecuentemente se tratan estas clulas con bungarotoxina marcada, se observa que la toxina se enlaza de manera uniforme a la superficie de la clula, lo que indica la distribucin pareja del nAChR dentro de la membrana plasmtica (fig. VE 4-6, a). Por lo contrario, si el RNAm para las subunidades nAChR se inyecta conjuntamente con RNAm que codifique la protena 43K, los receptores ya no se distribuyen uniformemente en la membrana, sino que aparecen en agrupamientos (fig. VE 4-6, fc). Estos agrupamientos tambin contienen la protena 43K sobre la superficie interna de la membrana. La protena 43K tal vez desempee un papel importante en causar el agrupamiento de las molculas nAChR durante la formacin de la sinapsis neuromuscular en el embrin y la fijacin de las molculas del receptor en esas sinapsis a partir de entonces. Tambin se ha implicado a una segunda protena denominada agrina como factor fijador de los nAChR a la membrana sinptica.revisada en 16 BIBLIOGRAFA 1. Langley, J.N. 1906. On nerve endings and on special excitable substances in cells. Proc. Roy. Soc. Lond. 78:170-194. 2. Loewi, O. 1921. Uber humorale ubertragbarkeit der herznervenwirkung. Pfluger's Ard. 214:239-242. (A review of Loewi's work written by him in English can be found in Harvey Lects. 28:218233, 1933.) 3. Marnay, A. 1937. Cholinesterase dans l'organe electrique de la torpille. Compte Rend. 126:573-574. (A review of Nachmanson's work written in English can be found in hs book entitled Chemical and Molecular Basis of Nerve Action, 2a. edicin, Academic Press, 1975.)

4. Chang, C.C. y Lee, C.Y. 1963. Isolation of the neurotoxns from the venom of Burgarus multicinctus and their modes of neuromuscular blocking action. Archs. Int. Pharmac. Ther. 144:241-257. 5. Lee, C.Y. y Tseng, L.F. 1966. Distribution of Bungarus multicinctus venom following envenomation. Toxican 3:281-290. 6. Olsen, R.W., Meunier, J.C., y Changeux, J.P. 1972. Progress in the purification of the cholinergic receptor protein from Electrophorus electricus by affinity chromatography. FEBS Letters 28:96-100. 7. Weill, C.L., McNamee, M.G. y Karlin, A. 1974. Affinity-labeling of purified acetylcholine receptor from Torpedo californica. Bioc. Biop. Res. Comm. 61:997-1003. 8. Hazelbauer, G.L. y Changeux, J.P. 1974. Reconstitution of a chemically excitable membrane. Proc. Nati Acad. Sci. U.S.A. 71:14791483. 9. Popot, J.L., Cartaud, J. y Changeux, J.P. 1981. Reconstituion of a functional acetylcholine receptor. Eur. ]. Biochem. 118:203-214. 10. Schiebler, W. y Hucho, F. 1978. Membrane rch in acetylcholine receptor: Characterization and reconstitution to excitable membrane from exogenous lipids. Eur. ]. Biochem. 85:55-63. 11. Brisson, A. y Unwin, N. 1984. Tubular crystals of acetylcholine receptor. /. Cell Biol 99:1202-1211. 12. Unwin, N. 1993. Acetylcholine receptor at 9 A resoluion. J. Mo. Biol. 229:1101-1124. 13. Eisele, J.-L., y cois. 1993. Chimaeric nicotinic-serotonergic receptor combines distinct ligand binding and channel specificities. Nature 366:479-483. 14. Cartaud, J. y cois. 1981. Consequences of alkaline trearment for the ultrastructure of the acetylcholine-receptor-rich membranes from Torpedo marmoria electric organ. /. Cell Biol. 90:418-426. 15. Froehner, S.C. y cois. 1990. The postsynaptic 43K protein clusters muscle nicotinic acetylcholine receptors in Xenopus oocytes. Neuron 5:403-410. 16. Hoch, W., Campanelli, J.T. y Scheller, R.H. 1994. Agrin-induced ciustering of acetylcholine receptors: A cytoskeletal link. /. Cell Bioi. 126:1-4.

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CAPITULO 4 Estructura y funcin de la membrana plasmtica

SINOPSIS
Las membranas plasmticas son estructuras delicadas notablemente delgadas, pero desempean un papel clave en muchas de las funciones ms importantes de la clula. La membrana plasmtica separa la clula viviente de su entorno; suministra una barrera selectivamente permeable que permite intercambiar ciertas sustancias, en tanto que evita el paso de otras; contiene el mecanismo que fsicamente transporta sustancias de un lado al otro de la membrana; tambin contiene receptores que se unen a ligandos especficos en el espacio externo y transmiten informacin de los compartimientos internos de la clula; media interacciones con otras clulas; suministra un armazn en el cual se pueden organizar componentes; es un sitio transductor de energa de un tipo a otro (p. 116). Las membranas son ensamblados de lpidos y protenas en los cuales los componentes se mantienen reunidos en una delgada capa por enlaces no covalentes. La membrana se mantiene unida en una lmina mediante una bicapa de lpidos que consta de una capa bimolecular de lpidos anfipticos cuyos grupos polares enfrentan el exterior y colas lpidas acil hidrfobas enfrentadas al interior. Entre los lpidos se incluyen fosfoglicridos, como fosfatidilcolina; lpidos a base de esfingosina, como el fosfolpido esfingomielina, y cerebrsidos que contienen carbohidratos y ganglisidos (glucolpidos), y colesterol. Las protenas de la membrana se pueden dividir en tres grupos: protenas integrales que penetran y atraviesan la bicapa de lpidos con porciones expuestas sobre ambas superficies de la membrana: citoplsmica y extracelular; protenas perifricas presentes por completo en el lado externo de la bicapa de lpidos, pero unidas mediante enlaces no covalentes con los grupos polares de la bicapa de lpidos o con la superficie de una protena integral; y protenas ancladas a los lpidos externos de la bicapa de lpidos pero unidas mediante enlace covalente a un lpido que forma parte de la bicapa. En condiciones tpicas, los segmentos transmembrana de una protena integral se presentan como hlices alfa, que pueden ser predominantemente hidrfobas cuando simplemente atraviesan la bicapa o anfipticas si revisten un canal acuoso interno (p. 118). Las membranas son estructuras muy asimtricas cuyas dos hojas tienen propiedades diferentes. Por ejemplo, todas las cadenas de carbohidrato de la membrana se apartan del citoplasma; muchas protenas integrales poseen sitios sobre su superficie extracelular que interactan con ligandos extracelulares, y sitios sobre su superficie interna que interactan con protenas perifricas que forman parte del esqueleto interno de la membrana; el contenido de fosfolpidos de las dos mitades de la bicapa es altamente asimtrico. La organizacin de las protenas dentro de la membrana se observa mejor en rplicas de fracturas por congelacin en las cuales se congelan clulas, sus membranas se separan a travs del centro de la bicapa por un plano de fractura y la superficie interna expuesta se visualiza mediante la formacin de una rplica metlica (p. 131). El estado fsico de una bicapa de lpidos tiene consecuencias importantes en la movilidad lateral de fosfolpidos y protenas integrales. La viscosidad de la bicapa y la temperatura a la cual sufre a transicin de fase depende del grado de insaturacin y longitud de la cadena lipoacil de los fosfolpidos. Para muchas actividades celulares es importante mantener la fluidez de la membrana, incluyendo transduccin de seales, divisin celular y formacin de regiones especializadas en la membrana. La difusin lateral de protenas dentro de la membrana se demostr originalmente mediante fusin de la clula y se puede cuantificar con tcnicas que siguen el movimiento de protenas marcadas con compuestos fluorescentes o marcadores electrnicamente densos. La medicin del coeficiente de difusin de protenas integrales sugiere que la mayor parte son sometidas a influencias restrictivas que inhiben su motilidad. Las protenas pueden ser restringidas por su asociacin a otras protenas integrales o a protenas perifricas localizadas en ambas superficies de la membrana. Debido a estos diferentes tipos de restriccin las membranas pueden lograr un grado considerable de estabilidad de organizacin, gracias a la cual se pueden diferenciar entre s regiones particulares de la membrana (p. La membrana plasmtica del eritrocito contiene dos protenas integrales principales, banda 3 y glucoforina, y un esqueleto interno bien definido compuesto de protenas perifricas. Cada subunidad de la banda 3 atraviesa la membrana cuando menos una docena de veces y contiene un canal interno a travs del cual se intercambian aniones bicarbonato y cloro. La glucoporfirina es una protena altamente glucosilada de funcin desconocida que contiene un solo dominio transmembrana consistente en una hlice a hidrfoba. El principal componente del esqueleto de la membrana es la protena fibrosa espectrina que interaca con otras protenas perifricas, como la anquirina, para suministrar apoyo a la membrana y restringir la difusin de sus protenas integrales (p. 139). La membrana plasmtica es una barrera selectivamente permeable que permite el paso de solutos por diferentes mecanismos, incluyendo difusin simple a travs de la bicapa de lpidos o de los canales de la membrana, difusin facilitada y transporte activo. La difusin es un proceso independiente de energa en el cual un soluto se mueve a favor de un gradiente electroqumico, disipando la energa libre almacenada en el gradiente. Pequeos solutos inorgnicos, como 2, C2 y t^O penetran con facilidad en la bicapa de lpidos, igual que los solutos con coeficiente de particin elevado (liposolubilidad elevada). Iones y solutos orgnicos polares, como azcares y aminocidos, requieren transportadores especiales para entrar o salir de la clula (p- 141). El agua se desplaza por osmosis directamente a travs de la bicapa de lpidos de una membrana semipermeable desde una regin con baja concentracin de soluto (compartimiento hipotnico) a otra con concentracin elevada de soluto

CAPITULO 4 Estructura y funcin de. la membrana plasmtica

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(compartimiento hipertnico). La osmosis desempea un papel clave en gran nmero de actividades fisiolgicas. Por ejemplo, en plantas, el ingreso de agua genera presin por turgencia contra la pared celular que ayuda a apoyar los tejidos no leosos. Los iones difunden a travs de una membrana plasmtica por medio de canales especiales revestidos de protena que con frecuencia son especficos para iones particulares. Los canales inicos de ordinario son abiertos y controlados por voltaje o ligandos qumicos, como los neurotransmisores (p. 143).

Difusin facilitada y transporte activo implican protenas integrales de membrana que se combinan especficamente con el soluto que transportan. Los facilitadores del transporte actan sin aporte de energa y tienen capacidad para desplazar solutos en ambas direcciones a travs de la membrana, siguiendo su gradiente de concentracin. Se cree que actan cambiando su conformacin, la cual expone el sitio de unin al soluto alternativamente en ambos lados de la membrana. El transportador de glucosa es un facilitador del transporte cuya presencia en la membrana plasmtica se estimula incrementando la concentracin de insulina. Los transportadores activos requieren aporte de energa y mueven iones y solutos contra un gradiente de concentracin. Los transportadores activos tipo P, como la ATPasa Na + -K + , son operados por la transferencia de un grupo fosfato del ATP al transportador, lo que cambia su afinidad hacia el ion transportado. Los sistemas secundarios de transporte activo aprovechan la energa almacenada en un gradiente inico para transpotar un segundo soluto contra un gradiente. Por ejemplo, el transporte activo de glucosa a travs de la superficie apical de una clula epitelial del intestino es operado por el cotransporte de Na + a favor de su gradiente electroqumico (p. 147).

El potencial de reposo a travs de la membrana plasmtica se debe principalmente a la limitada permeabilidad de la membrana al K + y est sujeto a cambios espectaculares. El potencial de reposo de una clula tpica, nerviosa o muscular, es de casi - 70 mV (interior negativo). Cuando se despolariza la membrana de una clula excitable ms all de un valor umbral, se inician acontecimientos que abren las compuertas de los canales de Na + y permiten el ingreso de Na + al interior, lo que provoca inversin del voltaje a travs de la membrana. Despus de que se abren las compuertas del Na + se cierran en cuestin de milisegundos y entonces se abren los canales de potasio, lo que provoca la salida de K + al exterior y el restablecimiento del potencial de reposo. La serie de cambios espectaculares en el potencial de membrana luego de la despolarizacin constituye un potencial de accin (p. 155). Una vez iniciado un potencial de accin, se convierte en un proceso de autopropagacin. La propagacin se debe a la despolarizacin que acompaa al potencial de accin generado en un sitio de la membrana suficiente para despolarizar la membrana adyacente, donde a su vez se inicia un potencial de accin, En un axn mielinizado, el potencial de accin producido en un nodulo de la vaina es capaz de despolarizar la membrana en el siguiente nodulo, lo que permite que el potencial de accin salte rpidamente de un nodulo a otro. Cuando el potencial de accin alcanza los botones terminales de un axn se abren las compuertas de calcio en la membrana plasmtica y permiten el flujo hacia adentro de Ca2+, el cual desencadena la fusin de membranas de las vesculas secretorias que contienen el neurotransmisor con la membrana plasmtica situada por arriba. El neurotransmisor difunde a travs de la hendidura sinptica, donde se enlaza a receptores en la membrana postsinptica induciendo la despolarizacin o la hiperpolarizacin de clulas especficas (p. 156).

PREGUNTAS DE REPASO
1. Elaborar una lista de algunas funciones importantes de las membranas para la vida de las clulas eucariotas. 2. Describir la estructura y propiedades de una bicapa artificial de lpidos. 3. Por qu se requieren detergentes para solubilizar as protenas de la membrana? Cmo se puede determinar la diversidad de as protenas integrales que residen en una fraccin purificada de membrana? 4. Cul es la importancia de la insaturacin de los cidos grasos sobre la fluidez de la membrana? De las enzimas capaces de insaturar cidos grasos? 5. Describir la asimetra de la membrana plasmtica en trminos de cada uno de sus principales elementos: protenas, lpidos y carbohidratos. 6. Describir las propiedades de los tres tipos de protenas de membrana (integral, perifrica y anclada a lpidos) en que difieren una de la otra y corno varan entre s. 7. Qu significa rplica por fractura de congelacin? En qu difiere la rplica de una fractura por congelacin y una rplica lograda mediante la tcnica de congelacin al aguafuerte respecto de la informacin que suministran de la membrana plasmtica? 8. Comparar la velocidad de difusin lateral de un lpido con la de flip-flop. Cul es la razn de esa diferencia? 9. Por qu es importante la fluidez de la membrana para la clula? 10. Cmo puede existir una carga inica diferente en ambos lados de una bicapa de lpidos? 11. Describir las tres tcnicas que pueden emplearse para medir la velocidad de difusin de una protena de membrana especfica. 12. Comparar y contrastar las cuatro diferentes maneras bsicas de desplazamiento de una sustancia a travs de una membrana plasmtica (segn se indica en la figura 4-32). 13. Comparar las diferencias energticas entre la difusin de un electrlito en comparacin con la de un no electrlito a travs de la membrana. 14. Describir la relacin entre coeficiente de particin y tamao de partcula en relacin con la permeabilidad de la membrana.

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CAPITULO 4 Estructura y funcin de a membrana plasmtica

15. Explicar los efectos de colocar una clula en un medio hipertnico, uno hipertnico o uno isotnico. 16. Describir dos maneras de aprovechar la energa para desplazar iones y solutos contra un gradiente de concentracin. 17. De qu manera ilustra la ATPasa de Na + -K + la lateralidad de la membrana plasmtica? 18. Cul es el papel de la fosforilacin en el mecanismo de accin de la ATPasa de Na+-K + ?

19. Cul es el papel de la vaina de mielina en la conduccin de un impulso? 20. Describir ios pasos entre el momento en que un impulso alcanza el botn terminal de una neurona presinptica y la generacin de un potencial de accin en una clula postsinptica.

PREGUNTAS ANALTICAS
1. Qu tipo de protenas integrales podra esperarse que residan en la membrana plasmtica de una clula epitelial que estuvieran ausentes en la de un eritrocito? Cmo se relacionan estas diferencias con las actividades de estas clulas? 2. Muchos tipos diferentes de clulas poseen receptores que se unen a hormonas esteroides. En qu sitio de la clula piensa usted que podran residir esos receptores? En qu sitio de la clula podra esperarse que resida el receptor de insulina? Por qu? 3. Cuando se public por primera vez el aspecto trilaminar de la membrana plasmtica, las imgenes se tomaron como evidencia que apoya el modelo de Davson-Danielli de la estructura de la membrana plasmtica. Por qu piensa usted que esas micrografas se interpretaron de esa manera? Qu evidencia se podra emplear para argir contra esa interpretacin? 4. Supongamos que usted planea utilizar liposomas para tratar de administrar frmacos a un tipo particular de clula del cuerpo, por ejemplo, clulas adiposas o musculares. Hay alguna forma de construir el liposoma para incrementar su especificidad? 5. Cmo es que polisacridos diferentes, como almidn y glucgeno, y los oligosacridos sobre las superficies de la membrana plasmtica pueden participar en interacciones especficas? Cmo se ilustra esta caracterstica al determinar el tipo sanguneo de una persona antes de administrarle una transfusin? 6. La tripsina es una enzima que puede digerir las porciones hidrfilas de las protenas de membrana, pero no puede atravesar la bicapa de lpidos y entrar a las clulas. Debido a estas propiedades, se emplea la tripsina junto con EGPADSS para determinar cules protenas tiene un dominio extracelular. Describir un experimento utilizando tripsina para determinar la lateralidad de las protenas de la membrana del eritrocito. 7. Describira usted el segmento transmembrana S4 del canal inico K + como una hlice hidrfoba, una hlice antiptica o de algn otro tipo? Por qu? 8. Supongamos que usted cultiva una poblacin de bacterias a 15C y luego eleva la temperatura del cultivo a 37C. Qu efecto podra tener sobre la composicin de los cidos grasos de la membrana? Sobre la temperatura de transicin de la bicapa de lpidos? Sobre la actividad de las desaturasas de la membrana? 9. Obsrvese la figura 4-6. Qu lpidos sera de esperar que tuvieran la mayor velocidad de flip-flop? Cules tendran la menor? Por qu? Si experimentalmente se determinara que la fosfatidilcolina muestra realmente la mayor velocidad flip-flop, cmo explicara usted este dato?; cul sera la expectativa si se compara la velocidad flip-flop de fosfolpidos contra una protena integral?; por qu? 10. S usted leyera que la administracin de uabana bloquea la captacin de glucosa en el intestino de un animal de laboratorio, concluira que la uabana debe ser un inhibidor del simporte de Na+-glucosa? Por qu s o por qu no? 11. Si se inyecta al axn gigante del calamar un pequeo volumen de solucin que contenga 0.1 M NaCl y 0.1 M KC1, en la cual ambos iones Na + y K + estn marcados con istopos radiactivos, cul de los iones marcados cree usted que aparecera con mayor rapidez en el medio (agua de mar) en tanto la neurona permanece en reposo? Despus de estimular la neurona para generar algunos potenciales de accin? 12. Cuando se trata a eritrocitos con neuraminidasa, una enzima que elimina el cido silico de las gucoprotenas, y luego se inyectan al animal del cual se extrajeron, los estudios indican que el bazo elimina los eritrocitos de la corriente sangunea. Puede usted elaborar una hiptesis para explicar lo que ocurre? 13. Por qu los coeficientes de difusin medidos para lpidos dentro de la membrana tienden a estar ms prximos a los valores esperados para difusin libre que los medidos para protenas integrales en las mismas membranas? 14. Asumiendo que la membrana plasmtica de una clula de pronto fuera permeable en igual magnitud tanto a iones Na + comoK+ y que cada ion respondiera a su gradiente de concentracin en igual magnitud, podra esperarse que estos dos iones se movieran a travs de la membrana a la misma velocidad? Por qu s o por qu no? 15. La mayor parte de los invertebrados marinos no pierden ni ganan agua por osmosis, en tanto que casi todos los vertebrados marinos sufren prdida continua de agua en un ambiente salino concentrado. Suponer las bases de esta diferencia y por qu puede reflejar diferentes vas de evolucin de los dos grupos. 16. Corno se compara la concentracin de solutos dentro de una clula vegetal con la de los lquidos extracelulares? Sera de esperar que lo mismo fuera cierto para las clulas de un animal? 17. Cules seran las consecuencias de conducir un impulso si los canales de Na+ fueran capaces de reabrirse de inmediato luego de cerrarse durante el potencial de accin?

CAPITULO 4 Estructura y funcin de la membrana plasmtica

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CAPITULO

Respiracin aerobia y mitocondrias

5-1 Estructura y funcin de las mitocondrias 5-2 Metabolismo oxidativo en el citoplasma y las mitocondrias 5-3 Papel de las mitocondrias en la formacin de ATP La perspectiva humana: Papel del metabolismo anaerobio y aerobio en el ejercicio 5-4 Translocacin de protones y establecimiento de una fuerza motriz de protones 5-5 Mecanismo para la formacin de ATP 5-6 Importacin de las protenas rnitocondriales 5-7 Peroxisomas La va experimental: Acoplamiento de oxidacin a fosforilacin

FIGURA 5-A. Gammagrama seudocoloreao de un hepatocito fracturado que muestra las formas y la estructura interna de las mitocondrias. (Cortesa de Lennart Nsson.)

n los primeros 2 000 millones de aos de vida en el planeta, la atmsfera consisti principalmente en molculas reducidas, como hidrgeno molecular (H^), amoniaco (NHs) y H^O. En ese periodo la Tierra estuvo poblada por anaerobios, microorganismos que captan y utilizan la energa por medio de un metabolismo independiente de oxgeno (anaerobio), como la gluclsis y a fermentacin. Luego aparecieron las cianobacterias, un nuevo tipo de microorganismos que efectan una forma diferente de proceso fotosinttico en el cual se separan molculas de agua y se libera oxgeno molecular (02). Las cianobacterias tuvieron gran xito, y los ocanos, los lagos y la atmsfera rpidamente se llenaron del nuevo gas. Segn se analiza en la pgina 34, el oxgeno puede ser una sustancia muy txica que capta electrones extra y reacciona con gran variedad de molculas biolgicas. La primera vez que apareci el oxgeno debi haber provocado la muerte por oxidacin a todos los microorganismos, menos a unos cuantos tipos. Sin embargo, con el tiempo evolucionaron especies que no slo estaban protegidas de los efectos dainos del oxgeno molecular, sino que posean vas metablcas que utilizan esas molculas con gran provecho. En ausencia de oxgeno, los microorganismos slo pueden extraer una limitada cantidad de energa de sus nutrientes, excretando productos como cido lctico y etanol, incapaces de metabolismo adicional. Por lo contrario, los microorganismos que incorporan 2 en su estrategia metablica pueden oxidar por completo compuestos como C2 y H^O, y en el proceso extraer un porcentaje mucho mayor del

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CAPITULO 5 Respiracin aerobia y mitocondrias

contenido energtico de dichos compuestos. Esos microorganismos que se convirtieron en dependientes de oxgeno fueron los primeros aerobios sobre la tierra y finalmente dieron lugar a todos los procariotes y eucariotes dependientes de oxgeno que viven en la actualidad. En los eucariotes, el aprovechamiento de oxgeno para extraer energa tiene lugar en organelos especializados, las mitocondrias.

Estructura y funcin de las mitocondrias

A diferencia de la mayor parte de los organelos citoplsmicos, las mitocondrias son lo bastante grandes para observarse con el microscopio de luz (fig. 5-1, a) y su presencia dentro de la clula se conoce desde hace algunos cientos de aos. Aun antes de que empezara este siglq ya se haban aislado mitocondrias de tejidos disecando las clulas con una aguja fina, y se describieron algunas de las propiedades de estos organelos. Por ejemplo, se demostr que las mitocondrias eran osmticamente activas; o sea, que se hinchan en un medio hipotnico y se encogen en un medio hipertnico. Esta propiedad sugiere que las mitocondrias estn rodeadas por una membrana semipermeable parecida a la que rodea a la propia clula. Igual que muchos otros organelos, la mitocondria posee caractersticas morfolgicas reconocibles, pero muestra gran variabilidad en su apariencia. Las mitocondrias tpicas tienen forma de salchicha (fig. 5-1, b), aproximadamente 0..2 ^ajLO_iwm_de_di.m_etro_. en corte transversal y 1 -a 4 m de longitud. El hecho de que las mitocondrias tengan un tamao similar al de las bacterias es algo ms que una simple coincidencia, puesto que numerosas pruebas sugieren_que estos organelos evolucionaron a partir de bacterias que vi-

van en simbiosis-dentro de otras clulas. En algunas clulas", como las del embrin inicial, las mitocondrias tienen forma casi esfrica, en tanto que en otros, como los fibroblastos, son estructuras alargadas fibrinosas (fig. 5-1, a). En concordancia con su funcin principal de.poner_la ''Ienerga a disponibilidad de la clulafel tamao y nmero de las mitocondrias y_su localizacin dentro de la clula "varan efe un tipo de clula a otro. Un hepatocito promedio de mamfero contiene casi 1 500 mitocondrias, que corresponde o 15 o 20% del volumen celular. Las mitocondrias sgn_io_ddvajns.abundantes en las-clulas musculares^que requieren gran_cantidad de_ATPj:omo combustible para la contraccin. Las mitocondrias a menudo se relacionan con gotas oleosas que contienen cidos grasos y de las cuales obtienen !a materia prima que deben oxidar. En las clulas del espermatozoide se observa una disposicin particularmente notable de las mitocondrias, donde se localizan en la "porcin meda" de la clula, justo por detrs del ncleo (fig. 5-1, c). Los movimientos del espermatozoide pueden efectuarse gracias a la energa suministrada por el ATP de estas mitocondrias. Las mitocondrias tambin son prominentes en muchas clulas vegetales, donde proporcionan el suministro primario de ATP a tejidos que no efectan fotosntesis, y tambin son fuente de ATP para las clulas de hojas fotosintticas durante periodos de oscuridad. En la micrografa de la figura 5-2, a, se muestra la estructura interna de una mitocondria, y en la figura 5-2, b, se presenta esquemticamente. El papel de la mitocondria cqmp_ tramdjicJOT cle^ a las membranas.tan prominentes de las micrografas electrnicas de estos organelos. Cada mitocondriajzontiene una_ jnembrana exterrj^L.unxoBiple|o-sis.tema de membranas _intemas;JLa. membrana externa envuelve gpr~ccjmpteto._a la mitocondria y sirve como frontera exterior. Una parte de

Mitocondria

(b)

(c)

I'';riA .">- Mitocondria. a) Fibroblasto viviente observado con microscopio de contraste de fases. Las mitocondrias se ven como corpsculos oscuros alargados, b) Micrografa electrnica de transmisin de una delgada seccin a travs de una mitocondria que revela la estructura interna del organelo, particularmente los pliegues membranosos (crestas) de la membrana interna, c) Localizacin de las mitocondrias en la pieza media del espermatozoide que rodea la porcin proximal del flagelo, (a: Cortesa de Norman K. Wcssels; b: K.R. Portcr/Photo Researchers; c: cortesa de Don W. Fawcett.)

CAPITULO 5 Respiracin aerobia y mitocondrias

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la membrana interna _se_sita_jus_to poj^dentro_de_la menv brana externa, pero gran parte de ella forma_pliegues^rofundqs ojnyagnaciones llamadascrggtas (figs. 5-1, b, y 5-2). En algunas clulas, como el hepatocito de mamfero, las crestas son hojas anchas que ocupan todo el dimetro transversal de la mitocondria. En la mayor parte de las clulas vegetales, las crestas tienen forma ms tubular. En los pliegues de la membrana interna aumenta mucho la superficie disponible para alojar el mecanismo necesario para la respiracin aerobia. Las membranas de la mitocondria dividen_el. organelo en dos compartimientos acuosos, uno_entre e\o de la mitocondria Denominado matriz y otro compartimiento entre las membra^extern ejnterna, dgngminado_espac^inter_membrana^La matriz tiene consistencia parecida a un gel por la presencia de una elevada concentracin de protenas hidrosolubles (hasta 500 mg/ml). En las micrografas y diagramas de las figuras 5-1 y 5-2 el espacio intermembrana aparece ms bien limitado, pero durante la respiracin activa este compartimiento puede ser muy extenso.

Membranas mitocondriales
Las membranas externa e interna tienen propiedades muy diferentes. La membrana externa contiene casi 50% de lpi. dos en pesoyima curiosa mezda de enzimas quejparticipan en actividades tan diversas como oxidacin de adrenalina, descornp^sjan^detriptf^o_yjalargamiento dejcidos gra^ .ggsjrlo contrario, T_ membrana interna tiene una relacin q.ue corresponde _a .una-m&lcula-.de_prptena gor cada 15 fpsfolgjdos, aproximadamente). Dentro de la compleja estructura de esta membrana se encuentran cuando menos .6.0. poiippdos diferentes. La membrana interna casi^est desprovista dejrolesterol y es rica en UTI fosfolpjdp_.p_gcq^a: jnjn^la cardioUgiria (difosfatidilglicerol, cuya estructura se muestra en la figura 4-6); ambas caractersticas corresponden a la membrana plasmtica de las bacterias, de la cual se presume que durante la evolucin se deriv la membrana mitocondrial interna. Se cree que la membrana mitocondrial externa proviene de una membrana externa observada como parte de la pared celular de ciertas clulas bacterianas (fig. 5-3); ambas contienen porinas, protenas integrales quefor.-^ man grandes gnales ncTselctivos en la membrana. Gracias a las_pornas,_la^ membrana externa es especialmente permeabjeyp^rmiieqlolculasma^^g^g'e IfJQQfJ daltons pasen libremente hacia el_espacio intermembrana.. Por lo tanto, para la mayor parte de los solutos el espacio intermembrana se contina con el citoplasma. Forjo contrario, la membrana interna es bastante impermeable; casi todas las mol^Ta^yTDTies^reqeren transportadores espcialessituados_en_ dicha membrana- interna para tener acceso a la matriz.___ Como analizaremos en la siguientes secciones, la composicin y la organizacin de la membrana interna son la clave de las actividades bioenergticas del organelo. Adems, por contener una gran variedad de sistemas de transporte, en la membrana mitocondrial interna reside la mayor parte del mecanismo necesario para la sntesis de ATP.

Crestas

Membrana interna

Partculas de ATP-sintasa

FIGL'KA 5-2. Estructura de una mitocondria. a) Gammagrama de una mitocondria congelada, fracturada y tratada al "aguafuerte" para resaltar los relieves que muestran la matriz interna encerrada por los pliegues de la membrana interna, b) Esquema que muestra la estructura interna de una mitocondria. (a: Segn K. Tanaka, Int. Rev. Cytol. 68:111, 1980.)

La arquitectura de la membrana interna y la aparente fluidez de su bicapa facilitan la interaccin de los componentes requeridos para la formacin de ATP.

La matriz mitocondrial
Adems de las diferentes enzimas, la matriz mitecondriaL tambin contiene.ribosomas (de tamao mucho menor que

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CAPITULO 5 " Respiracin aerobia y mitocondrias

Membrana externa

Pepidoglicano Membrana plasmtica

0.4 /m

FIGURA 5-4. Fisin mitocondrial. Micrografa electrnica de las mitocondrias de las clulas de un insecto fijadas durante el proceso de desdoblamiento. (Segn W.. Larsen, J. Cell Biol. 47:379, 1970, con permisa de RockefeUer University Press.) Protena de transporte FIGURA 5-3. Porinas. Las bacterias gramnegativas poseen una membrana externa que contiene lpidos por fuera de la membrana plasmtica como parte de su pared celular. Esta membrana externa contiene protenas, denominadas porinas, que constan de una hoja fi como barril y forman una abertura a travs de la cual puedan penetrar molculas de tamao moderado. Las porinas tambin se observan en la membrana mitocondrial externa de clulas eucariotas.

citoplsmica de este importante ion an est sujeta a controversia. En breve retornaremos el anlisis de la estructura y funcin de las mitocondrias, pero primero es til considerar el papel de estos organelos en las vas oxidativas bsicas de las clulas eucariotas (resumido en la figura 5-5).

!os encontrados en el citoplasma) y_mo_lculas de DNA circular; de doble cadena (fig-. 5-2, b). Por lo tanto, la mitoco" ^ _ _ . el mecanismo para elaborar RA y protenas propias. Este DNA no cromosmico~es~rnporTante porque" codifica un pequeo nmero de polipptidos mitocondriales (13 en el hombre) integrados a la membrana mitocondrial interna junto con polipptidos codificados por genes residentes en el ncleo e importados desde el sitio donde se sintetizan en el citoplasma (vase seccin 5-7). La observacin de clulas vivientes desarrolladas en cultivo ha demostrado que las mitocondrias son organelos dinmicos que cambian su forma, se desplazan de un sitio a otro dentro del citoplasma y sufren ramificaciones. Adems, se puede observar que las mitocondrias se fusionan entre s y tambin pueden sufrir fisin. Igual que las membranas se originan de membranas previas y las clulas de clulas anteriores, las mitocondrias se originan por fisin de mitocondrias ya existentes (fig. 5-4). Adems de un sistema gentico, la matriz mitocondrial con frecuencia contiene filamentos y granulos densos. Un tipo de granulos contiene una reserva de iones calcio en forma de fosfato de calcio precipitado. Las mitocondrias son acumuladores activos de ion calcio, aunque su papel para regular la concentracin

5-2 Metabolismo oxidativo en el citoplasma y las mitocondrias

En el captulo 3 se describieron las etapas iniciales de la oxidacin de carbohidratos. Las enzimas de la gluclisis efectan los primeros pasos del proceso de oxidacin de la glucosa; estas enzimas se localizan en el citoplasma (fig. 5-5). En la figura 3-23 se ilustraron las 10 reacciones que componen la va glucoltica, y en la figura 5-6 se resumen los principales pasos de la va. La gluclisis se inicia con la activacin de una molcula de glucosa por fosforilacin de dos tomos de carbono dei azcar a expensas de dos molculas de ATP. El producto, fructosa 1,6-difosfato, es un difosfato de seis carbonos, que a continuacin se desdobla en dos monofosfatos de tres carbonos. En reacciones subsecuentes, el aldehido de tres carbonos se oxida a un cido de tres carbonos y genera una molcula de NADH, y los dos grupos fosfato se transfieren sucesivamente al ADP, generando dos molculas de ATP por fosforilacin a nivel sustrato. La eliminacin del segundo fosfato genera piruvato, uno de los productos de la gluclisis. Durante la gluclisis, la clula slo puede aprovechar una pequea fraccin de la energa libre disponible en la glucosa, suficiente para sintetizar dos molculas de ATP por cada molcula oxidada de glucosa (fig. 5-6). La mayor

CAPITULO 5 Respiracin aerobia y mitocondrias Glucosa

175

Membrana plasmtica

Oxigeno ausente

ATP

C
.^Cadena transporte Lactato

NAO4

Dixido de carbono y agua

FIGURA ;>-;>. Diagrama del metabolismo de carbohidratos en clulas eucariotas. Las reacciones de gluclisis generan piruvato y NADH en el citoplasma. En ausencia de C>2, el piruvato se reduce a lactato (u otro producto de fermentacin, como etanol en las levaduras), que se excreta, en tanto que el NAD+ se vuelve a utilizar para continuar la gluclisis. En presencia de O^ el piruvato se desplaza al interior de la matriz (facilitado por un transportador de membrana), en donde se descarboxila y se une a la coenzirna A (CoA), una reaccin que genera NADH. El NADH producido durante la gluclisis dona sus electrones de alta energa a un compuesto que atraviesa la membrana mitocondrial interna, llevando los electrones a FAD (o NAD+) para formar FADH2 (o NADH). La acetil-CoA ingresa al ciclo del cido tricarboxlico (como se muestra en la figura 5-8), que genera GTP, NADH y FADH2. Los electrones de estas molculas de NADH y FADH2 viajan a lo largo de la cadena transportadora de electrones, constituida por portadores integrados en la membrana mitocondrial interna, hasta el O2 molecular. La energa liberada durante el transporte de electrones se emplea para la sntesis de ATP mediante un proceso analizado en detalle posteriormente en este captulo. Si toda la energa del transporte de electrones fuera utilizada para la sntesis de ATP se podran generar aproximadamente 36 ATP (incluyendo GTP) a partir de una sola molcula de glucosa.

parte de la energa permanece almacenada en el piruvato. Cada molcula de NADH sintetizada durante la oxidacin de gliceraldehido 3-fosfato tambin transporta un par de "electrones de alta energa". Los dos productos de la gluclisis, piruvato y NADH, se pueden metabolizar siguiendo dos vas muy diferentes, segn el tipo de clula en la cual se generan y la presencia o ausencia de oxgeno. Aunque el tema principal de este captulo es la respiracin aerobia (o sea, dependiente de oxgeno) y el papel de la mitocondria, es importante considerar de manera breve una va alterna mediante la cual las clulas pueden continuar produciendo ATP en ausencia de oxgeno. Oxidacin anaerobia del piruvato: proceso de fermentacin Es evidente que la gluclisis puede suministrar a la clula una pequea cantidad neta de ATP por cada molcula de glucosa oxidada. Sin embargo, como se analiza en La perspectiva humana, en la pgina 182, as reacciones glucolticas ocurren a gran velocidad, de modo que por esta va una

clula puede producir una cantidad significativa de ATP. En realidad, algunas clulas, incluyendo clulas de levadura, clulas tumorales y clulas musculares, dependen mucho de la gluclisis para la sntesis de ATP. Sin embargo, estas clulas deben confrontar un problema. Uno de los productos de la oxidacin del gliceraldehido 3-fosfato es NADH. La formacin de NADH ocurre a expensas de uno de los reactantes, NAD+, cuyo suministro es escaso para la clula. Puesto que en este importante paso de la gluclisis se requiere NAD + como reactante, ste debe regenerarse a partir de NADH. Cuando esto no ocurre, la reaccin no tiene lugar ni pueden proseguir las reacciones de la gluclisis que dependen de ese producto. Sin embargo, en ausencia de oxgeno no puede oxidarse NADH a NAD + por medio de la cadena transportadora de electrones, puesto que el oxgeno es el aceptor final de electrones en la cadena. Las clulas tambin pueden regenerar NAD+ por fermentacin transfiriendo electrones del NADH al piruvato, producto final de la gluclisis, o a un compuesto derivado de piruvato (fig. 5-7). Igual que la gluclisis, la fermentacin tiene lugar en el citoplasma de la clula eucariota (fig. 5-5). En la mayor parte de los microorganismos que dependen de O^

176

CAPITULO 5 Respiracin aerobia y mitocondrias

CH2OH

Glucosa
OH N
H

OH
OH

K1ATP
c

^ 1 ADP

0
2

K
3
x 0\

1ATP

La glucosa es fosforilada a expensas de un ATP, sufre redistribucin estructural para formar fosfato de fructosa, y luego es fosforilada una vez ms a expensas de un segundo ATP. Los dos grupos fosfato se sitan en los dos extremos (C1, C6) de la cadena de fructosa.

1 ADP
o PLJ opo
2 3

Fructosa 1,6-difosfato

| f
OH

i n H

o
0
2

t
H

El difosfato de seis carbonos se desdobla en dos monofosfatos de tres carbonos.

Gliceraldehido 3-fosfato

1 HCOH i
2P

oo
CH2OPOf

; s 2 NAD+ ^. /
. " ^ 2 NADH + 2 H

2 1 ,3-difosfoglicerato

0
C-OP023

El aldehido de tres carbonos se oxida para formar un cido conforme se emplean los electrones eliminados del sustrato para reducir la coenzima NAD+ a NADH. Adems, el cido C1 se fosforila para formar un acilfosfato, el cual posee un potencial elevado para transferir grupos fosfato (denotado por el sombreado amarillo).

HCOH i

2 3-fosfoglicerato

CH2OPOf s 2 ADP ( 0 V 2ATP II

El grupo fosfato de C1 se transfiere a ADP para formar ATP por fosforilacin a nivel de sustrato. Por cada glucosa oxidada se forman dos ATP.

c-oHCOH
i

CH2OPOf

0 0
2 Fosfoenolpiruvato

Estas reacciones dan como resultado la redistribucin y deshidratacin del sustrato para formar un enolfosfato en la posicin C2, que tiene un elevado notencial de transferencia.de grupos fosfato.

I * 0 c-oCH2

C-O-PC^ II H
/ f 0
2 ADP

2 Piruvato

^2 ATP

El grupo fosfato se transfiere al ADP formando ATP por fosforilacin a nivel de sustrato, generando una cetona en la posicin C2. Por cada glucosa oxidada se forman dos ATP.
REACCIN NETA: Glucosa + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 P; 2 piruvato + 2 ATP + 2 NADH + 2 H+ + 2 H20

loc=o 1
CH,

CAPITULO 5 FIGURA 5-6. Esquema de la gluclisis que muestra alguno de tos pasos clave. Incluye las dos reacciones de transferencia de grupos fosfato del ATP al azcar de seis carbonos para formar fructosa 1,6difosfato (pasos 1 y 3); la oxidacin y la fosforilacin de glceraldehido 3-fosfato para formar 1,3-difofosglicerato y NADH (paso 6), y la transferencia de grupos fosfato desde los sustratos fosforilados de tres carbonos al ADP para formar ATP por fosforilacin de sustratos (pasos 7 y 10).

177

U
-0
CH3
Piruvato Piruvato Lclalo d es ca rb ox i I as a ,;-7 d esh id rog ena s a HS-CoA

la fermentacin es un subterfugio para regenerar NAD + cuando la concentracin de C>2 es baja, de modo que la gluclisis pueda continuar y mantener la produccin de ATP. El producto de la fermentacin vara de un tipo de clula o microorganismo a otro. Cuando se requiere contraccin repetida de las clulas musculares, el suministro de oxgeno no tiene capacidad para mantener el paso con las demandas metablicas de la clula. En esas condiciones, ciertos tipos de clulas musculares esquelticas regeneran NAD + convirtiendo piruvato a lactato (vase La perspectiva humana en este captulo). Al disponer otra vez de oxgeno en cantidad suficiente, el lactato puede convertirse de nuevo a piruvato para continuar la oxidacin. Las clulas de las levaduras han enfrentado el desafo de la vida anaerobia con una solucin metablica diferente: convierten el piruvato a etanol, segn se ilustra en la figura 5-7. En muchos microorganismos la fermentacin es un proceso coadyuvante necesario para el metabolismo, y en algunos anaerobios es la nica fuente de energa metablica, aunque la energa obtenida slo por gluclisis es escasa en comparacin con la oxidacin completa de la glucosa hasta dixido de carbono y agua. De las 686 kilocaloras que pueden liberarse en la oxidacin completa de 1 mol de glucosa, slo se liberan 57 cuando se convierte a etanol y nada ms 47 cuando se convierte a lactato en condiciones estndar. En cualquier caso slo se sintetizan dos molculas de ATP por molcula de glucosa oxidada mediante gluclisis o fermentacin; ms de 90% de la energa simplemente se descarta en el producto de fermentacin (segn lo demuestra la inflamabilidad del alcohol etlico). En las primeras etapas de la vida sobre la Tierra, cuando todava no apareca el oxgeno, la gluclisis y la fermentacin tal vez fueron las vas metablicas primaras de las clulas procariotas primitivas para extraer azcares. Con la evolucin de las cianobacterias, la atmsfera se llen de oxgeno molecular permitiendo la evolucin de una nueva estrategia metablica, en la cual los productos de la gluclisis podan oxidarse por completo y producir mucho ms ATP.

deshidrogenasa

NADH
NAO'

NADH-<-H

S-CoA

f-o, , , Acetaldehido
NADH

HCOH

f CH3

CH3

Acetil CoA

Alcohol deshdrogenasa

Lactato

CH2OH
CH3

Alcohol etlico Oxidacin anaerobia del NADH

Oxidacin aerobia va ciclo del cido tricarboxlico

FIGl'RA 5-7. Fermentacin. La mayor parte de las clulas efectan respiracin aerobia dependiente de oxgeno. Si el suministro de oxgeno disminuye, como ocurre en las clulas del msculo esqueltico sometido a contraccin extrema o en las clulas de las levaduras vivientes en condiciones anaerobias, estas clulas pueden regenerar NAD+ por fermentacin. Las clulas musculares efectan la fermentacin formando lactato, en tanto que ias clulas de las levaduras lo hacen mediante la formacin de etanol.

un grupo acetilo de dos carbonos (CHsCOO"). A continuacin, el grupo acetilo forma un complejo con la coenzima A (un compuesto orgnico complejo derivado de la vitamina cido pantotnico) para formar acetil-CoA. Piruvato + HSCoA + NAD+ -> Acetil CoA + CO2 + NADH + H + La descarboxilacin de piruvato y la transferencia del grupo acetilo a la CoA (figs. 5-5 y 5-8) es catalizada por el complejo multienzimtico gigante piruvato deshidrogenasa, cuya estructura se mostr en la figura 2-41. El descubrimiento de la acetil-CoA por Fritz Lipmann, en 1961, fue la ltima pieza en el enigma de la oxidacin de la glucosa.
Ciclo del cido tricarboxlico (ATC)

La va aerobia para la oxidacin de piruvato

Los aerobios emplean oxgeno molecular para extraer gran cantidad de energa a partir de los dos productos de la gluclisis, piruvato y NADH, suficiente para sintetizar ms de 30 molculas adicionales de ATP. Este proceso tiene lugar en las mitocondrias (fig. 5-5). Iniciaremos con el piruvato y ms tarde volveremos a considerar el destino del NADH. Cada molcula de piruvato producida por gluclisis se transporta a travs de la membrana mitocondrial interna hacia el interior de la matriz, donde es descarboxilada para formar

Una vez formada, la acetil-CoA se introduce a la va cclica denominada ciclo del cido tricarboxlico (ATC), donde oxida al sustrato y conserva su energa. Con excepcin de la succinato deshidrogenasa, enlazada a la membrana interna, todas las enzimas del ciclo del cido tricarboxlico residen en la fase soluble de la matriz (fig. 5-15). El ciclo del cido

178

CAPITULO 5 Respiracin aerobia y mitocondrias

l" !c-o2c=o
3CH3

Piruvato HS-CoA
NAO'

Acetil-CoA

coo3I

(;00~
HOl =H ( i\\2 (;ooMa ato i
Fumarasa AG" = -0.9

Malato deshidrogenasa
A^?-'

H20\A
xc=o 1

HOC-COOr^ ^ ^ ^

yCH2

coo'- ' ^" '

^ Oxalacetato

C trato sintasa AG" = -7.5

zcoo-

Citrato f
Aconitasa

^ H20

\coo^^

2coo-

cooCH II HC I

Cinco pares
de electrones (procedentes de tomos de hidrogeno del sustrato) para emplear en la produccin HC-WCOOyl HOCH

coo-

'cooIsocitrato

Fumarato

de ATP
NAO'

..;FADH?_;
Succnato deshidrogenasa
FAD

Ispcitrato deshidrogenasa G-1 = -2.0

HS-CoA

coo3CH2

cooNAD' HS-CoA3CH2
X

xl CH^

CH,

Succinato

Succinil-CoA sintetasa AG" = -0.8

Yf
Succinil-CoA

ct-cetogli

C1 ~~

deshidrogenasa

a-cetoglutarato

FIGURA 5-8. Ciclo del cido tricarboxlico, tambin llamado ciclo de Krebs, nombre del investigador que lo formul, o ciclo del cido ctrico por el primer compuesto que se forma en el ciclo. El ciclo se inicia con la condensacin de oxalacetato (OAA) y acetil-CoA (reaccin 12). Los carbonos de estos compuestos estn marcados con nmeros o letras. Los dos carbones que se pierden durante el paso por el ciclo se derivan del oxalacetato. Tambin se ndica la energa libre estndar y el nombre de las enzimas. Los cinco pares de electrones eliminados de las molculas del sustrato por la piruvato deshidrogenasa y las enzimas del ciclo del cido tricarboxlico y transieridas a NAD+ o FAD pasan a lo largo de la cadena transportadora de electrones y se emplean para producir ATP. Las reacciones aqu mostradas empiezan en el nmero 11 debido a que la va contina donde se separa de la reaccin de gluclisis (10 de la figura 3-23).

CAPITULO 5 Respiracin aerobia y mitocondrias

179

tricarboxlico tambin se refiere como ciclo de Krebs, por el bioqumico ingls Hans Krebs, quien trabaj en esta va en los aos de 1930. Irnicamente, cuando Krebs obtuvo por primera vez datos suficientes para apoyar la idea de un ciclo metabHco, escribi un artculo acerca de su investigacin y lo envi a la revista britnica Nature. Varios das despus le regresaron el manuscrito acompaado de una carta de rechazo. El editor concluy que careca de la suficiente importancia para publicarse en esa revista. El primer paso del ciclo del cido tricarboxlico es la condensacin del grupo acetilo de dos carbonos con un oxalacetato de cuatro carbonos para formar una molcula de citrato de seis carbonos (fig. 5-8). Durante el ciclo, la molcula de citrato disminuye la longitud de su cadena, un tomo de carbono cada vez, y regenera la molcula de oxalacetato de cuatro carbonos, la cual se condensa con otra acetil-CoA. Estos dos carbonos eliminados durante el ciclo del cido tricarboxlico (que no son los mismos unidos al grupo acetilo) se oxidan por completo hasta dixido de carbono. Durante el ciclo del cido tricarboxlico pueden ocurrir cuatro reacciones, en las cuales se transfiere un par de electrones de un sustrato a una coenzima aceptora de electrones. Tres de las reacciones utilizan NAD+ para formar NADH, una reaccin emplea FAD (derivada de la vitamina riboflavina) para formar FADH2- La ecuacin neta para la reaccin del ciclo del cido tricarboxlico se puede escribir: Acctil-CoA + 2H2O + FAD + 3NAD+ + GDP + P -> 2CO2 + FADH2 + 3NADH + 3H+ + GTP + HSCoA El ciclo del cido tricarboxlico es la va central de las clulas. Si consideramos la posicin de dicho ciclo en el metabolismo total de la clula (figs. 5-9 y 3-20), se observa que los metabolitos de este ciclo son los mismos compuestos generados por la mayor parte de las vas catablicas de la clula. Por ejemplo, acetil-CoA es un producto final importante de un gran nmero de vas catablicas, incluyendo la descomposicin de cidos grasos, desdoblados cada vez a unidades de dos carbonos (fig. 5-9, a). Estos compuestos de dos carbonos entran al ciclo del cido tricarboxlico como acetil-CoA. Hasta ahora se conoce el papel de las mitocondrias en la descomposicin de polsacridos y grasas; pero estos organelos tambin son importantes en el desdoblamiento de protenas. Aunque los aminocidos que constituyen las protenas forman un conjunto heterogneo de molculas, su descomposicin tambin genera metabolitos del ciclo del cido tricarboxlico (fig. 5-9, b) que llegan a la matriz por medio de sistemas especiales de transporte. Es evidente que todas las macromolculas que suministran energa a la clula (polisacridos, grasas y protenas) se descomponen en metabolitos del ciclo del cido tricarboxlico. Por lo tanto, las mitocondrias se convierten en el centro donde ocurren los procesos que conservan la energa final del metabolismo, cualquiera que sea la naturaleza del material con el cual se inicia.
Importancia de las coensimas reducidas en la formacin de ATP

del cido tricarboxlico son las coenzimas reducidas FADH2 y NADH, que contienen los electrones tomados de diferentes sustratos oxidados. NADH tambin es un producto primario de la gluclisis. Las mitocondrias no tienen capacidad para importar el NADH formado en el citoplasma mediante gluclisis. En vez de eso, los electrones de NADH se emplean para reducir un metaboito de bajo peso molecular, que entonces: 1) puede entrar a las mitocondrias (a travs de una va denominada va alterna entre malato y aspartato) y reducir NAH+ a NADH, o 2) transferir sus electrones a FAD (a travs de una va denominada va alterna entre glicerol y fosfato, que se muestra en la figura 5-10) para producir FADH2. Ahora que podemos explicarnos la formacin de NADH y FADH2 por la gluclisis y el ciclo del cido tricarboxlico, volveremos a los pasos que siguen estas coenzimas reducidas para producir ATP. El proceso total se puede dividir en dos etapas distintas. Etapa 1. Los electrones pasan desde FADJ2 o NADH a una serie de portadores de electrones que constituyen la cadena de transporte localizada en la membrana mitocondrial interna. El aceptor terminal de electrones de la cadena respiratoria es el oxgeno molecular (02), el cual se reduce para formar agua. Conforme los electrones avanzan a lo largo de la cadena respiratoria, los cambios de conformacin en los portadores desplazan protones hacia afuera a travs de la membrana mitocondiral interna, estableciendo por lo tanto un gradiente de protones a travs de dicha membrana. Etapa 2. El movimiento controlado de los protones (H+) los regresa a travs de la membrana por medio de una enzima sintetizadora de ATP que suministra la energa necesaria para efectuar la reaccin endergnica que conduce a la sntesis de ATP. La importancia de los movimientos de protones en la formacin de ATP fue propuesta por primera vez en 1961 por Peter Mitchell, de la Universidad de Edinburgo. Los experimentos que condujeron a la aceptacin del mecanismo quimiosmtico, como lo llam Mitchell, se analizan en La va experimental al final de este captulo; en lo que resta del mismo se har un anlisis ms detallado de las dos etapas resumidas antes. Cada par de electrones transferidos del NADH al oxgeno por medio de la cadena transportadora de electrones libera suficiente energa para formar unas tres molculas de ATP. Cada par donado por FADH2 libera bastante energa para formar casi dos molculas de ATP. Si se suman todas las molculas de ATP formadas a partir de una molcula de glucosa completamente catabolizada por medio de gluclisis y el ciclo del cido tricarboxlico, la ganancia neta mxima es de 36 ATP (que incluye el GTP formado en cada vuelta del ciclo, fig. 5-8). Recordemos que la verdadera cantidad de ATP formado por las molculas oxidadas de glucosa depende de la relacin [ATP]/[ADP] dentro de la clula y las actividades particulares en las cuales participa la clula. La importancia relativa de la gluclisis en comparacin con el ciclo del cido tricarboxlico, o sea, del metabolismo oxidativo anaerobio comparado con el aerobio en la funcin

A partir de la ecuacin neta del ciclo del cido tricarboxlico es evidente que los productos primarios de las reacciones

180

CAPITULO 5 Respiracin aerobia y mitocondrias NADH + HOH

-CH2-C-CH2-C-S-CoA

CH^-C ~S-CoA

CICLO DE UN ACIDO GRASO

-CH2-CH=CH-C-S-CoA
FADH,

Alanina Cisterna Glicina Serina Treonina

Fenilalanina Tirosina Leucina Usina Triptfano

Piruvato

Acetoacetil CoA

Acetil-t R-CH2-CH2-CH2-C- S-CoA

Leucina Isoleucina Triptfano Arginina Histidina Glutamina Prolina

(a)

Aspartato Asparagina
Ma'ato

CICLO ACIDO
TRICARBOXLICO

co,
Ls^Glutamato

\o Fuma rato

Tirosina Fenilalanina

Succinato

>C<3=====1 Isoleucina Succinil-CoA Metionina Valina

W
FIGURA 5-9. Las vas catablicas generan compuestos que ingresan al ciclo del cido tricarboxlico. a) Oxidacin de cidos grasos. El primer paso en la oxidacin de un cido graso es su activacin por unin al grupo tiol (SH) de la coenzima A, que ocurre luego que el grupo lipoacil es transportado a travs de la membrana mitocondrial interna en asociacin a una protena transportadora. En la mitcondria, la molcula lipoacil-CoA sufre diseccin gradual, durante la cual se elimina una molcula de acetil-CoA de la cadena de cido graso con cada vuelta del ciclo. Adems de la molcula de acetil-CoA que ingresa al ciclo del cido tricarboxlico, en cada vuelta del ciclo del cido graso se produce una de NADH y una FADH.2. Del examen de esta serie de reacciones es evidente la razn por la cual las grasas constituyen un rico almacn de energa qumica, b) Ingreso de aminocidos al ciclo del cido tricarboxlico.

del msculo esqueltico humano, se analiza en La perspectiva humana.

5-3 Papel de las mitocondrias en la formacin de ATP

Con frecuencia se describe a las mitocondrias como "plantas en miniatura generadoras de energa", Igual que dichas plantas generadoras, las mitocondrias extraen energa de materiales orgnicos y la almacenan en forma de energa elctrica. Ms especficamente, la energa extrada de los sustratos se emplea para generar un gradiente inico a travs de la membrana mitocondrial interna. Este gradiente inico re-

presenta una forma de energa que puede liberarse para efectuar diferentes tipos de trabajo. En el captulo 4 se vio cmo las clulas intestinales emplean un gradiente inico a travs de su membrana plasmtica para transportar azcares y aminocidos fuera de la luz intestinal, en tanto que las clulas nerviosas utilizan un gradiente similar como base para generar impulsos nerviosos. El uso de gradientes inicos como forma de intercambiar energa requiere varios componentes, incluyendo un sistema para generar el gradiente, una membrana capaz de mantener el gradiente y el mecanismo para liberar el gradiente de modo que pueda efectuar trabajo. Las mitocondrias utilizan un gradiente inico a travs de su membrana interna para efectuar gran nmero de acti-

CAPITULO 5 Respiracin aerobia y mitocondrias Membrana mitocondrial Citoplasma interna IV Fosfato de dihidroxiacetona H2C OH
C=O

181

1 i Cadena ." transportadora de electrones

r, 2e^
3

H++NADH 3-fosfoglicerol deshidrogenasa

CH2OPOf

NAD

FIGURA 5-10. Intercambio de glicerol fosfato. El NADH producido en el citosol no puede atravesar la membrana mitocondrial interna. En el intercambio de glicerol fosfato que aqu se muestra, los electrones se transfieren al fosfato de dihidroxiacetona para formar 3fosfoglicerol, que a continuacin transfiere los electrones a una molcula de FAD dentro de la membrana mitocondrial interna. El FADH2 formado en la reaccin puede pasar los electrones a travs de la cadena transportadora de electrones.

nes; las sustancias que tienen un potencial elevado para transferir electrones, como el NADH, son agentes reductores fuertes, en tanto que aqullas con bajo potencial para transferir electrones, como H^O, son agentes reductores dbiles. Los agentes oxidantes y reductores se presentan en pares, como NAD + y NADH. Los agentes reductores fuertes se unen a los agentes oxidantes dbiles, y viceversa. Por ejemplo, NAD+ (del par NADH-NAD+) es un agente oxidante dbil, en tanto que el otro miembro del par H2, o sea el oxgeno (en realidad 02), es un agente oxidante fuerte. Puesto que el movimiento de electrones genera separacin de cargas, la afinidad de las sustancias por los electrones se puede medir con instrumentos que detectan voltaje (fig. 5-11). En cada par se mide su potencial de oxidorreduccin (o potencial redox) para relacionarlo con el potencial de algn par estndar. Arbitrariamente se eligi el hidrgeno corno par estndar. Igual que para cambios de energa libre, donde el cambio estndar de energa libre es AG, para los pares redox se emplea una nomenclatura similar. El potencial redox estndar, EO, para un par dado se designa como el voltaje producido por una media celdilla (slo estn presentes los miembros de un par), en la cual cada miembro del par se encuentra en concentracin y condiciones estndar (como en la figura 5-11). Las concentraciones estndar son 1.0 M para solutos y iones y 1 atm de presin para gases (p. ej., H2) a 25C El potencial redox estndar para una reaccin de oxidorreduccin que implique hidrgeno (2H+ + 2 electrones -> ty es 0.00 V. La asignacin de un signo (positivo o negativo) a pares diferentes del par hidrgeno es arbitraria y vara entre las diversas disciplinas. Consideraremos la asignacin de la siguiente manera. Aquellos pares

vidades que requieren energa, principalmente sntesis de ATP. Cuando la formacin de ATP se realiza por la energa liberada de los electrones eliminados durante la oxidacin del sustrato, el proceso se denomina fosforilacin oxidativa. La fosforilacin oxidativa se puede comparar con la fosforilacin a nivel de sustrato, segn se estudia en la pgina 102, en la cual el ATP se forma directamente por transferencia de un grupo fosfato procedente de una molcula del sustrato al ADP. Desentraar el mecanismo bsico de la fosforilacin oxidativa ha sido uno de los logros ms significativos en el campo de la biologa celular; las brechas de conocimiento que todava falta por llenar an constituyen un rea activa de investigacin. Para comprender el mecanismo de la fosforilacin oxidativa primero es necesario considerar de qu manera la oxidacin del sustrato puede liberar energa libre. Potenciales de oxidorreduccin Si se comparan varios agentes oxidantes, pueden clasificarse en series segn su afinidad por los electrones: cuanto mayor sea la afinidad, ms fuerte ser el agente oxidante. Tambin los agentes reductores se pueden clasificar segn su afinidad para electrones: a menor afinidad (los electrones se liberan ms fcilmente), rns fuerte ser el agente reductor. Para poner esto en trminos cuantitativos, los agentes reductores se clasifican segn su potencial de transferencia de electro-

Voltmetro

Puente de KCI

1MH*

1M/L.

1 atmH;

Media celda de referencia

Media celda de registro

FIGURA 5-11. Medicin del potencial estndar de oxidorreduccin. La media celda de muestra contiene los miembros oxidados y reducidos del par, ambos presentes a 1 M. La media celda de referencia contiene una solucin 1 M de H+ en equilibrio con el gas hidrgeno a una atmsfera de presin. El circuito eictrico se forma conectando las medias celdas a travs de un voltmetro y un puente salino. Si los electrones fluyen preferencialmente desde la meda celda de muestra a la media celda de referencia, entonces el potencial redox estndar (AEo) del par muestra es negativo; si los electrones fluyen en la direccin opuesta, el potencial redox estndar del par muestra es positivo. El puente salino consiste en una solucin saturada de KCI; proporciona una va para que los contraiones se muevan entre las medias celdas y conserven la neutralidad elctrica en los dos compartimientos.

182

CAPITULO 5 " Respiracin aerobia y mitocondrias

LA PERSPECTIVA HUMANA
Papel del metabolismo anaerobio j aerobio en el ejercicio
La contraccin muscular requiere una gran cantidad de energa. La mayor parte de esta energa se emplea para lograr que los filamentos que contienen actina y miosna se deslicen uno sobre otro, como analizaremos en el captulo 9. La energa necesaria para la contraccin muscular se deriva del ATP. La velocidad de hidrlisis del ATP aumenta ms de 100 veces en un msculo esqueltico sometido a contraccin mxima, en comparacin con el mismo msculo en reposo. Se estima que en promedio el msculo esqueltico humano tiene suficiente ATP "a la mano" para consumir durante una contraccin vigorosa de 2 a 5 segundos de duracin. Aunque el ATP se hidroliza, es importante producir al mismo tiempo ATP adicional; de otra manera, la proporcin ATP/ADP desciende y tambin se reduce la energa libre disponible para sostener la contraccin. Las clulas musculares contienen una reserva de fosfato de creatina (CrP), uno de los compuestos con potencial para transferir fosfatos mayor que el del ATP (fig. 3-27) y que por lo tanto puede utilizarse para generar ATP en la siguiente reaccin. CrP + ADP - Cr + ATP En condiciones tpicas, el msculo esqueltico tiene suficiente reserva de fosfato de creatina para mantener una concentracin elevada de ATP durante casi 15 segundos. Puesto que las clulas musculares tienen un suministro muy limitado tanto de ATP como de fosfato de creatina, se deduce que la actividad muscular intensa o sostenida requiere de la sntesis de cantidades adicionales de ATP, que deben obtenerse mediante metabolismo oxidativo. El msculo esqueltico humano consta de dos tipos generales de fibras {fig. PH 5-1): fibras de "contraccinrocurren con mayor rapidez que las del ciclo del cido tricarboxlico y el transporte de electrones, por lo que la velocidad de produccin de ATP por la va anaerobia es en realidad nas alta que la lograda en la respiracin aerobia. Los problemas de producir ATP por gluclisis son el desgaste rpido de la glucosa disponible en la fibra (almacenada en forma de glucgeno) y la produccin de un producto final indeseable, el cido lctico. Consideraremos este ltimo aspecto con mayor detalle. Debemos recordar que la gluclisis slocontina si el NAD+ se regenera y que eso ocurre por fermentacin. Las clulas musculares regeneran NAD + al reducir piruvato, el producto final de la guclisis, a cido lctico. La mayor parte del cido lctico difunde fuera de las clulas musculares activas hacia la sangre circulante, donde es transportado al hgado para convertirse de nuevo en glucosa. La glucosa producida en el hgado se libera al torrente sanguneo y por lo tanto puede regresar al msculo activo y continuar suministrando energa para efectuar la gluclisis acelerada. Sin embargo, la formacin de cido lctico se acompaa de un descenso de pH dentro del tejido muscular (desde pH 7.0 hasta 6.35), lo que a veces produce el dolor y los calambres que acompaan al ejercicio intenso. El incremento de la acidez junto con el agotamiento de las reservas de glucosa tal vez explique la sensacin de fatiga muscular caracterstica del ejercicio anaerobio. Si en lugar de emplear los msculos para levantar pesas o efectuar carreras se participa en un ejercicio "aerobio", como montar bicicleta o caminar con rapidez, la actividad puede prolongarse durante periodos mucho ms largos sin la sensacin de dolor muscular o de fatiga. Los ejercicios aerobios, como su nombre implica, estn

F1GURA PH 5-1. El msculo esqueltico contiene una mezcla de fibras de contraccin rpida (teidas en color oscuro) y fibras de contraccin lenta (teidas en color claro). (Cortesa de Duncan MacDougaU.)

pida", que se contraen con gran rapidez (p. ej., 15 a 40 mseg) y fibras de "contraccin lenta" que se contraen ms lentamente (p. ej., 40 a 100 mseg). El microscopio electrnico revela que las fibras de contraccin rpida estn casi desprovistas de mitocondrias, lo que indica que dichas clulas no pueden producir mucho ATP mediante respiracin aerobia. Por otra parte, las fibras de contraccin lenta contienen un gran nmero de mitocondrias. Estos dos tipos de fibras del msculo esqueltico son adecuadas para actividades de diferentes tipos. Por ejemplo, levantar pesas o correr a gran velocidad depende principalmente de las fibras de contraccin rpida, capaces de generar nas fuerza que sus contrapartes de contraccin lenta. Las fibras de contraccin rpida producen casi todo su ATP por la va anaerobia como resultado de la gluclisis. Aunque la gluclisis slo tiene capacidad para producir cerca de 5% de ATP por molcula de glucosa oxidada en comparacin con la respiracin aerobia, las reacciones de la gluclisis

CAPITULO 5

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disenados para permitir que los msculos trabajen por la va aerobia, o sea, continuar la produccin del ATP necesario mediante el transporte de electrones. Los ejercicios aerobios dependen principalmente de la contraccin de fibras lentas del msculo esqueltico, capaces de generar menos fuerza, pero que pueden continuar funcionando durante largos periodos debido a la produccin aerobia continua de ATP sin la formacin correspondiente de cido lctico. El ejercicio aerobio recibe su combustible inicial de las molculas de glucosa almacenadas como glucgeno en los propios msculos, pero luego de unos pocos minutos los msculos dependen ms y ms de los cidos grasos libres liberados en la sangre por el tejido adiposo (grasa). Cuanto mayor sea el periodo de ejercicio, mayor la dependencia de cidos grasos. Se estima

que casi 50% de las caloras consumidas por los msculos en 20 minutos de ejercicio aerobio intenso se derivan de la grasa. Ejercicios aerobios como trotar, caminar rpido, nadar o montar bicicleta constituyen una de las mejores formas de reducir el contenido de grasa del cuerpo. La proporcin entre fibras de contraccin rpida y fibras de contraccin lenta vara de un msculo a otro. Por ejemplo, los msculos posturales de la espalda, necesarios para que una persona permanezca en posicin erecta, contienen una mayor proporcin de fibras de contraccin lenta en comparacin con los msculos del brazo empleados para tirar o levantar objetos. La proporcin precisa entre fibras de contraccin rpida y fibras de contraccin lenta en un msculo particular est genticamente determinada y es muy variable de una persona a otra: factores

que desempean un importante papel para permitir que un individuo alcance la excelencia en ciertos tipos de actividad fsica. Por ejemplo, los corredores de velocidad y los levantadores de pesas mundiales suelen tener mayor proporcin de fibras musculares de contraccin rpida en comparacin con los corredores de distancias largas. Adems, el entrenamiento para deportes como levantamiento de pesas conduce a un crecimiento desproporcionado de las fibras de contraccin rpida. El tejido del msculo cardiaco tambin debe incrementar su grado de actividad durante el ejercicio intenso, pero a diferencia del tejido del msculo esqueltico, el msculo cardiaco slo puede producir ATP por metabolismo aerobio. En realidad, casi 40% del espacio citoplsmico de una clula muscular cardiaca humana est ocupado por mitocondrias que producen ATP.

cuyos agentes reductores son mejores donadores de electrones en comparacin con H2, o sea, con menor afinidad por sus electrones en comparacin con HZ, se les asigna potenciales redox negativos. Por ejemplo, ei potencial redox estndar para el par NADH-NAD+ es de -0.32 V (cuadro

CUADRO 5-1. Potenciales redox estndar de reacciones seleccionadas en un sentido

Ecuacin de electrodo E'

Acetato + 2H+ + 2e~ = acetaldehido 2H+ + 2e- = H2 a-cetogfutarato + COj + 2H+ + 2e- = isocitrato Acetoacetato + 2H+ + 2c- = ^-hidroxibutirato NAD+ + 2H+ + 2e- NADH + H+ NADP+ + 2H+ -I- 2e- = NADPH + H + Acetaldehido + 2H+ + 2e~ etanol Piruvato + 2H+ + 2e~ = lactato Oxalacetato + 2H+ + 2e~ = malato FAD + 2H+ + 2e~ = FADH2 (en flavoprotenas) Fumarato + 2H+ + 2e~ succinato 2 ciocromo >K(<IX) + 2e~ = 2 citocromo i>K(red) Ubiquinona + 2H+ + 2e~ = ubiquinol 2 citocrorno cox + 2e~ = 2 citocromo crc 2 citocromo fl3|ax + 2e~ = 2 citocromo fl^md) 2 \2 + 2H+ + 2e- = HO

-0.58 -0.421 -0.38 -0.346 -0.320 -0.324 -0.197 -0.185 -0.166 +0.031 +0.031 +0.030 +0.10 +0.254 +0.385 +0.816

5-1). Los pares cuyos agentes oxidantes sean mejores aceptores de electrones que H + , o sea, que presenten mayor afinidad para electrones en comparacin con H + , tienen potenciales redox positivos. En el cuadro 5-1 se muestran los potenciales redox de algunos pares biolgicamente importantes. En dicho cuadro el valor del par hidrgeno no es 0.00, sino -0.42V. Esta cifra representa el valor cuando la concentracin de H+ es 10~7 M (pH 7.0) en vez de 1.0 M (pH 0.0), que sera poco empleada en fisiologa. Si el potencial redox estndar se calcula a pH 7, entonces se indica por el smbolo EQ en vez de EQ. As como cualquier otra reaccin espontnea se acompaa de prdida de energa libre, lo mismo ocurre con las reacciones de oxidorreduccin. El cambio de energa libre estndar durante una reaccin de este tipo
=A (ox)

se puede calcular a partir de los potenciales redox estndar de los dos pares implicados en la reaccin segn la ecuacin
AG' = -

donde n es el nmero de electrones transferidos, F es la constante de Faraday (23.063 kcal/V*mol) y A es la diferencia en voltios entre el potencial redox estndar de los dos pares. Cuanto mayor sea la diferencia de potencial redox estndar entre los dos pares, ms tiempo proceder la reaccin para formar productos en condiciones estndar antes de alcanzar un estado de equilibrio.

184

CAPITULO 5 Respiracin aerobia y mitocondrias

Para la oxidacin de NADH por oxgeno molecular, NADH + \2 + H+ -> H2O + NAD+ los potenciales redox estndar de los dos pares se pueden escribir de la siguiente manera O 2 + 2H+ + 2e~ -* H2O NAD+ + 2H+ + 2e- -> NADH + H+ = +0.82 V EQ = -0.32 V

El cambio de voltaje para la reaccin total es igual a la diferencia entre los dos valores EQ (AE): AE'o = +0.82 V - (-0.32 V) = +1.14 V que es una medida de la energa libre liberada cuando se oxida NADH por oxgeno molecular en condiciones estndar. Sustituyendo este valor en la ecuacin anterior, AG' = (-2)(23.063 kcal/V-mol)(1.14 V) -52.6 kcal/mol La diferencia de energa libre estndar (AG f ) es -52.6 kcal/ mol. Igual que con otras reacciones, el verdadero valor AG depende de las concentraciones relativas de reactantes y productos (formas oxidadas y reducidas de los compuestos) presentes en la clula en un momento dado. No obstante, pareciera que el descenso de energa libre de un par de electrones conforme pasan de NADH a oxgeno molecular (AG0' = -52.6 kcal/mol) es suficiente para formar varias molculas de ATP (AG0' = +7.3 kcal/mol) incluso cuando la relacin ATP/ADP dentro de la clula es mucho ms alta que en condiciones estndar. En las mitocondrias, la transferencia de energa del NADH al ATP ocurre de manera gradual y ser el principal tema que se exponga en el resto de este captulo. Dentro de las mitocondrias, los electrones se transfieren al NAD + (o al FAD) a partir de varios sustratos del ciclo del cido tricarboxlico, principalmente isocitrato, a-cetoglutarato, malato y succinato. Los primeros tres de estos intermediarios poseen potenciales redox de valor negativo relativamente alto (cuadro 5-1), lo suficientemente alto para transferir electrones a NAD + en las condiciones prevalecientes en la clula.1 En contraste, la concentracin de succinato a fumarato, que tiene un potencial redox ms positivo, procede por la reduccin de FAD, una coenzima con mayor afinidad por electrones en comparacin con NAD + .

su respectiva deshidrogenase y transfiere sus electrones a otros transportadores relacionados con la membrana mitocondrial interna. Cada uno de los casi 20 transportadores de electrones que constituyen la cadena transportadora puede existir en su estado reducido u oxidado. Cada transportador se reduce sucesivamente porque gana electrones procedentes del transportador precedente en la cadena y a continuacin se oxida porque dona sus electrones al transportador subsecuente (fig. 5-14). Por lo tanto, los electrones pasan de un transportador al siguiente hasta que el aceptor final se reduce. El aceptor final de esta "cadena de cubetas" de electrones es el C2, el cual se reduce para formar agua. A lo largo de la lnea cada transportador de electrones tiene un potencial redox ms positivo que el transportador previo, y en cada transferencia sucesiva los electrones pierden energa libre adicional. La energa libre liberada por la transferencia de electrones se emplea para generar un gradiente de protones, el cual se utiliza posteriormente para efectuar la sntesis endergnica de ATP.
Tipos de transportadores

Transporte de electrones
La mayor parte de las enzimas del ciclo del cido tricarboxlico se encuentran libres dentro de la matriz fluida de la mitocondria. El NADH formado en la matriz se disocia de
1 Segn se indica en el cuadro 5-1, el potencial redox estndar (E) del par oxalacetato-malato es ms positivo que el del par NAD+NADH. Por lo tanto, la oxidacin de malato a oxalacetato slo puede proceder a la formacin de oxalacetato cuando la relacin de productos reactantes se conserva por debajo de las condiciones estndar. La AG de esta reaccin se conserva negativa manteniendo elevadas las concentraciones de malato o de NAD+ en relacin con las de oxalacetato o NADH en la regin que rodea al sitio activo de la enzima. La situacin es anloga a la observada en la formacin de gliceraldehido 3-fosfato a partir de dihidroxiacetona fosfato fpg. 84).

La cadena de transporte de electrones (o cadena respiratoria) de la membrana mitocondrial interna se compone de cuatro tipos de transportadores de electrones enlazados a la membrana: flavoprotenas, citocromos, ubiquinona, y protenas de hierro y azufre. Con excepcin de la ubiquinona, todos los centros redox dentro de la cadena respiratoria que aceptan y donan electrones son grupos prostticos (componentes no aminocidos) relacionados con protenas. Las flavoprotenas constan de un polipptido fuertemente enlazado a uno de los grupos prostticos relacionados, sea dinucletido de adenina flavina (FAD) o mononucletido de flavina (FMN) (fig. 5-12, a). Los grupos prostticos de las flavoprotenas se derivan de la riboflavina (vitamina 62) y cada uno puede aceptar y donar dos protones y dos electrones. El estado de oxidacin de la flavoprotena puede determinarse por mtodos espectroscpicos midiendo la cantidad de luz absorbida a diferentes longitudes de onda. Las protenas totalmente oxidadas muestran un mximo de absorcin a 370 y 450 nm, en tanto que los grupos reducidos slo tienen un mximo a 370 nm. Las principales flavoprotenas de las mitocondrias son la NADH deshidrogenasa de la cadena transportadora de electrones y la succinato deshidrogenasa del ciclo del cido tricarboxlico. Los citocromos son protenas que contienen grupos hem (como el descrito para la mioglobina en la pgina 58). El tomo de hierro de un hem puede sufrir una transicin reversible entre los estados de oxidacin Fe3+ y Fe2+ como consecuencia de la aceptacin y prdida de un solo electrn (fig. 5-12, b). Hay cuando menos cinco especies de citocromos presentes en la cadena transportadora de electrones, a, 3, b, c y c\ que difieren entre s por as sustituciones efectuadas en el grupo hem (indicada por las porciones sombreadas de la figura 5-12, fc) y tambin por la secuencia de aminocidos de la cadena del polipptido. Los grupos hem de la citocromo oxidasa tambin se relacionan con iones cobre que pueden desempear un papel clave en la transferencia de electrones a O2 (fig. 5-19). La ubiquinona (UQ, o coenzima Q) es una molcula Hposoluble que contiene una larga cadena hidrfoba com-

CAPITULO 5 Respiracin aerobia y mitocondrias

185

c=o
H3C

CH,OC II CH,OC

C-CH,

CH,

Unidad soprenoide Forma oxidada de ubiquinona (estado quinona)

Forma oxidada de FMN (estado quinona)

_ H'_ e0

,^c- C-CH3
cooN-H I Forma oxidada de hem
" I CH3OC^

CHrC^ ^C^ ^ C ^ W ^C=0

CHrC" " 3 I

C' II

T
OH ""

II C-R

Radical ubre intermedio (estado semiquinona)

Radical libre intermedio (estado semiquinona)

CH-CH,
CH,-C N-H I C=0

C-CH, II C-R

Forma reducida de ubiquinona (estado hidroquinona]

(O
Forma reducida de FMN (estado hidroxiquinona)

(a)
Forma reducida de hem

(b)
FICUlA 5-12. Estructura de las formas oxidada y reducida de los tres tipos de transportadores de electrones, a) FMN de la NADH deshidrogenasa; b) el grupo hem del citocromo c, y c) ubiquinona (coenzima Q). Los grupos hem de los diferentes citocromos de la cadena transportadora de electrones difieren en sus grupos sustituidos sobre el anillo porfirina (indicados por el sombreado) y la naturaleza del enlace a la protena. Los citocromos slo pueden aceptar un electrn, en tanto que FMN y quinonas pueden aceptar dos electrones y dos protones y pueden hacerlo en reacciones sucesivas, como se muestra en la figura. FAD difiere de FMN en que contiene un grupo adenosina unido al fosfato.

puesta por unidades isoprenoides de cinco carbonos (fig. 5-12, c), Igual que las flavoprotenas, cada ubiquinona puede aceptar y donar dos electrones y dos protones. Similar a flavoprotenas y citocromos, la ubiquinona se puede detectar espectroscpicamente debido a que posee una banda de absorcin a 280 nm que desaparece en el estado reducido. A principios del decenio de 1960 se descubri un nuevo grupo de transportadores de electrones en la membrana interna. Estos componentes, llamados protenas de hierro y azufre, se descubrieron mediante resonancia electrnica de giro (el hierro reducido tiene un electrn impar que da lugar a una seal electrnica de giro). Los tomos de hierro de las protenas de hierro y azufre no se localizan en un grupo hem, sino que estn ntimamente unidos a tomos de azufre

inorgnico como parte de un centro de hierro y azufre. Los centros ms comunes contienen dos o cuatro tomos de hierro y de azufre, designados [2Fe-2S] y [4Fe-4S], unidos a la protena en los residuos de cisterna (fig. 5-13). Un solo centro puede tener varios tomos de hierro, pero todo el complejo slo puede aceptar y donar un electrn. El potencial redox de un centro de hierro y azufre depende mucho de los residuos aminocidos que constituyen su entorno local; como grupo, las protenas de hierro y azufre presentan potenciales que varan de -400 mV hasta +300 mV, correspondiendo a una mayor porcin del espacio en el que ocurre el transporte de electrones. Se ha identificado ms de una docena de protenas de hierro y azufre dentro de las mitocondrias y todas estn ntimamente relacionadas con otros portadores de electrones.

186

CAPITULO 5 Respiracin aerobia y mitocondrias

-0.4

-0.2

-0.0

Cvs

E0 +0-2 |-

(a)

[2Fe-2S]
+0.4

+0.6

Cvs
+0.8

Cvs

FIGURA 5-13. Centros de hierro y azufre. Estructura de un centro de hierro y azufre: a) [2Fe-2S] y b) [4Fe-4S], Los tomos de azufre se muestran en color amarillo. Ambos tipos de centros de hierro y azufre estn unidos a la protena por medio de un enlace entre un tomo de azufre (mostrados en color amarillo brillante) y un residuo de cistena. Los dos tipos de centros de hierro y azufre slo aceptan un electrn, cuya carga se distribuye entre los diferentes tomos de hierro.

FIGURA 5 - H . Disposicin de varios portadores en la cadena transportadora de electrones. El diagrama ilustra el potencial redox aproximado de los portadores y la disminucin de energa libre conforme los pares de electrones se desplazan a o largo de la cadena respiratoria hasta el oxgeno. El gran nmero de centros de hierro y azufre no se indica en la figura, para simplificar. Como analizaremos ms adelante en el captulo, cada uno de los tres segmentos marcados por flechas rojas produce suficiente energa para mover los protones a travs de la membrana mitocondrial interna, la cual a su vez suministra la energa requerida para generar ATP a partir de ADP. (Segn A.L Lehninger, Biochemistry, 2a. edicin, 1975, Worth Piibshers, Nueva York.)

Punto de inhibicin

Los portadores de la cadena de transporte de electrones se disponen espacialrnente en orden decreciente de potencial inico, asegurando que los electrones pasen a travs de toda la cadena conforme fluyen de NADH o FAD2 hacia 2 (fig. 5-14). La secuencia especfica de los portadores que constituyen la cadena para el transporte de electrones fue estudiada por Britton Chance y sus colaboradores, en la Universidad de Pennsylvania, empleando varios inhibidores que bloquean el transporte de electrones en sitios especficos a lo largo de la va. Durante el bloqueo, los portadores sobre el lado NADH incrementan componentes en estado reducido, en tanto que los portadores sobre el lado del oxgeno ios acumulan en estado oxidado. Mediante anlisis espectroscpico de la naturaleza de los componentes reducidos y oxidados en presencia de diferentes inhibidores se pudo determinar la secuencia de los portadores. En la figura 5-15 se muestra una analoga del concepto de los experimentos con inhibidores. La secuencia de los portadores determinada experimentalmente concuerda bastante bien con las predicciones tericas basadas en el potencial redox de pares individuales, indicados en el cuadro 5-1. La velocidad de transferencia de electrones desde un portador a un aceptor depende de la distancia entre los dos centros redox y la va particular utilizada. Los estudios in-

NAD

FMN

o-

Bloqueo con antimicina A

FIGURA 5-15. Uso experimental de inhibidores para determinar la secuencia de portadores en la cadena de transporte de electrones. En esta analoga hidrulica, el tratamiento de las mitocondrias con el inhibidor antimicina A interrumpe el transporte, y a partir del punto de inhibicin los portadores del lado NADH permanecen en estado totalmente reducido y los portadores del lado 02 en estado completamente oxidado. Comparando el efecto de varios inhibidores se pudo establecer el orden de los portadores dentro de la cadena. (Segn A.L. Lehninger, Biochemistry, 2a. edicin, 1975, Worth Pvblishers, Nueva York.)

CAPITULO 5

187

dican que los electrones pueden viajar distancias considerables (10 a 20 A) entre centros redox adyacentes y los que fluyen a travs de "tneles" especiales constituidos por una serie de enlaces covalentes y puentes de hidrgeno que amplan transversalmente algunas partes de diferentes residuos de aminocidos. Un ejemplo de la va propuesta se refiere al citocromo c y se muestra en la figura 5-16.
Transportadores complejos de electrones

Cuando la membrana mitocondrial interna se rompe pueden aislarse los diferentes portadores de electrones que forman parte de cuatro complejos asimtricos distintos que rodean a la membrana, identificados como complejos I, II, III y IV (fig. 5-17). Dos componentes de la cadena de transporte de electrones, citocromo c y ubiquinona, no forman parte de alguno de los cuatro complejos, sino que existen de manera independiente en la membrana. La ubiquinona ocurre como un grupo de molculas disueltas en la bicapa de lpidos y el citocromo c como una protena perifrica de la membrana. Se piensa que el citocromo c y la ubiquinona se desplazan dentro de la membrana o a lo largo de la misma transportando electrones entre los grandes complejos protenicos relativamente inmviles. Una vez dentro de uno de los grandes complejos multiprotenas se cree que los electrones viajan a lo largo de vas definidas (del tipo ilustrado en la figura 5-16) entre centros redox adyacentes cuyas posiciones estn en sus respectivos lugares. Si el donador de electrones es NADH, los electrones entran a la cadena respiratoria por la va del complejo I, que transfiere electrones a la ubiquinona (fig. 5-17). Cuando el donador es FADH2, los electrones pasan directamente de la succinato deshidrogenasa del ciclo del cido tricarboxlco (que constituye el complejo II) a la ubiquinona, pasando por alto el extremo "izquierdo" de la cadena que posee un potencial redox demasiado negativo para aceptar los electrones menos energticos del nucletido de flavina. Si se examinan los potenciales redox de portadores sucesivos en la figura 5-14, es evidente que hay tres sitios en los cuales la transferencia de electrones se acompaa de mayor liberacin de energa libre (del orden de 200 mV). Cada uno de estos sitios se encuentra entre portadores que son parte de uno de los tres complejos, I, III y IV. La energa libre liberada en forma de electrones que pasa a travs de estos tres sitios se conserva mediante translocacin de protones desde la matriz a travs de la membrana interna al espacio intermembrana. La translocacin de protones por estos complejos transportadores de electrones establece el gradiente de protones que efectan la sntesis de ATP. La capacidad de los complejos I, III y IV para actuar como unidades independientes transportadoras de protones se puede demostrar purificando cada uno de ellos e incorporndolos individualmente en vesculas artificiales de lpidos. Cuando se les suministra el donador apropiado de electrones, estas vesculas que contienen protenas son capaces de aceptar electrones y translocar protones a travs de la membrana vesicular. El mecanismo de la translocacin de protones (H+) se analiza en las pginas 190 y 200. Examinaremos brevemente cada uno de los cuatro complejos. Complejo I (NADH-UQ oxirreductasa o NADH deshidrogenasa). El complejo I, que cataliza la transferencia de

FIGURA 5-16. Vas semejantes a tneles para los electrones del complejo levadura-citocromo c-citocromo c peroxidasa. El grupo hem del citocromo c peroxidasa (que no es un portador de la cadena mitocondrial para transporte de electrones, pero que constituye un aceptador anlogo de electrones y del cual se conoce su estructura cristalina con estudios de alta resolucin) se observa en rojo. Existen varias vas definidas (amarillas) para el movimiento de electrones de un grupo hem al otro. (Por effrey ]. Regan, segn David N. Bcrntnn y cois., reimpreso con autorizacin de Science 258:1741, 1992. 1992 por American Assodation for he Advancement of Science.)

un par de electrones del NADH a la ubiquinona (UQ), es enorme, contiene hasta 30 polpptidos distintos y representa una masa de casi un milln de daltons. El complejo I incluye hasta nueve centros distintos de hierro y azufre adems de flavoprotena. El paso de electrones a travs del complejo I se acompaa de la translocacin de protones al interior del espacio intermembrana; la estequiometra tal vez sea de 3 a 4 H + por cada par de electrones transferidos. Se piensa que seis de los polipptidos que constituyen el complejo I de la mitocondria humana son codificados por genes mitocondriales. Complejo II (succinato-UQ oxidorreductasa o succinato deshidrogenasa). El complejo II consta de varios polipptidos, dos de los cuales estn compuestos de succinato deshidrogenasa, enzima que contiene FAD enlazada a membrana que cataliza una reaccin clave del ciclo del cido tricarboxlico. Todos son codificados por genes nucleares. El complejo II proporciona una va para introducir electrones de "baja energa" (prximos a O mV) del succinato al FAD o a la ubiquinona. La transferencia de electrones a travs del complejo II no se acompaa de translocacin de protones. Complejo III (UQH2-citocromo c oxidorreductasa o citocromo bci). El complejo III cataliza la transferencia de electrones desde la ubiquinona reducida (UQH/?) al citocromo c, que es una protena perifrica de membrana y no parte integral de alguno de los complejos de la cadena respiratoria. Se calcula que cuatro H + se translocan a travs de la membrana por cada par de electrones transferidos por medio de la ubiquinona al complejo III. El complejo III contiene casi 10 polipptidos, uno codificado por el genoma mito-

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CAPITULO 5 Respiracin aerobia y mitocondrias

Espacio intermembrana

1/20,+2H1

10 nm

Complejo 1 NADH-UQ Oxidorreductasa SUBUN1DADES mtDNA nDNA TOTAL

Complejo III UQH2_ Citocromo c oxidorreductasa

1 -9 -10

Complejo II Succinato-UQ oxidorreductasa

Complejo IV Citocromo c oxidasa

6 -22 -28

3 10 13

FIGURA 5-17. Esquema de la disposicin de los componentes de una cadena transportadora de electrones de la membrana mitocondrial interna. La cadena respiratoria consta de cuatro complejos de portadores de electrones y otros dos portadores (ubiquinona y citocromo c) situados de manera independiente. Los electrones ingresan a la cadena procedentes del NADH (va complejo I) o FADH? (una parte del complejo II). En seguida pasan de los complejos 1 o II a la ubiquinona (UQ), un grupo dentro de la bicapa de lpidos. A continuacin se transfieren de la ubiquinona al complejo III y luego a la protena perifrica citocromo c, la cual se piensa que es mvil; despus los electrones pasan del citocromo c al complejo IV (citocromo oxidasa) y luego al O para formar H2. Se indican los sitios de translocacin de protones desde la matriz al citoplasma. El nmero preciso de protones translocados en cada sitio an es tema de controversia.

Citocromo c

FIGI IRA 5- i t. Citocromo oxidasa. El nmero preciso de subunidades en una molcula de citocromo oxidasa vara entre las especies, pero en los mamferos puede ser hasta de 13. Se cree que la protena existe en la membrana mitocondrial en forma de un dmero. Aqu se muestra la disposicin de siete de los polipptidos de un solo monmero. Se piensa que el monmero contiene dos copias diferentes de la subunidad VII localizadas en diferentes sitios.

Matriz
VI, 9 kD IV, 17 kD

CAPITULO D Respiracin aerobia y

condrial, e incluye varios grupos hem y centros de hierro y azufre. Complejo IV (citocromo c-O2 oxidorreductasa o citocromo c oxidasa). El paso final del transporte de electrones en la mitocondria es la transferencia de cuatro electrones del riocromo c (c. c) aJ oxgeno segn la reaccin 4ct O2 + 4H+ - 4cit 2H2O catalizada por el complejo IV, un enorme ensamblamiento de polipptidos comnmente denominado citocromo oxidasa. Adems de reducir el 02, la citocromo oxidasa tambin transloca protones a travs de la membrana interna. En la figura 5-18 se muestra un modelo de la molcula de citocromo oxidasa. De los casi 13 polipptidos que constituyen la enzima del mamfero, tres de ellos, las subunidades I, II y III, son los polipptidos ms grandes del complejo y contienen todos los centros redox. Estas tres subunidades son codificadas en el genoma mitocondrial. La citocromo oxidasa de la cadena respiratoria de la mayor parte de las bacterias aerobias slo contiene tres subunidades. Como

sera de esperar, si la mitocondria evolucion a partir i bacterias, las tres subunidades codificadas por el DNA mitocondrial son homologas de las tres subunidades que constituyen toda la enzima de las clulas bacterianas. Se ha estudiado de manera intensiva el mecanismo de Iransterena e electrones a tra vs del complejo IV. El principal desafo para los investigadores es explicar de qu manera los portadores que slo son capaces de transferir electrones simples pueden reducir una molcula de O2 a dos molculas de 2O, proceso que requiere cuatro electrones. Se cree que la reaccin ocurre paso a paso, como se muestra en la figura 5-19. Primero se transfieren electrones, uno cada vez, del citocromo c a travs de un ion cobre (CUA) de la subunidad II al hem (hem o) de la subunidad I (fig. 5-19, a). Desde ah, los electrones pasan, uno cada vez, a un centro redox (binuclear) localizado en la subunidad I que contiene un segundo hem (hem 3) y a un segundo ion cobre (Cug) situado a una distancia menor de 5. Una vez que el centro en 3-CuB acepta su segundo electrn (paso 3, fig. 5-19, b), una molcula de O2 se une al centro y acepta el par de elec-

Fe3* Cu2* 1er. e~

2H20

+* Fe3'Cu1*

2o. e-

2H

OH-Cu 2 *

<D
Fe 3 '-OH

\
05

-Cu"

4the

\
-Cu 2 *

Fe1*

o
(a)

(b)

FIGURA 5-19. Mecanismo de accin de la citocromo oxidasa. a) Modelo que muestra el flujo de electrones a travs de cuatro centros redox de la citocromo oxidasa. Se piensa que los electrones pasan uno cada vez desde el citocromo c al primer ion cobre (CUA) y luego al grupo hem (Fea) del citocromo a, despus al centro redox binuclear que consta de un segundo ion hierro (del grupo hem del citocromo 113) y un ion cobre (Cus), b) Mecanismo propuesto para la reduccin de O2 molecular para formar agua en el centro redox binuclear de la citocromo oxidasa, segn se describe en el texto. Cuatro electrones en total ingresan al complejo hem a^-Cu^, uno a la vez, desde el grupo hem del citocromo a. Tambin se han propuesto otras vas para el flujo de electrones, (a: Segn M.W. Calhoun, }.W. Thomas y R.B. Gennis, Trends Biochem. Sci. 19:327, 1994; b: segn un modelo propuesto pro G.T. Babcock y M. Wikstram en Nature 356:306, 1992; 1992 por Mncmillan Magazines Ltd.)

190

CAPTULOS Respiracin aerobia y mitocondras

Matriz

Citoplasma

Matriz

un anlisis estructural de alta resolucin de todo el complejo. De alguna manera, el paso de electrones a travs de las partes del complejo citocromo oxidasa induce cambios de conformacin como el ilustrado en la figura 5-20, que causa que los protones se desplacen desde la matriz al interior del espacio intermembrana. La transferencia de electrones del citocromo c al C>2 ocurre por un gran descenso del potencial redox (cuando monos 300 mV). Un descenso de cuatro electrones en este potencial puede explicar la translocacin de hasta seis H + a travs de la membrana, adems de los cuatro protones derivados de la matriz que se consumen en la conversin de 2 a agua. La verdadera proporcin tal vez se aproxime ms a los cuatro H + bombeados por molcula de Q- reducida, pero an es un tema de considerable debate.2

5-4 Translocacin de protones y establecimiento de una fuerza motriz de protones

H+ Citoplasma

FIGURA 5-20. Esquema de un modelo que muestra cmo puede actuar la citocromo oxidasa como bomba de protones operada por el potencial redox. En la figura 5-19, a, se mostr que los electrones pasan del citocromo c a travs de Cu^ al citocromo a. En el modelo que aqu se muestra, la transferencia de un electrn al citocromo a se acompaa de un protn que se une a un sitio sobre la enzima. Cuando el electrn se transfiere del citocromo a al centro redox binuclear del citocromo 3-CuB, hay un cambio de conformacin que libera el protn en el otro lado de la membrana. Este movimiento de protones ocurre en adicin a los protones retirados de la matriz que se emplean para reducir O2. (Segn THE VITAL FORC: A STUDY OF BIOENERGETICS por F.M. Harold. 1986 por W.H. Freeman and Company. Reimpreso con autorizacin.)

trones, formando un peroxianin O22~ (paso 5, fig. 5-19, b). Para impedir su liberacin, el ion perxido reactivo se mantiene en su sitio como un puente entre los componentes con carga positiva 13 y CUB. En el siguiente paso se transfiere un tercer electrn al centro binuclear, que acepta un protn procedente de la matriz y rompe el enlace covalente O-O para reducir uno de los tomos O (paso 7, fig. 5-19, b). El paso de un cuarto electrn y la entrada de tres protones adicionales procedentes de la matriz (pasos 8-11, fig. 5-19, b) conduce a la formacin de dos molculas de agua. Por cada protn eliminado de la matriz queda detrs un exceso de carga negativa (en forma de un OH~), y por lo tanto contribuye directamente al gradiente inico a travs de la membrana mitocondrial interna. Algunos venenos respiratorios potentes, incluyendo monxido de carbono (CO), acida (Na") y cianuro (CN~), producen su efecto txico por enlace al sitio cataltico de la citocromo oxidasa. (El monxido de carbono tambin se enlaza al grupo hem de la hemoglobina.) Adems de actuar como agente reductor de O, la citocromo oxidasa es una bomba de protones. La determinacin del mecanismo para la translocacin de protones por medio de la citocromo oxidasa, y de qu manera la transferencia de electrones realiza este proceso, todava esperan

Ya hemos visto que la energa libre liberada en forma de electrones pasa de NADH o de FADH2 al oxgeno molecular y se emplea para desplazar protones de la matriz al espacio intermembrana. La translocacin de protones a travs de la membrana interna es electrgena (o sea, produce voltaje), debido a que proviene de un mayor nmero de cargas positivas en el espacio intermembrana y el citoplasma, y un mayor nmero de cargas negativas dentro de la matriz. Por lo tanto, se deben considerar dos componentes en el gradiente de protones. Uno es la diferencia de concentracin entre los iones hidrgeno a un lado de la membrana en comparacin con el otro lado; ste es un gradiente de pH (ApH). El otro componente es el voltaje (1/1) que resulta de la separacin de cargas a travs de la membrana. Un gradiente con un componente de concentracin (qumico) y un componente elctrico (voltaje) es un gradiente electroqumico (pg. 190). La energa presente en ambos componentes del gradiente electroqumico de protones se puede combinar y expresar como fuerza motriz de protones (Ap), que se mide en milivoltos. Por lo tanto,

Ap = V - 2.3 RT/F ApH

Ya que 2.3 RT/F es igual a 59 mV a 25C, la ecuacin3 se puede replantear como
2 Con el tiempo se dio gran importancia al nmero particular de protones translocados por electrn transferido por molcula de oxgeno reducida a agua por molcula de ATP sintetizada. Estas diferentes proporciones son importantes para determinar el mecanismo preciso de sntesis de ATP, pero an hay gran desacuerdo respecto de las verdaderas cifras. Para no aadir complejidad innecesaria a un tema de por s complicado, tratamos de evitar el anlisis de las diferentes proporciones. Las estimaciones actuales sugieren que se translocan casi 10 protones por cada par de electrones que viajan desde el NADH al O2 y se utilizan tres protones en la sntesis de una molcula de ATP por la ATP sintasa. 3 En otras palabras, una diferencia de pH de una unidad representa una diferencia 10 veces mayor o menor en la concentracin de H+ a travs de la membrana y equivale a una diferencia de potencial de 59 milivoltios, que es igual a una diferencia de energa libre de 1.37 kcal/ mol.

CAPITULO 5 Respiracin aerobia y initocondrias

191

del Ap est representada por el componente de voltaje y el otro 20% por la diferencia de concentracin de protones (cerca de 0.5 cuando la diferencia de pH es de una unidad). Si la fuerza motriz de protones fuera principalmente el gradiente H+, todo el citoplasma sera muy cido, propiedad que puede afectar la actividad de las enzimas citoplsmicas. La presencia de voltaje transmembrana se puede demostrar visualmente utilizando colorantes liposoubles con carga positiva que se distribuyen a travs de la membrana en proporcin al potencial elctrico (fig. 5-21). Hace varios decenios se descubri que ciertos agentes, sobre todo 2,4-dinitrofenol (DNF), eran capaces de desacoplar el proceso de oxidacin de la mucosa y la desfosforilacin del ATP. Cuando se trata a clulas con DNF siguen oxidando sustratos pero ya no generan ATP. El frmaco acta como desacoplador de la fosforilacin oxidativa porque vuelve permeable la membrana mitocondrial a protones. Para mantener una fuerza motriz de protones, la membrana mitocondrial interna debe ser muy impermeable a protones. En caso contrario, el gradiente establecido por,el transporte de electrones se disipa de inmediato por la difusin de protones de regreso al interior de la matriz. Los experimentos que condujeron a aceptar la fuerza motriz de protones como intermediario en la formacin de ATP se analizan en La va experimental, al final del captulo.

5-5 Mecanismo para la formacin

de ATP
7)jm
FIGURA 5-21. Visualizacin de la fuerza motriz de protones. Micrografa por fluorescencia de una clula cultivada y teida con el compuesto catinico fluorescente JC-1. Cuando la clula est activa, el voltaje generado a travs de la membrana mitocondrial interna (interior negativo) produce acumulacin de la sustancia liposoluble dentro de la miocondria y provoca fluorescencia de los organelos. Con potenciales de membrana altos, JC-1 forma agregados que cambian sus propiedades de fluorescencia. En el estado monomrico, el colorante muestra fluorescencia verde, en tanto que en el estado agregado muestra fluorescencia de color rojo. Se observa que la clula contiene organelos fluorescentes de color naranja y de color verde, lo que sugiere la presencia de dos poblaciones diferentes de mitocondrias con distintos potenciales de membrana. (Cortesa de Lan Bo Chen.)

Ya vimos cmo el transporte de electrones genera un gradiente electroqumico de protones a travs de la membrana mitocondrial interna; ahora podemos regresar al mecanismo molecular que utiliza la energa almacenada en este gradiente para la fosforilacin de ADP.

Ap = V - 59 ApH donde ApH se expresa con valor negativo en tanto [H+] sea mayor en el espacio intermembrana que en la matriz. La contribucin del potencial elctrico a la fuerza motriz de protones en comparacin con el gradiente de pH depende de las propiedades de permeabilidad de la membrana interna. Por ejemplo, si durante el transporte de electrones el movimiento de protones hacia fuera se acompaa de iones cloro con carga negativa, entonces el potencial elctrico (i/;) se reduce sin afectar el gradiente de protones (ApH). Mediciones efectuadas en diferentes laboratorios fpg. 200) sugieren que una mitocondria que respira activamente genera una fuerza motriz de protones de unos 220 mV a travs de su membrana interna. Se estima que en la mitocondria de mamferos cerca de 80% de la energa libre

10 nm

KIGURA 5-22. Mecanismo de la sntesis de ATP. Micrografa electrnica de una pequea porcin de la mitocondria del corazn de ternera secada al aire y teida en negativo. Con una amplificacin aproximada de medio milln, se observan partculas esfricas unidas por un pequeo tallo a la superficie de las crestas de la membrana interna. (Segn Humberto Fcrnandez-Moran y cois. J. Cell Bol. 22.71, 1974, con permiso de Rockefeller University Press.)

192

CAPITULO 5 Respiracin aerobia y mitocondrias

A principios del decenio de 1970, Humberto FernndezMorn, del Hospital General de Massachussetts, estaba examinando mitocondrias aisladas por medio de la tcnica recin desarrollada de tincin negativa, y descubri una capa de esferas unidas al lado interno (lado de la matriz) de la membrana interna que se proyectaban desde la membrana y se unan a la misma por medio de tallos (fig. 5-22). Pocos aos despus, Efraim Racker, de la Universidad Cornell, aisl las esferas de la membrana externa, a las cuales llam factor 1 de acoplamiento, o simplemente FI. Racker descubri que las esferas FI se comportaban como una enzima que hidroliza ATP, o sea una ATPasa. A primera vista este parece ser un hallazgo muy peculiar. Por qu la mitocondria debe poseer una enzima para hidrolizar a la sustancia que se supone produce? Cuando se considera que la hidrlisis del ATP es la reaccin inversa de su sntesis, puede ser ms evidente la funcin de la esfera FI; sta contiene el sitio cataltico en el cual ocurre normalmente la formacin de ATP. Recordemos que 1. Las enzimas no afectan la constante de equilibrio de la reaccin que catalizan. 2. Las enzimas pueden catalizar las reacciones en ambas direcciones. Por consiguiente, la direccin de una reaccin catalizada por enzimas depende en todo momento de las condiciones prevalecientes. Esto se demostr elegantemente en experimentos con otras ATPasas, como la ATPasa de Na + -K + de la membrana plasmtica (pg. 149). Cuando se estudi esta enzima en el captulo 4, se describi como una enzima que aprovecha la energa obtenida en la hidrlisis del ATP para exportar Na + e importar K + contra sus respectivos gradientes. Esta es la nica funcin de la enzima en la clula. Sin embargo, en condiciones experimentales esta enzima puede catalizar la formacin de ATP en vez de su hidrlisis (fig. 5-23). Para lograr dichas condiciones se prepararon fantasmas de eritrocitos (pg. 139) con concentracin interna de K + y concentracin externa de Na + muy elevadas, ms altas de las que normalmente existen en la clula. En estas condiciones, el K + sale de la "clula" y el Na+ entra a la misma. Ambos iones se mueven siguiendo sus respectivos gradientes y no en contra de los mismos, como ocurre normalmente en una clula viviente. Si dentro del fantasma hay ADP y P, el movimiento de los iones produce sntesis de ATP en vez de hidrlisis. Experimentos como ste ilustran lo que sera de esperar con base en la reversibilidad terica de las reacciones catalizadas por enzimas. Tambin ilustran cmo se puede utilizar un gradiente inico para efectuar una reaccin en la cual se fosforila ADP para formar ATP, que es precisamente lo que ocurre en la mitocondria. La fuerza empleada es la fuerza motriz de protones establecida por el transporte de electrones.

ATPasa de Na+-K+

FIGURA 5-23. Experimento para efectuar la sntesis de ATP en vesculas de membrana reconstituidas con ATPasa de Na+-K+. Al ocasionar en estas vesculas una concentracin interna muy elevada de K + y una concentracin externa muy elevada de Na + , la reaccin tiene lugar en direccin opuesta a la que sigue en su curso normal dentro de la membrana plasmtica. En este proceso se forma ATP a partir de ADP y P. El tamao de las letras indica la direccin de los gradientes de concentracin.

Estructura de la ATP sintasa

La esfera FI es la porcin cataltica de la enzima que sintetiza ATP en la mitocondria, pero sta no es la historia completa. La enzima sintetizadora de ATP (fig. 5-24), denominada

ATP-sintasa (o complejo V), se compone de dos elementos principales: la pieza cabeza FI y una seccin basal, llamada FQ, integrada a la membrana interna. Las dos porciones estn conectadas por un estrecho tallo. Se estima que una mitocondria tpica de hgado de mamfero posee regularmente 15 000 copias de ATP-sintasa. En la membrana plasmtica de bacterias aerobias, la membrana tilacoides de clulas vegetales y la membrana interna de las mitocondrias se observan versiones homologas de la ATP-sintasa. Puesto que la ATP-sintasa de la bacteria E. coli es la mejor caracterizada, emplearemos esta versin particular como centro del siguiente anlisis. La pieza cabeza FI tiene un peso molecular de casi 360 000 daltons y contiene cinco polipptidos diferentes (fig. 5-24). En la enzima mitocondrial, los polipptidos homlogos son codificados por el DNA nuclear, sintetizados en el citoplasma e importados despus de la traduccin. La porcin FQ de la ATP-sintasa bacteriana consta de tres polipptidos diferentes y se cree que uno de ellos (el polipptido b) se proyecta afuera de la membrana para formar el tallo. En clulas de mamfero, los homlogos mitocondriales de estos tres polipptidos son codificados por DNA mitocondrial, en tanto que varios polipptidos adicionales no presentes en la enzima bacteriana son codificados por DNA nuclear. En las mitocondrias, la pieza basal Foest integrada a la membrana mitocondrial interna y forma un canal a travs del cual se conducen protones desde el espacio intermembrana al interior de la pieza cabeza FI. La presencia de un canal en la pieza basal FO puede apreciarse mejor en experimentos donde la membrana mitocondrial interna se fragmenta y forma vesculas membranosas llamadas partculas submitocondriales (fig. 5-25). Las partculas submitocondriales intactas pueden oxidar sustratos, generar un gradiente de protones y sintetizar ATP. Sin embargo, si se eliminan las esferas FI de las partculas mediante

CAPITULO 5 Respiracin aerobia y mitocondrias

193

FIGURA 5-24. Estructura de la ATP sintasa. a) Micrografa electrnica de la enzima aislada, b) Esquema de la ATP sintasa. La enzima consta de dos porciones principales: la pieza cabeza FI, que consta de cinco subunidades diferentes en proporcin 3a:3/?:l<5:ly:l.e y la pieza basal FO, la cual se integra a la membrana y consta de tres subunidades diferentes en la relacin la:2b:12c. Las subunidades b de FO se extienden hacia adentro de la pieza ceflica para formar un tallo, (a: Segn J.W. Soper, G.L. Decker y P.L. Pederson, J. Biol. Chem. 254:11173, 1979.)

tratamiento con urea, la membrana de la vescula ya no puede mantener un gradiente de protones a pesar de que contina oxidando sustrato y transportando electrones. Los protones translocados a travs de la membrana simplemente retornan a travs de la ATP-sintasa "decapitada" y la energa se disipa.

enlazados se condensan con facilidad para formar una molcula de ATP enlazada sin ingreso de energa adicional. En otras palabras, aunque la reaccin ADP soluble + P soluble -> ATP soluble + H2O puede requerir el ingreso de una cantidad considerable de energa (7.3 kcal/mol en condiciones estndar), la reaccin enzima-ADP enlazado + enzima-Pi enlazado -> enzima-ATP enlazado + H2O posee una constante de equilibrio cercana a 1 (AG = 0), y por lo tanto puede ocurrir espontneamente sin el ingreso de energa (pg. 83). Esto no significa que se pueda sintetizar ATP a partir de ADP sin consumir energa; ms bien indica que la energa se requiere para enlazar los sustratos al sitio activo, para liberar el producto del sitio activo o para ambos procesos, y no para la fosforilacin en s. Se cree que este proceso ocurre de la siguiente manera. Segn la hiptesis de Boyer de "cambio de enlace", cada pieza cabeza FI contiene tres sitios catalticos (uno por cada subunidad fi} que varan progresivamente a travs de tres diferentes conformaciones, segn se refleja en su afinidad por nucletidos. Estas tres conformaciones pueden describirse corno la conformacin "apretada" o T, en la cual los nucletidos (ADP + P o ATP) estn firmemente unidos; la conformacin "laxa" o L, en la cual ADP y P estn laxamente unidos; y la conformacin "abierta" u O, la cual debido a su muy escasa afinidad por nucletidos se considera que est vaca. Estos tres sitios se ilustran en el diagrama de la figura 5-26. Los pasos descritos en seguida se refieren a hechos que ocurren en el sitio cataltico, coloreado en rojo en esa figura.

Mecanismo de la formacin de ATP

En la actualidad hay acuerdo prcticamente unnime acerca de que el movimiento de electrones a lo largo de la cadena respiratoria produce un gradiente de protones, y que el movimiento de protones que cruzan de regreso la membrana a travs de la ATP-sintasa acta para conducir a la formacin de ATP. El mecanismo para que esto ocurra es menos claro. Una hiptesis formulada por Paul Boyer y sus colegas, de la UCLA, contina ganando aceptacin. En la hiptesis de Boyer, el movimiento de protones a favor de un gradiente electroqumico a travs de los canales en la base FO y en la cabeza FI induce cambios de conformacin que alteran la afinidad de la protena para ADP, P y ATP. Consideremos con mayor atencin esta hiptesis. De ordinario se piensa en reacciones celulares que ocurren en un medio acuoso en el cual la concentracin de agua es 55 M, y los reactantes y productos simplemente estn disueltos en el medio. En estas condiciones se requiere energa para formar enlaces covalentes que unan el ADP con fosfato inorgnico para formar ATP. Sin embargo, se ha demostrado que una vez que ADP y P se unen firmemente en el sitio cataltico de la ATP-sintasa, los dos reactantes

194

CAPITULO 5 Respiracin aerobia y mitocondrias Membrana externa Los sustratos se oxidan y se forma ATP ATPLos sustratos se oxidan pero no se forma ATP

Matriz

Vescula de membrana interna Membrana interna Lneas de desdoblamiento durante la sonicacin Mitocondria

Vescula de la membrana

Partculas F

50 nm

FIGURA 5-25. Formacin de ATP en experimentos con partculas submitocondriales. a) Micrografa electrnica de partculas submitocondriales que son fragmentos de la membrana mitocondrial interna convertidas en vesculas cerradas y con las esferas F] proyectndose hacia afuera en el centro, b) Esquema de un experimento que muestra que las partculas submitocondriales intactas son capaces de oxidar el sustrato y sintetizar ATP, en tanto que las partculas "decapitadas" son capaces de oxidar sustrato pero incapaces de formar ATP. (a: Cortesa de Efraim Racker.)

En e) paso 1 de la figura 5-26, ADP y P se enlazan laxamente al sitio cataltico en la conformacin L. A continuacin los protones se enlazan a la enzima en los sitios alostricos que enfrentan el espacio intermembrana donde la concentracin de H + es alta. Una vez enlazados, los protones inducen cambios de conformacin que aumentan la afinidad del sitio cataltico para ADP y P, provocando que estos reactantes se unan con mucho mayor firmeza a la enzima (esto se indica con los sustratos unidos a la conformacin T en el paso 2 de la figura 5-26). A continuacin los reactantes se condensan en forma espontnea para formar ATP, que permanece fuertemente enlazado al sitio activo en la conformacin T (paso 3, fig. 5-26). En seguida, la enzima

sufre un cambio de conformacin que expone el sitio alostrico de enlace a protones al lado de la membrana correspondiente a la matriz, donde la concentracin de H + es baja. La disociacin de los protones de la enzima en la matriz cambia la conformacin del sitio cataltico, disminuye su afinidad por el ATP enlazado y se libera el producto dentro de la matriz (paso 4, fig. 5-26). La reaccin total neta llevara a la sntesis de ATP a expensas de los protones que se mueven siguiendo su gradiente desde el espacio intermembrana hacia la matriz. Se cree que los cambios de conformacin del sitio activo se acompaan de la rotacin de la pieza cabeza FI en relacin con su tallo, llevando los sitios catalticos a posi-

ADP

Los protones se enlazan a las enzimas

Formacin espontnea de ATP

Liberacin de los protones de la matriz

ATP

FIGURA 5-26. Hiptesis de "cambio de enlace" como mecanismo por el cual el gradiente de protones efecta la sntesis de ATP. Los pasos numerados se refieren a la secuencia de acontecimientos que ocurren en la subunidad de color rojo, segn se describe en el texto. Lo ms importante es que el enlace de protones a la enzima en el lado citoplsmico de la membrana provoca un cambio de conformacin (desde el paso 1 hasta el 2), que da como resultado el eniace firme de ADP y de P en el sitio cataltico de la enzima. A continuacin, la formacin de ATP ocurre de manera espontnea. La liberacin subsecuente de protones al interior de !a matriz causa un segundo cambio de conformacin (pasos 3 a 4) que libera el ATP recin formado.

CAPITULO 5 Respiracin aerobia y mitocondrias

195

Citoplasma
ADR3"
\

rp
^7 ATP4-

ministr fuerte apoyo a la hiptesis de cambio de enlace as como a la proposicin de que la pieza cabeza gira sobre su tallo.

Otras funciones para la fuerza motriz de protones adems de la sntesis de ATP

Aunque la actividad ms importante de las mitocondrias puede ser la produccin de ATP, estos organels participan en muchas otras actividades que requieren ingreso de energa. A diferencia de la mayor parte de los organels que dependen principalmente de la hidrlisis de ATP para obtener la energa necesaria en sus actividades, las mitocondrias dependen de una reserva alterna de energa: la fuerza motriz de los protones. Por ejemplo, una investigacin de los transportadores situados entre la membrana mitocondrial interna revela varios ejemplos en los cuales el movimiento de solutos es gobernado por la energa libre almacenada en el gradiente inico a travs de esta membrana "energizada". Un punto de discusin es la ADP-ATP tmnslocasa que transporta ADP al interior de la matriz, donde sirve como reactante para la sntesis de ATP, intercambindolo por ATP, el cual se desplaza haca afuera de las mitocondrias. Las molculas de ATP llevan una carga negativa extra en comparacin con sus contrapartes ADP (ATP4" en comparacin con

Matriz
FIGURA 5-27. Empleo de la fuerza motriz de protones para desplazar ADP al interior de la matriz y ATP al espacio intermembrana (y por lo tanto citoplsmico).

clones sucesivas para interactuar con los protones que vienen a travs del canal FQ. Un trabajo publicado en 1994 acerca de la estructura atmica de la porcin mayor de la pieza cabeza FI de las mitocondrias del corazn de ternera su-

C02

FIGURA 5-28. Resumen de las principales actividades que ocurren durante la respiracin aerobia en una mitocondria.

Ciclo del cido tricarboxco *^\o pirvico

7
I

C4

c4

Espacio ., intermembrana

196

CAPTULO 5 Respiracin aerobia y mitocondrias

FIGURA 5.29. Importacin de protenas al interior de una mitocondria. a) Micrografa electrnica c!e una mitocondria que importa protenas precursoras mitocondriales in vitro. Los sitios por donde penetran las protenas se revelan marcando las protenas con partculas de oro visibles al microscopio electrnico. Las partculas se localizan en sitios donde las membranas interna y externa estn en contacto, b) Pasos propuestos seguidos por una protena importada al interior de la matriz mitocondrial. El polipptido se dirige a la mitocondria gracias a la secuencia orientadora en el N-terminal, que finalmente es eliminado en la matriz. Hsp70 y mHsp70 son chaperones moleculares. El Hsp70 citoplsmico facilita el desplegamiento del polipptido antes de penetrar a la mitocondria, en tanto que el mHsp70 mantiene la protena importada en un estado de plegamento laxo dentro de la matriz antes de transferirla al chapern HspO donde ocurre el plegamiento. Hsp60 es una cmara de doble capa cuya estructura y funcin son similares al GroEL bacteriano descrito en la pgina 74. (a: Segn Martin Schwaiger, Volker Herzog y Walter Neupert, J. Cell Biol. 105:243, 1987; con permiso de Rockefellcr Uniuersity Press.)

(a)

Secuencia orientadora 1. Precursor de protena desplegada

nir ^^

ATP
ADP + P

Precursor de ">"*" proena { mitocondriaL

2. La protena desplegada se enlaza al receptor y pasa a travs de ambas membranas

Protena madura

Hsp60
ADP + P; ATP

3. La protena se pliega y se ensambla

4. La secuencia de orientacin es eliminada

3,

Protena parcialmente plegada

(b)

CAPITULO 5 Respiracin aerobia y mitocondrias

197

ADP3 ). Debido a esta carga negativa adicional, se cree que el potencial elctrico a travs de la membrana interna (lado exterior positivo) (fig. 5-27) "tira" de las molculas de ATP hacia afuera de la matriz. Un transportador separado de la membrana interna capta el fosfato junto con un protn y suministra la energa para la reaccin. As pues, la fuerza motriz de protones no slo se emplea para la formacin de ATP, sino tambin para exportar el producto nucletido fuera de la mitocondria e importar os reactantes al interior de la matriz. Estas diferentes actividades se resumen en la figura 5-28; la mayor parte de ellas se relacionan de manera directa o indirecta con la sntesis de ATP. En otros ejemplos, la fuerza motriz de protones se puede utilizar como fuente de energa para "tirar" de los iones calcio hacia el interior de la mitocondria; para iniciar la reaccin transhidrogenasa que produce NADPH, que constituye el poder reductor de la clula (pg. 104); y para obligar a poiipptidos especficos a penetrar a la mitocondria procedentes de la matriz (esto se analiza posteriormente).

5-6 Importacin de las protenas mitocondriales

Muchas de las protenas de la mitocondria se distinguen por estar ensambladas a partir de poiipptidos sintetizados en regiones totalmente diferentes de la clula, caracterstica que confiere especial inters al estudio de la biognesis mitocondrial. Los poiipptidos codificados por el genorna mitocondrial y sintetizados en la matriz de la mitocondria son introducidos a la membrana mitocondrial interna como parte de protenas integrales de la membrana (fig. 5-17). Los restantes poiipptidos de la mitocondria son codificados por el genoma nuclear y sintetizados en el citoplasma. Cmo puede este ltimo grupo de poiipptidos encontrar su camino dentro de las diferentes partes de la mitocondria? La va mejor estudiada conduce del citoplasma a la matriz, el compartimiento mitocondrial ms interno. Los poiipptidos importados a la matriz contienen un segmento de 20 a 70 aminocidos adicionales a su N-termi~ nal que dirige la molcula hacia la matriz. Esta secuencia orientadora contiene algunos aminocidos hidroxilados con carga positiva que son la seal reconocida y enlazada por un complejo receptor en la superficie externa mitocondrial. La translocacin del polipptido desde el citoplasma al interior de la matriz mitocondrial ocurre en sitios donde las membranas mitocondriales externa e interna forman contactos especializados (fig. 5-29, a). El movimiento a travs de la membrana interna es gobernado por el potencial elctrico a travs de la membrana que acta sobre la secuencia orientadora con carga positiva; cuando se disipa el potencial aadiendo un desacoplador, la translocacin se interrumpe y el polipptido permanece "atrapado" dentro de la membrana. La evidencia indica que aunque una protena mitocondrial puede sufrir plegamiento en el citoplasma, se desdobla como resultado de su asociacin a un chapern citoplsmico denominado Hsp70 (fig. 5-29, b). (El papel de los chaperones se analiza en la pgina 71.) La protena desdoblada es liberada al receptor mitocondrial y entonces pasa a travs de un poro situado en la membrana mitocondrial en

su estado extendido, desplegado. Una vez dentro de la matriz, el segmento orientador N-terminal es eliminado por una proteasa y el polipptido nteracta con nuevos chaperones moleculares (fig. 5-29, b) que facilitan el plegamiento y ensamblado final. La ruta que siguen las protenas destinadas a la membrana interna y al espacio intermembrana est menos bien definida. Algunos poiipptidos aparentemente penetran a la matriz por la va ya mencionada y luego son exportados de la matriz hacia la membrana interna o la atraviesan por completo hacia el interior del espacio intermembrana. Otras pueden pasar del citoplasma, a travs de la membrana externa, y dirigirse a su destino final. Como se hizo notar antes, varias protenas de la membrana interna deben ensamblarse a partir de poiipptidos sintetizados en la mitocondria y el citoplasma. Los poiipptidos sintetizados en la matriz mitocondrial tal vez sean elaborados por un mecanismo similar al que opera en el retculo endoplsmico rugoso (pg. 287). Los ribosomas mitocondriales se unen a la superficie interna de la membrana interna y el polipptido naciente se transloca al interior de la membrana conforme se sintetiza (o sea, cotranslacin).

5-7 Peroxisomas
En 1954, el examen con microscopio electrnico de las clulas de los tbulos renales revel una partcula con apariencia granular densa de 0.5 a 1.0/im de dimetro, aproximadamente, enlazada a la membrana. Nada se saba acerca de la funcin de esta estructura y se le denomin microcorpsculo. Posteriormente se encontraron organelos similares en varias clulas eucariotas. Conforme se conoci ms acerca de su funcin se le dividi en dos tipos principales: peroxisomas, presentes tanto en plantas como en animales, y glioxisomas, que slo se observan en las plantas. Los microcorpsculos se consideran en el presente captulo debido a que comparten dos propiedades con las mitocondrias: participan en el metabolismo oxidativo e importan sus protenas despus de ser traducidas. Los peroxisomas son vesculas simples rodeadas por una membrana (fig. 5-30, a) y con frecuencia contienen un ncleo cristalino denso consistente en una enzima oxidativa (fig. 6-25). Los peroxisomas son "fbricas" metablicas muy verstiles, con enzimas que participan en actividades tan diversas como oxidacin de cidos grasos de cadena muy larga (AGCML, una de cuyas cadenas contiene ms de 18 carbonos); sntesis heptica de colesterol y cidos biliares; y sntesis de plasmalgenos, un tipo importante de fosfolpidos del tejido cerebral, en los cuales un cido graso se une al glicerol mediante una unin ter en vez de una unin ster. La enzima luciferasa, que genera la luz emitida por las lucirnagas, tambin es una enzima peroxismica. Estos organelos se denominaron "peroxisomas" debido a que se encuentran en los sitios donde se forma perxido de hidrgeno (H2C>2), un agente oxidante txico y muy reactivo. El perxido de hidrgeno se sintetiza por accin de varias enzimas, incluyendo urato oxidasa, glucolato oxidasa y aminocido oxidasas, que utilizan el oxgeno molecular para

198

CAPITULO 5 Respiracin aerobia y mitocondrias

2H2^2 ?0
RH;

Oxidasa

Catalasa

H2 ?u 02

2H,0

(b)

FIGURA 5-30. Estructura y funcin de los peroxisomas. a) Micrografa electrnica de peroxisomas purificados, aislados por centrifugacin a travs de un gradiente de densidad de sacarosa, b) Los peroxisomas contienen enzimas que efectan la reduccin del oxgeno molecular en dos pasos para formar agua. En el primer paso, una oxidasa elimina electrones de varios sustratos (RH2), como cido rico o aminocidos. En el segundo paso, la enzima catalasa convierte en agua el perxido de hidrgeno formado en el primer paso, (a: Segn Y. Fujiki y cois., ]. Cell Biol. 93:305, 1982; con permiso de Rockefeller University Press.)

0.5 fim

LA VIA E X P E R I M E N T A L

Acoplamiento de oxidacin a fosforilacin

El vnculo entre oxidacin y fosforilacin fue propuesto por primera vez por el bioqumico ruso Vladimir Engelhardt, en 1932, quien observ que las clulas colocadas en condiciones anaerobias rpidamente agotan sus reservas de ATP. Cuando se restablecen las condiciones aerobias, el ATP se resintetiza con rapidez.1 El acoplamiento de dos procesos biolgicos bsicos; la oxidacin de sustratos y la fosforilacin de ADP, se convirti en una de las reas ms importantes y debatidas de la investigacin en biologa celular. Una de las preguntas bsicas que debe responderse es de qu manera se almacena la energa liberada a lo largo de la cadena respiratoria como consecuencia del movimiento de electrones, de modo que pueda aprovecharse para la sntesis de ATP. La primera hiptesis importante para explicar el acoplamiento de fosforilacin a oxidacin se bas en la experiencia obtenida de investigaciones acerca de reacciones acopladas a energa. En 1953, E.C. Slater propuso que la energa liberada por el transporte de electrones queda atrapada en un intermediario qumico de alta energa, el cual subsecuentemente se emplea en una reaccin para formar ATP.2 En la figura 3-27 se hizo notar que numerosos compuestos biolgicos tienen potencial elevado para transferir fosfatos en comparacin con ATP. Cualquier compuesto de este tipo puede servir para almacenar energa que subsecuentemente se utilice en a sntesis de ATP transfiriendo un fosfato al ADP. Esta es la esencia de la fosforilacin a nivel sustrato {pg. 102). La bsqueda del intermediario qumico de alta energa en la fosforilacin oxidativa ocup la actividad de un gran nmero de laboratorios cuando menos durante 10 aos, pero no se descubri dicho compuesto. En 1961, Peter Mitchell, de la Universidad de Edinburgo, propuso un mecanismo radicalmente diferente para explicar el acoplamiento de oxidacin a fosforilacin, al cual denomin quimiosmosis. Casi todos los primeros investigadores en el campo de la bioenergtica eran bioqumicos acostumbrados a estudiar las reacciones que ocurren en un medio soluble, sea en el tubo de ensaye o en la fase lquida de la clula. Pero se haba demostrado que la fosforilacin oxidativa estaba ntimamente relacionada con membranas celulares, ya fuese la membrana interna de la mitocondria o la membrana plasmtica de bacterias aerobias. Mitchell pens que la estructura de la membrana deba ser un factor clave en cualquier hiptesis para explicar la fosforilacin oxidativa. Las primeras investigaciones de Mitchell acerca del transporte de membrana lo llevaron a apreciar el hecho de que las sustancias (electrones, iones, azcares u otros compuestos) se desplazaban en una direccin especfica (vectoralmente) de un lado de la membrana hacia el otro. Algunos de los primeros trabajos de Mitchell que lo llevaron a considerar movimientos vectoriales como clave de la fosforilacin oxidativa fueron revisados por R.N. Robertson.3 En la teora de la quimiosmosis, Mitchell propuso que el movimiento de los electrones a lo largo de la cadena respirato-

CAPITULO 5 Respiracin aerobia y mitocondrias

199

oxidar sus respectivos sustratos (fig. 5-30, b). El HjOz generado en estas reacciones rpidamente se descompone por accin de la enzima catalasa, presente en elevada concentracin en estos organelos. Igual que en la mitocondria, las protenas encontradas entre los peroxisomas se sintetizan en el citoplasma y luego son importados al organelo despus de su traduccin. El otro tipo principal de microcorpsculos, los glioxisomas, contienen algunas de las mismas enzimas encontradas en los peroxisomas (como catalasa y enzimas para la oxidacin de cidos grasos), pero adems contienen otras enzimas. Los glioxisomas son ms prominentes en las plantas de semilla, que dependen de los cidos grasos almacenados para obtener energa y materiales para iniciar la formacin de una nueva planta (fig. 5-31). Una de las actividades metablicas primaras en estas semillas germinantes es convertir los cidos grasos almacenados en carbohidratos (gluconeognesis). El desdoblamiento de los cidos grasos almacenados genera acetil-CoA, que puede condensarse con oxalacetato para formar citrato, el cual a su vez puede convertirse en glucosa mediante una serie de enzimas localizadas en el glioxisoma.

FIGURA 5-31. Localizacin del glioxisoma en semillas de planta. Micrografa de luz de una seccin a travs de los cotiledones de semillas de algodn embebidas. Los glioxisomas, que se observan como pequeas estructuras oscuras (flecha), son visibles gracias a un procedimiento citoqumico que tie la enzima catalasa. (Segn Kent D. Chapman y Richard N. Trelease, J. Cell Biol. 115:998, 1991; con permiso de Rockefeller University Press.)

ria da como resultado la translocacin de protones de un lado de la membrana rnitocondrial interna al otro.4'5 Mitchell lleg a esta conclusin luego de considerar la naturaleza de los portadores de electrones (pg. 184). La cadena respiratoria est constituida por dos tipos de portadores: unos que aceptan protones y electrones y otros que slo pueden aceptar electrones. En la hiptesis quimiosmtica, Mitchell recalc la importancia de la disposicin espacial de los diferentes portadores entre la membrana transductora de energa. Sugiri que los portadores que se enlazan a protones y electrones (corno las flavoprotenas) podran estar en el lado interno de la membra-

na rnitocondrial de modo que pudieran eliminar protones de la matriz. Para liberar estos protones en el otro lado, deben pasar electrones a los portadores del lado externo de la membrana que no aceptan protones (como los citocromos). Dada la organizacin apropiada de los portadores dentro de la membrana, se pueden pasar electrones a todo lo largo de la cadena hasta llegar al oxgeno, en tanto que los protones simplemente seran cambiados a travs de la membrana en una sola direccin. El paso de un electrn desde un portador del lado interno a uno del lado externo y su regreso al lado interno constituye una asa redox (fig. VE 5-2, a). Inicialmente, la hiptesis

Matriz NADH NAD+ 2H+ 2H+ l/202 + 2H+ H20 FIGURA VE 5-1. Modelo que muestra las tres asas redox propuestas por Mitchell antes de 1970. En cada asa, un portador que transloca tomos de hidrgeno capta un par de protones en la superficie de la matriz. Cuando el portador del tomo de hidrgeno pasa su carga a un portador que slo acepta electrones (p. ej., citocromos y protenas Fe-S), los protones se descargan en el espacio intermembrana (y el citoplasma). Por consiguiente, cada asa transloca dos protones desde la matriz al interior del espacio intermembrana. Z es un portador hipottico de hidrgeno propuesto para mover protones, el cual permitira que la citocromo oxidasa quedara como brazo transportador de electrones de la tercera asa redox. (Segn THE VITAL FORC: A STUDY OF BIOENERGETICS por KM. Harold. 1986 por W.H. Freeman and Company. Reimpreso con autorizacin.)
2H+ 2H+

Citoplasma

200

CAPITULO 5 Respiracin aerobia y mitocondras

(a)

1. La oxidacin del sustrato y el subsecuente transporte de electrones debe acompaarse de la liberacin de protones. 2. Los portadores de electrones deben disponerse dentro de la membrana interna para formar asas redox que capten protones en un lado de la membrana y los liberen en el otro lado. 3. La membrana mitocondrial interna debe ser .muy impermeable a protones. Adems, agentes desacopladores, como el dinitrofenol, pueden actuar haciendo la membrana ms permeable a protones, suprimiendo el gradiente electroqumico y por lo tanto suprimiendo la capacidad de los organelos para generar ATP. 4. Las mitocondrias que respiran activamente deben mostrar, a travs de su membrana interna, un gradiente cuantificable de protones, un potencial elctrico, o ambas cosas. 5. La presencia de un gradiente electroqumico de protones a travs de la membrana mitocondrial interna suministra la energa requerida para la fosforilacin del ADP. Consideremos brevemente algunos de los experimentos efectuados que apoyaron o refutaron estas predicciones. A mediados del decenio de 1960, una serie de experimentos efectuados por Mitchel y Jennifer Moye utilizando varios tipos de tcnicas de titulacin demostraron que la oxidacin del sustrato por mitocondrias aisladas de hgado de rata se acompaaba de la expulsin de protones.6'7 En estos experimentos, las mitocondrias aisladas de hgado de rata se mantuvieron en condiciones anaerobias, lo cual desenergiza la membrana mitocondrial. Cuando se inyect la suspensin de mitocondrias mediante un pulso breve de solucin salina saturada de C>2, Mitchel y Moyle pudieron descubrir acidificacin del medio. Cuando los electrones se suministraron por el sustrato /3-hidroxibutirato, que introduce electrones a la cadena respiratoria por la va NADH, los clculos de titulacin sugirieron que se liberaban seis H + en el medio por cada tomo de O reducido por un par de electrones. Cuando se emple succinato como sustrato, el cual transfiere electrones a FAD, slo se generaron cuatro H+/O. La adicin de dinitrofenoi a la preparacin mitocondrial inhibi la acidificacin del medio. La hiptesis quimiosttica original predijo que los electrones transportados del NADH al C>2 atraviesan tres asas redox, en tanto que los transportados de FADH2 atraviesan dos asas redox (fig. VE 5-1). Puesto que cada asa redox debe translocar dos protones por cada par de electrones transportados, los datos obtenidos por Mitchel y .Moyle para la expulsin de protones se interpretaron como apoyo de la hiptesis. Otros laboratorios efectuaron experimentos similares utilizando diferentes tcnicas para medir a concentracin de protones y con frecuencia obtuvieron cifras diferentes, desencadenando una gran controversia acerca de la existencia de las asas redox translocadoras de protones. Mitchel y Moyle efectuaron experimentos subsecuentes para medir hasta qu grado el gradiente electroqumico de protones estaba representado por el gradiente de protones en comparacin con la diferencia de potencial elctrico.8 La estimacin de la diferencia de potencial a travs de la membrana se efectu midiendo la distribucin de iones potasio a travs de la membrana mitocondrial en presencia de valinomicina,

AH2 + B
Bomba con canal

W
FIGT'RA VE 5-2. Modelos de asa (a) y de bomba (b) para translocacin de protones. (Segn Y. Kagawa, Biochim. Biop. Acta 505:76, 1978.)

quimiosmtica predijo la existencia de tres de tales asas, como se muestra en la figura VE 5-1. En la primera asa, por ejemplo, FMN2 porta un par de tomos de hidrgeno; los electrones seran transferidos a una protena de hierro y azufre, en tanto que los protones se descartan en el lado externo de la membrana (citoplsmico). Segn la hiptesis quimiosmtica, el moviminto de protones a travs de la membrana conduce al establecmiento de un gradiente electroqumico que representa el enlace de un intermediario de alta energa, procedente de la oxidacin del sustrato, con la fosforilacin del ADP. Para mantener el gradiente, Mitchel propuso que la membrana mitocondrial interna era bastante impermeable a protones y tambin a otras especies inicas. Al mismo tiempo, reconoci que, segn los tipos de sistema de transporte dentro de la membrana, la translocacin de protones podra establecer un gradiente de pH, un gradiente elctrico, o una combinacin de ambos (pg. 190). Una buena hiptesis debe hacer predicciones especficas que puedan probarse en forma experimental. La hiptesis quimiosmtica hizo algunas predicciones que estimularon un notable esfuerzo de investigacin en el campo de la bioenergtica. Entre las predicciones de la hiptesis quimiosmtica se incluyen las siguientes:

CAPITULO 5 Respiracin aerobia y mitocondrias

201

un compuesto que deja la membrana libremente permeable a iones K + . Cuanto mayor sea el voltaje a travs de la membrana (interior negativo), mayor el nmero de iones K + que fluye al interior de la matriz como respuesta a la separacin de carga antes de alcanzar el equilibrio. La diferencia de pH a travs de la membrana mitocondrial se estim a partir de la potencia amortiguadora de los compartimientos mitocondriales interno y externo, y a partir del cambio de pH del medio que ocurri cuando se destruy la membrana mitocondrial con detergente. Empleando estas tcnicas, Mitchell y Moyle estimaron que la fuerza motriz total de protones era de casi 230 mV, y que el principal componente estaba representado por el potencial elctrico. Estos valores aproximados fueron confirmados repetidamente. Aunque Mitchell continu apoyando la existencia de asas redox dentro de la cadena respiratoria,9-10 el consenso cambi a bombas de protones como mecanismo primario para la formacin de un gradiente electroqumico de protones. A diferencia del asa redox, que requiere alternancia de transportadores de protones y de transportadores de no protones dentro de la membrana, una bomba de protones slo requiere la presencia de una protena que pueda mover protones a travs de la membrana en respuesta al flujo de electrones. Las bombas de protones son como los otros tipos de transportadores de iones (seccin 4-5) capaces de translocar iones como resultado de cambios de conformacin que ocurren dentro de la protena, segn se describi para la ATPasa de Na + -K + en la pgina 150. En la figura VE 5-2 se presenta un perfil esquemtico de a diferencia entre un asa redox y una bomba de protones. Es importante observar que las asas y las bombas no son mecanismos mutuamente excluyentes. Es posible que algunos protones sean translocados como consecuencia de un asa redox y otros por una bomba de protones. La demostracin ms directa de la existencia de las bombas de protones dentro de la cadena respiratoria proviene de la investigacin de laboratorio de Marten Wikstrm, de la Universidad de Helsinki, iniciada a principios del decenio de 1970. Wikstrm enfoc su atencin en la citocrorno oxidasa, que segn la hiptesis quirniosttica original constituye el miembro transportador de electrones de la tercera asa redox (fig. VE 5-1). Puesto que la citocromo oxidasa consta de centros redox (hem y iones cobre) que slo transportan electrones,

sera imposible, segn la hiptesis quirniosttica original, que este componente de la cadena respiratoria translocara protones. Pero Wikstrm y sus colegas demostraron que en realidad la citocromo oxidasa desplaza protones a travs de la membrana, tanto si se encuentra dentro de la membrana mitocondrial como si se incorpora a vesculas artificiales.11'12 Para incorporar la enzima a las vesculas se dispers citocromo oxidasa purificada en un medio que contena fosfolpidos solubilizados con detergente. Cuando se eliminaron las molculas del detergente mediante dilisis, las vesculas formadas contenan citocromo oxidasa integrada a la bicapa de lpidos. Cuando se aadi citocromo c reducido a una preparacin de estas vesculas, se transfirieron electrones de las molculas de citocromo c al Oj. Si la citocromo oxidasa slo acta para transferir electrones, se podra esperar que el entorno se alcalinice debido al consumo de protones conforme se reduce el 2 para producir H2. En vez de eso, el medio se volvi cido (fig. VE 5-3), lo que indica expulsin de protones desde las vesculas. La tasa de acidificacin es paralela a la tasa del flujo de electrones desde el citocromo c hasta el C>2 y fue suprimida por desacopladores, como el dinitrofenol. Estos resultados suministran una fuerte prueba de la capacidad inherente de la citocromo oxidasa para translocar protones a travs de una membrana. Mitchell no acept la conclusin de que la citocromoxidasa era una bomba de protones, sino que ofreci una versin modificada del modelo quimiosmtico, en el cual el segundo complejo poda transiocar protones por medio de un "ciclo Q", en el cual las molculas de ubiquinona captan protones en un lado de la membrana y los translocan al otro lado, donde los liberan. Segn la proposicin revisada de Mitchell, la citocromo oxidasa permanece como el miembro transportador de electrones de la ltima asa redox (fig. VE 5-4). La operacin de un ciclo Q que mueve protones a travs del complejo III ha recibido considerable apoyo,.pero la demostracin de que la citocromo oxidasa funciona como bomba de protones tambin es casi indiscutible. La caracterstica ms importante de la hiptesis quimiosrntica propuesta por Mitchell en 1961 fue la idea de que la energa liberada por el transporte de electrones se almacenaba como un gradiente electroqumico de protones a travs de la membrana interna. Hemos descrito algunos de los experimentos que apoyan esta propuesta, en la actualidad aceptada casi

pH
FIGURA VE 5-3. Expulsin de protones desde vesculas membranosas que contienen citocromo c oxidasa. Las vesculas se suspendieron en 0.1 M de KC1 sin amortiguar. Luego de cinco minutos de preincubacin se aadieron 10 f\e una suspensin del donador de electrones ferrocitocromo c (o sea, citocromo c reducido) hasta lograr una concentracin final de 2/M. La adicin de ferrocitocromo produjo una expulsin inicial de protones, aumentando la acidez del medio. Esta expulsin fue contrarrestada por agentes desacopladores. La cantidad de protones expulsados inicialmente excede la concentracin de citocromo oxidasa por casi dos rdenes de magnitud, lo que indica que los protones expulsados se derivan del espacio acuoso interno de las vesculas y que la funcin transportadora de protones de la citocromo oxidasa tal vez sea una propiedad intrnseca del complejo. (Segn M.K.F. Wikstrom y H.T. Saari, Biochim. Biop. Acta 462:354, 1977.) Ferrocitocromo
7.12

Acido

7.13
7.14

1
^-^_ T
-H30 seg 3*-

7.15

7.16

7.17

202

CAPITULO 5 Respiracin aerobia y mitocondras

Matriz
NADH NAD+

2H'

Citoplasma FIGURA VE 5-4. Este modelo, propuesto por Mitchell a finales del decenio de 1960, introdujo a idea de un ciclo Q capaz de translocar cuatro protones y prescindir de una tercera asa que implique citocromo oxidasa. El ciclo Q, cuyos detalles no se analizan, fue ampliamente adoptado para explicar la translocacin de protones a travs de la porcin ubiquinona-complejo III de la cadena respiratoria. (Segn THE VITAL FORC: A STUDY OF BIOENERGETICS por FM. Harold. 1986 por W.H. Freetnan and Company. Reimpreso con autorizacin.)

por toda la comunidad cientfica; los restantes argumentos se relacionan con detalles del mecanismo para generar y utilizar el gradiente. Antes de abandonar el tema de la quimiosmosis, es digno mencionar un par de experimentos clave que establecieron que el gradiente de protones generado por el transporte de electrones pueda efectuar la sntesis de ATP. Segn la hiptesis quimiosmtka, el gradiente electroqumico de protones constituye por s mismo un estado de alta energa capaz de efectuar la fosforilacin del ATP. Si esta interpretacin es correcta, entonces el establecimiento de dicho gradiente por medios artificiales, o sea, transporte no relacio-

nado con electrones, tambin debe servir como fuerza impulsora para la formacin de ATP. Esta prediccin fue probada en 1966 en un ingenioso experimento efectuado por Andre Jagendorf y Ernest Uribe, de la Johns Hopkins University (fig. VE 5-5).i3 Como se analiza en el siguiente captulo, los cloroplastos generan ATP mediante un proceso denominado fotofosforilacin, que utiliza el mismo mecanismo bsico que gobierna la fosforilacin oxidativa en las mitocondrias. Por lo tanto, la hiptesis quimiosmtica tambin se aplica a cloroplastos (y a la membrana plasmtica de bacterias aerobias), igual que a las

60 segundos de incubacin *IIIJIP

--*^ (pH J7)

Transferencia de cloroplastos tratados con cido al tubo que contiene amortiguador a pH 8.0 Amortiguador pHS.O + ADP + 32P04
+ *'& MeClo -"
x

Cloroplastos de espinaca recin aislados _ _ _ Amortiguador pH .4.0

FIGURA VE 5-5. Produccin de ATP en cloroplastos aislados mediante el establecimiento de un gradiente artificial de pH.

jriHfek

(^9p

Amortiguador V^J7 pH4.0 Cloroplastos ahora con pH 4

32P~ATP *

CAPITULO 5 Respiracin aerobia y mitocondrias

203

CUADRO VE 5-1. Cintica de la disminucin alcalina y la fosforilacin del ADP Rendimiento de ATP en el tiempo (seg) Reaccin Disminucin de pH 8 ADP + P - ATP 41 3

30 7 27 1.7 48 1.1 47 0.4 42

60 47

FUENTE: A. Jagendorf y E. Uribe, Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 55: 173,1966. CUADRO VE 5-1. El ATP se expresa en nmol/mg de clorofila. La disminucin de la alcalinidad (rengln 1) se midi inyectando los cloropiastos cidos en un medio amortiguado a pH 8 y esperando luego el nmero indicado de segundos antes de aadir ADP, Mg2+, y fosfato marcado con 32P, seguido por un lapso de 15 segundos estndar con estos reactivos antes de interrumpir la reaccin por adicin de cido tricloractico. E segundo rengln muestra e! tiempo de fosforilacin determinado inyectando cloropiastos acidificados en toda la mezcla de reaccin de fosforiiacin y esperando el nmero indicado de segundos antes de interrumpir la reaccin con cido tricarboxlico. En el rengln de arriba es evidente que cuanto ms larga sea la espera antes de aadir los cloropiastos, menor ser el ATP sintetizado, debido a que el gradiente de pH se disipa. En el segundo rengln, la cantidad de ATP sintetizada aumenta conforme el tiempo de incubacin de la mezcla de reaccin con el istopo marcado aumenta hasta un punto cercano a seis segundos, cuando ya no se observ incremento adicional debido, una vez ms, a que el gradiente de pH se disipa durante el periodo de sntesis de ATP.

Cuando se incorpora bacteriorrodopsina en vesculas artificiales de fosfolpidos, esta protena establece un gradiente de protones a travs de a membrana vesicular despus de ser iluminada. Si se prepararon vesculas artificiales que contenan tanto bacteriorrodopsina como ATP-sintasa mitocondrial purificada, la iluminacin de las vesculas en presencia de ADP y P se acompaa de la sntesis de ATP. Claramente, el gradiente de protones generado por una bomba bacteriana operada por luz fue capaz de efectuar la fosforilacin del ADP utilizando la maquinaria enzimtica de la mitocondria. Los resultados de estos dos ltimos experimentos son importantes por muchas razones. No slo demostraron que un gradiente electroqumico puede suministrar energa Ubre para formar ATP, sino tambin indican qu transporte de electrones y sntesis de ATP no necesitan estar directamente acoplados. En estos experimentos no hubo transporte alguno de electrones; por lo tanto, se puede concluir que la fosforilacin puede ocurrir independientemente del transporte de electrones. En condiciones normales, el transporte de electrones genera un estado de alta energa empleado para la fosforilacin, pero no hay condiciones particulares para que ese estado de alta energa no pueda satisfacerse con un gradiente generado de otra manera.
BIBLIOGRAFA
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mitocondrias. Jagendorf demostr desde el principio que la iluminacin de cloropiastos aislados genera un gradiente de protones a travs de las membranas del cloroplasto, de modo que el lado interno es cido en relacin con el externo. Para establecer un gradiente "artificial" a travs de las membranas del cloroplasto, Jagendorf y Uribe prepararon cloropiastos aislados de clulas de espinaca y los suspendieron en la oscuridad en un tubo que contena un amortiguador a pH 4 durante casi 60 segundos {ftg. VE 5-5), tiempo requerido para que los protones del medio crucen la membrana del cloroplasto de modo que desciendan el pH dentro de dicho compartimiento. Luego que el pH de los compartimientos internos del cloroplasto descendi a 4 aproximadamente, se inyectaron en ia oscuridad los cloropiastos acidificados dentro de un segundo tubo que contena un medio amortiguado a pH 8 junto con las sustancias necesarias para sintetizar ATP radiactivo. La transferencia de los cloropiastos al amortiguador alcalino gener un gradiente transitorio de H+ 10 000 veces mayor (10~8 M [H+] en comparacin con 10~4 M [H+]) a travs de las membranas internas del cloroplasto. Unos cuantos segundos despus de a transferencia se pudo descubrir ATP recien sintetizado (lnea 2, cuadro VE 5-1). Los resultados indican que un gradiente de pH, por s mismo, puede efectuar la fosforilacin del ADP. En 1974, Efraim Racker y Walter Stoeckenius14 efectuaron un segundo experimento ingenioso que ilustr la potencia de un gradiente de protones para formar ATP. Recordemos de la pgina 150, captulo 4, que las bacterias prpura del gnero Hdobacterium poseen una protena denominada bacteriorrodopsina, la cual acta como bomba de protones operada por luz.

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CAPITULO 5 * Respiracin aerobia y mitocondrias

SINOPSIS
Las mitocondrias son grandes organelos constituidos por una membrana porosa externa y una membrana interna altamente permeable y plegada (cresta) que contiene gran parte del mecanismo requerido para la respiracin aerobia. La porosidad de la membrana externa es resultado de la presencia de protenas integrales denominadas porinas. La arquitectura de la membrana interna y la aparente fluidez de su bicapa facilitan la interaccin de los componentes requeridos durante el transporte de electrones y la formacin de ATP. La membrana interna rodea una matriz parecida a un gel que contiene, adems de protenas, un sistema gentico que incluye DNA, RNA, ribosomas y todos los mecanismos necesarios para transcribir y traducir informacin gentica. Muchas de las propiedades de la mitocondria se pueden explicar al asumir que evolucionaron a partir de antiguas bacterias simbiticas (p. 172). La mitocondria es el centro del metabolismo oxidativo de la clula que convierte los productos del catabolismo de carbohidratos, grasas y protenas en energa qumica almacenada en ATP. Piruvato y NADH son los dos productos de la gluclisis. El piruvato es transportado a travs de la membrana mitocondrial interna, donde sufre descarboxacin y se combina con la coenzima A para formar acetil-CoA, que se condensa con oxalacetato para formar citrato, el cual ingresa al ciclo del cido tricarboxlico. Conforme el citrato sufre las reacciones del ciclo del cido tricarboxlico, dos de sus carbonos son eliminados y liberados en forma de C2, que representa el estado ms altamente oxidado de los tomos de carbono. Los electrones eliminados de los sustratos se transfieren a FAD y NAD+ para formar FADH2 y NADH. Los cidos se descomponen en acetil-CoA, que ingresa al ciclo del cido tricarboxlico, y todos los 20 aminocidos se desdoblan para piruvato, acetil-CoA o intermediarios del ciclo del cido tricarboxlico. Por lo tanto, dicho ciclo es el camino en el cual convergen las principales vas metabcas de la clula (p. 175). Los electrones transferidos desde los sustratos a FADH2 y NADH siguen a lo largo de una cadena portadora de electrones hacia O^ liberando energa que se emplea para generar un gradiente electroqumico a travs de la membrana mitocondrial interna. El movimiento controlado de protones que regresan a travs de la membrana por medio de una enzima sintetizadora de ATP se emplea para la formacin de ATP en el sitio cataltico de la enzima. Cada par de electrones de NADH libera suficiente energa para formar casi tres ATP, en tanto que la energa liberada de un par electrones de FADH2 explica la formacin de casi dos ATP (p. 179). La cantidad de energa liberada en forma de electrones se transfiere de un donador (agente reductor) a un aceptor (agente oxidante) y puede calcularse a partir de la diferencia del potencial redox entre dos pares. El potencial redox estndar de un par se mide en condiciones estndar y se compara con el par F2-H+. El potencial redox estndar del par NADH-NAD+ es -0.32 V, que refleja el hecho de que NADH es un agente reductor fuerte, o sea, uno que transfiere con rapidez sus electrones. El potencial redox estndar del par H2O/O2 es +0.82 V, que refleja el hecho de que O2 es un fuerte agente oxidante, o sea, uno que tiene gran afinidad por electrones. La diferencia entre estos dos pares, equivalente a 1.14 V, proporciona una medida de la energa libre liberada (52.6 kcal/mol) cuando un par de electrones pasa del NADH a lo largo de toda la cadena transportadora de electrones hasta el 2 (p- 181). La cadena transportadora de electrones contiene cuatro tipos diferentes de transportadores: citocromos que contienen hem, flavoprotenas que contienen nucletidos con flavina, protenas de hierro y azufre, y quinonas. Flavoprotenas y quinonas pueden aceptar y donar tomos de hidrogeno, en tanto que citocromos y protenas de hierro y azufre slo aceptan y donan electrones. Los portadores de la cadena de transporte de electrones estn dispuestos espacialmente en orden decreciente de potencial redox. Los diferentes transportadores se organizan en cuatro grandes complejos de multiprotenas. Citocromo c y ubiquinonas son portadores movibles que intercambian electrones entre los complejos ms grandes. Conforme los pares de electrones pasan a travs de los complejos I, III y IV, se transloca un nmero especfico de protones desde la matriz a travs de la membrana al interior del espacio intermembrana. La translocacin de protones por estos complejos transportadores de electrones establece el gradiente de protones en el cual se almacena la energa. El ltimo de los complejos es la citocromo oxidasa, que transfiere electrones desde el citocromo c al Q y lo reduce para formar agua, un paso que tambin elimina protones de la matriz y contribuye al gradiente de protones (p. 184). La translocacin de protones genera separacin de cargas a travs de la membrana, adems de una diferencia en la concentracin de protones. Por consiguiente, el gradiente de protones tiene dos componentes: un gradiente de voltaje y uno de pH; la magnitud de stos depende del movimiento de otros iones a travs de la membrana. Los dos componentes juntos constituyen una fuerza motriz de protones {Ap). En mitocondrias de mamferos se estima que casi 80% de la energa libre de la Ap est representada por el gradiente de voltaje, y 20% por el gradiente de pH (p. 185). La enzima que cataliza la formacin de ATP es un complejo grande de mltiples protenas denominado ATP sintasa que contiene dos partes diferentes: una pieza cabeza FI que se proyecta al interior de la matriz e incluye un sitio cataltico, y una pieza basal FQ integrada a la bicapa de lpidos y que forma un canal a travs del cual se conducen protones desde el espacio intermemhrana hasta la enzima. Se cree que el movimiento controlado de protones a travs de la ATP sintasa induce cambios de conformacin para la formacin de ATP. La hiptesis aceptada en la actualidad propone que cada uno de los tres sitios catalticos de la porcin FI de la enzima se encuentra en estados de conformacin diferentes, designados firme, laxo y abierto. Cada sitio se mueve de una conformacin a la siguiente en respuesta a la unin y liberacin de protones. Las pruebas indican que el paso que requiere ener-

CAPITULO 5 Respiracin aerobia y mitocondrias

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ga no es en realidad la fosforilacin del ADP, sino la unin de nucletidos al sitio activo, la liberacin del sitio activo del ATP producido, o ambos. Se cree que los cambios de conformacin son gobernados por el movimiento de protones a travs de la enzima y estos pasos se efectan mediante cambios de afinidad del sitio activo hacia los nucletidos. Adems de la formacin de ATP, la fuerza motriz de protones tambin suministra la energa necesaria para algunas actividades de transporte, incluyendo captacin de ADP en la mitocondria durante los cambios para liberar ATP del citoplasma, captacin de iones fosfato y calcio, e importacin de protenas mitocondriales (p. 291).

Las protenas que constituyen una mitocondria pueden ser: 1) codificadas en el DNA mitocondrial y sintetizadas en el organeio, o 2) sintetizadas en el citoplasma e importadas al organelo luego de la traduccin. Las protenas mitocondriales sintetizadas en el citoplasma contienen una secuencia orientadora con carga positiva en su N-terminal, que provoca la unin del polipptido con su receptor en la superficie externa de la mitocondria; esto da lugar al transporte del polipptido a travs de la membrana mitocondrial hacia el interior de la matriz. La importacin puede auxiliarse mediante chaperones situados tanto en el citoplasma como en la matriz micondrial (p. 197).

PREGUNTAS DE REPASO
1. Describir los cambios en el metabolismo oxidativo que debieron haber acompaado a la evolucin y el xito de las cianobacterias. 2. Comparar las propiedades de las membranas mitocondriales interna y externa; e! espacio intermembrana y la matriz. 3. Cmo se conectan los productos de la gluclisis a las reacciones del ciclo del cido tricarboxlico? 4. Por qu se considera el ciclo del cido tricarboxlico como la va central del metabolismo energtico de una clula? 5. Describir el mecanismo mediante el cual el NADH producido por gluclisis puede ingresar electrones al ciclo del cido tricarboxlico. 6. Describir de qu manera el transporte de electrones a lo largo de la cadena respiratoria establece un gradiente de protones. 7. Cules son algunas de las principales actividades de los peroxisomas? Cul es el papel de la catalasa en esas actividades? 8. Cmo algunas protenas, como las enzimas del ciclo del cido tricarboxlico, pueden llegar a a matriz mitocondrial? 9. Observar la figura 5-12 y describir en qu son similares los estados semiquinona de la ubiquinona y la FMN. 10. Qu debe entenderse por centro binuclear de la citocromo oxidasa? Corno funciona en la reduccin de C>2? 11. Cules son las dos maneras diferentes en que contribuye la citocromo oxidasa al gradiente de protones? 12. En qu difiere el transporte de electrones de uno de los grandes complejos de la cadena transportadora de electrones del transporte de electrones entre los complejos? 13. Por qu la transferencia de algunos electrones da como resultado mayor liberacin de energa en comparacin con otros tipos de transferencia? 14. Cules son los dos componentes de la fuerza motriz de protones y cmo pueden sus contribuciones relativas variar de una clula a otra? 15. Cul es el efecto del dinitrofenol sobre la sntesis de ATP en la mitocondria? Qu es lo que ocurre? Cmo se vincula el gradiente de protones a la sntesis de ATP? 16. Describir la estructura bsica de la ATP-sintasa y el mecanismo para sintetizar ATP.

PREGUNTAS ANALTICAS
1. Considerar la reaccin A:H + B = B:H + A. Si en el equilibrio la proporcin [B:H]/[B] es igual a 2.0, se puede concluir que: 1) B:H es el agente reductor ms fuerte de los cuatro compuestos; 2) el par {A:H, A) tiene el potencial redox ms negativo en comparacin con el par (B:H, B); 3) ninguno de los cuatro compuestos son citocromos; 4) los electrones relacionados con B son de ms alta energa que los relacionados con A. Cules de las afirmaciones previas son ciertas? Dibujar la reaccin en uno de los sentidos de esta reaccin redox. 2. La vescula membranosa de una partcula submitocondrial, luego de eliminar las esferas Fj, sera capaz de: 1) oxidar NADH; 2) producir H^O a partir de Oa; 3) generar un gradiente de protones; 4) fosforilar ADP. Cules de las afirmaciones previas son ciertas? En qu seran diferentes estas respuestas, si es que hay alguna diferencia, si los objetos estudiados fueran partculas submitocondriales intactas tratadas con dinitrofenol? 3. La protena A es una flavoprotena con potencial redox de -0.2 V. La protena B es un citocromo con potencial redox de +0.1 V. a. Dibujar las reacciones en ambos sentidos para cada uno de los dos portadores de electrones. b. Escribir la reaccin que ocurrira si se aadieran a la mezcla molculas A reducidas y molculas B oxidadas. c. Cul de los dos compuestos en la reaccin de la parte b estara presente en concentracin ms alta cuando la reaccin alcanzara el equilibrio? 4. De las siguientes sustancias: ubiquinona, citocromo c, NAD+, NADH, C>2, H2O, cul es el agente reductor ms fuerte?; cul es el agente oxidante ms fuerte?; cul tiene mayor afinidad por electrones? 5. Si se determina que la membrana mitocondrial interna es libremente permeable a iones cloro, qu efecto tendra esto sobre la fuerza motriz de protones a travs de la membrana mitocondrial interna?

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CAPITULO 5 Respiracin aerobia y mitocondrias

6. Observar el descenso de energa durante el transporte de electrones mostrado en la figura 5-14. Ese perfil sera diferente si el donador original de electrones fuera FAD2 en vez de NADH? 7. Sera de esperar que la importacin de sustancias como ADP o P disminuyera la fuerza motriz de protones? Por qu? 8. En los potenciales redox estndar del cuadro 5-1, el par oxalacetato-malato es menos negativo que el par NAD+NADH. Cmo pueden ser estos valores compatibles con la transferencia de electrones de malato a NAD+ en el ciclo del cido tricarboxlico? 9. Cuntos fosfatos de alta energa se forman mediante fosforilacin a nivel de sustrato durante cada vuelta del ciclo del cido tricarboxlico {considerar slo reacciones de este ciclo)? Cuntos se forman como resultado de la fosforilacin oxidativa? Cuntas molculas de CC>2 se liberan? Cuntas molculas de FAD se reducen? Cuntos pares de electrones se extraen de los sustratos? 10. Los protones se mueven en ambas direcciones a travs de la membrana mitocondrial interna. Se mueven en una direccin corno resultado del transporte de electrones. Cul es la causa de que se muevan en la direccin opuesta?

11. El descenso en AG' de un par de electrones es -52.6 kcal/ mol y la AG' de la formacin de ATP es +7.3 kcal/mol. Si se forman tres ATP por cada par de electrones eliminados de un sustrato, se puede concluir que la fosforilacin oxidativa es de 21.9/52.6, o 42% eficiente? Por qu s o por qu no? (No basta afirmar que la clula no opera en condiciones estndar.) 12. Es de esperar que mitocondrias aisladas, metablicamente activas., acidifiquen o alcalinicen el medio en el cual estn suspendidas? Sera la respuesta diferente si estuviera trabajando con partculas submitocondriales en vez de mitocondrias? Por qu? 13. A veces se requiere el movimiento de tres protones para la sntesis de una molcula de ATP (fig. 5-28). Calcular la energa liberada por el paso de protones al interior de la matriz (vase pgina 191 para informacin). 14. Por qu sera de esperar que el movimiento de protones al interior del espacio intermembrana tuviera efecto sobre las enzimas del citoplasma? 15. Calcular la energa libre liberada cuando FADH/z se oxida mediante 2 molecular en condiciones estndar.

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CAPITULO

Fotosntesis y cloroplastos
6-1 Estructura y funcin del cloroplasto 6-2 Revisin del metabolismo fotosinttico 6-3 Absorcin de luz 6-4 Unidades fotosintticas y centros de reaccin 6-5 Fotofosforilacin de dixido de carbono y formacin de * 6-6 Fijacin carbohidratos La perspectiva humana: "Mejores" plantas por medio de ingeniera gentica La va experimental: Organizacin de la membrana tilacode

FIGURA 6-A. Cloroplastos en una hoja de Arabidopsis thaliana, miembro de la familia de las mostazas, vistos con criorrastreo mediante microscopio electrnico. (Cortesa de Richard ]. Howard, DuPojit Company.)

as formas primitivas de vida sobre la Tierra debieron haber obtenido sus materias primas y energa a partir de molculas orgnicas simples disueltas en su ambiente acuoso. Estas molculas orgnicas con certeza se formaron a partir de procesos abiticos, o sea, como resultado de reacciones qumicas no biolgicas que ocurran en los mares primitivos. Por lo tanto, as como nosotros sobrevivimos de nutrientes tomados de nuestro ambiente, as tambin debieron haberlo hecho las formas originales de vida. Los organismos que dependen de una fuente externa de compuestos orgnicos se llaman heterotrofos. As como todos los organismos vivientes fueron heterotrofos, la oportunidad de la biomasa sobre la Tierra para aumentar estaba gravemente restringida, ya que la produccin espontnea de molculas orgnicas era muy lenta. El desarrollo de la vida sobre la Tierra recibi un tremendo impulso con la evolucin de organismos que emplearon una nueva estrategia metablica que les permiti sobrevivir a partir de molculas que eran mucho ms abundantes que la escasa variedad orgnica. Este nuevo tipo de organismos tena capacidad de elaborar sus propios nutrientes orgnicos a partir de molculas de los tipos ms simples, como el dixido de carbono (CO) y el sulfuro de hidrgeno (H2S). Los organismos capaces de sobrevivir con CC^como principal fuente de carbono se denominan autotrofos. La elaboracin de molculas complejas a partir de CC>2 requiere el ingreso de grandes cantidades de energa. En el curso de la evolucin se desarrollaron dos tipos principales de autotrofos que pueden distinguirse por su fuente de energa. Los quimioautotrofos utilizan energa almacena-

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CAPITULO 6 Fotosntesis y cloroplastos

da en molculas inorgnicas (como amonio, sulfuro de hidrgeno o nitritos) para convertir CO2 en compuestos orgnicos, en tanto que los fotoautotrofos emplean la energa radiante del sol para efectuar esa tarea. Puesto que todos los quimioautotrofos son bacterias y su contribucin relativa a la formacin de biomasa sobre la Tierra es pequea, no consideraremos ms sus actividades metablicas. Por otro lado, los fotoautotrofos se encargan de capturar la energa que sirve como combustible para las actividades de casi todos los organismos sobre la Tierra. Los fotoautotrofos incluyen plantas evolutivamente organizadas y algas eucariotas; varios protistas flagelados, y una variedad de procarotes, incluyendo bacterias prpura azufrosas y no azufrosas, bacterias verdes y canobacterias. Todos estos organismos efectan fotosntesis, proceso en el cual la energa de la luz solar se transforma en energa qumica, la cual se utiliza en la formacin de carbohidrato y otros metabolitos orgnicos. Como analizaremos en detalle en este captulo, la fotosntesis es un proceso en el cual los electrones de energa relativamente baja son eliminados de un compuesto donador y convertidos en electrones de alta energa como resultado de la absorcin de luz. Estos electrones de alta energa pueden utilizarse entonces en vas anablicas en las cuales se sintetizan molculas biolgicas reducidas, como almidn y aceites. Es probable que los primeros grupos de fotoautotrofos que dominaron el planeta durante casi 2 000 millones de aos utilizaran sulfuro de hidrgeno como fuente de electrones para la fotosntesis, efectuando la reaccin total CO2 + 2H2S -i^> (CH20) + H2O + 2S donde (CH2O) representa una unidad de carbohidrato. En la actualidad hay numerosas bacterias vivientes que efectan este mismo tipo de fotosntesis, pero el sulfuro de hidrgeno ya no es abundante ni extenso, y en consecuencia los organismos que dependen de este compuesto como fuente de electrones estn inevitablemente restringidos en cuanto a importancia y distribucin. Hace aproximadamente 2 500 millones de aos apareci un nuevo tipo de procariote fotosinttico sobre la Tierra capaz de utilizar una fuente mucho ms abundante de electrones, es decir, el agua. El empleo del agua no slo permiti a estos organismos, o canobacterias, explotar una mayor diversidad de hbitats sobre la Tierra, sino que tambin produjo un material de desperdicio de enormes consecuencias para todas las formas de vida. El producto de desperdicio fue el oxgeno molecular (02) formado en la reaccin total: CO2 + H2O -^> (CH2O) + O2 La evolucin de un tipo de fotosntesis que libera oxgeno (oxignica) no slo abri el camino para que las cianobacterias se convirtieran en la forma dominante de vida sobre la tierra, sino que tambin suministr la oportunidad a los organismos para evolucionar hacia un metabolismo aerobio. Como veremos en el ltimo captulo, la respiracin aerobia permite a los organismos extraer una cantidad mucho mayor de energa de los nutrientes en comparacin con la que se puede obtener por vas anaerobias, como gluclisis y fermentacin. El cambio de H2S a H2O como "combustible"

para la fotosntesis es ms complicado que cambiar una letra del alfabeto por otra. El potencial redox del par S-H2S es de -0.25 V en comparacin con +0.816 V para el par |O2-H2O (pg. 190). En otras palabras, el tomo de azufre en una molcula de H2S tiene mucha menor afinidad por sus electrones (y por lo tanto los dona con mayor rapidez) que el tomo de oxgeno en una molcula de H^O. Por lo tanto, cuando un organismo debe adquirir electrones del agua tiene que generar un agente oxidante muy fuerte como parte de su metabolismo fotosinttico. El cambio de H2S a H2O como fuente de electrones para la fotosntesis requiri una transformacin completa del mecanismo fotosinttico. Iniciaremos nuestro anlisis de la fotosntesis examinando brevemente los organelos en los cuales ocurre el proceso.

6-1 Estructura y funcin del cloroplasto

La fotosntesis comparte muchas caractersticas con !a respiracin aerobia, incluyendo un sistema de transporte de electrones que consta de citocromos, quinonas y protenas de hierro y azufre; el establecimiento de un gradiente electroqumico de protones, y el empleo de este gradiente para efectuar la sntesis de ATP a travs de una ATP-sintasa homologa. Por lo tanto, no es sorprendente que, como en la respiracin aerobia, los sucesos de la fotosntesis estn ntimamente vinculados a la membrana celular. La fotosntesis no oxignica del tipo efectuado por la bacteria prpura se realiza en componentes que residen en la membrana plasmtica o en vesculas derivadas de la membrana plasmtica por invaginacin (fig. 6-1, a). Por lo contrario, el mecanismo fotosinttico oxignico de las cianobacterias reside en una elaborada disposicin de verdaderas membranas citoplsmicas que forman vallas o laminillas, como se muestran en la figura 6-1, b. En las clulas eucariotas, la fotosntesis tiene lugar en un organelo citoplsmico especializado, el cloroplasto, localizado predominantemente en las clulas mesfilas de las hojas. En la figura 6-2 se muestran la estructura de una hoja y la disposicin de los cloroplastos alrededor de la vacuola central de una clula mesfila. Los cloroplastos de plantas evolutivamente elevadas por lo general tienen forma lenticular (fig. 6-3), unos 2 a 4 /fm de ancho y 5 a 10 fin de largo, y en condiciones tpicas su nmero vara entre 20 y 40 por cada clula. Estas dimensiones colocan al cloroplasto como gigante entre los organelos, de igual tamao que el eritrocito completo estudiado en el captulo 4. Los cloroplastos se identificaron como sitio de la fotosntesis en 1881 en un ingenioso experimento efectuado por el bilogo alemn Theodor Engelmann, quien demostr que cuando se iluminan las clulas del alga verde Spyragyra, algunas bacterias se desplazan activamente para agruparse en e! exterior de las clulas cerca del sitio correspondiente a los grandes cloroplastos acintados. Las bacterias estaban utilizando las mnimas cantidades de oxgeno liberadas en el cloroplasto por la fotosntesis para estimular su respiracin aerobia,

CAPITULO 6 Fotosntesis y cloroplastos

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Clulas - rnesfilas de la hoja

0.4/m Seccin transversal ,- . de la hoja Estomas t Cloroplasto Vacuola Vista amplificada de las clulas en palizada con los cloroplastos

Ncleo

Tilacoides

FIGURA 6-2. Organizacin funcional de una hoja. La seccin transversal de una hoja muestra varias capas de clulas, incluyendo clulas en palizada, un tipo de clulas mesfilas que contienen los cloroplastos encargados de efectuar la fotosntesis y suministrar la materia prima y energa qumica para toda la planta.

FIJURA 6-1. Dos tipos diferentes de bacterias fotosntticas. a) Bacteria Rhodopseudomonas spheroides cuyo mecanismo de fotosntesis est contenido en vesculas derivadas por invaginacin de la membrana plasmtica, b) Cianobacteria Anacystis nidulans, cuyo aparato fotosinttico se aloja en las laminillas discoides, (a. Segn K. Menke, en T.W. Goodwin, ed., Biochemistry o Chloroplasts, vol. I , Academic Press, 1966; b: segn Norma ]. Lang y B.A. Whitton, eds. Biology of the BlueGreen Algae, Blackwell Science Ltd., 1973.)

La cubierta externa del cloroplasto consta de una envoltura compuesta de dos membranas separadas por un espacio estrecho (fig. 6-3). Igual que la membrana externa de las mitocondrias, la membrana externa del cloroplasto contiene porinas (pg. 173) que hacen a esta membrana permeable a solutos de peso molecular tan alto como 10 000 daltons. En contraste, la membrana interna de dicha envoltura es relativamente impermeable; las sustancias que se mueven a travs de dicha membrana interna lo hacen con ayuda de varios transportadores. Gran parte del mecanismo de sntesis de los cloroplastos, incluyendo pigmentos que absorben luz, una compleja cadena transportadora de electrones y un aparato sintetizador de ATP, se localiza en un sistema de la membrana nter-

210

CAPITULO 6 Fotosntesis y doroplastos

Tilacoides
2 mi

(b)

FIGURA 6-3. Estructura interna de un cloroplasto. a) Micrografa de transmisin electrnica a travs de un solo cloroplasto. La membrana interna est dispuesta en pilas de tilacoides en forma de discos fsicamente separados de la membrana externa, b) Esquema de un cloroplasto que muestra la doble membrana externa y la membrana tilacoide que se divide en tilacoides de los grana apilados y tilacoides del estroma no apilado (o laminillas de estroma). (a: Cortesa de Lester K. Shumway.)

na fsicamente separado de la doble capa de la envoltura. La membrana interna del cloroplasto, que contiene el mecanismo transductor de energa, est organizada en sacos membranosos aplanados denominados tilacoides. Los tilacoides se disponen ordenadamente en unas estructuras llamadas grana, que recuerdan una pila de monedas {figs. 6-3 y 6-4). El tratamiento de cloroplastos aislados en un medio salino diluido dispersa los tilacoides que se reapilan cuando se incrementa la fuerza inica del medio. El espacio dentro de un tilacoide es a luz, y el espacio fuera del tilacoide pero dentro de la envoltura externa se denomina estroma. Las cisternas membranosas aplanadas, llamadas estroma tilacoide (o estroma laminar), conectan algunos tilacoides de una grana con los de otra (fig. 6-4). La diferencia en estructura y funcin entre grana tilacoides y estroma tilacoide se analiza en La va experimental, al final del captulo. Igual que la matriz de una mtocondria, el estroma de un cloroplasto contiene pequeas molculas circulares de DNA en doble cadena y ribosomas semejantes a los de clulas procariotas, que junto con algunas enzimas forman una reserva de informacin gentica y el medio para utilizarla. Se estima que en las membranas tilacoides hay casi 60 polipptidos diferentes relacionados con sistemas para conversin de energa, y casi la mitad estn codificados en el DNA del cloroplasto. Los lpidos que componen la membrana tilacoide son poco comunes porque contienen una cantidad relativamente escasa de fosfolpidos y un elevado porcentaje de glucolpidos neutros monogalactosil y digalactosil diacigliceroles. Los cidos grasos de estos lpidos son abrumadoramente insaturados y la bicapa de lpidos es muy fluida. Los cloroplastos son organelos semiautnomos, capaces de autoduplicarse, y se piensa que evolucionaron a partir de un procariote fotosinttico capaz de producir oxgeno (al parecer una cianobacteria) que adopt una existencia simbitica dentro de una clula husped primitiva no fotosinttica. Como resultado, los cloroplastos y las bacterias fotosintticas

comparten muchas propiedades, incluyendo la presencia de porinas en las membranas externas, el tipo de DNA y de ribosomas en el estroma, y la naturaleza de su mecanismo fotosinttico, que analizaremos en detalle en las siguientes pginas.

6-2 Revisin del metabolismo fotosinttico

Uno de los mayores avances para entender las reacciones qumicas de la fotosntesis provino de una hiptesis pro-

Grana .s .- -" tilacoides "*->"",.;-.- Esfrorna S2 ilacdide

0.3 m

FIGURA 6-4. Membranas tilacoides. Micrografa electrnica de un corte a travs de una porcin de un cloroplasto de espinaca mostrando los grana tilacoides apilados y ls estromas tilacoides no apilados. (Segn LA. Staeheln, en LA. Staehelin, ed., Encyclopedia of Plant Physiology, vd. 19, p. 23, Sprhiger-Verag, 1986.)

CAPITULO 6 Fotosntesis y cloroplastos

211

puesta por C.B. van Niel a principios del decenio de 1930, quien entonces era estudiante graduado de la Universidad Stanford. Consideremos la ecuacin total propuesta para la fotosntesis: CO2 + H2O -^ (CH2O) + 02 En 1930, la idea prevaleciente era que la energa de la luz se empleaba para desdoblar el CO2, liberando oxgeno molecular (2) y transfiriendo el tomo de carbono a una molcula de agua para formar una unidad de carbohidrato (CH2O). En 1931, van Niel propuso un esquema alterno basado en su trabajo con sulfobacterias. Se haba demostrado de manera concluyente que estos organismos tenan capacidad para reducir CO2 a carbohidratos empleando la energa de la luz sin produccin simultnea de O2 molecular. Se propuso que la reaccin para la sulfobacteria era: CO2 + 2H2S -^ (CH2O) + H2O + 2S Reconociendo la semejanza bsica en el proceso fotosinttico de todos los organismos, van Niel propuso una reaccin general para incluir todas estas actividades: CO2 + 2H2A
H2O + 2A

presenta un resumen total que contrasta la termodinmica de estas dos actividades metablicas. Los sucesos de la fotosntesis se pueden dividir en dos series de reacciones. En la primera etapa, reacciones dependientes de luz, se absorbe energa de la luz solar para convertirla en energa qumica, la cual se almacena en el ATP y el NADPH. Durante la segunda etapa, reacciones independientes de luz (o "reacciones en la oscuridad"), se sintetizan carbohidratos a partir de dixido de carbono empleando la energa almacenada en el ATP y el NADPH formado en las reacciones dependientes de luz. Se estima que cada ao la vida vegetal sobre el planeta convierte aproximadamente 600 trillones de kilogramos de CO2 en carbohidratos y libera casi 400 trillones de kilogramos de O2. La mayor parte de esta actividad se efecta en el fitoplancton, una delgada y sensible capa de algas unicelulares vivientes que cubre los ocanos del mundo cada vez ms contaminados. Iniciaremos nuestro anlisis con las reacciones que dependen de luz, que son complejas y todava incompletamente definidas. 6-3 Absorcin de luz

Para la produccin de una hexosa, como la glucosa, la reaccn sera 6CO2 + 12H2A C6Hi2O6 + 6H2O + 12A Van Niel reconoci que la fotosntesis es un proceso esencialmente de oxidorreduccin. En la reaccin precedente, H2A es un donador de electrones (agente reductor) y se puede representar por H2O, H2S, o algn otro sustrato reducido. Sin embargo, CO2 es un agente oxidante, que en una clula vegetal se reduce para formar hexosa en la siguiente reaccin: 6CO2 + 12H2O -^ C6H12O6 + 6H2O + 6O2 En este esquema cada molcula de oxgeno se forma a partir del desdoblamiento de dos molculas de H2O, proceso causado por absorcin de luz. El papel del agua en la formacin de oxgeno molecular fue claramente establecido en 1941 por Samuel Rubn y Martin Kamen, de la Universidad de California, quienes efectuaron un experimento utilizando un istopo de oxgeno 18O especialmente marcado en vez del istopo comn 16O. En su experimento marcaron un grupo de plantas con C[18O2] y agua "regular", en tanto que otro grupo se marc con dixido de carbono "regular" y H2[18O] marcado. Los investigadores plantearon una pregunta sencilla: cul de estos dos grupos de plantas libera 18O2? Los resultados mostraron que las plantas con agua marcada produjeron oxgeno marcado, en tanto que las plantas con dixido de carbono marcado produjeron oxgeno "regular". Contrario a lo que se pensaba, no es el dixido de carbono el que se desdobla en sus dos elementos atmicos, sino el agua. La hiptesis de van Niel se haba confirmado. La proposicin de van Niel coloc a la fotosntesis en una perspectiva diferente; en esencia vino a ser lo inverso de la respiracin. En la respiracin, las mitocondrias reducen oxgeno para formar agua y en la fotosntesis el cloroplasto oxida agua para formar oxgeno. En la figura 6-5 se

La energa de la luz se transporta en paquetes llamados fotones. El contenido energtico de un fotn depende de la longitud de onda de la luz segn la ecuacin

,. , he E~hv-
A

donde h es la constante de Planck (1.58 x 10"34 cal seg), v es la frecuencia de la radiacin, c es la velocidad de la luz en el vaco y A es la longitud de onda de la luz. Cuanto ms corta sea la longitud de onda, mayor ser el contenido de energa. Un mol (6.02 X 1023) de fotones de luz roja (longitud de onda 635 nm) contiene aproximadamente 45 kcal de energa. La absorcin de luz es el primer paso en cualquier proceso fotoqumico. Cuando se absorbe un fotn, un electrn adquiere suficiente energa para pasar de un orbital interno a otro ms externo. Se dice que la molcula ha cambiado de un estado basal a un estado excitado. Puesto que hay un nmero limitado de orbitales en los cuales puede existir un electrn y cada orbital tiene un nivel energtico especfico, se deduce que cualquier tomo o molcula slo puede absorber luz de longitud de onda especfica. Una molcula en estado excitado es inestable y podra esperarse que slo dure alrededor de 10~9 segundos. A un electrn excitado pueden ocurrirle varias cosas, segn las circunstancias. Consideremos una molcula de clorofila, el pigmento fotosinttico ms importante que absorbe luz. Si el electrn de una molcula de clorofila excitada retorna a su orbital de menor energa, la energa absorbida debe liberarse. Si la energa de excitacin se libera en forma de calor o de luz (fluorescencia), la clorofila ha retornado al estado basal original y la energa absorbida del fotn se desperdicia. Esto es precisamente lo que se observa cuando se ilumina una preparacin de clorofila aislada: la solucin emite una fluorescencia intensa debido a que la energa absorbida se

212

CAPITULO 6 Fotosntesis y doroplastos

Fotosntesis
Cloroplasto
C02 + H20

Respiracin aerobia
M tocn dra
C02 + H20

/ NADPH

Carbohidrato , (contiene electrones de alta energa) f| ff] ; [j [jl [p NADH

NADH energa qumica (ATP)

Energa luminosa
12U
e-

(contiene electrones de baja energa)

H90

FIGURA 6-5. Comparacin entre la energtica total de la fotosntesis y la respiracin aerobia.

emite de nuevo con una longitud de onda ms larga (o sea, menor energa). Sin embargo, si este mismo experimento se ejecuta con una preparacin de doroplastos aislados, slo se observa una dbil fluorescencia, lo que ndica que se disipa muy poca de la energa absorbida. En vez de ello, los electrones energticos son transferidos a aceptores antes que tengan oportunidad de retornar a sitios vacos en los orbitales ms internos de las molculas de clorofila. Se estima que la transferencia del electrn puede ocurrir en menos de 10~12 segundos. Pigmentos foto sintticos Los pigmentos son molculas que contienen un crom/oro, grupo qumico capaz de absorber luz de una longitud de onda particular del espectro visible. Las hojas de las plantas son verdes porque contienen gran cantidad del pigmento clorofila que absorbe luz con mayor intensidad entre el azul y el rojo y deja que las longitudes de onda verdes intermedias se reflejen a nuestros ojos. La estructura bsica de la clorofila se muestra en la figura 6-6. Cada molcula consta de dos partes principales: 1) un anillo de porfirina cuya funcin es absorber luz, y 2) una cadena fitol hidrfoba (derivada de una unidad isoprenoide repetitiva, cuya estructura se muestra en la pgina 185) que mantiene la clorofila integrada al interior de la membrana fotosinttica. A diferencia de las porfirinas rojas de la hemoglobina y la mioglobina que contienen fierro (grupos hem), la porfirina de la molcula de clorofila contiene un tomo de magnesio. Enla-

ces dobles y sencillos alternos a lo largo del borde del anillo de porfirina actan deslocalizando electrones que forman una nube alrededor de dicho anillo (fig. 6-6). Sistemas conjugados de este tipo son fuertes absorbedores de luz, y dicha absorcin es causa de una redistribucin de la densidad de electrones en la molcula favoreciendo la prdida de un electrn hacia un aceptor adecuado. Adems, los sistemas de uniones conjugadas amplifican los picos de absorcin causando que las molculas individuales absorban intervalos de longitudes de onda. Estas caractersticas son evidentes en un espectro de absorcin de molculas purificadas de clorofila (fig. 6-7), que es una grfica de la intensidad de la luz absorbida en relacin con su longitud de onda. El intervalo de longitudes de onda que pueden absorber los pigmentos fotosintticos situados dentro de la membrana tilacoide aumenta adicionalmente por la presencia de varios tipos de especies de pigmento (estudiadas en el siguiente prrafo), presencia de varios polipptidos a los cuales se unen los pigmentos mediante enlaces no covalentes y diferencias locales en el entorno (fluidez, estado de agregacin, etc.), en el cual residen los pigmentos. Entre los organismos fotosintticos (fig. 6-6) se encuentran varias clases de clorofila, que se distinguen entre s por los grupos laterales unidos al anillo de porfirina. La clorofila a est presente en todos los organismos fotosintticos productores de oxgeno, pero est ausente en las diferentes sulf o bacterias. Adems de la clorofila a, la clorofila b se encuentra en todas las plantas evolutivamente elevadas y en las algas verdes, y una tercera variedad, la clorofila c, ocurre en algas de color marrn, diatomeas y ciertos proto-

CAPITULO 6 Fotosntesis y doroplastos O

C

213

^r En la bacterioclorofila a
Cri3

CH3

CH3

CH3

^^En la clorofila f CHO^

CH3

CH3

CH3

CH3

/J-caroteno
\i \j \i ^~\ri\y\jr\-3 /"VNAc CHCH

Vc

CH2 CH2 C=0 O

HC C=0 O CH3

C=0

CH2
CH

\:
H3C HC

\H3C HC

Los carotenoides absorben luz de longitudes de onda azul al verde (fig. 6-7). Las longitudes de onda amarillo, naranja y rojo son reflejadas por los carotenoides, lo que produce los colores caractersticos naranja y rojo de zanahorias, naranjas y hojas de algunas plantas durante el otoo. A medida que las hojas cesan de producir clorofila durante el fro clima invernal, los carotenoides dorados y rojos son ms visibles; esto explica los brillantes y coloridos paisajes del otoo. La funcin ms importante de los carotenoides puede ser proteger el mecanismo de fotosntesis contra daos causados por especies reactivas de oxgeno, y no la de absorber luz para la fotosntesis. Por ejemplo, clulas mutantes de algas que carecen de carotenoides no pueden sobrevivir en un ambiente aerobio debido a la destruccin mediada por oxgeno de su mecanismo de fotosntesis. La luz que incide sobre una hoja se compone de una gran variedad de longitudes de onda, por lo que la presencia de pigmentos con diferentes propiedades de absorcin garantiza que un mayor porcentaje de los fotones incidentes tengan oportunidad de estimular la fotosntesis. Esto se putde comprobar al examinar un espectro de accin (fig. 6-8), que es una grfica de la eficiencia total de la fotosntesis a diferentes longitudes de onda. Es importante la diferencia entre un espectro de accin y un espectro de absorcin. El espectro de absorcin mide las longitudes de onda capaces de suministrar la energa de transicin apropiada para que una sustancia especfica eleve los electrones a orbitales ms altos, en tanto que el espectro de accin indica

UP
riL.

CH3
Clorofila a

FIGURA 6-6. Estructura de la clorofila a. La molcula consta de un anillo de porfirina {a su vez formado por cuatro anillos pirrol ms pequeos) con un ion magnesio en su centro y una larga cola hidrocarbonada. En la clorofila b, el grupo CH3 sobre el anillo II es reemplazado por un grupo CHO. El rea sombreada que rodea al borde de la porfirina indica la deslocalizacin de electrones para formar una nube. La estructura de la porfirina de la clorofila que contiene magnesio se puede comparar a la porfirina que contiene hierro de un grupo hem mostrado en la figura 5-12.
350
400 450 500 550 600 650
750

Longitud de onda (nm)

zoarios. La bacterioclorofila slo se observa en bacterias verdes y prpuras, organismos en los cuales la fotosntesis no se acompaa de la formacin de oxgeno. Los pigmentos accesorios ms importantes de la fotosntesis en plantas evolutivamente elevadas son los carotenoides, por ejemplo el /3-caroteno.

FIGURA 6-7. Espectro de absorcin para varios pigmentos fotosintticos de plantas evolutivamente avanzadas. El trasfondo muestra los colores percibidos para longitudes de onda del espectro visible. La clorofila absorbe con mayor intensidad en las regiones violeta-azul y rojo del espectro, en tanto que los carotenoides (o sea, beta-carotenos) absorben tambin en la regin verde. Las algas rojas contienen pigmentos adicionales (ficobilinas) que absorben en las bandas intermedias del espectro.

214

CAPITULO 6 Fotosntesis y doroplastos Clorofila a Espectro de accin

"*-

SJ 3
SO D O" O

='>2

r ra ' o = u 33

500

600

700

Longitud de onda, nm FIGURA 6-8. Espectro de accin para la fotosntesis. El espectro de accin (representado por la lnea de color rojo) indica la eficacia de la luz de diferente longitud de onda para promover la fotosntesis en las hojas de una planta. Las lneas medias indican el espectro de absorcin de cada uno de los principales pigmentos fotosintticos. La lnea verde muestra el espectro de absorcin combinado de todos los pigmentos.

las longitudes de onda verdaderamente eficaces para efectuar una respuesta fisiolgica determinada. El espectro de absorcin para la fotosntesis sigue bastante bien el patrn del espectro de absorcin de clorofilas y carotenoides, lo que indica la importancia de estos pigmentos en la absorcin de luz.

clorofila del centro de reaccin, tiene realmente la capacidad de transferir electrones a un aceptor de los mismos. Aunque la masa de las molculas del pigmento no participa directamente en la conversin de energa luminosa a energa qumica, todas se encargan de absorber luz; forman una especie de antena, un sistema para captar luz que atrapa fotones de diferentes longitudes de onda y transfiere esta energa de excitacin con gran rapidez a la molcula del pigmento situada en el centro de reaccin. El sistema antena no slo incrementa la variedad de las longitudes de onda que pueden absorberse, sino tambin incrementa la eficiencia de la fotosntesis. Se estima que incluso con luz brillante un fotn incidente golpea una molcula de pigmento a una frecuencia de casi una vez por segundo. En contraste, en el centro de reaccin el pigmento tiene capacidad para transferir electrones a un aceptor adyacente con una frecuencia mayor de 200 por segundo. El agrupamiento de varios cientos de molculas de pigmento captador de luz alrededor de un solo centro de reaccin aumenta notablemente el nmero de electrones que el pigmento del centro de reaccin puede transferir en una unidad de tiempo. La transferencia de la energa de excitacin de una molcula de pigmento a otra es muy sensible a la distancia entre las molculas. La estrecha proximidad de los pigmentos se facilita gracias a su elevada concentracin y su asociacin a los polipptidos de la membrana que los mantiene en posicin fija, lo que favorece la transferencia de energa. Una "regla" importante que opera entre los pigmentos antena es que la energa de excitacin nunca puede transferirse a una molcula que requiera mayor energa. En otras

6-4 Unidades fotosintticas y centros de reaccin

En 1932, Robert Emerson y William Arnold, del California Institute of Technology, efectuaron un experimento que sugiere que no todas las molculas de clorofila del cloroplasto participan activamente en la conversin de energa luminosa a energa qumica. Empleando suspensiones del alga Chlorella y luz intermitente de muy corta duracin (p. ej., 10 jMseg) e intensidad de saturacin, determinaron la cantidad mnima de luz necesaria para producir el mximo de oxgeno en un ciclo de fotosntesis. Segn el nmero de molculas de clorofila presentes en la preparacin, calcularon que durante un breve destello de luz se libera una molcula de oxgeno por cada 2 500 molculas de clorofila presentes. Posteriormente se demostr que se absorbe un mnimo de ocho fotones (quantum) de luz para producir una molcula de C2; por lo tanto, se puede concluir que los cloroplastos contienen aproximadamente 300 veces ms molculas de clorofila de lo que al parecer se requiere para la fotosntesis. Una posible interpretacin de este dato es que slo un pequeo porcentaje de las molculas de clorofila participan en la fotosntesis. Sin embargo, ste no es el caso. Ms bien, las 300 molculas de clorofila actan juntas como una unidad fotosinttica en la cual slo un miembro del grupo, la

Molculas de pigmento antena

Fotn

Centro de reaccin FIGURA 6-9. Transferencia de la energa de excitacin. La energa de excitacin se transfiere al azar a pigmentos que absorben luz de longitud de onda crecientemente mayor hasta que alcanza la clorofila del centro de reaccin que transfiere un electrn excitado a un aceptor primario, corno se describe posteriormente en el captulo.

CAPITULO 6 Fotosntesis y dowplastos

215

palabras, la energa de excitacin no puede transmitirse a una molcula de pigmento que absorbe luz de longitud de onda ms corta (mayor energa) que la absorbida por la molcula donadora. Por consiguiente, corno la energa que pasa a travs de una unidad fotosinttica (fig. 6-9) cada vez se transfiere a una molcula de pigmento que absorbe una longitud de onda mayor, la naturaleza de las transferencias subsecuentes est muy restringida. La clorofila del centro de reaccin es la nica que tiene un pico mximo de absorcin a la longitud de onda mayor, y por lo tanto acta como una especie de "trampa" o "pozo" haca el cual inevitablemente se dirigen todas las molculas del pigmento antena captadoras de energa. La diferencia en el contenido de energa entre el fotn originalmente absorbido por un pigmento antena y la energa transferida finalmente al centro de reaccin se libera en forma de calor. Se estima que la energa de excitacin tarda unos 200 X 10~12 segundos en viajar desde el sitio de absorcin hasta el centro de reaccin del pigmento. Una vez que la energa es recibida en el centro de reaccin, el electrn excitado puede transferirse al aceptor "en espera". Evolucin del oxgeno: coordinacin de la actividad de dos sistemas foto sintticos diferentes La evolucin de organismos capaces de utilizar HjO como fuente de electrones requiri innovaciones en el mecanismo de fotosntesis, razn por lo cual puede entenderse si se considera la energtica de la fotosntesis oxignica (liberadora de 03). El par C^-HjO tiene un potencial redox estndar de +0.82 V, en tanto que el del par NADP+-NADPH es -0.32 V. La diferencia entre estos dos valores (1.14 V, que equivale a 52.6 kcal/mol) proporciona una medida de la energa que debe suministrarse a un par de electrones para eliminarlos de H^O y pasarlos a NADP+ en condiciones estndar. Un fotn de luz roja no contiene suficiente energa para elevar un electrn al nivel energtico requerido (pg. 211). Este problema se resolvi con la evolucin de dos diferentes reacciones fotoqumicas que ocurren en dos fotosistemas espacialmente separados. Cada fotosstema es "responsable" de impulsar los electrones una parte del camino sobre la cuesta energtica (fig. 6-10), de manera no muy diferente a como una silla elevadora de dos pasos levanta a los esquiadores para pasar un plano inclinado particularmente largo. Un fotosistema, denominado fotosistema II (PSII), impulsa los electrones desde un nivel energtico menor que el del agua en el extremo de baja energa hasta un punto a mitad del camino donde el otro fotosistema, denominado fotosistema I (PSI), eleva los electrones hasta un nivel energtico por arriba de NADP + . Se dice que los dos fotosistemas actan en serie, o sea, uno despus del otro. El centro de reaccin del fotosistema II se denomina P680: "P" por "pigmento" y "680" por la longitud de onda de la luz que la molcula de clorofila absorbe con mayor intensidad. El centro de reaccin del fotosistema I se denomina F700 por razones similares. Cuando la luz del sol incide sobre la membrana tilacoide, se absorbe energa simul-

tneamente en los pigmentos antena de ambos PSII y PSI, y pasa a los centros de reaccin de ambos fotosistemas. Los electrones de los pigmentos de ambos centros de reaccin son impulsados a un orbital ms externo y cada electrn fotoexcitado es transferido a un aceptor primario de electrones. La transferencia de electrones afuera de los fotosistemas deja los pigmentos de los dos centros de reaccin con un electrn menos, y por lo tanto con carga positiva. Luego de perder sus electrones, los centros de reaccin de PSII y PSI se pueden denominar P680+ y P700+, respectivamente. Los centros de reaccin positivamente cargados atraen electrones, lo que establece la etapa de flujo de electrones entre transportadores. En la fotosntesis oxignica, donde actan dos fotosistemas en serie, el flujo de electrones ocurre a lo largo de tres ramas: entre agua y PSII, entre PSII y PSI, y entre PSI y NADP+, disposicin descrita como esquema Z. En la figura 6-10 se muestra una amplia representacin del esquema Z; explicaremos el nombre de los diferentes componentes conforme examinemos por separado cada una de las principales partes de la va.
Operaciones PSII: obtencin de electrones por separacin de agua

PSII es un complejo de ms de 20 polipptidos diferentes, la mayor parte codificados por el genoma del cloroplasto de una clula vegetal. Nuestra comprensin de los sucesos que ocurren en los centros de reaccin PSII recibi un gran impulso en el decenio pasado cuando se comprob que PSII posee estructura y funcin muy similares a un centro de reaccin fotosinttico (CRF) de la bacteria prpura no sulfurosa Rhodopseiidomonas viridis. A mediados de los aos 1980, Johann Deisenhofer, Robert Huber y Helmut Michel, del Max Planck Institute de Alemania, describieron la estructura del CRF bacteriano a nivel de resolucin atmica. Estos datos suministraron la primera imagen tridimensional de una protena de membrana (o complejo protenico de membrana) en la forma que reside dentro de la bicapa del lpido de una membrana celular (fig. 6-11, a). El CRF de esta bacteria prpura contiene dos protenas hidrfobas, denominadas subunidad L y subunidad M, unidas a varios pigmentos y centros redox (indicados en color en la figura 6-11, a, y mostradas por separado de la protena en la figura 6-11, b}. Los centros redox se requieren para absorber luz y transferir electrones lejos de los pigmentos de los centros de reaccin, como se describe en el pie de figura. En vez de analizar el mecanismo que emplea esta bacteria retornaremos al fotosistema II, que efecta una serie similar de reacciones con una excepcin importante: los sucesos en PSII dan como resultado la separacin del agua. Una vez obtenida la secuencia de las subunidades L y M del centro del CRF bacteriano se determin su estructura tridimensional, comprobndose que el PSII de la cianobacteria y de plantas evolutivamente elevadas contiene dos protenas pequeas, denominadas DI y D2 (fig. 6-12, a), cuya secuencia de aminocidos mostr notable homologa con las dos subunidades bacterianas. Estudios subsecuentes demostraron que DI y D2 se-enlazan a la molcula de clorofila P680 y a los centros redox del fotosistema para efectuar las complejas actividades fotoqumicas requeridas para oxidar el agua.

216

CAPITULO 6 Fotosntesis y doroplastos Aceptor de electrones

-400

"Fi Sistema de transporte de electrones Aceptor de electrones

NADP+ +

-200

Sistema de transporte de electrones

+200
Molculas antena Centro de reaccin (P700) Fotolisis Fotn incidente Fotosistema

+400

+600
2H+ i/202 e e Molculas antena

Luz

+800
H30

Centro de reaccin (P68Q)

Fotosistema II H < ; i : R A f>-! Panorama del flujo de electrones durante las reacciones fotodependientes de la fotosntesis. Los sucesos mostrados en este esquema se describen en detalle en las siguientes pginas. Los diferentes portadores implicados en el transporte de electrones para la fotosntesis se indican en la figura 6-18.

Recoleccin de luz. El primer paso en la activacin de PSII es la absorcin de luz por un pigmento antena. La mayor parte de los pigmentos antena que recolectan luz para PSII residen en un complejo pigmento-protena separado, denominado complejo II captador de luz, o simplemente LHCII, el cual puede situarse fuera del propio f otosistema (fig. 6-12, a). Se ha aislado LHCII de cloroplastos de plantas de guisantes en forma de un trmero que consta de tres polipptidos integrales de membrana (fig. 6-12, a). Cada polipptido mantiene enlaces no covalentes que lo unen a casi 12 molculas de clorofila (7 molculas de clorofila a y 5 molculas de clorofila b; fig. 6-12, b) y dos carotenodes (mostrados en amarillo en la figura 6-12, b). Las clorofilas cuelgan de las hlices del polipptido a dos niveles diferentes respecto de la bicapa de lpidos; por esta razn, la disposicin de las clorofilas se compara con ropa colgada al aire para secar en dos cuerdas a diferente nivel. Los carotenoides protegen el complejo de las especies reactivas de oxgeno. Los pigmentos de LHC se encuentran en estrecho contacto entre s, facilitando la rpida transferencia de energa

hacia el centro de reaccin. Los complejos LHCII son muy abundantes en las membranas tilacoides; se estima que casi 50% de todas las molculas de clorofila sobre el planeta estn presentes como parte de un complejo LHCII. Segn se analiza en La va experimental al final del captulo, LHCII no siempre se une a PSII, y en condiciones apropiadas puede desplazarse a travs de la membrana tilacoide y unirse a PSI sirviendo como complejo captador de luz para el centro de reaccin PSI. Transferencia de electrones dentro de PSII. La energa de excitacin se transfiere de LHCII a un complejo antena interno situado en el plano central de la membrana y que consta de protenas ntimamente unidas a clorofila relacionadas con el centro de reaccin PSII. En la figura 6-13 se ilustra la secuencia de acontecimientos que ocurren en el centro de reaccin. Cuando se transfiere la energa de los pigmentos antena centrales a P680, los pigmentos del centro de reaccin responden (en unos 3 a 4 picosegundos) transfiriendo un electrn fotoexcitado a una molcula de feofitina, semejante a clorofila, con la que estn ntimamente relacionados (paso 1, fig. 6-13), que es el aceptor primario

CAPITULO 6 Fotosntesis y doroplastos Lado BChl (P) Lado L

217

BChl

BPh

200ps

(a)

(b)

Fe

QA

FI<;iHt\l ' Estructura del centro de reaccin fotosinttico deK. viridis. a) Las cadenas de protenas se representan por trazos de esqueletos lisos: el citocromo se muestra en verde, la subunidad M en azul, la subunidad L en marrn y la subunidad H en prpura. Los tomos de los cofactores redox se dibujan en colores brillantes: carbonos en amarillo, nitrgenos en azul, oxgenos en rojo, magnesio en verde, b) La va que siguen los electrones a travs del centro de reaccin de R. viridis est indicada por la flecha ancha de color amarillo. Aunque hay dos conjuntos de cofactores, la transferencia de electrones es muy asimtrica y ocurre casi exclusivamente a lo largo de la rama L mostrada a la derecha. Durante la fotosntesis, una molcula del pigmento (P) de bacterioclorofila absorbe la luz (molcula azul en la parte superior), que responde transfiriendo un electrn excitado a un aceptor cercano (A) provocando la formacin de un donador de electrones con carga positiva (P + ) y un aceptar de electrones con carga negativa (A~). En R. viridis, A es la bacteriofeofitina (molcula roja), una molcula parecida a la clorofila que carece de ion Mg 2+ . P + es deficiente en electrones y busca electrones; o sea, es un agente oxidante. Por lo contrario, A~ tiene un electrn extra que puede perder con facilidad; o sea, es un agente reductor. Puesto que las especies con carga positiva y negativa muestran una atraccin mutua evidente, es esencial estabilizar las dos cargas separadas. La estabilizacin se logra transfiriendo electrones a una molcula de quinona (QA/ molcula prpura) situada en un punto lejano de la bacterioclorofila original. Los electrones excitados pasan subsecuentemente a la ubiquinona (UQ) para formar un UQHi, que es un fuerte agente reductor. Por ltimo, los electrones fluyen de un UQH2 de nuevo al pigmento del centro de reaccin deficiente de electrones generando un gradiente de protones a travs de la membrana que se emplea en la sntesis de ATP. ps = picosegundo. (a: Segn Johann Deisenhofer y Helmut Michel, EMBO J. 8:2154, 1989, con permiso de Oxford University Press.)

de electrones. Esta transferencia de un electrn genera un donador con carga positiva (P680+) y un aceptor con cargta negativa (Feo~). La importancia de la formacin de dos especies con carga opuesta, P680+ y Feo~ puede ser ms evidente si consideramos la capacidad de oxidorreduccin de estas dos especies. P680+ es deficiente en electrones y anda en busca de ellos, convirtindose as en un agente oxidante. En contraste, Feo~ tiene un electrn extra que puede perder con facilidad y por lo tanto es un agente reductor. Este hecho, la formacin de un agente oxidante y un agente reductor operado por la luz, que tarda menos de una milmillonsima de segundo, es la esencia de la fotosntesis.

P680+ es un agente oxidante fuerte, en tanto que Feo~ es un agente reductor dbil. Se estima que el potencial redox de la forma oxidada de P680 es alrededor de +1.1 V, lo bastante fuerte para atraer con gran intensidad (baja energa) a los electrones del agua (potencial redox de +0.82 V) y separar la molcula. La separacin del agua durante la fotosntesis se denomina fotolisis. Debido a su carga opuesta, P680+ y Feo~ muestran notable atraccin mutua. Igual que en el CRF bacteriano ilustrado en la figura 6-11, la separacin de cargas se estabiliza separando cargas que finalmente quedan en lados opuestos de la membrana. En PSII, Feo~ transfiere su electrn

218

CAPITULO 6 Fotosntesis y doroplastos

LHC

(b)
FIGURA 6-12. Organizacin molecular del fotosistema II. a) El fotosistema II consta de varios polipptidos, incluyendo DI y D2, unidos a la clorofila del centro de reaccin y los componentes redox relacionados. El centro de reaccin est rodeado por complejos captadores de luz (LHCII) cuya estructura trimrica se muestra en el recuadro, b) Vista lateral del monmero LHCII en la forma que reside dentro de la bicapa de lpidos {indicada por las bandas azules). El monmero contiene tres hlices alfa que rodean a toda la membrana, marcadas A, B y C, adems de 12 molculas de clorofila. Las porfirinas de la clorofila estn dispuestas en dos niveles, correspondiendo regularmente a las dos hojas de la bicapa (clorofila a, verde oscuro; clorofila b, verde claro; caroenoides, amarillo; tomos de magnesio, esferas de color rosa), (a: Segn G. Renger, en Topics in Photosynthesis, /. Barber, ed., vol. 11, Elsevier, 1992; b: reimpreso con autorizacin deWernerKhlbrandt, Da NengWangy Yoshinori Fujiyoshi, Nature 367:618, 1994, copyright 1994, Macmian Magazines Ltd.)

(paso 2, fig. 6-13) a una molcula de plastoquinona (designada QA) enlazada a la protena DI en el lado externo (del estroma) de la membrana. La plastoquinona (PQ) es una molcula Hposoluble (fig. 6-14) de estructura similar a la ubiquinona (fig. 5-12, c). El electrn de la plastoquinona QA se transfiere (paso 3, fig. 6-13) a una segunda plastoquinona (designada QB), generando una forma semirreducida de la molcula (Q~) que permanece firmemente enlazada a la protena DI del centro de reaccin. Con cada una de estas transferencias, los electrones se aproximan cada vez ms al lado del estroma de la membrana. Conforme ocurren los acontecimientos descritos antes, el agujero del electrn en el pigmento con carga positiva (P680+) se llena mediante la transferencia de un electrn (paso A, fig. 6-13) procedente de un residuo especfico de tirosina (designado Tirz) de la protena DI, formando Tirz+ y P680 neutro. A su vez, Tir^"1" se reduce al aceptar electrones suministrados por el agua (paso B, fig. 6-13), segn analizaremos ms adelante. La absorcin de un segundo fotn por P680 enva un segundo electrn a lo largo de la va, de feofitina a QA, a Q B ~ para formar QB 2" (paso 4, fig. 6-13), que se combina con dos protones para formar QsH2 (PQH2) (paso 5, figs. 613 y 6-14). Los protones empleados en la formacin de PQHi se derivan del estroma, lo que provoca disminucin de la concentracin de H + del estroma (elevacin de su pH). La molcula PQH2 reducida se disocia de la protena y es sus-

tituida por una nueva molcula QB recien oxidada procedente de la reserva de plastoquinona de la bicapa (paso 6, fig. 6-13). En la siguiente seccin seguiremos el destino de los electrones (y protones) transportados por PQHj. Flujo de electrones del agua a PSII La parte menos conocida de toda la cadena que se extiende desde el agua hasta NADP+ es el primer segmento entre H2O y PSII. El desdoblamiento del agua es altamente endergnico debido a la asociacin estable del hidrgeno con los tomos de oxgeno. Consideremos que en el laboratorio el desdoblamiento del agua requiere el empleo de una fuerte corriente elctrica o temperaturas que se aproximan a 2 000C. Aun as, una clula vegetal puede efectuar esta hazaa en una montaa nevada utilizando la pequea cantidad de energa procedente de la luz visible. Se cree que la formacin de una molcula de oxgeno durante la fotolisis requiere la prdida simultnea de cuatro electrones procedentes de dos molculas de agua, segn la reaccin 2H2O -> 4H+ + O2 + 4eIncluso un centro de reaccin PSII slo puede generar a la vez una carga positiva (P680+), o un equivalente oxidante. En PSII se asocian cuatro iones manganeso (Mn) (fig. 6-13) que desempean un papel vital en la formacin de oxgeno. Los cuatro iones reunidos acumulan cuatro cargas positi-

CAPITULO 6 Fotosntesis y cloroplastos

219

0 :

2H* (del estroma)

DESTELLO

Luz tilacoide

FIGURA 6-13. Organizacin funcional del fotosistema II. El dibujo muestra un modelo estructural de PSII, incluyendo los principales componentes redox que se analizan en el texto. La va que siguen los electrones est indicada por la flecha amarilla. Los acontecimientos comienzan con la absorcin de luz por P680, lo que provoca la excitacin de un electrn y su transferencia (paso 1) a la feofitina (Feo), aceptar primario de electrones de PSII. Subsecuentemente, el electrn pasa a QA (fase dos) y luego a Qg (paso tres) para formar un radical libre con carga negativa (Qg~). La absorcin de un segundo fotn enva un segundo electrn a lo largo de la misma va convirtiendo en aceptor a Qs2~ (paso cuatro); A continuacin entran dos protones del estroma (paso cinco) generando QB!"^ (que en realidad es plastoquinona reducida, PQI-y, la cual se libera en la bicapa de lpidos y es sustituida por una nueva molcula QB oxidada (paso seis). Conforme ocurren los sucesos anteriores, los electrones se desplazan desde H2 por la va Tirz al pigmento del centro de reaccin con carga positiva (pasos B y A).

vas sucesivas que en el estado de oxidacin proceden desde O hasta +4. El grupo Mn alcanza el estado de oxidacin +4 (o 64) transfiriendo cuatro electrones, uno a la vez, al P680+ cercano (va Tirz+)- Despus de transferir cada electrn a P680+ para regenerar P680, el pigmento vuelve a oxidarse (regresando a P680+) luego de absorber otro fotn. Por lo tanto, la acumulacin de cuatro cargas positivas (equivalentes oxidantes) en el grupo Mn se efecta gracias a la absorcin sucesiva de cuatro fotones en el centro de reaccin PSII. Una vez logrado esto, el oxgeno liberado en el complejo PSII puede catalizar la eliminacin de 4e~ de las molculas 2H2, generando un O2 y regenerando al grupo Mn completamente reducido (estado SQ). Este proceso se puede escribir como

La reaccin requiere la presencia de iones cloro y iones calcio; la razn de estos cofactores todava no es clara. Los protones producidos en la reaccin de fotolisis se desplazan a la luz del tilacoide donde contribuyen al gradiente de protones. La demostracin de la acumulacin de equivalentes oxidantes sucesivos se obtuvo por primera vez exponiendo clulas de algas a destellos muy breves de luz (1 /fseg). Despus de 1 o 2 destellos prcticamente no se libera oxgeno. Las clulas deben iluminarse varias veces para que detecten una cantidad cuantificable de 2, lo que indica que para liberar O2 debe acumularse el efecto de fotorreacciones individuales (fig. 6-15). De PSII a PSI Anteriormente se describi cmo la absorcin de dos fotones sucesivos en el centro de reaccin PSII conduce a la formacin de una molcula de plastoquinona totalmente reducida (PQH2) que se libera en el interior de la reserva de PQ en la bicapa de lpidos. PQH2 es un transportador de electrones movibles cuya estructura y funcin es similar

4H++O 2 2H2O
4ehvhv. hv-

220

CAPITULO 6 Fotosntesis y doroplastos

CH3
(CH,-CH=C-CrU,-H

FIGURA 6-16. Transporte de electrones entre PSII y PSI. El flujo de electrones est indicado por la flecha amarilla. Los pasos se describen en el texto.

CH 3
~ CH= C OH

Plastoquinol FIGURA 6-14. Plastoquinona. La aceptacin de dos electrones y de dos fotones reduce PQ (plastoquinona) a PQH2 (plastoquinol).

fieren a otro transportador de electrones mviles, una protena hidrosoluble que contiene cobre denominada plastocianina, situada en el lado luminal de la membrana tilacoide (paso 3, fig. 6-16). La plastocianina transporta electrones al lado luminal de PSI, donde se transfieren a P700+, el pigmento con carga positiva del centro de reaccin PSI (paso 4, fig. 6-16). Operacin PSI y reduccin de NADP+ Los sucesos fotoqumicos que tienen lugar en PSI se inician con la absorcin de fotones por un complejo captador de luz (denominado LHCI) que contiene molculas antena de clorofila formando un complejo de varios polipptidos diferentes. La energa de la excitacin pasa de los pigmentos antena al centro de reaccin PSI, una multiprotena compleja grande que contiene varios centros redox diferentes (fig. 6-17). El pigmento del centro de reaccin es una molcula de clorofila a, P700, que al aceptar la energa de la excitacin se convierte en P700+ oxidado. La oxidacin del pigmento ocurre conforme se transfiere un electrn a una segunda molcula de clorofila a (designada AO), que acta como aceptor primario de electrones (paso 1, fig. 6-17). La separacin de cargas en PSI que acompaa a la absorcin de un fotn da como resultado la formacin de un agente oxidante dbil (P700+) y un agente reductor fuerte (Ao~). El agente reductor formado en PSI debe tener un potencial redox suficientemente negativo (estimado en 0.7V) capaz de reducir NADP+ (potencial redox de -0.324 V). La separacin inicial de cargas se estabiliza por la transferencia del electrn de AQ~ a travs de varias "manos", incluyendo un tipo de quinona denominadofiloquinona(designado Aj) y tres centros de hierro y azufre (designados FX, FB y FA), todos formando parte del centro de reaccin PSI (pasos 2-4, fig. 6-17). La formacin de P700+ ocurre en el lado luminal de la membrana y el electrn que pierde el aceptor primario pasa a travs de la membrana hasta los centros de hierro y azufre del lado del estroma. A continuacin, el electrn se transfiere a una pequea protena perifrica de hierro y azufre denominada ferredoxina (paso 5, fig. 6-17). De la ferredoxina, el electrn pasa al NADP+ junto con un protn, formando NADPH (paso 6, fig. 6-17). Esta reaccin es catalizada por una enzima grande denominada ferredoxina-NADP+ reductasa (FNR). Puesto que necesita dos electrones para formar NADPH y una molcula indivi-

a UQH2 de la cadena respiratoria de las mitocondrias (pg. 184). Durante la fotosntesis, los electrones procedentes de PQH2 se transfieren a un complejo multiprotenico denominado citocromo b$f(paso 1, fig. 6-16), en tanto que los protones se liberan en el interior de la luz tilacoide (paso 2, fig. 6-16). Puesto que estos protones originalmente se derivan del estroma, su liberacin en la luz constituye una translocacin de protones a travs de la membrana tilacoide (fig. 6-18). Los electrones procedentes del citocromo ^/se trans-

i i i i i i i i i i i I
12 16

Destello nmero FIGURA 6-15. Medicin de la cintica de liberacin de C>2. La grfica muestra la respuesta de doroplastos aislados que se mantuvieron en la oscuridad a destellos sucesivos de muy breve duracin. La cantidad de oxgeno liberada es mxima cada cuatro destellos de luz. El primer mximo ocurre despus de tres destellos (en vez de cuatro) debido a que la mayor parte de las protenas que contienen manganeso se presentan en el estado M1+ cuando se mantienen en la oscuridad.

CAPITULO 6 Fotosntesis y dorophstos H + + NADP + NADPH

221

FIGURA 6-17. Organizacin funcional del fotqsistema I. El dibujo muestra un modelo estructural de PSI, incluyendo los principales componentes redox analizados en el texto. Los sucesos se inician con la absorcin de luz por P700, lo que provoca la excitacin de un electrn y su transferencia (paso uno) a AQ, el aceptor primario de electrones de PSI. Posteriormente el electrn pasa a A; (paso dos) y luego a un centro de hierro y azufre denominado FX (paso tres) y despus a travs de dos centros ms de hierro y azufre (FA y FE), y por ltimo a la ferredoxina, una protena pequea de hierro y azufre (paso cinco). Cuando dos molculas diferentes de ferrodoxina han aceptado un electrn, actan juntas para reducir una molcula NADP+ a NADPH (paso seis). El pigmento deficiente en electrones se reduce por medio de un electrn donado por plastocianina (paso A).

Luz tilacoide

dual de ferredoxina slo puede aceptar un electrn, durante la reduccin deben actuar juntas dos ferredoxinas: 2 Ferredoxinare(j + H + NADP+
ferredoxina-NADP + reductasa

2 ferredoxinaov + NADPH

La eliminacin de un protn del estroma aumenta el gradiente de protones a travs de la membrana tilacoide. No todos los electrones que pasan a la ferredoxina terminan inevitablemente en NADPH; pueden tomar rutas alternas, segn el organismo particular y las condiciones del momento. Por ejemplo, los electrones procedentes de PSI pueden pasar a varios aceptares inorgnicos, que por lo tanto se reducen. Estas vas para electrones a veces conducen a la reduccin final de nitrato (NOs") a amonio (NHs) o de sulfato (SO42~) a sulfhidrilo (SH), reacciones que convierten "desperdicios" inorgnicos en compuestos necesarios para la vida. Por lo tanto, la energa de la luz solar se emplea no slo para reducir los tomos de carbono ms oxidados (del COa), sino tambin para reducir formas altamente oxidadas de nitrgeno y tambin tomos de azufre. Si reconsideramos todo el proceso de transporte de electrones que tiene lugar durante la fotosntesis oxignca (resumida en la figura 6-18), podemos observar que los elec-

trones viajan del agua al NADP+ por accin de dos f otosistemas que absorben luz que generan C>2 y NADPH. Adems, se establece un gradiente de protones a travs de la membrana tilacoide como resultado de la eliminacin de H + del estroma y liberacin de H + en la luz tilacoide. La contribucin al gradiente de protones (fig. 6-18) tiene su origen en: 1) separacin del agua; 2) adicin de 2H+ a Qe2~ para formar QeH2 y la liberacin subsecuente de los protones por el citocromo b^f, y 3) reduccin del NADPH. Es necesario absorber cuando menos ocho fotones (cuatro por cada fotosistema) para la formacin de una molcula de 2 y dos molculas de NADPH.

6-5

Fotofosforilacin

La conversin de un mol de CC>2 a un mol de carbohidrato (CH2) requiere el ingreso de una cantidad considerable de energa; especficamente, tres moles de ATP y dos de NADPH (fig. 6-22). El mecanismo para la sntesis de ATP en un cloroplasto es prcticamente idntico al de la mitocondria y la membrana plasmtica de las bacterias aerobias. Igual que en otros casos, la ATP sintasa (fig. 6-18) consta de una pieza cabeza (denominada CFi en los cloroplastos), que contiene el sitio cataltico de la enzima, y una pieza basal (CFo) integrada en la membrana, que forma un canal para

222

CAPITULO 6 Fotosntesis y cloroplastos

Estroma
CF

U.
Luz tilacoide

P, + ADP

ATP :
FIGURA 6-1 i. Resumen de las reacciones fotodependientes. a) Resumen del flujo de electrones procedentes de H2O hacia NADPH a travs de los tres complejos transmembrana. Se muestra el menor nmero de protones translocados a travs de la membrana como resultado de la oxidacin de dos molculas de agua. Se pueden translocar otros protones como resultado de la reduccin de molculas adicionales de plastoquinona, la accin de una bomba de protones, o ambos. Tambin se muestra la ATP sintasa de la membrna tilacoides que se analiza en la siguiente seccin. Los experimentos sugieren que se requieren tres protones para sintetizar cada molcula de ATP. b) Versin detallada del esquema Z que muestra la energtica de los dos fotosistemas y los diferentes transportadores de electrones implicados en las reacciones fotodependientes.

2NADPH 2H 4 +2NADP1

cit bsf

Reserva PQ

(a)
P700'
-400 i-

<-flx '\,BVH FNR f ' F d

-200

P680*

Feo
+200

X
'-Fe-S

+400

1 P700 |

+600

+800

HA O, Ttr 2 \.

+1000

(b)

protones. Las dos partes estn conectadas por un tallo. Las diferentes partes de la ATP-sintasa se construyen a base de polipptidos homlogos a los encontrados en las enzimas bacterianas y mitocondriales.

Los grandes complejos ATP-sintasa no se distribuyen uniformemente a travs de la membrana tilacoide, pero se localizan de manera preferencia! en las laminillas del estroma y en las regiones expuestas de las grana (fig. VE 6-4).

CAPITULO 6 Fotosntesis y doroplastos

223

Las piezas cabeza, CFi, se proyectan por fuera al interior del estroma conservando la orientacin del gradiente de protones, cuya concentracin ms alta est en la luz tilacoide. Por lo tanto, los protones se desplazan desde el sitio de mayor concentracin en la luz por medio de la ATPsntasa al interior del estroma, y por lo tanto opera el proceso de fosforilacin. Cuando la fotosntesis se lleva a cabo con cloroplastos aislados, el medio en el cual se encuentran inmersos se alcaliniza conforme los protones son translocados a travs de las membranas tilacoides al interior de la luz del tilacoide. Las mediciones efectuadas durante periodos de sntesis mxima de ATP sugieren que hay diferencias de concentracin de H + de 1 000 a 2 000 veces a travs de las membranas tilacoides, lo que corresponde a un gradiente de pH (ApH) de 3 a 4 unidades. El movimiento de protones dentro de la luz durante el transporte de electrones se compensa por el movimiento de otros iones, de modo que no se establece un potencial de membrana significativo. Por lo tanto, a diferencia de las mitocondrias, la fuerza motriz de protones (Ap) que acta en los cloroplastos se debe principal o exclusivamente a un gradiente de pH. Puesto que la luz de los tilacoides est prcticamente desprovista de enzimas, el pH bajo de este compartimiento (pH 4.5) no tiene efecto nocivo sobre la actividad celular. Fosforilacin no cclica en comparacin con la cclica La formacin de ATP durante el proceso de fotosntesis liberadora de oxgeno se denomina fotofosforilacin no cclica debido a que los electrones se desplazan en una va lineal (o sea, no cclica) desde H2O a NADP+ (fig, 6-18). Durante el decenio de 1950 se demostr que cloroplastos aislados eran capaces de formar ATP en ausencia de NADP+ o de C2- Todo lo que se necesita es luz, cloroplastos, ADP y Pj. El proceso descubierto posteriormente se llam fotofosforilacin cclica y se ilustra en la figura 6-19. PSI lleva a cabo la fotofosforilacin cclica de manera independiente de PSII. El proceso se inicia con la absorcin de un quantum

de luz en PSI y la transferencia de un electrn de alta energa al aceptor primario. A partir de all, el electrn se transfiere a lo largo de la ferredoxina, como siempre es el caso, pero en vez de transferirse al NADP+ el electrn pasa de nuevo al centro de reaccin deficiente en electrones, para completar el ciclo. Durante el flujo de electrones en este trayecto se libera suficiente energa libre para translocar protones a travs de la membrana por medio del complejo citocromo bg/ y para establecer un gradiente de protones capaz de efectuar la sntesis de ATP. La preponderancia de fotofosforilacin cclica en comparacin con la no cclica en un cloroplasto particular refleja presumiblemente las necesidades de la clula de ATP, NADPH y carbohidratos en ese momento.

6-6 Fijacin de dixido de carbono y formacin de carbohidratos

Despus de la segunda guerra mundial, Melvin Calvin y sus colegas, de la Universidad de California, en Berkeley, iniciaron lo que se conoci como el decenio largo del estudio de las reacciones enzimticas mediante las cuales se asimila dixido de carbono en las molculas orgnicas de las clulas. Armados con el recientemente disponible istopo radiactivo de carbono (14C) de vida media prolongada, y la nueva tcnica de cromatografa bidimensional en papel, emprendieron la tarea de identificar todas las molculas marcadas formadas donde se permite a las clulas utilizar [14C]C>2. Los estudios comenzaron con hojas de plantas, pero pronto se cambi a un sistema ms sencillo, el alga Clordla. Las algas cultivadas crecieron en cmaras cerradas en presencia de CC>2 no marcado y luego se introdujo CC>2 radiactivo (en forma de gas disuelto) mediante inyeccin en el medio de cultivo. Luego de determinado tiempo de incubacin con C2 marcado, se dren de lquido la suspensin de algas y se pas a un contenedor con alcohol caliente para matar las clulas de inmediato, deteniendo la actividad enzimtica, y para extraer molculas solubles. A continuacin se colocaron los extractos de las clulas como puntos sobre papel cromatogrfico y sujetados a cromatografa bidimensional. Para identificar el sitio de los compuestos radiactivos al final del procedimiento, se comprimi un pedazo de pelcula de rayos X contra el cromatgrafo y las placas se mantuvieron en la oscuridad para exponer la pelcula. Despus de revelar las fotografas, los compuestos radiomarcados se identificaron comparando los estndares conocidos y tambin por anlisis qumicos.

La va Cg
Se encontr que la conversin de C2 marcado a compuestos orgnicos reducidos ocurre de manera muy rpida. Si el periodo de incubacin es muy breve (unos pocos segundos), predomina un punto de radiactividad sobre el cromatograma (fig. 6-20). Se determin que el compuesto es un 3fosfoglicerato (PGA), uno de los intermediarios de la gluclisis. Puesto que el primer intermediario que se identific fue la molcula PGA de tres carbonos, estas reacciones se cono-

FIGURA 6-1 <J. Esquema simplificado de la fotofosforilacin cclica. La absorcin de luz por PSi excita un electrn que se transfiere a la ferredoxina (paso 1) y al citocromo bf (2), a plastocianina (3), y regresa a P700+ (4). En el proceso, el complejo citocromo transloca protones.

224

CAPITULO 6 Fotosntesis y doroplastos

5 segundos de fotosntesis cor Chlorel la Azcar iJ1 fosfato;

FIGURA 6-20 Cromatograma que muestra los resultados de un experimento en el cual clulas de algas se incubaron durante cinco segundos con 14COz antes de sumergirlas en alcohol. Un punto, que corresponde a 3-fosfoglicerato (PGA marcado) contiene la mayor parte de la radiactividad. (Cortesa de James Bassham y Melvin Calvin.)

cieron como va 3. Inicialmente, Calvin sospech que el C2 se una por enlaces covalentes (o se fijaba) a un compuesto de dos carbonos. Sin embargo, luego de una investigacin considerable se descubri que el aceptor inicial era un compuesto de cinco carbonos, rbulosa 1,5-difosfato (RuBP), el cual al condensarse con C2 forma una molcula de seis carbonos. Este compuesto de seis carbonos se fragmenta de inmediato en dos molculas de PGA, una de las cuales contiene el tomo de carbono recin aadido. El papel de la ribulosa 1,5-difosfato como aceptor de C2 se demostr en varios experimentos, como el ilustrado en la figura 6-21. Es bien sabido que cuando se administra C2 marcado a las clulas, luego de cierto periodo cada uno de los puntos presenta mxima radiactividad; o sea, se saturan de radiactividad. Se ha observado que las clulas expuestas durante suficiente tiempo a [14C]2 en la luz para saturar de radiactividad a los intermediarios presentan ele-

Luz

Oscuridad

20-

Fosfoglicerato
s 10

Ribulosa difosfato ..~. o,

100

200

300

Tiempo (segundos)

Luz apagada

FIGURA 6-2 ]. Datos en apoyo de la hiptesis de que RuBP es el compuesto al cual se fija el C2- Cuando se apagaron las luces que iluminaban un cultivo de algas con una cantidad mxima de istopos marcados, hubo un descenso casi inmediato de la concentracin de RuBP y la correspondiente elevacin de la concentracin de PGA. Esto sera de esperar si se consumiera RuBP durante la fijacin de CO2, paso que conduce a la formacin de PGA.

vacih inmediata de radiactividad en PGA y descenso inmediato de radiactividad en ribulosa 1,5-disfosfato (fig. 6-21) cuando se apaga la luz. La razn de este resultado se demuestra al considerar la necesidad de ATP y NADPH sintetizados en las reacciones de luz para la sntesis de RuBP (fig. 6-22, &). En ausencia de ATP y de NADPH, el PGA marcado no puede convertirse a otros intermediarios ni pueden formarse nuevas molculas de RuBP. En contraste, la condensacin de CC>2 con RuBP y la subsecuente conversin a PGA pueden continuar debido a que esta reaccin no depende de productos de alta energa formados en las reacciones con luz. Por consiguiente, la radiactividad de PGA se eleva, en tanto que la radiactividad de RuBP desciende. Tanto la condensacin de RuBP con C2 como la separacin del producto de seis carbonos (fig. 6-22, a) tienen lugar en el estroma por medio de una enzima grande de mltiples subunidades, ribulosa difosfato carboxilasa. Esta enzima, conocida comnmente como "Rubisco", slo es capaz de fijar tres molculas de CC>2 por segundo, y por lo tanto debe estar presente en gran cantidad dentro del cloroplasto. En realidad, Rubisco constituye la protena ms abundante sobre la Tierra, y equivale a casi la mitad de la protena de la mayor parte de las hojas o cerca de 10 kg por cada ser humano del planeta. Conforme se determin la estructura de varios intermediarios, junto con la posicin de los tomos de carbono marcados, cada vez fue ms aparente que la va para convertir CC-2 en carbohidratos es bsicamente circular. En la figura 6-22, b, se muestra una versin "abreviada" de la va. El crculo comprende tres partes principales: 1) carboxilacin para formar PGA; 2) reduccin de PGA a gliceraldehido 3fosfato (GAP) utilizando el NADPH y el ATP formados por transporte de electrones en las reacciones dependientes de luz, y 3) la regeneracin de RuBP, que requiere ATP adicional. En la figura 6-22, b, se puede observar que por cada seis molculas fijadas de C2 se producen 12 molculas de GAP (GAP es el punto marcado como triosa fosfato sobre el cromatograma de la figura 6-20). Los tomos en 10 de estas molculas GAP de tres carbonos se redisponen para regenerar seis molculas del aceptor de cinco carbonos de CC>2, RuBP (fig. 6-22, b). Las otras dos molculas GAP se pueden considerar como productos. Estas molculas GAP pueden exportarse al citoplasma, donde se convierten en el disacrido sacarosa o se oxidan por medio de gluclisis y el ciclo del cido tricarboxlico para suministrar ATP en el citoplasma. Alternativamente, GAP puede permanecer en el cloroplasto, donde se convierte en almidn. Las molculas de sacarosa formadas en el citoplasma a partir del GAP de la va Cs se transportan fuera de las clulas de la hoja y dentro de la corteza, donde se transfieren a los diferentes rganos no fotosintticos de la planta. As como la glucosa sirve como fuente de energa y unidad orgnica de construccin en la mayor parte de los animales, la sacarosa tiene un papel anlogo en casi todas las plantas. Por otra parte, el almidn se almacena dentro de las clulas vegetales en forma de granulos (fig. 2-16, b}. De la misma manera que el glucgeno almacenado suministra a los animales una glucosa rpidamente disponible en tiempos de necesidad, el almidn almacenado en las hojas proporciona

CAPITULO 6 Fotosntesis y doroplastos

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azcares a la planta durante la noche cuando cesa la fotosntesis. De las reacciones de la figura 6-22, b, es evidente que la formacin de carbohidratos es una actividad costosa. La conversin de seis molulas de C2 a una molcula de azcar de seis carbonos y la regeneracin de RuBP requiere 12

molculas de NADPH y 18 molculas de ATP. Este gran consumo de energa refleja el hecho de que CC>2 es la forma ms altamente oxidada de la cual se puede obtener carbono. Las reacciones que constituyen la va C^ (tambin denominada ciclo Calvin o ciclo de reduccin de la pentosa fosfato) ocurren en cianobacterias y en todas las clulas fo-

CH2OPO f CH?OPO I C-OH ChLOPOr I C^OH H HC-OH

CJ O

HC-OH CH2OPO \P (Forma ene-diol)

1

HC-OH

c=o I

o I
H

o=c-oI
HC-OH CH2OPO f 3-PGA

CH2OPO f Intermediario

(a)
6 (C02) HO-C-COC C-0 I HCOH 6 carboxilasa intermediaria SEPARACIONES

12(PGA) 6 (RuBP) HCOH I HCOH CH2OPOf Ciclo de Calvin-Benson

HCOH

0 6ADP + 6P 10 (GAP) H I C=0 HCOH I _ CH2OPO

12ADP + 12P

cH2opor \2 NADPH
12 NADP+ 2 GAP > Fructosa -*-Sacarosa 1,6-difosfato

rx

CH2OPOf

(b)
FIGURA 6-22. Conversin de COz en carbohidrato, a) Reaccin catalizada por ribulosa difosfato carboxilasa para fijar CO2 por unin a RuBP. El producto se desdobla rpidamente en dos molculas de 3-fosfoglicerato. b) Una versin abreviada del ciclo de Calvin que muestra el destino de seis molculas de CC>2 fijadas por combinacin con seis molculas de RuBP. (Se han borrado numerosas reacciones.) La fijacin de CX>2 se indica en el paso 1. En el paso 2 se fosforilan las 12 molculas PGA para formar 12 molculas de 1,3-difosfoglicerato, que en el paso 3 sufren reduccin por electrones suministrados por NADPH para formar 12 molculas de gliceraldehido 3-fosfato (GAP). En el caso que aqu se muestra, se eliminan dos molculas GAP (paso 4) para emplear en la sntesis de sacarosa en el citosol, que se puede considerar el producto de las reacciones independientes de luz. Las otr^s 10 molculas se convierten en seis molculas de RuBP (paso 5), que pueden actuar como aceptares de seis molculas ms de C2. La regeneracin de 6 RuBP requiere la hidrlisis de seis molculas de ATP. NADPH y ATP empleados en la formacin de carbohidratos en el ciclo de Calvin son los dos productos de alta energa de las reacciones foto-dependientes.

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CAPITULO 6 Fotosntesis y doroplastos

osintticas eucariotas; forman la nica va significativa para que el carbono inorgnico presente en la atmsfera se convierta en las complejas molculas biolgicas necesarias para la vida. La mayor parte de las enzimas del ciclo Calvin tambin se encuentran en otras vas, incluyendo la gluclisis. Una vez ms, es evidente la importancia de las membranas en la compartamentalizacin celular. Aunque muchos de los intermediarios formados en el ciclo Calvin tambin son sustratos en otras vas, su formacin dentro del estroma del cloroplasto los aisla de las enzimas del citoplasma.
Fotn'espiracin

Un punto de los que aparecieron en los primeros cromatogramas de los trabajos de Calvin con clulas de algas se identific como el compuesto glucolato, el cual fue ignorado (correctamente) al formular la va C$ de la figura 6-22. Aunque el glucolato no forma parte de la va Cs, es producto de una reaccin catalizada por Rubisco. Casi 20 aos despus de observar que Rubisco cataliza la unin de C2 a RuBP se descubri que Rubisco tambin cataliza una segunda reaccin, en la cual se une C>2 a RuBP para formar 2fosfoglucolato (fig. 6-23), el cual subsecuentemente se convierte dentro del estroma a glucolato mediante la accin de una enzima. El glucolato formado en el cloroplasto se transfiere a la mitocondria y finalmente conduce a la liberacin de CC>2, como describiremos posteriormente (fig. 6-25). Esta serie de reacciones implica captacin de Oj y liberacin de CC>2, por lo que se denomina f otorrespiracin. La fotorrespiracin libera molculas de C2 recin fijadas y por esa razn se considera un desperdicio de la energa de

la planta. En realidad, la fotorrespiracin puede explicar la prdida hasta de 50% del dixido de carbono recin fijado por plantas cultivadas que crecen en condiciones de iluminacin muy intensa. Por lo tanto, como sera de esperar, desde hace varios decenios se desarrrolla un esfuerzo concertado para desarrollar plantas con menor probabilidad de efectuar la fotorrespiracin. Hasta ahora, estos esfuerzos prcticamente han sido infructuosos, como se analiza en detalle en el ensayo La perspectiva humana: "Mejores" plantas por medio de ingeniera gentica. Estudios de la actividad enzimtica de Rubisco purificado muestran que la enzima no tiene preferencia por C2 como sustrato en comparacin con C*2. La razn de esta falta de especificidad es que al parecer ni el C2 ni el C2 se unen al sitio activo de la enzima. Ms bien, la enzima se une a RuBP, que adopta la forma enediol mostrada en la figura 6-23. Esta forma de RuBP puede entonces ser atacada por C2 o por C>2 para formar PGA o fosfoglucolato, respectivamente. Considerada de esta manera, la fotorrespiracin parece ser una consecuencia inevitable de las propiedades qumicas de RuBP. Puesto que C2 y C2 compiten entre s, la direccin predominante de la reaccin es determinada por la proporcin C2/O2 disponible para la enzima. S las plantas crecen en ambiente cerrado con concentracin elevada de C2, tienen capacidad para crecer con mucha mayor rapidez en virtud de su elevada tasa de fijacin de CC>2. Por lo contrario, cuanto mayor sea la concentracin relativa de C>2 en comparacin con la de CC>2, la planta participa ms en la fotorrespiracin y es menor la fijacin de dixido de carbono. Dos grupos de plantas, denominadas 04 y MAC,

0 2 CO ;

H2C-OP032-

oc=o
H-C-OH H2C-OP032Oxigenasa intermedia H2C-OP032~ I C=0 I H-C-OH H-C-OH H2C-OP032~ RuBP H2C-OPQ32HO-C-COOI C=0 I H-C-OH H2C-OP032Carboxilasa intermedia H2C-OP032~ 3-PGA

O II

2HH

c-o2-fosfoglcolato

H2C-OP032-

FIGURA 6-23. Reacciones de la fotorrespiracin. El Rubisco puede catalizar dos reacciones diferentes con RuBP como sustrato (mostradas en estado enediol dentro del plano). Si RuBP reacciona con O2 (paso Ib) se produce una oxigenasa intermedia (paso 2b) que se desdobla en 3PGA y 2-fosfoglicoato (paso 3b). Las reacciones subsecuentes de fosfoglicolato se muestran en la figura 6-25. El resultado final de estas reacciones es la liberacin de CO2, una molcula de la que la clula gasta previamente energa para fijarla. En contraste, si la molcula RuBP reacciona con CO2 (paso la), se produce una carboxilasa intermedia (paso 2a) que se rompe en dos molculas de PGA (paso 3a), la cual contina a travs del ciclo de Calvin.

CAPITULO 6 Fotosntesis y doroplastos

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han superado los efectos negativos de la fotorrespiracin desarrollando una innovacin evolutiva que incrementa la proporcin C2/O2 a la cual se exponen las molculas de la enzima Rubisco. Plantas 4 En 1965, Hugo Kortschak public que cuando se suministra [14C]2 a la caa de azcar, la radiactividad aparece primero en los compuestos orgnicos que contienen un esqueleto de cuatro carbonos y no en la molcula PGA de tres carbonos, como se observa en otros tipos de plantas. Un anlisis ms detallado revel que los compuestos de cuatro carbonos (predominantemente malato y oxalacetato) son resultado de la combinacin de C2 con fosfoenolpiruvato (PEP), y por lo tanto representan un segundo mecanismo de fijacin del dixido de carbono atmosfrico (fig. 6-24). La enzima encargada de unir C2 a PEP se denomin fosfoenolpiruvato carboxilasa y cataliza el primer paso de la va 4 (o Hatch-Slack). Las plantas que utilizan esta va se conocen como plantas C^ y estn representadas principalmente por las hierbas tropicales. Antes de considerar el destino de estos tomos de carbono recin fijados es til examinar las razones de la evolucin de una va alternativa para fijar CO2.

Cuando se colocan plantas en una cmara cerrada y se vigila su actividad fotosinttica, una vez que la concentracin de C2 en la cmara disminuye a casi 50 partes por milln (ppm), en la mayor parte de los casos se observa que la fotosntesis prcticamente se detiene. En contraste, una planta que utiliza la va C contina la fotosntesis hasta que la concentracin de C2 ha descendido a 1 o 2 ppm. La razn de esta diferencia es que la PEP carboxilasa puede seguir operando con concentraciones mucho ms bajas de CC>2 en comparacin con la enzima Rubisco, pero cul es el valor de que una planta pueda fijar COj a concentraciones tan bajas cuando la atmsfera invariablemente contiene C2 en concentraciones muy superiores a 200 ppm? El problema se complica todava ms cuando se comprueba que: 1) el empleo de PEP requiere un consumo adicional de ATP, y 2) las plantas no tienen una va biosinttica directa que conduzca de malato o de oxalacetato a carbohidrato. El valor de la va 4 es evidente cuando se colocan plantas C^ en un ambiente seco y caliente, similar al de donde viven muchas de ellas. El problema ms grave al que hacen frente las plantas que viven en un clima seco y caliente es la prdida de agua, llamada transpiracin, que invariablemente acompaa a la captacin de C2. El dixido de carbono entra a las hojas de las plantas a travs de orificios situados en la superficie, denominados estomas, y por los cuales el agua tambin puede escapar. Las plantas C4 se

FIGURA 6-24. Estructura y funcin de las plantas Cj. Micrografa electrnica de un corte transversal a travs de la hoja de una planta 4 que muestra la relacin espacial entre las clulas mesfllas y los haces de clulas de las vainas. Superpuestas en la micrografa se encuentran las reacciones de fijacin de COi que ocurren en cada tipo de clula. En el paso 1, la enzima carboxilasa PEP une COi a PEP en una clula mesfila localizada cerca de! exterior de la hoja. Los compuestos de cuatro carbonos formados se transportan a las clulas ms centrales localizadas en el haz de la vaina (paso 2), donde se libera CO2- El COi se concentra mucho en las clulas de las vainas, lo que favorece la fijacin de CO2 por la enzima carboxilasa RuBP (Rubisco) para formar 3-PGA (paso 3), el cual puede circular a travs del ciclo de Calvin. El piruvato formado cuando se- libera COi se enva de regreso a la clula mesfila (paso 4), donde se convierte en PEP. Aunque el proceso requiere la hidrlisis de ATP {paso 5), la elevada proporcin de C2/O2 en las clulas de las vainas reduce al mnimo el efecto de la fotorrespiracin. (Micrografa electrnica cortesa de S. Craig.)

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CAPITULO 6 Fotosntesis y cloroplastos

adaptan a los ambientes calientes y ridos debido a que tienen la capacidad de cerrar sus estomas para prevenir la prdida de agua e incluso tambin pueden mantener una captacin suficiente de CC2 para suministrar combustible a su actividad fotosinttica a tasa mxima. Se dice que son fotosintetizadores de "elevada eficiencia" debido al alto grado de fotosntesis por unidad de agua perdida. Por esta razn, las hierbas silvestres, plantas 4, tienden a invadir los terrenos, desplazando a las hierbas domsticas Cj originalmente plantadas. La caa de azcar, el maz y el sorgo son las plantas cultivadas ms importantes que utilizan la va C<j. Puesto que las plantas C4 se desarrollan escasamente en temperaturas fras, su distribucin est muy limitada a latitudes al sur y al norte. Como se mencion anteriormente, no hay va directa de malato o de oxalacetato a carbohidrato. Cuando se sigue el destino del CC>2 fijado por medio de la va C^, se observa que el grupo COj pronto se libera slo para ser capturado por Rubisco y convertido en un intermediario metablico de la va Cs (fig. 6-24). La razn para que las plantas C4 participen en este metabolismo aparentemente paradjico es evidente cuando se examina la anatoma de sus hojas. A diferencia de las plantas Cs, las hojas de las plantas C4 contienen dos cilindros concntricos de clulas. El cilindro exterior est formado por clulas mes/Has y el cilindro interno por haces de clulas envainadas (fig. 6-24). La fijacin de CC2 a PEP ocurre en las clulas mesfilas externas. La actividad de la PEP carboxilasa puede continuar, incluso cuando los estomas de las hojas estn casi enteramente cerrados y la concentracin de C2 en las clulas es muy baja. Una vez formados, los productos C4 se transportan a los haces de clulas envainadas, sellados a gases atmosfricos. Una vez dentro de las clulas envainadas, el CC2 puede separarse del C4 transportador, de manera que se produce una concentracin elevada de C2 en estas clulas interiores, concentracin adecuada para la fijacin efectuada por Rubisco. La concentracin del dixido de carbono en las clulas envainadas puede ser 100 veces mayor en comparacin con la mesfila. Por lo tanto, ta va C4 suministra un mecanismo para controlar la fijacin de CC>2 efectuada por la va menos eficiente C$ bombeando CC>2 en el haz envainado. Una vez separado el C2 del compuesto de cuatro carbonos, el piruvato formado retorna a las clulas mesfilas para volverse a cargar como PEP (fig. 6-24). Adems de ahorrar agua, las plantas que utilizan la va C4 tienen capacidad para generar una proporcin de C2/O2 elevada en el ambiente local de Rubisco, y por lo tanto favorecen el proceso de formacin de CC>2 de preferencia al de fotorrespiracin. En realidad, de ordinario fracasan todos los intentos para demostrar fotorrespiracin en las hojas intactas de C4.

fijacin de CC>2 en momentos diferentes del da, en vez de hacerlo en diferentes clulas de la hoja. (MAC significa metabolismo cido de las crasulceas, por las plantas de la familia Crassulaceae, en las cuales se descubri por primera vez.) Las plantas Cs y C abren sus estomas y fijan C2 durante el da, pero las plantas MAC mantienen sus estomas fuertemente cerrados durante las horas diurnas de mayor calor y sequedad. Luego, durante la noche, cuando la tasa de prdida de vapor de agua se ha reducido mucho, abren sus estomas y fijan C2 por medio de la PEP carboxilasa. Conforme se fija ms y ms dixido de carbono durante la noche, el cido mlico generado se transporta a travs de la membrana del tonoplasto al interior de las vacuolas de la clula. La presencia de este cido C4 se manifiesta por el "sabor matinal" agrio de la planta. Durante las horas del da, los estomas se cierran y el cido mlico se desplaza al interior del cloroplasto. En ese sitio cede su COz- el cual puede ser fijado a RuBP por el Rubisco en las condiciones de baja concentracin de C2 que existen cuando los estomas estn cerrados. Los carbohidratos se forman utilizando ATP y NADPH generados por las reacciones dependientes de luz. Peroxisomas y f o torr espiracin Los peroxisomas son organelos citoplsmicos cuyo papel en el mecanismo oxidativo de las clulas animales se analiz en la seccin 5-7 del captulo anterior. Los peroxisomas tambin estn presentes en ciertas clulas vegetales. Estudios acerca de peroxisomas de clulas de hojas muestran un notable ejemplo de interdependencia entre diferentes organelos. La micrografa electrnica de la figura 6-25 muestra un peroxisoma de la clula de una hoja en estrecha aposicin a las superficies de dos cloroplastos adyacentes y en ntima proximidad a una mitocondria cercana. Esta disposicin no es fortuita, sino que refleja una relacin bioqumica subyacente en donde los productos de un organelo sirven como sustratos en otro organelo. Las reacciones que tienen lugar en los diferentes organelos se superponen en la micrografa de la figura 6-25, y ms adelante se presenta un resumen. Anteriormente se hizo notar que los cloroplastos participan en un proceso denominado fotorrespiracin, que se inicia cuando RuBP reacciona con 2 en vez de C2 para formar un compuesto de dos carbonos, el fosfoglicolato. Una vez formado, el fosfoglicolato se convierte a glicolato, el cual se transfiere fuera del cloroplasto en el interior de un peroxisoma donde la enzima glicolato oxidasa lo convierte en glioxilato, el cual puede convertirse entonces a glicina por transaminacin. La glicina formada en el peroxisoma puede transferirse a una mitocondria, donde se convierte en serina. La serina producida en la mitocondria se transfiere de regreso al peroxisoma, donde se convierte en glicerato, el cual puede transportarse al cloroplasto y utilizarse en la sntesis de carbohidratos a travs de la formacin de cido 3-fosfoglicrico. Fotoinhibicin La fotosntesis es un proceso complejo y finamente controlado. As como demasiado oxgeno puede disminuir el ren-

Plantas MAC
Menos de 5% de las plantas poseen otra adaptacin bioqumica que les permite sobrevivir en habitat muy calientes y secos, como los desrticos. Estas plantas, denominadas plantas MAC, incluyen las suculentas (cactus), utilizan PEP carboxilasa para fijar el CC2 atmosfrico igual que las plantas C4, pero efectan las reacciones que dependen de luz y la

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. :..GIfctna Ocii Mitocondria

FIGLllA 6-2, Bases celulares de la fotorrespiracin. Micrografa electrnica de una porcin de una hoja de clulas mesfilas de la planta del tabaco que muestra un peroxisoma (identificado por su centro cristalino) comprimido contra un par de cloroplastos y cerca de una mitocondria. Las reacciones de fotorrespiracin que ocurren en cada uno de estos organelos se describen en el texto y se muestran superpuestas en los organelos, en los cuales ocurren. (Micrografa cortesa de Sue Ellen Frederck y Eldon H. Newcomb.)

dimiento de la fotosntesis, tambin el exceso de luz puede hacerlo. El efecto negativo de la luz muy intensa sobre la fotosntesis se denomina fotoinhibicin y se cree que es resultado principalmente del dao infligido al fotosistema II por la absorcin de un exceso de luz. PSII opera con el potencial de oxidacin ms alto de todos los sistemas biolgicos conocidos. La formacin de un agente fuertemente oxidante y el peligro siempre presente de la formacin de radicales oxgeno sumamente txicos confiere a PSII una

posibilidad de autodestruccin como resultado de sobreexcitacin del sistema. Todo el dao parece dirigido al polipptido (DI) que une casi todos los centros redox activos del fotosistema. Los cloroplastos contienen un mecanismo para la descomposicin proteoltica selectiva de DI y reemplazarlo por una molcula de polipptido recin sintetizada. Este proceso de reciclamiento de DI, cuya tasa se incrementa al aumentar la intensidad de la luz, parece ser la respuesta primaria de la fotoinhibicin inducida por luz.

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CAPITULO 6 Fotosntesis y doroplastos

LA PERSPECTIVA HUMANA
"Mejores" plantas por medio de ingeniera gentica
El ser humano ha tratado de modificar el material gentico de las plantas durante miles de aos mediante seleccin de cultivos e hibridacin. Con el desarrollo de la tecnologa del DNA recombinante, los genetistas de plantas lograron modificar selectivamente genes especficos que codifican caractersticas de inters para la agricultura, de modo que se desarrollaron nuevas especies con mejores caractersticas. Entre los rasgos que los genetistas de plantas les gustara modificar est el grado de resistencia a sustancias qumicas que matan plantas (herbicidas) y el nivel de resistencia a la fotorrespiracin; ambos incluyen temas que analizaremos en este captulo. Algunos de los herbicidas comunes, incluyendo diurn, atrazina y terbutrina, actan enlazndose a la protena DI de PSII. En la pgina 218 vimos cmo la absorcin de la luz por PSII conduce a producir una molcula PQ2, que posteriormente se libera de un sitio (el sitio QB) de la protena DI y es sustituido por una PQ de la reserva. Los herbicidas mencionados antes actan enlazndose al sitio QB abierto luego de liberar PQF2, al bloquear el transporte de electrones a travs de PSII. Recordemos que el centro de reaccin fotosinttico (CRF) de las bacterias prpura se parece mucho al de PSII, tanto en estructura como en mecanismo de operacin. La operacin del CRF bacteriano normalmente es inhibida por el herbicida terbutrina, causando la muerte de las clulas. La difraccin por rayos X de estas preparaciones revela una bolsa en la protena del centro de reaccin, a la cual se une la molcula de terbutrina. Se han aislado algunas bacterias mutantes resistentes a terbutrina. Inversamente, una bacteria muante (el mutante T4) es sensible a los herbicidas f enlico y de tipo urea, agentes que normalmente actan sobre las plantas pero que no tienen efectos sobre bacterias prpura. El mapeo gentico de los sitios de estas diferentes mutaciones ha puntualizado las partes de la protena bacteriana implicadas en el enlace con el herbicida. Puesto que la protena DI de los fotosstemas vegetales presenta una homologa estrecha con las protenas bacterianas, estos datos abrieron la puerta a modificaciones selectivas del gen DI para alterar la resistencia de las plantas a estos herbicidas. Los agrnomos tienen la esperanza de emplear tcnicas de ingeniera gentica para incrementar la sensibilidad de las plantas no deseadas (p. ej., maleza) a los herbicidas, en tanto se aumenta la resistencia a los herbicidas en plantas de valor en horticultura o agricultura. Si se pudiera lograr esto, la utilidad de los herbicidas aumentara mucho. En aos recientes se han aislado de plantas o de microorganismos varios inhibidores PSII, como gramidol, estigmatolina, auraquinas y cianobacterinas. Un estudio ms detallado de estos "herbicidas" naturales puede llevar a la produccin de nuevos exterminadores de maleza menos peligrosos para el ambiente. Una de las metas ms difciles de lograr para los bilogos moleculares de plantas es disear una versin del Rubisco, la enzima fijadora del C2 de todas las plantas, que sea menos susceptible a la fotorrespiracin (pgina 226). En el texto se hizo notar que el Rubisco acta como oxigenasa (enzima fijadora de 02) y como carboxilasa (enzima fijadora de CC>2). El Rubisco sera menos susceptible a la fotorrespiracin si se pudiera alterar su estructura, de modo que su actividad oxigenasa disminuyera en relacin con su actividad carboxilasa. Aunque los intentos para modificar la enzima e incrementar su capacidad de fijacin de C2 a expensas de la fotorrespiracin no tuvieron xito en el pasado, estudios recientes acerca de microorganismos han aumentado el optimismo de que puede lograrse este objetivo. Los organismos ms tiles en esta tarea han sido: 1) la bacteria no sulfurosa prpura R. rubrum, cuyo Rubisco funcional requiere la expresin de un solo gen sencillo en vez de dos, como en las plantas, y 2) el alga verde Chamydomonas reinhardt, que tiene capacidad de fotosntesis pero puede crecer en ausencia de fotosntesis tanto como su entorno contenga nutrientes orgnicos. Se han aislado cepas mutantes de estos microorganismos que expresan mayor actividad carboxilasa y menor actividad oxigenasa en comparacin con el tipo nativo. Por consiguiente, el crecimiento de estas cepas en presencia de concentraciones elevadas de 2 no inhibe la fotosntesis hasta un grado cercano a lo que normalmente ocurrira. En la actualidad se estn efectuando estudios para determinar la razn de que estos mutantes muestren menor actividad oxigenasa. Una hiptesis es que la sustitucin de aminocidos altera el canal por el cual los gases atmosfricos llegan al sitio activo de la enzima, y por lo tanto el canal es menos accesible a 2. Puesto que la fotorrespiracin desempea un papel importante en la reduccin de la productividad de la mayor parte de las cosechas de vegetales, cualquier xito para desarrollar cepas de plantas menos susceptibles a C>2 tendra mayor impacto en la produccin de alimentos.

CAPITULO 6 Fotosntesis y cloroplastos

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LA VIA

EXPERIMENTAL

Organizacin de la membrana tilacoide

Con el descubrimiento de que la fotosntesis requiere la cooperacin de dos fotosistemas distintos conectados por una cadena transportadora de electrones, se asumi que todos los componentes que participan en el transporte de electrones residen en muy estrecha proximidad en la membrana tilacoide. Como se indica en la figura 6-4 y se analiza en el texto acompaante, los tilacoides normalmente ocurren como parte de pilas nterconectadas (o grana). La membrana del estroma tilacoide (laminillas que interconectan las grana) se conoce como membrana no comprimida debido a que reside en contacto con el estroma, ms bien que comprimida contra otra membrana. En contraste, la mayor parte de las grana de la membrana tilacoide se conocen como membrana comprimida debido a que su superficie externa est comprimida contra la superficie externa de un tilacoide adyacente. Las excepciones son los bordes laterales y las superficies superior e inferior de las grana tilacoides, que tambin estn en contacto con el estroma (fig. VE 6-1). En los aos de 1960 y 1970, varios laboratorios intentaron determinar la distribucin en las membranas tilacoides de diferentes componentes implicados en la fotosntesis. En los primeros estudios se trat de fraccionar la membrana tiacoide en regiones de grana y estromatosas mediante centrifugacin diferencial de las vesculas de la membrana formadas luego de romper los cloroplastos por fuerzas mecnicas de corte, vibraciones de ultrasonido de alta frecuencia o tratamiento con detergentes.l-$ Los estudios se complementaron con el examen microscpico de las partculas visibles en la membrana tilacoide mediante fracturas por congelacin (fig. 4-18).4 Los resultados de estos primeros estudios condujeron a formular el modelo de la membrana tilacoide mostrado en la figura VE 6-2, en el cual los complejos PSII se restringen a las membranas comprimidas de fas grana, los complejos PSI estn presentes en las regiones comprimidas y no comprimidas de las grana, las molculas de ATP-sintasa se proyectan hacia afuera de las regiones no comprimidas, y las molculas Rubisco se encuentran laxamente enlazadas a la superficie externa de la membrana no comprimida. Estos datos establecieron el concepto de que la membrana comprimida de las grana contiene ambos fotosistemas y representa el sitio de transporte de electrones para la fotosntesis no cclica. Se pens que la membrana no comprimida era el sitio de fosforilacin cclica (la cual slo requiere la participacin de PSI) y de la sntesis de ATP (gobernada por el gradiente de protones y que por lo tanto no tiene que estar fsicamente relacionada con otra parte del mecanismo de fotosntesis). En 1980, el concepto de una ntima relacin entre los dos fotosistemas de la membrana tilacoide de las grana fue motivo de controversia. Se desarrollaron mejores tcnicas para distinguir entre membranas comprimidas y no comprimidas. Por ejemplo, se descubri que cuando los cloroplastos se rompen mecnicamente utilizando presin o fuerza a travs de un pequeo orificio, los segmentos de membrana tilacoide adyacentes a las regiones comprimidas de as grana se funden entre s para formar vesculas cuya superficie externa corresponde a la superficie interna de la membrana tilacoide (fig. VE 6-3). Las vesculas de este tipo se describen como "vesculas con lo de adentro por afuera". 5 El resto de la membrana (estroma tilacoide, membranas de granos terminales, y bordes de los granos) forma vesculas, en las cuales la superficie externa de los tilacoides se convierte en la superficie externa de la vescula (denominadas "vesculas con el lado correcto hacia afue-

ra").
Los dos tipos de vesculas se pueden separar, dependiendo de la diferencia de las propiedades de superficie, como carga e hidrofobicidad. Las vesculas con lo de adentro hacia afuera ejecutan las actividades caractersticas de PSII con poca contribucin de PSI. Si los tilacoides de! cloroplasto fueran tratados en un medio escaso en sal antes de romperlos, tratamiento que desapila los tilacoides de los granos y por lo tanto elimina las membranas comprimidas, no se formaran las vesculas con el lado interno hacia afuera. Estos datos condujeron al modelo propuesto por Bertil Andersson y Jan Anderson, de la Universidad de Lund, en Suecia,6 en el cual PSI y ATP sintasa se localizan casi exclusivamente en la membrana no comprimida, en tanto que PSII se segrega en las regiones comprimidas (fig. VE 6-4). El nico complejo mayor de protenas distribuido regularmente entre los dos tipos de regiones de la membrana es el complejo citocromo b(f, que se sita en la cadena transportadora de electrones que conecta PSII con PSI (fig. 6-16).7 Las protenas no son los nicos elementos de las membranas tilacoides que muestran heterogeneidad lateral; tambin los lpidos. En el texto se hizo notar que las membranas

Grana tilacoides Membrana terminal de los grana

Estroma tilacoide

CC
J

Mrgenes

c=j Membranas comprimidas BB Membranas expuestas FIGURA VE 6-1. La superficie externa de la membrana tiacoide se puede dividir en dos regiones estructuralmente diferentes: membranas comprimidas de los grana tilacoides cuya superficie est en contacto con otras membranas, y membranas no comprimidas del estroma tilacoide (o estroma laminar), y !os extremos y bordes de los grana tilacoides que tambin estn expuestos al estroma. (Segn }.M. Anderson, FEBS Lett. 124:1, 1981.)

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CAPITULO 6 Fotosntesis y doroplastos

PS II + complemento ntegro de chl a/b LHCP PS II + complemento parcial de chl a/b LHCP

PS I + pigmento captador de luz relacionado J Factor de acoplamiento . J RuBP carboxilasa

Modelo de membrana tilacoide de finales de! decenio de 1970, en el cual se propuso que la membrana tilacoide comprimida contiene ambos fotosistemas. Se propuso que las regiones no comprimidas contienen PSI, ATP-sintasa (factor de acoplamiento 1, o CF'i) y Rubisco (LHCP, protenas del complejo de captacin de luz). (Segn LA. Staehelin y C.}. Arntzsn, Ciba Found. Symp. 61:166, 1979.)

tilacoides contienen dos tipos predominantes de lpidos: monogalactosildiacilglicerol (MGDG) y digalactosildiacilglicerol (DGDG). La comparacin de las vesculas a partir de las fracciones comprimidas y no comprimidas indic que la proporcin MGDG/DGDG es de casi 3:1 en las regiones comprimidas, pero slo de 1:1 en las regiones no comprimidas,8 dato que sugiere que las bicapas de las membranas comprimidas y no comprimidas pueden tener diferentes propiedades fsicas. La confianza generada con el empleo de fracciones purificadas de membrana como base para determinar la heterogeneidad lateral condujo a sugerir que el procedimiento de rotura y purificacin introduca artefactos y que las vesculas no corresponden a las partes de la membrana tilacoide interna de

Presin mecnica

(c

2)

C
Resellado Hinchazn

D
Mecanismo propuesto para la formacin de vesculas de membranas tilacoides fragmentadas con la parte interna hacia afuera. (Segn E. Andersson y cois. Bioc. Biop. Acta 599:392,1980.)

las cuales se asuma que eran. Estas objeciones fueron superadas cuando se demostr visualmente la localizacin de los diferentes componentes con el uso de anticuerpos marcados con oro.9'10 Utilizando esta tcnica no invasiva, los investigadores demostraron que las protenas PSII haban sido excluidas de las membranas tilacoides no comprimidas, en tanto que las protenas PSI fueron excluidas de las regiones comprimidas (fig. VE 6-5). Por lo contrario, el complejo citocromo fcg/se distribuye regularmente a todo lo largo del sistema de membranas, como se muestra en el modelo de la figura VE 6-4. La demostracin de que los dos fotosistemas estaban espacialmente separados entre s dentro de la membrana tilacoides condujo al punto de vista actual de la naturaleza dinmica de la membrana fotosinttica, en la cual los transportadores movibles, como plastoquinona y plastocianina, tienen capacidad para difundir dentro de la membrana y transportar electrones de un complejo protenico al otro. El alto grado de fluidez de la membrana tilacoide, necesario para facilitar tales movimientos laterales, se demostr al medir el coeficiente de difusin de molculas de plastoquinona marcadas con colorantes fluorescentes dentro de la bicapa de lpidos mediante la tcnica de recuperacin de la fluorescencia despus de fotoblanqueamiento (pg. 136, cap. 4).11 Se han medido coeficientes para PQ en las membranas tilacoides con cifras tan elevadas como 10~6 cm2/seg (en comparacin con 10~8 cm2/seg para los lpidos de la mayor parte de las membranas), lo que sugiere que estas membranas fotosintticas pueden ser las ms fluidas de todas las principales membranas biolgicas. En ese estudio se calcul que la distancia promedio entre PSII y el complejo citocromo bf ms prximo es de casi 73 nm. Segn el coeficiente de difusin mencionado antes, se calcul que una molcula PQ debe poder difundir casi 2 800 nm en 20

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Membranas no apiladas (estroma laminar)

Complejo PSII ATP sintasa Complejo PSI / Citocromo b6f

Membranas apiladas (grana) . Modelo revisado de la organizacin de la membrana tilacoide propuesto en 1981; los dos fotosistemas estn espacialmente separados: PSII se localiza en la regin de las membranas comprimidas y PSI en la regin de las membranas no comprimidas. (Segn J.M Anderson y B. Andersson, Trends Biochem. Sci. 7:291, 1982.)

mseg, lo que corresponde a la vida media calculada para la reduccin del citocromo b$f luego de una serie de destellos luminosos saturantes. Por lo tanto, incluso si una molcula PQ sigue un camino muy desviado para la difusin entre los dos complejos de protenas, ste debe ser capaz de hacer la conexin en el tiempo permitido. En 1977, John Bennett, de la Universidad de Warwick, en Inglaterra, hizo un descubrimiento que posteriormente demostr tener importantes implicaciones en el estudio de la mem-

brana tilacoides. Bennett incub cloroplastos iluminados en un medio que contena fosfato marcado con istopo radiactivo (32P), a continuacin extrajo las protenas de los cloroplastos y fraccion la mezcla de protenas utilizando electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio.12 Durante la incubacin varias protenas resultaron marcadas con rapidez, una de las cuales se identific como la principal protena que enlaza la clorofila a/b captadora de luz (referida como LHCII en el texto, pgina 215). Estudios subsecuentes revelaron la

(a)

(b)

Micrografas electrnicas de cortes delgados de las clulas mesfilas tilacoides del maz marcadas con anticuerpos para: a) subunidad D del centro de reaccin PSI, y b) citocromo 7-559 del centro de reaccin PSII. Los centros de reaccin PSI se localizan casi exclusivamente en los tilacoides del estroma y en las membranas terminales de los grana tilacoides, en tanto que los centros de reaccin PSII se hallan casi por completo en membranas comprimidas de los grana tilacoides. (Cortesa de O. Vaon.)

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CAPITULO 6 Fotosntesis y cloroplastos

presencia en la membrana tilacoides de una proteincinasa encargada de la fosforilacin de LHCII.13 La atencin se volvi al mecanismo de regulacin de la cinasa y la importancia de la fosforilacin de protenas captadoras de luz. Normalmente, LHCII no sufre fosforilacin cuando los cloroplastos se incuban en la oscuridad. Sin embargo, la actividad de la proteincinasa no es estrictamente dependiente de luz, debido a que se puede activar incubando cloroplastos en la oscuridad en un medio que contenga un agente fuertemente reductor, como la ferredoxina reducida.14 Estos resultados sugieren que uno de los transportadores de electrones de la cadena de fotosntesis debe estar reducido antes de que se active la proteincinasa. Varias piezas sugieren que el componente clave es la plastoquinona.revisada en 15 La plastoquinona es el aceptor terminal de electrones del centro de reaccin PSII (fig. 6-13). Sera de esperar que el fondo comn de molculas de plastoquinona de la membrana se acumule en su estado reducido (PQH2) conforme los electrones se transfieren a PQ, pero que no pasen a los subsecuentes transportadores. Podra esperarse que esta condicin ocurriera en los momentos cuando PSII est operando a un nivel ms alto que PSI, o sea, cuando la actividad de los dos fotosisternas est fuera de equilibrio. Segn los diferentes datos, se propuso que la fosforilacin de LHCII por la proteincinasa activada sirve para corregir el desequilibrio resultante de la superexcitacin de PSII en relacin con PSI. Por ejemplo, se demostr que la fosforilacin de LHCII incrementa la transferencia de energa de excitacin a PSI a expensas de PSII.16 La explicacin molecular ms simple para estos datos es que la fosforilacin disocia LHCII de PSII en los sitios donde normalmente reside de las regiones comprimidas de a membrana tilacoide, El complejo LHCII fosforilado tendra entonces que emigrar a las regiones no comprimidas de la membrana, donde se pone en estrecho contacto con PSI, y por lo tanto permite la transferencia de la energa de excitacin al centro de reaccin PST.

Esta conclusin concuerda con los resultados de los anlisis de las fracturas por congelacin, en las cuales partculas de 8.0 nm pueden representar los complejos captadores de luz que en la membrana tilacoide de los cloroplastos de guisantes se redistribuyen de las regiones comprimidas a las no comprimidas despus de la fosforilacin.17 Tambin es consistente con el dato de que las protenas captadoras de luz en las fracciones de membrana aisladas de las regiones no comprimidas estn 10 veces ms intensamente fosforiladas que las mismas protenas en las regiones comprimidas.18 Las regiones comprimidas de la membrana son sitios donde las protenas de las membranas adyacentes entran en estrecho contacto entre s. La fosforilacin de as protenas captadoras de luz aadira cargas negativas a la superficie de la protena, lo que puede causar que la protena experimente repulsin electrosttica por parte de las protenas vecinas. Este tipo de repulsin fue sugerido como la mayor fuerza que aparta el LHCII fosforilado de las porciones comprimidas del tilacoide.19'20 Estudios subsecuentes indican que en la mayor parte de las situaciones slo la reserva exterior de LHCII que contiene los pofipptidos rpidamente fosforilados se desplaza al interior del estroma tilacoide despus de la fosforilacin, dejando que la reserva interna de protenas LHCII permanezca con PSII.21 El desplazamiento de los complejos LHCII de una parte del tilacoide a la otra puede desempear varas funciones en la fotosntesis, adems de corregir el desequilibrio entre los dos fotosisternas. Por ejemplo, casi todo el dao al aparato de fotosntesis causado por luz de alta intensidad lo experimenta PSII (pg. 228). Puesto que la exposicin a luz brillante conduce a la fosforilacin de LHCII y a separarlo de PSII, este fenmeno podra limitar el dao a PSII por sobreexcitacin. La migracin de LHCII tambin puede servir para regular el equilibrio entre la fosforilacin cclica y la no cclica. Algunos de los primeros estudios indicaron que la proteincinasa tilacoide tambin es sensible a la proporcin NADP+/NADPH del cloroplasto.

SINOPSIS
Se presume que las primeras formas de vida fueron heterotrofos que dependan de molculas orgnicas formadas por procesos abiticos; con el tiempo, estas formas fueron superadas por autotrofos, organismos capaces de sobrevivir con CC>2 como fuente principal de carbono. Se cree que los primeros autotrofos efectuaban fotosntesis no oxignica en la cual compuestos como H2S eran oxidados como fuente de electrones. La evolucin de la fotosntesis oxignica, en la cual se oxida agua y se libera 2, permiti a las cianobacterias aprovechar un nmero mucho mayor de habitat y preparar el escenario para la respiracin aerobia (p. 207). Los cloroplastos son organelos grandes enlazados a membrana que tal vez evolucionaron a partir de procariotes fotosintticos que contenan un sistema interno de membranas tilacoides, el cual aloja al mecanismo fotosinttico. Los cloroplastos estn enlazados por una doble membrana porosa gracias a la inclusin de porinas en la bicapa de lpidos. Los tilacoides son sacos membranosos aplanados dispuestos en filas ordenadas o grana. Los tilacoides estn rodeados por un estroma fluido que contiene DNA, ribosomas y el mecanismo requerido para la expresin del gen (p. 208). Las reacciones dependientes de luz de la fotosntesis empiezan con la absorcin de fotones por los pigmentos fotosintticos, suceso que impulsa los electrones a los orbitales externos, desde los cuales pueden ser referidos a un aceptor de electrones. Los principales pigmentos que absorben luz en las plantas son las clorofilas y los carotenoides. Cada molcula de clorofila consta de un anillo de porfirina que contiene Mg2+ que acta en la absorcin de la luz, y una cola hidrocarbonada (un fitol) que conserva el pigmento integrado a la bicapa. La clorofila absorbe con mayor intensidad en la regin azul y roja del espectro visible y con menor fuerza en la regin verde. Las

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Conforme esta proporcin disminuye y la concentracin relativa de NADPH aumenta, se reduce la necesidad de transporte no cclico de electrones. Sera de esperar que la fosforilacin de LHCII concentre ms energa de excitacin .en PSI, la cual podra utilizarse para estimular la fosforilacin cclica, proceso que permite al cloroplasto seguir produciendo ATP sin formacin de NADPH adicional. BIBLIOGRAFA 1. Jacobi, G. y Lehmann, H. 1969. Photochemkal activity of chloroplast fragments, en Prog. Phoiosyn. Res., vol. 2, H. Metzner, ed., p. 159-173. 2. Goodchild, D.J. y Park, R.B. 1971. Further evidence for stroma lamellae as a source of Photosystem 1 fractions from spinach chloroplasts. Bioch. Eiop. Acta 226:393-399. 3. Arntzen, C.J. y cois. 1972. Photochemical activity and structural studies of photoxystems derived from chloroplast grana and stroma lamellae. Bioch. Eiop. Acta. 256:85-107. 4. Staehein, L.A. 1976. Reversible particle movements associated with unstacking and restacking of chloroplast membranes in vitro. /. Cell Biol. 71:136-158. 5. Andersson, B., Sundby, C. y Albertson, P.-A. 1980. A mechanism for the formation of inside-out vesicles. Bioch. Biop. Acta 599:391402. 6. Andersson, B. y Anderson, J.M. 1980. Lateral heterogenity in the distribution of chlorophyll-protein complexes of the thylakoid membranes of spinach chloroplasts. Bioch. Biop. Acta 593:427-440. 7. Cox, R.P. y Andersson B. 1981. Lateral and transverse organization of cytochromes in the chloroplast thylakoid membranes. Bioch. Biop. Res. Comm. 103:1336-1342. 8. Gounaris, K. y cois. 1983. Lateral heterogeneity of polar ipids in the thylakoid membranes of spinach chloroplasts. FEBS Lett. 156:170-174. 9. Allred, D. y Staehein, L.A. 1985. Lateral distribution of the cytochrome b$f and coupling factor ATP synthetase complexes of chloroplast thylakoid. Pla Physiol. 78:199-202.

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longitudes de onda especficas que absorbe una molcula dependen de los polipptidos con los cuales est relacionada y las propiedades fsicas de la bicapa. Los carotenoides absorben con mayor intensidad en la regin azul y verde y con menor intensidad en la roja y naranja. El espectro de accin de la fotosntesis, que proporciona una medida de la longitud de onda capaz de estimular la fotosntesis, sigue muy estrechamente el espectro de absorcin de los pigmentos. Los pigmentos fotosintticos se organizan en unidades funcionates en las cuales slo una molcula, el centro de reaccin de la clorofila, tiene capacidad para transferir electrones a un aceptor de los mismos. La masa de las molculas de pigmento forma un sistema antena captador de luz que atrapa fotones de diferentes longitudes de onda y transfiere la energa de excitacin de la molcula del pigmento al centro de reaccin (p. 211). La transferencia de un par de electrones de H2O a NADP+ en condiciones estndar requiere el ingreso de cuando menos 52.6 kcal por mol, que es ms energa de la que un mol de

fotones puede suministrar. El impulso energtico necesario se logra mediante dos fotosistemas separados, cada uno de los cuales impulsa la energa de los electrones una parte del camino para rebasar fa cuesta energtica. El fotosistema II (PSII) impulsa los electrones desde un nivel de energa ms bajo que el del agua hasta el punto medio, donde el fotosistema I (PSI) eleva los electrones hasta el tope, por arriba de NADP+. Conforme los fotones se absorben en cada fotosistema, la energa pasa a los pigmentos en el centro de reaccin respectivo (P680 para PSII y P700 para PSI). La energa absorbida por la clorofila del centro de reaccin sirve para impulsar un electrn hacia un orbital externo, donde puede transferirse a un aceptor primario, produciendo un pigmento con carga positiva (P680+ yP700+)fp. 235). La va no cclica de flujo de electrones del agua a PSII y luego a PSI y NADP+ se denota por medio de una Z. La primera rama de la Z va de H2 a PSII. La mayor parte de los pigmentos antena que recolectan luz para PSII residen dentro

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CAPITULO 6 Fotosntesis y cloroplastos

de un complejo separado, denominado LHCII. La energa fluye de LHCII hacia el centro de reaccin PSII, donde se transfiere un electrn P680 a un aceptor primario, una molcula de feofitina similar a clorofila. Esta transferencia de electrones genera un agente fuertemente oxidante (P680+) y un agente dbilmente reductor (Feo~). La separacin de cargas en PSII se estabiliza separando molculas con carga opuesta; esto se logra conforme se transfieren electrones de feofitina a la quinona QA y luego a QB- La absorcin sucesiva de dos fotones por PSII conduce a la transferencia de dos electrones a Qg para formar Qs2~, que entonces capta dos protones del estroma formando QgH2 (la cual se reduce verdaderamente a plastoquinona). La plastoquinona reducida abandona el centro de reaccin y es sustituida por una plastoquinona oxidada capaz de recibir electrones adicionales. El movimiento de electrones a travs del centro de reaccin PSII sigue una va similar a la que se observa en el centro de reaccin de las bacterias prpura no azufradas cuya estructura cristalina ya se ha determinado. Conforme cada electrn se transfiere desde P680 al aceptor primario y de all a QB, el agujero en el pigmento del centro de reaccin con carga positiva (P680+) se llena con un electrn procedente de un residuo tirosina especfico (Tirz). Tirz, a su vez, recibe electrones, uno cada vez, de una protena que contiene cuatro iones manganeso. Conforme cada electrn se transfiere a Tirz, la protena que contiene Mn acumula una carga positiva. Una vez que la protena acumula cuatro cargas positivas tiene capacidad para eliminar cuatro electrones del agua, una reaccin que genera C>2 y suministra cuatro H + a la luz tilacoide, que contribuye al gradiente de protones (p. 216). Los electrones de la plastoquinona reducida se transfieren al complejo citocromo multiprotenico b{/, en tanto que los protones son liberados a la luz tilacoide y por lo tanto contribuyen al gradiente de protones. Los electrones procedentes de citocromo b$f pasan a la plastocianina localizada en el lado luminal de la membrana tilacoide y a P700+, el pigmento del centro de reaccin PSI que ha perdido un electrn luego de absorber un fotn. Conforme se absorbe cada fotn en P700 el electrn se transfiere a un aceptor primario QA y luego a travs de varios centros de hierro y azufre del centro de reaccin PSI a la ferredoxina. Los electrones se transfieren de la ferredoxina a NADP+ formando NADPH, que requiere un protn del estroma, contribuyendo al gradiente de protones. En resumen, el flujo no cclico de electrones produce la oxidacin de H2 a C>2 con transferencia de electrones a NADP+, formando NADPH y estableciendo un gradiente de H + a travs de la membrana El gradiente de protones establecido durante las reacciones dependientes de luz proporciona la energa requerida para formar ATP en el cloroplasto, proceso denominado fotofosforilacin. El mecanismo para la sntesis de ATP en el cloroplasto es prcticamente idntico al de la mitocondria; la ATP sintasa consta de una pieza cabeza CFi que se proyecta dentro del estrorna y una pieza basal CFo integrada a la membrana tilacoide. Los protones efectan la sntesis de ATP a medida que se desplazan a los sitios de mayor concentracin de la luz tilacoide por medio de la ATP sintasa y en el interior del estroma, en donde disipan el gradiente H + . La sntesis de ATP puede ocurrir en ausencia de oxidacin de H^O por medio de

un proceso de fosforilacin cclica que no implica PSII. La luz es absorbida por P700 de PSI, pasa a la ferredoxina y retorna al centro de reaccin PSI deficiente en electrones a travs del citocromo bf. Conforme los electrones se mueven en la va cclica, los protones se translocan a la luz tilacoide y posteriormente sintetizan ATP (p. 221). Durante las reacciones independientes de luz, la energa qumica almacenada en NADPH y ATP se emplea para la sntesis de carbohidratos a partir de C2. El CC2 se convierte en carbohidratos en la va Cs (o ciclo de Calvin), en la cual se fija CC>2 por medio de la RuBP carboxilasa {Rubisco) a un compuesto RuBP de cinco carbonos, formando un intermediario inestable de seis carbonos que se separa en dos molculas de cido 3-fosfoglicrico. NADPH y ADP se emplean para convertir molculas PGA a glicer al debido 3-fosfato (GAP). Por cada seis molculas de CC>2 fijadas se pueden orientar dos molculas de GAP a la formacin de sacarosa o de almidn, en tanto que as 10 molculas restantes de GAP pueden utilizarse para generar RuBP para un ciclo adicional de fijacin de COj (p. 223). Rubisco tambin puede catalizar una reaccin en la cual O^ en vez de CO^ se une a RuBP en forma covalente. Este proceso, que se denomina fotorrespiracin, conduce a la formacin de compuestos rnetabolizados en reacciones en las cuales se pierde C2- Puesto que la fotorrespiracin implica captacin de C>2 y liberacin de C2, representa un desperdicio de la energa de la planta. La tasa de fotorrespiracin en comparacin con la fijacin de CC>2 depende de la proporcin CC>2/ C*2 establecida por Rubisco. Dos grupos de plantas, denominadas plantas C4 y MAC, poseen mecanismos que aumentan esta proporcin \p. 225). Las plantas 4 y MAC poseen una enzima adicional fijadora de C2 denominada PEP carboxilasa, capaz de operar con concentraciones muy bajas de C2- Las plantas C4 poseen hojas de estructura nica que contienen un cilindro externo de clulas mesfilas y un cilindro interno de haces de clulas envainadas selladas a los gases atmosfricos. La PEP carboxilasa opera en las clulas mesfilas, donde se fija CC>2 al compuesto de tres carbonos fosfoenolpiruvato (PEP) para formar un cido de cuatro carbonos, el cual se transporta a los haces envainados donde se descarboxila. El CC>2 liberado en el haz envainado se acumula en concentracin elevada favoreciendo la fijacin de CC>2 a RuBP y la formacin de PGA y de GAP por medio del ciclo de Calvin. Las plantas MAC efectan reacciones dependientes de luz e independientes de la misma en diferentes horas del da. Las plantas mantienen estrechamente cerrados sus estomas durante las horas calientes y secas del da, lo que evita la prdida de agua. A continuacin, durante la noche, abren sus estomas y fijan C2 por medio de la PEP carboxilasa. El cido mlico producido en estas reacciones se almacena en la vacuola hasta las horas del da cuando el compuesto se desplaza de nuevo al cloroplasto. All cede su C2, que puede entonces fijarse por Rubisco en condiciones de baja concentracin de C>2 y convertirse a carbohidrato usando ATP y NADPH generados por las reacciones dependientes de luz (p. 2;

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PREGUNTAS DE REPASO
1. Describir el efecto que se cree que tuvo la aparicin de cianobacterias en el metabolismo de los organismos. 2. En qu son similares la fotosntesis no oxignica que emplea 2S como fuente de electrones y la fotosntesis oxignica que utiliza H2O como fuente de electrones? En qu son diferentes? 3. Describir la organizacin de las membranas del cloroplasto, incluyendo la disposicin de la ATP sintasa. En qu difiere esta organizacin de la observada en las rm'tocondrias? 4. Cmo puede una clula vegetal emplear electrones de baja energa procedentes del agua para reducir NADP+? 5. En trminos generales, en qu difieren las reacciones independientes de luz de las reacciones dependientes de luz? Cules son los productos primarios de los dos grupos de reacciones? 6. Cmo se compara el centro de reaccin de una bacteria prpura no azufrosa R. viridis con el centro de reaccin fotosinttico del cloroplasto de una planta? 7. Cul es la relacin entre el contenido energtico de un fotn y la longitud de onda de la luz? De qu manera determina la longitud de onda de la luz si puede o no estimular la fotosntesis? Cules son algunos de los factores que determinan las propiedades de absorbancia de la molcula de clorofila? Cmo determinan las propiedades de absorbancia de los pigmentos fotosintticos la direccin en la cual se transfiere la energa de excitacin dentro de una unidad de fotosntesis? 8. Cul es el papel de los pigmentos antena que captan luz en la fotosntesis? 9. Cul es la diferencia entre un espectro de absorcin y un espectro de accin? 10. Describir la secuencia de acontecimientos que ocurren despus de la absorcin de un fotn por el pigmento del centro de reaccin del fotosistema II. Describir los sucesos comparables en el fotosistema I. Cmo se enlazan los dos fotosis temas entre s? 11. Describir la diferencia de los potenciales redox de los pigmentos del centro de reaccin de los dos fotosistemas. 12. Describir el proceso mediante el cual se separa el agua durante la fotolisis. Cuntos fotones debe absorber PSII para que esto ocurra? 13. Cules son los pasos en las reacciones dependientes de luz encargadas de generar un gradiente electroqumico de protones a travs de la membrana tilacoide? En qu grado este gradiente se refleja en el gradiente de pH en comparacin con el voltaje? Cmo puede el gradiente de protones conducir a la formacin de ATP? 14. Describir el plan bsico del ciclo de Calvin, indicando las reacciones que requieren ingreso de energa. Por qu se decribe como ciclo? Por qu se tiene que conseguir energa en este tipo de va? Cules son los productos finales de la va? 15. Describir las principales diferencias estructurales y bioqumicas entre las plantas Cs y las plantas C,}. Cmo afectan estas diferencias la capacidad de estos dos tipos de plantas para crecer en climas secos y calientes?

PREGUNTAS ANALTICAS
1. Cul de los dos fotosistemas opera con el potencial redox ms negativo? Cul genera el agente reductor ms fuerte? Cul debe absorber cuatro protones durante cada vuelta de la fosforilacin no cclica? 2. Qu tipo de plantas (Cg, C4 o MAC) esperara usted que funcionen mejor si se exponen a luz diurna continua bajo condiciones de calor y sequedad? 3. De las siguientes sustancias: PQH2, citocromo reducido b, ferredoxina reducida, NADP+, NADPH, O2, H2O, Tirz+, cul es el agente reductor ms fuerte?; cul es el agente oxidante ms fuerte?; cul tiene mayor afinidad por electrones?; cul posee los electrones ms energticos? 4. Supongamos que se desea aadir el desacoplador dinitrofenol (DNF) a una preparacin de cloroplastos que efectan la fotosntesis. Cul de las siguientes actividades esperaramos que fuera afectada? 1) Absorcin de luz; 2) fosforilacin cclica; 3) transporte de electrones entre PSII y PSI; 4) fotofosforilacin no cclica; 5) sntesis de PGA; 6) reduccin de NADP+. 5. Calcular la fuerza motriz de protones que se formara a travs de la membrana tilacoide para mantener una diferencia de 10 000 veces la [H+] sin diferencia de potencial elctrico. (La ecuacin para la fuerza motriz de protones se encuentra en la pgina 191.) 6. En qu condiciones se esperara que una planta participara ms intensamente en la fotofosforilacin cclica? 7. Contrastar el cambio de pH del medio que ocurre cuando cloroplastos aislados efectan la fotosntesis en comparacin con mitocondrias aisladas que efectan respiracin aerobia. 8. En e captulo precedente se hizo notar que la mayor parte de la fuerza motriz en las mitocondrias se expresa como voltaje. Por lo contrario, la fuerza motriz de protones generada durante la fotosntesis se expresa casi exclusivamente como gradiente de pH. Cmo se pueden explicar estas diferencias? 9. Cmo se comparan !as propiedades redox de los centros de reaccin de una bacteria prpura no azufrosa con los de una planta PSII? 10. Estara usted de acuerdo en que una planta Cs tenga que gastar ms energa por C2 convertido a carbohidrato en comparacin con una planta C-4? Por qu s o por qu no? 11. En la fotosntesis, la captura de energa luminosa da como resultado liberacin y subsecuente transferencia de elec-

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CAPITULO 6 Fotosntesis y doroplastos 13. Si feofitina y AQ {una molcula de clorofila a) son aceprores primarios de electrones en PSII y PSI, respectivamente, cules son los donadores primarios de electrones de cada fotosistema? 14. Contrastar el papel de tres diferentes tomos metlicos en las reacciones fotodependientes de la fotosntesis. 15. Sera de esperar que el efecto invernadero (incremento del contenido de CC>2 de la atmsfera) tuviera mayor efecto en las plantas C4 o en las plantas Cj? Por qu?

trones. De qu molcula se derivan originalmente los electrones? En qu molculas residen finalmente dichos electrones? 12. Cuntas molculas de ATP y NADPH se requieren en la va Cs para sintetizar un azcar de seis carbonos? Si la sntesis de una molcula de ATP requiriera tres protones, esperara usted que este requerimiento relativo para ATP y NADPH pudiera satisfacerse por fotofosforilacin no cclica en ausencia de fotofosforilacin cclica?

BIBLIOGRAFA
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CAPITULO

Interacciones entre las clulas y su entorno

7-1 El espacio extracelular 7-2 Adherencia de clulas a sustratos no celulares 7-3 Adherencia de clulas a otras clulas La perspectiva humana: Papel de la adherencia celular en la inflamacin y la metstasis 7-4 Uniones hermticas: sellado del espacio extracelular 7-5 Uniones de abertura y plasmodesmosomas: mediacin de la comunicacin celular 7-6 Paredes celulares La va experimental: Papel de las uniones de abertura en la comunicacin intercelular

unque la frontera entre una clula viviente y su entorno no viviente es la membrana plasmtica, los materiales presentes por fuera de dicha membrana desempean un papel muy importante en la vida de la clula. En un animal o planta multicelulares, la mayor parte de las clulas se organizan en tejidos claramente definidos cuyas clulas componentes mantienen una relacin predecible entre s y con los materiales extracelulares situados entre las clulas. Aun clulas sin relacin fija dentro de un tejido slido, como los leucocitos de la sangre que viajan por todo el cuerpo, deben interacruar de manera muy especfica con otras clulas y los materiales extracelulares con los cuales se ponen en contacto. Estas interacciones regulan actividades tan diversas como migracin celular, crecimiento y diferenciacin de la clula, y organizacin tridimensional de los tejidos y rganos que aparecen durante el desarrollo embrionario. Este captulo se refiere principalmente al entorno extracelular y las diferentes interacciones en las que participan las clulas.

7-1 El espacio extracelular

FIGURA 7-A. Fibroblasto de piel humana teido y cultivado con anticuerpos contra fibronectina (mostrados en rojo). El ncleo est teido con colorante azul que se enlaza a DNA. Se observa la fibronectina localizada en el citoplasma, donde se sintetiza, y en el espacio extracelular, donde aparece ms difusa. (Segn Nancy Kedersha, Immunogen.)

Desplazndose hacia afuera de la membrana plasmtica se pueden examinar los elementos extracelulares que rodean los diferentes tipos de clulas. En captulos previos se hizo notar que casi todas las protenas integrales de membrana, y tambin los lpidos, poseen cadenas cortas de azcares
239

240

CAPITULO 7 Interacciones entre las clulas y su entorno

proyectadas hacia afuera de la membrana plasmtica (fig. 4-4). Estos carbohidratados forman parte de una capa ntimamente aplicada sobre la superficie exterior de la membrana plasmtica denominada glucocliz (o cubierta celular) (fig. 7-1, a). Adems de los carbohidratos de la membrana, el glucocliz por lo general contiene otros materiales extracelulares secretados por la clula hacia el espacio externo, donde permanecen ntimamente relacionados con la superficie celular. Este material extracelular es muy prominente en algunos tipos de clulas, como las epiteliales que revisten el conducto digestivo de los mamferos (fig. 7-1, b). Adems de desempear un papel clave en las interacciones clula-clula y clula-sustrato, el glucocliz puede suministrar proteccin mecnica a la clula y servir como barrera contra las partculas que llegan hasta la membrana plasmtica.

GC

(a)

0.5 Jim

Muchos tipos de clulas contienen una matriz extracelular (MEC), red organizada de materiales extracelulares que se halla ms lejos de la vecindad inmediata de la membrana plasmtica. A veces, la matriz extracelular consta de una mezcla amorfa mal definida de protenas y polisacridos, como se puede observar en el espacio extracelular del tejido conectivo laxo, o puede tomar la forma de una estructura distinta cuyo contorno puede observarse con el microscopio de luz (fig. 7-2). La MEC es algo ms que un material pasivo protector inerte; puede desempear un papel clave en la morfologa y actividades de la clula. Por ejemplo, la digestin enzimtca de la MEC que rodea clulas cultivadas de cartlago o clulas epiteliales de la glndula mamaria provoca notable disminucin de la actividad secretoria y de sntesis de las clulas. Si se aade otra vez al cultivo el material de la matriz extracelular se restablece e! estado de diferenciacin celular y la capacidad para producir los productos habituales. Una de las matrices extracelulares mejor definida es la membrana basal (o lmina basal), capa engrosada de unos 50 a 200 nm que rodea a las clulas musculares y adiposas y que cubre la superficie basal de tejidos epiteliales, como la piel (fig. 7-3, a), el revestimiento interno de los conductos digestivo y respiratorio, y de los vasos sanguneos. Se piensa que la membrana basal puede participar en el mantenimiento de la polaridad de las clulas epiteliales; en definir la va de migracin celular; en separar tejidos adyacentes, ayudando as a compartamentalizar un rgano en desarrollo, y en actuar como barrera al paso de las macromolculas. En esta ltima funcin, la membrana basal desempea un papel importante al evitar que las protenas salgan de la sangre cuando fluyen a travs de los poros de las paredes

(b)
FIGl'RA 7 - 1 El glucocliz. a) Superficie basa] de una clula ectodrmica de un embrin de pollo en sus primeras etapas. Se pueden distinguir dos estructuras distintas ntimamente aplicadas a la superficie externa de la clula; un glucocliz interno (GC) y una lmina basal (LB) externa (o membrana basal). El glucocliz incluye las porciones carbohidrato de las protenas y lpidos de la membrana, en tanto que la membrana basal es una estructura extracelular organizada distinta de la membrana celular, b) Micrografa electrnica de la superficie apical de una clula epitelial del revestimiento del intestino que muestra el glucocliz, que se ha teido con la protena ferritina que contiene hierro, (a: Segn A. Martinez-Paiomo, Int. Rev. Cytol. 29:64, 1970; b: segn S. Ito y D.W. Fawcett/Photo Researchers.)

FIGURA 7-2. Determinacin experimental del espesor de la matriz extracelular. Cuando se desarrollan en cultivo clulas cartilaginosas (condrocitos), producen una matriz extracelular cuyo contorno se puede observar aadiendo una suspensin de pequeas partculas, como eritrocitos fijos, como aqu se muestra. Lo extenso de la matriz extracelular que rodea a cada clula se puede medir por el espesor del espacio que queda sin penetrar por la partcula (cabeza de la flecha). La barra representa 10 /m. (Cortesa de Greta M. Lee, Brian Johnstone, Ken Jacobson y Bruce Caterson.)

CAPITULO 7

241

estroma de Ja crnea. En estos tejidos, las clulas que secretan la MEC slo equivalen a una fraccin del volumen tisular. La matriz extracelular, ms bien que las propias clulas, es la que confiere a estos tejidos sus propiedades identificables: dureza para la matriz sea, resistencia y flexibilidad para la matriz del cartlago, resistencia a la tensin para la matriz del tendn y transparencia para la matriz del estroma corneal. Aunque la matriz extracelular puede adoptar diferentes formas en diversos tejidos y organismos, los materiales que constituyen la MEC pertenecen a un nmero relativamente pequeo de familias moleculares; cada una de dichas familias puede contener varias molculas relacionadas. Iniciaremos aqu con una de las molculas ms importantes y ubicuas de la MEC, la glucoprotena colgena.

Colgena
Las colgenas son una familia de glucoprotenas fibrosas que forman parte exclusivamente de matrices extracelulares a las que confieren sus propiedades funcionales. Se observan en todo el reino animal y son notables por su alta resistencia a la tensin, que puede medirse como resistencia a fuerzas de traccin. Las colgenas constituyen la protena simple ms abundante en el cuerpo humano (ms de 25% de toda la protena), hecho que refleja la importancia y amplia distribucin de las matrices extracelulares. La colgena se produce principalmente en los fibroblastos, clulas presentes en diferentes tipos de tejidos conectivos y en clulas epiteliales. Hasta ahora se han identificado ms de 15 tipos distintos de colgena, algunos descritos en el cuadro 7-1. Cada tipo de colgena se restringe a un sitio particular dentro del cuerpo, pero a menudo hay dos o ms diferentes tipos reunidos en la misma MEC. Aunque hay grandes diferencias entre los miembros de la familia de la colgena, todos comparten ciertas caractersticas estructurales importantes. Toda molcula de colgena es un trmero que consta de tres cadenas de polipptidos denominadas cadenas a (fig. 2-33, a). Algunos tipos de molculas de colgena contienen tres cadenas a idnticas, en tanto que otros son heterotrmeros que contienen dos o tres cadenas diferentes. Por ejemplo, una molcula de colgena tipo I consta de dos cadenas al(I) y una cadena a2(II). Cuando menos en una parte de su longitud, las tres cadenas de polipptidos que forman una molcula de colgena se enredan sobre s mismas formando una triple hlice caracterstica (estudiada en la pgina 57). Numerosas colgenas, incluyendo los tipos I, II y III, se describen como colgenas fibrares debido a que se ensamblan en fibrillas semejantes a cables, que a su vez se ensamblan a fibras ms gruesas, de ordinario lo bastante grandes para observarlas con el microscopio de luz. En la figura 2-33, b, se muestra el empaque lado a lado de las filas de molculas de colgena I dentro de una fibrilla de colgena. Las molculas individuales de colgena no se alinean al mismo nivel en una fibrilla, sino que se escalonan ms o menos a la altura de la cuarta parte de la longitud de sus vecinas. Esta disposicin escalonada de las molculas componentes incrementa la resistencia mecnica del complejo y

FIGURA 7-3. La membrana basal (lmina basal). a) Gammagrafa electrnica de piel humana. La epidermis se ha separado de una parte de la membrana basal, que se puede observar por debajo de las clulas epidrmicas, b) Una membrana basal de espesor poco comn se forma entre los vasos sanguneos del glomrulo y el extremo proximal de los tbulos renales del rion. Esta capa extracelular desempea un papel importante para filtrar el lquido expulsado de los capilares haca el interior de los tbulos renales durante la formacin de orina. Los puntos negros dentro de la membrana basal glomerular (MBG) son partculas de oro fijas en los anticuerpos enlazados a molculas de colgena IV en la membrana basal (LC, luz capilar; P, podocito del tbulo). La barra representa 0.5/m. (a: Cortesa de K. Hollbrook; b: segn Michael Desjardins y M. Bendayan, J. Cell Biol. 113:695, 1991; con autorizacin de Rockefeller University Press.)

capilares. Esto tiene particular importancia en el rion, donde la sangre se filtra a travs de la doble membrana basal que separa los capilares del glomrulo de las paredes del tbulo renal (fig. 7-3, b). En la diabetes prolongada, la insuficiencia renal puede producir engrasamiento anormal de la membrana basal que rodea al glomrulo. La membrana basal tambin sirve como barrera contra la invasin de tejidos por clulas cancerosas errantes. Las matrices extracelulares ms extensas se observan en tejidos conectivos como cartlago, hueso, tendones y el

242

CAPITULO 7 interneciones entre as clulas y sw entorno CUADRO 7-1. Tipos de colgena Tipo Cadenas al(I), a2{I) al(II)
Cfl(IIl)

Estructura Fibrilar Fibrilar Fibrilar No fibrilar Fibrilar Fibrilar No fibrilar ? ? ? Fibrilar ?

Localizaran Piel, tendn, hueso, etc. Cartlago, humor vitreo Piel, msculo, etc. Todas las membranas bsales La mayor parte de los tejidos intersticiales La mayor parte de los tejidos intersticiales Fijacin de fibrillas Algunas clulas endoteliales Cartlago Cartlago hipertrfico y en etapa de mineralizacin Cartlago Piel, tendn

I
II III
IV V VI VII VIII IX X XI XII

al (IV), a2(IV) al(V), a2(V), o3(V) al(VI), a2(VI), a3{VI) l(VII) al (VIII) al(IX), a2(IX), a3(IX) al(X) trl(XI), a2(XI), a3(XI) al (XII)

Segn K. Kuhn, en R. Mayne y R.E. Burgeson, eds. Stmcture and Function o/Collagen Types, Academic Press, 1987, p. 2.

produce los patrones de banda caractersticos de las fibrillas de colgena (fig. 2-33, c). Las fibrillas aumentan todava ms su resistencia mediante uniones covalentes transversales formadas entre lisina e hidroxilisina de molculas adyacentes de colgena. Cuando se rompen estos enlaces intermoleculares cruzados, como a veces ocurre en animales que ingieren /3-aminopropionitrilo, una sustancia txica presente en semillas de chcharos dulces, el tejido conectivo puede debilitarse mucho. Entre los diferentes componentes de la MEC, las molculas de colgena proporcionan el armazn insoluole que determina muchas de las propiedades mecnicas de la matriz. En realidad, las propiedades de un tejido particular con frecuencia se pueden correlacionar con la organizacin tridimensional de sus molculas de colgena. Por ejemplo, los tendones, que conectan los msculos a los huesos, deben resistir tremendas fuerzas de traccin durante los momentos de la contraccin muscular. Los tendones contienen una MEC en que las fibras de colgena se alinean paralelas al'eje mayor del tendn, y por lo tanto paralelas a la direccin de las fuerzas de traccin. La crnea tambin es un tejido notable; debe servir como capa protectora durable en la superficie del globo ocular, pero tambin ser transparente para permitir el paso de la luz a travs del cristalino en direccin a la retina. La gruesa capa media de la crnea es el estroma, que contiene fibrillas de colgena relativamente cortas organizadas en distintas capas. La estructura en capas del estroma es similar a la corteza de un rbol; las fibrillas de cada capa son paralelas a las otras fibrillas de la misma capa, pero perpendiculares a las fibrillas de las capas situadas en ambos lados (fig. 7-4). Esta estructura parecida a la corteza de un rbol suministra resistencia a este delicado tejido, en tanto que la uniformidad de tamao y la disposicin de las fibras favorece la transparencia del tejido. No todas las colgenas forman fibrillas. Una de las colgenas no fibrilares es el tipo IV, cuya distribucin se restringe a las membranas bsales (pg. 240). Las membranas bsales son lminas de apoyo muy delgadas y las molcu-

las de colgena tipo IV se organizan formando una red aplanada que sirve como estructura para el depsito de otros materiales extracelulares. A diferencia de la colgena I, que consta de una triple hlice larga ininterrumpida, los trmeros de la colgena IV contienen segmentos no helicoidales interpuestos a lo largo de la molcula y de los dominios globulares en cada extremo. Los segmentos no helicoidales confieren a la molcula flexibilidad, en tanto que los extremos globulares sirven como sitios de interaccin entre molculas que dan al complejo su carcter tipo reticular (fig. 7-5). Proteoglicanos Adems de la colgena, las matrices extracelulares tpicamente contienen una gran cantidad de un tipo distintivo de

1 pm

FKURA 7-4. Estroma corneal. Consta principalmente de capas de fibras de colgena en las cuales las molculas de capas alternas se disponen en ngulos rectos entre s, lo que recuerda la estructura de la madera laminada (triplay). (Cortesa de M. Takus.)

CAPITULO 7 Interacciones entre !as clulas y su entorno

243

50 nm

FIGURA 7-5. Red de colgena tipo IV de la membrana basal. Mkrografa electrnica de una membrana basal del tejido amntico humano extrado mediante una serie de soluciones salinas para eliminar los materiales no colagenosos. El tratamiento deja una red poligonal muy ramificada de fibras que forman una estructura irregular. Las pruebas indican que esta estructura consta de molculas de colgena tipo IV entrelazadas en disposicin tridimensional compleja. En la figura 7-11 se muestra un modelo del armazn de la membrana basal. (Segn Peter D. Yurchenco y George C. Rubn,}. Cell Biol. 105:2561,1987; por Tw Rockefeller University Press.)

complejo proteinicopolisacrido denominado proteoglicano. Un proteoglicano (fig. 7-6, a) consta de una molcula protenica central a la cual se unen cadenas de glucosaminglicanos (GAG) (mostradas en rojo en la figura). Cada cadena de glucosaminglicano se compone de un disacrido repetitivo; o sea, posee una estructura A-B-A-B-A, donde A y B representan dos azcares diferentes. Los GAG son muy cidos debido a la presencia de grupos sulfato y carboxilo unidos a los anillos de los azcares (fig. 7-6, b). El papel de la colgena y de los proteoglicanos en la estructura y funcin de la matriz extracelular se puede ilustrar en el tejido cartilaginoso. El cartlago consta principalmente de una matriz extracelular secretada por condrocitos vivientes que quedan aprisionados en sus propias secreciones (fig. 7-7, a). Las molculas de colgena forman fibrillas distintas, en tanto que los proteoglicanos constituyen un material amorfo a su alrededor que llena el espacio extracelular (fig. 7-7, b,c). Los proteoglicanos de la matriz cartilaginosa estn ensamblados en un complejo gigantesco por la unin de las protenas centrales a una molcula de cido hialurnico, un GAG no sulfatado (fig. 7-6, b). En la figura 7-6, c, se muestra el aspecto microscpico de uno de estos complejos que puede ocupar un volumen equivalente a una clula bacteriana. Debido a las cargas negativas generadas sobre los GAG, los proteoglicanos pueden enlazarse a numerosos cationes,

que a su vez arrastran abundantes molculas de agua. Como resultado, los proteoglicanos forman un gel poroso hidratado que acta como "material de empaque" para resistir fuerzas de compresin (aplastamiento). Esta propiedad complementa a la de las molculas adyacentes de colgena que resisten fuerzas de traccin, y suministran un bastidor de apoyo para los proteoglicanos. En conjunto, colgenas y proteoglicanos suministran al cartlago, y a otras matrices extracelulares, fuerza y resistencia a la deformacin. (Se puede obtener una "sensacin" de las propiedades mecnicas del cartlago comprimindose una oreja o el puente de la nariz.) La matriz extracelular del hueso tambin se compone de colgena y proteoglicanos, pero se endurece por impregnacin de sales de fosfato de calcio. Una familia de proteoglicanos, los hepamn sulfato proteoglicanos (HSPG), adems de ser el principal componente de la MEC, tambin desempean algunas funciones en la superficie celular (fig. 7-8, a). Los miembros de esta familia incluyen sindecanos, betaglicanos y el CD44. La protena central de estos proteoglicanos rodea la membrana plasmtica, en tanto que los GAG se unen al dominio extracelular de la protena (fig. 7-8, &). Se cree que el dominio citoplsmico de la protena central interacta con el citoesqueleto, y que el dominio extracelular (particularmente el GAG unido a ese extremo de la protena} interacta con varias protenas de la MEC. Adems de fijar las clulas a la MEC, el dominio extracelular del HSPG puede enlazarse a una gran variedad de molculas difusibles, incluyendo enzimas y factores de crecimiento (fig. 7-8, b). El HSPG es uno de los diferentes tipos de macromolculas que forman un puente entre los medios externo e interno de la clula. Como tal, esta molcula se encuentra en posicin ideal para transmitir seales a travs de la membrana plasmtica. Dichas seales pueden influir en muchos aspectos de la conducta de la clula, incluyendo cambios en la morfologa celular, motilidad, adherencia, crecimiento y diferenciacin de la clula. El papel de los receptores de la superficie celular para transmitir mensajes ser explorado con mayor detalle en la pgina 258 y en el captulo 15.

Fibronectina, laminilla y otras protenas de la MEC

El trmino "matriz" implica una estructura formada por una red de elementos que interactan. Este trmino es muy adecuado para la matriz extracelular, que adems de colgena y proteoglicanos contiene varias protenas que interactan entre s con mucha precisin y de manera definida. La f ibronectina es una de las protenas extracelulares mejor estudiadas y revela muchas de las caractersticas observadas en la mayor parte de los componentes de otras matrices. Por ejemplo, la fibronectina, igual que otras protenas de la MEC, contiene una cantidad de dominios distintos, cada uno con funciones particulares (fig. 7-9, a). Cada cadena de polipptido que forma una molcula de fibronectina contiene: 1. Sitios de enlace para otros componentes de la MEC, incluyendo colgenas y glucosaminoglicanos especfi-

244

CAPITULO 7 Interacciones entre las clulas y su entorno Acido hialurnico p

Protena central

o.

HJ

o,
Y"
NHCOCH,

Hivi
OH H

Condroitiiv sulfato

Protena central Condroitincosulfato

OH

CH?H Queratansulfao
HO \. H

Queratansulfato
.... HJ

CH2oso30. ,0'

?-':
OH
H NHCOCH,

H
(a)

(c)

0.5 p

flGURA 7-6. Estructura de un complejo proteoglicano. a) Representacin esquemtica de un proteoglicano simple que consta de una molcula central de protena a la cual se unen numerosas cadenas de glucosarninglicanos (GAG). Los proteoglicanos procedentes de una matriz cartilaginosa contienen cadenas de queratansulfato y de condroitinsulfato cuyas estructuras se muestran en la parte b. b) En la matriz del cartlago, los proteoglicanos estn unidos a un GAG no sulfatado, llamado cido hialurnico, para formar un complejo gigante. En esta figura se muestran las estructuras de los disacridos repetitivos que constituyen cada uno de los GAG. Todos los GAG poseen numerosas cargas negativas (indicadas por el sombreado azul), c) Micrografa electrnica de un complejo proteoglicano comparable al ilustrado en la parte b, aislado de la matriz del cartlago, (c: Cortesa de Laivrence C. Rosenberg.)

(b)

Fibrillas de colgena

(O
FIGURA 7-7. Estructura del cartlago, a) Micrografa electrnica de una sola clula cartilaginosa (condrocito) rodeada por la matriz extracelular que secretan las clulas (N, ncleo; M, mitocondria; ER, retculo endoplsmico; V, vacuola citoplsmica; MV, vescula extracelular; C, colgena), b) Micrografa de alta resolucin que muestra la matriz extracelular. La matriz contiene delgadas fibrillas de colgena tipo II y pequeas condensaciones electrnicamente densas de proteoglicanos. Los materiales ms oscuros y de mayor tamao son organelos vesiculares que presuntamente contienen materiales de la matriz extracelular. c) Diagrama esquemtico de la organizacin aparente de la colgena y del proteoglicano de la matriz del cartlago. (a,b: Segn Louis C. Gerstenfeld y William /. Landis, J. Cell Biol. 112:508-9, 1991; con permiso de Rockefeller University Press.)

CAPITULO 7 Interacciones entre las clulas \j su entorno

245

Condroitinsulfato

Citoplasma Filamento de actina

(b)
FIGURA 7-8. Proteoglicanos que rodean la membrana, a) El sindecano, un proteoglicano que contiene beparansulfato, se localiza en la superficie celular de esta clula de Schwann, segn lo revela la unin con anticuerpos antisindecano. b) Dibujo esquemtico de una molcula sindecano compuesta de una protena central que abraza a la membrana, en la cual se unen ei heparansulfato y los glucosaminglicanos condroitinsulfato extracelulares. Se cree que el dominio citoplsmico de la molcula sindecano interacta con microfilamentos que contienen actina, en tanto que los GAG extracelulares interactan con ligandos especficos, como el factor de crecimiento de fibroblastos (FCF). (a: Segn David ]. Carey y cois. }. Celi Biol. 124:169, 1994; con permiso de Rockefeller University Press.)

eos, que ayudan a unir estas diversas molculas en una red estable interconectada. 2. Sitios de enlace para receptores situados sobre toda la superficie de la clula, que sirven para mantener una unin estable entre la MEC y la clula (fig. 7-13). Desde hace mucho tiempo se emplea fibronectina purificada en cultivo de clulas para proporcionar a stas una superficie donde adherirse y crecer. La importancia de la fibronectina en la MEC es muy evidente cuando los tejidos participan en actividades dinmicas, como las observadas durante el desarrollo embrionario. El desarrollo se caracteriza por oleadas de migracin celular que obligan a las clulas a seguir diferentes rutas de una a otra parte del embrin (fig. 7-10). Muchos estudios indican que las fibrillas con fibronectina a menudo se sitan en las vas que las clulas prefieren para desplazarse ffig. 7-9, b). Por ejemplo, las clulas de la cresta neural, que se desplazan afuera del sistema nervioso en desarrollo hacia el interior de casi todas las partes del embrin (fig. 7-10), atraviesan vas ricas en fibronectina. Estos movimientos celulares pueden inhibirse si se inyectan anticuerpos al embrin, que se enlazan a sitios de reconocimiento de las molculas de fibronectina y los bloquean. La importancia de la fibronectina en el desplazamiento de las clulas de la cresta neural puede demostrarse fcilmente in vitro (fig.

7-9, c). No es sorprendente que los ratones que carecen de un gen funcional para fibronectina sean incapaces de sobrevivir despus de las primeras etapas del desarrollo embrionario. Otra glucoprotena de la MEC es la laminina, cuyos polipptidos, igual que los de fibronectina, contienen dominios distintos con sitios de enlace especficos. Adems de enlazarse fuertemente a los receptores de la superficie celular, la laminina se puede enlazar a otras molculas de laminina, a heparansulfato proteoglicanos y a colgena tipo IV, un componente ubicuo de las membranas bsales (pg. 242). Se cree que la laminina y las molculas de colgena del tipo IV se entrelazan con una armazn porosa, como se muestra en la figura 7-11. Adems de su papel estructural, la laminina puede actuar en la capacidad reguladora e influir en el potencial de crecimiento y diferenciacin de la clula. La laminina ha sido mejor estudiada en relacin con su papel como gua del trayecto de los axones conforme crecen fuera del sistema nervioso central durante el desarrollo embrionario. La laminina est presente a lo largo de muchas de estas vas en el embrin, y cuando aparece sobre la superficie de un cultivo de neuroblastos promueve activamente el desarrollo del axn. El posible papel de la laminina en la diseminacin de las clulas cancerosas se estudia en La perspectiva humana, en la pgina 260.

246

CAPITULO 7 Interacciones entre las clulas y su entorno

RGD

Dominio Dominio Dominio Dominio para el para el para el para el enlace de enlace de enlace efe enlace de heparina colgena fibrina clulas (a) y fibrina

Sitio Sitio para el para el enlace de enlace de heparina fibrina

(C)

FIGURA 7-9. Estructura y funcin de la fibronectina. a) Una molcula de fibronectina humana consta de dos polipptidos similares, pero no idnticos, unidos por un par de enlaces disulfuro localizados cerca del C terminal. Cada polipptido se pliega en algunos dominios estructuralmente distintos que tambin poseen propiedades funcionales distintas. Lo ms importante es que cada dominio contiene uno o ms sitios de enlace para componentes especficos de la matriz extracelular o para la superficie de otras clulas. Algunas de las actividades de enlace se indican por los letreros de los dominios. Se indica el sitio dentro de! dominio de enlace celular que contiene la secuencia (arg-gli-asp, o RGD). Segn se analiza despus en el captulo, esta secuencia se enlaza especficamente a un tipo particular de protenas integrales de la membrana plasmtica (integrinas) que participan en la unin celular y en la transduccin de seales, b) Corte a travs de un embrin de pollo en etapa temprana tratado con anticuerpos fluorescentes contra fibronectina. La fibronectina se concentra en las membranas bsales (sitios rojo oscuro) situadas por debajo del epitelio embrionario y suministran un sustrato sobre el cual migrarn las clulas, c) En esta micrografa, las clulas de la cresta neural emigran desde una porcin del sistema nervioso de pollo en desarrollo (a la izquierda de la fotografa) a un plato de vidrio de cultivo que contiene tiras de una superficie recubierta de fibronectina que alterna con tiras de vidrio descubiertas. La regin revestida de fibronectina est indicada por las lneas blancas. Es evidente que las clulas permanecen exclusivamente sobre las regiones cubiertas de fibronectina. Las clulas que llegan al sustrato de vidrio (flechas) tienden a redondearse y a perder su capacidad migratoria. La flecha indica la direccin de la migracin, (b: Cortesa de ames W. Lash; c: segn Ciovanni Levi, Jean-Loup Ditband y ean Paul Tliiery, Int. Rev. Cytol. 123:213, 1990.)

Entre otras protenas de la MEC se incluyen tenascina, entactina y trombospondina. La tenascina es una glucoprotena oligomrica grande que se observa principalmente sobre !a superficie de las clulas embrionarias y varias clulas tumorales. A diferencia de la fibronectina, que promueve la adherencia celular, la tenascina parece que acta principalmente como componente antiadherente (fg. 7-2). Sin embargo, los ratones que se desarrollan sin copias de genes funcionales para tenascina no parecen mostrar efectos patolgicos por la ausencia de la protena. La entactina, componente de la membrana basal donde se enlaza a la laminina, puede desempear un papel importante en la adherencia y penetracin del embrin primitivo de mamfero en el revestimiento del tero durante la implantacin. Una gran variedad de clulas secretan trombospondina en la MEC, y es particularmente prominente en la matriz que rodea el

revestimiento de vasos sanguneos maduros. En este sitio, la trombospondina parece inhibir la neoformacin de vasos sanguneos (angiognesis). La combinacin nica de los diferentes componentes de la MEC contribuye a las caractersticas especficas de cada tipo de tejido. La mayor parte de los componentes de la MEC son grandes macromolculas compuestas de subunidades con estructura modular y poseen sitios de enlace entre s. Por consiguiente, las interacciones entre los materiales de la MEC pueden ser muy complejas. Incluso algunas molculas pueden poseer sitios de enlace con actividades opuestas, por ejemplo, un sitio que promueve la adherencia celular y otro que la inhibe. En estos casos, la organizacin supramolecular de los diferentes componentes puede determinar en ltimo trmino el efecto sobre la conducta de la clula, efecto dinmico que puede cambiar de un momento a otro.

CAPITULO 7 Interacciones entre las clulas y su entorno Clulas de la cresta neural

247

MC
7S

Col-IV

Lm

Clulas linfoides Clulas del primordio germinal (CPG) FIGURA 7-10. Resumen de algunos desplazamientos celulares que ocurren durante el desarrollo de un mamfero. Los movimientos ms extensos son efectuados por las clulas de la cresta neural que migran por fuera de la placa neural hacia la lnea media dorsal del embrin y originan todas las clulas pigmentadas de la piel (P), los ganglios simpticos (SpG), la mdula suprarrenal (AdM) y el cartlago del crneo embrionario (Mx, Md para los arcos maxilar y mandibular). Las clulas del primordio germinal (CPG) migran desde el saco vitelino al sitio donde se forman las gnadas (G) dentro del embrin. Los progenitores de clulas linfoides se transportan al hgado (L), mdula sea (Mo), timo (Ti), ganglios linfticos (GL) y bazo (Ba). (Nota: Las "vas" aqu mostradas conectan los puntos donde se originan las clulas con su destino; no muestran con precisin la verdadera ruta de las clulas.) (Segn Aaron A. Moscona y R.E. Hausman, en Cell and Tissue Interactions, J.W. Lash y M.M.. Burger, eds., Raven Press, 1977.)

FIGURA 7-11. Modelo de armazn de membrana basal. La disposicin de molculas de colgena tipo IV del armazn de la membrana basal se muestra en la figura 7-5. Aqu tambin se incluyen otras molculas que constituyen la membrana basal, principalmente la protena laminina (Lm), indicada por molculas engrosadas en forma de cruz, y la entactina (En). (Segn Peter D. Yurchenco, Yi-Shan Cheng y Hoy Colognato, J. Cell Biol. 117:1132, 1992; con permiso de Rockefeller University Press.)

7-2 Adherencia de clulas a sustratos no celulares

En el anlisis previo hicimos notar que ciertos componentes de la MEC, incluyendo fibronectina, laminina y colgena, tienen capacidad para enlazarse a receptores situados sobre la superficie de la clula. El grupo ms importante de receptores que fijan la clula a su microambiente extracelular son las integrinas.

Integrinas
Las integrinas son una superf amilia de protenas integrales de membrana compuestas de cadenas de polipptidos que abrazan toda la membrana, una cadena a y una cadena j$ unidas mediante enlaces no covalentes (fig. 7-13). Cuando menos se han identificado 15 diferentes subunidades a y ocho diferentes subunidades /3. Tericamente, pueden existir ms de 100 pares posibles de subunidades a y/3 en forma de heterodmeros, aunque el verdadero nmero est bastante restringido. En la superficie de la clula slo se han identificado unas 20 integrinas diferentes, cada una con distribucin tisular especfica predecible.

Ambas subunidades de integrina, a y /?, poseen una gran porcin extracelular donde se encuentran los sitios de enlace para ligandos especficos; un segmento corto, nico, que rodea a la membrana, y un pequeo dominio citoplsmico (40 a 50 aminocidos de largo)1 que contiene sitios de enlace para componentes del citoesqueleto (fig. 7-18). Por lo tanto, las integrinas tienen capacidad para enlazarse a sustancias en ambos lados de la membrana plasmtica. De hecho, el nombre "integrna" concuerda con el concepto de que estas protenas pueden transmitir seales entre los compartimientos extracelular e intracelular como una manera de "integrar" sucesos externos e internos. Este aspecto de la funcin de las integrinas se analiza con mayor detalle en la pgina 258. En el cuadro 7-2 se presenta una lista de las integrinas conocidas y de los ligandos claves que se unen a ellas. Puesto que las clulas individuales pueden expresar varias integrinas diferentes en su superficie, dichas clulas tienen capacidad de enlazarse a distintos componentes extracelulares. En muchos casos, una combinacin de integrinas que reconocen diferentes dominios de un ligando extracelular puede ser la que determine el efecto de la MEC sobre la conducta de la clula. Por ejemplo, las clulas situadas en la capa inferior de la epidermis contienen las integrinas a^\, a^fii y a$\, las cuales pueden ayudar a unir estas clulas a componentes de la membrana basal subyacente (cuadro 7-2). La liberacin de estas clulas de la membrana basal, requerida para que se desplacen hacia la superficie de la piel, se correlaciona con la prdida de expresin de las tres integrinas. La mayor parte de las protenas extracelulares que se enlazan a las integrinas lo hacen debido a que contienen la
1 Una excepcin a esta arquitectura molecular es la cadena /?4, que tiene unos 1 000 aminocidos extra como parte de su dominio citoplsmico. Esta enorme adicin hace que las integrinas /?4 puedan extenderse a mucha mayor profundidad dentro del citoplasma (fig. 7-18).

248

CAPITULO 7 * Interacciones entre as clulas y su entorno

FIGURA 7-12. Experimento que demuestra la accin antiadherente de la tenascina. Antes de aadir las clulas, se aplicaron las protenas fbronectina y tenascina a la superficie del plato de cultivo, segn se escriben sus respectivos nombres. Aunque las clulas permanecieron a baja densidad sobre el plato, se concentraron sobre las partes que contenan fibronectina evitando los sitios con tenascina, que permanecen vacos. (Segn Ruth Chicjuet-Ehrismann, Curr. Opin. Cell Biol. 3:802, 1991.)

RGD

COOH

Fibronectina

Sitios para la unin de calcio

NH,

Cadena pesada de la subunidad a

s

Cadena ligera de la subunidad a

Intracelular

Conexiones con el citoesqueleto

FIGURA 7-13. Estructura y funciones de las integrinas. Esquema de un heterodmero integrina tal como reside en la superficie de las clulas. La masa de cada subunidad se localiza en el lado extracelular de la membrana. La subunidad b mostrada aqu contiene los sitios de enlace RGD que reconocen fibronectina y otros materiales extracelulares. Los iones calcio, requeridos para la actividad de enlace de integrinas, se unen a cuatro motivos enlazados a cationes sobre la subunidad a. Ambas subunidades atraviesan la bicapa de lpidos de la membrana corno una sola hlice a.

secuencia de aminocidos arginina-glicina-cido asprtico (o, en la nomenclatura abreviada de aminocidos, RGD}. Esta secuencia de tripptidos se presenta en los sitios de enlace de la clula de fibronectina, laminina y colgena, y de otras protenas extracelulares. En la figura 7-14 se muestra el dominio de enlace de la clula de fibronectina, con su asa que contiene RGD. El sitio de enlace de RGD sobre la molcula de integrina se indica en la figura 7-13. Como ya se mencion, muchas clulas se adhieren firmemente a un plato de cultivo recubierto con fibronectina. Si las clulas se aaden en presencia de un pptido sinttico que contiene la secuencia RGD, la clula ya no puede unirse al plato de cultivo; el pptido sinttico tiene capacidad para competir con xito con las secuencias RGD de las molculas de fibronectina por los sitios de enlace sobre las integrinas de la superficie celular. Se estima que casi la mitad de todas las integrinas contienen sitios de enlace de RGD (como las mostradas en la columna de la izquierda del cuadro 7-2). Por consiguiente, las protenas extracelulares especficas son capaces de enlazarse a varios miembros diferentes de la familia de las integrinas, y viceversa. Dada esta redundancia y el hecho de que la afinidad de las integrinas por sus ligandos puede variar segn condiciones locales, el tema de las interacciones integrina-ligando es complicado y todava no comprendido en su totalidad. El enlace de todos los ligandos a las integrinas, sea por secuencias RGD u otras secuencias, requiere la presencia de iones bivalentes, ya sea Mg2+ o Ca2+. Los sitios de enlace para cationes bivalentes sobre la subunidad a se indican en la figura 7-13. El descubrimiento de la importancia de la secuencia RGD en la actividad de la integrina plante la posibilidad de nuevos tratamientos para padecimientos que afectan la superficie celular. La formacin de un cogulo sanguneo (trombo) en un vaso no daado puede interrumpir el flujo de sangre a travs de rganos vitales y es una de las principales causas de ataque al corazn y accidente vascular cerebral. Uno de los primeros pasos en la formacin de un cogulo sanguneo es la agregacin de plaquetas, fragmentos celulares no nucleados que circulan en la sangre. La agregacin de plaquetas requiere la interaccin de una integrina especfica de plaquetas (anb/^a) con protenas solubles de la sangre que contengan RGD, como el fibringeno y el factor de von Willebrand, que actan como uniones para mantener juntas a las plaquetas {fig. 7-15). Experimentos con animales indican que pptidos sintticos provistos de RGD pueden inhibir la coagulacin de la sangre y son agentes antitrombticos eficaces en el ser humano. Es evidente que estos agentes deben administrarse con sumo cuidado, puesto que pueden interferir con muchos otros procesos mediados por integrinas. Esto puede ilustrarse con una familia de toxinas presentes en el veneno de ciertas serpientes que contienen protenas con secuencias RGD. Estas toxinas actan al impedir el enlace a integrinas (por esa razn se les denomina desintegrinas). Adems de su papel en el enlace a materiales extracelulares y la transmisin de seales a travs de la membrana plasmtica, las integrinas tambin participan en la formacin de dos tipos- de estructuras adherentes especializadas: adherencias focales y hemidesmosomas.

CAPITULO 7 Interacciones entre las clulas y su entorno CUADRO 7-2. Clasificacin de los receptores de integrina segn el reconocimiento de las secuencias RGD RGD reconocidas Receptor de integrina Ligandos clave Fibronectina Fibronectina
V01 201

249

RGD no reconocidas Receptor de integrina Ligandos clave Colgena Colgena La mi nina Colgena La mi nina Fibronectina MACV Laminina

Fibronectina Leishmania Fibringeno

301

M02

401

601

IIfc03

Fibronectina Factor von Willebrand Vitronectina Fibringeno Fibronectina Factor von Willebrand Vitronectina Vitronectina
M02

ICAM-1 ICAM-2

Fibringeno ICAM-1 Fibronectina FUENTE: S.E. D'Souza, M.H. Ginsberg y E.F. PIow, Trenas in Biochem. Sci. 16:249, 1991.

Adherencias focales y hemidesmosomas: fijacin de clulas a su sustrato

Es mucho ms fcil estudiar la interaccin de las clulas con la parte inferior de un plato de cultivo que con una matriz extracelular de un animal. Por consiguiente, gran parte de nuestro conocimiento en esta rea se obtuvo del estudio de clulas que se adhieren in vitro a diferentes sustratos. Las etapas que ocurren durante la fijacin de una clula a la superficie del plato de cultivo se muestran en la figura 7-16. Al principio, la clula tiene forma esfrica, como generalmente ocurre en clulas suspendidas en medios acuosos. Una vez que la clula entra en contacto con el sustrato enva hacia afuera prolongaciones que forman uniones cada vez ms estables. Con el tiempo, las clulas se aplanan y extienden sobre s mismas hacia afuera del sustrato. La expansin se acompaa de un cambio espectacular en la organizacin del citoesqueleto, tal vez mediada por un mecanismo de seales transmembrana que comunica el citoplasma con el medio externo. Cuando los fibroblastos o las clulas epiteliales se propagan hacia la superficie inferior de un plato de cultivo, la parte de abajo de la clula no se comprime uniformemente contra el sustrato. En vez de ello, la membrana celular entra en estrecho contacto (casi 10 nm) con la superficie del plato slo en sitios discretos, dispersos, llamados contactos focales (o adherencias focales). En la regin de contacto focal, la membrana plasmtica contiene grupos de integrinas (con mayor frecuencia a^?i) que conectan el material extracelular que reviste el plato de cultivo con el sistema de microfilamentos del citoesqueleto que contiene actina (fig. 7-17).

FIGURA 7-14. Uno de los mdulos de una molcula de fibronectina que contiene el motivo RGD. Los tres aminocidos (arg-gli-asp) que constituyen el motivo {mostrado en amarillo) sirven como sitio de reconocimiento comn entre protenas extracelulares en los receptores de enlace sobre la superficie celular. El motivo RGD se sita en el vrtice de un asa del polipptido, sobresaliendo del mdulo. (Segn Alisan L. Main y cois. Cell 71:674, 992; con permiso de Cell Press.)

250

CAPITULO 7 Interacciones entre as clulas y su entorno

Pared del vaso sanguneo

Plaqueta

Agregacin de plaqueta Integrina

Ftbrmgeno

, Adherenci; de plaquet?

Sitio de lesin""

Receptor de plaquetas

(a)

2.5 pm

FIGURA 7-15. Los cogulos sanguneos se forman cuando las plaquetas se adhieren entre s a travs de puentes de fibringeno enlazados a las integrinas de las plaquetas. La presencia de pptidos RGD sintticos puede inhibir la formacin del cogulo sanguneo al competir con las molculas de fibringeno por los sitios de enlace RGD sobre las integrinas.

'(b)

2.5 pm

La presencia de contactos focales guarda relacin inversa con el movimiento de la clula sobre el sustrato; cuanto mayor sea el numero de contactos focales, menos movible ser la clula. Los contactos focales son estructuras adherentes caractersticas de clulas cultivadas adheridas a la superficie del plato de cultivo. En el interior del cuerpo se observan uniones firmes entre clulas y la matriz celular a nivel de la superficie basal de las clulas epiteliales, donde se unen a la membrana basal subyacente mediante una estructura adherente especializada denominada hemidesmosoma (fig. 7-18). Los hemidesmosomas consisten en una placa densa situada en la superficie interna de la membrana plasmtica con filamentos que corren al interior del citoplasma. A diferencia de los filamentos de los contactos focales, que contienen actina, los filamentos del hemidesmosoma son ms gruesos y contienen queratina. Los filamentos que contienen queratina se clasifican como filamentos intermedios, que sirven principalmente para funciones de apoyo; se distinguen de los microfilamentos ms delgados que contienen actina y cuya funcin es contrctil (los dos tipos de filamentos se estudian con detalle en el captulo 9). Los fi-

2.5 pm

-^ **r - - r^i^p._ - , __ "** '--^jiTl" - \

2.5 pm

FIGURA 7-lJ. Pasos en el proceso de propagacin celular. Gammagrafa electrnica que muestra la morfologa de los fibroblastos de ratn en momentos sucesivos durante la unin y propagacin sobre el cubreobjetos de vidrio. Las clulas se fijaron despus de: a) 30 minutos, b) 60 minutos, c) dos.horas y d) 24 horas de la unin. (Segn /./. Rosen y LA. Culp, Exp. Cell Res. 107:141, 1977.)

CAPITULO 7 Interacciones entre las clulas i/ su entorno

251

(a)

lamentos de queratina del contacto focal se unen a la matriz extracelular mediante integrinas que rodean a la membrana, incluyendo 0^4. La importancia de los hernidesmosomas se puede apreciar en una rara enfermedad, el pnfigo bullse, en el cual se producen anticuerpos que se enlazan a una protena presente en estas estructuras adherentes. Las enfermedades causadas por anticuerpos dirigidos contra nuestros propios tejidos se denominan enfermedades autoinmunitarias y son causa de una gran variedad de padecimientos. En casos de pnfigo hulloso, tos anticuerpos se enlazan a una protena (antgeno penfigoide hulloso) localizada en las placas de los hemidesmosomas. Esto causa que la capa inferior de la epidermis se separe de la membrana basal subyacente (y por lo tanto de la capa de tejido conectivo de la dermis). El paso de lquido al espacio situado debajo de la epidermis provoca graves ampollas en la piel.

7-3 Adherencia de clulas a otras clulas

El examen de un delgado corte transversal que pase por los principales rganos revela una compleja arquitectura que implica diversos tipos de clulas. La formacin de estos complicados patrones celulares tridimensionales dentro de los rganos en desarrollo sin duda depende principalmente de interacciones de tipo selectivo entre clulas similares y no similares. Las pruebas indican que las clulas pueden reconocer la superficie de otras clulas porque "saben" con cules deben interactuar y a cules deben ignorar. Es muy difcil estudiar las interacciones de adherencia que ocurren en las partes microscpicas de rganos minsculos conforme se desarrollan en el embrin. Los primeros intentos para aprender algo acerca de cmo las clulas se reconocen y adhieren entre s se llevaron a cabo al eliminar un rgano en desarrollo de un embrin, disociando el tejido para formar una suspensin de clulas nicas y determinando la capacidad de las clulas para reagruparse en cultivo. En experimentos donde se disociaron y mezclaron clulas de dos rganos diferentes en desarrollo, inicialmente se aglutinaron para formar una masa mixta. Sin embargo, con el tiempo, la clulas se desplazaron dentro del agregado y se "autoclasificaron", de modo que cada clula slo se adhiere a clulas de su mismo tipo (fig. 7-19). Un mtodo experimental diferente, ilustrado en la figura 7-20, a, tambin demuestra que las clulas de preferencia tienden a adherirse a otras clulas de su mismo tipo. En este estudio, clulas en suspensin marcadas con istopos radiactivos se aadieron a un plato de cultivo cuya superficie estaba cubierta por una monocapa de clulas, y se permiti que las clulas marcadas se asentaran sobre la monocapa durante cierto tiempo; a continuacin se lav el plato para liberarlo de clulas no adheridas y se midi la radiactividad producida por las clulas adheridas al plato. En experimentos de este tipo, generalmente se observa que el nmero de clulas marcadas adheridas al plato es mucho mayor s las clulas inmviles de la monocapa son del mismo tipo que las clulas en suspensin comparadas con clulas de diferente tipo (fig. 7-20, b).

2.5 yim

FIGLKA 7-17. Los contactos focales son sitios donde las clulas se adhieren a su sustrato, a) Este fibroblasto que se adhiere a un plato de cultivo revestido de fibronectina fue teido con anticuerpos fluorescentes para revelar la localizador de la integrina CL$I. Se observ que la integrina se localiza en pequeas placas que corresponden a los sitios de contacto focal, b) Aqu se muestra la superficie citoplsmica de un contacto focal en una clula cultivada de anfibio luego de procesar la superficie interna de la membrana por congelamiento rpido y "aguafuerte" profundo. Se observa que los haces de rnicrofilamentos se asocian a la superficie interna de la membrana en la regin de un contacto focal, (a: Segn William G. Crter, Elizabeth A. Wayner, load S. Bouchard y Pritinder Kaur, J. Cell Biol. 110:1389, 3990; b: segn Steven ]. Samuelsson, Paul ]. Luther, David W. Pumpliii, Robert j. Bloch, J. Cell Biol. 122:487, 1993; ambos con permiso de RockefeUer University Press.)

252

CAPITULO 7 Interacciones entre las clulas y su entorno

Filamentos intermedios Citoplasma Placa Membrana plasmtica

Espacio extracelular

Fibrillas de colgena
0.3 um

(b)

FIGURA 7-18. Los hemidesmosomas son sitios diferenciados de la superficie basal de las clulas epiteliales donde las clulas se fijan a la membrana basal subyacente, a) Micrografa electrnica de varios hemidesmosomas mostrando la placa densa sobre la superficie interna de la membrana plasmtica y los filamentos intermedios que se proyectan al interior del citoplasma, b) Diagrama que muestra los principales componentes de un hemidesmosoma. (a: Segn Douglas E. Kelly, J. Cell Biol. 28:51, 1966; con permiso de Rockefeller University Press.)

Poco se saba sobre la naturaleza de las molculas que median la adherencia entre clulas hasta el desarrollo de tcnicas para purificar protenas integrales de membrana y, ms recientemente, aislamiento y clonacin de los genes que codifican estas protenas. Hasta ahora se ha demostrado que cuatro distintas familias de protenas de membrana median la adherencia de una clula a otra: 1) selectinas; 2) ciertos miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF); 3) ciertos miembros de la superfamilia de las integrinas, y 4) cadherinas. Selectinas Durante e! decenio de 1960 se descubri que los linfocitos eliminados de ganglios linfticos perifricos, marcados con istopos radiactivos e inyectados de nuevo al cuerpo, retornaban a sus sitios de origen, fenmeno denominado "regreso a casa de los linfocitos". Posteriormente se observ que el regreso a casa poda estudiarse in vitro al permitir que los linfocitos se adhieran a cortes congelados de tejido linfoide. En estas condiciones experimentales los linfocitos se adhieren selectivamente al revestimiento endotelial de las vnulas (las venas ms pequeas) de los ganglios linfticos perifricos. La unin de linfocitos a vnulas poda impedirse con anticuerpos que se enlazan a una glucoprotena especfica sobre la superficie del linfocito. Este receptor de linfocitos se denomin LEU-CAM1 y posteriormente selectma-L. Las selectinas son una familia de glucoprotenas integrales de membrana que reconocen disposiciones especficas de grupos carbohidrato proyectados de la superficie de otras clulas y se unen a ellos. El nombre de este tipo de receptor de la superficie celular se deriva de la palabra "lecna", trmino que describe un compuesto capaz de enlazarse

a grupos carbohidrato especficos. Las selectinas poseen un pequeo dominio ctoplsmico, un dominio simple que rodea a la membrana, y un gran segmento extracelular que consta de algunos dominios separados, incluyendo el ms externo que acta como lectina (fig. 7-21, a). Se conocen tres selectinas: selectina E, que se expresa en las clulas endoteliales; selectina P, expresada sobre plaquetas y clulas endoteliales, y selectina L, que se expresa en todo tipo de leucocitos (glbulos blancos de la sangre). Estas tres selectinas reconocen un grupo similar de cuatro azcares (fig. 7-21, a,b) presente en los extremos de ciertas cadenas de carbohidratos de glucoprotenas o glucolpidos. El enlace de selectinas a sus ligandos carbohidrato depende de calcio. Como grupo, las seectinas median interacciones transitorias entre leucocitos circulantes y la pared vascular en sitios donde hay inflamacin y coagulacin. El papel de la selectina P se analiza en La perspectiva humana: Papel de la adherencia celular en la inflamacin y la metstasis. Inmunoglobulinas e integrinas Una de las piedras angulares en el conocimiento de la respuesta inmunolgica (pg. 62) fue el descubrimiento, en los aos 1960, de la estructura molecular de los anticuerpos de origen sanguneo (IgG). Se observ que las molculas de anticuerpos constan de una cadena de polipptidos compuesta de varios dominios similares. Cada dominio Ig, como se le llam, se compone de 70 a 110 aminocidos organizados en una estructura firmemente plegada que se muestra en las figuras 2-43 y 2-44. Con el tiempo, fue evidente que los dominios de tipo Ig se encuentran en gran variedad de protenas que en conjunto constituyen la superfamilia de las inmunoglubulinas, o IgSF. La mayor parte de los miem-

CAPTULO 7 Interacciones entre las clulas y su entorno

253

Ectodermo + mesodermo

100 pm

FIGURA 7-19. Demostracin experimental del reconocimiento clula a clula. Los tejidos de los Tg embrionarios se pueden disociar en clulas nicas tratando brevemente el tejido con una enzima proteoltica o eliminando los iones calcio del medio en el cual se encuentra suspendido el tejido. Cuando se disocian Clulas de1 dOS tipos de rganos embrionarios y despus se mezclan, las clulas de los dos rganos se agregan y luego se "autoclasifican" por asociacin con otras clulas del mismo tipo. AQU se muestran Jp.s jgsyjadp de dos experimentos de este tipo, a) En este experimento se disociaron en clulas aisladas y luego se volvieron a combinar las clulas de dos regiones del embrin temprano de un anfibio (ectodermo y mesodermo en etapa de gstrula). Al principio las clulas forman un agregado mixto, pero con el tiempo se clasifican. Las clulas ectodrmicas se desplazan hacia la superficie externa del agregado, sitio donde se localizan en el embrin,
y las clulas mesodrmicas se desplazan al interior, posicin que ocuparn en el embrin. A continuacin,

ambos tipos de clulas se diferencian en estructuras del tipo al que normalmente daran lugar, b) Micrografa con microscopio de luz que muestra los resultados de un experimento en el cual se mezclaron clulas precartilaginosas de un embrin de pollo con clulas del ventrculo cardiaco del mismo animal. Los dos tipos de clulas se han autoclasificado saliendo del agregado mixto; las clulas del corazn forman una capa en el lado externo de las clulas precartilaginosas. (a: Segn P.L. Townes y Johannes Holtfreter, J. Exp. Zool. 128:53, 1955; b: segn Malcolm S. Steinberg, J. Exp. Zool. 173:411, 1970.)

(a)

Clulas aisladas marcadas

incubacin -

Og^O O A ' JLavado

=>
10 Capa celular 20 30 O 10 20 30 40 50 Minutos

(b)
FIGURA 7-20. Protocolo experimental para medir la adherencia de clula a clula, a) En este estudio se vierte sobre una capa de clulas una suspensin de clulas marcadas con istopos radiactivos. La tasa de adherencia se determina incubando las clulas a tiempos diferentes, lavando las clulas no adheridas y midiendo la radiactividad procedente de las clulas restantes unidas a la monocapa celular, b) Cintica de la adherencia de clulas a una monocapa del mismo tipo de clulas (lnea roja) o a clulas de tipo diferente (lnea azul). El experimento mostrado compara la interaccin de clulas de teratoma de ratn y clulas de rion de ratn en dos combinaciones recprocas, (b: Segn B.T. Walther, R. Ohman v S. Roseman, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 70:1569, 1973.)

254

CAPITULO 7 Interacciones entre las clulas y su entorno

Qj Dominio estructural O Dominio parecido a EGF f~~1 Dominio parecido a lectina

Glucoprotena

(a)

FIGURA 7-21. Selectinas. Estas molculas de adherencia celular reconocen muchos carbohidratos especficos en los extremos de cadenas de oligosacridos, glucolpidos y glucoprotenas. a) Esquema de los tres tipos de selectinas y del carbohidrato ligando al cual se enlazan, b) Modelo del dominio selectina E de una lectina. Los residuos en amarillo son aqullos cuya mutacin disminuy de manera significativa el enlace de la protena con su ligando. El ligando (sLex) reconocido por la selectina E se muestra en color verde a un lado de la protena, orientada como si estuviera lista para enlazarse al dominio lectina de la protena. Los grupos rojos del ligando indican las fracciones carbohidrato que son cruciales para el enlace de la selectina E; estas incluyen los grupos carboxilo del cido silico, dos grupos hidroxilo de galactosa y tres grupos hidroxilo de fructosa. La barra representa 10 A. (i; Segn David V. Erbe y cois. J. Cell Biol. 129:224, 1992, cortesa de Laurence A. Laskey; con permiso de Rockefeller University Press.)

bros de las IgSF son protenas integrales de membrana presentes en la superficie de los linfocitos que participan en diferentes etapas de la funcin inmunolgica. Algunas de estas proteinas integrales median la adherencia clula-clula independiente de calcio. En realidad, el descubrimiento de dominios semejantes a Ig en molculas que participan en la adherencia celular en los invertebrados, animales que carecen de un sistema inmunolgico tpico, sugiere que originalmente las protenas similares a Ig evolucionaron a partir de mediadores de la adherencia celular y slo en forma secundaria adquirieron funciones como efectores del sistema inmunolgico de los vertebrados. La mayor parte de las molculas IgSF de adherencia celular median interacciones especficas de linfocitos con clulas (p. ej., macrfagos, otros linfocitos y clulas blanco) requeridas para la respuesta inmunolgica. Sin embargo, algunos miembros IgSF, como molculas de adherencia a clulas neurales (MACN) median la adherencia entre clulas no inmunolgicas, incluyendo clulas nerviosas y mus-

culares embrionarias. A partir del modelo de la molcula MACN mostrado en la figura 7-22, es evidente que igual que fibronectina y muchas otras protenas implicadas en la adherencia celular, las molculas IgSF para la adherencia de clulas poseen una estructura modular constituida por dominios individuales compartidos con otras protenas. Las molculas de adherencia a clulas neurales participan en diferentes etapas del desarrollo del sistema nervioso, incluyendo agregacin de clulas migrantes de la cresta neural para formar agregados que posteriormente se desarrollan como ganglios simpticos (fig. 7-10), interaccin estrecha entre clulas nerviosas y clulas de sostn que las rodean, y en la formacin de contactos sinpticos entre clulas nerviosas y sus clulas especficas. Por ejemplo, si se inyectan anticuerpos contra MACN en un embrin de pollo en desarrollo, se puede interrumpir cada uno de estos procesos. Diferentes tipos de protenas sirven como ligandos para las molculas IgSF de la superficie celular. Una protena IgSF sobre una clula puede enlazarse a la misma protena

CAPITULO 7 Interacciones entre las clulas y su entorno

COOH

255

Citoplasma

Citoplasma

FIGURA 7-22. Molculas de adherencia de clulas de la superfamilia Ig. Representacin esquemtica de la adherencia de clula a clula resultante de interacciones especficas entre dominios Ig de dos molculas de adherencia a clulas neurales que se proyectan desde la superficie de clulas vecinas. Cada molcula de adherencia a clulas neurales contiene un pequeo dominio citoplsmico, un segmento transmembrana, varios segmentos que recuerdan los segmentos repetidos observados en la fibronectina y seis dominios Ig situados en la porcin N terminal de la molcula.

cadherina P (placentaria). Estas cadherinas contienen un segmento extracelular relativamente grande que consta de cuatro dominios, un segmento nico transmembrana y un dominio citoplsmico nico. Las cadherinas se unen a clulas similares entre s y de manera preferencia! a la misma cadherina presente en la superficie de la clula vecina (fig. 7-23). Esta propiedad de autoasociacin se puede demostrar en clulas manipuladas por ingeniera gentica para que expresen una variedad de las diferentes cadherinas, y luego mezclar las clulas en diferentes combinaciones. Cuando se efecta este experimento, las clulas que expresan una especie de cadherina se adhieren preferencialmente a otras clulas que expresan la misma cadherina. La capacidad de las cadherinas para mediar la adherencia de clulas semejantes puede explicar los resultados de los primeros estudios, como el que se muestra en la figura 7-19, en el cual las clulas de agregados mixtos "se clasificaron" para formar agrupamientos de clulas de tipo similar. En realidad, las cadherinas pueden ser el factor aislado ms importante para mantener las clulas reunidas en tejidos firmemente cohesivos. El desarrollo embrionario se caracteriza por cambios en la expresin del gen, en la forma de la clula, en la motilidad celular, en la adherencia de clulas, y as sucesivamente. Las cadherinas desempean un papel clave en algunos de estos cambios. Por ejemplo, durante el desarrollo embrionario algunos sucesos morf ogenticos implican cambiar un grupo de clulas de un mesnquima (clulas laxas

Citoplasma

IgSF o a una diferente sobre otra clula. Por ejemplo, una molcula MACN sobre una clula puede enlazarse al mismo tipo de MACN sobre otra clula (fig. 7-22). Segn se describi antes, la mayor parte de las integrinas facilitan la adherencia de clulas con su sustrato, pero unas pocas integrinas median la adherencia de una clula con otra al enlazarse a protenas IgSF en clulas opuestas. Por ejemplo, la integrina a$\n la superficie de los leucocitos se une a la molcula de adherencia a clulas vasculares (MACV), una protena IgSF de la superficie de clulas endoteliales (fig. 7-28).

Cadlierinas
Las cadherinas son una familia de cuando menos 12 glucoprotenas relacionadas que median la adherencia celular dependiente de Ca2+. Los miembros de la familia de las cadherinas se pueden distinguir entre s por el tipo de clulas en las cuales se presentan; los miembros mejor estudiados son: cadherina E (epitelial), cadherina N (neural) y
Citoplasma FIGURA 7-23. Cadherinas y adherencia celular. Representacin esquemtica de dos clulas adheridas entre s como resultado de interacciones entre tipos similares de cadherinas proyectadas desde la membrana plasmtica de cada clula.

256

CAPITULO 7 Interacciones entre las clulas y su entorno Ectodermo

Endodermo Clulas mesenquimatosas migratorias

(a)
Ectodermo

Endodermo Somita {epitelio}

(W
Ectodermo

clulas mesodrmicas durante la etapa de gastrulacin. En condiciones tpicas las clulas se separan de una capa cohesiva en la superficie de la gstrula primitiva y vagan en regiones interiores como clulas mesenquimatosas (fig. 7-24, a). Despus de algn tiempo, muchas de estas mismas clulas adquieren propiedades adherentes y se ensamblan en un epitelio como los somitas formados a lo largo de la lnea media dorsal del embrin (fig. 7-24, b). A continuacin, en una etapa posterior, las clulas de ciertas partes del somita pierden su adhesividad y comienzan una vez ms a vagar como mesnquima (fig. 7-24, c) en las extremidades en desarrollo para formar msculo o cartlago, o abajo de la epidermis en desarrollo para formar tejidos drmicos. La agregacin de clulas en un epitelio, como los somitas, se correlaciona con la aparicin de cadherina N sobre la superficie de las clulas (fig. 7-24, d), una propiedad que debe promover la adhesividad mutua entre las clulas. En contraste, la dispersin de clulas a partir de un epitelio se correlaciona con la desaparicin de cadherina N (y la posible aparicin de integrinas que median la adherencia entre una clula y su matriz extracelular). La asociacin de clulas en tejidos se acompaa de la formacin de uniones especializadas clula-clula, donde las cadherinas desempean un papel importante. Uniones adherentes y desmosomas: fijacin de una clula a otras clulas Las clulas de ciertos tejidos, particularmente epitelios y msculo cardiaco, son notoriamente difciles de separar debido a que se mantienen firmemente unidas entre s por uniones adherentes especializadas. Hay dos tipos principales de uniones adherentes: uniones adherentes y desmosomas. Adems de estas uniones, las clulas epiteliales a menudo contienen otros tipos de uniones clula a clula localizadas a lo largo de su superficie lateral cerca de la luz apical (fig. 7-25). Considerada en conjunto, esta especie de superficie especializada se denomina complejo de unin intercelular. En los siguientes prrafos se describe la estructura y funcin de las dos uniones adherentes del complejo, en tanto que el anlisis de los otros tipos de uniones epiteliales (uniones apretadas y uniones de abertura) se consideran ms adelante en este captulo. Las uniones adherentes (o zonula adherens] se observan en varios sitios del cuerpo. Son particularmente comunes en epitelios como el que reviste el intestino, donde adoptan la forma de un "cinturn" que rodea a cada clula cerca de su superficie apical, enlazndola a sus vecinas. Las membranas plasmticas de una unin adherente estn separadas por un espacio de 20 a 35 nm, sitio donde se concentran molculas de cadherina (fig. 7-26, a). Estas clulas al parecer se mantienen juntas por uniones dependientes de calcio formadas entre los dominios extracelulares de molculas de cadherina que sirven de puente entre las brechas de clulas vecinas. El dominio citoplsmico de las molculas de cadherina de las uniones adherentes se une mediante miembros de una familia de protenas citoplsmicas, denominadas cateninas, con filamentos de actina del citoesqueleto (fig. 7-26, b). Por lo tanto, igual que las integrinas de un contacto

Endodermo

Clulas procedentes del mesnquima

85 pm

FIGURA 7-24. Cadherinas y la transformacin epitelial mesenquimatosa. a-c) Etapas en el desarrollo temprano de un embrin de pollo, a) Durante la gastrulacin, las clulas de la capa superior del embrin (epiblasto) emigran haca un surco situado en el cenro del embrin, una rosilla en el surco, y luego se desplazan lateralmente en forma de clulas mesenquimatosas al espacio situado por debajo del epiblasto. b) Algunas de estas clulas mesenquimatosas se renen en bloques de clulas epiteliales para formar los somitas. c) En la ltima etapa del desarrollo, una parte de la pared de cada somita se transforma en clula mesenquimatosa que emigra hacia varios tejidos perifricos, d) Seccin sagital que pasa por un embrin de pollo a nivel de los somitas. La parte anterior del embrin se muestra a la izquierda y la parte posterior a la derecha. El eje anteroposterior de un embrin de pollo funciona como lnea del tiempo para el desarrollo; ciertos sucesos ocurren primero por delante, como la formacin de los distintos somitas, luego en regiones por detrs. En esta fotografa se muestra la localizacin de la cadherina N mediante inmunofluorescencia. La formacin de un somita, que se observa progresivamente desde la porcin anterior hasta la posterior de un embrin, se correlaciona con la sntesis de cadherina N. (d: Segn Kohei Hatta, Shin Tagaki, Hajime Fujisawa y Masatashi Tkeichi, Dev. Biol. 120:218, 1987.)

principalmente no adhesivas) a un epitelio (capa celular organizada fuertemente adherente), o viceversa. Esta transicin mesnquima-epitelio se ilustra por el movimiento de

CAPITULO 7 Interacciones entre las clulas y su entorno Unin hermtica Unin adherente

257

FIGURA 7-25. Complejo de unin intercelular, a) Diagrama que muestra el complejo de unin sobre las superficies laterales cerca de la luz de una sola clula de epitelio columnar. Consta de una unin hermtica (zonula ocludens), una unin adherente (zonula adherens) y un desmosoma (macula adherens). Otros desmosomas y las uniones de abertura se localizan ms profundamente a lo largo de la superficie lateral de las clulas. El epitelio se apoya sobre una membrana basal. b) Micrografa electrnica de un complejo de unin entre dos clulas epiteliales del intestino de ratn. TJ, unin hermtica; AJ, unin adherente; D, desmosomas. (b: Segn Eveline E. Schneeberger, Am. J. Physiol. 262:1648, 1992.)

0.1 /m

258

CAPITULO 7 Interacciones entre las clulas y su entorno

FIGURA 7-26. Estructura de la unin adherente. a) Modelo esquemtico de la arquitectura molecular de una unin adherente. El dominio citoplsmico de la molcula de cadherina se conecta con los filamentos de actina del citoesqueleto mediante enlaces formados por protenas que incluyen las cateninas. b) Micrografa que muestra clulas epiteliales cultivadas en contacto entre s para formar una lmina semejante a un epitelio. Las clulas se fijaron y reaccionaron con anticuerpos a cadherina E (fluorescencia roja) y con anticuerpos a una de las cateninas (fluorescencia verde), que son protenas que unen la cola citoplsmica de las cadherinas con los filamentos de actina de! citoesqueleto. En las regiones donde ambos anticuerpos estn teidos las clulas se observan en color blanco. La imagen tridimensional se obtuvo inclinando las clulas de modo que pueda observarse la membrana plasmtica lateral. Los extremos apicales de las clulas estn marcados por uniones adherentes donde las concentraciones de cadherina y catenina son ms altas, (a; Segn S. Tsukita y cois. Curr. Opin. Cell Biol. 4:837,1992; b: cortesa de Inke S. Nathke y asan R. Swedlow.)

focal, las cadherinas de una unin adherente conectan el ambiente externo con el citoesqueleto intracelular. Los desmosomas (o maculae adherens) son uniones adherentes discoides (fig. 7-27, a) observadas en varios tejidos, pero ms notablemente en epitelios, donde se presentan en situacin basal respecto de las uniones adherentes (fig. 7-25). Las membranas plasmticas de un desmosoma estn separadas por 20 a 35 nm. La regin entre las clulas (desmoglea) est llena con un material ligeramente teido que se cree acta como "pegamento" de colgena viscosa. Las placas citoplsmicas densas sobre la superficie interna de la membrana plasmtica sirven como sitios de fijacin para filamentos intermedios en asa (no microlamentos, como en las uniones adherentes) que se extienden al interior del citoplasma (fig. 7-27, a,b). Estos filamentos intermedios abrazan toda la amplitud de la clula interconectando la superficie interna de los desmosomas situados sobre lados opuestos de la clula. Los desmosomas son particularmente abundantes en tejidos sujetos a esfuerzo mecnico, como la piel y el cuello uterino. La red de filamentos intermedios semeja una cuerda y suministra continuidad estructural y resistencia tensil a toda la capa de clulas. Las membranas plasmticas de un desmosoma contienen varios miembros de la familia de las cadherinas (desmoglenas y desmocolinas), que se cree conectan el material extracelular situado entre membranas plasmticas en aposicin con los filamentos intermedios de las placas citoplsmicas. La importancia de las cadherinas para mantener la integridad estructural de un epitelio se ilustra por una enfermedad autoinmunitaria (el pnfigo vulgar), en la cual se producen anticuerpos contra una de las desmoglemas, lla-

mados antgeno del pnfigo vulgar. La enfermedad se caracteriza por prdida de la adherencia de clula a clula en la epidermis y la presencia de grandes ampollas sobre la piel. Papel de los receptores de adherencia celular en las seales transmembrana En la figura 7-28 se presenta un resumen de muchos puntos tratados en pginas previas de este captulo. El esquema muestra cada uno de los cuatro tipos de molculas de adherencia celular analizados en secciones previas y sus interacciones con los materiales extracelular y citoplsmico. Uno de los papeles de las protenas integrales de membrana es transmitir informacin a travs de la membrana plasmtica, proceso conocido como seales transmembrana. Aunque este tema ser explorado con detalle en el captulo 15, podemos hacer notar que los cuatro tipos de receptores de adherencia celular ilustrados en la figura 7-28 tienen potencial para efectuar esta funcin. Por ejemplo, integrinas y cadherinas pueden transmitir informacin entre el medio extracelular y el citoplasma por su capacidad para formar enlaces con el citoesqueleto. La unin de una integrina con su ligando puede inducir varias respuestas dentro de una clula, incluyendo cambios del pH citoplsmico, concentracin de Ca2+, fosforilacin de protenas y expresin de genes. Estos cambios, a su vez, pueden alterar el potencial de crecimiento celular, la actividad migratoria o el estado de diferenciacin. La importancia de dichos receptores se puede ilustrar al desarrollar clulas epiteliales de glndula mamaria en ausencia de glucoprotenas extracelulares, como

CAPITULO 7 Interacciones entre las clulas y su entorno

259

Placa Filamentos intermedios Bicapa de lpidos

(W

0.1/*

FIGURA 7-27. Estructura de un desmosoma. a) Micrografa electrnica de un desmosoma de piel de salamandra, b) Modelo esquemtico de la arquitectura molecular de un desmosoma. (a: Segn Douglas E. Kelly. ]. Cell Biol. 28:51, 1966; con permiso de Rockefeller University Press.)

FIGURA 7-28. Revisin de las interacciones de la superficie celular. Se muestran cuatro tipos de interacciones de adherencia de clula a clula y dos tipos de interacciones entre clulas y sustratos extracelulares.

260

CAPITULO 7 Interacciones entre las clulas y su entorno

LA PERSPECTIVA HUMANA Papel de la adherencia celular en la inflamacin y la metstasis

La inflamacin es una de las respuestas primarias de los vertebrados a la infeccin. Cuando alguna parte del cuerpo se contamina con bacterias, como puede ocurrir luego de una herida punzocortante en la piel, el sitio lesionado se convierte en un imn para gran variedad de leucocitos; stos normalmente permanecen en el torrente sanguneo, pero ahora atraviesan la capa endotelial y las membranas bsales subyacentes que revisten las venas ms pequeas (vnulas) de la regin y penetran al tejido. Una vez en el tejido, los leucocitos atacan a los microorganismos invasores e ingieren los desperdicios. Aunque la inflamacin es una respuesta protectora, tambin produce efectos colaterales negativos como fiebre, hinchazn por acumulacin de lquido, enrojecimiento y dolor. Tambin puede desencadenarse una inflamacin inapropiada, como ocurre cuando se interrumpe el flujo de sangre a un tejido luego de un ataque al corazn o de un accidente vascular cerebral. Cuando se restablece el riego sanguneo al rgano, una onda destructiva recorre el tejido (proceso conocido como dao por reperfusin). Una respuesta inflamatoria excesiva tambin puede producir asma, sndrome de choque txico y sndrome de sufrimiento respiratorio. Gran parte de la investigacin se centra en preguntas como la siguiente: cmo se reclutan leucocitos en los sitios inflamados?; por qu detienen su flujo a travs de la corriente sangunea y se adhieren a la pared de los vasos?; cmo penetran en las paredes de los vasos?; cmo pueden suprimirse algunos efectos negativos de la inflamacin sin interferir en los aspectos benficos de la respuesta inflamatoria? Las respuestas a preguntas acerca de la inflamacin se han enfocado en tres tipos de molculas para la adherencia celular: selectinas, integrinas y molculas IgSF. En la figura PH 7-1 se muestra una cadena de acontecimientos propuestos para explicar lo que ocurre durante la inflamacin aguda. Una de las primeras etapas de la inflamacin se presenta conforme las paredes de las vnulas responden a los "llamados de ayuda" del tejido daado cercano (paso 1, fig. PH 7-1). Las clulas endoteliales que revisten estas vnulas se vuelven ms adhesivas para neutrfilos circulantes, un tipo de leucocito fagocitario que efecta un ataque rpido e inespecfico contra patgenos invasores. Este cambio de las propiedades de adherencia es mediado por el despliegue transitorio de selectinas P sobre la superficie de clulas endoteliales activadas en la regin daada (paso 2, fig. PH 7-1). Cuando los neutrfilos encuentran las selectinas forman adherencias transitorias que hacen lento su movimiento. En esta etapa se puede observar que las clulas "ruedan" lentamente a lo largo de la pared del vaso. Algunas compaas de biotecnologa estn tratando de desarrollar frmacos antiinflamatorios que acten al impedir el enlace de ligandos a selectinas. Los anticuerpos antiselectina tienen capacidad para interrumpir el "rodamiento" de los neutrfilos sobre superficies revestidas de selectina P in vitro y suprimir la inflamacin en animales. Se debe lograr un efecto bloqueador semejante utilizando carbohidratos sintticos que entren en competencia con ligandos carbohidrato sobre la superficie de los neutrfilos. Conforme los neutrfilos interactan con el endotelio de vnulas inflamadas, un proceso de activacin (desencadenado por un f osfolpido denominado factor activador de plaquetas,

O
Activacin endotelial Atrapamiento de neutrfilos Activacin de neutrfilos

O
Adherencia de neutrfilos

O
Invasin de neutrfilos

T - ICAM

| - Selectina

- Factor activador de plaquetas

- Integrina (no activada) \ ntegrina (activada)

FIGURA PH 7-1. Etapas en el desplazamiento de neutrfilos desde el torrente sanguneo durante la inflamacin. Estas etapas se describen en el texto.

CAPITULO 7 Interacciones entre las clulas y su entorno

261

producido por el endotelio) incrementa el enlace de integrinas ya situadas sobre la superficie del neutrfilo (paso 3, fig. PH 7-1). Las integrinas activadas se enlazan a molculas IgSF (ICAM)* sobre la superficie de las clulas endoteliales y causan que los neutrfilos detengan su rodamiento y se adhieran firmemente a la pared del vaso (paso 4, fig. PH 7-1). A continuacin, los neutrfilos unidos cambian su forma y se deslizan a travs de la capa endotelial (proceso denominado extravasacin) al interior del tejido daado (paso 5, fig. PH 7-1). Esta cascada de sucesos, que implica diferentes tipos de molculas para adherencia de clulas, garantiza que la unin de clulas sanguneas a la pared vascular y su penetracin subsecuente slo ocurra en sitios donde se requiera la presencia de leucocitos. La importancia de las integrinas en la respuesta inflamatoria se demuestra por una enfermedad rara denominada deficiencia de adherencia leucocitaria (DAL). Las personas con esta enfermedad no producen la subunidad fe que forma parte de algunas integrinas de leucocitos. En consecuencia, los leucocitos de estas personas no pueden adherirse a la capa endotelial de las vnulas, paso requerido para salir del torrente sanguneo. Estos pacientes sufren frecuentes infecciones bacterianas que ponen en riesgo su existencia, y que a veces son mortales. El mejor tratamiento de la enfermedad consiste en trasplante de medula sea que suministra al paciente las cepas celulares capaces de formar leucocitos normales. La administracin de anticuerpos contra la subunidad ^2 puede simular los efectos de DAL al interrumpir el movimiento de neutrfilos y de otros leucocitos hacia afuera de los vasos sanguneos. Estos anticuerpos han mostrado utilidad en la prevencin del dao por

* La presencia de molculas ICAM se puede emplear como indicador de reaccin inflamatoria en evolucin. Por ejemplo, la presencia de ICAM-1 en la bilis de pacientes a quienes se ha practicado trasplante heptico demuestra rechazo del nuevo rgano.

reperfusin luego de un ataque cardiaco. En el cncer, las clulas escapan de los mecanismos normales del cuerpo para controlar el crecimiento y proliferan de manera irregular. Si las clulas cancerosas permanecieran aisladas en una sola masa, como ocurre en condiciones tpicas, por ejemplo, el cncer de tiroides o algunos tipos de cncer cutneo, la mayor parte de los tumores cancerosos seran fciles de curar mediante extirpacin quirrgica del tejido enfermo. Sin embargo, casi todos los tumores malignos desprenden clulas capaces de salir de la masa tumoral primaria, penetrar a la corriente sangunea o los conductos linfticos e iniciar el crecimiento de tumores secundarios en otras partes del cuerpo. La propagacin de un tumor dentro del cuerpo se llama metstasis y es la razn de que el cncer sea una enfermedad tan devastadora. Se cree que las clulas metastticas (clulas cancerosas capaces de formar tumores secundarios) poseen propiedades especiales en la superficie celular no compartidas con la mayor parte de otras clulas del tumor. Las clulas metastticas deben ser menos adherentes que otras clulas para "liberarse" de la masa tumoral; tambin deben poder atravesar gran nmero de barreras, como paredes vasculares o la membrana basal que rodea a los tejidos, y ademas tambin deben ser capaces de invadir tejidos normales para formar colonias secundaras. Igual que los estudios de inflamacin descritos antes, los intentos para entender las bases moleculares de la metstasis se han enfocado en las protenas de la superficie celular que median la adherencia celular. En la produccin de metstasis se ha implicado a cambios en el nmero y tipo de diferentes molculas de adherencia celular, y por lo tanto a la capacidad de las clulas para adherirse a otras clulas o matrices extracelulares. Por ejemplo, la presencia de receptores capaces de unirse a laminina se correlaciona con la conducta metasttica del cncer mamario del ser humano y de las clulas de los melanomas: las clulas que se adhieren con mayor avi-

dez a las superficies revestidas con laminina muestran mayor potencial metasttico cuando se inyectan a ratones de laboratorio. Es de esperar que la presencia de receptores a laminina ayude a las clulas cancerosas a penetrar membranas bsales ricas en laminina. La incubacin de clulas de melanoma con fragmentos de laminina antes de inyectarlos, tratamiento que "amarra" a los receptores de la clula para laminina, reduce notablemente el nmero de tumores desarrollados en los animales husped. En contraste, las clulas malignas con frecuencia contienen un pequeo nmero de receptores para fibronectina (como la integrina ct^/i), propiedad que puede aumentar la capacidad de las clulas para desplazarse sobre su matriz extracelular. Cuando las clulas malignas se someten a manipulaciones de ingeniera gentica para expresar concentraciones mucho ms elevadas de integrinas a$\, disminuye mucho su capacidad para producir tumores en ratones. Cambios en la concentracin de cadherina pueden suministrar otra medida del potencial metasttico. En una investigacin de clulas tumorales epiteliales, cuanto mayor fue el nivel de expresin de cadherina E, menor el potencial metasttico de las clulas. Otros estudios sugieren que la prdida progresiva de cadherinas de la superficie de las clulas cancerosas conforme crecen en un tumor aumenta el nivel de malignidad de las clulas. Al parecer, la presencia de cadherina E favorece la adherencia de las clulas entre s, en tanto que la prdida de este receptor de la membrana favorece la dispersin de las clulas tumorales a sitios distantes. En realidad, cuando se obliga a las clulas malignas a expresar copias extra del gen cadherina E, reducen mucho su capacidad de causar tumores cuando se inyectan a animales husped. Al juntar los resultados de estos estudios se puede concluir que las molculas para adherencia celular desempean un papel importante en el avance de la enfermedad maligna. Aun no se determina si dichas molculas pueden ser objetivos tiles en la teraputica del cncer.

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CAPITULO 7 Interacciones entre las clulas y su entorno

fibronectina y laminina. Estas clulas muestran un aspecto aplanado, indiferenciado y producen leche con muy poca protena. Cuando se aade laminina al cultivo esta protena se une a las integrinas situadas en la superficie de las clulas, estimula una transformacin de las clulas para diferenciarlas en clulas mamarias e induce un incremento 50 veces mayor en la produccin de protenas de la leche. Inversamente, los cambios en el citoplasma pueden generar seales transferibles al exterior a travs de la membrana plasmtica. Las demostraciones de seales "de adentro hacia afuera" provienen de estudios efectuados con integrinas cuya conformacin puede cambiar segn el estado fisiolgico de las clulas. Por ejemplo, las plaquetas de la sangre circulante normalmente no se unen a molculas de fibringeno en la sangre. Sin embargo, cuando se activan en un sitio de lesin vascular, las integrinas anbft situadas en la superficie de las plaquetas sufren un cambio de conformacin que aumenta su afinidad a fibringeno. Elenlace de fibringeno a integrinas activadas provoca agregacin de plaquetas y taponamiento de la herida (fig. 7-15). La formacin de placas de colesterol en la pared de una arteria tambin puede activar plaquetas y conducir a la formacin de un cogulo sanguneo capaz de obstruir una arteria coronaria y provocar ataque al corazn.

7-4 Uniones hermticas: sellado del espacio extracelular

Desde hace varios decenios los bilogos saben que cuando se colocan ciertos tipos de epitelio, como piel de rana o pared de la vejiga urinaria, entre dos compartimientos que contienen diferentes concentraciones de soluto, la difusin de iones o solutos de un compartimiento al otro a travs del epitelio es muy escasa. Dada la impermeabilidad de las membranas plasmticas no es sorprendente que los solutos no puedan difundir libremente a travs de las clulas de una capa epitelial, pero por qu estas sustancias no pueden atravesar los espacios situados entre las clulas? La razn se demostr en la poca de 1960 a 1970, cuando se describieron contactos especializados denominados uniones hermticas, formadas entre clulas epiteliales vecinas. Estas uniones ocurren en el extremo ms alejado del borde apical de los complejos de unin entre clulas epiteliales adyacentes (fig. 7-25). La figura 7-29, a, es una micrografa electrnica de una seccin efectuada a travs de una unin hermtica perpendicular a las membranas de clulas adyacentes. Se observa que las membranas adyacentes hacen contacto en puntos discontinuos en vez de fusionarse en una superficie amplia. Como se indica en el modelo de la figura 7-29, b, se cree que los puntos de contacto celular representan sitios donde las protenas integrales de dos membranas adyacentes se encuentran en el espacio extracelular. Recientemente se purific la protena integral de las uniones hermticas y se le denomin ocludina. El anlisis de fracturas por congelacin, que permite observar la cara interna de la membrana, muestra que las membranas plasmticas de la unin hermtica contienen fibras interconectadas (fig. 7-29, c) que corren paralelas entre s y con la superficie apical del epitelio. Las fibras (o

surcos en la cara opuesta de la membrana fracturada) corresponden a hileras de protenas integrales de membrana alineadas que pueden observarse en seccin transversal en las figuras 7-29, a y b. Las hileras de protenas de membrana forman una banda continua que rodea por completo la clula como un empaque, haciendo contacto por todos lados con las clulas vecinas (fig. 7-29, d). En consecuencia, las uniones hermticas son uniones ocluyentes; o sea, forman una barrera continua de impermeabilidad que sella el espacio extracelular sobre uno de los lados del epitelio en relacin con el otro lado. Las uniones hermticas con gran nmero de fibras tienden a establecer un mejor sellado en comparacin con las uniones de fibras escasas. La capacidad de las uniones hermticas para impedir el paso de molculas entre las clulas se puede demostrar sumergiendo un pedazo de tejido en un material electrnicamente denso, como el metal pesado lantano. Cuando se examina posteriormente el tejido en el microscopio electrnico, se observa que el lantano penetra entre las clulas pero slo hasta los bordes superior e inferior de las uniones hermticas (fig. 7-30). Las uniones hermticas que unen las clulas endoteliales de los capilares cerebrales forman la barrera hematoenceflica, que impide el paso de sustancias de la corriente sangunea al interior del tejido cerebral. La barrera hematoencefica protege al cerebro de la penetracin de solutos "indeseados", pero tambin evita el acceso de muchos frmacos al sistema nervioso central. Por consiguiente, uno de los objetivos de la industria farmacutica es desarrollar tcnicas para "abrir" las uniones hermticas del cerebro y permitir el paso de agentes teraputicos de peso molecular elevado. Es digno de mencionar que algunos iones pequeos e incluso molculas de agua no pueden penetrar ciertas uniones hermticas, pero en cambio las clulas del sistema inmunolgico capaces de penetrar a los tejidos inflamados (pgina 260) pueden atravesar capas epiteliales a travs de estas uniones. Se cree que estas clulas envan una seal que abre la unin, permitindoles el paso. Puesto que durante el paso de los leucocitos no disminuye la resistencia elctrica de la capa epitelial, se cree que las uniones hermticas deben abrirse alrededor de los leucocitos y mantener estrecho contacto con las clulas inmunolgicas que las atraviesan.

7-5 Uniones de abertura y plasmodesmosomas: mediacin de la comunicacin celular

Las uniones de abertura son sitios entre clulas animales especializadas para la comunicacin intercelular. Las micrografas electrnicas revelan que estas uniones de abertura son sitios donde las membranas plasmticas de clulas adyacentes se ponen en estrecho contacto entre s (a una distancia aproximada de 3 nm), pero no entran en'contacto directo. En vez de ello, la abertura entre las clulas es atravesada por "fibras" sumamente finas (fig, 7-31, a) que en realidad son "caeras" moleculares que pasan a travs de membranas plasmticas adyacentes y se abren en el cito-

CAPITULO 7 Interacciones entre las clulas y su entorno '"":".

263

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Molculas de soluto

Molculas de soluto

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Protenas de membrana en la unin hermtica Espacio intercelular Citoplasma Protenas jte membrana en la unin hermtica Bicapa de lpidos

Citoplasma

Bicapa de lpidos

(b)

FIGURA 7-29- Uniones hermticas, a) Micrografa electrnica de un corte a travs de la regin apical de dos clulas epiteliales adyacentes que muestra en qu sitio las membranas plasmticas de las dos clulas se renen en puntos intermitentes en la unin hermtica, b) Modelo de unin hermtica que muestra los puntos intermitentes de contacto entre protenas integrales de dos membranas en aposicin. Cada uno de estos sitios de contacto se extiende en forma de una hilera de protenas dentro de las membranas formando una barrera que bloquea la penetracin de solutos en el espacio entre las clulas. c) Rplica de una fractura por congelacin que muestra la cara E de la membrana plasmtica de una de las clulas de una unin hermtica. Los surcos en a cara E permanecen luego de tirar de las protenas integrales de membrana desde la mitad de la misma. Cada surco representa una lnea continua de contacto entre las clulas (que aparecera como punto de contacto si la unin se hubiera cortado en seccin transversal, como en la parte a), d) Gammagrafa electrnica de la superficie apical de un epitelio que muestra la naturaleza circular de las uniones hermticas, (a: Cortesa de Daniel S. Friend; c: segn Phippa Claude y Daniel A, Goodenogh, ]. Cell Biol. 53:390, 1973; con permiso de Rockefeller University Press; d: cortesa de D. Tarn.)

plasma de clulas vecinas (fig. 7-31, b). Las uniones de abertura unen clulas de casi todos los tejidos de mamferos; las principales excepciones son el msculo esqueltico y la mayor parte del tejido nervioso. En comparacin con otras uniones intercelulares, las uniones de abertura muestran una composicin molecular simple; consisten casi en su totalidad de una protena integral de membrana denominada conexina. Las conexnas se agrupan dentro de la membrana plasmtica para formar un

complejo de mltiples subunidades denominado conexn, que rodea completamente la membrana (fig. 7-31, b). Cada conexn se compone de seis subunidades de conexina dispuestas alrededor de un agujero o anillo central de aproximadamente 1.5 nm de dimetro (fig. 7-31, c). Los conexones son ensamblados en algn punto despus que se sintetizan los polipptidos conexina en el retculo endoplsmico rugoso, pero antes de llegar a la membrana plasmtica (cap. 8). Las conexinas son miembros de una familia multignca;

264

CAPITULO 7 Interacciones entre las clulas y su entorno

0.2/im FIGURA 7-30. Las propiedades ocluyentes de una unin hermtica se revelan experimentalmente sumergiendo el tejido en una suspensin coloidal de un metal electrnicamente denso, el lantano, antes de fijacin. Se observa que el lantano penetra entre las clulas de este tejido epitelial de rata, pero no atraviesa a regin de la unin hermtica. (Cortesa de Eveline E. Schneeberger.)

cuando menos se ha aislado una docena de conexinas diferentes procedentes de distintos tejidos y tambin se han clonado sus genes. Algunas clulas sintetizan ms de un tipo de conexina, pero todava no se ha demostrado de manera concluyente si un solo conexn puede contener ms de un tipo de subunidad de conexina. Durante la formacin de las uniones de abertura, los conexones de membranas plasmticas de clulas opuestas se unen entre s a travs de interacciones de los dominios extracelulares de las subunidades de protena. Una vez alineados, los conexones de clulas adyacentes forman canales completos que conectan el citoplasma de una clula con el citoplasma de su vecina. A veces los conexones se agrupan en regiones especficas formando placas de uniones de abertura que se visualizan mejor en las rplicas de fracturas por congelacin (fig. 7-31, d).

Segn se analiza en La va experimental de este captulo, las uniones de abertura son sitios de comunicacin entre el citoplasma de clulas adyacentes. La existencia de comunicacin intercelular por uniones de abertura (CIUA) se manifiesta por el paso de corrientes inicas o de colorantes de bajo peso molecular, como fluorescena, desde una clula a sus vecinas (fig. 7-32). Las uniones de abertura de mamferos permiten la libre difusin de molculas con peso molecular aproximado a 1 000 daltons o menos. En contraste con los canales inicos altamente selectivos que conectan una clula con el medio externo (pg. 145), los canales de las uniones de abertura son notablemente no selectivos: si la molcula es lo bastante pequea, pasa a travs de la caera. Las uniones de abertura desempean un papel importante en el paso de corrientes inicas de una clula a sus vecinas, como se ilustra por ondas de excitacin que viajan a travs de los msculos cardiaco y liso. La contraccin del corazn de mamfero puede ser estimulada por un impulso elctrico generado en una pequea regin de tejido muscular especializado llamado nodulo sinoauricular, que acta como marcapaso del corazn. Los impulsos se propagan con rapidez a travs de las clulas que constituyen la pared del corazn, pasando de cada clula muscular cardiaca al interior de las clulas vecinas por medio de uniones de abertura que conectan las clulas. De igual manera, el flujo de corriente a travs de las uniones de abertura que conectan las clulas de msculo liso en la pared del esfago o del intestino genera ondas peristlticas coordinadas que se desplazan lentamente en direccin caudal a lo largo de la pared. El hecho de que las uniones de abertura puedan reunir gran nmero de clulas en ntimo contacto citoplsmico constituye en realidad un compartimiento gigantesco relacionado con molculas de tamao suficientemente pequeo para pasar a travs de los canales de comunicacin. Sera de esperar que esta condicin tuviese consecuencias fisiolgicas muy importantes, ya que algunas molculas reguladoras sumamente activas, como el AMP cclico y otros segundos mensajeros (cap. 15), son lo bastante pequeas para atravesar los canales de las uniones de abertura. Por consiguiente, se puede concluir que las uniones de abertura integran las actividades de clulas individuales de los tejidos en una unidad funcional capaz de responder de manera simultnea, aunque slo una parte de las clulas se expongan al estmulo directo. Las uniones de abertura tambin permiten la cooperacin metablica entre las clulas porque comparten metabolitos clave, como ATP, azcares fosfato, aminocidos y muchas coenzimas lo bastante pequeas para atravesar los conductos intercelulares. Plasmodesmosomas Las plantas carecen de uniones especializadas, como las observadas en tejidos animales, pero la mayor parte de las clulas vegetales se conectan entre s por medio de plasmodesmosomas (fig. 7-33), Los plasmodesmosomas son conductos citoplsmicos cilindricos, de 30 a 60 nm de dimetro, extendidos directamente entre clulas adyacentes a travs

CAPITULO 7 Interacciones entre las clulas y su entorno

265

0.15 pm

Citoplasma Partculas en la unin de tura (conexones)

Espacio intercelular

Citoplasma Conexn

Canal hidrfilo

Subunidad de conexina

FIGURA 7-31. Estructura de la unin de abertura, a) Micrograh'a electrnica de un corte a travs de una unin de abertura perpendicular al plano de las dos membranas adyacentes. El aspecto en cuentas de rosario de las membranas se debe a hileras de partculas intramembrana que sobresalen de la superficie de ambas membranas y hacen contacto en el espacio extracelular interpuesto, b) Modelo esquemtico de una unin de abertura que muestra la disposicin de seis subunidades de conexina para formar un conexn, el cual contiene el conducto central que conecta el citoplasma de las dos clulas adyacentes, c) Imagen de alta resolucin basada en difraccin ptica de una membrana aislada teida en negativo que contiene una placa de uniones de abertura (como se muestra en d). Se muestran las dimensiones relativas del anillo y del conexn y el empacamiento hexagonal de las unidades dentro de la placa, d) Rplica de fractura por congelacin de una placa de unin de abertura mostrando el gran

nmero de conexones y su alto grado de concentracin, (a: Segn Camilla Peracchia y Angela F. Dullhunty, J. Cell Biol. 70:419, 1976; con permiso de Rockefeller University Press; c: cortesa de Daniel Goodenough; d: cortesa de David Albertini.)

de la pared celular interpuesta. Los plasmodesmosomas estn revestidos de una membrana plasmtica y de ordinario contienen una varilla central densa, el desmotbulo, derivado del retculo endoplsmico Uso de las dos clulas en contacto. Igual que las uniones de abertura entre clulas

animales, los plasmodesmosomas sirven como sitios de comunicacin intercelular que unen a las clulas de un tejido vegetal para formar una unidad metablica. La va de paso entre clulas vegetales adyacentes presumiblemente se limita al estrecho espacio entre la superf-

266

CAPITULO 7 Interacciones entre las clulas y su entorno

(a)
FIGURA 7-32. Resultados de un experimento que demuestra el paso de solutos de bajo peso molecular a travs de las uniones de abertura. Micrografa en campo oscuro que muestra el paso de fluorescena desde una clula en la cual fue inyectada (X) a las clulas que la rodean. (Segn R. Azarnia y W.R. Loewenstein, J. Memb. Biol. 6:378, 1971.)

50 mm

ce externa del desmotbulo y la superficie interna de la membrana plasmtica. Estudios acerca del movimiento de colorantes inyectados desde una clula al interior de sus vecinas sugiere que, igual que las uniones de abertura, los plasmodesmosomas normalmente son impermeables a molculas mayores de unos 1 000 daltons. Sin embargo, infecciones por virus, como el virus del mosaico del tabaco, incrementan la permeabilidad de los plasmodesmosomas. Como resultado, las partculas virales intactas o sus cidos nucleicos pueden pasar entre las clulas, propagando la infeccin a travs de la planta.

V
(b)

^ Membrana plasmtica

FIGURA 7-33. Plasmodesmosomas. a) Micrografa electrnica de un corte a travs de un plasmodesmosoma del gametofito de un musgo. Se observa el desmotbulo, que consiste en una membrana continua con el RE del citoplasma en ambos lados de la membrana plasmtica, b) Dibujo esquemtico de un plasmodesmosoma. (a: Segn Lewis G. Tilney, Toad J. Cooke, Patricia S. Conney y Man/ S. Tilney, ]. Cell Biol. 112.740, 1992; con permiso de Rockefeller University Press.)

7-6 Paredes celulares

Como es de esperar, una membrana plasmtica de lpidos y protenas de unos 10 nm de espesor slo ofrece proteccin mnima al contenido celular. Por lo tanto, no es sorprendente que las clulas sean estructuras sumamente frgiles. Las clulas de casi todos los organismos diferentes de los animales estn envueltas en una capa externa protectora: los protozoarios tienen una cubierta externa engrosada, en tanto que bacterias, hongos y plantas tiene paredes celulares distinguibles. Restringiremos nuestro anlisis a la pared celular de las plantas. La pared de las clulas vegetales desempea numerosas funciones vitales. Confiere a las clulas su forma caracterstica (fig. 7-34, a); suministra apoyo mecnico a as clulas y, consideradas en conjunto, a toda la planta; protege a

las clulas contra desgaste mecnico, ingreso osmtico de agua y de patgenos; media las interacciones de clula a clula; y acta como barrera primaria a la penetracin de sustancias moleculares de gran tamao, aunque permite con rapidez el paso de molculas pequeas y de iones. Cuando se quita la pared celular de una clula vegetal cultivada tratndola con enzimas desdobladoras de la pared, como la celulasa, se libera la propia clula viviente denominada protoplasto. Como es de esperar, los protoplastos son sumamenete sensibles a cambios en su ambiente externo. En condiciones normales, las clulas vegetales estn rodeadas de lquidos hipotnicos, lo que aumenta su volumen hasta presionar contra la pared celular y ejercer presin por turgencia (pg. 144). En contraste, si se colocan protoplastos en medios ligeramente hipotnicos, se hinchan y se rompen.

CAPITULO 7 Interacciones entre las clulas y su entorno

267

45, proporciona el elemento fibroso de la pared celular. Las molculas de celulosa se organizan en microfibrillas (fig. 7-34, b), que confieren rigidez a la pared celular y suministran resistencia contra fuerzas tnsiles (tirn). Cada microfibrilla mide unos 10 nm de dimetro y se compone de un haz de 40 a 60 molculas de celulosa orientadas paralelamente y unidas entre s por puentes de hidrgeno. La pared celular est compuesta de capas donde las microfibrillas de capas adyacentes casi siempre se orientan en forma perpendicular entre s (fig. 7-34, b), no muy diferente a la organizacin de fibras de colgena en las capas del estroma corneal (fig. 7-4). Las molculas de celulosa se ensamblan en la superficie celular. Un complejo enzimtico integrado a la membrana plasmtica aade unidades de glucosa en el extremo de una molcula de celulosa en crecimiento (fig. 7-35, a,b). La orientacin de las microfibrillas en la superficie externa de la membrana plasmtica al parecer es determinada por la orientacin de los microtbulos corticales situados justo por debajo de la membrana plasmtica (fig. 7-35, b). En contraste con las microfibrillas de celulosa, los materiales de la matriz se sintetizan dentro del citoplasma (fig. 7-35, c) y se transportan a la superficie celular en vesculas secretorias. La matriz de la pared celular se compone de tres tipos de macromolculas: 1. Hemicelulosa, un polmero de la celulosa cuyos residuos de glucosa contienen cadenas laterales de otros azcares, principalmente xilosa (que constituye un xiloglucano). Las molculas de hemicelulosa se unen a la superficie de las microfibrillas de celulosa enlazndolas transversalmente en una red estructural compleja (fig. 7-34, b). 2. Pectinas, que son una clase heterognea de polisacridos con carga negativa que contienen cido galacturnico. Igual que los glucosaminglicanos de las matrices celulares animales, las pectinas forman un extenso gel hidratado que llena los espacios situados entre elementos fibrosos. Adems, el gel que contiene pectina acta como una criba molecular que determina el tamao de las molculas que pueden penetrar a la pared y llegar a la membrana plasmtica. Cuando algn patgeno ataca a una planta, los fragmentos de pectina liberados de la pared actan para estimular una respuesta defensiva de la clula vegetal. Las pectinas tambin constituyen la masa de la laminilla media, una capa que reside entre paredes celulares adyacentes y que sirve como cemento de unin. La pectina purificada se emplea comerciamente para dar consistencia de gel a compotas y gelatinas. 3. Protenas estructurales, que desempean un papel importante para determinar la arquitectura de la pared celular. Entre stas se incluyen protenas ricas en hidroxiprolina, protenas ricas en prolina y protenas ricas en glicina. El porcentaje de estos diferentes materiales en las paredes celulares es muy variable, y depende del tipo de planta, tipo de clula y etapa de la pared. Igual que las matrices extracelulares del tejido conectivo animal, las paredes de

100 nm

FIGURA 7-34. Pared de una clula vegetal, a) Micrografa electrnica de una clula vegetal rodeada por su pared celular, b) Micrografa electrnica que muestra los enlaces transversales de microfibrillas de celulosa y de hemicelulosa en la pared celular de una cebolla luego de extraer los polmeros no fibrosos de la pectina. (a.: Cortesa de W. Cordn WJwley; b: segn M.C. McCann, B. Wells y K. Roberts, J. Cell Sci. 96:329, 1990, con permiso de lite Compcmy ofBiologists Ltd.)

Las paredes de las clulas vegetales a menudo se comparan con materiales de construccin, como concreto reforzado con fibra de vidrio, porque contienen un elemento fibroso integrado en una matriz no fibrosa semejante a un gel. La celulosa, cuya estructura se describi en la pgina

268

CAPITULO 7 Interacciones entre las clulas y su entorno

las clulas vegetales son estructuras dinmicas que pueden modificarse en respuesta a cambios de las condiciones ambientales. Las paredes celulares se originan en una placa celular (descrita en la figura 14-33) situada entre el citoplasma de las clulas hijas recin formadas. Una vez generada la placa celular se secretan materiales en el espacio extracelular, donde se adsorben a las dos superficies de la placa para formar la pared celular, ms compleja, de las clulas adyacentes. Adems de suministrar apoyo mecnico y proteccin contra agentes extraos, la pared celular de una clula vegetal joven no diferenciada debe tener capacidad para crecer en igual proporcin con la clula a la cual rodea. Las paredes de clulas en crecimiento se denominan paredes primarias, y permiten una distensibilidad de la cual carecen las paredes secundarias ms gruesas presentes alrededor de la mayor parte de clulas vegetales maduras. El crecimiento de las paredes primarias ocurre por introduccin de materiales en la estructura de una pared ya existente. Las paredes secundarias tienen mayor contenido de celulosa y, en muchos casos, ms cantidad de lignina (polmero que contiene fenol y es el principal componente de la madera), prcticamente ausente en las paredes primarias. Por ejemplo, las paredes de clulas xileno contienen gran cantidad de lignina que suministra el apoyo estructural necesario para la translocacin de agua. La superficie externa de las paredes de clulas epidrmicas de las hojas contiene una sustancia crea que evita la prdida de agua y protege contra bacterias y hongos.

Microtbulo

Citoplasma

(b)
FIGURA 7-35. Sntesis de los materiales de la pared de una clula vegetal, a) Rplica de fractura por congelacin de la membrana de la clula de una alga mostrando la cara P con un grupo de rosetas organizadas en disposicin hexagonal. Se cree que estas rosetas representan las enzimas sintetizadoras de celulosa situadas dentro de la membrana plasmtica, b) Modelo de la acumulacin de fibrillas de celulosa. Se piensa que cada roseta forma una sola microfibrilla que se relaciona lateralemente con las microfibrillas de otras rosetas para formar una fibra cada vez mayor. Toda la disposicin de rosetas puede desplazarse lateralemente en la membrana conforme va siendo empujada por las molculas de celulosa que se alargan. Los estudios sugieren que a direccin del movimiento de las rosetas de la membrana es determinada por la orientacin de los microtbulos presentes en el citoplasma cortical por debajo de la membrana plasmtica (analizado en el captulo 9). c) Micrografa electrnica del complejo de Golgi de una clula de la cubierta de una raz perifrica con anticuerpos contra polmeros del cido galacturnico, uno de los principales componentes de la pectina. Este material, igual que las otras pectinas y la hemicelulosa, se ensambla en el complejo de Golgi. La barra representa 0.25 fim. (a: Segn T,H. Giddings, }r., D.L. BroweryL.A. Staehelin, J. Cell Biol. 84:332, 1980; c: segn Margaret Lynch y LA. Staehelin, J. Cell Biol. 118:477, 1991; todas con permiso de Rockefdler University Press.)

CAPITULO? Interacciones entre las clulas y su entorno

269

LA VIA E X P E R I M E N T A L

Papel de las uniones de abertura en la comunicacin intercelular

Segn la informacin presentada en el captulo precedente, se podra asumir que la transmisin sinptica siempre ocurre por liberacin a partir de la neurona presinptica de un transmisor qumico que se une a la superficie de la clula postsinptica. Este fue el punto de vista prevaleciente hasta el decenio de 1950, cuando Edwin Furshpan y David Potter, del University College, en Londres, encontraron una notable excepcin. Furshpan y Potter estaban estudiando la transmisin sinptica entre neuronas gigantes en la cuerda nerviosa del langostino. Observaron que una pequea despolarizacin subumbral inducida en la clula nerviosa presinptica causaba despolarizacin muy rpida {0.1 mseg) en la clula postsinptica.1'2 Si las clulas nerviosas se conectaban por sinapsis qumica, en el potencial de membrana no deba propagarse un cambio subumbral a la clula postsinptica, puesto que no es suficiente para estimular la liberacin de molculas de neurotransmisor. Aun si se liberaran molculas de neurotransmisor, posiblemente no induciran cambios tan rpidos en la clula postsinptica. Furshpan y Potter concluyeron que las dos clulas nerviosas estaban conectadas por una sinapsis de tipo diferente, una sinapsis electrotnica, en la cual las corrientes elctricas procedentes de la clula presinptica podan fluir directo a la clula postsinptica en el otro lado de la sinapsis. Se asumi que ese tipo de conexin de clula a clula, que permite el flujo de corriente entre clulas, era peculiar de clulas excitables como las neuronas y se especializaba en la comunicacin intercelular. A principio del decenio de 1960, Yoshinobu Kanno y Werner Loewenstein, de la Columbia University, estudiaban las propiedades de permeabilidad de la envoltura nuclear, el complejo membranoso que rodea al ncleo. Para determinar si los iones podan atravesar la envoltura nuclear analizaron fas grandes clulas que constituyen los tejidos epiteliales de las larvas de la mosca de la fruta (clulas que suministran los cromosomas gigantes tan tiles para estudios genticos). Estas clulas eran lo bastante grandes para permitir la penetracin de microelectrodos capaces de inducir y registrar corrientes inicas (fig. VE 7-1). Para su sorpresa, Kanno y Loewenstein observaron que cuando se inyectaban iones en el ncleo de una clula, el flujo de iones (medido como corriente elctrica) se propagaba dentro del citoplasma de la clula inyectada y tambin flua directo al interior del citoplasma de la clula adyacente. En realidad, el potencial registrado en la clula adyacente era casi tan grande como el de la clula donde originalmente se induca la corriente. Kanno y Loewenstein concluyeron que las clulas epiteliales de la glndula salival estaban elctricamente acopladas entre s, trmino que indica que los iones pueden fluir libremente de una clula a la otra a travs de uniones intercelulares de baja resistencia.3 Si los pequeos iones inorgnicos pueden pasar a travs de estas uniones entre las clulas vecinas, qu ocurre con sustancias de mayor tamao? Cuando se inyect un pequeo volumen de iones fluorescentes de fluorescena (peso molecular de 376 daltons) en el citoplasma de una clula mediante una micropipeta, la fluorescencia se difundi con rapidez hacia las clulas adyacentes hasta que toda la capa epitelial brillaba por la presencia del trazador (como en la figura 7-32). En contraste, de las clulas no se sali colorante fluorescente alguno hacia el medio externo, lo que indica que las molculas de fluorescena difundan directo del citoplasma de una clula al interior del citoplasma de las clulas adyacentes por me.dio de contactos permeables de clula a clula.4 Pronto se efectuaron observaciones similares en varios tipos diferentes de clulas epiteliales y mesenquimatosas, incluyendo las de varios mamferos; esto indica que tales uniones comunicantes estn muy ampliamente difundidas. El descubrimiento de que la clula contiene sitios en su superficie que permiten el libre intercambio de sustancias con las clulas vecinas desafi el concepto bien establecido de que las clulas eran unidades independientes completamente aisladas de su medio exterior. Los estudios de microscopa electrnica demuestran que la superficie de la clula est rodeada por una membrana plasmtica continua, pero la estructura de esta membrana se altera de alguna manera en las regiones donde las clulas hacen contacto con otras clulas. De otra manera, sera imposible para las sustancias desplazarse directo del citoplasma de una clula al interior de otra. En 1967, Jean Paul Revel y M. J. Karnovsky5 descubrieron uniones intercelulares que contienen canales entre clulas en estrecha aposicin. Las micrografas electrnicas de estas uniones mostraron una hendidura distinguible entre clulas adyacentes, lo que llev a los investigadores a darles el nombre de "uniones

FIGURA VE 7-1. Micrografa que muestra la instalacin de microelectrodos de registro en clulas vivientes del tbulo de Malpighi de una clula de insecto. (Cortesa de Werner R. Loewenstein.)

270

CAPITULO 7 Interacciones entre las clulas y sw entorno

nM 1000

750(a)

500-

250-

0[Ca2+j
(b)

10s

20s

FIGURA VE 7-2. Ondas de calcio inducidas por estimulacin mecnica en: a) un cultivo testigo de clulas de un glioma C6 de rata, y b) una clona de las mismas clulas mostradas en a, pero a la cual se le ha transfectado DNA conexina43. El DNA inyectado se transcribe y traduce en las clulas transfectadas y las molculas de la protena conexina se incorporan a la membrana plasmtica. Cuando se estimula mecnicamente una de las clulas no transfectadas hay muy poco paso de Ca2+ a sus vecinos; en contraste, cuando las clulas que expresan el gen conexina se estimulan mecnicamente, pasa una onda de Ca2* de una clula a otra a travs de las uniones de abertura formadas por la protena conexina43. (Segn Andrew C. Charles y cois. }. Cel Biol. 118:197, 1992; con permiso de Rockefdler University Press.)

de abertura" para distinguirlas de las uniones hermticas donde las clulas adyacentes entran en contacto directo. Se han efectuado varios estudios para saber ms acerca del tamao de los canales que conectan el citoplasma de clu-

las adyacentes. En el laboratorio de Loewenstein se probaron sondas fluorescentes unidas a pptidos de longitud variable. Se observ que molculas mayores de 1 200 daltons podan difundir entre las clulas de las glndulas salivales de larvas

Glioma

la)

(b)

FIGURA VE 7-3. a) Cuando una pequea masa de clulas de un glioma C6 se implant en el cerebro de una rata, las clulas se desarrollaron en una gran masa tumoral luego de dos semanas de crecimiento, b) Las mismas clulas que se han transfectado con DNA conexina43 y que se presume participan en a comunicacin intercelular a travs de las uniones de abertura se desarrollan en una masa tumoral mucho ms pequea durante un periodo similar. (Segn Christian C. Naus y cois. Cncer Res. 52:4210, 1992.)

CAPITULO 7 Interacciones entre las clulas y su entorno

271

de insectos.6 Segn estimaciones del tamao de estas molculas, los investigadores concluyeron que el dimetro interno del canal era alrededor de 10 a 15 A (1.0 a 1.5 nm), valor que concuerda estrechamente con el estimado por micrografa de alta resolucin de las uniones de abertura tomadas con microscopio electrnico.7

PAPEL DE LAS UNIONES DE ABERTURA EN EL CNCER

Una de las primeras cuestiones consideradas por Kanno y Loewenstein luego de su descubrimiento de los contactos intercelulares permeables fue si este mismo tipo de contacto estaba presente en las clulas cancerosas. Se saba que el ndice de crecimiento de las clulas normales era influido por estmulos procedentes de su ambiente. Tal vez uno de los factores que permitieron a las clulas cancerosas apartarse de los mecanismos de control del crecimiento que prevalece en las clulas normales era la prdida de su capacidad para recibir molculas reguladoras de sus clulas vecinas. Kanno y Loewenstein investigaron esta posibilidad midiendo_el flujo de corriente inica en tejido heptico normal en comparacin con el flujo entre clulas de varios tumores hepticos. Se pudo descubrir corriente inica que flua con rapidez entre las clulas del hgado normal de una rata, pero no hubo paso de corriente entre las clulas de ninguno de los tumores hepticos investigados.8 A partir de estos estudios iniciales se han analizado cientos de clulas cancerosas de diferente tipo en relacin con su capacidad para efectuar comunicacin intercelular por uniones de abertura. Se ha notado que los resultados iniciales de Loewenstein y Kanno siguen siendo vlidos para la mayor parte, pero no para todas las clulas cancerosas investigadas.Revisado en 9'10 No es sorprendente que no todas las clulas cancerosas muestren las mismas propiedades en relacin con la comunicacin intercelular por uniones de abertura. La conversin de una clula normal a clula maligna es un fenmeno de mltiples etapas que pueden ocurrir como resultado de cambios en una gran variedad de genes diferentes (captulo 16). Est claro que hay diferentes mecanismos por los cuales una clula puede perder el control del crecimiento. Algunos de estos mecanismos parecen implicar la prdida de la capacidad de las clulas para transmitir seales a travs de las uniones de abertura. En los tumores donde ocurre esto, a menudo hay prdida progresiva de comunicacin intercelular por uniones de abertura conforme la clula se maligniza cada vez ms.11 Adems, hay correlacin entre la prdida de comunicacin intercelular por uniones de abertura y el incremento del potencial metasttico de una poblacin de clulas.12 El potencial metasttico es una propiedad que requiere que las clulas cancerosas ignoren a las clulas adyacentes y avancen por s solas; por lo tanto, no es sorprendente que esta conducta requiera que una clula interrumpa sus vas de comunicacin con las clulas vecinas. Los datos obtenidos por correlacin entre una situacin (o sea, prdida de comunicacin intercelular por uniones de abertura) y otra (o sea, malignidad) quiz slo sean circunstanciales. La mejor prueba de una relacin causal directa entre las dos

situaciones proviene de estudios en los cuales se "obliga" a las clulas cancerosas a expresar protenas de unin de abertura (conexinas) por microinyeccin de molculas de DNA que codifican dichas protenas. Cuando a las clulas glioma C6, un tipo de clulas de tumor cerebral, se les inyecta DNA que codifica la protena conexina43, se incrementa de manera espectacular la comunicacin intercelular por uniones de abertura entre las clulas tumorales (fig. VE 7-2), con disminucin correspondiente de la tasa de divisin celular.13 De igual manera, cuando las clulas glioma C6 que se les ha transferido DNA que codifica conexina43 son implantadas en el cerebro de ratas adultas, generan tumores mucho ms pequeos que las clulas glioma a las cuales no se les ha transferido DNA (fig. VE 7-3).14 Estos datos apoyan el papel propuesto de comunicacin intercelular por uniones de abertura en el crecimiento de tumores cerebrales. Si los defectos en este tipo de unin desempean un papel en la formacin de tumores, entonces se deben obtener datos mediante mutaciones en genes que afectan la estructura y funcin de la unin de abertura. Con esta idea en mente, se han iniciado ahora estudios de deteccin de mutaciones de conexinas en tumores humanos.15

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CAPITULO 7 Interacciones entre ias clulas y su entorno

SINOPSIS
El espacio extracelular se extiende por fuera de la superficie externa de la membrana plasmtica y contiene varios materiales secretados que influyen en la conducta de las clulas. El glucocliz incluye porciones carbohidrato de glucoprotenas y glucolpidos de la membrana junto con protenas y polisacridos relacionados que protegen la clula y gobiernan sus interacciones con sustratos no vivientes y otras clulas. Los tejidos epiteliales se apoyan sobre una membrana basal que consta de una delgada red entretejida de materiales extracelulares. Varios tipos de tejido conectivo, incluyendo tendones, cartlago y el estroma corneal, contienen una matriz extracelular expansiva que confiere al tejido sus propiedades caractersticas, (p. 239). Los principales componentes de las matrices extrac chilares incluyen colgena, proteoglicanos y una variedad de protenas, como fibronectina, laminina y tenascinas. Cada protena de la matriz extracelular tiene una estructura modular compuesta de dominios que contienen sitios de enlace para unir una clula con otra y receptores sobre la superficie celular. Como resultado, estos diferentes materiales extracelulares interactan para formar una red interconectada unida a la superficie celular. La colgena consiste en protenas fibrosas muy abundantes que confieren a la matriz extracelular capacidad para resistir fuerzas de tensin. Los proteoglicanos constan de un ncleo de protena al cual se unen cadenas de glucosaminoglicanos con carga negativa. A su vez, los proteoglicanos individuales pueden juntarse en complejos masivos sumamente hidratados que sirven como material amorfo de empaque que llena el espacio extracelular (p. 241). Las integrinas son receptores de la superficie celular implicadas en interacciones dependientes de calcio entre las clulas y su sustrato. Las integrinas son protenas integrales de membrana heterodimricas cuyos dominios citoplsmicos pueden interacruar con los componentes del citoesqueleto y sus dominios extracelulares a veces contienen sitios de enlace para varios materiales extracelulares. Los materiales extracelulares que se enlazan a las integrinas lo hacen por enlace al rripptido RGD. El enlace de un ligando extracelular a una integrina puede enviar seales al interior de la clula y desencadenar cambios en las actividades celulares (p. 247). Las clulas se fijan a su sustrato por medio de sitios especializados en la superficie celular, como contactos focales y hemidesmosomas. Los contactos focales son sitios donde las clulas cultivadas se fijan a la superficie del plato de cultivo. La membrana plasmtica de un contacto focal contiene agrupamientos de integrinas cuyos dominios citoplsmicos estn unidos a microfilamentos del citoesqueleto que contiene actina. Los hemidesmosomas son sitios de unin de clulas in vivo a una membrana basal subyacente. En un hemidesmosoma, la membrana plasmtica contiene grupos de integrinas conectados a la membrana basal sobre su superficie externa y a filamentos intermedios que contienen queratina sobre la superficie interna (p. 249). La adherencia de clulas a otras clulas es mediada por varias familias distintas de protenas integrales de membrana: selectinas, integrinas, cadherinas y miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF). Las selectinas se enlazan a disposiciones especficas de grupos de carbohidratos que sobresalen de la superficie de otras clulas y median interacciones transitorias dependientes de calcio entre leucocitos circulantes y las paredes de los vasos sanguneos en sitios de inflamacin y coagulacin. Las molculas de adherencia celular de la superfamilia Ig son mediadoras de la adherencia clula a clula independiente de calcio, como se ejemplifica con molculas de adherencia a clulas neurales, que desempean un papel importante en el desarrollo del sistema nervioso. Una protena IgSF sobre una clula puede interactuar con una integrina o con la misma, o con otra protena IgSF de otra clula. Las cadherinas median la adherencia clula a clula dependiente de calcio al unirse a la misma especie de cadherina en la clula opuesta, y por lo tanto facilitan la formacin de tejidos compuestos de tipos similares de clulas. Las cadherinas pueden ser particularmente importantes durante el desarrollo embrionario, segn se puede ejemplificar por su papel en la conversin de clulas mesenquimatosas en epiteliales. Adems de su papel en la adherencia celular, todas estas protenas tienen potencial para actuar como intermediarias en las seales transmembrana (p. 251), La firme adherencia entre las clulas se facilita por la formacin de uniones adherentes especializadas y desmosomas. Las uniones adherentes rodean una clula cerca de su superficie apical, lo que permite el contacto entre la clula y todas sus vecinas que la rodean. Las membranas plasmticas de las uniones adherentes contienen ncleos de cadherinas que forman contactos adherentes entre s en el espacio extracelular situado entre la superficie de las clulas. Los dominios citoplsmicos de las cadherinas se unen por medio de protenas intermedias a los filamentos de actina del citoesqueleto. Los desmosomas son placas entre las clulas caracterizados por una concentracin de materiales extracelulares entre las membranas plasmticas y las placas citoplsmicas densas sobre la superficie interna de la membrana. Los desmosomas son sitios de concentracin de protenas integrales de la familia cadherina que se cree conectan el material extracelular situado entre las membranas plasmticas en aposicin con filamentos intermedios de iat, placas citoplsmicas (p. 256). Las uniones hermticas son sitios especializados de contacto que impiden la difusin de solutos entre las clulas a travs del epitelio. Una seccin transversal a travs de las uniones hermticas muestra que la superficie externa de las clulas adyacentes entra en contacto directo en sitios intermitentes. El examen de la membrana por fracturas por congelacin muestra los sitios que contienen hileras de partculas alineadas que forman fibras dentro de las membranas plasmticas de clulas adyacentes (p. 262), Uniones de abertura y plasmodesmosomas son sitios especializados de comunicacin entre clulas adyacentes en ani-

CAPITULO? Interacciones entre las clulas y su entorno

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males y vegetales, respectivamente. Las membranas plasmticas de clulas adyacentes en la regin de la unin de abertura contienen canales formados en disposicin hexagonal de subunidades de conexina que forman un conexn. El conexn de una membrana se encuentra a la misma altura que el conexn de la membrana adyacente y forma un conducto central que conecta el citoplasma de una clula con el citoplasma de la clula adyacente. El conducto central de un conexn tiene un dimetro aproximado de 1.5 nm, que permite la difusin directa entre las clulas de sustancias hasta de unos 1000 datons. El paso de corrientes inicas a travs de las uniones de abertura desempea un papel crtico en numerosos procesos fisiolgicos, incluyendo la propagacin de la excitacin a travs del tejido muscular cardiaco y del tejido muscular liso en la pared del conducto digestivo. Los plasmodesmosomas son canales citoplsmicos cilindricos que se extienden entre clulas vegetales adyacentes directamente a travs de la pared celular interpuesta. Estos canales, que de ordinario contienen un tbulo

membranoso en forma de barra, permiten el libre paso de molculas de soluto de unos 1 000 datons o menos (p. 262). Las clulas vegetales estn rodeadas por una compleja pared celular compuesta de varios materiales secretados que le suministran apoyo mecnico y la protegen de influencias potencialmente nocivas. Las microfibrillas de celulosa, compuestas de haces de molculas de celulosa y secretadas por enzimas que residen dentro de la membrana plasmtica, proporcionan rigidez y resistencia a la traccin. Las molculas de hemicelulosa actan para entrelazar transversalmente a las fibras de celulosa, en tanto que las pectinas, una clase heterognea de polisacridos con carga negativa, forman un gel extensamente unido que llena los espacios situados entre los elementos fibrosos de las paredes celulares. Igual que la matriz extracelular de las clulas animales, las paredes de las clulas vegetales son estructuras dinmicas que pueden modificarse en respuesta a cambios en las condiciones ambientales (p. 266).

PREGUNTAS DE REPASO
1. Distinguir entre glucocliz, membrana basal y matriz extracelular de tejido cartilaginoso. 2. Contrastar el papel de colgena, proteoglicanos y fibronectina en el espacio extracelular. 3. Elaborar una lista de unas cuantas funciones de la matriz extracelular en tejidos animales. 4. Qu tipos de protena integral de membrana desempean un papel clave en la mediacin de interacciones entre la superficie celular y la matriz extracelular? Entre las superficies celulares de clulas vecinas? Cul de estas interacciones requiere la presencia de Ca2+ o Mg2+? 5. Cul es la diferencia entre el proteoglicano de la matriz cartilaginosa en cuanto a estructura y funcin, y el sindecano de la superficie celular? 6. Cmo puede una protena de la superficie celular participar tanto en a adherencia celular como en la transduccin de seales a travs de la membrana? 7. Distinguir entre un contacto focal y un hemidesmosoma; un hemidesmosoma y un desmosoma; un desmosoma y una unin adherente. 8. Qu tipo(s) de uniones intercelulares contienen filamentos de actina? Cules contienen filamentos intermedios? Cules contienen integrinas? Cules contienen cadherinas? 9. Qu datos nos suministra el anlisis de una fractura por congelacin acerca de la estructura de una unin, que no pueden obtenerse por el examen de cortes de tejido teidos? 10. Comparar la disposicin de las protenas integrales de membrana en la unin hermtica en comparacin con la unin de abertura. 11. En qu son similares los plasmodesmosomas y las uniones de abertura? En qu son diferentes? Se podra esperar que una protena de tamao moderado pase a travs del plasmodesmosoma? 12. Describir los componentes que constituyen la pared de una clula vegetal y el papel de cada uno en la estructura y funcin de la pared.

PREGUNTAS ANALTICAS
1. La adherencia de las clulas a menudo se puede impedir in vitro tratando las clulas con agentes especficos. Cul de las siguientes sustancias se podra esperar que impidiera la adherencia de clulas mediada por selectinas? Con la adherencia de clulas mediada por molculas de adherencia a clulas neurales? Las sustancias son tripsina, que digiere protenas; un pptido, que contiene RGD; neuraminidasa, que elimina cido silico de un oligosacrido; colagenasa, que digiere colgena; hialuronidasa, que digiere cido hialurnico; EGTA, que se enlaza a iones Ca2+ en el medio. 2. Qu sustancia se podra aadir a un cultivo para impedir la migracin de las clulas de la cresta neural? Para evitar el crecimiento de un axn? Para suprimir la adherencia de fibroblastos al sustrato? 3. En el texto se hizo notar que los ratones que carecen de un gen para fibronectina no sobreviven durante las primeras etapas del desarrollo embrionario. Mencione dos procesos que se interrumpen en esos embriones. 4. Cmo piensa usted que cambiaran las propiedades del cartlago si careciera de una matriz extracelular? Cmo afectara esto a las propiedades del estroma corneal, o a las propiedades de un tendn? 5. En qu son similares las matrices extracelulares de los animales y las paredes celulares de las plantas en cuanto a su estructura? 6. Ya se mencion que dos diferentes enfermedades por autoinmunidad, una que produce anticuerpos contra un componente de los hemidesmosomas y otra que produce

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CAPITULO 7 Interacciones entre las clulas y su entorno cree usted que este tratamiento ayud a revelar la presencia de las uniones de abertura? Utilizando un procedimiento similar, en qu sera diferente una unin de abertura de una unin hermtica? 10. Por qu sera de esperar que disminuyendo la temperatura del medio en el cual crecen las clulas se afectara la capacidad de las mismas para formar uniones de abertura entre s? 11. Algunas de las uniones intercelulares ocurren como cinturones que abarcan a la clula, en tanto que otras ocurren como placas discretas. Cmo se correlacionan estos dos tipos de arreglos estructurales con las funciones de las respectivas uniones? 12. Proponer algn mecanismo que pueda explicar por qu el virus del mosaico del tabaco puede alterar la permeabilidad de un plasmodesmosoma. Cmo podra usted demostrar su proposicin? 13. Por qu piensa usted que las clulas animales pueden sobrevivir sin el tipo de paredes celulares que se observan en las clulas de casi todos los otros grupos de organismos?

anticuerpos contra un componente de los desmosomas, causan ampollas graves en la piel. Por qu se pensara que estas dos enfermedades tienen sntomas similares? 7. Cul de los diferentes tipos de molculas que median la adherencia celular es ms probable que se encargue de la especie de clasificacin mostrada por las clulas de la figura 7-19? Por qu? Cmo se podra demostrar esa conclusin? 8. FSH es una hormona hpofisaria que acta sobre las clulas foliculares del ovario para iniciar la sntesis de AMP cclico que estimula varios cambios metablicos. Normalmente, FSH no tiene efectos sobre clulas musculares cardiacas. Sin embargo, cuando se desarrollan juntas las clulas del folculo ovrico y las clulas musculares cardiacas en un cultivo mixto se observa que algunas clulas musculares cardiacas se contraen despus de aadir FSH al medio. Cmo puede explicarse esta observacin? 9. En la primera descripcin de uniones de abertura se emplearon tejidos sumergidos en una solucin de sales de lantano. Considerando el modelo de la figura 7-31, cmo

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CAPITULO

Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

8-1 Naturaleza dinmica del sistema endomembrana 8-2 Algunas tcnicas para el estudio de las citomembranas H-3 Retculo endoplsmico i-4 El complejo de Golgi 8-5 Lisosomas 8-6 Vacuolas de clulas vegetales La perspectiva humana: Enfermedades producidas por defectos de la funcin lisosmica 8-7 Captacin celular de partculas y rnacromolculas La va experimental: Endocitosis mediada por receptores

FIGURA 8-A. En esta micrografa se indican varios elementos del sistema endomembrana de un par de clulas epiteliales cultivadas, teidas con anticuerpos fluorescentes para mostrar la presencia del retculo endoplsmico (verde) y de os endosomas (rojo). El ncleo aparece en azul. (Cortesa de Katrina Alien, Man/ Rycoiuski y ]ean Wilson, Universidad de Arizona.)

bservado con microscopio de luz, el citoplasma de casi todas las clulas vivientes parece relativamente desprovisto de estructura. Incluso antes que empezara el siglo XX, el examen de cortes de tejido teidos indicaba la existencia de una extensa red membranosa dentro del citoplasma. Sin embargo, no fue sino hasta el desarrollo del microscopio electrnico, en el decenio de 1940, que los bilogos comenzaron a apreciar las diversas disposiciones de las estructuras membranosas presentes en el citoplasma de la mayor parte de las clulas eucariotas. Los primeros investigadores en microscopa electrnica observaron vesculas rodeadas de membrana de dimetros diferentes que contenan materiales de diversa densidad electrnica; largos canales enlazados por membranas que se ramifican a travs del citoplasma para formar una red interconectada de conductos, y pilas de sacos aplanados rodeados de membranas llamadas cisternas. De los primeros estudios con microscopa electrnica y de las investigaciones bioqumicas que siguieron cada vez fue ms evidente que el citoplasma de las clulas eucariotas estaba gubdividido en varios compartimientos rodeados por barreras membranosas. A medida que se examinaron ms tipos de clulas se demostr que las estructuras membranosas del citoplasma formaban distintos organelos identificables en diversas clulas, desde levaduras hasta plantas y animales evolutivamente desarrollados. Lo extenso de las estructuras membranosas que ocupan el citoplasma de una clula eucariota se ilustra en la micrografa de una clula de la raz de una planta de maz mostrada en la figura 8-1.

276

CAPITULO 8 Sistemas de a membrana citoplsmica; estructura, funcin y trfico de membrana

277

FIGURA !-1. Organelos membranosos citoplsmicos. El citoplasma de esta clula de la cubierta de la raz de una planta de maz tiene diversa disposicin de organelos membranosos. En este captulo examinaremos la estructura y funcin de muchos de estos organelos. (Cortesa de Hton H. MoUenhauer.)

En el presente captulo estudiaremos la estructura y las funciones del retculo endoplsmico, el complejo de Golgi, los endosomas, lisosomas y vacuolas. Considerados en conjunto, estos organelos membranosos forman un sistema de endomembranas estructural y funcionalmente interrelaconadas.1 Otros organelos membranosos del citoplasma, la mitocondria, los peroxisomas y los cloroplastos, fueron tema de los captulos precedentes.

8-1 Naturaleza dinmica del sistema endomembrana

Aunque el microscopio electrnico puede suministrar imgenes exquisitamente detalladas de las partes de una clula, inevitablemente son figuras congeladas en el tiempo. Las clulas ejecutan procesos dinmicos, pero el microscopio electrnico slo capta escenas estticas. Por consiguiente, debemos tratar de poner en accin a los organelos de la clula en nuestra propia imaginacin. Muchos estudios, algunos de los cuales se analizan en este captulo, muestran que casi todos los organelos membranosos del citoplasma forman parte de una red dinmica integrada en la cual se intercambian materiales de una parte de la clula a otra en ambos sentidos. En la mayor parte de los casos, los vehculos que llevan materiales entre los organelos, por ejemplo
1 La envoltura nuclear tambin puede considerarse parte del sistema endomembrana, ya que se contina con el retculo endopisrnico y es sitio de sntesis de protenas de membrana. Sin embargo, la envoltura nuclear no es un organelo citoplsmica y su principal papel es regular el flujo de material entre el ncleo y el citoplasma. En consecuencia, su estructura y funcin se revisan en el captulo 12.

del retculo endoplsmico al complejo de Golgi, son minsculas vesculas de transporte que se forman por gemacin a partir de un compartimiento membranoso. Estas vesculas se mueven a travs del citoplasma de manera dirigida, con frecuencia a lo largo de vas formadas por elementos del citoesqueleto, y luego se fusionan con la membrana de un compartimiento diferente que acepta tanto la carga soluble de la vescula como su envoltura membranosa (fig. 8-2, V). Ciclos repetidos de gemacin y fusin desplazan materiales a lo largo de las vas a travs de la clula. Se han identificado diversas vas en el citoplasma (fig. 8-2). Se puede notar una va biosinttica en la cual se sintetizan materiales en el retculo endoplsmico o en el complejo de Golgi, se modifican durante su paso a travs del complejo de Golgi y se transportan en el citoplasma a diferentes destinos, como la membrana plasmtica, un lisosoma, o la vacuola ms grande de una clula vegetal. Esta ruta se conoce como la va secretoria, pues gran parte de los materiales sintetizados en el retculo endoplsmico o en el complejo de Golgi estn destinados a ser descargados (secretados) hacia afuera de la clula. La va biosinttica secretoria incluye flujo de lpidos, carbohidratos y protenas. En la primera parte del captulo slo consideraremos sntesis y transporte de protenas (fig. 8-2) y ms tarde volveremos al ensamblado y desplazamiento de ciertos carbohidratos y lpidos de membrana. Las actividades secretorias de la clula se pueden dividir en dos tipos: elemental y regulada. Durante la secrecin elemental se transportan materiales desde su sitio de sntesis y se descargan en el espacio extracelular de manera continua, no regulada. La mayor parte de las clulas participan en la secrecin elemental, proceso que contribuye no slo a la formacin de matriz extracelular (seccin 7-1), sino tambin a la formacin de la propia membrana plasmtica. Durante la secrecin regulada se secretan y almacenan materiales en granulos secretorios rodeados de membrana en las regiones perifricas del citoplasma y slo se descargan en respuesta a un estmulo apropiado. La secrecin regulada ocurre, por ejemplo, en clulas que producen y liberan hormonas o enzimas digestivas y en clulas nerviosas que liberan sustancias neurotransmisoras. . En tanto que la va secretoria desplaza materiales hacia afuera de la clula, la va endoctica opera en direccin opuesta llevando materiales del exterior de la clula (y desde la superficie de la membrana celular) a compartimientos como los endosomas y lisosomas localizados en el interior de la clula (fig. 8-2). El movimiento de vesculas y de los materiales encerrados en ellas a lo largo de diferentes vas dentro de una clula es anlogo a los movimientos de vehculos de carga que llevan diferentes tipos de carga a lo largo de las calles de una ciudad. Ambos tipos de transporte requieren normas definidas de trfico para garantizar que los materiales destinados a diferentes localidades sean entregados con precisin en los sitios apropiados. Por ejemplo, el trfico de protenas al interior de una clula de la glndula salival requiere que las protenas del moco salival, elaboradas en el retculo endoplsmico, se dirijan especficamente hacia las vesculas secretorias; en tanto que las enzimas lisosmicas, tambin elaboradas en el retculo endoplsmico, se enven

278

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana FIGURA 8-2. Las vas biosinttica y endoctica unen a las endomembranas en una red dinmica interconectada. a) La va biosinttica describe el flujo de materiales {especialmente protenas) del retculo endoplsmico a travs del complejo de Golgi hacia diferentes sitios, incluyendo lisosomas, endosomas, vesculas secretorias, vacuolas y la membrana plasmtica. La va endoctica mueve materiales desde la superficie de la clula al interior de la misma por medio de endosomas y isosomas, donde en general son desdoblados por las enzimas lisosmicas. La va endoctica incluye el desplazamiento de protenas de membrana y materiales extracelulares. Los carbohidratos y los lpidos pueden seguir rutas semejantes, segn se describe al final del captulo, b) Diagrama que ilustra el proceso de transporte vesicular mediante el cual los materiales son llevados desde un compartimiento donador a un compartimiento receptor. Las vesculas se forman por gemacin de la membrana, durante la cual las protenas de la membrana donadora se pueden incorporar a la vescula membranosa y las protenas solubles en el compartimiento donador pueden quedar encerradas en la luz de la vescula. Cuando posteriormente la vescula de transporte se fusiona, las protenas de la vescula de la membrana entran a formar parte de la membrana receptora y las protenas solubles quedan secuestradas en la luz del compartimiento receptor.

Exocitosis

Exterior

Endocitosis-

especialmente a los lisosomas. Las protenas se dirigen a destinos celulares predeterminados empleando las "direcciones" especficas o seales seleccionadoras que llevan las propias protenas. La clasificacin de protenas con diferente direccin se facilita por receptores residentes en las paredes de la vescula de transporte que reconocen protenas destinadas a sitios particulares. En el ltimo decenio se ha avanzado mucho en el mapeo de los patrones de trfico de clulas eucariotas al identificar direcciones especficas y receptores que gobiernan el flujo de trfico y al dilucidar el mecanismo que garantiza la entrega fsica de los materiales en los sitios apropiados del interior de la clula. En las siguientes pginas se analizarn en detalle estos temas. Primero consideraremos algunos de los ms importantes mtodos experimentales gracias a los cuales se lograron estos avances.

8-2 Algunas tcnicas para el estudio de las citomembranas

(a)

Fusin con el 49)O/^ iompartimiento V**X * receptor A(

Los primeros estudios con microscopa electrnica suministraron a los bilogos una descripcin detallada del citoplasma de las clulas con muy poca atencin a las funciones que desempeaban las estructuras observadas. Para definir las funciones de los organelos citoplsmicos fue necesario desarrollar nuevas tcnicas y efectuar experimentos innovadores. Los primeros esfuerzos en este campo fueron recompensados en 1974 con el Premio Nobel para tres bilogos celulares: Christian De Duve, de la University of Louvain, en Blgica, y Albert Claude y George Palade, de la Rockefeller University. Los mtodos experimentales descritos en las siguientes secciones son particularmente tiles para suministrar bases de conocimiento sobre las cuales se basa la investigacin actual acerca de membranas ctoplsmicas.

Informacin obtenida por autorradiografa

Entre los cientos de diferentes clulas del cuerpo, las clulas acinares del pncreas poseen uno de los sistemas endomem-

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

279

brana ms desarrollados. Las principales funciones de estas clulas son sintetizar y secretar enzimas digestivas. Estas enzimas se envan a travs de los conductos pancreticos, donde fueron elaboradas, hacia el intestino delgado, donde desdoblan los alimentos ingeridos. Dnde se sintetizan las protenas secretorias de las clulas acinares del pncreas y cmo llegan a la superficie de las clulas donde sern descargadas? Estas preguntas son intrnsecamente difciles de responder porque todos los pasos del proceso de secrecin normalmente ocurren de manera simultnea dentro de la clula. Para seguir los pasos de un ciclo desde el principio hasta el final, o sea, desde la sntesis de una protena secretoria hasta su salida de la clula, James Jamieson y George Palade utilizaron la tcnica de autorradiografa. Segn se analiza con detalle en el captulo 17, la autorradiografa suministra una manera de visualizar un proceso bioqumico al permitir al investigador ubicar materiales marcados con istopos radiactivos dentro de una clula. En esta tcnica, con una delgada capa de emulsin fotogrfica se cubren cortes de tejido que contienen el istopo radiactivo, que as se expone a la radiacin que emana del tejido. Los sitios de las clulas que contienen radiactividad se manifiestan como granos plateados bajo el microscopio luego de revelar la emulsin que los cubre (fig. 8-3). Para determinar los sitios donde se sintetizan protenas secretorias, Palade y Jamieson incubaron durante un breve periodo pedazos de tejido pancretico en solucin con aminocidos radiactivos. En este periodo los aminocidos marcados fueron captados por las clulas vivientes e incorporados a las enzimas digestivas conforme se ensamblan en los ribosomas. Los tejidos se fijaron de inmediato, y las protenas sintetizadas durante la incubacin con aminocidos marcados se determinaron mediante autorradiografa. Esta tcnica revel que el retculo endoplsmico es el sitio donde se sintetizan las protenas secretorias (fig. 8-3, a). Para determinar la va que siguen las protenas secretorias dentro de la clula desde su sitio de sntesis hasta donde se descargan, Palade y Jamieson efectuaron un nuevo experimento. Despus de incubar el tejido por un breve periodo con aminocidos radiactivos, lo lavaron de inmediato para liberarlo del exceso de istopos y lo transfirieron a un medio que slo contena aminocidos no marcados. Los experimentos de este tipo se denominan "de seguimiento de pulsos". Pulso se refiere al breve periodo de incubacin con material radiactivo durante el cual se incorporan aminocidos marcados a la protena. Seguimiento indica el periodo durante el cual se expone el tejido al medio con aminocidos no marcados, tiempo durante el cual las protenas se sintetizan utilizando aminocidos no radiactivos. Cuanto ms largo el seguimiento, ms lejos viajarn las protenas elaboradas con istopos radiactivos durante el pulso a partir del sitio donde se sintetizaron dentro de la clula. En condiciones ideales, con esta tcnica se pueden seguir los movimientos de molculas recin sintetizadas observando la onda de material radiactivo que se desplaza a travs del citoplasma de la clula de un sitio al siguiente, en tanto concluye el proceso. Los resultados de estos experimentos, que definieron por primera vez la va biosinttica secretoria y reunieron algunos compartimientos membranosos aparentemente separados en una unidad funcional integrada,

se resumen en la figura 8-3, b-e, y se analizan con amplitud al final del captulo. Informacin obtenida por aislamiento de fracciones subcelulares La microscopa electrnica y la autorradiografa proporcionan informacin sobre la estructura y funcin de los organelos celulares, pero no suministran datos acerca de la composicin bioqumica de estas estructuras. Las tcnicas para fragmentar (homogeneizar) clulas y aislar tipos particulares de organelos fueron desarrolladas en los decenios de 1950 y 1960 por Albert Claude y Christian De Duve. Cuando se fragmenta una clula por homogeneizacin, las membranas citoplsmicas se rompen y los extremos de los fragmentos de membrana se fusionan para formar vesculas esfricas menores de 100 nm de dimetro (fig. 8-4, a). Las vesculas derivadas de diferentes organelos membranosos (ncleos, mitocondrias, membrana plasmtica, retculo endoplsmico, etc.) tienen diferentes propiedades que permiten separarlas entre s, mtodo denominado fraccionamiento celular. Entre los diferentes tipos de vesculas membranosas, las del sistema endomembrana (principalmente retculo endoplsmico y complejo de Golgi) forman un grupo heterogneo de vesculas de tamao similar conocidas como microsomas. En la figura 8-4, a, se muestran los resultados de una purificacin rpida (muy burda) de la fraccin microsmica de una clula. Dicha fraccin microsmica puede fragmentarse todava ms mediante las tcnicas estudiadas en la seccin 17-6. Por ejemplo, se pueden aislar vesculas derivadas de las diferentes partes del complejo de Golgi o se pueden separar vesculas con cubierta de protena de las vesculas que carecen de dicha cubierta. Las vesculas aisladas de la fraccin microsmica retienen un notable grado de su actividad original en la clula. Por consiguiente, no slo se puede determinar su composicin bioqumica, sino tambin muchas de sus capacidades funcionales, como su actividad enzimtica o su capacidad para segregar protena recin sintetizada. Por ejemplo, se observ que las vesculas derivadas de diferentes partes del complejo de Golgi poseen enzimas capaces de aadir diferentes azcares al extremo de una cadena de carbohidratos en crecimiento de una glucoprotena o de un glucolpido. Una vez aislada determinada enzima se puede utilizar como antgeno para preparar anticuerpos especficos contra dicha enzima. A continuacin se pueden unir los anticuerpos a materiales como partculas de oro, visibles con el microscopio electrnico, y comprobar la ubicacin de la enzima en el compartimiento membranoso de las clulas. Estos estudios precisaron el papel del complejo de Golgi en el ensamblado gradual de los carbohidratos complejos. Informacin obtenida por estudio de muanles genticos Un mulante es un organismo (o clulas cultivadas) cuyos cromosomas contienen uno o ms genes que codifican pro-

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CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

ductos diferentes de los que se encuentran en la mayor parte de los organismos (o clulas) dentro de la poblacin. Si el producto de un gen muante no puede efectuar su funcin normal, la clula con esta mutacin muestra una deficiencia caracterstica. Al determinar la naturaleza precisa de la deficiencia se obtiene informacin acerca de la funcin del producto del gen normal. El estudio de las bases genticas de la secrecin se efectu principalmente en clulas de levaduras en el laboratorio de Randy Schekman, de la Universidad de California, en Berkeley. Las levaduras son particularmente adecuadas para estudios genticos, ya que tienen un nmero relativamente pequeo de genes (en comparacin con otros tipos de eucariotes); son organismos unicelulares relativamente pequeos que pueden crecer en cultivo y se desarrollan como clulas hapoides. Una mutacin en un solo gen de una clula haploide de levadura produce un efecto observable, puesto que las clulas carecen de una segunda copia del gen para enmascarar la presencia de un gen anormal. En el transcurso de casi dos decenios, los investigadores aislaron docenas de diferentes mulantes en los cuales prcticamente se han fraccionado todos los pasos de la va secretoria. Muchos de los genes encargados de estos efectos fueron clonados y las protenas codificadas, aisladas y secuenciadas. El aislamiento de protenas de las levaduras motiv investigaciones exitosas de protenas homologas en sistemas de mamferos. Una de las lecciones ms importantes que se aprendieron a partir del empleo de todas estas tcnicas es que las actividades dinmicas en las que participan elementos de los sistemas endomembrana son muy persistentes. Clulas de levaduras, plantas y el cerebro humano no slo ejecutan procesos similares, sino que tambin emplean protenas notablemente semejantes. Es evidente que la diversidad estructural de las clulas oculta su similaridad molecular subyacente. En muchos casos, protenas de especies muy divergentes son intercambiables. Por ejemplo, sistemas in vitro derivados de clulas de mamferos, en condicones tpicas son capaces de utilizar protenas de levaduras para facilitar el transporte de las vesculas. A la inversa, clulas de levaduras con deficiencias genticas que interrumpen alguna fase de la va biosinttica pueden "curarse" en experimentos de ingeniera gentica empleando genes de mamferos.

8-3 Retculo endoplstnico

El retculo endoplstnico (RE) se divide en dos categoras muy amplias: retculo endoplsmico rugoso (RER) y retculo endoplsmico liso (REL) (fig. 8-5). Ambos tipos de RE (constituyen un sistema de membranas que encierran un \espacio. En consecuencia, el contenido lquido del citoplasma est dividido por el RE en dos compartimientos: un espacio encerrado dentro de sus membranas, denominado espacio luminal o cisterna!, y la regin situada por fuera de las membranas, que es el espacio citoslico. La distincin morfolgica entre RER y REL consiste en la presencia de ribosomas unidos en el primero y ausencia de los mismos en el ltimo. Cuando estn presentes, los

FIGURA 8-3. Empleo de la autorradiografa para revelar los sitios de sntesis y el transporte subsecuente de las protenas secretorias. a) Corte de una clula acinar pancretica incubada durante tres minutos con aminocidos radiactivos, fijada y preparada de inmediato para autorradiografa (vase seccin 17-4 para el anlisis de esta tcnica). Los granulos plateados que aparecen en la emulsin despus de revelada se localizan sobre el retculo endoplsmico. Esta fue la primera indicacin clara de que el retculo endoplsmico es el sitio de sntesis de las protenas secretorias (se estudia con detalle en la pgina 283). b-d) Diagrama de una secuencia de autorradiografas que muestran el movimiento de las protenas secretorias marcadas (representadas por granulos plateados en rojo) a travs de una clula acinar pancretica. Si la clula es un pulso marcado para tres minutos y fijado de inmediato (como se muestra en a), la radiactividad se localiza en el retculo endoplsmico (b). Despus de un pulso de tres minutos y un seguimiento de 17 minutos, las partculas marcadas se concentran en el complejo de Golgi y vesculas adyacentes (c). Luego de un pulso de tres minutos y un seguimiento de 117 minutos, la radiactividad se concentra en los granulos secretorios y comienza a ser liberada en los conductos pancreticos (d). e) Resumen de la cintica de marcado de los diferentes compartimientos de la clula acinar pancretica en el experimento descrito antes, (a: Cortesa de James D. Jameson y George Palade.)

ribosomas siempre se encuentran en la superficie que enfrenta el espacio citoslico. El RER aparece como un organelo membranoso extenso compuesto principalmente de sacos aplanados (cisternas) separados por un espacio citoslico como se muestra en la figura 8-6, a-c. Las micrografas electrnicas muestran el espacio cisternal del RER dividido en compartimientos separados (p. ej., fig. 8-6, b),

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

Luz

281

Granulos

Complejo de Golgi Retculo endoplsmico Ncleo Mitocondria

5 min

20 min

40 min

(b)
100 r

(c)

(d)

Retculo endoplsmico rugoso

gran cantidad de protenas, como las del pncreas o de las glndulas salivales/ poseen extensas regiones de RER (fig. 8-6, d). En breve volveremos a la funcin del RER, pero primero describiremos las actividades del REL. Retculo endoplsmico liso El REL est muy desarrollado en algunos tipos de clulas, incluyendo las de msculo esqueltico, tbulos renales y glndulas endocrinas productoras de esteroides (fig. 8-7, a). Las protenas especficas del REL varan de una clula a otra segn las funciones particulares del organelo, e incluyen:

20 -

3 10

20

40

60

Tiempo de seguimiento (min)

(e)
FIGURA 8-3. (Continuacin.)

pero se cree que todas las cisternas RER se comunican entre s y que el espacio cisternal es continuo entre ellas. Los elementos membranosos del REL son tpicamente tubulares (figs. 8-5 y 8-7) y forman un sistema interconectado de tuberas que se incurvan a travs del citoplasma en el cual se presentan. Cuando las clulas son homogeneizadas, los fragmentos REL forman vesculas de superficie lisa, en tanto que las vesculas formadas por fragmentos RER son de superficie rugosa (fig. 8-4, b,c). Los dos tipos de vesculas poseen porosidad diferente y pueden separarse con facilidad; por lo tanto, el contenido de protenas y lpidos de cada tipo de RE est bien caracterizado. Diferentes tipos de clulas tienen cantidades notablemente distintas de un tipo de RE o del otro, segn las actividades de la clula. Por ejemplo, las clulas que secretan

Sntesis de hormonas esteroides en clulas endocrinas de las gnadas y la corteza suprarrenal. Destoxicacin en el hgado de gran variedad de compuestos orgnicos, incluyendo, por ejemplo, barbitricos y etanol. La destoxicacin se efecta mediante un sistema de enzimas que transfieren oxgeno (oxigenasas), entre las cuales se incluye el citocromo P450. Es digno de mencionar que dada su falta de especificidad para sustrato, estas enzimas tienen capacidad de oxidar miles de diferentes compuestos hidrfobos y convertirlos en sustancias ms hidrfilas y ms fciles de excretar. Los efectos no siempre son positivos; el compuesto benzo[fl]pireno relativamente poco nocivo (formado al tostar carne sobre una parrilla) se convierte en un potente carcingeno por accin de las enzimas "destoxicantes" del REL. Liberacin de glucosa a partir de la glucosa 6-fosfato en clulas hepticas mediante la enzima glucosa 6-fosfatasa. Grandes reservas de glucgeno se encuentran almacenadas en el hgado en forma de granulos unidos a la superficie externa de las membranas del retculo endoplsmico liso (fig. 8-7, V). Cuando se requiere energa qumica, el glucgeno se desdobla por accin de la enzima fosforilasa y forma glucosa 1-fosfato, que a continuacin se convierte en glucosa 6-fosfato en el citoplas-

282

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

O
Homogeneizacin

El hqmogenado contiene varios tipos de vesculas membranosas

Clulas completas

Sobrenadante posnuclear
0

Centrifugar a 20 000 g durante 20 minutos

Homogenado

Clulas completas, ncleos, mitocondrias, peroxisomas

/ Transferir el L/ sobrenadante posnuclear

.*.:/*;!
Centrifugar a 50 000 g durante dos horas . .*"* . '

'"**" A
****** ,**.* **

Sobrenadante posmcrosmico

.v****

iXMhfli

Microsomas
0.3 Hm

FIGURA 8-4. Aislamiento de una fraccin microsmica por centrifugacin diferencial, a) Cuando se fragmenta una clula por homogeneizacin mecnica (paso 1), los diferentes organelos membranosos se rompen y forman vesculas membranosas esfricas. Las vesculas derivadas de diferentes organelos pueden separarse por distintas tcnicas de centrifugacin. En el procedimiento que aqu se muestra, 51 homogeneizado celular primero se someti a centrifugacin a baja velocidad para formar esferas de las partculas ms densas y de mayor tamafi0, dejando las vesculas ms pequeas (microsomas) en el sobrenadante (paso 2). Los microsomas se pueden quitar del sobrenadante por cp^trifugacin a mayor velocidad durante periodos ms prolongados (paso 3). Una fraccin microsmica cruda de este tipo se puede fraccioi-)a- e n diferentes tipos de vesculas en pasos subsecuentes, b) Micrografa electrnica de una fraccin microsmica lisa en el cual las vesculas membranosas carecen de ribosomas. c) Micrografa electrnica de una fraccin microsmica rugosa que contiene membranas tachonadas de ribosomas. (b-c: cortesa de ].A. Higgins y R.J. Barnett.)

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

283

conducto cuando llega la seal apropiada. La polaridad de los organelos de estas clulas epiteliales glandulares refleja el flujo de productos secretorios a travs de la clula desde su sitio de sntesis hasta el de descarga.
Sntesis de protenas en rbosonias enlazados por membranas en comparacin con ribosomas "libres"

Retculo endoplsmico liso

Retculo endoplsmico rugoso

El papel del retculo endoplsmico rugoso como sitio de sntesis de las protenas secretorias en el pncreas fue demostrado por Jamieson y Palade, segn se describi antes (pg. 280). Se han observado resultados similares en otros tipos de clulas secretorias, incluyendo las clulas caliciformes del intestino que secretan mucoprotenas, clulas endocrinas que secretan hormonas p_plipeptdicas, clulas plasmticas que secretan anticuerpos y clulas hepticas que secretan prpt_enas_s_r_ieas^ Nuevos experimentos han revelado que las protenas se pueden dividir en dos clases, segn el sitio donde se ensamblen en la clula. 1. Un tipo de polipptido se ensambla en los ribosomas unidos a la superficie externa (citoslica) de las membranas RER. Este tipo incluye: a) protenas secretadas por la clula; b) protenas integrales de membrana, y c) protenas de ciertos organelos, incluyendo complejo de Golgi, lisosomas, endosomas y vacuolas de plantas. 2. El otro tipo de protenas se ensambla en ribosomas "libres" y posteriormente se libera en el citoplasma. Este tipo incluye: a) protenas destinadas a permanecer en el citoplasma (como las enzimas glucolticas o las protenas del citoesqueleto); b) protenas perifricas de la superficie interna de la membrana plasmtica (como espectrinas y anquirinas, que slo se unen dbilmente a la superficie de la membrana), y c) protenas que normalmente se encuentran en corpsculos microscpicos, cloroplastos y mitocondrias. Este ltimo grupo de protenas se sintetizan en el citoplasma y luego se importan totalmente formadas (es decir, despus de traduccin) a travs de la membrana al interior del organelo apropiado. Cmo pueden identificar las clulas estos dos tipos de protena y delimitar sus sitios de sntesis? En 1971, Gunter Blobel y David Sabatini, de la Rockefeller University, propusieron que la sntesis de una protena en un ribosoma rodeado de membrana o en un ribosoma libre depende de la informacin contenida en la porcin N terminal del polipptido, que es la primera parte que surge del ribosoma durante la sntesis de protena. Sugirieron que las protenas secretorias contienen una secuencia de seales especial en el N terminal que provoca la unin del ribosoma con una membrana del RE y el desplazamiento del polipptido naciente al interior del espacio cisternal del RE. Esta hiptesis, conocida como hiptesis de la seal, ha sido apoyada por numerosas pruebas experimentales. Sntesis de una protena secretoria o lisosmica en ribosomas enlazados a membrana Las etapas que ocurren durante la sntesis de una protena secretoria o lisosmica se muestran en la figura 8-9. La sin-

FIGURA 8-5. Retculo endoplsmico. Micrografa electrnica de una parte de la clula pancretica de murcilago que muestra el retculo endoplsmico liso y rugoso. (Cortesa de Keith R. Porter.)

ma. En tanto el azcar permanezca en estado fosforilado, no puede dejar la clula heptica; la membrana plasmtica es impermeable a los azcares fosfato. La glucosa 6-fosfatasa de las membranas REL elimina el grupo fosfato y genera molculas de glucosa que finalmente se desplazan hacia la corriente sangunea, donde se transportan a los tejidos del cuerpo. Secuestro de iones calcio dentro del espacio cisternal. La liberacin regulada de Ca2+ de las membranas REL desencadena respuestas celulares especficas, incluyendo contraccin de clulas musculares esquelticas (fig. 9-63). Retculo endoplsmico rugoso Las primeras investigaciones acerca de la funcin del RER se efectuaron en clulas que secretan gran cantidad de protenas, como las clulas acinares del pncreas (fig. 8-3) o las clulas secretorias de moco del revestimiento del conducto digestivo (g. 8-8). A partir del esquema y la micrografa de la figura 8-8 es evidente que los organelos internos de estas clulas tienen marcada polaridad sobre el eje longitudinal de la clula, o sea, de su extremo basal al apical. El ncleo y la extensa regin de cisternas RER se localizan cerca de la superficie basal de la clula que se enfrenta al riego sanguneo. El complejo de Golgi se localiza en la regin central de la clula. El extremo apical de la misma, que se enfrenta a la luz del conducto, contiene materiales secretorios envueltos en membranas cuyo contenido se libera con facilidad en el

284

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

Ribosoma

Cisternas del retculo endoplsmico

(a)

0.3/m

5/m

FIGURA 8-6. Retculo endoplsmico rugoso (RER). a) Diagrama que muestra las pilas de cisternas aplanadas que constituyen el retculo endoplsmico rugoso. La superficie citoslica de ia membrana contiene ribosomas enlazados, que confieren a la cisterna su aspecto rugoso, b) Micrograia electrnica por transmisin de una porcin del RER de una clula acinar pancretica. Es evidente la divisin del RER en espacio cisternal (desprovisto de ribosomas) y espacio citoplsmico. c) Gammagrafa electrnica del RER en una clula acinar pancretica, d) Visualizaron del RE mediante gammagrafa confocal en una clula tota! cultivada. El RE (colores naranja y blanco) se concentra en la regin que rodea el ncleo (N). (b: Cortesa de S. lio; c: segn K. Tanaka, Int. Rev. Cytol. 68:W, 1980; d: segn Ayynppan K. Rnjiseknnm y coh. }. Cell Biol. 105:342, 1993; con permiso de The Company of Biologists Ltd.)

tesis del polipptido se inicia luego que un RNA mensajero se enlaza a un ribosoma libre, o sea, no unido a la membrana citoplsmica. En realidad, los ribosomas empleados para sintetizar protenas integrales de membrana, secretorias o lisosmicas provienen de la misma poblacin (reserva) que los utilizados para producir protenas que permanecen en el citoplasma. Segn predijeron Blobel y Sabatini, los polipptidos ensamblados en ribosomas enlazados a la membrana contienen una secuencia de seales, que incluye un

tramo de seis a 20 aminocidos no polares, que orienta el polipptido naciente hacia la membrana del RE y conduce a la compartamentalizacin del polipptido en la luz del retculo endoplsmico. (Un polipptido naciente es el que se halla en proceso de sntesis y por lo tanto no est todava completamente ensamblado.) Aunque el pptido de seal de ordinario se localiza en el N terminal o cerca del mismo, puede ocupar una posicin interna en alguno de los polipptidos.

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

285

fl-7. Retculo endoplsmko liso (REL). a) Micrografa electrnica de una clula de Leydig de los testculos que muestra el RE liso extenso donde se sintetizan hormonas esteroides. b) Micrografa electrnica de una clula heptica de rata mostrando la continuidad entre las membranas del RE rugoso y del liso (flechas grandes), y tambin la estrecha relacin de los granulos de glucgeno con el RE liso, (a: Segn Don W. Faivcett; b: segn Albert L. Jones y Douglas L. Schmucker, Gastroenterology 73:847, 1977.)

Conforme surge del ribosoma, la secuencia de seales ser reconocida por una partcula para reconocimiento de seales (PRS), que consta de seis polipptidos distintos y una pequea molcula de RNA denominada RNA 7SL. La PRS se enlaza a la secuencia de seales (paso 1, fig. 8-9) y detiene la sntesis del polipptido, evitando que el terminal sufra plegamiento anormal prematuro. El cese de la traduccin despus del enlace de la PRS da tiempo al complejo para encontrar una membrana RE a la cual pueda unirse, de otro modo el polipptido podra ser sintetizado en el citoplasma. La PRS enlazada acta como "etiqueta", que permite a todo el complejo (PRS-ribosoma-polipptido naciente) enlazarse a un receptor de PRS localizado en la superficie citoplsmica de la membrana del retculo endoplsmico (paso 2, fig. 8-9). Se cree que la fijacin del complejo ribosoma-PRS a la membrana del RE conduce a la liberacin de la PRS de la secuencia de seales; al enlace de la secuencia de seales a un componente de la membrana del RE (paso 3, fig. 8-9), el cual prepara el polipptido naciente para penetrar a la membrana; a la liberacin de la PRS del receptor de la PRS dentro del citoplasma; al desplazamiento (translocacin) del polipptido naciente a travs del canal revestido de protena que atraviesa la membrana (paso 4), y finalmente a la liberacin del ribosoma enlazado a la membrana. La liberacin de la PRS de la secuencia de seales requiere el enlace de GTP a la protena enlazada a GTP, en tanto que la liberacin de la PRS del receptor de la PRS, que permite el inicio de la translocacin, requiere la hidrlisis del GTP enlazado. Como estudiaremos en detalle en el captulo 15, las protenas enlazadas a GTP (o protenas G)

desempean un papel regulador clave en muchos procesos celulares. Debido a que existen en dos conformaciones alternas, una forma enlazada a GTP y otra enlazada a GDP, las protenas G pueden actuar como interruptores moleculares que inician o detienen procesos especficos. En el presente ejemplo, el enlace a GTP y la hidrlisis garantizan que el ribosoma participe de manera apropiada en el mecanismo de la membrana para translocacin antes de continuar la sntesis del polipptido. En la actualidad se puede estudiar in vtro todo el proceso de sntesis de protena enlazada a la membrana empleando vesculas artificiales o vesculas celulares aisladas en diferentes combinaciones de protenas purificadas. Por ejemplo, recientemente se confirm la existencia de un canal revestido de protena en la membrana del RER, sospechado durante largo tiempo, mediante experimentos electrofisiolgicos efectuados en vesculas aisladas del RER que sintetizan protenas. Estos experimentos revelan la presencia de canales de conductividad elevada a iones que sirven como vas de paso para polipptidos en proceso de translocacin. La abertura de estos canales depende de los ribosomas enlazados; cuando se libera el ribosoma, la compuerta del canal se cierra. Conforme el polipptido naciente penetra en la cisterna del RER, es conducido por diferentes enzimas localizadas en la membrana o en la luz del RER. El polipptido naciente elimina la porcin N terminal que contiene el pptido de seal mediante una enzima proteoltca, la peptidasa de seal. Una oligosacariltransferasa, otra protena integral de membrana del RER (estudiada ms adelante), aade carbohidratos a la protena naciente.

286

CAPITULO 8 * Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, fundn y trfico de membrana

Lisosorna

RE rugoso

Granulos mucgenos Complejo de Golgi

(b)

\.5]im

RER

FIGURA 8-8. Estructura polarizada de una clula secretoria, a) Dibujo de una clula caliciforme secretoria de moco del colon de rata, b) Micrografa electrnica de baja resolucin de una clula secretoria de moco de la glndula de Brunner del intestino delgado del ratn. Ambos tipos de clula muestran polarizacin distinta de los organelos, que refleja su papel en la secrecin de grandes cantidades de mucoprotena. El extremo basa! de las clulas contiene el ncleo y el RE rugoso. Las protenas sintetizadas en el RE rugoso se desplazan hacia el complejo de Golgi ntimamente relacionado y desde all al interior de las vesculas, en las cuales se concentra el producto secretorio final. Las regiones apicales de las clulas estn llenas de granulos secretorios que contienen mucoprotenas listas para ser liberadas, (a: Segn Moran Neutra y C.P. Leblond }. Cell Biol. 30:119, 3966, con permiso de Rockcfeller University Press; b: segn Alaiti Rambourg e Yves Clcrmont, Eur. J. Cell Biol. 51:196, 1990.)

(a)

La luz del RER contiene una elevada concentracin de protenas cuyo papel es garantizar que las protenas recin sintetizadas sufran las reacciones apropiadas de plegamiento para alcanzar su estructura funcional terciaria y cuaternaria. En estas protenas se incluye la enzima proteindisulfiro somerasa que cataliza la formacin y reordenamiento de enlaces disulfuro entre residuos de cistena de la cadena del polipptido, as como con numerosos chaperones moleculares (pg. 72) que evitan la formacin de agregados o plegamientos errneos de polipptidos. De alguna manera, la clula reconoce las protenas plegadas o ensambladas de manera incorrecta y las retiene en el RE, donde pueden ser destruidas. Este proceso, conocido como control de calidad, ayuda a garantizar que las protenas anormales no se transporten a otras partes de la clula. Un ejemplo de este proce-

so se observa en algunos casos graves de fibrosis qustica, donde la protena mulante RTFQ no puede llegar a la superficie de la clula (pg-153). La estructura del retculo endoplsmico es ideal para cumplir su papel como sitio de entrada a la va biosinttica de la clula. Su membrana proporciona una gran superficie sobre la cifal se pueden fijar muchos ribosomas (unos 13 millones por cada clula Viviente). La luz del RE proporciona un ambiente local que favorece plegamiento y ensamblado correctos de las protenas y un compartimiento donde pueden separarse protenas secretorias, lisosmicas y vacuolares de otras protenas recin sintetizadas. Como se mencion antes, las clulas deben tener capacidad para determinar dnde debe residir una protema recin sintetizada, sea fuera de la clula, en uno de los organelos membranosos del

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana dtoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana RNAm RNAt

287

Pptido de seal del polipptido naciente Citoplasma

o
Receptor
de la PRS

Ribosoma receptor

Membrana del RE
Luz del RE

Translocador de protena FIGURA 8-9. Modelo para la sntesis de protenas secretorias (o una enzima lisosmica) en un rbosoma enlazado a la membrana del RE rugoso. La sntesis del polipptido se inicia en un ribosoma libre. Conforme la secuencia seal (mostrada en rojo) emerge del ribosoma, se enlaza a la partcula para reconocimiento de seales (1), que detiene la traduccin en tanto se pone en contacto con la membrana del RE rugoso. La fijacin del ribosoma a la membrana del retculo endoplsmico (2) es mediada por un receptor para la partcula para reconocimiento de seales y un receptor separado del ribosoma. En los pasos subsecuentes (3 y 4), la PRS se libera del pptido de seal y luego del receptor de la PRS (pasos que requieren GTP y protena enlazada a GTP), el pptido de seal se une a un componente de la membrana RE (indicada aqu donde se une a la superficie interna de! conducto) y el resto del polipptido se transloca a travs del conducto. Luego que el polipptido naciente pasa al interior de la luz del RE, una protena de membrana (la peptidasa de seal) separa la seal del pptido. Una vez en la luz, el polipptido interacta con las protenas que garantizan un plegamiento apropiado (pg. 73) y promueven la formacin de enlaces disulfuro.

citoplasma o dentro del citoplasma. El asilamiento de protenas recin sintetizadas en las cisternas del RE prcticamente las elimina del citoplasma y permite enviarlas a su destino final. Este proceso es un claro ejemplo del papel de las membranas en la compartamentalzacin del espacio dentro de la clula de modo que puedan separarse los diferentes tipos de actividades. Biosntesis de membranas en el retculo endoplsmico Las membranas no se originan de novo, o sea, entidades nuevas procedentes de las reservas de protenas y lpidos; ms bien, slo se originan a partir de membranas preexistentes. Las protenas y lpidos recin sintetizados se introducen continuamente a las membranas ya existentes, proceso que en su mayor parte ocurre en el retculo endoplsmico. Como veremos a continuacin, los elementos de la membrana se desplazan del RE a casi todos los otros compartimientos de la clula. Conforme la membrana se desplaza a travs de la clula, las enzimas que residen en los diferentes compartimientos de la clula modifican su composicin de diferente manera. Por lo tanto/ aunque la membrana puede fluir por medio de vesculas desde el RE a travs del complejo de Golgi hacia la membrana plasmtica, las membranas que constituyen cada uno de estos compartimientos tienen su propia composicin nica y mantienen su identidad propia distintiva (cuadro 4-1). Recordemos que las membranas celulares son asimtricas; las dos superficies de una membrana tienen una estructura muy diferente (pg. 125). Esta asimetra se establece inicialmente en el retculo endoplsmico conforme lpidos y protenas se incorporan a la bicapa, y se mantiene a medida que la membrana pasa por los procesos de gemacin y fu-

sin de un compartimiento al siguiente. Como resultado, los componentes situados en la superficie cisternal de la membrana del RE se pueden identificar en la superficie luminal de las vesculas de transporte, la superficie luminal de la cisterna de Golgi y la superficie externa (exoplsmica) de la membrana plasmtica (fig. 8-10). Sntesis de protenas integrales de membrana en los ribosomas enlazados a la misma. Las protenas integrales de membrana, como glucoforina y banda 3 de la membrana plasmtica del eritrocito (fig. 4-31) se ensamblan de manera muy similar a las protenas secretorias y lisosmicas ya estudiadas. Se sintetizan en los ribosomas enlazados a la membrana y se translocan a travs de la membrana del RE conforme el polipptido se alarga. A diferencia de las protenas secretorias y isosmicas, que atraviesan por completo la membrana, las protenas integrales contienen uno o ms tramos de aminocidos hidrfobos que sirven como secuencia para detener la transferencia, las cuales impiden movimientos adicionales de la protena dentro de la cmara cisternal. Se ha postulado que la translocacin de la secuencia que detiene la transferencia en la protena que reviste el canal abre lateralmente dicho canal y permite que la parte hidrfoba del polipptido naciente penetre a la bicapa de lpidos. La figura 8-11 muestra la sntesis del tipo ms sencillo de protena integral, la que slo contiene un segmento transmembrana, cuyo N terminal se localiza en el lado cisternal de la membrana del RE y cuyo C terminal se encuentra en el lado citoplsmico. Hay numerosos ejemplos en que la "misma" protena aparece en dos versiones (soformas), una soluble y la otra enlazada a la membrana. Estas protenas tienen la misma secuencia de seales y la misma secuencia primaria, excepto

288

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana FIGURA 8-10. Mantenimiento de la asimetra de la membrana. A medida que las protenas se sintetizan en el RE rugoso, entran a la bicapa de lpidos en una orientacin predecible determinada por su secuencia de aminocidos. Esta orientacin persiste por todo el trayecto del sistema endomembrana, segn se ilustra en la figura. Las cadenas de carbohidratos se aaden primero al RE y constituyen una manera conveniente de evaluar la lateralidad de la membrana, ya que siempre aparecen sobre el lado cisterna! de las membranas citoplsmicas, que se transforman en el lado exoplsmico de la membrana plasmtica luego que se fusionan de vesculas con dicha membrana (paso mostrado en la figura 8-27).

Exterior

por la presencia de un tramo transmembrana hidrfobo en la protena de membrana, ausente en la forma soluble. Esta pequea diferencia determina si la protena forma parte de la membrana o ser secretada al espacio extracelular. Las protenas que rodean varias veces la membrana tienen un nmero de tramos hidrfobos que corresponden a los dominios transmembrana respectivos (como en la figura 4-16). Sntesis de lpidos de membrana. Casi todos los lpidos de la membrana se sintetizan en el retculo endoplsmico; las principales excepciones son esfingomielina y glucolpidos, cuya sntesis comienza en el RE y concluye en el complejo de Golgi. Las enzimas implicadas en la sntesis de fosfolpidos son protenas integrales de membrana del RE con sus sitios activos enfrentando al citoplasma. Los fosfolpidos recin sintetizados se introducen en la mitad de la bicapa que enfrenta al citoplasma. Algunas de estas molculas lpidas se desplazan ms tarde hacia la hoja opuesta ayudadas por protenas (flipasas) que translocan activamente las molculas de los lpidos a travs de la bicapa. El hecho de que las membranas de diferentes organelos posean composicin lpida notablemente diferente (cuadro 4-2) indica que los cambios tienen lugar conforme la mem-

Secuencia para detener la transferenci Citoplasma

Luz del RE

FIGURA f-11. Modelo de la sntesis de una protena integral de membrana que contiene un solo segmento transmembrana y una secuencia de seales cerca del N terminal del polipptido naciente. La PRS y los diferentes componentes de la membrana mostrados en la figura 8-9 tambin participan en la sntesis de protenas integrales, pero se omiten para mayor sencillez. El polipptido naciente se transloca al canal revestido de protena, igual que si fuera una protena secretoria (1-3), pero la entrada de la secuencia que detiene la transferencia hidrfoba al interior del poro (4) abre el canal lateralmente y la hlice hidrfoba se introduce en la bicapa (5-6). Se asume que en este momento el ribosoma se libera de la membrana y la sntesis de la porcin restante del polipptido (la porcin C terminal) ocurre conforme el ribosoma se libera en el citoplasma (como en el paso 5). Los polipptidos que tienen ms de un segmento transmembrana poseen una secuencia hidrfoba adicional que ayuda a introducirlos en la bicapa.

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana coplstnica: estructura, funcin y trfico de membrana FIGURA 8-12. Modificacin de la composicin de los lpidos de la membrana, a) Histograma que indica el porcentaje de cada uno de los tres fosfolpidos (fosfatidilcolina, fosfatidilserina y esfingomielina) en tres diferentes tipos de membrana celular (retculo endoplsrnico, complejo de Golgi y membrana plasmtica). El porcentaje de cada especie de lpido aparentemente cambia de manera gradual conforme la membrana fluye desde el RE a las membranas de Golgi y plasmtica, b) Diagrama que muestra tres mecanismos distintos para explicar cmo puede ser diferente la composicin de fosfolpidos de una membrana del sistema endomembrana en comparacin con otra membrana del sistema, aunque los compartimientos de membrana sean continuos espacial y temporalmente. 1) En la cabeza de los fosfolpidos de la bicapa, los grupos se modifican enzimticamente; 2) la membrana de una vescula en formacin tiene fosfolpidos de composicin diferente a los de la membrana a partir de la cual se forma por gemacin; 3) los fosfolpidos se pueden eliminar fsicamente de una membrana e introducir a otra membrana mediante intercambio de protenas por fosfolpidos.
(a)

289

PC

PS

SM

tu 50% -

RE

CG

1
MP RE

1
CG MP

,il
RE CG MP

RE = retcul endoplsmico CG = ccmpl o de Golgi MP = memb rara plasmtica del eritrocito

PC - fcsfatidilcolina
PS - osfatidilserina SM = esfingomielina

brana fluye a travs de la clula. Hay varios factores que contribuyen a dichos cambios (fig. 8-12). 1. La mayor parte de los organelos poseen la capacidad de modificar los lpidos ya presentes en una membrana, convirtiendo un tipo de fosfolpido (como la fosfatidilseridina) en otro (p. ej., fosfatidilcolina o fosfatidiletanolamina). 2. Cuando las vesculas se forman por gemacin de un compartimiento (como en la figura 8-2, b), algunos tipos de fosfolpidos pueden ser incluidos de manera preferencial en la membrana de la vescula en formacin, en tanto que otros tipos no se incluyen. 3. Las clulas contienen protenas para intercambiar con fosfolpidos cuya funcin es transportar fosfolpidos especficos a travs del citoplasma acuoso de un tipo de compartimiento de membrana a otro. Estas enzimas pueden facilitar el desplazamiento de fosfolpidos especficos desde el RE a otros organelos, incluyendo mitocondrias y cloroplastos.
Glucosllacin en el retculo endoplsmico rugoso

Casi todas las protenas producidas en ribosomas enlazados a la membrana, ya sean componentes integrales de membrana, enzimas lisosmicas o vacuolares, o partes de la matriz extracelular, se convierten en glucoprotenas. Como se indic en la figura 4-12, b, las cadenas de carbohidratos pueden fijarse a una protena mediante uniones N (al tomo de nitrgeno de un residuo asparagina) o uniones O (al tomo de oxgeno de un residuo serina o treonina [o un residuo hidroxicolina en la colgena]). Hay diferencias en las dimensiones promedio, composicin del azcar y va de sntesis entre estos dos tipos de oligosacridos, pero comparten ciertas propiedades. De mayor importancia es que las secuencias de azcares que componen ambos tipos de oligosacridos son altamente especficas; si se aislan los oligosacridos de una protena purificada, las secuencias son consistentes y predecibles. Cmo se determina la secuencia de azcares? Las macromolculas ms conocidas que poseen una secuencia ordenada de bloques de construccin son los cidos nucleicos y las protenas. La secuencia de cidos nu-

cleicos y protenas se genera por medio de una plantilla, o sea, una molcula preexistente que contiene la secuencia. En las glucoprotenas, la secuencia de carbohidratos se ge-

290

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citaplsmica: estructura, fundn y trfico de membrana

CrLOH O. H O O CH

CH,OH

/V-acetilglucosamina transferasa

OPOPO

NH

=0
CH,

o-

Q-

/ H

<;H2OH
OH OH

O (Enlace j31, 2)

/V-acetilglucosamina

Difosfato de uridina

Maosa aceptora en el extremo en crecimiento del oligosacrido

UDP-A/-acetlglucosamina FIGURA 8-13. Ejemplos de una reaccin catalizada por una glucosiltransferasa. Esta gran familia de enzimas transfiere azcares desde un portador de azcar nucletido (en este caso UDP-N-acetilglucosamina) al extremo en crecimiento de una cadena de oligosacridos (que en este caso contiene un residuo maosa en su extremo). Aqu se muestra la reaccin particular segn ocurre en el complejo de Golgi.

era sin el empleo de plantillas. La adicin de azcares a la cadena creciente de oligosacrido es catalizada por un grupo de enzimas enlazadas a la membrana denominadas glucostransferasas, enzimas que transfieren un monosacrido especfico procedente de un azcar donador apropiado a un azcar aceptor apropiado (fig. 8-13). La molcula donadora siempre es un azcar nucletido. Los ejemplos de azcares nucletdos donadores implicados en la construccin de cadenas de oligosacridos son cido silico-CMP, manosa-GDP, fucosa-GDP, galactosa-UDP y UDP-N-acetilglucosamina (fig. 8-13). La molcula aceptora, que recibe el azcar transferido, es el extremo en crecimiento de la cadena de carbohidratos. La secuencia de azcares ensamblada a un oligosacrido depende de la secuencia particular de glucostransferasas que participa en su construccin, la cual, a su vez, en ocasiones depende de la disposicin de las enzimas en la membrana y su especificidad por el sustrato. En la figura 8-14 se muestran los pasos iniciales para aadir azcares a oligosacridos formados por enlaces N unidos a protenas solubles e integrales de membrana. El segmento basal, o ncleo, de cada cadena de carbohidrato no se ensambla en la propia protena, sino que se coloca de manera independiente sobre un transportador lpido y luego se transfiere, en bloque, al residuo asparagina especfico del polipptido. Este portador lpido, denominado dolicol fosfato, es una molcula hidrfoba construida con ms de 20 unidades isopreno
CH3

mamferos se inicia con la transferencia de N-acetglucosamina 1-fosfato seguida por la transferencia de otra Nacetglucosamina y a continuacin de nueve unidades maosa y tres de glucosa en el patrn preciso indicado en la figura 8-14. A continuacin, la enzima oligosacariltransferasa del portador lpido transfiere este bloque de azcares al polipptido naciente conforme dicho polipptido se transloca a la luz del retculo endoplsmco. Aunque algunos polisacridos, particularmente de eucariotes inferiores, permanecen prcticamente como se muestra en la figura 8-14, la evolucin de organismos ms complejos se acompa de la diversificacin de grupos carbohidrato unidos a las protenas. La modificacin del ncleo oligosacrido se inicia en el RE al eliminar los residuos terminales de glucosa mediante glucosidasas. Los pasos restantes ocurren en la ruta hacia el complejo de Golgi y dentro del mismo como una etapa subsecuente en la va biosinttica (pg. 299). Primer paso en el transporte vesicular En condiciones tpicas, las cisternas RER son cavidades amplias y aplanadas que actan como conductos de transporte para desplazar protenas de membrana y luminales desde su sitio de sntesis a los extremos apicales del RER. La superficie del borde apical de las cisternas RER de ordinario es lisa, o sea, desprovista de ribosomas (fig. 8-7, b). Estas partes del RE se conocen como elementos de transicin, los cuales son sitios para formar el primer grupo de vesculas de transporte en la va biosinttica, vesculas que son dirigidas hacia el complejo de Golgi.

H2C=CC=CH2 H
Isopreno

integrada a la bicapa de lpidos de la membrana. Los azcares se aaden a la molcula de dolicol fosfato, una a la vez, en el orden apropiado que indican las glucostransferasas enlazadas a la membrana. Esta parte del proceso de N glucosilacin es prcticamente invariable; en las clulas de

8-4 El complejo de Golgi

En 1898, el bilogo italiano Camilo Golgi, al trabajar con tejido nervioso que haba impregnado durante varios das en un colorante con osmio, decubri una red de color amarillo oscuro localizada cerca del ncleo de la clula. Esta

CAPITUL 8 Sistemas de la membrana toplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana 3UDP 3UDP-

291

Polipptido naciente Ribosoma mRNA

4GDP

Membrana del retculo endoplsmico

Citoplasma

13
CDP 1 UDP 1UMP
2

UDP-

CTP Dolicol

= Glucosa = A/-acetilglucosamna (NAG)

= Maosa AVW P = Dolicol fosfato

FIGURA 8-4. Pasos en la sntesis de la porcin central de un oligosacrido N unido en el RE rugoso. Los primeros siete azcares (cinco residuos de maosa y dos de NAG) se transfieren uno cada vez al dolicol-PP sobre el lado citoplsmico de la membrana del RE (pasos 1 y 2). En esta etapa, el dolicol con su oligosacrido unido al parecer pasa a travs de la membrana (paso 3), y los azcares restantes (cuatro residuos de maosa y tres de glucosa) se unen en el lado luminal de la membrana. Estos ltimos azcares se fijan, uno a la vez, al lado citoplsmico de la membrana, al extremo de la molcula dolicol fosfato (como en los pasos 4 y 7), que entonces viaja a travs de la membrana (pasos 5 y 8) y dona su azcar al extremo en crecimiento de la cadena de oligosacrido (pasos 6 y 9). Una vez que el oligosacrido est completamente ensamblado, se transfiere a un residuo asparagina del polipptido naciente (paso 10). El dolico-PP regresa a travs de la membrana (paso 11) y est listo para iniciar la aceptacin de azcares una vez ms (pasos 12 y 13).

red, que posteriormente se identific en otros tipos de clulas, se denomin complejo de Golgi y ayud a su descubridor a que se le otorgara el premio Nobel en 1906. Durante decenios, el complejo de Golgi fue motivo de controversia entre quienes crean que el organelo realmente exista en las clulas vivientes y aquellos que pensaban que era un artefacto, estructura artificialmente formada durante la preparacin del tejido para la observacin con microscopio. Slo cuando se identific claramente el complejo de Golgi en muestras no fijadas obtenidas mediante fractura por congelacin se comprob su existencia dentro de la clula viviente ms all de toda duda razonable. El complejo de Golgi tiene morfologa caracterstica que consiste en cisternas aplanadas, discoides, con rebordes

amplios relacionados con vesculas y tbulos (figs. 8-15 y 8-16). Las cisternas, cuyos dimetros de ordinario son de 0.5 a 1.0 m, se disponen en pilas ordenadas, muy parecidas a pastelillos apilados e incurvadas de manera parecida a una copa poco profunda.2 Tpicamente, la pila de Golgi contiene menos de ocho cisternas; una clula individual puede contener desde unas cuantas hasta varios miles de pilas, segn el tipo de clula. Puesto que las membranas del complejo de Golgi estn desprovistas de ribosomas, se clasifican como membranas lisas, y luego de hpmogeneizacin aparecen en la fraccin microsmica lisa (pg. 282).
2 En las clulas vegetales, una sola pila de Golgi casi siempre se denomina dictiosoma.

292

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica; estructura, funcin y trfico de membrana

Retculo endoplsrnico con ribosomas

Vesculas de Golgi

Cisternas de Golgi

(a)
trans

FIGURA H-15. Complejo de Golgi. a) Micrografa electrnica de parte de una sola pila de Golgi mostrando vesculas cercanas a la cara cis y la gemacin de vesculas secretorias mayores a partir de los extremos de la cisterna de la cara trans. b) Micrografa electrnica de una parte de clula de la cubierta de una raz de tabaco mostrando 3a diferenciacin de la cisterna de un extremo de la pila de Golgi al otro (ilustrada adems en las siguientes figuras), (a: Cortesa de O. Kiermayer; b: cortesa de Tlwmas H. Giddings.)

(b)

RTG

Cisterna trans

Cisterna media

Cisterna cis

F I G U R A 8-16. D i b u j o de una parte del complejo de Golgi de una clula epitelial del conducto reproductor de la rata macho. Los elementos cis estn interrumpidos para poder visualizar el compartimiento medio. Los elementos del compartimiento trans con frecuencia son discontinuos y aparecen como redes tubulares. (Segn A. Rambourg y Y. Clermont, Eur. J. Cell Biol. 52: 195, 1990.)

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

293

fe)

0.15 jim

FIGURA 8-17. Diferencias regionales en la composicin de la membrana a travs de las pilas de Golgi. a) El tetrxido de osmio reducido impregna de manera preferencial las cisternas cis del complejo de Golgi. b) La enzima manosidasa II, que participa en la nivelacin de los residuos maosa de la parte central del oligosacrido, segn se describe en el texto, se localiza de preferencia en las cisternas medias, c) La enzima nuclesido difosfatasa, que procesa azcares nucletidos, se localiza de preferencia en las cisternas trans. (a y c: Segn Robert S. Decker, ]. Cell Biol. 61:603, 1974; b: segn ngel Velasco y cois. }. Cell Biol. 122:41, 1993; todas con permiso de Rockefeler Unversity Press.)

Las cisternas que constituyen las pilas de Golgi estn polarizadas; las ms prximas al RE se consideran en la cara cis, en tanto que las cisternas del extremo opuesto de la pila se encuentran en la cara trans (figs. 8-15, b, y 8-16). Estudios con diferentes tcnicas demuestran que el complejo de Golgi no tiene composicin uniforme de un extremo al otro. Por ejemplo, el osmio impregna de manera preferencial la cara cis (fig. 8-17, a). La enzima manosidasa II, concentrada en la cisterna meda (fig. 8-17, b), elimina los residuos de maosa, en tanto que la difosfatasa de nuclesido, una enzima que desdobla dmucletidos (p. ej., UDP), luego que dona sus azcares se observa preferencialmente en la cara trans (fig. 8-17, c). Las vesculas membranosas derivadas de diferentes porciones del complejo de Golgi tienen una densidad lo bastante diferente para separarlas entre s mediante gradientes de densidad (seccin 17-6). Segn estos y otros datos, el complejo de Golgi se divide en cuatro compartimientos funcionalmente distintos; las cisternas cis, media y trans; y la red trans de Golgi (RTG) (fig. 8-16). Las diferencias en la composicin de los compartimientos de la membrana de la cara cis respecto de la cara trans reflejan polaridad en las funciones del aparato de Golgi. Las protenas de la membrana, secretorias y lisosmicas, recin sintetizadas abandonan el RE y penetran al complejo de Golgi a travs de su cara ds y luego atraviesan la pila hacia la cara trans. El complejo de Golgi es principalmente una planta procesadora. Las protenas recin sintetizadas, que primero

fueron ensambladas en el RER, se modifican de manera secuencial especfica conforme atraviesan la pila de Golgi: las enzimas proteolticas recortan parte de su longitud; los aminocidos pueden modificarse (p. ej., por hidroxilacin de los aminocidos de una molcula de colgena) y cambiar gradualmente su contenido de carbohidratos mediante una serie de reacciones enzimticas (estudiadas ms adelante). Una vez que las protenas alcanzan la red trans de Golgi en el lado trans del organelo estn listas para ser clasificadas y enviadas a su destino final dentro o fuera de la clula. Desde hace tiempo se estableci claramente que hay movimiento de materiales a travs del complejo de Golgi, pero hay dos puntos de vista contrastantes respecto de la va donde ocurre. Hasta mediados del decenio de 1980 se pensaba que las cisternas de Golgi eran estructuras transitorias; se supuso que se formaban en la cara cis de la pila por fusin de las vesculas del RE y que cada cisterna se desplazaba fsicamente desde el extremo cis al extremo trans de la pila cambiando su composicin conforme avanzaba. Este modelo se conoce como de maduracin, puesto que propone que cada cisterna cis "madura" para convertirse en una cisterna trans. Se supone que cuando una cisterna alcanza la cara trans se fragmenta en vesculas que llevan los materiales a otros destinos. Aunque los defensores del modelo de maduracin del complejo de Golgi no lo abandonaron por completo, fue reemplazado principalmente por un modelo alterno que sostiene que las cisternas de una pila de

294

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana Fraccin "donadora" que contiene et complejo de Golgi de un mulante infectado con VSV
Compartimiento donador

porte (fig. 8-18). En estos estudios, efectuados por James Rothman y Lelio Orci, se prepararon dos muestras de fracciones de membrana derivadas del complejo de Golgi de clulas cultivadas de ovario de cobayo chino (OCC). Una fraccin ("fraccin donadora") se obtuvo de clulas infectadas con virus de la estomatitis vesicular, patgeno cuya informacin gentica codifica una protena integral de membrana (VSV-G) sintetizada en el RER y glucosilada en el complejo de Golgi de las clulas infectadas. Las clulas infectadas que suministraron la fraccin donadora eran mutantes genticos que carecan de la enzima que transfiere el azcar N-acetilglucosamina transferasa, normalmente residente en la cisterna media del complejo de Golgi que cataliza la reaccin mostrada en la figura 8-13. La otra fraccin ("fraccin aceptora") se obtuvo de clulas tipo nativo no infectadas que s contenan la enzima que transfiere el azcar. Cuando las dos fracciones se mezclaron con todos los factores solubles y tambin N-acetilglucosamina marcada con istopos radiactivos en las condiciones requeridas para la formacin y transferencia de vesculas, se observ aparicin de radiactividad en el dominio luminal de la protena VSV-G por adicin progresiva de N-acetilglucosamina. Esto slo puede ocurrir si las membranas donadoras que contienen VSV-G son transportadas a membranas aceptoras que contienen N-acetilglucosamina transferasa (fig 8-18). Consideraremos ahora con mayor detalle el mecanismo de transporte de vesculas.

Protena VSV-G

COOH

Tr'asa de GIcNAc suprimida

COOH

Fraccin "aceptora" que contiene el complejo de Golgi de clulas tipo nativo no infectadas

COOH

COOH

FIGURA 8-lS. Diseo de un experimento que apoya la hiptesis de que los materiales se desplazan entre los compartimientos de Golgi por medio de vesculas de transporte. La fraccin donadora que contiene membranas de Golgi se prepara a partir de clulas mutantes (que carecen de la enzima N-acetilglucosamina transferasa) infectadas con virus de la estomatitis vesicular (VSV). La protena G codificada por el genoma viral se sintetiza y glucoliza en el RE rugoso, pero no puede haber la segunda vuelta de glucolisacin que normalmente ocurre en el complejo de Golgi. Cuando se incuban estas membranas con una fraccin aceptora que tambin contiene membranas de Golgi, pero preparada a partir de clulas nativas no infectadas (clulas que poseen N-acetilglucosamina transferasa), la protena G de a fraccin donadora es glucosilada. La glucosilacin puede observarse incubando el donador mezclado con fracciones aceptoras en presencia de UDP-N-acetilglucosamina marcada con istopos radiactivos (indicada por el crculo rojo). Esta reaccin slo puede ocurrir si las vesculas de la fraccin donadora se fusionan con las membranas de la fraccin aceptora, de modo que la protena G no concluida pueda entrar en contacto con la transferasa presente en la luz de las membranas aceptoras. (Segn ].E. Rothman y L. Ora, FASEB J. 4:1463, 1990.)

Viaje desde el retculo endoplsmico hasta el complejo de Golgi a travs de los compartimientos de Golgi
Con el microscopio electrnico se observa que las vesculas formadas por gemacin del RE o de las cisternas cis y meda del complejo de Golgi estn revestidas en su superficie externa por una "cubierta vellosa" ms bien indiferenciada. Si las clulas se tratan con molculas de estructura similar a GTP (anlogos GTP), pero que a diferencia del GTP no se hidrolizan, estas vesculas revestidas se acumulan dentro de la clula (fig. 8-19) y pueden aislarse de clulas homogeneizadas mediante gradientes de densidad (seccin 17-6). Las vesculas revestidas se acumulan en presencia de un anlogo GTP no hidrolizable debido a que la cubierta contiene la protena enlazada a GTP llamada factor de adenosacin de ribosa (FAR), que debe hidrolizar al GTP enlazado antes que el revestimiento pueda desensamblarse. La hidrlisis de GTP y el desensamblado del revestimiento normalmente ocurren antes de la fusin de vesculas con una membrana especfica, lo que sugiere que FAR participa en el proceso de reconocimiento entre la membrana vesicular y su objetivo especfico (pg. 297). S hay coincidencia apropiada entre las dos membranas se presume que la hidrlisis de GTP acta como interruptor para despejar la va para la fusin de la membrana. Adems del FAR, la vescula contiene un complejo de siete protenas de revestimiento, distintas pero relacionadas,

Golgi permanecen en su sitio como entidades estables reunidas por un armazn de protenas. En este ltimo modelo, los materiales se desplazan a travs de la pila de Golgi, desde la cara cis a la red trans de Golgi mediante vesculas formadas por gemacin de un compartimiento de la membrana que se fusionan con un compatimiento vecino por fuera de la pila, como se muestra en la figura 8-2. Las pruebas citadas con mayor frecuencia para apoyar este ltimo modelo provienen del empleo de sistemas de clulas aisladas donde se reconstituyen las vesculas de trans-

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

295

para: 1) ser retenida en el compartimiento donde reside o 2) ser derivada (dirigida especficamente) a un destino particular diferente de la membrana plasmtica, como el lisosoma o una vescula secretoria regulada. En las siguientes seccio-

PIGURA Jl-J 9. Acumulacin de vesculas recubiertas de protena no clatrina. Las micrografas muestran el complejo de Golgi de una clula permeabilizada mediante tratamiento con un anlogo GTP no hidrolizable (GTPyS). Se observan numerosas vesculas recubiertas derivadas del complejo de Golgi y de yemas recubiertas sobre las membranas de Golgi. El recubrimiento de estas membranas contiene algunas protenas denominadas de revestimiento, que se distinguen de otro grupo de vesculas recubiertas (vesculas recubiertas de clatrina), descritas al final del captulo. (Segn ]ames E. Rothman y Lelio Ora, FASEB }. 4:1467, 1990.)

aisladas de organismos tan diversos como mamferos y levaduras. Las vesculas recubiertas con protenas de revestimiento se conocen como vesculas no recubiertas con clatrina, para distinguirlas de otro tipo de vesculas recubiertas que estudiaremos con detalle posteriormente. Las vesculas revestidas con protenas de revestimiento al parecer no son selectivas porque incluyen cualquier protena en su membrana y transportan cualquier carga soluble que no tenga restricciones especficas para abandonar el compartimiento donador. Muchas pruebas indirectas sugieren que las vesculas con protenas de revestimiento (u otras vesculas no revestidas con clatrina) participan en un proceso de flujo en masa, en el cual las vesculas desplazan continuamente membrana, materiales y lquidos de un compartimiento a otro, desde el RE a travs del complejo de Golgi y finalmente a la membrana plasmtica (fig. 8-20, a). En la figura 8-20, b, se muestra el ensamblado de la vescula recubierta con protenas de revestimiento. Segn este punto de vista del transporte de vesculas, una protena localizada en la membrana, en la luz del RE o en el complejo de Golgi "automticamente" ser transportada de un compartimiento al siguiente y con el tiempo a la superficie de la clula, a menos que contenga informacin

Revestimiento de protema no clatrina

Elemento de transicin del RE Vescula

Retculo endopsmico rugoso

!-- X*^"

(a)
COPs Yema revestida Vescula revestida

l'li;i:i \. Flujo en masa entre los compartimientos membranosos mediado por vesculas recubiertas de protena no clatrina. a) Las vesculas de transporte mostradas en este diagrama son iguales a las presentadas en la figura 8-19. Estas vesculas estn cubiertas en su superficie externa por un revestimiento de protenas no clatrina (p. ej.: protenas de revestimiento}. Se cree que las vesculas de este tipo transportan membranas y cargas soiubles de manera indiscriminada desde un compartimiento al siguiente a travs de la clula, b) Dibujo esquemtico del ensamblado de una vescula recubierta por protenas de revestimiento.

GTP

FAR

(b)

296

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplasmica: estructura, funcin y trfico de membrana

nes consideraremos con mayor detalle cada uno de estos factores.

Protenas retenidas en el RE

Si las vesculas se encuentran en gemacin continua dentro de los compartimientos de la membrana, cmo retiene cada compartimiento su composicin nica?. Por ejemplo, qu determina si una protena dada presente en la membrana del RE debe permanecer en ste o proseguir hacia la cisterna de Golgi? Las protenas que normalmente residen en la luz del RER (como la proteindisulfuro isomerasa y los chaperones moleculares) poseen como C terminal una secuencia de aminocidos que provoca su retencin dentro del compartimiento (fig. 8-21). Si una protena del retculo endoplsmico carece de la secuencia lis-asp-glu-leu (o KDEL, en la nomenclatura de una sola letra) no ser retenida en el compartimiento del RE, sino transportada a lo largo de la va biosinttica en vesculas de transporte (como en la figura 8-20). Cuando se efectan manipulaciones de ingeniera gentica sobre una clula para que exprese una protena no de RE que contenga un C terminal KDEL, dicha protena permanece en el RE en vez de ser enviada a su destino apropiado. Las protenas de la membrana del RE tienen una seal diferente (KKXX, donde K es lisina y X es cualquier aminocido), que de manera similar asegura su reten-

cin dentro del organelo. Cada compartimiento de membrana en la va biosinttica puede tener seales propias de retencin, lo que ayuda a explicar cmo cada compartimiento puede mantener su dotacin de protenas nicas frente al movimiento continuo de vesculas hacia adentro y afuera de esa regin. Los datos sugieren que las protenas residentes en el retculo endoplsmico que "accidentalmente" escapan del RE no se alejan mucho de la va biosinttica, sino que son recicladas a partir de la cisterna d$ de Golgi de regreso al RE (fig. 8-21). Esta observacin indica que el trfico de membrana ocurre no slo del RE al complejo de Golgi (la llamada va antergrado), sino tambin en la direccin opuesta (retrgrada). A partir del tratamiento de las clulas con brefeldin A (BFA), frmaco obtenido de clulas de hongos, se derivaron datos adicionales para el transporte retrgrado. El tratamiento con BFA conduce a la desaparicin del complejo de Golgi y desplazamiento de las protenas de Golgi residentes al interior del retculo endoplsmico. El brefeldin A acta al impedir la formacin de vesculas revestidas, al bloquear el trfico de membrana del RE al de Golgi, pero no a la inversa. En ausencia de trfico antergrado, se puede esperar que el movimiento retrgrado de las vesculas genere transporte de la membrana de Golgi hacia la membrana del retculo endoplsmico.
Orientacin de las vesculas hacia un compartimiento particular

Cisterna meda de Golgi

Protenas residentes del RE

Receptor KDEL

FIGURA 8-21. Retencin de protenas del retculo endoplsmico. Las protenas residentes del RE contienen una secuencia de aminocidos (KDEL) que provocan su retencin dentro del compartimiento. Se cree que la retencin ocurre conforme las protenas RE se unen de manera especfica a un receptor KDEL. Las protenas con una secuencia KDEL que escapan del RE en una vescula de transporte, al parecer regresan de los compartimientos cis de Golgi mediante un mecanismo de recidamiento.

La mayor parte de los factores aislados que participan en el transporte de vesculas desempean un papel inespecfico en el proceso, pero hay pruebas de que la fusin de la vescula es especfica. Por ejemplo, las vescculas del RE se fusionan con la cisterna cs de Golgi y no con la cisterna media. De manera similar, las vesculas de la cisterna media de Golgi slo se fusionan con la cisterna trans. La fusin selectiva es uno de los factores que garantiza un flujo altamente orientado a travs de los compartimientos membranosos de la clula. Se han aislado protenas, particularmente de clulas nerviosas, que median la fusin de membranas especficas. Por ejemplo, la membrana plasmtica de una neurona presinptica contiene una protena denominada sintaxina, que se une especficamente a una protena denominada protena de membrana relacionada con vesculas (PMRV, tambin conocida como sinaptobrevina) localizada en la membrana de las vesculas sinpticas. Se cree que la interaccin entre estas dos protenas media la fusin de la membrana y la liberacin del neurotransmisor (pg. 159). Aunque levaduras y mamferos estn separados por ms de mil millones de aos de evolucin y las clulas de las levaduras no efectan ninguna actividad anloga a la transmisin sinptica, estas primitivas clulas eucariotas contienen familias de genes que codifican protenas muy similares a sintaxina y protenas de membrana relacionadas con vesculas. Se ha propuesto que estas protenas son miembros de un par de familias de protenas que median el transporte vesicular en todas las clulas eucariotas. Las protenas similares a las protenas de membrana relacionadas con vesculas son miembros de la familia v-SNARE y se ubican en las membranas de vesculas de transporte. Protenas similares

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana toplstnica: estructura, funcin y trfico de membrana FIGURA 8-22. Se piensa que la especificidad del encuentro y fusin de las vesculas se logra a travs de interacciones especificas entre protenas sobre la membrana vesicular y protenas complementarias sobre la membrana del compartimiento al cual se dirigen, a) Se ha postulado que las protenas de la membrana vesicular son miembros de una familia v-SNARE, en tanto que las protenas del compartimiento al cual se dirigen de manera especfica son miembros de una familia t-SNARE. Conforme las vesculas de la membrana se forman por gemacin a partir de un compartimiento donador, recogen las protenas especficas v-SNARE que les permiten encontrarse con la membrana especfica apropiada que contiene una membrana complementaria t-SNARE. b) Diagrama de un ciclo de gemacin y encuentro. Adems de contener una v-SNARE, la vescula en gemacin del compartimiento donador est cubierta por un revestimiento de protena no clatrina. El revestimiento se desensambla antes del encuentro con la membrana especfica. Para el proceso de encuentro tambin se requieren algunas otras protenas (marcadas como SNAP y NSF).

297

a la sintaxna son miembros de la familia t-i y se localizan en la membrana aceptara (especfica). Se cree que interacciones especficas entre t-SNARE y v-SNARE (fig. 8-22) gobiernan el encuentro y la fusin de las vesculas. En esta hiptesis, por ejemplo, una v-SNARE de una vescula derivada del RE se une a t-SNARE en una cisterna cis de Golgi, pero no a t-SNARE en una membrana lisosmica. Orientacin de las protenas de la va biosinttica A pesar de todos los comentarios de las vesculas de transporte, an debemos explicar cmo una protena particular sintetizada en el RE se secreta en una vescula particular. Es importante que una clula tenga capacidad para distinguir entre los diferentes materiales que elabora. Por ejemplo, una clula pancretica tiene que separar enzimas digestivas recin sintetizadas y destinadas a ser secretadas de enzimas lisosmicas recin sintetizadas destinadas al lisosoma. Se cree que esta especie de proceso de clasificacin para separar protenas marcadas hacia diferentes destinos en vesculas diferentes ocurre en los ltimos compartimentos de Golgi, o sea, la red trans de Golgi (RTG). El microscopio electrnico revela que la RTG por lo general se compone de elementos tubulares interconectados en la vecindad de la cisterna trans ms interna (fig. 8-16). En la RTG se originan dos tipos de vesculas: 1. Vesculas no selectivas, no recubiertas de clatrina (fig. 8-20, a), que llevan materiales (como colgena y fibronectina) secretados continuamente por las clulas (o sea, secrecin elemental) y tambin protenas integrales de membrana que continuamente se aaden a la membrana plasmtica. 2. Vesculas selectivas recubiertas de clatrina que llevan cargas seleccionadas, como productos secretorios regulados y enzimas lisosmicas marcadas para sitios especficos. Ya analizamos la estructura y actividades de las vesculas no recubiertas de clatrina; ahora retornaremos a la variedad recubierta de clatrina. Estructura y Juncin de las vesculas recubiertas de clatrina de la red trans de Golgi La estructura de las vesculas recubiertas de clatrina se describe con detalle en la pgina 313. El revestimiento de estas
Sin revestimiento X

= v-SNARE para el RE cis de Golgi fr = t-SNARE para el RE ds de Golgi ^ = v-SNARE para la membrana plasmtica rrans de Golgi ^ = t-SNARE para la membrana plasmtica trans de Golgi

Retculo endoplsmico

(O)

Cisterna B

Sin revestimiento

Cisterna A

,.

298

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana, citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

Clatrina ^ Receptor con ligando A Adaptador

t
vescula con protenas de revestimiento que contiene material inespecfico de la RTG Formacin de la vescula revestida de clatrina que contiene material seleccionado
de la RTG

\n de la

Red trans de Golgi

Clatrina Adaptador (consta de dos sublimidades de adaptina) Dominio citoplsmco del receptor de membrana

Dominio transmembrana del receptor de membrana Material seleccionado para ser transportado

(W

FIGURA 8-23. Formacin en la RTG de fosillas que contienen adaptina y estn recubiertas de clatrina. a) Se pueden observar cuando menos dos tipos distintos de vesculas recubiertas en gemacin sobre la membrana de la red trans de Golgi. Las vesculas recubiertas por protena no clatrina no muestran selectividad respecto de la carga que transportan, en tanto que las vesculas recubiertas de clatrina transportan materiales capaces de enlazarse a receptores especficos de membrana. Los receptores de membrana se incorporan selectivamente en las vesculas recubiertas de clatrina como consecuencia de una unin especfica entre los extremos de las protenas de membrana y la capa ce adaptadores que los rodean (mostrada en el recuadro). Los adaptadores, a su vez, poseen sitios de enlace para la red ms externa de molculas de clatrina. b) Como se analiza posteriormente en el captulo, se pueden distinguir dos tipos de vesculas recubiertas de clatrina, un tipo formado por gemacin de la red trans de Golgi de ias pilas de Golgi, y el otro que se forma por gemacin a partir de la membrana plasmtica. Estos dos tipos de vescula se distinguen por los tipos de molculas de adaptina que componen los adaptadores. Las vesculas formadas por gemacin de la RTG contienen y-adaptina, cuya localizadn en estas clulas se revela por anticuerpos fluorescentes rojos. Las vesculas formadas por gemacin de la membrana plasmtica contienen er-adaptina, cuya localizacin se revela por anticuerpos fluorescentes verdes, (b: Segn Margaret S. Robinson, Trends in Cell Biol. 2:294, 1992.)

vesculas contiene: 1) una estructura externa parecida a un panal de abejas compuesto por la protena clatrina que forma un bastidor estructural, y 2) una cubierta interna compuesta de complejos protenicos llamados adaptadores, que cubren la superficie de la membrana vesicular enfrentada al citoplasma (fig. 8-23, a). La masa de cada adaptador consta de un par de protenas llamadas adaptinas, cuya localizacin dentro de la regin de la red trans de Golgi se muestra en la figura 8-23, b. Se piensa que las adaptinas proporcionan parte de la informacin requerida para la clasificacin de protenas. Los extremos C terminal de las molculas de adaptina forman un par de "orejas" proyectadas desde el cuerpo del complejo adaptador. Se cree que stas prolongaciones semejantes a orejas pueden enlazarse a las colas de los receptores de membrana. A su vez, los receptores se enlazan a ligandos especficos dentro de la luz de la vescula (fig. 8-23). Como resultado de estas interacciones, los materiales especficos dentro de la vescula se concentran en vesculas no cubiertas de clatrina.

Clasificacin de las protenas lisosmicas. La clasificacin de las protenas lisosmicas ilustra la manera de operar de algunos componentes de una vescula recubierta de clatrina. Las protenas lisosmicas se ensamblan a ribosomas enlazados a la membrana del RE y se transportan a la cisterna as de Golgi junto con otros tipos de protenas. Sin embargo, ya en la cisterna de Golgi, las enzimas que aaden un grupo fosfato a los azcares maosa de las cadenas de carbohidrato unidas por enlaces N reconocen a las protenas lisosmicas (fig. 8-24, u). Por lo tanto, a diferencia de otras glucoprotenas clasificadas en la red trans de Golgi, las enzimas lisosmicas poseen residuos maosa fosforilados que actan como seales de reconocimiento. Las enzimas lisosmicas que llevan esta seal son reconocidas y "capturadas" por los receptores maosa 6-fosfato, los cuales son protenas integrales de membrana de la red trans de Golgi (fig. 8-24, b). Este aspecto del mecanismo de clasificacin est bien establecido, pero la demostracin para el resto del cuadro es ms circunstancial.

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana toplsmca: estructura, juncin y trfico de membrana FIGURA -2-J. Mecanismo para enviar las enzimas lisosmicas a los lisosomas. a) Las enzimas lisosmicas son reconocidas por una enzima en la cisterna as que transfiere una N-acetilglucosamina fosforilada desde un azcar nucletido donador a uno o ms residuos maosa de oligosacridos N unidos. A continuacin se elimina la porcin glucosamina en un segundo paso mediante una segunda enzima que deja residuos de manosa-bsfato como parte de la cadena del oligosacrido. b) Diagrama que muestra las vas seguidas por: 1) una protena (rojo) secretada de manera elemental (como la fibronectina), y 2) una enzima lisosmica (negro). Los residuos maosa de la enzima lisosmica se fosforilan en las cisternas de Golgi (paso 1) y luego se incorporan selectivamente en una vescula recubierta por clatrina en la RTG (paso 2). Se cree que los receptores maosa 6-fosfato tienen un doble papel: interactan de manera especfica con las enzimas lisosmicas en el lado luminal de la vescula y tambin especficamente con adaptinas sobre la superficie ctoplsmica de la vescula (paso 3). Los receptores maosa 6-fosfato al parecer se separan de las enzimas antes de la formacin del lisosoma (paso 4) y regresan al complejo de Golgi (paso 5). Los receptores maosa 6-fosfato tambin estn presentes en la membrana plasmtica, donde pueden capturar enzimas lisosmicas secretadas en el espacio extracelular y retornarlas a una va- que las dirige hacia el lisosoma (paso 6).

299

:'J - 3 c c 1 1 1 g I u c o s a m i n a [osfotransferasa

F o sf odi es terglucosidasa

i t i A los i \ lisosomas
2UMP

- Maosa - GIcNAc

(e)
Exocitosis

O
<\a de <] clasificacin Disociacin de la enzima lisosmica del receptor 6-fosfato de maosa Q ^ Vescula del transporte 0

Se cree que los receptores maosa 6-fosfato de la RTG pueden tener sitios de enlace en ambos lados de la membrana de la red trans de Golgi. Aunque una parte del receptor se proyecta a la luz de la RTG y se enlaza a una enzima lisosmica, otra parte se proyecta al interior del citoplasma y se enlaza a una molcula de adaptina en uno de los complejos adaptadores ensamblados en la superficie de la membrana de la red trans de Golgi (fig. 8-24, b). Una vez formada, la vescula de clatrina recubierta que surge por gemacin de la RTG debe orientarse a un destino particular. Por ejemplo, las vesculas recubiertas contienen enzimas lisosmicas que deben orientarse a un lisosoma (o a un endosoma que posteriormente se convertir en un lisosoma, pgina 311). Presumiblemente, cada vescula de transporte que sufre un proceso de gemacin en la membrana lleva consigo protenas especficas derivadas de la membrana donadora capaces de fijarse a receptores especficos sobre la membrana aceptora para iniciar la fusin. En la figura 8-22 se muestran las v-SNARE y t-SNARE que pueden mediar este proceso. Glucosilacin en el complejo de Golgi La funcin definida con mayor claridad del complejo de Golgi es el ensamblado de carbohidratos. El complejo de Golgi es el sitio donde se concluye el ensamblado de oligosacridos a glucoprotenas y glucolpidos. El complejo de Golgi tambin es sitio de sntesis de la mayor parte de los complejos polisacridos de la clula, incluyendo, por ejemplo, los glucosaminoglicanos observados en la matriz extracelular de clulas animales o las pectinas y la hemicelulosa que se encuentran en las paredes celulares de las plantas (fig, 7-35, c). El papel del complejo de Golgi en la glucosilacin se demostr por primera vez mediante autoradiografa en clulas caliciformes intestinales que secretan grandes cantidades de mucina, una protena con alto contenido de azcar. Cuando se expone esta clula a azcares marcados con istopos radiactivos se observa que priProtena secretoria

Reciclamiento del receptor 6-fosfato para maosa

Receptor maosa 6-fosfato

Red trans de Golgi

Fosforilacin de la enzima lisosmica Enzima lisosmica

Retculo endoplsmico rugoso

(b)

mero se incorporan al interior del complejo de Golgi (fig. 8-25). El complejo de Golgi es una estacin principal de procesamiento a lo largo de la va biosinttica (fig. 8-2). Cuan-

300

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

Luz del intestino

Exocitosis: etapa terminal de la secrecin Las clulas que participan en la secrecin regulada, como las que se muestran en la figura 8-8, tpicamente contienen un gran nmero de vesculas secretorias (tambin llamadas granulos secretorios) apiadas cerca de sus superficies apicales. Los granulos secretorios se originan de vesculas recubiertas de clatrina que sufren gemacin en la red trans de Golgi. Conforme las vesculas secretorias se desplazan a la superficie apical de la clula, el contenido de las vesculas se concentra cada vez ms a medida que el agua sale de las vesculas hacia el citoplasma. En las clulas nerviosas, las vesculas que contienen sustancias neurotransmisoras sufren gemacin de la RTG localizada cerca del ncleo de la clula y a continuacin se transportan al extremo del axn, distancia que puede ser de varios metros en un vertebrado de gran tamao. Para que un granulo secretorio descargue su contenido es necesario que la membrana del granulo y la membrana plasmtica suprayacente entren en contacto y en seguida se fundan, generando as una abertura a travs de la cual se puede liberar el contenido del granulo (fig. 8-27, a,b). Este proceso de fusin de membranas y descarga del contenido, que se denomina exocitosis, de ordinario se desencadena cuando la concentracin local de iones calcio aumenta. Por ejemplo, en la pgina 159 se hizo notar que la llegada de un impulso nervioso al botn terminal de una neurona incrementa el flujo hacia adentro de Ca2+ con la subsecuente descarga de molculas de neurotransmisor mediante exocitosis. La inyeccin de soluciones de calcio dentro de las clulas que participan en la secrecin regulada provoca la descarga total del producto secretorio. Las etapas de la exocitosis (o de cualquier tipo de fusin regulada de membranas) son un proceso todava no bien comprendido. El contacto entre la membrana de una vescula secretoria y la membrana plasmtica es mediado por algunas de las llamadas "protenas de fusin" situadas en la superficie y dentro de la membrana. La funcin aparente de estas protenas es establecer contactos a corta distancia entre membranas especficas destinadas a ntractuar y fusionarse. Se cree que el contacto entre las membranas puede causar la formacin de un pequeo "poro de fusin" revestido de protena (fig. 8-27, b) que rpidamente se dilata para formar una abertura para descarga. Cualquiera que sea el mecanismo de fusin de la membrana, cuando una vescula citoplsmica se fusiona con la membrana plasmtica, la superficie interna de la membrana vesicular entra a formar parte de la superficie externa de la membrana plasmtica, en tanto que la superficie externa de la membrana vesicular formar parte de la superficie interna de la membrana plasmtica (fig. 8-10).

FIGURA 8-25. Sntesis de poiisacridos complejos en el complejo de Golgi. Diagrama de una clula caliciforme del colon de rata mostrando la ubicacin de los granos plateados (rojo) en autorradiografas de clulas fijadas inmediatamente despus de incubacin con 3H-glucosa. El complejo de Golgi se muestra intensamente radiactivo, lo que indica su papel en la incorporacin de residuos de azcar a las cadenas de carbohidrato que constituyen la masa de la secrecin mucosa. La incorporacin de azcares en el complejo de Golgi contrasta con la incorporacin de aminocidos en el RE rugoso. (Basado en el trabajo realizado por Manan Neutra y C.P. LeUond.)

do tratamos en la pgina 290 el tema de la formacin de cadenas de carbohidratos N unidas, los residuos de glucosa acababan de s2er eliminados de los extremos del oligosacrido central. Conforme las glucoprotenas solubles y de membrana recin sintetizadas pasan a travs de las cisternas cis y media de la pila de Golgi, tambin se pierden la mayor parte de los residuos maosa de los oligosacridos centrales y se aaden secuencialmente otros azcares mediante diferentes glucosiltransferasas (fig. 8-26). La organizacin final de los azcares en un oligosacrido determinado al parecer es determinada por la disposicin espacial de diferentes glucosiltransferasas que entran en contacto con la protena recin sintetizada conforme se desplaza a travs de las cisternas membranosas del complejo de Golgi. Por ejemplo, la enzima sialiltransferasa, que coloca un cido silico en la posicin terminal de la cadena en clulas animales, se encuentra en el extremo trans de la pila de Golgi, como sera de esperar si las glucoprotenas recin sintetizadas se desplazaran continuamente hacia esta parte del organelo. En contraste, las protenas'residentes del RER carecen de azcares que normalmente se aaden en las cisternas de Golgi media y trans, como ocurrira a protenas que nunca alcanzan esta parte de la pila de Golgi. A diferencia de los oligosacridos N unidos, los que se fijan a protenas por uniones O se ensamblan por completo en el complejo de Golgi.

8-5 Lisosomas
Los lisosomas actan como organelos digestivos de la clula. Dentro de un lisosoma tpico se encuentra confinado un grupo de casi 50 enzimas hidrolticas diferentes (cuadro 8-1) sintetizadas en el RE rugoso y enviadas a esos organelos. En conjunto, las enzimas lisosmicas son capaces de

CAPITULO 8 Sistemas de a membrana citoplsmica: estructura, fundn y trfico de membrana

301

cis de Golgi

cis de Golgi media de Golgi V Maosa

media de Golgi

meda de Golgi

media de Golgi trans de Golgi

trans de Golgi

frans de Golgi

/V-acetilglucosamina

Galactosa

Acido silico 4 Fucosa

FIGURA 8-26. Etapas en la glucosilacin de oligosacridos de mamfero N enlazados en el complejo de Gogi. Luego de eliminar los tres residuos de glucosa, a continuacin se quitan varios residuos maosa, en tanto que algunos azcares (N-acetilglucosamina, galactosa, fucosa y cido silico) se aaden al oligosacrido mediante la accin de glucosiltransferasas especficas. En la luz de las cisternas de Golgi y los dominios luminales de las protenas integrales de las membranas de Golgi se aaden cadenas similares de azcares a ambas protenas solubles.

(a)
FIGURA 8-27. Exocitosis. a) Micrografa electrnica que muestra un granulo secretorio luego de concluir la fusin con la membrana, b) Modelo de un poro de fusin formado durante la exocitosis por interaccin de una protena integral multimrica de la vescula y la membrana plasmtica. 1) Las protenas de las dos membranas entran en contacto; 2) las protenas forman un poro cerrado que abraza las dos bicapas, y 3) el poro se dilata conforme las molculas de lpido difunden a lo largo de las superficies hidrfobas dispuestas entre las subunidades de fusin de los poros, (a: Cortesa de Susan o Bunven.)

302

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana CUADRO 8- ': Muestra de enzimas lisosmicas Enzima Fosfatasas Sustrato

diante un transportador de protones (una H+-ATPasa) presente en la membrana que limita al organelo. Las membranas lisosmicas contienen dos grupos de protenas acidas integrales altamente glucosiladas llamadas Igp-A y Igp-B,

fosfatasa acida fosfodiesterasa acida Nudeasas ribonucleasa acida desoxirribonucleasa acida Proteasas catepsna colagenasa

fosfomonosteres fosfodisteres

RNA DNA

protenas colgena Enzimas que hidrolizan GAC

iduronato sulfatasa /3-galactosidasa heparan N-suifatasa tr-N-acetilglucosaminidasa

dermatansulfato queratansulfato heparansulfato heparansulfato

Polisacaridasas y oligosacaridasas a-glucosidasa fucosidasa a-manosidasa sialidasa glucgeno fucosil oligosacridos manosil oligosacridos sialil oligosacridos Enzimas que hidrolizan esfingolpidos ceramidasa glucocerebrosidasa /?-hexosaminidasa arilsulfatasa A ceramida glucosilceramida ganglisido C-M2 galactosilsulftido Enzimas que hidrolizan lpidos lipasa acida fosfolipasa triacilgliceroles fosfolpidos

(a)

hidrolizar prcticamente cualquier tipo de macromolcula biolgica para convertirla en productos de bajo peso molecular que puedan ser transportados a travs de la membrana lisosmica al interior del citoplasma. Las enzimas de un lisosoma comparten una propiedad importante: todas tienen actividad ptima a pH cido: son hidrolasas acidas. El pH de estas enzimas se correlaciona con el pH bajo del compartimiento lisosmico, que es alrededor de 4.6. La elevada concentracin interna de protones se mantiene me-

FIGTiRA 8-28. Lisosomas. a) Micrografa de un macrfago de mdula sea cultivado cuyos lisosomas contienen materiales ingeridos y teidos con el colorante fluorescente amarillo lucifer. Los lisosomas de estas clulas inicialmente son tubulares e interconectados para formar una red reticular corno la que se observa en la fotografa. Los isosomas muestran una conformacin ms vesicular luego de participar en la fagocitosis, b) Porcin de una clula de Kupffer del hgado (fagocitaria) que muestra cuando menos 10 lisosomas de tamao muy variable, (a: Segn Philip E. Knapp y Joel A. Swanson, J. Cell Sci. 95:433, 1990; con permiso de Tlie Company of Biologists; b: segn Hans Glaitmann y cois. J. Cell Biol. 67:887, 1975, con permiso de Rockefeller University Press.)

(b)

0.3 fjm

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, fundn y trfico de membrana Acrosoma

303

FIGURA -29. Reaccin acrosmca. a) El acrosoma del espermatozoide del erizo marino se sita en el extremo anterior, justo frente al ncleo, b) Cuando la membrana plasmtica del espermatozoide entra en contacto con los materiales que rodean al vulo ocurre una reaccin que libera enzimas lisosmicas almacenadas en el acrosoma, que digieren un trayecto que conduce hacia la superficie del huevo. (Cortesa de Cien L. Decker, D.B. Joseph y William }. Lennarz.)

(a)

cuya funcin puede ser proteger a la membrana contra el ataque de las enzimas que encierra. Aunque los lisosomas alojan un grupo conocido de enzimas, en las micrografas electrnicas su apariencia no es distintiva, ni siquiera uniforme. Por ejemplo, el tamao

FIGURA. 8-30. Lisosomas y autofagia. Micrografa electrnica de la clula de una porcin de tbulo renal de ratn que muestra numerosos lisosomas. La presencia de enzimas lisosmicas en estos organelos se demuestra por tcnicas citoqumicas mediante la precipitacin de fosfato de plomo procedente del fosfato inorgnico liberado por actividad de a fosfatasa acida (como en LI). El lisosoma marcado 1.2 se fusiona con una mitocondria enlazada a la membrana para formar una vacuola autofgica. (Segn Viuianne Maggi, en E.E. Bittar, ed., Cell Biology in Medicine, Wiiey, 1973.)

de los lisosomas oscila desde estructuras relativamente grandes (mayores de 1 fim de dimetro) hasta vesculas muy pequeas (25 a 50 nm de dimetro). La variacin en la morfologa lisosmica es ms evidente en los macrfagos, clulas especializadas en ingerir partculas extraas mediante un proceso de fagocitosis, que se estudia a profundidad en la seccin 8-7. Cuando se diferencian macrfagos en cultivo, sus lisosomas inicalmente son organelos tubulares interconectados que forman una red reticular (fig. 8-28, a). Una vez que el macrfago cultivado comienza a fagocitar materiales, sus lisosomas se transforman en vesculas ms tpicas. La figura 8-28, b, muestra una pequea porcin de: un clula de Kupffer, una clula fagocitaria del hgado encargada de ingerir eritrocitos envejecidos. Los lisosomas mostrados en la figura 8-28, b, tienen forma irregular y densidad electrnica variable, lo que ilustra la dificultad para identificar estos organelos con base slo en su morfologa. De ordinario, para identificar un organelo como lisosoma hay que demostrar la presencia de la enzima fosfatasa acida (fig. 8-30). Esto se efecta por mtodos citoqumicos incubando cortes de tejido con un sustrato adecuado para la enzima en presencia de una sal soluble de plomo, como el citrato de plomo. Cuando la fosfatasa acida separa el fosfato inorgnico del sustrato se forma un precipitado insoluble de fosfato de plomo en el sitio, el cual puede identificarse directamente en el microscopio electrnico. Aunque es evidente que los lisosomas aparecen estticos en una micrografa electrnica, se ha demostrado que son organelos dinmicos capaces de efectuar fusin y fisin con rapidez. La presencia dentro de una clula de esta verdadera bolsa de enzimas destructoras sugiere algunas posibles funciones. La funcin mejor estudiada de los lisosomas es el desdoblamiento de materiales que llegan a las clulas procedentes del ambiente extracelular. Muchos organismos unicelulares ingieren partculas nutrientes que son desensambladas en el lisosoma por las enzimas. Los nutrientes pasan al interior del citoplasma a travs de la membrana lisosmica. En mamferos, las clulas fagocitarias, como los macrfagos y los neutrfilos, funcionan como carroeros

304

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

que ingieren desperdicios o microorganismos potencialmene peligrosos. En general, estos materiales se inactivan al pH bajo del lisosoma y luego son digeridos por las enzimas. Se estima que un macrfago participa intensamente en la fagocitosis y puede contener ms de mil lisosomas. No todas las bacterias ingeridas por clulas f agocitarias son destruidas. Algunas especies, como Mycobacterium tuberculosis, agente causal de la tuberculosis, penetran al citoplasma de un macrfago mediante fagocitosis, pero la vescula (fagosoma) donde quedan encerrados no se fusiona con un lisosoma. De alguna manera, el microorganismo inhibe la fusin que conducira a su destruccin, y en lugar de eso se multiplica dentro de la clula. En contraste, la bacteria causante de la fiebre Q, Coxiella burnet, queda incluida en un fagosoma que se funde con un lisosoma, pero ni el ambiente cido ni las enzimas del lisosoma son capaces de destruir al patgeno. Un tercer paso es el que toma Listeria monocytogenes, bacteria capaz de causar meningitis. Este microorganismo produce una fosfolipasa que destruye la integridad de la membrana lisosmica y permite que la bacteria escape hacia el interior del citoplasma de la clula. Durante la fertilizacin se observa una actividad lisosmica poco habitual. La cabeza del espermatozoide con-

tiene un paquete de enzimas lisosmicas denominado acrosoma. Cuando el espermatozoide alcanza la vecindad de un vulo, la membrana que rodea el acrosoma se fusiona con la membrana plasmtica suprayacente y libera las enzimas lisosmicas almacenadas (fig. 8-29). Las enzimas digieren una va a travs de la cubierta externa del vulo y dejan un "agujero" por el cual avanza el espermatozoide, que entonces puede alcanzar la membrana plasmtica del vulo. Los lisosomas no slo estn implicados en la destruccin de materiales que penetran a la clula desde el medio externo. Tambin desempean un papel clave en el recambio del organelo, o sea, la destruccin y sustitucin de organelos. Durante este proceso, denominado autofagia, un organelo como la mitocondria, mostrado en la figura 8-30, se rodea de una membrana donada por el retculo endoplsmico. A continuacin, la membrana que rodea al organelo se fusiona con un lisosoma formando una vacuola autofgica. Cuando se examina una micrografa electrnica no es raro observar una mitocondria u otro organelo atrapado en una vacuola autofgica. Se calcula que en una clula heptica de mamfero, una mitocondria sufre autofagia cada 10 minutos, aproximadamente. El nmero de vacuolas autofgicas observadas en una clula puede variar segn el estado -

Fagoctosis Exocitosis

Vacuola fagocitaria (fagosoma)

Granulo de pigmento de lipofuscina

Vacuola autofgica (citolisosoma) Complejo de Golgi

Mitocondria

FIGURA 8-31. Resumen de las vas dei sistema lisosmico.

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

305

siolgico de la misma. Si se priva a una clula de nutrientes se observa un marcado incremento de la autofagia. En estas condiciones, la autofagia suministra a la clula la energa para mantenerse viva mediante la canibalizacin de sus propios organelos. El papel de los lisosomas en dos funciones principales, fagocitosis y autofagia, se resume en la figura 8-31; el papel de estos organelos digestivos en una tercera actividad (endocitosis) se analiza en la pgina 313. Se ha demostrado que los lisosomas primarios, o sea, lisosomas que an no tienen funciones en la digestin celular, se fusionan con vesculas fagocitarias que contienen materiales extraos, como bacterias, o con vesculas autofgicas que contienen organelos celulares, como mitocondrias. En cualquier caso, una vez concluido el proceso digestivo, el organelo se denomina corpsculo residual. Segn el tipo de clula, el contenido del corpsculo residual puede eliminarse de la clula por exocitosis, o quedar retenido indefinidamente en el citoplasma como granulo de lipofuscina. Los granulos de lipofuscina aumentan de nmero conforme un individuo envejece; su acumulacin es particularmente notable en clulas de vida prolongada, como las neuronas, donde estos granulos se consideran una caracterstica principal del proceso de

envejecimiento. El papel de los lisosomas en diversas enfermedades se analiza en La perspectiva humana, en este captulo.

8-6 Vacuolas de clulas vegetales

Ms de 90% del volumen de muchas clulas vegetales se encuentra ocupado por una sola vacuola llena de lquido y rodeada por una membrana (fig. 8-32). Aunque de estructura sencilla, las vacuolas de las plantas efectan una amplia gama de funciones esenciales. Sirven como almacn transitorio para muchos solutos de la clula y de macromolculas, incluyendo iones, azcares, aminocidos, protenas y polisacridos. Las vacuolas tambin pueden almacenar algunos compuestos txicos. Estos compuestos (como los glucsidos que contienen cianuro y los glucosinolatos) forman parte de un arsenal qumico de armas liberadas cuando la clula es lesionada por un herbvoro o por hongos. Otros compuestos txicos son simplemente subproductos de reacciones metablicas; puesto que las plantas carecen de sistemas de tipo excretorio, como los observados en animales, utilizan sus vacuolas como medio para elimi-

(b)

FIGURA 8-32. Vacuolas de clulas vegetales, a) Cada una de las clulas cilindricas de las hojas de la planta acutica Elodea contiene una gran vacuola central rodeada por una capa de citoplasma que contiene los cloroplastos visibles en la micrografia. b) Micrografa por transmisin electrnica de una clula cortical de frijol de soya que muestra la gran vacuola central y la delgada capa de citoplasma que la rodea, (a: Segn M.l. Walker/Photo Researchers; b: segn M..F. Brown/Visuals Unlimited.)

306

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

LA PERSPECTIVA HUMANA
Enfermedades producidas por defectos de la funcin lisosmica
Si consideramos que las enzimas hidrolticas de un lisosoma pueden digerir todo el contenido de una clula, no es sorprendente que los trastornos de la funcin lisosmica tengan un profundo efecto sobre la salud humana. Por ejemplo, la enfermedad de los mineros conocida como silicosis se debe a la captacin de fibras de slice por las clulas fagocitarias de los pulmones. Las fibras quedan encerradas' en los lisosomas, pero no pueden digerirse; en vez de esto, provocan fugas en la membrana lisosmica, derrame del contenido de enzimas digestivas dentro de la clula y dao al tejido pulmonar. Ocurre algo similar cuando las clulas carroeras captan fibras de asbesto y ocasionan la enfermedad llamada asbestosis. Ambos padecimientos pueden ser debilitantes e incluso causar la muerte. Ciertos tipos de enfermedades inflamatorias, como la artritis reumatoide, se deben en parte a la liberacin de enzimas lisosmicas procedentes de clulas inmunolgicas en el espacio extracelular, daando los materiales intraarticulares. La comprensin de los mecanismos para enviar protenas hacia organelos particulares se inici con el descubrimiento de que los residuos maosa 6-fosfato de las enzimas lisosmicas actan como "direccin postal" para entregar protenas a los lisosomas. El descubrimiento de la "direccin" del lisosoma ocurri en estudios de pacientes con una rara enfermedad heriditaria conocida como enfermedad de la clula I, en la cual muchas clulas del cuerpo contienen lisosomas inundados de materiales no degradados. Los materiales se acumulan en los lisosomas de estos pacientes por la falta de enzimas hidrolticas. Cuando se estudiaron cultivos de fibroblastos de estos pacientes se observ que las enzimas lisosmicas se sintetizan en concentracin normal, pero que en vez de entrar a los lisosomas de la clula son secretadas al medio externo. Estudios subsecuentes revelaron que las enzimas secretadas carecen de residuos maosa fosfato presentes en las enzimas correspondientes de las clulas de individuos normales. Pronto se demostr que el defecto de la clula I era una deficiencia de la enzima (N-acetilglucosamina fosfotransferasa) necesaria para la fosforilacin de la maosa (fig. 8-24). En 1965, W.G. Hers, de la Universidad de Louvain, en Blgica, postul una hiptesis para explicar cmo la ausencia de una enzima lisosmica aparentemente sin importancia, la a-glucosidasa, poda provocar la aparicin de una enfermedad hereditaria mortal conocida como enfermedad de Pompe. Hers sugiri que en ausencia de a-glucosdasa el glucgeno no digerido se acumula en los lisosomas causando inflamacin de esos organelos y dao irreversible a clulas y tejidos. Enfermedades de este tipo, caracterizadas por la deficiencia de una enzima lisosmica y acumulacin del correspondiente sustrato no desdoblado (fig. PH 8-1), se denominan enfermedades por almacenamiento lisosmico; hasta ahora se han descrito ms de 30 (cuadro PH 8-1). Los sntomas de las enfermedades por almacenamiento lisosmico van desde enfermedades muy graves hasta padecimientos difciles de determinar, segn el grado de actividad de la enzima a pesar de la presencia de una mutacin gentica. La mayor parte de las enfermedades por almacenamiento lisosmico son hereditarias autosmicas recesivas y por lo tanto los individuos afectados heredan el gen defectuoso de ambos progenitores. Dos de estas enfermedades (la de Fabry y la de Hunter) son causadas por genes presentes en el cromosoma X y ,son mucho ms frecuentes en los hijos

Fipiira PH 8-1. Trastornos del almacenamiento lisosmico. Micrografa electrnica de un corte transversal de una porcin de glndula sudorpara en un paciente con enfermedad de Hunter, padecimiento por almacenamiento lisosmico caracterizado por incapacidad para descomponer glucosaminoglicanos. De los tres tipos de clulas mostradas, rnioepiteliales (ME), clulas claras (CC) y clulas oscuras (DC), las dos ltimas se caracterizan por la presencia de numerosas vacuolas ausentes en las mismas clulas de un individuo normal. En estas vacuolas se observan enzimas lisosmicas teidas y glucosaminoglicanos, lo que indica acumulacin de glucosaminoglicanos no digeridos en esos lisosomas. (Cortesa de S.S. Spicer.)

varones, quienes heredan el alelo imitante de la madre. Entre las enfermedades por almacenamiento lisosmico mejor estudiadas se encuentra la enfermedad de TaySachs, resultante de una deficiencia de la enzima /-N-hexosaminidasa A, en-

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana ciioplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

307

CUADRO PH 8-1. Enfermedades por almacenamiento de esfingolpidos

Principal sustancia almacenada

Enfermedad

Deficiencia enzimtica

Consecuencias

Gangliosidosis GMI Enfermedad Tay-Sachs Enfermedad de Fabry Enfermedad de Sandhoff Enfermedad de Gaucher Enfermedad Niemann-Pick Lipogranulomatosis de Farber Enfermedad de Krabbe Sulfatidolipidosis

jS-galactosidasa GMi Hexosaminidasa A a-galactosidasa A Hexosaminidasas A y B Glucocerebrsido Esfingomielinasa Ceramidasa Galactocerebrosidasa Arilsulfatasa A

Ganglisido GMI Ganglisido GMI Trihexosiceramida Ganglisido G^2 y globsido Glucocerebrsido Esfingomielina Ceramida Galactocerebrsido Sulftido

Retraso mental, hepatomegalia, afeccin del esqueleto, muerte cerca de los dos aos de edad Retraso mental, ceguera, muerte cerca de los tres aos de edad Erupcin cutnea, insuficiencia renal, doior en las extremidades inferiores Similar a la enfermedad Tay-Sachs, pero de evolucin ms rpida Hepatomegalia y esplenomegalia, erosin de huesos largos, retraso mental slo en la forma infantil Hepatomegalia y esplenomegalia, retraso mental Dolor y deformacin progresiva de las articulaciones, nodulos cutneos, muerte en los primeros pocos aos Prdida de la mielina, retraso mental, muerte a la edad de dos aos Retraso mental, muerte en el primer decenio de vida

zima requerida para desdoblar el ganglisido GM2 (ig. 4-6), componente comn de la membrana de clulas cerebrales. En su forma ms grave, que ataca durante la infancia, la enfermedad se caracteriza por retraso mental y motor progresivo, y tambin por anomalas esquelticas, cardiacas y respiratorias. La enfermedad es muy rara en la poblacin general, pero alcanza una tasa mayor de 1 en 3 600 nacimientos entre descendientes de judos de Europa oriental. En aos recientes, la ocurrencia de la enfermedad descendi de manera espectacular en esta poblacin tnica como consecuencia de la identificacin de portadores, consejo gentico a progenitores en riesgo, y diagnstico prenatal por amniocentesis. En realidad, todas las enfermedades conocidas por almacenamiento lisosmico

se pueden diagnosticar antes del nacimiento. En los ltimos aos han mejorado mucho las perspectivas del tratamiento de las enfermedades por almacenamiento lisosmico con la demostracin de que los sntomas de la enfermedad de Gaucher, causada por deficiencia de la enzima lisosmica glucocerebrosidasa, se pueden aliviar parcialmente sustituyendo la enzima. Los lactantes con enfermedad de Gaucher acumulan grandes cantidades de glucocerebrsidos en los lisosomas de sus macrfagos. Los intentos iniciales para corregir la enfermedad inyectando en la corriente sangunea una solucin de la enzima humana normal no tuvieron xito debido a que la enzima era captada por las clulas hepticas, no afectadas gravemente por la enfermedad.

Para orientar especficamente a los macrf agos, la glucocerobrosidasa purificada se trat con enzimas que eliminan los azcares terminales de las cadenas de oligosacridos al exponer los residuos maosa subyacentes. Luego se inyect en la corriente sangunea esta enzima modificada, que fue reconocida por los receptores situados en la superficie de los macrfagos y captada con rapidez por endocitosis mediada por receptor (estudiada en la pgina 309). Puesto que los lisosomas son el objetivo natural de los materiales llevados al interior del macrfago por endocitosis, las enzimas fueron entregadas con eficiencia en los sitios precisos de la clula donde se manifestaba la deficiencia. Todava no se sabe si esta tcnica se aplicar extensamente.

nar estos subproductos del resto de la clula. Algunos de estos compuestos, como la digital, han demostrado tener un valor clnico importante. En la pgina 000, se hizo notar que las clulas vegetales conservan una presin de lquido elevada (turgencia) que empuja la pared celular hacia afuera y conserva la forma de la clula. La presin por turgencia es generada por la elevada presin osmtica de la vacuola. La membrana que rodea la vacuola, denominada tonoplasto, contiene algunos siste-

mas de transporte activo que bombean iones al interior del compartimiento de la vacuola hasta alcanzar una concentracin mucho ms alta que la del lquido extracelular. Debido a la elevada concentracin inica, el agua penetra a la vacuola por osmosis. La presin ejercida por turgencia en la vacuola no slo suministra apoyo mecnico a los tejidos blandos de una planta, sino tambin proporciona la fuerza necesaria para estirar la pared celular y permitir que las clulas vegetales aumenten de volumen.

308

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana ciioplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

Las vacuolas de las plantas tambin son sitios de digestin intracelular no muy diferentes de los lisosomas de una clula animal. En realidad, las vacuolas de las plantas poseen algunas hidrolasas acidas iguales a las que se encuentran en los Hsosomas; el pH de la vacuola se mantiene a un valor bajo mediante una H+-ATPasa dentro del tonoplasto que bombea protones al interior del lquido vacuolar. Otra caracterstica que comparten las vacuolas vegetales con los lisosomas es su participacin como punto final en la va biosinttca de la clula. Igual que las protenas del lisosoma, muchas protenas de una vacuola vegetal se sintetizan en ribosomas enlazados a membranas del RER, son transportadas a travs del complejo de Golgi y clasificadas en la cara tmns de dicho complejo antes de ser enviadas hacia la vacuola. En algunas clulas, como las del parnquima del almacn de semillas en desarrollo, ms de 50% de las protenas recin sintetizadas son enviadas a la vacuola para almacenamiento.

teriales demasiado grandes para penetrar su membrana independientemente de sus propiedades de permeabilidad? Para satisfacer esta necesidad evolucionaron mecanismos que captan materiales del medio extracelular dentro de vesculas derivadas de pliegues, o invaginaciones, de la membrana plasmtica. La captacin de materiales extracelulares en vesculas ctoplsmicas se divide en dos categoras separadas, fagocitosis y endocitosis, que ocurren por mecanismos diferentes. La fagocitosis es la captacin de partculas materiales y la endocitosis es la captacin de lquidos, solutos disueltos y macromolculas suspendidas.3 Las vesculas formadas por fagocitosis son tpicamente casi 10 veces ms grandes (1 a 2 m de dimetro) en comparacin con las formadas por endocitosis (0.1 a 0.2/m de dimetro).

8-7 Captacin celular de partculas y macromolculas

En un captulo previo se consider el movimiento de solutos de bajo peso molecular directamente a travs de la membrana plasmtica, pero cmo pueden las clulas captar ma-

3 En anos recientes, la terminologa sufri cambios en este campo. En 1963, Chrstian de Duve introdujo el termino endocitosis para incluir dos tipos de actividades, la ingestin de partculas (fagocitosis) y la captacin de lquidos y solutos (pinocitosis). Puesto que ltimamente se demostr con claridad que fagocitosis y pinocitosis son actividades fundamentalmente diferentes, el trmino pinocitosis cay en desuso (excepto para describir la captacin de lquido por protistas). En la actualidad, endocitosis se usa comnmente para describir la captacin tanto de lquidos como de molculas disueltas o suspendidas, y debe distinguirse de la fagocitosis.

Lisosomas que contienen enzimas digestivas Captacin Engullimiento Absorcin

Seudpodos

Alimento

Vacuola con alimento

Alimento digerido

Alimento absorbido

(a)

FI<;iJKA -3.'. Fagocitosis, a) Diagrama de las etapas de engullimiento, digestin y absorcin de materiales llevados al interior de una amiba por fagocitosis, b) Se ilustra el proceso de engullimiento efectuado por un leucocito polimorfo nuclear que ingiere una partcula de levadura, (b: Segn J. Boy/es y Dorothy F. Bainton, Cell 24:906, 1981; con permiso de Cell Press.)

15 pm

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

309

Fagocitosis La fagocitosis ("clulas que comen") es ejecutada extensamente por unos pocos tipos de clulas especializadas en captar partculas materiales del ambiente y entregarlas al lisosoma. Los organismos heterotrofos unicelulares, como amibas y ciliados, se mantienen vivos atrapando partculas nutrientes y organismos ms pequeos, y aprisionndolos en pliegues de la membrana plasmtica. Los pliegues se fusionan para formar una vacuola (ofagosoma) que se desprende de la membrana plasmtica (fig 8-33, a). El fagosoma se fusiona con un lisosoma y as el material se digiere en el interior de la clula. En casi todos los animales evolutivamente desarrollados, la fagocitosis es un mecanismo protector y no una manera de alimentarse. Los mamferos poseen varias clulas fagocitarias, incluyendo macrfagos y neutrfilos, cuya funcin es vagar por la sangre y los tejidos fagocitando organismos invasores, clulas daadas, eritrocitos envejecidos y desperdicios. La actividad contrctil de microfilamentos subyacentes a la membrana plasmtica que contiene actina controla el engullimiento de partculas materiales por fagocitosis. El proceso de engullimiento de partculas se ilustra en la figura 8-33, b. Los pasos en la digestin del material engullido se muestran en la figura 8-31. Endocitosis La endocitosis se puede dividir de manera muy general en dos categoras: endocitosis a granel y endocitosis mediada por receptores. La endocitosis a granel consiste en la captacin de lquidos extracelulares que la superficie de la membrana no reconoce. Cualquier molcula, grande o pequea, incluida en el lquido tambin penetra a la clula. Esta endocitosis se puede visualizar aadiendo sustancias al medio de cultivo, como el colorante amarillo luciferina o la enzima peroxidasa de rbano silvestre, que son captadas por las clulas de manera inespecfica. La endocitosis a granel puede ocurrir de manera continua en muchos tipos de clulas y su funcin primaria puede centrarse en la recuperacin de membrana plasmtica luego de periodos de secrecin o durante el ingreso de lquido extracelular. La endocitosis mediada por receptores (EMR) consiste en la captacin de macromolculas extracelulares especficas (ligandos) luego de unirse a receptores en la superficie exterior de la membrana plasmtica. La endocitosis mediada por receptores se estudia ms adelante y en La va experimental, al final de este captulo. Tanto la endocitosis a granel como la mediada por receptores pueden ocurrir a una tasa notablemente rpida: en un periodo tan breve como 15 minutos puede entrar a la clula hasta la mitad de la superficie de la membrana. A pesar del rpido movimiento de la membrana plasmtica hacia adentro, la superficie celular no se arruga ni hay necesidad inmediata de sintetizar nuevos componentes de la membrana; simplemente se rdela la membrana en una y otra direccin en la superficie interior de la clula, de modo que se aade membrana a la superficie tan rpidamente como se elimina.

Endosamos El material captado por endocitosis de ordinario se descarga en una red de tbulos y vesculas que en conjunto se conocen como endosomas. Los endosomas adems se dividen en dos compartimientos, los endosomas tempranos, tpicamente localizados cerca de la regin perifrica de la clula, y los endosomas tardos, que de ordinario se localizan en alguna parte ms interior de la clula, ms cerca del ncleo (fig. 8-34). Los endosomas tempranos y tardos se pueden distinguir entre s segn sus propiedades, como su densidad flotante (que permite aislarlos en fracciones diferentes en un gradiente de densidad), pH y contenido enzimtico. Los materiales captados por endocitosis en la superficie de la clula primero se transportan a los compartimientos endosmicos tempranos, que se cree que actan como una rea de clasificacin. Algunos materiales que penetran a los endosomas tempranos son enviados a los endosomas tardos (fig. 8-35), otros retornan a la membrana plasmtica e incluso algunas sustancias pueden ser enviadas hacia el complejo de Golgi. Se cree que los endosomas tardos reciben enzimas lisosmicas sintetizadas en el RER y clasificadas en la RTG, adems de recibir el material de los endosomas tempranos. Los endosomas tardos pueden imaginarse como un "compartimiento prelisosmico" que tiene pH cido y una concentracin baja de enzimas lisosmicas. Los materiales pasan del endosoma tardo al interior de los lisosomas, donde sufren un procesamiento adicional, segn se analiza en La va experimental, al final del captulo. Endocitosis mediada por receptor y papel de las fosittas revestidas La endocitosis mediada por receptor proporciona un medio para la captacin selectiva y eficiente de macromolculas que pueden estar presentes en concentraciones relativamente bajas dentro del lquido extracelular. Las clulas poseen receptores para captar muchos tipos diferentes de sustancias, incluyendo hormonas, factores de crecimiento, enzimas y protenas plasmticas. Los ligandos que entran a la clula por medio de EMR se unen a los receptores que se agrupan en regiones especializadas de la membrana plasmtica, conocidos como fosillas revestidas. Algunos receptores se agrupan en las fosillas revestidas en concentracin equivalente a 100 veces la del resto de la membrana plasmtica. Las fosillas revestidas (fig. 8-36, a) se reconocen en el microscopio electrnico como sitios donde la superficie est indentada y la membrana plasmtica cubierta en su cara citoplsmica por una capa de material velludo electrnicamente denso constituida por la protena clatrina, la misma protena que participa en la formacin de vesculas revestidas de clatrina en la red trans de Golgi (pg. 298). Una fosilla revestida sobre la membrana plasmtica se invagina al interior del citoplasma (fig. 8-36, b) y forma una vescula revestida que adelgaza su tallo para liberarse de la membrana plasmtica que la cubre (fig. 8-36, c,d). Al examinar la estructura del recubrimiento y de las molculas que las componen se puede tener un mejor conocimiento del proceso de formacin de las vesculas revestidas. La figura 8-37 muestra una fosilla revestida como se observa en las superficies extracelular y citoplsmica de la membrana plasmtica de una clula que participa en

310

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, juncin y trfico de membrana

endocitosis mediada por receptor. Observada desde su superficie citoplsmica (fig. 8-37, b), se nota que la cubierta velluda contiene una red de polgonos parecida a un panal de abejas. La construccin geomtrica de la cubierta se deriva de la estructura de sus bloques de construccin de catrina. Cada molcula de clatrina se compone de tres cadenas pesadas y tres cadenas ligeras reunidas para formar un ensamblado de tres extremidades denominado trisquelion (fig. 8-38). Un trisquelion constituye un mdulo notablemente adaptable con el cual una clula puede construir rejillas poligonales. Durante la invaginacin, el enrejado relativamente plano de la fosilla revestida se incurva rodeando la vescula en formacin. La figura 8-37, c, muestra la estructura de una fosilla revestida que sufre invaginacin y se aproxima a la etapa donde se desprende para formar una vescula revestida. Una rejilla compuesta de trisqueliones es una estructura muy adecuada para sufrir el tipo de redisposicin estructural requerida para transformar una rejilla plana en una estructura en forma de caja (fig. 8-39, a). En realidad, los trisqueliones purificados de clatrina se autoensamblan para formar cajas vacas similares a las encerradas en una vescula revestida. En la figura 8-39, b, se muestra la disposicin de trisqueliones de tres extremida-

des de clatrina superpuestos en la pared de una vescula revestida. Igual que las vesculas revestidas de clatrina formadas por gemacin de la RTG (pg. 298), las vesculas revestidas formadas durante la endocitosis tambin contienen una capa de complejos adaptadores situada entre la rejilla de clatrina y la superficie de la membrana vesicular que enfrenta el citoplasma. Lo mismo que en las vesculas revestidas de la RTG, los adaptadores son los que especficamente se unen a los receptores de la membrana plasmtica (fig. 8-40). Se cree que la unin ocurre entre adaptadores y "seales especficas de endocitosis" localizadas en las colas citoplsmicas de los receptores que deben llevarse al interior. Estos enlaces aseguran que los receptores (y sus ligandos enlazados) queden incluidos dentro de la vescula revestida en formacin y

Membrana plasmtica

Endosomas perifricos tempranos Vescula de J transporte

Los receptores de la membrana son reciclados haca la membrana plasmtica

Lisosoma

(a)

(c)

FIGURA 8-34. La va endosmica. a) Diagrama que muestra el desplazamiento de materiales procedentes del espacio extracelular hacia los endosomas tempranos, donde se cree que tiene lugar la clasificacin. Con frecuencia los receptores de membrana son enviados de regreso hacia la membrana plasmtica, en tanto que los materiales dentro de la vescula se transfieren a los endosomas tardos y luego al lisosoma. b-c) Se incubaron clulas cultivadas con transferrina fluorescente marcada y una protena que las clulas captan por endocitosis. b) Poco despus de la endocitosis se observan los materiales marcados en endosomas tempranos, punteados, ampliamente distribuidos, c) En la etapa final, la transferrina marcada se libera en el compartimiento endosmico tardo y se concentra ms cerca del ncleo celular, (b-c: Cortesa de Satyajit Mayor, Kenneth W. Dunn y Fred Maxfield.)

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmca: estructura, funcin y trfico de membrana

311

(b)
FIGURA 8-35. Demostracin experimental del desplazamiento de materiales del endosoma temprano al endosoma tardo, a) Clula de cobayo cultivada incubada durante cinco minutos con la enzima peroxidasa de rbano, que la clula lleva a su interior por endocitosis y que puede localizarse mediante microscopa electrnica cioqumica. El producto de la reaccin con la peroxidasa de rbano ingerida se observa como precipitado electrnicamente denso de forma y tamao variables, restringido a los endosomas tempranos (flechas), b) Clula incubada con peroxidasa de rbano durante 25 minutos, tiempo suficiente para que la enzima ingerida se desplace a los endosomas vesiculares de mayor tamao formados tardamente (flechas ms grandes). En estas clulas particulares, los endosomas tardos de ordinario se muestran llenos de estructuras vesiculares ms pequeas (P, membrana plasmtica). (Cortesa de G. Griffiths, R. Back y M. Marsh.)

0.1 um

FIGURA 8-36. Endocitosis mediada por receptor. Esta secuencia de micrografas muestra las etapas de captacin de lipoprotenas vitelinas por el oocito de gallina, a) Las protenas que la clula lleva a su interior se concentran en la superficie externa de una regin indentada de la membrana plasmtica, llamada fosilla revestida. La superficie interna de la membrana plasmtica de la superficie revestida est cubierta por una capa de material velloso electrnicamente denso que contiene clatrina. b) La fosilla revestida se hunde para formar un pliegue de membrana plasmtica todava recubierto en su superficie interna por clatrina. c) La membrana plasmtica a punto de separarse en forma de una vescula que contiene protena de yema de huevo sobre su superficie uminal y clatrna sobre su superficie citoplsmica. d) Vescula revestida separada de la membrana plasmtica. El siguiente paso del proceso es liberar la cubierta de clatrina. (Segn M.M, Pernj y A.B, Gilbcrt, }. Cell Science 39:257, 1979, con permiso de Tlie Company of Bidogists Ltd.)

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CAPITULO 8 Sistemas de la membrana ctopSsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

Cadena pesada Cadena ligera

(b)

FIGURA R-38. Trisqueliones de clatrina. Micrografa electrnica de una preparacin sombreada con metal de trisqueiones de clatrina. En el recuadro se muestra el trisquelin compuesto de tres cadenas pesadas. La "extremidad" interna de cada cadena pesada se une a una cadena ligera ms pequea. (Fotografa segn Ernst Ungewickell y Daniel Branton, reproducida con permiso de Nature, vol. 289, p. 421, 1981, copyright 1981, Macmilian Magazines Limited.)

0.1 nm

FIGURA 8-37. Fosilfas revestidas, a) Micrografa electrnica de una rplica tomada de la superficie extracelular de un fibroblasto completo congelado en seco e incubado con LDL y colesterol. Se observan partculas de LDL y colesterol como gotas presumiblemente fijas a receptores localizados sobre la superficie extracelular de la fosilla revestida, b) Micrografa electrnica de una rplica tomada de la swperfide citoplsmica de una fosilla revestida de fibroblasto. Las fosillas revestidas se componen de una red poligonal relativamente aplanada y en relacin con la superficie interna de la membrana plasmtica, c) Micrografa electrnica de la superficie citoplsmica mostrando la membrana plasmtica invagnada y rodeada por una red de clatrina que adopta forma hemisfrica. (Segn ohn Heuser y Louise Evans, ]. Cell Biol. 84:568, 1980; con permiso de Rockefeller University Press.)

no permanezcan en la membrana plasmtica. Las molculas de adaptina empleadas en la membrana plasmtica para formar vesculas revestidas son diferentes de las incorpora-

das en las vesculas revestidas formadas por gemacin a partir de la red trans de Golgi. En la micrografa por fluorescencia de la figura 8-23, b, es evidente la diferente distribucin de estos dos grupos de adaptinas. Al minuto de su formacin, la vescula endoctica revestida pierde su cubierta de clatrina y se convierte en una vescula de superficie lisa que de ordinario se fusiona con un endosoma temprano (pg. 310). En la mayor parte de los casos, el pH bajo del compartimiento endosmico temprano provoca la liberacin del ligando de su receptor. Se cree que la mayor parte de los receptores no enlazados se concentran en una porcin de la membrana que los separa del endosoma y retorna los receptores a la membrana plasmtica (fig. 8-41), donde pueden participar en otro turno de endocitosis. En algunos casos, igual que con la captacin del factor de crecimiento epidrmico (FCE), tanto el receptor como el ligando pueden transportarse al lisosoma para su desdoblamiento. En estos sistemas, la endocitosis sirve como medio para re-

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana toplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

313

Rosilla revestida de ctatrina

Lquido extraceluiar

Vescula revestida de clatrina

(a)
FIGURA 8-39. Ensamblado molecular de una vescula revestida, a) Esquema de la incorporacin de triesqueliones en la red externa de clatrina de una vescula revestida, b) Modelo que muestra el empacamiento propuesto de las subunidades de trisquelion. Dos trisqueliones aparecen superpuestos dentro de la red. Cada extremidad de un trisquelion se extiende desde un vrtice a lo largo de los bordes de dos polgonos vecinos y luego retorna al interior con su dominio terminal formando la capa interna observada en esta reconstruccin, (b: Segn G.P.A. Vigers, R.A. Crowther y B.M.F. Pearse, EMBO J. 5:533, 1986, con permiso de Oxford niversity Press.)

guiar el nmero de molculas del receptor localizadas en la superficie de la clula. La vescula revestida (y la vescula no revestida que se origina de ella) se puede imaginar como un sistema de entrega que transporta un ligando especfico desde el espacio extraceluiar a un sitio particular dentro de la clula. En la mayor parte de los casos, el ligando finalmente se entrega a un lisosoma para procesamiento metablico adicional, pero como se ilustra en el siguiente ejemplo, ste no siempre es el caso. Los mamferos recin nacidos dependen de la leche de su madre, que les suministra anticuerpos contra posibles patgenos. Estos anticuerpos se captan en el conducto digestivo donde se enlazan a receptores localizados en f osillas

revestidas situadas en la superficie apical del epitelio intestinal. En vez de ser transportados a un endosoma, las vesculas revestidas que contienen anticuerpos se transportan a travs de toda la longitud de la clula epitelial, donde se

Fosilla revestida

FIGURA 8-40. Las rosillas revestidas facilitan la captacin selectiva de protenas integrales de membrana con sus respectivos ligandos. La captacin de receptores especficos de membrana en la membrana plasmtica ocurre por un mecanismo similar al descrito en la figura 8-23 para el transporte de materiales en vesculas revestidas de clatrina de la red trans de Golgi. La clatrina se ensambla sobre la superficie exterior de la capa de adaptadores que tienen doble funcin: se enlazan a molculas de clatrina sobre la superficie externa y a los extremos citoplsmicos de receptores especficos de membrana sobre su superficie interna. Los receptores de membrana, a su vez, se unen a igandos especficos. Como resultado de estas diferentes interacciones, los complejos de receptor especfico-ligando se incorporan a una vescula recubierta y son transportados al interior de la clula, en tanto que otras protenas de membrana incapaces de enlazarse a los adaptadores permanecen en la membrana plasmtica.

Clatrina ^ Receptor con ligando A Adaptador

314

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana dtoplsmica: estructura, fundn y trfico de membrana Ester colesterilo Fosfolpdo Colesterol no esterificado Apolipoprotena B-100

FIGURA 8-42. Las LDL de colesterol consisten en casi 1 500 molculas de ster colesterilo rodeadas por una recubierta antiptica de casi 800 fosfolpidos, 500 molculas de colesterol y una sola molcula de apolipoprotena B (peso molecular, 550 kD) que interacta especficamente con el receptor LDL que se proyecta a partir de la membrana plasmtica. Endosoma tardo

Usosoma

FIGURA 8-41. Reciclamiento de receptores de la membrana plasmtica. En el modelo que aqu se muestra, los receptores de la membrana plasmtica se separan de su ligando en un endosoma temprano. Los receptores se renen dentro de una vescula membranosa y retornan a la membrana plasmtica.

fusionan con la membrana plasmtica basal y liberan los anticuerpos en el torrente sanguneo del lactante. LDL y metabolismo del colesterol. Entre muchos ejemlos de endocitosis mediada por receptor, la primera estu-

diada y mejor comprendida es la que suministra colesterol exgeno a las clulas. El colesterol es una molcula hidrfoba que no puede transportarse en la sangre en estado libre. En vez de ello, se transporta como un complejo gigante denominado lipoprotena de baja densidad (LDL), La partcula LDL mostrada en la figura 8-42 contiene un ncleo central de casi 1 500 molculas de colesterol esterificado para formar cidos grasos de cadena larga. Este ncleo est rodeado por una capa de fosfolpidos y sus protenas relacionadas. Los receptores LDL son transportados a la membrana plasmtica, donde se concentran en las fosillas revestidas, incluso en ausencia de ligando. Como consecuencia, los receptores estn "a la espera" sobre la superficie de la clula para captar estas partculas de Hpoprotenas en el momento que estn disponibles. Una vez que las partculas LDL se unen a una fosilla revestida, la fosilla se invagina para formar una vescula revestida, el recubrimeinto de

LA VIA E X P E R I M E N T A L

Endocitosis mediada por receptores

De ordinario, el desarrollo embrionario se inicia con la fusin de un minsculo espermatozoide y un vulo mucho mayor. El vulo se desarrolla a partir de oocitos, que en condiciones tpicas acumulan materia vitelina sintetizada en otra parte del cuerpo de la mujer. Cmo penetran las protenas de peso molecular elevado del material vitelino al oocito? En 1964, Thomas Roth y Keith Porter de la Universidad de Harvard publicaron un trabajo acerca del mecanismo mediante el cual las protenas del material vitelino pueden ser captadas al interior del oocito de mosquito.1 Observaron que durante las etapas de crecimiento rpido del oocito (luego que el animal ingiere sangre) hay incremento espectacular del nmero de depresiones similares a fosillas observadas en la superficie del oocito. Las fosillas formadas por .invaginacin de la superficie de la

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, fundn y trfico de membrana Clula de msculo liso Macrfago

315

=>

Clula endotelial

Lesin al endotelio

Leucocito

Clula espumosa que contiene LDL

Formacin de una placa

FIGURA 8-43. Placa aterosclertica. El proceso causante de la aterosclerosis an no es bien comprendido. En la actualidad se piensa que la formacin de una placa se inicia con la aparicin de una forma oxidada de LDL que atrae clulas de msculo liso y macrfagos. Al parecer, estas clulas ingieren LDL y se depositan como clulas espumosas en la pared de la arteria. E depsito adicional de LDL, combinado con el crecimiento de las clulas de msculo liso en la pared arterial, conduce a la oclusin del vaso.

clatrina se desensambla y los receptores LDL son reciclados de vuelta a la membrana plasmtica (como se muestra en la figura 8-41). Mientras tanto, las partculas LDL se liberan en los lisosomas donde se descompone el componente protenico y se libera colesterol para emplear en la clula en el ensamblado de la membrana o en otros procesos metablicos (p. ej., sntesis de hormonas esteroides). El nmero de receptores LDL presentes en determinada clula es modulado por las necesidades metablicas de la clula. Si sta crece activamente y sintetiza grandes cantidades de membrana o produce hormonas esteroides, la cantidad de receptores aumenta y es mayor el nmero de partculas LDL captadas del medio que las rodea. Los pasos que condujeron al descubrimiento de la endocitosis mediada por receptor y el paso al interior de las LDL se describen con detalle en La va experimental: Endocitosis mediada por receptores. La concentracin de LDL (o el contenido de colesterol) en la sangre guarda estrecha correlacin con el desarrollo de aterosclerosis, padecimiento caracterizado por reduccin del calibre de las arterias. La oclusin arterial es consecuencia de un proceso complejo y mal comprendido que incluye

depsito de placas que contienen LDL en la pared interna de los vasos {fig. 8-43). Adems de reducir el flujo sanguneo, las placas aterosclerticas actan como sitios para la formacin de cogulos sanguneos que pueden impedir por completo el flujo de sangre a travs de un vaso. Los cogulos sanguneos formados en las arterias coronarias son la causa principal de infarto al miocardio (ataque cardiaco). Las LDL no son el nico agente que transporta colesterol en la sangre. Las HDL (lipoprotenas de alta densidad) poseen una estructura similar pero contienen protenas diferentes y desempean un papel fisiolgico distinto en el cuerpo. En tanto las LDL sirven principalmente para llevar molculas de colesterol del hgado, donde son empacadas, a travs de la sangre hacia las clulas del cuerpo, las HDL transportan colesterol en direccin opuesta, desde las clulas del cuerpo hacia el hgado, donde es captado por endocitosis y excretado como parte de la bilis. As como las concentraciones elevadas de LDL se relacionan con mayor riesgo de ataque cardiaco, las concentraciones altas de HDL se asocian a menor riesgo. Las HDL tienen este efecto debido a que permiten al hgado eliminar colesterol de la sangre.

membrana plasmtica estaban cubiertas en su superficie interna por un revestimiento velloso. En una afirmacin proftica, Roth y Porter sugirieron que las rosillas eran "superficies diferenciadas dedicadas exclusivamente a captar protenas y transportarlas al interior del oocito". Postularon que las protenas del material vitelino eran adsorbidas especficamente sobre la superficie externa de la membrana de las fosilfas recubiertas que a continuacin se invaginan para formar vesculas revestidas . Las vesculas revestidas pierden su cubierta vellosa y se fusionan entre s para formar los grandes corpsculos vitelinos enlazados a la membrana caractersticos del oocito maduro. Las primeras observaciones acerca de la estructura de las vesculas revestidas fueron obtenidas en 1969 por Toku Kanaseki y Ken Kadota, de la Universidad de Osaka.2 El examen

con microscopio electrnico de una fraccin vesicular cruda aislada de cerebro de cobayo revel que las vesculas revestidas estaban cubiertas por una redecilla poligonal (fig. VE 8-1). Estos investigadores sugirieron que el revestimiento era un mecanismo para controlar el plegamiento de la membrana plasmtica durante la formacin de vesculas. Los primeros estudios de la naturaleza bioqumica de la vescula revestida fueron publicados en 1975 por Barbara Pearse, del Medical Research Counc en Cambridge, Inglaterra.3 Pearse desarroll un procedimiento mediante el cual las vesculas de membranas del cerebro de cerdo fueron centrifugadas a travs de una sucesin de gradientes de densidad de sacarosa hasta obtener una fraccin purificada de vesculas revestidas. La protena de estas vesculas se solubiliz y fraccion por

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CAPITULO 8 Sistemas de a membrana toplsmica: estructura, fundn y trfico de membrana

FIGURA VE 8-1. a) Modelo manual de una "canastilla vaca" que forma la red superficial de una vescula revestida, b) Micrografa de alta resolucin electrnica de una canastilla vaca. Los nmeros 5 y 6 representan un pentgono y un hexgono, respectivamente. (Segn Toku Kanaseki y Ken Kadota, J. Cell Biol. 42:226, 1969, con permiso de RockefeUer University Press.)

(a)

electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (EGPA-DSS, seccin 17-7). Los resultados indicaron que el revestimiento contiene una especie predominante de protenas con peso molecular de unos 180 000 daltons (fig. VE 8-2); Pearse denomin clatrna a esta protena. Encontr la misma protena (segn el peso molecular y el mapeo de pptidos) en preparaciones de vesculas revestidas aisladas de diferentes tipos de clulas obtenidas de varas especies de animales.4 Conforme se desarrollaba la investigacin descrita, en 1973 se iniciaba una lnea de estudio aparentemente independiente en los laboratorios de Michael Brown y Joseph Goldstein, en la University of Texas Medical School, en Dallas. Brown y Goldstein se interesaron en la enfermedad hereditaria hipercolesterolemia familiar (HF). Las personas homocigotas para el gen defectuoso (alelo HF) mostraban concentraciones muy elevadas de colesterol en el suero (800 mg/100 mi en comparacin con 200 mg/100 mi para una persona normal), invariablemente desarrollaban obstruccin grave de arterias (aterosclerosis) y en general moran de ataque cardiaco antes de cumplir 20 aos de edad. En aquel tiempo se saba muy poco acerca de los defectos fisiolgicos o bioqumicos fundamentales de esta enfermedad. Brown y Goldstein iniciaron sus estudios de la HF examinando el metabolismo del colesterol en fibroblastos cultivados derivados de la piel de individuos normales e individuos afectados por hipercolesterolemia familiar. Observaron que las lipoprotenas que contienen colesterol (como las LDL) presentes en el medio inhiben la enzima que controla la tasa de biosntesis de colesterol, reductasa HMG-CoA (fig. VE 8-3).5 Por lo tanto, la adicin de LDL al medio de cultivo donde crecan los fibrobastos normales produjo disminucin del nivel de actividad de reductasa HMG-CoA y la correspondiente disminucin de la sntesis de colesterol en los fibroblastos. Cuando se midi la concentracin de reductasa HMG-CoA en fibroblastos derivados de HF se observ que eran 40 a 60 veces mayor que la de fibroblastos en cultivos testigo.6 Adems, la actividad de las enzimas en los fibroblastos de HF no era afectada en absoluto por la presencia de LDL en el medio (fig. VE 8-4). Brown y Goldstein concluyeron que "la anomala gentica primaria no implica al gen estructural de la propia enzima,

180 kD

FIGURA VE 8-2. Electroforesis en gel de poiacrilamida con dodecilsulfato de sodio de varias fracciones obtenidas de cerebro de cerdo. Las primeras tres columnas representan fracciones tomadas de: 1) extracto crudo de tejido cerebral; 2) sobrenadante de una muestra del extracto centrifugado a baja velocidad, y 3) granulo obtenido por centrifugacin de una preparacin cruda que contiene vesculas revestidas. Las ltimas cuatro columnas representan protenas obtenidas de preparaciones purificadas del extracto. Las preparaciones purificadas contienen una especie de protena predominante con peso molecular de 180 000 daltons, a la cual Pearse denomin clatrina. (Segn B.M.F. Pearse, J. Mol. Biol. 97:96, 1975.)

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica; estructura, fundn y trfico de membrana

317

I roo I-

10

20

30

.01 .05.1

10

M HORAS

FRACCIN DEL SUERO (% del vol)

CONCENTRACIN DE PROTEINA (mo/ml)

FIGURA VE 8-3. Actividad de la reductasa HMG-CoA medida luego de aadir la fraccin lipoprotenica de suero de ternera (cuadros claros), suero de ternera no fraccionado (crculos oscuros), o la fraccin no lipoprotenica del suero de ternera (tringulos claros). Es evidente que las lipoprotenas deprimen mucho la actividad de la enzima, en tanto que la fraccin no lipoprotenica tiene poco efecto. (Segn M.S. Brown y cois. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 70:2266, 1973.)

pero se requiere un gen hasta ahora no identificado cuyo producto es necesario para la mediacin del control por retroalimentacin [de reductasa HMG-CoA] por lipoprotenas". Cmo la presencia de lipoprotenas en el medio puede afectar la actividad de una enzima en el citoplasma de clulas cultivadas? Para encontrar la respuesta a esta pregunta, Brown y Goldstein realizaron estudios para determinar la naturaleza de la interaccin entre clulas y lipoprotenas. Comenzaron aadiendo LDL radiactivas a un plato de cultivo que contena una sola capa de fibroblastos derivados de HF o de sujetos humanos normales.7 En tanto los fibroblastos normales se enlazaban con afinidad y especificidad elevadas a molculas de LDL marcadas, las clulas mutantes prcticamente no mostraron capacidad para enlazarse a estas molculas de lipoprotena (fig. VE 8-5). Las pruebas indicaron que las clulas normales poseen un receptor altamente especfico para LDL y que este receptor era defectuoso en las clulas de pacientes con HF. El siguiente paso fue determinar qu ocurre a las LDL despus de enlazarse al receptor. Algunos datos sugirieron que las partculas de LDL enlazadas al receptor eran introducidas a la clula y entregadas a los lisosomas, donde las protenas de las LDL se desdoblaban y se liberaban molculas de colesterol libre para utilizar en el ensamblado de la membrana. Por ejemplo, la prueba del papel de los lisosomas en el procesamiento de LDL se obtuvo utilizando fibroblastos de un paciente con un trastorno por almacenamiento lisosmico (pg. 306) caracterizado por acumulacin de esteres colesteril en sus lisosomas.8 La enfermedad resulta de una deficiencia de la enzima lisosmica lipasa acida, que normalmente separa las molculas de colesterol de los cidos grasos con los cuales se esterifican. En la figura 8-42 se muestra en qu forma se empacan las molculas de colesterol dentro de las partculas de lipoprotenas de baja densidad. A diferencia de los fibroblastos normales, las clulas derivadas

FIGURA VE 8-4. Clulas de fibroblastos de sujetos testigo (crculos oscuros) o de pacientes homocigotos para HF (crculos claros) desarrollados en platos de cultivo que contenan 10% de suero de ternera fetal. Al sexto da (que corresponde a la hora cero de la grfica) se sustituy el medio por un medio fresco que contena 5% de plasma humano deficiente en lipoproteina. Al momento indicado se prepararon los extractos y se midi la actividad de la reductasa HMG-CoA. Considerando a las clulas testigo, es evidente que al inicio del periodo de observacin la enzima tiene muy poca actividad en estas clulas, y la razn es que en el medio hay una cantidad suficiente de lipoprotenas que contienen colesterol que las clulas no necesitan sintetizar por s mismas. Cuando se cambia el medio por plasma deficiente en lipoprotenas, las clulas ya no pueden usar el colesterol procedente del medio y por lo tanto aumenta la cantidad de enzima dentro de la clula. En contraste, las clulas de pacientes iF no respondieron a la presencia ni a la ausencia de lipoprotenas en el medio. (Segn ].L. Goldstein y M.S. Brown, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 70:2805, 1973.)

de un paciente con deficiencia de esta enzima no tienen capacidad para utilizar el colesterol presente en las partculas de LDL aadidas al medio de cultivo (fig. VE 8-6). En consecuencia, las concentraciones de reductasa HMG-CoA se mantuvieron muy elevadas en estas clulas a pesar de la adicin de LDL al medio de cultivo. Estos datos suministran fuertes pruebas de que los esteres externos de colesteril que penetran a la clula como parte de las LDL son suministrados a los lisosomas para liberar colesterol. Para visualizar el proceso de enlace al receptor y el paso al interior, Brown y Goldstein colaboraron con Richard Anderson, quien haba estudiado la estructura celular con el microscopio electrnico. El grupo incub fibroblastos de sujetos normales y enfermos de HF con LDL que presentaban uniones covalentes con la protena ferritina que contiene hierro. Debido a los tomos de hierro, las molculas de ferritina pueden dispersar un rayo de electrones y por lo tanto visualizarse directamente en el microscopio electrnico. Cuando se incubaron fibroblastos normales con LDL y ferritina a 4C, temperatura a la cual los ligandos se pueden enlazar a la superficie celular, pero no pueden ser llevados al interior, las partculas de LDL y ferritina aparecieron enlazadas a la superficie celular. Un examen ms detallado revel que fas partculas de LDL no se distribuyeron al azar sobre la superficie de la clula, sino se localizaron en segmentos cortos (0.5 mm) de la membrana plasmtica,

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CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

30 25

NORMAL

HOMOC1GOTO

Hidrlisis del linoleato colesterilo

40 Normal

20 I
O

l5

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v *^~i * *^-*rf*^A *_-*-^^ .

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^1 c ' .-, - 1 / 150 Enfermedad por almacenamiento de ster colesterilo
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250

B
200 150 100 50
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HORAS

0 ()

_*
300 450 600 PHI CI-LDL (jg protena/ml)

o 3 4 0 i 2 3 HORAS 4

FIGURA VE 8-5. Tiempo de curso de las LDL radiactivas marcadas con 1251 enlazadas a clulas de un sujeto normal (crculos) y un homocigoto con HF (tringulos) a 4C y 37C. Las clulas se incubaron en un amortiguador que contena 5/tg/mI de 125I-LDL en presencia (crculos y tringulos claros) y ausencia (crculos y tringulos oscuros) de 250/g/ml de LDL no radiactivas. Es evidente que en ausencia de LDL no radiactivas, las clulas normales unen cantidades significativas de LDL marcadas, en tanto que las clulas de pacientes HF no lo hacen. El mismo resultado se observ con ambas temperaturas, lo que indica que el enlace no depende de energa (puesto que a 4C no se forma ATP). El enlace de LDL marcadas se reduce mucho en presencia de LDL no radiactivas, lo que indica que las lipoprotenas no marcadas compiten con las marcadas por los sitios de enlace, y por tanto el enlace de la lipoprotina a las clulas es especfico (o sea, no es resultado de un enlace inespecco). (Segn M.S. Broum y ].L. Goldstein, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 71:790, 1974.)

FIGURA VE 8-6. Ester es colesterilo enlazados a LDL aadidos a extractos de clulas prepa radas a partir de fibroblastos normales (cros de pacientes con enfermedad por almacenamiento lisosmico (tr ngulos oscuros) que carecen de la enzima lisosmica requerida para iberar el colesterol de su forma esterificada. Se indica la tasa de hidr lisis del ster. Los resultados de este tipo implicaron a los lisosomas en la liberacin de colesterol de las partculas de LDL. (Segn j.L. Go dstein y cois. ]. Biol. Chem. 250:8490, 1975.)

donde sta presentaba indentaciones y estaba recubierta por material "velloso" (fig. VE 8-7).9 Estos segmentos de la membrana corresponden a las fosillas recubiertas originalmente descritas por Roth y Porter y encontradas desde entonces en varios tipos de clulas. Aunque se observ que las clulas de pacientes con HF tenan un nmero similar de rosillas recubiertas sobre su superficie, las LDL-ferritina no se enlazaron a estas clulas mutantes. Los resultados apoyan la hiptesis de que el alelo HF mutante codifica un receptor que no puede enlazarse a lipoprotenas de baja densidad. Estudios subsecuentes de microscopa electrnica acerca del paso al interior de las LDL y ferritina revelaron la va endoctica para llevar al interior estas partculas de lipoprotenas, como se describe en el texto.10 Segn estos resultados, el grupo postul que el rpido paso al interior de las LDL enlazadas al receptor depende estrictamente de la localizacin de los receptores de LDL en las fosillas revestidas. De este postulado se deduce que si un receptor de LDL no se localiza dentro de una fosilla revestida, no

tiene capacidad para entregar su ligando enlazado a los lisosomas celulares, y por lo tanto ser incapaz de afectar la biosntesis de colesterol en la clula. En esa poca se descubri un receptor de LDL con una mutacin de tipo diferente. Los receptores de LDL que poseen este defecto (conocido como mutacin J.D., por el paciente en quien se observ) pueden enlazarse a cantidades normales de LDL marcadas con istopo radiactivo, aunque la lipoprotina enlazada al receptor no pase al interior y por consiguiente no pueda llegar a los lisosomas citoplsmicos para su procesamiento.11 Anderson y sus colaboradores postularon que el receptor de LDL es una protena transmembrana que normalmente se localiza en las fosillas revestidas debido a que su dominio citoplsmico se enlaza especficamente a un componente de dichas fosillas revestidas, tal vez clatrina (pero ms tarde se identific como adaptina). Debido al defecto en su dominio citoplsmico, el receptor mutante J.D. no tiene capacidad para ubicarse en las fosillas revestidas de la clula. Las personas con esta mutacin muestran el mismo fenotipo que los pacientes cuyos receptores son incapaces de enlazarse a lipoprotenas de baja densidad. Estudios subsecuentes determinaron que el receptor de LDL normal es una glucoprotena transmembrana de 839 aminocidos; los 50 aminocidos situados sobre el extremo C terminal de la protena se extienden al interior de la membrana como un dominio citoplsmico. El anlisis del receptor mutante J.D. muestra que en esta protena slo hay una sustitucin de aminocido en el dominio citoplsmico; un residuo tirosina localizado normalmente en la posicin 807 es sustituido por una cistena.12 Esta sola alteracin en la secuencia de aminocidos oblitera totalmente la capacidad de la protena para concentrarse en las fosillas revestidas.

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

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estos receptores quiz compartan una estructura secundaria similar que servira para que fueran reconocidos por el mismo complejo adaptador de la rosilla revestida (pg. 313). Esta hiptesis ha sido probada en algunos laboratorios que sintetizaron partculas pequeas (por ejemplo, cuatro a nueve aminocidos) correspondientes a las secuencias observadas en las colas citoplsmicas de los receptores que pasan al interior por medio de fosillas recubiertas. Cuando se analizan por espectroscopia de resonancia magntica nuclear, estos pptidos de secuencias diversas adoptan una conformacin muy similar caracterizada por un giro fi apretado con el residuo tirosina esencial localizado en un extremo (fig. VE 8-8).13-14 Las estructuras de este tipo pueden actuar como "anzuelos" que las protenas dejan colgando en las fosillas revestidas conforme las molculas del receptor se mueven entre la bicapa lquida de la membrana plasmtica. FIGURA VE 8-7. Micrografa electrnica que muestra el enlace de las LDL a rosillas revestidas de fibroblastos humanos. Las LDL se hicieron visibles conjugndolas con partculas de ferritina que contienen hierro electrnicamente denso. La barra equivale a 100 nm. (Segn R.G.W. Anderson, M.S. Brown y .L. Goldstein, Cell 10:356, 1977, con permiso de Cell Press.) BIBLIOGRAFA 1. Roth, T.F. y Porter, K.R. 1964. Yolk protein uptake in trie oocyte of the mosquito Aedes aegypti. J. Cell Biol. 20:313-332. 2. Kanaseki, T. y Kadota, K. 1969. The "vesicle in a basket". /. Cell Biol. 42:202-220. 3. Pearse, B.M.F. 1975. Coated vesicles from pig brain: Purification and biochemical characterization. /. Mol Biol. 97:93-96. 4. Pearse, B.M.F. 1976. Clathrin: A unique protein associated with the intracelluar transfer of membrane by coated vesicles. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 73:1255-1259. 5. Brown, M.S., Dana, S.E. y Goldstein, J.L. 1973. Regulaton of HMG CoA reductase activity in human fibroblasts by lipoproteins. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 70:2162-2166. 6. Goldstein, J.L. y Brown, M.S. 1973. Familial hypercholesterolemia: Identification of a defect n the regulation of HMG CoA reductase activity associated with overproduction of cholesterol. Proc. Nati Acad. Sci. U.S.A. 70:2804-2808. 7. Brown, M.S. y Goldstein, J.L. 1974. Familial hypercholesterolemia: Detective binding of lipoproteins to cultured fibroblasts associated with impaired regulation of HMG CoA reductase activity. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A.'71:7S8-792. 8. Goldstein, J.L. y cois. 1975. Role of lysosomal acid lipase in the metabolism of plasma low density lipoprotein. /. Biol Chem. 250:8457-8495. 9. Anderson, R.G.W., Goldstein, J.L. y Brown, M.S. 1976. Localzation of low density lipoprotein receptors on plasma membrane of normal human fibroblasts and their abscence in cells from a familial hypercholesterolema homozygote. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 73:2434-2438. 10. Anderson, R.G.W., Brown, M.S. y Goldstein, J.L. 1977. Role of the coated endocytic vesicle in the uptake of recept-or-bound low density lipoprotein in human fibroblasts. Cell 10:351-364. 11. Anderson, R.G. W., Goldstein, J.L, y Brown, M.S. 1977. A mutacin that impairs the ability of lipoprotein receptors to localise in coated pits on the cell surface of human fibroblasts. Nature 270:695-699. 12. Davis, C.G. y cois. 1986. The J.D. mutation in familial hypercholesterolema: Arnino acid substitution in cytoplasmic domain impedes internalization of LDL receptors. Cell 45:15-24. 13. Bansal, A. y Gierasch, L.M. 1991. Internalization signal of the LDL receptor adopts a reverse-turn conformation. Cell 67:1195-1201. 14. Eberle, W. y cois. 1991. The essential tyrosine of the internalization signal in lysosomal acid phosphatase is part of a /? turn. Cell 67:1203-1209.

Cuando se hizo esta determinacin en 1986 ya se haba demostrado que algunos otros ligandos penetran a la clula por endocitosis mediada por receptor. Se volvi la atencin a las secuencias de aminocidos de las colas ctoplsmicas de otros receptores localizados en las fosillas revestidas. Haba una "seal comn de paso al interior"? Aunque se encontr que estos receptores no comparten una secuencia comn de aminocidos, muchos de ellos contienen un residuo trosina esencial. Se sugiri que aunque las secuencias pueden diferir,

FIGURA VE 8-8. Ocho tetrapptidos diferentes variantes de una secuencia observada en el dominio citoplsmico de la transferrina y de receptores de LDL. Todos los pptidos aqu mostrados adoptan una conformacin similar de vueltas cerradas que coloca las cadenas laterales de tirosina en posicin similar proyectndose desde el plano hacia la vuelta cerrada, (b: Segn james F. Collawn y cois. Cell 63:1066, 1990, con permiso de Cell Press.)

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CAPITULO 8 Sistemas de a membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

SINOPSIS
El citoplasma de las clulas eucariotas contiene un sistema de organelos membranosos, incluyendo retculo endoplasmico, complejo de Golgi y lisosomas que funcional y estructuralmente se relacionan entre s y con la membrana plasmtica. Estos diferentes organelos membranosos son parte de una red dinmica integrada en la cual se intercambiam materiales en una y otra direccin como parte de vesculas de transporte que se forman por gemacin en un compartimiento y se fusionan con otro. Las membranas y los materiales que encierran se desplazan a travs de la clula en vesculas de transporte a lo largo de vas definidas. Una va biosinttica secretoria lleva protenas desde su sitio de sntesis en el RE a travs del complejo de Golgi a su destino final (un organelo, la membrana plasmtica o el espacio extracelular), en tanto que una va endoctica desplaza material en direccin opuesta desde la membrana plasmtica o el espacio extracelular al interior de la clula. Las vesculas y la carga que encierran son enviadas a su destino apropiado mediante seales especficas que poseen las propias protenas (p, 277), El retculo endoplsmico (RE) es un sistema de tbulos, cisternas y vesculas que dividen el citoplasma en un espacio luminal dentro de las membranas del RE y un espacio citoplsmico por fuera de ellas. El RE se divide en dos tipos muy amplios, el RE rugoso (RER), que de ordinario se presenta como cisternas aplanadas y cuyas membranas tienen ribosomas unidos, y el RE liso (REL), que en condiciones tpicas se muestra como compartimientos tubulares y cuyas membranas carecen de ribosomas. Las funciones del REL varan de una clula a otra e incluyen la sntesis de hormonas esferoides, destoxicacin de una gran variedad de compuestos orgnicos, movilizacin de glucosa a partir de glucosa 6-fosfato, y secuestro de iones calcio. Las funciones del RER son similares en diferentes tipos de clulas; incluyen sntesis de protenas que sern secretadas, protenas lisosmicas, protenas integrales de membrana y lpidos de membrana (p. 280). Las protenas sintetizadas en los ribosomas enlazados a la membrana del RER pueden reconocerse por una secuencia de seales hidrfoba que de ordinario se sita cerca del Nterminal del polipptido naciente. Conforme surge la secuencia de seales del ribosoma, se enlaza a una partcula para reconocimiento de seales (PRS) que detiene la sntesis y acta como etiqueta para mediar el enlace del complejo a un receptor de la PRS presente slo en la membrana del retculo endoplsmico rugoso. Luego del enlace, la PRS se libera de la membrana y el polipptido naciente pasa a travs de un agujero revestido de protena en la membrana del RE hacia el interior de la luz del retculo endoplsmico. Las protenas lisosmicas y secretorias se translocan al interior de la luz del RE en su totalidad, en tanto que las protenas de membrana se integran a la bicapa de lpidos gracias a una o ms secuencias que detienen la transferencia de partculas hidrfobas. Una peptidasa de seal enlazada a la membrana elimina el pptido de seal del polipptido y la protena sufre plegamiento y formacin de enlaces disulfuro con ayuda de protenas que residen en la luz del retculo endoplsmico. Las protenas que no se pliegan correctamente son reconocidas y destruidas. Una vez que la protena recin sintetizada se sita en la luz o en la membrana del RER, puede desplazarse desde ese sitio hasta su destino especfico a lo largo de la va biosinttica (p. 283). La mayor parte de los lpidos de una membrana celular tambin se sintetizan en el RE y se desplazan desde este sitio a diferentes destinos. Los fosfolpidos se sintetizan en la cara citoslica del RE y se introducen en la hoja citoslica de la membrana del retculo endoplsmico. Algunas de estas molculas son transportadas subsecuentemente a la hoja opuesta. La composicin lpida de las membranas est sujeta a modificaciones de varios tipos. Por ejemplo, una protena intercambiadora de fosfolpidos pueden eliminar selectivamente fosfolpidos de la membrana de un organelo y transportarlos a travs del citoplasma, o los grupos ceflicos de lpidos especficos pueden sufrir modificaciones por medios enzimticos (p. La adicin de azcares (glucosilacin) a los residuos asparagina de protenas se inicia en el RE rugoso y contina en el complejo de Golgi. Las secuencias de azcares de las cadenas de oligosacridos de las glucoprotenas son determinadas por el tipo y localizacin de los miembros de una gran familia de glucosiltransferasas, enzimas que transfieren un azcar especfico desde un azcar nucletido donador hasta el aceptor especfico. Las cadenas de carbohidrato se ensamblan en el RE por transferencia de un azcar cada vez al dolicol fosfato, una larga molcula hidrfoba integrada a la membrana. Despus de ensamblado, el oligosacrido central se transfiere en bloque desde el transportador dolicol a un residuo asparagina de polipptido. Casi tan pronto como es transferido el bloque de carbohidratos, se inicia su modificacin, primero eliminando los residuos glucosa terminales. Las vesculas de la membrana, con su carga incluida, sufren un proceso de gemacin en los bordes del RE y se dirigen hacia el complejo de Golgi (p. 289). El complejo de Golgi funciona como una planta de procesamiento, modificando los componentes de la membrana y la carga sintetizada en el RE antes de enviarlos a su destino. El complejo de Golgi tambin es sitio de sntesis de los complejos polisacridos que constituyen la matriz de la pared de clulas vegetales. Cada complejo de Golgi consta de una pila de cisternas aplanadas en forma de placa con rebordes dilatados y relacionadas con vesculas y tbulos. Los materiales entran a la pila en la cara cis y se mueven por transporte vesicular hacia la cara opuesta, o trans. Conforme se desplazan, las glucositransferasas localizadas en las cisternas de Golgi particulares aaden azcares, con frecuencia los aminocidos se modifican y pueden ser eliminadas porciones de polipptidos. Una vez que las protenas alcanzan la red trans de Golgi (RTG) en el extremo de la pila, estn listas para ser clasificadas y enviadas a su destino final celular o extracelular (p. 290). Las vesculas producidas por gemacin del RE y de las cisternas de Golgi estn cubiertas por un revestimiento de protenas (protenas no clatrmas) que se cree desplazan membra-

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as y protenas de manera inespecfica. Se piensa que estas vesculas participan en un proceso de flujo en bloque en el cual membranas, materiales y lquidos se desplazan como partes constitutivas a travs de la clula. Segn este punto de vista, una protena localizada en !a membrana, en la luz del RE o en el complejo de Golgi se transporta "automticamente" de un compartimiento al siguiente y finalmente a la membrana plasmtica, excepto cuando contiene informacin que indica que debe ser retenida en el compartimiento donde reside o cuando se deriva (enva) hacia un destino especfico distinto de la membrana plasmtica, como el lisosoma (p. 294). Las protenas pueden ser retenidas en un compartimiento particular debido a que poseen una seal especfica de retencin, o ser enviadas a un compartimiento ms alejado a lo largo de las vas porque poseen una seal de destino especfico. Las seales de retencin mejor estudiadas operan para mantener protenas solubles o de membrana en el RE. Si estas protenas escapan del RE y alcanzan la cisterna cis de Golgi, son devueltas a su compartimiento apropiado por un mecanismo de reciclamiento mediado por receptor. Se piensa que las yemas vesiculares de un compartimiento donador poseen protenas especficas en sus membranas (miembros de la familia de v-SNARE) que reconocen una protena complementaria {miembros de una familia de t-SNARE) localizadas en el compartimiento especfico (del aceptor). El encuentro de las dos membranas es mediado por las SNARE, en tanto que la fusin de la membrana aparentemente se desencadena por un cambio de conformacin de las protenas enlazadas a GTP luego de la hidrlisis del mismo (p. 296). La clasificacin de protenas en la va biosinttica ocurre sobre todo en os ltimos compartimientos de Golgi, la red trans de Golgi. En el compartimiento de la RTG se originan dos tipos de vesculas: 1) vesculas cubiertas con protenas no clatrina, como las protenas de revestimiento, que mueven material de manera no selectiva y son materiales constitutivos de la membrana plasmtica, y 2) vesculas recubiertas de clatrina que contienen una protena de membrana particular que dirige la vescula a un destino especfico. Las vesculas recubiertas de clatrina transportan cargas especficas en virtud de adaptadores que forman una capa entre la recubierta externa de clatrina y la membrana de la vescula. Una parte del adaptador se enlaza especficamente a la recubierta de clatrina y la otra se enlaza tambin especficamente al extremo citoplsmico de las protenas de membrana, que a su vez se unen a sus correspondientes ligandos dentro de la luz de la vescula (p. 297). Las enzimas lisosmicas producidas en el RER se clasifican en la RTG y son transportadas a su destino por los lisosomas gracias a residuos maosa fosforilados que se encuentran

entre sus cadenas de oligosacridos. Conforme pasan a travs de las cisternas de Golgi, varias enzimas lisosmicas son reconocidas por enzimas que aaden fosfato de glucosamina a ciertos residuos maosa en el centro del oligosacrido. A continuacin la glucosamina es eliminada, dejando residuos maosa fosfato reconocibles por los receptores de membrana en la RTG, que causa que las enzimas se empaquen en las vesculas que se dirigen al lisosoma (p. 299). Los lisosomas son organelos enlazados a la membrana que contienen disposicin diferente de hidrolasas acidas capaces de digerir casi todo tipo de macromolculas biolgicas. Morfolgicamente, los lisosomas muestran un aspecto diverso que refleja la gran variedad de materiales que pueden digerir. Entre sus numerosas funciones, los lisosomas descomponen materiales, como bacterias y desperdicios, que llegan a la clula por fagocitosis; desdoblan organelos citoplsmicos envejecidos por un proceso denominado autofagia y digieren las macromolculas entregadas a travs de los endosomas por un proceso de endoctosis mediado por receptor. En muchos protistas unicelulares, los lisosomas digieren materiales nutrientes ingeridos por fagocitosis, en tanto que en los mamferos y otros animales los lisosomas desempean un papel clave en la defensa inmunolgica (p. 300). Las vacuolas vegetales realizan diversas actividades. Las vacuolas sirven como almacn transitorio para solutos y macromolculas; contienen compuestos txicos empleados para la defensa; suministran un recipiente para desperdicios celulares; mantienen un compartimiento hipertnico que ejerce presin por turgencia contra la pared celular, y son sitios de digestin intracelular mediada por hidrolasas acidas (p. 305). Muchas clulas poseen mecanismos que captan materiales del ambiente extracelular en vesculas citoplsmicas derivadas por invaginacin de la membrana plasmtica. La fagocitosis es la captacin de partculas materiales y la endocitosis es la captacin de lquido, solutos disueltos y macromolculas suspendidas. La fagocitosis puede servir como mecanismo de alimentacin o como un sistema celular de defensa. En la endocitosis mediada por receptor, los ligandos especficos se enlazan a los receptores que se proyectan desde la superficie externa de la membrana plasmtica. Los receptores se renen en fosillas recubiertas de la membrana sobre la superficie citopsmica por un armazn poligonal formada por molculas de clatrina de tres extremidades. La redisposicin de la rejilla de clatrina facilita la formacin de vesculas recubiertas que contienen os materiales llevados al interior. Las vesculas pierden su cubierta, se fusionan con los endosomas y entregan su contenido al lisosoma (p. 308).

PREGUNTAS DE REPASO
1. Mencionar los organelos que componen la va biosinttica en comparacin con los que forman parte de la va endoctica. 2. Describir las diferencias en una autorradiografa de clulas pancreticas incubada con aminocidos marcados durante cinco minutos y fijadas de inmediato en comparacin

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CAPITULO 8 Sistemas de a membrana citoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

3. 4.

5.

6.

7.

8.

con una clula marcada y luego seguida durante 40 minutos. Cules son las principales diferencias morfolgicas entre RER y REL? Las principales diferencias en sus funciones? Describir los pasos entre el momento en que un ribosoma se une a un RNA mensajero que codifica una protena secretoria y el momento en que la protena abandona el retculo endoplsmico rugoso. Cmo se introducen a la membrana las protenas integrales recin sintetizadas? Cmo se introducen los lpidos recin sintetizados? Describir algunas de las formas mediante las cuales algunos de los organelos membranosos pueden mantener su composicin nica a pesar del trfico continuo de membranas y materiales que los atraviesan. Describir los pasos que ocurren conforme una protena secretoria soluble, como la enzima digestiva de una clula pancretica, se desplaza desde el RER a la cisterna cis de Golgi. Desde la cisterna cis a la red trans de Golgi. Desde la red trans de Golgi a la membrana plasmtica. Cul es papel del dolicol fosfato en la sntesis de glucopro-

tenas de la membrana? Cul es la secuencia de azcares unidos a la protena determinada? 9. Describir de qu manera el experimento mostrado en la figura 8-18 es un argumento contra el modelo de maduracin para la formacin del complejo de Golgi. 10. Describir la diferencia del papel de las vesculas recubiertas de clatrina y las recubiertas por protenas no de clatrina que se forman en la red trans de Golgi. 11. Qu determina la especificidad de interaccin entre una vescula de transporte y el compartimiento de la membrana con la cual se fusiona? 12. Describir los pasos que aseguran que una enzima Hsosrnica se dirija a un lisosoma y no a una vescula secretoria. 13. En qu difiere el proceso de glucosilacin en el complejo de Golgi del que ocurre en el retculo endoplsmico rugoso? 14. Describir tres funciones distintas de los lisosomas. De vacuolas vegetales 15. Describir los pasos que ocurren entre el enlace de una partcula de LDL a la membrana plasmtica de una clula y la entrada de las molculas de colesterol al citoplasma.

PREGUNTAS ANALTICAS
1. Cul de los siguientes polipptidos, si es que alguno, sera de esperar que careciera de una seal pptida: anticuerpos (IgG, pg. 63), fosfatasa acida, hemoglobina, protenas ribosmicas, glucoforina, protenas del tonoplasto. 2. Supongamos que usted sospecha que un paciente puede sufrir la enfermedad de clula I. Cmo podra decidir si este diagnstico es correcto empleando clulas cultivadas del paciente? 3. En qu compartimiento celular se esperara que una glucoprotena tuviera su mayor contenido de maosa? Es mayor el contenido de N-acetilglucosamina? Es mayor el contenido de cido silico? 4. El sulfato de condroitina es un glucosaminoglicano. Esperara usted encontrar este material en la luz del RER? Por qu si o por qu no? 5. Cules son las tres protenas que se esperara encontrar como componentes integrales de la membrana RER y que estaran ausentes de la REL? Cules son las dos protenas del REL que no estn presentes en el retculo endoplsmico rugoso? 6. Supongamos que se quiere estudiar el proceso de secrecin regulada en una clula que carece de granulos secretorios maduros, o sea, vesculas que contienen material secretorio listo para ser descargado. Cmo se obtendra una clula que careciera de dichos granulos? 7. Qu tipo de anticuerpo se podra emplear para distinguir entre vesculas recubiertas aisladas formadas en la RTG de aqullas formadas en la membrana plasmtica? 8. La autorradiografa depende de partculas emitidas por tomos radiactivos que inciden sobre una emulsin fotogrfica situada en la parte superior de un corte de tejido. Cuando se revela la emulsin, el sitio donde la partcula incide sobre la emulsin aparece como granulo plateado, como en la figura 8-3, a. Cmo piensa usted que el espesor del corte podra afectar la resolucin de la tcnica, o sea, la capacidad para localizar el sitio preciso en a clula donde se incorpora la radiactividad? 9. En qu parte de una clula sera de esperar que se incorporaran primero los siguientes compuestos: 3H-leucina,3Hcido silico, 3H-manosa, 3H-colina, 3H-cido glucurnico (como precursor de GAG),3H-pregnenolona (precursor de hormonas esferoides), 3H-ramosa en una clula vegetal (la ramosa es un precursor de pectinas)? 10. Cul de las siguientes clulas se esperara que participaran de manera ms intensa en la endocitosis a granel: a) un eritrocito; b) una clula acinar pancretica; c) un macrfago? Por qu? 11. Sera de esperar que las propiedades del lado cisternal de las membranas de Golgi sean ms similares al lado extracelular o al lado citoplsmico de la membrana plasmtica? Por qu? 12. Qu compartimiento(s) de una clula se relaciona ms con cada una de las siguientes: clatrina, iones calcio en una clula muscular esqueltica, dolicol fosfato, ribonucleasa y lipasa, digital, receptores de LDL, protenas de revestimiento, partculas para reconocimiento de seales no enlazadas? 13. Si se incuba una rebanada de tejido pancretico con 3Hleucina durante dos horas continuas, en qu parte de las clulas acinares esperara usted que se incorporara la radiactividad? 14. Si usted aadiera un frmaco que interfiere con la capacidad de los ribosomas para enlazarse al RNAm, qu efecto

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana ctoplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana

323

esperara que tuviera sobre la estructura del retculo endoplsmico rugoso? 15. Una de las mejores maneras de estudiar la secuencia de acontecimientos a lo largo de la va biosinttica es infectar una clula con un virus, como el virus de la estomatitis vesicular. Por qu piensa que una infeccin viral se presta a este tipo de estudio? En qu se parece esta tcnica al empleo de un radioistopo?

16. No todos los receptores que contienen endocitosis mediada por receptores se localizan en las fosilas recubiertas antes de enlazarse al ligando, pero se concentran en las fosilas recubiertas antes de ser llevadas al interior. Cmo se supone que el enlace de un ligando al receptor provocara su concentracin en una fosilla recubierta?

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324

CAPITULO 8 Sistemas de la membrana toplsmica: estructura, funcin y trfico de membrana Fagocitosis y endocitosis Anderson, R.G.W. 1993. Potocytosis of small molecules and ions by caveolae. Trends Cell Biol. 3:60-72. Brown, M.S. 1984. How LDL receptors influence cholesterol and atherosclerosis. Sci. Am. 251:58-66 (nov.). Rabinovitch, M. y cois. 1995. Phagocytosis. Trends Cell Biol. 5:85-142. Ross, R. 1993. Atherosclerosis: A defense mechanism gone awry. Am. ]. Pathol 143:987-1002. Vaux, D. 1992. The structure of an endocytosis signal. Trends Cell Biol. 2:189-192.

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CAPITULO

Citoesqueleto y motilidad celular

9-1 Estudio del citoesqueleto 9-2 Motores moleculares 9-3 Microtbulos 9-1 Filamentos intermedios 9-5 Microfilamentos

*9-6 Contractilidad muscular

9-7 Motilidad no muscular La va experimental: El motor molecular que impulsa el transporte axonal rpido

l esqueleto de un animal es un conocido sistema de E rganos que consta de elementos endurecidos que apoyan a los tejidos blandos del cuerpo y desempean un papel clave en la mediacin de los movimientos corporales. Las clulas tambin tienen un "sistema esqueltico", el citoesqueleto, con funciones anlogas. El citoesqueleto se compone de tres estructuras filamentosas bien definidas: microtbulos, microfilamentos y filamentos intermedios, que en conjunto forman una elaborada red interactiva (fig. 9-1). Los microtbulos son estructuras cilindricas huecas cuya pared se compone de subunidades formadas a partir de la protena tubulina. Los microfilamentos son estructuras finas, slidas, compuestas de actina. Se cree que los filamentos intermedios son fibras semejantes a cuerdas compuestas de varas protenas con estructura similar. Los elementos que constituyen el citoesqueleto funcionan en algunas actividades interrelacionadas. Como bastidor, que suministra apoyo estructural que ayuda a mantener la forma de las clulas. Por ejemplo, los eritrocitos de mamfero mantienen su forma discoidal gracias al citoesqueleto de espectrina y actina situado sobre la superficie interna de la membrana plasmtica de dichas clulas (pg. 141) Como armazn interna, encargada de mantener la posicin de diferentes organelos en el interior de la clula. Esta funcin es particularmente evidente en clulas epiteliales polarizadas, como la mostrada en la figura 8-8, donde los organelos se disponen siguiendo un patrn definido a lo largo de un eje que va del extremo apical al extremo basal de la clula. Como parte de un mecanismo necesario para el movimiento de materiales y organelos dentro de las clulas.
325

FIGURA 9-A. Extremo terminal de un axn en crecimiento de la liebre marina Aplysia. Los filamentos de actina requeridos para las actividades mviles de alargamiento del axn se muestran en azul; los microtbulos, localizados atrs del extremo en crecimiento, se muestran en rojo. La fotografa es una composicin de imgenes separadas de video superpuestas dgitamente. (Segn P. Forscher y S./- Smith, ]. Cell Biol. 107:1513, 1988, con permiso de Rockefeller University Press. Cortesa de Paul Porscher, Yale University.)

326

CAPITULO 9 Citoesqueleto y motilidad celular

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FIGURA 9-2. La flexibilidad del citoesqueleto es evidente en esta clula que se desplaza a 90 sobre el borde de un cubreobjetos. Barra, 30/im. (Segn Guenter Albrecht-Buehler, Int. Rev. Cytol. 120:211, 1990.)

Filamentos de actina

Microtbulos

Filamentos intermedios

(b)
FIGURA 9-1. Componentes del citoesqueleto. a) Gammagrafa electrnica del citoesqueleo de una clula cultivada (N, ncleo). Barra, 3 m. b) Diagrama que muestra sitios en una clula epitelial donde tienden a concentrarse cada uno de los tres principales elementos del citoesqueleto. La estructura de cada uno de los tres tipos de filamento se muestra en los recuadros, (a: Segn B. Payrastre y cois. }, Cell Biol. 115:123, 1991; con permiso de Rockefeller University Press.)

celular hasta el sitio donde se utilizan en el extremo terminal de la clula. Como elementos generadores de fuerza encargados del movimiento de clulas de un sitio a otro. Los organismos unicelulares de ordinario ejecutan locomocin celular "arrastrndose" sobre la superficie de un sustrato slido o impulsndose por s mismos a travs de su ambiente acuoso con ayuda de organelos locomotores especializados (cilios y flagelos) que sobresalen de la superficie celular. Los animales multicelulares contienen clulas capaces de amplios desplazamientos (ftg. 9-2). Estos diferentes tipos de motilidad celular dependen de los elementos citoesquelticos. Como sitios para fijar RNA mensajeros y facilitar su traduccin a polipptidos. Cuando las clulas se extraen con detergentes no inicos, que dejan relativamente intacto el citoesqueleto, gran parte del mecanismo de traduccin de la clula permanece en el citoesqueleto. Como transductor de seales. Adems de la funcin mecnica mencionada antes, el citoesqueleto, que con frecuencia entra en contacto con la superficie interna de la membrana plasmtica, desempea un papel clave en la transmisin de seales del ambiente extracelular al interior de la clula. Debemos recordar que aunque los componentes del citoesqueleto en las micrografas parecen estructuras estticas e inmutables, en realidad son muy dinmicas capaces de reorganizarse con rapidez espectacular. Adems, gran parte de las funciones del citoesqueleto requieren muchas protenas accesorias que no forman parte de los propios filamentos.

Ejemplos de esta funcin incluyen el movimiento de las vesculas de transporte del retculo endoplsmico al complejo de Golgi; la invaginacin de la membrana plasmtica durante la formacin de vesculas fagocitarias; la separacin de los cromosomas duplicados durante la mitoss, y el movimiento de vesculas que contienen neurotransmisores a lo largo de clulas nerviosas desde el sitio donde se sintetizan en el cuerpo

9-1 Estudio del citoesqueleto

En la actualidad, el estudio del citoesqueleto es una de las reas ms activas en biologa celular, en gran parte debido

CAPITULO 9 - Citoesqueleto y motilidad celular al desarrollo de tcnicas que permiten a los investigadores adoptar un mtodo unificado morfolgico, bioqumico y molecular. Como resultado, ahora se sabe bastante acerca de las familias de protenas que constituyen el ctoesqueleto; la organizacin de las subunidades dentro de sus respectivas estructuras fibrosas; los "motores moleculares" que generan las fuerzas que permiten al citoesqueleto participar en actividades de movimiento; y las cualidades dinmicas que controlan la organizacin espacial, ensamblado y desensamblado de los diferentes elementos del citoesqueleto. Analizaremos brevemente algunas tcnicas importantes para estudiar el citoesqueleto. Empleo del microscopio de fluorescencia El microscopio de luz ha sido la herramienta tradicional empleada para conocer ms acerca de la organizacin celular en tejidos fijados y teidos, y para observar clulas vivientes que participen en diferentes tipos de movimiento. En los ltimos dos decenios, el microscopio de luz sufri grandes cambios que permitieron a este instrumento suministrar informacin acerca de estructuras celulares mucho ms pequeas que las visibles mediante tcnicas pticas estndar. La microscopa de fluorescencia (seccin 17-1) ha desempeado un papel muy importante en esta revolucin. La microscopia de preparaciones fluorescentes se ha empleado para estudiar la dinmica del citoesqueleto. Por ejemplo, las subunidades protenicas de las estructuras del citoesqueleto (como tubulina y queratina) pueden hacerse fluorescentes mediante la formacin de uniones covalentes (conjugacin) con una protena fluorescente de bajo peso molecular, que a continuacin se introduce a la clula viviente mediante microinyeccin. Las subunidades se incorporan a la forma polimrica de la protena como mcrotbulo o microfilamento intermedio y se puede seguir en el tiempo el sitio donde se localiza la estructura fluorescente mientras la clula participa en sus actividades normales. As, a diferencia de las tcnicas de alta resolucin, la clula permanece viva durante la observacin. La figura 9-3 muestra la distribucin de los microtbulos en el axn en proceso de alargamiento de una neurona inyectada previamente con tubulina fluorescente. La microscopia de fluorescencia tambin se puede usar para conocer el sitio dentro de la clula de una protena presente en concentracin muy baja. Estos experimentos se efectan mejor utilizando anticuerpos fluorescentes capaces de enlazarse con elevada afinidad a la protena buscada. Los anticuerpos son particularmente tiles debido a que pueden distinguir variantes relativamente cercanas (isoformas) de una protena. La protena puede localizarse inyectando el anticuerpo en una clula viviente, experimento que tambin puede revelar la funcin de la protena estudiada, puesto que la unin del anticuerpo con frecuencia destruye la capaciadad de la protena para efectuar su actividad normal. Alternativamente, se puede determinar la localizacin de la protena especfica aadiendo el anticuerpo fluorescente a clulas o cortes de tejido fijados, como se ilustra en la figura 9-4. La distribucin de los tres tipos de elementos citoesquelticos: microtbulos, filamentos nter -

327

5/tm

FIGURA 9-;i. Distribucin de los microtbulos en un axn en proceso de alargamiento de una neurona viviente. La clula se inyect con un pequeo volumen de tubulina cerebral unida por enlaces covalentes al colorante fluorescente rodamina. Una vez en el citoplasma, las subunidades de tubulina fluorescente se incorporan a los microtbulos cuyas posiciones pueden ser seguidas bajo el microscopio de fluorescencia conforme las clulas efectan sus actividades normales. (Segn James H. Sabry y cois. J. Cell Biol. 115:353, 1991, cortesa de David Bentley; con permiso de Rockefeer University Press.)

medios, y microfilamentos, se puede revelar en la misma clula en tres imgenes sucesivas en las micrografas de la figura 9-5. Empleo de la videomicroscopia y ensayos de inutilidad in vitro Otra manera de aumentar la potencia del microscopio de luz es "filmar" los sucesos observados bajo el microscopio con una cmara de video y observar la escena en una pantalla de televisin preparada para tal objetivo. La imagen capturada por una cmara de video posee un contraste excepcional y adems se puede digitalizar y someter a procesos de computacin. Estas caractersticas permiten observar y fotografiar objetos ordinariamente observados a baja resolucin con el microscopio de luz, como los microtbulos de 25 nm o las vesculas membranosas de 40 nm. La videomicroscopia tambin puede emplearse para observar in vitro el crecimiento o la reduccin de microtbulos individuales conforme ganan o pierden subunidades.

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CAPITULO 9 Citoesqueleto y motilidad celular

de vidrio; a continuacin, los microtbulos se cubren directamente con microscpicos globulitos empleando un sistema de rayos lser enfocados que actancomo "tenazas pticas", que contienen en su superficie una sola o unas cuantas molculas de protena motora. En condiciones apropiadas, empleando ATP como fuente de energa, se pueden seguir el movimiento de un globulito a lo largo del microtbulo sobre la pantalla de televisin {fig. 9-6). Los rayos lser enfocados tambin se pueden utilizar para "atrapar" un solo globulito y medir las diminutas fuerzas (medidas en piconewtons, pN) generadas por una sola protena motora cuando "intenta" mover al globulito contra la fuerza ejercida por la trampa ptica. Las fuerzas y los desplazamientos medidos en estos ensayos son tan pequeos y los instrumentos tan sensibles a la vibracin, que un grupo de investigadores registr sus mejores medidas despus de la 1:00 a.m., cuando el sistema de transporte subterrneo (METRO) de la ciudad estaba detenido.
FIGURA 9-4. Idealizacin de una protena dentro de una clula utilizando anticuerpos fluorescentes. Esta clula de alga fue teida con anticuerpos fluorescentes (color amarillo verdoso) dirigidos contra una protena denominada centrina. Se observa que la centrina se localiza dentro de los flagelos de la clula y las estructuras semejantes a races entre el flagelo y el ncleo. El color rojo de la clula es resultado de la autofluorescencia de molculas de clorofila de la alga fotosintica. (Segn Mark A. Sanders y Jeffrey L. Salisbunj, de la Clnica Mayo, en Cell 70:533, 1992; con permiso de Cell Press.)

Empleo de tcnicas de microscopa electrnica Una de las propiedades ms caractersticas del citoesqueleto es su insolubilidad en detergentes no inicos, como el tritn X-100. Cuando se tratan las clulas con estos detergentes se extraen los materiales solubles y membranosos, y dejan el puro citoesqueleto casi en la misma condicin y disposicin que se encuentra en la clula viviente. Una de las mejores tcnicas para visualizar el citoesqueleto de las clulas tratadas con detergente es liberar las clulas, eliminar el agua que la rodea mediante sublimacin al "aguafuerte" profundo (fig. 4-19), y a continuacin utilizar las fibras citoesquelticas expuestas como moldes para formar rplicas de platino que puedan visualizarse con el microscopio electrnico. Segn se ilustra esn la figura 9-7, esta tcnica propor-

El desarrollo de la videomicroscopia tambin condujo a desarrollar tcnicas para observar movimientos generados por molculas individuales de protenas que actan como "motores moleculares". Por ejemplo, en un tipo de ensayo, primero se permite a los microtbulos fijase a un cubreobjetos

FIGURA 9-5. Localizacin por medio de fluorescencia de los microfilamentos, microtbulos y filamentos intermedios en la misma clula. Este fibroblasto fue coloreado con tres diferentes sondas fluorescentes que se unen a los tres diferentes tipos de elementos citoesquelticos. a) Los filamentos que contienen actina fueron marcados con la toxina de hongos faloidina; b) los microtbulos que contienen tubulina se marcaron con anticuerpos antitubulina, y c) los filamentos intermedios se marcaron con anticuerpos antivimentina. El conjugado fluorescente utilizado en cada caso se indica en el ngulo inferior derecho de cada fotografa. Cada uno de estos colorantes fluorescentes emite luz de diferente longitud de onda. Por consiguiente, se puede localizar cada uno en la clula utilizando filtros que bloquean la luz emitida por los otros dos compuestos fluorescentes. (Segn Monika Herzog y cois., cortesa de Vctor Small, Cell Bology: A Laboratory Handbook, /.. Celis, ed., Academic Press, 1994.)

CAPITULO 9 Citoesqueleo y motilidad celular

329

(d) FIGURA 9-6. Mediante videomicroscopia se pueden seguir las actividades de los motores moleculares. En esta secuencia de video: a) un globulito, recubierto con la protena motora cinesina, es capturado hacia afuera de la suspensin utilizando unas tenazas pticas de rayo lser; b) el globulito se deposita sobre un microtbulo (la reflexin de la luz lser en la interfase cubreobjetos-agua oscurece parcialmente la imagen); c-d) el globulito se enlaza al microtbulo y comienza a moverse a lo largo de la va microtubular; e) dibujo esquemtico del movimiento de uno de estos globulitos a lo largo de un microtbulo mostrando las dimensiones relativas de los componentes. (Segn Steven M. Block, L.S.B. Goldstein y Bruce }. Schnapp. Reimpreso con permiso de Nature 348:349, 1990. Copyright 1990, Macmlan Magazines Ltd.)

ciona vistas tridimensionales espectaculares del citoesqueleto, con resolucin lo bastante alta para identificar elementos especficos simplemente segn su dimetro y la morfo-

logia de su superficie. Se puede incrementar el contenido de informacin de la preparacin tratndola con anticuerpos especficos antes del sombreado metlico, y despus observar los complejos antgeno-anticuerpo en las rplicas con la resolucin lograda en las mismas.

9-2 Motores moleculares

Los motores son mquinas que convierten energa qumica o elctrica en energa mecnica. Por ejemplo, el motor de un automvil convierte la energa qumica de la gasolina en energa mecnica, poniendo a girar el eje delantero o el trasero que arrastra a las ruedas en su rotacin. Los motores diseados por el hombre son muy variados y sirven para efectuar todo tipo de trabajo mecnico. Consideremos un motor del tipo mostrado en la figura 9-8, el cual, de manera no muy diferente a la locomotora de un tren, se desplaza tirando de su carga a lo largo de rieles. A diferencia de la locomotora tpica, este motor genera su fuerza mediante un brazo oscilante que se enlaza sucesivamente a sitios inmviles sobre el riel. El brazo se balancea hacia adelante y se enlaza a un sitio sobre el riel, el cual activa al motor para efectuar su golpe de potencia durante el cual el brazo se desplaza hacia atrs impulsando el motor con su carga hacia adelante a lo largo del riel. Luego de concluir el golpe de

FIGURA 9-7. Examen con microscopio electrnico del citoesqueleto. Rplica metlica del citoesqueleto congelado en seco de un fibroblasto extrado con el detergente no inico Tritn X-100. Son evidentes los haces de microfilamentos (marcados SF por fibras de esfuerzo, que se analizan posteriormente en el captulo). Tambin se observan dos estructuras ms gruesas que pueden ser microtbulos (MT), y una red ms difusa de filamentos tachonada de grupos como racimos de uvas que tienen el tamao y la forma de los polirribosomas (R). (Segn ]ohn E. Heuser y Marc W. Kirschner, J. Cell Bol. 86:215, 1980; con permiso de Rockefeller University Press.)

330

CAPITULO 9 Citoesquekto \j moiilida celular

potencia, el brazo se separa de su sitio de enlace y se regresa mediante un golpe de recuperacin. El brazo entonces vuelve a fijarse a otro sitio de enlace sobre el riel, el cual una vez ms desencadena el golpe de potencia. Los motores moleculares que operan en coordinacin con el citoesqueleto comparten ciertas propiedades con este tipo de motor. En los ltimos 10 aos, aproximadamente, se han descubierto numerosas protenas motoras, de las cuales casi todas pueden agruparse en tres familias muy amplias: miosinas, cinesinas y dinenas. En las siguientes pginas analizaremos cada uno de los tipos de protenas motoras, pero antes debemos indicar algunos conceptos generales. Dos de las familias de protenas, cinesinas y dinenas, se mueven a lo largo de vas que consisten en microtbulos, en tanto que las miosinas se desplazan a lo largo de vas formadas por microfilamentos. No se conocen protenas motoras que utilicen filamentos intermedios como vas. Las protenas motoras del citoesqueleto son transductores mecanoqumicos; o sea, convierten la energa qumica (almacenada en el ATP) en energa mecnica que se emplea para desplazar las cargas celulares fijas al motor. Los tipos de carga celular incluyen vesculas, mitocondrias, lisosomas, cromosomas y otros filamentos citoesquelticos. Se cree que las protenas motoras se mueven gradualmente en una sola direccin a lo largo de la va citoesqueltica de un sitio a otro, de manera no muy diferente al motor mostrado en la figura 9-8. Conforme la protena se desplaza a lo largo de la va, sufre una serie de cambios de conformacin que constituyen un ciclo mecnico. Los pasos del celo mecnico se acoplan a los pasos del ciclo qumico, el cual proporciona la energa necesaria que acta como combustible del movimiento. Los pasos del ciclo qumico incluyen: enlace de la molcula de ATP al motor, hidrlisis del ATP para formar ADP y P, liberacin de los productos del motor, y enlace de una nueva molcula de ATP. Conforme la protena motora se mueve a sitios sucesivos a lo largo de los polmeros citoesquelticos, se repiten una y otra vez los ciclos qumico y mecnico, arrastrando la carga sobre distancias tan grandes como toda la longitud de un microtbulo. A medida que los investigadores conocieron ms detalles de la estructura de los motores moleculares y observaron a conducta in vitro de protenas motoras individuales, surgi un cuadro detallado de la motilidad del citoesqueleto.

9-3 Microtbulos
Estructura y composicin
Como su nombre indica, los microtbulos son estructuras cilindricas huecas que ocurren en casi toda clula eucariota observada con el microscopio electrnico. Los microtbulos son elementos con diversa disposicin de estructuras adems del citoesqueleto, las cuales incluyen el huso mittico de las clulas en divisin y el ncleo central de cilios y flagelos. Los microtbulos tienen dimetro externo de 24 nm, una pared cuyo espesor es de unos 5 nm y longitud que puede extenderse a todo lo largo o ancho de una clula. Un examen ultraestructural cuidadoso de los microtbulos muestra que su pared es un polmero compuesto de subunidades globulares (fig. 9-9, a}. Cada subunidad globular consta de una sola molcula de la protena tubulina. Las subunidades se disponen en hileras longitudinales llamadas protofilamentos, alineados paralelamente al eje mayor del tbulo (fig. 9-9, a}. En un corte transversal se nota que los microtbulos casi siempre contienen 13 subunidades que rodean la circunferencia de la pared (fig. 9-9, b). Aunque la pared del microtbuo parece estar formada por subunidades globulares, el ensamble de los microtbulos ocurre por incorporacin de bloques de construccin dimricos. Cada uno de estos bloques es una unidad que consta de dos molculas ensambladas de tubulina, una a-tubulina y una/3-tubulina (fig. 9-9, c,d). Cada unidad contiene dos componentes no idnticos (un heterodmero), por lo que el protofilamento ntegro presenta una estructura asimtrica con una a-tubulina en un extremo y una /-tubulina en el otro. Todos los protofilamentos de un microtbuo tienen la misma polaridad. Cuando un polmero se forma de componentes asimtricos, todos orientados en la misma direccin (es decir, cabeza con cola) a lo largo del eje (a/,a/3,. . . a/3, a/?), entonces el polmero en s es una estructura polarizada con un extremo (que contiene molculas /3-tubulina) distinguible del otro extremo (que contiene molculas a-tubulina). Un extremo del microtbuo se conoce como extremo ms y el otro como extremo menos. Como estudiaremos ms adelante en este captulo, la polaridad estructural de los microtbulos es un factor importante en el ensamblado de

Sitio de enlace FIGURA 9-. Motores moleculares que se cree que funcionan de manera anloga a la hipottica estructura que arrastra la carga aqu mostrada. Durante un ciclo sencillo de actividad mecnica, el motor se fija a un sitio de enlace sobre su va {paso 1), sufre un golpe de potencia que desplaza el motor a lo largo de la va (paso 2), se desprende de su sitio de enlace (paso 3) y retorna a su posicin original (paso 4). Se cree que ocurre un ciclo de actividad similar, vinculado al ciclo qumico que implica el enlace e hidrlisis de ATP, que ocurre conforme los motores biolgicos se desplazan a lo largo de sus vas citoesquelticas arrastrando varios tipos de carga celular.

CAPITULO 9 Citoesqueleto y motilidad celular

331

(c)

SubunJdad 35 x 40

Heterodmero
100 nm

(b)

(d)

FIGURA 9-9. Estructura de los microtbulos. a) Micrografa electrnica de microtbulos del cerebro tenidos en negativo que muestran las subunidades globulares que constituyen los protofilamentos. Las prolongaciones en la superficie de los microtbulos son protenas relacionadas con el microtbulo (PRM), analizadas ms adelante, b) Micrografa electrnica de una seccin transversa a travs de un microtbulo de una clula del extremo de la raz de un Juniperus revelando las 13 subunidades dispuestas en la pared del organelo. Los microtbulos de estas clulas vegetales abundan ms en la zona cortical, casi de 100 nm de espesor justo por debajo de la membrana plasmtica (vase en la parte inferior derecha de la micrografa). c-d) Diagramas de una seccin transversal y una seccin longitudinal de un microtbulo. El modelo muestra 13 protofilamentos compuestos de heterodmeros a//-tubulina. (a: Segn Linda A. Amos, }. Cell Biol. 72:645, 1977; con permiso de Rockefeller University Press; b: reimpreso con permiso de Mi/ron C. Ledbetter, J. Agr. Food Chem 13:406, 1965. Copyright 1965 American Chemica! Society.)

estos organelos y de su capacidad para participar en actividades mecnicas dirigidas.

Protenas relacionadas con microtbulos

Funcin Los microtbulos desempean diferentes tareas:

Los microtbulos pueden formarse in vitro a partir de preparaciones purificadas de tubulina, pero los microtbulos obtenidos de clulas de ordinario contienen protenas adicionales denominadas protenas relacionadas con microtbulos (PRM). La mayor parte de las PRM que se han identificado slo se observan en el tejido cerebral, pero una de estas protenas, denominada PRM4, tiene amplia distribucin (cuadro 9-1). Con el microscopio electrnico se puede observar que algunas PRM tienen una porcin globular (o "cabeza") que se fija al lado del microtbulo, y una porcin filamentosa (o "cola") que se extiende hacia afuera a partir de la superficie del microtbulo. En la figura 9-10 se muestra el enlace de una PRM2 a la superficie de un microtbulo. Las PRM pueden interconectar microtbulos para formar haces visibles como puentes transversales que conectan a los microtbulos entre s. Otras PRM a veces incrementan la estabilidad de los microtbulos, alteran su rigidez o influyen en su velocidad de ensamblado. La actividad de las diferentes PRM es controlada principalmente por adicin y eliminacin de grupos fosfato por proteincinasas en un residuo particular de aminocido.

1. Sirven como esqueleto interno o armazn que proporciona apoyo estructural y ayuda a mantener la posicin de los organelos citoplsmicos. 2. Forman parte del mecanismo que desplaza materiales y organelos de una parte a otra de la clula.

CUADRO 9-! Protenas relacionadas con microtbulos Protenas PRM1A PRM1B (PRM5) Vesiquina PRM2A, PRM2B PRM4 PRM3 Dinamina PRM2C tau Peso molecular (kD)
350 325 295 270 200 180 100 70 50-65

Fuente Tejido nervioso Tejido nervioso Tejido nervioso Tejido nervioso Ampliamente distribuido Ampliamente distribuido Tejido nervioso Tejido nervioso Tejido nervioso

332

CAPITULO 9 Citoesqueleto y motilidad celular

Mcrotbulo FIGURA 9-10. Protenas relacionadas con microtbulos (PRM). Diagrama de una molcula PRM2 enlazada a la superficie de un microtbulo. Cada molcula PRM2 contiene tres sitios de enlace a tubulina conectada por cortos segmentos de la cadena polipptida. Los sitios de enlace estn espaciados a una distancia suficiente para permitir que la molcula de PRM2 se una a tres subunidades separadas de tubulina en la pared del microtbulo. Las colas de las molculas PRM se proyectan hacia afuera, donde pueden interactuar con otros componentes celulares.

FIGURA 9-11. Localizacin de los microtbulos en una clula cultivada de ratn, grande y aplanada, revelada por anticuerpos fluorescentes antitubuna. Se observa que los microtbulos se extienden desde la regin perinuclear de la clula en disposicin radial; se pueden seguir los microtbulos individuales y se observa que se incurvan gradualmente a medida que constituyen la forma de la clula. (Segn Man/ Osborn \j Klaus Weber, Cell 12:563, 1977; con permiso de Cell Press.)

3. Son elementos mviles de cilios y flagelos. 4. Son componentes primarios del mecanismo encargado de la mitosis y la rneiosis. En las siguientes pginas consideraremos las tres primeras funciones de los microtbulos; el papel de los microtbulos en la divisin nuclear se analiza en el captulo 14.
Microtbulos como apoyos estructurales

Los microtbulos son lo bastante rgidos para resistir fuerzas de compresin o de traccin sobre la fibra. Esta propiedad permite a los microtbulos suministrar apoyo mecnico de manera no muy diferente a como las vigas de acero apoyan un alto edificio de oficinas. Por ejemplo, los microtbulos evitan que las contracciones del citoplasma deformen las clulas. La distribucin de los microtbulos citoplsmicos en una clula por lo general define la morfologa de la misma. Las clulas animales cultivadas de ordinario se dispersan sobre el sustrato adoptando una forma esfrica aplanada, y los microtbulos se extienden en disposicin radial hacia afuera de la regin que rodea al ncleo (g. 9-11). En contraste, los microtbulos de clulas epiteliales columnares por lo general se orientan con su eje mayor paralelo al eje longitudinal de la clula (fig. 9-12). Gracias a esta configuracin, el microtbulo al parecer apoya la forma polarizada de la clula de igual manera que la forma en que las varillas de aluminio apoyan la concavidad de una tienda. A veces es difcil demostrar el papel de los microtbulos en la conservacin de la morfologa de una clula ntegra, pero su papel como elemento "esqueltico" se manifiesta con claridad cuando se examinan ciertas prolongaciones celulares muy alargadas, ms notable en axones neuronales y en axpodos de protozoarios heliozoan. El axn de una clula nerviosa est lleno de microtbulos orientados paralelamente entre s y con respecto

del eje longitudinal del mismo (fig. 9-13). En axones maduros, estos microtbulos sirven principalmente para desplazar vesculas y otras partculas citoplsmicas a lo largo del axn (pg. 380). En el desarrollo del embrin, los microtbulos desempean un papel clave para mantener la forma del axn conforme crece lentamente, extendindose por fuera del sistema nervioso central al interior de los tejidos embrionarios perifricos. En un cultivo de clulas se puede observar un proceso similar de crecimiento axonal hacia afuera. Cuando una neurona cuyo axn est en crecimiento se trata con frmacos fragmentadores de microtbulos, como nocodazol o colquicina, la prolongacin axonal deja de crecer y de ordinario se retrae haca atrs retornando hacia el cuerpo celular. Un ejemplo notable del papel de los microtbulos en el mantenimiento de la forma celular es la prominencia delgada y alargada del axpodo de los protozoarios heliozoan (fig. 9-14). Cada axpodo contiene una estructura central compuesta de numerosos microtbulos dispuestos en espiral con microtbulos individuales que abarcan toda la longitud de la prominencia. En las clulas vegetales, los microtbulos desempean un papel indirecto en la conservacin de la morfologa celular mediante su influencia en la elaboracin de la pared celular. En una clula vegetal, la masa de microtbulos de ordinario se localiza justo por debajo de la membrana plasmtica (fig. 9-9, b) formando una zona cortical distinta. Los microtbulos de esta zona cortical influyen en la posicin de las enzimas sintetizadoras de celulosa localizadas en la membrana plasmtica (fig. 7-35). En consecuencia, las enzimas producen microfibrillas de celulosa orientadas paralelamente respecto de los microtbulos subyacentes (fig. 9-15). Por su parte, la orientacin de las microfibrillas de celulosa en la pared desempea un papel importante para definir las

CAPITULO 9 Citoesqueleto y inutilidad celular

333

Desmosoma

(b)

0.25 pm

FIGURA 9-13. Microtbulos de un axn y su papel en el movimiento del organelo. a) Micrografa de una neurona viva aislada de pollo, b) Micrografa electrnica de una porcin de la misma clula mostrada en a (el cuadro indica la cobertura de la ME). La partcula localizada en esta rea de la micrografa de luz se mantuvo en movimiento hasta el momento de la fijacin. La micrografa electrnica revela que la partcula corresponde a un lisosoma. El gran nmero de microtbulos paralelos desempea un papel importante en este tipo de movimientos. (Segn A.C. Breuer, C.N. Christian, M. Henkart y P.G. Nelson, J. Cell Biol. 65:568, 1965, con permiso de Rockefeller University Press.)
0.5 um

FIGURA *>-12. Disposicin de los microtbulos. Dibujo esquemtico (a) y micrografa electrnica (b) de los microtbulos en las clulas del ala de un insecto. La orientacin de los microtbulos da lugar a la forma alargada de la clula. (Segn John B. Tucker y cois. Eur. J. Cell Biol. 41:281-284, 1986.)

tro de la clula, justo fuera del ncleo. El tratamiento de la clula con nocodazol o colquicina puede dispersar los elementos de Golgi hacia las regiones perifricas de la clula. Cuando se elimina el frmaco y los microtbulos vuelven a ensamblarse, las membranas de Golgi regresan al centro de la clula. Microtbulos como agentes de motilidad intracelular Las clulas vivientes muestran intensa actividad conforme las macromolculas y los organeios se desplazan dirigindose de un sitio a otro. Con el microscopio de luz se puede apreciar este "ir y venir" de partculas materiales dentro de una clula viviente, pero el proceso subyacente rara vez resulta fcil de estudiar por la falta de un citoesqueleto alta-

caractersticas de crecimiento de la clula, y por lo tanto de su morfologa. Tambin se cree que los microtbulos participan en el mantenimiento de la organizacin interna de la clula. El tratamiento de la clula con frmacos fragmentadores de microtbulos puede afectar gravemente la ubicacin de los organeios membranosos, en particular del complejo de Golgi. El complejo de Golgi casi siempre se localiza cerca del cen-

334

CAPITULO 9 Citoesqueleto y motilidad celular

Microtbulos

FIGURA 9-14. Microtbulos como barras de apoyo, a) Este protista tiene tentculos que se prolongan a partir del cuerpo de la clula, b) Los tentculos se apoyan por elaborada disposicin espiral de microtbulos. (a: Segn Peter Parks/Animals Animis; b: cortesa de Man/red Hauser.)

mente ordenado en la mayor parte de los tipos de clula. Por ejemplo, se sabe que el transporte de vesculas de un compartimiento de la membrana a otro depende de la presencia de microtbulos, porque la interrupcin de estos elementos citoesquelticos con frecuencia detiene el movimiento. En los estudios que proporcionan ms informacin acerca de los movimientos de organelos se utilizaron 1. Clulas como neuronas o clulas pigmentadas cuyos movimientos intracelulares se basan en haces regularmente ordenados de microtbulos. 2. Sistemas in vitro donde pueden reconstituirse movimientos basados en microtbulos fuera de la clula viviente. Transporte axonal. El axn de una motoneurona individual puede extenderse desde la mdula espinal hasta la punta de los dedos de la mano o del pie. El centro que

controla esta neurona es su cuerpo celular, una porcin esfrica de la clula que reside en la porcin ventral de la mdula espinal. El cuerpo de la clula contiene al ncleo, al retculo endoplsmico, al complejo de Golgi y a otros organelos necesarios para sintetizar y procesar protenas y otras molculas. Cuando se inyectan aminocidos marcados dentro del cuerpo celular, se incorporan a protenas marcadas que se desplazan al interior del axn y recorren gradualmente toda su longitud. La mayor parte de los materiales, como las molculas de neurotransmisor empleadas en la transmisin sinptica en el extremo terminal de la neurona, se encuentran separados en compartimientos dentro de vesculas membranosas en el RE y el complejo de Golgi, y luego se transportan a lo largo del axn (fig. 9-16, a). Diferentes materiales se desplazan a distintas velocidades; el transporte axonal ms rpido alcanza una velocidad de hasta 5/m por segundo (400 mm por da). Se dice que las estruc-

20 pm

Relaciones espaciales entre la orientacin de los microtbulos y el depsito de celulosa en clulas vegetales. Clulas mesfilas de trigo que fueron coloreadas con doble colorante para microtbulos (a) y celulosa de la pared celular (b). Es evidente que los microtbulos corticales y las microfibrillas de celulosa estn coalineados. (Segn Georg Jung y Wdfgang Wernicke, Protoplasma 53:145, 1990.)

CAPITULO 9 Citoesqudeto y motilidad celular

335

(a)
PRIVL Protena motora Microtbulos (neurotbulos)

V Filamento intermedio (neurofamento) Organelo

turas y materiales que viajan desde el cuerpo celular hacia el extremo de la neurona se mueven en direccin antergrada. Otras estructuras, incluyendo vesculas endocticas formadas en el axn termina! que transportan factores reguladores de clulas especficas, se mueven en direccin opuesta o retrgrada, desde la sinapsis hacia el cuerpo celular. Los axones estn llenos de estructuras citoesquelticas, incluyendo haces de microfilamentos, filamentos intermedios y microtbulos interconectados entre s en diferentes formas (fig. 9-16, b). Diversas pruebas sugieren que tanto los movimientos antergrados como los retrgrados son mediados principalmente por microtbulos. Mediante videomicroscopia, los investigadores pueden observar las vesculas individuales conforme se mueven a lo largo de los microtbulos de un axn cuando se acercan o alejan del cuerpo celular (fig. 9-17). La participacin de los microtbulos se puede verificar fijando la clula y observando la misma regin con el microscopio electrnico. Con esta tcnica se observa que la vescula en movimiento se encuentra en ntima relacin con un microtbulo (como en la figura 9-13). Casi toda la informacin respecto del mecanismo de transporte axonal y otros tipos de motilidad intracelular proviene de estudios in vitro utilizando componentes purificados, como se describe en la siguiente seccin. Motores micro tubular es y ensayos de motilidad in vitro El tema de las protenas motoras se introdujo en la pgina 329. Se han aislado dos tipos de protenas motoras encargadas de los movimientos de materiales citoplsmicos a lo largo de los microtbulos: cinesinas y dinenas citoplsmicas.

(b)
FIGURA 9-16. Transporte axonal. a) Dibujo esquemtico de una clula nerviosa que muestra el movimiento de vesculas a lo largo del axn siguiendo las vas de los microtbulos. Las vesculas se mueven en ambas direcciones dentro del axn. b) Dibujo esquemtico de la organizacin de los microtbulos y los filamentos intermedios (neurofilamentos) dentro de un axn. Las vesculas que contienen materiales transportados se unen a los microtbulos mediante protenas de unin transversa, incluyendo protenas motoras como la cinesina y la dinena.

(b)

(c)

FIGURA 9-1 7. Visualizacin del transporte axonal. a-c) Estas videomicrografas muestran el avance de un organelo membranoso a lo largo de un axn ramificado. El cuerpo celular se encuentra alejado del campo en el extremo superior izquierdo, en tanto que el extremo terminal (conos de crecimiento, pgina 379) quedan fuera del campo en la parte inferior derecha. La posicin del organelo se indica por las cabezas de flecha. El organelo que se est siguiendo (una vacuola autofgica) se mueve en la direccin retrgrada a travs de la punta de la rama y contina movindose hacia el cuerpo de la clula. Barra, 10 m. (Segn Peter }. HoUenbeck, J. Cell Biol. 121:307, 1993; con permiso de Rockefeller University Press.)

336

CAPITULO 9 Ctoescjudeto y motilidad celular

Cinesinas En 1985 se aisl una protena motora del axn gigante del calamar, implicada en el desplazamiento de vesculas membranosas y otros organelos desde el cuerpo celular hacia las terminales sinpticas. A esta protena se le dio el nombre de cinesina. La cinesina es una protena grande compuesta de varios dominios distintos, incluyendo un par de cabezas globulares que actan como "motores" generadores de fuerza y una cola en forma de abanico que se enlaza a la carga que debe arrastrar (fig. 9-18, a). La cinesina no es ms que un miembro de una superf amilia cada vez ms extensa de protenas parecidas a cinesina (PPQ). Las cabezas (o dominio motor) de las protenas parecidas a cinesina tienen una secuencia semejante que refleja la similitud de su papel en el desplazamiento a lo largo de los microtbulos, en tanto que las colas tienen secuencias diversas, lo que indica la variedad de cargas que estas protenas pueden arrastrar. Cuando se fijan molculas purificadas de cinesina a globulitos y se observan en ensayos de motilidad in vitro del tipo mostrado en la figura 9-6, se ve que los globulitos se mueven a lo largo de microtbulos individuales hacia el extremo con polaridad positiva del polmero (fig. 9-18, b). En otras palabras, la cinesina es un motor microtubular dirigi-

Cadenas pesadas

Cadena ligera

T
Cabeza
(a)

Bisagra flexible

Tallo

Cola

do hacia el extremo ms. Puesto que todos los microtbulos de un axn se orientan con sus extremos de polaridad negativa enfrentando al cuerpo celular y sus extremos positivos enfrentando las terminales sinpticas, se presume que la cinesina se encarga del transporte axonal antergrado. El descubrimiento de la cinesina y su papel en el transporte axonal se analiza en La va experimental, al final del captulo. Las protenas motoras, incluyendo cinesina, funcionan a travs de un puente transverso dependiente de un ciclo de ATP. A lo largo de un protofilamento de un microtbulo slo se desplaza una sola molcula de cinesina con velocidad proporcional a la concentracin de ATP (hasta una velocidad mxima de casi 900 nm por segundo). Si la concentracin de ATP es baja, las molculas de cinesina viajan con lentitud suficiente que permite observar que la protena no se mueve en forma continua, sino ms bien se desplaza por pasos separados (fig. 9-18, b). Cada paso mide casi 8 nm de longitud, que corresponde a las dimensiones de un dmero de tubulina. Por lo tanto, al parecer las molculas de cinesina se desplazan sobre la va microtubular avanzando cada vez sobre dos subunidades globulares (o sea un heterodmero). Las protenas similares a cinesina no se restringen a clulas nerviosas, sino que se encuentran en todos los tipos de clulas eucariotas. En el captulo 8 vimos cmo las vesculas se mueven de un compartimiento membranoso a otro a lo largo de ciertas vas definidas. Las rutas seguidas por las vesculas citoplsmicas son definidas principalmente por microtbulos {fig. 9-16, a) y la cinesina tiene una participacin muy importante como agente generador de las fuerzas que impulsan el movimiento de estas vesculas (fig. 9-19). La cinesina tambin se relaciona con el movimiento de vesculas derivadas del RE, endosomas, lisosomas y granulos secretorios. En la mayor parte de las clulas, los microtbulos se organizan con sus extremos positivos situados fuera del centro de la clula, de modo que la cinesina tiende a desplazar vesculas y organelos hacia afuera en direccin a la membrana plasmtica de la clula. Diemos citoplsmicas La primera protena motora relacionada con microtbulos se descubri en 1963 como causante del movimiento de cilios y flagelos. A esta protena se le denomin dinena. De inmediato se sospech la existencia de formas citoplsmicas, pero transcurrieron ms de 20 aos antes de purificar y caracterizar una protena semejante a dinena en el tejido cerebral de mamferos. Pronto se identificaron protenas relacionadas en gran variedad de clulas no nerviosas, e igual que la cinesina, en la actualidad se cree que la dinena citoplsmica, como se le denomin, es una protena motora ubicua en clulas eucariotas. La dinena citoplsmica es una protena enorme (peso molecular mayor de un milln de daltons) compuesta de 9 a 10 cadenas de polipptido. La molcula contiene dos grandes cabezas globulares que actan como motores generadores de fuerza (fig. 9-20, a). Ensayos de motilidad in vitro indican que, en contraste con la cinesina, la dinena citoplsmica se mueve a lo largo del microtbulo hacia el extremo menos del polmero. Las pruebas sugieren cuando menos dos papeles para la dinena citoplsmica:

(b)
FIGURA 9-18. Cinesina. a) Estructura de una molcula de cinesina que consta principalmente de dos cadenas pesadas que se entrelazan en la regin del tallo. Las cabezas generadoras de fuerzas se unen al microtbulo, y la cola a la carga que se transporta, b) Diagrama esquemtico de una molcula de cinesina moviendo una vescula a lo largo de una va microtubular.

CAPITULO 9 Citoesqueleto y motiad celular Cadena pesada Cadenas ligeras

337

(a)

Terminacin axonal

FIGURA 9-l l >. Demostracin experimental de la localizad un conjunta de la cinesina con los microtbulos. Esta clula cultivada fue doblemente marcada con anticuerpos contra cinesina (amarillo) y tubulina (verde). Los anticuerpos anticinesina tien las vesculas unidas a la membrana relacionadas con la red microtubular (observadas en color naranja donde los dos anticuerpos fluorescentes se superponen). (Segn Scott T. Brady y K. Kevin Pfister, J. Cell Science Suplemento 14, 1991, con permiso de The Cotnpany of Biologists Ltd.)

FIGURA 9-20. Dinena citoplsmica. a) Estructura de una molcula de dinena citoplsmica que consta de dos cabezas globulares grandes generadoras de fuerza, cada una compuesta de una cadena pesada de dinena, y un tallo, un nmero de subunidades ms pequeas en la base de la molcula, que se presume median la unin de la protena motora a la carga que se transporta, b) Diagrama esquemtico de dos vesculas movindose en direccin opuesta a lo largo del mismo microtbulo, una impulsada por cinesina movindose en direccin antergrada y la otra por dinena citoplsmica en direccin retrgrada, (b: Segn R.B. Vallee y G.S. Bloom. Reproducido con permiso de Annual Revieiu of Neuroscience, vol. 14, 1991 por Animal Reviews, Inc.)

1. Agente generador de fuerza para el movimiento de cromosomas durante la mitosis (capitulo 14). 2. Motor dirigido al extremo menos del microtbulo para mover vesculas y organelos membranosos a travs del citoplasma. Se cree que en clulas nerviosas la dinena citoplsmica participa en el movimiento retrgrado de organelos citoplsmicos, o sea, desplazamiento hacia el cuerpo celular de la neurona. En las clulas fibroblsticas, la dinena citoplsmica quizs arrastre organelos, incluyendo vesculas de Golgi, lisosomas y endosomas, hacia el centro de la clula. Segn este punto de vista, tal vez demasiado simplista, la cinesina y la dinena citoplsmica sirvan para mover materiales similares en direcciones opuestas sobre la misma red de vas (fig. 9-20, b). Centros organizadores de microtbulos La funcin de un microtbulo dentro de una clula viviente depende de su localizacin y orientacin; por esto es impor-

tante entender por qu un microtbulo se forma en un sitio y no en otro. La formacin de microtbulos a partir de los dimeros a/3-tubulina ocurre en dos fases distintas: una ms lenta de nudeacin, en la cual inicialmente se forma una pequea porcin de los microtbulos, y una fase ms rpida de alargamiento. La nucleacin de los microtbulos in vivo ocurre junto con otras estructuras especializadas que, debido a su papel en la formacin de los microtbulos, se denominan centros organizadores de microtbulos (COMT). Centrosomas En clulas animales, los microtbulos del citoesqueleto de ordinario se forman junto con el centrosoma, estructura compleja que contiene dos centrolos en forma de barril rodeados por un material pericentriolar electrnicamente denso y amorfo {fig. 9-21, a, b). Los centrolos son estructuras cilindricas de casi 0.2 m de dimetro y generalmente

338

CAPITULO 9 Citoesqueleto y motilidad celular

Tbulo B Tbulo A, I / Tbulo C

Material pericentriolar

(a)
FIGURA 9-21. Estructura del centrosoma. a) Diagrama de un centrosoma que muestra los pares de centriolos, el material pericentriolar (MFC) que lo rodea, y los microtbulos que surgen del MPC, donde ocurre la nucleacin. b) Micrografa electrnica de una seccin transversal de un centrolo mostrando la disposicin en rayos de rueda de las nueve fibrillas perifricas, cada una de las cuales consta de un microtbulo completo y dos microtbulos incompletos, c) Micrografa electrnica que muestra dos pares de tentrolos situados en una invaginacin de la superficie del ncleo. Cada par consta de un largo centrolo progenitor y un centrolo hijo ms pequeo (flecha), que sufre alargamiento en esta fase del ciclo celular (analizado en la seccin 14-2). (a: Segn S.. Doxsey y cois., Cell 76:643, 1994; b: cortesa de B.R, Brinkley; c: segn erme B. Rattner y Stcphanie G. Phillips, J. Cell Biol. 57:363, 1973; con permiso de Rockefellcr University Press.)

casi el doble de largo. Con muy pocas excepciones, los centriolos contienen nueve fibrillas regularmente espaciadas, que en seccin transversal cada una aparece como una banda de tres microtbulos designados tbulos A, B y C, conectados al centro del organelo mediante un rayo radia!. Slo el tbulo A est completo (fig. 9-21, a, b). Cada banda de tres microtbulos se inclina en ngulo con la superficie de la estructura, dando a los centriolos un aspecto caracterstico de rehilete. Los centriolos casi siempre se encuentran en pares, con los miembros de la pareja situados en ngulo recto entre s (fig. 9-21, a,c). Tpicamente, el centrosoma se sita cerca del centro de la clula, justo por fuera del ncleo. El examen cuidadoso de cortes efectuados a travs de la regin del centrosoma muestra que es un sitio donde convergen numerosos microtbulos. La mejor tcnica para estudiar el origen de los microtbulos del citoesqueleto es despolimerizar las clulas a temperatura fra o con "venenos" de microbulo, como noco-

dazol o colquicina,1 y en seguida observar el ensamblado de los microtbulos luego de suministrar calor a la clula o de eliminar el veneno. Se puede observar el desensamblado y reensamblado de los microtbulos fijando las clulas en diferentes momentos y tiendo los microtbulos con anti-

1 Aunque la colquicina es el veneno de microtbulos mejor estudiado, todava no se conoce por completo su mecanismo de accin. La colquicina acta enlazndose a los dmeros de tubulina; pero no puede enlazarse a molculas de tubulina dentro de un microtbulo, excepto, al parecer, a la subunidad terminal. Se piensa que este frmaco despolimeriza los microtbulcs existentes porque se incorpora al extremo ensamblador del polmero (sea por unin directa a la subunidad terminal o por unin a una subunidad libre que luego se incorpora al extremo en crecimiento) impidiendo la adicin de subunidades adicionales en esc sitio. Mientras tanto, el extremo opuesto del microtbulo sufre despolimerizacin neta, lo que provoca la disolucin del polmero.

CAPITULO 9 - dtoesqueleto y motilidad celular

339

cuerpos fluorescentes antitubulina. Pocos minutos despus de suprimir las condiciones inhibitorias se observan uno o dos puntos fluorescentes brillantes en el citoplasma de cada clula. En 15 a 30 minutos ffig. 9-22, a) se observa un nmero creciente de filamentos marcados con fluorescencia que irradian fuera de estos focos. Cuando se efecta un corte en estas mismas clulas y se examina en el microscopio electrnico, se observa que los microtbulos recin formados irradian de un centrosoma. El examen atento muestra que los microtbulos no penetran realmente al centrosoma ni hacen contacto con los centrolos, sino ms bien surgen del material denso pericentriolar que reside en la periferia del centrosoma. Este material al parecer sirve para iniciar la formacin de los microtbulos. La polaridad de estos microtbulos siempre es la misma; el extremo menos se relaciona con el centrosoma y el extremo ms (donde ocurre el alargamiento, como se describe luego) se sita en el lado opuesto del polmero (fig. 9-22, b).
Corpsculos bsales y oros centros organizadores de microtbulos

Los centrosomas no son los nicos COMT en las clulas. Por ejemplo, los microtbulos que forman las fibras de un cilio o de un flagelo se originan de una estructura denominada corpsculo basa!, residente en la base del organelo en fase de prolongacin (fig. 9-35). Los corpsculos bsales tienen estructura idntica a la de un centrolo, y de hecho los corpsculos bsales y los centrolos pueden originarse entre s. El flagelo de un espermatozoide, por ejemplo, se forma a partir de un corpsculo basal derivado de un centrolo que fue parte del huso meitico del espermatocito del cual se origin el espermatozoide.

Otros tipos de clulas tienen diferentes centros organizadores de microtbulos. Por ejemplo, en hongos, el COMT primario se presenta como una estructura discoide denominada corpsculo polar del huso, que est integrado a la envoltura nuclear (fig. 9-23), Los microtbulos que crecen por fuera del corpsculo polar del huso forman parte del citoesqueleto citoplsmico, en tanto que los microtbulos que se dirigen hacia adentro forman parte del huso mittico (formado dentro del ncleo de estos organismos). Las plantas carecen tanto de centrosomas como de centrolos. El COMT primario de una clula vegetal consta de placas de material situado en la superficie externa de la envoltura nuclear a partir de la cual surgen los microtbulos del citoesqueleto (fig. 9-24). Cualquiera que sea su aspecto, los COMT al parecer desempean un papel similar en las clulas; controlan el nmero de microtbulos que forman la polaridad de dichos microtbulos, el nmero de protofilamentos que constituyen sus paredes, y el sitio y momento en el cual se ensamblan los microtbulos. Adems, los COMT comparten un elemento protenico comn: un tipo de tubulina descubierta a mediados del decenio de 1980 denominado ytubulina. A diferencia de las tubulinas a y /?, que representan casi 2.5% de la protena de una clula no neural, la ytubulina slo equivale a casi 0.005% de la protena total de la clula. Se ha observado que los anticuerpos fluorescentes y-tubulina tien cualquier tipo de COMT, incluyendo el material pericentriolar de los centrosomas (fig. 9-25, a), lo que sugiere que la y-tubulina es un componente vital para el ensamblado de microtbulos. Esta conclusin se apoya en otros estudios. Por ejemplo, la microinyeccin de anticuerpos anti y-tubulina a una clula viviente impide el en-

Centrosoma Ncleo

*
lOpm

(b)

FIGURA 9-22. Demostracin experimental de la nucleacin del microtbulo en el centrosoma. a) Micrografa de fluorescencia de un fibroblasto cultivado expuesto a colcemida para efectuar el desensamblado de los microtbulos de la clula y luego se permiti su recuperacin durante 30 minutos antes del tratamiento con anticuerpos fluorescentes y antitubulina. La estructura brillante como estrella marca el centrosoma, un centro organizador de microtbulos (COMT) a partir del cual se ensamblaron nuevos microtbulos ha empezado a desarrollarse en todas direcciones, b) Diagrama del crecimiento nuevo de microtbulos mostrando la adicin de subunidades en el extremo ms del polmero, lejos del centrosoma. (a: Segn Manj Osboru y Klaus Weber, Proc. Nati Acad. Sci. U.S.A. 73:869, 1976.)

340

CAPITULO 9 Ciloescjudeto y motilidad-celular

samblado de microtbulos luego de la despolimerizacin por frmacos o temperaturas fras. De manera similar, las clulas de hongos genticamente manipuladas para que no sintezen y-tubulina tambin son incapaces de ensamblar microtbulos normales. Se asume que la y-tubulina es un elemento clave en la nucleacin de microtbulos, tal vez porque forma una "plantilla" de forma anular sobre la cual se ensamblan los dmeros //5-tubulina (como en la figura 9-25, b).

Propiedades dinmicas de los microtiibulos

Aunque los microtbulos morfolgicamente parecen muy similares, cualquiera que sea su localizacin dentro de la clula, hay diferencias notables en la estabilidad de estos polmeros. Los microtbulos del huso mittico o del citoesqueleto son sumamente lbiles, o sea, susceptibles de destruccin. Los microtbulos de neuronas maduras son mucho menos lbiles, en tanto que los de cilios y flagelos son muy estables. Las clulas vivientes pueden someterse a gran variedad de tratamientos que provocan desensamblado de los microtbulos citoesquelticos sin interferir con la mayor parte de las otras estructuras celulares. Estos tratamientos incluyen temperaturas fras; presin hidrosttica; concentracin elevada de Ca2+, y empleo de varas sustancias qumicas, incluyendo colquicina, vinblastina, vincristina, nocodazol y podofilotoxina. El frmaco taxol interrumpe las actividades dinmicas de os microtbulos por un mecanis-

FIGURA 9-23. Centro organizador de microtbulos de una clula de levadura. El centro primario de organizacin de microtbulos de las clulas micticas es un huso de forma discoide con un corpsculo en un polo integrado en la envoltura nuclear. Los microtbulos del huso mittico se pueden observar emergiendo del corpsculo situado en el polo del huso y penetrando al ncleo. Los microtbulos citoesquelticos son nucleados en la superficie externa del corpsculo del polo del huso. (Cortesa de ]ohn Kilmartin.)

4 pm

FIGURA 9-24. Centro organizador de microtbulos de una clula vegetal, a) Localizacin de los microtbulos de una clula de la endosperma Haenianthus durante la interfase (entre las divisiones mitticas). Se observan los microtbulos que emanan de la superficie del ncleo. b) La misma clula observada en a teida con un anticuerpo dirigido contra cer^rosomas purificados de ternera. La superficie externa del ncleo de la clula vegetal aparece con un brillo fluorescente que indica la presencia < T e protenas homologas a las de los centrosomas de la clula animal. (Cortesa de Anrte-Marie Lambert.)

CAPITULO 9 Citoesqueleto y motiUdad celular

341

(a)

(b)

FIGURA 9-25. Papel de la y-tubulina en la funcin del cenrrosoma. a) Fibroblasto en divisin con doble tincin con anticuerpos contra ytubulina (rojo) y /3-tubulina (verde). El color naranja se debe a la coincidencia de dos tipos de tubulina que se presentan en los dos centrosornas localizados en polos opuestos de una clula en divisin, b) Modelo de la funcin de la y-tubulina en el cual un anillo de molculas de y-tubulina en el COMT sirve para nuclear el ensamblado de microtbulos. La nucleacin se inicia conforme las subunidades/3-tubulina de los heterodmeros a//3 se unen a la y-tubulina enlazada al centro organizador de microtbulos. Esto determina la orientacin de los dmeros de tubulina en protofilamentos y por lo tanto define la polaridad del rnicrotbulo. (a: Cortesa de M. Kaiherine ung y Berl R. Oakley; b: segn B.R. Oakley, Trends Cell Biol. 2:1, 1992.)

mo muy diferente; se enlaza al polmero del microtbulo y evita su desensamblado. La labilidad de los microtbulos refleja que son polmeros originados por asociaciones no covalentes de los bloques dimricos de construccin. Los tratamientos mencionados antes destruyen los microtbulos causando su despolimerizacin. Esta facilidad para despolimerizarse revela el potencial de los microtbulos del citoesqueleto de una clula viviente para sufrir cambios dinmicos en su estado de organizacin estructural. Los microtbulos del citoesqueleto en general estn sujetos a despolimerizacin y repolimerizacin conforme cambian las necesidades de la clula de un momento a otro. Este ciclo de desensamblado y reensamblado puede observarse fcilmente en clulas cultivadas. Durante la interfase (periodo del ciclo celular entre dos divisiones mitticas), la mayor parte de las clulas del cultivo se encuentran firmemente fijas al fondo del plato de cultivo y poseen un citoesqueleto microtubular altamente organizado del tipo que se muestra en la figura 9-11. Conforme la clula se prepara para entrar en mitosis, una onda de desensamblado recorre sus microtbulos citoesquelticos, la clula retorna a su forma esfrica y pierde su fijacin al sustrato, con formacin simultnea del huso mtco. A continuacin, luego de la mitosis, el desensamblado del aparato mittico va seguido por el reensamblado de los microtbulos citoesquelticos y el aplanamiento de la clula contra la superfice del plato. Estos cambios espectaculares

en la organizacin espacial de los microtbulos se logran sin destruccin o sntesis de subunidades de tubulina. Ms bien, los microtbulos que constituyen el citoesqueleto se forman con las mismas subunidades que pocos minutos antes eran parte del huso mittico. Se podra hacer una analoga con la demolicin de un viejo edificio de ladrillos, donde luego se utilizan los mismos ladrillos para construir un nuevo edificio, todo en cuestin de pocos minutos. La rpida conversin de un tipo de estructura microtubular en otro ilustra la naturaleza dinmica de estos organelos, pero se puede lograr una perspectiva an ms clara mediante microinyeccin de tubulina marcada en una clula cultivada fuera de su etapa de divisin. Las subunidades marcadas se incorporan rpidamente a los microtbulos preexistentes del citoesqueleto, incluso en ausencia de una redisposicin de las estructuras (fig. 9-26). Cuando se observa al microscopio de fluorescencia durante cierto tiempo una clula que contiene microtbulos fluorescentes, se puede observar directamente el carcter dinmico de estos polmeros (fig. 9-27). En todo momento algunos microtbulos crecen en longitud, en tanto que otros se encogen. Si se contina la observacin de microtbulos individuales, se notar que su longitud aumenta o disminuye al azar entre las fases de crecimiento y encogimiento. Puesto que el encogimiento es ms rpido que el alargamiento, con el tiempo desaparecen la mayor parte de los microtbulos de la clula y se reubican en nuevos microtbulos que crecen por fuera del centrosoma. Este comportamiento de los microtbulos,

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CAPTULO 9 Citoesqueleto y motilidad celular

FIGURA 9-26. Dinmica del microtbulo en las clulas vivientes. A este fibroblasto cultivado se le inyect un pequeo volumen de tubulina unida mediante enlaces covalentes a biotina, una molcula pequea cuya localizacin en la clula se puede determinar con facilidad empleando anticuerpos fluorescentes antibiotina. Cerca de un minuto despus de la inyeccin, las clulas se fijaron y se determin la localizacin de la tubulina biotinilada incorporada en los microtbulos insolubles. De esta micrografa fluorescente es evidente que incluso durante periodos tan breves como un minuto, las subunidades de tubulina se incorporan ampliamente a los extremos en crecimiento de los microtbulos citoesquelticos. (Segn Marc Kirschner, J. Cell Biol. 102, cover # 3, 1986, con permiso de Rockefeller University Press.)

de alternar hacia adelante y atrs entre las fases de crecimiento y acortamiento, se describe como inestabilidad dinmica. La inestabilidad dinmica conduce a un rpido intercambio entre subunidades de tubulina y polmeros. El continuo desensamblado y reensamblado de los microtbulos permite a las clulas responder con prontitud a cualquier situacin o participar en toda actividad que requiera remodelar la estructura del citoesqueleto. Las subunidades se incorporan a un microtbulo por adicin en los extremos del polmero. Cuando se observan polmeros in vitro, se nota que crecen o se encogen por cambios en cualquiera de sus extremos, aunque tanto el ensamblado como el desensamblado pueden ocurrir con mayor rapidez en el extremo ms. Sin embargo, la observacin de clulas vivientes sugiere que el crecimiento y encogimiento in vivo ocurren de manera predominante en el extremo ms del polmero, el extremo opuesto al centrosoma (u otro centro organizador de microtbulos). El conocimiento de los factores que pueden influir en las tasas de crecimiento y acortamiento del microtbulo proviene principalmente de estudios de polimerizacin y despolimerizacin de microtbulos in vitro. Factores que influyen en el ensamblado y desensamblado La primera tcnica con xito para ensamblar microtbulos in vitro fue desarrollada en 1972 por Richard Weisenberg,

de la Temple University. Asumiendo que un homogeneizado de clulas debe poseer todas las macromolculas requeridas para el proceso de ensamblado, Weisenberg logr polimerizar tubulina en homogeneizados de cerebro a 37C aadiendo Mg2+, GTP y EDTA (que se enlazan a Ca2+, un inhibidor de la polimerizacin). Weisenberg observ que los microtbulos podan desensamblarse y reensamblarse una y otra vez con slo descender y elevar la temperatura de la mezcla de incubacin. La figura 9-28 muestra tres microtbulos ensamblados en un tubo de ensaye a partir de tubulina purificada. Se puede notar que uno de los tres microtbulos slo contiene 11 protofilamentos (segn indica su fino dimetro). No es raro que los microtbulos ensamblados in vtro posean un nmero anormal de protofilamentos. Se puede incrementar mucho el ensamblado de microtbulos in vitro aadiendo pedazos de microtbulos o estructuras que contengan microtbulos (fig. 9-29) que actan como semillas para la adicin de subunidades libres. Los primeros estudios in vitro establecieron que se requiere GTP para el ensamblado de microtbulos. El ensamblado de los dmeros de tubulina requiere la unin de una molcula de GTP a la subunidad /3-tubulina.2 No se necesita la hidrlisis de GTP para la verdadera incorporacin del dmero al extremo de un microtbulo. Ms bien, el GTP se hidroliza a GDP poco despus que el dmero se incorpora al microtbulo y entonces el GDP permanece enlazado al polmero ensamblado (fig. 9-30, a). Cuando un dmero de un microtbulo se libera durante el desensamblado y entra a la reserva soluble, el GDP intercambiable es sustituido por un nuevo GTP. Este intercambio de nucletidos "recarga" el dmero y le permite servir una y otra vez como bloque de construccin para un microtbulo. El ensamblado de un microtbulo requiere la hidrlisis de GTP, y por lo tanto no es una actividad celular sin costo. Por qu evolucion una va de polimerizacin tan costosa? La respuesta ms probable es que permite a una clula controlar la velocidad de reacciones opuestas, ensamblado y desensamblado, de manera independiente. Un dmero que se va aadiendo a un microtbulo se encuentra enlazado a GTP, en tanto que el dmero que se libera del microtbulo se halla unido a GDP. Estos dos tipos de subunidades poseen conformacin diferente y por lo tanto distinta afinidad para otras subunidades del microtbulo. Los dmeros de tubulina y GTP muestran mayor afinidad entre s que los dmeros de tubulina y GDP. Como resultado, sera de esperar que la presencia de tubulina y GTP en el extremo de un protofilamento favoreciera la fijacin de otra tubulina y GTP, en tanto que la presencia de un dmero de tubulina y GDP en esa posicin favorecera su liberacin del microtbulo. Recordemos que la hidrlisis del GTP se retrasa un poco respecto de la incorporacin de la sububnidad. Por lo tanto, durante momentos de rpido crecimiento del microtbulo, los dmeros de tubulina se aaden con mayor rapidez que

2 Tambin se une una molcula de GTP a la subunidad a-tubulina, pero no es intercambiable ni se hidroliza despus de la incorporacin de la subunidad, y no la consideraremos ms.

343

FIGURA 9-27. Inestabilidad dinmica, ac) Estas fotografas y los diagramas que las acompaan ilustran los cambios de longitud de los microtbulos individuales dentro de las clulas vivientes. Las clulas fueron inyectadas con tubulina marcada con rodamina y se sigui la fluorescencia con videomicroscopia. Se produjo una marca de referencia a travs de los microtbulos mediante fotoblanqueamiento. Durante el periodo de observacin (indicado en la parte superior derecha de los dibujos), el extremo del microtbulo 1 se encoge y luego crece con respecto de su dominio blanqueado, el microtbulo 2 creci, y el microtbulo 3 creci y luego se encogi. Los cambios de longitud se deben a la ganancia y prdida de subunidades distales al dominio blanqueado sobre cada microtbulo. Estas fotografas ilustran la inestabilidad dinmica de los microtbulos. Barra, 3 /m. (Segn Paul }, Saimnak y Gary C. Borisy. Reimpreso con permiso de Nature 332:725, 198S; copyright 1988, Macminn Magazines Ltd.)

c'l

MGI1I14 9-28. Microtbulos ensamblados en el tubo de ensaye. Micrografa electrnica de microtbulos congelados no fijados polimerizados in vitro. Se observan subunidades individuales de tubulina globular, y los protofilamentos verticales dentro de los cuales se organizan las subunidades. Ntese que la porcin media de los tres microtbulos slo contienen 11 protofilamentos. (Cortesa de R.H. Wade, Institus de Biologie Structuraie, Grenoble, Frauda.)

FIGURA 9-29. Ensamblado de la tubulina sobre estructuras microtubulares existentes. Micrografa electrnica mostrando el ensamblado in vitro de tubulina cerebral sobre los extremos de los microtbulos de un axonema del flagelo de Chlannjdomonas. (Cortesa de LL Binder y Jod L, Rosenbaum.)

344 1

CAPITULO 9 Citoesqueleto \j motilia celular 2 3 4 2 3 4 5

5 6

= GDP-Tubulina

- GTP-Tubna

FIGURA 9-30. Ensamblado de microtbulos. a) Heterodmeros de tubulina aadidos al extremo en crecimiento de un microtbulo que contienen GTP que se hidroliza poco tiempo despus de su incorporacin, b) Durante los periodos de rpido crecimiento del microtbulo se cree que el extremo de ste acumula subunidades de tubulina que contienen GTP enlazado, que favorece un ensamble adicional del polmero en vez del desensamblado.

la hidrlisis de su GTP. La presencia de una cubierta de dmeros de tubulina y GTP de alta afinidad en los extremos de los protofilamentos debe favorecer la adicin de ms subunidades y el crecimiento del microtbulo (fig. 9-30, b). En contraste, cuando la velocidad de hidrlisis de GTP conserva el paso con la tasa de la adicin de subunidades, se favorece el encogimiento del polmero en vez de su crecimiento. El acortamiento de los microtbulos puede ocurrir con notable rapidez, lo que permite a una clula desensamblar su citoesqueleto microtubular a gran velocidad y anticiparse a un cambio en la actividad biolgica. En la pgina 331 se mencion que ciertas protenas relacionadas con microtbulos (PRM) incrementan la estabilidad del polmero. Las PRM pueden actuar ayudando en la etapa de nucleacin o bloqueando la liberacin de subunidades de los extremos del polmero. Los cambios de concentracin de las PRM o de su estado de fosforilacin quiz tengan mayor impacto sobre el equilibrio entre ensamblado y desensamblado de los microtbulos. Se cree que los diferentes tipos de microtbulos en una clula (p. ej., microtbulos del huso en comparacin con los del citoesqueleto o los microtbulos ciliares) que contienen diferentes PRM, pueden ayudar a la clula a ensamblar un tipo en tanto desensamblan otro tipo diferente. Los microtbulos ms estables se presentan en cilios y flagelos, lo cual es el tema de la siguiente seccin.

miento. Un cilio por lo general puede compararse con un remo cuando la clula se mueve en direccin perpendicular al propio cilio. Durante su latido de potencia, el cilio se mantiene en estado rgido (fig. 9-31, a) conforme empuja contra el medio que lo rodea. En su latido de recuperacin, el cilio se torna flexible y ofrece poca resistencia al medio. Los cilios tienden a presentarse en gran nmero sobre la superficie de una clula y de ordinario su actividad est coordinada (fig. 9-31, b). En organismos multicelulares, los cilios se utilizan para desplazar lquido y partculas materiales a travs de diferentes conductos (fig. 9-31, c). Por ejemplo, en el hombre, el epitelio ciliado que reviste el conducto respiratorio impulsa hacia afuera de los pulmones el moco y los desperdicios atrapados. En condiciones tpicas, los flagelos son ms largos que los cilios y se presentan en menor nmero sobre la superficie de una clula (fig. 9-32, a). A diferencia de los cilios, el latido de un flagelo es ondulatorio (fig. 9-32, b), con varias ondas presentes en cada momento a lo largo del flagelo (fig. 9-36). El latido de un flagelo genera una fuerza que impulsa hacia adelante o arrastra una clula en direccin paralela al eje longitudinal del flagelo. En organismos multicelulares, los flagelos se presentan principalmente en la cola del espermatozoide, donde su movimiento impulsa a la clula reproductiva hacia la superficie del vulo. Estructura de cilios y flagelos Una micrografa electrnica de la seccin transversal de un cilio o de un flagelo es una de las imgenes ms familiares en biologa celular (fig. 9-33, a). Toda la extensin del cilio o del flagelo est cubierta por una membrana que se contina con la membrana plasmtica de la clula. El centro del cilio, denominado axonema, contiene disposicin de microtbulos que corren longitudinalmente a travs de todo el organelo. En casi todos los casos, el axonema consta de nueve microtbulos perifricos dobles. Todos los microtbulos del axonema tienen la misma polaridad: su extremo ms se encuentra en la punta de la prolongacin y su extremo menos en la base. Cada doblete perifrico consta de un microtbulo completo, tbulo A, y un microtbulo incompleto, tbulo B, que contienen 10 a 11 subunidades en vez de las 13 habituales.

Cilio y flagelos: estructura y funcin

Quienquiera que observe una gota de agua de un estanque con un microscopio e intente evitar que un protozoario se aleje nadando del campo del microscopio, apreciar la actividad de cilios y flagelos. Cilios y flagelos son organelos movibles en forma de pelos proyectados desde la superficie de gran variedad de clulas eucariotas. Tambin las bacterias poseen estructuras conocidas como flagelos, pero los flagelos de los procariotes son simples filamentos sin relacin evolutiva con su contraparte de los eucariotes. El siguiente anlisis slo se refiere a organelos de eucariotes. Cilios y flagelos son dos versiones de la misma estructura que pueden distinguirse mejor por su patrn de movi-

CAPITULO 9 Citoesqueleto y motilidad celular

345

La estructura bsica del axonema fue descrita por primera vez en 1954 por Don Fawcett y Keith Porter, de la Universidad de Harvard. Conforme mejor la resolucin del microscopio electrnico algunos elementos menos evidentes se hicieron visibles (fig. 9-33, b). Se observaron tbu!os centrales incluidos dentro de prolongaciones que forman la vaina central, conectada a los tbulos A de los dobletes perifricos mediante un conjunto de rayos radiales. Los dobletes se conectan entre s por un puente interdoblete compuesto de una protena elstica, la nexina. De particular importancia fue la observacin de que un par de "brazos", un brazo interno y un brazo extemo, se proyectan desde el tbulo A en direccin de antergrada (cuando se observa el cilio desde la base hacia la punta). Un corte longitudinal, o sea una seccin a travs del axonema paralela a su eje longitudinal, revela la naturaleza continua de los microtbulos y la naturaleza discontinua de los otros elementos (fg. 9-34, a). Los rayos radiales, por ejemplo, ocurren tpicamente en grupos de tres repetidos cuando mucho a 96 nm (fig. 9-34, b). La misma disposicin de 9 + 2 se observa en cilios y flagelos de prcticamente todos los organismos eucariotas, desde hongos hasta seres humanos, otra de las muchas observaciones que nos recuerdan la unidad de la vida. Aunque el patrn 9 + 2 se conserva insistentemente, hay varias desviaciones evolutivas notables de este modelo estructural. Por ejemplo, en los platelmintos se observa un patrn de 9 + 1, y en el cangrejo herradura asitico, la anguila y los insectos del gnero Plectophora un patrn 9 + 0. Algunos flagelos que carecen de elementos centrales son movibles y otros no lo son. Como se mencion en la pgina 339, un cilio o un flagelo surgen de un corpsculo basal (fig. 9-35) cuya estructura es comparable al centrolo de la figura 9-21. Igual que un cilio o un flagelo, un corpsculo basal contiene nueve fibras perifricas, pero cada una consta de tres microtbulos en vez de dos. El tbulo A est completo, en tanto que los tbulos B y C ambos son incompletos. No hay microtbulos centrales en el corpsculo basal ni en el centrolo. Los tbulos A y B del corpsculo basal se alargan para formar los dobletes del cilio o del flagelo (fig. 9-35). Cuando se secciona un cilio o flagelo de la superficie de una clula viviente, se regenera un nuevo organelo como excrecencia del corpsculo basal.
Brazos de tlineina

Direccin del desplazamiento

Golpe de potencia

Golpe de recuperacin

(a)

10 j.un

El mecanismo para la locomocin de cilios y flagelos reside por completo en el axonema, segn se manifiesta en experimentos donde se cortan cilios de su conexin con la clula y

FIGURA 9-31. Latido ciliar, a) Diferentes etapas en el latido de un cilio, b) Los cilios sobre la superficie de un protozoario ciliado laten siguiendo ondas metacronales en las cuales los cilios de una hilera dada se encuentran en la misma etapa del ciclo, pero los de hileras adyacentes se encuentran en etapas diferentes. RS, cilio en recuperacin luego del latido; ES, cilio en latido de potencia eficiente, c) Cilios sobre la superficie del labio (fimbria) del oviducto del ratn, (b: Reimpreso con permiso de G.A. Horrdge y S.L. Tamm, Science 163:818, 1969, copyright 1969 American Association for the Advancement of Science; c: cortesa de Eilen R. Dirksen.)

3,5 pm

346

CAPITULO 9 Citoesgueleto y motilidad celular

Direccin del desplazamiento

50 nm

FIGURA 9-32. Flagelo eucariote. a) Alga biflagelada unicelular, Chlarmjdamonas reinhardtii. Los dos flagelos aparecen de color verde debido al anticuerpo fluorescente dirigido contra una de las principales protenas de membrana flagelar. El color naranja resulta de la autofluorescencia de la clorofila de la clula, b) Etapas en el latido de un flagelo, (a: Cortesa de Robert A. Bloodgood.)

Membrana plasmtica

Brazo interno de dinena

Brazo externo de dinena

Vaina central

se disuelve su membrana superficial. El axonerna restante todava puede generar latidos rtmicos cuando se aaden Mg 2+ y ATP (fig. 9-36). Cuanto mayor sea la concentracin de ATP, mayor ser la frecuencia del batir de estos organelos "reactivados". La protena encargada de convertir la energa qumica del ATP en energa mecnica para la locomocin ciliar fue aislada en el decenio de 1960 por lan Gibbons, de la Universidad de Harvard. Estos experimentos suministran un elegante ejemplo de la relacin entre estructura y funcin en sistemas biolgicos y los mtodos para mostrar esta relacin mediante anlisis experimental. Empleando soluciones capaces de solubilizar diferentes componentes, Gibbons pudo efectuar una diseccin qumica de los cilios del protozoario Tetrahymena (fig. 9-37). En el paso 1 se muestra un axonema intacto. La diseccin de la membrana que envuelve el axonema se efectu disolviendo la membrana con el detergente digitonina (paso 2). Los axonemas aislados se disecaron posteriormente sumergindolos en solucin con EDTA, un compuesto que se enlaza a iones divalentes (qudalos) y los elimina. Cuando se examinaron en el microscopio electrnico los axonemas tratados con EDTA, los tbulos centrales haban desaparecido, igual que los brazos que se proyectaron desde los tbulos A {paso 3). Simultneamente con la prdida de estas estructuras, los axonemas pierden su capacidad para hidrolizar ATP, en tanto que el sobrenadante adquiere esa capacidad. La ATPasa extrada de los axonemas fue una prote-

Tbulo B Doblete exterior Tbulo A Farde microtbulos centrales

Puente de nexina

Espiga radial

(b)
FIGURA 9-33. Estructura de un axonema ciliar o flagelar, a) Seccin transversal a travs del axonema de un espermatozoide fijado en una solucin que contiene cido tnico, que suministra un contraste negativo permitiendo la resolucin de subunidades del microtbulo. 9e observan los dobletes perifricos que consisten en un microtbulo completo y uno incompleto, en tanto que los dos microtbulos centrales estn completos. Los brazos de dinena se observan como prolongaciones "vellosas" desde la pared del microtbulo completo. b) Diagrama de un axonema que muestra la estructura de las fibras micro tubulares, los dos tipos de brazos de dinena (brazos externos de tres cabezas y brazos internos de dos cabezas), los enlaces de nexina entre los dobletes, la vaina central que rodea los microtbulos centrales y los rayos radiales que se proyectan desde los dobletes externos hacia la vaina central, (a: Cortesa de Leais G. Tney y K. Fujiwara.)

na enorme (ms de dos millones de daltons) a la cual se dio el nombre de dinena, y en la actualidad se conoce como dinena ciliar para distinguirla de la dinena citoplsmca,

CAPITULO 9 Citocscfuelcto y molidad celular

347

FKilJRA 9-34. Vista longitudinal de un axonema. a) Micrografa electrnica de una seccin longitudinal media de una regin recta de un cilio. Los rayos radiales se observan uniendo la vaina central con el microtbulo A del doblete situado a la derecha. Estos rayos se sitan en grupos de tres. b) Diagrama de una seccin longitudinal del doblete flagelar. Los radios emergen en grupos de tres, que se repiten {a 96 nm en este caso) a lo largo del trayecto del microtbulo. Los brazos externos de dinena estn espaciados a intervalos de 24 nm. (a: Segn Fred D. Warner y Peter Salir,}. Cell Biol. 63:41, 1974; con permiso de Rockefeller University Press.)

24 nm 24 nm

32 nm

40 nm

24 nm

(a)

50 nm

(b)

protena relacionada que participa en el transporte de organelos (pg. 336). Cuando se mezclaron las partes insolubles del axonema con la protena insoluble en presencia de Mg2+, gran parte de la actividad ATPasa se relacion, una vez ms, con el material insoluble de la mezcla (paso 4). El examen de los axonemas despus de mezclarse con dinena y Mg2+ demostr que los brazos haban reaparecido sobre los tbulos A. Gibbons concluy que los brazos observados en una seccin transversal de los cilios contienen ATPasa que participa en la utilizacin de la energa y, presumiblemente, es requerida para la locomocin. En investigaciones subsecuentes se observ que el tratamiento de axonemas aislados del espermatozoide con solucin salina concentrada {0.6 M NaCl) elimina selectivamente los brazos externos y deja los brazos internos en su sitio (paso 5). Cuando se aadi ATP a los axonemas que carecen de brazos externos, latieron a una velocidad equivalente a casi la mitad del axonema intacto, aunque muestran ondas de forma normal. Este dato sugiere que cada

hilera de brazos genera casi la mitad de la fuerza empleada para el movimiento. El examen con microscopio electrnico de los brazos externos liberados por la solucin salina concentrada mostr que contienen tres cabezas globulares unidas por delgados tallos a una base comn (fig. 9-38, a). Cada cabeza es un puente transversal del tipo ilustrado en la figura 9-38, b, que hidroliza ATP. En el axonema intacto, la base de la protena est firmemente unida a la superficie exterior del tbulo A con las cabezas globulares proyectadas hacia el tbulo B del doblete vecino (fig. 9-39). Los brazos internos, extrados posteriormente empleando procedimientos ms burdos, pertenecen a tipos distintos, algunos con tres cabezas globulares que recuerdan los brazos externos y otros slo contienen dos cabezas.
Mecanismo de locomocin de cilios y flagelos

Segn se analizar posteriormente en este captulo, el acortamiento del tejido muscular se debe al deslizamiento de

348

CAPITULO 9 Citoescjueleto y motilidad celular

Cilio Microtbulo central Vaina centra! Rayo radial Doblete . exterior

Corpsculo basal

FIGURA 9-35. Corpsculo basal y axonemas ciliar y flagelar, a) Micrografa electrnica de una seccin longitudinal a travs de los corpsculos bsales de varios cilios en la superficie apical de clulas epiteliales del oviducto de conejo, b) Diagrama de la relacin estructural entre los microtbulos del corpsculo basal y el axonema de un cilio o de un flagelo, (a: Cortesa de R.G.W. Anderson.)

filamentos de actina a lo largo de filamentos adyacentes de miosina mediante fuerzas generadas por un puente transverso parecido a una cremallera residente en la cabeza de la molcula de miosina. Tomando como modelo el sistema de actinomosina, se propuso que el movimiento ciliar poda explicarse por el deslizamiento relativo de dobletes microtubulares adyacentes. En este modelo (mostrado en la figura 9-39}, los brazos de dinena actan como puentes transversales que al retorcerse generan la fuerza requerida para el movimiento de cilios o flagelos. El brazo de dinena del tbulo A de un doblete se fija al tbulo B del doblete vecino (paso 1, fig. 9-39) y a continuacin sufre un cambio de conformacin que provoca que el tbulo A se deslice una distancia perceptible hacia la base del tbulo B al que est fijo (paso 2). El brazo de dinena se desprende entonces del tbulo B (paso 3) y vuelve a fijarse a otro sitio para empezar un nuevo ciclo (paso 4). El deslizamiento sobre un lado del axonema alternara con el deslizamiento en el otro lado, de modo que una parte del cilio o del flagelo siempre se inclina en una direccin y luego en la direccin opuesta (fig. 9-40). Los datos de investigacin acumulados continan apoyando la teora del deslizamiento de los microtbulos y el papel de los brazos de dinena. Charles Brokaw, del California Institute of Technology, logr observar directamente el deslizamiento de los microtbulos en axonemas flagelares en accin. En estos estudios se denudaron axonemas aislados de su membrana y se incubaron con diminutas esferitas doradas que se fijan a la superficie externa expuesta de los

dobletes perifricos. Las esferitas actuaron como marcadores fijos sobre sitios especficos de los dobletes (fig. 9-41). A continuacin se observ la posicin relativa de las esferitas en tanto se estimul la actividad de los axonemas aadiendo ATP. Conforme el axonema se desplazaba hacia atrs y adelante, la distancia entre las esferitas de diferentes dobletes aument y disminuy de manera cclica, como sera de esperar si dobletes vecinos se deslizaran hacia arriba y hacia abajo uno sobre otro. Para que el deslizamiento de los microtbulos incline el cilio o el flagelo, alguna parte del axonema debe ofrecer resistencia al deslizamiento. De otro modo, las fibras simplemente se deslizaran hacia adelante sin causar inclinacin. Los rayos radiales, los enlaces entre dobletes, o ambos, probablemente suministren la resistencia. Experimentos in vitro apoyan la existencia de una estructura que resiste el deslizamiento en el axonema. Cuando se incuban con ATP axonemas aislados, ocurren movimientos normales. Si se trata primero a estos axonemas con la enzima proteoltica tripsina en condiciones leves, slo suficientes para destruir la integridad de los rayos radiales y de las fibras entre los dobletes, el axonema se desintegra al aadir ATP. Utilizando un microscopio de luz equipado con iluminacin en campo oscuro se puede observar el movimiento de los dobletes separndose entre s (fig. 9-42). Cuando los rayos o los interdobletes no oponen resistencia ya no se observa la actividad deslizante y los dobletes simplemente pasan uno sobre otro hasta separarse por completo.

CAPITULO 9 Ctoesqueleto y motilidad celular

349

Pellet
(contiene axonemas con actividad ATPasa}

Pellet (contiene axonema con brazos exteriores suprimidos)

Sobrenadante (contiene brazos externos)

Incubacin con EDTA

20 pm

FIGURA 9-36- Espermatozoide del erizo de mar reactivado con 0.2 mM de ATP luego de la desmembranacin con el detergente Tritn X-100. Esta microfotografa de mltiples exposiciones se obtuvo con cinco destellos (flash) de luz y muestra el flagelo reactivado en diferentes etapas de su latido. (Segn Charles ]. Brokaw y T.F. Simonick, J. Cell Biol. 75:650, 1977, con permiso de RockefeUer University Press.)

Sobrenadante (contiene ATPasa solubilizada)

CDCP
Pellet {contiene fibras exteriores

Regulacin de la locomocin ciliar y flagelar Considerando que los cilios laten 10 a 40 veces por segundo, que cada latido tiene una orientacin precisa y que este movimiento de ordinario es coordinado de modo que miles de cilios actan en conjunto para producir el movimiento deseado, es claro que este tipo de actividad locomotora debe estar estrechamente regulada. Es digno de mencionar que cilios y flagelos aislados mantienen prcticamente su manera normal de latir, por lo tanto el propio organelo debe manejar gran parte de la coordinacin. La propagacin de una onda de inclinacin de los cilios a lo largo del axonema implica la unin y separacin cclica de cientos de brazos, lo que constituye una notable proeza. Se han observado dos factores que influyen en la velocidad y orientacin de los latidos ciliares o flagelares; estos son los iones Ca2+ y el AMP cclico (AMPc). La accin de estos dos mensajeros qumicos (vase captulo 15) se puede ilustrar con el protozoario ciliado Paramecium. Este ciliado normalmente nada hacia adelante. Cuando encuentra un objeto en su camino, la direccin de los movimientos ciliares se invierte por s sola (o sea, el golpe de poder se ejerce en la direccin opuesta), el ciliado nada hacia atrs y gira cambiando de direccin (fig. 9-43). A continuacin, el ciliado inicia los latidos en una nueva direccin para avanzar hacia adelante. Este proceso contina hasta que el cilia-

RecombJnacin en presencia de Mg2"1

Gran parte de las fibras han recuperado sus brazos y se observa actividad ATPasa en la fraccin insoluble FIGURA 9-37. Etapas en la diseccin qumica del cilio del protozoario Tetrahymena. Las etapas numeradas se describen en e! texto.

do orienta sus movimientos para evitar el objeto y nadar alejndose del mismo. Mediciones electrofisiolgicas indican que el contacto del ciliado con un objeto despolariza la membrana plasmtica con la subsecuente abertura de los canales de Ca2+ operados por voltaje. La entrada de iones calcio acta (junto con el enlace del calcio a la protena calmodulina) sobre el axonema para invertir la direccin de los latidos y el "retro-

350

CAPITULO 9 Citoescjieleto y motilidad celular

Uniones a! tabulo B Cabezas

(a)

20 nm

FIGURA 9-39. Papel de los brazos de dinena para generar la fuerza que impulsa la motilidad ciliar o flagelar. Las etapas se describen en el texto.

FIftL'RA 9-38. Dinena ciliar, a) Rplica en platino de sombreado rotatorio de una molcula de dinena del brazo flagelar externo preparada por microscopa de congelacin rpida y aguafuerte profundo. Como se muestra en el dibujo acompaante, cada una de las tres cadenas pesadas forma una cabeza globular prominente con una extensin que funciona en el enlazamiento del brazo de dinena al doblete vecino, b) Mkrografa electrnica de una rplica de axonemas de Chlamydomonas preparadas mediante congelacin rpida, fractura y aguafuerte profundo. Se indica una hilera de brazos de dinena con la flecha, (a: Cortesa de ohn E. Heuser y rsula W. Goodenough; b: segn U.W. Goodenough y .E. Heuser,}. Cell Biol. 95:800, 1982; con permiso de Rockefeller University Press.)

La velocidad del movimiento hacia adelante es regulada por la concentracin de AMPc. S el ciliado encuentra un agente estimulante, como alguna sustancia qumica que lo atraiga, los canales de K + se abren y la membrana se hiperpolariza, lo cual activa la enzima (adenillciclasa) que sintetiza AMPc. La elevacin de la concentracin de AMPc desencadena la fosforilacin de ciertas protenas del axonema e incrementa la frecuencia de los latidos ciliares y acelera el movimiento hacia adelante. La aplicacin directa de Ca2+ o de AMPc a Jos axonemas desmembranados simula la conducta apropiada que muestra una clula intacta, lo que indica que los efectores de estos mensajeros qumicos forman parte de la propia estructura axonmica, pero los mecanismos detallados todava no se han dilucidado.

L Filamentos intermedios
Durante muchos aos, el microscopio electrnico revel la presencia de gran nmero de clulas con filamentos slidos no ramificados, de superficie lisa y un dimetro de 10 nm, intermedio entre los microtbulos y los micro filamentos. Dadas las dimensiones relativas de estas estructuras se les denomin filamentos intermedios (FI), Los filamentos intermedios se ramifican a travs del citoplasma de gran va-

ceso" del ciliado. El cierre de las compuertas de calcio provoca descenso de la concentracin de Ca2+ y retorno al desplazamiento hacia adelante.

CAPITULO 9 Citocsqueleto y motilidad celular

351

pptidos interactan espontneamente conforme sus barras a-helicoidales se entrelazan en una bobina enrollada para formar un dmero parecido a una cuerda de 45 nm de longitud, aproximadamente (paso 2). Los dos polipptidos se alinean paralelos entre s con la misma orientacin, por lo que el dmero presenta polaridad con un extremo definido por el C terminal de los polipptidos y el extremo opuesto por el N terminal.

Ensamblado y desensamblado de filamentos intermedios

A diferencia de los microtbulos y microfilamentos que se ensamblan siguiendo una sola va, los filamentos intermedios al parecer pueden formarse en varias vas encargadas de sintetizar filamentos de espesor y nmero de subunidades variables. Adems, el ensamblado de los FI no se acompaa de hidrlisis de nucletidos. Se cree que la unidad bsica de ensamblado es un tetrmero formado por dos dmeros que permanecen alineados lado a lado en disposicin escalonada con sus extremos N y C terminales apuntando en direccin opuesta (antiparalela), como se muestra en la figura 9-44, paso 3. Puesto que los dmeros apuntan en direccin opuesta, el tetrmero carece de polaridad. Los tetrmeros se renen en ambos lados y ambos extremos para formar intermediarios mal descritos que se ensamblan para formar el filamento final (fig. 9-44, paso 4). Como los bloques de construccin tetramricos carecen de polaridad, lo mismo ocurre con el filamento ensamblado, otra caracterstica que distingue a ios filamentos intermedios de otros elementos citoesquelticos. Igual que las fibras de colgena de la matriz extracelular, tambin compuesta de subunidades escalonadas, los filamentos intermedios son muy resistentes a fuerzas de traccin (tnsiles). La capa externa de la piel est formada por residuos de clulas epidrmicas muertas y consta casi por completo de una redecilla densa de filamentos intermedios que contienen queratina. Estos filamentos confieren a la piel su resistencia al aire, agua, bacterias y la mayor parte de las sustancias qumicas. Los filamentos intermedios tienden a ser ms estables a la fragmentacin qumica que otros tipos de elementos citoesqueltkos y ms difciles de solubiizar empleando procedimientos leves de extraccin. Sin embargo, una vez extrados los filamentos intermedios utilizando detergentes inicos, como dodecilsulfato de sodio, se pueden desp*olimerizar y repolimerizar repetidamente in vitro, lo que indica que las subunidades poseen toda la informacin necesaria para su autoensamblado. Gracias a su insolubilidad, nicialmente se pens que los FI eran estructuras permanentes invariables, por lo que fue sorpresivo observar que muestran una conducta dinmica in vivo. Cuando se inyectan subunidades de queratina marcada en clulas de piel cultivadas, rpidamente se incorporan a los FI existentes. De manera sorprendente, las subunidades no se incorporan a los extremos del filamento, como podra esperarse a partir de estudios en microtbulos y microfilamentos, sino ms bien se incorporan al interior del filamento (fig. 9-45). Al principio, los filamentos slo presentan molculas mar-

FIGURA 9-40. Mecanismo de la motilidad ciliar o flagelar mediante deslizamiento de microtbulos. Diagrama del deslizamiento uno contra otro de microtbulos vecinos. Cuando el cilio es recto, iodos los dobletes externos terminan al mismo nivel (centro). La inclinacin del cilio ocurre cuando los dobletes sobre un lado inclinado se deslizan ms all de los del otro lado (arriba y abajo). La fuerza causante del deslizamiento de microtbulos vecinos se mostr en la figura previa.

riedad de clulas animales y con frecuencia muestran un patrn espacial semejante a microtbulos con los cuales pueden conectarse (fig. 9-5). Hasta ahora, los filamentos intermedios slo se han identificado con certeza en clulas animales. A diferencia de microfilamentos y microtbulos, ios FI son un grupo de estructuras qumicas heterogneas codificadas en el ser humano cuando menos por 60 genes diferentes. Con base en su distribucin en los tejidos (cuadro 9-2) y tambin segn criterios bioqumicos, genticos e inmunolgicos, las subundades de polipptido de los FI se pueden dividir en seis clases principales. La mayor parte de estos polipptidos, si no es que todos, comparten disposicin similar de dominios que les permite formar filamentos muy parecidos. Lo ms notable es que cada polipptido contiene un dominio central -helicoidal en forma de barra de longitud similar y secuencia homologa de aminocidos. Este dominio posee a cada lado dominios globulares de tamao y secuencia variable (paso 1, fig. 9-44). Dos de estos poli-

352

CAPITULO 9 Citoescueeto y moilidad celular

6pm

FIGURA 9-41. Demostracin experimental del deslizamiento de los microtbulos. Se desmembran un espermatozoide de erizo marino y se reactiv con ATP, despus se fotografi mediante mltiples exposiciones, como en la figura 9-36. En este experimento, se unieron globulitos de oro a los dobletes de microtbulos externos expuestos, donde sirvieron como marcadores de sitios especficos a lo largo de los microtbulos. Conforme el flagelo fue latiendo se pudieron observar las posiciones relativas de los globulitos. Como aqu se muestra, los globulitos se separan y luego se vuelven a reunir a medida que e! flagelo ondula, indicando que los dobletes se deslizan hacia atrs y hacia adelante respecto uno de otro. (Segn Charles J. Brokaw, ]. Cell Biol. 114, cover #6, 1991; con permiso de Rockefeller University Press.)

cadas en sitios dispersos a lo largo de su trayecto, pero ms o menos en una hora toda la red de filamentos intermedios est marcada. Estos resultados sugieren que las clulas epidrmicas contienen una reserva de subunidades de querauna que, igual que los microtbulos y los microfilamentos, se encuentra en equilibrio dinmico con la forma polimerizada. Se obtuvieron datos similares en filamentos intermedios de neuronas. En algunas clulas tambin se puede observar la calidad dinmica de los filamentos intermedios conforme se inicia y concluye la mltosis. En este caso, los filamentos intermedios se desensamblan antes de la divisin celular y se reensamblan en las clulas hijas. En otros casos (como en las clulas epidrmicas queratinizadas), los FI permanecen polimerzados durante todo el periodo de divisin celular y simplemente se dividen junto con otros materiales del citoplasma. El ensamblado y desensamblado de algunos tipos de FI al parecer es controlado por la fosforilacin y desfosforilacin de las subunidades. Por ejemplo, la fosforilacin de las subunidades desmina y vimentina inhibe notablemente su polimerizacin en los filamentos tipo 111 (cuadro 9-2).

Tipos y funciones de los filamentos intermedios Los filamentos intermedios observados en clulas epiteliales (incluyendo clulas epidrmicas, hepatocitos y clulas acinares pancreticas) se componen de dos tipos de queratina: tipo I (acida) y tipo II (neutra y bsica). Se han identificado unos 15 miembros de cada tipo de queratina. Los filamentos intermedios queratinizados siempre constan de he'tero di meros que contienen un miembro de cada tipo de polipptido de queratina. Los filamentos de queratina de las clulas epiteliales forman una elaborada red semejante a una canasta que rodea al ncleo y se ramifica a travs del citoplasma (fig. 9-46). Muchos filamentos terminan en placas citoplsmicas de los desmosomas y hemidesmosomas que fijan estas clulas a otras clulas y a la membrana basal subyacente (pgs. 251 y 258). Adems de microtbulos y microfilamentos, el citoplasma de las neuronas se encuentra lleno de haces de filamentos intermedios laxamente empacados cuyos ejes largos se orientan en forma paralela al axn de la clula nerviosa (fig. 9-16). Estos filamentos intermedios, o murofilamentoscomo

CAPITULO 9 Citoesqueleto y motitidad celular

353

FIGURA 9-43. Conducta de prueba y error de Paramecium. Cuando el ciliado encuentra en su camino un objeto, los latidos de sus cilios se invierten y el organismo nada hacia atrs, luego gira aproximadamente 30 y nada hacia adelante otra vez. La maniobra se repite hasta que el camino est despejado. El mecanismo causante de esta respuesta se analiza en el texto.

FIGURA 9-42. Demostracin experimental de la presencia de un elemento protenko en el axonema que se opone al deslizamiento. Micrografa en campo oscuro de axonemas sujetos a tratamiento proteoltico leve y luego reactivados mediante incubacin con ATP. Se muestran dos axonemas donde se alarg varas veces su longitud normal debido al deslizamiento de dobletes externos que pasan uno sobre otro. (Segn George B. Witman, }. Plummer y G. Sander, J. Cell Biol. 76:743, 197S; con permiso de Rockefeller University Press.)

se les denomina, se componen de por lo menos tres tipos distintos de protenas (NF-L, NF-H y NF-M, todas del grupo tipo IV del cuadro 9-2) que se copolimerizan para formar el filamento intacto. Esta red de neurofilamentos tal vez constituya el principal componente del armazn es*ructural que apoya a los largos axones de una extensa neurona mielinzada.

Los intentos para demostrar las funciones de los diferentes tipos de filamentos intermedios no siempre han sido satisfactorios. En algunos de (os primeros estudios, se inyectaron anticuerpos contra protenas de filamentos intermedios en clulas cultivadas provocando una desorganizacin espectacular de la disposicin normal de los FI, sin causar incapacidad fisiolgica alguna evidente en las clulas tratadas. Esta observacin, junto con el hecho de que los filamentos intermedios al parecer estn ausentes en clulas vegetales, protistas y algunas clulas animales, sugiere que los filamentos intermedios no participan en procesos esenciales, como la mitosis y la citocinesis. En vez de ello, se concluy que los FI proporcionan estabilidad mecnica a las clulas y realizan funciones especializadas en tejidos especficos. Los recientes esfuerzos para conocer la funcin de los filamentos intermedios se apoyan en ratones manipulados con ingeniera gentica que producen polmeros FI alterados o mayores cantidades que lo normal del polipptido de filamentos intermedios normal. Aunque estos estudios no aclaran necesariamente el papel preciso de los filamentos intermedios, ilustran la importancia de estas estructuras para la viabilidad de las clulas. Los ratones transgnicos que producen polipptdos de queratina alterada pueden mostrar problemas graves de salud. Por ejemplo, los ratones con prdida del gene que codifica K14, un tipo de polipptido I sintetizado normalmente por clulas de la capa epidrmica basal, son tan sen-

354

CAPITULO 9 Citoesjueleto y motilidad celular

CUADRO 9-2. Propiedades y distribucin de las principales protenas filamentosas intermedias de mamfero
Protena FI Tipo de secuencia Peso molecular promedio (x IO~3J 40-56.5 53-67 Nmero estimado de polipptidos Distribucin primaria del tejido

Queratina Queratina Vimentina Desmina Protena acida fibrilar glial (PAFG) Peri ferina Protenas neurofilamentosas
NF-L

I II III III III III IV IV IV V V V VI

57
53-54

50 57 62 102 110 70 67 60 240

15 15 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Epitelio Epitelio Clulas mesenquimatosas Msculo Clulas guales y astrocitos Neuronas perifricas Neuronas de nervios perifricos y centrales

NF-M NF-H Protenas laminina Laminina A Laminina B Laminina C Nestina

Todo tipo de clula (Envolturas nucleares)

Clulas de estirpe neuronal

Adaptado de Kathryn Albers y Elaine Fuchs, Int. Rev. Cytol. 134:244, 1992.

NH2 C NH2

COOH
^>

Monmero

COOH

NH,
NH?
Cimero

COOH

COOH

COOH

COOH

NH;

sfe
NH
2

COOH

Tetrmero

COOH

Estructura FI FIGURA 9-44. Modelo del ensamble y arquitectura del filamento intermedio. Cada monmero (paso 1) consiste en uno de una amplia variedad de diferentes polipptidos que comparten organizacin similar al tener dominios terminales globulares separados por una larga regin o-helicoida). Los pares de monmeros se asocian en orientacin paralela con sus terminaciones alineadas para formar dmeros (paso 2). Dependiendo del tipo de filamento intermedio/ los dmeros pueden estar compuestos de monmeros idnticos (homodmeros) o no idnticos (heterodmeros). Los dmeros, en cambio, se asocian en forma escalonada antiparalela para formar tetrmeros {paso 3), que se supone son la subunidad bsica de ensamble de los filamentos intermedios. La organizacin de las subunidades tetramricas con el filamento se muestra en el paso 4.

sibles a la presin mecnica que incluso traumatismos leves, como el que ocurre durante el paso a travs del conducto del parto o durante la lactancia del recin nacido, pueden causar ampollas graves sobre la piel o la lengua. Este fenotipo posee un fuerte parecido con una rara enfermedad de! ser humano que causa ampollas cutneas, denominada epidermlisis bullosa simple (EBS). Anlisis subsecuentes de pacientes con EBS demostraron que poseen mutaciones en el gen que codifica el polipptido K14 homlogo (o el polipptido K5 que forma dmeros con K14). Estos estudios confirman el papel de los FI para impartir fuerza mecnica a clulas situadas en las capas epiteliales. En otros estudios se utilizaron ratones transgnicos cuyas clulas nerviosas producen tres o cuatro veces la cantidad normal de NF-L, un polipptido de los neurofilamentos. La expresin excesiva de esta protena conduce a la acumulacin gradual de numerosos neurofilamentos, mayor que lo normal en el citoplasma de clulas nerviosas con degeneracin axonal y atrofia muscular acompaantes (fig. 9-47). Tambin se observa acumulacin y ensamblado anormal de neurofilamentos en nervios motores de pacientes con ciertas enfermedades neuromusculares degenerativas, incluyendo esclerosis lateral amiotrca (o enfermedad de Lou Gehrig). Todava falta por determinar si estas enfermedades neurodegenerativas se pueden explicar como resultado de mutaciones en los genes que codifican polipptidos de neurofilamentos.

9-5

Microfilamentos

Las clulas muestran motilidad notable. Por ejemplo, la cresta neural de las clulas de un vertebrado sale del sistema nervioso en desarrollo y atraviesa toda la amplitud del embrin formando productos tan diversos como las clulas

CAPITULO 9 Citoesqueleto y motilidad celular

355

FIGURA 9-45. Demostracin experimental del carcter dinmico de los filamentos intermedios. Estas fotografas muestran los resultados de un experimento en el cual se inyect queratina tipo I marcada con biotina a clulas epiteliales cultivadas y 20 minutos ms tarde se localiz utilizando inmunofluorescencia. La fotografa en a muestra el sitio de la queratina biotinilada inyectada (segn lo revelan los anticuerpos antibiotina) que fueron incorporados a los filamentos durante el periodo de 20 minutos que sigui a la inyeccin. La fotografa en b muestra la distribucin entre los filamentos intermedios en la clula como lo revelan los anticuerpos antiqueratina. El patrn de puntos de fluorescencia en a indica que las subunidades inyectadas se incorporan a los filamentos existentes en sitios por toda su longitud ms bien que en sus extremos. Barra, 10 ftm. (Segn Rita K. MUler, Karen Vikstrom y Robert D. Goldman, J. Cell Biol. 113:848, 1991; con permiso de Rockefeer Univcrsity Press.)

pigmentadas de la piel y el cartlago de las mandbulas (fig. 7-10). De manera similar, legiones de leucocitos patrullan los tejidos del cuerpo en busca de desperdicios y microorganismos. Algunas partes de las clulas muestran igual

100 pm

FIGURA 9-46. Distribucin de los filamentos intermedios que contienen queratina en clulas cultivadas de piel (queratinocito). Se observa que los filamentos forman una red similar a una caja que rodea al ncleo y tambin se extiende a la periferia de la clula. (Cortesa de Kursad Turksen y Elaine Fuchs, Universidad de Chicago.)

motilidad; en el borde de una herida, amplias prolongaciones de las clulas epiteliales actan como dispositivos mviles que ayudan a empujar la capa de clulas sobre la regin daada y sellar la herida. De manera similar, el borde delantero de un axn enva prolongaciones microscpicas que reconocen el sustrato y guan a la clula hacia un objetivo sinptco. Todos estos diferentes ejemplos de motilidad comparten cuando menos un elemento comn: dependen de la presencia de microfilamentos, que es el tercer tipo en importancia de elementos citoesquelticos. Los microfilamentos miden cerca de 8 nm de dimetro y se componen de la protena actina. En 1990 se dio un gran paso en la investigacin del citoesqueleto cuando Kenneth Holmes y sus colegas, del Max Planck Institute de Alemania, determinaron la estructura tridimensional de la actina cfel msculo de conejo a nivel de resolucin atmica mediante cristalografa de rayos X. Cada molcula de actina tiene la forma de un cacahuate con dos dominios separados por una hendidura profunda y conectados entre s por una corta seccin o "bisagra" del eje longitudinal. En presencia de ATP, estas subunidades de actina, o actina C, se polimerizan siguiendo un patrn de cabeza y cola para formar un filamento flexible compuesto de dos cadenas de molculas de actina entrelazadas en una doble hlice (fig. 9-48). Los trminos "filamento de actina", "mcrofilamento", y "actina F" son todos sinnimos para este tipo de filamento de doble cadena. Puesto que cada subunidad de actina tiene polaridad y todas las subunidades del filamento de actina apun-

356

CAPITULO 9 - Citaesciueleto y motilidad celular

FIGURA 9-47. Efecto de la expresin excesiva de neurofilamentos polipptidos. Micrografa de luz de un corte teido con colorante argntico de una porcin de la mdula espinal de un ratn transgnico que expresa excesivamente los genes que codifican al polipptido del NF-L. Las motoneuronas de este ratn son anormales y contienen remolinos de neurofilamentos con corpsculos celulares en forma de baln. (Segn Z.S. Xu, L.C. Cork, .W. Griffin y D.W. Cleveland, Cell 73, cover # 2, 1993, con permiso de Cell Press.)

100nm FIGURA 9-48. Estructura de un filamento de actina. a) Modelo de un filamento de actina F. Los monmeros de actina estn representados en tres colores para distinguir subunidades consecutivas con mayor facilidad. Los subdominios en uno de los monmeros de actina estn marcados 1, 2, 3 y 4. b) Micrografa electrnica de una rplica de un filamento de actina mostrando su arquitectura de doble hlice, (a: Segn Michael F. Schmid y cois., cortesa de Wah Chin, en J. Cell Biol. 124:346, 1994; con permiso de Rockefeller University Press; b: segn Robcrt H. Depue, }r. y Robert V. Rice, J. Mol. Biol. 12:302, 1965,)

tan en la misma direccin, el microfilamento entero tambin tiene polaridad. Segn el tipo de clula y la actividad en la que participan los filamentos de actina, se pueden organizar en disposiciones altamente ordenadas, redes laxamente definidas o haces apretados. La actina se identific desde hace ms de 50 aos como una de las principales protenas contrctiles de la clula muscular. Desde entonces, la actina se identifica como una protena principal en casi todos los tipos de clulas eucariotas observadas. Las especies vegetales y animales evolutivamente elevadas poseen algunos genes que codifican actina, que en conjunto forman una familia de polipptidos estrechamente relacionados cuyos miembros se especializan en diferentes tipos de motilidad. La estructura de la actina se ha conservado notablemente en todo el curso de la evolucin. Por ejemplo, la secuencia de aminocidos de las molculas de actina de clulas de levadura y del msculo esqueltico de conejo son 88% idnticas. En realidad, los

filamentos de actina de diversas fuentes pueden copolimerizar*se para formar filamentos hbridos. La identificacin de filamentos de actina en determinada clula se puede lograr utilizando una prueba citoqumica basada en que los filamentos actina, cualquiera que sea su origen, interactan de manera muy especfica con la protena miosina. Para facilitar la interaccin se fragmenta miosina purificada (obtenida de tejido muscular) con una enzima proteoltica en dos o tres partes, una de las cuales fragmento de meromiosina pesada (MMP) o su subfragmento SI ms pequeo, vase figura 9-53] se enlaza a las molculas de actina a todo lo largo del microfilamento. Adems de identificar los filamentos que contienen actina, la MMP o los fragmentos SI se enlazan de modo que revelan la polaridad del fila-

CAPITULO 9 Citocsqueleto y motilidad celular

357

ment. El extremo del microfilamento ai cual se fijan los fragmentos de miosina tiene aspecto puntiagudo, y el otro extremo presenta pas. En la figura 9-49 se muestra la polaridad de ios filamentos de actina en microvellosidades de clulas epiteliales del intestino "decoradas" con fragmentos de miosina SI. Tambin se puede localizar actina con el microscopio de luz utilizando fragmentos SI o anticuerpos anti actina marcados con colorantes fluorescentes (fig. 9-70, a).

Ensamblado y desensamblado de merofilamentos

Los monmeros de actina deben enlazarse a un nucletido de adenosina, por lo regular ATP, antes de polirnerizarsc. El papel del ATP en el ensamblado de la actina es similar al del GTP en el ensamblado de microtbulos (pg. 344). El ATP relacionado con monmeros de actina se hidroliza a ADP en algn momento luego de su incorporacin al filamento de actina en crecimiento. Por consiguiente, cuando las clulas estn ensamblando filamentos de actina a gran velocidad, el extremo del filamento contiene un casquete de subunidades actina-ATP que impide el desensamblado del filamento y favorece su ensamblado continuo. En el tubo de ensaye es fcil lograr la polimerizacin y despolimerizacin de filamentos de actina, por lo que las condiciones que favorecen el ensamblado y desensamblado de microfilamentos es un proceso bien comprendido. Cuando se incuban microfilamentos con monmeros de actina marcada en concentracin elevada, ambos extremos de los microfilamentos quedan marcados, pero un extremo incorpora monmeros a una velocidad cinco a 10 veces mayor que la del otro extremo. La decoracin con fragmento de meromiosina pesado revela que el extremo barbudo (o ms) del microfilamento es el extremo que crece con mayor rapidez, en tanto que el extremo puntiagudo (o menos) crece con mayor lentitud (fig. 9-50, a). Inversamente, el extremo puntiagudo es el sitio preferencial de despolimerizacin. Puesto que los monmeros de actina tienden a aadirse al extremo ms del filamento y abandonar su extremo menos, los monmeros individuales deben desplazarse siguiendo la longitud del filamento de actina, proceso conocido como "trfico" (fig. 9-50, b). Falta por establecer si este trfico ocurre realmente in vivo. Igual que en los microtbulos, las clulas conservan un equilibrio dinmico entre las formas monmera y polmera de actina. Los cambios en las condiciones locales de una porcin particular de la clula pueden desviar el equilibrio hacia ensamblado o desensamblado de microfilamentos con importantes consecuencias para la conducta de esta parte de la clula. En las siguientes pginas se exploran numerosos ejemplos de la importancia del ensamblado y desensamblado de actina. Como se mencion antes, los filamentos de actina participan en casi todo tipo de procesos de movimiento en los cuales ocurren las clulas. La participacin de estos filamentos se puede determinar con mayor facilidad tratando las clulas con una citocalasina, grupo de compuestos extrados de clulas del moho que despol imerizan los microfilamentos, o con faloidina, compuesto extrado de hon-

200 nm

FIGURA 9-49. Determinacin de la ubicacin de la polaridad de los filamentos de actina utilizando la subunidad SI de miosina. Mcrografa electrnica de una rplica que muestra los haces de microfilamentos en el centro de la microvellosidad de una clula epitelial intestinal. La clula se fij, se trat con fragmentos de miosina 51, se fractur por congelacin y se someti a aguafuerte profundo para exponer los componentes filamentosos del citoplasma. La orientacin de las cabezas de flecha formadas por o complejo de actina SI suministra informacin importante acerca de la direccin en la cual se mueven los microfilamentos. Los filamentos intermedios en !a parte inferior de la mcrografa no contienen actina y por lo tanto no se unen a los fragmentos de miosina 51. (Segn N. Hirokawa, L.C. Tilney, K. Fujiumra y f.E. Heuser, ]. Cell Biol. 94:430, 1982; con permiso de Rockefeller Uni'erfity Pre$$.)

g*os venenosos que estabiliza al microfilamento de manera que la clula ya no puede utilizarlos en sus actividades dinmicas. La exposicin de las clulas a cualquiera de estos compuestos detiene casi de inmediato los procesos mediados por microfilamentos. En la figura 9-51 se muestra el efecto de la citocalasina sobre las ms delgadas prolongaciones mviles (ftlopodios) de las clulas mesenquimatosas del erizo de mar.
Polimerizacin de la actina como mecanismo generador desfuerza

Se ha demostrado que algunos tipos de motilidad celular se deben exclusivamente a la polimerizacin de la actina y

358

CAPITULO 9 Citoesqueleto y moilidad celular

10 jm

<v

FIGURA 9-51. Efecto de la citocalacina sobre las estructuras que contienen filamentos de actina. Un par de clulas mesenqumatosas del erizo de mar con prolongaciones filamentosas finas (filopodio) luego de 30 segundos (a) y de cinco minutos (b) de exposicin a citocalacina D. El frmaco provoca la disolucin de la prolongacin celular, que est compuesta principalmente de filamentos de actina. (Segn Gemid Karp y Michad Solursh, Dev. Biol. 112:281, 1985.)

FIGURA 9-50. Ensamblado de actina in vitro. a) Micrografa electrnica de un filamento corto de actina marcado con miosina 51 y luego utilizado para nuclear la polimerizacin de actina. La adicin de subunidades de actina ocurre con mayor rapidez en el extremo barbudo (ms) que en el puntiagudo (menos) del filamento existente. b) Diagrama de la adicin preferencial de subunidades de actina en el extremo ms de un microfilamento y su prdida preferencial del extremo menos en un ensayo in vitro. Como resultado, las subunidades giran como rueda de molino a travs del filamento in vitro. (a: Cortesa de M.S. Runge y Tilomas D. Pallar.)

efectan el contacto inicial con la superficie del vulo. Los estudios de la reaccin acrosmica en el pez pepino Thyone, efectuados por Lewis Tilney y sus colegas en la Universidad de Pennsylvania, demostraron que la rpida extensin del filamento (fig. 9-52, a,b) slo es gobernada por la polimerizacin de actina G (actina globular) para formar actina F. En otro ejemplo bien estudiado, la propulsin de ciertas bacterias (p. ej., Listeria monoci/togenes, que provoca envenenamiento alimentario) a travs del citoplasma de un fagocito infectado, es impulsada por la polimerizacin de monmeros de actina de la clula husped en una regin justo por detrs de la clula bacteriana (fig. 9-52, c). Estos procesos de motilidad operados por actina son ejemplos raros; prcticamente todos los otros tipos de motilidad celular implican la accin de una segunda protena, la miosina. Mioina: molcula motora de los filamentos de actina Anteriormente se examin la estructura y acciones de dos motores moleculares, cinesina y dinena, que operan sobre vas en los microtbulos. Hasta ahora todos los motores conocidos que operan junto con filamentos de actina son miembros de la superfamilia miosina. Inversamente, la nica

no afectan la accin de protenas motoras. Consideraremos dos ejemplos. Durante los sucesos que preceden a la fertilizacin, las clulas del espermatozoide de muchas especies responden a la presencia cercana de un vulo mediante una reaccin acrosmica en la cual crecen finos filamentos de manera explosiva en el extremo frontal del espermatozoide. Estos filamentos acrosmicos, como se les denomina,

CAPITULO 9

FIGURA 9-52. Dos ejemplos de motilidad celular basados nicamente en la polimerizacin de la actina. La rpida extensin del filamento acrosrnico en el extremo anterior del espermatozoide de una cucurbitcea marina ocurre conforme la actina G almacena en la cabeza del espermatozoide (a) es polimerizada para formar actina F (b). c) Micrografa electrnica de una clula infectada con la bacteria Listeriti, mostrando los filamentos de actina que se forman detrs de ella y empujan a la bacteria a travs del citoplasma. Los filamentos de actina tienen aspecto velludo debido a que estn decorados con cabezas de miosina. La barra en la parte superior izquierda, 0.1 ,wm. (n-b: Cortesa de Lewis G. Tilney; c: segi'in Leiis G. Tilney i/ cois. ]. Cell Biol. 118:77, 1992; con permiso de Rockefeller Universihj Press.)

(b)

funcin conocida de la miosina es actuar como sistema generador de fuerza en presencia de actina. Todas la miosnas estudiadas se mueven hacia el extremo ms de los microfilamentos. Falta por determinar si las clulas contienen o no motores moleculares que se muevan hacia el extremo menos del microfilamento. La miosina se aisl por primera vez del tejido muscular esqueltico de mamferos y posteriormente de gran variedad de clulas eucariotas, incluyendo protozoarios, vegetales evolutivamente elevados, clulas no musculares de animales, y tejido muscular cardiaco y liso de vertebrados. Las miosinas por lo general se dividen en dos clases: la miosina

convencional (tipo II) y la no convencional (tipo I).3 Ambos tipos de miosina se presentan juntas en muchas clulas eucariotas (fig. 9-78). Las molculas de tipo II son las mejor conocidas de los dos tipos.
3 Con el descubrimiento de una variedad creciente de miosinas procedentes de diversas fuentes, cada vez es ms difcil clasificarlas slo en dos grupos. Todas las miosinas comparten un dominio motor caracterstico (cabeza) que contiene ATP y sitios para enlace de actina F, pero tambin poseen dominios altamente divergentes en la cola y un nmero variable de cadenas ligeras. En algunas clasificaciones se consideran siete o ms clases de miosina.

360

CAPITULO 9 Citoesqueleio y motilidad celular Cadenas pesadas

Miosina II Las protenas del tipo de miosina II generan fuerza en diferentes tipos de tejido muscular y tambin en varias actividades no musculares, incluyendo divisin de una clula en dos mediante citocinesis. Cada molcula de miosina II consta de seis cadenas de polipptido (un par de cadenas pesadas y dos pares de cadenas ligeras) organizadas para producir una protena altamente asimtrica (fig. 9-53, a). Cada molcula contiene una larga cola en forma de varilla fija a un extremo de dos cabezas bulbosas globulares. La cola est formada por el entrelazamiento de secciones -helicoidales de las dos cadenas pesadas para formar una espira! a-helicoidal enrollada (pg. 59). La diseccin de la molcula de miosina mediante procedimientos leves de digestin proteoltica produce varios fragmentos, indicados en la figura 9-53, b. Los dos sitios susceptibles a proteasas en la cola son porciones no helicoidales de la cadena pesada que se cree actan como "bisagras" flexibles que ayudan en las funciones motoras en la molcula. En un ensayo de motilidad in vtro, similar al de la figura 9-54, cabezas aisladas de miosina (fragmentos SI de la figura 9-53, b) inmovilizadas sobre la superficie de un cubreobjetos de vidrio pueden provocar deslizamiento de los filamentos de actina a los cuales estn fijos. Por lo tanto, todo el mecanismo requerido para la actividad motora est incluido en un solo dominio de la cabeza. La porcin fibrosa de la cola de una molcula de miosina II media el ensamblado de miosina en filamentos. Las molculas de miosina se ensamblan de modo que los extremos de las colas apunten hacia el centro del filamento y las cabezas globulares se alejen del mismo (figs. 9-55 y 9-58). Por esta razn, el filamento se describe como bipolar para indicar una inversin de la polaridad a partir del centro del filamento. Como se describe en la siguiente seccin, los filamentos de miosina que se ensamblan en las clulas de msculo esqueltico son componentes muy estables del aparato contrctil, en tanto que los filamentos ms pequeos de miosina que forman la mayor parte de las clulas no nucleares con frecuencia son estructuras transitorias que se ensamblan en el sitio y momento que se necesitan y se desensamblan despus de actuar. Miosina I En 1973, Thomas Pollard y Edward Korn, de los National Institutes of Health (NIH), de Estados Unidos, describieron una protena similar a miosina extrada del protozoario Acanthamoeba, A diferencia de las rniosinas convencionales, esta miosina ms pequea slo tiene una cabeza y es incapaz de formar filamentos por polimerizacin in vitro. Desde entonces se aislaron en varios tipos de clulas otras miosinas de una sola cabeza y dominios de cola muy variables que se agruparon para formar la miosina clase I. Las protenas de la miosina I constan de una sola cadena pesada y una o ms cadenas ligeras. Igual que las miosinas II, la miosina I puede generar in vitro un movimiento dependiente de ATP a lo largo de filamentos de actina. El mejor conocimiento de la funcin de las miosinas clase I proviene de estudios efectuados en clulas manipuladas por ingeniera gentica del moho del fango Dictyostelium, cuyo nico gen miosina II se puede borrar o supri-

Cadenas ligeras dos hlices a

COOH i

3OOOOOC ~ koooooeooe

(a)

(1)

DOOOOOOOOOOOOOOOOOOC

Digestin proteoltica

(b)
FIGURA 9-53. Estructura de una molcula de miosina II. a) Una molcula de miosina II (peso molecular de 460 000 daltons) consta de un par de cadenas pesadas y dos pares de cadenas ligeras, segn se indica. Los pares de cadenas pesadas constan de una cola en forma de barra en la cual las porciones de las dos cadenas de polipptdos se entrelazan para formar una espiral enrollada y un par de cabezas globulares, b) Cada molcula contiene dos sitios a lo largo del bastn, sensibles a proteasa. Estas dos regiones susceptibles se presentan como sitios de estructura no helicoidal que dan a la molcula flexibilidad y actan como una especie de bisagra. El desdoblamiento de la cola en el sitio 1 genera dos fragmentos: meromiosina ligera (MML) y meromiosina pesada (MMP). El desdoblamiento de la MMP en el sitio 2 genera dos tipos de fragmentos, uno de los cuales es la cabeza SI que contiene la protena con actividad motora.

mir funcionalmente. Las clulas tratadas de esta manera slo expresan miosina I, pero tienen capacidad de locomocin y fagocitosis normales. Sin embargo, estas clulas no pueden dividirse, puesto que la separacin de! citoplasma en dos partes (citocinesis) depende de manera estricta de miosina II. Los anticuerpos fluorescentes contra miosina I tienden a localizarse cerca de la membrana plasmtica, lo que apoya la hiptesis de que estas molculas de miosina de una sola cabeza generan fuerzas a nivel de la superficie de la clula (fig. 9-78). La miosina I tambin se encuentra asociada a organelos membranosos y se cree que es la protena

CAPITULO 9 Citoesqueleto \j motilidad celular

361

motora que desplaza vesculas citoplsmicas a lo largo de vas constituidas por microfilamentos. Iniciaremos el examen de la contractilidad y el movimiento celular en el sistema mejor estudiado, la clula del msculo esqueltico de los vertebrados.

Actina

Miosina

9-6 Contractilidad muscular

El msculo esqueltico debe su nombre a que casi todo este tejido se encuentra anclado a los huesos del esqueleto que desplaza. Est bajo control voluntario y la contraccin se puede efectuar de manera consciente. Las clulas del msculo esqueltico tienen estructura altamente dispareja. Una clula muscular nica de forma cilindrica tiene 10 a 100 /m de espesor y hasta 40 mm de longitud, y contiene cientos de ncleos. Debido a estas propiedades, la clula muscular esqueltica se denomina con mayor propiedad fibra muscular. Las fibras musculares poseen mltiples ncleos porque cada fibra es producto de la fusin en el embrin de gran nmero de mioblastos mononucleados (clulas premusculares). La fusin de mioblastos mononucleados ocurre con facilidad en un plato de cultivo, aunque los mioblastos se obtengan de animales evolutivamente distantes (fig.9-56). Las clulas del msculo esqueltico quiz tengan la estructura ms ordenada de todas las clulas del cuerpo. Una seccin transversal de una fibra muscular (fig. 9-57) revela que se asemeja a un cable formado por cientos de fibras cilindricas delgadas, denominadas miofibrillas. Las mlofibrillas estn separadas entre s por el citoplasma que contiene un elaborado sistema de membranas intracelulares y tambin un mecanismo para el suministro de energa constituido por mitocondrias, gotas de grasa y granulos de glucgeno. Cada miofibrilla consta de disposicin lineal repetitiva de unidades contrctiles denominadas sarcmeros; cada sarcmero est provisto de un patrn caracterstico de bandas y lneas que dan a la fibra muscular un aspecto estriado. El examen de fibras musculares teidas en el microscopio electrnico muestra que el patrn de bandas es consecuencia de la superposicin parcial de dos tipos diferentes de filamentos, conocidos como filamentos delgados y filamentos gruesos (fig. 9-58). Cada sarcmera se extiende desde una lnea Z a la siguiente lnea Z y contiene varias bandas oscuras y zonas claras. Una sarcmera posee un par de bandas I levemente teidas localizadas en los bordes externos, y una banda A ms densamente teida localizada entre las bandas I y la zona H levemente teida, localizada en el centro de la banda A. Una lnea M densamente teida se sita en el centro de la zona H. La banda I slo contiene filamentos delgados, la zona H slo filamentos gruesos, y la parte de la banda A situada a los dos lados de la zona H representa la regin de superposicin y contiene ambos tipos de filamentos. Una seccin transversal a travs de la regin de superposicin muestra que los filamentos delgados se organizan en disposicin hexagonal alrededor de cada filamento grueso, en tanto que cada filamento delgado se sita entre dos filamentos gruesos (fig. 9-58). La seccin longitudinal revela la presencia de prolongaciones de filamentos gruesos a

FIGURA 9-54. Ensayo de motilidad in vitro para miosina. a) Dibujo esquemtico, en el cual las cabezas de miosina se enlazan a un cubreobjetos recubierto de silicn que posteriormente se incub con una preparacin de filamentos de actina. b) Resultados del experimento mostrado en a. La imagen proviene de dos tomas de video separadas 1.5 segundos, fotografiadas con doble exposicin sobre el m^smo cuadro de pelcula. Las lneas punteadas con cabezas de flecha muestran el movimiento de los filamentos de actina sobre las cabezas de miosina durante un breve periodo entre las exposiciones. (Segn T. Yanagida, Adv. Biophysics 26:82, 1990.)

intervalos regularmente espaciados. Estas prolongaciones representan puentes transversales capaces de formar uniones con los filamentos delgados vecinos.

Modelo de contraccin muscular de filamentos deslizantes

Todos los msculos esquelticos ejecutan su funcin mediante acortamiento; no tienen otra manera de efectuar tra-

362

CAPITULO 9 Citoesqueleto y motilidad celular

Cadenas ligeras

FIGURA 9-55. Estructura de un filamento bipolar de miosina II. a) Diagrama de la disposicin de las molculas individuales de miosina en el filamento de miosina II. b) Micrografa electrnica de un filamento bipolar de miosina formado in vitro. Se observan cabezas de filamento en ambos extremos, que dejan una seccin lisa en el centro del filamento, (b: Cortesa de Hugli Huxley.)

Filamento bipolar
(a)

bajo. Las unidades de acortamiento son las sarcmeras, cuya disminucin de longitud combinada explica la reduccin de longitud de todo el msculo. Los datos ms importantes acerca del mecanismo subyacente de la contraccin muscular provienen de observar el patrn de bandas en las

sarcmeras durante diferentes etapas del proceso contrctil. Conforme la fibra muscular se acorta, la banda A de cada sarcmera conserva prcticamente su misma longitud, en tanto que la banda H y las bandas I disminuyen de anchura y luego desaparecen en conjunto. A medida que el acortamiento progresa, las lneas Z se aproximan cada vez ms al borde externo de la banda A hasta que entran en contacto (fig. 9-59). Segn este tipo de observaciones, dos grupos de investigadores britnicos, Andrew Huxley y R. Niedergerke, y Hugh Huxley y Jean Hanson elaboraron un modelo de gran alcance para explicar la contractilidad muscular. Propusieron que el acortamiento de sarcmeras individuales no es resultado del acortamiento de los filamentos, sino ms bien de su deslizamiento uno sobre el otro. El deslizamiento do los filamentos delgados hacia el centro de la sarcmera dara como resultado el incremento de la superposicin observado entre los filamentos y la disminucin de anchura de las bandas I y H (fig. 9-59). El modelo de filamentos deslizantes fue rpidamente aceptado y an se siguen acumulando datos a su favor.
Composicin y organizacin de los niioftlamentos

FIGURA 9-56. Demostracin en cultivo de clulas que las clulas del msculo esqueltico se originan de la fusin de clulas. Las clulas musculares aqu mostradas (denominadas miotubos cuando estaban en cultivo) se ve que contiene dos tipos diferentes de ncleos. Estos miotbulos se originan de la fusin de dos tipos de clulas musculares mononucleares precursoras (mioblastos), un tipo derivado de una estirpe celular de ratn y la otra de codorniz. El tringulo indica el ncleo de un miotubo hbrido de ratn. Las fibras musculares en, el cu.er.pa se ari'g.in.atv por un proceso similar de fusin de mioblastos. (Segn M. Crescenzi, D.H. Crouch y F. Tato, J. Cell Biol. 125:1142, 1994, con permiso de Rockefeller University Press.)

Los filamentos delgados de una sarcmera constan principalmente de actina, en tanto que los filamentos gruesos contienen principalmente miosina. La tercera protena ms abundante en la fibra muscular esqueltica es la titina, cuyo peso molecular de casi tres millones de daltons y su longitud de ms de 1 fim la hacen la protena, nas grnele hasta ahora descubierta. Las molculas de titina se originan en la lnea M y se extienden a lo largo del filamento de miosina, atraviesan la banda A y terminan en la lnea Z (fig. 9-60). Debido a su disposicin, la titina se considera una tercera

CAPITULO 9 Citoesciueieto y motilidad celular Msculo del cuerpo

363

Vaina Fibra de "clula" muscular

Banda

Banda I

FI<;UHA ()-."i7. Estructura del msculo esqueltico. Diagrama de los niveles de organizacin del msculo esqueltico, desde un msculo corporal completo hasta una sencilla sarcmera. El primer recuadro muestra una micrografa con microscopio de luz de una fibra muscular multinucleada. El segundo recuadro muestra una micrografa electrnica de una sencilla sarcmera nico con letras en las bandas. (Micrografas cortesa de Geralditie F. Gauthier.)

clase de filamento muscular. La titina es una molcula muy elstica (se puede estirar hasta una longitud mayor de 3 /m) y tal vez se encargue de ejercer el pequeo grado de tensin desarrollado por un msculo relajado y de mantener la posicin de los filamentos de miosina en el centro de la sarcmera. Adems de actina, los filamentos delgados de un msculo esqueltico contienen otras dos protenas, tropomiosina y troponina (fig. 9-61). La tropomiosina es una molcula alargada {unos 40 nm de longitud) que se adapta firmemente a los surcos situados entre las dos cadenas de actina del filamento delgado. Cada molcula de tropomiosina en forma de barra se acompaa de siete molculas de actina dispuestas linealmente a lo largo de la cadena F de actina (fg. 9-61). Las molculas de tropomiosina se sitan cabo a cabo a lo largo de todo el filamento delgado. La troponina es una protena globular compuesta de tres subunidades, y cada una desempea un papel importante y distinto en la funcin total de la molcula. Las molculas de troponina se encuentran a intervalos de casi 40 nm a lo largo de los fila-

mentos delgados y entran en contacto con los elementos de actina y tropomiosina del filamento. Cada filamento grueso se compone de varios cientos de molculas de miosina y de pequeas cantidades de otras protenas. Igual que los filamentos formados in vitro (fig. 9-55), los filamentos gruesos de las clulas musculares invierten su polaridad en el centro de la sarcmera, que corresponde a la lnea M de la figura 9-57. El centro del filamento contiene regiones de colas opuestas de las molculas de miosina y est desprovisto de cabezas. Las cabezas de miosina se proyectan a partir de cada filamento grueso a lo largo de casi toda su longitud, debido a la posicin escalonada de las molculas de miosina que constituyen el cuerpo del filamento (fig. 9-58).
Bases moleculares de la contraccin

Luego de formulada la hiptesis de los filamentos deslizantes se volvi la atencin a las cabezas de las molculas de miosina como componentes generadores de fuerza de la fibra muscular. Cuando llega la orden, las cabezas de

364

CAPITULO 9 CitOaquelet y motilidad celular Banda Banda A Zona H Filamento grueso Filamento delgado 3&?ficetTa% Banda

Lnea Z

Lnea Z

:::
(b)

(a)

FIGURA 9-58. Mecanismo contrctil de la sarcmera. a) Diagrama de una parte de la miofibrilla que muestra la disposicin superpuesta de filamentos delgados que contienen actina (color naranja) y filamentos gruesos que contienen miosina (color prpura). Las pequeas prolongaciones transversales sobre la fibra de miosina representan las cabezas (puentes transversos), b) Micrografa electrnica de una seccin transversal a travs de una parte del msculo del insecto volador mostrando la disposicin hexagonal de los filamentos delgados alrededor de cada filamento grueso, (b: Micrografa por j. Auber/Photo Researchers, Inc.)

miosina se extienden lateralmente para hacer contacto con los filamentos delgados, formando los puentes transversales observados entre los dos tipos de filamentos. Las cabezas de un solo filamento de miosina interactan con seis filamentos de actina que las rodean. Una vez formados los puentes transversales, las cabezas de miosina se inclinan hacia el centro de la sarcmera (fig. 9-62, paso 4). El movimiento de las cabezas de miosina acta como latido de potencia para deslizar el filamento de actina delgado una distancia perceptible sobre el filamento grueso. Durante una contraccin tpica, la fibra muscular se acorta casi 65% de la longitud que presenta en estado de relajacin (fig. 9-59). Puesto que cada sarcmera tiene casi 2.5/m de longitud, sera de esperar que los filamentos delgados se deslicen aproximadamente 1 /m durante la contraccin. Dado que el simple cambio de conformacin de una cabeza de miosina slo puede mover un filamento de actina unos 5 a 10 nm, una sola contraccin requiere una serie repetida de interacciones entre los puentes transversales y los filamentos delgados. Se estima que un puente transversal determinado puede sufrir 50 a 100 ciclos mecnicos por segundo.
Energtica del filamento deslizante

La energa requerida para impulsar el cambio de conformacin en el puente transverso se obtiene de la hidrlisis de ATP mediante una ATPasa presente en el mismo puente transversal. La miosina, que es al mismo tiempo protena estructural y enzima, es ideal para esta tarea. La parte en forma de barra de la molcula le permite formar filamentos, requeridos para mantener los puentes transversos en posi-

cin espacial rgida en los intervalos apropiados. Las cabezas de miosina sirven como catalizadores de la hidrlisis de ATP y como palancas de! movimiento de filamentos de actina. Por lo tanto, igual que otras protenas motoras, cinesina y dinena, la miosina acta como transductor quimiomecnico que convierte la energa qumica del ATP en la energa mecnica de un filamento deslizante. Cada ciclo de actividad mecnica del puente transverso de miosina se acompaa de un ciclo de actividad de la ATPasa, segn se ilustra en la figura 9-62 y se describe en el pie de figura. En el paso 1 de la figura 9-62, el ATP se enlaza a la cabeza de miosina. La hidrlisis del ATP ocurre en realidad antes que la cabeza de miosina haga contacto con el filamento de actina. Los productos de la hidrlisis del ATPa saber, ADP y P, permanecen enlazados al sitio activo de la enzima, en tanto que la protena absorbe la energa liberada durante la hidrlisis (fig. 9-62, paso 2). Esta miosina energizada se fija entonces a la molcula de actina (paso 3}, libera el fosfato enlazado y sufre un cambio de conformacin controlado por la energa libre almacenada (fig. 9-62, paso 4). El cambio de conformacin desplaza el filamento de actina hacia el centro de la sarcmera y por lo tanto representa el golpe de potencia de la cabeza de miosina. La liberacin del ADP enlazado (paso 5) y la fijacin de una nueva molcula de ATP a la cabeza de miosina {paso 1) induce la disociacin del puente cruzado del filamento de actina para iniciar un nuevo ciclo. En ausencia de ATP, la cabeza de miosina permanece firmemente enlazada al filamento de actina. La incapacidad del puente transverso de miosina para separarse en ausencia de ATP es la base del estado rigor mortis que sobreviene despus de la muerte.

CAPITULO 9 Citoesqueleto y motilidad celular

365

Cabezas de rniosina

Filamento de miosina Filamento de actina (filamento grueso) (filamento delgado)

Banda

Zona H Banda ARELAJADO Puente transverso Movimiento de actina \o de actina

ccrt fin
KM

ITM

TJ-JM TJJ

1CM Tlf

ni uj ni

Mlf
Zona H "Banda A CONTRADO Banda I

(a)
FIGURA 9-59. Acortamiento de la sarcmera durante la contraccin muscular, a) Diagrama que muestra la diferencia en la estructura de la sarcmera en un msculo relajado y uno contrado. Durante la contraccin, los puentes cruzados de miosina hacen contacto con los filamentos delgados que los rodean y los filamentos delgados se ven forzados a deslizarse hacia el centro de la sarcmera. b) Par de micrografas que muestran la desaparicin de la banda 1 y de la zona H como resultado del deslizamiento de los filamentos delgados hacia el centro de la sarcmera. (b: Segn James E. Dennis/PHOTOTAKE.)

Acoplamiento de excitacin y contraccin

Las fibras musculares se organizan en grupos denominados unidades motoras. Todas las fibras de una unidad motora estn inervadas en conjunto por las ramas de una sola motoneurona y se contraen simultneamente cuando llega un impulso excitatorio a lo largo del axn neuronal. El punto de contacto entre la porcin terminal del axn y una fibra muscular se denomina unin neuromuscular (fig. 9-63; vase tambin la figura 4-49 para mayor detalle de la estructura de las sinapsis). La unin neuromuscular es el sitio de transmisin de los impulsos nerviosos procedentes del axn hacia la fibra muscular a travs de la hendidura sinptica cuya membrana plasmtica tambin es excitable y capaz de conducir un potencial de accin. Los pasos que vinculan la llegada de un impulso nervioso a la membrana plasmtica del msculo con el acortamiento de las sarcmeras profundas situadas dentro de la

ftya muscular constituyen un proceso conocido como acoplamiento de excitacin y contraccin. A diferencia de la neurona, donde un potencial de accin permanece en la superficie de la clula, el impulso generado en una clula muscular esqueltica se propaga al interior de la clula a lo largo de pliegues membranosos llamados tbulos transversos (T) (fig. 9-63). Los tbulos T terminan en estrecha proximidad con el sistema de membranas ctoplsmicas que constituyen el retculo sareoplsmico (RS), el cual forma un manguito membranoso alrededor de la miofibrilla. Casi 80% de las protenas integrales de la membrana del RS consiste en Ca2+-ATPasa cuya funcin es transportar iones Ca 2+ fuera del citoplasma hacia el interior de la luz del RS, donde se almacenan hasta ser requeridos. La importancia del calcio en la contraccin muscular fue demostrada por primera vez en 1947 por L.V. Heilbrunn, de la Universidad de Pennsylvania, quien inyect calcio a

366

CAPITULO 9 Citoesqueleto y motilidad celular Sarcmera Nebulina Miosina Actina Titina

,L

Lneas Z

FIGURA 9-60. Disposicin de las molculas de titina dentro de la sarcmera. Estas molculas bastante elsticas se estiran desde el extremo de la sarcmera en la lnea Z hasta la banda M en el centro de la sarcmera. Tres a seis molculas de titina se asocian a cada mitad de un filamento de miosina. Conforme la sarcmera se acorta, las molculas elsticas de titina se estiran igualmente desde sitios opuestos. Se piensa que esto mantiene los filamentos gruesos en el centro de la sarcmera. Las molculas de nebulina (que no se estudiaron en el texto) se relacionan con los filamentos delgados y se cree que regulan la longitud (es decir, el nmero de monmeros de actina) que constituyen cada filamento delgado. (Segn T.C.S. Kelier, Curr. Opin. Cell Biol. 7:33, 1995.)

una fibra muscular y observ contraccin de la fibra. En estado relajado, la concentracin de Ca2+ en el citoplasma es muy baja (alrededor de 10~7 M), menos de la concentracin umbral requerida para la contraccin. Con la llegada de un potencial de accin a travs de los tbulos transversos, los canales de calcio de la membrana del RS se abren y el calcio se difunde hacia afuera del compartimiento del RS a corta distancia de las miofibrillas. Como resultado, la concentracin de Ca2+ se eleva desde 2 x 10~7 M hasta casi 5 x 10~5 M. Para entender cmo la elevacin de la concentracin de calcio desencadena la contraccin de una fibra muscular esqueltica es necesario reconsiderar la estructura de la protena de los filamentos delgados. En estado relajado, las molculas de tropomiosina, localizadas en los surcos del filamento delgado (fig. 9-61), se sitan en una posicin que impide el acceso de molculas de actina a las cabezas de miosina. La posicin de la tropomiosina dentro del surco est bajo el control de la molcula de troponina fijada. Cuando la concentracin de Ca 2+ se eleva, los iones se fijan a una de las subunidades de troponina (troponina C), acontecimiento que provo-

Actina

Troponina

Tropomiosina

ca un cambio de conformacin en otra subunidad de la molcula de troponina, que a su vez se transmite a la tropomiosina adyacente, la cual se desplaza alrededor de 1.5 nm hacia el centro del surco del filamento (de la posicin b a la en la figura 9-64). Este cambio de posicin de la tropomiosina expone el sitio de enlace de miosina sobre las molculas adyacentes de actina, lo que permite que los puentes transversos situados sobre los filamentos gruesos se fijen a los filamentos delgados. Cada molcula de troponina controla la posicin de una molcula de tropomiosina, que a su vez controla la capacidad de enlace de siete monmeros de actina unidos al filamento delgado. Cuando se suspende la estimulacin de la motoneurona inervante, se cierran los canales de Ca2+ en la membrana del RS y la Ca2+-ATPasa elimina el exceso de calcio del citoplasma. Como resultado, los iones Ca2+ se separan de los sitios de enlace sobre la troponina, provocando que las molculas de tropomiosina regresen a la posicin donde impiden la interaccin de actina y miosina. El proceso de relajacin puede imaginarse como una lucha por el calcio entre la protema de transporte de la membrana del RS y la troponina; la protena de transporte tiene mayor afinidad por el ion, por lo que lo elimina preferencialmente del citoplasma y deja a la troponina en estado no enlazado.

9-7 Motilidad no muscular

10 nm

Las clulas del msculo esqueltico son un sistema ideal para estudiar contractilidad y movimiento;4 las protenas
4 La contractilidad es resultado de las fuerzas de traccin generadas. En muchos casos, las interacciones contrctiles producen acortamiento, que es un tipo de movimiento, pero la contractilidad tambin puede ocurrir de manera isomtrica en la cual se genera tensin sin acortamiento.

FIGURA 9-61. Organizacin molecular de los filamentos delgados. Cada filamento delgado consta de una disposicin de subunidades de actina de doble hlice con una molcula de tropomiosina en forma de barra situada en los surcos y molculas de troponina espaciadas a intervalos definidos, segn se describe en el texto. Los cambios de conformacin en estas protenas que desencadenan la contraccin se muestran en la figura 9-64.

CAPITULO 9 Citoescudeto y inutilidad celular

367

FIGURA 9-62. Ciclo contrctil de la actinomiosina. El movimiento de los filamentos delgados mediante una cabeza de miosina generadora de fuerza ocurre como resultado de la unin entre un ciclo mecnico que implica fijacin, movimiento y separacin de la cabeza, y un ciclo qumico que implica enlace, hidrlisis y liberacin de ATP, ADP y P. En este diagrama, los dos ciclos se inician en el paso 1 con el enlace de ATP a una hendidura en la cabeza de miosina, lo que provoca la separacin de la cabeza del filamento de actina. La hidrlisis del ATP enlazado (paso 2) energiza la cabeza y provoca que se enlace dbilmente al filamento de actina (paso 3). La liberacin de P causa fijacin ms firme de la cabeza de miosina al filamento delgado y el golpe de potencia (paso 4) que mueve el filamento delgado hacia el centro de la sarcmera. La liberacin del ADP (paso 5) prepara el mecanismo para otro ciclo. (Segn M.Y. Jiang y M.P. Shcetz, Bioess. 16:532, 1994.) 0

Golpe de potencia ^ 0

ADP-P

Tbulos transversos

Mitocondrias

ofibrilla

Retculo sarcoplsmico

Ncleo

FIGURA 9-63. Anatoma funcional de una fibra muscular. El calcio se aloja en la red elaborada de membranas internas que constituyen el retculo sarcoplsmico (RS). Cuando un impulso llega a travs de una motoneurona, se transporta al interior de la fibra a io largo de la membrana del tbulo transverso hacia el retculo sarcoplsmico. La compuerta de calcio del RS se abre y libera calcio en el citoplasma. El enlace de iones calcio a las molculas de troponina de los filamentos delgados produce los acontecimientos descritos en la siguiente figura y la contraccin de la fibra.

368

CAPITULO 9 Citoesqueleto y motilidad celular

Tropomiosina (Actina Actina * [Actina ; Actina

FIGURA 9-64. Papel de la tropomiosina en la contraccin muscular. Diagrama del modelo de impedimento estrico en el cual el sitio de unin de la miosina sobre los filamentos delgados de actina est controlado por la posicin de la molcula de tropomiosina. Cuando la concentracin de calcio se eleva, la integracin entre calcio y roponina (no mostrada) provoca un movimiento de la tropomiosina desplazndola de la posicin b a la posicin a, que expone el sitio de enlace sobre el filamento delgado de a cabeza de miosina.

mentes de actina dentro de las clulas es determinada por una notable variedad de protenas enlazadas a la actina que afectan el ensamblado, propiedades fsicas e interacciones entre s y con otros organelos celulares. De los filamentos de actina se han aislado casi 100 diferentes protenas enlazadas a actina pertenecientes a muchas familias de uno u otro tipo de clula. El tema es complejo y todava no bien comprendido. Las protenas enlazadas a actina se pueden dividir en varias categoras segn sus presuntas funciones en la clula (cuadro 9-3 y figura 9-66). Es digno de notar que algunas de estas protenas pueden efectuar ms de una actividad segn su concentracin, estado de la protena (por ejemplo, si est fosforilada o no) y las condiciones prevalecientes (p. ej., concentracin de iones Ca2+ y H + ). Adems, un filamento de actina contiene gran nmero de monmeros de actina y por lo tanto permite a las diferentes protenas enlazadas actuar simultneamente en diferentes sitios a lo largo del filamento. 1. Protenas que secuestran monmeros. La primera protena enlazada a actina que se descubri se denomin profilina; se demostr que se enlaza a monmeros de actina G y evita su polimerizacin. Se cree que la presencia de protenas que secuestran actina explica la concentracin

contrctiles que interactan estn presentes en concentracin elevada y forman parte de estructuras celulares definidas. El estudio de la motilidad no muscular es ms desafiante debido a que los componentes importantes tienden a ocurrir en disposiciones transitorias ms lbiles y menos ordenadas, y en condiciones tpicas se restringen a una delgada zona cortical justo por debajo de la membrana plasmtica. Esta zona cortical es una regin activa de la clula encargada de procesos como ingestin de materiales extracelulares, extensin de prolongaciones durante el movimiento celular y constriccin de una clula para formar dos clulas durante la divisin celular. Todos estos procesos dependen del ensamblado de microfilamentos en la corteza. Aunque las "reglas bsicas" de la contractilidad muscular y no muscular pueden ser muy diferentes, en todo tipo de clulas los procesos de movimiento se originan en las mismas dos protenas: actina y miosina. En las siguientes pginas consideraremos algunos ejemplos de contractilidad y motilidad no muscular que dependen de filamentos de actina y de protenas motoras similares a miosina. Sin embargo, es importante examinar primero los factores que gobiernan la tasa de ensamblado, nmero, longitud y patrones espaciales de los filamentos de actina.

Protenas enlazadas a actina

La actina purificada puede polimerzarse in vitro para formar filamentos de actina, pero dichos filamentos carecen de capacidad para nteractuar entre s o efectuar actividades tiles. Cuando se observan al microscopio recuerdan el piso de un establo cubierto de paja. En contraste, los filamentos de actina de clulas vivas se organizan en varios patrones que incluyen haces de diferente tipo, redes delgadas (biuimensionales) y un complejo gel tridimensional (fig. 9-65). No hay verdadera diferencia entre los propios filamentos de actina. Ms bien, la organizacin y conducta de los fila-

FIGURA 9-65. Organizacin de los filamentos de actina dentro de la clula. Como se describe al final de este captulo, las clulas se mueven a travs de un sustrato extendiendo varios tipos de prolongaciones. La micrografa electrnica muestra el borde delantero de un fibroblasto mvil que muestra los filamentos de actina de alta densidad. Se observa que estos filamentos estn organizados en dos formas distintas: como haces en los cuales los filamentos se disponen paralelos entre s (flecha) y como una red de enlaces transversos en la cual los filamentos se disponen en varias direcciones. (Cortesa de J. Vctor Small.)

CAPITULO 9 Citoesqueleto y motilidad celular CUADRO 9-3. Protenas enlazadas a actina Protenas Peso molecular (kD) Fuente

369

Protenas que secuestran monmeros Profilina 12-15 Ampliamente propagada Timosinas 5 Ampliamente propagada Depactina 18 Gocitos de la estrella de mar Rion Des trina 19 Protenas que bloquean /3-actinina Casquete Z Protena de recubrimiento extremos 35-37 32, 34 28-31 Rion, msculo esqueltico Msculo
Acanthctmoeba

Protenas de enlaces transversos Filamina 250 250 Protena enlazada a actina (PEA) Gel actina 23Protenas en haces Fimbrina Vellina Fascina r-Actinina 68 95 57 95

Msculo liso Plaquetas, macrfagos Amibas Epitelio intestinal, etc. Epitelio intestinal, oocitos Huevos de erizo de mar Msculo Clulas de mamfero Amibas, huevos erizo de mar Plasma sanguneo Msculo esqueltico Ampliamente propagada Dictyostelium

Protenas aue cortan filamentos Gelsolina 90 Fragmina/severina 42 Brevina 93 Protenas enlazadas a membrana Distrofina 427 Vinculina 130 Ponticulina 17

NOTA: Muchas de las protenas que se enlazan a actina pueden tener ms de una funcin, dependiendo de las condiciones.

relativamente alta de actina G en clulas no musculares (50 a 200 /m); si estuvieran ausentes, las condiciones en el citoplasma favoreceran la polimerizacin casi completa de la actina soluble G. Debido a su capacidad para unirse a la actina G y estabilizar la reserva de monmeros, los cambios en la concentracin o actividad de protenas que secuestran actina pueden variar el equilibrio monmero-polmero en cierta regin de la clula y provocar que en ese momento se favorezca la polimerizacin o la despolimerizacin. Se cree que las protenas ms importantes que secuestran monmeros son miembros de la familia timosina (p. ej., T/Ji), pequeas protenas presentes en concentracin elevada en clulas no musculares que se enlazan con alta afinidad a la actina G. Las timosinas tambin reciben este nombre porque originalmente se aislaron de los tejidos del timo, donde se cree actan corno hormonas tmicas. 2. Protenas que bloquean extremos (casquetes). Las protenas de este grupo pueden regular la longitud de los

filamentos de actina al enlazarse a uno u otro extremo del filamento, y por lo tanto al formar un casquete. Si se cubre el extremo de crecimiento rpido (ms) del filamento, puede ocurrir despolimerizacin en el extremo opuesto y como resultado el filamento se desensambla. Ciertas protenas bloquedoras de extremos pueden promover la formacin de nuevos filamentos (nuclencir) y al mismo tiempo inhibir el alargamiento de los filamentos existentes. En conjunto, el resultado es la presencia de mayor nmero de filamentos ms pequeos. Las protenas bloqueadoras de extremos incluyen el casquete 2 y la /5-actinina. 3. Protenas de enlace transversal. En este grupo se incluye una gran variedad de protenas capaces de alterar la organizacin tridimensional de una poblacin de filamentos de actina. Cada protena tiene dos o ms sitios de enlace para actina y por lo tanto puede enlazar transversalmente dos o ms filamentos de actina separados. Algunas de estas protenas tienen forma de varilla flexible larga y tienden a promover la formacin de redes laxas de filamentos interconectados en ngulo casi recto (como en la figura 9-65). Las regiones del citoplasma que contienen estas redes muestran propiedades de gel elstico capaz de resistir presin mecnica local. Las protenas que favorecen !a formacin de gel tridimensional incluyen ABP280 y filamina. Otras protenas de enlace transverso tienen forma globular y promueven la formacin de haces filamentosos de actina en disposiciones paralelas de mallas apretadas. Las microvellosidades que se prolongan desde la superficie apical de las clulas del epitelio intestinal y de la clulas que revisten los tbulos renales contienen haces de microfilamentos alineados paralelos al eje longitudinal de las microvellosdades (fig. 9-67). Los microfilamentos se mantienen en haces por las protenas vellina y fimbrina enlazadas a la actina. Tambin se encuentran haces de filamentos de actina en los estereocilios filiformes (fig. 9-68) que se prolongan desde las clulas receptoras del odo interno, donde desempean un papel clave en el sentido de la audicin y el equilibrio. Los filamentos reunidos en haces adquieren mayor rigidez, lo que les permite actuar como un esqueleto interno de apoyo para esas prolongaciones citoplsmicas. 4. Protenas que cortan filamentos. Las protenas de este tipo tienen capacidad para enlazarse a un filamento ya existente y partirlo en dos. Reducen la longitud de los filamentos y disminuyen con rapidez la viscosidad del citoplasma. La primera protena de este tipo que se identific fue la gelsolina, descubierta gracias a su capacidad para licuar (solubilizar) extractos citoplsmicos gelados. Al crear extremos libres adicionales, las protenas cortadoras tambin pueden promover el ensamblado de monmeros de actina G o recubrir con un casquete los fragmentos que generan. Severina y fragmina son otras protenas que cortan filamentos de actina. 5. Protenas enlazadas a la membrana. Gran parte del mecanismo contrctil de clulas no musculares se sita justo por debajo de la membrana plasmtica. Durante numerosas actividades, las fuerzas generadas por la protena contrctil actan sobre la membrana plasmtica empujndola hacia afuera (como ocurre, por ejemplo, durante la locomocin celular) o causando su invaginacin hacia adentro (por ejemplo, durante la fagocitosis o la citocinesis). Estas

370

CAPITULO 9 Citoescudeto y motilidad celular Extremo bloqueado (casquete) Unin cruzada

FIGURA 9-66. Papel de las protenas enlazadas a actina.

Monmero secuestrante

Enlace a la membrana

Corte de filamentos

actividades son facilitadas por el enlace de filamentos de actina a la membrana plasmtica, ya sea directamente por medio de fijacin a los dominios citoplsmicos de una protena integral de membrana o indirectamente por fijacin a una protena perifrica de la membrana. En captulos previos se describieron dos ejemplos de este ltimo tipo: la inclusin de polmeros cortos de actina como parte del esqueleto de la membrana de los eritrocitos (fig. 4-31) y la fijacin de filamentos de actina a la membrana en contactos focales y uniones adherentes (figs. 7-17, b, y 7-26, a]. Las protenas que unen la membrana con actina incluyen espectriha, vinculina y miembros de la familia ERM (ezrina, radixina y moesina). Uno de los miembros ms difundidos de la familia de las espectrinas es la protena distrofina, una protena enlazada a actina sobre la superficie interna de la membrana plasmtica (fig. 9-69). Se cree que la distrofina tiene un papel estructural en la unin del mecanismo contrctil de las clulas musculares con la membrana plasmtica suprayacente. Las mutaciones del gen que codifica la distrofina causan distrofia muscular, enfermedad hereditaria caracterizada por debilidad y disfuncin muscular progresiva. Se piensa que el dao muscular se debe a desgarro de la membrana plasmtica y su complejo citoesqueltico relacionado causado por las contracciones musculares.

no musculares, incluyendo citocinesis, fagocitosis, corrientes citoplsmicas (flujo orientado de la masa citoplsmica que ocurre en ciertas clulas vegetales grandes), trfico de vesculas, activacin de plaquetas sanguneas, movimientos laterales de protenas integrales dentro de la membrana plasmtica, interaccin de sustratos celulares, locomocin celular, crecimiento axona! y cambios en la morfologa celular. La motilidad y contractilidad no muscular se ilustran en los siguientes ejemplos.
Interacciones clula-sustrato y papel de las fibras de esfuerzo

Ejemplos de contractilidad y motilidad no muscular

Los filamentos de actina y los motores de miosina se encargan de gran variedad de actividades dinmicas en clulas

Cuando se permite a una clula asentarse en el fondo de un plato de cultivo/ se aplana y extiende sobre el sustrato. Esta fijacin con frecuencia implica la formacin de contactos focales adherentes firmes (descritos en la pgina 251). Justo por debajo de la membrana plasmtica del contacto focal se observan filamentos de actina alineados en haces estrechamente apretados llamados fibras de esfuerzo (fig. 9-70, a,b). Las fibras de esfuerzo son muy parecidas a las miofibrillas del tejido del msculo esqueltico, ms que cualquier otra estructura en una clula no muscular. Adems de acuna, las fibras de esfuerzo contienen algunas otras protenas tpicas de clulas musculares, incluyendo miosina, tropomiosina y a-actinina. Este ltimo grupo de protenas se presenta de manera discontinua a lo largo de la fibra de esfuerzo, confirindole un aspecto bandeado (fig. 9-70, b) que recuerda las sarcmeras de una fibra de msculo esqueltico. En contraste, los f amen tos de actina corren como elementos continuos a travs de las fibras de esfuerzo, pero la tincin con meromiosina pesada indica que los filamentos de actina

CAPITULO 9

371

Extremo recubierto Extremo ms del filamento Miosina Fimbrina

Villina

Microfilamento

trctil. Esta espectativa se origina en estudios de fibras de esfuerzo aisladas de clulas mediante microciruga con rayo lser; las fibras de esfuerzo aisladas se contraen en presencia de ATP, Este dato plantea una pregunta interesante: por qu debe haber fibras potencialmente contrctiles en clulas adherentes que no participan en ningn tipo de actividad locomotora? En realidad, cuando se aplica un estmulo para mover una clula cultivada sedentaria, con frecuencia uno de los primeros cambios visibles es la prdida de las fibras de esfuerzo. Se cree que las fibras de esfuerzo de una clula firmemente adherida sufren contraccin isomtrica, o sea, contraccin que genera tensin sin cambio de longitud. Este tipo de contraccin ayuda a mantener la tensin entre la clula y el sustrato. En el cuerpo pueden observarse fibras de esfuerzo en clulas de la superficie extracelular expuestas a fuerzas deslizantes que tienden a separarlas de su sustrato.
Locomocin celular

Microvellosidad FIGURA 9-67. Filamentos de actina y protenas enlazadas a actina en una microvellosidad. Las microvellosidades se encuentran en la superficie apical de los epitelios que sirve para absorber solutos, como en el revestimiento del intestino y la pared del tbulo renal. Cada microvellosidad contiene cerca de 25 filamentos de actina mantenidos en disposicin altamente ordenada por las protenas vellina y fimbrina formadoras de haces. Todava no est claro el papel de la miosina I, que se presenta entre las membranas plasmticas de las microvellosidades y los filamentos perifricos de actina.

dentro de un haz determinado se orientan en ambas direcciones. Dado este tipo de organizacin antiparalela, se podra esperar que una fibra de esfuerzo sea una estructura con-

La locomocin celular, como ocurre en un organismo multicelular, de ordinario es imposible de observar, ya que tiene lugar en tejidos opacos y clulas indistinguibles de otras clulas que las rodean. Por consiguiente, la mayora de los investigadores estudian la locomocin celular en sistemas donde se pueden observar clulas nicas conforme se desplazan sobre el fondo del plato de cultivo, segn se muestra en la figura 9-71. La locomocin celular comparte propiedades con otros tipos de locomocin, como la marcha. Si una persona camina, su cuerpo efecta una serie de actividades repetitivas. Primero extiende una pierna en la direccin del desplazamiento; segundo, el extremo inferior del pie hace contacto con el piso, que acta como punto de adherencia transitoria; tercero, los msculos de la pierna generan una fuerza que impulsa el cuerpo (incluyendo la otra pierna) hacia

FIGURA 9-68. Estereocilios que se proyectan desde la superficie de una clula pilosa. Las clulas pilosas, como las que se observan en el odo interno humano, son sensibles a la estimulacin mecnica que provoca el desplazamiento de los estereocilios que se proyectan desde la clula, a) Gammagrafa electrnica de un haz de estereocilios tomados del odo interno de una rana toro, b) Micrografa electrnica de transmisin de una seccin transversal de un estereocilio mostrando que est compuesto de un has denso de filamentos de actina. (a: Cortesa de A.j. Hudspeth y R.A. Jacobs; b: cortesa de A.]. Hudspeth, R.A. acobs y P.G. Gillespie.)

(a)

2 ]in\

372

CAPITULO 9 Citoesqueeto y motilidad celular

(a)

Membrana plasmtica muscular

FIGURA 9-69. Distrofina, una proteina que une filamentos de actina a la membrana plasmtica de las clulas musculares, a) Micrografa de fluorescencia de una porcin de una clula muscular esqueltica de ratn marcada con anticuerpos contra distrofina. La localizacin de la distrofina en la superficie interna de la membrana plasmtica se muestra por las reas de mayor tamao y color rojizo (flechas grandes). La distrofina se localiza donde las lneas Z en los extremos de las sarcmeras entran en contacto con la membrana. Las lneas Z estn dbilmente marcadas debido a que los anticuerpos antidistrofina muestran dbil capacidad para enlazarse a una protena relacionada, -actinina, que est concentrada en las lneas Z (flechas pequeas). Barra, 10 /rn. b) Diagrama de la forma en la cual la distrofina junta protenas integrales de membrana y filamentos de actina. (a; Segn Volker Straub, Reginald E. Bittner, jean }. Leger y Tilomas Voit, J. Cell Biol. 119:1186, 1992; con permiso de Rockcfelkr Uniuersity Press.)

adelante, todo esto mientras se genera traccin contra el punto de adherencia; cuarto, el pie, que ahora se encuentra detrs del cuerpo y no al frente del mismo, se levanta del piso antes del siguiente paso. Aunque las clulas movibles pueden adoptar formas muy diferentes conforme se arras-

tran sobre el sustrato, muestran una secuencia similar repetitiva de actividades (fig. 9-72): 1) el movimiento se inicia por protrusin de una parte de la superficie celular en la direccin del desplazamiento de la clula; 2) una parte de la superficie interna de la clula se fija al sustrato formando un sitio de adherencia; 3) la masa celular se desplaza hacia adelante sobre el contacto adherente, que finalmente entra a formar parte de la porcin trasera de la clula, y 4) la clula se aparta bruscamente de su contacto posterior con la superficie, provocando retraccin del borde trasero o "cola". Clulas que se arrastran sobre el sustrato. Quienquiera que observe a una amiba arrastrndose sobre la superficie de un portaobjetos tiene la oportunidad de ver uno de los tipos ms espectaculares de locomocin celular. Conforme el microorganismo se desplaza, se observan partes de la superficie celular empujadas hacia adelante por una columna de citoplasma que fluye del interior de la clula hacia la periferia (fig. 9-73). Las partes salientes redondeadas y anchas que se forman durante los movimientos ameboides se denominan seudpodos. A medida que el citoplasma fluye al interior del seudpodo que avanza, la amiba se mueve lentamente en una u otra direccin. La locomocin de clulas nicas en organismos evolutivamente elevados de ordinario no se efecta mediante flujo citoplsmico obvio, sino que se acompaa de diferentes tipos de prolongaciones de la superficie celular sobre el borde delantero de la clula. Un fibroblasto de mamfero que se desplaza sobre la superficie de un plato de cultivo puede ser un ejemplo de locomocin muy diferente de la amibiana. Conforme el fibroblasto avanza se aplana sobre el sustrato y por lo general adopta la forma de un abanico con un extremo frontal ancho y una "cola" estrecha (fig. 9-71). Su movimiento es errtico y por saltos, unas veces avanza y otras retrocede. En condiciones adecuadas, un fibroblasto puede moverse una distancia aproximada de 1 mm. La clave de la habilidad de! fibroblasto para la locomocin reside en la orilla delantera, que se extiende fuera de la clula como una prolongacin ancha y aplanada en forma de velo, llamada lamelipodio, la cual se desliza hacia adelante sobre el sustrato (fig. 9-74, a). Los lamelipodios tpicamente estn desprovistos de una estructura particular y su borde externo con frecuencia muestra movimientos ondulatorios que le dan aspecto rugoso (fig. 9-74, b). Conforme el lamelipodio se extiende desde la clula, se adhiere al sustrato subyacente en puntos especficos suministrando sitios transitorios de fijacin sobre los cuales se arrastra la clula. La protrusin de un lamelipodio se acompaa del ensamblado de monmeros de actina en filamentos y la organizacin de estos filamentos en arreglos organizados mediante uniones a protenas enlazadas a actina. En la figura 9-75, a, se muestra la elevada concentracin de filamentos de actina en el borde delantero de una clula que se desplaza en comparacin con el resto del citoplasma. La organizacin tridimensional de los microfilamentos del borde delantero se aprecia mejor luego de extraer las clulas con detergentes no inicos (fig. 9-75, b). Los microfilamentos del lamelipodio suministran una parte esencial del mecanismo necesario para la locomocin. El tratamiento de una clula con citocalasina provoca la rpida desapa-

CAPITULO 9 Citoesqudeto \j motilia celular

373

FIGURA 9-70. Fibras de esfuerzo, a) Distribucin de las fibras de esfuerzo en un fibroblasto cultivado segn lo revelan anticuerpos antiactina fluorescente, b) Disposicin peridica de la tropomiosina dentro de las fibras de esfuerzo de una clula cultivada extendida segn lo revela el tratamiento con anticuerpos antitropomiosina. (a: Segn Elias Lazarides, ], Cell Biol. 65:553, 1975; con permiso de Rockefeller University Press; b: segn ,R. Feramisco y cois. Cold Spring Harbor Conferences on Cel! Proliferarion, vol. 8, 1983.)

ricin de la red de filamentos del lamelipodio y el cese del movimiento. Los lamelipodios tambin contienen numerosas protenas de unin cruzada, cortadoras y formadoras de haces de

actina (pg. 369). La importancia de las protenas accesorias de la actina se aprecia en estudios de clulas del melanoma humano que no pueden expresar la protena ABP de unin cruzada. Estas clulas son incapaces de extender lamelipodios normales, pero en vez de ello muestran muchas

15 [Jtn

FIGURA 9-71. Gammagrafa electrnica de un fibroblasto de ratn "arrastrndose" sobre la superficie de un plato de cultivo. El borde delantero de la clula se extiende mediante un lamelipodio aplanado cuya estructura y funcin se analizan despus en este captulo. (Segn Guentcr Albrecht-Budiler, Int. Rev. Cytol. 120:194, 1990.)

FIGURA 9-72. Secuencia de actividades repetitivas que ocurren conforme una clula se arrastra sobre el sustrato.

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CAPITULO 9 * Citoesqueleto y motilidad celular

FIGURA 9-73. Movimiento ameboide. a) Micrografa de una amiba viviente que se mueve sobre un sustrato, b) Conforme la amiba se desplaza, una columna de endoplasma en estado de solucin (lquido) fluye a travs de la regin central de la clula hacia el extremo frontal, donde fluye lateralmente y se convierte a un estado ms gelifkado. Se cree que la gelificacn del flujo de citoplasma, que resulta de enlaces transversos de los filamentos de actina que forman una red, es el factor que genera la fuerza necesaria para el movimiento de la clula. El citoplasma gelificado de la regin perifrica de la clula se convierte de nuevo a estado de solucin en la regin de la cola, (a: Segn M. Abbey/ Visuals Unlimited.)

(a)
Seudpodo Ncleo Vacuolas alimentarias Regin de gelacin

Vacuola contrctil

\n del movimiento

Citoplasma solado Citoplasma gelado Regin de solacin

(b) burbujas localizadas alrededor de su circunferencia (fig. 9-76). La introduccin de un gen por la protena de unin cruzada perdida en estas clulas restablece su capacidad para formar prolongaciones normales en la superficie y participar en la locomocin dirigida. En la figura 9-77 se muestran dos mecanismos alternos para generar las fuerzas necesarias para formar prolongaciones celulares en el borde delantero de una clula movible. Ambos mecanismos tal vez contribuyan al proceso total de la locomocin celular. Una hiptesis sugiere que, igual

FIGURA 9-74. Borde delantero de una clula mvil, a) El borde delantero de este fibroblasto mvil se aplana contra el sustrato y se extiende en un lamelipodio en forma de velo, b) Gammagrafa electrnica del borde delantero de una clula cultivada que muestra la membrana rugosa del lamelipodio. (n: Cortesa de Vctor Small; b: segn jenn Paul Revel, Symp. Soc. Exp. Biol. 23:447, 1974.)

(a)

(b)

CAPITULO 9 Citoesqueleto y motilidad celular

375

D.l fim

Sprn Filamentos de actina concentrados en el borde delantero de la clula mvil, a) La distribucin de los filamentos de actina dentro del citoplasma de un fibroblasto en locomocin est indicada por los patrones de color. El color rojizo en el borde delantero de la clula indica un filamento de actina con densidad aproximadamente 10 veces mayor que la de color azul ms profundo presente en la masa de la clula, y un incremento al doble de la densidad del filamento de actina sobre las reas amarillo-verdes detrs del borde delantero. El patrn de color se basa en clculos de la densidad del filamento de actina que llega por microinyeccin de anlogos fluorescentes de actina que tienen diferentes propiedades para ensamblarse en filamentos, b) Micrografa electrnica del borde delantero de un lamelipodio del cono de crecimiento de una neurona fijada, extrada con detergente, congelada rpidamente y tratada al agua fuerte. Esta porcin de la clula se observa llena con filamentos de actina que permanecen insolubles despus de la extraccin con detergente no inico. La orientacin general de los filamentos de actina ms largos es perpendicular al borde delantero. Barra, 0.1 /im. (a: Segn Kenneth A. Giuliano y D. Lnnsing Taylor, J. Cell Biol. 124:978, 1994; b: segn Annettc K. Lewis y Paul C. Bridginan, J. Cell Biol. 119:1235, 1992; ambas con permiso de Rockefeller University Press.)

que la formacin del filamento acrosmico (pg. 360), la membrana plasmtica sobresale al exterior como resultado de la unin de subunidades de actina en los extremos de los microfilamentos corticales. Una posibilidad alterna es que la protrusin de la membrana sea consecuencia de fuerzas generadas por interaccin entre molculas de miosna y los microfilamentos corticales. Cuando se impide la accin de la miosina inyectando anticuerpos anti miosina, se afecta de manera adversa la locomocin celular. Estudios con anticuerpos fluorescentes contra diferentes tipos de miosinas indican que la miosina I se localiza de preferencia en el extremo frontal de una clula en movimiento, en tanto que la miosina II se concentra hacia el extremo posterior de la clula (fig. 9-78). Como se mencion anteriormente, las clulas del moho del fango Dictyostelium, que carecen totalmen-

te de miosina II, pueden efectuar locomocin relativamente normal, lo que sugiere que la miosina I puede ser el motor primario para impulsar la locomocin celular. Desde hace muchos aos se sabe que la miosina est presente en regiones mviles de clulas no musculares, pero slo recientemente se observaron filamentos bipolares de miosina pequea en estas regiones. El mecanismo de la miosina para generar las fuerzas encargadas de la locomocin todava es especulativo. El estudio de una clula que se desplaza a travs de un sustrato est lleno de contradicciones. Mientras en el borde delantero de la clula puede ocurrir ensamblado de microfilamentos, en el borde trasero puede estar ocurriendo desensamblado de microfilamentos. Mientras en una parte de la clula se pueden estar formando adherencias al sus-

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CAPITULO 9 CitoesqueSeto y moilidad celular

FIGURA 9-76. Demostracin de requerimiento para una protena enlazada a actina. a) Micrografa de luz de contraste de fases de un fibroblasto testigo que muestra la morfologa normal de una clula que se arrastra, b) Grupo de clulas do melanoma maligno humano que carecen de protena especfica de enlace a actina (llamada PEA). Las clulas son incapaces de formar laminillas, pero en vez de eso forman burbujas esfricas en la superficie de la membrana que no est en contacto con otra clula. (Reimpreso con permiso de Twmas P. Stossel, Science 260:1087, 1993; copyright 1993 American Association for the Advancement of Science.)

trato, en otra parte se estn rompiendo adherencias. Para comprender la locomocin celular es necesario apreciar los aspectos espaciales y temporales de los sucesos celulares. Por fortuna, se dispone de algunas tcnicas que permiten a

los investigadores observar los cambios bioqumicos conforme ocurren en clulas vivientes que efectan su actividad normal. Por ejemplo, se puede observar la distribucin dinmica de actina no polimerizada (actina G) en comparacin con la actina filamentosa (actina F) en clulas vivientes a medida que se desplazan. La actina G se presenta en pequeas "reservas" concentradas detrs del borde delantero

T T T T
(a)
Miosina

T T T T
(b)
FIGURA 9-77. Dos mecanismos para generar fuerzas que conducen a la formacin de prolongaciones en el borde anterior de la clula mvil, a) Diagrama que muestra cmo la polimerizacin de los filamentos de actina en los bordes de la clula puede generar fuerzas mviles. En esfe modelo, las fuerzas se originan a partir de un mecanismo de cremallera en el cual los monmeros de actina se introducen entre los extremos de los filamentos de actina y el borde de la clula. b) En un mecanismo alterno, las fuerzas se generan por motores de miosina que actan sobre filamentos de actina, los cuales se deslizan hacia el borde delantero de la clula. (Segn J. Lee, A, Ishihara y K. acobson. Trenas in Cell Biol. 3:368, 1993.)
20 pin

FIGURA 9-78. Localizacin de la miosina I y la II en una clula mvil. Utilizando anticuerpos conjugados a diferentes colorantes fluorescentes, se observa la miosina 1 (rojo) localizada principalmente dentro del borde anterior de este fibroblasto migratorio, en tanto que la miosina II (verde) se localiza ms cerca de la parte posterior de la clula. La direccin de la migracin est indicada por la flecha. (Segn Patricia A. Conrad y cok. ]. Cell Biol. 120:1389, 1993; con permiso ce Rockefeller University Press.)

CAPITULO 9 Citoesquekto y niotilidad celular

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clula para promover la polimerizacin de actina G en el borde delantero y la formacin de prolongaciones celulares (como en la figura 9-75). Deben recibirse otras seales que desencadenen la despolimerizacin de la red de actina con-

20}im FIGURA 9-7<>. Distribucin relativa de la actina filamentosa y la no filamentosa en una clula epitelial mvil. La actina no filamentosa (actina G) se localiz observando la distribucin de una protena que se une especficamente a la actina monomrica. La actina filamentosa se localiz observando la localizacin de la toxina faloidina de un hongo, que se enlaza especficamente a filamentos de actina. La proporcin entre los dos se calcul y se muestra en color; el rojo indica una regin con alto porcentaje de actina G y el azul un elevado porcentaje de actina F. El frente de la clula est indicado por flechas. Los pequeos grupos de actina no filamentosa se encuentran en una banda justo por detrs del borde delantero del lamelipodio. Estos grupos pueden suministrar una elevada concentracin de actina G secuestrada para el ensamblado rpido en filamentos implicados en la actividad del lamelipodio. (Segn Long-guang Cao, Douglas /. Fishkind y Yu-li Wang, J. Cell Biol. 123:178, 1993; con permiso de Rockefeer University Press.)

de una clula (fig. 9-79), donde presumiblemente est unida a una protena secuestradora de monmeros que evita su polimerizacin espontnea (pg. 369). Se cree que conforme la clula se desplaza hacia adelante pasan seales desde la superficie celular al interior de la corteza de la

HGL'IA 9-80. Estructura de un cono de crecimiento; extremo mvil de un axn en crecimiento, a) Imagen en video de un cono vivo en crecimiento. El extremo terminal se extiende en forma de un lamelipodio aplanado que se arrastra hacia adelante sobre el sustrato. Se pueden observar microespigas (flechas) parecidas a barras dentro del velo transparente del lamelipodio de una fina prolongacin denominada filopodio (cabeza de flecha) que puede observarse proyectndose hacia adelante del borde delantero del lamelipodio. Barra, 5 /m. b) El mismo cono de crecimiento mostrado en a luego de fijar y colorear la clula para actina F utilizando faloidina fluorescente. Los filamentos de actina se concentran en la regin basal del lamelipodio y se alinean con los filopodios. Tambin se observa actina filamentosa a lo largo del borde externo del lamelipodio, que se arrastra hacia afuera sobre el sustrato, c) El mismo cono de crecimiento de a y b teido por inmunoflourescencia en busca de microtbulos. Los microtbulos se concentran en el dominio central del axn, pero estn ausentes sobre todo del lamelipodio. El borde externo del lameiipodio est indicado por los asteriscos en c. (Segn Paul Forscher y Stephen /. Smith, J. Cell Biol. 107:1508, 1988.)

(c)

10 um

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CAPITULO 9 Citoesqueleto y motilidad celular

(a)

(b) FIGURA 9-81. Etapas tempranas en el desarrollo del sistema nervioso de los vertebrados, a-d) Dibujos de los cambios en la forma de la clula que causan la formacin de una capa de clulas ectodrmicas aplanadas en la regin mediodorsal del embrin que se enrolla para formar el tubo neural. El cambio inicial en la altura de las clulas se cree que es gobernado por la orientacin y alargamiento de los microtbulos, en tanto que el enrollamiento de la placa para formar un tubo puede ser controlado por fuerzas contrctiles generadas por filamentos de actina en los extremos apicales de las clulas, e) Gammagrafa electrnica de la superficie dorsal de un embrin de pollo conforme su placa neural se pliega para formar un tubo, (c: Cortesa de Kathryn W. Tosnsy.)

(O

(d)

forme se mueve hacia el interior de la clula. Una vez ensamblados los filamentos de actina, sus movimientos pueden ser controlados por fuerzas generadas por las molculas acompaantes de miosina. Inhibicin del movimiento por contacto. En cultivo de clulas se puede observar una caracterstica importante de la locomocin celular cuando una clula mvil hace contacto con otra. Al contacto sigue inhibicin espectacular de

la actividad ondulatoria de las membranas rugosas en la superficie de los lamelipodios y cese inmediato de la locomocin. Esta conducta se denomina inhibicin del movimiento por contacto. Los acontecimientos subsecuentes dependen del tipo de clulas cultivadas. Los fibroblastos de ordinario detienen su movimiento durante pocos minutos, pero estas clulas pronto desarrollan lamelipodios activos en otros sitios de su superficie que provocan movimiento

CAPITULO 9 Citoesqueleto y motilidad celular

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en nuevas direcciones. Por otra parte, las clulas epiteliales casi siempre permanecen en estrecho contacto sobre la superficie del plato de cultivo. Conforme se une al agregado un nmero cada vez mayor de clulas epiteliales, la poblacin se transforma en una capa cohesiva de clulas no diferentes a las capas de clulas epiteliales formadas dentro del cuerpo.
Crecimiento axonal

Dentro del embrin, los axones de neuronas en desarrollo crecen a lo largo de vas definidas siguiendo ciertas caractersticas topogrficas del sustrato o respondiendo a la presencia de sustancias qumicas que se difunden hacia su camino. Los lamelipodios y filopodios del cono de crecimiento responden a la presencia de estos estmulos fsicos y qumicos provocando que los axones en busca de camino crezcan en la direccin que los lleva al rgano especfico que deben inervar. Cambios morfolgicos en la clula durante el desarrollo embrionario Cada parte del cuerpo tiene una forma caracterstica y una arquitectura interna construidas durante el desarrollo embrionario: bsicamente la mdula espinal es un tubo hueco, el rion consta de tbulos microscpicos, cada pulmn se compone de espacios areos microscpicos, y as sucesivamente. Numerosas actividades celulares se encargan del desarrollo de la morfologa caracterstica de un rgano, incluyendo cambios programados en la forma de la clula. Los cambios morfolgicos de la clula se efectan principalmente mediante cambios en la orientacin de los elementos citoesquelticos del interior celular. En las primeras etapas del desarrollo del sistema nervioso se observa uno de los mejores ejemplos de este fenmeno. Hacia el final de la gastrulacin en los vertebrados, las clulas externas (ectodrmicas) situadas a lo largo de la superficie dorsal del embrin se alargan, formando una elevada capa epitelial denominada placa neural. El alargamiento de las clulas de la placa neural (fig. 9-81, a, b) se logra por ensamblado de microtbulos orientados con su eje longitudinal paralelo al de la clula (recuadro, figura 9-81, b). Despus de su alargamiento las clulas del epitelio neural quedan confinadas a un extremo, adoptando forma de cua, y toda la capa de clulas se incurva hacia adentro (fig. 9-81, c). Este ltimo cambio morfolgico celular se efecta gracias a la contraccin de una banda de microfilamentos ensamblados en la regin cortical de las clulas justo por debajo de la membrana apical (recuadro, figura 9-81, c). Con el tiempo, la incurvacin del tubo neural provoca que los bordes externos entren en contacto para formar un tubo cilindrico hueco (fig. 9-81, d,e) que da lugar a todo el sistema nervioso del animal.

En 1907, Ross Harrison, de la Yale University, efectu uno de los experimentos clsicos en biologa. Harrison quit un pequeo pedazo de tejido del sistema nervioso de un embrin de rana en desarrollo y coloc el fragmento en una pequea gota de lquido linftico. En los siguientes das Harrison observ el tejido con el microscopio y encontr que las clulas nerviosas no slo permanecieron saludables, sino que muchas de ellas desarrollaron prolongaciones hacia el medio circundante. Fue la primera vez que se mantuvieron clulas vivas en cultivo de tejidos, pero este experimento tambin suministr suficientes pruebas de que los axones, que en el cuerpo pueden extenderse varios metros desde el sistema nervioso central hacia los tejidos perifricos, se forman mediante un proceso de crecimiento y alargamiento. El extremo de un axn en etapa de alargamiento es muy diferente del resto de la clula. Aunque al exterior la masa del axn muestra muy pocas pruebas de actividad, el extremo, o cono de crecimiento, recuerda un fibroblasto movible que se arrastra de manera activa. El examen atento del cono viviente en crecimiento muestra la presencia de varios tipos de protrusiones locomotoras: lamelipodios amplios y aplanados que se deslizan hacia afuera sobre el sustrato; microespigas rgidas y cortas {fig. 9-80, a) que apuntan hacia afuera del borde del lamelipodio, yfilopodios muy alargados que se extienden y retraen mostrando continuamente actividad mvil. La microscopia de fluorescencia muestra que todas estas estructuras estn llenas de filamentos de actina (fig. 9-80, b). Por otro lado, los microtbulos no penetran al extremo del cono de crecimiento, sino que llenan el ncleo central del axn que avanza hacia la punta (fig. 9-80, c). El cono de crecimiento es una regin de la clula cuya funcin consiste en explorar el ambiente y prolongar el axn.

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CAPITULO 9 Citoesqueleto y motilidad celular

LA VIA E X P E R I M E N T A L

El motor molecular que impulsa el transporte agonal rpido

Tericamente, fa resolucin mxima posible con el microscopio de luz es una propiedad que depende de la longitud de onda de la luz y es de casi 0.2 /m. Por consiguiente, si dos objetos estn separados por una distancia menor de 0.2//m no pueden observarse como objetos distintos con el microscopio de luz (seccin 17-1). Hacia 1970, las compaas pticas haban producido entes capaces de lograr la mxima resolucin posible con el microscopio de luz. Pero tambin se dispona de una nueva tecnologa para superar esa limitacin. La mayor parte de los microscopios compuestos poseen un par de lentes oculares a travs de los cuales el observador visualiza el campo, y un tercer ente ocular donde se coloca una cmara para fotografiar el campo. Con el desarrollo de la videotecnologa porttil fue posible sustituir la cmara de cine por una cmara de video y observar lo que ocurre bajo el microscopio en una pantalla de televisin. La cmara de video no so suministra una nueva manera de emplear el microscopio de luz, sino que incrementa mucho el lmite de resolucin del instrumento.1'2 Hay varias razones para este fenmeno, y la ms notable es que las cmaras de video aumentan notablemente el contraste de los objetos en el campo de modo que su tamao relativo aparezca amplificado y sus bordes muy distintos. Cuando se combina la observacin en video con la microscopa de contraste por interferencia diferencial (CID) (seccin 17-1), se pueden resolver objetos tan pequeos como los filamentos intermedios (10 nm de dimetro) y los microtbulos {25 nm de dimetro). La tcnica se conoce como microscopa de contraste por interferencia diferencial con amplificacin por video (MCID-CAV). Uno de los pioneros de la videomicroscopia fue Robert Alien, del Dartmouth College. Alien se interes por mucho tiempo en el movimiento citoplsmico, y uno de los primeros proyectos que emprendi utilizando la MCID-CAV fue el examen de la clula nerviosa viviente. Desde aos antes se saba que algunos materiales, incluyendo vesculas sinpticas, se desplazan del cuerpo celular sobre el trayecto del axn a velocidades hasta de 5/im/seg. Se pensaba que este transporte axonal rpido, como se le llama (pg. 334), ocurra a lo largo de los mcrotbulos, pero no estaba claro si los microtbulos actuaban simplemente como vas para el movimiento del organelo o participaban de manera ms activa generando las fuerzas mviles. En 1982, Alien y sus colaboradores publicaron un trabajo acerca del movimiento de vesculas muy pequeas (30 a 50 nm) sobre el trayecto del axn gigante del calamar utilizando MCID-CAV. Se observaron vesculas en movimiento continuo en una sola direccin, fuese hacia el extremo terminal (anterogrado) o hacia el cuerpo celular (retrgrado) con velocidad promedio de 2.5 /m/seg y ms rpida hasta de 5 Las vesculas se desplazan a lo largo de elementos lineales, presumiblemente FI o microtbulos, que no pudieron distinguirse. Una de las ventajas de trabajar con axn gigante es que el citoplasma (o axoplasma) puede exprimirse fuera de la clula de manera no muy diferente a la extraccin de pasta dental de su contenedor. El axoplasma extruido retiene muchas de las propiedades del axoplasma celular, pero es ms accesible para manipular y tratar con diferentes sustancias. Por ejemplo, se observ que el movimiento de las vesculas contina casi a la misma velocidad en el axoplasma extruido en comparacin con la clula ntegra.4 La tcnica MCID-CAV permiti observar con mayor claridad los elementos lineales que definen la va del movimiento en el axoplasma extruido en comparacin con el axn intacto. Lo ms importante fue demostrar que el transporte axonal rpido puede continuar fuera de los confines de una clula intacta y probar que las molculas se encargan de transportar organelos. En 1985 se public una serie de trabajos resultado de los esfuerzos en colaboracin de Ronald Vale, Bruce Schnapp, Thomas Reese y Michael Sheetz, que aclararon mucho el mecanismo del transporte axonal. Para iniciar sus estudios diluyeron axoplasma extruido aadiendo una solucin salina apropiada, que no tena el efecto de dispersar el contenido del axoplasma, de modo que los filamentos individuales podan observarse con mayor facilidad utilizando MCID-CAV.5 En estas condiciones, vesculas de tamao muy variable se desplazaban continuamente a lo largo de filamentos lineales a una velocidad uniforme de 2.2 //m/ seg, sugiriendo que el transporte axonal rpido se debe a un solo tipo de motor molecular. En algunos casos se observaron organelos desplazndose a lo largo de ms de un filamento a la vez, lo que indicaba que los organelos tenan mltiples sitios de enlace para el motor. E movimiento del organelo requiere ATP. En ausencia de ATP, los organelos se inmovilizan y permanecen enlazados a los filamentos. Vale y sus colegas desarrollaron un mtodo para observar el movimiento de los organelos en un axoplasma extruido y luego fijar la preparacin de modo que el mismo filamento y organelo observados por vdeo se pudieran examinar con el microscopio electrnico (fig. VE 9-1, a,b). El examen atento revel que los organelos podan moverse a lo largo de filamentos individuales en ambas direcciones y, en realidad, podan rebasarse sin chocar (fig. VE 9-2).& Esta observacin sugiri que cada filamento tiene varias vas a lo largo de las cuales se pueden mover los organelos. Los filamentos con sus organelos unidos tenan aproximadamente 25 nm de dimetro y una subestructura que sugera que eran microtbulos. El empleo de anticuerpos inmunofluorescentes confirm que estaban constituidos por tubulina. Puesto que todos los

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381

2.0 jan

FIGURA VE 9-2. Secuencia de las micrografas de video que muestran movimiento bidireccional de organelos (tringulos) sobre los filamentos orientados vertkahnente mostrados en la figura VE 9-1. (Segn B.]. Schnapp y cois. Cell 40:458, 1985; con permiso de Cell Press.)

1.5 un FIGURA VE 9-1. Video correspondiente (izquierda) y micrografa electrnica (derecha) de los mismos dos filamentos observados por video que participan en el transporte de vesculas. Se muestran ambas imgenes a la misma amplificacin; la diferencia en el tamao de los filamentos ilustra la forma en la cual la microscopa de video amplifica el tamao aparente de los objetos pequeos. (Las flechas indican los filamentos ms pequeos irrelevantes para el anlisis.) (Segn B.}. Schnapp y col?. Cell 40:458, 1985; con permiso de Cell Press.)

protofilamentos de un microtbulo se orientan en la misma direccin y los organelos pueden desplazarse en ambas direcciones a lo largo de un microtbulo, algn factor distinto del propio microtbulo debe definir la direccin del movimiento. La atencin se volvi a una protena motora que pudiera desplazarse a lo largo de un microtbulo. Para 1985 se haba aislado y caracterizado la dinena como protena motora causante del movimiento ciliar (pg. 346), y estudios efectuados en huevos del erizo de mar indicaban que tambin poda existir una forma citoplsmica de dinena. Pero era poco probable que, incluso si la dinena fuera la encargada del movimiento citoplsmico del organelo, pudiera transportar materiales en ambas direcciones a lo largo de mismo microtbulo. En una publicacin subsecuente. Vale y sus colegas reconstituyeron con xito un sistema de transporte axonal con ingredientes separados.7 Los microtbulos que fueron utiliza-

dos como "rieles" para el movimiento se prepararon a partir de tubulina soluble polimerizada en presencia de taxol, un frmaco que promueve e! ensamblado y estabiliza el polmero (pg. 342). A continuacin se extrajeron los microtbulos ensamblados con 1 M de NaCl para eliminar las protenas no tubulina que pudieran acompaar a las estructuras. El anlisis subsecuente de la protena de estos microtbulos mostr que constan principalmente de tubulina. El axoplasma obtenido de cerebro de calamar se separ en varias fracciones mediante centrifugacin a travs de un gradiente con varias concentraciones (densidades) de sacarosa. Una de las fracciones (recolectada en el lmite entre las capas de sacarosa de 15 y 35%) contena vesculas membranosas de dimensiones correspondientes al intervalo que se sabe son transportadas in vivo (0.05 a 0.5 m). Cuando se aadi esta fraccin de organeos a la fraccin purificada de microtbulos en presencia de ATP, prcticamente no se observ movimiento de los organelos. Se obtuvo una segunda fraccin de axoplasma del sobrenadante acumulado en la parte superior del tubo luego de la centrifugacin a travs del gradiente de sacarosa. Este sobrenadante (designado S2) contena una mezcla compleja de polipptidos, segn mostr la electroforesis en gel de poliacrilamida (EGPA), pero se encontraba libre de organelos, microtbulos y filamentos ms pequeos. Cuando se mezcl el sobrenadante S2 con la fraccin de organelos y microtbulos purificados en presencia de ATP, los organelos comenzaron a fija/se a los microtbulos y a desplazarse a lo largo de los mismos. A diferencia de los resultados con axoplasma exrruido, el movimiento de organelos promovido por el sobrenadante S2 ocurri en una sola direccin y a lo largo de un solo microtbulo. No slo los organelos se desplazaron a lo largo de los microtbulos, sino que tambin lo hicieron los propios microtbulos a lo largo de la superficie del cubreobjetos de vidrio (fig. VE 9-3). El movimiento de los microtbulos requiere la adicin del sobrenadante S2, no as el de los organelos. Cuando se coloc una pequea gota de sobrenadante sobre un cubreobjetos de vidrio durante unos pocos minutos y luego se lav cuidadosamente el cubreobjetos y se sec con papel absorbente antes de aadir los microtbulos, se observ que los microtbulos an se mueven sobre el cubreobjetos en presencia de ATP. Esto indica que el factor del sobrenadante que

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CAPITULO 9 Citoesqueleto y moiilidad celular

GLOBUUTO

VESCULA

FIGURA VE 9-4. Modelo esquemtico que muestra cmo una protena motora del sobrenadante S2 puede apoyar la translocacin de organelos, globulillos carboxilados y microtbulos. La direccin de movimiento del organelo y del globulito a lo largo de los microtbulos es opuesta a la direccin del movimiento del microtbulo sobre el vidrio, segn io indican las flechas. (Segn R.D. Vale y cois. Cell 40:567, 1955; con permiso de Cell Press.)

1.0 Jim

FIGURA VE 9-3. Movimiento de los microtbulos purificados a lo largo de una superficie de vidrio en presencia del sobrenadante S2. Se indican los tiempos transcurridos en la parte superior derecha en segundos: dcimas de segundo. Se pueden observar tres microtbulos designados b, c y d, que se mueven diagonalmente desde el extremo inferior izquierdo hasta el superior derecho, en tanto que otro microtbulo (a) se mueve horizontalmente. Un organelo (*) fijo al cubreobjetos suministra un punto de referencia estacionario. (Segn H.D. Vale y cois. Cell 40:564, 1985; con permiso de Cell Press.)

promueve el movimiento puede adherirse al vidrio y todava retener su capacidad para actuar como motor del microtbulo. Experimentos subsecuentes indicaron que se podan incubar esferitas de ltex en el sobrenadante 52 y que el agente motor

se adhiere a las esferitas. Cuando estos globulitos "recubiertos" se aadieron a los microtbulos extendidos sobre el cubreobjetos, los globulitos se movieron en una sola direccin a lo largo de un microtbulo estacionario. El desplazamiento de microtbulos sobre la superficie del vidrio o de las esferitas sobre los microtbulos requiere la adicin de ATP. Si se aadiera adenil mido difosfato (AMP-NFP), un anlogo de ATP que no se hidroliza, en vez de ATP, cesara todo movimiento. Los investigadores concluyeron que "todos estos movimientos pueden ser controlados por una sola ATPasa soluble que se enlaza de manera reversible a los organelos, globulitos o cristal y generan una fuerza translocadora sobre el rnicrotbuo". El componente soluble que promueve el movimiento de los organelos es sensible a tripsina y a la desnaturalizacin por calor, lo que indica que es una protena, la cual presumiblemente acta de manera similar a tripsina o dinena. El desarrollo de un sistema capaz de generar movimiento suministr el ensayo necesario para purificar la protena motora causante de la. translocacin de organelos basada en microtbulos en el sobrenadante 52. En la figura VE 9-4 se muestra un modelo del mecanismo de la protena motora del sobrenadante que puede operar en el movimiento de globulitos, vesculas y microbulos. A finales de 1985, Vale y sus colaboradores publicaron un trabajo afirmando haber purificado la protena motora.8 La purificacin se bas en la demostracin inicial de que las partculas de axoplasma de calamar se fijan firmemente a los microtbulos en presencia del anlogo no hidrolizable de ATP, o sea, AMP-NFP.9 La explicacin de sus resultados es que a protena motora relacionada con estos organelos se une al microtbulo y luego se fija porque el AMP-NFP enlazado al sitio ATPasa no se hidroliza. Si este fuera el caso, entonces sera posible purificar la protena motora permitiendo que el sobrenadante 52 interactuara con los microtbulos en presen-

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cia de AMP-NFP. Siguiendo este protocolo, se encontr una protena de aproximadamente 600 kD enlazada a los microtbulos y liberada por adicin de ATP. Cuando la protena liberada se aplic a una preparacin de rnicrotbulos purificados, los rnicrotbulos se desplazaron sobre el cubreobjetos. Un anlisis subsecuente de los componentes polipptidos de la protena indic que era distinta de miosina y de dinena, y por lo tanto perteneca a una nueva clase de molculas generadoras de fuerza. Se les denomin protenas cinesina (del griego kinein, mover). En el ltimo trabajo publicado de la serie de 1985, Vale y sus colaboradores comunicaron propiedades adicionales de la cinesina.10 Como se mencion antes, demostraron que el sobrenadante S2 (que contiene la molcula de cinesina soluble) promueve el movimiento de organelos a lo largo de un solo microtbulo en una sola direccin. Para determinar la direccin de la translocacin fue necesario emplear rnicrotbulos cuyos extremos ms y menos fueran identificabas. Esto se logr al permitir la polimerizacin de la tubulina purificada sobre los centrosomas in vitro y empleando estos rnicrotbulos de polaridad definida como sustrato para el movimiento de partculas. Como se analiz en la pgina 339, los rnicrotbulos crecen con sus extremos ms alejndose del centrosoma y sus extremos menos en direccin a dicho centrosoma. Cuando se aadieron molculas de cinesina unidas a globulitos de ltex a estos rnicrotbulos, los globulitos siempre se desplazaron a lo largo de la va microtubular desde el extremo menos al extremo ms. Es evidente que la cinesina es un motor dirigido hacia el extremo ms del microtbulo. Puesto que el movimiento antergrado dentro del axn tambin se dirige hacia el extremo ms, los investigadores concluyeron que la cinesina era el motor encargado del transporte antergrado de vesculas en la clula nerviosa. Pero ei movimiento de organelos en axones intactos ocurre en ambas direcciones, antergrada y retrgrada. Recordemos que el axoplasma extruido promueve el movimiento de las partculas en ambas direcciones a lo largo de un solo microtbulo. Cuando se incubaron globulitos de ltex en una fraccin solubilizada cruda (designada Sla) de tejido cerebral, estos giobulitos tambin, fueron capaces de movimientos bidireccionales a lo largo de microtbulos nicos. Segn estos datos, pareci que la fraccin soluble cruda contena tanto el motor antergrado {cinesina) como el motor retrgrado (una protena desconocida) y que los sucesivos pasos de purificacin para pasar de SI a S2 retiraron e! motor retrgrado. Se volvi entonces la atencin a tratar de distinguir entre las dos molculas motoras. En un experimento, se prepar un anticuerpo contra cinesina purificada.10 Las molculas del anticuerpo se unieron posteriormente mediante enlaces covalentes a globulitos de cefarosa y se emplearon dichos globulitos para empacar una columna. La fraccin cruda Sla se pas a travs de la columna, con la expectativa de eliminar las molculas de cinesina de la fraccin. Cuando se incubaron los globulitos de ltex con el lquido que haba pasado a travs de la columna, dichos globulitos se movieron ahora a lo largo de los microtbulos, slo en direccin retrgrada, suministrando mayores datos de que los movimientos antergrado y retrgrado requieren pro-

tenas motoras diferentes y que la cinesina no es el motor retrgrado. En otro experimento, la fraccin cruda Sla se trat con Netilmaleimida (NEM) y vanadato antes de incubarla con los globulitos de ltex. Los globulitos incubados con esta fraccin ya no se movieron en ambas direcciones, sino slo hacia el extremo ms de los microtbulos, o sea, en direccin antergrada. Estos resultados indican que las protenas motoras antergrada y retrgrada tienen diferente sensibilidad a frmacos, proporcionando as mayores datos de que son protenas muy diferentes. Se sabe que la N-etilmaleimida y el vanadato son agentes inactivadores de protenas motoras similares a dinena, por lo que se plantea la posibilidad de que el motor retrgrado es una protena semejante a dinena. La naturaleza del motor retrgrado todava se est investigando. En el decenio pasado se lograron considerables avances en el estudio de la estructura y funcin de la cinesina. La cinesina ha sido implicada en el movimiento de varios tipos diferentes de organelos membranosos en diversos tipos de clulas. Puesto que la cinesina es una protena motora que causa movimiento de organelos a lo largo de los microtbulos, los organelos translocados deben ser capaces de unirse a molculas de cinesina. Se aisl una protena integral de membrana en vesculas de clulas embrionarias de cerebro que al parecer acta como receptor de cinesina.11 A esta protena se le dio el nombre de quinectina, y quiz sea parte de la familia de protenas implicadas en el trfico de vesculas del tipo descrito en el captulo 8. Las bases moleculares de la accin de la cinesina todava se investigan activamente mediante ensayos de motilidad in vitro. Tomados en conjunto, estos estudios han proporcionado un conocimiento considerable del mecanismo mediante ei cual los organelos membranosos se desplazan de manera dirigida de una parte de la clula a otra.

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CAPITULO 9 Citoesqueleto y motihdad celular

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SINOPSIS
El citoesqueleto se compone de tres tipos distintos de estructuras fibrosas: microtbulos, filamentos intermedios y microfilamentos (filamentos de actina), que participan en varias actividades celulares. En conjunto, los elementos del citoesqueleto actan como apoyo estructural que ayuda a mantener la forma de la clula; como armazn interna encargada del acomodo de varios organelos en el interior de la clula; como parte del mecanismo requerido para el movimiento de materiales y organelos dentro de las clulas; como elementos generadores de fuerza encargados del movimiento de las clulas de un sitio a otro; como sitios para fijar RNAm y facilitar su traduccin en polipptidos, y como transductor de seales, transmitiendo informacin de la membrana celular al interior de la clula (p. 325). La microscopa de fluorescencia, la videomicroscopia, los ensayos de motilidad in vitro, la microscopia electrnica, y el empleo de la biologa molecular y de imitantes genticos han demostrado utilidad especialmente en el estudio del citoesqueleto. La microscopia de fluorescencia se emplea para estudiar la dinmica del citoesqueleto siguiendo el destino de las protenas citoesquelticas marcadas con fluorescencia e inyectadas a clulas vivientes, o por el empleo de anticuerpos fluorescentes u otras sondas para localizar componentes citoesquelticos especficos dentro de clulas o cortes de tejido fijados. Tambin se puede usar la videomicroscopia para visualizar los elementos del citoesqueleto mediante microscopio de luz, lo que permite a los investigadores estudiar las actividades de las protenas motoras utilizando ensayos de motilidad in vitro (p. 327). Se han identificado y caracterizado tres familias de protenas motoras: las cinesinas y las dinenas que se mueven a lo largo de los microtbulos, y las miosinas que se mueven a lo largo de los microfilamentos. Estas protenas pueden convertir la energa qumica almacenada en el ATP en energa mecnica para mover cargas celulares fijas al motor. Las fuerzas se generan por cambios de conformacin en la protena motora y se acoplan a un ciclo qumico que implica enlace e hidrlisis de nucletidos y la liberacin de los productos enlazados (p. 329). Los microtbulos son estructuras cilindricas huecas de 25 nm de dimetro que se ensamblan a partir de la protena tubulina y, adems de constituir el citoesqueleto, forman parte del huso mittico, centrolos y el ncleo central de cilios y flagelos. Los microtbulos son polmeros ensamblados a partir de heterodmeros cr//3-tubulina dispuestos en hileras o protofilamentos. Gran parte de las propiedades de los microtbulos, incluyendo su flexibilidad, estabilidad y capacidad para interactuar, son influidas por miembros de un grupo de protenas relacionadas con microtbulos (PRM). Dada su aparente rigidez, los microtbulos con frecuencia muestran capacidad para servir como apoyo, no distinta a la manera como las vigas de acero apoyan un edificio alto. El papel estructural de los microtbulos es ms evidente cuando se examinan prolongaciones celulares muy alargadas, como el axopodio de protozoarios y los axones de neuronas, ambas estructuras llenas con microtbulos orientados paralelamente al eje largo de la prolongacin. Los microtbulos tambin funcionan en actividades tan diversas como influir el depsito de celulosa en la pared de una clula vegetal; mantener la posicin de organelos membranosos en la va biosinttica, incluyendo RE y complejo de Golgi, y mover vesculas y otros materiales entre el cuerpo celular y la porcin terminal de axn de una neurona (p. 330). Cinesina y dinena citoplsmicas desplazan materiales en direcciones opuestas a lo largo de microtbulos. Tanto la cinesina como la dinena citoplsmica son protenas motoras grandes que poseen cabezas globulares que interactan con los microtbulos y funcionan como mquinas generadoras de fuerza, y un extremo opuesto que se enlaza a los tipos especficos de carga que debe transportar. La cinesina mueve materiales hacia el extremo ms del microtbulo y la dinena citoplsmica hacia el extremo menos. Se cree que la cinesina participa en el,movirniento de vesculas derivadas del RE, endosomas, Hsosomas y granulos secretorios, y se ha demostrado que es la protena motora primaria que media el transporte antergrado en un axn (desde el cuerpo celular a la terminal del axn) (p. 334). La nucleacin in vivo de microtbulos se relaciona con varios centros organizadores de microtbulos. En clulas animales, los microtbulos del citoesqueleto de ordinario se forman en un centrosoma, estructura compleja que contiene dos centrolos en forma de barril rodeados por un material amorfo percentriolar electrnicamente denso. Los centrolos contienen nueve fibrillas regularmente espaciadas, cada una compuesta de tres microtbulos, y que en general se presentan en pares cuyos miembros se orientan en ngulo recto entre s. Los microtbulos tpicamente se irradian hacia afuera del material pericen trio lar, que se cree contiene los elementos necesarios

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para la nucleacin del microtbulo. Los microtbulos que forman las fibras de un cilio o de un flagelo se originan de un corpsculo basa! que prcticamente tiene la misma estructura que el centrolo. Centrolos y corpsculos bsales pueden autogenerarse. Centrosomas, corpsculos bsales y otros centros organizadores de microtbulos, como la superficie externa de la envoltura nuclear de clulas vegetales, comparten una protena comn llamada y-tubulina, que al parecer desempea un papel clave en la nucleacin de microtbulos (p. 337). Los microtbulos del citoesqueleto son polmeros dinmicos sujetos a acortamiento, alargamiento, desensamblado y reensamblado. Varios agentes pueden inducir desensamblado del citoesqueleto microtubular, incluyendo colquicina, temperatura fra y concentracin elevada de Ca2+. Los microtbulos del citoesqueleto normalmente se desensamblan antes de la divisin celular y las subunidades de tubulina se reensamblan como parte del huso mittico, el cual se desensambla luego de la divisin celular, y las subunidades se emplean para reensamblar el citoesqueleto. En todo momento, algunos microtbulos del citoesqueleto estn creciendo en tanto que otros se encogen. Cuando se observa continuamente un microtbulo individual, se pueden notar fases alternas de crecimiento y encogimiento hacia atrs y adelante, fenmeno conocido como inestabilidad dinmica. Tanto el crecimiento como el encogimiento ocurren de manera predominante, si no exclusiva, en el extremo ms del polmero, el extremo opuesto al centro organizador de microtbulos. Los dmeros de tubulina ensamblados en el microtbulo contienen una molcula GTP que se hidroliza poco despus de su incorporacin al polmero. Durante los periodos de ensamblado rpido, la hidrlisis del GTP enlazado a los dmeros de tubulina incorporados retrasan la incorporacin de nuevos dmeros, de modo que el extremo del microtbulo est recubierto por un casquete de dmeros de tubulina-GTP que favorece la adicin de nuevas subunidades y el crecimiento del microtbulo. Ensamblado y desensamblado tambin pueden ser operados por la concentracin de Ca2+ y la presencia de PRM especficos (p. 340). Cilios y flagelos contienen una estructura central, el axonema, compuesta de una disposicin de microtbulos que apoyan al organelo conforme se prolonga desde la superficie celular y constituye el mecanismo para generar las fuerzas requeridas para la locomocin. En seccin transversal, se observa que un axonema consta de nueve dobletes de microtbulos en el exterior {un microtbulo A completo y un microtbulo B incompleto) rodeando un par de microtbulos sencillos. Un par de brazos se proyecta desde el microtbulo A de cada doblete. Los brazos se componen de dinena ciliar, una protena motora que utiliza la energa liberada por hidrlisis de ATP para generar las fuerzas requeridas para inclinar los cilios o los flagelos. Esto se logra por unin de los brazos de dinena de un doblete al microtbulo B del doblete vecino y por un cambio de conformacin que obliga al microtbulo A a deslizarse una distancia perceptible. A continuacin el brazo de dinena se separa del tbulo B y vuelve a unirse a otro sitio para empezai un nuevo ciclo. El deslizamiento sobre un lado del axonema alterna con el deslizamiento sobre el otro lado, de modo que una parte del cilio o del flagelo primero se inclina en una direccin y luego en la direccin opuesta. Se ha demostrado

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directamente el deslizamiento de microtbulos uniendo globulitos a los dobletes de axonemas desmembranados y observando sus movimientos relativos luego de reactivacin. La direccin y velocidad de los latidos ciliares o flagelares son reguladas por iones calcio y AMP cclico (p. 344). Los filamentos intermedios (FI) son estructuras citoesquelticas semejantes a cuerdas de casi 10 nm de dimetro que, segn el tipo de clula, pueden componerse de diversas subunidades de protenas capaces de ensamblarse en tipos similares de filamentos. A diferencia de los microtbulos, los filamentos se componen de bloques de construccin simtricos fsubunidades tetramricas), que se ensamblan en filamentos que carecen de polaridad. Los FI son resistentes a fuerzas de traccin y relativamente insolubles, pero igual que los otros dos tipos de elementos citoesquelticos, son estructuras dinmicas que incorporan rpidamente subunidades marcadas con fluorescencia e inyectadas a las clulas. Se piensa que ensamblado y desensamblado son controlados sobre todo por fosforilacin y desfosforilacin. Se cree que los FI suministran estabilidad mecnica a las clulas y proporcionan funciones especializadas a tejidos especficos (p. 351). Los filamentos de actina (o microfilamentos) tienen 8 nm de dimetro, se componen de una doble hlice de polmero de la protena actina, y desempean un papel clave prcticamente en todos los tipos de contractilidad y motilidad dentro de la clula. Segn el tipo de clula y la actividad, los filamentos de actina se pueden organizar en disposiciones muy ordenadas, redes laxas mal definidas, o haces firmemente reunidos. Con frecuencia los filamentos de actina se identifican por su capacidad para unirse a fragmentos especficos de miosina (MMP o cabezas SI) que tambin revelan la polaridad del filamento. Aunque ambos extremos de un filamento de actina pueden ganar o perder subunidades, el extremo barbudo (o extremo ms) del filamento es el sitio preferido para la adicin de subunidades y el extremo puntiagudo (o extremo menos) es el sitio preferido para la prdida de subunidades. Para que una subunidad de actina se incorpore al extremo en crecimiento de un filamento, debe enlazarse a un ATP que se hidroiza poco despus de su incorporacin. Se cree que el ensamblado de los microfilamentos, igual que el de los microtbulos, es ayudado por la presencia de un casquete de actinaATP en el extremo en crecimiento. Las clulas mantienen equilibrio dinmico entre las formas monomrica y polimrica de actina, que puede alterarse por cambios en varias condiciones locales. El papel de los filamentos de actina en un proceso particular se puede probar fcilmente tratando las clulas con una citocalasina, que promueve la despolimerizacin del filamento, o con faloidina, que evita su desensamblado y participacin en actividades dinmicas (p. 354). Las fuerzas encargadas de procesos dependientes del microfilamento se pueden generar por ensamblado del filamento de actina o, con mayor frecuencia, como resultado de la interaccin con la protena motora miosina. La reaccin acrosmica, que ocurre en el extremo de un espermatozoide justo antes de la fertilizacin, y la propulsin de ciertas bacterias a travs del citoplasma de un fagocito infectado, son dos procesos gobernados por la polimerizacin de actina. Las miosinas

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9. Contrastar los movimientos de un flagelo y de un cilio. Describir los mecanismos mediante los cuales estos organelos pueden sufrir movimientos de inclinacin. Cul es el papel de los puentes entre los dobletes (nexinas) en estos movimientos? Cul es el papel de la base de las molculas de dinena? 10. Cmo pueden influir los iones calcio y el AMPc en la velocidad y direccin de los latidos ciliares? 11. Contrastar los papeles de la miosina I y la miosina II en las actividades celulares. 12. Describir la estructura de la sarcmera de una miofibrilla muscular esqueltica y los cambios que ocurren durante su contraccin.

13. Describir los pasos que ocurren entre el momento que un impulso nervioso se transmite a travs de una unin neuromuscular y el momento en que la fibra neuromuscular realmente comienza a acortarse. Cul es el papel de los iones calcio en este proceso? 14. Elaborar una lista de varios tipos de protenas unidas a actina y una funcin de cada tipo. 15. Contrastar el movimiento de una amiba con el de una clula de mamfero que se arrastra sobre un sustrato. 16. Describir el papel de los filamentos de actina en las actividades del cono de crecimiento de una neurona.

PREGUNTAS ANALTICAS
1. Si se tira de una miofibrilla de modo que la sarcmera aumente su longitud casi 50%, qu efecto se esperara que tuviera sobre la capacidad contrctil de la miofibrilla? Por qu? Qu efectos tendra sobre las bandas H, A e I? 2. Supongamos que usted est estudiando el movimiento de un axonema ciliar desmembranado y olvid aadir ATP a la mezcla de incubacin. Qu efecto esperara sobre la posicin de los brazos de dinena? Por qu? 3. Cules son los dos tipos de motilidad no muscular que pueden ser afectados por los anticuerpos contra miosina I y miosina II? Por qu? 4. Un centrolo contiene microtbulos completos y un cilio tiene microtbulos completos. 5. Si el modelo de nucleacin de los microtbulos mediante y-tubulina de la figura 9-25 fuera correcto, qu podra concluirse acerca de la estructura de los extremos ms de un microtbulo citoesqueltico? 6. Elaborar una lista de cuatro cosas que se podra hacer para cambiar el equilibrio dinmico de una preparacin in vitro de tubulina y de microtbulos haca la formacin de microtbulos. Elaborar una lista de cuatro tratamientos que cambiaran el equilibrio en la direccin opuesta. 7. Se mencion que el axonerna ciliar o flagelar desmembranado puede latir con una frecuencia y patrn normales. Se podra concluir que la membrana plasmtica no es importante en la funcin de los cilios o de los flagelos? 8. Puesto que se observa que las vesculas citoplsmicas se mueven en ambas direcciones dentro de un axn, se podra concluir que algunos microtbulos estn orientados con sus extremos ms enfrentando al axn terminal y otros orientados por la polaridad opuesta? 9. Estara usted de acuerdo con la afirmacin de que el centrosoma desempea un papel clave para determinar la velocidad de alargamiento y acortamiento de los microtbulos de una clula animal? Por qu si o por qu no? 10. Si usted estuviera comparando a estructura molecular de una cinesina y una dinena, qu parte (cabeza o cola) esperara que fueran ms similares? Por qu? 11. La figura 9-33 muestra el aspecto de una seccin transversal de un axonema ciliar cortado a travs de una parte interior del cilio. Cmo podra diferir la imagen de una seccin transversal s se hubiera cortado muy cerca del extremo de un cilio al iniciar un latido de recuperacin? 12. Algunos anticuerpos capaces de enlazarse a cinesina pueden impedir el movimiento del organelo, en tanto que otros anticuerpos anticinesina parece que tienen poco efecto. Cmo se podra explicar esta observacin? 13. Por qu piensa usted que se aprendera ms acerca de la dinmica del microtbulo inyectando tubulina fluorescente en una clula en vez de tubulina marcada con istopos radiactivos? Podra plantear una pregunta que fuera mejor respondida empleando tubulina marcada con istopos radiactivos? 14. Supongamos que descubre que un ratn carece de las copias del gen cinesina y que aparentemente no muestra efectos nocivos y vive hasta una edad avanzada. Qu se podra concluir acerca de la importancia de la cinesina en la locomocin intracelular? IS.^Qu tipo de tejido de vertebrados esperara usted que fuera una fuente excelente de tubulina? De actina? De queratina? Qu protena esperara usted que fuera menos soluble y ms difcil de extraer? Qu tipos de protena se esperaran como contaminantes en una preparacin de tubulina? Cules en una preparacin de actina?

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CAPITULO

10

Naturaleza del gen y del genoma

10-1 Cromosomas: portadores fsicos de los genes 10-2 Naturaleza qumica del gen 10-3 Estructura del genoma 10-4 Estabilidad del genoma 10-5 Mapas moleculares del genoma

La perspectiva humana: Mapeo del genoma humano La perspectiva humana: Correccin de trastornos genticos mediante geneterapia La va experimental: Naturaleza qumica del gen

a ciencia de la gentica se inici con el trabajo de Gregor Mendel, alrededor de 1860. El laboratorio de Mendel fue un pequeo jardn en los terrenos del monasterio austriaco donde viva. No se sabe exactamente qu motiv a Mendel a comenzar sus estudios, pero evidentemente tena un pan experimental muy claro en la mente: su objetivo era aparear, o cruzar, plantas de guisante con diferentes caractersticas hereditarias y determinar el patrn de transmisin de dichas caractersticas a los descendientes. Mendel eligi guisantes de jardn como objeto de estudio por varias razones prcticas, sobre todo porque poda obtener una variedad de semillas que daran plantas con caractersticas distintas. Mendel decidi enfocarse sobre siete caracteres o rasgos claramente definibles, como altura de la planta o color de sus flores, cada uno de los cuales apareca en dos formas alternativas que podan identificarse con claridad (cuadro 10-1). Despus de varios aos de cuidadosos estudios cultivando y cruzando sus plantas durante varias gener,aciones y contando el nmero de individuos que mos-

CUADRO 10-1. Los siete rasgos de las plantas de guisantes de Mendel

Rasgo Alelo dominante Alelo recesivo

Altura de la planta Color de las semillas Forma de las semillas Color de las flores Posicin de las flores Color de la vaina Forma de la vaina

Alta Amarillo Redonda Prpura A lo largo del tallo Verde Inflada

FIGURA 10-A. Imagen generada por computadora de la doble hlice de DNA. (Segn Will y Deni Mclntyre/Photo Researchers.)

Baja Verde Angular (rugosa) Blanco En los extremos del tallo Amarillo Constreida

389

390

CAPITULO 10 Naturaleza del gen y del genoma

traban diferentes caractersticas, Mendel lleg a as siguientes conclusiones: 1. Las caractersticas de las plantas eran gobernadas por factores (o unidades) de herencia, que ms tarde llam genes. Cada planta posea dos copias del gen que controla el desarrollo de cada rasgo, uno derivado de cada progenitor. Los dos genes podan ser idnticos o no idnticos entre s. Posteriormente estas dos formas alternativas de genes se denominaron alelos. Para cada uno de los siete rasgos estudiados, un alelo dominaba sobre el otro. Si ambos aparecan juntos en a misma planta, el alelo dominante enmascaraba la existencia del recesivo. 2. Cada clula reproductiva (o gameto) producida por una planta slo contena una copia del gen correspondiente a cada rasgo. Un gameto particular poda coritener el alelo recesivo o el dominante para un rasgo determinado, pero no ambos. Cada planta se origina por la unin de un gameto masculino con uno femenino. Por consiguiente, de los dos alelos que gobiernan cada rasgo en una planta, uno se hereda del progenitor femenino y el otro del progenitor masculino. 3. En cada planta los dos alelos que controlan un rasgo permanecen unidos durante toda la vida, pero se separan (o segregan) durante la formacin de los gametos. Este dato es la base de la "Ley de la segregacin" de Mende. 4. La separacin del par de alelos correspondientes para un rasgo no tiene efecto sobre la separacin de alelos para otro rasgo. Por ejemplo, un gameto particular puede recibir un gen paterno que controla e! color de a semilla y un gen materno que controla la forma de dicha semilla. En este dato se basa la "Ley de la permutacin independiente" de Mendel. Mendel present los resultados de su trabajo a los miembros de la Natural History Society of Brunn, Austria; las actas de sus sesiones no registran comentario alguno de esta presentacin. Mendel public sus experimentos en la revista de la sociedad de Brunn, en 1865, donde no generaron inters sino hasta 1900,16 aos despus de su muerte. En ese ao, tres botnicos europeos llegaron a las mismas conclusiones de manera independiente y los tres redescubrieron las publicaciones de Mendel abandonadas durante 35 aos en los armarios de muchas bibliotecas por toda Europa.

este aspecto de la herencia: las bases fsicas de la misma dentro de la clula. El descubrimiento de los cromosomas Alrededor de 1880, varios bilogos europeos observaban con atencin la actividad de las estructuras celulares recin discernibles con los microscopios de luz que mejoraban con rapidez. Estos cientficos no conocan el trabajo de Mendel, sin embargo concluyeron que cualquier factor que gobernara las caractersticas heredadas deba pasar de una clula a otra y de una generacin a la siguiente. Este conocimiento, por s mismo, es fundamental; toda a informacin gentica necesaria para generar y conservar una planta o animal complejo debe estar por completo dentro de una sola clula. Observaciones efectuadas sobre clulas en divisin revelaron que los elementos del contenido citoplsmico quedan en una u otra clula hija al azar, dependiendo slo del plano a travs del cual pasa el surco que divide la clula. Por lo contrario, al parecer hay fuerte tendencia a que el contenido del ncleo se divida por igual entre las clulas hijas. Durante la divisin celular, el material del ncleo se organiza en "filamentos" visibles, que en 1888 se denominaron cromosomas, trmino que significa "corpsculos coloreados". Ms o menos en aquel tiempo se observ el proceso de fertilizacin y se describi el papel de los dos gametos: espermatozoide y vulo (fig. 10-1). Aunque el espermatozoide es una clula diminuta, se sabe que tiene igual importancia gentica que el vulo, de tamao mucho mayor. Qu tienen en comn estas dos clulas tan diferentes? La carac-

Segundo corpsculo polar proncleo materno

Proncleo paterno

(b)

(c)

Cromosomas: portadores fsicos de los genes

Aunque Mendel suministr datos convincentes de que los rasgos hereditarios eran controlados por factores discretos, o genes, en sus estudios no se preocup en absoluto de la naturaleza fsica de estos elementos o su localizacin dentro del organismo. Mendel realiz todo su proyecto de investigacin sin observacin alguna con el microscopio. Durante el tiempo transcurrido entre el trabajo de Mendel y su redescubrimiento, algunos bilogos se preocuparon de

(d)

(e)

FIGURA 10-1. Hechos que ocurren en Ascaris luego de la fertilizacin, segn se public en el siglo XIX como resultado de una investigacin clsica. Tanto los gametos macho como hembra contienen dos cromosomas. La fusin del espermatozoide y del ncleo del vulo (denominado proncleo) en el citoplasma del vulo (entre e y f) produce un cigoto que contiene cuatro cromosomas. (Segn T. Boveri, Jenaische Zeit, 22:685,

CAPITULO 10 Naturaleza del gen y del genoma terstica ms aparente es el ncleo y sus cromosomas. La importancia de los cromosomas aportados por el elemento masculino se manifest en un estudio efectuado por el bilogo alemn Teodoro Boveri en huevos de erizo de mar fertilizados con dos espermatozoides en vez de uno, como normalmente es el caso. Esta condicin, conocida como polispermia, se caracteriza por interrupcin de la divisin de las clulas y muerte temprana del embrin. Por qu un diminuto espermatozoide extra dentro del vulo, de tamao mucho mayor, tiene consecuencias tan drsticas? La presencia de un conjunto de cromosomas y un centrolo extras (pg. 337), ambos donados por el segundo espermatozoide, causa divisiones celulares anormales en el embrin, en las cuales las clulas hijas reciben cromosomas en nmero variable. Boveri concluy que el desarrollo normal a travs de un proceso ordenado "depende de una combinacin particular de cromosomas; y esto slo puede significar que los cromosomas individuales deben poseer cualidades diferentes". Esta fue la primera demostracin de una diferencia cualitativa entre los cromosomas, como sera de esperar si constituyeran un grupo de vehculos portadores de informacin gentica. El proceso subsecuente a la fertilizacin puede observarse con mayor detalle en el nematelminto Ascaris, cuyos pocos cromosomas son grandes y eran tan fciles de observar en el siglo XIX como an se hace en laboratorios para estudiantes de biologa. En 1883, el bilogo belga Edouard van Beneden observ que las clulas del cuerpo del gusano posean cuatro cromosomas grandes, pero los ncleos masculino y femenino presentes en el huevo justo despus de la fertilizacin (antes de la fusin de los dos ncleos) slo tenan dos cromosomas cada uno (fig. 10-1). Alrededor de 1880 se describi el proceso de la meiosis, y en 1887 el bilogo alemn August Weismann propuso que la meiosis incluye una "divisin reductora" durante la cual el nmero de cromosomas se divide a la mitad antes de la formacin de los gametos. Si no ocurriera este tipo de divisin reductora, el nmero de cromosomas se duplicara de una generacin a la siguiente, lo cual evidentemente no puede ocurrir. Cromosomas como portadores de informacin gentica El redescubrimiento del trabajo de Mendel y su confirmacin tuvo influencia inmediata sobre la investigacin en biologa celular. Cualquiera que fuera su naturaleza fsica, los portadores de las unidades de herencia tendran que comportarse de manera coherente con los principios mendelianos. En 1903, Walter Sutton, posgraduado de la Universidad de Columbia, public un artculo donde seal directamente a los cromosomas como portadores fsicos de los factores genticos de Mendel. Sutton observ la formacin de clulas en el espermatozoide del saltamontes, que igual que Ascaris, tiene cromosomas grandes y fciles de observar. En las clulas germinales de la gnada masculina ocurren dos tipos de divisiones: divisiones mitticas medante las cuales las espermatogonias producen ms espermatogenias, y divisiones meiticas durante las cuales la

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espermatogenia produce espermatozoides. Examinando las etapas de la mitosis en la espermatogenia, Sutton cont 23 cromosomas. El examen atento de la forma y tamao de los 23 cromosomas sugiri que se presentaban en pares "al parecer iguales". Se distinguieron 11 pares de cromosomas junto con un cromosoma adicional, llamado cromosoma accesorio (posteriormente se demostr que era el cromosoma X determinante de! sexo), que no tena pareja. Sutton comprob que la presencia de pares de cromosomas, o cromosomas homlogos, como pronto se les denomin, correlacionaba perfectamente con los pares de factores hereditarios descubiertos por Mendel. Cuando Sutton examin los cromosomas de clulas justo cuando iniciaban la meiosis, observ que los miembros de cada par de cromosomas se unan formando un bivalente. Identific once bivalentes, cada uno mostrando una lnea de asociacin transversa (fig. 10-2). Cada una de las dos clulas resultantes de la primera divisin meitica recibi uno de los cromosomas homlogos que este modo fueron separados. Esta era la divisin reductora propuesta 15 aos antes por Weismann sobre bases puramente tericas. Tambin fue la base fsica de la proposicin de Mendel acerca de la existencia de parejas de factores hereditarios que permanecen unidos durante toda la vida de un individuo, pero que se separan durante la formacin de los gametos. La divisin reductora observada por Sutton explic algunos otros hallazgos de Mendel: los gametos slo contienen una versin de cada gen (alelo); el nmero de gametos que contiene cada alelo es igual al nmero de gametos con el alelo homlogo; y los dos gametos que se unen durante la fertilizacin producen un individuo con dos alelos para cada rasgo. Pero todava persistieron muchas preguntas sin respuesta. Por ejemplo, cmo se organizan los genes en los cromosomas? y podra determinarse el sitio de genes especficos?

KIGURA 10-2. Cromosomas homlogos. Esquema de Sutton de los cromosomas homlogos del saltamontes macho reunidos durante la profase meitica para formar bivalentes. Se observan 11 pares de cromosomas homlogos (a-k) y un cromosoma impar X. (Segn W.S. Sutton, Biol. Bull 4:24, 1902.)

392

CAPITULO 10 Naturaleza del gen y del genoma

El cromosoma como grupo unido

Con la misma claridad que Sutton percibi la relacin entre la conducta de los cromosomas y los resultados de Mendel en las plantas de guisante, tambin descubri un problema deslumbrante. Mendel observ la herencia de siete rasgos y encontr que cada uno se heredaba de manera independiente respecto de los otros. Esta fue la base de la Ley de la permutacin independiente de Mendel. Pero si los genes permanecan unidos dentro de los cromosomas, igual que las cuentas de un rosario, entonces un progenitor deba pasar cromosomas enteros a su descendencia, o sea, paquetes de genes. Los genes sobre un mismo cromosoma deben actuar como s estuvieran vinculados entre s; o sea, formar parte de un mismo grupo unido. Cmo fue que los siete rasgos de Mendel se permutaron de manera independiente? Se encontraban todos sobre diferentes grupos unidos, o sea, diferentes cromosomas? Si este es el caso, el guisante de jardn debe poseer siete pares diferentes de cromosomas homlogos. Los genes que controlan cada rasgo estudiado por Mendel pueden encontrarse en cromosomas diferentes o estar tan separados sobre eJ mismo cromosoma que pueden actuar de manera independiente (pgina 393). Si los resultados de Mendel se debieron exclusivamente a la buena suerte o slo a falta de inters en cualquier rasgo que no concordara con sus predicciones, esto todava no est claro. La prediccin de Sutton acerca de grupos enlazados pronto se transform de especulacin en un hecho. Antes de dos aos se demostr en los chcharos dulces que dos rasgos (color de las flores y forma del polen) estaban ligados, y rpidamente se acumularon otros datos de la unin cromosmica.

FIGURA 10-3. Mosca de la fruta, Drosophila melanogaster. Fotografa de mosca de la fruta de tipo silvestre, macho y hembra. (Segn R. Calentine/Visuals Unlimited.)

Anlisis gentico en Drosophila

Pronto la investigacin en gentica se enfoc sobre un organismo, la mosca de la fruta Drosophila (fig. 10-3). El plazo para el desarrollo de una mosca de la fruta (del huevo a la madurez) es de 14 das y tiene capacidad para producir hasta 1 000 huevos en el curso de su existencia. Adems, es un animal muy pequeo, de modo que se puede manejar un gran nmero de estos insectos; son fciles de conservar y alimentar y muy poco costosos. En 1909, Thomas Hunt Morgan, de la Universidad de Columbia, lo consider el organismo perfecto e inici lo que despus fue el principio de una nueva era en investigacin gentica. Cuando comenz a trabajar con este insecto tuvo una gran desventaja: slo dispona de una "cepa" de mosca, el tipo silvestre (fig. 10-3). Mendel simplemente tuvo que comprar algunas variedades de semillas de guisante, pero Morgan debi generar sus propias variedades de mosca de la fruta. Esperaba que podan surgir variantes del tipo silvestre si criaba moscas en nmero suficiente. Antes de un ao y despus de criar miles de moscas logr su primer muante, o sea, un individuo con una caracterstica hereditaria que lo diferenciaba del tipo silvestre. El muante posea ojos blancos en vez de los normales de color rojo. Alrededor de 1915, Morgan y sus estudiantes haban encontrado 85 mutantes diferentes con gran variedad de

estructuras afectadas. Al parecer, en raras ocasiones ocurra un cambio espontneo, o mutacin, dentro de un gen, que se alteraba de manera permanente y poda transmitirse de una generacin a la siguiente. Demostrar que una alteracin espontnea en un gen se heredaba tuvo consecuencias mucho ms trascendentes que la gentica de Drosophila. La comprobacin del origen de las variaciones que aparecen en las poblaciones fue la prueba de un eslabn vital en la teora de la evolucin. Si podan originarse nuevos genes de esta manera, entonces la seleccin natural poda actuar sobre los mutantes y as, lentamente, surgiran nuevas especies. Las mutaciones genticas suministran la materia prima requerida para la mutabilidad de las especies. Las mutaciones constituyen un acontecimiento necesario para la evolucin, pero tambin son una herramienta para los genetistas, un signo contra el cual se puede comparar la condicin de silvestre. Conforme se aislaron las imitantes, de Drosophila, fueron criadas, cruzadas y mantenidas como reserva en el laboratorio. Tal como se esperaba, las 85 mutaciones no se permutaron de manera independiente; en vez de eso, Morgan encontr que pertenecan a cuatro diferentes grupos ligados, uno con muy pocos genes mutantes (slo dos en 1915). Este dato se relaciona perfectamente con la observacin de que las clulas de Drosophila poseen cuatro pares de cromosomas homlogos, uno muy pequeo (fig. 10-4). Persistieron muy pocas dudas acerca de que los genes residen en los cromosomas. Entrecruzamiento y recombinacin Aunque se confirm la asociacin de genes en grupos ligados, el vnculo entre alelos sobre el mismo cromosoma era incompleto; o sea, alelos originalmente presentes sobre de-

CAPITULO 10 Naturaleza del gen y del genoma

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FIGURA 10-4. La mosca de la fruta posee cuatro cromosomas, uno muy pequeo. Los dos cromosomas homlogos distintos determinan el sexo. Igual que en el hombre, la mosca de la fruta macho es XY y la hembra XX.

terminado cromosoma no permanecen juntos por obligacin durante la formacin de los gametos. Por lo tanto, las caractersticas maternas y paternas heredadas por un individuo en cromosomas homlogos separados pueden "barajarse", de modo que determinados cromosomas en el gameto pueden contener alelos originalmente derivados de progenitores separados. En 1911, Morgan ofreci una explicacin de la descomposicin de la unin. Dos aos antes, F.A. Janssens observ que cromosomas homlogos de los bivalentes se entrelazaban en la etapa temprana de la meiosis (fig. 10-5). Janssens propuso que esta interaccin entre cromosomas maternos y paternos poda provocar la descomposicin e intercambio de fragmentos. Aprovechando esta observacin y la proposicin de Janssens, Morgan sugiri que este fenmeno, al cual denomin entrecruzamiento (o recombinacin gentica), poda explicar la aparicin de descendientes (recombinantes) que mostraban combinaciones inesperadas de rasgos genticos. En la figura 10-6 se muestra un ejemplo de entrecruzamiento. El estudio de los descendientes de un gran nmero de cruzamientos entre adultos portadores de varas mutaciones sobre un mismo cromosoma mostr: 1} que el porcentaje de recombinacin entre determinado par de genes de un cromosoma, como color de ojos y longitud de alas, era constante de un experimento a otro, y 2) que los porcentajes de recombinacin entre distintos pares de genes, como entre color de ojos y longitud de las alas en comparacin con color de ojos y color dei cuerpo, podan ser muy diferentes. El iecho de que determinado par de genes muestre la misma frecuencia de recombinacin en todos los cruzamientos sugiere fuertemente que la posicin de los genes a lo largo del cromosoma (su locus) es fijo y no vara de una mosca a la siguiente. Si cada gen tiene un locus fijo, entonces la frecuencia de recombinacin entre dos genes debe reflejar la distancia que separa dichos genes. Cuanto mayor sea el espacio disponible entre dos sitios del cromosoma, ms probable ser que ocurra rompimiento entre esos dos sitios y mayor la frecuencia de recombinacin. El ejemplo ilustrado en la figura 10-6 muestra que los genes de Dwsophila para longitud de alas y color del cuerpo se sitan a una

FIGURA 10-5. Visualizacin de los sitios de entrecruzamiento. Cromosomas homlogos se entrelazan durante la meiosis, como se observa en esta micrografa de las clulas meiticas de un lirio. Los puntos donde se cruzan los homlogos se denominan quiasmas (flechas) y (como se analiza en el captulo 14) son sitios donde ocurre el entrecruzamiento en etapa ms temprana. (Cortesa de A..H. Sparrow.)

distancia considerable sobre e! cromosoma y, por lo tanto, es probable que se encuentren separados por un punto de desintegracin interpuesto. En contraste, los genes para color de ojos y color del cuerpo estn muy cerca uno del otro sobre el cromosoma, y por consiguiente generan un porcentaje mucho menor de descendientes recombinantes. Alelos localizados en extremos opuestos de un largo cromosoma quedan tan separados que con frecuencia se comportan como si estuvieran localizados en cromosomas separados. Mediante la frecuencia de recombinacin, los genetistas pudieron preparar mapas detallados de series de genes ordenados a lo largo de cada uno de los cuatro cromosomas de la mosca de la fruta. Desde entonces se emplean las frecuencias de recombinacin para preparar mapas cromosmicos de diversos organismos, desde virus y bacterias hasta una gran variedad de especies de eucariotes.

Mutagnesis y cromosomas gigantes

En la primera etapa de la gentica, la bsqueda de mutantes era un procedimiento lento y tedioso dependiente de la aparicin espon tnea de genes alterados. Utilizando una cepa especial de mosca de la fruta diseada para revelar la presencia de alelos recesivos, Hermn Muller, de la Universidad de Indiana, observ que las moscas sometidas a una dosis subletal de rayos X mostraban una frecuencia 100 veces mayor de mutacin espontnea. Este dato tuvo consecuencias importantes. En la prctica, el empleo de agentes mut-

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CAPITULO 10 Naturaleza del gen y del genoma

Par de cromosomas homlogos (BbWw) (antes de la meiosis) ..Corpsculo gris B />Mi-,

Alas largas Alas cortas

T*\o C!

Corpsculo

~
W

Duplicacin y formacin de la tetrada

V V
Meiosis

Par de cromosomas homlogos en formacin de tetrada

(*)

Gameto normal {BW} Entrecruzamiento bW)

Entrecruzarniento de gameto Bw Gameto normal bw) /

(b)

FIGURA 10-6. El entrecruzamiento proporciona el mecanismo para "barajar" los alelos de los cromosomas materno y paterno, n) Formacin bivalente (tetrada) durante la meiosis, mostrando las tres posibles intersecciones del entrecruzamiento (quiasmas, indicados por flechas rojas), b) Representacin simplificada de un entrecruzamiento sencillo en un heterocigoto de Drosophila (BbWw) en el cromosoma nmero 2 y los gametos resultantes. Si alguno de los gametos entrecruzados participa en la fertilizacin, la descendencia presentar una combinacin de alelos ausente en los progenitores.

genos, como rayos X y radiacin ultravioleta, increment mucho el nmero de matantes disponibles para la investigacin gentica. Esto tambin mostr el peligro de incrementar el empleo de radiaciones en la industria y la medicina. Adems, revel una nueva propiedad importante del material gentico: cualquiera que fuera su naturaleza qumica, era susceptible de sufrir alteraciones por radiacin electromagntica. El redescubrimiento de los cromosomas gigantes de ciertas clulas de insectos, efectuado en 1933 por Theophilus Painter, de la Universidad de Texas, ilustra una caracterstica bsica de los sistemas biolgicos. Hay variabilidad tan notable entre los organismos, demostrable no slo a nivel macroscpico sino tambin celular y subcelular, que con frecuencia un tipo particular de clula puede ser mucho ms adecuado para cierto tipo de investigacin en comparacin con todos los dems. Las clulas de la glndula salival de la larva Drosophila contienen cromosomas casi 100 veces ms grandes que los observados en la mayor parte de las otras clulas del organismo (fig. 10-7, a). Durante el desarrollo de la larva, estas clulas interrumpen su divisin pero mantienen su crecimiento. La duplicacin del DNA contina y suministra el material gentico adicional necesario para apoyar el elevado nive! de actividad secretoria de estas enormes clulas. Las cadenas duplicadas de DNA permanecen fijas entre s en perfecta alineacin lado con lado (recuadro de la figura

10.7, a), produciendo cromosomas gigantes hasta con 1 024 veces ms cadenas de DNA en comparacin con los cromosomas normales. Estos cromosomas politeno, como se les denomina, son ricos en detalles visuales, y cuando se les tie y examina al microscopio muestran casi 5 000 bandas. Lo ms importante es que el patrn de bandas prcticamente es constante de una mosca a otra y de un tejido a otro; en contraste, se pueden observar diferencias considerables entre los cromosomas de moscas de diferentes especies del gnero Drosophila. Painter not que ciertas bandas individuales podan correlacionarse con genes especficos. La posicin relativa de los genes sobre los cromosomas gigantes concuerda con la posicin pronosticada en mapas genticos preparados segn la frecuencia de recombinacin, lo que confirma visualmente la validez de todo el procedimiento de mapeo. Los cromosomas gigantes de los insectos tambin son tiles por otra razn. Comparando los patrones de bandas de cromosomas politeno de diferentes especies se tiene la oportunidad sin paralelo de investigar cambios evolutivos a nivel de cromosoma. Adems, estos cromosomas no son objetos celulares inertes, sino estructuras dinmicas en las cuales ciertas regiones se "esponjan" durante etapas particulares del desarrollo (fig. 10-7, b). Los cromosomas esponjados son sitios donde se transcribe DNA a KN A y suministran uno de los mejores sistemas disponibles para visualizar directamente la expresin de genes (fig. 17-20, a}.

CAPITULO 10 Naturaleza del gen y del genonm

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Naturaleza qumica del gen

Los genetistas clsicos descubrieron las reglas que gobiernan la transmisin de caractersticas genticas y la relacin entre genes y cromosomas. En 1934, en su discurso de aceptacin del Premio Nobel, T. H. Morgan afirm que "al nivel en que se encuentran los experimentos de gentica no hay diferencia alguna si el gen es una unidad hipottica o una partcula material". Sin embargo, en el decenio de 1940 se plantearon nuevas preguntas, y la ms importante fue la siguiente: Cul es la naturaleza qumica del gen? Los experimentos que condujeron a responder esta pregunta se presentan en La va experimental de este captulo. Por ahora consideraremos algo de la informacin reunida cuando se demostr que los genes estaban constituidos por DNA.

Estructura del DNA

Banda

fflj

En 1952, la comunidad cientfica finalmente acept la idea de que los genes estaban constituidos por DNA. El descubrimiento de que el material gentico era DNA dio respuesta a una pregunta de suma importancia, pero no ayud gran cosa a explicar cmo funciona una molcula de DNA dentro de la clula. Para comprender las funciones de una macromolcula compleja, sea protena, polisacrido, lpido o cido nucleico, es indispensable conocer cmo est construida dicha molcula. A principios del decenio de 1950, en varios laboratorios de Estados Unidos y de Inglaterra se investigaba el enigma de la estructura del DNA; el problema fue resuelto en 1953 por James Watson y Francis Crick, de la Universidad de Cambridge. Antes de describir la estructura propuesta consideraremos los hechos disponibles en aquel tiempo. La informacin acerca de la estructura del DNA se deriv de estudios de dispersin bioqumica iniciados por Friedrich Miescher en 1860 y por anlisis de difraccin de rayos X llevados a cabo por William Astbury en el decenio de 1940 y continuados por Rosalind Franklin, Linus Pauling, Maurice Wikins y otros.
Composicin de las bases

Se saba que la unidad bsica para construir DNA era un nucletido (fig. 10-8, a), constituido por un azcar desoxiribosa de cinco carbones al cual se fijaba un fosfato esterificado en la posicin 5' del anillo de azcar, y en el sitio 1' una base nitrogenada.1 Hay dos tipos de bases, las piri1 En este punto es til introducir un poco de terminologa. Una molcula que slo contiene una de las cuatro bases nitrogenadas de la figura 10-8 unida a una fraccin de azcar pentosa se conoce corno nuclesido. S el azcar es una desoxrrbosa, el nuclesido es uri desoxirribonuciesido. Son cuatro los principales desoxirribonuclesidos segn la base unida: desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxtimidina y desoxicitidina. Si el nuclesido posee uno o ms grupos fosfato unidos (generalmente en la posicin 5'), la molcula es un nucletido. Hay nuclesidos 5'-monofosfato, nuclesidos 5'-difosfato y nuclesidos 5'-trifosfato, segn el nmero de fosfatos en la molcula. Ejemplos de cada uno son la desoxiadenosina 5'-monofosfato (dAMP), desoxiguanosina 5'-difosfato (cIGDP) y desoxicitidina 5'-trifosfato (dCTP). Un conjunto similar de nucletidos implicados en el metabolismo del RNA contienen el azcar ribosa en vez de desoxirribosa. Nucletidos como el ATP utilizados en el metabolismo energtico son molculas que contienen ribosa.

Cromosomas politeno gigantes de larvas de insecto, a) Estos cromosomas politeno gigantes de la glndula salival de una larva de mosca de la fruta muestran miles de bandas distintas teidas en color oscuro. Muchas de las bandas se han identificado como loci de genes particulares. En este insecto, los cromosomas politeno constan de varias cadenas individuales de DNA. Las bandas sobre los cromosomas correponden a sitios donde el DNA est ms firmemente compactado, b) Gammagrafa electrnica de un cromosoma politeno gigante procedente de una larva de Chirononius mostrando la expansin de sitios especficos para formar una "esponja". Los cromosomas esponjados son sitios donde se transcribe DNA. (a: Segn Biolgica! Photo Service; b: cortesa de Terry D. Alien y Claus Pelling.)

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CAPITULO 10 Naturaleza del gen y del genoma Fosfato

/\ ^N,

N-H

CH2 O

Base fflj Azcar

Azcar fosfato del esqueleto

(b)
FIGURA 10-8. Estructura qumica del DNA. a) Estructura de un nucletido. El nucletido aqu mostrado contiene la base adenosina; la molcula es una desoxiadenosina 5'-monofosfato (dAMP). b) Estructura qumica de un pequeo segmento de una cadena de DNA simple mostrando los cuatro nucletidos.

otro borde llamado extremo 3' (fig. 10-8, n). Puesto que todos los nucletidos apilados de la cadena miran hacia el mismo lado, toda la cadena tiene una direccin. Un extremo es el 3' y otro el 5' (fig. 10-8, b). El anlisis de difraccin de rayos X indica que la distancia entre los nucletidos apilados es de 3.4 A (0.34 nm) y sugiere la presencia de una estructura grande repetida cada 3.4 nm. La pregunta de mayor importancia es cmo se organizan las cadenas de la molcula. Como se analiza en la pgina 426, el concepto inicial de DNA como simple tetranucletido repetido (p. ej.: ATGCATGCATGC) impidi que se le considerara como macromolcula portadora de informacin. En 1950, Erwin Chargaff, de la Universidad de Coiumbia, hizo un importante descubrimiento que excluy finalmente la teora del tetranucletido y proporcion informacin vital a Watson y Crick. Chargaff, convencido de la importancia clave de la secuencia de nucletidos del DNA, inici el primer paso en todo anlisis de secuencia: determin la cantidad relativa de cada base en muestras de DNA. El anlisis de composicin de bases se efectu por hidrlisis de as bases fijas a los azcares, aislando las bases del hidrolizado mediante cromatografa en papel y determinando la cantidad de material en cada uno de los cuatro puntos a los cuales se desplazaron las cuatro bases. Si la teora del tetranucletido era correcta la proporcin de cada base debe ser casi 25% de la cantidad total. Chargaff encontr que la proporcin de las cuatro bases componentes era muy variable de un tipo de organismo a otro y con frecuencia muy diferente de la proporcin 1:1:1:1 pronosticada por la teora del tetranucletido. Por ejemplo, la proporcin A:G del DNA del bacilo tuberculoso era 0.4, en tanto que la proporcin A:G del DNA humano era 1.56. La composicin de bases permaneca constante en dichas especies sin que el tejido empleado como fuente de DNA hiciera diferencia alguna. Dentro de esta gran variabilidad en las bases que componen diferentes DNA se descubri una importante relacin numrica. En una muestra determinada de DNA, e! nmero de purinas siempre es igual al nmero de pirimidinas. Ms especficamente, el nmero de adeninas siempre igual al nmero de tminas, y el nmero de guaninas siempre fue igual al de citosinas. En otras palabras, Chargaff descubri las siguientes reglas en la composicin de bases del DNA: [A] = [T] [G] = [C] [A] + [T] * [G] + [C] Los datos de Chargaff arrojaron nueva luz sobre la molcula de DNA confirindole especificidad e individualidad de un organismo a otro. Sin embargo, el significado de la equivalencia de bases todava no est claro.

midinas ms pequeas y las purinas de mayor tamao. Tambin se saba que los nucletidos se unen entre s mediante enlaces covalentes para formar un polmero lineal, o cadena, con un eje central compuesto por grupos alternos de azcar y fosfato unidos por enlaces 3',5'-fosfodister (fig. 10-8, b). Se pensaba que las bases fijas a cada azcar se proyectan desde el esqueleto central como una columna de entrepaos apilados. Los nucletidos poseen una estructura polarizada: un borde denominado extremo 5' donde se localiza el fosfato y

La proposicin de Watson y Crick

Cuando analizamos la estructura de las protenas en el captulo 2, subrayamos la importancia de las estructuras secundaria y terciaria como determinantes de la actividad de la protena. Para comprender la actividad biolgica del DNA se requiere informacin similar acerca de su organizacin tridimensional. Mediante datos de difraccin de rayos X y la construccin de modelos factibles a partir de cortes de los

CAPITULO 10

397

cuatro tipos de nucletidos, Watson y Crick propusieron un modelo de la estructura del DNA que incluye los siguientes elementos (fig. 10-9): 1. La molcula se compone de dos cadenas de nucletidos. Esta proposicin fue seguida casi de inmediato por una propuesta errnea de Linus Pauling, quien sugiri que el DNA se compone de tres cadenas de nucletidos. 2. Las dos cadenas se enrollan alrededor de un eje central formando un par de hlices derechas. Las hlices derechas avanzan girando en direccin de las manecillas del reloj. La naturaleza helicoidal del DNA fue revelada por un patrn de puntos producido por difraccin de rayos X. 3. El esqueleto -azcar-fosfato-azcar-fosfato- se localiza en el exterior de la molcula con los dos grupos de bases proyectndose hacia el centro. En el modelo de Pauling, el esqueleto de cada cadena se situ equivocadamente en el centro de la molcula. Los grupos fosfato confieren a la molcula carga negativa. 4. Las bases ocupan planos aproximadamente perpendiculares al eje longitudinal de la molcula y por lo tanto se colocan una sobre otra igual que platos apilados. Las interacciones hidrfobas y las fuerzas de van der Waals (pg. 35) entre las bases planares apiladas estabilizan toda la molcula del DNA. Las vueltas helicoidales y los pares de bases planares, en conjunto, confieren a la molcula el aspecto de una escai'era de caracol. 5. Las dos cadenas se conservan unidas mediante puentes de hidrgeno entre las bases de una cadena y sus correspondientes bases sobre la otra cadena. Un puente de hidrgeno, por s solo, es dbil y fcil de romper, lo que permite la separacin de las cadenas de DNA durante ciertas actividades. Al mismo tiempo, la fuerza de los puentes de hidrgeno es aditiva, de modo que el gran nmero de ellos que mantiene las cadenas juntas confiere estabilidad a la doble hlice de la molcula. 6. La distancia del tomo de fsforo del esqueleto al centro del eje es de 10 A (por lo tanto, la anchura de la doble hlice es de 20 A). 7. La pirimidna de una cadena siempre coincide con una purina de la otra cadena. Esta relacin genera una molcula de 20 A de ancho. Por lo contrario, la asociacin de dos purinas podra extenderse ms all de la anchura especificada, y la asociacin de dos pirimidinas podra no ser suficientemente ancha. 8. Los tomos de nitrgeno unidos al carbono 4 de la citosina y al carbono 6 de la adenna muestran predominantemente la configuracin amino (NH2) (fig. 10-9) y no a forma imino (NH). De manera similar, los tomos de oxgeno enlazados al carbono 6 de la guanina y al carbono 4 de la timina predominantemente muestran configuracin ceto (C=O) en vez de configuracin eno! (C - OH). Estas restricciones estructurales en la configuracin de las bases sugieren que la nica purina estructuralmente capaz de enlazarse a timina es adenina y que guanina es la nica purina capaz de enlazarse a citosina. Por lo tanto, los nicos pares posibles fueron A-T y G-C, que satisfacen perfectamente el anlisis pre-

vio de la composicin de bases efectuado por Chargaff. Los pares A-T se unen mediante dos puentes de hidrgeno y los pares G-C mediante tres puentes de hidrgeno. 9. Las dos cadenas que componen una doble hlice corren en direcciones opuestas; o sea, son antiparalelas. Por lo tanto, si una cadena se encuentra alineada en la direccin 5'3'. Al observar la molcula desde el exterior se nota que en el espacio entre vueltas adyacentes de la hlice se forman dos surcos de diferente amplitud: un surco mayor ms ancho y un surco menor ms estrecho, que rodean en espiral la superficie externa de la doble hlice. Las protenas unidas al DNA casi siempre se alojan en estos surcos. 11. La doble hlice efecta una vuelta completa cada 10 residuos (3.4 nm), o 150 vueltas por cada fragmento igual a un milln de veces el peso molecular. 12. No hay restriccin alguna sobre la secuencia de bases de determinada cadena de la molcula. Sin embargo, una vez especificada la secuencia particular de una cadena automticamente queda determinada la secuencia de la otra cadena. Esta relacin entre las dos cadenas de la doble hlice se conoce como complementariedad. Por ejemplo, A es complementaria de T, AGC es complementaria de TCG, y una cadena completa es complementaria de la otra. Como veremos despus, la complementariedad es de suma importancia para casi toda actividad y mecanismo donde participan cidos nucleicos.
Importancia de la proposicin de Watson-Crick

Desde la primera vez que los bilogos consideraron al DNA como material gentico, definieron tres principales funciones que deba cumplir (fig. 10-10): 1. Almacn de informacin gentica. El DNA es la "plantilla" molecular, un registro de instrucciones precisas almacenadas que definen todas las caractersticas hereditarias mostradas por un organismo. 2. Autoduplicacin y herencia. Puesto que el DNA contiene toda la plantilla de un organismo, debe contener la informacin para su propia duplicacin. La duplicacin del DNA es el medio para transmitir instrucciones genticas de una clula a sus clulas hijas o de un individuo a su descendencia. 3. Expresin del mensaje gentico. Durante muchos aos los bilogos sospecharon que los genes individuales transportan informacin para sintetizar protenas especficas. Deba existir algn mecanismo para utilizar la informacin almacenada en un gen en la sntesis de polipptidos especficos. El modelo de la estructura del DNA propuesto por WatsonCrick fue de suma importancia para averiguar de qu manera se efectan las dos primeras de estas tres funciones genticas. El modelo apoy fuertemente la sospecha de que el contenido de informacin del DNA reside en la secuencia lineal de las bases. A cada gen corresponde determinado segmento de DNA. La secuencia especfica de nucletidos en dicho segmento dictara la secuencia de aminocidos en

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CAPITULO 10 Naturaleza dd gen y del genoma

20 A

Azcar

Surco mayor FIGURA 10-9. La doble hlice, a) Representacin esquemtica de la doble hlice de DNA. b) El par de bases de Watson y Crick. c) Modelo de espacio lleno de la forma B de DNA mostrando cmo las bases llenan el espacio entre los dos esqueletos. (El tamao de los tomos incluye su radio de van der Waals.) ) Micrografa electrnica del DNA liberado de la cabeza rota del bacterifago T2. Esta molcula de DNA lineal (ntense los dos extremos libres) tiene un peso molecular de casi 1.2 x 108 daltons (180 000 pares de bases) y mide 68/im de longitud, unas 600 veces ms largo que la cabeza del fago en la cual est contenida, (c: Cortesa de Nelson Max; d: cortesa de A.K. Kleinschmidt y cois. Biochim. Biophys. Acta 61:861, 1962.)

(b)

CAPITULO 10 Naturaleza del gen y del %enoma Ncleo Gen para el color de los ojos Gen para la enzima fosforilasa

399

Sntesis del polipptido

FIGURA 10-10. Tres funciones requeridas del material gentico. a) El DNA debe contener la informacin que codifica estos rasgos hereditarios, b) El DNA debe contener informacin para controlar su propia duplicacin, c) El DNA debe contener informacin para controlar el ensamblado de protenas especficas.

(d)
FIGURA 10-9. (Continuacin.)

el polipptido correspondiente. Un cambio de la secuencia lineal de los nucletdos de dicho segmento provocara una mutacin hereditaria en dicho gen. Respecto de la segunda funcin, la publicacin inicial de Watson y Crick acerca de la estructura del DNA incluy una propuesta de la manera como se puede duplicar una molcula. Sugirieron que durante la duplicacin los puentes de hidrgeno que mantienen unidas a las dos cadenas de la hlice de DNA se rompan secuencialmente provocando una separacin gradual de las cadenas, muy parecido a lo que ocurre en las dos mitades de un cierre automtico empleado en prendas de vestir. Cada cadena separada, con sus bases nitrogenadas expuestas, servira entonces como plantilla, dirigiendo el orden de ensamblado de nucletdos complementarios para formar las cadenas complementarias. Al concluir este proceso se generan dos molculas idnticas de una doble cadena de DNA, cada una con una cadena de

400

CAPITULO 10 Naturaleza del gen y del genoma

la molcula DNA original y una cadena recin sintetizada (fig. 13-1). En el captulo 13 estudiaremos qu tan acertada fue la propuesta de Watson y Crick y su prediccin del mecanismo de duplicacin del DNA. De las tres funciones primarias mencionadas antes, slo el mecanismo de control del ensamblado de DNA para formar una protena especfica permaneci en el ms absoluto misterio. La dilucidacin de la estructura del DNA no slo fue importante en s misma, sino que tambin estimul la investigacin de toda actividad donde deba participar material gentico. Una vez aceptado el modelo estructural, toda teora del cdigo gentico, sntesis de DNA, o transferencia de informacin deba concordar con dicha estructura. Conformaciones alternativas del DNA Los datos de difraccin de rayos X empleados por Watson y Crick provenan del anlisis de preparaciones de fibras de DNA en estado hidratado. Esta forma totalmente hidratada o "hmeda" del DNA, descubierta por Rosalind Franklin, se denomina forma B y al parecer representa la conformacin de la molcula como existe dentro de la clula. Franklin observ que fibras preparadas bajo condiciones de escasa humedad mostraban estructura ms cristalina y sus patrones de difraccin de rayos X presentaban contrastes ms agudos. En las fibras ms secas, la conformacin de las molculas de DNA es algo diferente a la de fibras ms hidratadas y se conoce como forma A del DNA. La transicin de la forma B a la forma A se acompaa de gran nmero de cambios en la molcula (fig. 10-11, a y b), incluyendo un notable acortamiento de toda la fibra, cambio en la pendiente de la hlice de 3.4 a 2.7 A de elevacin por cada par de bases, inclinacin de las bases respecto del eje de la hli-

ce, etctera. Estudios subsecuentes indicaron que la forma A del DNA presenta conformacin similar a la que adoptan las regiones de doble cadena en las molculas de RN. En realidad, las formas A y B son muy similares entre si; ambas son hlices con vueltas de cuerda a la derecha. En 1978, Alexander Rich y sus colegas, del Massachussetts Institute of Technology, estudiaban patrones de difraccin de rayos X en cristales de un DNA sinttico que slo contena pares de bases G-C. El patrn de difraccin revel un DNA de forma helicoidal nunca antes observado. A diferencia de todos los DNA estudiados previamente, las cadenas de esta molcula sinttica se enrollaban en una espiral de sentido retrgrado, una hlice con giro a la izquierda. Tambin la conformacin del esqueleto estructural de esta hlice era muy diferente, con un trayecto continuo en zigzag en vez de uno regular como la forma B (fig. 10-11, e). Rich denomin DNA-Z a esta nueva estructura del DNA. La pregunta de mayor importancia respecto del DNAZ es si existe o no in vivo, y si la respuesta es afirmativa, qu papel desempea. Las pruebas que apoyan la presencia del DNA-Z en las clulas se han debatido calurosamente. Estudios in vitro del DNA-Z sugieren que slo es estable en condiciones no fisiolgicas, como en concentracin salina elevada o de torsin forzada; en condiciones fisiolgicas, la conformacin in vitro se transforma en una hlice con giro a la derecha. La posibilidad de que el DNA cromosmico pudiera existir en ms de una conformacin tiene importantes implicaciones, puesto que aade una nueva dimensin a la estructura del material gentico relacionada con el esqueleto estructural y no con la secuencia de nucletidos. Todava falta establecer si hay condiciones locales en una porcin del cromosoma que pueden apoyar o no la existencia transitoria de un DNA-Z con giro a la izquierda.
Superhlice DNA

A-DNA

B-DNA

C-DNA

D-DNA

Z-DNA

FIGURA 10-11. Conformaciones alternas de DNA. Se muestran segmentos que contienen 20 pares de bases en modelos con giro a la derecha de DNA-A, -B, -C o -D y para DNA-Z con giro a la izquierda. Todas as vistas son perpendiculares al eje helicoidal. Las lneas helicoidales continuas se forman por unin de tomos de fsforo a lo largo de cada cadena. Las lneas segmentadas indican-la posicin de los pares de bases y se forman por unin del tomo l'C de cada par de bases. Esta manera simplificada de representacin acenta diferen'cias en los parmetros helicoidales y en la posicin de los pares de bases entre estos modelos. (Reproducido, con permiso, de S.B. Zimmerman, Annual Review of Biochemistry, vol. 51, 1982 por Annual Reviews Inc.)

En 1963, Jerome Vinograd y sus colaboradores, del California Institute of Technology, descubrieron que dos molculas de DNA en forma de crculo cerrado y con peso molecular idntico pueden mostrar velocidad de sedimentacin muy diferente cuando se centrifugan a travs de un gradiente de densidad (seccin 17-11). Un anlisis ms detallado indic que las molculas de DNA que sedimentan con mayor rapidez tienen forma ms compacta debido a que la molcula se enrolla sobre s misma (fig. 10-12, a,b), muy parecido a una banda de hule cuyos dos extremos se enrollan en direcciones opuestas, o un cable de telfono enrollado sobre s mismo luego de usarse. Este estado del DNA se conoce como superhlice. En esta forma el DNA es ms compacto que su contraparte relajada, ocupa menos volumen y se mueve con mayor rapidez en un campo de fuerza centrfuga o elctrica (fig. 10-12, c}. La superhlice se entiende mejor cuando se dibuja un tramo de la doble hlice de DNA asentada libremente sobre una superficie plana. En estas condiciones, una molcula posee el nmero estndar de 10 pares de bases por vuelta de hlice y se dice que est relajada. Si los extremos de las dos cadenas simplemente se fusionan para formar un crculo, el DNA aun permanece relajado. Sin embargo, consideremos lo que ocurrira si antes de unir los extremos retorcemos la molcula. Si torcemos el DNA a lo largo y en direc-

CAPITULO 10

401

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FIGURA 10-13. DNA poco enrollado. La molcula de DNA a la izquierda esta subenrollada, o sea, en promedio tiene ms de 10 pares de bases por vuelta de una hlice. Una molcula poco enrollada adopta espontneamente la forma superhelicoidal, como se muestra en el dibujo a la derecha.

faj

:S*>^ (b)

FIGURA 10-12. Superhlice de DNA. 7-i') Micrografas electrnicas que muestran la diferente conformacin de una molcula circular relajada del DNA de un fago (a) y el mismo tipo de molcula en una superhlice (b). c) Cuando se someten a electroforesis en gel una mezcla de molculas de DNA SV40 relajadas y de superhlices, estas ltimas altamente compactas, se desplazan con mucha mayor rapidez en comparacin con la forma relajada. Las molculas de DNA se pueden observar coloreando el gel con bromuro de etidio, una molcula fluorescente que se integra a la doble hlice, (a \j b: Cortesa de James C. Wang; c: segn Walter Keller, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 72:2553, 1975.)

cin opuesta a la cual estn enrollados los dobletes, la molcula tiende a desenrollarse. Una molcula de DNA desenrollada tiene mayor nmero de pares de bases por vuelta de hlice (fig. 10-13). La molcula es ms estable con 10 residuos por vuelta, por lo que tiende a oponerse al esfuerzo para desenrollarla y vuelve a enrollarse sobre s misma formando una superhlice (fig. 10-13). Se dice que la superhlice de DNA es nega tiva cuando se genera por desenrollamiento y positiva cuando se forma por retorcimiento excesivo. El DNA circular presente en la naturaleza (p. ej., mitocondrial, viral, bacteriano) invariablemente presenta conformacin de superhlice negativa. El enrollamiento excesivo no se restringe al DNA circular pequeo, tambin ocurre en el DNA lineal eucariota donde tramos de la molcula se enrollan alrededor de ncleos protenicos, o nucleosomas (seccin 12-1). El superenrollamiento desempea un papel clave: permite la compactacin del DNA cromosmico para adaptarse a los microscpicos lmites del ncleo celular. La superhlice DNA negativa est desenrollada y por lo tanto ejerce presin en el sentido de separar las cadenas, separacin requerida durante la duplicacin (sntesis de DNA) y en la transcripcin (sntesis de RNA).

Tanto en clulas procariotas como en eucariotas ciertas enzimas pueden cambiar el estado de superenrollamiento de la doble cadena DNA; estas enzimas se denominan topoisomerasas. Las clulas contienen varias topoisomerasas que pueden dividirse en dos clases, segn su mecanismo de accin. La accin de la topoisomerasa tipo I consiste en romper transitoriamente una de las cadenas del par y permitir que gire alrededor de la otra cadena (fig. 10-14, a) y despus volver a unir la porcin rota de la cadena; de este modo disminuye la fuerza de torsin de la molcula. La topoisomerasa tipo II rompe transitoriamente ambas cadenas del par, a continuacin transfiere un segmento de DNA a travs de la rotura y vuelve a sellar las cadenas cortadas para "congelar" la molcula en su nuevo estado (fig. 13-13). Adems de su capacidad para enrollar y relajar el DNA, las topoisomerasas pueden unir molculas de DNA y formar o deshacer nudos; tambin pueden entrelazar (encadenar) crculos separados o desunir crculos entrelazados y formar elementos individuales (fig. 10-14, b,c). ,Las topoisomerasas son indispensables en procesos como duplicacin y transcripcin de DNA, que requieren el desenrollamiento de la doble cadena de DNA. Las topoisomerasas tambin desempean un papel clave durante la mitosis en la separacin de pares de cromosomas duplicados. La importancia de estas enzimas se ilustra porque ciertos frmacos, como los antibiticos empleados para destruir clulas bacterianas o en quimioterapia para detener el rpido crecimiento de clulas cancerosas, actan enlazndose a las topoisomerasas e inhibiendo su actividad.

10-3 Estructura del genoma

Por una parte, el DNA es una macromolcula, un ensamble de gran nmero de tomos enlazados en disposiciones definidas cuya estructura tridimensional se puede conocer

402

CAPITULO 10 Naturaleza del gen y del genoma

mediante tcnicas como cristalografa de rayos X. Por otro lado, el DNA es un depsito de informacin, una plantilla, una propiedad ms difcil de describir en trminos moleculares sencillos. Si, como se mencion antes, un gen corresponde a un segmento particular de DNA, entonces toda la informacin gentica transmitida al descendiente por sus progenitores equivale a la suma de todos los segmentos de DNA presentes en el huevo fertilizado al iniciarse la vida. En toda poblacin, los individuos que constituyen las especies comparten igual conjunto de genes, aunque los diferentes miembros individuales posean invariablemente versiones un tanto diferentes (alelos) de muchos genes. Por lo tanto, cada especie de un organismo posee una dotacin nica de informacin gentica conocida como su genoma. En el ser humano, el genoma prcticamente equivale a toda la informacin gentica contenida en un solo conjunto haploide de 23 cromosomas. Complejidad del genoma Para estimar la complejidad del genoma primero es necesario considerar una de la propiedades ms importantes de la doble hlice de DNA: su capacidad para separarse en sus dos cadenas componentes, propiedad denominada desnaturalizacin.
(a)
Desnaturalizacin del DNA

Segn describieron por primera vez Watson y Crick, las dos cadenas de una molcula de DNA se mantienen juntas por dbiles enlaces no covalentes. Una de las propiedades de la doble hlice que se investig desde un principio fue su desnaturalizacin mediante calor. Cuando se eleva lentamente
(1)

(2)

(c)
l''l<;iJRA 10-1-1. Actividades de la topoisomerasa. ti) Modelo que muestra la accin de la topoisomerasa I, La enzima tiene seccionada una de las cadenas de DNA, que gira alrededor de la otra cadena. A continuacin la cadena cortada se vuelve a unir, b) Tipos de reacciones que pueden catalizar las topoisomerasas. La parte 1 muestra reacciones de supercnrollamiento-relajacin; la parte 2 presenta reacciones de anudar-desanudar; la parte 3, reacciones de encadenamiento y desencadenamiento. Las lneas ms gruesas representan la doble cadena de DNA y las lneas delgadas, cadenas sencillas de DNA. c) Micrografa electrnica de un par de molculas de DNA circular conectadas (encadenadas). Molculas de este tipo se acumulan en bacterias que carecen de topoisomerasa especfica, (a: Segn DNA Topology and its Biologic Effects, N. Cozzarelli y j.C. Wang, eds.. Cola Spring Harbor Laboratory Press, 1990; c: segn Nicols Cozzarelli, Cell vol. 71, covcr # 2, 1992, con permiso de Ccll Press.)

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403

la temperatura de una solucin de DISTA, se alcanza una temperatura especfica a la cual se inicia la separacin de las cadenas. Luego que la temperatura sube unos pocos grados, el proceso generalmente concluye y la solucin contiene molculas de una sola cadena completamente separadas de sus parejas originales. El avance de la desnaturalizacin trmica (o fusin del DNA) de ordinario se puede observar siguiendo el incremento de absorbancia de las cadenas nicas en comparacin con las dobles cadenas de las cuales se originan. Las bases nitrogenadas de una molcula de cido nucleico absorben radiacin ultravioleta con absorbancia mxima cercana a 260 nm (fig. 10-15). Una vez separadas las dos cadenas de DNA, las interacciones hidrofbicas que resultan del apilamiento de las bases disminuyen mucho, lo que cambia la naturaleza electrnica de las bases e incrementa su absorbancia de radiacin ultravioleta. En la figura 10-16 se muestra el aumento de absorbancia que acompaa a la desnaturalizacin del DNA. La temperatura correspondiente a la mitad del cambio de absorbancia se denomina temperatura de fusin (Tf). Cuanto mayor sea el contenido de G-C (%G + %C) del DNA, mayor ser la Tf. La mayor estabilidad del DNA cuyo contenido en G-C es ms alto refleja la presencia de puentes adicionales de hidrgeno entre las bases en comparacin con los pares A-T. La micrografa electrnica de la figura 10-17 muestra que incluso en una sola molcula de DNA los fragmentos ricos en A-T se funden antes que las regiones ricas en G-C.
Renaturalizacin del DNA

1.48 1,44 1,40

1.36 1,32 1.28 1.24 1.20 1.16 1.12 1.08 1.04 25 31 37 43 49 55 61 67 73 79 85 91 99

Temperatura (C) FIGURA 10-16. Desnaturalizacin trmica del DNA. Curva de desnaturalizacin trmica para el bacterifago nativo T6 DNA en citrato de sodio 0.3 M. La "fusin" de DNA (separacin de las cadenas) ocurre en un estrecho intervalo de temperatura, particularmente para los DNA ms sencillos de virus pequeos. La temperatura correspondiente a la mitad del incremento de absorbancia se denomina Tm. (Segn /. Marmur y P. Doty, J. Mol. Blol. 3:593, 1961.)

La separacin por calor de la doble cadena de DNA no es un dato inesperado, pero parece mucho menos probable que las cadenas sencillas vuelvan a unirse para formar una molcula estable de doble cadena. Sin embargo, en 1960, Julius Marmur y sus colaboradores, de la Universidad Harvard, observaron que enfriando lentamente una solucin de DNA bacteriano desnaturalizado por calor se restablecen las propiedades de la doble hlice; absorbe menos

2,-

-p i

240

260

280

300

Longitud de onda (nm) FIGURA 10-15. Espectro de absorcin de la timina. Los cuatro nucletidos del DNA, y por consiguiente el propio DNA, muestran absorbancia mxima cerca de los 260 nm. Esta absorbancia a 260 nm por lo general se emplea para determinar la concentracin de cido nucleico. La tasa de absorbancia a 260/280 nm es una medida de la pureza de la preparacin de cido nucleico, puesto que las protenas contaminantes casi siempre absorben ms fuertemente a 280 nm. La relacin 260/280 de DNA purificado es casi de dos.

luz ultravioleta y se comporta otra vez como material gentico capaz de transformar las clulas bacterianas (pg. 427). Se obtienen resultados similares calentando el DNA a 100C para desnaturalizarlo, disminuyendo rpidarnenete la temperatura de la solucin hasta 25C, aproximadamente, por abajo de la Tf e incubando el DNA a esta temperatura durante cierto tiempo. Estos estudios demostraron que las molculas simples de DNA, complementarias en la doble cadena, tenan capacidad para volver a asociarse, suceso denominado renaturalizacin, o recocimiento. Esta fue una de las observaciones ms valiosas jams hechas en biologa molecular. Por una parte, la renaturalizacin fue la base de una investigacin acerca de la complejidad del genoma, tema analizado en la siguiente seccin. Por otra parte, la renaturalizacin tambin condujo a desarrollar un mtodo denominado hibridacin del cido nucleico, que permite formar molculas de doble cadena uniendo cadenas complementaras de cidos nucleicos de origen diferente. La hibridacin del cido nucleico, metodologa que aprovecha la extraordinaria especificidad de las cadenas de cido nucleico para unirse entre s, se utiliz para responder muchas preguntas bsicas de biologa molecular. Un ejemplo del tipo de preguntas que pueden responderse mediante hibridacin de cadenas simples de cidos nucleicos se analiza posteriormente en este captulo (pg. 406) y se ilustra en la figura 10-21. Complejidad de los genomas viral y bacteriano Varios factores determinan la tasa de renaturalizacin de una preparacin determinada de DNA. Estos son: 1) fuerza inica de la solucin; 2) temperatura; 3) concentracin de DNA; 4) periodo de incubacin y 5) tamao de las molculas que interactan. Con esto en mente, consideremos lo

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CAPITULO 10 Naturaleza del gen y del genoma

0.5.um

FIGURA 10-17. Relacin entre temperatura de fusin y contenido de GC. Micrografa electrnica que muestra un segmento de DNA del huevo de un erizo de mar que contiene genes para los cinco tipos de molculas de histona (estudiados en la seccin 12-1 e indicados en el mapa acompaante). Las regiones de DNA que sufren la separacin de cadenas en las condiciones empleadas se observan como segmentos delgados de una sola cadena. Estas regiones corresponden a segmentos ricos en pares de bases A-T situados entre las porciones de DNA que realmente codifican las protenas de histona. (b: Cortesa de R. Portincinn y M.L. Birnstid, dcredios reservado?.)

que pudiera ocurrir si se compara la tasa de renaturalizacin de tres DNA diferentes, cada uno constituyendo el genoma entero de: 1) un virus pequeo como el SV40 (5.4 x 103 pares de nucletidos); 2) un virus de mayor tamao, como T4 (1.8 x 105 pares de nucletidos), y 3) una clula bacteriana como . cali (4.5 x 106 pares de nucletidos). La principal diferencia entre estos DNA es su longitud. Para comparar su renaturalizacin es importante que las molculas reaccionantes sean de longitud equivalente, tpicamente casi 1 000 pares de bases. Se pueden fragmentar las molculas de DNA en pedazos de esta longitud de varias maneras: una es ejerciendo fuerza mediante alta presin a travs de un pequeo orificio. Cuando se permiti renaturalizar estos tres tipos de DNA, todos presentes a la misma longitud e igual concentracin (mg/ml), lo hicieron a tasas notablemente diferentes (fig. 10-19). Cuanto ms pequeo el genoma, ms rpida la renaturalizacin. La razn fue evidente ai considerar la concentracin de las secuencias complementarias en las tres preparaciones. Puesto que las tres preparaciones tienen !a misma cantidad de DNA en un volumen determinado de solucin, se deduce que cuanto ms pequeo el genoma, mayor ser el nmero de genomas presentes con determinado peso de DNA y mayor la probabilidad de colisin entre fragmentos complementarios. Esto se ilustra por el caso hipottico mostrado en la figura 10-18. Se observa el mismo perfil de renaturalizacin sin importar si los tres DNA se renaturalizan en tubos separados o juntos en la misma solucin (fig. 10-18, b,c). Esto ilustra un principio importante de las reacciones de hibridacin: la velocidad de reaccin entre molculas de secuencias complementa-

rias no es afectada por la presencia de molculas con secuencias no relacionadas.

Complejidad de los genomas eucarotas

La renaturaiizacin de ios DNA viral y bacteriano ocurre siguiendo una curva simtrica sencilla (fig. 10-19). La curva de renaturaiizacin tiene esta forma porque todas las secuencias estn presentes en igual concentracin (salvo unas pocas secuencias del DNA bacteriano). Por consiguiente, en esa poblacin cada secuencia de nucletidos tiene probabilidad de encontrar una pareja en un tiempo determinado respecto de cualquier otra secuencia. Diferentes estudios de mapeo gentico sugieren que el DNA de un cromosoma contiene los genes uno a continuacin del otro en disposicin neal, y permiten pronosticar este resultado. Los datos de genomas virales y bacterianos contrastan notablemente con los obtenidos en DNA de mamfero por Roy Britten y David Kohne, del California Institute of Technology. A diferencia de genomas ms simples, los fragmentos del DNA de un genoma de mamfero se renaturalizan a velocidades notablemente diferentes (fig. 10-20). Esas diferencias reflejan el hecho de que en una preparacin de fragmentos de DNA eucariota, las distintas secuencias de nucletidos se encuentran presentes a concentraciones muy variadas. Este fue el primer indicio de que el DNA eucariota no es una simple progresin de genes uno despus de otro, como en bacterias y virus, sino una organizacin mucho ms compleja. Cuando se renaturalizan fragmentos de DNA procedentes de plantas y animales, la curva de ordinario muestra tres pasos distintivos (fig. 10-20), que corresponden a la renaturalizacin de tres clases muv abundantes de secuen-

CAPITULO 10 Naturaleza de! gen y del genoma

405

Secuencia de bases Desnaturalizado por calor Al

DNA

Al-

Organismo DNA de A Genoma = 1 000 pares de bases de DNA Peso de un genoma = 10~ G picogramos (pg) Desnaturalizada *-**** Blpor calor
*

Bl1

Secuencias de bases Bl B2

Cortados a IQ'bps

Bl B2

DNA

B2+ -*B2-

Organismo DNA de B Genoma = 2 000 pares de bases de DNA Peso de un genoma = 2 x 10~6 pg

Cl
Secuencias de bases Cl C2
(a) C3 C4 Cortado a 10 3 bps

C2 C3 C4

Desnaturalizado "-_,' por calor

ci-

cr
C2-

-----C3*_
C4H
C4-

C3 H

Organismo DNA de C Genoma = 4 000 pares de bases de DNA Peso de un genoma = 4 x 10~ 6 pg

Experimento de renaturalizacin 1) Extracto de DNA de cada uno de los tres organismos hipotticos mostrados antes 2) Disolver cada DNA en un volumen de amortiguador (p. ej., 0.12 M de fosfato de sodio) de modo que la concentracin final sea de 5 mg/ml 3) Cortar el DNA de B y de C a 103 bps (A, B y C a igual longitud) 4) Desnaturalizar como se muestra antes 5) Incubar cada solucin a 60C y seguir el avance de la renaturalizacin como se muestra en las curvas de abajo

Mezcla de los tres DNA: A, B, C

ubos al licio de la icubacin

Tiempo

Tiempo

Tiempo

Tiempo

Tiempo

(b)
FIGURA 10-l. Experimento hipottico acerca de la renaturalizacin del DNA de tres organismos diferentes, a) Genoma de cada uno de los organismos. En cada preparacin, el DNA est cortado en fragmentos de 1 000 pares de bases de longitud y desnaturalizado en cadenas nicas mediante calor. Cada copia de un genoma de A produce un par de fragmentos complementarios; cada una de B da lugar a dos pares de fragmentos complementarios, y cada una de C da cuatro pares de fragmentos complementarios, b) Comparacin de las tasas de renaturalizacin de los tres diferentes DNA cuando todos estn presentes a la misma concentracin, c) Renaturalizacin del DNA cuando existen las tres preparaciones en la misma mezcla. La grfica de ia izquierda indica la curva de renaturalizacin del DNA de cada uno de los tres organismos. La grfica de la derecha sigue la renaturalizacin del DNA total. (En verdaderos experimentos de este tipo, como el que se muestra en la siguiente figura, se grfica la formacin de dobles cadenas de DNA contra Qjf, trmino que combina dos variables; concentracin de DNA y tiempo de incubacin. Una solucin con una concentracin elevada de DNA incubada durante breve tiempo tendr el mismo C0t que una de baja concentracin incubada durante un tiempo correspondientemente mayor; ambas tendrn el mismo porcentaje de DNA renaturalizado. Si todas las otras variables se mantienen constantes, la Cpf a la cual la mitad del DNA se ha renaturalizado es una medida sensible del peso molecular do estos tipos simples de genomas.)

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CAPITULO 10 Naturaleza de! gen y del genoma

Pares de bases en el genoma

10

102

103 I 104

105| 106 J I O

108

109

Cintica de la renaturalizacin del DNA ms simple (DNA sinttico, viral y bacteriano). Las curvas muestran la renaturalizacin de cadenas seccionadas de DNA a partir de la fuente indicada. El tamao del genoma, o sea, el nmero de pares de bases de nucletidos presentes en una copia de toda la informacin gentica del organismo, est indicada por las flechas cerca de la escala numrica de arriba. La forma de cada curva de renaturalizacin es muy simple y muestra una sola pendiente. Sin embargo, el tiempo de renaturalizacin es muy diferente y depende de !a concentracin de fragmentos complementarios, que a su vez depende del tamao del genoma. Cuanto ms grande sea el genoma, menor ser la concentracin de fragmentos complementarios en la solucin y mayor el tiempo necesario para concluir la rcnaturalizacin.
10

100

1 000 10000

(molas x seg/litro)

cas de DNA. Las tres se renaturalizan a diferente velocidad porque difieren en cuanto al nmero de veces que su secuencia de nucletidos se repite dentro de la poblacin de fragmentos. Cuanto ms grande sea el nmero de copias de una secuencia particular en el genoma, mayor ser su concentracin y ms rpida su renaturalizacin. Los tres tipos se denominan fraccin altamente repetida, fraccin moderadamente repetida y fraccin no repetida. Secuencias de DNA altamente repetidas. La fraccin altamente repetida consta de secuencias presentes en cuando menos 105 copias por genoma y tpicamente constituye casi 10% del DNA total de los vertebrados. Esta fraccin del genoma se renaturaliza con tal rapidez que su progresin slo puede seguirse en soluciones diluidas donde la concentracin de reactantes sea muy baja. Las secuencias altamente repetidas por lo general son cortas (unos pocos cien100%

tos de nucletidos en su mayor longitud) y se presentan en grupos donde la secuencia dada se repite una y otra vez sin interrupcin. Una secuencia dispuesta de este modo de un extremo a otro se dice que est presente en secuencia. Las secuencias altamente repetidas pertenecen a varias categoras superpuestas, incluyendo DNA satlite, DNA rninisatlite y DNA rnicrosatlite. DNA satlite. El DNA satlite consta de secuencias cortas (de 5 a 100 pares de bases de longitud} repetidas gran nmero de veces para formar grupos muy amplios que contienen hasta 100 millones de pares de bases de DNA. En muchas especies, la composicin de bases de estos segmentos DNA es muy diferente de la masa de DNA, y durante centrifugacin en gradiente de densidad se pueden separar fragmentos con la secuencia en bandas "satlite" distintas (de ah su nombre DNA satlite). Algunas especies pueden tener ms de una secuencia de DNA satlite; por ejemplo, Drosophyla viris tiene tres secuencias satlites diferentes cada siete nucletidos de largo, todas con secuencias muy similares, lo que indica un origen gentico comn. Las secuencias altamente repetidas de mayor longitud no aparecen como bandas separadas en gradientes de densidad, puesto que su composicin total de bases de ordinario no es muy diferente a la del DNA restante. DNA minisatlite. Las secuencias minisatlite tienen en promedio alrededor de 15 pares de bases de longitud y se encuentran en grupos que contienen hasta 1 000 o 3 000 repeticiones. Por lo tanto, las secuencias minisatlite ocupan tramos mucho ms cortos del genoma en comparacin con las secuencias satlite. DNA rnicrosatlite. Las secuencias rnicrosatlite son las ms cortas (2 a 5 pares de bases de longitud) y se presentan en grupos de 100 o menos copias repetidas en promedio. Las secuencias microsatlites se dispersan a travs del DNA, y en el genoma humano se encuentran cuando menos 30 000 locus rnicrosatlite diferentes.

75%

50%

lO-3

10-2

io-l

10

1Q2

C0 (moes x seg/litro) FIGURA 10-20. Cintica de la renaturalizacin del DNA eucariota. Los datos indican la presencia de tres clases distintas de fragmentos diferenciables por la repeticin de sus secuencias dentro del genoma: DNA altamente repetido, DNA moderadamente repetido y DNA no repetido (copias nicas).

CAPITULO 10 Naturaleza del gen y del genoma

407

Sabiendo que el genoma contiene gran nmero de copias de secuencias cortas de DNA, una de las primeras preguntas que surgen es: en qu sitio del cromosoma se localizan las secuencias de DNA? Anteriormente mencionamos que las observaciones iniciales de renaturalizacin de DNA condujeron a desarrollar una vasta metodologa de hibridacin de cidos nucleicos (revisada con detalle en el captulo 17}. Podemos hacer ahora la misma pregunta respecto de la localizacin de la secuencia de DNA satlite para ilustrar la potencia analtica de la hibridacin de cidos nucleicos. En los experimentos de renaturalizacin descritos anteriormente se permiti que las cadenas complementarias de DNA se enlazaran entre s mientras chocaban al azar dentro de la solucin. Mary Lou Pardue y Joseph Gall, de la Universidad de Yale, desarrollaron un protocolo experimental alterno denominado hibridacin in situ, inicialmente utilizado para responder la pregunta planteada antes acerca de localizacin del DNA satlite. El trmino in situ ("en su sitio") quiere decir que el DNA de los cromosomas se

mantiene en su sitio mientras reacciona con una preparacin particular de DNA marcado. Para efectuar la hibridacin de cidos nucleicos, ambos interactuantes deben ser cadenas sencillas, En el experimento mostrado en la figura 10-21, a, se prepar una muestra de cromosomas mitticos sobre una laminilla o cubreobjetos. A continuacin, el DNA de los cromosomas se convierte en cadenas nicas al tratar a los cromosomas con solucin alcalina que separa las cadenas de DNA y las mantiene desunidas. Durante la subsecuente etapa de hibridacin, los cromosomas desnaturalizados se incuban en solucin que contiene DNA satlite marcado de una sola cadena que puede unirse selectivamente a cadenas complementarias del DNA satlite inmovilizado en los cromosomas. Luego del periodo de incubacin, se lava el DNA satlite soluble no hibridado o se digiere y se prepara un frotis para revelar los sitios donde se encuentran unidos los fragmentos de DNA marcados. En los primeros estudios de hibridacin, las cadenas de DNA soluble se marcaron con istopos radiactivos y la localiza-

Cromosoma mittico Tratar el cubreobjetos con solucin alcalina para desnaturalizar el DNA Incubar con una sonda DNA marcada, a continuacin lavar para retirar el DNA no hibridado Cubrir el cubreobjetos con emulsin fotogrfica y exponer la emulsin a la radiactividad para producir una autorradiografa

s=sr ^ ^?-

***
^ ^

rfnW%

Cut reobjetos ', v d e vidrio ^

^ \

Doble cadena de DNA

Cadena sencilla de DNA

DNA hbrido de doble cadena

(a)

FICIJKA 10-2 l Hibridacin in situ y localizacin del DNA satlite, a) Etapas en el procedimiento de hibridacin in situ, segn se describe en el texto. En este ejemplo, las secuencias de DNA satlite se localizaron por medio de autorradiografa. b) Localizacin de DNA satlite en el centrmero de los cromosomas humanos mediante fluorescencia de hibridacin in situ (FHIS). Para efectuar este experimento se uni DNA a-satlite purificado a biotina y se incub con los cromosomas cuyo DNA se haba desnaturalizado. La localizacin del DNA biotinilado enlazado se descubre con una sonda fluorescente que se enlaza especficamente a biotina. La fluorescencia amarilla denota la presencia de DNA satlite hibridado contra un fondo de cromosomas contrateidos de rojo, La localizacin de la marca en el centrmero se comprueba por la constriccin del cromosoma, que es evidente en dicho sitio, (b: Segn Huntington F. Wlard, Trends Genetics 6:414, 1990.)

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CAPITULO 10 Naturaleza de! gen y del genoma

cin de los fragmentos de DNA enlazados se determin por medio de autorradiografa (como en la figura 10-32). Recientemente se observ que se puede obtener mayor resolucin mediante localizacin de fluorescencia. Con esta tcnica, denomina da fluorescencia de hibridacin in situ (FHIS), los fragmentos de DNA soluble se conjugan con biotina y se localizan fragmentos enlazados a cromosomas por interaccin con una protena fluorescente (llamada avidina) que se enlaza especficamente a la biotina con afinidad muy elevada. Mediante hibridacin in stu se ha demostrado repetidamente que el DNA satlite se localiza en los centrmeros de los cromosomas. Sin embargo, a pesar de ms de veinte aos de investigacin todava no est claro el papel del DNA satlite. Otros ejemplos de hibridacin in situ se muestran en las figuras 10-24,10-26,10-28 y 10-32. La posicin y el nmero de copias de la secuencia microsatlite vara mucho de una persona a otra, incluso entre miembros de la misma familia. Un ejemplo de esta variabilidad se observa en el gen denominado FMR1, cuya funcin no est definida con precisin. De cualquier manera, un alelo normal de este gen contiene entre 5 y 60 copias de un tripleto especfico (CCG) que se repite en una parte del gen que no codifica incorporacin de aminocidos. Una persona puede ser portadora de casi 200 copias de este tripleto sin mostrar efectos adversos. Sin embargo, cuando el nmero de copias se eleva a poco ms de 60, el locus se convierte en un sitio muy inestable y el nmero de copias tiende a incrementar con rapidez. Por lo tanto, personas con 60 a 200 copias del tripleto, aunque normales en s, son portadoras de un cromosoma muy inestable que transmiten a su descendencia. Si el nmero de repeticiones en la descendencia es mayor de 200, el individuo casi siempre presenta retraso mental. Esta enfermedad, conocida como sndrome X frgil porque de ordinario se acompaa de un sitio frgil sobre el cromosoma X, es causa comn de retraso mental hereditario. En la figura 10-22 se muestra la relacin entre nmero de copias del tripleto y fenotipo. En la enfermedad de Huntington, se demostr otro trastorno hereditario devastador como causa de un incremento similar del nmero de copias de la secuencia de un tripleto. En otras

enfermedades (cuadro 10-2) y en ciertos tipos de cncer tambin se implican modificaciones en las secuencias minisatlite y microsatlite. En el genoma hay miles de sitios que muestran un nmero variable de microsatlites repetidos (polimrfieos). Todava no est claro si estas simples secuencias repetidas desempean o no un papel en la estructura del DNA o en su funcin, pero su presencia se aprovecha para elaborar mapas genticos, aislar genes causantes de enfermedades humanas y desarrollar la tcnica de dactiloscopia de DNA (fig. 10-23). El mecanismo que modifica el nmero de copias de estas cortas secuencias repetidas an es motivo de especulacin. Secuencias de DNA moderadamente repetidas. La fraccin moderadamente repetida dei DNA puede variar desde casi 20 basta cerca de 80% del DNA total, segn el organismo. Esta fraccin incluye secuencias repetidas en cualquier parte del genoma, desde unas pocas veces basta varios cientos de miles. Las secuencias moderadamente repetidas pertenecen a distintas familias, cuyos miembros pue-den ser: 1) idnticos entre s, o 2) no idnticos pero relacionados. Entre las secuencias de DNA moderadamente repetidas se incluyen las que codifican productos conocidos del gen, sea RNA o protenas, y las que carecen de funcin codificadora. 1. Secuencias de DNA repetidas con funcin codificadora. Esta fraccin incluye genes que codifican RNA de transferencia y RNA ribosmico, y tambin los que codifican un importante grupo de protenas cromosmicas, las histonas. Las secuencias repetidas que codifican cada uno de estos productos de ordinario son idnticas entre s y se colocan en serie. Es indispensable la presencia de mltiples genes codificadores de los RNA ribosmicos y de transferencia, puesto que se requieren grandes cantidades de estos RNA y su sntesis no se beneficia de un paso extra de amplificacin, como ocurre para genes que codifican protenas, en los cuales el RNAm puede actuar corno plantilla para !a sntesis de muchos polipptidos. Aunque la produccin de histonas implica un RNA mensajero intermedio, durante el inicio del desarrollo de muchos animales los requerimientos de protena de este tipo son muy grandes en un periodo sumamente breve y se necesitan varios cientos de plantillas de DNA para la tarea. 5. DMA repetido que carece de funcin codificadora. La gran cantidad de secuencias de DNA moderadamente repetidas no codifican producto alguno. En vez de ocurrir como grupos o secuencias en fila, los miembros de estas familias se dispersan a travs del genoma como elementos individuales. La mayor parte de estas secuencias repetidas se pueden agrupar en dos clases, conocidas como ECIN (elementos cortos interpuestos) o ELIN (elementos largos interpuestos). Los ECIN tpicamente presentan longitud menor de 500 pares de bases, en tanto que los ELIN tienen ms de 1 000 pares de bases de largo. Las secuencias de nucletidos de estos elementos varan mucho de una especie a otra; en el ser humano se encuentran dos familias de secuencias repetidas (Ah, que es un ECIN, y Ll, que es un ELIN) que se estudian en la pgina 414. Todava se espera una respuesta satisfactoria a si estas secuencias repetidas tienen alguna funcin en la expresin del gen o simplemen-

Afectado

{CCG)n FI<;ilKA 10-22. Relacin entre trinucletidos repetidos y desarrollo del sndrome de X frgil. La flecha seala el sitio de inicio de la transcripcin. El recuadro indica el segmento codificante del gen FMR-1. (Segn R.I. Richards y G.R. Sutherland, Ce!l 70:710, 3992, con permiso de Cell Press.)

CAPITULO 10 Naturaleza de! gen y del genoma CUADRO 10-2. Enfermedades genticas por reiteracin del trinucletido Trnudetido reiterado Intervalo normal de reiteracin Intervalo de reiteracin en la enfermedad 40-62 42-100 43->60 250-4 000 >50 Reiteraciones en la regin codificante

409

Enfermedad
Atrofia muscular bulborraqudea Enfermedad de Huntington Ataxia espinocerebelosa tipo 1 X frgil Distrofia miotnica

CAG CAG CAG CCG CTG

11-33 11-34 < 29-36 6-54 5-30

S S Tal vez No No

FUENTE: H. Creen, Cell 74:956, 1993, con permiso de Cell Press.

A *

TS

D pantalones

camisa

te son "basura" que tiende a acumularse en los genomas como resultado de los diferentes procesos analizados ms adelante. Secuencias de DNA no repetidas. Como lo pronostic Mendel desde el principio, los estudios clsicos acerca de patrones hereditarios de rasgos visibles condujeron a los genetistas a la conclusin de que slo hay una copia de cada gen en cada conjunto de cromosomas haploides. Cuando se permite la renaturalizacin de DNA eucariota, una fraccin significativa de los fragmentos (70% de los fragmentos de DNA bumano en una longitud de 1 000 pares de bases) resulta muy lenta para encontrar pareja, tan lenta que en realidad se asume que hay una sola copia por genoma. Esta fraccin representa secuencias de DNA no repetidas (copias nicas), entre las cuales se incluyen los genes que muestran patrones de herencia mendeliana. Debido a la existencia de una sola copia en el genoma, los genes no repetidos siempre se localizan sobre un sitio especfico de cromosoma particular (fig. 10-24). Considerando la gran variedad de secuencias presentes, la fraccin no repetida contiene, con mucho, la mayor cantidad de informacin gentica. La fraccin no repetida incluye secuencias de DNA que codifican casi a todas las protenas diferentes de histonas. Aunque estas secuencias no presentan mltiples copias, cada vez hay ms pruebas de que los genes codificadores de polipptidos casi siempre son miembros de una famila o superfamila de genes relacionados. Esto es verdad para globinas, actinas, miosinas, colgena, tubulinas, integrinas y tal vez la mayor parte de las protenas de una clula eucariota. Cada miembro de una familia de multigenes es codificado por una secuencia no repetida diferente pero relacionada.

l ; I < ; r K V 10-2.'i. Dactiloscopia de DNA. En esta tcnica, ampliamente utilizada para determinar la identidad de un individuo a partir de una muestra de DNA, el DNA se digiere mediante tratamiento con nucleasas de restriccin especficas (corno en a figura 10-36), y los fragmentos de DNA se sujetan a electroforesis en gel. La localizacin de fragmentos de DNA que contengan secuencias especficas en gel se determina utilizando sondas con marcas radiactivas y secuencias complementarias a las observadas. Los fragmentos de DNA que se unen a estas sondas varan de longitud de una persona a otra debido a la presencia de un nmero variable de secuencias cortas repetidas en el genoma. La autorradiografa mostrada en esta figura se utiliz en el caso de un criminal; el presunto culpable enfrent la acusacin de apualar y dar muerte a una joven mujer. Las manchas de sangre sobre los pantalones y la camisa del acusado se compararon contra muestras estndar conocidas de sangre de la vctima y del acusado. El DNA de las manchas de sangre de las ropas del acusado no coincidi con sus propias muestras de sangre pero s con las de la vctima. Las filas contienen DNA de las siguientes fuentes: 1, 2, 3, 9 y 10 son muestras testigo de DNA que sirven como control de calidad; 4, sangre del acusado; 5, manchas de sangre de los pantalones del acusado: 6 y 7, manchas de sangre de la camisa del acusado, y 8, sangre de la vctima. (Cortesa de Cellmark Diagnostics.)

10-4 Estabilidad del genoma

Debido a que el DNA es el material gentico, solemos imaginarlo como una molcula estable cuyo contenido de informacin slo vara lentamente durante largos periodos de la evolucin. Sin embargo, las pruebas indican que la organizacin de las secuencias del genoma puede cambiar con rapidez, no slo en el orden evolutivo, sino en cuanto al periodo de vida de determinado individuo.

410

CAPITULO 10 Naturaleza del gen y del genoma

mas homlogos se juntan durante la meiosis sin estar perfectamente alineados. Como resultado de esta mala alineacin, el intercambio gentico entre homlogos genera un cromosoma con un segmento extra de DNA (duplicacin) y otro cromosoma con un segmento menos de DNA (supresin). Si la duplicacin de una secuencia particular contina en generaciones subsecuentes, se genera un grupo de segmentos repetidos en fila en un sitio localizado dentro de dicho cromosoma (fig. 10-26). Una vez producidas mltiples copias de una secuencia mediante el proceso de duplicacin, sera de esperar que la sustitucin de nucletidos modifique de diferente manera a varios miembros, generando una familia de multigenes cuyos miembros individuales presenten variaciones en las secuencias de aminocidos. Esto se ilustra por la evolucin de los genes de globina.
Evolucin de los genes de globina

Localizacin cromosmica de una secuencia de DNA no repetida. Esta preparacin de cromosomas mitticos se elabor a partir de una clula de ratn en etapa de divisin y se incub con una preparacin purificada de DNA que codifica una de las protenas laminares nucleares (lmina 82) codificada por un gen no repetido. Antes de incubar la lmina 62 de DNA con los cromosomas se uni a biotina mediante enlaces covalentes. Luego de la incubacin se lav la preparacin para eliminar el DNA no enlazado especficamente a los cromosomas, y los sitios sobre los cromosomas que contenan DNA biotinilado se revelaron incubando la preparacin con una sonda fluorescente que se une a la biotina con gran afinidad. Los sitios donde se une la sonda, que indican Ja localizacin del gen laminar dentro de los cromosomas, aparecen como puntos brillantes. El gen laminar aparece sobre el cromosoma 10. Cada cromosoma contiene dos copias del gen debido a que el DNA se duplic antes que las clulas iniciaran la mitosis. (Segn Monika Zewe y cois., cortesa de Werner Franke, Eur. J. Cell Biol. 56:349, 1991.)

Duplicacin y modificacin de las secuencias del DNA Podemos iniciar el examen de estabilidad del genoma con el dato bien establecido de que los organismos eucariotas contienen familias de multigenes que codifican polipptidos con secuencias relacionadas de aminocidos. Se cree que todos los miembros de una famila de multigenes se originan de una sola copia ancestral repetida en el curso de la evolucin. El primer paso en este tipo de amplificacin consiste en duplicar alguna regin del cromosoma, hecho que puede ocurrir conforme se sintetiza DNA, pero que con mayor probabilidad se produce mediante un proceso de entrecruzamiento desigual, como se muestra en la figura 10-25. Hay entrecruzamiento desigual cuando un par de cromoso-

Como se muestra en la figura 2-40, b, la hemoglobina es un tetrmero compuesto por cuatro polipptidos de globina. El examen de los genes de globina, de mamfero o de peces, revela una organizacin muy caracterstica. Cada uno de estos genes est formado por tres exones y dos intrones. Segn se analizar con detalle en el siguiente captulo, los exones son parte de genes que codifican aminocidos en el polipptido codificado, en tanto que los intrones no lo son: stos son ms bien secuencias interpuestas no codificantes. Por ahora, consideraremos estas partes de gen como indicadores de evolucin. El examen de ciertos poliptidos semejantes a globina, como la protena vegetal denominada leghemoglobina y la protena muscular mioglobna, revela la presencia de cuatro exones y tres intrones. Se cree que el polipptido de globina actual se origin de una forma ancestral como resultado de la fusin de dos exones {paso 1, figura 10-27), hace unos 800 millones de aos. Se sabe que algunos peces primitivos slo tienen un gen de globina (paso 2), lo que sugiere que dichos peces se separaron de otras estirpes de vertebrados antes de la duplicacin del gen (paso 3). Luego de su duplicacin, hace unos 500 millones de aos, el gen se apart por mutacin (paso 4) para formar dos tipos distintos de globina, uno a y otro/. Se cree que en pasos subsecuentes, las formas a y /5 se separaron mediante un proceso de transposicin o translocacin convirtindose en cromosomas separados (paso 5). A continuacin, cada gen sufri duplicaciones y divergencias subsecuentes (paso 6), generando la organizacin actual observada en seres humanos (paso 7). Los genes a-globina del genoma humano se ubican sobre el cromosoma 16, en tanto que los genes ^-globina se encuentran en el cromosoma 11. Segn se analiz en el captulo 2, la molcula de hemoglobina consta de dos pares de polipptidos (subunidades): un par que siempre es miembro de la subfamilia a-globina y el otro par que siempre pertenece a la subfamilia /5-globina. Las combinaciones especficas de globinas a y /? se ensamblan durante la construccin de molculas de hemoglobina en diferentes etapas del desarrollo. En la figura 10-27 se muestran las cadenas de globina a y fi requeridas para la sntesis de hemoglobinas embrionaria, fetal y del adulto, Otra caracterstica de la evolucin del gen, revelada por el anlisis de los grupos de globina, fue la presencia de

CAPITULO 10 Naturaleza del gen y del genoma

411

Entrecruzamiento desigual

26

O-D
(a)

(b)

El entrecruzamiento desigual entre genes duplicados suministra un mecanismo para generar cambios en el nmero de genes, a) La etapa inicial mostrada tiene dos genes relacionados (1 y 2). En un individuo diploide, el gen 1 sobre un homlogo se puede alinear con el gen 2 del otro homlogo durante la meiosis. Si durante esta alineacin equivocada ocurre entrecruzamiento, los dos gametos perdern un gen 2 y ambos tendrn un gen 2 extra, b) Conforme el entrecruzamiento desigual contina durante las divisiones meiticas en generaciones subsecuentes, gradualmente evolucionar una secuencia de arreglos de DNA repetidos en serie.

"genes" con secuencias claramente homologas de genes funcionales de globina, pero con mutaciones graves acumuladas que funcionalmente los excluyen por completo. Los genes de este tipo en realidad son reliquias evolutivas que se conocen como seudogenes, y su presencia en los genomas

Localizacin de una regin en cromosomas humanos que contiene un gen recientemente duplicado. La micrografa muestra los cromosomas mitticos de un varn incubados con DNA de un gen que participa en la enfermedad del rion poliqustico. Igual que en los ejemplos previos de hibridacin in situ, se desecha el DNA no enlazado, y el sitio donde el DNA se enlaza con su DNA complementario en el cromosoma se identifica mediante una sonda fluorescente enlazada. La flecha indica una regin del cromosoma 16 que contiene varias copias de la sonda enlazada. Un anlisis posterior indic la presencia de tres genes (HC-A, HG-B y HG-C) cuya secuencia de nucletidos es lo bastante parecida para enlazarse a la misma sonda de DNA. El hecho de que las secuencias no difieran significativamente indica que su duplicacin ocurri en ancestros recientes. (Segn Christopher J. War y cois. Cell 77:883, 1994; cortesa de Peter C. Harris, con permiso de Cell Press.)

est muy difundida. En ambos grupos de genes de globina a y fi de la figura 10-27 se observan ejemplos de seudogenes. Otro punto importante del examen de los dos grupos de globina de los cromosomas humanos es la cantidad de DNA que consta de secuencias no codificantes, sea como intrones dentro de los genes o como espaciadores entre los mismos. En realidad, menos de 15% del DNA localizado en estas regiones codifica la secuencia de aminocidos de los polipptidos de globina; el resto consta de regiones no codificantes, que en su mayor parte carecen de funcin conocida. Estudios de secuencias de DNA de diferentes especies indican que las distintas partes de la regin evolucionan a velocidad muy variable. El DNA de las regiones codificantes es muy constante, en tanto las regiones no codificantes son mucho ms variables. Ms an, los cambios descubiertos en regiones codificantes casi siempre son simples sustituciones de bases, en tanto que los cambios de porciones no codificantes con frecuencia incluyen adiciones y supresiones de segmentos de DNA. En algunos casos, los polipptidos codificados por determinada familia de secuencias evolucionaron con funciones divergentes, aunque la secuencia de aminocidos todava muestra su relacin ancestral. Por ejemplo, la hormona decrecimiento y la pro lactina son dos hormonas hipof isarias con una secuencia de aminocidos claramente relacionada que evoca respuestas totalmente diferentes en sus clulas efectoras. Incluso si el cambio en la secuencia de aminocidos de una protena particular es muy pequeo durante largos periodos de la evolucin, como en el caso de las actinas (pg. 355), siempre hay diferencias sustanciales de la secuencia de nucletidos entre genes correspondientes a organismos evolutivamente distantes pero relacionados. Las sustituciones toleradas de nucletidos son aquellas que no alteran las secuencias de aminocidos en las cadenas de polipptidos.2
2 Segn se analiza en el captulo 11, un mismo aminocido puede ser codificado por varios tripletos de nucletidos diferentes (codones). Por consiguiente, la secuencia de nucletidos puede cambiar sin que vare la secuencia de aminocidos codificada.

412

CAPITULO 10 Naturaleza del gen y del genoma Tiempo de evolucin Familia de genes de/-globina (cromosoma 11) Adulto Adulto Seudogen

Gen de globna ancestral

Embrin

00

Familia de genes a-giobina (cromosoma 16)

FIGURA 10-27. Va para la evolucin de los genes de globina. Los exones se muestran en rojo y los intrones en amarillo. Las etapas evolutivas mostradas en el diagrama se analizan en el texto. La disposicin de los genes de globina a y (9 sobre los cromosomas humanos 16 y 11 (mostrados sin sus intrones de la derecha) es producto de varios cientos de millones de aos de evolucin.

a-\o y adulto ai Feto y adulto

Seudogen
Seudogen Embrin

1.

0-0

Evolucin de las secuencias de DNA en el laboratorio. Para estudiar en el laboratorio el proceso de cambio gentico y evolucin en especies elevadas, se necesitan organismos con plazo muy corto de generacin y tamao muy pequeo. Esta fue la razn para emplear la mosca de la fruta como sistema satisfactorio para anlisis genticos. Sin embargo, incluso este insecto es demasiado lento para reproducirse y de tamao muy grande para permitir a los investigadores mantener el nmero necesario de individuos en el laboratorio para estudiar los principales cambios evolutivos del DNA. Por fortuna, se pueden efectuar algunos

anlisis de este tipo en clulas cultivadas que pueden crecer aceleradamente y en gran nmero. Las clulas cultivadas de mamfero pueden mostrar duplicacin de genes con frecuencia sorprendentemente elevada. Esto se demostr por primera vez en cultivos de clulas de ratones y caballos en presencia de metotrexato, frmaco utilizado en la quimioterapia del cncer. El metotrexato destruye clulas al enlazarse al sitio activo de una enzima esencial, la dihidrofolato reductasa (DHFR), e inactivarla. Se ha notado que el metotrexato a menudo es eficaz momentneamente para reducir el tamao de tumores malig-

CAPITULO 10 Naturaleza del gen y del genoma

413

nos, pero luego pierde su eficacia. En cultivo de clulas tumorales el metotrexato puede generar resistencia similar al elevar gradualmente la concentracin del frmaco a la cual se expone la clula. Este protocolo experimental consiste en cultivar clulas con metotrexato en concentracin baja pero capaz de destruir todas las clulas, menos una por cada cien mil. Estas pocas clulas resistentes pueden entonces cultivarse con rapidez en gran nmero y ser tratadas con una concentracin ms alta del frmaco, el cual una vez ms puede destruir casi todas las clulas pero seleccionar un pequeo nmero de ellas an ms resistentes que las que se permiti proliferar. El anlisis de clulas capaces de desarrollarse en diferentes concentraciones de metotrexato indica que su resistencia regularmente corresponde a su contenido de DHFR; las clulas ms resistentes son las que contienen unas 400 veces la cantidad de enzima en comparacin con la inicial. E incremento del contenido de una enzima particular se puede explicar mediante varios mecanismos; en este caso se debe a la amplificacin del gen que codifica la cadena del polpptido de dihidrofolato reductasa. Estudios subsecuentes han indicado que las secuencias de DNA amplificado que codificaban para la enzima aparecan en un grupo pequeo de un cromosoma particular (fig. 10-28). La evolucin de la resistencia a metotrexato en clulas tumorales cultivadas es un ejemplo de amplificacin selectiva del gen, puesto que otras partes del genoma no son. afectadas, pero ste no es un caso de amplificacin programada. Ms bien, la secuencia de DNA que compone este gen particular se amplific como resultado de un acontecimiento al azar dentro del genoma, como un entrecruzamiento desigual. Se puede asumir que hay probabilidades finitas pero raras de que determinado segmento del genoma "acciden-

talmente" se duplique en una clula dada, aunque algunas secuencias pueden ser ms susceptibles de duplicacin en comparacin con otras debido a su ubicacin dentro del cromosoma. Si la duplicacin confiere mayor valor selectivo a la clula que la porta, como en la duplicacin del gen de DHFR en presencia de metotrexato, entonces esa clula y su descendencia tendrn mayor probabilidad de sobrevivir y reproducirse. Elementos genticos mviles Los estudios acerca de resistencia a frmacos en clulas tumorales cultivadas suministraron un notable ejemplo de cmo puede generarse un grupo de secuencias repetidas. S consideramos las secuencias repetidas originadas en el curso normal de la evolucin, encontramos que muchas de ellas ocurren en series, en tanto que otras se dispersan a travs del genoma. Asumiendo que todos los miembros de una familia de secuencias repetidas se originaron de una sola copia, entonces cmo pueden repartirse los miembros individuales entre cromosomas diferentes? La primera persona que sugiri que los elementos genticos eran capaces de mudarse de un sitio a otro en el genoma fue Barbara McClintock, genetista que trabaj con maz en os Cold Spring Harbor Laboratories, en Nueva York. Los rasgos genticos se expresan principalmente como cambios en patrones y marcas de las hojas y coloracin de las mazorcas (fig. 10-29). A fines del decenio de 1940, McClintock observ que ciertas mutaciones eran muy inestables, aparecan y desaparecan de una generacin a la siguiente, o incluso durante la vida de una planta indivi-

RGL1A 10-28. Demostracin experimental de la amplificacin del gen DHFR en clulas seleccionadas por exposicin a metotrexato. Mediante hibridacin in situ con fluorescencia empleando como sonda un gen de DHFR clonado de ratn se revela la localzacin de las secuencias DHFR del gen (mostradas en amarillo) en los cromosomas de este hbrido de ratn y cobayo. Se observa que el gen de DHFR est muy amplificado en ambos miembros del par de cromosomas homlogos sobre los cuales se encuentra el gen. (Cortesa de George B. Yelatzie y Robert T. Schimke.)

FIGURA 10-29. Manifestaciones visibles de transposicin en e! maz. Tpicamente los granos de maz son de color uniforme. Los puntos sobre este grano son resultado de la mutacin de un gen que codifica una enzima participante en la produccin de pigmentos. Las mutaciones de este tipo pueden se muy inestables, y se originan o desaparecen durante el periodo de desarrollo de un solo grano. Estas mutaciones inestables aparecen y desaparecen como consecuencia del movimiento de elementos susceptibles de mudarse durante el periodo de desarrollo. (Cortesa de Venkatesan Sundaresan.)

414

CAPITULO 10 Naturaleza del gen y de! genoma

dual. Luego de varios aos de cuidadosos estudios concluy que ciertos genes se movan de un sitio del cromosoma a otro totalmente diferente, afectando la expresin del gen. Denomin transposicin a esta nueva disposicin de los genes, y a los genes que mudaron de sitio los llam elementos transportables. Entretanto, los bilogos moleculares que trabajaban con bacterias no encontraron pruebas de transposicin. Para ellos, los genes parecan elementos estables situados en disposicin lineal sobre el cromosoma que permanecan constantes de un individuo a otro y de una generacin a la siguiente. Las publicaciones de McClintock fueron escritas en un estilo denso y difcil de entender, y se referan a un organismo cuya gentica era muy compleja y poco familiar a otros investigadores prominentes. Como resultado, los datos de McClintock fueron ignorados. A finales de los aos 1960, varios laboratorios descubrieron que ciertas secuencias del DNA bacteriano podan mudarse de un sitio a otro del genoma. Estos elementos transportables se denominaron transposones. Subsecuentemente, se observ que los transposones codifican una protena, o transposasa, que facilita su introduccin al sitio especfico del DNA. En la mayor parte de los casos, los elementos transportables de la bacteria no abandonan realmente el sitio donador; en vez de ello, se duplican y la copia del DNA resultante es introducida por la transposasa en un sitio especfico distante. Anlisis secuenciales de transposones indican que la secuencia presente en un extremo del elemento se repite en el extremo opuesto, pero con orientacin opuesta (o sea, como una secuencia repetida, pero invertida) (fig. 10-30). Las transposasas reconocen estas repe-

Receptor del DNA AATTC TTAAG Transposones interpuestos en el DNA receptor

AATTC TTAAG
\

Transposn
.A.
"X

TTAAG
'

i i

i i
GGGGTCTG CCCCAGAC

/ ' / /

1 1

[ 1

CAGACCCC GTCTGGGG

= Repeticin directa en el receptor DNA = Repetido inverso en los extremos del transposn FIGURA 10-3O. Organizacin de las secuencias de un transposn. Los extremos del elemento mvil transportable contienen secuencia inversa repetida. La integracin del transposn al DNA del husped genera una duplicacin que se observa como unidad corta directa repetida en ambos extremos del elemento. Las secuencias de nucletidos aqu mostradas pertenencen a Tn3, un transposn bacteriano que codifica tres protenas, incluyendo la transposasa que le permite integrarse a nuevos sitios en el DNA.

ticiones terminales requeridas para integrarse al DNA especfico. Se observan secuencias repetidas en los extremos de todo tipo de elemento transportable, tanto en bacterias como en eucariotes. Adems, la integracin del elemento genera un pequeo duplicado en el DNA especfico que flanquea el elemento transpuesto en el sitio donde se introdujo (fig. 10-30). Los sitios especficos de duplicacin sirven como "duplicados" para identificar sitios en el genoma que estn ocupados por elementos transportables, o que ya han estado ocupados por ellos. Como originalmente predijo McClintock, los estudios en genomas eucariotas han revelado la presencia de numerosos elementos transportables. Es muy improbable que un elemento transportable cambie de posicin durante el periodo de vida de determinada clula, pero son tantas las copias presentes de ese elemento que su movimiento tiene enormes consecuencias en la evolucin de los genomas. Se cree que la introduccin de elementos transportables ocurre al azar. Por consiguiente, un elemento tiene exactamente la misma probabilidad de introducirse en el centro de un gen que codifica protena que en cualquier otra parte. En el hombre se han comprobado varios ejemplos de tales acontecimientos, incluyendo algunos casos de hemofilia causada por un elemento gentico mvil que "salta" a la parte media de uno de los genes claves para codificar la coagulacin sangunea. Se estima que una de cada 500 mutaciones en el hombre son resultado de la introduccin de un elemento transportable. Se conocen varios tipos diferentes de elementos eucariotas transportables y tambin diversos mecanismos de transposicin (fig. 10-31). Los mecanismos encargados de la transposicin son complejos y poco comprendidos. Como en el caso de los transposones bacterianos descritos antes, algunos elementos eucariotas transportables se duplican y la copia del DNA se introduce en un sitio especfico dejando el sitio donador sin cambios. En otros casos, el elemento se separa del DNA en el sitio donador y se introduce en un sitio especfico distante. Sin embargo, con mayor frecuencia la transposicin implica un RNA intermedio. El DNA del gen se transcribe al RNA, el cual entonces se "transcribe en reversa" a un DNA por medio de una transcriptasa inversa, enzima que emplea una molcula de RNA como plantilla para sintetizar una copia complementaria de DNA. La copia eje DNA se elabora como una copia de doble cadena y luego se integra al sitio especfico del DNA. En muchos casos, el elemento transportado lleva en s la secuencia que codifica una transcriptasa inversa. Los elementos transportables que requieren transcriptasa inversa para mudarse se denominan retrotransposones. Casi todos los mecanismos de transposicin implicados copian el elemento movible en vez de seccionarlo, pero con el tiempo la transposicin provoca aumento de tamao del genoma. Papel de los elementos genticos movibles en la evolucin En la pgina 408 se mencion que las secuencias de DNA moderadamente repetidas constituyen una porcin significativa del genoma humano. Las dos familas ms comunes de secuencias moderadamente repetidas en el DNA humano son elementos transportables; son las familias Alu y Ll,

CAPITULO 10 Naturaleza de! gen \j del genoma DNA donador con transposn DNA receptor DNA receptor con transposn

415

DNA donador luego de perder el transposn y reunin de los extremos DNA donador con transposn DNA receptor DNA receptor con transposn

Sntesis de una copia del DNA del transposn

(b)
DNA donador con retrotransposn

DNA donador con transposn

ONA receptor

DNA receptor con retrotransposn

i
[
RNA

mm
1 t

i
i r~
DNA donador con retrotransposn.

Transcripcin por la RNA polimerasa

i i

cDINA

Transcripcin inversa para formar cDNA de una sola cadena

DNA (O

Conversin al DNA de doble cadena

F H i l l i V 10-;il. Tres vas alternas para mover a los elementos transportables de un sitio a otro dentro del genoma. a) Transposicin no replicativa; b) transposicin roplicativa, y c) transposicin a travs de un RNA intermedio. Esta ltima va es prcticamente idntica a la empleada por los retrovirus para introducir copias del DNA do su genoma en el DNA del husped.

y se cree que ambas transponen por medio de RNA intermedio. La secuencia Ll tiene aproximadamente 6 000 pares de bases de longitud y equivale a casi 4% de todo el genoma humano. Esta secuencia contiene un segmento que codifica una transcriptasa inversa requerida para la transposicin. Aun ms abundantes que las secuencias Ll son las secuencias Ah, interpuestas en cientos de miles de diferentes sitios a todo lo largo del cromosoma. Ah es una familia de secuencias cortas relacionadas y tiane casi 300 pares de bases de longitud. Puesto que las secuencias Alu constituyen ms de 5% del genoma humano total, se podra esperar que esta secuencia se repita en genomas a travs de todo el reino animal, pero este no es el caso. Estudios en genomas de

diferentes mamferos indican que la secuencia Alu apareci primero como elemento transportable en el genoma de primates evolutivamente elevados hace casi 60 millones de aos, y el nmero de copias fue creciendo a partir de entonces a una velocidad de casi una copia cada 100 aos. Se estima que el miembro promedio de a familia Alu permaneci en el genoma de la lnea evolutiva del ser humano durante casi 25 millones de aos. Con los datos disponibles no se puede determinar si la amplificacin est alcanzando un punto de "saturacin" en el genoma o contina sin impedimentos. Cuando se descubre algo nuevo en un organismo, la primera pregunta que de ordinario se hace un bilogo es:

416

CAPITULO 10 Naturaleza del gen y del genoma

cul es su funcin? An hay debate al respecto entre dos escuelas de pensamiento: 1. Un grupo argumenta que los elementos transportables no tienen funcin, ms bien son un tipo de "parsito gentico" que se puede propagar dentro del genoma husped y transmitirse a la descendencia, en tanto no provoque efectos adversos graves en la capacidad del husped para vivir y reproducirse. 2. Un segundo grupo argumenta que la transposicin es un mecanismo clave para generar cambios genmicos que constituyen el impulso de la evolucin biolgica. Exploremos esta segunda proposicin con mayor detalle. Es claro, que el movimiento de un elemento transportable puede tener efectos nocivos sobre la expresin de un gen situado en el DNA especfico. Sin embargo, en raras ocasiones se puede esperar que este movimiento sea benfico y confiera al organismo una ventaja selectiva. En mayor escala, se ha sugerido que la transposicin puede ser la causa de la aparicin de nuevas especies (especiacin). El examen del registro fsil llev a la idea de que la especiacin con frecuencia ocurre en cortos periodos seguidos por periodos ms prolongados durante los cuales se observa muy poco cambio en las especies. Luego del descubrimiento en el laboratorio de genes con capacidad para suprimir el efecto mutacional de algunas transposiciones en ratones y moscas de la fruta, surgi una explicacin para estos brotes evolutivos. Se sugiere que las mutaciones suprimidas pueden acumularse en el DNA de una poblacin durante mucho tiempo sin ser expresadas. Luego, si el supresor fuera "sbitamente" inactivado, los cambios acumulados se manifestaran de golpe, provocando espectaculares diferencias en el fenotipo de dicho individuo y su progenie, lo que tal vez conduzca a la formacin de una especie totalmente nueva. Un punto queda claro: la transposicin ha tenido mayor impacto en la alteracin de la composicin gentica de los organismos conforme evolucionan. Esto puede ilustrarse claramente con el elemento P de Drosophila melanogaster. El examen de moscas de la fruta criadas en el laboratorio, descendientes de los individuos atrapados por T.H. Morgan y sus colegas a principios de siglo, muestra que se encuentran desprovistas del elemento P. En contraste, todo miembro de la especie capturado en el medio "silvestre" es portador de este elemento transportable (fig. 10-32). Se cree que este elemento fue introducido a! genoma de una sola mosca de la fruta hace unos 50 aos (quiz por transmisin de un individuo a otro de la especie Drosophila) y se propag rpidamente a travs de toda la poblacin de las especies. Es interesante notar que hace apenas veinte aos los bilogos moleculares consideraban el genoma como depsito de informacin gentica estable y susceptible de reposicin. En la actualidad, es notable que los organismos puedan conservar su propia integridad de un da para otro frente a esta redisposicin en gran escala del material gentico. Por el descubrimiento de la transposicin, Barbara McCHntock fue la nica ganadora del Premio Nobel en 1983, casi 35 aos despus de sus primeros descubrimientos.

FIGURA 10-32. Elementos P en Drosophila. Porcin de un par de homlogos politeno de Drosophila donde la localizacin de los elementos P est indicada por granulos plateados en los sitios unidos al RNA complementario de la secuencia del elemento P transportable? marcado con istopo radiactivo. Se observa que el elemento P se introduce en diferentes sitios sobre los dos cromosomas homlogos. La introduccin de un elemento P en uno de los sitios caus mutacin en el gen que all reside. (Segn Kate Loughney, K. Krebery Barr/ Ganctzky, Cell 58:1143, 1989; con permiso de Ccll Press.)

10-5 Mapas moleculares del genoma

Durante decenios, los genetistas han determinado la frecuencia de entrecruzamiento de genes para elaborar mapas de stos a lo largo de un cromosoma (pg. 394). Cuanto ms cercanos se encuentran los genes sobre el cromosoma menor es la probabilidad de que sus alelos se separen durante el entrecruzamiento. Con este procedimiento de mapeo, los diferentes alelos de un gen actan como marcadores genticos, sirviendo como letreros que ayudan a revelar la ubicacin relativa de otros sitios a lo largo del cromosoma. Se sabe que algunos genes presentan varias formas allicas, como los que determinan el tipo sanguneo, a los que se es denomina genes polimrficos, y constituyen los mejores marcadores genticos debido a que los individuos pueden diferir de mltiples maneras. Asignar un marcador gentico a la posicin relativa en un cromosoma segn la frecuencia de entrecruzamiento se conoce como mapeo gentico. Pero, como se indica en la figura 10-33, los mapas genticos no son la nica manera de disecar un cromosoma. Hay otro tipo de mapa cromosmico cuyo objetivo es determinar la secuencia de nucletidos de DNA que constituyen cada cromosoma. Este tipo de mapa es el tema de La perspectiva humana: Mapeo del genoma humano. El medio para lograr este objetivo es disecar en fragmentos superpuestos de tamao manejable la enorme molcula de DNA que constituye cada cromosoma. Estos fragmentos pueden clonarse y secuenciarse (seccin 17-12) para determinar su orden en el cromosoma. Los mapas de este tipo elaborados con fragmentos de DNA en vez de marcadores genticos se denominan mapas fsicos (fig. 10-33). La construccin de

CAPITULO 10 Naturaleza del gen y del genoma

417

LA PERSPECTIVA HUMANA
Mapeo del genoma humano
En 1986, un grupo de cientficos de todo el mundo se reuni en Cold Spring Harbor Laboratories, de Long Island, Nueva York, para analizar la posibilidad de descodificar toda la informacin gentica almacenada en los cromosomas humanos, mediante una colaboracin cientfica internacional de grandes proporciones. En pocos aos, las dependencias gubernamentales de Estados Unidos, Europa y Japn decidieron unirse a este esfuerzo, conocido como PGH, Proyecto del Genoma Humano. El trmino "genoma" se refiere a la informacin almacenada en todo el DNA de un solo conjunto de cromosomas. El genoma humano contiene unos 3 000 millones de pares de bases. Si cada letra de esta pgina fuera equivalente a un par de bases del DNA, la informacin contenida en el genoma humano sera suficiente para un libro de un milln de pginas, aproximadamente! El objetivo del Proyecto del Genoma Humano es conocer la secuencia del DNA de los 24 cromosomas humanos (22 autosomas ms los cromosomas X y Y que determinan el sexo) hacia el ao 2005. Se establecieron centros comprometidos a lograr este objetivo en todo el territorio de Estados Unidos y en otros pases. Durante los primeros aos del proyecto, los investigadores prepararon mapas fsicos de cada cromosoma humano con el fin de obtener, para el ao 1998, marcadores identftcables de secuencias localizadas cada 100 000 bases. Tambin se aislaron fragmentos superpuestos de DNA dispuestos en un orden para cubrir toda la longitud de cada cromosoma. Adems del genoma humano, el proyecto tambin incluye secuenciar el genoma de varios organismos "modelo", incluyendo bacterias, levaduras, nematodos, la mosca de la fruta y el ratn. El genoma completo de una levadura (14 millones de pares de bases divididas en 16 cromosomas) debi estar secuenciado para fines de 1996, el cual sera el primer eucariote cuya plantilla gentica se conociera en su totalidad. Conforme se descubran secuencias y localizaciones de diferentes genes de la levadura, se tratar de determinar sus funciones. Puesto que el genoma humano posee homlogos de casi todos los genes de la levadura, esta informacin podr relacionarse directamente con el proyecto humano. El costo total del Proyecto del Genoma Humano se estima en casi 3 000 millones de dlares: un dlar por cada par de bases. Para qu gastar tanto dinero y esfuerzo simplemente para determinar una lista de nucledos de cuatro letras que pueden llenar un milln de pginas? El objetivo del proyecto no slo es compilar una secuencia de letras, sino conocer el significado de dicha secuencia. Con el Proyecto de! Genoma Humano se espera: Revelar la secuencia de aminocidos de cada polipptido codificado por nuestros genes. Mediante el anlisis de las secuencias, los bilogos podrn entonces conocer la funcin probable de estos polipptidos. Esta informacin puede arrojar luz sobre casi todos los aspectos de la biologa humana, desde las bases bioqumicas de la memoria hasta los productos del gen que provocan perdida de control del crecimiento celular, con la consiguiente malignidad. Se estima que el genoma humano contiene alrededor de 100 000 genes distintos. Obtener informacin detallada acerca de las secuencias que participan en el control de la expresin del gen. Identificar los genes que causan enfermedades humanas o que contribuyen a ellas, incluyendo enfermedades tan complejas como cncer, hipertensin, enfermedad de Alzhemer y enfermedades mentales, y determinar los cambios en la secuencia que desencadenan la enfermedad. Lograr conocimientos acerca de la evolucin a nivel molecular al comparar nucletidos y secuencias de aminocidos en el hombre con los de sus parientes evolutivos cada vez ms distantes. Los estudios de este tipo tambin revelarn los productos del gen caractersticos del hombre, lo que ayudar a explicar por qu somos biolgicamente diferentes de otros organismos. Permitir a los investigadores obtener cualquier gen particular en muestras de DNA, y por lo tanto tener una oportunidad ilimitada de continuar la investigacin en biologa molecular humana. Suministrar a los biotecnlogos la oportunidad de elaborar protenas humanas previamente desconocidas con valor potencial en medicina. El Proyecto del Genoma Humano no est exento de crticas. Algunos cientficos opinan que el proyecto es demasiado costoso, al menos a nuestro nivel actual de experiencia en la secuenciacin de DNA, y que consume dinero de otros proyectos de investigacin. Adems, casi todo el trabajo es tedioso y falto de creatividad, no del tipo de proyecto atractivo para la mayora de los cientficos. Sidney Brenner, uno de los pioneros de la biologa molecular inglesa, irnicamente sugiri que este sera un trabajo adecuado para castigar convictos de una colonia penal. Otros crticos argumentan que el conocimiento de las secuencias del DNA humano abre la puerta a una nueva invasin de nuestra intimidad. Por ejemplo, es factible que compaas de seguros o empresas que ofrezcan empleos demanden informacin acer-

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CAPITULO 10 Naturaleza de! gen y del genoma

ca de la constitucin gentica de posibles empleados o asegurados para determinar su predisposicin hacia enfermedades particulares. Todava ms, otros temen que el conocimiento acerca de las secuencias de nucletidos

determinantes de ciertas caractersticas genticas conduzca a que gobiernos inescrupulosos intenten alterar el genoma humano en cierta direccin particular. Para contrarrestar estos temores, el director del Proyecto del Ge-

noma Humano subraya con gran nfasis las implicaciones ticas, sociales y legales de una amplia disponibilidad de informacin relativa a las secuencias genticas.

un mapa fsico se inicia con la diseccin del DNA, lo que se logra empleando endonucleasas de restriccin. Endonucleasas de restriccin Durante el decenio de 1970 se observ que las bacterias contienen nucleasas capaces de reconocer secuencias cortas de nucletidos en el DNA doble y desdoblar el esqueleto

Mapa gentico

Identificacin de gen

I- Enzima A

I- Protena B reguladora de gen 2-5 cM I- Protena estructural C I- Protena D de transporte en la membrana Mapa fsico Secuenciacin de DNA

principal de la molcula en sitios muy especficos sobre ambas cadenas del doblete. Estas enzimas recibieron el nombre de endonucleasas de restriccin, o simplemente enzimas de restriccin. La denominacin se debe a que las bacterias las emplean para destruir el DNA viral capaz de penetrar a la clula, y por lo tanto restringen el potencial de crecimiento de !os virus. El propio DNA de la bacteria se encuentra protegido de ataques nucleolticos por metilacin de los sitios susceptibles sobre las bases, modificacin qumica que impide la accin de la enzima. Se han aislado enzimas de varios cientos de organismos procariotas diferentes que, en conjunto, reconocen ms de 100 distintas secuencias de nucletidos. Las secuencias reconocidas por estas enzimas son de cuatro a ocho nucletidos de largo y se caracterizan por un tipo particular de simetra interna. Consideremos la secuencia particular reconocida por la enzima EcoRl(fig. 10-34): 3CTTG5' 5GAATTC3'

FIGURA 10-33. Tipos de informacin obtenida por anlisis gentico. Los mapas genticos suministran informacin acerca de la posicin relativa de los marcadores genticos determinada por la frecuencia de recombinacin. Los mapas fsicos se construyen por superposicin de fragmentos DNA obtenidos por digestin con enzimas de restriccin. La identificacin de genes se ha convertido en una investigacin clnica muy importante conforme se incrementa el nmero de genes identificados como causantes de enfermedades en el hombre. El secucnciamiento de DNA proporciona informacin acerca de la secuencia de pares de bases que constituyen regiones especficas de los cromosomas. Como se analiza en La perspectiva humana de la pgina 417, los investigadores tienen como meta secuenciar todo el genoma humano para el ao 2005. (Segn f . S . Coins Science 262:45, 1993. Copyright 1993 por American Assodation for tie Advancement of Science.)

Se dice que este segmento posee simetra rotacional doble porque puede girar 180 sin cambiar la secuencia de bases. Por lo tanto, si uno lee la secuencia en la misma direccin (3' a 5' o 5' a 3') sobre cada cadena, se observa el mismo orden de bases. Una secuencia con este tipo de simetra se denomina palndromo. Cuando la enzima EcoRl ataca este palndromo, rompe cada cadena sobre el mismo sitio en la secuencia, indicado por las flechas entre los residuos A y G. Los puntos mostrados sobre la parte de arriba del segmento indican las bases de esta secuencia que son metiladas para proteger el DNA husped del ataque enzimtico. En la figura 10-35 se muestran las secuencias reconocidas por algunas enzimas de restriccin. Algunas de estas enzimas desdoblan los enlaces directamente opuestos entre s sobre las dos cadenas, lo que produce extreinos a! mismo nivel, en tanto que otras, como la EcoRl, ejecutan cortes biselados. El descubrimiento y purificacin de las enzimas de restriccin constituye uno de los avances ms valiosos efectuados por los bilogos moleculares en aos recientes. La secuencia particular de cuatro a seis nucletidos es muy frecuente slo por azar, por lo que cualquier tipo de DNA puede ser fragmentado por estas enzimas. El empleo de las enzimas de restriccin permite disecar con precisin el DNA del genoma humano, o de cualquier otro organismo, en un

CAPITULO 10 Naturaleza del gen y de! genoma

DNA G A A T TC

419

Enzima

Reconocimiento de la secuencia 3'-N-C-A-R.Y-T-G-N-5'

Enzima

Reconocimiento de la secuencia

R. Hmdll

R. EcoRI

3-N-C-T-TA-AG-N-5' 5-N-GrA-A T-T-C-N-3'

CT T A A G Reconocimiento de" la secuencia fcoRI

R. BsuR S'-N-N-G-G^C-C-N-N-S'

R. EcoRII

Enzima EcoR1

R. Hpal 5--N-G-T-TAAC-N-3-

3'--T-T-CG-A-N-5 5

FIGURA 10-35. La mayor parte de las enzimas de restriccin separan las molculas de la doble cadena de DNA por secuencias de cuatro a seis nucletidos especficos. Se ilustran las secuencias reconocidas por varias de estas enzimas junto con el sitio sobre cada cadena donde se efecta el corte (indicado por las flechas). Las enzimas situadas a la izquierda rompen ambas cadenas en un mismo punto, en tanto que las situadas a la derecha rompen la cadena en sitios escalonados. N es cualquier nucletido (el nucletido opuesto debe ser complementario), R es una purina, Y una pirimidina. La lnea punteada central indica el punto de doble simetra de rotacin. (Reimpreso segn K. Murray, Endeavour 35:130, 1976, con el amable permiso de Elsevier Science Ltd.)

3'

FIGURA 10-34. Separacin del DNA mediante la enzima de restriccin EcoRI.

conjunto definido de fragmentos especficos. Una vez digerido el DNA de un individuo particular con una de estas enzimas, los fragmentos generados se pueden fraccionar en tramos de longitud definida mediante electroforesis en gel (fig. 10-36, a). Diferentes enzimas desdoblan una misma preparacin de DNA en distintos conjuntos de fragmentos, y los sitios desdoblados dentro del genoma por las diferentes enzimas se pueden identificar y ordenar en un mapa de restriccin (una especie de mapa fsico), como el mostrado en la figura 10-36, b. Dada su capacidad para fragmentar el DNA en un conjunto predecible de fragmentos, las enzimas de restriccin tienen aplicacin en gran nmero de actividades humanas, incluyendo diagnstico mdico y peritajes en medicina forense. En las siguientes pginas se describen las bases de estas aplicaciones. Sntesis y empleo del polimorfismo por restriccin de la longitud de fragmentos Los fragmentos de restriccin generados por el DNA de determinada persona despus de ser tratada con una o fhs enzimas de restriccin forman un conjunto bien definido de fragmentos. Si se trata el DNA de diversas personas (in-

cluso gemelos no idnticos) con una enzima de restriccin, el patrn electrofortico de los fragmentos es similar, pero no idntico, debido a diferencias en la secuencia de nucletidos de una persona a otra. La mayor parte de estas diferencias en la poblacin humana se pueden relacionar con la presencia de secuencias cortas repetidas, adyacentes entre s en grupos en vastos tramos dentro de los genes. Los recuadros en color de la figura 10-37, a, muestran uno de estos grupos de secuencias repetidas. En esa ilustracin, las dos molculas de DNA representan partes comparables de dos cromosomas homlogos de un hombre y una mujer, y dos de sus hijas (fig. 10-37, b). Ntese que el nmero de las secuencias repetidas (indicadas por los recuadros) sobre las dos molculas de DNA es distinto. Diferencias de este tipo son muy comunes, y en realidad explican gran parte de las variaciones genticas en la poblacin humana. Al parecer, estas diferencias no desempean funcin biolgica algu-na, pero son muy valiosas como marcadores para localizar genes humanos e identificar individuos humanos. En el ejemplo ilustrado en la figura 10-37, a, los segmentos correspondientes de DNA localizados en dos cromosomas homlogos se desdoblan en fragmentos de diferente tamao debido a diferencias en el nmero de veces que se repite una pequea secuencia. A estas diferencias se les llama polimorfismo por restriccin de la longitud de fragmentos (PRLF), o simplemente "riflips". Los PRLF producen diferencias notables en el patrn de bandas de la electroforesis (fig. 10-37, c), que puede usarse para identificar individuos mediante tcnicas dactiloscpicas de DNA (fig. 10-23) o trazar la herencia de genes particulares. En 1979, Ray White y Arlene Wyman, de la Universidad de Massachusetts, identificaron el primer PRLF (fig. 10-37, d) en un estudio del DNA de miembros de una vasta familia mormona elegida por sus relaciones genealgicas

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CAPITULO 10 Naturaleza del gen y del gertoma

ORIGEN

ORIGEN

Hpall - 1 Hpall - 2 Hpall - 3 Hpall - 4

Hpall - 5 Hpall - 6

Hpall - 7 Hpall- 1+G H

Hpall - 1+F

Hpall - 8

-AZUL

(a)
EcoR

25
Hpall -6

75
Hpall -5 Hpall -8 -7

Hpall -2

Hpall -1

Hpall -3

Hpall -4

FIGURA 10-36. Construccin de un mapa de restriccin del genoma circular pequeo del DNA del virus tumoral polioma. n) Autorradiografas de fragmentos de DNA marcados con 32P sometidos a electroforesis en gel. El gel de la izquierda muestra e! patrn de fragmentos de DNA obtenido despus de digestin completa del genoma del polioma con la enzima Hpall. Para determinar cmo se renen estos ocho fragmentos en el genoma intacto es necesario tratar el DNA para generar fragmentos superpuestos. La superposicin de fragmentos se puede producir tratando el genoma intacto con una segunda enzima que desdoble la molcula en diferentes sitios o tratndolo con la misma enzima en condiciones donde el DNA sea completamente digerido, como se hizo con el gel de la izquierda. Los dos geles de la derecha representan ejemplos de genoma del polioma parcialmente digerido con HpsII. El gel de enmedio muestra fragmentos generados por digestin parcial de la superhlice de DNA circular y el gel de la derecha muestra los fragmentos Hpall formados luego de convertir el genoma circular en una molcula lineal mediante EcoRl (una enzima que slo efecta un corte en el crculo), b) Mapa de restriccin del genoma de polioma linearizado con base en el desdoblamiento mediante HpoII. En la parte de arriba se muestran los ocho fragmentos procedentes de la digestin completa a lo largo del DNA. Debajo del mapa se muestran en disposicin ordenado los fragmentos superpuestos de la digestin parcial. (Segn Beverly E. Griffin, Mike Fried y Alisan Cowie, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 71:2073, 1974.)

CAPITULO 10 Naturaleza del gen y del genoma

421

DNA en un par de cromosomas homlogos

(a)

e 5

Ms grande
Longitud del fragmento

1 2 (Padre) (Madre)

3 4 (Hijas) 2 400 BP

30 25

1 400 BP

Ms pequea fe)

OI4SI / EeoRI

(d)

FIGURA 10-37. Polimorfismo por restriccin de la longitud de fragmentos (PRLF). a) Segmentos homlogos de DNA procedentes de un par de cromosomas homlogos de un individuo. Las flechas representan sitios en el DNA atacados por una enzima de restriccin particular. Los recuadros en color denotan secuencias cortas repetidas del DNA. En este ejemplo, el DNA situado sobre un cromosoma tiene tres secuencias repetidas y el DNA sobre el cromososma homlogo posee 12. Cuando se tratan estas dos molculas de DNA con la enzima de restriccin, una produce fragmentos con 2 400 pares de bases, en tanto que la otra produce fragmentos con 1 400 pares de bases. Este es un ejemplo de polimorfismo por restriccin de la longitud de fragmentos (PRLF). b) Breve genealoga de cuatro miembros de la familia: un padre, una madre y sus dos hijas. El DNA del padre se muestra en la parte a. c) Patrn de los fragmentos de DNA de los cuatro miembros de la familia. Cada fila (correspondiente a diferente persona) muestra dos bandas: una por cada cromosoma homlogo. Las dos bandas en la fila 1 identifican el DNA del padre de la parte a. Los fragmentos del DNA de la madre son diferentes de los del padre, lo que refleja diferencias en la secuencia de nucletidos de DNA. Cada una de fas hijas hereda un cromosoma de su madre y uno de su padre, generando los patrones observados en las filas 3 y 4. d) Primera demostracin de que se puede usar PRLF en busca de diferencias genticas en una poblacin humana. El nmero arriba de cada fila denota un individuo particular. Ntense las marcadas diferencias entre los patrones de bandas. Las filas que slo tienen una banda densa son de individuos cuyos dos fragmentos homlogos son: 1) bandas de tamao bastante similar, de modo que se mezclan en una sola banda ms gruesa, o 2) homocigotos para este PRLF particular, de modo que ambos homlogos producen fragmentos del mismo tamao, (d: Segn Arlene Wyman y Ray White, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 67:6754, 1980.)

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CAPITULO 10 Naturaleza de! gen y del geno/na

bien definidas. Cuando el DNA de 56 personas del grupo estudiado se someti a digestin por la misma enzima restrictiva, la sonda marcada identific fragmentos de 30 tamaos diferentes dentro de la poblacin. Puesto que la longitud de los fragmentos de restriccin se hereda segn las leyes mendelianas de igual manera que la forma de las semillas en plantas o el tipo sanguneo en el hombre, el polimorfismo en la longitud de los fragmentos equivale a encontrar 30 diferentes alelos para un gen entre 56 individuos relacionados. Para ilustrar cmo se puede emplear este tipo de variabilidad en el mapeo de genes, describiremos el uso de los PRLF para localizar el gen que causa la fibrosis qustica.
Localizacin del gen causante de fibrosis qustica

Como se estudi en la pgina 152, la fibrosis qustica (FQ) es una enfermedad hereditaria cuyas vctimas sufren trastornos respiratorios crnicos debido a la produccin de moco viscoso y duro en las clulas que revisten las vas respiratorias. El objetivo de los investigadores en la bsqueda del gen de la fibrosis qustica era encontrar un PRLF muy prximo a dicho gen. Cmo sabra el mapeador si haba identificado dicho PRLF? Recordemos que es muy poco probable que dos genes localizados muy cerca sobre un cromosoma se separen durante el entrecruzamiento. Por consiguiente, si un PRLF particular y el gen de la FQ estn muy prximos, entonces todos los individuos de una familia afectados por la enfermedad probablemente posean la misma versin del marcador del PRLF (fig. 10-38). Otras familias que padecen a enfermedad pueden tener versiones diferentes de polimorfismo por restriccin de la longitud de fragmentos.

Si un investigador encuentra un PRLF invariablemente presente en los miembros de una familia con la enfermedad, entonces puede deducir que el PRLF est prximo al gen que causa la enfermedad. En otras palabras, el PRLF sirve como marcador gentico para localizar genes cuya posicin sera indetectable de otra manera. Una vez identificado el PRLF que reside dentro del milln de nucletidos, aproximadamente, del gen de la FQ, los investigadores emplearon otras tcnicas para desplazar el PRLF haca las regiones adyacentes del DNA hasta llevarlo al propio gen de la fibrosis qustica. Segn se vio en la pgina 153, el aislamiento del gen de la fibrosis qustica condujo a caracterizar la protena codificada por el gen, a desarrollar un mtodo para diagnosticar FQ en un feto mediante estudios de deteccin del DNA fetal y una estrategia para corregir el defecto a travs de geneterapia. Los prospectos para geneterapia se consideran con mayor detalle en La perspectiva humana de este captulo. En los ltimos aos, se aislaron algunos otros genes causantes de enfermedades, incluyendo los genes que provocan enfermedad de Huntngton, sndrome de cromosoma X frgil, distrofia muscular y varios genes que predisponen al individuo a diferentes formas de cncer comn. Se han desarrollado nuevas tcnicas para acelerar el aislamiento de genes que desempean algn papel en enfermedades complejas, como cncer, diabetes, enfermedad cardiovascular y esquizofrenia. Se tienen fundadas esperanzas de que, como en la fibrosis qustica, el conocimiento de las bases genticas de estas enfermedades suministren la base para nuevos tratamientos ms eficaces.

Posicin del

con el gen de FQ Gen de FQ

^-J

Marcador PRLF >ara el gen de FQ

Posicin del con el gen normal

t

(a)

(b)

FIGURA 10-38. Unin de los genes de la fibrosis qustica con un marcador gentico, a) El DNA de un portador heterocigoto de fibrosis qustica (FQ) tiene un alelo normal y un alelo mutante. Los dos alelos, localizados sobre cromosomas homlogos, inevitablemente se unen a fragmentos de restriccin de diferente tamao. En este hipottico ejemplo, el gen de la FQ est ntimamente ligado al marcador de PRLF, de color verde. En este caso, cualquier miembro de la familia que porta el alelo FQ tiene mucha probabilidad de poseer el fragmento de restriccin ms largo. Una vez que se encuentra un marcador cercano, como el PRLF de color verde mostrado en a, los investigadores pueden trazar un camino desde el marcador hasta el gen buscado, b) Supongamos que dos heterocigotos con los mismos homlogos mostrados en a tuvieran dos hijos. Sera de esperar que los hijos presentaran tres patrones diferentes de fragmentos de restriccin. La lnea uno muestra el DNA de un hijo homocigoto normal y por lo tanto tiene dos copias del fragmento ms pequeo; la fila dos es de un nio heterocigoto que tiene un fragmento largo y uno corto y ser portador, igual que los padres; y la fila tres es la de un nio que sufre de la enfermedad y tendr dos copias del fragmento ms largo.

CAPITULO 10 - Naturaleza del gen y del genoma

423

LA PERSPECTIVA HUMANA
Correccin de trastornos genticos mediante geneterapia
En el decenio de 1970, un joven llamado David capt la atencin de la sociedad estadounidense como "el nio de la burbuja de plstico". La burbuja era un ambiente estril aislado donde el joven vivi casi toda su vida. Requera ese extraordinario nivel de proteccin porque naci con un padecimiento hereditario muy raro llamado enfermedad por inmunodeficiencia combinada grave (ECG), a causa de la cual prcticamente careca de sistema in mulo gico. La burbuja protega a David contra virus y bacterias que podan provocarle infecciones mortales, pero tambin lo mantuvo aislado de todo contacto fsico directo con el mundo exterior, incluyendo sus padres. En casi 25% de los casos, la EICG se debe a la ausencia hereditaria de una sola enzima, adenosina desaminasa (ADA), que cataliza una reaccin en la va catablica de la descomposicin de purinas. En ausencia de esta enzima, el sustrato normal de la misma (desoxiadenosina) se acumula hasta alcanzar concentraciones txicas que matan a ciertas clulas sensibles, incluyendo linfocitos T encargados de la inmunidad mediada por clulas. La geneterapia es el proceso para curar a un paciente alterando su genotipo. Por varias razones, la EICG es excelente candidato para geneterapia. Primero, no hay cura para la enfermedad e invariablemente provoca la muerte en edad temprana. Segundo, la EICG es consecuencia de alteraciones de un gen especfico ya aislado y clonado, y por lo tanto disponible para emplear en el tratamiento. Por ltimo, las clulas que normalmente expresan el gen ADA son un tipo de leucocitos fciles de eliminar del paciente, de cultivar in vitro, de modificar genticamente y luego de reintroducir al paciente mediante transfusin. En 1990, una nia de cuatro aos de edad afectada por EICG fue la primera persona autorizada por los National Ins ti tutes of Health y la Food and Drug Administraron de Estados Unidos para recibir geneterapia. En septiembre de 1990 se le administr una transfusin de sus propios leucocitos portadores de copias normales del gen ADA gracias a modificaciones genticas. La expectativa fue que los leucocitos modificados proporcionaran a la nia las armas necesarias para liberarse de infecciones en el futuro. Los leucocitos tienen un periodo de vida limitado, por lo que el procedimiento deba repetirse peridicamente para conservar la capacidad inmunolgica de la paciente. En el momento de escribir esto, la nia y otro nio incluido ms tarde en el programa se encuentran bien. Los resultados de esta primera aventura en el campo de la geneterapia indican que el tratamiento tuvo xito. En la actualidad, los mayores esfuerzos estn enfocados a desarrollar ms tcnicas para introducir genes extraos en las clulas. Los leucocitos inyectados de regreso a los nios afectados por EICG fueron manipulados mediante ingeniera gentica infectando las clulas con un retrovirus portador del gen ADA humano normal. El virus se desactiv genticamente para suprimirle su capacidad de duplicacin y producir una progenie viral. Sin embargo, todava es capaz de integrar su genoma (y el gen ADA extra que porta) al DNA de la clula husped donde dicho gen puede ser la base de operaciones para producir la enzima requerida. La capacidad de los retrovirus para integrarse al genoma los hace excelentes vectores en experimentos de geneterapia. Pero el empleo de retrovirus entraa ciertos riesgos. Por ejemplo, la integracin del retrovirus dentro del genoma ocurre al azar, y por lo tanto siempre hay la posibilidad remota de que el virus se integre a un sitio del genoma donde active un oncogen productor de cncer y entonces malignizar clulas susceptibles. Adems, los retrovirus slo pueden integrar sus genes a una clula en etapa de divisin activa, lo que excluye su empleo en clulas que no se dividen, como neuronas y clulas musculares. Algunos estudios, como el de fibrosis qustica descrito en la pgina 153, se realizaron utilizando adenovirus como vector del gen. El adenovirus no integra su genoma al DNA de la clula husped, por lo que no puede activar oncogenes, pero s puede emplearse para infectar clulas fuera de su etapa de divisin. Los adenovirus tambin tienen desventajas, incluyendo una tendencia a separarse de la clula husped infectada. Los virus no son la nica va para introducir DNA a las clulas. Se puede lograr que las clulas capten DNA de su ambiente (procedimiento denominado transfecdn) mediante la aplicacin de choques elctricos, o fusionarlas con un liposoma (pg. 122) donde se encuentra encapsulado el DNA; estas tcnicas no son tan eficaces como el empleo de vectores virales, pero algunos cientficos las consideran ms seguras y su eficiencia puede incrementarse combinndolas con otras tcnicas. Por ejemplo, el gen introducido a la clula puede unirse a un gen resistente a frmacos. A continuacin, cuando las clulas crecen en un medio que contiene el frmaco, slo las que captaron el DNA pueden crecer y proliferar, eliminando as a las clulas que carecen del gen extrao. Cuando se consider por primera vez la geneterapia como una posibilidad factible, los prospectos obvios para tratamiento fueron enfermedades hereditarias, como EICG, fibrosis qustica e hipereolesterolemia familiar (pg. 316), puesto que todas estas enfermedades podan corregirse introduciendo un gen normal en las clulas de tejidos y rganos afectados. En realidad, estas tres enfermedades congnitas son motivo de ensayos clnicos promiso-

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CAPITULO 10 Naturaleza del gen \j del genoma

rios. Pero el enfoque de la geneterapia ha cambiado de estas enfermedades relativamente raras, causadas por defectos en un solo gen, a enfermedades ms comunes, de bases ms complejas, incluyendo cncer y padecimientos cardiovasculares. Veamos cmo se puede aplicar la geneterapia a estas dos enfermedades. En La perspectiva humana del siguiente captulo se analiza un plan para emplear geneterapia en el tratamiento del SIDA.

CNCER Durante varios decenios, los investigadores clnicos intentaron aplicar los conocimientos logrados en investigaciones de biologa molecular al tratamiento de! cncer. Infortunadamente, este esfuerzo ha tenido poco xito. En la actualidad, con el advenimiento de la geneterapia se han aprobado nuevos protocolos de ensayos clnicos y la comunidad cientfica espera mejores resultados. El examen de uno de estos protocolos servir para ilustrar las posibilidades. El virus del herpes contiene un gen que codifica una enzima con actividad cataltica no observada en clulas de mamferos. Esta enzima es un tipo de timidincinasa (llamada HSV-TK) que aade un grupo fosfato a la base timina de un nucletido de timidina. La HSV-TK tambin puede emplear ciertos anlogos de timidina (compuestos de estructura qumica similar) como sustratos para fosforilacin, incluyendo un compuesto denominado ganciclovir (o aciclovir), que comnmente se prescribe contra las erupciones por virus del herpes. El ganciclovir, una vez fosforilado, entra a la va de sntesis de DNA, pero no puede incorporarse al mismo. En vez de ello, este compuesto impide la sntesis de DNA provocando la muerte de la clula infectada. Por lo tanto, en presencia de ganciclovir, el HSV-TK acta como "gen suicida" que causa la autodestruccin de la clula. El gen HSV-TK se ha empleado con xito en animales para destruir ciertos tumores cerebrales y en la actualidad est sometido a ensayos clnicos limi-

tados en el ser humano. En estos ensayos, retrovirus desactivados, portadores del gen HSV-TK introducido mediante manipulaciones de ingeniera gentica, se inyectan en la masa del tumor cerebral donde son captados por una parte de las clulas. Las neuronas constituyen una poblacin de clulas que no se dividen, por lo que no son susceptibles de infeccin por retrovirus y el procedimiento no las afecta (los tumores cerebrales constan de clulas guales malignas). Una vez que las clulas tumorales captan al "gen suicida", se puede inyectar ganciclovir y provocar la destruccin de las clulas modificadas genticamente. En estos ensayos con animales se observ que slo una fraccin de las clulas tumorales capta el retrovirus portador de HSV-TK, pero el resto de las clulas tumorales tambin pueden ser destruidas por los metabolitos txicos producidos por las clulas infectadas (el llamado "efecto del espectador"). Todava no se sabe si ste o cualquier otro protocolo de geneterapia ser til contra el cncer.

transfeccin de clulas cardiacas con genes que codifican receptores de adrenalina todava es un objetivo distante, pero se ha demostrado la posibilidad de este mtodo. La principal causa de ataques al corazn es la oclusin de una o ms arterias coronarias por la formacin de placas (pg. 315). Uno de los procedimientos ms comunes para corregir esta situacin es la angioplastia con baln, en a cual se introduce un catter en la arteria coronaria bloqueada. Posteriormente se infla la punta del catter igual que un baln (fig. PH 10-1), distendiendo las paredes de la arteria hacia afuera. Infortunadamente, las arterias abiertas con este procedimiento casi siempre vuelven a cerrarse por el crecimiento de clulas musculares lisas en la pared del vaso. Experimentos con animales indican que se puede impedir la proliferacin de estas clulas y mantener la arteria abierta mediante geneterapia. En un grupo de experimentos, las clulas de la arteria se infectaron con un adenovirus portador del gen HSV-TK en el sitio de la

ENFERMEDAD CARDIOVASCULAR La insuficiencia cardiaca congestiva aparece conforme el corazn pierde gradualmente su capacidad de contraerse con la fuerza requerida para circular la sangre de manera eficaz. La fuerza de contraccin cardiaca normalmente aumenta por la hormona y el neurotransmisor epinefrina, el cual se enlaza a receptores /3-adrenrgcos situados en la superficie de las clulas del msculo cardiaco. Una de las causas aparentes de insuficiencia cardiaca congestiva es la incapacidad de las clulas para responder a la epinefrina. Experimentos con animales indican que la fuerza contrctil del corazn puede aumentar mucho si las clulas del msculo cardiaco del animal contienen copias extra del gen que codifica el receptor /?-adrenrgico, lo que aumenta el nmero de receptores de epinefrina sobre la superficie de la clula. El tratamiento de la insuficiencia cardiaca congestiva en el hombre por

FIGURA PH 10-1. Angioplastia con baln efectuada con el instrumento que aqu se muestra. Luego de introducir la sonda en la arteria coronaria bloqueada, se infla cerca de su extremo empujando las paredes de la arteria hacia afuera. (Segn Dan McCoy/Ranbow.)

CAPITULO 10 Naturaleza del gen y del genoma

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angioplastia con baln, seguido por exposicin a ganciclovir para matar dichas clulas (como se describi antes). En otro grupo de experimentos se impidi la proliferacin de clulas musculares Usas obligndolas a captar un gen que produce un RNA antisentido (pg. 439) que impide la traduccin de un RNAm celular requerido para la proliferacin de las clulas. Procedimientos de este tipo tal vez sean sistemticos en la prctica mdica del prximo siglo.

CONSIDERACIONES ETICAS Es importante hacer notar que todos los procedimientos analizados, y tambin los considerados para aprobacin, implican la modificacin de clulas somticas, clulas que no entran en la va para formacin de gametos. La modificacin de clulas somticas slo afecta a la persona tratada y el cromosoma modificado no puede transmitirse a las futuras generaciones. Este no es el caso si se modifica cualquiera de

las clulas germinales de las gnadas o clulas del embrin temprano, puesto que esas clulas contribuyen a la formacin de gametos. Hasta ahora hay consenso de no efectuar estudios que impliquen la modificacin de clulas humanas de estirpe germinal. Esos estudios representan riesgos en lo referente a la constitucin gentica de generaciones futuras y plantean graves problemas ticos respecto de la intromisin de los cientficos en la evolucin humana.

LA VIA

EXPERIMENTAL

Naturaleza qumica del gen

Tres aos despus de que Gregor Mendel presentara los resultados de su trabajo acerca de la herencia en plantas de guisantes, Friedrich Miescher se gradu en una escuela de medicina de Suiza y viaj a Tubingen, Alemania, a permanecer un ao estudiando bajo la direccin de Ernst Hoppe-Seyler, uno de los qumicos ms notables (y tal vez el primer bioqumico) de ese periodo. Miescher se interes en las sustancias qumicas contenidas en el ncleo de la clula. Para aislar material de los ncleos celulares con un mnimo de contaminacin por los componentes citoplsmicos, Miescher necesitaba clulas con ncleos grandes y fciles de obtener en gran cantidad. Eligi leucocitos, que obtuvo del pus de vendajes quirrgicos desechados por una clnica local. Miescher trat las clulas con cido clorhdrico diluido al cual aadi un extracto desproteinado de estmago de cerdo (este extracto contena pepsina, una enzima proteoltica). El residuo obtenido despus de este tratamiento se compona principalmente de ncleos celulares aislados que se asentaron en el fondo del vaso. A continuacin Miescher extrajo los ncleos con lcali diluido. El material soluble en lcali fue purificado adicional mente mediante precipitacin con cido diluido y nueva extraccin con lcali diluido. Miescher observ que el extracto alcalino contena una sustancia con propiedades diferentes a las descubiertas previamente: era una molcula muy grande, de carcter cido y rica en fsforo. Llam "nuclena" a este material. El ao de residencia de Miescher concluy y retorn a su hogar en Suiza, en tanto Hoppe-Seyler, cauteloso acerca de los resultados, repiti el trabajo. Confirmados los resultados fueron publicados en 1871. i De vuelta en Suiza, Miescher continu sus estudios de la qumica del ncleo celular. Como viva cerca del ro Rhin poda obtener con facilidad salmones que nadaban contra la corriente y arribaban llenos de huevos o espermatozoides maduros. Los espermatozoides son clulas ideales para estudiar los ncleos. Igual que los leucocitos, se pueden obtener en gran cantidad y 90% de su volumen corresponde al ncleo. Las preparaciones de Miescher con nuclena obtenida de espermatozoides contenan un porcentaje ms elevado de fsforo (casi 10% del peso), en comparacin con leucocitos, lo que indica que contenan menos protena contaminante. En realidad, fueron las primeras preparaciones de DNA relativamente puro. El trmino "cido nucleico" fue acuado en 1889 por Richard Altmann, alumno de Miescher, quien trabaj mtodos de purificacin de DNA libre de protenas de varios tejidos animales y de levaduras.2 , En los ltimos dos decenios del siglo xix, numerosos bilogos se dedicaron al estudio de los cromosomas, describieron su conducta durante la divisin celular y en el lapso entre las divisiones (pg. 390). Una manera de observar los cromosomas es teirlos con colorantes. Un botnico llamado E. Zacharias descubri que el mismo colorante que revela los cromosomas tambin colorea una preparacin de nuclena extrada utilizando el procedimiento de Miescher de digestin con pepsina en un medio de HCI. Adems, cuando las clulas extradas con pepsina y HCI fueron extradas subsecuentemente con lcali diluido, procedimiento ya conocido para extraer nuclena, el residuo celular (incluyendo los cromosomas) ya no contena material coloreable. Estos y otros resultados apoyaron fuertemente la idea de que la nuclena era un componente de los cromosomas. En una proposicin notablemente proftica en 1884, Otto Hertwig, quien estudi la conducta de

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CAPITULO 10 Naturaleza del gen y del genoma

los cromosomas durante la fertilizacin, afirm: "Pienso que cuando menos hemos aumentado la probabilidad de que la nuclena sea la sustancia encargada no slo de la fertilizacin, sino tambin de la transmisin de las caractersticas hereditarias."3 Irnicamente, conforme ms se aprenda acerca de las propiedades de la nuclena, menos se le consideraba candidato para ser el material gentico. Durante los 50 aos subsecuentes al descubrimiento del DNA por Miescher se describi !a qumica de la molcula y la naturaleza de sus componentes. Algunas de las contribuciones ms importantes en esta tarea fueron realizadas por Phoebus Aaron Levene, quien emigr de Rusia a Estados Unidos en 1891 y con el tiempo logr un puesto en el Rockefeller Institute de Nueva York. Levene fue quien finalmente resolvi uno de los problemas ms persistentes de a qumica del DNA cuando en 1929 determin que el azcar de los nucletidos era la 2desoxirribosa.4 Para aislar el azcar, Levene y E.S. London colocaron el DNA en el estmago de un perro mediante una abertura quirrgica y uego recolectaron muestras de intestino del animal. Conforme el DNA pas por el estmago y el intestino, varias enzimas del conducto digestivo del animal actuaron sobre la molcula fragmentando los nucletidos en sus partes componentes que entonces se pudieron aislar y analizar. Levene resumi sus conocimientos de los cidos nucleicos en una monografa publicada en 1931.5 Aunque la determinacin de la estructura del DNA se acredita a Levene, tambin se le acredita el mayor tropiezo en la bsqueda de material gentico. En este periodo, cada vez fue ms evidente que las protenas eran muy complejas y mostraban gran especificidad como catalizadores en una notabie variedad de reacciones qumicas. Por otro lado, se pens que eS DNA estaba compuesto por bloques formados por sus cuatro nucletidos repetidos en forma montona. El principa! defensor de esta manera de visualizar el DNA, que se llam teora de los tetranucletidos, fue Phoebus Levene. Puesto que los cromosomas slo contienen dos elementos, o sea DNA y protena, pocos dudaban que la protena fuera el material gentico. Mientras tanto, conforme se fue trabajando la estructura del DNA, se desarroll una lnea de investigacin aparentemente independiente en el campo de la bacteriologa. A principios del decenio de 1920 se observ que algunas especies de bacterias patgenas podan crecer en el laboratorio en dos formas diferentes. Las bacterias virulentas, o sea, clulas bacterianas capaces de provocar enfermedad, formaron colonias lisas, regulares, en forma de domo; por lo contrario, las clulas bacterianas no virulentas crecieron en colonias que eran rugosas, planas e irregulares (fig. VE 10-1).6 El microbilogo britnico J.A. Arkwrght introdujo los trminos liso (L) y rugoso (R) para describir estos dos tipos. Observadas al microscopio, las clulas que formaban as colonias L estaban rodeadas por una cpsula gelatinosa, de la cual carecan las clulas de las colonias R. La cpsula bacteriana protege a la bacteria de as defensas del husped, lo que explica por qu las clulas R, sin cpsula, no provocan infeccin en animales de laboratorio. Debido a su impacto tan grande sobre a salud humana, las bacterias causantes de neumona (Streptococcus pneumoniae o simplemente neumococo) son desde hace mucho tiempo foco

FIGURA VE 10-L. Las colonias brillantes grandes a la derecha son de neumococos virulentos tipo S resultantes de la transformacin de un neumococo no virulento tipo R (colonias ms pequeas) por DNA procedente de neumococos S muertos por calor. (Segn O.T. Avery, C.M. MacLeod y M. McCarty, }. Exp. Med. 79:153, 1944; con permiso de Rockefeller Uaivcrsity Press.)

de atencin entre los microbilogos. En 1923, Frederick Griffith, mdico en el Ministerio Britnico de Salud, demostr que los neumococos tambin crecen como colonias L o R, y adems que las dos formas eran interconvertibles; o sea, en ocasiones una bacteria R poda convertirse en una bacteria L, o viceversa.7 Griffith observ, por ejemplo, que si inyectaba un nmero excepcionalmente grande de bacterias R a un ratn, el animal a menudo desarrollaba neumona y produca bacterias que formaban colonias de la forma L. Anteriormente se haba demostrado que el neujTiococo se presenta en varios tipos distintos (tipos 1, II y III) inmunolgicamente distinguibles entre s. En otras palabras, se pueden obtener anticuerpos de animales infectados que slo reaccionan con uno de los tres tipos. Ms an, una bacteria de un tipo nunca da lugar a clulas de otro tipo. Cada uno de los tres tipos de neumococos poda ocurrir en la forma L o R. En 1928, Griffith hizo un descubrimiento sorprendente cuando inyect varias preparaciones bacterianas a un ratn.8 La inyeccin de numerosas bacterias L muertas por calor o de un pequeo nmero de bacterias R vivas, por s mismas no causaron dao al ratn; sin embargo, cuando se inyectaron juntas ambas preparaciones al mismo ratn, este contrajo neumona y muri. Se pudieron aislar y cultivar bacterias virulentas del ratn. Para ampliar sus datos, inyect combinaciones de bacterias de diferentes tipos (fig. VE 10-2). Inicialmente inyect ocho ratones con bacterias L de tipo I muertas por calor junto con un pequeo inoculo de la cepa R tipo II de bacterias vivas. Dos de los ocho animales contrajeron neumona y Griffith pudo aislar y cultivar clulas bacterianas L tipo 1 virulentas del ratn infectado. Era imposible que las bacterias muertas por calor hubieran vuelto a la vida, por lo que Griffith concluy que las clulas muertas tipo I haban suministrado algo a las clulas vivas no encapsuiadas tipo II que las transform en la forma encapsulada tipo I. Cuando creci en cultivo, la bacteria transformada continu produciendo clulas tipo I y por o tanto el cambio era estable y permanente. Griffith trat

CAPITULO 10 Naturaleza del gen y del gcnoma

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Clulas vivas encapsuladas (S), de tipo I

Clulas vivas sin cpsula (R), tipo II

Clulas S tipo I muertas por calor

Clulas S tipo I muertas por calor mezcladas con clulas vivas R tipo

El ratn muere

El ratn sobrevive

El ratn sobrevive

El ratn muere

FIGURA VE 10-2. Diseo del experimento efectuado por Griffith para el descubrimiento de la transformacin bacteriana.

de demostrar que las cepas R tipo I podan transformarse permanentemente en los tipos L II y III, y viceversa. En todos los casos, la transformacin pareci ser de tipo especfico, predecible y hereditaria. Los datos de Griffith acerca de esta transformacin rpidamente fueron confirmados por varios laboratorios en todo el mundo, incluyendo el de Oswald Avery, inmunlogo en el Rockefeller Institute, la misma institucin donde trabajaba Levene. Al principio, Avery dud que una sustancia liberada por una clula muerta pudiera alterar el aspecto de una clula viva, pero se convenci cuando Martin Dawson, su joven ayudante, confirm los mismos resultados en su laboratorio.9 Entonces Dawson intent demostrar que la transformacin no necesariamente ocurre en un animal husped vivo. Un extracto crudo de bacterias L muertas, mezclado con un pequeo nmero de clulas no virulentas (R) cultivadas en presencia del antisuero R, poda convertir las clulas R en la forma L virulenta. Las clulas transformadas siempre fueron del tipo I, II o III caracterstico de las clulas L muertas.10 El siguiente paso lo dio J. Lionel Alloway, otro miembro del laboratorio de Avery, quien pudo solubilizar el agente transformador. Esto se logr congelando y descongelando rpidamente clulas muertas donadoras, calentando en seguida las clulas fragmentadas, centrifugando la suspensin y haciendo pasar el sobrenadante a travs de un filtro de porcelana cuyos poros impedan el paso de bacterias. El extracto soluble as filtrado mostr la misma capacidad transformadora que las clulas originalmente muertas por calor.11 En los siguientes diez aos, Avery y sus colegas enfocaron su atencin en purificar la sustancia causante de la transformacin y en determinar su identidad. Tan sorprendente como puede parecer ahora, en aquel tiempo ningn otro laboratorio del mundo se dedic a identificar el "principio transformador", como lo [lamo Avery. Los avances en este problema fueron lentos.detallado en 12 con e tiempo, Avery y sus colaboradores, Coln MacLeod y Maclyn McCarty, lograron aislar

una sustancia activa de! extracto soluble capaz de causar la transformacin en concentracin de apenas una parte en 600 millones. Todas las pruebas sugeran que la sustancia activa era DNA: 1) mostraba muchas de las propiedades qumicas caractersticas del DNA; 2) ningn otro tipo de material pudo detectarse en la preparacin, y 3) los ensayos con diferentes enzimas mostraron que slo aquellas capaces de digerir DNA podan inactivar el principio transformador. El trabajo publicado en 1944 fue escrito con escrupulosa cautela, sin conclusiones espectaculares afirmando que los genes estaban constituidos por DNA y no por protenas.13 Es digno de mencionar que el trabajo despert muy poca atencin. Maclyn McCarty, uno de los tres autores, narra un incidente ocurrido en 1949 cuando se le invit a hablar en la Johns Hopkins University, junto con Leslie Gay, quien estaba probando los efectos del nuevo frmaco Dramamine para tratar el mareo de traslacin. La gran sala estaba repleta de personas, y "luego de un breve periodo de preguntas y respuestas despus despus de la presentacin del trabajo [de Gay], el presidente de la Sociedad me present como segundo orador. Muy poso de lo que dijo se pudo escuchar a causa del bullicio de a gente que permaneca fuera de a sala. Cuando concluy la salida de quienes abandonaron la sala, despus de ios primeros minutos de mi discurso pude contar escasas 35 personas que permanecieron en el auditorio, quiz por escuchar algo acerca de la transformacin de! neumococo o porque sintieron que deban quedarse por cortesa". Pero el verdadero potencial del descubrimiento de Avery se reveia en una carta que escribi en 1943 a su hermano Roy, tambin bacterilogo: Si estamos en lo correcto, y por supuesto que esto todava no se ha demostrado, entonces significa que los cidos nucleicos no slo son importantes desde el punto de vista estructural, sino tambin las sustancias funcionalmente activas para definir la actividad bioqu''mica y las caractersticas especficas de una clula, y qu 3 por

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CAPITULO 10 Naturaleza del gen y del genoma

medio de una sustancia qumica conocida es posible inducir cambios predecibles hereditarios en las clulas. Esto es algo que durante mucho tiempo fue el sueo de los genetistas... Suena como si un virus pudiera ser un gen. Pero con los mecanismos que ahora me interesan, un paso cada vez... Por supuesto, ef problema est erizado de implicaciones... Se relaciona con gentica, qumica enzimtica, metabolismo celular y sntesis de carbohidratos, etc. Pero en la actualidad se requieren suficientes pruebas bien comprobadas para convencer a todos de que la sal sdica del cido desoxirribonucleico, libre de protenas, est dotada con esta actividad biolgica y propiedades especficas y esta es la prueba que ahora tratamos de obtener. Es muy divertido inflar burbujas, pero es ms sensato reventarlas uno mismo antes que alguien lo haga. Se han dedicado muchos artculos y pasajes de libros a averiguar la razn de la falta de entusiasmo hacia los datos de Avery. Parte de ello quiz sea el estilo humilde del artculo y el hecho de que Avery era bacterilogo, no genetista. Algunos bilogos estaban convencidos de que las preparaciones de Avery deban estar contaminadas con cantidades mnimas de protena y que ese contaminante, no el DNA, era el agente transformador activo. Otros se preguntaban si estudios acerca de bacterias publicados en una revista mdica podan tener relevancia alguna en el campo de la gentica y consideraban el fenmeno de la transformacin como una peculiaridad de las bacterias. En los aos siguientes a la publicacin del trabajo de Avery hubo cambios importantes en la gentica, se reconoci la existencia de cromosomas bacterianos y algunos prominentes genetistas volvieron su atencin a esos procariotes. Estos cientficos estaban convencidos de que el conocimiento logrado por el estudio de organismos celulares muy simples arrojara luz sobre los mecanismos que operan en plantas y animales ms complejos. Adems, los trabajos de Erwin Chargaff y sus colegas acerca de la composicin de las bases del DNA14 acab con la idea de que esta molcula slo era una simple serie de nucletidos repetidos {estudiada en la pgina 396). Este dato revel a los investigadores la posibilidad de que el DNA posea las propiedades necesarias para desempear un papel en el almacenamiento de informacin. Siete aos despus de la publicacin del trabajo de Avery acerca de la transformacin bacteriana, Alfred Hershey y Martha Chase, de Cold Spring Harbor Laboratories en Nueva York, prestaron su atencin a un sistema todava ms simple: los bacterifagos, o virus que infectan clulas bacterianas. Alrededor de 1950, los investigadores reconocieron que aun los virus tenan un programa gentico. El material gentico inyectado a una clula husped pudo dirigir la formacin de nuevas partculas virales dentro de la clula infectada. En cuestin de minutos, la clula infectada estall y liber nuevas partculas del bacterifago que infectaron clulas husped vecinas. Era claro que el material gentico capaz de dirigir la formacin de la progenie viral deba ser DNA o protena, puesto que eran las nicas dos molculas en el virus. Observaciones con microscopio electrnico demostraron que durante la infec-

FIGURA VE 10-3. Micrografia electrnica de una clula bacteriana infectada por el bacterifago T4. Se observa un fago unido a la superficie externa de la clula bacteriana mediante las fibras de su apndice, en tanto se ensamblan nuevas cabezas de fago en el citoplasma de la clula husped. (Cortesa de Jonathan King y Erka Hartwig.)

don, la masa del bacterifago permanece fuera de la clula, fija a la superficie celular por apndices fibrosos (fig. VE 10-3). Hershey y Chase razonaron que el material gentico del virus deba poseer dos propiedades. Primero, si el material dirige el desarrollo de nuevos bacterifagos durante la infeccin entonces debe pasar al interior de la clula infectada. Segundo, debe transmitirse a la siguiente generacin de bacterifagos. Hershey y Chase prepararon dos grupos de bacterifagos para utilizar como material infectante (fig. VE 10-4). Un grupo contena DNA marcado con fsforo radiactivo (DNA-32P); el otro grupo contena protena marcada con azufre radiactivo (protena-35S). Puesto que el DNA carece de tomos de azufre (S) y la protena de ordinario carece de tomos de fsforo (P), estos dos radioistopos suministraron marcas distinguibles en los dos tipos de macromolculas. El plan experimental consisti en infectar una poblacin de clulas bacterianas con uno u otro tipo de bacterifago, esperar unos pocos minutos y luego desprender los virus vacos de la superficie celular. Luego de intentar varios mtodos para separar la cubierta del fago unida a la bacteria, observaron que la mejor manera de lograrlo era someter fa suspensin de bacterias infectadas a la accin de las hojas giratorias de una licuadora Waring. Una vez desprendidas las partculas del virus de las clulas se pudieron centrifugar las bacterias al fondo del tubo, permaneciendo los virus vacos en suspensin. Siguiendo este procedimiento Hershey y Chase determinaron la radiactividad dentro de las clulas en comparacin con la radiactividad en las cubiertas vacas del fago. Observaron que en clulas infectadas con bacterifago marcado con protena radiactiva, la radiactividad permaneca en las cubiertas vacas. Por lo contrario, en clulas infectadas con bacterifago marcado con DNA radiactivo, la radiactividad pasa a interior de la clula husped. Respecto de la radiactividad trans-

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Absorcin de partculas separadas por lidiadora

=3

S
FIGURA VE 10-4. Diseo del experimento de HersheyChase mostrando que las clulas bacterianas infectadas por un fago que contiene DNA marcado con 32P se volvi radiactivo y produjo progenie de fagos marcados, en tanto que las clulas bacterianas infectadas con fagos que contenan protena marcada con 35S no presentaron radiactividad y produjeron progenie no marcada.

Progenie del fago producida a partir de bacterias a pesar de la prdida de la cubierta de los fagos absorbidos. Un porcentaje considerable de la radiactividad original se encuentra en la progenie

~ 80% de radiactividad

=o =o ~ 20% de
radiactividad

T
=G>

Absorcin de partculas separadas por licuadora

~ 20% de radiactividad

Proena no marcada O Protena marcada "L. DNA no marcado U DNA marcado

Menos de 1%de radiactividad transferida a la progenie

~ 80% de radiactividad

=G> =3

mitida a la siguiente generacin, encontraron menos de 1% de la protena marcada en la progenie, y casi 30% del DNA marcado pas a la siguiente generacin. La publicacin de los experimentos de Hershey y Chase, en 1952,15 junto con el abandono de la teora de los tetranucletidos, suprimi todos los obstculos restantes para aceptar que el DNA era el material gentico. De momento se gener un nuevo y enorme inters hacia una molcula hasta entonces ignorada. El escenario estaba listo para el descubrimiento de la doble hlice. BIBLIOGRAFA 1. Miescher, J.F. 1871. Hoppe-Seyler's Mea. Chem. Untersuchugen. 4:441. 2. Altmann, R. 1889. Anat. u. Physiol-, Physiol. Abt. 524. 3. Tomado de Mirsky, A.E. 1968. The Discovery of DNA. Sci. Amer. 218:78-88. 4. Levene, P.A. y London, ES. 1929. The structure of thymonucleic acid. /. Biol. Chem. 83:803-816. 5. Levene, P.A. y Bass, L.W. 1931. Nucleic Acids. The Chemical Catalog Co. 6. Arkwright, J.A. 1921. Variation in bacteria in relation to agglutination both by salts and by specfic serum. /. Path. Bact. 24:36-60.

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CAPITULO 10 Naturaleza del gen y del genoma

SINOPSIS
Los cromosomas son portadores de informacin gentica. Las primeras observaciones condujeron a los bilogos a considerar el papel gentico de los cromosomas. Estas observaciones incluyen: la precisin del reparto de cromosomas entre las clulas hijas durante la divisin celular; la comprobacin de que los cromosomas de una especie permanecen constantes en forma y nmero de una divisin celular a la siguiente; el dato de que el desarrollo embrionario requiere un conjunto particular de cromosomas, y la observacin de que el nmero de cromosomas se divide a la mitad antes de la formacin de los gametos y se duplica luego de la unin de un espermatozoide y un vulo durante la fertilizacin. Los datos de Mendel suministraron a los bilogos nuevos criterios para identificar a los portadores de los genes. Los estudios de Sutton acerca de la formacin de gametos en el saltamontes revelaron la existencia de cromosomas homlogos, la asociacin de homlogos durante la divisin celular que precede a la formacin de gametos y la separacin de los homlogos durante la primera divisin meitica (p- 390). Si los genes se encuentran juntos en cromosomas transmitidos de padres a hijos, entonces los genes de un mismo cromosoma deben unirse para formar un grupo ligado. La existencia de grupos ligados se confirm en varios sistemas, particularmente en la mosca de la fruta donde se observ que docenas de mutaciones pueden ordenarse en cuatro grupos unidos que corresponden en tamao y nmero a los cromosomas presentes en las clulas de estos insectos. AI mismo tiempo, se descubri que la unin era incompleta; o sea, los alelos originalmente presentes en determinado cromosoma no permanecen necesariamente juntos durante la formacin de los gametos, sino que pueden ser "barajados" entre los homlogos paternos y maternos. Este fenmeno, al cual Morgan denomin entrecruzamiento, se deba al rompimiento y reunin de segmentos de cromosomas homlogos que ocurra cuando los homlogos se asociaban fsicamente durante la primera divisin meitica. El anlisis de descendientes por apareamiento entre adultos portadores de un tipo de mutacin sobre el mismo cromosoma indica que la frecuencia de recombinacin entre dos genes suministra una medida de la distancia relativa que separa esos dos genes. Por lo tanto, se puede emplear la frecuencia de recombinaciones para preparar mapas detallados de series ordenadas de genes a lo largo de cada cromosoma de una especie. El mapa gentico de la mosca de la fruta, basado en la frecuencia de recombinaciones, se comprob de manera independiente mediante el examen de la localizacin de diferentes bandas en el cromosoma politeno gigante observado en ciertos tejidos larvarios de estos insectos (p. 392). Los experimentos analizados en La va experimental suministran datos concluyentes de que el material gentico es DNA. El DNA es una molcula helicoidal con dos cadenas de nucletidos que corren en direcciones opuestas con un esqueleto central exterior y las bases nitrogenadas mirando hacia adentro. Los nucletdos de una cadena que contienen adenina siempre forman pareja con los nucletidos de la otra cadena que contienen timina, lo mismo ocurre con los nucletidos que contienen guanina y citosina. Como resultado, las dos cadenas de una molcula de DNA son complementarias entre s. La informacin gentica est codificada en la secuencia lineal especfica de los nucletidos que constituyen las cadenas. El modelo de Watson-Crick de la estructura del DNA sugiri un mecanismo de duplicacin, incluyendo separacin de las cadenas y uso de cada cadena como plantilla para dirigir el orden de ensamblado de nucletidos durante la construccin de la cadena complementaria. El mecanismo por el cual el DNA gobernaba el ensamblado de una protena especfica permaneca en el misterio absoluto. El modelo de DNA mostrado en la figura 10-9 es DNA-B, una forma helicoidal con giro a la derecha. El DNA-B contrasta ms notablemente con el DNA-Z que adopta la forma de una hlice con giro a la izquierda y cuyo eje central adquiere conformacin en zigzag. La molcula de DNA de la figura 10-9 se encuentra en estado relajado y posee 10 pares de bases por vuelta de la hlice. Dentro de la clula, el DNA tiende a presentarse subenrollado (con menor nmero de pares de bases por vuelta) y se dice que muestra superenrollamiento negativo, condicin que tiende a facilitar la separacin de las cadenas durante la duplicacin y la transcripcin. El estado de superenrollamiento del DNA puede alterarse por accin de las topoisomerasas, enzimas capaces de cortar, redisponer y volver a sellar las cadenas de DNA (p. 395). Toda la informacin gentica presente en un solo conjunto haploide de los cromosomas de un organismo constituye el genoma del organismo. La variedad de secuencias del DNA que forman el genoma y el nmero de copias de esas diferentes secuencias describen la complejidad del genoma. El conocimiento de la complejidad del genoma procede de los primeros estudios que mostraron una molcula de DNA constituida por dos cadenas separables por calor; cuando la temperatura de la solucin desciende, ias cadenas complementarias simples vuelven a asociarse para formar la doble cadena de las molculas estables de DNA. El anlisis de la cintica de este proceso de reasociacin suministra una medida de la concentracin de secuencias complementarias, que a su vez ndica la variedad de secuencias presentes en una cantidad determinada de DNA. Cuanto mayor sea el nmero de copias de una secuencia particular en el genoma, mayor ser su concentracin y ms rpida su reconstruccin (p. 401). Cuando se reconstruyen fragmentos de'DNA procedentes de clulas eucariotas, de ordinario la curva muestra tres pasos distintos que corresponden a la renaturalizacin de tres diferentes tipos de secuencias de DNA. La fraccin altamente repetida consta de secuencias de DNA cortas repetidas en gran nmero; incluye DNA satlite situado en el centrmero de los cromosomas, DNA minisatlite y DNA microsatlite. Este ltimo grupo tiende a ser muy variable, causa ciertas enfermedades hereditarias y constituye la base de tcnicas dactiloscpicas con DNA. La fraccin moderadamente repetida incluye secuencias de DNA que codifican RNA ribosmico y de transferencia y protenas histona, as como varias secuencias con funciones no codificantes. La fraccin no repetida contiene

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genes codificadores de protenas, de los cuales slo hay una copia por conjunto haploide de cromosomas (p. 419). La organizacin de las secuencias del genoma puede cambiar lentamente en el curso de la evolucin o rpidamente como consecuencia de una transposicin. Los genes eucariotas que codifican protenas casi siempre son miembros de !a familia de multigenes cuyos elementos presentan datos de haber evolucionado a partir de un gen ancestral comn, Se cree que el primer paso en este proceso es la duplicacin de un gen, la mayor parte de las veces quiz por entrecruzamiento desigual. Una vez ocurrida la duplicacin, sera de esperar que la sustitucin de nucletidos modifique a varios miembros en diferentes formas y produzca una familia de secuencias repetidas con estructura similar pero no idntica. Los genes de globna, por ejemplo, constan de grupos de genes localizados en dos cromosomas distintos. Cada grupo contiene varios genes relacionados que codifican polipptidos de globina empleados en diversas etapas de la vida del animal. Los grupos tambin contienen seudogenes, homlogos de los genes de globina, pero no funcionales. Se puede seguir la duplicacin de genes en el laboratorio durante generaciones exponiendo clulas cultivadas a frmacos capaces de seleccionar clulas con mayor nmero de copias de una protena particular (p. 404). Ciertas secuencias de DNA pueden mudarse rpidamente por transposicin de un sitio a otro en el genoma. Estos elementos capaces de mudarse se denominan transposones y pueden integrarse al azar a travs de todo el genoma. Los transposones mejor estudiados son los de bacterias. Se caracterizan por repeticiones inversas en su extremo terminal y segmentos internos que codifican una transposasa requerida para su integracin y la formacin de secuencias cortas repetidas en

los DNA husped que flanquean el elemento en el sitio de integracin. Los transposones bacterianos con frecuencia contienen genes resistentes a antibiticos que han contribuido a propagar cepas de bacterias resistentes. Los elementos eucariotas susceptibles de cambiar de sitio pueden desplazarse mediante varios mecanismos. Algunos se duplican y la copia se introduce en un sitio especfico dejando sin cambios el sitio donador. En otros casos, el elemento es escindido del sitio donador e introducido en un sitio especfico. En la mayor parte de los casos, el elemento se transcribe a un RNA que puede ser copiado por una transcriptasa inversa codificada por el elemento, y el DNA copiado se integra en el sitio especfico. La fraccin moderadamente repetida del DNA humano contiene dos grandes familias de elementos mudables, la familia Alu y la Ll (p. 413). Una muestra dada de DNA puede romperse en un conjunto definido de fragmentos mediante tratamiento con endonucleasas de restriccin procedentes de bacterias que reconocen una secuencia especfica de cuatro a ocho nucletidos y pueden cortar ambas cadenas del doble DNA. Diferentes enzimas desdoblan la misma preparacin de DNA en diferentes conjuntos de fragmentos de restriccin. Los sitios del genoma separados por diversas enzimas pueden identificarse y ordenarse en un mapa de restriccin. Cuando el DNA de diferentes personas (incluso gemelos no idnticos) se trata con una enzima de restriccin, la longitud de los fragmentos es similar, pero no idntica, debido a diferencias en las secuencias de nucletidos de una persona a otra. Estas diferencias se conocen como polimorfismo por restriccin de la longitud de fragmentos (PRLF). Los PRLF pueden usarse para identificar individuos mediante tcnicas dactiloscpicas con DNA o trazar la herencia de un gen particular (p. 418).

PREGUNTAS DE REPASO
1. Qu es un grupo unido? Cul es su relacin con un cromosoma? Cmo se puede determinar el nmero de grupos unidos en una especie? 2. Qu es un marcador gentico? Cmo actan las mutaciones como marcadores genticos? Cul es el significado de un marcador gentico altamente polimrfico? Mencione un ejemplo de marcador altamente polimrfico y cul es la ventaja de emplearlo en el mapeo gentico. 3. Qu se entiende por unin incompleta? Cul es su relacin con la formacin de parejas de cromosomas homlogos durante la meiosis? 4. En qu difieren los cromosomas politeno de un insecto de los cromosomas normales? 5. Qu significa la polaridad de una cadena de DNA? Que las dos cadenas sean antiparalelas? Que la molcula tenga un surco mayor y un surco menor? Que las cadenas sean complementarias entre s? 6. Cul fue la importancia del anlisis de Chargaff acerca de la composicin de bases del DNA para determinar la estructura de la doble hlice? 7. Qu es un genoma? En qu difiere un genoma bacteriano complejo de un genoma eucariota? 8. Qu significa el trmino desnaturalizacin del DNA? Por Qu la desnaturalizacin depende del contenido G-C del DNA? Cmo puede afectar esta variable a la T,,,? 9. Qu es un DNA microsatlite? Cul es el papel de estas secuencias en las enfermedades humanas? Cmo se demostr su utilidad en gentica humana? 10. Qu tipo de presiones selectivas condujeron a la evolucin de secuencias de DNA repetidas con funciones codificantes? Qu tipos de producto codifican? Cul es la consecuencia para el genoma humano de las secuencias de DNA repetidas que carecen de funciones codificantes? 11. Qu fraccin del genoma contiene la mayor cantidad de informacin? Por qu esto es cierto? 12. Describir el curso de los acontecimientos evolutivos que se cree dieron lugar a familias de multigenes como las que codifican las globinas. Cmo pueden estos sucesos dar lugar a seudogenes? Cmo se originaron las protenas con funciones totalmente diferentes?

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CAPITULO 10 Naturaleza de! gen y del geuoma

13. Describir tres mecanismos para el desplazamiento de los elementos genticos de un sitio a otro en el genoma. 14. Describir los pasos para preparar un mapa de restriccin de una parte del DNA utilizando una enzima de restriccin particular.

15. Qu es un PRLF? Cmo se utilizan los PRLF para identificar genes como el que codifica la fibrosis qustica?

PREGUNTAS ANALTICAS
1. En qu hubieran diferido los resultados de Mendel si dos de los siete rasgos estudiados fueran codificados por genes situados uno cerca del otro sobre alguno de los cromosomas de las plantas de guisante? 2. Sutton pudo suministrar datos visuales de a ley de segregacin de Mendel. Por qu le habra sido imposibe confirmar o refutar la ley de la permutacin independiente de Mendel? 3. Los genes X, Y y Z se localizan sobre un cromosoma. Dibujar un mapa sencillo mostrando el orden de los genes y la distancia relativa entre los genes X, Y y Z utilizando los datos que siguen: Frecuencia de entrecruzamiento
36%

10% 26%

Entre estos genes X-Z Y-Z X-Y

4. Alelos situados sobre extremos opuestos de un cromosoma tienen tal probabilidad de separarse durante el entrecruzamiento que pueden hacerlo de manera independiente. Cmo se puede determinar mediante cruzamiento gentico si estos dos genes pertenecen al mismo grupo unido? Cmo se podra establecer esto utilizando la hibridacin de cido nucleico? 5. En qu puntos de la curva de la figura 10-20 se observara la renaturalizacin del DNA que codifica RNA ribosmico? Suponga que tiene una preparacin pura de fragmentos de DNA cuyas secuencias codifican RNA ribosmico. Dibujar la renaturalizacin de este DNA superpuesta a la curva de DNA total mostrada en la figura 10-20. 6. Estara usted de acuerdo con la siguiente afirmacin? En una poblacin promedio de fragmentos de DNA eucariotas de longitud promedio de 200 nucletidos, una enzima de restriccin podra atacar la mayor parte de los fragmentos. En caso contrario, por qu no? 7. Se le proporciona una muestra de DNA extrado de una fuente desconocida. Despus de fragmentacin y desnaturalizacin se encuentra una curva de renaturalizacin poco

habitual con slo 10% del DNA formado por secuencias de DNA no repetidas (copia nica). 1) Dibujar la curva de renaturalizacin. 2) Asumiendo que se desea una preparacin pura con secuencias nicas de DMA para emplear en experimentos subsecuentes, cmo se puede obtener dicha preparacin? 3) Dibujar la curva de renaturalizacin de esta preparacin pura de DNA no repetido superpuesta a a curva de la parte 1. 8. Supongamos que se tienen dos soluciones de DNA, una de cadena simple y la otra de cadena doble, con absorbancia equivalente a 260 nm. Cmo se podra comparar la concentracin de DNA en estas dos soluciones? 9. Cul patrn de marcado sera de esperar despus de hibridacin in situ entre cromosomas mitticos y RNAm de mioglobina marcada? Entre los mismos cromosomas y DNA de histona marcada? 10. Segn la composicin de bases determinada por Chargaff, cul de las siguientes caracterizara toda muestra de DNA? 1) [A] + [T] = [G] + [C]; 2) [A]/[T] = 1; 3) [G] = [C]; 4) [A] + [G] - [T] + [C]. Si el contenido de C de la preparacin de una doble cadena de DNA es de 15%, cul es su contenido de A? 11. Si 30% de las bases de una cadena nica de DNA son T, entonces 30% de las bases de dicha cadena sern A. Cierto o falso? Por qu? 12. Concuerda usted con la afirmacin de que T,,, representa la temperatura en la cual 50% de las molculas de DNA en una solucin son de cadena nica? 13. Supongamos que encuentra un primate con un gen/-globina con una sola secuencia interpuesta. Piensa que este animal pudo haber evolucionado de un ancestro primitivo que se separ de otros animales antes de la aparicin del segundo intrn? 14. Por qu se considera un suceso al azar la amplificacin del gen de DHFR cuando es el nico gen del genoma que se amplifica en clulas que crecen en metotrexato? 15. En el momento actual, una persona puede enterarse con 85% de certidumbre si padecer enfermedad de Huntington mediante el anlisis de PRLF. Por qu piensa usted que no puede haber 100% de certidumbre?

BIBLIOGRAFA
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433

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CAPITULO

11

Utilizacin de la informacin gentica: de la transcripcin a la traduccin

11-1 Relacin entre genes y protenas 11-2 Transcripcin: el proceso bsico 11-3 Transcripcin y procesamiento del RNA en clulas eucariotas La perspectiva humana: Posible uso de las ribozimas en medicina 11-4 Codificacin de la informacin gentica 11-5 Traduccin de la informacin gentica La va experimenta]: Papel del RNA como catalizador

l avance de la biologa en el siglo pasado se reflej de muchas maneras en nuestro concepto cambiante de la naturaleza del gen. Los trabajos de Mendel ensearon a los bilogos que los genes son elementos discretos que controlan el desarrollo de rasgos especficos. En su oportunidad, Mendel pudo haber argumentado en favor del concepto de que cada gen determina un solo rasgo. Boveri, Weismann, Sutton y sus contemporneos descubrieron que los genes posean un cuerpo fsico como parte del cromosoma. Morgan, Sturtevant y sus colaboradores demostraron que los genes ocupan sitios especficos: residen en lugares particulares sobre cromosomas especficos. Estos sitios permanecen constantes en cada individuo de una especie y se transmiten a la siguiente generacin. La formulacin de estas ideas represent una serie de avances importantes en el camino hacia el conocimiento gentico, pero an faltaba aclarar cmo opera la informacin almacenada en un gen para controlar las actividades de la clula. Este es el principal tema que analizaremos en el presente captulo. Iniciaremos estudiando algunos conceptos adicionales respecto de la naturaleza del gen para tener una idea ms aproximada de su papel en la sntesis de productos codificados.

FIGURA 11-A. Imagen generada por computadora de una subunidad ribosmica en a cual el RNA ribosnco aparece como una lnea azul y las protenas ribosmicas como "lluvia de estrellas" esfrica, (Cortesa de Barr/ Noler, Universidad de California, Santa Cruz.)

11-1 Relacin entre genes y protenas

En 1908, el mdico escocs Archibald Garrod public que los sntomas observados en personas afectadas por ciertas

434

CAPITULO 11 Utilizacin de la informacin gentica: de la transcripcin a la traduccin

435

enfermedades hereditarias raras son resultado de la ausencia de enzimas especficas; este fue el primer conocimiento significativo de la funcin de un gen. Una de las enfermedades investigadas por Garrod, la alcaptonuria, es un padecimiento fcil de diagnosticar por el color oscuro que adquiere la orina cuando se expone al aire. Garrod observ en personas con alcaptonuria la ausencia en la sangre de una enzima que oxida el cido homogentsko, compuesto formado durante el desdoblamiento de los aminocidos fenilalanina y tirosina {fig. 11-1). El cido homogentsico acumulado se excreta por la orina, a la cual confiere un color oscuro al ser oxidado por el aire. Garrod haba descubierto la relacin entre un gen especfico, una enzima especfica y una enfermedad metablica especfica. Denomin a estas enfermedades "errores congnitos del metabolismo". Igual como ocurri con otras observaciones tempranas de importancia bsica en gentica, los descubrimientos de Garrod fueron ignorados durante decenios. En 1940, George Beadle y Edward Tatum, del California Insttute of Technology, revivieron la idea de que los genes controlan la formacin de enzimas. Neurospora es un moho tropical del pan que en condiciones normales puede crecer en medios muy simples con una sola fuente de carbono inorgnico (p. ej., un azcar), sales inorgnicas y biotina (una vitamina del complejo B). Puesto que sus necesidades para vivir son tan escasas, debe tener capacidad para sintetizar todos los metabolitos que requiere. Beadle y Tatum asumieron que un organismo con capacidad de sntesis tan amplia deba ser muy sensible a deficiencias enzmticas, fciles de descubrir mediante el protocolo experimental apropiado. Bsicamente, Beadle y Tatum irradiaron las esporas del moho y las distribuyeron de modo que cada una produjera una poblacin genticamente idntica de clulas, y luego investigaron deficiencias metablicas especficas en muestras de estas poblaciones utilizando el protocolo mostrado en la figura 11-2, El inicio fue por irradiacin de miles de clulas. Dos de dichas clulas perdieron su capacidad de

crecer en un medio mnimo: una necesit piridoxina (vitamina B6) y la otra requiri tiamina (vitamina BI). Por ltimo, se investig la descendencia de casi 100 000 esporas irradiadas y se aislaron docenas de diferentes tipos de mutantes. Cada mutante careca de un gen y en consecuencia presentaba una deficiencia enzimtica que impeda a la clula catalizar una reaccin metablica particular. Los resultados fueron claros: un gen especfico portaba informacin para elaborar una enzima particular. Esta conclusin fue conocida como la hiptesis de "un gen-una enzima". Posteriormente, cuando se supo que las enzimas a menudo se componen de ms de una cadena de polipptidos, cada una codificada por un gen diferente, el concepto se modific a "un gen-una cadena de polipptidos". Esta relacin se aproxim mucho ms a la funcin bsica de un gen, pero tuvo que modificarse debido al descubrimiento de que un solo gen con frecuencia genera varios polipptidos relacionados como resultado de nsamblamientos alternativos (estudiados en la seccin 12-3). Los datos de Beadle y Taum plantearon una pregunta acerca de la naturaleza molecular del defecto ocurrido en una protena a causa de una mutacin gentica. La respuesta a esta pregunta se obtuvo en 1956, cuando Vernon Ingram, de la Universidad de Cambridge, public un trabajo acerca de las consecuencias moleculares de la mutacin causante de la anemia drepanoctica. La hemoglobina consta de cuatro grandes polipptidos, demasiado grandes para secuenciar con la tecnologa de aquella poca, pero Ingram tom un atajo. Obtuvo preparaciones aislando hemoglobina de clulas normales y de clulas drepanocticas en cierto nmero de tramos especficos usando la enzima proteoltica tripsina. A continuacin someti los fragmentos del pptido a cromatografa en papel para determinar si poda diferenciar alguno de los tipos de hemoglobina normal y drepanoctica entre los productos digeridos por la tripsina. De los 30 pptidos o ms presentes en la mezcla, uno migr de manera diferente en las dos preparaciones (como lo ilustrado en la figura 2-29); esta nica diferencia al parecer

NH2

NH2

CH 2 CHCOOH

HO

CH 2 CHCOOH

COOH

Fenilalanina

Tirosina

Acido homogentsico

HC COOH HOOC CH II HC COOH Acido fumrico CH 3 CCH 2 COOH II O Acido acetoactico

Oxidasa del cido homogentsico

HC C CH2 C COOH i II O O Acido 4-maleilacetoactico

FIGURA 11-1. "Error congnito del metabolismo". Los pasos en la va conducen al desdoblamiento de los aminocidos aromticos (fenilalanina y tirosina). Las alteraciones de la enzima oxidasa del cido homogentsico en personas con alcaptonuria causan acumulacin del cido homogentsico en la orina.

436

CAPITULO 11 * Utilizacin de la informacin gentica: de la transcripcin a la traduccin

O
Tipo nativo de Neurospora Irradiar con rayos X o luz ultravioleta

o
Desarrollar en medio complementado Esporas producidas por meioss seguido por una sola mitosis

Meiosis

Medio mnimo Prueba de la capacidad de crecimiento

Medio mnimo + vitaminas

Medio mnimo + aminocidos

Los mutantes pueden crecer en medio complementado, pero no en medio mnimo

Medio mnimo complementado con:

A,

Piridoxina

Acido p-aminobenzoico

Colina

Inositol

Acido flico

Acido Miacina Riboflavina Tiamina pantotnico

Control del medio mnimo

KIOL'KA 11-2. Experimento de Beadle y Tatum para aislar mutantes genticos en Nenrosporu. Se irradiaron esporas para inducir mutaciones (paso 1) y luego se permiti crecer colonias en tubos que contenan medio complementario (SM) (paso 2). A continuacin se prob la capacidad de esporas individuales producidas por las colonias para crecer en un medio mnimo (MM) (paso 3). Las que no crecieron eran murantes y la tarea consisti en determinar la naturaleza del gen mutante. En el paso 4 del ejemplo mostrado se observ una muestra de clulas que crecen en un medio mnimo complementado con vitaminas, pero que no crecen en medio complementado con aminocidos. Esta observacin indica deficiencia de la enzima que controla la sntesis de vitaminas. En el paso 5, el crecimiento de estas mismas clulas en un medio mnimo complementado con una u otra de las vitaminas indica que la deficiencia reside en un gen que participa en la sntesis de cido pantotnico (una parte de la coenzima A).

causaba todos los sntomas de la anemia drepanoctica. Una vez separados los ppdos, Ingram obtuvo un solo pequeo fragmento para secuenciar, ms bien que una protena completa. La diferencia observada fue la sustitucin de una valina en la hemoglobina drepanoctica por un cido glutmico de la molcula normal. Ingram haba demostrado que una mutacin en un solo gen poda causar una sola sustitucin en una secuencia de aminocidos de una sola protena. Flujo de informacin a travs de la clula: panorama general Hasta aqu se ha establecido la relacin entre informacin gentica y secuencia de aminocidos, pero este conocimiento por s solo no proporciona indicios acerca del mecanismo para generar cadenas de polipptidos especficos. Segn

sabemos ahora, hay un intermediario entre un gen y su polipptido, el RNA mensajero intermediario (RNAm). Un RNA mensajero se ensambla como copia complementaria de una de las dos cadenas de DNA que constituyen un gen. La sntesis de un RNA a partir de una plantilla de DNA se denomina transcripcin. Esta secuencia de nucletidos es complementaria a la del gen a partir del cual fue transcrita, por lo que el RNAm retiene la misma informacin contenida en el propio gen. El uso de un RNA mensajero permite a las clulas separar informacin almacenada a partir de la utilizacin de informacin (fig. 11-3). El gen permanece almacenado, aislado dentro del ncleo como parte de una enorme molcula inmvil de DNA, pero puede transmitir su informacin a un RNA movible mucho ms pequeo capaz de llegar al citoplasma. Una vez en el citoplasma, el RNAm puede servir como plantilla para controlar la incorporacin de ami-

DNA del cromosoma l-'IGURA 11-3. Flujo de informacin en una clula eucariota. El DNA de los cromosomas localizados en el ncleo contiene toda la informacin gentica almacenada. Sitios seleccionados del DNA se transcriben al RNA (paso 1), que se procesa a RNA mensajero (paso 2). El RNA mensajero se transporta fuera del ncleo (paso 3) hacia el interior del citoplasma, donde se traduce en polipptidos mediante un ribosoma que se desplaza a lo largo del RNAm (paso 4). Luego de la traduccin, el polipptido se pliega para asumir su conformacin nativa (paso 5). Citoplasma

Pre-RNAm

Segmento de DNA que se transcribe

RNAm que se traduce

Protema

{^

RNAm Ncleo

nocidos en el orden particular codificado por la secuencia de nucletidos del DNA y del RNAm. El uso del RNA mensajero tambin permite a la clula amplificar enormemente su actividad. Una molcula de DNA puede servir como plantilla para la sntesis de gran nmero de cadenas de polipptidos. Las protenas se sintetizan en el citoplasma mediante un proceso muy complejo denominado traduccin. La traduccin requiere la participacin de docenas de diferentes elementos, incluyendo ribosomas. Los ribosomas son componentes inespecficos del mecanismo de traduccin, una especie de "banco de trabajo" sobre el cual cualquier ribosoma puede traducir cualquier RNAm. Por esta razn se pueden utilizar clulas bacterianas como "laboratorios farmacuticos" para elaborar protenas codificadas por los RNAm humanos. Conforme lo analizado en la pgina 69, un ribosoma funcional consta de una subunidad grande y una pequea. El ribosoma se ensambla a partir de estas subunidades en el momento de iniciar la sntesis de un polipptido particular, y se desensambla cuando la sntesis concluye. Los ribosomas constan de RNA y protena (como se ilustra en la fotografa de la pgina 434). El RNA de un ribosoma se denomina RNA ribosmico (o RNAr), e igual que los RNAm, cada uno se transcribe a partir de una cadena de DNA de un gen. En vez de capacidad de informacin, los RNAr desempean funciones estructural y cataltica. El RNA de transferencia (o RNAt) constituye una tercera clase principal de RNA necesario durante la sntesis de protenas (fig. 11-3). Se requiere RNA de transferencia para traducir la informacin codificada en el "alfabeto" de un nucletido de RNAm aJ "alfabeto" del aminocido de un polipptido. Los RNAt y los RNAr son molculas de vida media prolongada dentro de la clula {tpicamente, horas a das), pero los RNAm de ordinario son inestables y su vida media se mide en minutos u horas.

El RNAr y el RNAt deben su actividad a su capacidad para adoptar estructuras complejas secundarias y terciarias. Por lo tanto, a diferencia del DNA, que tiene una estructura relativamente definida cualquiera que sea su fuente, los RNA se pliegan en formas tridimensionales complejas, notablemente diferentes de un tipo de RNA a otro. As pues, igual que las protenas, los RNA pueden efectuar diversas funciones debido a que adoptan gran variedad de formas diferentes. Como en las protenas, el plegamiento de las molculas de RNA sigue ciertas reglas. As corno la regla principal del plegamiento de protenas es cubrir residuos hidrofbicos (pg. 72), una regla primaria del plegamiento del RNA es formar regiones que posean pares de bases complementarias (fig. 11-4). En las siguientes secciones de este captulo analizaremos con detalle los funciones del RNAm, el RNAr y el RNAt. Las bases de la estructura material del RNA se estudiaron en la pgina 67.

11-2

Transcripcin: el proceso bsico

La transcripcin es un proceso mediante el cual un tipo de cido nucleico produce otro tipo de cido nucleico. Por consiguiente, la transcripcin es mucho ms simple que la traduccin y puede efectuarla una sola enzima (que trabaje en conjunto con varias protenas auxiliares). En clulas procariotas y eucariotas, las enzimas encargadas de la transcripcin se denominan RNA polimerasas dependientes de DNA o simplemente RNA polimerasas. Estas enzimas pueden ensamblar una cadena lineal de nucletidos cuya secuencia es complementara de una de las cadenas de DNA que le sirve como plantilla. El primer paso en la sntesis de un RNA es la asociacin de la polimerasa con la plantilla de DNA. Esto conduce a un tema de mayor inters general, a saber, las interacciones

438

CAPITULO 11 * Utilizacin de la informacin gentica: de la transcripcin a a traduccin

FIGURA 11-4. Estructura bidimensional de un RNA ribosmico bacteriano que muestra el extenso acoplamiento de pares de bases entre diferentes regiones de una sola cadena.

especficas de dos macromolculas muy diferentes, protenas y cidos nucleicos. As como diferentes protenas han evolucionado para unirse a diversos tipos de sustratos y catalizar distintos tipos de reacciones, as tambin algunas evolucionaron para reconocer y unirse a secuencias especficas de nucletidos en una cadena de cido nucleico. El sitio donde se enlaza la molcula de RNA polimerasa antes de iniciar la transcripcin se denomina promotor. Adems de suministrar un sitio de enlace para la polimerasa, el promotor contiene la informacin que determina cul de las dos cadenas de DNA ser transcrita y el sitio donde se inicia la transcripcin (g. 11-7). La polimerasa se desplaza en la direccin 3' a 5' a lo largo de la plantilla de la cadena de DNA ensamblando una cadena complementaria antiparalela de RNA que crece desde el extremo terminal 5' en direccin 3' (fig. 11-5, a). Las polimerasas pueden formar RNA prodigiosamente largos. En consecuencia, la enzima debe permanecer fija al DNA sobre largos tramos de la plantilla (se dice que la enzima es de proceso). AI mismo tiempo, la asociacin de la enzima debe ser lo bastante laxa para que pueda desplazarse de un nucletido al siguiente en la plantilla. Como se indica en la figura 11-5, b, la RNA polimerasa cataliza la reaccin RNA,, + NPPP -> RNA, I+1 + PP (-> 2 P) en la cual los precursores trifosfato de ribonuclesido {NPPP) son hidrolizados para producir monofosfato de nuclesido

conforme se polimerizan en una cadena covalente. La hidrlisis de este enlace ster de fosfato es una reaccin altamente exergnica cuyo equilibrio se encuentra muy desplazado hacia la formacin de pirofosfato (PP). La reaccin est orientada adicionalmente en esa direccin por hidrlisis del pirofosfato mediante una pirofosfatasa para formar iones de fosfato inorgnico. Las reacciones que conducen a la sntesis de cidos nucleicos (y de protenas) son intrnsecamente diferentes a las del metabolismo intermediario estudiadas en el captulo 3, ya que es imperativo que la reaccin proceda en una sola direccin; o sea, la reaccin es prcticamente irreversible. En tanto que algunas de las reacciones que conducen a la formacin de molculas pequeas, como aminocidos, pueden estar muy cercanas al equilibrio que pueda medir una reaccin inversa considerable, las reacciones que conducen a la sntesis de cidos nucleicos y protenas deben ocurrir en condiciones donde prcticamente no haya reaccin inversa. Esta condicin puede cumplirse si se acoplan estas reacciones a la hidrlisis altamente exergnica de molculas como el pirofosfato. Conforme se desplaza la polimerasa a lo largo de la plantilla debe introducir el nucletido apropiado en cada sitio de la cadena creciente. La enzima presumiblemente puede seleccionar el trifosfato de ribonuclesido complementario que debe incorporar gracias a la capacidad del nucletido para formar la estructura estereoqumica apropiada con el nucletido en la cadena de DNA que se transcribe (fig. 11-5, b). Una vez que la polimerasa pasa sobre un sitio particular, se reconstituye la doble hlice de DNA (como en la figura 11-5, a); la cadena de RNA no permanece asociada a su plantilla como un hbrido de DN A-RN A (excepto para unos cuantos nucletidos justo detrs del sitio donde la polimerasa est operando). Una polimerasa de RNA bacteriano puede incorporar unos 50 nucletidos por segundo a una molcula de RNA en crecimiento. La microfotografa electrnica de la figura 11-5, c, muestra una molcula de DNA de un fago con cierto nmero de molculas de RNA polimerasa enlazadas. En este punto del anlisis es necesario diferenciar los procesos de transcripcin en clulas procariotas y eucariotas. Transcripcin en procariotes Las clulas procariotas contienen un solo tipo de RNA polimerasa compuesta de cinco subunidades firmemente asociadas para formar un ncleo enzimtico central. Si este ncleo enzimtico se purifica a partir de clulas bacterianas y se aade a una solucin de molculas de DNA bacterianas y ribonucletidos, la enzima se une al DNA y sintetiza RNA. Sin embargo, las molculas de RNA producidas por la polimerasa purificada no son iguales a las encontradas dentro de la clula porque el ncleo enzimtico se fija a sitios inapropiados en el DNA, sitios que normalmente seran ignorados en la clula. Sin embargo, si a la RNA polimerasa se aade un polipptido accesorio purificado \\amadofactor sigma (a) antes de fijarse al DNA, la transcripcin comienza en los sitios apropiados (fig. 11-6). La fijacin del factor sigma al ncleo enzimtico aumenta la afinidad de la enzi-

RNA naciente

(5'

Cadena de DNA en contrasentido * 5'

Subenrollamiento

Burbuja de transcripcin

Superen rol la miento

Terminal 5' del RNA

*5S5!""> - --. '-.-'' -- " . ,-.--'; --;;>- -. -.,.: <^g

fW KHilJKA I 1 -. Alargamiento de la cadena durante la transcripcin, a) Modelo esquemtico del alargamiento de una molcula de RNA recin sintetizada durante la transcripcin. En este modelo, el DNA gira conforme genera el transcrito y por lo tanto sufre arrollamiento excesivo por delante del sitio de incorporacin del nucletido y desenrollamiento detrs de ese sitiu. Este modelo se basa en la suposicin de que tanto la polimcrasa como el DNA se encuentran fijos al ncleo del armazn estructural interno (indicado por las barras negras), lo que evita su rotacin. La cadena de DNA transcrita se denomina cadena en contrasentido porque es complementaria de la de KNA, que contiene la informacin (determina el sentido), b) El alargamiento de la cadena ocurre como resultado de un ataque por el 3' OH del nucletido al extremo de la cadena en crecimiento sobre el 5' a fosfato del trifosfato de nuclesido en crecimiento. El pirofosfato liberado se desdobla a continuacin impulsando an mas la tendencia de la reaccin hacia la polimerizacin. La geometra del acoplamiento de bases entre el nucletido de la cadena de la plantilla y el nucletido en crecimiento determina cul de los cuatro posibles trifosfatos de nuclesido se incorporan a a cadena de l\NA en crecimiento en cada sitio, f) Micrografa electrnica de varias molculas de RNA polimerasa enlazadas a la plantilla de DjM A del fago, (u: Scyii /i. Fiitclicr, Trenas Genet. 4:271-272, 198S; c: cortesa ilc R.C. WUliaiiia.)

440

CAPITULO 11 Utilizacin de la informacin gentica: de a transcripcin a la traduccin Enzima del ncleo (contiene 5 subunidades)

^2^^^^^^^^

Falta de asociacin entre DNA y la enzima del ncleo. Las cadenas de RIMA iniciadas no comenzaron en los sitios apropiados

(a)
Enzima completa

Factor sigma

^^^7^^^^^^

(b)

Asociacin de la enzima completa con DNA en el sitio apropiado y abertura de una doble hlice

(c)

Prdida del factor sigma conforme la cadena RNA se alarga

FIGURA 1 1 -6. Inicio de la transcripcin en procariotes. a) En ausencia del factor sigma, la enzima central no puede interactuar con el DNA en los sitios especficos de inicio, b-d) Cuando la enzima central se asocia al factor sigma inicia la sntesis de RNA en los sitios apropiados. Despus el factor se disocia de la enzima central, que entonces puede sufrir alargamiento.

ma por los sitios promotores sobre el DNA y disminuye su afinidad general por DNA. Una vez iniciada la transcripcin, la subunidad sigma se separa de la plantilla de DNA, en tanto que la polimerasa contina ensamblando una cadena de RNA complementaria. Los promotores bacterianos se localizan en la regin de una cadena de DNA, justo antes {o en la parte alta) del sitio

donde se inici la sntesis de RNA.1 El anlisis de las secuencias de DNA en la parte alta de numerosos genes bacterianos indica dos tramos cortos similares de un gen al otro. Uno de dichos tramos contiene alrededor de 35 bases en la parte alta a partir del sitio de inicio y ocurre como una variacin de la secuencia TTGACA (fig. 11-7). Este sitio (conocido como regin -35) es la secuencia reconocida por el factor sigma relacionado con la polimerasa. Las clulas bacterianas poseen varios factores sigma diferentes que reconocen diversas versiones de la secuencia 35. El uso de diferentes factores sigma es un mecanismo que la clula utiliza para seleccionar una batera particular de genes para posible transcripcin. Por ejemplo, cuando las clulas E. coli se someten a una sbita elevacin de temperatura, sintetizan un nuevo factor sigma que reconoce una secuencia promotora distinta, lo que conduce a la transcripcin de una batera de genes de choque trmico. La segunda secuencia de consenso se presenta unas 10 bases hacia arriba del sitio de inicio y ocurre como variacin de la secuencia TATAAT (fig. 11-7). Este sitio, denominado segmento Pribnow por su descubridor, se encarga de identificar el nucletido preciso que iniciar la transcripcin. Aunque la mayor parte de las mutaciones en regiones promotoras reducen la tasa de transcripcin, ciertas sustituciones de bases en las regiones -35 y -10 pueden incrementar mucho esa tasa. Por o tanto, los promotores son algo ms que simples regiones de reconocimiento; actan como importantes sitios de control para regular la tasa de expresin de genes. As como la transcripcin se inicia en puntos especficos del cromosoma, tambin termina cuando se alcanza una secuencia especfica de nucletidos. En algunos casos, para concluir la transcripcin se requiere una protena llamada factor rho, pero en Ja mayor parte de los casos la polimerasa puede detener la transcripcin y liberar la cadena de RNA sin factores adicionales. Los sitios de terminacin independientes de rho poseen una secuencia notablemente similar en la regin precedente al sitio de conclusin. Esta regin incluye dos tramos de pares G-C dispuestos en forma de un par repetido invertido seguido por una hilera de adeninas en la cadena transcrita (fig. 11-8). Como consecuencia de esta simetra en su secuencia de bases, se asume que el extremo 3' del RNA naciente forma una asa en forma de gancho para el cabello (fig. 11-8} que impide el avance de la enzima. Los datos indican que la polimerasa se detiene cuando llega a esta regin. Esto suministra un buen ejemplo de la importancia de la estructura secundaria del RNA. Se cree que el tramo de nucletidos de! DNA que contiene adenina facilita la liberacin de la cadena de RNA, puesto que los pares de bases formados entre la U de una cadena de RNA y una A de la cadena de DNA son especialmente dbiles. Las mutaciones: 1) que debilitan la estructura del asa en forma de gancho de cabello, o 2) que fortalecen la interaccin entre la plantilla de DNA y el RNA transcrito en

1 El nucletido donde se inicia la transcripcin se denomina +1 y crece en direccin hacia arnba, que se escribe a la derecha. El nucletido que precede al sitio de inicio se denomina 1 y el nmero se vuelve cada vez ms negativo en direccin hacia arriba (a la izquierda).

CAPITULO 11 Utilizacin de la informacin gentica: de la transcripcin a la traduccin AATXXXXXXXJftX XXXXXXTTGACAXXXXXXXXXXXXXXXXXXXTAT XXXXXX Cadena de p-p^p ' RNA naciente 1A"X" X X X X X X A A C T G T X X X X X X X X X X X X X X X X X X X A T kr^0^ ^ r_ n\.t:ha X X X X X X Lauena ue id pianusia
T T A X X X X X X X | T X

441

Secuencia -35

Secuencia -10

Punto de inicio

FIGURA 11-7. Elementos bsicos de una regin promotora en el DNA de una bacteria E. coli. La secuencia reguladora clave requerida para el inicio de la transcripcin se observa en regiones localizadas a -35 y -10 pares de bases a partir del sitio donde se inicia la transcripcin.

la regin rica en U, pueden ser causa de que la polimerasa lea el sitio de terminacin.

11-3 Transcripcin y procesamiento del RNA en clulas eucariotas

Las clulas eucariotas poseen tres enzimas transcriptoras distintas, cada una encargada de la sntesis de diferentes grupos de RNA. La RNA polimerasa I sintetiza RNA ribosmico grande (28S, 18S y 5.8S); la RNA polimerasa II sin-

tetiza RNA mensajero y la mayor parte de los RNA nucleares pequeos (estudiados ms adelante); y la RNA polimerasa III sintetiza RNA de bajo peso molecular, incluyendo varios RNA de transferencia y el RNA ribosmico 5S. No se han encontrado procariotes con RNA polimerasas mltiples, en tanto que los eucariotes ms simples (levaduras) poseen los mismos tres tipos presentes en clulas de mamferos. Esta diferencia en el nmero de RNA polimerasas es otra aguda diferencia entre los dos tipos de clulas. Las polimerasas eucariotas son enzimas sumamente complejas que contienen de ocho a 14 polipptidos distintos

Cadena de la plantilla de DNA 5' 31 X-X-X-X-G-C-C-C-G-C-X-X-X^ X-X-X-X-C-G-G-G-C-G-X-X-X-X-X-X-X-C~G-C-C--G-A-A^W\-A A A A-X-X-X-X-X-X-X-X 3' 5'

Transcrito de RNA

Transcrito de RNA plegado para inducir terminacin

x X
X

x X
x

C-G G-C C-G C-G C-G G-C

5'

X X X X U U U U U U U U-OH

FIGURA 11-8. Terminacin independiente de Rho de la transcripcin en E. coli. La regin de terminacin contiene dos tramos de pares G-C dispuestos en forma de una unidad repetida inversa seguida por una hilera de adeninas en la cadena transcrita. Como resultado de esta secuencia de bases, el extremo 3' del RNA naciente puede formar una asa en forma de gancho para el cabello, que detiene el movimiento de la RNA polimerasa.

442

CAPITULO 11 Utilizacin de la informacin gentica: de la transcripcin a la traduccin CUADRO 1.1-1. Los RNA nucleares pequeos

RNA
Nucleoplasma Ul U2 U4 U5 U6 U7 Ull U12 7SK 8-2 Nuclolo U3 U8 U13 7-2

Funcin

Abundancia (copias/clula)

RNA polimernsi

Pre-RNAm ensamblador Pre-RNAm ensamblador Pre-RNAm ensamblador Pre-RNAm ensamblador Pre-RNAm ensamblador Histona pre-RNAm ensamblado? a Desconocida Desconocida Desconocida Pre-RNAt de procesamiento (Rnasa) Pre-RNAr de procesamiento Desconocida Desconocida Desconocida

1 x 106 5 x 105 2 x 105 2 x 105 4 x 105 5 x 103 1 x 104 5 x 103 2 x 105 1 x 105 2 4 1 1 x 105 x 1CH x 104 x 105

11 II II II III II II II III III lili II III

* U3 se sintetiza por accin de la RNA polimerasa III en plantas. FUENTE: S.J. Baserga y J.A. Steitz, RNA World, R.F. Gesteland y J.F. Atkins. eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993.

(subunidades), y son lo bastante grandes para visualizarse con facilidad en las micrografas electrnicas (fig. 11-5, c). Adems de las subunidades que constituyen las enzimas, cada una de las polimerasas se auxilia durante su operacin con varias protenas auxiliares denominadas factores de transcripcin. Se pueden distinguir dos categoras amplias de factores de transcripcin: factores generales de transcripcin, requeridos para que la polimerasa inicie la transcripcin, y factores especficos de transcripcin (o protenas reguladoras de genes) que determinan la tasa de transcripcin de un gen o grupo particular de genes. El mecanismo de accin de los factores especficos de transcripcin se encuentra en el verdadero centro del proceso de expresin selectiva de genes y se analiza con detalle en el captulo 12. Los tres tipos de RNA polimerasa eucariota pueden distinguirse segn su sensibilidad a la a-amanitina, octapptido sumamente txico (ocho aminocidos unidos). La C!-amanitina se aisla de un hongo venenoso comn, Amanita phalloides, que tambin es fuente de la faloidina, toxina para microfilamentos (pg. 357). La actividad de la RNA polimerasa II es muy sensible a la amanitina-alfa, en tanto que la RNA polimerasa I no es afectada por ese compuesto. La RNA polimerasa III se inhibe en menor grado que la RNA polimerasa II. Una persona envenenada por ingestin de estos hongos no muestra sntomas inmediatos, sino que la funcin heptica se deteriora en los das subsecuentes debido a la falta de produccin de un nuevo RNAm necesario para controlar la sntesis continua de protenas. En casos graves, la nica manera de salvar la vida de la persona puede ser un trasplante heptico. Los tres principales tipos de RNA se derivan de molculas de un precursor de RNA considerablemente mucho

mayor que el producto RNA "maduro". La molcula de RNA inicialmente sintetizada, de longitud equivalente a la longitud completa del DNA transcrito, se denomina transcrito primario, o pre-RNA. El segmento de DNA correspondiente sobre el cual se transcribe el transcrito primario se denomina unidad de transcripcin. Tpicamente, los transcritos primarios tienen existencia fugaz y son procesados para formar RNA funcional ms pequeo mediante una serie de reacciones de procesamiento. El procesamiento del RNA requiere varios RNA pequeos (90 a 300 nucletidos de largo) y sus protenas relacionadas. Los RNA se denominan RNA nucleares pequeos (RNAnp) debido a su corto tamao y a que funcionan dentro del ncleo. No hay ms de una docena de diferentes RNAnp; las especies mejor definidas se muestran en el cuadro ^1-1. (La U en el nombre del RNA indica que es rico en nucletidos que contienen uracilo.) En las siguientes secciones examinaremos las actividades relacionadas con la transcripcin y procesamiento de cada uno de los RNA cucariotas principales.

RNA ribosmico
En la pgina 408 se mencion el DNA que codifica al RNA ribosmico como parte de una fraccin moderadamente repetida del genoma. Las clulas eucariotas contienen millones de ribosomas, cada uno con varias molculas de RNAr junto con docenas de protenas ribosmicas. En realidad, ms de 80% del RNA de una clula consta de RNA ribosmico. Para suministrar a la clula un nmero tan grande de transcritos, las secuencias de DNA que codifican

CAPITULO 11

443

RNAr normalmente se repiten cientos de veces. Este DNA, llamado DNAr, de ordinario se agrupa en una o unas pocas regiones del genoma (fig. 11-9). En la clula en inferase (o sea, que no se encuentra en estado de divisin), los racimos de DNAr se agrupan como parte de una o ms estructuras nucleares de forma irregular denominadas nuclolos, que funcionan corno organelos productores de ribosomas. Los nuclolos desaparecen durante la mtosis y luego reaparecen en el ncleo de as clulas hijas alrededor de las partes del genoma que contienen genes de RNA ribosmico. Por consiguiente, las regiones del cromosoma que contienen DNAr se denominan organizadores nucleolares. Como se indic en la micrografa electrnica de la figura 11-10, la masa del nuclolo se compone de partculas de unos 15 a 20 nm de dimetro que confieren al nuclolo un aspecto granuloso. Integrados en esta masa granular se encuentran uno o ms corpsculos redondos que consisten principalmente en material fibrilar. En breve mostraremos la base molecular de las regiones fibrilar y molecular.
FIGURA 11-10. Estructura del nuclolo. Micrografa electrnica de una seccin del ncleo con su nuclolo. La masa del nuclolo consta de un componente granular (ge). Integrados dentro de los granulos se encuentran centros fibrilares (fe) rodeados por un componente fibrilar ms denso (dfc). Segn un modelo actual, la transcripcin del precursor RNA ribosmico tiene lugar en e borde situado entre fe y dfc. Barra, 1 //m. (Segn Pavel Hozak \ cois. }. Cell Science 107:641, 1994; con permiso de Company of BioSogists Ltd.)

Sntesis de los precursores de RNAr

De ordinario, los oocitos son clulas muy grandes (p. ej., 100 /m de dimetro); los de anfibio en general son enormes (ms de 2.5 mm de dimetro). Durante el desarrollo de oocitos de anfibios, el DNAr se amplifica selectivamente y aumenta mucho el nmero de nuclolos que alojan los genes de RNAr (fig. 11-11, a). Este paso de amplificacin del DNA es necesario para suministrar el gran nmero de ribosomas necesarios para que el huevo fertilizado inicie su desarrollo embrionario. Debido a que estos oocitos contienen cientos de nuclolos, cada uno elaborando activamente RNAr, son sujetos ideales para estudiar sntesis y procesamiento de los RNAr. Los centros fibrilares de los nuclolos del oocito se pueden apartar cuidadosamente para revelar la presencia de una fibra circular. Cuando se examina esta fibra en el micrescopio electrnico muestra un aspecto que recuerda una cadena de "rboles de Navidad" (fig. 11-11, b). El examen de una parte de la fibra con mayor amplificacin (fig. 11-11, c) revela algunos aspectos de la actividad nucleolar y la sntesis de RNA ribosmico.
FIGURA 11-9. Localizacin experimental mediante hibridacin n sitn del DNA que codifica RNA ribosmico en el anfibio Xeuopus. Se aisl DNA ribosmico y se utiliz como plantilla para sintetizar RNA in vitro complementario marcado con istopos radiactivos. A continuacin el RNA marcado se hibridiz con DNA desnaturalizado de una preparacin de cromosomas de Xenopus, y la Idealizacin de la radiactividad enlazada se determin mediante autorradiografa. El DNA que codifica RNAr se localiza en uno o ms sitios donde se forman nuclolos (por lo tanto, estos sitios se denominan organizadores nucieolares). Puesto que los organizadores nucleolares de ambos miembros de un par homlogo de cromosomas Xenopus se unen entre s, la radiactividad aparece localizada en un sitio sobre el juego de cromosomas (flecha). (Segn Mari/ Lew Pardue, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 35:476, 1973.)

1. La micrografa de la figura 11-11, b, muestra genes distintos para RNA ribosmico situados uno despus del otro a o largo de una molcula simple de DNA, o que revela la disposicin en fila de los genes de RNAr repetidos. 2. La micrografa de la figura 11-11, b, muestra una imagen esttica de lo que ocurre en el nuclolo. Podemos interpretar esta fotografa para obtener mayor informacin respecto del proceso de transcripcin del RNAr. Cada una de las casi 100 fibrillas que surgen del DNA como rama del "rbol de Navidad" es un transcrito del RNAr naciente sorprendido en el acto de alargamiento.

444

CAPITULO 11 Utilizacin de la informacin gentica: de a transcripcin a la traduccin Nuclolos

(b)
(a)

2 |jm

FIGURA 11-11. Sntesis del RNA ribosmico. a) Micrografa tomada con microscopio de luz de un ncleo aislado do un oocito de Xenopus teido para revelar los cientos de nuclolos, b) Micrografa electrnica de un segmento de DNA aislado de uno de los nuclolos de un oocito de Xenopus. El DNA (llamado DNAr) contiene los genes que codifican los dos RNA ribosmicos grandes, seccionados de un solo transcrito primario. Se muestran varios genes, cada uno en el proceso de transcripcin, lo cual se manifiesta por las fibrillas fijas al DNA. Estas fibrillas constan de RNA naciente y protenas relacionadas. Los tramos de DNA entre los genes transcritos son espaciadores no transcritos, c) Vista ms cercana de dos genes nucleolares en el momento de ser transcritos. La longitud del transcrito primario de RNAr en crecimiento aumenta conforme crece la distancia a partir del punto de inicio. Se pueden observar las molculas de RNA polimerasa como puntos en la base de cada fibrilla, (a: Segn David D. Brown c Igor B. Daivid, Science 360:272, 1968; copyright 1968 por American Association for the Advancement of Science, b-c: cortesa de Osear L. Mier, }r. y Barbara R. Beatty.)
(c)

0.5 vim

El granulo oscuro en la base de cada fibrilla, visible con mayor resolucin en la fotografa de a figura 11-11, c, es la molcula de la RNA polimerasa I encargada de la formacin de dicho transcrito. La longitud de las fibrillas aumenta gradualmente de un extremo al otro del "tronco del rbol de Navidad". Las fibrillas ms cortas son molculas de RNA con menor nmero de nucletidos fijos a molculas de polimerasa que a su vez estn enlazadas al DNA ms prximo al sitio de inicio de la transcripcin. Cuanto ms larga la fibrilla ms cerca se encuentra de completar el transcrito. La longitud del DNA entre las fibrillas de RNA ms cortas y ms largas corresponde a una sola unidad de transcripcin. El promotor se sita justo arriba del sitio donde se inicia la transcripcin. La elevada densidad de las molculas de

RNA polimerasa a lo largo de cada unidad de transcripcin (casi una cada 100 pares de bases de DNA) refleja la elevada tasa de sntesis de RNAr en los nuclolos de estos oocitos. 3. En las micrografas electrnicas se puede observar que las fibrillas de RNA contienen grumos y partculas acompaantes. Estas partculas constan de RNA y protena que participan en la conversin de los precursores de RNAr a su producto final RNAr y su ensamblado en subunidades ribosmicas. 4. En la figura 11-11, b, se puede notar que la regin de la fibra de DNA entre unidades de transcripcin adyacentes est desprovista de cadenas de RNA nacientes. Debido a que esta regin de agrupamientos de genes ribosmicos no se transcribe, se le conoce como espa-

CAPITULO 11 Utilizacin de la informacin gentica: de la transcripcin n la traduccin

445

ciador no transcrito. Los espaciadores no transcritos se presentan en varias unidades repetidas, grupos de genes, incluyendo los de RNAt, e histonas. Debido a su organizacin en fila, todos los genes del grupo pueden estar bajo control comn, de modo que se puede echar a andar o desconectar simultneamente toda una batera de genes.
Procesamiento del precursor de RNAr

Los ribosomas eucariotas tienen cuatro RNA ribosmicos distintos, tres en la subunidad grande y uno en la subunidad pequea. En el hombre, la subunidad grande contiene una molcula RNA 28S, una 5.8S y una 5S, en tanto que la subunidad pequea contiene una molcula RNA 18S.2 Tres de estos RNAr (285,18S y 5.8S) se derivan de un solo transcrito primario (denominado pre-RNA), mostrado en la figura 11-12. El RNAr 5S se sintetiza a partir de un precursor RNA separado fuera del nuclolo. Iniciaremos con el primer grupo de tres. Durante el procesamiento, varias enzimas que hidrolizan enlaces fosodister especficos del esqueleto de RNA desdoblan el pre-RNAr. Una de las peculiaridades del preRNAr, en comparacin con otros transcritos de RNA, es su alto grado de metilacin. En el momento que el precursor pre-RNAr sufre su primer desdoblamiento, ms de 100 grupos metilo se han aadido ya a la molcula. Casi todas las metilaciones ocurren sobre la ribosa, aunque unos pocos

2 El valor S (o unidad Svedberg) se refiere al coeficiente de sedimentacin del RNA; cuanto mayor sea el nmero, ms rpidamente se desplaza la molcula a travs de un campo de fuerza durante la centrifugacin y (para un grupo de molculas qumicamente similares) mayor ser el tamao de la molcula. Los RNA 28S, 18S, 5.8S y 5S consisten en nucletidos de longitud aproximada a 5 000, 2 000, 160 y 120 nucletidos, respectivamente.

radicales metilo se colocan sobre bases especficas. Los nucletidos que contienen los grupos metilo se localizan en posiciones especficas y se agrupan en porciones de la molcula. Todos los nucletidos del pre-RNAr metilados permanecen como parte de los productos finales, en tanto que las secciones no metiladas se destruyen durante el procesamiento. La presencia de los grupos metilo probablemente proteja estas regiones del RNA contra el desdoblamiento enzimtico, sea directamente o como resultado de cambios impuestos a !a estructura secundaria del RNA. Debido a que el RNAr sufre una metilacin tan intensa, se puede seguir su sntesis incubando clulas con el aminocido metionina, cuyos grupos metilo se marcan con istopos radiactivos. La metionina se emplea en el metabolismo como grupo donador de metilo; el grupo metilo se transfiere a la metionina mediante la accin de varias enzimas sobre un aceptor especfico, incluyendo el pre-RNAr. Cuando se suministra 14C-metionina a un cultivo de clulas de mamfero durante breve tiempo, se incorpora una fraccin considerable de radiactividad a la molcula de RNA 45S, que corresponde a una longitud de casi 13 000 nucletidos. El RNA 45S es precursor de las molculas 28S, 18S y 5.8S. La longitud combinada de los tres RNAr maduros es de aproximadamente 7 000 nucletidos, poco ms de la mitad del transcrito primario. Los intermediarios formados a lo largo de la va de procesamiento, desde el pre-RNAr 45S hasta el RNAr maduro, se pueden descubrir incubando brevemente clulas de mamfero con metionina marcada y luego siguiendo las clulas en un medio no marcado durante diferentes periodos (fig. 11-13). En este tipo de experimento, la primera especie en ser marcada es el transcrito primario 45S, observado luego de 10 minutos como un pico de radiactividad (lnea punteada) en la fraccin de RNA nucleolar. Luego de un breve periodo, la radiactividad aparece en varias molculas de

Rana

Ratn

25kb

FIGUKA 11-12. Unidad de transcripcin del RNAr. La parte superior del dibujo muestra el aspecto de una porcin del DNA procedente de un nuclolo conforme es transcrito por el RNAr. En la parte inferior se ilustra una de las unidades de transcripcin que codifica el RNAr en Xenopus y en el ratn. Las partes del DNA que codifican los productos RNAr maduros se muestran en azul. Las regiones de espaciador transcrito, o sea, porciones del DNA transcritas pero cuyos RNA correspondientes son degradados durante el procesamiento se muestran en amarillo. El espaciador no transcrito, situado entre las unidades de transcripcin, contiene la regin promotora en el lado 5' del gen y un amplificador (una regin de DNA que aumenta la velocidad de transcripcin). (Segn B. Sollner-Webb, Trends Biochem. Sci. 16:59, 991.]

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CAPITULO 11 Utilizacin de la informacin gentica; de la transcripcin a la traduccin

10

20

10

20

10

20

10

Nmero de fraccin FIGURA 11-13. Anlisis cintico de la sntesis y procesamiento del RNAr. Durante 10 minutos se incub un cultivo de clulas de mamfero con metionina marcada con 14C y a continuacin se observ en un medio sin radiactividad durante diferentes periodos, corno se indica en cada recuadro. Despus del seguimiento, las clulas se lavaron para liberarlas del istopo y se homogeneizaron para preparar las fracciones nucleolar y citoplsrm'ca. De cada fraccin se extrajo RNA que se analiz mediante ultracentrifugacin para separar el RNA segn su tamao (cuanto ms grande el RNA, ms prximo se encuentra al fondo del tubo, el cual corresponde a la fraccin 1). La lnea continua representa la absorbancia UV de cada fraccin celular que suministra una medida de la cantidad de RNA de cada tipo. Este perfil de absorbancia no cambia con el tiempo. La lnea punteada muestra la radiactividad en diferentes momentos durante el seguimiento. Las grficas de RNA nucleolar (perfiles de arriba) muestran la sntesis del precursor RNAr 45S y su subsecuente conversin a una molcula 32S, un precursor del RNAr 28S. Los otros productos principales del precursor 45S dejan el ncleo con gran rapidez y, por lo tanto, no se muestran de manera prominente en el RNA nucleolar. Los perfiles de abajo muestran el curso temporal de la aparicin de las molculas de RNAr maduras en el citoplasma. El RNAr 18S aparece en el citoplasma mucho antes que las especies 28S de mayor tamao, lo que se correlaciona con la rpida salida del primero desde el nuclolo. (Segn H. Greenberg y S. Penman, ]. Mol. Biol. 21:531, 1966.)

RNA ms pequeas {fig. 11-13), lo que indica el desdoblamiento del precursor ms grande en productos en la va hasta la formacin de las especies de RNA maduras. El intermediario de vida ms prolongada sedimenta a 32S y se observa como un pico distinto en el RNA nucleolar luego de 40 a 150 minutos. El RNA 32S sirve como precursor del RNAr 28S. Una de las vas en el procesamiento de la transcripcin primaria de RNAr se indica en la figura 11-14. El procesamiento del pre-RNAr se efecta conforme la molcula se asocia firmemente a las partculas de ribonucleoprotena {RNP), lo cual, como se indica en la mcrografa de la figura 11-11, c, ocurre incluso antes de completarse la transcripcin del precursor 45S. Las partculas de ribonucleoprotenas se ensamblan en el citoplasma y posteriormente se desplazan al interior del ncleo y despus a los nuclolos. La primera partcula RNP que se fija al transcrito RNAr contiene el RNAsn U3 que se enlaza al extremo terminal 5' del transcrito RNAr. Esta partcula de RNA se puede obser-

var como una "pelota" situada en el extremo externo de las fibrillas de RNA nacientes mostradas en la figura 11-11, c, donde cataliza la eliminacin del extremo 5' del transcrito (fig. 11-14). El nuclolo no slo es sitio de procesamiento de RNAr, sino tambin de ensamblado de las dos subunidades ribosmicas. Por consiguiente, conforme se procesa el RNA se asocian dos tipos de protenas: las protenas que permanecern en la subunidad ribosmica y las protenas del nuclolo que interactan transitoriamente con los RNAr intermedios y slo se requieren para el procesamiento. Adems de las enzimas que desdoblan con xito al RNA, se cree que este ltimo grupo tambin contiene protenas que protegen los sitios donde ocurre el desdoblamiento y otras que hacen a dichos sitios ms accesibles al procesamiento enzirntico. Iniciaremos esta seccin acerca de la sntesis del RNAr con una descripcin de la estructura microscpica del nuclolo, al cual regresamos. El nuclolo tiene estructura

CAPITULO 11 Utilizacin de la informacin gentica: de a transcripcin a la traduccin

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FIGURA 11-14. Esquema para el procesamiento del RNA ribosmko de mamferos. El transcrito primario para RNAr es una molcula 45S de casi 13 kilobases. Los cuatro principales sucesos de desdoblamiento que ocurren durante el procesamiento de este pre-RNAr estn indicados por los nmeros en crculos. El desdoblamiento del transcrito primario en el sitio 1 elimina la secuencia terminal principal 5' y produce un intermediario 41S. El segundo desdoblamiento puede ocurrir en el sitio 2 o en el 3, segn el tipo de clula. El desdoblamiento en el sitio 3 genera un intermediario 32S observado en las curvas de la figura previa. Los pasos finales del procesameinto implican la separacin de las secciones 28S y 5.8S entre s. (Segn R.P. Pernj, J. Cell Biol. 91:29s, 1981; con permiso de Rockefeler University Press.)

'

5.8S

simple y carece de un componente membranoso, por lo que es uno de los organelos celulares mejor comprendidos. La parte central fibrilar del nuclolo (fig. 11-10) consiste en transcriptos de DNAr y RNAr nacientes. Los granulos que rodean este centro constan de subunidades ribosmicas en varias etapas de maduracin. Cuando se suministra a las clulas 3H-uridina y se practica autorradiografa en diferentes momentos de la incubacin (como se describi para las protenas secretorias en la pgina 279), la radiactividad aparece primero en las regiones fibrilares, lo que indica que son los sitios de sntesis de RNA. Como sera de esperar, conforme el tiempo de incubacin aumenta, la radiactividad se desplaza hacia afuera al interior de las regiones granulares. Sntesis y procesamiento del RNAr 5S El RNAr 5S, de 120 nucletidos de largo aproximadamente, forma parte de la subunidad ribosmica grande. En los ribosomas de procariotes y eucariotes se encuentra una especie de RNA similar. En clulas eucariotas, los genes RNAr 5S estn totalmente separados de los genes que codifican los otros RNAr y se localizan fuera del nuclolo. Estos genes se organizan en fila con las posiciones transcritas, alternando con espaciadores no transcritos para formar unidades repetidas (fig. 11-15) anlogas a las unidades repetidas que codifican los RNAr 18S y 28S. La RNA polimerasa III transcribe os genes RNAr 5S. El extremo 5' del transcripto primario es idntico al del RNAr 5S maduro, pero el extremo 3' de ordinario contiene nucletidos extra que son eliminados durante el procesamiento. Luego de su sntesis, el RNAr 5S se transporta al nuclolo para unirse a los otros componentes que participan en el ensamblado de subunidades ribosmicas. De las tres polimerasas, la RNA polimerasa III raras veces se enlaza a un sitio promotor localizado dentro de la porcin transcrita del gen en vez de un sitio hacia arriba en el flanco 5' del gen, que sera el sitio "lgico" donde la enzima se enlaza inicialmente al DNA, El uso de un promotor interno se demostr claramente introduciendo genes

RNAr 5S modificados en la clula husped y determinando la capacidad del DNA para servir como plantilla de la polimerasa III del husped. Se observ que poda eliminarse toda la regin del flanco 5' y que la polimerasa todava transcriba el DNA iniciador en el sitio normal de inicio. Sin embargo, cuando la supresin incluye la parte central del gen (desde el nucletido 50 al 80 de los casi 120 pares de bases del gen), la polimerasa no transcribe el DNA y ni siquiera se enlaza al mismo. Si el promotor interno del gen RNAr 5S se introduce en otra regin del genoma, el nuevo sitio se convierte en plantilla para la transcripcin de la RNA polimerasa III. Se requieren tres factores distintos de transcripcin antes que la RNA polimerasa III inicie la transcripcin de un gen codificador de RNArSS. Uno de los factores (TFIIIA) es especfico para iniciar la transcripcin de RNA 5S, en tanto que los otros dos factores (TFIIIB y TFIIIC) son necesarios para iniciar la transcripcin de todos los RNA sintetizados por la RNA polimerasa III.

RNA de transferencia
Se estima que las clulas eucariotas tienen aproximadamente 60 especies diferentes de RNA de transferencia, cada una

Hindlll

H/ndIII

FIGURA 11-15. Unidad repetida del DNA que contiene el gen RNAr 5S en Xenoptts. El gen que codifica el RNAr 55 se muestra en azul. El fragmento de DNA mostrado en esta figura se gener por tratamiento del DNA genmico (DNA extrado de los cromosomas) con la enzima de restriccin HmdlII. La porcin roja representa un sitio en el cual pueden existir algunas secuencias pequeas repetidas.

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CAPITULO 11 Utilizacin de n informacin gentica; de la transcripcin a la traduccin

codificada por una secuencia de DNA repetida varias veces dentro del genoma. El grado de repeticin vara con el organismo; se estima que las clulas de una levadura tienen casi 300 genes de RNAt en total, la mosca de la fruta casi 850 y el hombre cerca de 1 300. El RNA de transferencia se sintetiza a partir de genes localizados dentro de pequeos grupos dispersos alrededor del genoma. Un soio grupo tpicamente contiene mltiples copias de diferentes genes de RNAt, e inversamente, la secuencia de DNA que codifica un RNAt de ordinario se encuentran en ms de un grupo. Dentro de un grupo, el DNA (DNAt) consta principalmente de secuencias espaciadoras no transcritas junto con el RNAt que codifica las secuencias situadas a intervalos irregulares en disposicin en serie repetida (fig. 11-16). La RNA polimerasa III transcribe los RNAt, igual que el RNAr 5S, y la secuencia promotora del gen se sita dentro de la seccin codificante de ste en vez de localizarse en su flanco 5'. El transcrito primario de una molcula de RNA de transferencia es mayor que el producto final y deben seccionarse los fragmentos sobre ambos extremos 5' y 3' del RNAt precursor (y un fragmento interior en algunos casos). Todo RNAt maduro posee un tripleto con secuencia CCA en su extremo 3'. Luego de procesar el RNAt, los tres nucletidos se aaden por medio de enzimas. RNA mensajero Las molculas de RNA de una clula constan de RNAr, RNAt y RNAsn. Pero cuando se incuban clulas eucariotas durante breve tiempo (cinco minutos) en 3 H-urdina o 32Pfosfato, la cantidad de radiactividad incorporada a estos RNA particulares o sus precursores es relativamente escasa {fig. 11-17, a). Casi toda ia radiactividad se incorpora a un grupo mayor de molculas de RNA que muestran las siguientes propiedades. 1) Peso molecular elevado (ms de SOS o 50 000 nucletidos); 2) en conjunto, corresponden a RNA con diversas secuencias de nucletidos (heterogneos); y 3) slo se encuentran en el ncleo. Debido a estas propiedades, este RNA se conoce como RNA nuclear heterogneo (RNAhn). Cuando se colocan clulas incubadas en 3Huridina o 32 P-fosfato durante un breve lapso (pulso) en un medio sin elementos marcados y se les "sigue" durante una hora aproximadamente antes de destruirlas y extraer su RNA, la radiactividad desciende bruscamente en los RNA nucleares grandes y aparece en los RNA citoplsmicos ms pequeos (fig. 11-17, b).

Q O

(a)

Nmero de fraccin

I o
Q O

5.0

3.0

1.0
10
fW

20

30

r;

Nmero de fraccin FIGURA 11-17. Formacin de RNA nuclear heterogneo (RNAnh) y su conversin a RNAm ms pequeo, a) Curvas que muestran el patrn de sedimentacin del RNA total extrado de las clulas sanguneas de patos luego de exponerlo a fosfato marcado con 32P durante 30 minutos. El RNA ms grande es el que se desplaza mayor distancia durante la centrifugacin y se deposita lo ms cercano al fondo del tubo. La absorbancia (lnea de color prpura) indica la cantidad total de RNA en diferentes regiones del tubo de centrifugacin, en tanto que la lnea roja indica la radiactividad correspondiente. Es evidente que la mayor parte del RNA recin sintetizado es muy grande, mucho mayor que los RNAr 28S y 18S estables. Los RNA grandes son los RNAnh. b) Perfiles de absorbancia y radiactividad del RNA extrado de clulas sometidas a un pulso de 30 minutos en un medio con radiactividad como en la parte n, luego seguido por tres horas en presencia de actinomicina D, que evita la sntesis de RNA adicional. Es evidente que el RNAnh grande se ha procesado para formar productos RNA ms pequeos. (Segn G. Attardi, H. Parns, M}. Hwang y B. Attardi, J. Mol. Biol. 20:160, 1966.)

1 kb
Tir*__-!_- U

2 kb I

Met-A Met-B >-

-4-1

]
Asn

Fen

3 kb 1 Leu>- Lis>GD O Ala

FIGURA 11-16. Disposicin de los genes que codifican RNA de transferencia en Xenopus. Segmento de 3.18 kilobases de DNA genmico que muestra la disposicin de varios genes de RNAt y de los espaciadores. (Segn S.G. Clarkson y cois., en D.D. Brmun, ed., Developmental Biology Using Purified Genes, Academic Press, 1981.)

Cuando se efectuaron por primera vez estos experimentos en el decenio de 1960, se interpretaron como la demostracin de una relacin "precursor-producto" entre el RNAnh del ncleo y los RNAm citoplsmicos. Segn estos estudios, se propuso que el RNAm no se sintetiza como cuando se une a ribosornas citoplsmicos, sino ms bien como parte de molculas mucho mayores de RNAnh. Posteriormente esta interpretacin fue confirmada por los resultados de muchos trabajos de investigacin en los ltimos 25 aos. Por lo tanto, aunque el RNAm (y sus precursores RNA nucleares heterogneos) slo constituye un pequeo porcentaje de! RNA total, en la mayor parte de las clulas eucariotas significa, en todo momento, un elevado porcentaje del RNA sintetizado en dichas clulas ffig. 11-17, a). El RNAnh es sumamente

CAPITULO 11 Utilizacin de la informacin gentica: de la transcripcin a la traduccin

449

inestable (por su rpido procesamiento en el ncleo); el RNAm es relativamente inestable (debido a su descomposicin en el citoplasma); los RNAr y RNAt son relativamente estables, y por lo tanto se acumulan gradualmente y as llegan a ser la especie predominante dentro de la clula.
Mecanismo utilizado para la transcripcin de RNAm

Ovalbmina de pollo Globina^ de conejo Globina/3 principal de ratn

\i/
JtX

-\j>\j

CCCCAGGGCTCAGCCAGTGTCTGTCA GCAGAGCAGGGCAGCTGCTGCTAJCACT TGAGGTAGGATCAGTTGCTCCTCSCATTT

La RNA polimerasa II sintetiza a todos los RNAm precursores con ayuda de algunas protenas auxiliares denominadas factores generales de transcripcin, cuyo papel preciso an no se define. Estas protenas se conocen como factores "generales" de transcripcin porque son las mismas requeridas por la polimerasa para la transcripcin de diversos arreglos de genes. El promotor de la polimerasa II se sita en el lado 5' de la unidad de transcripcin. En la mayor parte de los genes estudiados, la porcin ms crtica del promotor (denominada elemento promotor central) se sita entre las bases 24 y 32 hacia arriba a partir del sitio en el cual se inicia la transcripcin (fg. 11-18, a). Esta regin contiene una secuencia de bases idntica a otra del oligonucletido 5'-TATAAA3', tambin conocida como compartimiento TATA. El compartimiento TATA del DNA es el sitio donde se ensambla un complejo preinicial que contiene los factores generales de transcripcin y la polimerasa. El complejo preinicial debe ensamblarse antes de comenzar la transcripcin del gen. El primer paso en el ensamblado del complejo preinicial es la unin de una protena, denominada protena de enlace TATA (PET), que reconoce especficamente la secuencia de DNA de los promotores eucariotas. El dominio de enlace a DNA de la PET se compone de una lmina /3 de 10 cadenas (pg. 56), incurvada para formar una estructura en forma de silla de montar donde cabalga el DNA (fig. 11-18, b). La PET no acta por s misma, ms bien sirve como subunidad para algunos factores de transcripcin de mltiples protenas. Cuando forma parte del complejo multiprotena TFIID (factor de transcripcin de la polimerasa II de la protena D), la PET reconoce especficamente la secuencia de DNA de un promotor polimerasa II. La cristalografa de rayos X ha revelado que el enlace de la PET a un promotor polimerasa II causa deformacin espectacular de la conformacin del DNA (fig. 11-18, c). El DNA enlazado genera un claro retorcimiento en toda su longitud, y el doblete de DNA se desenrolla en un tramo de ocho pares de bases. Es probable que este cambio de conformacin del DNA desempee un papel importante para el subsecuente inicio de la transcripcin, que requiere una separacin de la doble cadena de DNA para permitir la entrada de la polimerasa a la cadena que acta como plantilla. Por lo tanto, el primer paso en la sntesis de un complejo preinicial para polimerasa II es la unin de TFIID al promotor de DNA. El enlace de TFIID prepara el escenario para la unin ordenada de otros factores de transcripcin y de la polimerasa para formar el complejo preinicial completo. En la figura 11-19 se muestra un modelo para el enlace secuencial de estos diferentes factores. Una vez iniciada la transcripcin, algunos de los factores generales (especficamente TFIIB y TFIID) quedan detrs del promotor y otros permanecen asociados a la polimerasa conforme avanza sobre la plantilla (fig. 11-20). En tanto la TFIID permanezca enlazada al promotor, las molculas adicionales de RNA polime-

(a) NH5

COOH

FIGURA I 1 -1 i. El segmento TATA en los promotores eucariotas. a) Secuencia de nucletidos de la regin justo arriba del sitio donde se inicia la transcripcin en tres genes eucariotas diferentes. El segmento TATA est indicado por el sombreado verde y el nucletido en el cual se inicia la transcripcin por el sombreado rojo. i>) Estructura tridimensional de la protena de unin a TATA (PUT) de la planta en floracin Arabidopsis thaliana colocada a horcajadas sobre el DNA. c) El enlace de PUT se acompaa de notable distorsin en la conformacin de la hlice de DNA que desenrolla un tramo de ocho pares de bases, (b: Segn S. Burley y cois. Cold Spring Harbor Symp. Quant Biol. 58:124, 1993; c: reimpreso con permiso de K. Struhl, Science 263:1104, 1994. Copyright 1994 por American Association for the Aduancement of Scieyce,)

rasa pueden fijase al sitio promotor e iniciar sin retraso vueltas adicionales de transcripcin. El dominio C terminal (DCT) de la subunidad ms grande de RNA polimerasa II tiene una estructura poco habitual; consta de una secuencia de siete aminocidos (Tir-SerPro-Tre-Ser-Pro-Ser-) repetida una y otra vez. En mamferos, el DCT consta de 52 unidades repetidas de este heptapptido. De los siete aminocidos, todos menos las dos prolinas son candidatos primarios para fosforilacin mediante proteincinasas. Los estudios indican que la RNA polimerasa que ensambla el complejo preinicial no est fosforilada, en tanto que la misma enzima que participa en la transcripcin est intensamente fosforilada; todos los gru-

450

CAPITULO 11 Utilizacin de la informacin gentica: de la transcripcin a la traduccin -- Sitio de inicio

DNA

TFIIE TFIIjlTFIIF
TFIID

TATA TFIID TFIIH

DNA

DNA

DNA

DNA

TATA

TFIIF RMAI1 polimerasa (RNAP1I)

DNA

FIGURA 11-20. Inicio de la transcripcin por la RNA polimerasa II precedida por fosforilacin del dominio terminal C (DTC). Se cree que la fosforilacin de la polimerasa provoca la separacin del complejo de transcripcin de los factores generales de transcripcin que permanecen en el segmento TATA.

TRIE TFUjlTFIIF TFIID *- Sitio de inicio

DNA
TATA FIGURA 11-19. Etapas propuestas en el ensamblado del complejo de inicio para la RNA polimerasa II en el segmento TATA de un promotor eucariota. La polimerasa en s se denota con RNAPII; los otros componentes son los diferentes factores generales de transcripcin requeridos en el ensamblado de todo el complejo. (Segn B.M.. Herschbach y A.D. Johnson, reproducido con permiso de Annual Reviciv of Cell Biology, vol. 9, 1993, por Annual Revieras Inc.)

cadenas de DNA del doblete para que la polimerasa prosiga a lo largo de la cadena sencilla de la plantilla. De igual manera que el segmento Pribnow de los procariotes, al cual se parece, el segmento TATA determina el sitio preciso donde se inicia la transcripcin. Si se alteran o borran partes del segmento y luego se ensayan como plantillas en diferentes tipos de sistemas de prueba, la transcripcin se inicia en varios sitios anormales. Otros muchos sitios del gen localizados hacia arriba desempean un papel clave para determinar a qu velocidad inicia la enzima nuevos turnos de transcripcin a partir del segmento TATA. El papel de estos sitios se analiza en el captulo acerca del control de la expresin de genes (seccin 12-3). ^
Estructura de los RNAm

pos fosfato se localizan en el DCT (fig. 11-20). Pareciera que la RNA polimerasa II se fosforilara justo antes de iniciar la transcripcin. Los datos indican que la fosforilacin de la polimerasa es catalizada por una subunidad de uno de los factores de transcripcin (TFIIH) que acta como proteincinasa. La fosforilacin de la polimerasa puede actuar como desencadenante para separar la enzima de los factores de transcripcin que permanecen enlazados al compartimiento TATA y permitir que la enzima se desplace sobre la plantilla de DNA. Se cree que una de las otras subunidades de TFIIH desempea un papel clave en la separacin de las

Todos los RNA mensajeros comparten ciertas propiedades: contienen una secuencia continua de nucletidos que codifica un polipptido especfico; se encuentran en el citoplasma y estn fijos a ribosomas o tienen capacidad para unirse a ellos para ser traducidos. La mayor parte de los RNAm contienen un segmento significativo no codificante, o sea, una porcin que no controla el ensamblado de aminocidos. Por ejemplo, casi 25% de cada RNAm de globina consta de regiones no codificantes, no traducidas (fig. 11-21). Las porciones no codificantes se observan en los extremos 5' y 3' de un RNA mensajero y contienen secuencias con un papel regulador importante (seccin 12-3). Adems de nucletidos no codificantes, los RNAm eucariotas presentan modificaciones especiales en sus extremos terminales 5' y 3' no observadas en los mensajeros procariotas. El extremo 5' de

CAPITULO 11 Utilizacin de la informacin gentica: de la transcripcin a la traduccin Cdigos para un polipptido de 146 aminocidos de largo
5' Cap j ,-''
' 5'

451

Apndice poli(A)

^ Regin codificante '

3' ''

Regin no traducida

Regin no traducida

2'-0-metil ribonuclesido
OH OH\CH,-0-P-0-P-0-P-0-CH

OH

mRNA

F1GLKA 1 1 - 2 1 . Estructura del RNAm de la globina f humana. EL RNAm contiene un casquete de metilguanosina 5', regiones no codificantes 5' y 3' que flanquean el segmento codificante, y un apndice poli(A). La longitud de cada segmento se marca como nmero de nucleticos. La longitud del apndice po(A) es variable. Tpicamente comienza a una longitud de casi 250 nucletidos y poco a poco se reduce en longitud, como se analiza en el captulo 12. Se muestra la estructura del casquete 5'.

un RNAm eucariota tiene un "casquete" de guanosina mediada, en tanto que el extremo 3' tiene una cadena de 50 a 250 residuos de adenosina que forman un apndice poli(A) (g. 11-21). En breve describiremos cmo adquieren los RNAm sus caractersticos extremos terminales especializados 5' y 3'. Sin embargo, primero es necesario invertir un poco de tiempo para entender cmo se forman los RNAm en la clula.
Desdoblamiento de genes: un hallazgo inesperado

Casi en seguida del descubrimiento de los RNAnh se propuso que ese grupo de RNA nuclear que con rapidez capta el material marcado era precursor de los RNAm citoplsmicos {pg. 449). Conforme se adquiri mayor conocimiento acerca de los RNAnh durante los decenios de 1960 y 1970, se estableci con mayor firmeza una relacin precursorproducto entre el RNAnh y el RNAm. Por ejemplo, se demostr que el RNAnh, igual que los RNAm, contiene un casquete 5' de metilguanosina y un apndice polifA) 3' y, todava de mayor importancia, que la secuencia especfica

de RNAm estaba presente en la poblacin de RNAnh. El principal punto de controversia fue la diferencia de tamao de los RNA de ambas poblaciones: los RNAnh son varias veces ms grandes que los RNAm (fjg. 11-22). Por qu las clulas sintetizan molculas enormes como precursores de versiones mucho ms pequeas? Los primeros estudios del procesamiento de RNA ribosmico demostraron que poda formarse RNA maduro a partir de precursores de mayor tamao. Recordemos que durante el procesamiento de los RNAr (fig. 11-14) se eliminan los segmentos grandes de los lados 5' y 3' de diferentes intermediarios para producir los RNA finales maduros. Se pens que una va similar pudiera explicar el procesamiento de RNAnh para formar RNAm. Infortunadamente, los RNAm constituyen una poblacin tan diversa que casi es imposible seguir los pasos del procesamiento de una sola especie de RNAm como se ha hecho para los RNAr. El problema se resolvi gracias a una inesperada secuencia de acontecimientos. Aun en 1977, los bilogos moleculares asuman que una secuencia lineal continua de nucletidofi del RNA mensajero es complementaria de una secuencia continua de nucletidos que compone la cadena de DNA de un gen. Por entonces, Philip Sharp y sus colegas del MIT, y Richard Roberts y colaboradores, de Cold Spring Harbor Laboratories de Nueva York, hicieron un notable descubrimiento. Ambos grupos de investigadores observaron que las molculas de RNA se transcriben a partir de segmentos discontinuos de DNA, segmentos que estaban separados entre s a lo largo de ia cadena de la plantilla de DNA. Las observaciones iniciales ms importantes se hicieron durante el anlisis de la transcripcin del genoma de un adenovirus. El adenovirus es un patgeno capaz de infectar gran variedad de clulas de mamfero. Se observ que algunos de los diferentes RNA mensajeros del adenovirus se componen de los mismos 150 a 200 nucletidos terminales. Podra esperarse que esta secuencia principal represente un tramo de nucletidos repetidos localizados cerca de la regin promotora de cada uno de los genes para estos RNAm. Sin embargo, un anlisis ms atento revel que la secuencia principal 5' no es complementaria de una secuencia repetida y, ms an, ni siquiera es complementaria de un tramo continuo de nucletidos en la plantilla de DNA. En vez de eso* la secuencia principal se transcribe a partir de tres segmentos de DNA distintos y separados (representados por los bloques x, y y z en la figura 11-23). Las regiones de DNA situadas entre estos bloques, conocidas como secuencias interpuestas (Ij a 13 en la figura 11-23), por alguna razn estn ausentes en el RNAm correspondiente. Se podra argumentar que la presencia de secuencias interpuestas es una peculiaridad de genomas virales, pero esta observacin bsica pronto se ampli a los propios genes celulares. Segn se analiz en la pgina 418, las bacterias contienen enzimas de restriccin que reconocen y desdoblan molculas de DNA en el sitio de ciertas secuencias de nucletidos. A mediados del decenio de 1970 se us una gran variedad de dichas enzimas para analizar los sitios de desdoblamiento (sitios de restriccin) bien estudiados presentes en algunos genes y alrededor de ellos. Alee Jeffreys y Richard Flavell, de la Universidad de Amsterdam, estudia-

452

CAPITULO 11 * Utilizacin de la informacin gentica: de la transcripcin a la traduccin

iVi:-'.V-V/fc'%^;:^;-vl^.^Vf's\v;>-;^^^ ''"'W v ii*'" \V--::v:/;n-V-;vr:-;^-^ ::.'-.--.-.:.A;v:"'--*-'V.-;C^K; 1M .>-*;.};= ':-,- :--::*'"-:'ViA>;.-.: ^:i.v.':.v"-=v--=:;;..V-';. i '~

_.

RNAnh .RNAm
(X0.5)

3G (O

24

18

12

0.5

Tamao molecular (kb}

KICl'KA 1 1-22. Diferencia de tamao entre las poblaciones de RNAnh y RNAm. a,b) Micrografas electrnicas de preparaciones de molculas poH(A)-RNAm (a) y poli(A)-RNAnh (b) con sombreado metlico. Se muestran los tamaos representativos de los diferentes tipos. La molcula de referencia es el DNA viral <I>X174. c) Distribucin de los tamaos de RNAnh y RNAm de las clulas L de ratn segn se determinan mediante sedimentacin en gradiente de densidad. La lnea roja representa el RNAnh que rpidamente muestra la marca, en tanto que la lnea prpura representa los RNAm aislados de los polirribosomas luego de cuatro horas del periodo de marcado. La abscisa se convirti de nmeros de fraccin (indicado por los puntos) a tamao molecular calibrando los gradientes. (Sc^iin folm A. Bnntlc v W. E. Hahn, Cell 8:145, 1976; con permiso de Cei! Press.)

ron el DNA de conejo que contena el gen de globina /?. Observaron que el DNA posee un sitio de restriccin para la enzima BamHl (B en la figura 11-24) localizada aproximadamente a 700 pares de bases a partir del sitio de restriccin para la enzima EcoRl (E en la figura 11-24). En notable contraste, cuando trataron una preparacin de globina DNAc fun DNA complementario sintetizado a partir del RNAm purificado para globina/? por la enzima transcriptasa inversa, seccin 17-12) con estas mismas enzimas, los sitios correspondientes B y E se localizaron a una distancia de 67 nucletidos (lnea de abajo en la figura 11-24). Al parecer, el gen globina contiene una secuencia interpuesta de casi 600 pares de bases localizada directamente dentro de una porcin del gen que codifica la secuencia de aminocidos del polipptido globina. Un anlisis posterior indic que este inserto no codificante estaba presente en el DNA extrado de varios tejidos del conejo, incluyendo espermatozoides, y por lo tanto no tiene relacin con la expresin del gen. Ms tarde, la determinacin de la secuencia completa del gen de globina /? demostr que contiene una segunda secuencia interpuesta ms pequea no descubierta en los estudios iniciales. Los conocimientos acerca de la estructura del gen logrados con el gen de globina pronto se extendieron a otros genes, y se demostr que la presencia de genes con secuencias interpuestas, llamados genes cortados, es nas la regla que la excepcin. Las partes de un gen cortado que contribuyen a un producto RNA maduro se denominan exones, en tanto que las partes que corresponden a las secuencias interpuestas se denominan intrones. Los genes cortados son ms abundantes en los eucariotes, tanto en eucariotes ms simples como en levaduras y protozoarios, y en los reinos animal y vegetal. (Sin embargo, los intrones de los eucariotes inferiores tienden a ser ms escasos y de menor tamao que los de plantas y animales.) Se observan en todo tipo de gen, incluyendo RNAt, RN Ar, RNA vira! y genes que codifican protenas celulares. No obstante, la mayor parte de los genes que codifican RNAt y RNAr no son genes cortados y algunas protenas (incluyendo histonas, intcrfern y ciertos polipptidos virales} tambin son codificadas por secuencias de DNA continuas. El descubrimiento de los genes con secuencias interpuestas plante de inmediato la pregunta de cmo dichos genes pueden producir RNA mensajero que carezca de esas secuencias. Una posibilidad era que las clulas produjeran un transcrito primario que correspondiera a toda la unidad de transcripcin y que las porciones de RNA correspondientes a las secuencias de intervencin del DNA de alguna manera fueran eliminadas. Si este era el caso, entonces en el transcrito primario debieran estar presentes los segmentos correspondientes a los intrones. Esta explicacin tambin debiera suministrar una razn acerca del tamao mucho mayor de las molculas de RNAnh, en comparacin con las molculas de RNAm que finalmente producen. La investigacin acerca del RNA nuclear ha proseguido en estos ltimos aos hasta el punto que se han determinado las dimensiones de unos pocos precursores de RNAm (preRNAm). Por ejemplo, se observ que la secuencia de globina est presente en una molcula de RNA nuclear que sedimenta a 15S, a diferencia del RNAm de globina final cuyo coefi-

CAPITULO 11 Utilizacin de la informacin gentica: de la transcripcin a la traduccin V

DNA

453

\2

Gen exn

Exn Transcrito primario 5'ppp

Exn Procesamiento 7mGppp intermedio

RNAm maduro

x y z 7mGppp

Exn poli A

F I < ; n \ . Descubrimiento de las secuencias interpuestas. En la parte de arriba se muestra el genoma de un adenovirus. Los bloques de la secuencia discontinua marcados x, y i/ z aparecen en disposicin continua en el RNAm que codifica varios polipptidos, como la protena exn. Segn se analiza ms adelante en el texto, la conversin del precursor a RNAm implica eliminar (excisin) as secuencias interpuestas (Ii[3) y ligar las porciones restantes para producir una molcula de RNA continua (abajo). En la figura 11-36 se muestran los pasos del proceso.

I_L

F M l ' I . V I 1-24. Descubrimiento de las secuencias interpuestas en un gen eucariota. Mapa de los sitios de desdoblamiento por enzimas de restriccin en la regin del gen de globina/i de conejo (arriba) y el correspondiente mapa de DNAc preparado del RNAm de globina /? (abajo). (Un DNAc es un DNA formado f vitro por la transcriptasa inversa utilizando RNAm como plantilla. Por lo tanto, el DNAc posee la secuencia complementaria al RNAm.) Las letras indican los sitios donde las diferentes enzimas ce restriccin separan al DNA. Segn los sitios donde las enzimas rompen a los dos DNA, es evidente que el DNA preparado a partir del genoma tiene una regin cuantificable ausente del correspondiente DNAc (y por lo tanto ausente del RNAm a partir del cual se produjo el DNAc). (Segn A.}. Jeffreys y R.A. Flnvel, Cell 12:1103, 1977; con permiso de Cc!l Press.)

cente de sedimentacin es de IOS. Shirley Tilghman, Philip Leder y sus colaboradores, de los National Institute of Health en Estados Unidos, emplearon una ingeniosa tcnica (conocida como formacin de una asa R) para determinar la relacin fsica entre los RNA de globina 15S y IOS y obtener informacin acerca de la transcripcin de genes cortados. Recordemos de la pgina 402, que las cadenas simples de DNA complementario pueden enlazarse especficamente entre s. Tambin pueden enlazarse entre s el DNA de una sola cadena y las molculas de RNA, siempre y cuando posean secuencias complementarias de nucletidos; esta es la base de la tcnica de hibridacin de DNA-RNA analizada en la seccin 17-12 (el complejo DNA-RNA se denomina hbrido). Tilghman y sus colaboradores observaro,p en el microscopio electrnico que cuando se formaba un hbrido entre un fragmento de DNA que contiene el gen de globina y el RNA 155, las dos molculas se enlazaban entre s para formar un hbrido de DNA-RNA de doble cadena continua (fig. 11-25, a). En contraste, cuando se incubaba el mismo fragmento de DNA con RNAm de globina IOS maduro, emerga un gran segmento de DNA en el centro de la regin codificante para formar una asa de doble cadena (fig. 11-25, b). Esta asa se formaba como resultado de la interposicin en el DNA de una gran secuencia no complementaria de cualquier parte del mensaje globina ms pequeo. Al parecer, el RNA 15S en realidad contiene segmentos correspondientes a secuencias interpuestas en los genes que son eliminadas durante la formacin del RNAm IOS. Ms o menos al mismo tiempo se efectu un experimento de hibridacin de tipo similar entre el DNA que co-

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CAPITULO 11 Utilizacin de la informacin gentica: de la transcripcin a la traduccin

Hbrido DNA-RNA

DNAde cadena sencilla desplazado

(a)

DNA de cadena sencilla desplazado DNA de doble ia del intrn

Hbrido DNA-RNA

DNAde cadena sencilla desplazado

(b) KIGlilA 11-25. Visualizacin de una secuencia interpuesta en el gen de globina. Micrografas electrnicas de hbridos formados entre: a) RNA 15S precursor de globina y DNA de un gen de globina, y b) RNAm IOS de globina y el mismo DNA como en a. Las lneas de color indican las posiciones de las molculas de RNA. El RNAm precursor equivale en longitud y secuencia al DNA del gen de globina, pero el RNAm 105 carece de una porcin presente en el DNA del gen. Estos resultados sugieren que el RNA 155 es procesado al eliminar la secuencia de RNA interno y volviendo a unir las regiones de los flancos. (Segn Shirley M. Tilghman \j cois. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 75:1312, 1978.)

difica la ovalbmina, una protena que se encuentra en los huevos de gallina, y su correspondiente RNAm. El hbrido formado entre el DNA y el RNAm de la ovalbmina contiene 7 asas distintas que corresponden a 7 secuencias interpuestas (g. 11-26). Consideradas en conjunto, las secuencias interpuestas equivalen a casi tres veces ms el DNA que las ocho porciones codificadas combinadas (exones). Estudios subsecuentes han revelado que los intrones de un gen promedian 4 a 10 veces la longitud de los exones, y por esta razn las molculas del RNAnh en condiciones tpicas son mucho ms largas que las de RNAm. Un gen de ratn se extiende ms de 20 veces que el DNA necesario para codificar sus correspondientes mensajes, y el gen para colgena tipo I contiene ms de 50 secuencias interpuestas. Estos y otros datos suministraron fuertes pruebas para proponer que la formacin del RNAm ocurre por supresin

de la secuencia interna de ribonucletidos a partir de un pre-RNAm mucho ms grande. Volvamos a los pasos por los cuales ocurre esto.
Procesamiento del RNA mensajero

La RNA polimerasa II ensambla un transcrito primario complementario del DNA de toda la unidad de transcripcin. A continuacin este transcrito se procesa en el ncleo para formar RNAm maduro que se transporta al citoplasma. El examen de genes transcriptores activos en el microscopio electrnico indica que los transcritos de RNA se asocian a diferentes protenas huspedes y a numerosas partculas distintas, mientras an se encuentran en proceso de sntesis (g. 11-27). Estas partculas constan de protenas y ribonucleoprotenas, e incluyen los agentes encargados de convertir el transcrito primario en el mensajero maduro. Los pri-

CAPITULO 11 Utilizacin de la informacin gentica: de a transcripcin a a traduccin

455

FIGURA 11-26. Secuencias interpuestas en el gen de ovalbmina. Micrografa electrnica de un hbrido formado entre el RNAm de ovalbmina y un fragmento de DNA genmico de pollo que contiene el gen de ovalbmina. El hbrido mostrado en esta microfotografa es similar en naturaleza al de la figura 11-25, b. En ambos casos, el DNA contiene toda la secuencia del gen y por lo tanto se aisl directamente del genoma. En contraste, el RNA fue completamente procesado y las partes transcritas de las secuencias interpuestas fueron eliminadas. Cuando el DNA gcnmico y el RNAm se hibridizan, las porciones de DNA no representadas en el RNAm forman asas. Se pueden observar la asas de las siete secuencias interpuestas (A-G). (Cortesa de Fierre Chambn.)

meros pasos de este proceso de conversin incluyen la adicin de un casquete 5' y el apndice poli(A) 3'. Casquete 5' y apndices poli(A). El extremo 5' de todos los RNAm posee inicialmente un trifosfato derivado del primer trifosfato de nuclesido incorporado en el sitio

donde se inicia la sntesis de RNA. Una vez que se forma el extremo 5' de un precursor RNAm mediante la accin de la RNA polimerasa II, varias enzimas actan para modificar ese extremo de la molcula (fig. 11-28). En el primer paso, se elimina el ltimo de los tres fosfatos convirtiendo el extremo

FIGURA 1 1 - 2 7 . Asociacin de protenas con las molculas preRNAm nacientes para formar fibrillas de ribonucleoprotenas. a) Micrografa electrnica de una unidad de transcripcin no ribosmica. b) Trazo para interpretar la micrografa mostrada en la parte a. La lnea punteada representa la cadena de croinatina, la lnea slida representa fibrillas de ribonucleoprotena (RNP) y los crculos slidos representan partculas de RNP relacionadas con las fibrillas. Las partculas de RNP no se distribuyen al azar a lo largo del transcrito naciente, sino ms bien se enlazan a sitios especficos donde tiene lugar el procesamiento de RNA. (Segn Ann L. Beyer, Osear L. Miller, }r. y Steven L. McKnight, Cell 20:78, 1980; con permiso de Cell Press.)

(a)

(b)

456

CAPITULO 11 Utilizacin de la informacin gentica: de la transcripcin a a traduccin

Transcrito primario

Metilo

Casquete de guanina

Apndice po(A)

11-28. Etapas en la adicin de un casquete de metilguanosina 5' y un apndice poli(A) 3' a un pre-RNAm. El extremo 5' del prc-RNAm naciente se enlaza a una fosfohidrolasa (paso 1) que elimina el grupo fosfato terminal. En el paso 2, una guanilil transferasa aade un residuo de guanina en orientacin inversa mediante una unin de 5' a 5'. En el paso 3, a los grupos metilo se les aade tanto el casquete de guanina terminal como el nucletido situado en el extremo del RNA naciente. En el extremo 3' del pre-RNAm ocurre una serie muy diferente de acontecimientos. Primero, una endonucleasa reconoce una secuencia especfica (UAAUUU) y desdobla la cadena de RNA, generando un nuevo extremo 3'. En los pasos a-c, la polimerasa polifA) aade residuos de adenosina al extremo 3'. Un RNAm tpico de mamfero contiene de 200 a 250 residuos de adenosina en su apndice poli(A); este nmero es considerablemente menor en eucariotes inferiores. (Segn D.A. Micklos y G.A. freyer, DNA Science, Carolina Biolgica! Supply Co.)

terminal 5' en difosfato (paso 1, fig. 11-28). A continuacin se aade un GMP en orientacin invertida, de modo que el extremo 5' de la guanosina quede frente al extremo 5' de la cadena de RNA (paso 2, fig. 11-28). Como resultado, los dos ltimos nuclesidos se encuentran unidos por un puente 5'5' trifosfato. Por ltimo, el extremo terminal "invertido" de guanosina se metila en la posicin 7 sobre su base de guanina, en tanto que el nucletido del lado interno del puente de trifosfato se metila en la posicin 2' de la ribosa (paso 3, fig. 11-28). El extremo 5' del RNA ahora contiene un casquete de metilguanosina (como se muestra con mayor detalle en la figura 11-21). Estas modificaciones enzimticas en el extremo 5' del transcrito primario ocurren con gran rapidez, mientras la molcula de RNA todava se encuentra en las etapas iniciales de sntesis. Adems de la mediacin de los nucletidos terminales del precursor RNAm, varios residuos de nucletidios internos tambin pueden ser mediados o no serlo. Se cree que el casquete de metilguanosina del extremo 5' de un RNAm tiene varias funciones: evita que el extremo 5' del RNAm sea digerido por nucleasas, ayuda a transportar RNAm hacia afuera del ncleo y desempea un papel importante para iniciar la traduccin del RNAm. Como se mencion antes, el extremo 3' de un RNAm contiene una cadena de residuos de adenosina que forman un apndice poIi(A). Este apndice invariablemente se encuentra a unos 15 nucletidos hacia abajo de una secuencia AAUAAA que sirve como sitio de reconocimiento para una nucleasa que desdobla el pre-RNAm situado justamente hacia abajo de este sitio (fig. 11-28, lado derecho del RNA). Normalmente, una vez pasado este sitio la RNA polimerasa avanza bien sobre la plantilla de DNA hasta que concluye la transcripcin. Luego del desdoblamiento por las nucleasas, una enzima llamada polmernsa pol(A) aade las adenosinas que componen el apndice poli(A) (pasos a-c, fig. 11-28). Como se analiza en la seccin 12-3, poli(A) participa en a estabilizacin del RNAm dentro del citoplasma protegindolo del desdoblamiento prematuro. Puesto que un porcentaje considerable del RNAm carece de apndice poIi(A) (incluyendo los que codifican histonas), la presencia de esta modificacin no es requisito para la sntesis, procesamiento, transporte o traduccin de un RNAm eucariota. Empalme del transcrito primario: eliminacin de las secuencias interpuestas. Las partes de un transcrito primario que corresponden a secuencias de DNA interpuestas (intrones) se eliminan mediante un proceso complejo conocido como empalme del RNA. Para empalmar un RNA, se debe introducir una pausa en la cadena a nivel de los bordes 5' y 3' (o sitios de desdoblamiento) de cada intrn, y los exones situados a ambos lados de los sitios de empalme deben unirse mediante enlaces covalentes (ligados). En la figura 11-29 se muestra todo el proceso de ensamblado del preRNAm de globina. Es imperativo que el proceso de empalme ocurra con absoluta precisin, puesto que la presencia o ausencia de un solo nucletido anormal en cualquiera de las uniones de empalme cambia el cuadro de lectura del mensaje y causa errores de traduccin. Cmo puede el mecanismo de empalme reconocer el lmite entre un exn y un intrn? Inicialmente, esta pregunta se respondi mediante el anlisis de la secuencia de DNA. El examen de cientos de uniones entre exones e intrones en

CAPITULO 11 Utilizacin de la informacin gentica: de la transcripcin a la traduccin Gen de globina

DNA !

457

; Transcrito mG primario y Procesamiento intermedio

Transcripcin por la RNA RNA polmera polimerasa II y el casquete

Eliminacin del extremo 3' por la nucleasa

\n
Desdoblamiento endonucleoltico en las uniones de empalme

o
IOS
RNAm maduro

Ligadura de los exones AAA

FIGURA 11-29. Esquema general de las etapas que ocurren durante el procesamiento del RNAm de globina. Las secuencias interpuestas se muestran en color rosa, en tanto que las porciones azul oscuro del gen indican as posiciones de los exones, o sea, las secuencias de DNA representadas en el RNA mensajero maduro.

eucariotes, desde levaduras e insectos hasta vertebrados, revel la presencia en los sitios de empalme de una secuencia de nucletidos altamente conservada de origen evolutivo ancestral. En notable contraste, las secuencias de la porcin interna de los intrones tienden a ser muy divergentes. En la figura 11-30 se muestra la secuencia encontrada con mayor frecuencia en el lmite exn-intrn dentro de las molculas de RNAnh. La G/GU en e! extremo 5' del intrn (sitio de empalmado 5') y la AG/G en el extremo 3' del intrn (sitio de empalmado 3') prcticamente aparecen en todos los pre-RNAm eucariotas. La sustitucin de una sola base en la secuencia de DNA dentro de estos tramos invariables bloquea la excisin del intrn, lo que conduce a la acumu-

lacin de precursores no empalmados. Esto ocurre en ciertos tipos de talasemias humanas, una deficiencia de globina caracterizada por anemia. En la mayor parte de los casos, los RNA no empalmados son reconocidos y desdoblados de modo que no se envan al citoplasma y se traducen a polipptidos no funcionales. En los ltimos 10 aos se elabor una descripcin para explicar muchos de los pasos implicados en el empalmado de los transcritos pre-RNAm. Conforme las molculas grandes de RNAnh se transcriben, cada intrn se asocia a un complejo macromolecular llamado espliceosoma. El espliceosoma contiene varias protenas y algunas partculas de distintas ribonucleo pro tenas denominadas RNPnp porque se componen de RNAnp enlazado a protenas especficas (cuadro 11-1). El anlisis de RNPnp recibi gran apoyo cuando se descubri que la sangre de pacientes afectados de ciertas enfermedades autoinmunitarias (como lupus eritematoso generalizado, en el cual la persona produce anticuerpos contra sus propios componentes celulares) contena anticuerpos que reaccionan con partculas pequeas presentes en el ncleo celular (fig. 11-31). Usando antisuero obtenido de estos pacientes, Joan Steitz y sus colegas, de la Universidad de Yale, pudieron purificar algunos RNPnp. Aislaron cuatro RNPnp diferentes: RNPnp Ul, RNPnp U2, RNPnp U4/U6 y RNPnp U5. Algunas protenas son peculiares de un RNPnp particular; otras son compartidas como una porcin del ncleo central comn. Mecanismo de empalmado de los pre-RNAm. El descubrimiento, en 1982, de que los precursores RNAr de los protozoarios ciliados Tetrahymena podan empalmarse por s mismos (analizado en La va experimental, al final del captulo) cambi el concepto de los bilogos acerca del mecanismo de empalmado del RNA. El intrn del pre-RNAr de Tetraliymena es un ejemplo de intrn del grupo I. Los intrones del grupo I se observan con mayor frecuencia en mitocondrias de hongos y plantas, cloroplastos de plantas y en el RNA nuclear de eucariotes evolutivamente inferiores, como Tetrahyrnena. Aunque la secuencia de nucletidos de los intrones del grupo I puede ser muy variable, todos tienen capacidad para formar estructuras tridimensionales muy parecidas (fig. 11-32). Esta compleja estructura plegada, junto con varias placas bien situadas de nucletidos conservados, permite a estos intrones desdoblarse por s mismos. Posteriormente se descubri otro tipo de intrn autoempalmable, denominado intrn grupo II, en las mitocondrias de hongos y cloroplastos de plantas. Los intrones del grupo II tambin se pliegan en una estructura muy compleja (fig. 11-33, a), pero muy diferente de los intrones del grupo I. A

Sitio 5' de empalme Exn

c

Sitio 3' de empalme Intrn Exn

bu

Ab

FIGritA 11-SO. Secuencias de nucletidos en los sitios de empalmado de pre-RNAm. Las secuencias de nucletidos mostradas en las regiones de los sitios de empalmado se basan en el anlisis de numerosos pre-RNAm. Las bases mostradas en amarillo prcticamente son invariables. Las que se muestran en negro representan la base preferida en dicha posicin. N representa cualquiera de los cuatro nucletidos; Y es una pirimidina.

458

CAPITULO 11 Utilizacin de la informacin gentica: de la transcripcin a la traduccin

FKLIKA 1 1 - 3 1 . Localizacin mediante inmunofluorescencia de Ul RNPnp en los ncleos celulares mediante anticuerpos presentes en el suero de un paciente con enfermedad autoinmunitaria. El suero de diferentes pacientes contiene anticuerpos dirigidos contra distintos componentes nucleares. Las clulas cultivadas que aqu se muestran fueron tratadas con un anticuerpo fluorescente contra Ul RNPnp, que tie al ncleo, pero no al nuclolo ni al citoplasma. El antisuero, como el que aqu se emplea, ha mostrado utilidad para identificar y purificar los componentes del mecanismo de empalmado. (Cortesa de oan A. Steitz.)

diferencia de los intrones del grupo I, los intrones de! grupo II se empalman por s mismos pasando por una etapa intermedia denominada lazada (fig. 11-33, b), debido a que recuerda el tipo de lazo usado por los vaqueros para lazar becerros a la carrera. Los pasos que ocurren durante la eliminacin de intrones en molculas pre-RNAm de clulas animales prcticamente son idnticos a [os seguidos por los intrones del grupo II. La principal diferencia es que el pre-RNAm no se puede empalmar por s mismo, sino que requiere mltiples RNAnp nucleares (fig. 11-34) y sus protenas relacionadas (fig. 11-35). El hecho de que: 1) el pre-RNAm se empalme siguiendo la misma serie de reacciones qumicas que ocurren en los intrones del grupo II cuando se autoempalman, y 2) el RNAnp requerido para el empalmado del pre-RNAm se parezca mucho a porciones de los intrones del grupo II (fig. 11-34), sugiere fuertemente que el RNAsn es e! componente catalticamente activo de los RNPnp, y no las protenas. Si esto es cierto, las protenas ejerceran un papel complementario, por ejemplo, mantener la estructura tridimensional apropiada de los RNAnp para transportar a los RNAm empalmados a la envoltura nuclear y actuar como sitios de interaccin con factores reguladores. Nuestra comprensin del mecanismo de empalmado del RNA se logr principalmente a travs de estudios de extractos de clulas libres que pueden empalmar con precisin pre-RNAm in vitro. La secuencia de acontecimientos que supuestamente ocurren durante el empalmado de un intrn de pre-RNAm se indican en la figura 11-36 y se describen con cierto detalle en el pie de la figura acompaante. Los sucesos descritos en la figura 11-36 suministran el ejem-

FIGUHA 11-32. Estructura de los intrones del grupo I. En este modelo se indica la compleja estructura tridimensional del intrn del grupo I de Tctraln/mcna. Los dos exones que flanqea el intrn se muestran en color blanco. Como consecuencia del plegamiento del intrn, los dos exones se aproximan estrechamente hasta un punto donde pueden unirse luego de eliminar el intrn. Los pares de bases se indican como puentes fosfato-fosfato entre las cadenas apareadas. (Cortesa de E. Westhof.)

po rrtejor estudiado de las complejas y dinmicas interacciones que pueden ocurrir entre molculas de RNA. De los diferentes RNAnp que participan en el empalmado del RNA se cree que el RNA U6 es el ribosoma que efecta los dos cortes en el pre-RNAm requeridos para eliminar el intrn. Puesto que la mayor parte de los genes contienen algunas secuencias interpuestas, las reacciones de empalmado mostradas en la figura 11-36 deben ocurrir repetidas veces sobre un solo transcrito primario para eliminar todos los intrones del pre-RNAm. Las pruebas sugieren que los intrones se eliminan en un orden preferido generando intermediarios especficos de procesamiento cuyo tamao vara entre el del transcrito primario y el RNAm maduro. En la figura 11-37 se muestra un ejemplo de los intermediarios formados durante el procesamiento nuclear de RNAm ovomucoide en las clulas del oviducto de la gallina.

CAPITULO 11 Utilizacin de la informacin gentica: de la transcripcin a la traduccin

459

FIGURA 11-33. Estructura y va de autoempalmado de los intrones del grupo II. a) Estructura bidimensional de un intrn del grupo II. El intrn se pliega con seis dominios caractersticos. El asterisco indica el nucletido de adenosina que sobresale del dominio VI y forma la estructura de lazo descrita abajo. Los dos extremos del intrn se aplican estrechamente entre s, como se indica por la proximidad de los dos lmites intrn-exn. b) Pasos en el autoempalmado de los intrones del grupo II. En el paso 1, el 2' OH de una adenosina dentro del intrn (asterisco en el dominio VI de la parte a) ataca el sitio de ensamblado 5', desdoblando el RNA y formando una rama 2'-5' con el primer nucletido del intrn. Esta estructura ramificada se describe como lazo de vaquero. En el paso 2, el 3' OH libre del exn desplazado ataca al sitio 3' de empalme, que desdobla al RNA en el otro extremo del intrn. Como resultado de esta reaccin, el intrn se libera como lazo de vaquero libre y los extremos 3' y 5' de los dos exones que flanquea quedan ligados (paso 3). Se sigue una va similar en el empalme de intrones a partir de pre-RNAm, pero ocurre ms bien por autoempalmado. Estos pasos requieren la ayuda de algunos factores adicionales.

51 31

Implicaciones evolutivas del rompimiento de genes y el empalmado de RNA El descubrimiento de la capacidad del RNA para catalizar reacciones qumicas tuvo un enorme impacto sobre nuestro concepto de la evolucin biolgica. Una de las preguntas fundamentales planteadas por los bilogos evolutivos desde el descubrimiento del DNA ha sido: cul fue el primer material gentico, la protena o el DNA? El dilema se origina en las funciones aparentemente no superpuestas de estos dos tipos de macromolculas. Los cidos nucleicos almacenan informacin, en tanto que las protenas catalizan reacciones. Con el descubrimiento de os ribosomas fue evidente que un tipo de molcula, el RNA, poda hacer ambas cosas. Estos datos condujeron a especular que durante las primeras etapas de la evolucin de la vida no existan DNA ni protena. Tal vez las molculas de RNA pudieron haber ejecutado una doble tarea: sirvieron como material gentico y como catalizadores de las reacciones enzimticas necesarias. En esta etapa, la vida poda describirse como incluida en "un mundo de RNA". Slo en la ltima etapa de la evolucin "se conectaron" las funciones de almacenamiento de informacin y de catlisis al DNA y a la protena, respectivamente, dejando a RNA la funcin primara de "intermediario" en el flujo de informacin gentica. Muchos investigadores opinan que el empalmado es un buen ejemplo de herencia del mundo del RNA. El descubrimiento reciente de intrones del grupo II en las bacterias prpura y las cianobacterias, quiz parientes cercanos de los ancestros de las mitocondrias y los cloroplastos, respectivamente, arroj nueva luz acerca de los ascendientes del empalmado del RNA. Este dato apoya la hiptesis de que los intrones del grupo II son la fuente a partir de la cual se originaron los intrones pre-RNAm. La hiptesis se presenta en la figura 11-38. Segn esta hiptesis, los intrones originalmente estuvieron presentes en organelos endosimbiticos que residan en clulas eucariotas primitivas. Con el tiempo, los intrones dejaron el DNA del organelo e invadieron el DNA nuclear, donde establecieron su residencia permanente. La transferencia de las secuencias
Exn 1

Intrn

Exn 2
Sitio 3' de empalme

Pre-RNAm

Sitio 5' de empalme G

2'OH

Exn 1 + intrn-exn 2 Exn 2 A

,y
/
2'

J ,e^-

'/X /yr Exn EXC 1

Lazo de vaquero del intrn + exones ligados Exn 1 Exn 2

(b)

DNA de las mitocondrias y los cloroplastos al ncleo celular est bien comprobada, de modo que el movimiento de DNA en esta direccin no es inesperado. Una vez en e! ncleo, los intrones pudieron desplazarse de un sitio a otro mediante el proceso de transposicin analizado en la pgina 414 del captulo previo. El anlisis de las secuencias de intrones sugiere que tienen capacidad de actuar como elementos genticos movibles. Puesto que los intrones originalmente fueron ca-

460

CAPITULO 11 Utilizacin de a informacin gentica: de la transcripcin a la traduccin

U6 ACAGAGAuGAUC
A ACUAG A U

Uc

3.

U2

Pre-RNAm

Dominio \1 FIGURA 11 -.. Demostracin visual de la presencia de ribonu-

r A G C n n n r Ur\

i deoprotenas i \PA nucleares pequeas (RNPnp) relacionadas con transcritos nacientes. Cromosomas politenos gigantes de las glndulas salivales de Drosofliiln melanogasler teidos con anticuerpos fluorescentes contra la protena de las partculas de RNPnp. Los anticuerpos fluorescentes brillantemente teidos se enlazan de manera selectiva al material presente en las regiones esponjadas de los cromosomas, que son sitios donde ocurre la transcripcin. (Scgm Erikn L Mtittiniz, Michael J. Matunis y Gideon Dreyfiss, ]. Cell Biol. 121:226, 1993; con permiso de Rockefeer Uiiiversity Press.)

\n

Gr r r r r r
1 I ! i II

' Exn 2

yA

yyyyyy AOH Exn 1 GU

Dominio VI

(b)
FIGURA 1 1-3-1. Semejanza estructural propuesta entre las reacciones de empalme efectuadas por el espliceosoma sobre preRNAm y las reacciones de autoempalmado del grupo II de intrones. a) Interaccin estructural entre un intrn de una molcula pre-RNAm (flanqueada por los exones 1 y 2) y dos RNAnp (U2 y U6) requeridos para el empalme, b) Estructura de un intrn del grupo II que muestra la disposicin de partes crticas que quedan alineadas durante el autoempalmado (como se indic en la figura previa). Es evidente la semejanza de las partes del intrn del grupo II ai RNA combinado en la letra a. Arriba se muestran los residuos invariables en letras maysculas; las purinas y pirimidinas conservadas se denotan por r i/ y, respectivamente. Los residuos variables se marcan con n. (Segn A.M. Weiner, Ccll 72:162, 1993; con permiso de Ccll Press.)

paces de autoensamblarse, su presencia a mitad de los genes no causara problema porque las secuencias correspondientes a los intrones simplemente se cortan a s mismas a partir de los transcritos de RNA primarios antes de convertirse en RNAm. Con el tiempo, las porciones catalticas de los intrones fueron separadas de los RNA ms grandes corno fragmentos aparte que continan participando en el proceso de empalmado. Tiempo despus, la evolucin conform estos fragmentos en RNAnp cuya actividad cataltica se volvi dependiente de la presencia de protenas. En conjunto, RNAnp y las protenas evolucionaron para convertirse en los componentes RNPnp del espliceosoma. A medida que esto ocurra, los nucletidos internos de los intrones no tuvieron ya funcin alguna, lo que explica su longitud variable y la divergencia en las secuencias de nucletidos. Aunque la presencia de intrones pudo haber creado una "carga" adicional a las clulas debido a que deben eliminar estas secuencias interpuestas de sus transcritos, los intrones tienen sus virtudes. Como veremos en el siguiente captulo, el empalme de RNA es uno de los pasos sometido a regula-

MGI'li\ l-:tfi. Disposicin del mecanismo de empalme a nivel del intrn y algunos de los pasos durante el empalmado. Ei paso 1 muestra la porcin del pre-KNAm que ser empalmada. En el paso 2, el primero de los componentes de empalme, Ul RNPnp, se encuentra fijo al sitio de empalme 5' del intrn. La secuencia de nucletidos de Ul RNAnp es complementaria del sitio de empalme 5' del pre-RNAm y muestra que Ul RNAnp inicialmente se enlaza al extremo 5' del intrn mediante la formacin de un par de bases especficas entre el sitio de- empalme y Ul RNAnp. U2 RNPnp es el siguiente en introducirse al complejo de empalme, enlazndose al pre-RNAm (como se muestra en el recuadro A), de manera que un residuo de adenosina sobresale (punteado) por fuera de la hlice que lo rodea (paso 3). Este es el sitio que finalmente se transforma en el punto de ramificacin del lazo de vaquero. El siguiente paso es el enlace de U4/U6 y U5 RNPnp al pre-RNAm (paso 4). Una vez que todos los RNPnp se encuentran enlazados al intrn, concluye la disposicin del espliceosoma (paso 4), y est listo el escenario para una serie de interacciones dinmicas entre el pre-RNAm y los RNAnp especficos, y entre los propios R N A n p . A medida que forman el complejo con pre-RNAm, los RNAnp U4 y U6 se aparean a las bases para formar un gran nmero de p<lres (recuadro B). Despus de su entrada al complejo, los puentes de hidrgeno entre U4 y U6 se rompen y las regiones de U6 que forman pares con U4 se convierten en pares de bases para una porcin de U2 RNAnp (recuadro C). Se cree que U es una ribozima y U4 un inhibidor de su actividad cataltica. Una vez que U4 RNAnp se desplaza, U6 RNAnp se encuentra en posicin para efectuar los dos cortes requeridos para eliminar el intrn. Tambin se piensa que Ul y U5 RNAnp vuelven a juntar los sitios de empalmado para facilitar el desdoblamiento de los enlaces a cada lado del intrn (recuadro D). El ensamblado del espliceosoma va seguido por el desdoblamiento del sitio de ensamblado 5', formando un exn 5' libre y un intrn-3' de lazo de vaquero del exn intermediario (paso 5). Se cree que el exn 5' libre puede mantenerse en su sitio por su asociacin a RNAnp del espliceosoma. La primera reaccin de desdoblamiento en el sitio 5' de empalme va seguida rpidamente por un segundo desdoblamiento en el sitio de empalme 3', que secciona al intrn del lazo de vaquero y simultneamente junta los extremos de los dos exones vecinos (paso 6). Luego del empalmado, el KNPnp tal vez se libere del pre-RNAm como partcula individual que se pueda volver a ensamblar en los sitios de otros intrones.

CAPITULO II . Utilizacin de cripn a la traduccin SitioS' de empalme

5 "

461

Sitio 3' de empalme

Bcn 1

Intrn

punt de ramificacin

E xn

462

CAPITULO 11 Utilizacin de la informacin gentica: de la transcripcin a la traduccin

Cito-".

plsmico origen'

Nuclear

5450 nucletidos

3100. 2750 2500 2300 2000

1700

RNAmoni maduro

1100

FIGURA 11-37. Procesamiento del RNAm ovomucoide. La fotografa muestra una tcnica llamada mancha Northern, en la cual el RNA extrado (en este caso de ncleos de clulas del oviducto de gallina) se fracciona mediante electroforesis en ge y se extiende sobre papel filtro en forma ce manchas. El RNA inmovilizado sobre el papel filtro se incuba con DNAc marcado con istopo radiactivo (en este caso, el DNAc se elabora a partir del RNAm ovomucoide) para producir bandas que revelan la posicin de los RNA con la secuencia complementaria. El RNAm maduro que codifica la protena ovomucoide tiene 1 100 nucletidos de largo y se muestra en la parte inferior de la mancha. Es evidente que el ncleo contiene algunos RNA de tamao mayor que tambin contiene la secuencia de nucletidos del RNAm ovomucoide. Los RNA ms grandes situados sobre la mancha muestran una longitud de 5 450 nucletidos que corresponde al tamao de la unidad de transcripcin ovomucoide; se supone que este RNA es el transcrito primario a partir del cual se copia finalmente el RNAm, Otras bandas prominentes contienen RNA con longitudes de 3 100 nucletidos (correspondientes a un transcrito que carece de los intrones 5 y 6), 2 300 nucletidos (transcrito que carece de los intrones 4, 5, 6 y 7) y 1 700 nucletidos (transcrito que carece de todos los intrones, excepto el nmero 3). (Cortesa de Bcrt O'Mnlley.)

El intrn invade al DNA nuclear

Citoplasma

-Exn 1 -Intrn -Exn 2

El intrn es autoempalmado

- Exn 1 - Intrn . - Exn 2

Organelo endosimbitico Las porciones catalticas de los introneS se convierten en genes separados cuyos Gen que codifica productos de RNA al RNA requerido se requieren para para el empalme el empalmado de de pre-RNAm los pre RNAm - Exn 1 - Intrn - Exn 2 Intrones ahora variables de tamao debido a que ya no se alargan por autoempalme

El intrn se desplaza hacia el interior del creciente nmero de genes nucleares

Los intrones se autoempalman

FIGURA I 1-38. Hiptesis que puede explicar el origen evolutivo de los intrones en el DNA eucariota. Pasos propuestos en la evolucin de un intrn autoempalmable en un simbionte ancestral procariota en el interior de intrones del genoma eucariota. Los pasos se analizan en el texto.

CAPITULO 11 Utilizacin de a informacin gentica: de la transcripcin a la traduccin

463

cin celular a lo largo de la va para formar RNAm. Muchos transcritos primarios pueden procesarse en dos o ms vas, de modo que la secuencia que acta como ntrn en una va se convierte en exn en una va alterna. Como resultado de este proceso, denominado ensamblado alterno, el mismo gen puede codificar varios polipptidos diferentes. Tambin se cree que la presencia de intrones tuvo mayor impacto en la evolucin biolgica. En la pgina 59 vimos que con frecuencia as protenas se componen de segmentos distintos, o dominios, que funcionan de manera semindependiente. En algunos casos, los dominios de un polipptido corresponden a la parte del mismo codificada por exones distintos. Por ejemplo, los receptores de LDL, protenas que desempean un papel crucial en la captacin de colesterol sanguneo (pg. 314), se componen de partes que claramente son homologas de partes de otras protenas. Una porcin central del polipptido receptor de LDL contiene un dominio muy similar en estructura y secuencia a una porcin de otra protena llamada factor de crecimiento epidrmico (FCE). Este dominio es codificado por algunos exones vecinos que tambin estn presentes en el gen FCE. Otro dominio del receptor de LDL se parece mucho a una porcin de a protena sangunea denominada factor C9 del complemento codificada por una serie de exones similares a los observados en el gen C9. Es evidente que el gen que codifica al receptor de LDL se ha ensamblado de partes de otros genes (fig. 11-39). E! desplazamiento de "mdulos" genticos entre diferentes genes, proceso denominado revolver los exones, pudo haber participado de manera importante en el ensamblado

de ancestros de muchos de os genes presentes en los organismos actuales. Durante largos periodos, los exones pudieron ser revueltos independientemente en varias formas, permitiendo un nmero casi infinito de combinaciones en la bsqueda de nuevas y tiles secuencias de codificacin. Gracias al entremezclado de los exones, la evolucin no necesariamente ocurre slo a travs de la lenta acumulacin de mutaciones puntuales, sino que tambin puede avanzar a "saltos cunticos" con la aparicin de nuevas protenas literalmente de la noche a la maana. Creacin de nuevos ribosomas en el laboratorio El principal "punto difcil" en la mente de muchos bilogos respecto de la posibilidad de un mundo de RNA en el cual el RNA acte como nico catalizador, es que hasta ahora slo se han encontrado unas pocas reacciones catalizadas por RNA en la clula. En la actualidad, stas incluyen las reacciones de desdoblamiento y de ligadura requeridas para el empalmado del RNA y la formacin de enlaces peptdicos durante la sntesis de protenas. En la actualidad, varios grupos de investigadores exploran el potencial cataltico del RNA creando nuevas molculas de RNA en el laboratorio. Con uno de los mtodos adoptados se modifica de diferente manera el RNA existente y se prueba su capacidad de participar en nuevos tipos de actividades. Por ejemplo, se ha demostrado que algunos RNA modificados pueden catalizar ciertas reacciones qumicas que seran necesarias si el RNA fuera capaz de autoduplicarse. Puesto que la autoduplicacin es una propiedad fundamental de la vida, este dato apoya la existencia de un "antiguo mundo de RNA". Otros grupos de investigadores estn creando los RNA deseados a partir de "raspado" sin ningn diseo preconcebido de cmo se debe construir el RNA. El RNA se forma permitiendo que mquinas automticas sintetizadoras de DNA ensamblen el DNA con secuencias de nucletidos al azar y luego transcriban el DNA para formar una vasta poblacin de RNA cuyas secuencias de nucletidos tambin se determinan al azar. Una vez obtenida una poblacin de RNA, se pueden seleccionar miembros individuales de la poblacin en virtud de las propiedades particulares que poseen. Este mtodo se describe como "evolucin molecular en el laboratorio". En un grupo de estudios se seleccion RNA sinttico por su capacidad para enlazarse a un ligando particular, como el trifosfato de nuclesido o un pptido, mediante cromatografa por afinidad (seccin 17-7). En estos experimentos, los ligandos se unen a esferitas, utilizadas luego para empacar una columna de cromatografa. Cuando se permite que la preparacin de RNA se deslice a travs de la columna, los RNA capaces de enlazarse al ligando inmovilizado son retirados de la solucin, en tanto que la mayor parte de las molculas de RNA simplemente pasan a travs sin ser afectadas. Una vez seleccionada la subpoblacin de RNA se puede incrementar su nmero y someter a otra vuelta selectiva bajo condiciones ms estrictas. Con cada vuelta selectiva, los RNA que "pasan la prueba" cada vez son ms adecuados para la tarea que se les impone.

Receptor de LDL

Intrones

Exones

ffiffiffl
Complemento C9 Precursor de FCE
FIGURA 11-39. Origen de los exones del gen que codifica el receptor de LDL. Los 18 exones que constituyen el gen para el receptor de LDL se muestran en la parte de arriba; las flechas indican la posicin de los 17 intrones. El receptor de LDL contiene una secuencia de aminocidos que muestra una homologa distinta para el factor de crecimiento epidrmico (FCE) y la protena del complemento C9. Los estudios indican que el gen para el receptor de LDL contiene una regin (mostrada en azul} que corresponde al gen del complemento C9 y otra regin (indicada en amarillo) que corresponde al gen que codifica al precursor para el factor de crecimiento epidrmico. El gen para el precursor del FCE se muestra en la parte inferior de la figura con sus exones delimitados. Algunos de los exones del gen precursor del FCE corresponden a los exones del gen receptor de LDL, otros no. Es de suponer que los intrones nicos para uno u otro gen aparecieron despus del ensamblado del gen receptor de LDL durante la evolucin. (Segn B. Lcwin, Genes V, p. 697, Oxford University Press, 1994.)

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CAPITULO 11 Utilizacin de la informacin gentica; de la transcripcin a la traduccin

LA PERSPECTIVA HUMANA
Posible uso de las ribozimas en medicina
Las ribozimas poseen dos propiedades importantes que los convierten en agentes potenciales de la lucha contra ciertas enfermedades crnicas: 1) contienen tramos de nucletidos que les permiten formar pares de bases con un RNA complementario y 2) tienen un sitio cataltico capaz de desdoblar el esqueleto del RNA complementario (fig. PH 11-1). Con estas propiedades, las ribozimas son sujetos ideales para manipulacin en ingeniera gentica, puesto que se pueden disear a la medida para reconocer y destruir cualquier RNA especfico. Ya se inici el uso de ribozimas diseadas a la medida en la lucha contra enfermedades virales. Para que un virus dae a una clula infectada, el genoma viral debe transcribirse en RNA viral, que posteriormente se traduce en protena virales. Consideremos lo que ocurre si una clula infectada posee un gen que codifica a una ribozima capaz de enlazarse especficamente y destruir el RNA viral. Podra esperarse que la clula fuese inmune contra el virus, aunque el genoma viral se encuentre integrado al DNA de las clulas husped. Experimentos recientes efectuados por Flosie Wong-Staal, de la Universidad de California, y Arnold Hempel, de la Northern Illinois University, demostraron la posibilidad de utilizar ribosomas de esta manera. En sus experimentos, Wong-Staal y Hempel aislaron Hnfocitos T de pacientes con SIDA y transfectaron las clulas (seccin 17-12) con una secuencia de DNA manipulada por ingeniera gentica que codifica una ribozima capaz de reconocer y desdoblar RNAm del HIV. El gen para ribozimas se coloca hacia abajo de un promotor "fuerte", que garantiza su transcripcin activa. Las pruebas indican que la ribozima reduce la cantidad de virus producido por clulas infectadas con HIV por un factor aproximado de 10 000 en comparacin con clulas infectadas con HIV no transfectadas. Lo ms importante es que la ribozima evidentemente es eficaz para destruir el RNA viral sin daar al RNA normal de la clula. El siguiente paso en el proyecto es iniciar ensayos clnicos a gran escala en los cuales se introducen linfocitos portadores de un gen para ribozima de regreso al cuerpo del paciente del cual se tomaron las clulas. Se espera que las clulas transfectadas sean resistentes al virus y preserven el sistema inmunitario deficiente del paciente. El objetivo final de esta geneterapia es introducir el gen para ribozimas destructores de RNA en todas las clulas del cuerpo infectadas por el virus y no slo en aquellas presentes en la circulacin sangunea. Como se analiz en la pgina 153, se han desarrollado diferentes vectores para suministrar genes extraos a diferentes sitios del cuerpo. Las ribozimas tambin pueden ser tiles en la lucha contra ciertos tipos de cncer. Como se estudia en el captulo 16, se ha demostrado que ciertos tipos de cncer humano son resultado de una mutacin en un gen {un encogen) que codifica una protena que participa en la regulacin de la divisin celular. Puesto que la malignidad de estas clulas se debe a la sntesis de un RNA diferente del producido por una clula normal, sera factible revertir el estado maligno de la clula destruyendo el RNA alterado, tarea apropiada para una ribozima. Se han aislado clulas del cncer humano de la vejiga y se han transfectado con un gen diseado a la medida que codifica un ribosoma capaz de reconocer y destruir el RNA transcrito del oncogen alterado. Normalmente, las clulas vesicales malignas pueden causar tumores cuando se inyectan a ratones de la-

KIGURA l'H 1 1 - 1 . Accin de una ribozima. La ribozima que aqu se muestra, llamada ribozima de cabeza de martillo, es capaz de enlazarse al RNA que tiene una secuencia complementaria de nucletidos y catalizar una reaccin para desdoblar el esqueleto del sustrato del RNA. (Reimpreso con permiso de T.R. Ccch y O.C. lUenbcck, Na tu re 372:39, 1994; copyright 1994 por Macmillftn Mngazincs Ltd.)

CAPITULO 11 Utilizacin de la informacin gentica: de la transcripcin a la traduccin

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boratorio, pero las clulas cancerosas transfectadas con la ribozima pierden sus propiedades malignas y ya no son capaces de formar tumores en el ani-

mal husped. Para ser eficaz como tratamiento para el cncer, el gen que codifica el ribosoma tendr que introducirse en todas las clulas del tumor, lo

cual, como se analiz antes, requiere el desarrollo de un vector capaz de entregar el gen a los tejidos internos del cuerpo.

Es de esperar que un RNA que se enlaza con gran afinidad a un ligando posea actividad cataltica capaz de modificar dicho ligando. Esta expectativa se cumpli en experimentos recientes en los cuales inicialmente se seleccionaron RNA capaces de unirse al ATP y despus se eligi una subpoblacin que hidroliza ATP y transfiere el grupo fosfato al extremo de otro RNA. La transferencia de un grupo fosfato del ATP a un donador adecuado es uno de los tipos de reacciones ms importantes efectuadas por enzimas de protenas en las clulas vivientes. La demostracin de que un ribosoma sinttico puede catalizar una reaccin de este tipo aade mayor credibilidad al concepto de que las molculas de RNA son capaces de catalizar todas las reacciones requeridas para mantener la vida de una clula primitiva antigua.

sibles que pueden ocurrir en un sitio particular del DNA (o el RNAm). Con una letra hay cuatro palabras posibles, 16 palabras posibles con dos letras y 64 (43) posibles palabras con tres letras. Puesto que se deben especificar 20 aminocidos diferentes (palabras), los codones deben contener cuando menos tres nucletidos sucesivos (letras). Pronto se comprob en diferentes experimentos de gentica la existencia del tripleto natural. Adems de proponer que el cdigo era un tripleto, Gamow tambin propuso que es un cdigo superpuesto. Consideremos la siguiente secuencia de nucletidos: AGCAUCGCAUCGA Si el cdigo est superpuesto, entonces el ribosoma se mover a lo largo del RNAm avanzando un nucletido cada vez y reconociendo un nuevo codn con cada movimiento. En la secuencia precedente, AGC especificara un aminocido, GCA el siguiente aminocido, CAU el siguiente, y as sucesivamente. Sin embargo, si el cdigo no estuviera stipej'puesto, cada nucletido a lo largo del RNAm sera parte de uno y slo un codn. Se pueden extraer conclusiones acerca de la superposicin o no superposicin del cdigo a partir de estudios en protenas imitantes, como la hemoglobina muante que causa la anemia drepanoctica. En la anemia drepanoctica, como en muchos otros casos estudiados, se observ que en la protena mutante se ha sustituido un solo aminocido. Si el cdigo estuviera superpuesto a un cambio en uno de los pares de bases del DNA debera afectar a tres codones consecutivos (fig. 11-40) y, por lo tanto, a tres aminocidos consecutivos en el polipptido correspondiente. Sin embargo, si el cdigo no est superpuesto y cada nucletido es parte de un solo codn, entonces sera de esperar la sustitucin de un solo aminocido. Estos y otros datos indican que el cdigo no est superpuesto y que la proposicin de Gamow al respecto era incorrecta. El uso de un cdigo no superpuesto aade una dificultad tcnica al ribosoma. Puesto que el ribosoma se mueve a lo largo del RNAm una distancia equivalente a tres nucletidos a la vez, entonces la secuencia de aminocidos que se ensambla al ribosoma es determinada por los tripletos particulares "ledos". Una vez unido el ribosoma a un RNAm comienza a leer el primer codn y siempre se desplaza a lo largo en bloques consecutivos de tres nucletidos. Para garantizar la lectura de los tripletos apropiados, el ribosoma se fija al RNAm en un sitio preciso llamado codn de inicio, AUG, que automticamente coloca al ribosoma en el cua-

11-4 Codificacin de la informacin gentica

Una vez descrita la estructura del DNA era evidente que la secuencia de aminocidos de un polippdo fuera especificada por la secuencia de nucletidos en el DNA de un gen. Pareca poco probable que el DNA pudiera servir como plantilla fsica directa para el ensamblado de una protena. En vez de eso, se asumi que la informacin almacenada en la secuencia de nucletidos se presentaba en algn tipo de cdigo gentico. Con el descubrimiento del RNA mensajero como intermediario del flujo de informacin del DNA a la protena, la atencin se orient a investigar de qu manera una secuencia "escrita" en un "alfabeto" ribonucletido puede codificar una secuencia "escrita" en un "alfabeto" muy diferente de aminocidos. Propiedades del cdigo gentico Uno de los primeros modelos del cdigo gentico fue postulado por el fsico George Gamow, quien propuso que cada aminocido de un polipptido estaba codificado por una secuencia de tres nucletidos. En otros trminos, las palabras del cdigo, o codones, para aminocidos eran tripletos de nucletidos. Gamow lleg a esta conclusin con una lgica un poco de escritorio. Razon que deben requerirse cuando menos tres nucletidos por cada aminocido que posea su propio codn nico. Consideremos el nmero de palabras que se pueden deletrear utilizando un alfabeto de cuatro letras diferentes correspondientes a las cuatro bases po-

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CAPITULO 11 Utilizacin de a informacin gentica: de la transcripcin a la traduccin

Secuencia original ...AGCATCG... Secuencia despus de la sustitucin de una sola base ..AGAATCG..

Cdigo superpuesto
. . ., A G C , GCA, CAT, ATC, TCG

Cdigo no superpuesto
., A G C , ATC

Cdigo superpuesto ., A G A i G / \ A 1 A A J _ i A T C , T C G , .

Cdigo no superpuesto
.. A G A . A T C , .

FIGURA 11-40. Distincin entre un cdigo gentico superpuesto y uno no superpuesto. Efecto de la sustitucin de una sola base en el RNAm sobre el contenido de informacin en cada uno de estos dos tipos de cdigo. Los codones afectados se muestran subrayados en rojo.

dro de lectura apropiado, de modo que lea correctamente todo el mensaje desde ese punto en adelante. Por ejemplo, en el siguiente caso, CUAGUUACAUGCUCCAGUCCGU el ribosoma se desplaza desde el codn de inicio, AUG, a los siguientes tres nucletidos, CUC, y as sucesivamente a lo largo de toda la lnea. Algunas de las mutaciones ms destructivas son aquellas que slo aaden o borran un par de bases al DNA. Un ejemplo de adicin de un solo nucletido a la secuencia previa se ilustra por CUAGUUACAUGCUCGCAGUCCGU Las mutaciones de este tipo se denominan mutaciones por cambio de cuadro y causan que el ribosoma se mueva a lo largo del RNAm en el cuadro de lectura incorrecto desde el punto de la mutacin hacia el resto de la secuencia codificadora. Como resultado, estas mutaciones con cambio de cuadro conducen a ensamblar una secuencia enteramente anormal de aminocidos desde el punto de la mutacin hasta el extremo del polipptido. Irnicamente, despus de ms de veinte aos asumiendo que el ribosoma siempre se mueve de un tripleto al siguiente, se han descubierto varios ejemplos donde el RNAm contiene una seal de recodificacin para que el ribosoma cambie su cuadro de lectura, de ordinario regresando un nucletido hacia atrs (cambio al cuadro -1) o saltando un nucletido (cambio al cuadro +1). Considerando que los organismos emplean un cdigo de tripletos con capacidad para especificar 64 aminocidos diferentes y que en realidad slo hay 20 aminocidos para especificar, se plantea la pregunta sobre cul es la funcin de los 44 tripletos extra. Hay tres posibilidades: todos ellos, algunos de ellos o ninguno de ellos codifica aminocidos. Si alguna de las dos primeras posibilidades es correcta, entonces cuando menos uno de los aminocidos ser especificado por ms de un codn. Se dice que un cdigo de este tipo est deteriorado. Como despus se comprob, el cdigo est muy deteriorado, puesto que casi los 64 codones posibles especifican aminocidos. Los que no lo hacen (3 de los 64) tienen una funcin especial: el ribosoma los reconoce como codones de terminacin y detienen la lectura del mensaje.

El deterioro del cdigo fue pronosticado originalmente por Francis Crick sobre fundamentos tericos cuando consider la extensa gama de composicin de bases por diferentes DNA bacterianos. Por ejemplo, se observ que el contenido de G + C poda variar de 20 a 74%, en tanto que la composicin de aminocidos en las protenas de estos organismos mostraba poca variacin total. Esto sugiri que los mismos aminocidos eran codificados por diferentes secuencias de bases, lo que constitua el deterioro del cdigo.
Identificacin de los codones

En 1961 ya se conocan las propiedades generales del cdigo, pero an no se descubra alguna codificacin especfica asignada a los tripletos. En aquel tiempo, casi todos los genetistas pensaban que deban transcurrir cinco a 10 aos antes de descifrar todo el cdigo. Pero Marshall Nirenberg y Heinrich Matthaei dieron un gran paso cuando desarrollaron una tcnica para sintetizar sus propios "mensajes genticos" artificiales y luego determinar qu tipo de "protena" codificaban. El primer mensaje sometido a prueba fue un polirribonucletido compuesto exclusivamente de uridina; el mensaje se denomin "poIi(U)". Cuando se aadi po!i(U} al tubo de ensaye que contena un extracto bacteriano con los 20 aminocidos adems de los materiales necesarios para la sntesis de protenas (ribosomas y varios factores solubles), el sistema sigui las instrucciones del mensajero artificial y elabor un polipptido. Analizando el polipptido ensamblado se observ que era una polifenilalanina, un polmero del aminocido fenilalanina. Nirenberg y Matthaei haban demostrado as que el codn UUU especifica fenilalanina. En los siguientes cuatro aos, varios investigadores se unieron a la bsqueda y se elaboraron otros RNAm sintticos para probar las especificaciones de aminocidos de todos los 64 codones posibles. El resultado fue la carta descodificadora universal o "cdigo gentico" mostrado en la figura 11-41 (el pie de la figura contiene las instrucciones para leer la carta). Las asignaciones suministradas al codn en la figura 11-41 son prcticamente universales: cualquiera que sea el tipo de clula, como bacteria, levadura, hongo, pino gigante de California o ser humano, los mismos codones especifican a los mismos aminocidos. La principal excepcin a la universalidad del cdigo gentico se observa en los codones del RNAm mitocondral. Por ejemplo, en la mito-

CAPITULO 11 Utilizacin de la informacin gentica: de la transcripcin a la traduccin 1a letra ra EL CDIGO GENTICO

467

C
Fenilalanina Fenilalanina Leucina Leucina Leucina Leucina Leucina Leucina Isoleucina Isoleucina Isoleucrna Metionina {inicio} Valina Valina Valina Valina Serina Serina Serina SerJna Prolina Prolina Prolina Prolina Treonina Treonina Treonina Treonina Alanina Alanina Alanina Alanina

A
Tirosina Tirosina Paro Paro Histidina Hjstidina~ Glutamina" ^-^ Glutamina Asparagina Asparagina Lisina Lisina Acido asprtico Acido asprtico Acido glutmico Acido glutmico

Cistena Cistena'' Paro Triptfano Arginina Argidina Arginina Arginina Serina Serina Arginina Arginina Glicina Glicina
.-

U
C
"^ A

G U C A G
~"^

ACG

C
A

G U

^j
A

Glicina Glicina

ccu

4
3a letra

FIGURA 11-41. El cdigo gentico. La correlacin entre codn y aminocidos indicada en esta carta descodificadora es igual casi en todos los organismos. Por ejemplo, para emplear la carta en la traduccin del codn UGC se debe encontrar la primera letra (U) sobre ei rengln indicado a la izquierda. Seguir este rengln a la derecha hasta encontrar la segunda letra (G), indicada en la parte de arriba; a continuacin encontrar el aminocido que coincide con la tercera letra (C) en la fila de la derecha. UGC especifica la introduccin de cistena. Cada aminocido (excepto 2) posee varios codones que ordenan su introduccin. Estos son "sinnimos" genticos, sistemas de respaldo que reducen el peligro de que mutaciones letales destruyan las clulas. Como se analiza en la siguiente seccin, la descodificacin en las clulas la efecta ei RNAt, algo de lo cual se ilustra esquemticamente a la derecha de la figura.

condra humana, UGA se lee como triptfano en vez de alto, AUA se lee como metionina en vez de isoleucina, y AGA y AGC se leen como paro en vez de arginina. Aun con estas discrepancias, las similitudes de los cdigos genticos mitocondrial y nuclear sobrepasan con mucho sus diferencias y en general se cree que uno se deriv del otro, y que todos los organismos presentes sobre la tierra en la actualidad comparten un origen evolutivo comn. El examen de la carta de codones de la figura 11-41 indica claramente que la asignacin de aminocidos no es al azar. Ms bien, hay una semejanza evidente en los codones que especifican el mismo aminocido. Como resultado, las mutaciones espontneas que provocan cambios en el gen de una sola base con frecuencia no producen cambio en la secuencia de aminocidos de la protena correspondiente. La comparacin de las secuencias de nucletdos de la misma protena entre especies diferentes indica que se acumu-

lanmuchas ms sustituciones de nucletdos que no cambian la secuencia de aminocidos de la protena en comparacin con las sustituciones que s causan cambios. Ei aspecto del "margen de seguridad" del cdigo es ms importante que el de su deterioro. La asignacin a los codones es tal que aminocidos similares tienden a ser especificados por codones similares. Por ejemplo, los codones de diferentes aminocidos hidrofbcos se agrupan en las primeras dos columnas de la carta. Por consiguiente, la sustitucin de una base en uno de estos codones probablemente sustituya a un residuo hidrofbico por otro. Adems, las principales semejanzas entre aminocidos y codones relacionados aparecen en los primeros dos nucletidos del tripleto, en tanto que la mayor variabilidad ocurre en el tercer nucletido. La explicacin de este fenmeno se revela en la siguiente seccin, donde se describe el papel del RNA de transferencia.

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CAPITULO 11 Utilizacin de a informacin gentica: de la transcripcin a la traduccin

Descodificacin de los codones: papel de los RNA de transferencia cidos nucleicos y protenas son como dos lenguajes escritos con diferentes tipos de letra. Cmo puede la informacin codificada en una secuencia de nucletidos controlar el ensamblado secuencial de aminocidos en una protena? A fines de los aos 1950, Francis Crick propuso una respuesta a esta pregunta con base en su conviccin de que la manera predominante para que un cido nucleico exprese su especificidad era mediante la formacin de uniones de hidrgeno entre nucletidos complementarios. Crick postul la existencia de una molcula "adaptadora" de cido nucleico, la cual "descodificara" el mensaje gentico de los nucletidos para convertirlo en aminocido. Cada aminocido tendra su propia especie de adaptador, y de esta manera, una secuencia especfica de bases podra traducirse en una cadena

definida de polipptidos. Esta era una hiptesis atrevida: predecir un tipo de molcula enteramente nueva con base en la lgica bioqumica y no en su aislamiento. Poco tiempo despus se descubri el RNA de transferencia en la fase soluble del citoplasma celular, y casi de inmediato se confirm su papel como adaptador en la sntesis de protenas. Puesto que cada RNAt puede reconocer dos diferentes tipos de molculas, un RNAm y un aminocido, debemos considerar de qu manera tienen lugar ambas formas de reconocimiento. Sin embargo, primero analizaremos la estructura de las molculas del RNAt que les permite efectuar estas funciones. En 1965, luego de siete aos de trabajo, Robert Holley, de la Universidad Cornell, public la primera secuencia de bases de una molcula de RNA, la del RNA de levadura especfico para el aminocido alanina (fig. 11-42, a). Esta molcula RNAt se compone de 77 nucletidos, 10 de los cuales son modificaciones de los cuatro nucletidos

3' A ~OH

Tallo aceptor

Anticodn

Anticodn

(a)
FKil'llA 11-42. Estructura bidimensional del RNA de transferencia, a) Secuencia de nucletidos en forma de hoja de trbol de RNAtAla de levadura. Los aminocidos se encuentran unidos al extremo 3' del RNAt, en tanto que el extremo opuesto posee el anticodn, en este caso IGC. La funcin del anticodn se analiza ms adelante. Adems de las cuatro bases, A, U, G y C, este RNAt contiene ty, seudouridina; T, ribotimidina; mi, metilinosina; I, inosina; rr^G, dimetilguanosina; D, dihidrouridina; meG, metilguanosina. Los sitios de las 10 bases modificadas en este RNAt se indican por el sombreado en color, b) Representacin generalizada del RNAt en forma de hoja de trbol. Las bases comunes a todos los RNAt (procariota y eucariota) se indican con letras; R es una purina invariable, Y es una pirimidina invariable, >p es una seudouridina invariable. Los crculos claros indican sitios donde las bases participan en la formacin de pares de bases no de Watson-Crick. A menudo, pero no siempre, los nuclesidos mostrados se modifican. La mayor variabilidad entre los RNAt ocurre en el brazo V (variable), que puede oscilar de 4 a 21 nucletidos. Hay dos sitios de menor variabilidad a lo largo del brazo D.

CAPITULO 11 Utilizacin de la informacin gentica: de la transcripcin a la traduccin

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estndar (A, G, C, U) del RNA, como lo indica el sombreado de la figura. En los siguientes aos se publicaron y secuenciaron algunas otras especies de RNAt y se observaron varias similitudes en todos los diferentes RNAt (fig. 11-42, b). Todos ellos constan casi del mismo pequeo nmero de nucletidos,, entre 73 y 93, y todos tienen un porcentaje significativo de bases poco comunes que al parecer son resultado de modificaciones enzimticas de una de las cuatro bases estndar despus que se incorporan a la cadena de RNA (es decir, luego de la transcripcin). Adems, todos los RNAt poseen secuencias de nucletidos en una parte de la molcula que son complementarias de secuencias localizadas en otras partes de la molcula. A causa de estas secuencias complementarias, todos los RNAt tienen posibilidad de plegarse de igual manera para formar una estructura parecida a una hoja de trbol. En la figura 11-42 se muestran los tallos con pares de bases y las asas no apareadas de las hojas de trbol del RNAt. El aminocido siempre se fija a la A en el extremo 3' de la molcula. Las bases poco comunes, que se concentran en las asas, actan para interrumpir la formacin de puentes de hidrgeno en estas regiones y tambin sirven como sitio potencial de reconocimiento para enzimas. Hasta este punto slo se ha considerado la estructura secundaria o bidimensional de estas molculas adaptadores. Los RNA de transferencia pueden plegarse para formar una estructura terciaria nica definida. El anlisis de difraccin de rayos X demuestra que los RNAt asumen forma de L (fig. 11-43). Como en el caso de la estructura terciaria de las protenas, el plegamiento de una molcula de RNAt se facilita por la formacin de enlaces dbiles entre partes de otra

manera distantes de la molcula. Las bases observadas en sitios comparables en toda molcula de RNAt (bases invariantes de la figura 11-42, b) tienen particular importancia para generar la estructura terciaria comn en forma de L. La forma comn de todos los RNAt refleja el hecho de que todos deben tomar parte en la misma serie de reacciones durante la sntesis de protena. Sin embargo, al mismo tiempo, varias enzimas deben distinguir los diferentes RNAt, de modo que el aminocido apropiado se pueda fijar a su RNAt apropiado (conocido). Los RNA de transferencia se encargan de leer las palabras en el alfabeto nucletido del RNAm y asegurarse de traducirlas a las palabras apropiadas en el alfabeto aminocido de la protena. El reconocimiento entre una molcula de RNAt determinada y un tripleto de RNAm determinado (codn) se logra por la formacin de puentes de hidrgeno entre secuencias de bases complementarias sobre los RNA de transferencia y mensajeros. La parte del RNAt que participa en esta interaccin especfica con el codn del RNAm es un tramo de tres nucletidos secuenciales, denominado anticodn, que se localiza en el asa media de la molcula de RNAt (fig. 11-43, a). En todos los RNAt, esta asa se compone de siete nucletidos, los tres de en medio formando el anticodn. El anlisis de la estructura terciaria indica que el anticodn se localiza en un extremo de la molcula de RNAt en forma de L, opuesto hacia el cual el aminocido se encuentra fijo (fig. 11-43, b). Conforme el RNAt se enlaza secuencialmente a su codn complementario del RNAm, los aminocidos que transporta se ensamblan de modo secuencial en una cadena de polipptidos. Como resultado, la secuencia de nucletidos del RNAm controla la secuencia de aminocidos del polipptido.

Anticodn

(a)

(b)

FIGURA 11-43. Estructura tridimensional de un RNAt. a) Dibujo esquemtico. El brazo aceptor de aminocidos (AA) y el brazo T^C (T) forman una doble hlice continua, y el brazo anticodn (AC) y el brazo D forman la otra doble hlice parcialmente continua. Estas dos columnas helicoidales forman una L. El esqueleto de fosfato-ribosa se muestra como una fibra continua, excepto por los tres segmentos punteados en los cuales vara el nmero de nucletidos entre los diferentes RNAt. b) Fotografa de un modelo de 2.5 A de un fenilalanil RNAt de levadura tomada por B.F.C Clark y J.E. Ladner utilizando coordinados suministrados por A. Klug. La distancia del anticodn al extremo 3' terminal es de casi 8 nm. (a. Reimpreso con permiso de S.-H. Kim, Nature 256:680, 1975; copyright 1975 por Macmillan Magazines Limited; b: cortesa de B.F.C. Clark.)

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CAPITULO 11 Utilizacin de la informacin gentica: de la transcripcin a la traduccin

Puesto que son 61 los diferentes codones que puede especificar un aminocido, sera de esperar que una clula tuviera cuando menos 61 diferentes RNAt, cada uno con un anticodn diferente complementario de uno de los codones de la figura 11-41. Pero recordemos que las ms grandes similitudes entre codones que especifican el mismo aminocido ocurren en los primeros dos nucletidos del tripleto, en tanto que la mayor variabilidad en estos mismos codones ocurre en el tercer nucletido del tripleto. Consideremos los 16 codones que terminan en U. En cada caso, si la U cambia a C, se especifica el mismo aminocido (primeras dos lneas de cada cuadro en la figura 11-41). De manera similar, en la mayor parte de los casos, un cambio entre una A y una G en el tercer sitio tampoco tiene efecto en la determinacin del aminocido. La posibilidad de intercambiar la base de la tercera posicin llev a Francis Crick a proponer que el mismo RNA de transferencia puede reconocer ms de un codn. Su proposicin, llamada hiptesis de la inestabilidad, sugiere que en tanto el requerimiento estrico entre el anticodn del RNAt y el codn del RNAm pueda ser muy estricto para las primeras dos posiciones, quiz sea ms flexible en la tercera posicin, lo que permite a dos codones que especifican el mismo aminocido y que slo difieren en la tercera posicin puedan emplear el mismo RNAt en la sntesis de protenas. Una vez ms, la hiptesis de Crick result correcta. Las reglas que gobiernan la inestabilidad en la tercera posicin del codn son las siguientes (fig. 11-44): la U del anticodn puede formar par con A o G del RNAm; la G del anticodn puede formar par con U o C del RNAm; y la I (inosina, derivada de la guanina en la molcula de RNAt original) del anticodn puede formar par con U, C o A del RNAm. La hiptesis de la inestabilidad se comprob demostrando que ciertas molculas de RNAt purificado se unen a ms de un codn para el aminocido especificado. Como consecuencia de la inestabilidad, los seis codones para leucina, por ejemplo, slo requieren tres RNAt.
Activacin de aminocidos

apropiados para aquel aminocido (o sea, todos los RNAt cuyos anticodones reconozcan los diferentes codones para ese aminocido, como se indica en la figura 11-41). Las aminoacil-RNAt sintetasas constituyen un excelente ejemplo de la especificidad de las interacciones protena-cido nucleico. Deben existir ciertas caractersticas comunes entre todas las especies de RNAt de un aminocido determinado para permitir a la enzima apropiada del grupo reconocer todos estos RNAt y al mismo tiempo discriminar todos los RNAt para otros aminocidos. Se ha determinado la estructura tridimensional de varias de estas enzimas (fig. 11-45) y se ha venido acumulando informacin acerca de las caractersticas estructurales de los RNAt que pueden causar que sean seleccionados o rechazados como sustratos. Puesto que los sustratos de RNAt para las diferentes aminoacilRNAt sintetasas son tan parecidos, se podra pronosticar que las enzimas tambin son similares entre s. En realidad, representan un conjunto ms bien heterogneo de protenas que se cree han evolucionado a partir de diferentes protenas ancestrales. Es posible que esas enzimas aparecieran en una etapa muy primitiva de la evolucin antes que muchas otras partes del mecanismo de traduccin. Las aminoacil-RNAt sintetasas efectan la siguiente reaccin en dos pasos: Primer paso: ATP + aminocidos - aminoacil-AMP + PP Segundo paso: aminoacil-AMP + RNAt -^ aminoacil-RNAt + AMP En el primer paso, la energa del ATP se emplea para "activar" el aminocido mediante la formacin de un aminocido adenilado que se enlaza a la enzima. Este es el paso primario de requerimiento de energa en todo el proceso de ensamblado del polipptido. Los acontecimientos subsecuentes, como la transferencia del aminocido a la molcula RNAt (paso 2 de arriba), y finalmente el crecimiento de la cadena de polipptidos, son todos termodinmicamente favorables. El PP producido en la primera reaccin se hidroliza a continuacin para formar P, forzando an ms la reaccin total hacia la formacin de productos (durante la sntesis de protenas se consume energa, pero no se emplea en la formacin de uniones peptdicas). El segundo paso 'en la formacin de una molcula de RNAt cargada tiene lugar cuando la enzima transfiere su aminocido en-

Durante la sntesis de protena es de gran importancia que cada molcula de RNA de transferencia se una al aminocido "correcto" (conocido). Los aminocidos se unen mediante enlaces covalentes a los extremos 3' de su RNAt conocido por accin de una enzima llamada aminoacil-RNAt sintetasa. Una aminoacil-RNAt sintetasa especfica reconoce cada aminocido, la cual es capaz de "cargar" todos los RNAt

Leu

Codones de RNAm 5' FIGURA 11-44 Flexibilidad en la interaccin entre codones y anticodones. En algunos casos, el nucletido situado en el extremo 5' del anticodn del RNAt puede formar par con ms de un nucletido situado en el extremo 3' (tercera posicin) del codn de RNAm. En consecuencia, el mismo RNAt puede usar ms de un codn. Las reglas para la formacin de parejas flexibles se indican en la figura y tambin en el texto.

CAPITULO 11 Utilizacin de la informacin gentica: de la transcripcin a la traduccin

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te convirtieron la cistena fijada en alanina y observaron el efecto que esto tena sobre la incorporacin del aminocido. No tuvo efecto. El grupo de reconocimiento del RNAt, que es su anticodn, no mostr alteraciones y, por lo tanto, sigui reconociendo los mismos nucletidos del RNAm como si no se hubiera alterado qumicamente el aminocido. Por consiguiente, siempre que se encontr una cistena codificada en el mensaje se incorpor una alanina en la cadena del polipptido.

11-5 Traduccin de la informacin gentica

La sntesis o traduccin de protenas es la actividad sinttica ms compleja que ocurre en la clula. En tanto que otras macromolculas de las clulas se elaboran por medio de reacciones enzimticas relativamente directas, el ensamblado de una protena requiere todos los diferentes RNAt con sus aminocidos unidos, ribosomas, RNA mensajeros y algunas protenas con varias funciones, cationes y GTP. La complejidad no es sorprendente si consideramos que la sntesis de protenas requiere la incorporacin de cada uno de los diferentes 20 aminocidos en la secuencia precisa dictada por un mensaje codificado escrito en un lenguaje que emplea distintos smbolos. En la descripcin siguiente, casi siempre nos referimos a los mecanismos de traduccin que operan en clulas bacterianas. El proceso es notablemente similar en clulas eucariotas. La diferencia principal es que la traduccin en clulas eucariotas implica numerosos factores protenicos solubles (no ribosmicos). La sntesis de una cadena de polipptidos se puede dividir en tres actividades distintivas: inicio, alargamiento y terminacin de la cadena. Consideraremos por separado cada una de estas actividades. Inicio En la figura 11-47 se ilustran los pasos bsicos del inicio de la traduccin en procariotes. Es indispensable que el riboso-

FIGURA 11-45. Modelo tridimensional de la interaccin entre un RNAt y su aminoacil-RNAt sintetasa. Estructura de cristal de glutamil-RNAt sintetasa de E. cali (en azul) que forma un complejo con RNAtGln {en rojo y amarillo). La enzima reconoce este RNAt especfico y puede identificarlo entre otros a travs de extensas interacciones con el tallo aceptor y el anticodn del RNAt. (Segn Tilomas A. Steitz, Science vol. 246, cover of 12/1/89 issue.)

lazado a! extremo 3' del RNAt conocido. Si por alguna razn la sintetasa coloca un aminocido particular sobre un RNAt inapropiado, se activa un mecanismo de control de calidad de la enzima y se secciona la unin entre el aminocido y el RNAt. A partir del anlisis anterior, es evidente que el aminocido en s no desempea un papel directo para determinar si se coloca en un polipptido. Ms bien, los codones del RNAm se interpretan segn la capacidad de reconocimiento de la aminoacil-RNAt sintetasa. Esto se demostr en uno de los primeros experimentos efectuados por Fritz Lipmann y sus colaboradores, cuando alteraron qumicamente un aminocido despus de fijado a su RNAt especifico (fig. 11-46). En ese experimento, estos investigadores prepararon primero RNAt de cistena cargado con cistena. Posteriormen-

NH|

O-

NH3*

O C C CH 2 SH
H
NH uc PU no l_/ri2 f w r*' v>,

O P O C C CH 3
O H

RNAt de cistena sintetasa

Reducida por nquel Raney

H ATP
Cistena
2P,

AMP + PP
Cis-RNAtCis

FIGURA 11-46. Demostracin experimental de que la especificidad de la incorporacin de un aminocido es determinada por RNAt y no por el aminocido fijado. La sustitucin de una cistena por una alanina luego que se ha fijado a RNAtCls no afecta su incorporacin a la cadena de polipptido; o sea, la alanina se incorpora en los sitios que normalmente ocupan los residuos de cistena.

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CAPITULO 11 Utilizacin de la informacin gentica: de la transcripcin a la traduccin

ma se fije a un punto determinado sobre el RNAm de modo que el mensaje se lea en el cuadro de lectura correcto (pg. 466). Esto se logra obligando al ribosoma a iniciar la traduccin en un sitio especfico del mensaje, llamado codn inicial. Como pronto ser evidente, el RNAm no se enlaza a ribosomas intactos, sino ms bien el mensaje lo hace a subunidades pequeas y grandes en etapas separadas. El primer paso principal de inicio es el enlace de la subunidad ribosmica pequea a la primera (o a una de las primeras) secuencia AUG del mensaje, la cual sirve como codn inicial.3 Cmo puede la subunidad pequea seleccionar el codn AUG inicial en comparacin con algn otro codn interno? Los RNAm bacterianos poseen una secuencia especfica de nucletidos (llamada secuencia Shine-Dalgarno, por sus descubridores) que reside cinco a 10 nucletidos antes del codn inicial. La secuencia Shine-Dalgarno es complementaria de una secuencia de nucletidos cercana al extremo 3' del RNA ribosomico 16S en la subunidad ribosmica pequea.
RNAr RNAm - - A C C U C C U U U A 3' GGGGA 5'

Varios de los pasos delineados en la figura 11-47 requieren la ayuda de protenas solubles, llamadas factores de inicio (designados FI en los procariotes y Fie en eucariotes). Por ejemplo, se cree que el FIe4E en eucariotes se enlaza al casquete situado en el extremo 5' del RNAm y es mediador de la interaccin entre el mensaje y la subunidad

RNAm

fmet

El reconocimiento del codn inicial AUG es resultado de la interaccin entre estas secuencias complementarias en el RNAm y el RNAr conforme la subunidad pequea se enlaza al mensaje. En eucariotes, la subunidad ribosmica pequea reconoce primero el extremo 5' del mensaje que precede al casquete de metilguanosina (pg. 456), y luego se desplaza a lo largo del RNAm hasta alcanzar una secuencia de nucletidos (tpicamente 5'-CCACCAUGC-3') que contiene el tripleto AUG en un contexto en el cual se le puede reconocer como codn inicial. En casi 90% de los RNAm eucariotas, el primer tripleto AUG es el codn de inicio. Cuando se examinan las asignaciones de codones (fig. 11-41) se puede observar que AUG es algo ms que un simple codn inicial; es el nico codn para metionina. En realidad, la metionina siempre es el primer aminocido que se incorpora al extremo N terminal de la cadena naciente de polipptido. (En los procariotes, la metionina inicial posee un grupo formilo que lo convierte en N-formilmetionina.) En la mayor parte de los casos, la metionina (o N-formilmetionina) posteriormente se elimina mediante accin enzimtica, pero la metionina permanece como aminocido N terminal en casi 50% de las cadenas de polipptido maduras. Las clulas poseen dos metionil-RNAt distintos: uno se usa para iniciar la sntesis de protenas (designado RNAt Met) y otro diferente (designado RNAtMet) para incorporar residuos metionilo al interior de un polipptido. Es interesante que mitocondrias y cloroplastos de clulas eucariticas usan iV-formilmetionina para iniciar la traduccin en vez de metionina, dato que suministra una de las piezas ms fuertes en el argumento del origen procariota de estos organelos.

RNAm

3 GUG tambin puede servir como codn inicial y se observa como tal en unos pocos mensajes naturales. Cuando se usa GUG, todava se utiliza N-formilmetionina para formar el complejo inicial a pesar de que los codones GUG internos especifican valina.

FIGURA 11-47. Pasos en el inicio de la sntesis de protena en procariotes. En el paso 1, la subunidad ribosmica SOS a la cual se encuentra fijo el factor de inicio FI3 se enlaza al RNAm en el codn de inicio AUG. Esta interaccin es facilitada por una interaccin que ocurre entre una secuencia complementaria de nucletidos situados sobre el RNAr y el RNAm, segn se indica en el texto. En el paso 2, N-formilmetionil-RNAt (RNAt M ^) con el factor de inicio FI2 enlazado y GTP, se enlaza al complejo subunidad 30S-RNAm. A continuacin se hidroliza GTP. En el paso 3, la subunidad SOS se une al complejo con la liberacin acompaante de FI2, FI3 y los productos de la hidrlisis del GTP (GDP y P).

CAPITULO 11 Utilizacin de la informacin gentica: de la transcripcin a la traduccin

473

ribosmca pequea. Un factor acompaante se desplaza a lo largo del extremo 5' del mensaje eliminando cualquier regin de doble cadena que pudiera impedir los movimientos del ribosoma a medida que se desplaza en busca del codn inicial. Adems de los factores protenicos, tambin se requiere GTP para que el inicio tenga xito. Una molcula de GTP se enlaza al RNAtM^ antes que entre la subunidad ribosmica pequea. Una vez que el RNAt iniciador se fija, la subunidad grande se une al complejo, los factores solubles se liberan y el GTP se hidroliza. La hidrlisis de GTP tal vez provoque un cambio de conformacin en el ribosoma, requerido para el inicio de la traduccin. Cada ribosoma tiene dos sitios para asociarse a las molculas de RNA de transferencia (fig. 11-48). Estos dos sitios, llamados sitio A (aminoacilo) y sitio P (peptidilo), tienen papeles diferentes en la traduccin. Por lo general, el sitio A es en el que entra el aminoacil-RNAt al complejo RNAm ribosmico, en tanto que el sitio P es donde el RNAt dona aminocidos a la cadena en crecimiento.4 El RNAt iniciador (RNAtM?1) probablemente aparezca al principio en el sitio P del ribosoma, segn se ndica en la figura 11-47. Alargamiento Con el RNAt iniciador firmemente cargado en su lugar dentro del sitio P, el ribososma queda disponible para la entra-

4 En la actualidad se acepta un tercer sitio, llamado sitio E (salida, del ingls exit], como sitio separado donde el RNAt abandona el ribosoma despus de donar su aminocido al extremo de la cadena en crecimiento. Puesto que esto aade poco al anlisis, se omite la referencia al sitio E, pero se ndica en la figura 11-48.

Subunidad 50S Subunidad 305

RNAt

=aa

FI<;iRA ll-48. Loralizacin aparente para el ribosoma enlazado al RNAt en los sitios A, P y E. Se muestra la polaridad del RNAm. Las flechas indican la probable va de un RNAt cuando se desplaza hacia adentro y afuera del ribosoma. El sitio E, a partir del cual sale el RNAt del ribosoma, no se analiza en el texto.

da de un segundo aminoacil-RNAt en el sitio A vacante, lo cual es el primer paso en el alargamiento (paso 1, fig. 11-49, a). Ant^s que el segundo aminoacil-RNAt o cualquiera de los subsiguientes pueda enlazarse de manera eficaz al RNAm en el sitio A, debe combinarse con uno de los diversos factores de alargamiento de protenas (este factor particular de alargamiento se denomina Tu en los procariotes y FAel en eucariotes) unido al GTP. Aunque cualquier complejo aminoacil-RNAt-Tu-GTP puede entrar al sitio A, slo aqullos cuyo anticodn sea complementario del codn RNAm situado en el sitio A puede quedar atrapado all porque se une especficamente al RNAm. Una vez que el aminoacil-RNAt-Tu-GTP apropiado se enlaza al codn RNAm, el GTP se hidroliza y el complejo Tu-GDP se libera. E! complejo RNAt-Tu-GTP se regenera, segn se muestra en el paso 2 de la figura 11-49, a. El segundo paso en el ciclo de alargamiento es la formacin de un enlace peptdico entre los aminocidos enlazados a los dos RNAt (paso 3, fig. 11-49, a, y fig. 11-49, b). La reaccin ocurre por transferencia de la metionina (o de la Nformlmetionina) situada sobre el RNAt iniciador del sitio P al aminocido unido al RNAt, unido a su vez al segundo codn en el sitio A. Esta reaccin es catalizada por pcptidi! transferasa, un componente de la subunidad grande del ribosoma. Durante aos, se asumi que la peptidil transferasa era una protena del ribosoma. Despus, conforme fue aparente la potencia cataltica del RNA, la atencin se volvi al RNA ribosmico como catalizador para la formacin de enlaces peptdicos. En la actualidad se ha demostrado que la actividad de la peptidil transferasa en realidad reside en la molcula del RNA ribosmico grande de la subunidad ribosmica grande. En otras palabras, la peptidil transferasa es una ribozima (estudiada en La va experimenta! de la pgina 479}. La formacin del primer enlace peptdico deja un extremo de la molcula de RNAt del sitio A todava fijo a su codn complementario sobre el RNAm y el otro extremo de la molcula fijo a un dipptido. El RNAt del sitio P queda entonces desprovisto de todo aminocido unido. El tercer paso en el ciclo de alargamiento implica: 1) expulsin del RNAt no cargado del sitio P, y 2) movimiento del ribosoma trinucletido (un codn) junto con el RNAm en la direccin 3' {paso 4, fig. 11-49, T). Este ltimo paso, llamado translocacin, se acompaa de movimiento del RNAt dipptido hacfa el sitio P del ribosoma, todava enlazado mediante un puente de hidrgeno al segundo codn del RNAm. La translocacin requiere otro factor de alargamiento (G en procariotes y FAe2 en eucariotes) y la hidrlisis de GTP. Puesto que la translocacin implica el movimiento de una partcula sobre una distancia aproximada de 1 nm a lo largo del mensaje, debe acompaarse de notables cambios de conformacin en la estructura del ribosoma. La energa requerida para impulsar la translocacin es suministrada por la hidrlisis del GTP. As, por cada ciclo de alargamiento cuando menos se hidrolzan dos molculas de GTP, una (o ms) durante la seleccin del aminoacil-RNAt y otra durante la translocacin. Una vez separado el pcptidil-RNAt del sitio P, el sitio A una vez ms se encuentra abierto a la entrada de otro aminoacil-RNAt, en este caso uno cuyo anticodn sea com-

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CAPITULO 11 Utilizacin de a informacin gentica: de a transcripcin a la traduccin

Pptido CC

R
RNAt,

H O H I II I Pptido CCNC

R'
RNAt, Sitio P vaco Sitio A

(b)
GTP
GDP-Tu + P Tu-Ts
AARNAt

Tu-GTP

GTP-Tu-AA-RNA

RNAm

GDP

J L Peptidi transferasa

FIGl'RA 11-49. Pasos en el alargamiento del polipptido naciente durante la traduccin en procariotes. a) En el paso 1, un aminoacilRNAt cuyo anticodn es complementario al segundo codn del RNAm entra al sitio vaco A del ribosoma. En el paso 2 el enlace del RNAt se acompaa de la liberacin de GDP-Tu, que ser reciclado segn se muestra. En el paso 3 tiene lugar la formacin de un enlace peptdico mediante la transferencia de la cadena del polipptido naciente desde el RNAt en el sitio P al aminoacil-RNAt del sitio A. La reaccin es catalizada por una porcin del RNAr 285 que acta como ribozima. En el paso 4, el enlace del factor G (FA-G) y la hidrlisis de GTP dan como resultado la liberacin del RNAt del sitio P y la translocacin del ribosoma relacionado con el RNAm. b) Formacin de un enlace peptdico y desplazamiento subsecuente del RNAt desacilado del sitio P.

plementario del tercer codn. Cuando el tercer RNAt cargado se asocia al RNAm en el sitio A, el dipptido del RNAt del sjtio P se transfiere al aminocido sobre el RNAt del sitio A formando el segundo enlace peptdico y un tripptido fijo al RNAt del sitio A. El RNAt del sitio P otra vez se encuentra desprovisto de un aminocido. La formacin de enlaces peptdicos va seguida de la expulsin del RNAt del sitio P y la translocacin del ribosoma al cuarto codn, y el ciclo est listo para comenzar una vez ms. Precisin de la traduccin La interaccin entre los tripletos del RNAm y el RNAt no ocurre con la suficiente fuerza para explicar por s misma la precisin conocida de la sntesis de protenas (slo uno de cada 10 000 aminocidos se incorpora de manera incorrecta). Se han propuesto diferentes hiptesis para explicar esta tasa relativamente baja de errores. Una hiptesis sugiere que slo codones y anticodones complementarios entre s pueden adaptarse dentro de la hendidura formada por el

CAPITULO 11 Utilizacin de la informacin gentica: de la transcripcin a la traduccin

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RNA ribosmico, y slo cuando la hendidura est ocupada puede formarse la unin peptdica. En otra hiptesis se da importancia al retraso aparente entre el enlace del complejo RNAt-Tu-GTP con el RNAm y el momento en que el aminocido se aade a la cadena de polipptido en crecimiento. Cuanto mayor sea el tiempo que un codn y un anticodn inapropiados (no complementarios) permanezcan enlazados, mayor ser la probabilidad de que su dbil interaccin provoque la disociacin y separacin de los dos RNA. Otra hiptesis invoca la hidrlisis del GTP como medio para garantizar la fidelidad de la traduccin. Aunque desde hace mucho se ha asumido que cada ciclo de alargamiento se acompaa de la hidrlisis de dos GTP, hay suficientes datos que sugieren que el verdadero nmero es de tres o ms. La energa adicional puede ser consumida para liberar los RNAt enlazados de manera inadecuada. La estreptomicina, uno de los antibiticos ms ampliamente prescritos, ejerce su efecto porque se enlaza selectivamente a la subunidad ribosmica pequea de las clulas bacterianas causando que ciertos codones del RNAm se lean de manera equivocada e incrementando, por lo tanto, la sntesis de protenas anormales. Puesto que el antibitico no se enlaza a ribososmas eucariotas, no tiene efectos sobre la traduccin de los RNAm de las clulas del husped. As, la estreptomicina al parecer acta enlazndose a la protena ribosmica llamada S12, que de alguna manera participa en el control de la interaccin precisa entre el RNAt especfico

y el complejo ribosoma-RNAm. La resistencia bacteriana a la estreptomicina se puede atribuir a cambios en las protenas ribosmicas, en particular S12. Una gran variedad de antibiticos deben su efecto a la interferencia con diferentes aspectos de la sntesis de protenas en clulas bacterianas. En el cuadro 11-2 se presenta un resumen de la accin de algunos de estos antibiticos. Terminacin Como se mencion en la pgina 467, tres de los 64 codones trinucletidos posibles son codones de paro cuya funcin es concluir el ensamblado de polippdos en vez de codificar otro aminocido. No existe RNAt cuyos anticodones sean complementarios de los codones de paro. Cuando el ribosoma alcanza uno de estos codones, UAA, UAG, UGA, la seal que se lee es detener todo alargamiento adicional y liberar el polipptido asociado al ultimo RNAt. La terminacin requiere la presencia de factores de liberacin que interactan directamente con los codones de paro; las bacterias tienen dos factores de liberacin (FL1 reconoce UAA y UAG, y FL2 reconoce UGA), en tanto que las clulas eucariotas slo poseen uno (FLe). El factor de liberacin posee un GTP enlazado que posteriormente se hidroliza. Una vez detenida la traduccin, el polipptido terminado se separa de su fijacin al RNAt, y ambos, factor de liberacin y RNAt

CUADRO 11-2. Antibiticos que inhiben la sntesis de protenas Sitio de accin Antibitico Puromicina Tetraciclinas Estreptomicina Tipo de clula Eu, Pro* Pro Pro Subunidad Etapa Alterado en imitantes resistentes Efectos especficos

R, P R I, R

Protena S12

Kasugamicina Espectinomicina Cloranfenicol, lincomicina Esparsomicina Ertromicina Siomicina, tiostrepton Kirromicina Pulvomicina Acido fusdico Viomicina

Pro Pro Pro Eu, Pro Pro Pro

Pro

Protena 52; RNA 16S ^ Protena S5

Libera peptidil-puromicina Bloqueo estable del enlace en el sitio A 1. Irreversible: bloquea el movimiento del complejo de inicio 2. Causa lectura errnea por alargamiento del ribosoma Bloquea la formacin de! complejo de inicio Bloquea el movimiento despus del inicio Bloquea la transferencia de peptidil Bloquea la reaccin de puromicina y el enlace establece en el sitio A Bloquea la extensin de la cadena poco despus del inicio Irreversible; bloquea la unin de G-GTP, y de Tu-aa-RNAt-GTP Bloquea la liberacin de Tu-GDP Bloquea la formacin de aa-RNAt-Tu-GTP Bloquea la liberacin de G y de GDP Bloquea el sitio P

L L S S L S, L

P T, R R R T T

RNA 23S, Protenas L4, L26 RNA 235

Pro Eu, Pro Pro

Tu G S, L

* Eu, pro = eucariote, clulas procariotas; L, S = subunidad ribosmica grande y pequea; R = reconocimiento; P - transferencia de peptidil; T = translocacin; I = inicio. FUENTE: B.D. Davis, R. Dulbecco, H.N. Eisen y H.S. Ginsberg, Mcrobiology, 5a. ed., Lippincott, 1990, p. 211.

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CAPITULO 11 Utilizacin de la informacin gentica: de la transcripcin a la traduccin

Extremo parecido a la cadena RNAt

ocn

Parecido a fenilalanina Terminal 3' del fenilalanil-RNAt

FIGURA 11-50. Semejanza entre puromicina y la terminal 3' de fenilalanil-RNAt. Debido a esta similitud, la puromicina entra al sitio A y provoca la liberacin prematura del polipptido naciente.

desacilado, se liberan del ribosoma. La hidrlisis del enlace entre el polipptido y el ltimo RNAt puede ser catalizada por la misma porcin del RNAr encargada de la formacin de enlaces peptdicos durante el alargamiento. Cuando la terminacin concluye, el ribosoma se separa del mensaje y

se disocia en sus subunidades como preparacin para otro turno de traduccin. Puesto que los tres codones de terminacin pueden formarse con facilidad mediante cambios en una sola base a partir de muchos otros codones, podran esperarse mutaciones que originen codones de paro dentro de un gen. Tales mutaciones provocaran la terminacin prematura de la cadena de polipptidos en crecimiento. Durante decenios se han estudiado mutaciones de este tipo, llamadas mutaciones sin sentido, y se sabe que provocan varias enfermedades hereditarias en el hombre. Las mutaciones sin sentido de ordinario ocasionan las formas ms graves de una enfermedad hereditaria debido a que slo se sintetiza una parte de la protena y, por lo tanto, invariablemente es no funciona!. Otra forma de terminar prematuramente el crecimiento de la cadena es aadir el antibitico puromicina. Esta molcula se parece al extremo 3'de un RNAt cargado (fig. 11-50) y puede penetrar al sitio A del ribosoma. Una vez en dicho sitio, el pptido del sitio P se transfiere a la puromicina del sitio A y se forma un enlace covalente. La transferencia de la cadena naciente de polipptido a la puromicina coloca un casquete sobre el extremo carboxilo de la cadena, de modo que ya no pueden fijarse ms aminocidos. En vez de ello, el complejo peptidil-puromicina separa al ribosoma.

RNAm

Subunidad grande Subunidad pequea Polipptido concluido

Subunidad grande Subunidad pequea

(b)
FIGURA 11-51. Polirribosomas. a) Dibujo esquemtico de un polirribosoma (polisema), b) Micrografa electrnica de un corte transversa] a ras del borde exterior de una cisterna de retculo endoplsmico rugoso. Los ribosomas estn alineados en asas y espirales, lo que indica su fijacin a la molcula de RNAm para formar polisomas. c) Micrografa electrnica de polisemas con sombreado metlico y aislados de reticulocitos que participan en la sntesis de hemoglobina. La mayor parte de estos polisemas tienen entre cuatro y seis ribosomas. (b: Cortesa de E. Yantada; c: cortesa de Alexander Rich.)

(c)

CAPITULO 11 Utilizacin de a informacin gentica: de la trntiscripcin a la traduccin

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Formacin de polirribosomas Cuando se examina en e microscopio electrnico un RNA mensajero durante el proceso de traduccin, invariablemente se observan numerosos ribosomas fijos a todo lo largo de la cadena de RNAm. A este complejo de ribosomas y RNAm se le denomina polirribosoma, o polisema (fig. 11-51). Inicialmente, cada uno de los ribosomas se ensambla a partir de sus subunidades en el codn de inicio y luego se desplaza desde ese punto hacia el extremo 3' del RNAm hasta alcanzar un codn de terminacin. Tan pronto como cada ribosoma se desplaza una distancia suficiente a lo largo del mensaje a partir del codn inicial, el siguiente ribosoma se fija al RNAm y comienza la actividad de traduccin. La traduccin simultnea del mismo RNAm por un gran nmero de ribosomas incrementa mucho la tasa de sntesis de protenas dentro de la clula. Ahora que se han descrito los acontecimientos bsicos de la traduccin, es adecuado concluir el captulo con foto-

grafas de este proceso, una tomada de una clula procariota (fig. 11-52, a) y la otra de una clula eucariota (fig. 11-52, b). A diferencia de las clulas eucarotas, en las cuales ocurre la transcripcin ocurre en el ncleo y la traduccin en el citoplasma y los dos procesos estn separados por muchos pasos interpuestos, en las clulas procariotas las correspondientes actividades se encuentran firmemente acopladas. Por lo tanto, la sntesis protenica en las clulas bacterianas se inicia sobre plantillas de RNAm mucho antes de concluir la sntesis del RNAm. La sntesis de un RNAm procede en la misma direccin que se mueven los ribosomas cuando traducen el mensaje, o sea, desde el extremo 5' al 3'. En consecuencia, tan pronto como una molcula de RNA comienza a sintetizarse, el extremo 5' est disponible para fijarse a ribosomas. La micrografa de la figura 11-52, a, muestra la cadena de DNA sobre la cual ocurre la transcripcin, el RNAm de longitud creciente de un extremo al otro del gen, y los ribosomas fijos a cada RNAm naciente que forma los polirribosomas. En la micrografa de la figura

'i:'-''"':".:,' ''Wi--:~ .i i* '!'_-..'

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'"" "-'-'-'"

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(a)
FIGURA 11-52. Observacin visual de la transcripcin y la traduccin, a) Micrografa electrnica de partes de un cromosoma de E. coli que participa en la transcripcin. El DNA se observa como lneas dbiles que corren a lo largo de las fotos, en tanto que las cadenas de RNAm nacientes se observan fijas a uno de sus extremos, al parecer por una molcula de RNA polimerasa. Las partculas asociadas al RNA naciente son ribosomas en el acto de la traduccin; en bacterias, la transcripcin y la traduccin ocurren simultneamente. Las molculas de RNA aumentan de longitud conforme crece la distancia al sitio de inicio, b) Micrografa electrnica de un polirribosoma aislado de las clulas de la glndula de la seda de un gusano de seda, las cuales producen grandes cantidades de la protena fibroma de la seda. Esta protena es lo bastante grande para ser visible en la micrografa (las flechas apuntan a las cadenas de polpptido naciente), (a: Reimpreso con permiso de Osear L Miller, /)., Barbara A. Hamkalo y C.A. Tilomas, Science 169:392, 1970; copyright 1970 por American Association for the Advancement of Science; b: cortesa de Steven L. McKnight y Osear L. MiUer, r.)

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CAPITULO 11 Utilizacin de la informacin gentica: de la transcripcin a la traduccin

11-52, a, no se observa la cadena naciente de protena, pero puede verse en la micrografa de la figura 11-52, b, que muestra un solo polirribosoma aislado de una clula en la glndula secretoria de seda del gusano de seda. La protena de la seda sintetizada es visible debido a su gran tamao y naturaleza fibrosa. Las tcnicas para visualizar la transcripcin y la traduccin desarrolladas por Osear Mller, Jr., del Oak Ridge National Laboratory, suministran una demostra-

cin visual adecuada del proceso previamente descrito en trminos bioqumicos. Al iniciar este captulo analizamos el cambiante concepto del gen. Se comenz como una unidad hereditaria abstracta que gobierna las caractersticas de una planta de guisante, posteriormente el gen se convirti en un sitio sobre un cromosoma, un segmento de una molcula de DNA, y ms recientemente como unidad de transcripcin. Es no-

LA VIA E X P E R I M E N T A L

Papel del RNA como catalizador

La investigacin en bioqumica y biologa molecular durante el decenio de 1970 consolid nuestros conocimientos acerca del papel de las protenas y los cidos nucleicos. Las protenas eran los agentes que ponen en marcha a la clula, las enzimas las que aceleran la velocidad de las reacciones qumicas dentro de los organismos. Los cidos nucleicos, por otra parte, constituan la molcula encargada de la informacin en la clula, almacenando instrucciones genticas en sus secuencias de nucletidos. La divisin del trabajo entre protenas y enzimas pareca tan bien definida como cualquier definicin establecida en las ciencias biolgicas. Despus, en 1981, se public un trabajo que comenz a empaar esta distincin.1 Thomas Cech y sus colaboradores, de la Universidad de Colorado, han estado estudiando el proceso mediante el cual el precursor de RNA ribosmico sintetizado por el protozoario ciliado Tetrahymena thermophila era convertido en molculas de RNAr maduro. A diferencia del pre-RNAr de mamferos estudiado en la pgina 447, T. thermophila pre-RNAr contiene una secuencia interpuesta de casi 400 nucletidos seccionados de transcrito primario antes de unirse a los segmentos que deben juntarse (ligados). Previamente, Cech haba observado que los ncleos aislados de las clulas podan sintetizar el precursor pre-RNAr y efectuar la reaccin de empalme en su totalidad. Todava no se aislaban enzimas empalmadas de ningn tipo de clula y Tetrahymena poda ser un buen sistema para estudiar dichas enzimas. El primer paso fue aislar el precursor pre-RNAr en su estado intacto y luego determinar el nmero mnimo de componentes nucleares que deban aadirse a la mezcla de reaccin para obtener un empalme preciso. Se observ que cuando se incuban ncleos aislados en un medio con cationes monovalentes en baja concentracin (5 mM NHL}"1"), se sintetiza la molcula pre-RNAr pero el intrn no se separa. Esto permiti a los investigadores purificar el precursor intacto que planeaban utilizar como sustrato para ensayar la actividad de empalme en extractos nucleares. Sin embargo, observaron que cuando se incuba el precursor purificado por s solo en concentraciones ms elevadas de iones NH4+ en presencia de Mg2+ y un compuesto de guanosina (p. ej., GMP o GTP), la secuencia interpuesta se desempalma del precursor (fig. VE 11-1).: El anlisis de la secuencia de nucletidos confirm que el RNA pequeo separado del precursor era el intrn con un nuclendo aadido que contena guanina en su extremo 5'. Se demostro que el nucletido adicional se deriva del GTP aadido a la mezcla de reaccin.
"Nativa" Desnaturalizada por calor 5* 25 50 120 5 5* 25 50 120 E.coli

{NH4);,SO4.mM

1VS RNA-

FIGURA VE 11-1. RNA ribosmico purificado procedente de Tetrahymena marcado con 32P, transcrito a diferentes concentraciones de (NPL^SO,), que se analiz mediante gradiente de electroforesis en gel de poliacrilamida. Los nmeros en la parte de arriba indican la concentracin del sulfato de amonio. Se presentan dos grupos de muestras, "nativas" y desnaturalizadas por calor. Las muestras de este ltimo grupo fueron hervidas durante cinco minutos en amortiguador y enfriadas sobre hielo para disociar toda molcula que pueda unirse mediante puentes de hidrgeno entre bases complementarias. Las dos columnas de la derecha contienen RNAr 16S y 23S bacteriano que proporcionan marcadores de tamao conocido contra los cuales se pueden comparar otras bandas del gel. A partir de la posicin de las bandas se puede observar que conforme se eieva la concentracin de sulfato de amonio, aparece RNA pequeo cuyo tamao es igual al de las secuencias interpuestas aisladas. Estos datos suministraron la primera indicacin de que el RNAr tena capacidad para seccionar al intrn sin ayuda de factores adicionales. (Segn T.R. Cech y cois. Cel 27:488, 1931; con permiso de Cell Press.)

CAPITULO 11 Utilizacin de la informacin gentica: de la transcripcin a la traduccin

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table que a travs de todos estos cambios en el camino hacia el conocimiento de los factores hereditarios, cada idea acerca del gen retuvo su validez aunque se adapt a los nuevos datos citolgicos y moleculares. El descubrimiento de secuencias interpuestas cambi nuestro concepto una vez ms, terminando con el dogma prevaleciente de que una secuencia lineal ininterrumpida de nucletidos genera una secuencia correspondiente de aminocidos, y revel la inesperada complejidad de la transferencia de informacin dentro de la clula eucariota.

Como ocurre con frecuencia, el descubrimiento de nuevas circunstancias enigmticas ayuda a explicar otras. En este caso, se comprob que la mayor parte de los genes contienen un conjunto de intrones que en total corresponden a una longitud igual a varias veces la de los segmentos codificantes; esto fue un gran avance en el camino para explicar la existencia de demasiado DNA en los genomas de los organismos evolutivamente elevados y por qu los transcritos primarios son mucho ms largos que los mensajeros producidos en ltimo trmino.

El empalme de un intrn es una reaccin complicada que requiere reconocimiento de las secuencias que limitan el intrn, desdoblamiento de los enlaces fosfodister en ambos lados del intrn y unin de los fragmentos adyacentes, Se han efectuado todo tipo de esfuerzos para eliminar cualquier protena que pudiera adherirse al RNA antes de probar su capacidad de empalme, El RNA se ha extrado con detergente-fenol, se ha centrifugado a travs de un gradiente y se ha tratado con una enzima proteoltica. Slo hubo dos explicaciones razonables: el empalme lo efectuaba una protena enlazada firmemente al RNA o la molcula pre-RNAr era capaz de empalmarse por s misma. Esta ltima idea no era fcil de aceptar. Para resolver la cuestin de la presencia de una protena contaminante, Cech y colaboradores utilizaron un sistema artificial en el cual era imposible la existencia de protenas nucleares de empalme.2 El DNA que codifica al precursor de RNAr fue desarrollado en . coli mediante clonacin del DNA, a continuacin se purific y utiiiz como plantilla para la transcripcin in vitro por una RNA polimerasa bacteriana purificada. El pre-RNAr sintetizado in vitro se purific e incub por s solo en presencia de iones monovalentes y divalentes, y un compuesto de guanosina. Puesto que el RNA nunca haba estado en una clula, era imposible que estuviera contaminado por enzimas celulares empalmadas. Aun as, el pre-RNAr aislado sufri la reaccin de empalme precisa que haba ocurrido en la clula. El RNA tena que haberse empalmado por s solo. Como resultado de estos experimentos, se demostr que el RNA era capaz de catalizar una reaccin compleja de mltiples pasos. Los clculos indicaron que la reaccin se efectu con una velocidad diez millones de veces mayor, aproximadamente, en comparacin con la reaccin no catalizada. Por lo tanto, igual que las enzimas de protena, el RNA era activo en concentraciones pequeas, no se alteraba por la reaccin y pudo acelerar mucho una reaccin qumica. La nica diferencia entre este DNA y las "enzimas estndar" fue que el RNA acta sobre s mismo en vez de hacerlo sobre un sustrato independiente. Cech Hamo "ribozima" al RNA. En 1983 se descubri un segundo ejemplo, aunque no relacionado, de catlisis de RNA.3 Sidney Altman y colaboradores, de la Universidad de Vale, y Norman Pace y colegas, del National Jewish Hospital en Denver, colaboraron en un estudio acerca de la ribonucleasa P, enzima que participa en el procesamiento de un precursor de RNA de transferencia en bacterias. La enzima era poco comn por estar compuesta tanto de protenas como de RNA. Cuando se incub en amorti-

guadores con una concentracin elevada de Mg2+ (60 mM), la subunidad RNA purificada pudo eliminar el extremo 5' del precursor de RNAt (fila 7, fig. VE 11-2), as como la molcula ntegra de ribonucleasa P lo hara dentro de la clula. Se demostr que los productos de la reaccin in vitro incluyen la molcula de RNAt madura procesada. En contraste, la subunidad de protena aislada de la enzima estaba desprovista de actividad cataltica (fila 5, fig. VE 11-2). Para eliminar la posibilidad de que una protena contaminante fuera realmente la que catalizaba a reaccin, se sintetiz in vitro la porcin de RNA de la ribonucleasa P a partir de una

1 2 3

4 5

6 7 8 9 1 0

FIGURA VE 13-2. Resultados de la electroforesis en gel de poliacrilamida de la reaccin entre mezclas que contienen el precursor de tirosinil-RNAt (pTir) y el precursor de otro RNA llamado RNA 4.5S (p4.5). Nos centraremos exclusivamente en pTir, normalmente procesado por la RNAasa P en dos molculas de RNA, Tir y 5'-Tir (que corresponde al extremo 5', el precursor). Las posiciones a las cuales se desplazan estos tres RNA (pTir, Tir y 5'-Tir) durante la electroforesis se indican en el lado izquierdo del gel. La lnea 1 muestra los RNA que aparecen en la mezcla de reaccin cuando se incuba pTir (y p 4.5) con la enzima RNAasa P completa. Muy poco del pTir permanece en la mezcla porque se convierte en los dos productos (Tir y 5'-Tir). La lnea 5 muestra los RNA que aparecen en la mezcla de reaccin cuando pTir se incuba con el componente protenico purificado de la enzima. La protena no tiene capacidad para desdoblar el precursor RNAt, segn se manifiesta por la ausencia de bandas donde se desplazaran los dos productos. En contraste, cuando se incuba pTir con el componente RNA purificado de la enzima (lnea 7), pTir se procesa de manera tan eficiente como si se empleara la RNAasa P intacta. (Segn C. GuerrierTokada y cois. Cell 35:351, 1983; con permiso de Cell Press.)

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plantilla de DNA recombinante. Igual que con e RNA extrado de clulas bacterianas, este RNA sintetizado artificialmente, sin protena alguna aadida, pudo desdoblar con precisin el precursor de RNAt.4 A diferencia de la enzima procesadora de RNAr estudiada por Cech, el RNA de la ribonucleasa P actu sobre otra molcula como sustrato y no sobre s misma. Por lo tanto, se demostr que las ribozimas pueden tener las mismas propiedades catalticas de las enzimas proteinceas. En la figura VE 11-3 se muestra un modelo reciente de interaccin entre la subunidad de RNA cataltica de la ribonucleasa P y un sustrato precursor de RNAt. La demostracin de que el RNA puede catalizar reacciones qumicas gener la atmsfera apropiada para volver a investigar una antigua pregunta: qu componente de la subunidad ribosmica grande es la peptidiltransferasa, o sea, el catalizador de la formacin de los enlaces peptdicos (pg. 474). En el decenio de 1970, varios hallazgos independientes plantearon la posibilidad de que el RNA ribosmico poda hacer algo ms que actuar simplemente como un molde para sostener protenas ribosmicas particulares en la posicin apropiada de modo que las protenas puedan efectuar importantes actividades. Entre las pruebas se incluyen los siguientes tipos de datos. 1. Ciertas cepas de E. cali portan genes que codifican protenas que destruyen bacterias llamados colicinas. Se sabe que una de estas toxinas, llamada colicina E3, inhibe ia sntesis de protenas en clulas bacterianas sensibles. Los ribosomas aislados de clulas tratadas con colicina E3 parecen perfectamente normales segn la mayor parte de los criterios, pero no apoyan la sntesis de protenas in vitro. Un anlisis ms atento de dichos ribosomas revel que el defecto reside en el RNAr, no en la protena ribos-

mica. El RNA 16S de la subunidad pequea fue desdoblado por la colicina en casi 50 nucletidos desde su extremo 3', y sta es la causa de que la subunidad no apoyara la sntesis de protenas.5 2. Se observ que e! tratamiento de la subunidad ribosmica grande con ribonucleasa TI, una enzima que desdobla los enlaces entre nucletidos adyacentes del RNA, destruye la capacidad de la subunidad para efectuar la reaccin de la peptidiltransferasa.6 3. Estudios muy variados con antibiticos que inhiben la formacin del enlace peptdico, incluyendo cloranfenicol, carbomicina y eritromicina, sugieren que estos frmacos actan sobre el RNA ribosmico y no sobre la protena. Por ejemplo, se observ que los ribosomas se vuelven resistentes a los efectos del cloranfenicol como resultado de sustituciones en las bases del RNA ribosmico.7 4. Se ha demostrado que el RNA ribosmico se conserva con gran persistencia en la secuencia de bases, mucho ms que la secuencia de aminocidos de las protenas ribosmicas. Algunas regiones del RNA ribosmico prcticamente son invariables en ribosomas aislados de bacterias (tanto arqueobacterias como eubacterias), hongos, plantas y animales, y tambin en ribosomas aislados de mitocondrias y cloroplastos. Casi todas las regiones persistentemente conservadas se proyectan en la superficie del ribosoma. El hecho de que la secuencia de RNAr est tan conservada sugiere que estas molculas tienen un papel crucial en la funcin del ribosoma.8'9 En realidad, una conclusin del trabajo de C.R. Woese y sus colaboradores, publicado en 1975,8 afirma: "Puesto que la correlacin entre estas regiones conservadas y los sitios conocidos de unin ribosmica es escasa o no existe, hay una fuerte implicacin de que las grandes reas de RNA participan directamente en la funcin ribosmica." Luego del descubrimiento del RNA cataltico en los laboratorios de Cech y Altman se intensific la investigacin sobre el papel del RNA ribosmico. Varios estudios efectuados por Harry Noller y sus colegas en la Universidad de California, en Santa Cruz, precisaron el sitio en ei RNA ribosmico donde reside, o alrededor del cual se encuentra, el centro de la peptidiltransferasa. En un estudio, sintetizaron una versin modificada de fenilalanil-RNAt (fig. VE 11-4, a) que, cuando se enlaza al sitio P de un ribosoma, forma por s solo un enlace cruzado con la molcula RNAr. Incluso en esta etapa de unin cruzada, el RNAt anlogo retiene su capacidad de participar en la formacin de enlaces peptdicos, dato que indica que el anlogo debe estar situado en el sitio P con la orientacin apropiada. Anlisis subsecuentes del RNAr en estos experimentos indicaron que los nucletidos con enlace cruzado en el RNAr se localizan en un sitio altamente conservado que forma una asa central localizada en el dominio V de la molcula (fig. VE 11-4, b).10 Esta es precisamente la misma regin del RNAr que recientemente se seal como sitio de mutaciones que confieren resistencia al cloranfenicol o a la eritromicina (fig. VE 11-4, b). En conjunto, estos datos sealan fuertemente a esta asa del RNA como componente integral del centro de la peptidiltransferasa. En otra serie de experimen-

FIGURA VE 11-3. Modelo de la molcula de una porcin de la subunidad de RNA cataltico de la ribonucleasa P bacteriana (blanco) y de su sustrato enlazado, RNAt precursor (rojo). El sitio sobre el RNAt precursor donde ocurre el desdoblamiento causado por la ribozima est indicado por una esfera amarilla. (Cortesa de Michael E. Harris y Norman R. Pace.)

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Fen-RNAt

10 A

(a)

AGA

GGGUGCCGUCU CC
1
2620

A U_C

FIGURA VE 11-4, a) Estructura de la fenilalanil-RNAt modificada que se emplea en los experimentos, b) Estructura secundaria del dominio V del RNAr 23S bacteriano. Los residuos U en los sitios 2584 y 2585 estn marcados por fotoafinidad para el RNAt anlogo mostrado en 17 en el sitio ribosmico P. Las secuencias en cuadro son altamente conservadas a travs de la evolucin; tambin se muestran sitios donde hay cambio de bases como resultado de la resistencia a cloranfenicol (tringulo slido) y eritromicina (asterisco). (Segn A. Baria \j cois. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 51:3607-3610, 1984.)

C GGUUGUGGCGG U I C

249

G C U
24BO

2500

2600N K\A<S GA \ \ \ G 2590

G CU UG

Gf /S/ J 258Q U * G

<$*y ji>^

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C - G G - C -2510

PB-Fen-RNAt

.A G - C ** A U 2570 G ~ C G
V

X:
U G A A A

*
AUCCUGGGGCU
i i i i i i i i i
G

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A
_

UGGGACCCUGG.U
U 2560-A C C G A U G G-2550 C 40

(b)

tos se demostr que el RNA de transferencia enlazado al ribosoma protege bases especficas en el RNAr de la subunidad grande contra el ataque de agentes qumicos especficos. La proteccin contra ataques qumicos indica que el RNAt debe estar situado muy cerca de las bases RNAr protegidas. Diferentes grupos de bases son protegidos dependiendo de que el RNAt se enlace al sitio A o al P, pero en cualquier caso los nucletidos protegidos se sitan dentro del asa central del dominio V, o alrededor de sta.11 La proteccin se pierde si el extremo 3' del RNAt fel extremo con el CCA enlazado al aminocido) se elimina. Este es el extremo del RNAt implicado en la formacin del enlace peptdico, el cual sera de esperar que residiera en estrecha proximidad al sitio de la peptidiltransferasa.

Los intentos para asignar una funcin particular al RNA ribosmico aislado siempre han fracasado. Se considera que aun si la protena ribosmica no tiene funcin especfica, su presencia cuando menos es necesaria para mantener el RNAr en su conformacin apropiada. Considerando que las protenas ribosmicas y el RNAr evolucionaron conjuntamente durante cientos de millones de aos, sera de esperar que las molculas fueran interdependientes. A pesar de esta expectativa, en 1992 Harry Noller y sus colaboradores finalmente demostraron a potencia cataltica del RNAr aislado.12 Trabajando con ribosomas particularmente estables de Tiiermtis aquaticus, una bacteria que vive a temperaturas elevadas, Noller trat preparaciones de la subunidad ribosmica grande con un detergente extractor de protena (DSS), una enzima que degrada

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protenas (proteinasa K) y varios pasos en fenol desnaturalizado! de protenas. En conjunto, estos agentes eliminaron cuando menos 95% de la protena de la subunidad ribosmica dejando nada ms RNAr. Se demostr que ms de 5% de la protena que permaneci asociada al RNAr constaba de pptidos pequeos, que eran fragmentos de las protenas ribosmicas. Pero a pesar de eliminar casi toda la protena, el RNAr retuvo 80% de la actividad peptidiltransferasa de la subunidad intacta. La actividad cataltica fue bloqueada por cloranfenicol y por el tratamiento con ribonucleasa. Cuando se someti el RNA a tratamientos adicionales para eliminar la pequea cantidad de protena restante, la preparacin perdi su actividad cataltica. Puesto que es muy poco probable que los fragmentos restantes de protena sean lo bastante grandes para mostrar cualquier actividad cataltica importante, hay acuerdo general de que estos experimentos demostraron que la peptidiltransferasa es una ribozima. BIBLIOGRAFA
1. Cech, T.R., Zaug, A.J. y Grabowski, P.J. 1981. In vitro splicing of the ribosomal RNA precursor of Tetrahymena. CeU 27:487-496. 2. Kruger, K. y cois. 1982. Self-splicing RNA: Autoexcision and autocyclization of the ribosomal RNA intervening sequence of Tetrahymena. Cell 31:147-157.

3. Guerrier-Tokada, C. y cois. 1983. The RNA moiety of ribonuclease P is the catalytic subunit of the enzyme. Cell 35:849-857. 4. Guerrier-Tokada, C. y cois. 1984. Catalytic activity of, an RNA molecule prepared by transcription in vitro. Science 223:285-286. 5. Bowman, C.M. y cois. 1971. Specific inactivation of 16S ribosomal RNA produced by colicin E3 in vivo. Proc, Nati Acad. Sel U.S.A. 68:964-968. 6. Cerna, ]., Rychlick, I. y Jonak, J. 1975. Peptidyl transferase activity of Escherichia cali ribosomes digested by ribonuclease TI. Eur. J. Biochem. 34:551-556. 7. Kearsey, S. y Craig, I.W. 1981. Altered ribosomal RNA genes in mitochondria from mammalian cels with chloramphenicol resistance. Nature 290:607-608. 8. Woese, C.R. y cois. 1975. Conservation of primary structure in 16S ribosomal RNA. Nature 254:83-86. 9. Noller, H.F. y Woese, C.R. 1981. Science 212:403. 10. Barta, A. y cois. 1984. Identification of a site on 23S ribosomal RNA located at the peptidyl transferase center. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 81:3607-3611. 11. Moazed, D. y Noller, H.F. 1989. Interaction of tRNA with 23S rRNA in the ribosomal A, P, and E sites. Cell 57:585-597. 12. Noller, H.F., Hoffarth, V. y Zimniak, L. 1992. Unusual resstante of peptidyl transferase to protein extraction procedures. Science 256:1416-1419.

SINOPSIS
Nuestro conocimiento de la relacin entre genes y protenas es resultado de algunas observaciones clave. La primera observacin importante fue efectuada por Garrod, quien concluy que las personas que sufren enfermedades metablicas hereditarias carecen de enzimas especficas. Ms tarde, Beadle y Tatum pudieron inducir mutaciones en los genes de Neurospora e identificar la reaccin metablica especfica afectada. Estos estudios condujeron al concepto de "un gen-una enzima" y posteriormente a la versin ms refinada de "un gen-una cadena de polipptidos". Las consecuencias moleculares de una mutacin fueron descritas por primera vez por Ingram, quien demostr que la anemia drepanoctica, una enfermedad hereditaria, se debe a la sustitucin de un solo aminocido en una cadena de globina (p. 434). El primer paso en la expresin de un gen es la transcripcin de una cadena de la plantilla de DNA por una RNA polmerasa. Las molculas de polimerasa se dirigen al sitio apropiado sobre el DNA al enlazarse a una regin promotora, que en casi todos los casos se sita justamente por delante del sitio en el cual se inicia la transcripcin. La polimerasa se desplaza en la direccin 3' a 5' a lo largo de la cadena de DNA que sirve como plantilla, que se ensambla a una cadena complementaria antiparalela de RNA que crece desde su extremo terminal 5' en direccin 3'. A cada paso a lo largo de la va, la enzima cataliza una reaccin en la cual se hidrolizan trifosfatos de ribonuclesido (NTP) para convertirse en monofosfatos de nuclesido conforme son incorporados. La reaccin tambin es controlada por hidrlisis del pirofosfato liberado. Los procariotes poseen un solo tipo de RNA polimerasa que puede asociarse a varios factores sigma diferentes que determinan cules genes se transcriben. El sitio donde se inicia la transcripcin es determinado por una secuencia de nucletidos localizada aproximadamente 10 bases adelante del sitio de inicio (p. 437). Las clulas eucariotas tienen tres RNA polimerasas distintas (I, II y III), cada una encargada de la sntesis de grupo diferente de RNA. Casi 80% del RNA de la clula consta de RNA ribosmico (RNAr). Los RNA ribosmicos (con excepcin de la especie 5S) son sintetizados por RNA polimerasa I; transfieren RNA mediante la RNA polimerasa III; y el RNAm por la RNA polimerasa II. Los tres tipos de RNA se derivan de transcritos primarios que son ms largos que el producto RNA final. El procesamiento de RNA requiere varios RNA nucleares pequeos (RNAnp) (p. 441). Tres de los cuatro RNAr eucariotas (5.8S, 18S y 28S) se sintetizan a partir de una sola unidad de transcripcin, constituida por DNA (DNAr) localizada dentro del nuclolo, y se procesa mediante una serie de reacciones nucleolares. Los nuclolos de oocitos de anfibios se pueden dispersar para revelar activamente el DNAr transcrito que toma la forma de una cadena de "rboles de- Navidad". Cada uno de los rboles es una unidad de transcripcin cuyas ramas ms pequeas representan a los RNA ms cortos que se encuentran en la etapa ms temprana de transcripcin, o sea, ms prximos al sitio donde se inici la sntesis de RNA. El anlisis de esto;

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complejos revela la disposicin en serie de los genes RNAr, la presencia de espaciadores no transcritos que separan las unidades de transcripcin y la presencia de partculas de ribonucleoprotenas acompaantes (RNP) implicadas en el procesamiento de los transcritos. Los pasos que ocurren en el procesamiento del RNAr fueron estudiados al exponer clulas de mamfero cultivadas a precursores marcados, como 14C-metionina, cuyos grupos metilo se transfirieron a algunos nucletidos del pre-RNAr. Se cree que la presencia de los grupos metilo protege ciertos sitios del RNA a partir del desdoblamiento por nucleasas implicadas en el procesamiento del transcrito. Casi la mitad de los transcritos primarios 45S se eliminan durante la formacin de los tres productos RNAr maduros. El nuclolo tambin es sitio de ensamblado de las subunidades ribosmicas (p. 443). Los precursores del RNAr 5S y del RNAt son sintetizados por la RNA polimerasa III, cuyo promotor se localiza en la porcin transcrita del gen en vez de la regin que lo flanquea hacia arriba. Ambos tipos de RNA se sintetizan en tramos de DNA en los cuales los genes estn organizados en serie, con las porciones transcritas alternando con espaciadores no transcritos. Luego de su procesamiento, los RNAr 5S son transportados al nuclolo donde son ensamblados con otros componentes en la subunidad ribosmica grande. Los genes de RNA de transferencia se localizan en grupos que contienen mltiples copias de diferentes genes (P- 447). Estudios de cintica de RNA rpidamente marcado sugieren que el RNAm se deriva de precursores mucho mayores. Cuando se incuban clulas eucariotas de uno a pocos minutos en 3H-uridina u otros precursores de RNA marcados, la mayor parte de la marca se incorpora al grupo de molculas RNA de peso molecular muy elevado y diversas secuencias de nucletidos, y se restringen al ncleo. Estos RNA se conocen como RNA nuclear heterogneo (o RNAnh). Cuando las clulas incubadas brevemente con 3H-uridina se siguen en un medio que contenga precursores no marcados durante una hora o ms, la radiactividad aparece en el RNAm citoplsmico ms pequeo. Este y otros datos, como la presencia de casquete 5' y apndice poli(A) 3' en ambos RNAnh y RNAm, llev a la conclusin de que el RNAnh es el precursor del RNAm (p. 448). Los pre-RNAm son sintetizados por accin de molculas de RNA polimerasa II junto con algunos factores de transcripcin general que permiten a la polimerasa reconocer el sitio del DNA apropiado e iniciar la transcripcin en el nucletido apropiado. En casi todos los genes estudiados, el promotor se sita entre las bases 24 y 32 adelante del sitio de inicio en una regin que contiene el segmento TATA. Este segmento TATA es identificado por la protena de enlace TATA (PET), cuyo enlace al DNA inicia el ensamblado de un complejo de preinicio. La fosforilacin de una parte de la RNA polimerasa provoca la separacin de la polimerasa y el inicio de la transcripcin (P- 449). Una de las revisiones ms importantes en nuestro concepto de gen tuvo lugar a fines del decenio de 1970 con el descubrimiento de que las regiones codificantes de un gen no forman

una secuencia continua de nucletidos. Las primeras observaciones a este respecto fueron efectuadas en estudios de transcripcin del genoma de un adenovirus, en el cual se observ que la porcin terminal de algunos RNA mensajeros diferentes se componen de la misma secuencia de nucletidos codificados por segmentos discontinuos en el DNA. Las regiones situadas entre los segmentos codificantes se denominan secuencias interpuestas. Pronto se observ una condicin similar para los genes celulares, como los que codifican globina 3 y ovalbmina. En cada caso, las regiones de DNA que codifican porciones del polipptido (exones) estn separadas entre s por regiones no codificantes (intrones). Un anlisis subsecuente indic que todo el gen se transcribe a un transcrito primario. Las regiones correspondientes a los intrones son eliminadas posteriormente del pre-RNA y se le unen los segmentos codificantes adyacentes. Este proceso de separacin y reunin se denomina empalmado del RNA (p- 451). Los principales pasos en el procesamiento de los transcritos primarios para convertirlos a RNAm incluyen adicin de un casquete 5', formacin de un extremo 3', adicin de un apndice poli(A) 3' y eliminar las secuencias interpuestas. La formacin del casquete 5' ocurre mediante una reaccin por pasos en la cual se extrae el fosfato terminal, se aade GMP en orientacin inversa, y se agregan grupos metilo a la guanosina aadida y al primer nucletido del propio transcrito. E! extremo 3' final del RNAm se genera por desdoblamiento del transcrito primario justo en el sitio situado por debajo de un punto de reconocimiento AAUAAA y la adicin de residuos de adenosina, uno a la vez, mediante la polimerasa poli(A). La eliminacin de los intrones del transcrito primario depende de la presencia de residuos invariables en ambos sitios de empalme 5' y 3' sobre cualquier lado de cada intrn. El empalme se efecta por un esplceosoma multicomponente que contiene varias protenas y partculas de ribonucleoprotenas {RNPnp} que se ensamblan de manera gradual en el sitio donde se retira el intrn. El conocimiento de la evolucin de los mecanismos de empalme se obtuvo a partir de estudios de reacciones de autodesdoblamiento de los intrones del grupo I y el grupo II de RNA en eucariotes inferiores, mitocondrias y cloroplastos. Estos estudios sugieren fuertemente que los RNAnp del espliceosoma, no las protenas, son los componentes catalticamente activos de los RNPnp. Uno de los beneficios aparentes del desdoblamiento de genes es la facilidad con la cual se pueden barajar los exones dentro del genoma y generar nuevos genes a partir de secciones de otros genes preexistentes (P- 455). La informacin para la incorporacin de aminocidos a un polipptido est codificada en la secuencia de tripletos de codones en el RNAm. Adems de encontrase en el tripleto, el cdigo gentico no es un cdigo superpuesto y est deteriorado. En un cdigo no superpuesto, cada nucletido es parte de uno y slo de un codn, y el ribosoma debe desplazarse a lo largo del mensaje, tres nucletidos cada vez. Para asegurar la lectura de los tripletos apropiados, el ribosoma se fija al RNArn en el sitio preciso denominado codn de inicio, AUG, que automticamente coloca al ribosoma en el cuadro de lectura apropiado de modo que lea correctamente todo el mensaje. Un cdigo tripleto formado por cuatro diferentes nucletidos puede tener 64 (43) codones diferentes. El cdigo est

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deteriorado debido a que muchos de los 20 aminocidos tienen ms de un codn. De os 64 codones posibles, 61 especifican un aminocido, en tanto que los otros tres son codones para detener el proceso y provocan que el ribosorna concluya la traduccin. Las funciones asignadas a los codones son prcticamente las mismas en toda clula y sus secuencias son tales que la sustitucin de bases en el RNAm tiende a reducir al mnimo el efecto sobre las propiedades del polpptido (p. 465). La informacin contenida en el alfabeto de nucletidos del DNA y el RNA es descodificada por el RNA de transferencia durante el proceso de traduccin. Los RNA de transferencia son RNA pequeos (73 a 93 nucletidos de largo} que comparten una estructura tridimensional similar en forma de L y algunos residuos invariables. Un extremo del RNAt posee el aminocido y el otro extremo contiene una secuencia anticodn de tres nucletidos complementaria del tripleto de codn del RNArn. Los requerimientos estricos de complementariedad entre codn y anticodn son menos estrictos en la tercera posicin del codn para permitir que diferentes codones que especifican el mismo aminocido utilicen el mismo RNAt. Es indispensable que cada RNAt se una al aminocido apropiado (conocido), o sea, el aminocido especificado por el codn RNAm al cual se une el anticodn RNAt. El enlace de los RNAt con sus aminocidos conocidos est garantizado por un grupo diverso de enzimas denominadas aminoacil-RNAt sintetasas. Cada enzima es especfica para uno de los 20 aminocidos y puede reconocer todos los RNAt a los cuales cada aminocido debe unirse. El consumo de energa durante la formacin de los aminoacil-RNAt es el paso primario que requiere energa en todo el proceso de ensamblado de polipptidos (p. 468).

La sntesis de protenas es la actividad sinttica ms compleja que ocurre dentro de una clula, e implica todos los diferentes RNAt con los aminocidos a los cuales se unen los ribosomas, el RNA mensajero, algunas protenas, los cationes y GTP. El proceso se divide en tres actividades: inicio, alargamiento y terminacin. Las actividades principales de inicio incluyen la unin precisa de la subunidad ribosmica pequea al codn de inicio del RNAm, que establece el marco de lectura para todo el proceso de traduccin; la entrada al ribosoma de un RNAt/ Met especial de inicio, y el ensamblado del mecanismo de traduccin. Durante el alargamiento ocurre un ciclo de entrada del RNAt, formacin de enlace peptdico y salida del RNAt autorrepetido con cada aminocido incorporado. El aminoacil-RNAt penetra a travs del sitio A, donde se une al codn complementario del RNAm. Conforme penetra cada RNAt, el polipptido naciente fijo al RNAt del sitio P es transferido al aminocido sobre el RNAt del sitio A, formando una unin peptdica. La formacin de uniones peptdicas es catalizada por una porcin del RNAr grande que acta como ribozima. A continuacin el RNAt no cargado del sitio P es expulsado y el ribosoma se transloca al siguiente codn del RNAm, listo para repetir el ciclo. Tanto el inicio como el alargamiento requieren hidrlisis de GTP, que se cree que sirve principalmente para incrementar la precisin de la traduccin. La traduccin termina cuando el ribosoma alcanza uno de los tres codones de paro. Luego que un ribosoma se ensambla en el codn de inicio y se desplaza una corta distancia hacia el extremo 3' del RNAm, generalmente otro ribosoma se fija al codn de inicio, de modo que cada RNAm es traducido simultneamente por varios ribosomas, lo que incrementa mucho la tasa de sntesis de protena dentro de la clula. El compiejo formado por un RNAm y sus ribosomas acompaantes constituyen un polirribosoma (p. 471).

PREGUNTAS DE REPASO
1. Por qu razn Beadle y Tatum concluyeron que un gen codifica una enzima especfica? 2. Cmo pudo Ingram determinar el aminocido sustituido en la hemoglobina de personas con anemia drepanoctica sin secuenciar la protena? 3. Cul es el papel de un promotor en la expresin de genes? Dnde se localizan los promotores para diferentes polimerasas procariotas y eucariotas? 4. Describir la diferencia entre un transcrito primario, una unidad de transcripcin, un RNAm maduro y un intermediario de procesamiento. 5. Dibujar un esquema de una micrografa electrnica de DNAr que est siendo transcrito. Marcar el espaciador no transcrito, el espaciador transcrito, las molculas de RNA polimerasa, el RNPnp U3 y el promotor. 6. Comparar la organizacin de los genes que codifican RNAr grandes y RNA 5S, y el RNAt dentro del genoma de un vertebrado. 7. Qu es la separacin de un gen? Cmo se descubri el rompimiento de genes? 8. Cul es la relacin entre RNAnh y RNAm? Cmo se descubri esta relacin? 9. Cules son los pasos generales en el procesamiento de un pre-RNArn a un RNAm? Cul es e papel de los RNAnp y del espliceosoma? 10. Qu significa el trmino "mundo de RNA"? Qu tipo de pruebas argumentan en favor de su existencia? 11. Explicar qu significa la expresin: el cdigo gentico es tripleto y no superpuesto. Qu sugiere el dato de que la composicin de bases del DNA vara mucho entre diferentes organismos en relacin con el cdigo gentico? Cmo se estableci la identidad del codn UUU? 12. Por qu se conocen los RNAt como molculas adaptadoras? Qu aspecto estructural tienen en comn los RNAt? 13. Describir a naturaleza de la interaccin entre RNAt y arninoacil-RNAt sintetasas. Describir la naturaleza de la interaccin entre RNAt y RNAm. Qu significa la hiptesis de la flexibilidad de la interaccin? 14. Describir algunas diferencias entre los pasos de inicio de la traduccin y los pasos de alargamiento de la misma. 15. Qu es un polirribosoma? En qu difiere su formacin en procariotes y eucariotos?

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PREGUNTAS ANALTICAS
1. Qu codones esperara usted que tengan un RNAt nico, o sea, uno que slo se emplea para ese codn? Por qu muchos codones no tienen su propio RNAt nico? 2. La proflavina es un compuesto que se autointroduce en el DNA y provoca mutaciones que cambian los cuadros de lectura. En qu difiere el efecto de las mutaciones inducidas por proflavina en la secuencia de aminocidos de un cdigo superpuesto y de otro no superpuesto? 3. Se acaba de aislar un nuevo frmaco que slo tiene un efecto claro sobre el metabolismo celular: inhibe totalmente el desdoblamiento de pre-RNAr a RNA ribosmico. Luego de tratar un cultivo de clulas con este frmaco, se suministra a las clulas 3H-uridna durante dos minutos y luego se les deja crecer durante cuatro horas en presencia del frmaco en un medio no marcado antes de extraer el RNA y centrifugarlo a travs de un gradiente de sucrosa. Dibujar las curvas que se obtienen graneando absorbancia a 260 nm y radiactividad contra nmero de fracciones del gradiente. En la abscisa, utilizar valores S de RNA. 4. Empleando los mismos ejes para la grfica de la pregunta anterior, dibujar el perfil de un RNA radiactivo obtenido luego de incubar clulas cultivadas durante 48 horas en 3H-uridina sin frmaco inhibidor alguno. 5. Supongamos que usted elabora un RNA sinttico a partir de un dmucetido repetido (p. ej., AGAGAGAG) y luego utiliza este RNA como mensajero para sintetizar un polipptido en un sistema sintetizador de protenas in viiro, como el empleado por Nirenberg y Matthaei para producir polifenilalanina. Qu tipo de polipptido esperara producir a partir de este polinucletido particular? Esperara tener rns de un tipo de polipptidos producido? Por qu s o por qu no? 6. Supongamos que encuentra una enzima que se incorpora al azar a nucletidos dentro de un polmero sin el requerimiento de una plantilla. Cuntos codones diferentes podra encontrar en el RNA sinttico elaborado utilizando dos diferentes precursores nucletidos (p. ej., CTP y ATP)? (Una enzima denominada polinucletido fosforilasa cataliza este tipo de reaccin y se utiliz en estudios para identificar codones.) 7. Dibujar las partes de una globina 155 pre-RNAm marcando las porciones no codificantes. 8. Cul es el menor nmero de GTP que se necesitara para sintetizar un pentapptido? 9. En los mismos ejes de la grfica, dibujar dos curvas de renaturalizacin (vase la figura 10-20): una para DNA extrado de tejido cerebral de Xenopus y la otra de DNA extrado de oocitos de Xenopus. 10. Estara de acuerdo con la siguiente afirmacin? El descubrimiento de que la anemia drepanoctica es resultado del cambio en un solo aminocido demuestra que el cdigo gentico no es superpuesto. Por qu s o por qu no? 11. La talasemia es una enfermedad caracterizada por mutaciones que convierten codones de aminocidos en codones de terminacin. Supongamos que debe comparar los polipptidos sintetizados in vtro a partir de RNAm purificado de una gran variedad de pacientes de talasemia. Cmo esperara comparar estos polipptidos? Observe la carta de codones de la figura 11-41. Cuntos codones de aminocidos pueden convertirse en codones de paro sustituyendo una sola base? 12. Piensa usted que sera posible obtener un cdigo gentico con slo dos letras, A y T? Si su respuesta es afirmativa, cul sera el menor nmero de nucletidos requeridos para elaborar un codn? 13. Durante el alargamiento de una cadena de polipptidos: 1) el RNAt se desplaza de un codn del RNAr al siguiente; 2) el ribosoma se mueve acercndose al extremo 3' del RNAm; 3) la cadena creciente del polipptido pasa del RNAt del sitio P al aminocido presente en el sitio A; 4) el RNAt entra al sitio P vaco. Encierre en un crculo las respuestas correctas. 14. Cmo es posible que la sntesis de RNAm ocurra a una mayor tasa en las clulas bacterianas que en cualquier otro tipo de RNA, aunque muy poco RNAm se encuentra dentro de esa clula? 15. Si un codn para serina es 5'-AGC-3', el anticodn para -3'. Cmo afectara la flexibieste tripleto sera 5-. lidad esta interaccin codn-anticodn?

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CAPITULO

12

Ncleo de la clula y control de la expresin de genes

12-1 El ncleo de una clula eucariota La perspectiva humana: Aberraciones cromosmicas 12-2 Control de la expresin de genes en procariotes 12-3 Control de la expresin de genes en eucariotes La va experimental: Genes que controlan el desarrollo embrionario

FIGUIA 1 2-A. Cromosomas humanos durante a meta/ase marcados con fluorescencia mediante hibridacin in situ con DNA procedente de seis distintas fuentes, cada uno especifico para un cromosoma diferente. Los cromosomas marcados se fumaron con una cmara de imgenes digitales y se seudocolorearon mediante procesamiento en computadora. Los cromosomas 1, 2, 4, 8, 14 y X aparecen en verde, violeta, blanco, naranja, rojo y amarillo, respectivamente. Otros cromosomas aparecen en azul. (Cortesa de Tilomas Ried y David C. Ward, Yale Universty.)

pesar de diferencias obvias en forma y funcin, las diversas clulas que constituyen un organismo multicelular, sea hongo, rbol o mamfero, contienen un conjunto completo de genes. Una clula cartilaginosa y una neurona muestran pequea semejanza exterior, aunque ambos tipos de clulas contienen el mismo complemento de genes. La informacin gentica presente en una clula eucariota especializada se puede comparar con los planos elaborados para construir un gran edificio de muchas habitaciones. Durante el proceso de construccin, probablemente ser necesario consultar todos los mapas, pero en el trabajo paraun piso o una habitacin particular slo debe consultarse un pequeo subconjunto de esta informacin. Lo mismo puede decirse de un huevo fertilizado que contiene una dotacin completa de instrucciones genticas que deben duplicarse fielmente y distribuirse a cada una de las clulas del organismo en desarrollo. Como resultado, las clulas contienen mucho ms informacin gentica de la que podrn utilizar en toda su existencia. En consecuencia, las clulas contienen mecanismos que es permiten expresar su informacin gentica selectivamente siguiendo slo las instrucciones relevantes para dicha clula en ese momento particular. En este captulo se exploran algunas maneras en que las clulas controlan la expresin del gen, lo que garantiza que se sintetizan ciertas protenas y otras no. Sin embargo, primero describiremos la estructura y propiedades del ncleo de ias clulas eucariotas en el cual reside casi todo el mecanismo de regulacin.

48S

CAPITULO 12 Ncleo de la clula i/ control de la expresin de genes

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12-1 El ncleo de una clula eucariota

Considerando su importancia en el almacenamiento y utilizacin de la informacin gentica, el ncleo de una clula eucariota tiene morfologa ms bien comn (fig. 12-1, a). El contenido del ncleo aparece como masa viscosa amorfa de material contenido en una envoltura nuclear compleja. Dentro del ncleo de una clula tpica en su inferase (o sea, no mittica) se incluyen; 1) los cromosomas, visibles como fi-

bras muy largas de nucleoprotena llamada cromatina; 2) la matriz nuclear, que es una red fbrilar que contiene protenas; 3) uno o ms nuclolos, que son estructuras amorfas electrnicamente densas que sirven para sintetizar RNA ribosmico y en el ensamblado de ribosomas (estudiado en la pgina 446), y 4) el nudeoplasma, sustancia lquida en la cual se disuelven los solutos del ncleo. Los diferentes elementos de un ncleo eucariota se muestran esquemticamente en la figura 12-1, b. Envoltura nuclear El trmino envoltura nuclear, en oposicin a membrana nuclear, denota la compleja organizacin de la estructura en la frontera entre el ncleo y el citoplasma de una clula eucariota. La separacin del material gentico celular del citoplasma que la rodea puede ser la caracterstica nica ms importante que distingue a los eucariotes de los procariotes, lo que confiere al aspecto de la envoltura nuclear el carcter de punto de referencia en la evolucin biolgica. La envoltura nuclear consta de varios elementos (fig. 12-2, a). La continuidad de la envoltura nuclear como estructura limitante se mantiene por medio de un par de membranas concntricas separadas por un espacio intermembrana de 10 a 50 nm. Las dos membranas se funden en diferentes sitios formando un poro circular que contiene un armazn complejo de protenas. La densidad de los poros nucleares vara de casi 2 a 4 por/m 2 en la envoltura nuclear del eritrocito metablicamente inactivo de un ave, hasta ms de 60 por /m2 en la envoltura nuclear de un oocito que se prepara para los requerimientos provenientes del desarrollo embrionario. La clula promedio de los mamferos contiene cerca de 3 000 poros nucleares. En la membrana externa por lo general se observan ribosomas dispersos y casi siempre se contina con la membrana del retculo endoplsmico (fig. 12-2, a). La superficie interna de la envoltura nuclear se encuentra revestida por una red fibrilar densa, denominada lmina nuclear. En algunas clulas, como los oocitos de los anfibios, la lmina nuclear forma una capa bastante continua (fig. 12-3), en tanto que en otras clulas aparece ms fragmentada. Se piensa que la lmina nuclear acta como apoyo estructural para la envoltura nuclear y sirve tambin como sitio para anclar las fibras de cromatina en la periferia del ncleo (fig. 12-2, b). Las fibrillas de la lmina nuclear tienen aproximadamente 10 nm de dimetro y se componen de polipptidos, llamados lminas, que pertenecen a la misma familia de superpolipptidos que constituyen los filamentos intermedios de 10 nm del citoesqueleto (pg. 350). Igual que los filamentos intermedios del citoplasma, la integridad de la lmina nuclear es regulada por fosforilacin y desfosforilacin. AI parecer, el desensamblado de la lmina nuclear antes de la rrdtosis es inducido por fosforilacin de las lminas mediante una cinasa especfica (seccin 14-2).
Estructura y funcin del complejo de poros nucleares

1 pm

Envoltura nuclear \oro nuclear

Matriz nuclear Nudeoplasma Cromatina

(b)
FIGURA 12-1. El ncleo de la clula, a) Micrografa electrnica de una interfase del ncleo de la clula HeLa que muestra un par de nuclolos y cromatina dispersa. Es evidente que la heterocromatina (pg. 498) rodea toda la superficie interna de la envoltura nuclear. Se observan dos regiones prominentes y tambin grumos de cromatina dispersos a travs del nucleoplasma. b) Dibujo esquemtico que muestra algunos de los principales componente del ncleo, (a: Segn Werner W. Frnnke, Jnt. Rev. Cytol. [Suppl.] 4:130, 1974.)

La envoltura nuclear es la barrera entre dos de los principales compartimientos de la clula: el ncleo y el citoplasma,

490

CAPITULO 12 Ncleo de la clula y control de la expresin de genes

Protema integral

Citoplasma Ribosoma Membrana interior Complejo del poro nuclear RE

Membrana exterior

2um
0.2 un

FIGURA 12-2. La envoltura nuclear, o) Diagrama esquemtico que muestra la doble membrana, poros nucleares, lmina nuclear y la continuidad de la membrana externa con el retculo endoplsmico rugoso, b) Micrografa electrnica de un corte a travs de una parte de la envoltura nuclear de una clula del extremo de una radcula de cebolla. Ntese la doble membrana con el espacio interpuesto, los complejos de los poros nucleares y la heterocromatina relacionada que no se extiende al interior de la regin de los poros nucleares, (b: Segn Wemer W. Franke y cois. ]. Cell Biol. 91:475, 1981; con permiso de Rockefeller University Press.)

FIGURA 12-3. La lmina nuclear. Micrografa electrnica de una envoltura nuclear congelada en seco y sombreada con meta! de un oocito de Xenopus extrado con el detergente no inico Tritn X-100. La lmina parece ms bien como una red continua que incluye filamentos orientados regularmente en direccin perpendicular entre s. El recuadro muestra una regin bien preservada de la cual se han quitado mecnicamente los poros nucleares. (Reimpreso con permiso de Ueli Aebi y cois. Nature 323:561, 1986; copyright 1986 Macmian Magazines Limited.)

y los poros nucleares constituyen las puertas a travs de la barrera. A diferencia de la membrana plasmtica, que evita el paso de macromolculas entre el citoplasma y el espacio extracelular, la envoltura nuclear es un punto de gran actividad para el movimiento de RNA y protenas en ambas direcciones entre los compartimientos que separa. La duplicacin y transcripcin del material gentico dentro del ncleo requiere la participacin de numerosas protenas que deben sintetizarse en el citoplasma y transportarse a travs de la envoltura nuclear. A la inversa, los RNAm, RNAt y las subunidades ribosmicas elaboradas en el ncleo deben transportarse a travs de la envoltura nuclear en la direccin opuesta. Algunos componentes, como los RNAnp, se mueven en ambas direcciones; se sintetizan en el ncleo, se ensamblan para formar las partculas de RNP en el citoplasma, y luego regresan al ncleo donde participan en el procesamiento del RNAm. Todo este trfico se canaliza a travs de los poros nucleares. Puesto que materiales tan grandes como las subunidades ribosmicas pueden deslizarse a travs de los poros nucleares (fig. 12-4), podramos asumir que son simplemente canales abiertos, pero es todo lo contrario. Los poros nucleares contienen un aparato complejo en forma de canasti-

lia denominado complejo del poro nuclear (CPN), que se adapta sobre el poro igual que un tapn y se proyecta hacia afuera en direccin al citoplasma y al nucleoplasma. La estructura del CPN puede observarse en las micrografas electrnicas de la figura 12-5 y los modelos de la figura 12-6. El CPN es un complejo molecular enorme que muestra simetra octagonal y contiene de 100 a 200 polipptidos; la rr. :a de un CPN es casi 30 veces la de un ribosoma. Se cuenta con modelos cada vez ms refinados de la complicada estructura del CPN conforme se desarrollan tcnicas ms poderosas de microscopia electrnica y de anlisis por imagen. Cuando se inyectan solutos de bajo peso molecular dentro del citoplasma de una clula, pueden penetrar con rapidez a travs de los poros nucleares por simple difusin. Se sugiere que estos compuestos se desplazan a travs de las hendiduras situadas entre los rayos de la canastilla (fig. 12-6, ti). La capacidad de molculas mayores (como protenas y nucleoprotenas) para pasar del citoplasma al ncleo depende de que sean o no residentes normales del ncleo. Por ejemplo, cuando una protena no nuclear, como la albmina del suero bovino, se marca con istopo radiactivo y se inyecta en el citoplasma, tiende a permanecer en el citoplasma. Por lo contrario, cuando se efecta el mismo experimento con una protena nuclear, como la nucleoplasmina, la protena marcada penetra con rapidez al ncleo.

CAPITULO 12 Ncleo de la clula y contro! de la expresin de genes

491

0.1 ym

FIGURA 12-4. Movimiento de materiales a travs del poro nuclear. Micrografa electrnica de un corte a travs de la envoltura nuclear de una clula de insecto mostrando el movimiento de material granular a travs del poro nuclear desde el ncleo (N) al interior del citoplasma (Cy). (Segn Barbara J. Stevens / Rewson Swift, J. Cell Biol. 31:72, 1966; con permiso de Rockefeller University Press.)

En 1982, Robert Laskey y sus colaboradores, del Medical Research Council de Inglaterra, observaron que la nucleoplasmina, una de las protenas nucleares ms abundantes en los oocitos de anfibios, contiene un tramo de aminocidos cerca de su C terminal que acta como seal de localizan nuclear (SLN), lo que permite a la protena atravesar los poros nucleares y entrar al ncleo. Desde entonces se han identificado muchas SLN, la mayor parte de las cuales constan de uno o dos tramos cortos de aminocidos con carga positiva. Por lo tanto, la orientacin de las protenas hacia el ncleo es similar en principio al trfico de otras protenas destinadas a ser aisladas dentro de un organelo particular, como una mitocondria (pg. 197) o un peroxisoma (pg. 197). En todos estos casos, las protenas poseen una "direccin postal" especfica que puede reconocer a un receptor determinado situado en la superficie del organelo al cual va dirigida.

(c)

0,6)om

FIGURA 12-5. Aspecto con el microscopio electrnico del complejo del poro nuclear tomado de una envoltura nuclear aislada de un oocito de anfibio, n) La cara citoplsmica de la envoltura nuclear muestra los granos citoplsmicos perifricos del complejo del poro nuclear, b) La cara nuclear de la envoltura nuclear muestra el aspecto en forma de canastilla de la porcin interna del complejo, c) La cara nuclear de la envoltura muestra la distribucin de las canastillas del CPN (b) y los sitios donde se retienen las placas intactas de la lmina nuclear (NEL). La lmina se encuentra fija a la cara interna de las canastillas del complejo de poros nucleares. En todas estas micrografas, las envolturas nucleares aisladas se fijaron, se deshidrataron, se secaron y recubrieron con metal. (Segiln M.W. Goldberg y T.D, Alien, J. Cell Biol. 339:1431-1433, 3992; con permiso de Rockefeller University Press.)

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CAPITULO 12 Ncleo de a clula y control de la expresin de genes

Anillo citoplsmico Partculas citoplsmicas

Transportador

Radios

Filamentos citoplsmicos

(a)

(b)

FIGURA 12-6. Modelo del complejo de poro nuclear, a) Representacin tridimensional de un complejo de poro nuclear como se puede observar dentro de la envoltura nuclear. El anillo citoplsmico se seccion y separ para revelar el transportador. Se cree que los materiales que difunden a travs de la envoltura nuclear atraviesan la abertura entre los rayos del anillo. Tambin se piensa que los materiales transportados selectivamente al interior del ncleo primero se unen a los delgados filamentos que se prolongan desde el exterior del anillo al interior del citoplasma. Estos materiales al parecer inducen un cambio de conformacin en el transportador que provoca que se desplacen al interior del nucleoplasrna. b) Modelo tridimensional basado en la microscopa electrnica de alta resolucin mostrando el poro nuclear como se observara desde el citoplasma. Se notan las uniones entre el transportador {mostrado en rosa) y los rayos del anillo que lo rodea, (a: Segn Christopher W. Akeij y Michael Rademacher, J. Cell Biol. 322:15, 1993; con permiso de Rockefeller Universitij Press; b: cortesa de Christopher Akey.)

La introduccin de protenas al ncleo ocurre en varas etapas. En el primer paso, la protena que debe introducirse se une a un receptor de SLN, que al parecer se localiza a lo largo de los filamentos que se prolongan al interior del citoplasma desde el anillo exterior del complejo del poro (fig. 12-7). La interaccin entre la protena nuclear y el receptor de SLN conduce a la protena hacia la cara ctoplsmica del complejo del poro nuclear. El desplazamiento de la protena a travs del poro requiere la energa liberada por hidrlisis de ATP y se cree que implica un cambio de conformacin del transportador, la voluminosa estructura semejante a un tapn situada en el centro del poro nuclear (fig. 12-6, b). El cambio de conformacin puede abrir un canal acuoso en el centro del transportador y permitir que las molculas unidas entren al nucleoplasrna; por lo contrario, los materiales que pasan del ncleo al citoplasma tal vez provoquen la abertura del transportador en la direccin opuesta. Un solo poro nuclear permite el paso de protenas y la salida de RNA. Este transporte en ambas direcciones se ilustra en la micrografa de la figura 12-8. Los puntos negros ms pequeos observados en la fotografa son partculas de oro recubiertas con RNA de transferencia e inyectadas dentro del ncleo de la clula; se han desplazado a travs del poro al interior del citoplasma. Los puntos negros de mayor tamao son partculas de oro ms grandes recubiertas con la protena nuclear nucleoplasmina e inyectadas en el citoplasma de la clula; se desplazan a travs del

mismo poro en la direccin opuesta hacia el interior del ncleo. Cromosomas Al parecer, los cromosomas se muestran al principio de la mitosis y desaparecen una vez que sta concluye, por lo que plantean a los citlogos una de las preguntas ms importantes pero desafiantes: Cul es la naturaleza del cromosoma en la^lula no mittica? Cuando se observan con el microscopio electrnico, la mayor parte de los organelos subcelulares revelan una estructura que proporciona muchos conocimientos acerca de su organizacin y su funcin. Sin embargo, las micrografas electrnicas de cortes delgados a travs del ncleo por lo general revelan muy poco de la naturaleza de los cromosomas durante la interfase (fig. 12-1, a).
Empaquetamiento del genoma

Una clula humana promedio contiene casi 6 000 millones de pares de bases de DNA divididas entre 46 cromosomas (cifra para un nmero de cromosomas diploides no duplicados). Cada cromosoma contiene una sola molcula continua de DNA; cuanto mayor sea el cromosoma ms largo el DNA que contiene. Puesto que cada par de bases ocupa casi 0.34 nm de longitud de una molcula de DNA, 6 000 millones de pares de bases equivalen a una molcula de DNA de

CAPTULO 12 Ncleo de a clula y control de la expresin de genes

493

-1^-K

0.2 MIH FIGURA 12-8. Demostracin experimental del movimiento en ambas direcciones de macromolculas a travs del poro nuclear. Como se describe en el texto, las partculas de oro recubiertas con RNA de transferencia (puntos negros ms pequeos) e inyectadas en el ncleo de la clula (N) se mueven al interior del citoplasma (C), en tanto que las partculas de oro recubiertas con la protena nuclear nucleoplasmina (puntos negros de mayor tamao) e inyectadas en el citoplasma de la clula se desplazan a travs del mismo poro en la direccin opuesta hacia e interior del ncleo. (Segn S.L Dworetzky y Cari M, Feldherr, J. Cell Biol. 106:581, 1988; con permiso de Rockefeiler University Press.)

"*<<'" -;-V..
0-4 |4m

FIGURA 12-7. Captacin selectiva de protenas nucleares dentro del ncleo. La nucleoplasmina es una protena presente en alta concentracin en el nucleoplasma de los oocitos de Xenopus. Cuando se recubren partculas de oro con nucleoplasmina y se inyectan en el citoplasma (C) del oocito de Xenopus, se observa que se enlazan a los filamentos citoplsmicos que se prolongan desde el exterior del anillo del complejo de poro nuclear. Tambin se observan varias partculas en trnsito a travs del poro hacia el interior del ncleo (). (Segn W.D. Richardson y cois. Cell 52:662, 1988; con permiso de Cell Press, fotografa cortesa de A.D. Mills.)

dos metros de largo. Adems, el DNA del interior de una clula se enlaza a gran cantidad de agua (casi seis molculas de agua por par de bases), que expande su volumen an ms. Cmo es posible fijar dos metros de DNA hidratado en un ncleo de slo 10 /m de dimetro y, ms an, mantener el DNA en estado accesible a enzimas y protenas reguladoras? De igual importancia, cmo se organiza la nica molcula de DNA de cada cromosoma de modo que no se enrede irremediablemente con las molculas de otros cromosomas? La respuesta estriba en el notable empaquetamiento de una molcula de DNA. Desde hace mucho se sabe que los cromosomas contienen fibras de una sustancia llamada cromatina, compuesta de DNA y protena. Las protenas de la cromatina por lo general se dividen en dos principales grupos: histonas y protenas cromosmicas no histonas. Las histonas constan de un conjunto de protenas bsicas pequeas bien definidas, y las protenas cromosmicas no histonas incluyen numerosas protenas reguladoras enzimticas de estructura muy diversa, la mayor parte de las cuales an no estn

bien caracterizadas. La cromatna tambin contiene un pequeo porcentaje de RNA, compuesto sobre todo de cadenas de RNA en diferentes etapas del proceso de formacin y RNAnp implicado en el empalme de los RNAm. Nucleosomas: el menor nivel de organizacin de los cromosomas. El empaquetamiento ordenado del DNA eucariota depende de las histonas, un notable conjunto de protenas divididas en cinco grupos distintos fciles de distinguir por su contenido de lisina y arginina (cuadro 12-1). Las histonas se diversifican an ms mediante algunas modificaciones de los aminocidos, como fosforilacin o acetilacn, que ocurren luego de la sntesis de polipptidos. Las secuencias de aminocidos de las histonas, particularmente H3 y H4, han sufrido muy pocos cambios a travs de periodos muy prolongados de la evolucin. Por ejemplo, la histona H4 de los guisantes y de las vacas contiene 102 aminocidos y su secuencia slo difiere en dos residuos amino. Esta conservacin evolutiva extrema sugiere que cada uno de estos aminocidos desempea un papel til en la funcin de las protenas. A principios del decenio de 1970 se observ que cuando se trata cromatina con nucleasas inespecficas, la mayor parte del DNA se convierte en fragmentos de 200 pares de bases de longitud, aproximadamente, o algn mltiplo de dicho tamao (fig. 12-9). En contraste, un tratamiento similar del DNA desnudo produce una poblacin de fragmentos cuyo

494

CAPITULO 12 Ncleo de la clula y control de la expresin de genes CUADRO 12-1. Histonas del timo de ternera Histona Nmero de residuos Masa <kD)
23.0 14.0 13.8 15.3 11.3

% Arg

% Lis

UPE* (X 10~6 ao)

Hl H2A H2B H3 H4

215 129 125 135 102

1 9 6 13 14

29 11 16 10 11

8 60 60 330 600

* Unidad del periodo evolutivo: el tiempo para que la secuencia de aminocidos de una protena cambie 1% despus de la divergencia de dos especies.

tamao se distribuye al azar. Estos datos sugieren que los pedazos uniformes del DISTA cromosmico estn protegidos del ataque enzimtico, al parecer por su asociacin peridica a las protenas. En 1974, utilizando el dato de la digestin de nucleasa junto con otros diferentes tipos de informacin, Roger Kornberg, de la Universidad de Harvard, propuso un nuevo tipo de estructura para la cromatina. Sugiri que el DNA y las histonas se organizan en subunidades repetitivas denominadas nucleosomas. En la actualidad se sabe que cada nucleosoma contiene una partcula central del nucleosoma, que consta de 146 pares de bases de superhlices de DNA (pg. 400) enrolladas casi dos veces alrededor de un complejo cuneiforme de ocho molculas de histona. El complejo central de la histona consta de dos molculas de cada una de las siguientes histonas H2A, H2B, H3 y H4 (fig. 12-10, a}. Las partculas centrales del nucleosoma se conectan entre s mediante un tramo de DNA de unin de longitud variable, pero en condiciones tpicas de casi 60 pares de bases. Juntos, el DNA del nucleosoma y el de unin tienen casi 200 pares de bases, que corresponden al valor descubierto en los primeros experimentos con nucleasa (fig. 12-9). Las partculas centrales del nucleosoma, que tienen casi 10 nm de dimetro, y el DNA de unin desnudo, que es de casi 2 nm de dimetro, aparecen en las rnicrograas electrnicas como "cuentas de rosario" (fg. 12-10, b). Segn se analiza ms adelante, una molcula de histona Hl normalmente se localiza justo afuera de la partcula central del nucleosoma y se relaciona con ambos extremos del DNA conforme entra y sale de la partcula central (fig. 12-10, a). La imagen que se muestra en la figura 12-10, b, se observa luego que las molculas de histona Hl son eliminadas selectivamente de las fibras de cromatina al exponer la preparacin a soluciones de baja concentracin salina antes de la observacin. Los residuos bsicos de aminocidos del ncleo central de las histonas se agrupan sobre uno o ambos extremos de la molcula, y por lo tanto el resto de la molcula permanece con carcter relativamente hidrofbico. Esta separacin es ideal para la organizacin del nucleosoma. Las partes ms hidrofbicas, partes no cargadas de las histonas, ocupan el centro de la partcula del nucleosoma y por lo tanto promueven su agregacin en un ncleo apretado. Por lo contrario, las partes bsicas polares del ncleo de las histonas forman apndices flexibles dirigidos hacia el exterior de la partcula, donde los residuos con carga positiva se en-

cuentran disponibles para generar interacciones inicas con grupos fosfato cargados negativamente del esqueleto de DNA. Aun cuando el DNA se encuentra ntimamente asociado con el ncleo de la histona sobre la superficie interna de la fibra helicoidal, la superficie externa del DNA todava est expuesta y accesible para interactuar con molculas reguladoras. Estudios recientes con cristalografa de rayos X sugieren que los residuos con carga positiva ocurren en pares sobre la superficie de la histona octamrka. Estos sitios de pares ocurren a lo largo de una espiral situada en la va esperada del DNA a medida que rodea la porcin central (mostrada en el modelo de la figura 12-11). Se piensa que los sitios de pares situados en la superficie de la histona octamrica proporcionan "puntos de fijacin" para las dos cadenas de la hlice del DNA. Puesto que todas las molculas de DNA de cualquier origen y cualquier secuencia de nucletidos contienen un esqueleto idntico de azcar y fosfatos para interactuar con las histonas, no es sorprendente que las secuencias de aminocidos de las histonas sean altamente conservadas. Con una proporcin de casi nueve molculas de histona por cada 200 pares de bases de DNA, sera de esperar que una clula humana con 6 000 millones de pares de DNA contenga casi 300 millones de molculas de histona. Esta es la razn de que las clulas en proceso de divisin rpida requieran un nmero repetido de genes de histona (pg. 409) para satisfacer sus necesidades de produccin de histonas La interaccin entre histonas y DNA es principalmente estructural y relativamente independiente de la secuencia de nucletidos. Por ejemplo, un DNA que normalmente no se asocia a histonas, como el de los bacterifagos o de polinucletidos sintticos de doble cadena, se incorpora a las subunidades nucleosmicas cuando se incuba in vitro con histonas purificadas derivadas de plantas o animales. Estos tipos de experimentos tambin ilustran la capacidad del nucleosoma para autoensamblado. Aunque el enlace de histonas a DNA no sigue una secuencia especfica, no se puede deducir que las partculas centrales del nucleosoma necesariamente se siten en sitios al azar dentro de determinado gen. En realidad, se ha demostrado que ciertas partes de los genes poseen una relacin invariable con las partculas nucleosmicas centrales cercanas. La micrografa electrnica de la figura 12-12 mus-

CAPITULO 12 Nitcleo de la clula y control de la expresin de genes

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Misiona octmera

(a)

(b)
FIGURA 12-10. Organizacin nucleosmica de la cromatina. a) Diagrama que muestra la estructura de una partcula central del nucleosoma y la molcula de histona Hl acompaante. La partcula central en s consta de ocho molculas de histona centrales (dos de cada una de las histonas H2A, H2B, H3 y H4) y casi 1.8 vueltas (146 pares de bases) de DNA. b) Micrografa electrnica de la cromatina liberada del ncleo de un clula de Drosophila. Se puede ver que las partculas centrales del nucleosoma estn conectadas por cortas cadenas de DNA de unin, (b: Cortesa de Osear L. Miller, fr.)

FIGURA 12-9. Uno de los primeros experimentos que indic que la cromatina posee organizacin estructural repetitiva. Se trataron grupos aislados con DNA endonucleasa inespecfica, y a continuacin se aisl el DNA y se someti a electroforesis en gel de poacrilarnida. Las tres porciones de gel mostraron los patrones de DNA extrado luego de tratamiento de los ncleos durante 40 minutos (gel de la izquierda), 60 min (gel de enmedio) u 80 minutos (gel de la derecha). El DNA liberado por la digestin enzmtica se encuentra en fragmentos de tamao definido cuyo peso molecular son mltiplos del que se muestra en la banda 1. Con el tiempo de digestin ms breve, los fragmentos que predominan son 4, 5 y 6 veces la longitud del fragmento ms pequeo (monomrico). Con los tiempos de digestin ms prolongados, se producen ms de los fragmentos de los tamaos ms pequeos. No se observan fragmentos ms pequeos que los indicados en la banda 1 debido a que la longitud del DNA de este tamao est protegida por su relacin con histonas. (Cortesa de Dean A. Hewish y Leigh A. Burgoyne.)

tra los cromosomas de un virus SV40 en el cual las partculas centrales nucleosmicas se distribuyen peridicamente, excepto en una regin, dedicada a las histonas acompaantes. La ausencia de partculas nucleosmicas en este sitio, que al parecer contienen el origen para duplicacin del cromosoma viral, se cree que es resultado del enlace de una molcula protenica no histona. Por lo tanto, el enlace de la protena no histona a un sitio especfico dentro del DNA puede influir en la posicin de las partculas nucleosmicas en la regin adyacente del cromosoma. La capacidad del DNA para ncurvarse alrededor del ncleo de la histona tambin es un factor en la posicin de los nucleosomas. Los segmen-

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CAPITULO 12 Ncleo de la clula y control de la expresin de genes

FIGURA 12-12. Demostracin de la colocacin de los nucleosomas sobre el DNA. Micrografa electrnica de un "minicromosoma" SV40 mostrando la hendidura caracterstica (parte de arriba de la fotografa) en la distribucin de las partculas centrales del nucleosoma. (Segn S. Saragosti, G. Moi/ne y M. Yaniv, Cell 20:67, 1980; con permiso de Ce!! Press.)

FIGURA 12-11. Modelo de las interacciones DNA-histona en un nucleosoma basado en datos de la cristolografa de rayos X. Se ha eliminado el par de bases en la porcin media del DNA dejando slo el esqueleto, lo que permite observar las interacciones histona-DNA. Sus cargas positivas (puntos rojos y naranja) sobre las molculas de historia coiciden con un patrn de cargas negativas situadas sobre el esqueleto de DNA que las rodea. Las histonas son azules y blancas; el DNA est representado por el cilindro gris externo y el esqueleto de doble hlice "en forma de cuentas". (Cortesa de Evangehs Moudiianakis, Science 263:327, 1994.)

tos de DNA ricos en A-T son ms flexibles y ms fciles de inclinar que las regiones ricas en G-C. Como resultado, los nucleosomas tienden a formarse donde hay dispersin ptima entre regiones ricas en A-T y G-C, caracterstica que disminuye la energa requerida para envolver el DNA alrededor de la histona octamrica. (Las regiones ricas en A-T tienden a presentarse donde el surco menor de la doble hlice se enfrenta a los ncleos centrales de las histonas, en tanto que las regiones ricas en G-C se observan donde el surco menor mira hacia afuera.) Como se ver ms adelante en este captulo, la posicin de los nucleosomas puede conferir una relacin importante a la expresin de un gen. Al principio de esta seccin nos preguntamos cmo un ncleo de 10 //m de dimetro puede albergar un DNA de

200 000 veces su dimetro. La formacin de los nucleosomas representa el primer paso importante en el proceso de empaquetamiento. Puesto que el espacio entre un rvcletido y otro es de 0.34 nm, los 200 pares de bases de un solo nucleosoma de 10 nm de dimetro se estiran casi 70 nm cuando se extienden por completo. Por consiguiente, se dice que la proporcin de empaquetamiento del DNA de los nucleosomas es de casi 7:1. Niveles ms elevados de la estructura de la cromatina. Una molcula de DNA enrollada alrededor de las partculas centrales de un nucleosoma de 10 nm de dimetro es el ms bajo nivel de organizacin de la cromatina. La crornatina no existe en su estado relativamente extendido de "cuentas de rosario" dentro de la clula. Las micrografas electrnicas de cortes a travs del ncleo revelan numerosos "puntos pequeos" de unos 30 nm de dimetro que representan las fibras de cromatina cortadas en seccin transversal. Cuando se prepara cromatina procedente de ncleos en presencia de iones bivalentes, se observa un filamento de espesor similar (30 nm) (fig. 12-13, a). La estructura de los filamentos de 30 nm todava es asunto de debate. En la figura 12-13, b, se muestra un modelo en el cual el filamento nucleosmico ms delgado (10 nm) se enrolla para formar los filamentos ms gruesos de orden ms elevado. Este nivel adicional de organizacin de la cromatina incrementa la relacin de empaquetamiento del DNA unas seis veces ms. El mantenimiento de los filamentos de 30 nm depende de la interaccin entre molculas de histona Hl de los nucleosomas vecinos. Si las molculas Hl se extraen selectivamente, los filamentos ms gruesos de cromatina se desenrollan para formar los ms delgados, las "cuentas de rosario" ms extendidas. La adquisicin de histona Hl restablece la estructura de orden ms elevada.

CAPITULO 12 Ncleo de la clula y control de la expresin de genes

497

FIGURA 12-13. Filamentos de 30 nm: es tructura de la cromatina de nivel ms eleva do. a) Micrografa electrnica de un filament nativo de cromatina de 30 nm. b) Modelo d filamento de cromatina de 30 nm. El filament est representado (de abajo hacia arriba) com si se hubiera formado con concentraciones ere cientes de sal. (a: Cortesa de Barbara Hamkalo J.B. Rattner.)

Se cree que el siguiente nivel de empaquetamiento de las molculas de DNA dentro del ncleo ocurre cuando los filamentos de cromatina de 30 nm se organizan en una serie de asas amplias superenrolladas. Se estima que cada asa contiene entre 10 y 150 kilobases (kb) de DNA y que est unida en su base a protenas especficas, incluyendo una topoisomerasa tipo II que presumiblemente regula el grado de superenrollamiento del asa de DNA. Sera de esperar que la topoisomerasa desenrede las molculas que el DNA de una asa hubiera enredado. Las asas de DNA pueden actuar para dividir el genoma en "dominios" que contengan un soio gen o un pequeo conjunto de genes enlazados expresados por un mecanismo regulador comn. Con asas de tamao promedio de 50 kb, un conjunto haploide de cromosomas humanos contiene casi 60 000 asas; este es el mismo orden de magnitud del nmero de genes que se cree contiene el genoma humano. Normalmente, las asas de fibras de cromatina se dispersan dentro del ncleo y no es posible observarlas, pero

su presencia se puede revelar en ciertas circunstancias. Por ejemplo, cuando se tratan cromosomas mitticos aislados con reactivos que extraen las histonas, se puede observar que el DNA libre de histona se extiende hacia afuera a partir de un armazn de protenas que forma asas (que constan de protena no histona} (fig. 12-14, a). Pueden observarse asas de tipo similar en la interfase de los cromosomas politeo de clulas de insectos (fig. 10-7) y en los cromosomas iampbrush meiticos de oocitos de anfibios (fig. 12-14, b), lo que indica que no son simples peculiaridades de cromosomas mitticos. Los cromosomas mitticos representan la etapa ltima del empaquetamiento de la cromatina (fig. 12-14, a); un cromosoma mittico del /(m de longitud tpicamente con tiene casi 1 cm de DNA. Este empaquetamiento tiene lugar mediante un proceso todava mal comprendido que se acompaa de la fosforilacin de casi todas las molculas de histona Hl en cada uno de los cinco residuos serina distintos dentro de la molcula.

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CAPITULO 12 Ncleo de la clula y control de a expresin de genes

m^-^-v^^^:m

FW^.% v':/ '^:l

\.'^M\S^^^^^^^^^^.

2 pin

FIGURA 12-14. Asas de cromatina: estructura de la cromatina de nivel ms elevado, a) Micrografa electrnica de un cromosoma mito tico reducido de histona que muestra que las asas de DNA se fijan en su base a un molde residual de protenas, b) En esta micrografa electrnica tambin se observa el dominio de cromatina en forma de asas de un cromosoma en forma de mecha aislado de un oocito de anfibio, (n: Segn James R. Paulson y U.K. Lacmmli, Cell 12:823, 1977; con permiso de Cell Press; b: cortesa de joscpls G. Gnll.)

En la figura 12-15 se muestra una revisin de los diferentes niveles de organizacin de la cromatina desde el filamento nucleosmico hasta un cromosoma mittico.
Heterocromatina y eucrom,atina

Luego de concluir la mtosis, la mayor parte de la cromatina que compone los cromosomas mitticos altamente empaquetados se dispersa, y regresa a su condicin difusa de la interfase. Sin embargo, en la mayor parte de las clulas casi

10% del material cromosmico permanece en forma condensada compacta durante la interfase (esta cromatina condensada se observa en la periferia del ncleo de la figura 12-1, a). La cromatina que permanece condensada durante la interfase se denomina heterocromatina, para distinguirla de la eucromatina, que vuelve al estado disperso. Cuando se administra a las clulas un precursor de RNA marcado con algn istopo radiactivo, como la 3H-uridina, y posteriormente se fija, secciona y se practica autorra-

CAPITULO 12 Ncleo de la clula y control de la expresin de genes

499

x=~
DNA de doble hlice (2 nm de dimetro)

Partcula central del nucleosoma Misionas (8 subundades)

Filamento del nucleosoma (10 nm de dimetro)

Fibra de 30 nm

Dominios enrollados en forma de asa

Cromosoma de la metafase

l ' l i ; i IV 1 2 - 1 . > . Niveles de organizacin de la cromatina. Las molculas desnudas de DNA se encuentran rodeadas por histonas para formar nucleosomas, que representan el nivel ms bajo de organizacin de la cromatina. Los nucleosomas se organizan en filamentos de 30 nm, que a su vez lo hacen en dominios en forma de asa. Cuando las clulas se preparan para la mitosis, las asas se enrollan an ms para formar fibras visibles dentro de los cromosomas mitticos (fig. 14-13, a).

diografa en dichas clulas, los grumos de heterocromatina permanecen sin marca radiactiva, lo que indica que tienen poco o nada que ver con la actividad de la transcripcin. La heterocromatina se divide en dos categoras, heterocromatina constitutiva y heterocromatina facultativa, segn su permanencia en estado compacto. La heterocromatina constitutiva permanece en estado condensado en todas las clulas y en todo momento, y por lo tanto representa al DNA permanentemente silencioso. En clulas de mamferos, la masa de la heterocromatina constitutiva se sita den-

tro del centrmero de cada cromosoma y alrededor del mismo (analizado ms adelante), y en unos pocos sitios seleccionados, como el brazo distal del cromosoma Y en mamferos machos. En muchas plantas, los extremos de los cromosomas (telmeros) tambin contienen bloques de heterocromatina constitutiva. El DNA de heterocromatina constitutiva consta principalmente de secuencias altamente repetidas (pg. 406) y al parecer est desprovisto de genes que codifican protena. En realidad, cuando los genes normalmente activos se desplazan a una posicin adyacente a la heterocromatina (cuando el cambio de posicin es resultado de transposicin o translocacin), tienden a inactivarse por s mismos, fenmeno conocido como efecto de posicin. Se cree que la heterocromatina contiene elementos cuya influencia puede propagarse hacia afuera cierta distancia, afectando el estado fisiolgico de los genes cercanos. A diferencia de la variedad constitutiva, la heterocromatina facultativa es una cromatina especficamente inactivada durante ciertas fases de la vida de un organismo. Se puede observar un ejemplo de heterocromatina facultativa al comparar las clulas de mamfero hembra con las del macho. Las clulas del macho tienen un pequeo cromosoma Y y un cromosoma X mucho mayor. Puesto que los cromosomas X y Y tienen muy pocos genes en comn, los machos slo tienen una copia sencilla de los genes transportados en los cromosomas sexuales. Aunque las clulas de las hembras contienen dos cromosomas X, slo uno de este par presenta actividad de transcripcin. El otro cromosoma X permanece condensado como un grumo heterocromtico (fig. 12-16, a), denominado corpsculo Barr por el investigador que lo descubri en 1949. Se cree que la formacin de un corpsculo de Barr es un mecanismo para garantizar que las clulas de hembras y machos tengan el mismo nmero de cromosomas X activos, y por lo tanto sinteticen cantidades equivalentes de los productos codificados por los genes unidos al cromosoma X. Inactivacin X. En 1961, la genetista inglesa Mary Lyon propuso que en todas las clulas de los mamferos hembra ocurre heterocromatizacin de un cromosoma X en las etapas tempranas del desarrollo embrionario. Este proceso se denomina inactivacin X y posteriormente se demostr que tiene lugar en el embrin cerca del momento de la gastrulacin. La inactivacin X en el embrin es un proceso al aza,r en el sentido de que el cromosoma X derivado del padre y el cromosoma X derivado de la madre tienen igual probabilidad de ser inactivados en cualquier clula determinada. Por consiguiente, el X paterno se puede inactivar en una clula del embrin y el X materno puede inactivarse en la clula vecina. Sin embargo, a partir de ese momento, el mismo cromosoma X ser inactivo en todos los descendientes de esa clula particular. La reactivacin del segundo cromosoma X ocurre en las clulas germinales antes del inicio de la meiosis. En consecuencia, ambos cromosomas X son activos durante la oognesis, y todos los gametos reciben un cromosoma X eucromtico. Puesto que los cromosomas X materno y paterno pueden contener alelos diferentes para la misma caracterstica, las hembras adultas en cierto sentido son mosaicos genticos, debido a que diferentes alelos funcionan en distintas clulas. El mosaicismo del cromosoma X se refleja en los par-

500

CAPITULO 12 Ncleo de la chda y control de la expresin de genes

(b)
FIGURA 12-16. Cromosoma X inactivo: ejemplo de heterocromatina facultativa, a) El cromosoma X inactivado en el ncleo de una clula de mujer aparece como estructura heterocrorntica teida de color oscuro, denominada corpsculo de Barr (flechas), b) Gato manchado. La inactivacin al azar de cualquiera de los cromosomas X en clulas diferentes durante el desarrollo embrionario temprano genera un mosaico de parches de tejidos. Cada parche contiene a los descendientes de una clula presente en el embrin en el momento de la inactivacin. Estos parches son visualmente evidentes en los gatos manchados, que poseen un alelo por cada mancha de color negro residente en uno de los cromosomas'X y un alelo por cada mancha de color amarillo sobre el otro X. Esto explica por qu razn los gatos machos manchados prcticamente no existen, puesto que en el macho todas las clulas tienen el mismo alelo para las manchas de color, (a: Cortesa de Murray L. Barr; b: segn }ean PmgenfTony Stone World Wide.)

ches de color del pelaje de algunos mamferos, incluyendo los gatos manchados (fig. 12-16, b). En el hombre, los genes de pigmentacin no se localizan en el cromosoma X, de all la ausencia de "mujeres manchadas". Sin embargo, el mosaicismo se puede demostrar en mujeres debido a inactivacin X. Por ejemplo, cuando se hace incidir un estrecho rayo de luz roja o verde en los ojos de una mujer portadora heteEQCgQtB d SSSUSS S los colores rojo y verde, se pueden observar parches de clulas retinaes con visin defectuosa para el color dispersas entre parches de clulas con visin normal. El mecanismo causante de la inactivacin X ha sido foco de atencin desde una publicacin, en 1992, en la que se sugiri que la inactivacin la inicia una molcula de RNA, en vez de una protena, transcrita de uno de los genes (denominado Xisf) localizado en un cromosoma X por lo dems inactivo. (El gen homlogo sobre el cromosoma X activo no se transcribe, lo que constituye un caso raro donde se expresa una porcin heterocromatizada del genoma.) Este dato, junto con otros ms, ha generado la idea de que las molculas de RNA pueden actuar directamente como reguladores de genes, lo que representa una funcin previamente no descubierta del RNA. Los bilogos siempre han pensado que la macromolcula del RNA es primordial como elemento que contiene informacia, pero ahora se anticipan nuevos papeles para el RNA y algunos apenas estn surgiendo (vase tambin el anlisis del control de la traduccin en la pgina 529).

Estructura del cromosoma mittico

El estado disperso de la cromatina durante la interfase de la clula favorece la duplicacin y transcripcin del DNA. Por lo contrario, la cromatina de una clula mittica se encuentra en su estado ms altamente condensado, lo que favorece la dotacin de un "paquete" ntegro de DNA a cada clula hija. Los cromosomas mitticos han demostrado gran utilidad para los bilogos y tambin para los mdicos, debido a que contienen un "juego competo" de material gentico de una clula y se pueden visualizar con facilidad mediante tcnicas sencillas. guando un cromosoma sufre condensacin durante la profase mittica, adopta una forma distinta y predecible determinada principalmente por la longitud de la molcula de DNA en ese cromosoma y la posicin del centrmero (vase ms adelante). Los cromosomas mitticos de una clula en divisin pueden visualizarse mediante la tcnica mostrada en la figura 12-17, a. En esta tcnica se rompe cada una de las clulas y los cromosomas mitticos de un solo ncleo se colocan y fijan a la superficie de una laminilla sobre una rea muy pequea (fig. 12-17, b). Cuando se cortan los cromosomas individuales en una fotografa de este tipo, se pueden formar pares homlogos (23 en el ser humano) y exhibir como un cariotipo, en el cual los homlogos se ordenan segn su tamao decreciente, como se muestra en la figura 12-17, c. Las preparaciones de cromosomas mitticos se efectan de manera sistemtica a partir de cultivos de clulas sanguneas y se emplean para descubrir individuos

CAPTULO 12 Ncleo de la clula / contra! de la expresin de genes

501

Pipeta capilar con bulbo

Gota de sangre

Transferencia a un frasco de cultivo

Medio de cultivo (incluye la sustancia que estimula la mitosis en los - leucocitos) Cultivar aproximadamente 72 horas, luego aadir colquicina durante 30 minutos hasta tres horas. Recolectar las clulas para centrifugacin

(b)

Medio Lavar con medio fresco. Aadir solucin hipotnica a las clulas. Dejar reposar 10 min. Quitar el sobrenadante y aadir fijador fro (3:1 metanohcido actico). Dejar reposar 30 minutos en fri, y a continuacin dispersar las clulas Clulas

Suspensin de clulas

Gotas de fijador con las clulas Laminilla hmeda Fijador evaporado. Laminilla teida

(c)

Laminilla
: Sitio

que contiene

los cromosomas

liberados de un
solo ncleo

(a)

FIGURA 12-17. Cromosomas mirticos y caiiotipos humanos, a) Procedimiento empleado para obtener preparaciones de cromosomas mitticos a partir de leucocitos de sangre perifrica para observar al microscopio, b) Fotografa de un grupo de cromosomas mitticos tomado del ncleo de una sola clula humana en etapa de divisin. Este conjunto de 46 cromosomas diploides duplicados se tino con colorante de crnacrina que confiere a los cromosomas un patrn de bandas. Las dos cromtidas que constituyen cada cromosoma pueden distinguirse entre s; los cuadros indican un par de cromosomas homlogos, c) Cromosomas de un varn dispuestos para formar un cariotipo. Los cariotipos se preparan a partir de fotografas de cromosomas extrados de un solo ncleo. Cada cromosoma se recorta de la fotografa y se hace coincidir con su par homlogo segn su tamao, como se muestra en la figura, (b: Segn R. Venwn/Phototake, c; segn CNRl/Science Photo Libranj/Photo Researchers.)

502

CAPITULO 12 Ncleo de la clula y control de la expresin de genes

LA PERSPECTIVA HUMANA
Aberraciones cromosomicas
Adems de las mutaciones que alteran la informacin contenida en un solo gen, los cromosomas pueden sufrir alteraciones ms extensas que ocurren con mayor frecuencia durante la divisin celular. Se pueden perder pedazos de un cromosoma o intercambiar segmentos entre diferentes cromosomas. Puesto que estas aberraciones cromosomicas ocurren despus de la rotura de los cromosomas, su tasa aumenta por exposicin a los agentes que daan el DNA, como infecciones virales, rayos X o sustancias qumicas reactivas. Adems, los cromosomas de algunos individuos contienen sitios "frgiles" particularmente susceptibles a rotura. Las personas con ciertas enfermedades hereditarias raras, como el sndrome de Bloom, la anemia de Fanconi, y la ataxia telangiecasia, poseen cromosomas inestables que muestran una gran tendencia a la rotura. Las consecuencias de una aberracin cromosmica dependen de los genes afectados y del tipo de clula en la cual ocurre. Si la aberracin se presenta en una clula somtica (no reproductiva), las consecuencias en general son mnimas, pues de ordinario slo unas cuantas clulas del cuerpo estn afectadas. Sin embargo, en raras ocasiones una clula portadora de una aberracin puede transformarse en clula maligna, la cual puede crecer hasta formar un tumor canceroso. Las aberraciones cromosomicas que ocurren durante la meiosis, en particular como resultado del entrecruzamiento anormal, pueden transmitirse a la siguiente generacin. Cuando se hereda una aberracin cromosmica a travs de un gameto, todas las clulas de los descendientes mostrarn la aberracin y el individuo en general no sobrepasa del desarrollo embrionario. Hay varios tipos de aberraciones cromosomicas, incluyendo: Inversiones. A veces un cromosoma se rompe en dos sitios y el segmento situado entre los puntos de rotura se vuelve a fijar dentro del cromosoma en orden inverso. Esta aberracin se denomina inversin. Por lo menos 1% de los humanos son portadores de una inversin, la cual puede detectarse durante la elaboracin de carotipos cromosmicos. Puesto que un cromosoma que posee una inversin de ordinario contiene todos los genes de un cromosoma normal, el individuo no se ve afectado adversamente. Sin embargo, si una clula con inversin de un cromosoma sufre meiosis, el cromosoma aberrante no puede formar un par apropiado con su homlogo normal debido a las diferencias en el orden de sus genes. En estos casos, la formacin de un par cromosmico de ordinario se acompaa de la formacin de un asa (fg. PH 12-1). Si ocurre entrecruzamiento en el asa, segn se muestra en la figura, los gametos generados por meiosis tendrn una copia adicional de ciertos genes (duplicacin) o carecern de dichos genes (supresin). Cuando un gameto que contiene un cromosoma alterado se funde con un gameto normal durante la fertilizacin, el cigoto resultante muestra desequilibrio cromosmico y por lo general no es viable. Tmnslocadones. Cuando todos los pedazos o uno solo de un cromosoma se fija a otro cromosoma, la aberracin se denomina translocacin (fig. PH 12-2). Igual que las inversiones, una translocacin en una clula somtica por lo general tiene poco efecto sobre las funciones de dicha clula o de su progenie. Sin embargo, ciertas translocaciones aumentan la probabilidad de malignizacin de la clula.
Centrrnero C/ B

Primera anafase meitica

FIGURA PH 1 2 - 1 . Efecto de la inversin.

El entrecruzamiento entre un cromosoma normal (azul) y uno que contiene una inversin (verde) de ordinario se acompaa de la formacin de un asa. Los cromosomas que resultan de este entrecruzamiento contienen duplicaciones y deficiencias, las cuales se muestran en los cromosomas en la primera divisin meitica en la parte inferior de la figura.

El ejemplo mejor estudiado es el cromosoma Filadelfin, que se observa en las clulas malignas (pero no en las clulas normales) de individuos con ciertas formas de leucemia. El cromosoma Filadelfia, as denominado por la ciudad en la cual se descubri en 1960, es una versin acortada del cromosoma humano nmero 22. Durante aos se pens que el segmento perdido representa una simple supresin,

CAPITULO 12 Ncleo de la clula y control de la expresin de genes

503

La comparacin de los 23 pares de cromosomas de las clulas humanas contra los 24 pares de cromosomas en las clulas de chimpancs, gorilas y orangutanes revela una similitud notable. El examen atento de los dos cromosomas de los simios que no tienen contraparte en el ser humano revela que juntos equivalen, banda por banda, al cromosoma humano nmero 2 (fig. PH 12-3). En algn punto durante la evolucin de los seres humanos, un cromosoma entero fue translocado a otro, y mediante la fusin de los dos cromosomas se form uno solo, reduciendo el nmero haploide de 24 a 23.
PIGUKA I*H 12-2. Una translocacin. Micrografa que muestra un conjunto de cromosomas humanos en los cuales el cromosoma 12 (verde) ha intercambiado pedazos con el cromosoma 7 (rojo). Los cromosomas afectados se hicieron fluorescentes mediante hibridacin n sihi con un gran nmero de fragmentos de DNA especficos para cada uno de los dos cromosomas implicados. El uso de estas "tinciones" hace muy evidente el intercambio de piezas de un cromosoma con otro. (Cortesa de Lawrence Livermore National Lnboratonj, segn una tcnica desarrollada por ]oe Cray y Dan Pinkel.)

pero con el perfeccionamiento de las tcnicas para observar cromosomas, se observ que la pieza faltante del gen se transloca a otro cromosoma (nmero 9). El cromosoma nmero 9 contiene un gen que codifica una proteincinasa que participa en la proliferacin celular. Como resultado de la translocacin, un extremo pequeo de esta protena se sustituye por casi 600 aminocidos extra codificados por un gen presente en el pedazo translocado del cromosoma nmero 22. Esta nueva protena excesivamente alargada al parecer retiene la actividad cataltica de la Versin original, pero ya no est sometida a los mecanismos reguladores normales de la clula. Igual que en las inversiones, las tninslocaciones causan problemas durante la meiosis. Un cromosoma alterado por una translocacin tienen un contenido gentico diferente en comparacin con su homlogo. Como resultado, los gametos formados por meiosis contienen copias extra de los genes o carecen de los mismos. Se ha demostrado que las translocaciones

desempean un papel importante en la evolucin, generando cambios a gran escala que a veces constituyen el punto de arranque de lneas evolutivas separadas que se ramifican a partir de un ancestro comn. Durante nuestra historia evolutiva reciente tal vez ocurri un incidente gentico de esta naturaleza.

Supresiones. Cuando se pierde una parte de un cromosoma ocurre una supresin. Como se hizo notar anteriormente, cuando uno de los gametos es producto de meiosis anormal se forman cigotos que contienen supresin cromosmca. La prdida de una porcin de un cromosoma de ordinario provoca la ausencia de genes crticos, generando consecuencias graves, incluso si el cromosoma homlogo del individuo es normal. La mayor parte de los embriones humanos que contienen supresiones significativas no terminan su de-

Humano

Cromosoma # 2

Chimpanc

Gorila

Orangutn

FICIIKA PH 12-3. Translocacin y evolucin. S los dos nicos cromosomas de los monos que no tienen contraparte en el ser humano se "fusionan", coinciden con el cromosoma humano nmero 2, banda por banda.

504

CAPITULO 12 Ncleo de a clula y control de la expresin de genes

sarrollo, y los embriones que lo logran presentan varias malformaciones. La primera correlacin entre una enfermedad humana y la supresin cromosmica fue establecida en 1963 por Jerome Lejeune, genetista francs que anteriormente haba descubierto la base cromosmica del sndrome de Down. Lejeune descubri que un beb nacido con varias malformaciones faciales y desarrollo anormal de la laringe (voz en ca-

jn) careca de una parte del cromosoma 5. Un defecto en la laringe del nio le provocaba un llanto parecido a los ruidos emitidos por un gato en agona. Por consiguiente, el cientfico denomin al trastorno sndrome cri du chai que significa sndrome de aullido de gato. Duplicaciones. Cuando se repite una porcin del cromosoma ocurre una duplicacin. El papel de las duplicaciones en la formacin

de familias de mltiples genes se analiz en la pgina 410. Duplicaciones crornosmicas ms sustanciales generan una situacin en la cual se encuentran tres copias de un gen en vez de las dos copias normalmente presentes (situacin denominada trisoma pardal}. Las actividades celulares son muy sensibles al nmero de copias de genes, y por lo tanto las copias extra de genes pueden tener efectos nocivos graves.

con anomalas crornosmicas. Segn se analiza en La perspectiva humana, en este captulo, con dicha tcnica se puede determinar la presencia de cromosomas extra, la ausencia de los mismos o los burdamente alterados. Los cromosomas que se muestran en la figura 12-17, b, fueron teidos con quinacrina, un colorante fluorescente que confiere a los cromosomas aspecto de bandas cruzadas. El patrn de estas bandas Q, como se les denomina, es caracterstico para cada cromosoma de una especie y suministra una base para identificar cromosomas con rapidez y comparar !os cromosomas de una especie con la siguiente (fig. PH12-3). Tambin se pueden descubrir alteraciones crornosmicas relativamente sutiles, como cambios en el patrn de bandas. Las bandas Q ms brillantes tpicamente contienen secuencias de DNA repetitivas ricas en A-T, y menor contenido de genes que codifican protenas. Centrmeros. Podemos notar que cada cromosoma mostrado en la figura 12-17 tiene un sitio donde las superficies externas estn notablemente indentadas. El sitio de indentacin seala el centrmero del cromosoma (fig. 12-18).

Anteriormente se mencion que los centrmeros de los cromosomas contienen heterocromatina constitutiva. Los centrmeros de los cromosomas humanos tienen una secuencia de casi 170 nucletidos de largo (denominada DNA a satlite) dispuestos en serie y repetidos entre 2 000 y 30 000 veces por cada centrmero. El DNA centromrico se enlaza a protenas especficas, incluyendo las que sirven como sitios de fijacin para los microtbulos que separan los cromosomas durante la divisin celular (estudiado con detalle en la seccin 14-2). Telmeros. Los dos extremos de la molcula de DNA que constituye cada cromosoma contienen un tramo poco comn de secuencias repetidas denominado telmero, que forma un "casquete" en cada extremo del cromosoma. En el ser humano, los telmeros contienen la secuencia repetida miles de veces (fig. 12-19, a). A diferencia de la mayor parte de las secuencias repetidas que varan considerablemente de una especie a otra, incluso en especies ntimamente relacionadas, la misma secuencia obser-

FIGI'KA L 2 - 1 . Cada cromosoma mittico posee un centrmero cuyo sitio est marcado por una indentacin distinguible. Gammagrafa electrnica de un cromosoma mittico. El centrmero (C) aloja secuencias cortas altamente repetidas de DNA (DNA satlite) y una estructura protenica denominada cnetocoro, que es el sitio de fijacin de los microtbulos del huso durante la mitosis y la meiosis estudiadas en el captulo 14). (Segn erme B. Rattner, Bioessays 13:51, 1991.)

CAPITULO 12 Ndeo de la clula y control de a expresin de genes Telomerasa RNA

505

CCCCAACCCCMCCCx5

GGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG 3

CCCCAACCCCAACCC

-IGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG 3

Alargamiento

y^ f ^

fCCCCAACCCCAACCC
:|GGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGfT"G

FIGL lA 12-1 '>. Telmeros. n) Hibridacin in situ de una sonda DNA que contiene la secuencia TTAGGG, que localiza a los telmeros de cromosomas humanos, b) Mecanismo de accin de la telomerasa. La enzima contiene una molcula RNA complementaria del extremo 3' de la cadena. El RNA se une a esta regin sobresaliente de DNA (paso 1) y a continuacin sirve como plantilla para aadir unidades elomricas repetidas (paso 2). Conforme se sintetiza DNA, el RNA telomrico se desliza a lo largo de la cadena alargndose (paso 3) y sirve como plantilla para la incorporacin de nucletidos adicionales (paso 4). A continuacin otra DNA polimerasa sintetiza a la segunda cadena, (a: Segn }. Meyne, en R.P. Wagner, Chromosomes: A Synthesis, Wiley, 1993; b: segn C.W. Greider y E.H. Blackburn, reimpreso con permiso de Nature 337:336, 1989; copyright 1993 Macmlan Magazines Limited.)

vada en los telmeros humanos se encuentra en todos los vertebrados hasta ahora examinados. Otros organismos, como los protozoarios y levaduras, poseen telmeros con secuencias diferentes, pero igual que en los vertebrados, una cadena es invariablemente rica en residuos de guanocna y la cadena complementaria en residuos de ctosina. La cadena rica en G corre en direccin 5' a 3' hacia cada extremo del cromosoma y se extiende 12 a 15 nucletidos ms all del extremo de la cadena'rca en C. Como resultado del "desnivelamiento", la cadena rica en G forma un apndice de DNA de una sola cadena en cada extremo del cromosoma. Esta disposicin se mantiene de una generacin de clulas a la siguiente por medio de una enzima especial denominada telomerasa, que puede aadir nuevas unidades repetidas al extremo 3' de la cadena rica en G (fig. 12-19, b). La elomerasa, cuyas propiedades fueron extensamente estudiadas por EHzabeth Blackburn y sus colegas, de la Universidad de California en San Francisco, es una transcriptasa inversa que ensambla DNA a partir de una plantilla de

RNA. La telomerasa es una enzima muy poco comn en la cual el RNA que sirve como plantilla en realidad es un componente integral de la propia enzima. Las secuencias de los telmeros tambin sirven como sitios de enlace para varias protenas especficas (fig. 12-20). Los telmeros desempean papeles importantes: se requieren para la duplicacin completa del cromosoma, protegen a los cromosomas contra las nucleasas y otras influencias desestabilizadoras, evitan que los extremos de los cromosomas se fusionen entre s, y facilitan la interaccin entre los extremos del cromosoma y la envoltura nuclear en ciertos tipos de clulas. Experimentos recientes sugieren nueva participacin. Las clulas normales pueden dividirse slo un nmero limitado de veces en cultivo antes que muestren signos de "envejecimiento" y por ltimo la muerte. Se han propuesto varas causas para explicar esta observacin. La ms reciente es un acortamiento progresivo de los telmeros. El acortamiento de los telmeros ocurre debido a que la mayor parte de as clulas normales de mamferos carecen

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CAPITULO 12 Ncleo de la clula y control de la expresin de genes

2 pm

FIGURA 12-20. Demostracin experimental de que ciertas protenas se enlazan especficamente al DNA telomrico. Estos cromosomas se prepararon a partir de ncleos meiticos de una clula de levadura y se incubaron con la protena RAP1, la cual posteriormente fue localizada en los telmeros mediante un anticuerpo fluorescente antiRAPl. Las regiones en azul indican DNA teido, las reas amarillas representan el antiRAPl marcado, y las reas rojas muestran el RNA teido con yoduro de propidio. (Segn franz Klein y cois. }. Cell Biol. 117:940, 1992; cortesa de Susan M. Casser; con permiso de Rockefeller Universify Press.)

12-21). Las interacciones entre los extremos de los cromosomas y la envoltura nuclear suministran otro medio de ordenar los cromosomas dentro del ncleo (fig. 12-22, a). Esta relacin es ms evidente durante la meiosis, cuando tos cromosomas pueden extenderse radialmente hacia afuera de la envoltura nuclear formando un "ramillete" (fig. 12-22, b). Desde hace varios decenios se sabe que el RNA ribosmco se sintetiza en un sitio particular dentro del nuclolo, pero se asumi que otros RNA, en particular el RNAm, se ensamblan a travs de todo el ncleo. Sin embargo, hay suficientes pruebas de que los RNAm se sintetizan en un nmero restringido de sitios discretos dentro de cada ncleo. Cuando se identifican mediante sonda fluorescente marcada, los sitios de sntesis y procesamiento de precursores del RNAm aparecen como "manchitas" briliantes contra un nucleoplasma por lo dems no marcado (fig. 12-23). Cada una de las 20 a 50 "manchitas" observadas en determinado ncleo debe ser sitio de sntesis de diversas disposiciones de diferentes RNAm. Se piensa que los distintos componentes del ncleo deben estar ordenados en el compartimiento por la accin de una red compleja interactiva de filamentos que constituyen la matriz nuclear.
La matriz nuclear

Cuando se extraen ncleos aislados con detergentes no inicos y concentracin elevada de sal (p. ej., 2 M de NaCl) para

al parecer de telomerasa. A diferencia de las clulas normales, las clulas cancerosas no detienen su crecimiento en cultivo de clulas; se dice que son "inmortales". Uno de los factores que puede contribuir a la inmortalidad de las clulas malignas es la reactivacin de la telomerasa, que mantiene la longitud de los telmeros de una generacin a la siguiente. En realidad, estudios recientes demuestran que algunos tipos de cncer humano poseen actividad de telomerasa no presente en sus contrapartes normales. Este dato motiv una bsqueda de inhibidores especficos de esta enzima con la esperanza de que puedan detener el crecimiento de algunos tumores. El ncleo considerado como organelo organizado Los bilogos celulares se apoyan principalmente en estudios bioqumicos para entender las actividades del ncleo. Aunque suministran gran cantidad de informacin, rompen cualquier tipo de estructura molecular ordenada que pudiera existir dentro del ncleo y dan la impresin de que este ncleo slo es un "saco" de elementos dispuestos al azar. Sin embargo, muchos datos sugieren que el ncleo es en realidad un compartimiento altamente ordenado. Por ejemplo, las fibras de cromatina que constituyen una interfase determinada del cromosoma no se dispersan a travs de todo el ncleo, como podra esperarse, sino que se concentran en un dominio especfico que no se superpone extensamente con los dominios de otros cromosomas (fig.
5|jm

FIGURA 12-21. Localizacin de un solo cromosoma en un ncleo en interfase. La rnicrografa muestra el ncleo de una clula HeLa sometido a doble marcado FHIS (flourescencia de hibridacin in sitii) para visualizar: 1) el sitio del gen dstrofina, que se encuentra sobro el cromosoma X, y 2) la localizacin do todo el cromosoma X. La sonda enlazada al gen distrofina se localiz mediante un colorante fluorescente verde, en tanto que las sondas enlazadas a otras secuencias del cromosoma X se localizaron con un colorante fluorescente de color rojo naranja. Se observa que cada uno de los cromosomas homlogos X ocupa territorios restringidos dentro de los ncleos de la clula HeLa en vez de distribuirse homogneamente a travs de lodo el ncleo. Las flechas indican los sitios donde se localiza el gen distrofina de cada homlogo. (Cortesa de Anette Kurz \j Peter Lichicr, Dentedles Krebsforsdiungszentrum Heidelberg.)

CAPITULO 12

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riCI.'KA 12-22. Demostracin de la relacin de los telmeros con la envoltura nuclear, a) Micrografa del ncleo de una levadura con tincin doble para DNA (fluorescencia roja) y para protenas RAP1 (fluorescencia verde-amarilla), los cuales se unen especficamente a secuencias de DNA del telmero (fig. 12-20). La Idealizacin de las protenas RAP1 en los grupos situados en la superficie interna de la envoltura nuclear sugiere una probable relacin del DNA telomrico con la membrana nuclear interna, b) Cromosomas de una etapa de la profase meitica del saltamontes macho en el cual cromosomas homlogos se asocian fsicamente como parte de un bivalente. Los extremos de los bivalentes se disponen en un ramillete bien definido con sus regiones terminales agrupadas cerca de la superficie interna de la envoltura nuclear, hacia la base de la fotografa, (a: Corh'ftit de Tliierry Laroche y Siisnn M. Gusser; b: cortesa de Bernard olm, segn E. John, Meiosis. Reimpreso con permiso de Cambridge Umversity Pre?$, 1990.)

eliminar lpidos y casi todas las protenas histona y no historia de la croma tina, se observa el DNA como un halo que rodea un ncleo central nuclear residual (fig. 12-24, a). Si se digieren subsecuentemente las fibras de DNA con DNasa,

FIGURA 12-23. Demostracin de que los factores de empalme de los precursores RNAm se organizan en un patrn moteado dentro de los ncleos en inferase. Se cree que una parte del patrn moteado comprende sitios de almacenamiento o de reensamblado para los factores de empalme, en tanto que otra parte representa sitios activos de transcripcin. Al entrar en mitosis (cabeza de la flecha), los factores de empalme se redistribuyen difusamente por todo el citoplasma. (Cortesa de David L. Spector, Cola Spring Harbor Labomton/.)

la estructura que permanece posee la misma forma del ncleo original, pero est compuesta de una red de delgadas fibrillas que contienen protenas entrecruzadas en orma de cierre a travs del espacio nuclear {fig. 12-24, b). Esta red fbrar insoluble se denomina matriz nuclear. La matriz nuclear es algo ms que un esqueleto para mantener la forma del ncleo o un molde sobre el cual se organizan las asas de cromatina (pg. 498); tambin sirve para anclar gran parte del mecanismo implicado en las diferentes actividades del ncleo, incluyendo transcripcin, duplicacin y procesamiento de RNA. Por ejemplo, cuando las clulas se incuban con RNA radiactivo o precursores de DNA durante un breve periodo, casi todos los cidos nucleicos recin sintetizados se encuentran asociados a las fibrillas de la matriz nuclear. La prueba ms espectacular de la importancia de la matriz nuclear proviene de una serie de estudios efectuados en el laboratorio de Jeanne Lawrencc en la Universidad de Massachusetts. Utilizando hibridacin in situ con fluorescencia para identificar la localizacin de secuencias especficas de DNA o RNA (pg. 407), Lawrence y sus colaboradores encontraron que las molculas de RNA transcritas a partir de un solo gen aparecen como rayas en una parte muy restringida del ncleo {fig. 12-25, a). Las rayas verdosas que se muestran en la figura 12-25, a, se deben a la presencia de varios cientos de molculas precursoras de RNAm transcritas de un solo gen localizado cerca de un

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CAPITULO 12 Ncleo de la clula y control de la expresin de genes

despus de la extraccin. Estos resultados sugieren fuertemente que los RNA recin sintetizados se asocian a elementos de la matriz nuclear. La orientacin de las rayas sugiere que los RNA se desplazan desde sitios dentro del interior del ncleo donde se sintetizan a sitios ms perifricos en el ncleo (fig. 12-25, b). Conforme los precursores RNAm se alejan del gen donde fueron sintetizados, el mecanismo de empalme de las clulas elimina los intrones de los transcritos. La orientacin de la pista desde el interior nuclear hacia la periferia nuclear es coherente con un modelo en el cual la matriz nuclear ayuda a guiar a los RNA desde su sitio de transcripcin hasta otro o a unos cuantos poros nucleares a travs de los cuales pueden salir del ncleo.

Control de la expresin de genes en procariotes

Una clula bacteriana vive en contacto directo con su ambiente, que puede sufrir cambios espectaculares en composicin qumica de un momento a otro. En determinado momento puede estar presente un compuesto particular, en tanto que otras veces dicho compuesto est ausente. Una ventaja selectiva evidente para estas clulas es utilizar sus recursos disponibles de la manera ms eficiente, y los mecanismos que han evolucionado que les permiten responder a cambios especficos mediante la expresin de genes selectivos. Consideremos las consecuencias de transferir un cultivo de bacterias desde un medio mnimo a otro que contenga: 1) lactosa o 2) triptfano. 1. La lactosa es un dsacrido (vase fig. 12-15) compuesto de glucosa y galactosa cuyo desdoblamiento oxidativo puede suministrar a la clula energa e intermediarios metablicos. El primer paso en el desdoblamiento de esta molcula es la hidrlisis del enlace (unin /3galactsido) que junta los dos azcares, reaccin catalizada por la enzima /3-galactosidasa. Cuando se cultivan estas clulas bacterianas en condiciones mnimas antes de transferirlas, las clulas no necesitan/3-galactosidasa. En condiciones mnimas, una clula promedio contiene menos de cinco copias de enzima y una sola copia del RNAm correspondiente. La adicin de Jactosa al medio de cultivo produce un nmero casi 1 000 veces mayor de molculas de/3-galactosidasa dentro de las clulas en comparacin con el nmero presente cuando las clulas se encontraban en el medio mnimo. La presencia de lactosa indujo la sntesis de esta enzima (fig. 12-26). 2. El triptfano es un aminocido esencial. En ausencia de este compuesto en el medio de cultivo, la bacteria debe gastar cierta cantidad de energa para sintetizar triptfano y asegurar su disponibilidad para incorporarlo a las protenas. Las clulas que crecen en ausencia de triptfano contienen las enzimas, y su correspondiente RNAm, necesarias para elaborar triptfano. Sin embargo, si este aminocido sbitamente llega a estar disponible en el medio, las clulas ya no tienen que sintetizar su propio triptfano y en unos pocos minutos la produccin de las enzimas de la va del triptfano se detie-

FIGURA 12-24. La matriz nuclear, a) Micrografia electrnica de un ncleo aislado en presencia de detergente y 2M de sal, que deja la matriz nuclear rodeada por un halo de asas de DNA. La flecha indica el lmite externo de las asas de DNA. b) Micrografia electrnica de una parte del fibroblasto de ratn extrada con detergente y reducida de su cromatina y DNA mediante tratamiento con nucleasas y solucin salina concentrada. Se observa que el ncleo (N) consta de una matriz filamentosa residual cuyos elementos terminan en el sitio de la envoltura nuclear. El citoplasma (C) contiene una matriz citoesqueltica diferente cuya estructura se estudia en el captulo 9. (a: Reimpreso con permiso de D.A. Jackson, $./. McReady y P.A. Cook, Nature 292:553, 1981; copyright 1981 Macmillan Magazines Limited; b: segn David G. Capeo, Kathcrine M. Wan y Sheldon Penman, Cell 29:851, 1982; con permiso de Cell Press.)

extremo de la raya (la posicin del gen est indicada por la flecha). La concentracin de los transcritos en un foco tan definido sugiere que no son libres de difundir simplemente hacia afuera del DNA sobre el cual fueron transcritos, sino ms bien son mantenidos en su sitio por algn componente estructura! del ncleo conforme se procesan. Cuando los ncleos, como el que se muestra en la figura 12-25, a, se extraen con detergentes y concentracin elevada de sal, prcticamente todos los precursores RNAm recin transcritos permanecen asociados a la matriz nuclear residual. En realidad, las pistas fluorescentes de RNAm observadas antes de la extraccin en un ncleo determinado permanecen en la misma posicin precisa en ese ncleo

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(a)

3 pin

(b)

MGUIA 12-25. Localizacin experimental de RNA recin sintetizado en el ncleo, a) Legalizacin simultnea del gen de fibranectina y de su transcrito primario mediante doble marcado FHIS (fluorescencia de hibridacin in situ). En este experimento, una sonda DNA se conjuga con biotina y otra con digoxigenina. Se permite que las sondas se enlacen a secuencias complementarias en el ncleo, y su loralizacin se determina incubando la preparacin con molculas fluorescentes de colores distintos que se enlazan especficamente a la biotina o a la digoxigenina. La sonda empleada para localizar el gen de fibronectina contiene una secuencia que slo se enlaza a la regin no transcrita que flanquea el extremo 5' del gen, y por lo tanto no se enlaza al transcrito de RNA. El sitio del gen de fibronectina est indicado por una coloracin fluorescente de color amarillo rojizo (flecha). La localizacin de los transcritos de fibronectina est indicada por la coloracin fluorescente verdosa que se observa como rastro difuso indicando que el RNA permanece concentrado en la vecindad del gen despus de su sntesis, b) Modelo esquemtico para la va de procesamiento dentro de un transcrito primario. Se muestra una versin simplificada del transcrito primario, con un solo intrn indicado en blanco y exones indicados en verde. El gen transcrito se muestra en rojo. (Reimpreso con permiso de Yigong Xm, Carol V. Johnson, Paul R. Dobner y Jeanne B. Laivrence, Science 259:1328, 1993; copyright 1993 American ssociation for the Aduancenient of Science.)

ne. En presencia de triptfano, los genes que codifican estas enzimas son reprimidos. El opern bacteriano En las bacterias, los genes que contienen la informacin para ensamblar las enzimas de una va metablica de ordinario se agrupan en el cromosoma en un complejo funcional denominado opern. Todos los genes del opern son coordinados mediante un mecanismo de control descrito por primera vez en 1961 por Francois Jacob y Jacques Monod, del Instituto Pasteur de Pars. Un opern bacteriano tpico consta de genes estructurales, una regin promotora, una regin operadora y un gen regulador (fig. 12-27). Los genes estructurales codifican enzimas pos s mismos. Los genes estructurales de un opern de ordinario se sitan adyacentes entre s, y una polimerasa de RNA se desplaza de un gen estructural al siguiente, transcribiendo todos los genes a un solo RNAm. Este RNAm gigante se traduce despus enpolipptidos distintos que se convierten en las diferentes enzimas de la va rneta-

blica. Por consiguiente, al ponerse en marcha un gen activa a todos los productores de enzimas de un opern. El promotor es el sitio activo donde la polimerasa de RNA se une al DNA antes de iniciar la transcripcin (analizado en la pgina 438). El operador se sita entre el promotor y el primer gen estructural donde sirve como sitio de enlace para una protema, denominada represora. La represora es un ejemplo de protena reguladora de un gen capaz de reconocer una secuencia especfica de pares de bases dentro del DNA y enlazarse a dicha secuencia con afinidad elevada. Como se notar en las siguientes secciones de este captulo, las protenas enlazadas al DNA, como los represores bacterianos, desempean un papel predominante para determinar si un segmento particular del genoma es transcripcionalmente activo o silencioso. El gene regulador codifica a la protena represora. La clave para la expresin del opern estriba en el represor. Cuando el represor se enlaza al operador (fig. 12-27), el promotor queda protegido de la polimerasa, y la transcripcin de los genes estructurales se interrumpe. Si el represor puede enlazarse o no al operador depende de la

510

CAPITULO 12 Nttcleo de la clula y contra! de la expresin de genes

sustancia metablica clave determina si el opern es activo o inactivo en cualquier momento dado.
1000

'=

1.0 -

0.1
o.
15

Adicin de! inductor

Eliminacin del inductor

FICUKA 12-2f>. Cintica de la induccin de /-galactosidasa en E. coli. Cuando se aade un inductor apropiado {^-galactsido), la produccin de RNAm para la enzima /i-galactosidasa se inicia con ms rapidez y despus de un minuto aproximadamente aparece la enzima, cuya concentracin se incrementa de manera acelerada. La eliminacin del inductor conduce a descenso precipitado de la concentracin del RNAm, que refleja su desdoblamiento rpido. La cantidad de enzima desciende porque no se sintetizan nuevas molculas.

El opern lac La interaccin entre estos diferentes elementos se ilustra con el opern lac, el grupo de genes que regula la produccin de las enzimas necesarias para metabolizar lactosa en las clulas bacterianas. El opern lac es un ejemplo de opern inducible; o sea, aquel en el cual la presencia de una sustancia metablica clave (en este caso lactosa) induce la transcripcin de genes estructurales (fig. 12-28, a). El opern lac contiene tres genes estructurales en serie. Cuando se dispone de lactosa, el disacrido entra a la clula donde se une al represor, cambiando la conformacin del represor e incapacitndolo para fijarlo al DNA del operador. En este estado, los genes estructurales se transcriben, se sintetizan las enzimas y las molculas de lactosa se consumen. As, en un opern inducible, como el opern lac, la protena represora es capaz de enlazarse al DNA slo en ausencia del inductor. Conforme disminuye la concentracin de lactosa en el medio, el disacrido se separa de su sitio de enlace sobre la molcula represora. La liberacin de lactosa permite al represor enlazarse al operador, lo que fsicamente bloquea la polimerasa y le impide alcanzar a los genes estructurales, interrumpiendo la transcripcin efectuada por el opern.

Control positivo mediante AMP cclico El represor lac ejerce su influencia mediante con trol negativo, puesto que la interaccin del DNA con esta protena inhibe la expresin del gen. El opern lac tambin se encuentra bajo control positivo, segn se descubri durante una de las primeras investigaciones del fenmeno denominado efecto glucosa. Cuando se suministra glucosa a las clulas bacterianas, y tambin algunos otros tipos de sustratos, como lacto-

forma de dicho represor, la cual, a su vez, depende de la presencia o ausencia de un compuesto clave en la va metablica, como lactosa o triptfano. La concentracin de esta

Los elementos del opern se muestran en verde

Operador (O)

Genes estructurales (codifican enzimas de la misma va metablica)

FIGURA 12-27. Organizacin de un opern bacteriano. Las enzimas que constituyen una va metablica estn codificadas en una serie de genes estructurales que residen en disposicin contigua en el cromosoma bacteriano. Todos los genes estructurales de un opern se transcriben a un RNAm continuo, el cual se traduce a polippidos separados. La transcripcin de los genes estructurales est controlada por una protena represora que, cuando se une al sitio operador del DNA, impide el movimiento de la RNA polimerasa a partir del promotor do los genes estructurales.

CAPITULO 12 Ncleo de la clula y control de a expresin de genes

511

sa o galactosa, las clulas metabolizan la glucosa e ignoran los otros compuestos. La glucosa en el medio acta para suprimir la produccin de diferentes enzimas catablicas, como la /3-galactosidasa, necesarias para descomponer estos otros sustratos. En 1965 hubo un sorprendente descubrimiento. El AMP cclico, el cual previamente se pens que slo participaba en el metabolismo de los eucariotes, se descubri en clulas de E. coli. Se observ que la concentracin de AMPc en las clulas se relaciona con la presencia de glucosa en el medio: cuanto mayor la concentracin de glucosa, menor la concentracin de AMPc. Adems, cuando se aade AMPc al medio en presencia de glucosa, todas las enzimas catablicas normalmente ausentes de pronto fueron sintetizadas por las clulas. El mecanismo exacto mediante el cual la glucosa desciende la concentracin de AMPc todava no se ha dilucidado, pero el mecanismo mediante el cual el AMPc supera el efecto de la glucosa es bien comprendido. Como se podra esperar, una molcula pequea, como la del AMPc (f ig. 15-2) no puede estimular directamente la expresin de una serie especfica de genes. Igual que en las clulas eucariotas, el AMPc acta enlazndose a una protena, en este caso \aproteinn activadora de catabolitos (PAC) del gen. La PAC es incapaz de enlazarse por s misma al DN A; sin embargo, cuando forma un complejo con el AMPc, el complejo CAP-AMPc reconoce y se enlaza a un sitio especfico en la regin control lac ffig. 12-29). La presencia de la PAC enlazada provoca un cambio en la conformacin del DNA, que permite a la RNA polimerasa transcribir el opern Inc. Si la transcripcin ocurre o no, en realidad depende de la presencia o ausencia del represor enlazado, lo que seala si el sustrato lactosa est o no disponible.
El opern trp

En un opern represible, como el opern triptfano (trp), el represor no puede enlazarse por s mismo al operador DNA. En vez de esto, el represor slo es activo como protena que se enlaza al DNA cuando forma un complejo con un correpresor, como el triptfano {fig. 12-28, b). En ausencia de triptfano, el sitio operador se encuentra abierto para enlazarse a la RNA polimerasa, que transcribe los genes estructurales del opern trp, lo que conduce a la produccin de enzimas que sintetizan triptfano. Cuando el triptfano est disponible, las enzimas de la va sinttica de triptfano ya no son necesarias y el complejo represor-triptfano impide la transcripcin.

12-3 Control de la expresin de genes en eucariotes

Las protenas sintetizadas por una clula bacteriana son determinadas extensamente por las condiciones en las cuales est creciendo la clula. Los problemas que confrontan las clulas eucariotas son ms complejos. Adems de poseer un genoma que contiene mucha mayor informacin, las clulas de una planta o animal complejo existen en gran variedad de estados diferenciados. Los vertebrados se componen de cientos de tipos diferentes de clulas, cada una mucho ms compleja que una clula bacteriana, y requieren una serie distinta de protenas que les permita ejecutar sus diferentes actividades especializadas.

Hubo un tiempo en que los bilogos pensaron que las clulas alcanzaban un estado particular de diferenciacin reteniendo aquellas partes de los cromosomas requeridas para las funciones de las clulas de ese tipo, en tanto que se eliminan las partes innecesarias de los cromosomas. Esta idea de que la diferenciacin se acompaa de la prdida de informacin gentica fue abandonada en los decenios de 1950 y 1960 gracias a una serie de experimentos clave efectuados tanto en plantas como en animales, demostrando que las clulas diferenciadas retienen los genes requeridos para la formacin de otros tipos de tejidos diferentes de aquellos de donde se tomaron dichas clulas. Por ejemplo, Frederick Steward y sus colegas, de la Universidad Cornell, demostraron que se podan aislar clulas individuales de las races de una planta madura y, bajo condiciones apropiadas de laboratorio, indujeron su crecimiento en una planta totalmente desarrollada que contena todos ios diferentes tipos de clulas normalmente presentes. Las clulas simples de un animal adulto no pueden originar individuos nuevos, pero el ncleo de dichas clulas muestra capacidad para apoyar el desarrollo de un nuevo individuo. Esto fue demostrado por primera vez en anfibios por John Gurdon, de la Universidad Oxford. Gurdon quit el ncleo de una clula adulta de la piel del sapo con garras Xenopus laevis, y trasplant dicho ncleo a un huevo activado cuyos propios cromosomas fueron destruidos mediante irradiacin (fig. 12-30). El huevo que recibi el ncleo trasplantado se desarroll en un renacuajo bien formado que contena varias clulas totalmente diferenciadas, adems de las clulas de la piel. De estos experimentos es evidente que los ncleos de clulas especializadas, como las de races de plantas o piel de animales, contienen la informacin gentica necesaria para la diferenciacin de muchos tipos diferentes de clulas. Los resultados de una gran variedad de experimentos indican que las clulas no pierden material gentico cuando sufren diferenciacin. Ms bien, las clulas que se convierten en celdillas hepticas, por ejemplo, sufren esta transformacin porque expresan un conjunto especfico de "genes hepticos", en tanto que las clulas que se desarrollan para formar neuronas lo hacen por que expresan un conjunto de "genes de nervios". La clula bacteriana promedio contiene suficiente DNA para codificar unos 3 000 polipcptidos, de los cuajes casi la tercera parte se expresan tpicamente en cualquier momento particular. Esto se puede comparar con las clulas humanas que contienen DNA suficiente (6 000 millones de pares de bases) para codificar varios millones de polipptidos distintos. Aunque la mayor parte de este DNA no contiene en realidad informacin para codificar protenas, se estima que los mamferos sintetizan hasta 100 000 diferentes polipptidos durante toda su vida. De esta cifra, se estima que una clula tpica de mamfero elabora casi 5 000 diversos polipptidos en cualquier momento determinado. Muchos de estos polipptidos, como las enzimas de la gluclisis o los transportadores de electrones de la cadena respiratoria, prcticamente se sintetizan en todas las clulas del cuerpo. Al mismo tiempo, cada tipo de clula contiene protenas que son nicas para su estado de diferenciacin. Estas protenas, ms que cualquier otro componente celular, confieren a la clula sus caractersticas nicas. A causa de esta

512

CAPITULO 12 Ncleo de la clula y control de la expresin de genes

OPERON INDUCIBLE

Inductor (p. ej., lactosa)

OPERON REPRES1BLE

Correpresor (p. ej., triptfano)

Represor activo

Represor inactivo

Genes estructurales

La transcripcin es bloqueada Genes estructurales ESTADO INDUCIDO ESTADO REPRIMIDO

3.

RNA polimerasa

RNAm

Represor inactivo

Se detiene la biosntesis, la concentracin de trptfano desciende conforme se utiliza ESTADO DESREPRIMIDO

La concentracin de lactosa desciende conforme se degrada

RNAm

6.

ESTADO REPRIMIDO

9 V
8.
7.

La transcripcin es bloqueada Producto final (triptfano}

(a)

(b)

CAPITULO 12 Ncleo de la clula y control de la expresin de genes FIGURA 12-28. Regulacin del gen por operones. Operones inductores y represores operan bajo un principio similar: si el represor puede enlazarse al represor, los genes se inactivan; si el represor es inactivado y no puede enlazarse al operador, los genes se expresan. a) Operones inducibles. 1) En concentracin elevada, el inductor (en este caso, disacrido lactosa) se enlaza a la protena represora y 2) impide que se fije al operador (O). 3) Sin el represor en su camino, la RNA polimerasa se fija al promotor (P), y 4) transcribe los genes estructurales. Por lo tanto, cuando la concentracin de lactosa es alta, se induce el opern, y se elaboran las enzimas necesarias para digerir azcar. 5) Conforme se metaboliza en azcar su concentracin disminuye, 6) provocando que el inductor enlazado a molculas se disocie del represor, el cual entonces recupera su capacidad para fijarse al operador y evitar la transcripcin. As, cuando la concentracin de inductor es baja, el opern est reprimido, evitando la sntesis de enzimas innecesarias. b) En un opern represible, como el opern trp, el represor, por s mismo, es incapaz de enlazarse al operador, y los genes estructurales que codifican las enzimas son transcritos activamente. Las enzimas del opern trp catalizan las reacciones para sintetizar esta enzima esencial. 1) Cuando se encuentran disponibles, las molculas de trip- tfano actan como correpresores unindose al represor inactivo, y 2) k, *.>. cambian su forma de modo que pueda fijarse al operador, 3) evitando la transcripcin de los genes estructurales. Por lo tanto, cuando la concentracin de triptfano es alta, el opern est reprimido, evitando la produccin excesiva de triptfano. 4) Cuando la concentracin de triptfano es baja, la mayor parte de las molculas represoras carecen de un correpresor y por lo tanto no se fijan al operador. 5) Se transcriben los genes, 6) se sintetizan enzimas, y 7) se elabora el producto final necesario (triptfano}. 8) Conforme la biosntesis prosigue, el triptfano se acumula en una concentracin lo bastante alta para reprimir de nuevo al opern (paso 1).

513

duccin de estos pocos polipptdos se convierta en la actividad sinttica dominante de las clulas. Puesto que la cadena de acontecimientos que conducen a la sntesis de una protena particular consta de varias etapas separadas, hay varios niveles en los cuales se puede ejercer control. La regulacin de la expresin de un gen en clulas eucariotas ocurre principalmente a tres niveles distintos (fig. 12-31). 1. Los mecanismos de control a nivel de transcripcin determinan si un gen particular ser transcrito y en caso afirmativo, con qu frecuencia. 2. Los mecanismos de control a nivel de procesamiento determinan la va para procesar un transcrito de RNA primario en un RNA mensajero que puede traducirse en un polipptido. 3. Los mecanismos de control a nivel de traduccin determinan si un RNAm particular ser realmente traducido, y si esto es as, con qu frecuencia y durante cunto tiempo. Antes de considerar estos tres niveles principales de control de la expresin del gen, estudiaremos otras dos estrategias empleadas por unos cuantos tipos de clulas, pero que son interesantes como ejemplos de la manera en que las clulas reconocen un grupo especfico de sitios genticos expresados selectivamente. Amplificacin selectiva de las plantillas de DNA La amplificacin selectiva de genes es un proceso en el cual una porcin limitada del genoma sufre especficamente una duplicacin excesiva como medio de aumentar el nmero de copias de un conjunto particular de genes. La amplificacin selectiva de genes podra suministrar potencialmente un mecanismo para incrementar la expresin de aquellos genes que desempean un papel clave en las actividades de determinado tipo de clula, como los genes de globina en una clula destinada a convertirse en eritrocito. Sin embargo, los resultados de una gran variedad de experimentos indican que la amplificacin selectiva de genes no

''. ^tremenda cantidad de DNA que se encuentra en las clulas ;. ^/,-eucariotas y el gran nmero de diferentes protenas que se ''--; "ensamblan, la regulacin de la expresin de genes en una ;^'clula eucariota es un proceso extraordinariamente com~;,piejo, el cual apenas comienza a comprenderse. Consideremos la situacin que enfrenta una clula que ;,-se desarrolla para formar un eritrocito dentro de la mdula ; '-' sea humana. La hemoglobina equivale a ms de 95% de su -v"::; protena, pero los genes que codifican los polipptidos de '' "Hemoglobina representan menos de una millonsima de su :; .1 IpNA total. La clula no slo tiene que encontrar esta "agu"-ja" gentica en el "pajar" cromosmco, sino tambin debe " --regular su expresin con tal grado de precisin que la pro*'*r?

Promotor

Gen /
^ -.'' O t/J 5 tD Q_

GenZ Sitio de enlace CAP-AMPc Operador ^ RNAm

3' 5'

HU

*:= DNA

S*AaGCGeSCAarGACCGC4ACGCAATTA4TGTGAGTTAQCTCACrCflTTAeeflCCCCAGGCTTTACACTTT4TGCTTCCGGCTCGTATGTTeiGTGGAArTGTGflGCGGATAaCAATTTCACflCAGGflaOCaGCTiieACCAT5 CTTTCGCCCGTCACTGGCGTTGCeTTAATT4CACTCAATCGAGTGAGTAATCCarGGGGTCCGAAaTGrGAAATACGaAGGCCGAGCATACAACACACCTT4ACACrCGCCTATTGTTAAAGTGTGTCCTTTGTCGATACTGGTA

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

+1

+10

+20

+30

'.?"";-,-- FIGURA 12-2 < >, Secuencia de nucetidos de los sitios de enlace en la regin controlada por el opern lac: La regin promotora^ on ti ene %VjSJ sitio de enlace para la proteina PAC y tambin para la RNA polimerasa. El sitio para iniciar la transcripcin est indicado +1, que se encuentra *; '"_ aproximadamente 30 nucletidos adelante del sitio en el cual se inicia la traduccin. (Reimpreso con permiso de R.C. Dickson y cois. Science S7:32, -.''-.---,i975; copyright. 1975 American Association for the Advancement of Science.) " -

514

CAPITULO 12 Ncleo de la clula y control de la expresin de genes

Clonas de la rana B (no A)

Huevo Huevo (irradiado para destruir el ncleo) Huevo * enucleado

Clula de ta piel totalmente diferenciada

i

Permitir que el huevo se desarrolle para formar un gusarapo Huevo con trasplantado

Ncleo de la clula de la piel

O
11
i

Implante del ncleo dentro del huevo

FIGURA 1.2-30. Resultados de un experimento empleando trasplante de ncleos. Cuando se trasplanta el ncleo de una clula diferenciada de la piel de Xenopus dentro de un vulo activado enucleado, el vulo se desarrolla como un gusarapo de aspecto normal con una amplia variedad de clulas diferenciadas distintas de las clulas de la piel. Puesto que todos los genes del gusarapo se derivan del ncleo trasplantado (lo que se puede demostrar mediante el uso de marcadores genticos), estos experimentos confirman la creencia ampliamente difundida de que las clulas diferenciadas retienen toda la informacin gentica originalmente presente en el cigoto.

es un mecanismo general para lograr la tasa mxima de expresin gentica. Aunque determinada clula diferenciada pueda producir grandes cantidades de una especie particular de protena, no es necesaria la presencia de un mayor nmero de plantillas de DNA, y basta que la secuencia de DNA ocurra en una sola copia por conjunto de cromosomas haploides. La amplificacin selectiva de genes no es un proceso que sucede extensamente, pero se conocen varios ejemplos bien comprobados. Por ejemplo, los genes que codifican RNA ribosmico en los grandes oocitos de anfibios son selectivamente amplificados. A diferencia de un RNAm nico, que se puede traducir miles de veces para producir millares de copias de un polippdo particular, una molcula nica de RNAr slo puede formar parte de un ribosoma particular. Conforme el oocito del anfibio crece, su volumen aumenta de manera espectacular y s llena de ribosomas que el embrin en desarrollo utilizar para satisfacer sus necesidades de protenas nuevas. Aun cuando los genomas de los anfibios contengan cientos de copias de los genes que codifican RNA ribosmico (pg. 408), todava se requieren copias adicionales para suministrar las plantillas necesarias. Estas plantillas se generan mediante un proceso de duplicacin que libera DNA circular que contiene copias en serie de los genes de RNAr. Cada una de las molculas de DNAr sirve como sitio organizador para la formacin de

sus propios nuclolos, que se convierten en sitios de ensamblado de ribosomas en el gran ncleo del oocito (fig. 11-13). Es irrelevante si el RNAr 5S del oocito del anfibio, requerido en igual nmero por los otros RNAr, se sintetiza a partir de plantillas de DNA que no son amplificadas. Ms bien, el genoma de estos anfibios contiene unos 20 000 genes 5S presentes en toda las clulas del animal, pero que slo se usan en la formacin del oocito. Aunque un solo RNAm puede dirigir el ensamblado de numerosas cadenas de polipptidos, se conocen unos pocos casos en los cuales la elevada demanda de protenas requiere un incremento selectivo del nmero de plantillas de DNA. Por ejemplo, en Drosophilc el huevo est recubierto por una cascara (corion) producida por las clulas que lo rodean durante un breve periodo al final de la oognesis. Las 20 o ms protenas que constituyen el corion son codificadas por dos grupos de genes localizados sobre cromosomas separados. Conforme se aproxima el tiempo para la formacin de la cascara del huevo, un grupo de genes se amplifica selectivamente casi 15 veces, en tanto que el otro grupo se amplifica ms de 60 veces. La amplificacin ocurre por el inicio repetido de la sntesis de DNA a partir de sitios definidos dentro de cada grupo de genes del corion. Las secuencias de DNA incrementadas suministran el nmero necesario de plantillas para sintetizar la cantidad requerida de molculas de protena.

CAPITULO 12 Ncleo de la clula y control de la expresin de genes

515

ONTROL A NIVEL E LA TRANSCRIPCIN

CONTROL A NIVEL DE LA TRADUCCIN

FIGURA 12-31. La expresin del gen es controlada en tres niveles primarios. Los controles a nivel de la transcripcin operan para regular cules genes se transcriben y con qu frecuencia; los controles a nivel de procesamiento operan para determinar qu partes de los transcritos primarios formarn parte de la reserva de RNAm celular; y los controles a nivel de traduccin regulan si un RNAm particular ser traducido o no y, en caso afirmativo, con qu frecuencia y durante cunto tiempo.

Re ordenamiento de las secuencias de DNA que participan en la formacin de anticuerpos En la pgina 63 se estudi la estructura de las molculas de anticuerpo. Cada molcula de anticuerpo se compone de dos tipos de cadenas de polipptidos: cadenas ligeras (L) y cadenas pesadas (H). Ambos tipos contienen dos partes idenficables: una posicin variable (V), cuya secuencia de aminocidos vara de un anticuerpo a otro, y una porcin constante (C), cuya secuencia de aminocidos es idntica entre todas las cadenas H o L del mismo tipo. Cul es la base gentica para la sntesis de polipptidos en los cuales se mezcla una secuencia de aminocidos compartida y nica? En 1965, William Dreyer, del California Institute of Technology, y J. Claudc Bennett, de la Universidad de Alabama, propusieron la hiptesis de "dos genes-un polipptdo" para explicar la estructura de los anticuerpos. En esencia, Dreyer y Bennett propusieron que cada cadena de anticuerpo es codificada por dos genes separados: un gen C y un gen V, que de alguna manera se combinan para formar un "gen" continuo que codifica una sola cadena ligera o pesada. Once aos despus, en 1976, Susumu Tonegawa, trabajando en un instituto de investigacin en Suiza, sumi-

nistr datos claros en favor de la hiptesis del reordenamiento del DNA. Tonegawa y sus colegas midieron en el DNA !a distancia entre las secuencias de nucletidos que codifican las porciones C y V de una cadena particular de anticuerpos. Compararon esta distancia en el DNA aislado de dos tipos diferentes de clulas de ratn, clulas de embriones y clulas del plasma secretorias de anticuerpos. Aunque estos dos segmentos de DNA se encontraban ampliamente separados en el DNA obtenido de embriones, dichos segmentos se encontraban muy prximos en el DNA obtenido de las clulas plasmticas. Estos datos sugieren fuertemente que las partes del DNA en realidad se reordenan durante la formacin de clulas productoras de anticuerpos. Una investigacin posterior revel que el DNA de un cromosoma particular contiene un solo gen C y un gran nmero de genes diferentes V. Durante el proceso de reordenamiento, que ocurre en tanto el linfocito est maduro en la mdula sea, el gen C se desplaza a un punto muy prximo de uno de los genes V, lo que permite la transcripcin de un solo RNAm a partir de estos elementos genticos combinados. Consideremos con mayor detalle este proceso. En el paso 1 de la figura 12-32 se muestra la organizacin de las secuencias de DNA que participan en la formacin de las cadenas ligeras K del ratn. En este caso, varios genes V se localizan en disposicin lineal separada del gen C nico por cierta distancia. El anlisis de la secuencia de nucletidos de estos genes V indic que eran un poco ms cortos que lo necesario para codificar la porcin correspondiente de la regin V de la cadena ligera K. La razn de esto se aclar cuando se secuendaron otros segmentos de la regin. El tramo de nucletidos que codifica a los 13 aminocidos en el extremo carboxilo de la regin V se encuentra a cierta distancia del resto de las secuencias del gen. Esta pequea porcin que codifica el extremo de la regin V se denomina segmento J. Como se muestra en la figura 12-32, hay cinco segmentos J distintos (con secuencia similar de nucletidos) dispuestos en serie. El grupo de segmentos J se separa entonces del gen C mediante un tramo adicional de ms de 2 000 nucletidos. El verdadero reordenamiento ocurre cuando un gen especfico V se junta a uno de los segmentos J, formando por lo tanto una secuencia completa y especfica del gen B que an se encuentra separada del gen C por 2 000 a 4 000 nucletidos (pasos 2 y 3, fig. 12-32). Antes de la transcripcin no se requiere movimiento adicional de DNA; toda la regin gentica se transcribe en un transcrito primario grande (paso 4) a partir del cual el RNA de empalme secciona porciones no codificantes (paso 5). En este caso, el de las cadenas ligeras K del ratn, se estima que el DNA de las clulas germinales contiene unos 300 genes V. Por lo tanto, si asumimos que las uniones V-J ocurren al azar, podra esperarse que un ratn sintetizara casi 1 500 diferentes tipos de cadenas K (cinco segmentos J por 300 genes V). Un anlisis posterior revel que el sitio donde el segmento J se une a la regin V puede variar algo de un reordenamiento a otro. Esta variabilidad en el sitio de unin V-J aumenta la diversidad de las cadenas K unas 10 veces ms, alcanzando as un nmero mximo de casi 15 000 especies de cadenas K. Puesto que el sitio donde ocurre la unin V-J es parte de una de las regiones hipervariables del polipptido del anticuerpo (fig. 2-44), las ligeras diferencias

516

CAPITULO 12 Ncleo de la clula y control de la expresin de genes

O
DNA de lnea germinal
V6 V5 V4 V3 V2 VI Jl J2 J3 J4 J5 C

V6

V5

V4

V3

32 J3 J4 J5

nes ilustra cmo un puado de secuencias de DNA presentes en la estirpe germinal da lugar a una notable diversidad de productos del gen. Como se analiz antes, un ratn puede sintetizar varios miles de diferentes especies de cadenas K, Se estima que el mismo animal puede producir cuando menos 50 000 especies de cadenas pesadas ms grandes. Si cualquier cadena ligera determinada puede combinarse con otra cadena pesada definida, un solo ratn (o un ser humano) es capaz de generar millones de diversas especies de molculas de anticuerpos, todas a partir de casi 1 000 elementos genticos originalmente presentes en la estirpe germinal. Control a nivel de la transcripcin Igual que en las clulas procariotas, la transcripcin diferencial de genes es el mecanismo aislado ms importante mediante el cual las clulas eucariotas determinan qu protena sintetizarn en cualquier momento de su vida. Numerosas pruebas indican que las clulas expresan diferentes genes en distintas etapas del desarrollo embrionario por clulas en tejidos variados o por clulas expuestas a diversos tipos de estmulos. En los ltimos 10 aos se avanz mucho en el conocimiento de los mecanismos que permiten que ciertos genes sean transcritos en una clula particular, en tanto que todos los dems genes del genoma permanecen silenciosos. Se han purificado numerosas protenas, llamadas factores de transcripcin, cuyo papel es enlazarse a secuencias especficas de DNA y estimular o inhibir la transcripcin de genes parecidos.1 Aunque se conoce la estructura de varios factores de transcripcin y su manera de interactuar con su secuencia de DNA especfica, una descripcin unificada de su mecanismo de operacin an es un objetivo distante. Por ejemplo, es evidente que un solo gen puede estar controlado por diferentes sitios reguladores capaces de enlazarse a diversas protenas reguladoras. Por lo contrario, una sola protena enlazada.a DNA puede fijarse a numerosos sitios alrededor del genoma y controlar la expresin de multitud de genes diferentes. Es evidente que el control de la transcripcin de genes es muy compleja y est influenciada por diversas situaciones, incluyendo la afinidad del factor de transcripcin por una secuencia particular DNA y la capacidad de los factores de transcripcin para enlazarse a sitios cercanos sobre el DNA que actan coordinadamente entre s. La complejidad inherente al control de la transcripcin de genes se puede ilustrar examinando el DNA en el interior de un solo gen y alrededor del mismo; utilizaremos el gen de la metalotionena como ejemplo (fig. 12-33). La metalotionena es una pequea enzima que participa en la destoxicacin de metales. En clulas animales, la sntesis de

DNA de clula B
V6 V5 V4 V3 J2 J3 J4 J5

Transcripcin
V3 J2 J3 J4 J5 C

Transcrito primario I ......i Hlfin j

f~~

V3 J2

RNAm maduro

FIGURA 12-32. Reordenamiento del DNA que conduce a la formacin de un gen funcional que codifica la cadena K de una inmunoglobulina. En el paso 1 se muestra la organizacin de las secuencias de DNA variable (V), de unin (]) y constante (C) dentro del genoma. Los pasos que conducen a la sntesis del RNAm maduro que codifica el polipptido de la cadena K se describen en el texto. La unin al azar de un segmento V y uno J (pasos 2 y 3) determina la secuencia de aminocidos del polipptido. El espacio-entre el segmento J "elegido" y el segmento C (que puede contener uno o ms segmentos J, como se muestra en la figura) permanece como un intrn en el gen (paso 4). La porcin del transcrito primario que corresponde al intrn se elimina durante el procesamiento del RNA (paso 5).

en el sitio de unin pueden tener efectos importantes sobre la interaccin antgeno-anticuerpo. El reordenamiento de las secuencias de DNA ya descrito tiene consecuencias muy importantes para un linfocito. Una vez que se une con xito una secuencia especfica V^ a la secuencia }K, la clula no puede sintetizar ninguna otra especie de cadena K. Este anlisis se restringe a las cadenas ligeras K por razones de sencillez. Ocurren reordenamientos similares del DNA durante el compromiso de la clula para sintetizar una cadena ligera A de tipo particular y una cadena pesada especfica. Ms que cualquier otro proceso, la formacin de genes de anticuerpos por reordenamiento del DNA ilustra el potencial del genoma para participar en actividades dinmicas. La existencia de este mecanismo de "barajamiento" de ge-

1 Las secuencias reguladoras de DNA a menudo se denominan elementos de control ds, puesto que residen en la misma molcula de DNA que el propio gen. Por lo contrario, los factores que participan en la regulacin de la transcripcin y que no son parte de la molcula de DNA, como los diferentes factores de transcripcin que se enlazan a secuencias especficas de DNA, se denominan elementos de control trans. Estos trminos comnmente se encuentran en publicaciones relacionadas con la transcripcin.

CAPITULO 12 Ncleo de la clula y control de la expresin de genes

517

Elementos de respuesta
ERG ENB
ERM ERM

ENB

ERM

ERM

TATA

-260

-240 -220 -200 -180

-160

-140

-120 -100

-60

40

-20

FIGURA 12-33. Regin reguladora del gen de metalotionena. La transcripcin de este gen, igual que otros, es controlada por varios factores de transcripcin que interactan especficamente con diferentes secuencias de DNA localizadas en una regin reguladora adelante de la regin codificadora del gen. Dentro de la regin reguladora se incluyen elementos de respuesta a metales (ERM) que enlazan factores de transcripcin activados por metales, un elemento de respuesta a glucocorticoides (ERG) que se enlaza a una protena esteroide receptora, y elementos de nivel basal {ENB) que se enlazan a una protena necesaria para obtener un nivel basal de transcripcin del gen. (Segn B. Lewin, Genes V, p. 881, Oxford University Press, 1994.)

esta protena se incrementa mucho luego de la administracin de metales, como cadmio o zinc, o en respuesta a un incremento en la concentracin de hormonas glucocorticoides secretadas por la corteza suprarrenal. La clave para entender la regulacin de la expresin del gen de metalotionena estriba en descubrir las funciones del gran nmero de secuencias reguladoras de DNA que residen haca adelante del propio gen. El cuadro TATA es la secuencia reguladora ms prxima (ms proximal) hacia adelante, que es el principal componente del promotor del gen. Recordemos que el promotor es el sitio regulador sobre el DNA que determina el sitio preciso en el cual se inicia la transcripcin (pg. 449). Como se estudi en el captulo 11, el cuadro TATA es el sitio de ensamblado de muchos factores de transcripcin general requeridos antes que un gen eucariota pueda ser transcrito por una RNA polmerasa II. Para algunos genes, la formacin del complejo de preinicio en el sitio del cuadro TATA puede ser suficiente para permitir un nivel basal de transcripcin del gen adyacente. Este nivel basal de transcripcin se modifica entonces (estimulado o inhibido) por la presencia de otras protenas de enlace al DNA situadas en otros sitios sobre dicho DNA. El nivel basal de expresin del gen de metalotionena al parecer requiere la presencia de un factor de transcripcin adicional (llamado AP2) enlazado a los dos elementos de nivel basal (ENB) indicados en la figura 12-33. Entre los otros elementos que regulan la expresin del gen de metalotionena se encuentran los elementos de respuesta al metal (ERM), que se enlazan a los factores de transcripcin activados por los metales. Los ERM proporcionan el medio para que la clula incremente la transcripcin del gen de metalotionena por arriba del nivel basal en respuesta a la presencia de metales. Ntese que la regin reguladora del DNA contiene varios ERM capaces de enlazarse a un factor de transcripcin (fig. 12-33). Estudios en los cuales se efecta la supresin de los ERM del DNA indican que los efectos de las protenas enlazadas a estos sitios son aditivos; cuanto mayor la concentracin del metal, ms elevado el nmero de factores de transcripcin enlazados, y mayor la estimulacin de la transcripcin del gen de metalotionena. Se asume que los factores de transcripcin enlazados a un ERM influyen en la transcripcin porque interactan con el mecanismo de transcripcin residente en el cuadro TATA.

Los glucocorticoides estimulan la expresin del gen de metalotionena por una va independiente de la empleada por los metales. Estas hormonas esferoides actan mediante una serie de elementos de respuesta a glucocorticoides (ERG) que comparten una secuencia similar. Cuando las hormonas penetran a una clula blanco, se enlazan a una protena receptora de glucocorticoide y cambian la conformacin de la protena incrementando su actividad por la secuencia ERG en el DNA (fig. 12-34). Como resultado, el complejo hormona-receptor se convierte en un factor de transcripcin "activado" que se enlaza a los diferentes ERG dentro del genoma, incluyendo los situados hacia adelante del gen de metalotionena. El enlace del complejo receptor-hormona a los ERG del gen de metalotionena incrementa la tasa de inicio de la transcripcin en el promotor cercano. Puesto que la misma secuencia ERG se localiza hacia adelante de diferentes genes sobre distintos cromosomas, un solo estmulo (concentracin elevada de glucocorticoides) puede activar de manera simultnea a todos los genes necesarios para una respuesta comprensible. Adems de los tipos de secuencias de DNA descritos antes, la expresin de la mayor parte de los genes tambin est controlada por un tipo de elemento de DNA llamado amplificador, que sirve como sitio de enlace para factores que estimulan la transcripcin por arriba del nivel basal. Los amplificadores se distinguen de otros elementos reguladores de DNA por propiedades reveladas a travs de la experimentacin; en esta forma, los amplificadores se pueden, desplazar de un sitio a otro dentro del DNA o incluso invertirse (girar 180), sin afectar la capacidad de un factor de transcripcin enlazado para estimular la transcripcin. La supresin de un amplificador puede disminuir el nivel de transcripcin por un factor de 100 veces o ms. Algunos amplificadores pueden localizarse miles o incluso decenas de miles de bases ms adelante del gen cuya transcripcin estimulan. El grupo de genes de la globina/ humana, por ejemplo, contiene un amplificador que gobierna la transcripcin de los diferentes genes de la globina /3 en un sitio localizado decenas de miles de pares de bases hacia adelante de la mayor parte de ellos. Se piensa que las protenas enlazadas a los amplificadores estimulan la transcripcin al interactuar con componentes especficos (p. ej., TFIIB o TFIID de la figura 11-20) del mecanismo basal de transcripcin enlazado al cuadro TATA. Se cree que estos dos sitios distantes sobre el DNA se ponen en estrecho contacto como

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CAPITULO 12 Ncleo de la clula y control de l expresin de genes

FIGURA 12-34. Pasos en la activacin de un gen por una hormona esteroide, como el glucocorticoide cortisol. La hormona penetra a la clula procedente del lquido extracelular (paso 1), difundiendo a travs de la bicapa de lpidos (paso 2} y en el citoplasma, donde se enlaza a un receptor de glucocorticoides (paso 3). El enlace de la hormona cambia la conformacin del receptor (paso 4) y provoca la translocacin en el ncleo, donde acta como factor de transcripcin que se enlaza al elemento de respuesta a glucocorticoides del DNA (paso 5). El enlace de la hormona activa la transcripcin del DNA (paso 6), lo que conduce a la sntesis de protenas especficas en el citoplasma (paso 7).

resultado de la formacin de asas del DNA interpuesto. Ya se ha demostrado muchas veces la capacidad del DNA para mantenerse en forma de asa mediante interacciones entre las protenas enlazadas; en la figura 12-35 se muestra un ejemplo. Del nmero de sitios reguladores ya descritos (y otros de la misma regin del DNA que no se mencionaron), es evidente que el control de la expresin del gen a nivel de transcripcin puede ser muy complicado. Para comprender cmo interactan los factores de transcripcin con el DNA, entre s y con las protenas enlazadas al cuadro TATA, podemos examinar brevemente la estructura de algunas de estas protenas reguladoras de la transcripcin. Estructura de los factores de transcripcin Mediante cristalografa de rayos X y espectroscopia de resonancia magntica nuclear se ha determinado la estructura tridimensional de algunos complejos DNA-protena, lo que suministra una imagen bsica de la manera en que estas dos molculas gigantes interactan entre s. Igual que la mayor parte de las protenas, los factores de transcripcin contienen diferentes dominios que median distintos aspectos de la funcin de la protena. Tpicamente, los factores de transcripcin contienen cuando menos dos dominios: uno cuya funcin es reconocer y enlazarse a una secuencia especfica de pares de bases en el DNA, y otro que consiste en activar la transcripcin interactuando con otras protenas (fig. 12-36). Podemos comenzar examinando el receptor de glucocorticoides cuyo papel en la estimulacin de la expresin del gen de metalotionena que ya hemos descrito.

FIGURA 12-35. Mecanismo mediante el cual los factores de transcripcin enlazados en sitios distantes pueden influir la expresin del gen. Micrografa electrnica que muestra el enlace del receptor progesterona al DNA por delante del gen de uteroglobina provocando la formacin de un asa. La barra es igual a 50 nm. (Reimpreso con permiso de Bernard Theveny y cois., cortesa de Edivin Milgroin, Nature 329:79, 1987; copyright 1987 MacmiUan Magazines Limited.)

CAPITULO 12 Ndeo de la clula y control de la expresin de genes

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Sitio de inicio DNA TFIID

FIGURA 12-36. Los factores de transcripcin contienen los dominios de enlace a DNA y de transcripcin-activacin. Representacin esquemtica de un factor de transcripcin (representado como un dmero igual que la mayor parte de los mostrados hasta ahora) con dominios separados que interactan con una secuencia DNA especfica (un amplificador) y con el mecanismos basal de transcripcin que reside en el cuadro TATA del promotor. Se cree que esta ltima interaccin estimula la transcripcin (o inhibe la transcripcin si el factor es un represor), alterando la conducta del mecanismo de transcripcin.

El receptor para glucocorticoides. Los glucocorticoides (como el cortisol) son hormonas esferoides secretadas por la porcin ms externa de la glndula suprarrenal que promueven la conversin de aminocidos a glucosa y su captacin por el cerebro. La secrecin de estas hormonas es ms elevada durante periodos de estrs, como durante el ayuno o despus de una lesin fsica grave. Para que una clula responda a los glucocorticoides debe poseer un receptor especfico capaz de enlazarse a la hormona. El receptor de glucocorticoides (RG) es miembro de una familia de receptores nucleares (incluyendo receptores para hormona tiroidea, cido retinoico y estrgenos) que comparten propiedades similares y se cree que han evolucionado a partir de una protena ancestral comn. Igual que los otros miembros de la familia, los RG tienen tres dominios distintos: un dominio para enlazarse a un ligando al cual se une la hormona esterode, un dominio para enlazarse a DNA que reconoce y se une a una secuencia de DNA especfica, y un tercer dominio que activa la transcripcin. Las secuencias de DNA capaces de enlazarse a los RG tienen una secuencia similar de nucletidos que contienen dos tramos simtricos de DNA separados por tres nucletidos espaciadores. Un ejemplo de secuencia para enlazar RG (p. ej., un elemento de respuesta a glucocorticoides, o ERG) es 5' -AG AACAnnnTGTTCT-3' 3' -TCTTGTmn AC AGA-5' donde n puede ser cualquier nucletido. (Se dice que una secuencia de este tipo tiene "simetra rotacional doble" y se denomina palndromo, debido a que las dos cadenas tienen la misma secuencia 5' a 3'.) La importancia del ERG en la mediacin de la respuesta hormonal se puede demostrar ms claramente introduciendo una de estas secuencias en la regin situada ms adelante del gen que normalmente no

responde a los glucocorticoides. Cuando clulas que contienen DNA manipuladas genticamente se exponen a glucocorticoides, se inicia la transcripcin de los genes situados por detrs del ERG trasplantado. Las variaciones en las secuencias de nucletidos de un ERG a otro pueden incrementar o reducir su afinidad por RG y, a su vez, alterar el efecto del RG sobre la transcripcin. La doble naturaleza de la secuencia ERG desempea un papel importante debido a que pares de molculas RG forman dmeros en los cuales cada subunidad del dmero se une una mitad de la secuencia de DNA ya indicada (fig. 12-37). Se ha demostrado que la formacin de dmeros es una caracterstica comn de muchos tipos diferentes de factores de transcripcin y, como se estudia ms adelante, se cree que desempean un papel importante en la regulacin de la expresin del gen. Cada dominio para enlazar DNA de una subunidad RG contiene dos asas helicoidales a orientadas perpendicularmente entre s. Cada una de las hlices a tiene un ion zinc en su base (esferas de color rosa en la figura 12-37). Cada ion zinc se sita en el centro de un complejo formado por cuatro residuos de cistena acomodados con gran precisin. Puesto que forman asas peptdicas que se prolongan desde la superficie de la protena, y dado que contienen un ion zinc en su base, estos segmentos helicoidales a se conocen como dedos de zinc. Los dos dedos de zinc del RG tienen papeles diferentes. Uno de los dedos de zinc, denominado "hlice de reconocimiento", se prolonga dentro del surco mayor del DNA donde reconoce a la secuencia ERG y se une a ella. El otro dedo de zinc media el enlace a otra molcula del RG para formar un dmero. Como resultado de la dimerizacin, se prolongan simtricamente dos hlices de reconocimiento dentro de los dos surcos mayores adyacentes del DNA especfico, una a partir de cada subunidad del dmero. Otros factores de transcripcin. La comparacin de numerosos factores de transcripcin revel que los dominios para enlazar DNA de la mayor parte de los factores de transcripcin se pueden agrupar en varias clases extensas cuyos miembros poseen estructuras relacionadas (motivos) que interactan con las secuencias de DNA. La existencia de varias familias de protenas que pueden enlazarse al DNA ndica que la evolucin encontr un nmero diferente de soluciones a los problemas de construir polipptidos que puedan enlazarse a la doble hlice de DNA. Como veremos pronto, la mayor parte de estos motivos contienen un segmento (a menudo una hlice a, como en la figura 12-37) introducido en el surco mayor del DNA, donde reconocen la secuencia de pares de bases que revisten el surco. El enlace de la protena al DNA se logra mediante una combinacin de fuerzas de van der Waals (hidrofbicas), enlaces inicos, y puentes de hidrgeno entre residuos de aminocidos y diferentes partes del DNA, incluyendo su esqueleto. Entre los motivos ms comunes que ocurren en las protenas que se enlazan a DNA se encuentran el dedo zinc, la hlice-asa-hlice, el cierre de leucina y el cuadro GME. Cada uno suministra un armazn estructuralmente estable sobre el cual se pueden colocar en posicin apropiada las superficies de la protena que reconocen el DNA especfico para interactuar con la doble hlice. Cada motivo puede

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CAPITULO 12 Ncleo de a clula y control de la expresin de genes

contienen un tipo de dedo de zinc diferente y evolutivamente no relacionado. En estas protenas de dedo de zinc, el ion zinc de cada dedo se mantiene en su sitio mediante dos cistenas y dos histidinas (en vez de las cuatro cisternas, como en los receptores esteroides). Tpicamente, estas protenas contienen algunos de estos dedos que actan de manera independiente entre s y estn separados para proyectarse en surcos sucesivamente mayores dentro del DNA especfico, como se ilustra en la figura 12-38, a. La primera

FIGURA 12-37. Interaccin entre un factor de transcripcin y su secuencia especfica de DNA. Modelo de la interaccin entre el dominio de enlace de DNA del receptor dimrico para glucocorticoide (GR) y el DNA especfico (ERG). En el texto se hizo notar que los receptores para glucocorticoides y estrgenos pertenecen a la misma familia de protenas. Los residuos del GR esenciales para distinguir entre un elemento de respuesta a glucocorticoides en el DNA y un elemento de respuesta a estrgenos (ERE) se indican en rojo. La porcin correspondiente del DNA (representada por dos pares de bases A-T en el centro de la mitad de cada sitio ERG) al cual se enlazan estos residuos tambin se indica en rojo. Los residuos del segmento mostrado que son importantes para la interaccin protena-protena se colorean en verde. Los cuatro iones zinc (dos por cada monmero) se muestran como esferas de color rosa. (Reimpresa con permiso de T. Har y cois., cortesa de Robert Kaptein, Science 249:159, 3990; copyright 1990 American Association for tlie Advancemcnt of Science.)

(a)

COOH

encontrarse en una gran variedad de protenas que regulan diversos tipos de actividades celulares en organismos que van desde hongos hasta plantas y animales. 1. El motivo dedo de zinc. Como se describi antes, el receptor de glucocorticoides contiene dos dedos de zinc en los cuales se encuentra unido (coordinado) un ion zinc con cuatro residuos de cistena. Varios factores de transcripcin

FIGURA 12-;if. Factores de transcripcin que se enlazan por medio del motivo dedo de zinc, a) Modelo del complejo formado entre una protena con cinco dedos de zinc (llamada GLI) y DNA. Cada uno de los dedos de zinc tiene color diferente; el DNA es de color azul oscuro Cilindros y cintas resaltan las hlices a y las lminas $, respectivamente, b) Modelo del enlace de TFIIIA al DNA del gen de RNAr 5S. Como se hizo notar ert el captulo 11, el promotor del gen RNAr 55 se localiza en el propio gen, en vez de estar en el extremo 5' del flanco, (a: Reimpreso con permiso de Nikola K. Pavlctich y Cari O. Fabo, Science 261:1702, 1993; copyright 1993 American Association for the Advaricement of Science; b: segn K.R. Oemens y cois. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 89:10825, 1992.)

CAPITULO 12 Ncleo de la clula y control de la expresin de genes

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protena de dedo de zinc que se descubri, TFIIIA (requerida para la transcripcin del gen RNAr 55 por la polimerasa RNA III), tiene nueve dedos de zinc (fig. 12-38, b). La comparacin de algunas protenas de dedos de zinc ndica que el motivo proporciona el armazn estructural para una gran variedad de secuencias de aminocidos capaces de reconocer un conjunto diverso de secuencias de DNA. 2. El motivo hlice-asa-hlice (HAH). Como su nombre implica, este motivo se caracteriza por dos segmentos helicoidales a separados por un asa interpuesta. El dominio HAH con frecuencia va precedido por un tramo de aminocidos muy bsicos cuya cadena lateral con carga positiva entra en contacto con el DNA y determina la especificidad de la secuencia del factor de transcripcin. Las protenas con este motivo siempre ocurren como dmeros, segn se ilustra en el ejemplo del factor de transcripcin MyoD en la figura 12-39. Las dos subunidades del dmero de ordinario son codificadas por genes diferentes y por lo tanto la protena es un heterodmero. La heterodimerizacn expande ampliamente la diversidad de los factores reguladores que pueden ser generados a partir de un nmero limitado de polipptidos (fig. 12-40). Por ejemplo, supongamos que una clula debe sintetizar cinco polipptidos diferentes que contengan HAH capaces de formar heterodmeros entre s en cualquier combinacin; entonces sera posible formar 32 (25) diferentes factores de transcripcin que reconozcan 32 diferentes secuencias de DNA. En realidad, las combinaciones entre polipptidos probablemente estn restringidas, no muy diferente a la formacin de molculas heterodimricas de integrina (pg. 247). La heterodimerizacin tambin suministra una oportunidad para que una protena altere las propiedades de otra protena en relacin con su capacidad para enlazarse a DNA. Por ejemplo, una protena HAH denominada Id carece del tramo de aminocidos bsicos normalmente presentes en estas protenas y, por consiguiente, no tiene actividad para unirse a DNA. La Id puede enlazarse a otras protenas HAH y disminuir su afinidad de stas por la secuencia de DNA que normalmente reconoceran. Id puede desempear un papel en el desarrollo embrionario al enlazarse a un factor de transcripcin HAH denominado MyoD (mostrado en la figura 12-39, a), que acta como desencadenante de la diferenciacin de las clulas musculares. La prdida del Id de las clulas premusculares puede liberar MyoD de su complejo inhibidor y permitir que active la expresin del gen que inicia la diferenciacin de las clulas musculares. Por lo tanto, la dimerizacin constituye un mecanismo para regular la actividad de las protenas cuya funcin es moderar la expresin de los genes. Los factores de transcripcin que contienen HAH juegan un papel clave en la diferenciacin de ciertos tipos de tejidos, incluyendo msculo esqueltico. Esto se ilustra en la fotografa de la figura 12-41, que muestra un embrin de ratn transgnico que contiene la regin reguladora del gen miogenina colocado por delante de un gen/?-galactosidasa bacteriano. Es comn emplear el gen/3-gaIactosidasa para probar la expresin de tejidos especficos de un gen porque la presencia de esta enzima se puede revelar fcilmente mediante el color azul producido en una simple prueba histoqumica. En el ejemplo mostrado en la figura 12-41, la

FIGURA 12-39. Factor de transcripcin con un motivo hlice-asahlice (HAH). a) MyoD, un factor de transcripcin implicado en el inicio de diferenciacin de las clulas musculares, es una protena HAH que se enlaza al DNA mediante una regin bsica acompaante. El sitio de enlace de DNA de 14 pares de bases se muestran en azul ligero, la regin bsica es roja igual que las cadenas laterales que constituyen contactos especficos para bases y fosfatos del DNA. La regin hlice-asa-hHce de MyoD se muestra en amarillo, b) Presentacin del complejo dimrico MyoD en la misma orientacin que en la parte a. Las hlices a se representan como cilindros. (Segn P.C.M.. Ma y cois., cortesa de Cari O. Fabo, Cell 77:453, 1994; con permiso de Cell Press.)

sntesis de a enzima bacteriana slo puede ocurrir despus del enlace de factores especficos de transcripcin a las regiones reguladoras del gen miogenina, que slo ocurre en las porciones del embrin (el miotomo de los somitas) que dar lugar a tejido muscular. Los factores de transcripcin que contienen HAH tambin desempean un papel en el control de la proliferacin de clulas y se han implicado en la formacin de ciertos tumores cancerosos. En la pgina 502 se hizo notar que la

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CAPITULO 12 Ncleo de la clula y control de la expresin de genes

FIGURA 12-40. Incremento de la especificidad de los factores de transcripcin para unirse a DNA mediante heterodimerizacin. En este modelo de una protena HAH, se pueden formar tres diferentes factores de transcripcin dimricos capaces de reconocer distintos sitios de enlace a DNA uniendo las dos subunidadcs en diversas combinaciones. Homodmero A-A Homodmero B-B Heterodmero A-B

translocacin de un cromosoma puede producir genes anormales cuya expresin convierte a la clula en cancerosa. En casos de translocacin de cromosomas que conducen al desarrollo de cncer especfico se han encontrado genes que codifican cuando menos a cuatro diferentes protenas HAH (c-myc, SCL, LYL-1 y E2A). El ms prevaleciente de dichos cnceres es el linfoma de Burkitt, en el cual el gen c-myc se transloca a un locus que contiene un gen que codifica parte de una molcula de un anticuerpo. 3. El motivo cierre de leucina (CL). Este motivo debe su nombre a que la leucina aparece cada siete aminocidos a lo largo de una hlice a de casi 30 a 40 residuos. Puesto

12-11. Demostracin experimental de la expresin de tejidos especficos de un factor de transcripcin implicado en la diferenciacin de clulas musculares. La activacin de la transcripcin del gen miogenina ocurre especficamente en aquellas partes del embrin de ratn de 11.5 das de desarrollo que da lugar a tejido muscular. La activacin de la transcripcin est indicada por las clulas teidas de azul empleando una tcnica descrita en el texto. (Segn T.C. Cheng y cois., cortesa de Ee N. Olson, ]. Cell Biol. 119:1652,1992 con permiso de Rockefeller University Press.)

que una hlice a se repite cada 3.5 residuos, todas las leucinas situadas a lo largo de este tramo del polipptido se enfrentan en la misma direccin. Dos hlices a de este tipo pueden "cerrarse por entrecruzamiento" a todo lo largo de su trayecto para formar una espiral enrollada (pg. 59) en la cual las leucinas de una hlice estn presionadas contra las leucinas de la otra hlice. Por lo tanto, igual que la mayor parte de los otros factores de transcripcin, las protenas con un motivo CL existen en forma de dmeros. El motivo CL adquiere su capacidad para unirse al DNA porque posee un tramo de aminocidos bsicos situados a un lado de la hlice a que contiene leucina. As, igual que las protenas HAH, las porciones helicoidales a del motivo son importantes en la dimerizacin, en tanto que un tramo cercano de aminocidos bsicos permite a la protena reconocer una secuencia especfica de nucletidos en ei DNA. 4. El motivo cuadro GME. El "cuadro" GME se denomina as porque fue el primero que se descubri en un abundante grupo de protenas denominado grupo de movilidad elevada (GME), E! motivo consta de tres hlices a dispuestas en forma de Len dos sitios aparentes para enlazar DNA localizados en el exterior de la L. A diferencia de la mayor parte de los factores de transcripcin, que se enlazan al DNA y activan la transcripcin interactuando con protenas situadas a nivel del promotor, los factores de transcripcin que poseen cuadros GME activan la transcripcin porque deforman el DNA confirindole una conformacin que incrementa la transcripcin. La protena del GME mejor estudiada se denomina UBF, que activa la transcripcin de genes RNAr por la RNA polimerasa 1. UBF se enlaza al DN/\n forma de dmero cuyas dos subunidades contienen un total de 10 cuadros GME. Mediante su interaccin con sitios sucesivos a lo largo del DNA, los cuadros GME deforman la hlice de DNA de tal modo que producen un asa alrededor de la protena, como se muestra en la figura 12-42. La formacin del asa de DNA inducida por UBF trae en estrecha proximidad a dos secuencias reguladoras de DNA que normalmente estn separadas por 120 pares de bases en estrecha proximidad que pueden enlazarse para colaborar con un solo factor de transcripcin. Por lo tanto, las protenas del GME actan ordenando al DNA en disposicin espacial particular que incrementa su acceso a otros factores reguladores.
Represin de la transcripcin en eucariotcs

Como se puede observar en las figuras 12-27 y 12-28, el control de la transcripcin en clulas procariotas se apoya prin-

CAPITULO 12 Ncleo de la clula y control de la expresin de genes

523

Factores de transcripcin

portante parece ser el conocimiento del control de su sntesis. Al parecer, los genes que codifican factores de transcripcin se controlan a s mismos por otros factores de transcripcin cuya sntesis todava est controlada por otros factores. Comprender esta cascada de regulacin de la transcripcin es un desafo formidable, pero los avances hacia dicho objetivo ayudarn a responder muchas preguntas bsicas en la biologa celular y del desarrollo (vase La va experimental al final de este captulo). Papel de la metilacin del DNA En la pgina 418 se hizo notar que las bacterias aaden grupos metilo a ciertas bases de su propio DNA para protegerlo del ataque de las enzimas de restriccin de la propia clula. Las clulas eucariotas tambin metilan su DNA, pero una prueba cada vez mayor sugiere que, cuando menos en los vertebrados, la adicin de los grupos metilo acta principalmente para silenciar la transcripcin del DNA. El examen del DNA de mamferos y de otros vertebrados indica que hasta uno de cada 100 nucletidos posee un grupo metilo aadido, todos ellos fijos al carbono 5 de una citosina. Casi todos los residuos metilctosina se presentan como parte de un dinucletido CG dentro de una secuencia simtrica como la indicada en la figura 12-43, a. Estas secuencias no ocurren al azar en el DNA, sino que tienden a concentrarse en "islotes" ricos en GC, con frecuencia localizados dentro o cerca de regiones reguladoras de la transcripcin (fig. 12-43, b). En los vertebrados, la metilacin es una modificacin dinmica; hay enzimas para eliminar grupos metilo y tambin para aadirlos. Aunque el patrn promedio de metilacin del DNA cambia* relativamente poco de un tejido a otro, este patrn de metilacin dentro de las regiones reguladoras de genes especficos sometidos a activacin durante la diferenciacin celular puede cambiar de manera considerable. Estos cambios se pueden ilustrar por un mapa de metilacin de una regin particular del genoma, como se ilustra en la figura 12-44 con el grupo del gen de la globina fi de mamfero.

FIGURA 12-42. UBF es un factor de transcripcin dimrico que deforma el DNA de tal modo que lo hace una plantilla adecuada para la RNA polimerasa I. El enlace de RNA polimerasa I requiere algunos factores de transcripcin basal, no distintos de los requeridos para el enlace de la RNA polimerasa II al cuadro TATA de sus promotores.

cipalmente en los represores, o sea, protenas que se enlazan al DNA e impiden la transcripcin del gen cercano. Aunque la investigacin en eucariotes se ha enfocado sobre factores que activan o incrementan la transcripcin de genes especficos, es evidente que las clulas eucariotas tambin poseen mecanismos reguladores negativos. Hay dos maneras distintas de silenciar un gen: secuencias de DNA reguladoras especficas pueden interactuar con protenas represoras, o el DNA se puede modificar de manera que constituya una plantilla menos adecuada. Algunas de las protenas reguladoras negativas (p. ej., NC1, NC2, Drl) se enlazan al promotor e impiden el ensamblado del complejo previo al inicio requerido para comenzar la transcripcin (pg. 449). Otros represores se enlazan hacia adelante de las secuencias de DNA e inhiben de alguna manera la transcripcin. As, igual que en los procariotes, el patrn de transcripcin de genes particulares en un momento dado de la vida de una clula eucariota puede depender del equilibrio entre factores reguladores de accin positiva y de accin negativa. En cierto sentido, el estudio de los factores de transcripcin es una actividad aparentemente "sin fin". Cuanto ms aprendemos acerca de la importancia de estas protenas reguladoras para controlar la expresin de genes, ms im-

Pares de kilobases
0

CCGG GGCC GCGC CGCG ACGT TGCA

(9)

10

15 1

20 I

25 1

30 1

Gen de dihidrofolato reducase

DNA

Gen de hipoxantina fosforribosil transferasa

DNA

Tir-1
(b)

FIGURA 12-43- Metilacin del DNA. a) Ejemplos de las secuencias de nucletidos ms comnmente metiladas en el DNA. Los puntos de color indican la posicin de los grupos metilo, b) Ejemplos de islotes ricos en GC en las regiones promotoras de tres genes de mamfero. La longitud de los islotes se indica por la anchura de los cuadros de color rojo. La anchura de los exones se indica en negro; es evidente que las secuencias interpuestas constituyen la gran masa de cada gen, como habitualmente es el caso. (Segn A.P. Bird, Trends Genet. 3:343, 1987.)

524

CAPITULO 12 Ncleo de la clula y control de a expresin de genes

Migado adulto Hgado fetal Granuocitos Mdula sea Espermatozoide Cerebro fetal Sangre del adulto Sangre del feto Bazo
83
Q_ CC OO CD O

O)

se

FIGURA 12-44. Medicin de los niveles de metilacin de la regin del gen de la globina/? humana en diferentes tipos de clulas humanas. La figura muestra el mapa de los sitios de desdoblamiento de las enzimas de restriccin sensibles a metilacin y el nivel aproximado de modificacin en cada sitio. Mediante el signo f ) se indica 100 % de metilacin. Los sitios no medidos permanecen vacos a la izquierda. Ntese que el nivel de metilacin del DNA de globina y es mucho menor en el hgado del feto, el cual transcribe activamente este gen, en comparacin con otros tejidos en los cuales este gen permanece silencioso. (Segn L.H.T. van der Ploeg y R.A. Flavell, Cell 19:956, 1980; cot permiso de Cell Press.)

El patrn de expresin de diferentes miembros de la familia del gen de la globina se muestra en la figura 12-45. Se cree que cuando menos algunas de estas diferencias en la secuencia de transcripcin del gen de la globina reflejan cambios en los patrones de metilacin del DNA. Esta conclusin se basa en la observacin de que ciertos sitios especficos en el DNA de genes de transcripcin activos es mucho menos probable que sea metlada en comparacin con los mismos sitios en el DNA de un tejido en el cual el gen es inactivo. Por ejemplo, el menor nivel de metilacin en la regin situada por delante del gen de la globina y en el DNA del hgado fetal comparado con otros tejidos (fig. 12-44) se correlaciona fuertemente con el elevado nivel de transcripcin del gen en este tejido particular durante esta etapa del desarrollo (fig. 12-45). Debemos notar que no todos los genes estudiados muestran esta correlacin, lo que ndica que la metilacin del DNA quiz slo sea uno de un gran nmero de mecanismos mediante los cuales se puede inactivar a nivel de

transcripcin al DNA. En realidad, la metilacin del DNA no est implicada en el control de la expresin de gen en plantas o animales invertebrados. Cualquiera que sea la verdadera importancia de esta modificacin qumica en el material gentico de los seres humanos y de otros mamferos, constituye un estudio de alta prioridad en biologa molecular. La relacin entre mediacin y actividad del gen se puede estudiar en clulas tratadas con 5-azacitidina, un compuesto incorporado en el DNA en lugar de la citidina, pero que no puede metilarse. El tratamiento de clulas con 5-azacitidina puede activar la expresin de genes especficos cuyos productos se relacionan con el tipo de clula tratada. Por ejemplo, el tratamiento de leucocitos malignos en cultivo de clulas da como resultado la desmetilacin de los genes de la globina inactivados y su transcripcin subsecuente. Estos datos condujeron a ensayos clnicos de la 5-azacitidina como tratamiento para pacientes afectados de leucemia mieloide aguda, enfermedad caracterizada por la

Etapa embrionaria e
50

Etapa fetal

Etapa de adulto

1 2

FI<;iJIA 12-45. Transcripcin de diferentes miembros de la familia de genes de globina en diferentes etapas del desarrollo humano. Las molculas de hemoglobina se forman por la asociacin de dos globinas similares a con dos globinas similares f. Los diferentes miembros de cada una de estas dos subfamilias se sintetizan en diferentes etapas de desarrollo, segn se indica en la figura. La expresin de los genes de globina similares a se indica por lneas rojas, y la de los genes de globina similares / se indica por lneas azules.

Gestacin en semanas

Nacimiento

CAPITULO 12 Ncleo tie la clula y control de la expresin de genes

525

proliferacin descontrolada de las clulas sanguneas. La administracin de 5-azacitidina conduce a la activacin del gen, esto a su vez provoca que tos precursores de clulas sanguneas malignas dejen de proliferar y sufran la diferenciacin celular, que finalmente les causa la muerte. Estudios preliminares sugieren que el frmaco es capaz de provocar remisiones de la leucemia en algunos pacientes y normalizar el perfil de clulas sanguneas. Tambin se emplea la azacitidina en el tratamiento de pacientes con /3-talasemia, enfermedad de las clulas sanguneas caracterizada por sntesis insuficiente de globina/3, uno de los dos polipptidos presentes de ordinario en la hemoglobina de los adultos. La incorporacin de 5-azacitidina en el DNA de estos pacientes produjo la desmetilacin y activacin de sus genes de globina y, genes previamente activos en el feto (fig. 12-45). Como resultado, los eritrocitos se llenan de hemoglobina fetal (compuesta de dos cadenas de globina y y dos cadenas de globina a), capaz de satisfacer las necesidades de transporte de oxgeno del individuo. La mayor parte de las pruebas sugieren que la metilacin del DNA sirve ms bien para mantener un gen en estado inactivo que como mecanismo para iniciar la inactivacin. Por ejemplo, la inactivacin de los genes sobre uno de los cromosomas X de los mamferos hembra (pg. 500) ocurre antes que una onda de metilacin del DNA pueda convertir al DNA en estado ms permanentemente inactivado. La metilacin puede inhibir la transcripcin al interferir en la capacidad de los factores de transcripcin para reconocer los sitios donde se enlazan al DNA, o alterando la conformacin del DNA de tal modo que haga a las plantillas menos adecuadas para la RNA polimerasa. Uno de los ejemplos ms espectaculares de la importancia de la metilacin en la expresin de genes ocurre durante el fenmeno de impresin genmica. Impresin genmica. Hasta mediados del decenio de 1980 se haba asumido que el conjunto de cromosomas heredados del progenitor masculino era funcionalmente equivalente al conjunto correspondiente de cromosomas heredados del progenitor femenino. Pero, igual que muchas otras suposiciones aceptadas durante largo tiempo, se demostr que ese no era el caso. Ms bien, ciertos genes son activos o inactivos durante las etapas tempranas del desarrollo dependiendo nicamente de haber sido llevadas al cigoto por el espermatozoide o por el vulo. Por ejemplo, durante el desarrollo temprano del ratn, el gen que codifica una protena llamada factor de crecimiento parecido a insulina 2 (FCI2) slo es activo sobre el cromosoma transmitido por el progenitor masculino, en tanto que el gen que codifica al receptor de esta protena (una protena denominada FCI2R) slo es activo sobre el cromosoma transmitido por el progenitor femenino. Se dice que los genes de este tipo sern marcados segn el origen de sus progenitores. Los estudios sugieren la existencia de cuando menos 100 genes dentro del genoma del mamfero sometidos a este tipo de expresin diferencial. Las versiones inactivas y activas de los genes marcados difieren en su patrn de metilacin. En algunos casos, la versin poco metilada del gen es la activa, en tanto que en otros, el gen que contiene grupos metilo adicionales es el activo y la versin poco metilada es silenciosa a nivel de

transcripcin. Se cree que las diferencias entre alelos maternos y paternos en las clulas de un embrin se originan durante la formacin de los gametos en el progenitor. Debe haber algunos mecanismos mediante los cuales genes especficos (p. ej., FC2K) son sealados para la inactivacin durante la formacin del espermatozoide, en tanto que otros genes (p. ej., FCJ2) son marcados para inactivacin durante la formacin del vulo. Cul es el posible papel que la impresin genmica puede desempear en el desarrollo de un embrin? La respuesta probablemente sea: ninguno. En la pgina 418 se hizo notar que las bacterias usan la metilacin para proteger a la clula de virus invasores. La metilacin tambin puede desempear un papel para proteger clulas eucariotas de la infeccin viral. Por ejemplo, cuando se introducen genomas de retrovirus en ciertas clulas, se convierten en clulas fuertemente metiladas. Es posible que dichos genes metilados durante la formacin del gameto se siten en una regin del genoma reconocida como DNA extrao por los mecanismos de defensa del cuerpo. Por lo tanto, la metilacin de ciertos genes durante la formacin del gameto puede tener su origen en un "accidente". En realidad, ciertos genes marcados en ratones (p. ej., FCI2K) no estn marcados en el hombre, lo que sugiere que no hay una razn bsica para que estos genes particulares deban expresarse diferencialmente en el embrin.
Estructura y transcripcin de la cromatina

Segn la explicacin en la pgina 495, el DNA de un ncleo eucariota no se presenta en forma descubierta, sino que est rodeado por complejos de histona para formar nucleosomas. El descubrimiento de los nucleosomas en el decenio de 1970 plante una pregunta importante que todava no se ha resuelto satisfactoriamente: de qu manera las protenas no de histona (como los factores de transcripcin y las RNA polimerasas) pueden interactuar con el DNA estrechamente relacionado con ncleos centrales de histona? En realidad, mltiples pruebas sugieren que la incorporacin del DNA en los nucleosomas inhibe la transcripcin del DNA, al menos cuando se practica el ensaye in vitro. Sin embargo, al mismo tiempo es evidente que se puede transcribir el DNA incluso cuando forma complejos con histona. Los intentos para explicar esta aparente contradiccin slo han tenido xito limitado. El siguiente es un breve resumen del estado actual de nuestro conocimiento. La posicin precisa de los nucleosomas dentro de la regin reguladora de un gen casi siempre desempea un papel clave para permitir que las protenas que se enlazan a DNA estimulen la transcripcin de dicho gen. En la pgina 496 se hizo notar que los nucleosomas no estn presentes al azar a lo largo del DNA, sino que a menudo se sitan en sitios particulares. Como resultado, se cree que ciertas secuencias clave reguladoras de DNA residen en sitios fijos en relacin con las partculas centrales del nucleosoma de la vecindad. Una secuencia particular de DNA, como un amplificador, puede residir al parecer entre dos partculas centrales del nucleosoma y por lo tanto permanece accesible para el enlace de un factor de transcripcin (fig. 12-46, a). Aun si un segmento de DNA rodea al ncleo de histona, se puede predecir que algunas partes de dichos segmen-

526

CAPITULO 12 Ncleo de la clula y control de a expresin Nucleosoma

Nucleosoma

Factor de transcripcin

Amplificador

Promotor Nucleosoma

FIGURA 12-46. Papel del posicionamiento del nucleosoma para facilitar la transcripcin, a) En este caso, el nucleosoma se coloca en una posicin de modo que los elementos reguladores claves del gen permanecen fuera de la partcula central y disponibles para enlazarse a los factores de transcripcin, b) En este caso, los elementos reguladores se localizan en el DNA que rodea las histonas centrales. Gracias a estas histonas, los elementos reguladores clave del DNA entran en estrecho contacto y pueden unirse a un factor de transcripcin.

tos residen sobre la superficie interior de a doble hlice que enfrentan las molculas de hstona, en tanto que otras partes de ese segmento posiblemente residan en la superficie exterior del doblete que enfrenta la solucin que lo rodea (fig. 12-11). Las secuencias de DNA que se alejan del ncleo de histona deben ser accesibles para la interaccin con factores de transcripcin. En realidad, el enrollamiento de casi 150 pares de bases de DNA alrededor del ncleo de histona es un medio para llevar en estrecha proximidad a dos elementos de control especficos sobre el DNA que normalmente se encuentran separados, y gracias a esta proximidad pueden interactuar de manera cooperativa con uno o ms factores de transcripcin (fig. 12-46, f?). Por lo tanto, en algunos casos los nucleosomas pueden realmente desempear un papel activo para promover la interaccin entre el DNA y una protena reguladora. Dadas estas diferentes posibilidades, se puede pensar que la posicin del nucleosoma desempea otro papel para las secuencias del DNA adems de codificar la informacin gentica y de enlazar factores de transcripcin. As como la secuencia primaria de una protena contiene la informacin para su propio plegamiento,

la secuencia primaria del DNA contiene al parecer la informacin para la posicin de ciertos nucleosomas clave. Lo mismo que otras partes de la clula, la cromatina no es una estructura esttica sino ms bien activa, un complejo dinmico de protenas y cidos nucleicos capaces de ser "remodelados". Cuando una protena reguladora se enlaza en un sitio especfico de la cromatina del DNA; sea entre los nucleosomas o en un nucleosoma, es probable que induzca cambios secundarios en la estructura de la cromatina para hacer ms o menos accesibles otros sitios a la unin de protenas subsecuentes. Los datos indican que la influencia de una protena reguladora de gen enlazada a un sitio sobre el DNA se puede sentir a una distancia considerablemente alejada. Por ejemplo, el enlace de un factor de transcripcin especfico a una secuencia amplificadora localizada lejos de un gen puede facilitar el ensamblado de un complejo de preinicio en el cuadro TATA localizado muy cerca del gen. Una vez ensamblado, el complejo de preinicio puede servir como blanco para los factores de transcripcin que se enlazan a otra secuencia reguladora. Como resultado de acontecimientos sucesivos de este tipo, una regin particular de la cromatina se convierte de regin inactiva a regin activa a nivel de transcripcin. La cromatina activa a nivel de transcripcin posee ciertas propiedades distintivas que la distinguen de la cromatina inactiva. Por ejemplo, la cromatina activa es ms accesible a los agentes externos, incluyendo enzimas que digieren DNA, como la DNasa I, capaz de desdoblar el DNA en ciertos sitios. Estos sitios hipersensibles a DNasa I, como se les denomina, tpicamente residen en las regiones reguladoras de genes que son activamente transcritas, pero estn ausentes de estas mismas regiones de genes que son silenciosas a nivel de transcripcin. Se asume que los sitios hipersensibles son regiones de DNA donde los nucleosomas fueron desplazados, y por lo tanto, estn disponibles para interactuar con protenas reguladoras de genes (fig. 12-47). En general, se concuerda que el inicio de la transcripcin se acompaa de cambios estructurales en la cromatina que aloja una secuencia reguladora de un gen, pero hay menos concordancia acerca de los cambios de la cromatina dentro del propio gen. En ciertos casos, donde un gen se transcribe muy activamente, como en el caso de los genes de RNAr durante la oognesis de los anfibios, el DNA aparece desprovisto de nucleosomas (como en la figura 11-11). Sin embargo, la mayor parte de los genes cuya transcripcin se ha examinado al microscopio electrnico parece retener sus nucleosomas (fig. 12-48) a pesar del desplazamiento de molculas de RNA polimerasa a lo largo del trayecto del DNA. La RNA polimerasa es una molcula enorme, regularmente el doble de la masa de un nucleosoma entero, y se enlaza a unos 50 pares de bases de DNA, parte de los cuales tienen que ser desenrollados. Parece poco probable que esta actividad pudiera ocurrir sobre una plantilla de DNA firmemente enlazada a la superficie de una partcula central intacta del nucleosoma. Para continuar con la expectativa, considerables datos sugieren que los nucleosomas situados en una regin de transcripcin sufren modificaciones que hacen ms accesible el DNA tanto a molculas de polimerasa como a factores de transcripcin. Esto puede ocurrir por la destruccin del octrnero histona conforme se desplaza

CAPITULO 12 Nucleasa micrococal Mspl Nucleosomas

527

DNAsa I

Mspl DNAsa Gen de la globina /

-300

-250

-200

-150

-100

-50

FIGURA 12-47. Se supone que sitios hipersensibles a nucleasa se localizan en regiones ms accesibles a enzimas. La cromatina de la regin dei gen de la globina fj del pollo presenta un sitio hipersensible localizado por delante (de -70 a -270) de la regin codificante, susceptible a ser digerida por varias nucleasas. Aunque el sitio aqu mostrado est desprovisto de nucleosomas, los datos sugieren que algunos sitios hipersensibles pueden asociarse ms laxamente a los nucleosomas. (Segn B. Lewin, Genes V, p. 829, Oxford University Press, 1994.)

la polimerasa y por la reconstitucin del nucleosoma luego que ha pasado la enzima {fig. 12-49). Otra manera de reestructurar el nucleosoma es aadiendo grupos acetlo a los residuos usina del ncleo central de las histonas en regiones de cromatina activamente transcrita. Puesto que las cadenas laterales de Usina acetilada ya no poseen carga positiva, podra esperarse que perdieran su "agarre" sobre el DNA adyacente. Uno de los ejemplos ms espectaculares de la correlacin entre actividad de transcripcin y acetilacin del ncleo central de la histona se puede observar comparando el cromosoma X activo de clulas femeninas, que contiene histonas acetiladas, con los cromosomas X inactivos, cuyas histonas prcticamente se encuentran libres de esta modificacin qumica (fig. 12-50).
Regulacin del alargamiento de la transcripcin

RNA polimerasa

RNA naciente

Dmero H2A-H2B

Aunque el inicio de la transcripcin es el sitio primario de la regulacin de la expresin de genes, tambin se han descubierto mecanismos que controlan el alargamiento de la transcripcin. El movimiento de una molcula de RNA polimerasa a lo largo del DNA no ocurre con velocidad uniforme;

, VLPPJP

FIGURA 12-48. Demostracin de la transcripcin del DNA en una regin que contiene nucleosomas. Este minicromosoma SV40 contiene nucleosomas, que se observan como esferas de color oscuro, y tambin una cadena de RNA naciente (flecha) indicando que el DNA es transcrito por una RNA polimerasa. (Cortesa de Fierre Chambn.)

FIGURA 12-49. Modelo para la transcripcin a travs de las partculas centrales del nucleosoma. En el paso 1, la RNA polimerasa desestabiliza al nucleosoma formando un complejo que desplaza a mitad de las histonas (los dos dmeros H2A-H2B) que constituyen la partcula central. En el paso 2, la otra mitad de la histona central (etrmero H3-H4) se desplaza con las histonas que son transferidas sobre el DNA libre que deja la polimerasa. En el paso 3, los dmeros H2A-H2B se vuelvan a juntar al DNA para formar una partcula central completa del nucleosoma. (Segn C.D. Adams i/ J.L Workman, Cell 72:307, 1993; con permiso de Cell Press.)

528

CAPITULO 12 Ncleo de la clula y control de la expresin de genes

FIGURA 12-50. Demostracin experimental de una correlacin entre actividad de transcripcin y acetilacin de las histonas. Este cromosoma de la metafase esparcido fue doblemente marcado con anticuerpos fluorescentes para: 1) histona acetilada H4, que presenta fluorescencia verde, y 2) bromodesoxiuridina (BrdLJ), que muestra fluorescencia roja. Como se estudia en el siguiente captulo, la BrdU es un anlogo de la timidina que se incorpora al DNA durante la duplicacin. El cromosoma X inactivado se duplica ms tarde en la fase 5 del ciclo celular, de modo que se puede marcar selectivamente con BrdU, como se hizo aqu. Es evidente que todos los cromosomas, excepto el X inactivado, se tien brillantemente con el anticuerpo contra histona acetilada. (Segn P. Jeppesen y B.M. Turner, cover of Cell vol. 74, no. 2, 1993, cortesa de Peter eppesen; con permiso de Cell Press.)

hay ciertas secuencias que reducen la velocidad de la polimerasa e incluso la detienen durante breves periodos. Se han identificado factores de transcripcin que favorecen el paso de la enzima sobre estas "piedras del camino" o, alternativamente, la liberacin prematura de la polimerasa de la plantilla de DNA (y por lo tanto la conclusin del ensamblado del RNA naciente). El factor de alargamiento TFIIS (fig. 11-20) parece promover el paso de la polimerasa sobre dichos sitios desdoblando los nucletidos desde el extremo 3' del transcrito naciente, y provocando objetivamente el movimiento de la polimerasa varios pasos hacia atrs a lo largo de la plantilla y luego otra vez hacia adelante. Control a nivel de procesamiento A travs de este libro hemos visto que las protenas con frecuencia son codificadas por miembros de una familia de multigenes. Se supone que los diferentes genes que componen una familia de multigenes se originaron durante la evolucin de un solo gen ancestral que sufri duplicaciones repetidas. Con el tiempo, los duplicados sufrieron divergencia de secuencias, generando una familia de genes que codifican protenas homologas con funciones relacionadas. La formacin de una familia de multigenes es un "mecanismo" evolutivo que genera gran diversidad de protenas, las cuales tambin puede ser generadas dentro de un organismo individual mediante un proceso denominado empalme alternativo, que regula la expresin de un gen a nivel de procesamiento del RNA.

El empalme alternativo es un mecanismo muy difundido mediante el cual un solo gen puede codificar dos o ms protenas relacionadas. Como se coment en el captulo previo, la mayor parte de los genes (y por lo tanto sus transcritos primarios) contienen numerosos intrones y exones. En muchos casos, hay ms de una va para procesar un transcrito primario particular. En el caso ms sencillo, un intrn especfico puede ser empalmado fuera del transcrito o retenido como parte del RNAm final. Un ejemplo de este tipo de empalme alternativo se observa durante la sntesis de la fibronectina, una protena observada en el plasma sanguneo y en la matriz extracelular (pg. 243). La fibronectina producida por los fibroblastos y retenida en la matriz contiene dos pptidos "extra" en comparacin con la versin de la protena producida por las clulas hepticas y secretada en el plasma (g. 12-51). Los pptidos extra son codificados por porciones del precursor RNAm retenidas durante el procesamiento en el fibroblasto pero eliminadas durante el procesamiento en la celdilla heptica. Hay un gran nmero de otros tipos de patrones de empalme alternativo. En algunos casos, un transcrito primario puede contener secuencias terminales alternas 5' o 3'. Por ejemplo/ las clulas productoras de anticuerpos pasan por una etapa temprana de diferenciacin en la cual el anticuerpo producido se encuentra integrado a su membrana plasmtica. En etapa tarda, el linfocito diferenciado secreta a la sangre un anticuerpo con el mismo sitio de combinacin idntico. Estas dos formas del anticuerpo, el originado en la sangre y las formas enlazadas a la membrana, tienen aminocidos diferentes en un extremo del polipptido segn cul de los dos exones 3' alternativos fue incluido en el mensaje durante el procesamiento del RNA (fig. 12-52). El empalme alternativo puede ser muy complejo, lo que permite que las clulas "elijan" entre una gran variedad de diferentes combinaciones de posibles exones. El mecanismo de la clula por el cual selecciona exones alternos

Transcrito primario 5'

EIIIB V

EI1IA

Fibroblasto RNAm RNAm heptico

FIGURA 12-51. Empalme alternativo de la fibronectina RNAm. El gen consta de algunos exones mostrados en el dibujo de arriba (los intrones mostrados en negro no se dibujaron a escala). Dos de estos exones codifican partes del polipptido denominado EIIIA y EII1B, incluidos en la protena producida por fibroblastos pero excluidos de la protena producida en el hgado. La diferencia se debe al empalme alternativo; aquellas partes del pre-RNAm que codifican estos dos exones estn seccionados del transcrito en las clulas hepticas. Los sitios de los exones perdidos se indican por las flechas en el RNAm del hgado.

CAPITULO 12 Ncleo de a clula y control de la expresin de genes

529

Exones alternativos
a b e
d e f ^^~^\ DNA

;3E^^_
. " --*-

6 f

^____^
-rr^fxl'

abc4-d_e f

Transcrito primario RNAm

RNAm para la versin del anticuerpo de origen sanguneo

c * d

Transcrito primario

RNAm RNAm para fa versin del anticuerpo de origen en la membrana FIGURA 12-52. Empalme alternativo de genes que codifican anticuerpos. Anticuerpos con el mismo sitio para combinarse con antgenos pueden presentarse en dos formas: como protenas solubles de origen sanguneo o como protenas enlazadas a la membrana plasmtica de un linfocito B. La secuencia de aminocidos de las dos formas del anticuerpo difiere en un extremo de la molcula. Estas diferencias ocurren debido a que las dos formas de polipptdos se sintetizan en diferentes RNAm derivados del mismo transcrito primario por procesamiento alternativo. El exn marcado como f se incorpora al RNAm que codifica la versin de origen sanguneo del anticuerpo, en tanto que un exn alterno (g) se incorpora al RNAm para la versin enlazada a la membrana.

una fraccin cuantificable de los RNAnh que normalmente sintetizan las clulas es desdoblada por completo dentro del ncleo y por lo tanto no da lugar a RNAm maduro. Los investigadores nunca fueron del todo claros acerca de este asunto porque es difcil determinar si un transcrito especfico es degradado por completo o slo parcialmente. Sin embargo, estudios recientes sugieren que las clulas pueden ser capaces de controlar que un transcrito primario sea o no procesado. Este mecanismo regulador se puede ilustrar por el ejemplo de una protena llamada U1A, una de las protenas que se enlaza a l RNAnp durante el ensamblado del RNA (pg. 461). Cuando las clulas se manipulan genticamente para que sobreexpresen la protena U1A, la cantidad de RNAm que codifica esta protena disminuye. Un anlisis adicional indica que la protena se enlaza a cieras secuencias en pre-RNAm especfico que contiene el mensaje U1A e inhibe la poliadenilacin del pre-RNAm. Sin el apndice poli(A), el mensaje se descompone con rapidez. Por lo tanto, la protena U1A al parecer regula la produccin de su propio RNAm enlazndose a su precursor RNAm y alterando el curso de las modificaciones postranscripcin.

Control a nivel de la traduccin

El control a nivel de la traduccin incluye una variedad de mecanismos reguladores que afectan la traduccin del RNAm previamente transportado desde el ncleo del citoplasma. Los temas considerados bajo este mecanismo regulador general incluyen: locazacin del RNAm en ciertos sitios dentro de la clula; capacidad de una clula para controlar si un RNAm es traducido o no y, en caso afirmativo, con qu frecuencia; y longevidad del RNAm, propiedad que determina la duracin de la traduccin del mensaje. Los mecanismos de control a nivel de traduccin generalmente operan a travs de interacciones entre RNAm especficos y varias protenas presentes en el citoplasma. En la pgina 451, se hizo notar que los RNAm contienen segmentos no codificantes, denominados regiones no traducidas (RNT), en ambos extremos 5' y 3'. Las RNT 5' se extienden desde el casquete de metilguanosina al inicio del mensaje hasta el codn de inicio AUG, en tanto que las RNT 3' se extienden desde el codn de terminacin en el extremo de la regin codificante al extremo del apndice poli(A) fijo a casi todo el RNAm eucariota (fig. 11-21). Durante muchos aos las secciones no traducidas del mensaje fueron ignoradas ampliamente, pero en la actualidad hay datos de que las RNT son los sitios donde !a clula enfoca la mayor parte de sus esfuerzos para controlar a traduccin.
Localizacin de los RNAm dentro del citoplasma

para incluir o excindir todava no est claro. La eleccin depende principalmente de que un sitio de empalme especfico 3' o 5' sea reconocido por el mecanismo de empalmado como sitio de desdoblamiento (pg. 459). Se han identificado varias protenas que parecen regular la eleccin del sitio de empalme, y se est investigando su mecanismo de accin. Este mecanismo desempea claramente un papel importante en la regulacin de la expresin gentica. En la mayor parte de los casos, las protenas producidas por determinado gen mediante empalme alternativo son idnticas a lo largo de la mayor parte de su trayecto, pero difieren en regiones claves que pueden afectar propiedades tan importantes como su localizacin en la clula, el tipo de ligandos que pueden enlazar, o la cintica de su actividad cataltica. Algunos factores de transcripcin se producen en genes que pueden ser ensamblados alternativamente; la produccin de una u otra variante de protena reguladora puede determinar la va de diferenciacin adoptada por las clulas. En la mosca de la fruta, por ejemplo, la va de desarrollo que conduce al embrin a convertirse en masculino o femenino es determinada por el ensamblado alternativo de transcritos de ciertos genes importantes desde el punto de vista del desarrollo. Aunque el empalmado alternativo es la forma mejor estudiada de control a nivel de procesamiento, no es el nico tipo. Estudios iniciales sobre el RNA nuclear sugirieron que

La informacin requerida para iniciar la formacin de un embrin en un vulo animal fertilizado se establece dentro del oocito durante la oognesis. Por ejemplo, en la mosca de la fruta, un extremo del vulo da lugar a la cabeza y otras estructuras anteriores, en tanto que el extremo opuesto del vulo genera la parte posterior del embrin y tambin el tejido gonadal (fig. 12-53). El desarrollo del eje anteroposterior del embrin y posteriormente del adulto est sombrea-

530

CAPITULO 12 Ncleo de la cluia y control de la expresin de genes

A5A4A3

T3

TI

u oskar. Cuando se transcribe el gen extrao durante la oognesis, el RNAm se localiza en el sitio determinado por la RNT 3'. Aunque el mecanismo de localizacn del RNAm todava no est bien comprendido, se cree que es mediado por protenas que reconocen secuencias de localizacin en el RNAm. Tanto microtbulos como filamentos de actina han sido implicados en el control de la organizacin espacial de los RNAm en el citoplasma. Por ejemplo, en el vulo de la mosca de la fruta, el transporte del RNAm bicode se interrumpe mediante agentes que provocan la despolimerizacin de los microtbulos. En los fibroblastos humanos, casi 75% del RNAm poli(A) del citoplasma se puede localizar en los filamentos de actina o muy cerca de ellos. Como se ilustra en la figura 12-54, muchas de las molculas individuales de RNAm se encuentran en la interseccin entre filamentos del armazn citoesqueltico.
Control de la traduccin de los RNAm

Los RNAm almacenados en el huevo no fertilizado son plantillas para protenas sintetizadas durante las etapas tempranas del desarrollo y, por lo tanto, no se utilizan para la sntesis de protenas en el propio huevo. Los RNA mensajeros almacenados en el huevo para uso posterior con frecuencia se refieren como RNAm "enmascarados", debido a que se encuentran inactivos por asociacin con protenas inhibidoras. Consideremos el caso de! huevo no fertilizado

(b).

(c)

FIGURA 12-53. Localizacin del RNAm en el citoplasma del huevo de Drosophila. a) Dibujo esquemtico que muestra tres etapas en la vida de una mosca de la fruta: huevo, larva y adulto. Se indican los segmentos del trax y el abdomen, b) Localizacin del RNAm bicoide en el polo anterior de una primera etapa de desdoblamiento del embrin de Drosophila mediante hibridacin in situ. c) Localizacin del RNAm oskar en el polo posterior de una etapa comparable a la mostrada en b. Ambos RNA localizados desempean un papel importante en el desarrollo del eje anteroposterior de la mosca de la fruta. (b: Cortesa de Daniel Sf. Johnson; c: cortesa de Antoine Guichet y Anne Ephrussi.)

do hacia adelante por la locaizacin del RNAm especfico a lo largo de este mismo eje en el vulo. Por ejemplo, el RNAm transcrito del gen bicoide se localiza en particular en el extremo anterior del vulo, en tanto que el RNAr transcrito del gen oskar se halla en el extremo opuesto (fig. 12-53, b,c). La protena codificada por el RNAm bicoide desempea un papel crtico en el desarrollo de la cabeza y el trax, en tanto que la protena codificada por el RNAm oskar es necesario para la formacin del abdomen y las clulas germinales. La informacin que gobierna la localizacin citoplsmica de un RNAm se localiza en la RNT 3'. Esto se puede demostrar utilizando la mosca de la fruta portadora de un gen extrao cuya regin codificadora est acoplada a una secuencia de DNA que codifica la RNT 3' del RNArn bicoide

FIGURA 12-54. Localizacin del RNAm para filamentos de actina en el citoplasma. Los puntos negros en esta micrografa electrnica son partculas de oro en un sitio de interseccin entre filamentos de actina donde se localiza una molcula de RNAm po{A). Para obtener esta micrografa se extrajeron fibroblastos humanos con el detergente no inico Tritn X-100 y luego se incubaron con una sonda oligo dT unida a biotina. Las molculas oligo dT se enlazan especficamente a los apndices pol^A) del RNAm y luego se localizan al incubar la preparacin con un anticuerpo de conejo contra biotina. Los sitios del RNArn citoplsmico se vuelven visibles incubando la preparacin con un anticuerpo de cabra marcado con otro que se enlaza al anticuerpo de conejo en el complejo anticuerpo-biotina-oligo dT. (Segn Gary ]. Bassell y cois. }. Cell Biol. 126:869, 1994; con permiso de Rockefeller University Press.)

CAPITULO 12 Ncleo de la clula y control de la expresin de genes

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del erizo de mar. Cuando se incuba una suspensin de estos huevos con aminocidos marcados con istopos radiactivos, muy poca radiactividad se incorpora a la protena (fig. 12-55, a). Sin embargo, si se fertiliza esta misma preparacin de huevos aadiendo espermatozoides, la incorporacin de aminocidos marcados es cuantifcable, y la tasa de incorporacin se eleva lentamente en las siguientes horas (fig. 12-55, a) y a continuacin la concentracin decrece confor-

1400
"o 1200
1000

ro 600
400

200

-20

8 12 16 20 24 28 32 40 44 48 52 56 60

(a)

Tiempo (minutos) despus de la adicin del espermatozoide

Testigo

Tratado con actinomicina

10

15

20

25

(b)

Moras despus de la fertilizacin

FIGURA 12-55. Demostracin experimental de la activacin de RNAm "enmascarado" luego de la fertilizacin de los huevos del erizo de mar. a) Incorporacin acumulativa de 14C-leucina por huevos fertilizados y no fertilizados del erizo de mar. El tiempo cero marca e punto de fertilizacin, que va seguido despus de un breve retardo por una marcada elevacin de la tasa de sntesis de protena, b) Tasas de incorporacin de 14C-valina en huevos fertilizados del erizo de mar en presencia o ausencia de actinomicina D, un inhibidor de la sntesis de RNA. El incremento inicial de la sntesis de protenas que sigue a la fertilizacin (a) no se inhibe por la actinomicina D. Estos resultados indican que la sntesis de protenas en el periodo subsecuente a la fertilizacin no depende de plantillas RNAm recin sintetizadas, sino ms bien tiene lugar sobre RNAm presente en el huevo en el momento de la fertilizacin. En contraste, la segunda elevacin de la sntesis de protenas que se inicia casi 10 horas despus de la fertilizacin requiere plantillas nuevas de RNAm porque es inhibida por el frmaco, (a: Segn D. Epel, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 57:902, 1967; b: segn P.R. Gross y cois. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 51:409, 2964.)

me el embrin se desarrolla para formar una blstula de unos miles de clulas. Puesto que el cambio del estado inactivo al activo ocurre con tal rapidez, sera difcil entender de qu manera la sntesis de protenas despus de la fertilizacin depende de la sntesis acompaante de nuevos RNAm. Como se puede demostrar de varias maneras, el RNA mensajero que se traduce luego de la fertilizacin est presente en la mayor parte del huevo antes de su contacto con el espermatozoide. Por ejemplo, si los huevos del erizo de mar se fertilizan y crecen en presencia de actinomicina D (potente inhibidor de la sntesis de RNA), despus de la fertilizacin se activa la sntesis de protenas de manera muy semejante a como ocurre en los cultivos testigo (fig. 12-55, b). Puesto que en presencia del frmaco no pueden producirse nuevos RNA, las protenas deben sintetizarse sobre plantillas preformadas de RNAm. Los estudios han descubierto varios mecanismos empleados por las clulas para regular la tasa de traduccin del RNAm en respuesta a las cambiantes necesidades celulares bajo diferentes condiciones ambientales. Se puede considerar que algunos de estos mecanismos actanglobalmente, ya que afectan la traduccin de todos los mensajes. Por ejemplo, la actividad del factor de inicio FIe2 (pag. 473) disminuye en forma aguda por fosforilacin. Cuando una clula es sometida a ciertos estmulos, como la infeccin viral o el choque por calor, se activa una cinasa particular que fosforila al FIe2, lo que a su vez disminuye la tasa de inicio de la sntesis de nuevos polipptidos. Otros mecanismos actan para alterar la tasa de traduccin del RNAm especfico. Uno de los casos mejor estudiados de este tipo implica al RNAm que codifica la protena ferritina. La ferritina es una protena que funciona para secuestrar tomos de hierro en el citoplasma de las clulas, protegiendo a la clula contra los efectos txicos del metal libre. La traduccin de la ferritina de RNAm es regulada por un represor especfico cuya actividad depende de la concentracin de hierro no enlazado en las clulas. En ausencia de hierro, el represor se enlaza a una secuencia especfica en la RNT 5' del mensaje denominada elemento de respuesta a hierro (ERH), que inhibe su traduccin (fig. 12-56). Cuando se encuentra hierro disponible, el represor se convierte a una forma que pierde su afinidad por el elemento de respuesta a hierro. La disociacin del represor de la ferritina RNAm permite que el mensaje tenga acceso al mecanismo de traduccin y favorece la sntesis subsecuente de la protena que se enlaza a hierro. En los ltimos 10 aos, el RNA se ha reconocido cada vez ms como partcula capaz de efectuar funciones especficas distintas de codificar secuencias de aminocidos. Una de las adiciones ms recientes a la creciente lista de actividades del RNA surgi a fines de 1993 en estudios efectuados sobre el nematodo Caenorhabditis elegans. Lin-14 es un gen que codifica una protena que regula acontecimientos durante el desarrollo temprano de este gusano. Se alcanza un punto durante el desarrollo cuando la sntesis de protena cesa aunque el lin-14 de RNAm permanezca en la clula. Se observ que debe haber ciertas secuencias en la RNT 3' del lin-14 de RNAm si se ha de inhibir la traduccin del mensaje. Se supone que la inhibicin de la traduccin es mediada por una protena enlazada a la secuencia regula-

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CAPITULO 12 Ncleo de la clula y control de la expresin de genes

Elementos de / respuesta / a hierro 1 (REH)

S
i i .

^^b,

1
4~ Protena de enlace a REH (aconitasa (estado activo)

1
Hierro (traduccin inhibida) + Hierro (traduccin /estimulada)

Protena de enlace a (estado inactivo)

Hierra

Regin codificante de protena

AAAA 3'

Ferritina RNAm

AUG

nr,llli\. Control de la traduccin de la ferritina RNAm. Cuando la concentracin de hierro es baja, una protena enlazada a hierro, denominada aconitasa, se enlaza a una secuencia especfica en la regin no traducida 5' de la ferritina RNArn conocida como elemento de respuesta al hierro (ERH), que se encuentra plegado en forma de gancho para el pelo. Cuando se dispone de hierro, se enlaza al represor, cambiando su conformacin y provocando la disociacin del ERH, lo que permite la traduccin del RNAm para formar ferritina.

dora en la RNT 3', pero los estudios indican que el represor no es una protena, sino una molcula de RNA muy pequea, producto del gen lin-4. La RNT 3' del RNAm lin-14 contiene un tramo de siete secuencias repetitivas homologas del RNA transcrito a partir del gen lin-4. Se ha propuesto que el enlace del pequeo RNA regulador al RNAm impide la traduccin del mensaje. Es posible que hasta siete RNA lin-4 puedan enlazarse simultneamente a las RNT 3' del RNAm (fig. 12-57). Tal vez e grado de represin de la traduccin sea regulado por el nmero de RNA lin-4 enlazado al RNAm. Esta hiptesis es apoyada por el dato de que la traduccin de los RNAm que slo contienen tres de las secuencias repetidas (formadas a partir de genes en los cuales se han borrado las otras cuatro secuencias) se inhibe a un menor grado que la traduccin de los RNAm intactos. E! descubrimiento de un RNA que regula la traduccin plantea la misma pregunta establecida despus del descubrimiento de un RNA capaz de autoempalmado (pg. 478): Es esta una posibilidad rara o la punta de un iceberg? Si los descubrimientos pasados en la bioqumica del RNA son indicadores precisos, sera de esperar que la sntesis de muchas protenas diferentes se encuentre bajo control de RNA reguladores homlogos a las porciones de las regiones no codificantes del correspondiente RNAm.

Control de la estabilidad del RNAm Cuanto ms largo sea el RNAm presente en una clula, podr servir en ms ocasiones como plantilla para el ensamblado de un polipptido. Por lo tanto, s una clula tiene que controlar la expresin del gen, es tan importante regular la superviviencia del RNAm como regular la sntesis de dicho RNAm en primer lugar. A diferencia de los RNAm procariotas que inician su descomposicin en su extremo 5' incluso antes de concluir su extremo 3', la mayor parte de los RNAm eucariotas tienen un periodo de vida relativamente largo. Sin embargo, el periodo de vida de las RNAm eucariotas vara mucho. Por ejemplo, el RNAm c-fos sintetizado en muchas clulas como respuesta a cambios en las condiciones externas, se descompone con rapidez dentro de la clula (vida media de 10 a 30 minutos). En contraste, el RNAm que codifica la produccin de protenas dominantes de una clula, como la hemoglobina en los precursores de eritrocitos o la ovalbmina en una clula del oviducto de la gallina, tpicamente tienen vida media mayor de 24 horas. Igual que con la localizacin del RNAm o la tasa de inicio de la traduccin del RNAm, la clula puede reconocer RNAm especficos y aplicarles tratamiento diferencial. En un experimento inicial se demostr que los RNA que carecen de apndices poli( A) se degradan rpidamente luego de inyectarlos dentro de clulas extraas, en tanto que los mismos RNAm que poseen dichos apndices fueron relativamente estables. Esta fue la primera demostracin para sugerir que la longevidad de un RNAm poda relacionarse con la longitud de su apndice poli(A). Un RNAm tpico que abandona el ncleo contiene un apndice poli(A) de casi 200 residuos de adenosina. El apndice poli(A) no es un RNA desnudo, sino que se encuentra enlazado a una protena especfica, la prolena de enlace poli(A) (PEPA). Cada molcula PEPA se enlaza a unos 30 residuos de adenosina. Se cree que la PEPA tiene una funcin doble. Por un lado, la protena protege al apndice contra la actividad nucleasa general, pero por otra parte parece incrementar la sensibilidad del apndice a una ribonucleasa poli(A) especfica. En la figura 12-58 se muestra un modelo de la va para la degradacin de un RNAm. Cuando un RNAm permanece en el citoplasma, su apndice poli(A) tiende a disminuir gradualmente de longitud a medida que es reducido por la nucleasa poli(A) (paso 2, fig. 12-58). No se observa efecto alguno sobre la estabilidad del RNAm hasta que el apndice se reduce unos 30 residuos, que quiz sea una longitud demasiado pequea para retener una molcula PEPA enlazada (paso 3, fig. 12-58). Una vez que la longitud del apndice se acorta, el RNAm parece desdoblarse con rapidez. Es interesante que la descomposicin del RNAm comience en el extremo 5' luego de eliminar el poli(A) en el extremo 3' del mensaje. De alguna manera, la presencia del apndice poli(A} en el extremo 3' del mensaje parece mantener el casquete en el extremo opuesto de la molcula. Una vez eliminado el extremo 3' (paso 4, fig. 12-58), el mensaje pierde su casquete (paso 5) y se descompone a partir del extremo 5' sin casquete hacia el extremo 3' (paso 6). La longevidad del RNAm no depende slo de la longitud del apndice poli(A), puesto que diversos RNAm con vida media muy diferente empiezan con un apndice de

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533

Regin codificante PolifA}

<= 3

(a)
RNAm c.
5

1 2

4 5

'6

A U A A CC UC C

fv
5

Lin-14 CCUCA UGCUCUCAGGMC Lin-4 UGAGUGUGA GAGUCCUUG

oJ

A A G A

o.
3

r.
5

24nt
U

=.

ACAUUCA CUCAGGAAU 'JGUGAGU GAGUCCUUG

3' C 5.

CUCGCAUUU CUCAGGGAAC .GAGUGUGAA GAGUCCCUUG

K. GA T 5 UA CUCAU CUCAGGAAU GAGUG GAGUCCUUG 3' U A C 5,

RNAm
5'

0 3'

r-

Lin-14 UUCUACCUCAGGGAAC Lin-4 GAGGUG GAGUCCCUUG

3. U A A '

UU A

AG A G

,. 5

ACUCACA CUCAGGGAC UGAGUGU GAGUCCCUG

G
A
A

C'A AA

7
3

A
C

U 5'

(b)

C CU

FIGURA 12-57. Control de la traduccin mediada por un RNA regulador, a) La RNT 3' del RNAm lin-14 del nematodo tiene siete regiones distintas capaces de enlazarse al RNA iri-4. La regin codificante de la protena por delante de la RNT 3' se indica por los cuadros interrumpidos. b) Esquema hipottico de pares de bases situados entre dos RNA en cada uno de los siete sitios reguladores. (Reimpreso con permiso de M. Wickens y K. Takayama, Nature 367:17, 1994; copyright 1994 Macmillan Mcigazincs Limited.)

m 7 Gppp

AUG

UAA

AAAAAAAAAAAA75 Nucleasa poli(A)

m7Gppp

AUG

UAA

rn7Gppp

AUG

m7Gppp

AUG

UAA

longitud similar. Una vez ms, las diferencias en la secuencia de nucletidos de las RNT 3' han demostrado que participan en la tasa de acortamiento causada por el apndice poli(A). Algunos RNAm contienen secuencias "desestabilizadoras" que al parecer incrementan la susceptibilidad del apndice poIi(A) al ataque de la iiucleasa poli(A). Adems, los RNA mensajeros con vida media especialmente breve parecen estar sujetos al ataque directo de las endonucleasas que reconocen y desdoblan la molcula en secuencias especficas dentro de la regin no traducida 3'. Antes de dejar el tema de los controles a nivel de traduccin y el asunto sobre el control de la expresin de genes en general, se puede hacer notar que en los ltimos aos se ha descubierto un gran nmero de sorprendentes fenmenos genticos nuevos. Hasta ahora, estos procesos slo se han observado en unos cuantos sistemas, y por lo tanto su aplicacin general an es incierta. Entre estos procesos recin descubiertos se encuentran: Cambio del marco de traduccin, en el cual el ribosoma cambia su marco de lectura en algn punto durante su viaje a lo largo del RNAm desplazndose un nucletido hacia atrs {1) o hacia adelante (+1). Los cambios del, marco pueden ser por deslizamiento de un RN At de un codn a un tripleto superpuesto, el cual entonces se convierte en el nuevo codn. Puesto que los cambios del marco pueden ocurrir con una eficiencia menor de 100%, se pueden generar dos polipptidos diferentes del mismo RNAm. Pasar por alto la lectura de un codn de terminacin, en el cual el ribosoma contina su viaje despus de un codn de terminacin.

5 ; -> 3' exonucleasa FIGURA I2-5J. Degradacin del RNAm. Los pasos mostrados en el dibujo se describen en el texto.

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CAPITULO 12 Ncleo de a clula y control de la expresin de genes

Correccin de un RNAm, en cuyo caso los nucletidos especficos se convierten en otros nucletidos despus de la transcripcin del RNA (postranscripcin). La correccin del RNA mensajero ocurre sobre todo en las mitocondrias, pero el caso mejor estudiado es la protena nuclear codificada de mamfero apolipoprotena B, traducida a partir de un RNAm de unos 14 000 nucletidos de largo. En el intestino, la citidina del residuo 6666 en el RNA se convierte enzimticamente a uridina, que genera un codn de paro (UAA) que concluye la traduccin. La versin acortada de la protena, denominada apolipoprotena B48, slo se produce en las clulas del intestino delgado. Pasar por alto la traduccin, en la cual el ribosoma "brinca" sobre una secuencia de nucletidos en un RNAm especfico dejando una porcin interna del mensaje sin traducir. Empalme de protenas, en el cual un segmento de polipptido especfico se secciona y los dos bordes se unen en forma, covalente. Control despus de la traduccin: determinante de la estabilidad de las protenas Hemos visto que las clulas poseen mecanismos elaborados para controlar la tasa de sntesis de protenas. No es sorprendente que las clulas tambin posean mecanismos para controlar el tiempo de supervivencia de las protenas una vez que son totalmente funcionales. Aunque el tema de la estabilidad de las protenas no cae tcnicamente bajo el encabezado de control de la expresin de genes, es una

extensin lgica de dicho tema y por lo tanto aparece en esta parte del texto. Los mecanismos que controlan el periodo de vida de una protena no estn bien comprendidos. Uno de los factores importantes es el aminocido especfico que reside en el extremo N terminal de la cadena de polipptidos. Los polipptidos que terminan en ciertos aminocidos (metionina, serina, alanina, treonina, valina y glicina) tpicamente son especies de vida larga con vida media mayor de 20 horas. Por lo contrario, los polipptidos que terminan en otros aminocidos (fenilalanina, leucina, cido asprtico, Usina y arginina) tienen vida media tpicamente menor de cinco minutos de duracin. Esta relacin se conoce como regla del extremo N. Las clulas pueden emplear varios mecanismos para sealar a las protenas que deben ser descompuestas, pero el mejor estudiado requiere una pequea protena altamente conservada denominada ubiquitina. Diversas enzimas participan en la seleccin de las protenas "condenadas" y se unen de manera covalente a una lisina especfica en cada molcula de ubiquitina. La mayor parte de las protenas sealadas contienen algunas molculas de ubiquitina unidas a diferentes sitios dentro de la protena blanco. Una vez sealada por la ubiquitina, la protena se descompone enzimticamente mediante un complejo especial multiprotenico denominado proteosoma. Las micrografas electrnicas sugieren que el proteosoma es un complejo en forma de barril, y estudios bioqumicos indican que la protelisis ocurre en el centro del barril, lo que al parecer protege a otras partes de la clula contra dao proteoltico inespecfico. Los proteosomas se observan tanto en el ncleo como en el citoplasma de las clulas eucariotas.

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LA VIA E X P E R I M E N T A L

Genes que controlan el desarrollo embrionario

La teora de la evolucin de Darwin mediante seleccin natural se apoya fuertemente en sus observaciones acerca de que los miembros de una poblacin poseen caractersticas hereditarias que varan de un individuo a otro. Una de las personas que apoy con mayor fervor la teora de Darwin fue William Bateson, quien public un tratado en 1894 describiendo las variaciones que existan en las poblaciones naturales de diferentes tipos de organismos.1 Las observaciones de Bateson respecto de los esqueletos de seres humanos revelaron ejemplos raros donde un tipo de vrtebra estaba sustituido por otro tipo. Acu el trmino "homeosis" para describir estas diferencias en las cuales una parte del cuerpo aparentemente estaba cambiada por una estructura que normalmente se localiza en otra parte. Con ei redescubrimiento, en 1900, del trabajo de Mendel sobre plantas de guisantes y los estudios de gentica efectuados por Morgan en la mosca de la fruta establecindola como un organismo de laboratorio, los bilogos estuvieron en mejor posicin para apreciar la importancia de una mutacin que poda causar un cambio espectacular en la forma del cuerpo. En 1915, Calvin Bridges, uno de los colegas de Morgan, describi el primer muante hometico en la mosca de la fru|-ai Estudiado en 2 iguaj que otros tipos de mosca, la mosca de la fruta de tipo nativo slo tiene un par de alas localizadas en el segundo segmento torcico. El tercero (ltimo) segmento torcico posee un par de rganos de equilibrio (balancines). En contraste, el tercer segmento torcico del muante descubierto por Bridges posea un par de alas pequeas en vez de los balancines. Bridges denomin al murante bitrax (bx). Estudios posteriores indicaron que el bx formaba parte de un grupo de genes similares que al parecer controlan la direccin en la cual se desarrollan ambos segmentos, torcico y abdominal. El grupo de genes localizados sobre el tercer cromosoma se conoci como complejo bitrax (BX-C). En 1926 se describi un segundo tipo de muante hometico en Drosopha, en la cual las antenas normalmente desarrolladas sobre un segmento anterior de la cabeza fueron sustiuidas por un par de piernas.3 Este gen se denomin antenapedia (Antp) y se dempsr que era parte de un grupo diferente de genes sobre el tercer cromosoma, denominado complejo antenapedia (ANT-C). En la figura VE 12-1 se muestran gammagrafas electrnicas de una mosca de la fruta normal, de un muante bx, y de un muante Antp. Gran parte del trabajo de identificar los genes que constituyen los dos complejos hometicos fue efectuado por Edward B. Lewis, del California Instue of Technology. En una de sus limas publicaciones, Lewis especul acerca de que los genes homeicos pudieron haber evolucionado para saisfacer dos necesidades disinas de una mosca conforme cada una se volva ms diferente de sus ancestros milipdicos.4 Una de estas necesidades sera la de suprimir la formacin de un par de piernas en aquellos segmentos de la mosca que, a diferencia de la forma ancestral del cuerpo, no form piernas largas. Una segunda necesidad sera la de suprimir la formacin de un

(e)
FIGURA VE 12-1. Gammagrafa electrnica de: a) mosca de la fruta normal; b) un muante Antp en el cual las antenas fueron sustituidas por un par de piernas, y c) un imitante bx en el cual dos de los tres segmentos torcicos poseen un par de alas. (a,b: Cortesa de F.R.. Turner; c: segn David Scharf/Peter Arnold.)

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CAPITULO 12 Ncleo de a clula y control de la expresin de genes

segundo par de alas presentes en los insectos ancestros de cuatro alas. Una mutacin en el primer grupo de genes causara que un segmento produjera una pierna (como en el mulante Antp), en tanto que una mutacin en un gen del segundo cuerpo provocara el desarrollo de un segundo par de alas (como en bx). El hecho de que los genes que constituyen los complejos bitrax y antenapedia parecen tener funciones similares para controlar la va del desarrollo de diferentes segmentos, sugiere que quiz se originaron como resultado de la duplicacin y divergencia de un solo gen ancestral. Una manera de probar la relacin evolutiva entre los genes es determinar si ellos poseen o no secuencias de DNA homologas. La primera indicacin de que los genes horneticos verdaderamente comparten una regin de secuencia similar provino de estudios efectuados en el laboratorio de Walter Gehring, en la Universidad de Basilea, en Suiza, publicados como una serie de trabajos en 1984. En una de estas publicaciones,5 se extrajo DNA de moscas adultas, se digiri con la enzima EcoRl, y se someti a electroforesis a travs de gel de agarosa para separar los fragmentos resultantes segn su tamao. Los fragmentos de DNA en el gel fueron desnaturalizados sumergiendo el gel en una solucin de NaOH y luego se transfiri sobre una lmina de filtro de nitrocelulosa presionando el gel contra la nitrocelulosa. Esta tcnica, denominada mancha de Southern, por Edward Southern quien la desarroll, causa que los fragmentos de DNA se absorban al filtro de nitrocelulosa como resultado de la accin capilar (fig. 17-12). Una vez que tos fragmentos se fijan sobre el filtro se pueden incubar en soluciones que contienen sondas de DNA de una sola cadena marcadas con istopo radiactivo, las cuales se unen (hibridizan) a los fragmentos de DNA complementarios sobre el filtro. El DNA marcado no enlazado se puede lavar y probar la ocalizacin de las sondas unidas mediante autorradiografa presionando el papel filtro contra una pelcula de rayos X. En estos experimentos, las sondas marcadas se prepararon a partir de fragmentos cortos del complejo BX-C o del ANT-C previamente clonados. Utilizando la mancha de Southern preparada del DNA total segn se describi antes, se observ que algunas de las sondas marcadas eran capaces de hibridar varios fragmentos de diferente tamao sobre el filtro de nitrocelulosa. As se demostr en estos experimentos que el DNA del genoma contiene algunos sitios diferentes complementarios de una sola sonda marcada representando una pequea parte del complejo ANT-C o BX-C El siguiente paso fue explorar la capacidad de esta misma sonda marcada para enlazarse a fragmentos de restriccin preparados a partir de genes especficos. Utilizando esta tcnica se encontr que cada uno de los tres genes diferentes de los complejos horneticos [antenapedia, ultrabitrax (Ubx), y fushi tarazu (ftz}] contiene una secuencia capaz de hibridar al fragmento marcado, lo que indica que los tres genes comparten una regin que posee una secuencia similar de nucletidos. Esta regin similar se denomina homeobox.5 La homeobox no es parte de una regin reguladora del DNA, sino que reside dentro de la porcin codificante de los genes. El anlisis subsecuente de las regiones de !os tres genes horneticos que se enlazaron a la misma sonda indic que la

regin de homologa est limitada a un tramo de 180 pares de bases que codifican un tramo de 60 aminocidos denominado el homeodominio. El anlisis de la secuencia de la regin homeobox en los tres genes indic que Antp muestra 77% de homologa con ftz (o sea, 138 nucletidos de los 180 coincidieron perfectamente). La homologa de los genes/z y Ubx fue de 75%, en tanto que la de Antp y Ubx fue de 79%. Ms an, muchas de la sustituciones de nucletidos que distinguen los tres genes consistieron en una simple sustitucin de un aminocido sobre un codn que simplemente reemplaz a otro codn que especifica el mismo aminocido. De os 60 aminocidos codificados por la homeobox, 45 de ellos son idnticos en los tres genes.6 Tambin se consider el papel de la protena codificada por estos genes. El hecho de que el homeodominio sea rico en aminocidos bsicos (aproximadamente 19 de os 60 aminocidos fueron Usina, arginina o histidina) plantea la posibilidad de que la protena funciona enlazndose a DNA. Aunque la secuencia de aminocidos del homeodominio no muestra homologa extensa con la de cualquier otra protena conocida, mostr una dbil homologa con un par de protenas de levaduras que se sabe funcionan como factores de transcripcin que se enlazan a DNA. Por lo tanto, segn la naturaleza bsica del homeodominio y de la dbil homologa a protena que se enlaza a DNA, se propuso que los genes horneticos podan codificar protenas que actan como factores de transcripcin que se enlazan a DNA. Esta hiptesis coincide con la idea de que los genes hometicos actan como genes "maestros para control" cuyos productos controlan la expresin de varios genes subordinados. Una vez establecido que la secuencia homeobox es una caracterstica consistente de los genes hometicos de Drosopha, se plantea la pregunta de la presencia de una secuencia similar en los genes de otros organismos. Para someter a prueba esta posibilidad, William McGinnis y sus colaboradores, en el laboratorio de Gehring, prepararon la mancha de Southern utilizando DNA genmico total fragmentado procedente de varios organismos y probaron la capacidad de los fragmentos separados para enlazarse a sondas DNA marcadas que contienen la secuencia homeobox de Drosophila.6 Cuando el DNA probado con la mancha de Southern fue aislado de Drosophla aparecieron marcas sobre seis bandas de las manchas de la nitrocelulosa (tres correspondieron a/te, Ubx y Antp, y tres a otros genes). El DNA procedente de escarabajos, lombriz de tierra, pollos, ratones y del hombre tambin produjo algunas bandas marcadas, lo que indica la presencia en cada uno de estos organismos de varios genes que contienen la secuencia homeobox. En estos primeros estudios se observ que alrededor de seis a ocho fragmentos de restriccin del DNA del ratn y del hombre se unen al homeobox de Drosopha que contiene a sonda DNA. En contraste, el DNA de bacterias no mostr la presencia de secuencias homeobox. No slo los genes de ratones y del hombre poseen un homeobox, pronto se demostr que la secuencia se conserva notablemente entre moscas y mamferos, miembros de dos filum notablemente divergentes. Por ejemplo, se demostr que uno de os fragmentos de restriccin del genoma de ratn codifica un polipptido en el cual 44 de los 60 aminocidos del homeobox fueron idnticos con los

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codificados por e honieobox del gen Antp de Drosophila (fig. VE 12-2)7 Los trabajos publicados en 1984 acerca de los homeobox generaron considerable inters entre los bilogos del desarrollo, quienes estaban buscando indicios acerca de os genes que controlan el desarrollo, y los bilogos moleculares, quienes buscaban protenas que controlan la transcripcin. El dato de que el genoma de mamfero contiene genes con secuencias homologas a los genes hometicos que desempean un papel tan importante en el desarrollo de Drosophila fue particularmente notable'. La atencin se volvi al papel de estos genes durante el desarrollo del mamfero. En los siguientes aos, los investigadores han estado buscando la respuesta a tres preguntas principales. 1. Cuntos homeobox que contienen genes existen en el genoma de los vertebrados, y cmo son los genes organizados dentro de los cromosomas? 2. En qu etapas de desarrollo embrionario y en cules tejidos embrionarios existen homeobox que contengan genes transcritos? 3. Cul es el papel de estos genes durante el desarrollo? La primera de estas preguntas fue estudiada mediante varias tcnicas genticas y moleculares. Los estudios en ratn indican que hay cuatro grupos distintos de homeobox que contienen genes localizados en cuatro diferentes cromosomas.8 Los cuatro grupos del genoma del mamfero se denominan HoxA-HoxD.9 Cada grupo de genes contiene una serie de trece genes aproximadamente homlogos a los genes que ocupan posiciones comparables en los grupos situados sobre otros cromosomas (fig. VE 12-3). Es notable que varios de los genes de los dos genes hometicos de Drosopha (ANT-C y BX-C) tienen homlogos en los genomas del ratn (y del ser humano), y el orden de los homlogos se retiene dentro de los grupos de genes tanto en insectos como en mamferos. Esta observacin sugiere que el ancestro de artrpodos y vertebrados que tal vez divergi hace unos 700 millones de aos posea un grupo similar de genes que determin su plan corporal durante el desarrollo embrionario.

La segunda de estas preguntas se estudi mediante hibridacin in stu preparando cortes de embriones que fueron incubados en sondas DNA de una sola cadena que contenan las secuencias homeobox. Las clulas del embrin que transcriben activamente un gen que contenga la secuencia homeobox poseern transcritos complementarios de la sonda marcada. Durante la incubacin, el DNA marcado se enlaza a los transcritos complementarios formando hbridos DNA-RNA cuya localizacin se puede determinar por medio de autorradiografa. Utilizando esta tcnica se observ que partes especficas del embrin de ratn transcriben genes homeobox particulares durante etapas especficas del desarrollo.10 Ms an, el orden lineal de los genes Hox a lo largo de un cromosoma semejan la expresin de dicho gen a lo largo del eje anteroposterior del embrin. Los genes indicados con nmeros menores dentro de cada grupo de la figura VE 12-3 (se dice que son ms de 5') se expresan en las regiones ms anteriores del embrin.11'12 Desde mucho antes, E.B. Lewis hizo una observacin similar en los grupos de genes hometicos de Drosophila. Los esfuerzos para comprender el papel de os genes Hox en el desarrollo de los mamferos apenas han comenzado. Se emplean diferentes tcnicas, incluyendo inyeccin al interior del embrin de anticuerpos dirigidos contra las protenas homeobox, formacin de ratones transgnicos que contienen copias extra de los genes Hox que se expresan excesivamente durante el desarrollo embrionario, y la formacin de ratones que carecen de ambas copias de uno de los genes Hox. En conjunto, estos estudios sugieren que como en el caso de la mosca de la fruta, los genes homeobox participan en el control de las caractersticas segmentarias bsicas del cuerpo de los vertebrados. En los vertebrados, la segmentacin es ms aparente al examinar el esqueleto axial (en especial la columna vertebral) y el sistema nervioso central, en particular mdula espinal y porcin posterior del encfalo. Las alteraciones de la expresin normal de los genes Hox en vertebrados provoca malformaciones en estructuras segmentarias, pero tambin afecta otros rganos. En un estudio, por ejemplo, se formaron ratones "knockout" que carecan de ambas copias de uno de los genes hometicos. Aunque estos ratones sobrevivieron al desarrollo embrionario y fetal, todos murie-

10
Ratn 10

20

Ser Lis Arg Gl Arg Tre Ala Tir Tre Arg Pro Gln Leu Val Glu Leu Glu Lis Glu Fen Arg Lis Arg Gli Arg Gln Tre Tir Tre Arg Tir Gln Tre Leu Glu Leu Glu Lis Glu Fen Ser Lis Arg Tre Arg Gln Tre Tir Tre Arg Tir Gln Tre Leu Glu Leu Glu Lis Glu Fen Arg Arg Arg Gli Arg Gln Tre Tir Tre Arg Tir Gln Tre Leu Glu Leu Glu Lis Glu Fen

Antp ftz Ubx

FIGURA VE 12-2. Comparacin de la secuencia de aminocidos que constituyen el homeodominio de un gen de ratn y de tres genes de la mosca de la fruta (Antp, ftz y Ubx). Los aminocidos subrayados son idnticos en los productos del gen Antp del ratn y de la mosca. (Segn W. McGnnis y cois. Cell 38:677, 1984; con permiso de Cell Press.)

21
Ratn 10 Antp ftz

40 30 Hs Fen Asn Arg Tir Leu Met Arg Pro Arg Arg Val Glu Met Ala Asn Ala Leu Asn Leu

Ubx

His Fen Asn Arg Tir Leu Tre Arg Arg Arg Arg lie Glu lie Ala His Leu Leu Gis Leu His Fen Asn Arg Tir He Tre Arg Arg Arg Arg lie Asp lie Ala Asn Ala Leu Ser Leu His Tre Asn His Tir Leu Tre Arg Arg Arg Arg He Glu Met Ala Tir Ala Leu Gis Leu

41
Ratn 10

Tre Glu Arg Gln Je

60 50 Lis lie Trp Fen Gln Asn Arg Arg Met Lis Tir Lis Ls^ Asp Gln

Antp

z
Ubx

Tre Glu Arg Gln He Lis He Trp Fen Gln Asn Arg Arg Met Lis Trp Lis Lis Glu Asn Ser Glu Arg Gln He Lis He Trp Fen Gln Asn Arg Arg Met Lis Ser Lis Lis Asp Arg Tre Glu Arg Gln He Glu He Trp Fen Gln Asn Arg Arg Met Lis Leu Lis Lis Glu He

538

CAPITULO 12 Ncleo de la clula y control de la expresin de genes

Direccin de la transcripcin de los genes ANT-C y BX-C lab ANTERIOR pb Dfd Ser Antp Ubx a6<M Abd-B ANT-C i

Grupo: i

POSTERIOR

Hox A (Hox 1)

Humano 21 flatn 2.9

Hox C (Hox 3)

2H 2.8

2G 2.7

2F 2.6

FIGURA VE 12-3. Organizacin de los genes que constituyen los cuatro complejos Hox de mamfero. Los genes se denominan segn la nomenclatura propuesta en el trabajo publicado en 1992. En la parte de arriba se muestra la alineacin con los genes Drosaphiln. La direccin de la transcripcin de los genes est indicada por flechas de una sola punta. (Segn M.P. Sco, Cell 71:551, 1992; con permiso de Cdl Press.)
C5 3D 3.4 C6 3C 3.3

C4

C8

C9
3B 3.2

CIO CU
31 3.6
3H

C12 C13 3F 3G

Humano Ratn
Hox D (He* 4)

3E

3.7

3'-*Direccin de la transcripcin de los genes Hox

-* 5'

ron poco despus de nacer como resultado de anomalas mayores localizadas principalmente en cuello y garganta.13 Estos defectos del desarrollo incluyeron ausencia del timo y de as glndulas paratiroides, reduccin de los tejidos en las glndulas tiroidea y salivales submaxilares, y tambin anomalas craneofaciales y defectos en el corazn y las arterias principales. Las deficiencias anatmicas que ocurren en estos ratones son notablemente semejantes a una rara enfermedad congnita humana denominada sndrome de DiGeorge, lo que plantea la posibilidad de que este padecimiento humano sea resultado de la expresin anormal de este gen hometico. Los productos de los genes Hox son protenas que se unen a DNA y se cree que actan como factores de transcripcin para regular la expresin de otros genes que participan en el desarrollo de las estructuras embrionarias. Los primeros estudios de la actividad del homeodominio que se enlaza a DNA fueron efectuados utilizando protena codificada por el gen dentado, uno de los genes incluidos en el homeobox de la mosca de la fruta.14 Para definir mejor a actividad de enlace al DNA de la protena, se realiz un estudio en el cual varias partes de la secuencia codificada por el gen dentado se fusionaron con el gen bacteriano /3-galactosidasa. A continuacin se sintetizaron estas protenas de fusin (quimricas) y se les permiti enlazarse a fragmentos de DNA procedentes del genoma. La capacidad de ia protena de fusin para enlazarse al DNA se determin mediante precipitacin de complejos protena-DNA con un anticuerpo contra /-galactosidasa. Mediante este procedimiento se determin que la mayor parte de la protena procedente del gen dentado careca de actividad para enlazarse a DNA y por lo tanto estaba dispensada de esta funcin. La actividad para enlazrse al DNA de la protena dentada se localiz en una regin que consta de casi todo el homodominio y tambin de 12 aminocidos adiciona-

les en un flanco de su extremo N terminal. La secuencia DNA implicada en el enlace del homeodominio se determin permitiendo e) engrane de a protena dentada de fusin con fragmentos DNA genmicos, y a continuacin tratando los complejos protena-DNA con una enzima (DNasa I) que digiere todo el DNA no protegido por una protena enlazada. En seguida se quit la enzima y el DNA no digerido se purific y secuenci. Este tipo de experimentos suministra una "huella" de la secuencia de DNA enlazado por la protena. Los resultados de estos experimentos indican que la protena dentada se une a fragmentos de DNA que tienen una secuencia igual o muy similar a TCAATTAAAT. En la mayor parte de los casos, esta secuencia se repite varias veces dentro de la regin protegida de! DNA. La identificacin de una secuencia de DNA a a cual se puede unir el homeodominio proporcion la herramienta para buscar dichos sitios en las regiones reguladoras situadas hacia adelante de los genes que se sabe participan en el desarrollo embrionario. La identificacin de un sitio reconocible en el homeodominio tambin permiti describir la estructura tridimensional del complejo formado por el homeodominio y el DNA al cual se enlaza.15 Se demostr que el homeodominio contiene un motivo de enlace a DNA denominado hlice-vuelta-hlice (HVH) similar al que se identific previamente en represores bacterianos que se enlazan a sitios operadores en los operones bacterianos (pg. 510). Los aspectos claves de la interaccin entre el DNA y el producto de un gen hometico se muestran en la figura VE 12-4. Una de las cuestiones ms importantes respecto de la actividad de los genes hometicos es de qu manera se distingue el producto de un gen de os productos de otros genes. Como se hizo notar antes, las secuencias de aminocidos de los homeodominios de diferentes protenas hometicas son muy

CAPITULO 12 Ncleo de a clula y control de la expresin de genes

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FIGURA VE 12-4. Diagrama que muestra ia relacin del brazo N terminal del homeodominio y la doble hlice DNA. La posicin de las hlices a se indica por los cilindros. (Segn C.R. Kissinger y cois. Ceil 63:581, 1990; con permiso de Cell Press.)

similares entre s. Como resultado, inicialmente sera de esperar que las diferencias en actividad de enlace a DNA de diferentes productos de genes hometicos pudieran ser determinadas por aquellas partes de la protena que residen fuera del homeodominio; estas son las regiones de las protenas muy diferentes entre s. Una manera de determinar que parte de un grupo de protenas relacionadas determina su especificidad funcional es construir genes que codifiquen protenas hbridas que contengan porciones de varios miembros del grupo. A continuacin se pueden introducir estos genes hbridos en la mosca de la fruta o en un embrin de ratn y observar su efecto sobre el desarrollo. En varios laboratorios se han efectuado experimentos en los cuales partes de protenas hometicas se intercambian entre s, y todos los resultados indican que la especificidad funcional se encuentra en la secuencia de aminocidos del propio homeodominio. Por lo tanto, si un gen hbrido codifica una protena cuyo homeodominio pertenezca a la protena A y el resto a la protena B, la protena hbrida funciona como si fuera protena A.16'17 Los resultados de estos experimentos plantean preguntas importantes respecto de la manera en que las protenas con dominios similares de enlace a DNA, que en algunos casos slo difieren por unos pocos aminocidos, se encargan de activar diferentes bateras de genes causantes del desarrollo de partes del embrin en distintos tipos de estructuras. Se supone que los productos de los genes hometicos actan como parte de una red de factores de transcripcin que compiten entre s por tipos similares de sitios de enlace en las regiones reguladoras de los genes importantes desde el punto de vista del desarrollo. Por ltimo, las seales para que un segmento particular de una mosca se desarrolle para formar una antena en vez de una pierna quiz dependa de diferencias relativamente sutiles en la afinidad de los factores de transcripcin hometicos para secuencias particulares de DNA. La importancia de los factores de transcripcin en el inicio de la formacin de un rgano particular es ms evidente en estudios recientes realizados sobre un gen que controla el de-

sarrollo del ojo. El ojo de un insecto es un rgano complejo que requiere la actividad combinada de unos 2 500 diferentes productos de genes. Drosopha eyeless (ey) es una mutante que no desarrolla sus ojos, lo que indica que el producto del gen ey participa en la formacin del ojo. Sin embargo, la importancia de la protena no se comprob sino hasta 1995, cuando Gehring y sus colaboradores demostraron que el producto del gen ey es capaz por s solo de provocar el desarrollo de un ojo en cualquiera de las partes ms improbables del cuerpo de la mosca, como un ala o una pierna (fig. VE 12-5).18 Para efectuar este experimento, los investigadores prepararon dos grupos de moscas de la fruta manipulados genticamente. Un grupo era portador de copias extra del gen eyeless localizado hacia atrs de una regin reguladora que poda ser activada por un factor de transcripcin de levadura llamado GAL4. El segundo grupo portaba copias del gen de levadura GAL4 cuya expresin estaba controlada por el amplificador ms cercano (pg. 517) que responda a factores de transcripcin especficos del tejido. Por consiguiente, el gen GAL4 slo se expres en tejidos especficos de estos animales. Cuando se aparearon los miembros de estos dos grupos de moscas, la descendencia contena elementos construidos por ambos tipos de genes extraos, y en consecuencia expres el gen ey en las clulas que producan GAL4. Cuando GAL4 se expres en

FIGURA VE 12-5. La pierna de esta mosca de la fruta posee un ojo compietamente formado como resultado de la expresin forzada del gen eyeless dentro de las clulas del primordio de la pierna durante el desarrollo del adulto. (Cortesa de U. Kloter, G. Halder y W.J. Gehring.)

540

CAPITULO 12 Ndeo de !a clula y control de la expresin de genes

clulas de las alas, ocurri lo mismo con el producto del gen cy, lo que provoc que las clulas de las alas dieran lugar a un ojo. Algunos miembros de la descendencia de este apareamiento produjeron hasta 14 ojos diferentes localizados en varios sitios anormales fo sea cctpicos) alrededor del cuerpo. Adems de proporcionar el encabezado para los peridicos alrededor del mundo, esta investigacin sugiri que cy era un verdadero gen maestro para el control de la formacin del ojo. Al parecer, el producto del gen puede activar otros genes que inician una reaccin en cadena que conduce a a construccin ordenada de todas las partes de un ojo. Puesto que los ojos de los artrpodos y de los vertebrados se construyen de manera tan diferente, siempre se asume que los dos tipos de ojos evolucionaron de manera independiente. Aun as, dos experimentos demuestran que ios mamferos, incluyendo ratones y el hombre, contienen un gen homlogo a eyeless, el cual se ha demostrado que participa en la formacin del ojo. En realidad, el gen del mamfero puede sustituir al gen de la mosca para provocar la formacin de ojos ectpicos en la mosca de la fruta. Por lo tanto, aunque las moscas y los mamferos desarrollan tipos muy diferentes de ojos, los datos sugieren que el desarrollo del ojo est controlado por un tipo similar de "gen maestro" y que los dos tipos de ojos en realidad estn evolutivamente relacionados.

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SINOPSIS
El ncleo de una clula eucariota es una compleja estructura rodeada por una envoltura nuclear que controla el intercambio de materiales entre el ncleo y el citoplasma, y mantiene la composicin nica de cada uno de los principales compartimientos de clulas. La envoltura nuclear consta de varios elementos distintos, incluyendo una membrana nuclear interna y otra externa separadas por un espacio perinuclear y un nmero variable de poros nucleares. Los poros nucleares son sitios donde las membranas nucleares interna y externa se fusionan para formar una abertura circular llena por una estructura compleja denominada complejo del poro nuclear (CPN). El CPN tiene una estructura semejante a una canastilla con simetra octagonal compuesta de anillos, radios, partculas y filamentos. Los poros de entrada son sitios a travs de los cuales circulan materiales entre el ncleo y el citoplasma. Los estudios indican que las sustancias de bajo peso molecular pueden difundir a travs del CPN, tal vez pasando entre los radios. RNA y protenas se desplazan a travs del CPN en ambas direcciones mediante un proceso an poco comprendido de transporte selectivo. Las protenas que normalmente residen dentro del ncleo contienen un tramo de aminocidos denominado seal de localizacin nuclear (SLN) que les permite enlazarse a un receptor en la superficie citoplsmica del CPN, y que al parecer desencadena un cambio de conformacin en el transportador central permitiendo que las molculas enlazadas penetren al interior del ncleo. La superficie interna de la envoltura nuclear se encuentra revestida por una red fibrilar denominada lmina nuclear, que consta de protenas

CAPITULO 12 Ncleo de la clula y control de la expresin de genes

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(lminas) que son miembros de la familia de las protenas que constituyen filamentos intermedios. El lquido del ncleo se denomina nucleoplasma (p. 489). Los cromosomas del ncleo contienen un complejo definido de DNA y protenas histona que forman filamentos nucleoprotenicos caractersticos representando el primer paso en el empaquetamiento del material gentico. Las histonas son protenas pequeas bsicas divididas en cinco tipos distintos. Las histonas y el DNA se organizan en complejos nucleosmicos centrales, que constan de dos molculas de cada una de las histonas H2A, H2B, H3 y H4 rodeadas por casi dos vueltas de DNA. Las partculas centrales del nucleosoma estn conectadas entre s por tramos de DNA de unin que en promedio constan de casi 60 pares de bases. En conjunto, las partculas centrales y el DNA de unin generan un filamento nucleosmico que recuerda las cuentas de un rosario. Las histonas del complejo central estn organizadas con las porciones hidrofbicas de las protenas dirigidas hacia el centro del complejo y sus porciones bsicas extendidas hacia afuera para formar uniones inicas con los residuos fosfato del esqueleto de DNA. La interaccin entre histonas y DNA es sobre todo estructural y relativamente independiente de la secuencia de nucletidos, aunque se conocen excepciones importantes donde los nucleosomas se colocan en sitios especficos sobre el DNA. El empaquetamiento del DNA dentro de los nucleosomas reduce su longitud ms o menos a una sptima parte en relacin con su condicin cuando se encuentra completamente extendido (p. 492). La cromatina dentro de las clulas no se encuentra en forma de filamento ampliamente extendido, sino est compactada en niveles ms altos de organizacin. Cada partcula central nucleosmica contiene una molcula de histona Hl que se une ai DNA conforme la partcula entra y sale. Las histonas Hl median una interaccin entre nucleosomas vecinos que generan un filamento de 30 nrn, que representa un nivel ms elevado de organizacin de la cromatina. Los filamentos de 30 nm se organizan a su vez en dominios en forma de asa que se pueden visualizar con mayor facilidad cuando los cromosomas mitticos son sometidos a procedimientos para retirar histonas. Los cromosomas mitticos representan el estado ms compacto de la cromatina, estado en el cual las asas que componen un cromosoma simple se juntan en una estructura altamente compacta. Cierta fraccin de la cromatina, denominada heterocromatina, permanece en este estado altamente compacto a travs de la interfase. La heterocromatina se divide en cromatina constitutiva, que permanece condensada en todas las clulas en todo momento, y heterocromatina facultativa, que se inactiva especficamente durante ciertas fases de la vida de un organismo. Uno de los cromosomas X de cada clula de los mamferos hembra se encuentra sujeto a un proceso de inactivacin durante el desarrollo embrionario que lo convierte en heterocromatina facultativa inactiva a nivel de transcripcin. Puesto que la inactivacin X ocurre al azar, en !a mitad de las clulas del embrin se inactiva el cromosoma X derivado del padre, en tanto que el cromosoma X derivado de la madre se inactiva en la otra mitad. Corno resultado, las hembras adultas son mosaicos genticos con respecto de los genes presentes en el cromosoma X (p. 497j.

Los cromosomas mitticos poseen varias caractersticas fcilmente reconocibles. Los cromosomas mitticos pueden prepararse mediantes la lisis de clulas detenidas en mitosis y luego teidas por diferentes procedimientos para generar cromosomas identificables que contengan patrones predecibles de bandas. Cada cromosoma rnittico contiene una indentacin marcada, denominada centrmero, que aloja secuencias DNA altamente repetidas y sirve como sitio para unir microtbulos durante la mitosis. Los extremos del cromosoma son los telmeros, que contienen una cadena rica en G que corre ms all de su complemento rico en C. Una enzima especial, llamada telomerasa, que contiene RNA como elemento integral, mantiene esta disposicin de una generacin de clulas a la siguiente. Los telmeros al parecer desempean varios papeles importantes en la regulacin de la actividad celular (p. 500). El ncleo es un compartimiento celular altamente ordenado. Esto se comprueba con a observacin de que cromosomas especficos estn confinados a regiones particulares del ncleo; los telmeros pueden relacionarse con la envoltura nuclear; las RNP implicadas en el empalmado de los pre-RNAm se restringen a sitios particulares, y los movimientos de los transcritos recin sintetizados estn restringidos al momento en que se procesan. Las pruebas indican que ia red de filamentos protenicos que constituye la matriz nuclear desempea un papel clave en el mantenimiento de la estructura ordenada del ncleo (p. 506). En los procariotes, los genes se organizan en unidades reguladoras llamadas operones. Los operones son grupos de genes estructurales que tpicamente codifican diferentes enzimas en la misma va metablica. Puesto que todos los genes estructurales se transcriben a un solo RNAm, se puede regular su expresin de manera coordinada. El nivel de expresin de genes est controlada por un compuesto metablico clave, como el inductor de lactosa, que se fija a una protena represora y cambia su forma. Este acontecimiento altera la capacidad del represor para enlazarse al sitio operador sobre el DNA y por lo tanto impide la transcripcin (p. 508). Todas las clulas diferenciadas de un organismo eucariota retienen toda la informacin gentica. La tasa de sntesis de un polipptido particular es determinada por una serie compleja de acontecimientos reguladores que operan principalmente a tres niveles distintos. 1) Los mecanismos a nivel de la transcripcin determinan si un gen ser o no transcrito o, en caso afirmativo, con qu frecuencia; 2) los mecanismos de control a nivel de procesamiento determinan la va mediante la cual se procesa el transcrito de RNA primario, y 3) los mecanismos de control a nivel de traduccin determinan si un RNAm particular es realmente traducido y, si es as, con qu frecuencia y durante cunto tiempo. En algunos casos raros ocurre amplificacin selectiva de genes y reordenamiento programado del DNA (p. 511). En diferentes etapas del desarrollo, clulas de diferentes tejidos sometidas a diversos estmulos expresan genes diferentes. La transcripcin de un gen particular est controlada

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CAPITULO 12 Ncleo de la clula y control de la expresin de genes

por factores de transcripcin que son protenas capaces de enlazarse a secuencias especficas localizadas en sitios fuera de la regin codificante del gen. La secuencia reguladora ms prxima hacia adelante es el cuadro TATA, que es el principal componente del promotor del gen y sitio de ensamblado del complejo precursor de inicio. Se cree que la actividad de las protenas en el cuadro TATA depende de interacciones con otras protenas enlazadas a otros sitios, incluyendo diferentes tipos de elementos de respuesta y elementos amplificadores. Los elementos amplificadores se distinguen por el hecho de que pueden desplazarse de un sitio a otro dentro del DNA, incluso siguiendo direccin inversa. Algunos amplificadores se localizan a veces a 10 000 pares de bases por delante del gen cuya transcripcin estimulan. Se cree que las protenas enlazadas a un amplificador y a un promotor entran en contacto gracias a la accin de las asas formadas en el DNA (p. 516). La determinacin de la estructura tridimensional de algunos complejos formados entre factores de transcripcin y DNA indica que estas protenas se enlazan al DNA mediante un nmero limitado de motivos estructurales. En condiciones tpicas, los factores de transcripcin contienen cuando menos dos dominios, uno cuya funcin es reconocer y enlazarse a una secuencia especfica de pares de bases en el DNA, y otro cuya funcin es activar la transcripcin al interactuar con otras protenas. La mayor parte de los factores de transcripcin se enlazan al DNA en forma de dmeros, sean heterodmeros u homodmeros, que reconocen secuencias en el DNA que poseen simetra doble. Casi todos los motivos que se enlazan al DNA contienen un segmento, a menudo una hlice a, dentro del surco mayor del DNA, donde reconocen la secuencia de pares de bases que revisten dicho surco. Entre los motivos ms comunes presentes en las protenas que se enlazan a DNA se encuentra el dedo de zinc, la hlice-asa-hlice, y el cuadro GME. Cada uno de estos motivos proporciona un armazn estructuralmente estable sobre el cual la superficie de la protena que reconoce especficamente el DNA puede interactuar con la doble hlice de DNA. Aunque tal vez la mayor parte de los factores de transcripcin sean estimuladores, algunos actan inhibiendo la transcripcin (p. 518). Se piensa que la metilacin de las bases citosina de ciertos nucletidos residentes en regiones ricas en G-C inactivan funcionalmente a los genes eucariotas. La metilacin es una modificacin dinmica; existen enzimas para eliminar grupos metilo y tambin para aadirlos. La adicin de grupos metilo en regiones reguladoras clave por delante de los genes se correlaciona con disminucin de la transcripcin del gen, en tanto que la eliminacin de dichos grupos metilo se correlaciona con un incremento de la transcripcin. El efecto de la metila.cin es particularmente evidente en la cromatina que ha sido inactivada a nivel de transcripcin mediante heterocromatizacin, como el cromosoma X inactivo de la clula de los mamferos hembra. Otro fenmeno relacionado con la metilacin del DNA es la impresin genmica, que afecta a un pequeo nmero de genes del embrin activos o inactivos

a nivel de transcripcin segn el progenitor del cual se originen (p. 522). La incorporacin de DNA a los nucleosomas aade otra dimensin al control de la transcripcin generando oportunidades para el control de dicha transcripcin. El acomodo preciso del nucleosoma en la regin reguladora de un gen desempea un papel importante al permitir que las protenas que se unen a DNA estimulen la transcripcin de dicho gen. La interaccin de un factor de transcripcin con el DNA puede inducir cambios secundarios en la estructura de la cromatina permitiendo que otros sitios sean ms o menos accesibles al enlace subsecuente de protenas. Adems, la cromatina activa a nivel de transcripcin posee ciertas propiedades distintivas que la distinguen de la cromatina inactiva, sobre todo de sitios hipersensibles a la digestin enzimtica del DNA. Ciertas pruebas indican que los nucleosomas sufren modificaciones que hacen ms accesible el DNA a las molculas de polimerasa conforme se transcribe el DNA empaquetado (p. 525). La expresin de genes es regulada a nivel de procesamiento por el empalmado alternativo, proceso mediante el cual un solo gen puede codificar dos o ms protenas relacionadas. Se pueden procesar muchos transcritos primarios a travs de ms de una va, produciendo RNAm que contiene diferentes combinaciones de exones. En el caso ms simple, un intrn especfico puede ser empalmado fuera del transcrito o retenido como parte del RNAm final. Se piensa que la va especfica seguida durante el procesamiento de precursores de RNAm depende de la presencia de protenas que controlan los sitios de empalme reconocidos por desdoblamiento (p. 528). La expresin de genes es regulada a nivel de traduccin por diferentes procesos, incluyendo localizacin del RNAm, control de la traduccin de los RNAm existentes y longevidad del RNAm. Casi todas estas actividades reguladoras son mediadas por interacciones con las regiones no traducidas 5' y 3' (RNT) del RNAm. Por ejemplo, se piensa que la localizacin del RNAm en regiones particulares de los huevos de la mosca de la fruta es mediada por protenas que reconocen secuencias de localizacin en la RNT 3'. La presencia de un RNAm en el citoplasma no garantiza su traduccin. El mecanismo sintetizador de protenas de una clula puede estar controlado globalmente de modo que se pueda afectar la traduccin de todos los RNAm, o la traduccin de RNAm especficos, como ocurre en el control de la sntesis de ferritina por la concentracin de hierro que acta por medio de protenas que se enlazan a la RNT 5' de la ferritina de RNAm. Uno de los factores primarios que controlan la longevidad (estabilidad) del RNAm es la longitud del apndice poli{A). Esta parte del RNAm normalmente se encuentra protegida por una protena unida a po(A). Nucleasas especficas dentro de la clula gradualmente acortan el apndice poli(A) hasta alcanzar un punto donde la protena protectora ya no puede ser retenida por el apndice. Una vez perdida la protena, el RNAm queda sin su casquete y su descomposicin ocurre en la direccin 5' a 3' (p. 529).

CAPITULO 12 Ncleo de la clula y control de a expresin de genes

543

PREGUNTAS DE REPASO
1. Describir los elementos que constituyen la envoltura nuclear. Cul es la relacin entre las membranas nucleares y el complejo del poro nuclear? De qu manera regula el complejo del poro nuclear el movimiento de materiales en ambas direcciones entre el ncleo y el citoplasma? 2. Cul es la relacin entre las histonas y el DNA de una partcula central del nucleosoma? Cmo se revel por primera vez la existencia de los nucleosomas? Corno se organizan los nucleosomas en niveles ms altos de organizacin de cromatina? Cul es el papel de la histona Hl en esta jerarqua? 3. Cul es la diferencia estructural y funcional entre heterocromatina y eucromatina? Entre heterocromatina constitutiva y heterocromatina facultativa? Entre un cromosoma X activo y uno inactivo en las clulas de mamferos hembra? 4. Cul es la diferencia estructural y funcional entre los centrmeros y los telrneros de un cromosoma? 5. Describir algunas observaciones que sugieran que el ncleo es un compartimiento ordenado y que la matriz nuclear participa en mantener dicho orden. 6. Describir la cascada de sucesos que causan cambios sbitos en la expresin del gen en una clula bacteriana luego de la adicin de lactosa. Cmo se puede comparar esto con lo que ocurre en respuesta a la adicin de triptfano? 7. Cul es el papel del AMP cclico en la sntesis de /?-gaIactosidasa? 8. Describir los diferentes niveles de regulacin de la expresin del gen que permiten que el gen de la globina /?, con la siguiente estructura, dirija la formacin de una protena que explica casi 95% de toda la protena de la clula. exn 1-intrn-exn 2-intrn-exn 3 9. Cules son las funciones de un represor lac bacteriano y de un receptor similar de glucocorticoides en mamferos? En qu son diferentes? 10. Describir un ejemplo en el cual la diferenciacin celular se acompaa de cambios selectivos en la estructura del genoma 11. Qu tipo de secuencias reguladoras se encuentran en las regiones reguladoras del DNA por delante de un gen, como el que codifica la metalotionena? Cul es el papel de estas diferentes secuencias para controlar la expresin de los genes cercanos? 12. De qu manera la posicin del nucleosoma puede estimular o inhibir la transcripcin de los genes cercanos? 13. Describir un ejemplo de empalme alternativo. Cul es el valor del control de este tipo para una clula? Cmo puede regular una clula los sitios donde se elige el ensamblado de precursores de RNAm? 14. Describir tres diferentes maneras para controlar la expresin de genes a nivel de traduccin. Citar un ejemplo de cada uno de estos mecanismos de control. 15. Cul es el papel del apndice poli(A) en la estabilidad del RNAm? Cmo puede la clula regular la estabilidad de los diferentes RNAm?

PREGUNTAS ANALTICAS
1. Qu consecuencias podran esperarse como resultado de las mutaciones en diferentes protenas que constituyen la matriz nuclear? 2. Luego de examinar las rnicrografas electrnicas de las figuras 12-4 y 12-8, qu se puede concluir respecto de la magnitud de los materiales capaces de atravesar los poros nucleares? Cmo concuerda esto con la observacin de que protenas relativamente pequeas, como la albmina, no penetran al ncleo cuando se inyectan en el citoplasma? 3. Supongamos que se descubre un mutante sensible a temperatura cuyo ncleo no puede acumular ciertas protenas nucleares a temperatura elevada (restrictiva), pero que contina acumulando otras especies. Qu conclusiones se pueden extraer respecto de la locazacin en el ncleo y la naturaleza de esta mutacin? 4. De qu manera la reciente imagen del nucleosoma mostrada en la figura 12-11 ayuda a explicar por qu las histonas centrales son protenas altamente conservadas? 5. Supongamos que la inactivacin X no es un proceso al azar, sino que siempre conduce a la inactivacin del cromosoma X derivado del padre. Qu efecto sera de esperar sobre el fenotipo de las hembras? 6. Los cromosomas mostrados en la fotografa de la figura 12-A se marcaron mediante incubacin de la preparacin con fragmentos de DNA especfico para cada uno de los diferentes cromosomas. Supongamos que uno de los cromosomas en el campo contiene regiones con dos colores diferentes. Cul sera su conclusin respecto de este crojnosoma? 7. El rastro de color verde en la figura 12-25, a, se obtuvo incubando la clula con una sonda DNA complementaria a la porcin transcrita del gen fibronectina. En qu sera diferente la localizacin de la fluorescencia verde si la sonda DNA fuera complementaria de uno de los muchos intrones en el gen de fibronecina en vez de uno de los exones? 8. Cul sera la ventaja de tener transcritos sintetizados y procesados en ciertas regiones del ncleo en vez de procesados al azar a travs del nucleoplasma? 9. Comparar y contrastar el efecto de una supresin en el gen operador del opern de lactosa con una en el operador del opern de histidina. 10. Si se encuentra un mutante de . coi; que produjo cadenas continuas de polipptidos que contienen /?-galactocidasa y galactcido permeasa (codificado por el gene i/), cmo se explicara esto?

544

CAPITULO 12 Ndeo de la clula y control de la expresin de genes tura notablemente similar, la cual se superpone sobre claras diferencias en su secuencia de aminocidos. Por qu sera de esperar que diferentes protenas reguladoras de genes muestren estas notables similitudes y por qu sera de esperar diferencias claras? 14. Mencione dos mecanismos empleados por las clulas para producir un gran nmero de polipptidos diferentes a partir de un nmero limitado de genes. En trminos moleculares, en qu difieren estos mecanismos entre s? 15. Supongamos que se trabaja con una estirpe celular que muestra un nivel muy bajo de sntesis de protenas, y se sospecha que las clulas son sometidas a control inhibidor global de la traduccin. Qu experimentos se deben realizar para determinar si ste es el caso?

11. Se sospecha que una nueva hormona que se est probando funciona para estimular la sntesis de miosina al actuar a nivel de la transcripcin. Qu tipo de evidencia experimental se necesita para apoyar esta afirmacin? 12. Supongamos que se efecta una serie de experimentos en los cuales se trasplantan ncleos de diferentes tejidos de adultos a un huevo de anfibio enucleado y activado, y se observa que el huevo no se desarrolle ms all de la etapa de blstula. Se podra concluir que el ncleo trasplantado ha perdido los genes necesarios para el desarrollo posterior a la blstula? Por qu s o por qu no? Por qu razn este tipo de experimentos proporciona generalmente ms informacin para la interpretacin de resultados negativos? 13. Ciertas protenas reguladoras de genes poseen una estruc-

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CAPITULO

13

Duplicacin y reparacin

del DNA
13-1 Duplicacin del DNA 13-2 Reparacin del DNA La perspectiva humana: Deficiencias en la reparacin por excisin de nucletidos en el ser humano La va experimental: Papel de las deficiencias en la reparacin por excisin de nucletidos en el ser humano en la investigacin para reparar el DNA

a capacidad de reproducirse es una de las propiedades L fundamentales de todas las especies vivientes. Este proceso de duplicacin se puede observar en varios niveles: los organismos lo hacen por reproduccin sexual o asexual; las clulas, por divisin celular; y el material gentico se autorreproduce por duplicacin (autorreproduccin). El mecanismo que usan las clulas para la duplicacin tambin tiene capacidad para efectuar otras acciones: reparar el material gentico despus que ha sufrido diferentes tipos de dao. Estos dos procesos, duplicacin y reparacin del DNA, sern el tema de este capitulo. Se supone que la capacidad de aureduplicacin es una de las propiedades fundamentales que aparecieron al principio del camino hacia la evolucin de las primeras formas primitivas de vida. Sin la capacidad de propagarse, cualquier ensamblado primitivo de molculas biolgicas estaba destinado a desaparecer. Los primeros portadores de informacin gentica probablemente fueron molculas RN A con capacidad de autoduplicacin (pg. 459). Conforme progres la evolucin y las molculas de RNA prepararon el camino a las molculas de DNA como material gentico, el proceso de duplicacin se fue haciendo cada vez ms complejo, requiriendo numerosos materiales auxiliares. Por lo tanto, aunque una molcula de DNA contiene la informacin para su propia duplicacin, carece de la capacidad para ejecutar la actividad por s misma. Segn escribi recientemente Richard Lewontin: "La imagen comn del DNA como molcula autorreproductora es casi tan cierta como describir una carta como documento autoduplicante. La carta necesita una fotocopiadora; el DNA necesita una clula." Veamos entonces cmo se las arregla una clula para efectuar esta tarea.

FIGURA 13-A. Modelo de tina porcin de la enzima bacteriana DNA poliinemsa ! (mostrada en mnano) formando un complejo con DNA. La plantilla de la cadena de DNA se muestra en azul y la cadena iniciadora a la cual se aadirn los subsecuentes nncletidos se muestra en rojo. (Cortesa de Thonias A. Steitz, Yale University.)

546

CAPITULO 13 Duplicacin y reparacin del DNA

547

13-1 Duplicacin del DNA

En 1953, Watson y Crick formularon la estructura de DNA y la acompaaron de una proposicin para explicar su "autoduplicacin". La proposicin se apoy en los puentes de hidrgeno que mantienen enlazada la doble cadena. Individualmente, estos puentes de hidrgeno son dbiles y fciles de romper. Watson y Crick percibieron que la duplicacin ocurre por la separacin gradual de las cadenas de la doble hlice (fig. 13-1), causada por la destruccin sucesiva de los puentes de hidrgeno, algo muy parecido a la separacin de las dos mitades de un cierre automtico (zpper). Puesto que las dos cadenas son complementarias entre s, cada una contiene la informacin necesaria para construir la otra cadena. Por lo tanto, una vez separadas las cadenas, cada una acta como plantilla para dirigir el ensamblado de los nucletidos necesarios para formar la cadena complementaria y restablecer su estado de doble cadena. Naturaleza semiconservadora de la duplicacin En la propuesta de Watson y Crick para explicar la duplicacin se desprenden ciertas predicciones relacionadas con la conducta del DNA durante la duplicacin; lo ms mpor-

Vieja

Vieja

Vieja Nueva

Nueva

Vieja

FIGURA 13-1. Proposicin original de Watson y Crick para la duplicacin de una molcula de DNA de doble hlice. Durante la duplicacin, la doble hlice se desenrolla y cada una de las cadenas progenituras sirve como plantilla para ensamblar una nueva cadena complementaria.

tante es la separacin fsica de las cadenas progenituras durante el proceso. Segn la propuesta, cada una de las dobles cadenas hijas debe componerse de una cadena completa procedente de la doble cadena progenitura y una cadena completa recin sintetizada. La duplicacin de este tipo (fig. 13-2, esquema 1) se conoce como semiconservadora, puesto que cada clula hija recibe una mitad de la estructura original. En ausencia de informacin acerca del mecanismo encargado de la duplicacin, se deben considerar otros dos tipos de duplicacin. En un caso, el de la duplicacin conservadora (fig. 13-2, esquema 2), las dos cadenas originales permaneceran juntas (luego de servir como plantillas) al igual que las dos cadenas recin sintetizadas. Como resultado, una de las clulas hijas slo contiene la doble cadena conservada en su totalidad, en tanto que la otra clula hija slo contiene DNA recin sintetizado. En el tercer caso, el de la duplicacin dispersiva (fig. 13-2, esquema 3), la integridad de cada una de las cadenas progenituras estara interrumpida. Como resultado, las clulas hijas contienen dobles cadenas en las cuales cada una se compone de DNA antiguo y nuevo, o sea, ni las cadenas ni las dobles cadenas en s se conservan. Para decidir entre estas tres posibilidades es necesario distinguir las cadenas de DNA recin sintetizadas de las cadenas DNA originales que sirvieron como plantillas. Esto se logr por primera vez en 1958 en estudios efectuados sobre bacterias por Matthew Meselson y Franklin Stahl, del California Institute of Technology (fig. 13-3). Estos investigadores desarrollaron bacterias durante muchas generaciones en un medio que contena 15N-cloruro de amonio como nica fuente de nitrgeno. Por consiguiente, las bas^s nitrogendas del DNA de estas clulas slo contenan el istopo pesado de nitrgeno. Los cultivos de bacterias "pesadas" se lavaron para liberarlas del medio antiguo e incubaron en un medio fresco con compuestos que contenan 14N, y luego se quitaron muestras a intervalos crecientes durante un periodo de varias generaciones. Se extrajo el DNA de las muestras de bacterias y se someti a centrifugacin con cloruro de cesio (seccin 17-11). La posicin donde se encuentra una molcula particular de DNA en equilibrio dentro de un gradiente de densidad de cloruro de cesio se relaciona directamente con su densidad de ascenso, que en este caso est directamente relacionada con el porcentaje de tomos 15N en oposicin a los tomos 14N. Si la duplicacin es semiconservadora, sera de esperar que la densidad del DNA disminuyera gradualmente hasta el punto que se alcanzara la edad de una generacin (fig. 13-3, a). Esta disminucin de la densidad debe ocurrir conforme se sintetizan cadenas ligeras junto con cadenas pesadas. Despus de una generacin, todas las molculas de DNA deben ser hbridos 15N-14N, y su densidad de ascenso debe ser igual a la mitad de la que se estima para el DNA totalmente pesado y el DNA totalmente ligero (fig. 13-3, a). Conforme contina la duplicacin despus de la primera generacin, las cadenas recin sintetizadas slo siguen conteniendo istopos ligeros, y aparecen dos tipos de dplex en los gradientes: los que contienen hbridos 15N-14Na y los que contienen slo 14Na. A medida que transcurre el tiempo de crecimiento en e! medio ligero, un porcentaje cada vez mayor de las molculas de DNA presentes sern ligeras. Sin embargo, si la

548

CAPITULO 13 Duplicacin y reparacin del DNA

Molculas de DNA progenituras

Molculas de DNA de la primera generacin de descendientes

Molculas de DNA de la segunda generacin de descendientes

DUPLICACIN SEMICONSERVADQRA

Molculas de DNA progenituras

duplicacin contina siendo semiconservadora, las cadenas pesadas progenituras originales deben permanecer intactas y presentes en las molculas de DNA hbridas que representan cada vez un porcentaje ms y ms pequeo del DNA total (fig. 13-3, a). Los resultados de los experimentos del gradiente de densidad obtenidos por Meselson y Stahl se muestran en la figura 13-3, b, e indican que la duplicacin ocurre de manera semiconservadora. En la figura 13-3, a, se presentan los resultados que se obtendran si la duplicacin ocurriera por mecanismos conservadores o dispersivos. Pronto se demostr que la duplicacin semiconservadora tambin ocurre en clulas eucariotas. El dibujo y la fotografa de la figura 13-4 muestran los resultados de un experimento en el cual se permiti que las clulas de mamfero cultivadas sufrieran dos ciclos de duplicacin en bromodesoxiuridina (BrdU), un compuesto que se incorpora al DNA en lugar de timidinas. Cada cromosoma se forma a partir de dos cromtides: una cromtide compuesta de dos cadenas que contienen BrdU, en tanto que la otra cromtide es un hbrido con cadenas de BrdU y una cadena que contiene timidina. Esta ltima se presenta como parte de la molcula progenitura original del DNA antes de aadir BrdU al cultivo. Duplicacin en clulas bacterianas

Molculas de DNA de la primera generacin de descendientes

Molculas de DNA de la segunda generacin de descendientes

En esta seccin del captulo se tratan los mecanismos de duplicacin en clulas bacterianas, puesto que son ms fciles de entender que en los eucariotes. Los avances en la investigacin de bacterias fueron impulsados por ciertas tcnicas genticas y bioqumicas que, hasta recientemente, no se podan emplear para estudiar sistemas eucariotes. Entre stos se incluye: Disponibilidad de mutantes incapaces de sintetizar una u otra protena necesaria para el proceso de duplicacin. El aislamiento de mutantes incapaces de duplicar sus cromosomas puede parecer paradjico: cmo se pueden cultivar clulas con este defecto? Las clulas mutantes incapaces de sintetizar un metabolito particular se pueden cultivar suministrndoles el compuesto requerido, pero nada se puede proporcionar a mutantes deficientes en una protena requerida para su duplicacin que les permita superar su deficiencia. La solucin a este tipo de dificultad experimental se resuelve aislando mutantes sensibles a temperatura (s). La deficiencia slo se manifiesta en el mutante cuando la temperatura se eleva hasta cierto punto, denominada temperatura no permisiva. Cuando crecen a una temperatura menor (permisiva), el mutante puede producir su protena de manera satisfactoria, lo bastante para efectuar la actividad requerida, y las clulas continan creciendo y dividindose. Los mutantes sensibles a temperatura se pueden aislar prcticamente para cualquier actividad fisiolgica y tienen particular importancia en el estudio de la sntesis de DNA conforme ocurre la duplicacin, la reparacin de DNA y la recombinacin gentica. Desarrollo de sistemas in vitro donde se pueda estudiar la duplicacin utilizando componentes celulares puri-

DUPLICACIN CONSERVADORA

Molculas de DNA progenituras

Molculas de DNA de la primera generacin de descendientes

Molculas de DMA de la segunda generacin de descendientes

DUPLICACIN DISPERSIVA

FHillKA 13-2. Tres esquemas alternativos de dupiicacin. En el esquema 1 se muestra la duplicacin semiconservadora; en el esquema 2 la duplicacin conservadora, y en el esquema 3 la duplicacin dispersiva. En el texto se describen los tres modos alternativos de duplicacin.

CAPITULO 13 Duplicacin y reparacin del DNA Experimento nmero

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Generaciones

Progenitor
Transferencia a 14N

Generaciones

DNA 14N ligero

DNA
14 N' 5 N 15N

(a)

hbrido pesado

DNA

Semiconservadora
2.5

(b)

3.0

Conservadora

4.1

(c)

O y 1.9 mezclados O y 4.1 mezclados

(a)

Dispersiva

(b)

FUHli.4 13-3. Demostracin experimental de que la duplicacin del DNA es semiconservadora en bacterias. En diferentes etapas del experimento se extrajo DNA de las bacterias, se mezcl con una solucin concentrada de la sal cloruro de cesio (CsCl), se coloc en un tubo de centrifuga y se centrifug a alta velocidad hasta alcanzar el equilibrio. Los iones de cesio tienen masa atmica suficiente para ser afectados por la fuerza centrfuga, y establecen un gradiente de densidad durante el periodo de centrifugacin con la menor concentracin (menor densidad) de Cs en la parte de arriba del tubo y la mayor concentracin (mayor densidad) en el fondo del tubo. Durante la centrifugacin, los fragmentos DNA situados dentro del tubo se localizan en puntos donde la densidad es igual a su propia densidad, lo que a su vez depende de la relacin 15N/14N presente en sus nucletidos. Cuanto mayor sea el contenido de 14N, mayor ser la altura de los fragmentos de DNA en el tubo al final del periodo de centrifugacin, a) Resultados esperados en este tipo de experimento para cada uno de los tres posibles esquemas de duplicacin. El tubo situado a la izquierda indica la posicin del DNA progenitor y las posiciones de las bandas correspondientes a fragmentos de DNA totalmente ligeros o hbridos, b) Resultados experimentales obtenidos por Meselson y Stahl. La aparicin de una banda hbrida y la desaparicin de la banda pesada luego de una generacin elimina la posibilidad de duplicacin conservadora. La subsecuente aparicin de dos bandas, una ligera y otra hbrida, elimina el esquema dispersivo, (b: Segn M. Meselson y F. Stahl, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 44:671, 1958.)

ficados. En algunos estudios, la molcula de DNA que debe duplicarse se incuba con extractos celulares de los cuales se eliminan protenas especficas que se sospecha son esenciales. En otros casos, el DNA se incuba con varas protenas purificadas cuya actividad debe probarse. En conjunto, estas tcnicas revelaron la actividad de cuando menos 30 protenas diferentes necesarias para duplicar el cromosoma de E. coli. En el cuadro 13-1 se presenta una lista de algunas de las protenas implicadas en la duplieattv. b^cteriara. .TI Vas srgceTites pginas analizaremos las actividades de varias de estas protenas, cuyo papel est ahora claramente definido. En procariotes y eucariotes la

duplicacin ocurre por mecanismos muy similares, y por lo tanto casi toda la informacin presentada en el anlisis de la duplicacin bacteriana tambin se aplica a clulas eucariotas.
Bifurcaciones de duplicacin y duplicacin bidircccional

Segn el esquema semiconservador de duplicacin, la separacin del par de cadenas de la doble hlice se acompaa de la sntesis de un par de cadenas complementarias. A principios del decenio de 1960, John Cairns, de Cold Spring Harbor Laboratories, desarroll una tcnica autorradiogrica que suministr una notable imagen visual de este proceso. Cairns observ que se podan Usar bacterias con cuidado y dispersar sus cromosomas sobre una superficie sin

550

CAPITULO 13 Duplicacin y reparacin de! DNA

Cromosoma

Cadena de DNA

VLV Cromosoma que slo contiene timidina

Duplicado en BrdU

Cromtide

Ambas cromtides contienen una cadena con BrdU y una cadena con timidina Duplicacin continuada en medio que contiene BrdU

Una cromtide de cada cromosoma contiene timidina

(a)

(b)

FIGURA 13-4. Demostracin experimental de que la duplicacin de DNA es semiconservadora en clulas eucariotas. a) Diagrama de los resultados de un experimento en el cual se permiti a las clulas sufrir una vuelta de duplicacin en un medio con timidina y despus se le transfiri a un medio con BrdU para las siguientes vueltas de duplicacin. Las cadenas de DNA que contienen BrdU se muestran en rojo, b) Se muestran los resultados de un experimento similar al efectuado en a. En este experimento se desarrollaron clulas de mamfero en cultivo con BrdU durante dos vueltas de duplicacin antes de preparar cromosomas mitticos y teirlos por un procedimiento empleando colorantes fluorescentes y tincin de Giemsa. Con este procedimiento, las cromtides que contienen timidina en una o ambas cadenas se tien de color oscuro, en tanto que las cromtides que slo contienen BrdU se tien de color claro. La fotografa indica que despus de dos vueltas de duplicacin en BrdU, una cromtide de cada cromosoma duplicado slo contiene BrdU, en tanto que la otra cromtide contiene una cadena de DNA marcada con timidina. (Se observa que algunos de los cromosomas intercambian partes homologas entre cromtides hermanas. Este proceso de intercambio de cromtides hermanas es comn durante la mitosis, pero no se analiza en el texto.) (b: Cortesa de Sheldon Wolff.)

manipulacin adicional. Si las bacterias eran desarrolladas en 3H-timidina antes de preparar los cromosomas, entonces la autorradiografa con microscopio de luz poda revelar la silueta de las cadenas de DNA marcadas, aunque la resolucin del microscopio de luz fuera insuficiente para ver !as propias molculas. Las autorradiografas de este tipo (fig. 13-5) confirmaron la naturaleza circular de los cromosomas bacterianos y revelaron el patrn ntegro de la duplicacin. En muchos casos se form una silueta granulosa plateada denominada estructura theta (0). En este perfil sera de esperar que una doble cadena circular fuera sorprendida en el acto de la duplicacin, como se ilustra en la figura 13-6. Cada estructura theta se compone de tres DNA de longitud distinta, uno de los cuales representa la porcin no duplicada del cromosoma y las otras dos el par de molculas hijas

en proceso de formacin. Los puntos donde el par de segmentos duplicados se unen con los segmentos no duplicados se denominan bifurcaciones de duplicacin. Cada bifurcacin de duplicacin corresponde a un sitio donde: 1) la doble hlice progenitura sufre la separacin de las cadenas y 2) se incorporan nucletidos a las cadenas complementarias recin sintetizadas. Segn estas primeras autorradiografas y muchos estudios subsecuentes, se aclararon varios puntos generales. La duplicacin comienza en un sitio especfico sobre el cromosoma bacteriano denominado origen. El origen de a duplicacin sobre los cromosomas de E. coli es una secuencia de casi 245 pares de bases llamada oriC, a la cual se unen algunas protenas para iniciar el proceso de duplicacin (vase figura 13-17 para una vista detallada). Por lo tanto, un sitio

CAPITULO 13 Duplicacin y reparacin del DNA CUADRO 13-1. Protenas y genes que participan en la duplicacin del DNA en E. coli Protena DnaA DnaC IHF

551

Gen
dnaA dnaC himA hip f,s hupA hupB rpoA
R fi-ii/i ulfLf

Funcin Protena iniciadora: enlaza oriC; promueve la abertura de la doble hlice; carga el DnaB Forma complejos con DnaB; suministra DnaB al DNA Secuencia especfica de la doble cadena DNA que se enlaza a protenas; se enlaza a oriC Secuencia especfica de la doble cadena DNA que se enlaza a protenas; se enlaza a oriC Protena que se enlaza de manera inespecfica a la doble cadena DNA Activacin de la transcripcin de oriC y oriX, iniciador de la cadena delantera de ColEl

flS HU
RNA polimerasa

.p ft

DnaK DnaJ GrpE DnaB Primasa SSB ssb PriA priA priC PriC dnaT DnaT Holoc-nzima DNA polimerasa III dnaE a dnaQ e holE & dnaX t dnaX holA holB 6' IwlC IwlD dnaD poA Pol 1 RNasa H Ligasa Girasa Topo IV

rpoC rpoD dnaK ana] grpE dnaB dnaG

Protena de choque de calor: desensambladora del complejo orA; monomerizacin de Pl RepA Protena de choque de calor: marcado de protenas por accin de DnaK Protena de choque de calor: forma complejos con DnaK Helicasa 5' -> 3' y activadora de primasa Iniciador de la sntesis Se enlaza a cadenas DNA sencillas Ensamblado del primosoma precedente tipo 0X; helicasa 3' -> 5' (factor n' o Y) Ensamblado del primosoma tipo 0X (protena n") Ensamblado del primosoma tipo 0X fprotena i o factor X) Polimerasa 3' > 5' exonucleasa Se desconoce Dimerizacin de partculas centrales

Complejo y; carga de /? dependiente de ATP sobre el extremo iniciador

rnh lig girA girB parC parE

Factor de procesamiento: "pinza deslizante" Eliminacin del iniciador y llenado de la brecha; sntesis inicial de la cadena delantera sobre ColEl Eliminacin del iniciador; procesamiento del iniciador para la sntesis de la cadena delantera sobre ColEl Unin de los fragmentos DNA nacientes Polimerasa tipo II; eslabn giratorio durante la duplicacin, superhlice DNA, desencadenamiento Desencadenamiento; posiblemente topoisomerasa II Enlace de protena Ter: detencin de la bifurcacin de duplicacin

TBP

tus

FUENTE: T.A. Baker y S.H. Wickner. Reproducido con permiso de Annual Review ofGenetics, vol. 26 1992 por Annual Reviews, Inc.

de origen para la duplicacin es anlogo de muchas maneras a un promotor para la transcripcin, porque ambos tipos de secuencias reguladoras actan como sitios de enlace para protenas especficas que se enlazan a una secuencia de DNA iniciadora de la sntesis de DNA o de RNA en un sitio especfico a lo largo de la plantilla, Una vez iniciada, la duplicacin prosigue alejndose del origen en ambas direcciones, o sea, en forma bidireccional (fig. 13-6). Las dos confluencias de duplicacin se desplazan en direcciones opuestas hasta que encuentran un punto del crculo separado del origen, donde la duplicacin concluye. Las dos nuevas cadenas duplicadas se separan y por ltimo son orientadas al interior de dos clulas diferentes.

Propiedades de las DNA polimerasas

Iniciaremos el anlisis de los mecanismos de duplicacin del DNA describiendo algunas propiedades de las DNA polimerasas, las enzimas encargadas de construir nuevas cadenas de DNA. En el decenio de 1950, Arthur Kornberg, de la Universidad de Washington, inici el estudio de estas enzimas. En sus primeros experimentos Kornberg y sus colegas purificaron una enzima de extractos bacterianos que tena capacidad de incorporar precursores de DNA radiactivos en un polmero cido insoluble identificado como DNA. A esta enzima se le dio el nombre de DNA polimerasa (y despus, luego del descubrimiento de nuevas enzimas pol imerizan tes de DNA, se le conoci como DNA polimerasa I). Para que la

552

CAPITULO 13 Duplicacin y reparacin del DNA

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Bifurcacin de duplicacin

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FIGURA 13-6. Modelo de un cromosoma circular que sufre duplicacin semiconservadora bidireccional. Dos bifurcacins de duplicacin se mueven en direcciones opuestas a partir de un solo origen (flecha con dos cabezas). Las nuevas cadenas de DNA se muestran en rojo.

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los de la DNA polimerasa son trifosfatos de desoxirribonuclesido. Conforme se descubrieron ms propiedades de la DNA polimerasa, la situacin se complic ms. Cuando se probaron varios tipos de plantillas de DNA se observ que el DNA aadido tiene que satisfacer ciertos requerimientos estructurales para promover la incorporacin de precursores marcados (fig. 13-7). Por ejemplo, una molcula de DNA de doble cadena intacta no puede estimular la incorporacin. Esto no es sorprendente si se considera que como requisito las cadenas de la hlice deben estar preparadas para que ocurra la duplicacin. Sin embargo, era menos evidente por qu una molcula circular de una sola cadena tambin estaba desprovista de actividad; podra esperarse que esta sea una plantilla ideal para dirigir la elaboracin de una cadena complementaria. Por lo contrario, cuando se aade una molcula de DNA de doble cadena parcial a una mezcla de reaccin que contenga la enzima polimerizante y los precursores marcados, se observa de inmediato la incorporacin de nucletidos. La razn de que el crculo de cadena sencilla no tenga esta capacidad se debe a que la enzima no puede iniciar la formacin de una cadena de DNA. Ms bien, slo puede aadir nucletidos a la terminal 3' hdroxilo de una cadena existente. La cadena de DNA que suministra la enzima con la terminal 3' OH necesaria se denomina iniciadora. Todas las DNA polimerasas estudiadas hasta ahora poseen estos dos mismos requerimientos bsicos (fig. 13-8, a): una plantilla de cadena de DNA para copiar y una cadena iniciadora a la cual se pueden aadir nucletidos. El conocimiento de estos requisitos explica por qu ciertas estructuras de DNA no pueden promover la sntesis de DNA (fig. 13-7). Una

FIGURA 13-5. Visualizacin de la duplicacin en bacterias. Autorradografa de un cromosoma de E. coli que ha sufrido cerca de 1.8 vueltas de duplicacin en un medio que contiene 3H-timidina. La densidad de los granos plateados suministra una estimacin de la marca en esa porcin del cromosoma. La lnea punteada en el esquema representa una cadena no marcada; una lnea slida, una cadena marcada. Investigaciones posteriores revelaron que la duplicacin de un cromosoma bacteriano ocurre por el desplazamiento de un par de bifurcaciones de duplicacin a partir de un solo origen. (Segn John Cairns, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 28:44, 1963.)

reaccin proceda, la enzima requiere la presencia de DNA y de cuatro trifosfatos de desoxirribonuclesido (dTTP, dATP, dCTP y dGTP). El anlisis del producto radiactivo indica que el DNA sintetizado tiene la misma composicin de bases que el DNA no marcado originalmente aadido. Como era de esperar, las cadenas de DNA aadidas sirvieron como plantilla para la reaccin de polimerizacin suministrando las instrucciones para incorporar nucletidos. En principio, la DNA polimerasa cataliza una reaccin similar a la de una RNA polimerasa. Ambos tipos de polimerasa se desplazan a lo largo de una sola cadena de DNA leyendo cada nucletido de la plantilla e incorporando un nucletido complementario sobre el extremo de la cadena que se ensambla. As, la reaccin de ensamblado de una nueva cadena de DNA es prcticamente igual a la mostrada en la figura 11-5 para la sntesis de RNA, excepto que los precursores para RNA polimerasas son los trifosfatos de ribonuclesido, en tanto que

CAPITULO 13

553

p
ST AS

5' 3' 5' 5'

On
L LU
(a) (b)

T5'

DNA polimerasa Cadena de DNA nueva en construccin

FIGURA 13-7. Plantillas y no plantillas para la actividad de la DNA polimerasa. a) Ejemplo de estructuras de DNA que no estimulan la sntesis de DNA in vitro mediante la accin de la DNA polimerasa aislada de E. coli. b) Ejemplo de estructuras de DNA que sirven como plantillas e iniciadores para la enzima. En todos los casos las molculas de b contienen una cadena plantilla para copiar y una cadena iniciadora con un 3' OH sobre el cual se aaden nucletidos.

(b)
doble hlice lineal intacta suministra la terminal 3' hidroxilo pero carece de actividad de plantilla. En contraste, una sola cadena circular suministra una plantilla pero carece de la actividad del iniciador. La molcula parcial de doble cadena satisface ambos requerimientos y por lo tanto promueve la incorporacin de nucletidos. El hallazgo de que la DNA polimerasa no puede iniciar la sntesis de una cadena de DNA plantea una pregunta distinta: Cmo se inicia la sntesis de una nueva cadena en la clula? Retornaremos en breve a esta pregunta. La DNA polimerasa purificada por Kornberg mostr otra propiedad difcil de entender en trminos de su presunto papel como enzima duplicante: slo era capaz de sintetizar DNA en la direccin 5' a 3' (escrita 5' -> 3'). El primer diagrama presentado por Watson y Crick {fig. 13-1) incluye la esencia de lo que sera de esperar que ocurriera en la bifurcacin de la duplicacin. El diagrama sugiere que una de las cadenas recin sintetizadas es polimerizada en direccin 5' -> 3', en tanto que la otra cadena se polimeriza en direccin 3' -> 5'. Existe alguna otra enzima encargada de la construccin de cadenas 3' ~> 57 Esta enzima opera de manera diferente en la clula en comparacin con las condiciones in vitro? Tambin retornaremos a esta cuestin. Durante el decenio de 1960 hubo indicios de que la "enzima de Kornberg" no era la nica DNA polimerasa en una clula bacteriana. Luego, en 1969, se aisl una cepa murante de E. coli que mostr menos de 1% de la actividad normal de la enzima, pero que era capaz de multiplicarse a una tasa normal. Estudios posteriores rebelaron con clarFIGURA 13-lt. Incorporacin de nucletidos sobre el extremo 3' de una cadena en crecimiento por la accin de la DNA polimerasa. a) Polimerizacin de un nucletido sobre el extremo 3' de la cadena iniciadora. La seleccin del nucletido es determinada por la base del nucletido en la cadena plantilla, b) Diagrama que muestra la direccin del movimiento de la polimerasa a lo largo de dos cadenas plantilla.

dad que la enzima de Kornberg, o DNA polimerasa I, era una de tres DNA polimerasas distintas presentes en cluas bacterianas; a las otras se les denomin DNA polimerasa II y DNA polimerasa III. Una clula bacteriana tpica contiene enfere 300 y 400 molculas de DNA polimerasa I por clula y slo unas 40 copias de DNA polimerasa II y 10 copias de DNA polimerasa III. La presencia de DNA polimerasa II y III est enmascarada por la cantidad mucho mayor de DNA polimerasa I en la clula. Se descubri que de las tres enzimas, la DNA polimerasa III es la principal encargada de incorporar nucletidos durante la duplicacin del DNA (estudiado con mayor detalle en la pgina 557).l Pero el descubrimiento de otras DNA polimerasas no responde a las pre-

1 Con frecuencia esta enzima se refiere como holoenzima de DNA polimerasa III, lo que significa que la protena activa consta de varias subunidades accesorias adems de la propia polimerasa. El centro cataltico de la holoenzima de DNA polimerasa III consta de tres subunidades (a, e y S}. La holoenzima contiene siete subunidades adicionales, incluyendo la pinza deslizante /?, que se muestra en la figura 13-18.

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CAPITULO 13 Duplicacin y reparacin del DNA

guntas planteadas antes; ninguna de las tres enzimas puede iniciar cadenas de DNA, ni puede construir cadenas en direccin 3' > 5'.
Duplicacin semidiscontinua

La falta de actividad de polimerizacin en la direccin 3' > 5' tiene una explicacin ms directa: no se pueden sintetizar cadenas de DNA en dicha direccin. Ambas cadenas recin sintetizadas se ensamblan en la direccin 5' -> 3'. Las molculas de las polimerasas encargadas de construir las dos nuevas cadenas de DNA se mueven en direccin opuesta a lo largo de sus respectivas plantillas, ambas procedentes en direccin 3' > 5' a lo largo de la plantilla y construyendo una cadena que crece a partir de su terminal 5'-P (fig. 13-8). Por consiguiente, una de las cadenas recin sintetizadas crece haca la bifurcacin de duplicacin donde ias cadenas de DNA se separan, en tanto que la otra crece alejndose de la misma. Aunque esto resuelve el problema en relacin con una enzima que slo puede sintetizar una cadena en una direccin, genera un dilema an rns difcil. Es evidente que la cadena que crece hacia la confluencia se puede construir mediante adicin continua de nucletidos a su extremo 3'. Pero cmo se sintetiza la otra cadena? Pronto se consiguieron datos que indican que la cadena que crece alejndose de la confluencia de duplicacin se sinteti-

za de manera discontinua, o sea, como fragmentos (fig. 13-9). Antes de iniciarse la sntesis de un fragmento se debe exponer un tramo adecuado de la plantilla por desplazamiento de la bifurcacin de duplicacin. Una vez iniciada sta, cada fragmento crece alejndose de la bifurcacin de duplicacin hacia el extremo 5' de un fragmento previamente formado al cual se une posteriormente. Por lo tanto, las dos cadenas recin sintetizadas de las dobles cadenas hijas se sintetizan por procesos muy diferentes. La cadena sintetizada continuamente se denomina cadena adelantada porque su sntesis contina a medida que la confluencia de duplicacin avanza. Por lo contrario, la cadena sintetizada de manera discontinua se denomina cadena retrasada, porque el inicio de cada fragmento debe esperar que las cadenas progenituras se separen y expongan una plantilla adicional (fig. 13-9). Como se estudia en la pgina 557, tal vez ambas cadenas se sinteticen de manera simultnea, de modo que los trminos adelantada y retrasada no son apropiados como se pens cuando se acuaron por primera vez. Debido a que una cadena se sintetiza continuamente y la otra de manera discontinua, se dice que la duplicacin es semidiscontinua. Reiji Okasaki, de la Universidad Nagoya de Japn, fue quien descubri que una de las cadenas se sintetiza como fragmentos pequeos, segn diferentes tipos de experimentos con partculas marcadas. Okasaki observ que si se ad-

Bifurcacin de duplicacin

FIGURA 13-9. Las dos cadenas de una doble hlice se sintetizan mediante una secuencia diferente de acontecimientos. Las molculas de DNA polimerasa slo pueden desplazarse a lo largo de una plantilla 3' -> 5'. En consecuencia, las dos cadenas recin ensambladas crecen en direcciones opuestas, una hacia la bifurcacin de duplicacin y la otra alejndose de la misma. Una cadena se ensambla de manera continua, la otra en segmentos que deben unirse mediante accin enzimtica. a) Diagrama que muestra las diferencias en la sntesis de las dos cadenas. b) Micrografa electrnica de una molcula de DNA duplicante del bacterifago que se observa como estructura en forma de 3-. Las dos ramas de la izquierda son las partes duplicadas de la molcula y el extremo derecho es la porcin no duplicada. Se observa que la cadena retrasada del DNA duplicante contiene una porcin expuesta de cadena simple, indicada por la flecha, (b: Segiin . Wolfson y David Dressler, reproducido con permiso de Annual Review of Microbiology, vo. 29 1975 por Annual Reviews Inc.)

CAPITULO 13 Duplicacin y reparacin del DNA

555

ministran a las bacterias pulsos breves de 3H-timidina y de inmediato se les da muerte, gran parte de la radiactividad se poda encontrar corno partes de fragmentos de DNA pequeos, de unos 1 000 a 2 000 nucletidos de longitud. Por lo contrario, si despus del pulso corto haba un breve periodo de seguimiento, la radiactividad formaba parte de molculas de DNA mucho mayores (fig. 13-10). Estos datos indican que una parte del DNA se construye en segmentos pequeos (llamados posteriormente fragmentos Okasaki) que rpidamente se unan a piezas ms grandes sintetizadas previamente. La enzima encargada de unir los fragmentos Okasaki y formar una cadena continua se denomina DNA ligasa. AI descubrirse que la cadena retrasada se sintetiza por pedazos, las dificultades para explicar el inicio de la sntesis fueron aun mayores. Cmo se inicia fa formacin efe cada

Velocidad de sedimentacin
20 40 60 S

120seg

uno de estos fragmentos si ninguna de las polimerasas de DNA puede iniciar la cadena? Pronto se descubri c^ue el inicio no se debe a la DNA polimerasa, sino ms bien a una enzima que construye un primer compuesto corto de RNA, o de DNA. La cadena retrasada, cuya sntesis comienza en el origen de la duplicacin, al parecer se inicia por la accin de RNA polimerasa, la misma enzima encargada de sintetizar todo el RNA de las clulas bacterianas. La RNA polimerasa sintetiza un RNA iniciador corto, que en seguida se extiende gracias a la accin de la DNA polimerasa. En contraste, el RNA iniciador corto que comienza la sntesis de cada fragmento Okasaki de la cadena, retrasada es ensamblado por un tipo distinto de RNA polimerasa conocida como primasa. Los segmentos cortos de RNA situados en el extremo 5' de fa cadena defantera y en ef extremo 5' de cada fragmento Okasaki son eliminados subsecuentemente y la brecha resultante en la cadena se llena con DNA y despus se sella. Estos sucesos se ilustran esquemticamente en la figura 13-11. La formacin de iniciadores RNA transitorios durante el proceso de duplicacin del DNA es una actividad curiosa. Quiz sea mayor la probabilidad de cometer errores durante el inicio que durante el alargamiento, y el empleo de un segmento de RNA corto retirable evita la inclusin de bases no coincidentes. Bifurcacin de la duplicacin Duplicacin significa algo ms que la simple incorporacin de nucletidos. La formacin de una molcula helicoidal de doble cadena circular (o de una molcula de DNA lineal gigante dentro de un cromosoma eucariota) plantea problemas topolgicos mayores. Para entender las dificultades consideraremos brevemente una analoga entre un DNA dplex y una tira helicoidal de doble cadena. Consideraremos lo que ocurre si se coloca un pedazo lineal de esta tira sobre el piso, sosteniendo las dos cadenas por uno de sus extremos, y a continuacin se tira de las cadenas para separarlas justamente como se tira del DNA para separarlo durante la duplicacin. Se puede notar que la separacin de las cadenas de una doble hlice constituye tambin un proceso de desenrollamiento de la estructura. En el caso de la tira, que tiene libertad para girar alrededor de su eje, la separacin de las cadenas a partir de un extremo se acompaa de un movimiento de rotacin de toda la fibra como medio de oponerse al desarrollo de tensin dentro de la estructura. Consideremos ahora el resultado de separar las cadenas si el otro extremo de la tira se encuentra fijo a un gancho sobre la pared (fig. 13-12). En estas circunstancias, la separacin de las cadenas a partir de su extremo libre genera una fuerza de torsin creciente en la tira y provoca que la porcin no separada se enrolle cada vez ms apretadamente. La separacin de las dos cadenas de una molcula de DNA circular (o una molcula lineal que no sea libre de girar, como ocurre en un gran cromosoma eucariota) es anlogo a tener un extremo de la molcula lineal fijo en la pared; en todos estos casos, la tensin desarrollada dentro de la molcula no puede liberarse por rotacin de toda la molcula. Por consiguiente, el DNA situado en la parte posterior de la confluencia de duplicacin comienza a formar una superhlice positiva (pg. 400). Si se conside-

Distancia desde arriba F K I K A 13-10. Resultado de un experimento para demostrar que parte del DNA se sintetiza en forma de fragmentos pequeos. Perfil de densidades en un gradiente de sacarosa del DNA procedente de un cultivo de clulas de E. coli infectadas por un fago. Las clulas se marcaron durante perodos cada vez ms prolongados y se determin la velocidad de sedimentacin del DNA marcado. Cuando se prepar DNA despus de pulsos muy breves, un porcentaje significativo de la radiactividad apareci en pedazos muy cortos del DNA (representados por el pico cerca de la parte de arriba del tubo a la izquierda). Luego de periodos ms prolongados, los fragmentos marcados con DNA se unieron a molculas de peso molecular ms elevado. (Segn R. Okazaki y cois. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Bioi. 33:130, 1968.)

556

CAPITULO 13 Duplicacin y reparacin del DNA

Des en rolla miento

Sntesis de un iniciador Alargamiento por DMA polimerasa III

Ligadura

Eliminacin del iniciador y llenado de la abertura con DMA polimerasa I

FIGURA 13-11. Empleo de fragmentos de RNA cortos como iniciadores removibles para iniciar la sntesis de cada fragmento de Okasaki de la cadena retrasada. En el dibujo se indican los primeros pasos. En las siguientes figuras se indica el papel de varias protenas accesorias en esta actividad. (Segn T. Ogaiva y T. Oknjnki, reproducido con permiso de Annual Review of Biochemistry, volume 49 1980 por Annual Reviews Inc.)

ra que el cromosoma circular completo de E. coli contiene casi 400 000 vueltas y se duplica en 40 minutos a partir de dos confluencias, ser aparente la magnitud del problema. En la pgina 401 se hizo notar que las clulas contienen enzimas, denominadas topoisomerasas, capaces de cambiar el estado de superhlice en una molcula de DNA. Una enzima de este tipo, denominada DNA girasa, desempea un papel crtico para aliviar a tensin formada durante la duplicacin desplazndose a lo largo del DNA y actuando como "eslabn giratorio" que cambia la superhlice positiva del DNA en una superhlice negativa de DNA. La enzima puede efectuar esta notable proeza desdoblando ambas cadenas del DNA dplex, pasando un segmento del DNA a travs de la doble cadena rota hacia el otro lado y luego sellando las partes cortadas, proceso que es gobernado por la energa liberada durante la hidrlisis de ATP (fig. 13-13). Se piensa que la conversin de una superhlice de DNA positiva a negativa tiene importancia para las actividades que ocurren en la bifurcacin de duplicacin. La superhli-

FIGURA 13-12. Efecto del desenrollamiento de una cuerda de dos hilos que tiene un extremo unido a un gancho. Se origina el mismo problema cuando se intenta desenrollar una molcula de DNA circular de doble cadena.

ce de DNA se encuentra sometida a estrs mecnico y, por consiguiente, almacena la energa que le confiere una tendencia persistente a desenrollar regiones localizadas de la hlice. Como resultado, la superhlice de DNA negativa en la bifurcacin de duplicacin se encuentra lista para iniciar el desenrollamiento y la separacin. Incluso a pesar de esta fuerza motriz impulsora, el desenrollamiento del dplex y la separacin de las cadenas requiere la ayuda de dos tipos diferentes de protenas que se enlazan al DNA, una helicasa fo protena desenrolladora de DNA) y protenas nicas enlazadas a cadenas de DNA. Las helicasas efectan el desenrollamiento del dplex mediante una reaccin en la cual se emplea la energa liberada por hidrlisis de ATP para romper los puentes de hidrgeno que mantienen unidas a las dos cadenas. E. coli posee cuando menos 11 helicasas diferentes que emplea en varios aspectos del metabolismo del DNA. Una de estas protenas, el producto del gen dnaB, sirve en la duplicacin como la principal protena desenrolladora abriendo e) dplex para exponer fa cadena sencilla de DNA requerida como plantilla por la polimerasa. La helicasa se fija primero al DNA en el origen de la duplicacin y se desplaza en direccin 5' - 3' a lo largo de la plantilla de la cadena retrasada (fig. 13-14), desdoblando la hlice conforme avanza. La separacin de las cadenas se facilita por la fijacin de las protenas enlazadas a la cadena sencilla a las cadenas desnudas de DNA (fig. 13-14). Estas protenas se enlazan selectivamente al DNA de cadena sencilla, conservndolo en estado extendido y evitando que se vuelva a enrollar. Recordemos que una enzima especial denominada primasa tiene el papel de iniciar la sntesis de cada fragmento Okazaki. En las bacterias, la primasa y la helicasa estn ntimamente relacionadas, formando lo que se denomina "primosoma". El prirnosoma se desplaza a lo largo de la plantilla de la cadena retrasada de manera progresiva (o sea, sin separarse de la plantilla de la cadena durante el tiempo que persiste la bifurcacin de duplicacin). Conforme la helicasa "viaja" a lo largo de la plantilla de la cadena retrasada, abriendo las cadenas del dplex, la primasa acom-

CAPITULO 13 - Duplicacin y reparacin de! DNA

557

Rotura del DNA en a doble cadena

La girasa pasa al segmento de enfrente a travs de la rotura

La rotura se vuelve a sellar en e! sitio de entrecruzamiento

FIGURA 13-13. Modelo para el mecanismo de accin de una DNA girasa. La DNA girasa es una topoisomerasa de tipo II (pg. 401). En este ejemplo particular, la DNA girasa se aade a una molcula de DNA circular de doble cadena (paso 1). En el paso 2 la girasa se une al DNA en uno de los sitios de entrecruzamiento, envuelve un segmento de 105 a 140 pares de bases enrollndose sobre s misma. En el paso 3, la girasa rompe un tramo de la doble cadena de DNA en la parte posterior del nudo positivo y pasa el segmento de enfrente a travs de la rotura, invirtiendo el signo de la superhlice (paso 4). En el paso 5, la rotura se vuelve a cerrar en la parte de adelante del sitio de entrecruzamiento.

panante inicia la sntesis de fragmentos de la cadena retrasada sintetizando iniciadores RNA cortos peridicamente en-sitios especficos a lo largo de !a plantilla de la cadena retrasada. Como se hizo notar antes, los iniciadores RNA se extienden subsecuentemente como DNA medante la accin de la DNA polmerasa. En la figura 13-15 se muestra un dibujo esquemtico del papel de todas las protenas descritas antes. Puesto que el inicio, el alargamiento y conclusin de los fragmentos de Okazaki ocurren con suma rapidez, se plantea la pregunta acerca de que si la misma molcula de DNA polmerasa III se emplea en la sntesis de los sucesivos fragmentos de la cadena retrasada o se recluan nuevas molculas de polmerasa en el citoplasma. Se ha intentado responder a esto mediante experimentos in vitro en los cuales la mezcla de reaccin del DNA duplicante se diluye sbitamente. Si la polimerasa permanece unida al DNA conforme se sintetizan fragmentos sucesivos de Okazaki, entonces la dilucin del medio no debe afectar su actividad. Por lo contrario, si se recluan nuevas molculas de polime-

DNA helicasa Cadena retrasada Movimiento de la bifurcacin Protelna que se enlaza a cadenas simples Cadena adelantada

rasa del medio, la dilucin debe hacer mucho ms lenta la sntesis de la cadena retrasada. Los resultados de estos experimentos apoyan la primera propuesta; una sola molcula de polimerasa III es reciclada desde el sitio donde acaba de concluir un fragmento de Okazaki hacia el siguiente sitio a lo largo de la plantilla de la cadena retrasada, donde volver a iniciar la tarea de alargamiento del iniciador RNA corto que acaba de situarse bajo el primosoma. El examen del diagrama de la figura 13-15 indica que el reciclamiento de la polimerasa hacia el siguiente fragmento de Okazaki requiere que la enzima se desplace hacia la bifurcacin de duplicacin. Se cree que la enzima logra esto "aprovechando un viaje" con el mecanismo de duplicacin de la plantilla de la cadena delantera que se desplaza en esa direccin. Aunque las dos polimerasas se mueven en direcciones opuestas a lo largo de sus respectivas cadenas, pueden actuar como si fueran parte del mismo complejo de protenas. Probablemente esto se logre manteniendo el DNA de la plantilla de la cadena retrasada en forma de asa inversa, lo que provocara que esta plantilla tenga la misma orientacin que la plantilla de la cadena delantera. Esto, a su vez, permitira que ambas polimerasas se desplacen como parte de un solo complejo de duplicacin, o replisoma (fig. 13-16, a), sin violar la "regla de direccionalidad" 5' 3' para la sntesis de la cadena de DNA. Una vez que la polimerasa ensambladura de la cadena retrasada alcanza el extremo 5' del fragmento de Okazaki sintetizada durante la vuelta previa, la plantilla de la cadena retrasada al parecer se libera (fig. 13-16, b) y posteriormente la polimerasa comienza a trabajar a nivel del iniciador RNA del siguiente fragmento de Okazaki situado a lo largo de la lnea (fig. 13-16, c),
Inicio y conclusin de la duplicacin

FIGURA 13-14. Papel de la DNA helicasa y de las protenas que se enlazan a la cadena sencilla en la bifurcacin de duplicacin. La helicasa se desplaza a lo largo del DNA y cataliza el desenrollamiento controlado por el ATP dplex. Conforme se desenrolla el DNA, las cadenas no pueden volver a unirse para reconstituir el dplex por la accin de las protenas de cadenas nicas enlazadas.

Nos hemos concentrado en las actividades que ocurren en la bifurcacin de duplicacin debido a que all es donde se sintetiza realmente el DNA. En la pgina 550 se hizo notar que la duplicacin comienza en un sitio especfico sobre el cromosoma bacteriano llamado oriC. Este sitio posee algu-

558

CAPITULO 13 Duplicacin y reparacin del DNA NMPr NMPd

Cadena retrasada Primosoma Protena dnaB (helicasa}. Protenas priA, B, C

3' ' 5'

Primasa Iniciador

gasa ~c

<><*>
-DNA polimerasa III, holoenzima

DNA polimerasa I

Topoisomerasa Helicasa Protena de cadenas nicas enlazadas a DNA ^**Z////, / 5 Cadena adelantada

3'
FIGURA 13-15. Resumen de las diferentes protenas que participan en actividades en la bifurcacin de duplicacin de E. coli. (Segn DNA Duplication por A. Kornberg y T.A. Baker. Copyright 1952 por W.H. Freeman & Company. Reimpreso con permiso.)

as caractersticas nicas que desempean un papel en el ensamblado del mecanismo para la duplicacin e inicio de la sntesis de cadenas de DNA. En la figura 13-17 se muestran los pasos de inicio de la duplicacin. El primer paso es el enlace de cerca de 30 copias de una protena iniciadora especfica para una secuencia repetitiva de nucletidos dentro del sitio oriC. Las molculas de la protena iniciadora forman un complejo con el DNA enrollado sobre su periferia, acontecimiento que induce a la separacin de las cadenas de DNA en un sitio adyacente rico en pares de bases A-T. La separacin de las cadenas va seguida por la entrada de una helicasa de DNA en la regin de una sola cadena, la fijacin de protenas enlazadas a DNA de cadenas sencillas, y el reclutamiento de las otras protenas necesarias para establecer una bifurcacin de duplicacin activa. Al parecer se ensamblan dos grupos de protenas de duplicacin en el origen, de modo que la bifurcacin de duplicacin puede proseguir en ambas direcciones a partir del origen. Las dos bifurcaciones de duplicacin finalmente se encuentran en una regin del cromosoma llamada ter, donde la duplicacin concluye, las enzimas duplicativas se desconectan de los sitios donde se asocian al DNA, y los dos cromosomas hijos se separan. Este ltimo proceso es mediado por una topoisomerasa especial. El control de la duplicacin se ejerce en el origen. Una vez ensamblado el mecanismo de duplicacin y que la bifurcacin de duplicacin se desplaza hacia afuera del origen, la duplicacin contina en la clula hasta que todo el cromosoma se duplica. Por lo tanto, si ocurre o no la duplicacin, depende del enlace de las protenas reguladoras en el origen.

Estructura y funcin de las DNA polimerasas An falta por responder la pregunta: por qu una bacteria requiere tres DNA polimerasas diferentes? Todas las DNA polimerasas (en procarotes y eucariotes) tienen la misma actividad cataltica bsica, que consiste en aadir desoxrribonucletidos sobre el extremo en crecimiento de un iniciador de cadena sencilla; sin embargo, difieren en cuanto a los papeles que puedan desempear dentro de la clula. Con base principalmente en el anlisis de diferentes tipos de cepas mutantes, se les pueden asignar los siguientes papeles. La enzima que acta en la formacin de la cadena de DNA durante la duplicacin en E. coli es la DNA polimerasa III, la cual, por este papel principal en la duplicacin, con frecuencia se le denomina replicasa. La holoenzima DNA polimerasa III (vase la nota del pie en la pgina 553) es mucho mayor que las otras dos polimerasas, contiene una sola subunidad cataltica y cuando menos nueve subunidades diferentes acompaantes con varias funciones en el proceso de duplicacin. Una de las subunidades no catalticas, denominada subunidad y?, al parecer se encarga de mantener a la polimerasa asociada a la plantilla de DNA. Las DNA polimerasas (igual que las RNA polimerasas} deben mostrar dos propiedades al parecer contrastantes. Tienen que permanecer asociadas a la plantilla sobre largos tramos para sintetizar una cadena complementaria continua. Al mismo tiempo, no se pueden fijar con tanta firmeza que les impida desplazarse de un nucletido a la plantilla del siguiente. Un par de subunidades/? que forman una estructura en forma de dona en a cual se extienden las molcula de

CAPITULO 13 Duplicacin y reparacin del DNA DNA polimerasa III, holoenzma Subunidad /3 SSB

559

RNA iniciador Fragmento de Okasaki en crecimiento

Cadena atrasada

Primosoma que sintetiza un iniciador RNA nuevo

Fragmento de Okasaki concluido

Iniciador RNA que ser sustituido con DNA por polimerasa I; muestra sellada por DNA ligasa

Fragmento de Okasaki recin iniciado

Fragmento de Okasaki viejo

FIGURA 13-16. Duplicacin de ambas cadenas, delantera y trasera, en E. cali efectuada por las DNA polimerasas que trabajan en conjunto en forma de un complejo nico, n) Las dos molculas de DNA polimerasa III (marcadas holoenzimas de DNA polimerasa) se mueven en la misma direccin, aunque avanzan hacia los extremos opuestos de sus respectivas plantillas. Esto se logra provocando la formacin de un asa en la cadena retrasada, b) La polimerasa se libera de la plantilla de la cadena retrasada cuando encuentra el fragmento de Okasaki previamente sintetizado. Esto puede suministrar la seal que indica al primosoma que inicie la sntesis del siguiente iniciador de RNA sobre la cadena retrasada, c) La polimerasa que participa en el ensamblado del fragmento de Qkasaki previo se vuelve a unir a la plantilla de la cadena retrasada a lo largo de su trayecto y sintetiza DNA sobre el extremo del iniciador RNA que justamente acaba de construir el primosoma.

Secuencia de DNA rica en A-T

OriC Protena iniciadora

Q Q Q
Protenas de la bifurcacin de duplicacin

FIGURA 13-1

Inicio de la duplicacin a nivel de oriC en E. culi. Los pasos se describen en el texto. (Segn K.J. Marinas, reproducido con permiso de Annual Review of Biochemistiy, volunte 62 1992 por Anima! Reviews Inc.)

560

CAPITULO 13 Duplicacin y reparacin del DNA

DNA a travs del agujero central (fig. 13-18, a) suministran estas propiedades contrastantes. Las subundades/3 se describen como "pinzas deslizantes" que permiten a la enzima moverse de un nucletido al siguiente sin separarse de la plantilla. Cuando la enzima alcanza el extremo de un fragmento de Okazaki, la polimerasa se desengancha de las

pinzas /3 y se une a unas nuevas pinzas que la esperan en un RNA iniciador situado hacia adelante (fig. 13-18, b). Todava no se conoce con certeza la funcin de la DNA polimerasa II. Se han aislado mutantes que carecen de esta polimerasa y no muestran deficiencia evidente. Se piensa que la DNA polimerasa I participa principalmente en la reparacin del DNA, proceso mediante el cual se corrigen las partes daadas de DNA (pg. 568). La DNA polimerasa I tambin es la enzima primaria que elimina a los iniciadores RNA en el extremo 5' de cada fragmento de Okazaki y lo sustituye por DNA (fig. 13-15). La capacidad de la enzima para efectuar esta tarea se analiza en la siguiente seccin.
Actividad de exonucleasa de las DNA polimerasas

(a)
5' 3

Plantilla de la cadena adelantada

Plantilla de la cadena atrasada

Para comprender el papel de las DNA polimerasas en la duplicacin, es necesario considerar otra propiedad de estas enzimas: su capacidad para desdoblar un cido nucleico polmero y tambin para sintetizarlo. Todas la polimerasas bacterianas poseen actividad de exonucleasa. Una exonucleasa es una enzima capaz de descomponer cidos nucleicos eliminando los nucletidos terminales uno a la vez. Hay exonucleasas 5' -> 3' y exonucleasas 3' - 5', segn en qu direccin avance la descomposicin de la cadena. Adems de su capacidad de pomerizar, la DNA polimerasa I tiene actividades de exonucleasa 3' -> 5' y 5' - 3; (fig. 13-19). Estas tres actividades se encuentran en dominios diferentes del polipptido senciilo. Por lo tanto, es notable que esta protena prcticamente constituye tres diferentes enzimas en una. Las dos actividades de exonucleasas tienen papeles totalmente diferentes en la duplicacin. Consideraremos primero la actividad de exonucleasa 5' -* 3'. La mayor parte de las nucleasas son especficas para DNA o para RNA, pero la exonucleasa 5' -> 3' de la DNA polimerasa I puede descomponer cualquier tipo de cido nucleico. La primasa deja un tramo de RNA en el extremo 5' de cada fragmento de Okazaki de la cadena retrasada, el cual ser retirado por la exonucleasa 5' -> 3' de la DNA polimerasa 1 (figs. 13-15 y 13-19, a). Puesto que la enzima elimina RNA, se cree que emplea su actividad de polimerasa para llenar la brecha resultante con DNA, el cual posteriormente se une mediante enlaces covalentes al extremo 3' del fragmento de DNA adyacente mediante la accin de la DNAJigasa.
Control de la mayor fidelidad durante la duplicacin del DNA

(b)
13-li. La subunidad/J de una DNA polimerasa III forma unas pinzas deslizantes, a) Modelo tridimensional que muestra las dos subunidades i que constituyen las pinzas deslizantes fi en forma de aro de la holoenzima de DNA polimerasa III. El DNA se muestra en azul en las pinzas i. b) Diagrama de la polimerasa que rodea a la cadena retrasada. La polimerasa se sostiene sobre el DNA gracias a las pinzas deslizantes f} y se desplaza a lo largo de la cadena de la plantilla para sintetizar la cadena complementaria. Despus de concluir el fragmento de Okasaki, la enzima se desengancha de las pinzas /? y rodea a unas nuevas pinzas en direccin hacia adelante del iniciador RNA (dibujo de la derecha). Las pinzas /} originales quedan detrs del fragmento de Okasaki terminado, (n: Cortesa de ohn Ktiriyan; b: segn P.T. Stukenberg, }. Turner y M. O'Donnell, Cell 78:878, 1994, por cortesa de Cell Press.)

La supervivencia de un organismo depende de la duplicacin exacta del genoma. Un error cometido en la sntesis de una molcula de RNA mensajero por una RNA polimerasa provoca la sntesis de protenas defectuosas, pero una molcula de RNAm slo es una plantilla relativamente corta dentro de una gran poblacin de dichas molculas; por lo tanto, el dao resultante del error dura poco. En contraste, un error durante la duplicacin produce una mutacin permanente y la posible eliminacin de la progenie de dicha clula. Se estima que la probabilidad de que un nucletido determinado se copie de manera incorrecta durante la duplicacin en E, coli es de casi 10~9. En otras palabras, slo uno de cada 1 000 millones de nucletidos incorporados no

CAPITULO 13 Duplicacin \j reparacin del DNA Sitio de hidrlisis de exonucleasa 5'

561

n.i
Muesca en la cadena sencilla fflj Bases desiguales
N-H O

10.8

Sitio de hidrlisis de la exonucleasa 5' - 3 r

(b)
nGL"H<V 13-19. Actividades de exonucleasa de la DNA polimerasa I. a) La exonuclesa 5' -> 3' elimina unos 10 nucletidos del extremo 5' de una muestra en la cadena simple. Esta actividad desempea un papel clave para eliminar los iniciadores RNA. b) La exonucleasa 3' - 5' sirve para extraer nucletidos incorrectamente apareados del extremo 3' de la cadena de DNA en crecimiento. Esta actividad es vital para conservar la precisin de la sntesis de DNA.

es complementario del nucletido correspondiente sobre la plantilla de la cadena. Puesto que el genoma de E. cali contiene casi 4 x 106 nucletidos, esta tasa de error corresponde a menos de un nucletido alterado por cada 100 ciclos de duplicacin. La incorporacin de un nucletido particular en un sitio determinado de la cadena en crecimiento se basa en la capacidad del trifosfato de nuclesido activo para formar un par de bases aceptable para el nucletido de la plantilla de la cadena. El anlisis de la distancia entre tomos y ngulos de unin indica que el par de bases A-T y G-C posee una geometra idntica entre s pero diferente de la de otros pares de bases. Como se muestra en la figura 13-20, una DNA polimerasa, que tiene un sitio al cual se unen cuatro trifosfatos de nuclesido, puede satisfacer las proporciones geomtricas de los pares de bases situados entre posibles precursores y la plantilla conforme los precursores se mueven hacia adentro y haca afuera del sitio activo. De los cuatro posibles trifosfatos de nuclesido que llegan, slo uno formar un par de bases apropiado con la plantilla para producir un par de bases A-T o G-C. Cuando se forma el par de bases aceptable, la enzima cataliza la incorporacin del nucletido dentro de la cadena creciente.

10.3

FIGURA 13-20. Caractersticas geomtricas de un par de bases apropiado y pares de bases desiguales. (Segn H. Echols y M.F. Goodman, reproducido de Annual Review of Biochemistry, vohime 60 por Animal Reviews Inc.)

En ocasiones, la polimerasa selecciona un nucletido incorrecto para incorporacin, y como resultado las bases del par no coinciden, o sea, el par de bases es diferente de A-T o G-C. Se estima que un par de bases incorrecto de este tipo ocurre casi una vez cada 105 a 106 nucletidos incorporados, frecuencia mucho mayor que la tasa espontnea de casi 10~9. Cmo se mantiene tan baja la tasa de mutaciones normales? Parte de la respuesta reside en la segunda exonucleasa de las dos mencionadas antes, la exonucleasa con actividad 3' > 5', que se encuentra en las tres polimerasas bacterianas. Se cree que una base no coinci-. dente ser reconocida por la exonucleasa como resultado de su gran tendencia a separarse de la plantilla y formar

562

CAPITULO 13 Duplicacin y reparacin del DNA

(a)

Plantilla Modelo de la porcin 'construida

(b)
.Sitio de polimerasa activo Plantilla

Sitio activo de exonucleasa Modo de polimerizacin Modo de correccin

F1GUKA 13-21. Activacin de la exonucleasa 3' - 5' de la DNA polimerasa I. Modelo esquemtico de una porcin de la enzima que se conoce como fragmento Klenow, el cual contiene los sitios activos de la polimerasa (P) y de la exonucleasa 3' > 5' (E). La actividad de exonucleasa 5' > 3' se localiza en una parte diferente del polipptido, que no se muestra en la figura. Con frecuencia las regiones del fragmento Klenow se comparan con una mano, y all las porciones marcadas como "dedo" y "pulgar". La terminal 3' de la cadena en crecimiento puede alternarse entre los sitios activos de la polirnerasa y de la exonucleasa. La adicin de una base incorrectamente apareada al extremo de la cadena en crecimiento tiende a producir un extremo 3' libre que penetra en el sitio de la exonucleasa, de donde ser eliminado. (Reproducido con permiso segn L.S. Beese, V. Derbyshire y T.A. Steitz, Science 260:354, 1993; copyright 1993 American Association for the Advancement of Science.)

una cadena nica con 3' terminal (fig. 13-21). Luego de la incorporacin de un nucletido incorrecto, la polimerasa se detiene en el sitio suministrando el tiempo necesario para que la exonucleasa de accin relativamente breve 3' -> 5' elimine el nucletido desajustado antes que pueda continuar el alargamiento de la cadena. Esta tarea de "correccin de pruebas" es una de las actividades enzimticas ms notables e ilustra el grado de perfeccionamiento del cual ha evolucionado la maquinaria molecular biolgica. La exonucleasa de actividad 3' 5' probablemente elimine casi 99 de cada 100 bases desajustadas, elevando la fidelidad a casi 10~7 a 10~8. Adems, las bacterias poseen un mecanismo, denominado reparacin de desajustes, que opera despus de la duplicacin para corregir casi todos los desajustes que puedan escapar al paso de la correccin de pruebas. As, en conjunto las actividades de seleccin inicial, correccin de pruebas inmediata, y la subsecuente reparacin de los desajustes pueden explicar la tasa total de errores observada de casi 10*. Una de las caractersticas ms notables de la duplicacin bacteriana es su velocidad. La duplicacin de un cromosoma bacteriano ntegro en slo 40 minutos a 37C requiere que cada bifurcacin de duplicacin mueva casi 1 000 nucletidos por segundo. La longitud de un fragmento Okazaki se encuentra en el mismo intervalo, lo que indica que todo el proceso, incluyendo la formacin de un iniciador RNA, su alargamiento y correccin de pruebas efectuadas simultneamente por la DNA polimerasa, y su enlace al resto de la cadena, debe ocurrir ms o menos una vez por segundo. E. coii duplica su DNA en unos 40 minutos, pero se puede iniciar una nueva vuelta de duplicacin antes que concluya la vuelta previa. Por consiguiente, cuando estas bacterias crecen a tasa mxima, pueden duplicar su nmero una vez cada 20 minutos.

Duplicacin en clulas eucariotas Como sera de esperar, nuestro conocimiento de la duplicacin en clulas eucariotas todava est muy por detrs del conocimiento en clulas procariotas. Este desequilibrio est cambiando con rapidez por el desarrollo de nuevos sistemas similares a los empleados durante decenios para estudiar la duplicacin procariota. Entre stos se incluyen: El aislamiento de clulas imitantes de levaduras incapaces de sintetizar productos especficos del gen requeridos para diferentes aspectos de la duplicacin. Puesto que las protenas de duplicacin empleadas por las clulas de levadura son notablemente similares en estructura a las protenas de las clulas eucariotas ms elevadas, la informacin obtenida a partir del estudio de estas levaduras se puede aplicar principalmente a alulas de mamferos. El desarrollo de sistemas in vitro en los cuales se puede duplicar DNA purificado utifr2a"ndo extractos celulares o componentes purificados. En la mayor parte de los estudios in vitro de duplicacin de mamferos se emplean plantillas preparadas a partir de genomas virales ms simples de los que normalmente se pueden duplicar en estas clulas. Por ejemplo, el DNA del virus SV40 del mono contiene un solo origen de duplicacin, que acta como sitio para e! enlace de una protena codificada por el virus, llamada antgeno T grande. Otra protena del virus diferente de sta, que se enlaza al origen SV40 para iniciar la duplicacin, libera el mecanismo de duplicacin de la clula husped para duplicar su genoma, y esto permite a os investigadores estudiar el papel de las protenas celulares especficas para duplicacin en el tubo de ensaye.

CAPITULO 13

563

En general, la duplicacin es muy semejante cualquiera que sea el tipo de gen duplicado: viral, procariota o eucariota. Todos estos sistemas requieren protenas no enrolladas, protenas que se enlazan al DNA de una sola cadena, topoisomerasas, primasas, DNA polimerasas y ligasas. Igual que en los procariotes, el DNA de las clulas eucariotas se sintetiza de manera semidiscontinua, aunque los fragmentos de Okazaki de la cadena retrasada son considerablemente ms pequeos que en las bacterias, con un promedio de longitud cercana a 250 nucletidos. Hasta la fecha se han aislado cinco diferentes DNA polimerasas de clulas eucariotas, y se les designa o., j3, j, y s. La polimerasa a est ntimamente relacionada con la primasa, que inicia la sntesis de los iniciadores en el extremo 5' de cada fragmento de Okazaki conforme el complejo polimerasa-primasa se desplaza a lo largo de la plantilla de la cadena retrasada. Al parecer, la cadena delantera y la mayor parte de los fragmentos de la cadena retrasada son ensamblados por la polimerasa . La polimerasa y duplica el DNA mitocondrial y la polimerasa /? sirve para la reparacin del DNA. El papel de la polimerasa s es ms problemtico, aunque al parecer desempea algn papel en la duplicacin del DNA nuclear que no se puede efectuar en clulas que carecen de esta polimerasa. Igual que las polimerasas procariotas, todas las enzimas eucariotas alargan cadenas de DNA en la direccin 5' - 3', aadiendo nucletidos a un grupo 3' hidroxilo y ninguna de ellas puede iniciar la sntesis de una cadena de DNA sin un iniciador. La mayor parte de las DNA polimerasas eucariotas han mostrado hasta ahora que poseen actividad de exonucleasa 3' -> 5', garantizando que la duplicacin ocurra con un alto grado de precisin. Slo la polimerasa/5 carece de actividad de exonucleasa. Aunque los primeros experimentos autorradiogrf icos acerca de la duplicacin de bacterias indicaron que la duplicacin de su cromosoma se inicia en un solo sitio, experimentos de tipo similar con clulas eucariotas sugieren que la duplicacin ocurre simultneamente en muchos sitios a lo largo del cromosoma (fig. 13-22). Las clulas de los organismos elevados poseen mucho ms DNA que las bacterias, y las polimerasas eucariotas incorporan nucletidos al DNA a una tasa mucho menor. Para duplicar un cromosoma entero en un tiempo razonable, el DNA eucariota se duplica en unidades ms pequeas, llamadas duplicanes. En os cromosomas eucariotas, los duplicones en general tienen entre 15 y 100 fm de longitud (50 a 300 kilobases), y cada uno tiene su propio origen a partir del cual las bifurcaciones de duplicacin prosiguen hacia afuera en ambas direcciones (fig. 13-22). Inicio de la duplicacin El inicio de la sntesis de DNA en un duplicn determinado al parecer est sometido a regulacin considerable. Los duplicones localizados en sitios cercanos dentro de un cromosoma determinado tienden a sufrir duplicacin de manera simultnea (evidente en la figura 13-22). Ms an, los duplicones activos en un momento particular durante una vuelta de sntesis de DNA (fase S, cap. 14) tienden a mostrarse activos en una etapa comparable durante vueltas sucesivas. Por lo tanto, el momento en que una regin par-

FIGURA 13-22. Resultados de un experimento para demostrar que la duplicacin en cromosomas eucariotas se inicia en muchos puntos a lo largo del DNA. Las clulas se incubaron en 3 H-timidina durante un breve periodo antes de la preparacin de fibras de DNA para autorradiografa. Las lneas de granos plateados negros indican sitios donde se incorpora el DNA radiactivo precursor durante el periodo de marcado. Es evidente que la sntesis ocurre en sitios separados a lo largo de la misma molcula de DNA. Como se indica en el dibujo de lneas acompaante, el inicio da lugar en el centro de cada sitio de incorporacin de la timidina formando dos bifurcaciones de duplicacin que se mueven separndose hasta encontrar una bifurcacin vecina. (Micrografia cortesa de jod Huberman.)

ticular de un cromosoma sufre duplicacin en un tipo particular de clula est programado y es predecible. La secuencia de duplicacin de una regin del cromosoma puede estar gobernada principalmente por su estado de compactacin: cuanto ms firmemente compactado, ms tarda ser la etapa en la cual ser duplicado. Las regiones ms altamente compactadas del cromosoma constan de heterocromatina (pg. 498), que es el ltimo DNA que se duplica. Esta diferencia en el momento de la duplicacin no se debe a secuencias DNA, puesto que el cromosoma X inactivo, heterocromatizado en las clulas de los mamferos femeninos (pgina 500) se duplica muy tardamente en la fase S, en tanto que el cromosoma X eucromtico activo se duplica en etapas ms tempranas. Puesto que es indispensable que cada porcin del genoma slo se duplique una vez durante cada ciclo, debe haber algn mecanismo para evitar el reinicio de la duplicacin en un sitio que ya ha sido duplicado. En los ltimos 10 aos se han efectuado numerosas investigaciones para dilucidar el mecanismo mediante el cual se inicia la duplicacin. El avance ms significativo en este campo se logr con clulas de levadura, puesto que se puede eliminar el origen de la duplicacin del cromosoma de levadura e introducir en otras molculas de DNA, confirindoles la capacidad de duplicarse dentro de una clula de levadura o al ser incubadas en extractos celulares que contengan las protenas necesarias para la duplicacin. Puesto que estas secuencias tienen la capacidad de promover la duplicacin del DNA que las contiene, se les conoce como secuencias duplicantes autnomas (SDA). Los cromosomas de una clula de levadura contienen aproximadamente 400 orgenes de duplicacin (o SDA) dispersos a travs de su DNA. Las SDA aisladas y analizadas comparten variados elementos. El elemento central de una SDA consta de 11 pares de bases y funciona como sitio de enlace especfico para un complejo multiprotenico esencial denominado complejo de reconocimiento del origen (CRO). Cuando se provoca una mutacin en a SDA de modo que

564

CAPITULO 13 Duplicacin y reparacin del DNA

no pueda enlazarse al CRO, no puede ocurrir el inicio de la duplicacin. Justo adyacente al sitio de enlace al CRO se encuentran secuencias en ambos lados en las cuales el DNA dplex muestra menor estabilidad y constituye un sitio donde la doble hlice es fcil de desenrollar (fig. 13-23). Se cree que el inicio de la duplicacin se desencadena por enlace de otro componente de la multiprotena del CRO que ya reside en el origen. Esfe enlace puede estimular el desenrollamiento local del DNA en las secuencias adyacentes. Igual que en las bacterias, el desenrollamiento del DNA en cada origen tal vez constituya la etapa previa al subsecuente enlace de todas las protenas necesarias para establecer un par de bifurcaciones de duplicacin activas. La determinacin de la naturaleza de los orgenes de la duplicacin es ms difcil de estudiar en clulas de mamferos que en levaduras. Parte del problema reside en que al estudiar in vitro la actividad de las plantillas del DNA desnudo purificado utilizando extractos celulares de clulas de mamferos, prcticamente todos son adecuados para la duplicacin. Estos estudios sugieren que el DNA de mamferos quiz no posea sitios especficos en donde se inicie la duplicacin. Sin embargo, estudios de duplicacin en cro-

mosomas intactos in vivo sugieren que la duplicacin se inicia en sitios especficos a lo largo del DNA y no por seleccin al azar, como ocurre in vitro. Al parecer, la molcula de DNA contiene muchos sitios donde se puede iniciar la duplicacin DNA, pero los efectos de la organizacin de la cromatina y de la posicin del nucleosoma suprimen el inicio en la mayor parte de estos sitios, en tanto que lo promueven en sitios especficos que sirven como origen de la duplicacin. Recientemente se precis un sitio donde se inicia la duplicacin bidireccional en el grupo de genes de globina /3, como se muestra en la figura 13-24. Cuando se corra esta secuencia especfica, como ocurre en pacientes que sufren de una deficiencia determinada de la hemoglobina, conocida como sndrome de la hemoglobina de Lepore, el DNA de esta parte del cromosoma se duplica mediante una bifurcacin de duplicacin que se desplaza al interior de la regin de un origen no identificado residente fuera del grupo de genes de globina fi (fig. 13-24, abajo). Por lo tanto, el patrn de uso del origen es flexible y la eliminacin de un origen no estimula el inicio en una nueva secuencia de origen. En vez de ello, la clula toma ventaja de la presencia de un origen a distancia.
Duplicacin y estructura del ncleo

SDA

CRO

Datos crecientes sugieren que la matriz nuclear (pg. 506) desempea un papel importante en el proceso de duplicacin, igual que en los sucesos de transcripcin. Cuando se administran a las clulas pulsos breves de precursores radiactivos de DNA, casi 80% de la radiactividad incorporada se encuentra en la matriz nuclear. Este dato sugiere que el mecanismo de duplicacin ocurre en estrecha relacin con la matriz nuclear. Si en lugar de fijar las clulas inmediatamente despus del pulso se les permite incorporar precursores de DNA no marcado durante una hora, aproximadamente, antes de la fijacin, la mayor parte de la radiactividad se puede seguir desde la matriz hasta las asas

Normal

Hb Lepore

FIGURA 13-23. Activacin del origen de duplicacin en una levadura. Las pruebas indican que un complejo de protenas (CRO) reside en el origen de duplicacin hasta ser activado por la adicin de otro factor (representado por la partcula en azul). El enlace del factor al complejo preexistente provoca la separacin de la cadena, que conduce al reclutamiento de las protenas de duplicacin necesario para ensamblar una bifurcacin de duplicacin activa.

FIGURA 13-24. Localizacin de un origen de duplicacin dentro del locus del gen de globina/ humano. La duplicacin se inicia en el sitio indicado en la parte de arriba y avanza hacia afuera en ambas direcciones. Si este origen de duplicacin se borra, como en el caso de personas con un tipo particu'ar de /3-talasemia quienes producen una hemoglobina anormal (Hb c.e Lepore), los genes de globina /3 se duplican en bifurcaciones que se originan por fuera del locus. (Segn J.F.X. Diffiey, C -rr. Opin. Cell Biol. 6:370, 1994.)

CAPITULO 13 Duplicacin \j reparacin del DNA

565

de DNA circunvecinas. Este ltimo dato sugiere que el DNA duplicante se mueve como cinturn transportador a travs de un aparato de duplicacin inmovilizado (fig. 13-25). Estudios subsecuentes sugieren que las bifurcaciones de duplicacin activas en cualquier momento dado no se distribuyen al azar dentro del ncleo celular, sino que se localizan en unos 50 a 250 sitios, llamados focos de duplicacin (fig. 13-26, ). Se estima que cada uno de los brillantes puntos rojos indicados en la figura 13-26, a, contiene cerca de 40 bifurcaciones de duplicacin incorporando nucletidqs simultneamente en cadenas de DNA. Adems de contener las protenas y enzimas necesarias para la sntesis de DNA, estos focos son sitios donde se concentra la enzima metiltransferasa (fig. 13-26, b), encargada de la metilacin del DNA inmediatamente despus de ser sintetizado (pg. 568).
Estructura y duplicacin de la cromatina

En tanto el cromosoma de las clulas procariotas consta principalmente de una molcula desnuda de DNA, los cromosomas de las clulas eucariotas contienen DNA que forma un complejo firmemente apretado con disposiciones regulares de protenas. De igual manera que el mecanismo de transcripcin puede atravesar una regin del DNA ntimamente vinculada con partculas centrales de histona, de igual manera lo hace el mecanismo de duplicacin. Igual que en la transcripcin (pg. 526), el acceso al DNA durante la duplicacin se puede lograr mediante la abertura

o desplegamiento de las partculas centrales del nucleosoma. En cualquier caso, la presencia de un centro de histona durante la duplicacin plantea la pregunta acerca de la distribucin de estas partculas a las hijas dplex. El examen de una molcula de DNA duplicante con el microscopio electrnico revela partculas parecidas a nucleosomas en ambas hijas dplex muy cerca de la bifurcacin de duplicacin (fig. 13-27, a), lo que sugiere que el ensamblado del DNA para formar nucleosomas es un acontecimiento muy rpido. Un gran nmero de estudios concuerdan en el dato de que las histonas recin sintetizadas y las histonas preexistentes no se mezclan en la formacin de nucleosomas durante la duplicacin. Ms bien, los octmeros de histona presentes antes de la duplicacin permanecen intactos y se pasan a las hijas dplex, en tanto que las histonas recin sintetizadas se ensamblan en partculas centrales totalmente "nuevas". La manera como se segregan estos octmeros nuevos y viejos de histona es tema de gran controversia. Las pruebas actuales sugieren que conforme la bifurcacin de duplicacin pasa a travs del centro de un nucleosoma, el octmero de histona que constituye dicho centro pasa al azar a una hija dplex, y un nuevo octmero de histona se ensambla en el otro brazo de la bifurcacin. Por lo tanto, las partculas centrales nuevas y viejas se distribuyen al azar entre las dos hijas dplex (fig. 13-27, b). Es ms confusa la manera en la cual las hijas dplex adquieren poblaciones similares de protenas cromosmicas no de histona.

13-2 Reparacin del DNA

La vida sobre la tierra est sujeta a muchas fuerzas destructivas que se originan en los medios interno y externo del organismo. En todas las molculas dentro de la clula, el DNA se encuentra en las condiciones ms precarias. Por un lado, es indispensable que la informacin gentica permanezca prcticamente invariable conforme pasa de una clula a otra y de un individuo a otro. Por otra parte, el DNA es una de las molculas de la clula ms susceptible a dao ambiental. Cuando el esqueleto de una molcula de DNA es golpeado por radiacin ionizante con frecuencia se rompe; cuando se le somete a la accin de compuestos qumicos comunes, algunos producidos por el propio metabolismo deja clula, las bases de una molcula de DNA se pueden alterar de manera estructural; cuando se exponen a la radiacin ultravioleta, las pirimidinas adyacentes a la cadena de DNA muestran tendencia a interactuar entre s para formar un complejo covalente, o sea, un dmero (fig. 13-28). Incluso la absorcin de energa trmica por el DNA de un ave o mamfero de sangre caliente es suficiente para separar las bases adenina y guanina de su fijacin a los azcares' de su esqueleto carbonado del DNA. La magnitud de estas alteraciones espontneas (lesiones) se puede apreciar del dato estimado de que cada clula de mamfero de sangre caliente pierde varios miles de bases al da! Cuando estas lesiones no se reparan, se produce una lesin permanente, o mutacin, en el DNA. Si la mutacin ocurre en una clula que se encuentra en camino de convertirse en gameto, la alteracin gentica puede pasar a la generacin siguiente. Las mutaciones tambin tienen efectos sobre clulas no re-

FIGURA 13-25. Participacin de la matriz nuclear en la duplicacin del DNA. Diagrama que muestra cmo se unen a la subestructura nuclear los orgenes de la duplicacin y las bifurcaciones de duplicacin bidireccional. Los orgenes de la duplicacin estn indicados por los puntos, y las flechas indican la direccin del alargamiento de las cadenas en crecimiento.

566

CAPITULO 13 Duplicacin y reparacin del DNA

(a)

(b)

FIGURA 13-26. Demostracin de que la actividad de duplicacin no ocurre al azar en todo el ncleo, sino est confinada a un nmero relativamente pequeo de sitios distintos, a) Antes de iniciar la sntesis de DNA al principio de la fase S, se requieren varios factores para iniciar la duplicacin que son ensamblados en sitios discretos dentro del ncleo, formando centros de preduplicacin. Estos sitios aparecen como objetos discretos en rojo en la micrografa, que fue teida con un anticuerpo fluorescente contra una protcna llamada factor A de duplicacin (FAD) necesario para iniciar la duplicacin, b) El patrn de mediacin de los residuos de citidina en el DNA de la cadena progenitora se conserva en la cadena hija luego de la duplicacin por accin de una DNA metiltransferasa. Los puntos brillantes en este ncleo muestran los sitios en la enzima durante la fase S, periodo del ciclo celular correspondiente a la sntesis de DNA. Se observa que la enzima se concentra dentro de los sitios discretos, que constituyen los focos de duplicacin donde tiene lugar la sntesis de DNA. (a: Segn Yasuhisa Adachi y Ulrich K. Laetnmli, EMBO J. vol. 13, cover of no. 17, 1994, con permiso de Oxford University Press; b: cortesa de Andrea W. Page y Timothy ti. Bestor.)

Nucleosoma

(b)

FIGURA 13-27. Distribucin de los complejos centrales de histona entre las cadenas hijas despus de la duplicacin, a) Micrografa electrnica de la cromatina aislada del ncleo de un embrin de Drosophyla en rpido desdoblamiento, que muestra un par de bifurcaciones de duplicacin que se alejan entre s en direcciones opuestas. Entre las dos bifurcaciones se pueden observar regiones de DNA recientemente duplicado ya cubiertas por partculas centrales nucleosmicas con igual densidad aproximada de las cadenas progenituras que todava no sufren duplicacin, b) Diagrama de la disposicin de los nucleosomas despus de la duplicacin del DNA. Las partculas centrales presentes antes de la duplicacin se indican en azul, en tanto que las partculas centrales compuestas de histonas nuevas se indican en rojo. Los dos tipos de partculas de distribuyen al azar a lo largo de las cadenas hijas, (a: Cortesa de Stcven L McKtght y Osear L Mler, ]r.; b: segn M.L DcPamphiiis, Curr. Opin. Cell Biol. 5:435, 1993.)

CAPITULO 13 Duplicacin y reparacin del DNA

567

su pareja. Por consiguiente, si se eliminan uno o ms nucletidos de una cadena, la cadena complementaria puede seguir como plantilla para reconstruir el dplex. Puesto que la reparacin del DNA implica sntesis de DNA, es fcil saber si est ocurriendo por la incorporacin de 3H-timidina en momentos en que la clula no participa de alguna manera en la duplicacin de DNA (vase fig. VE 13-4, al final del captulo). Como veremos en el siguiente anlisis, la duplicacin del DNA y la reparacin del mismo tienen muchas caractersticas en comn, y por lo tanto no es sorprendente que compartan muchas de las "partes y servicios". Reparacin por excisin de nucletidos Los sistemas de reparacin por excisin de nucletidos operan eliminando una pequea seccin de la cadena de DNA que contiene ciertos tipos de lesiones en masa, como los dmeros de pirimidina o nucletidos a los cuales se han fijado ciertos grupos qumicos (paso 1, fig. 13-29). El proceso de reparacin se inicia con la accin de un par de endonucleasas que practican incisiones en el esqueleto de la cadena alterada a cada lado de la lesin (paso 2). El oligonucletido daado situado entre los cortes queda entonces

OH

FIGURA J 3-28. Dmero de pirimidina formado en un DNA dplex luego de radiacin UV.

productivas; pueden impedir la transcripcin y la duplicacin, conducir a la transformacin maligna de una clula, y acelerar el proceso de envejecimiento de un organismo. Considerando las drsticas consecuencias de las alteraciones en las molculas de DNA y la elevada frecuencia con que ocurren, es indispensable que las clulas posean algn mecanismo para reparar los daos genticos. En realidad, los bilogos han descubierto que las clulas tienen varios sistemas de reparacin al parecer capaces de corregir casi todo tipo de dao al cual la molcula de DNA pueda ser vulnerable. Se estima que en 1 000 salvamentos efectuados por el sistema de reparacin de la clula, el dao es menor que el cambio de una sola base. La existencia de estos sistemas suministra un elegante ejemplo de los mecanismos que han evolucionado para el mantenimiento homeosttko del estado viviente. Tanto las clulas procariotas como las eucariotas poseen varias enzimas que vigilan el DNA "en bsqueda" de alteraciones y deformaciones que dichas enzimas pueden reconocer y reparar. En algunos casos, el dao se puede solucionar directamente; por ejemplo, hay una enzima que usa la energa de la luz solar para romper el enlace que mantiene juntas a dos pirimidinas en un dmero de pirimidinas, y por lo tanto retorna la molcula a su condicin original. Sin embargo, la mayor parte de los sistemas de reparacin requieren que la seccin daada del DNA sea escindida, o sea, eliminada selectivamente. Una de las grandes virtudes del DNA dplex consiste en el hecho de cada cadena contiene la informacin necesaria para construir a

Endonucleasa UV
O 3'OH 5'P
\a UV
> . 3'OH 5'P

T=T

DNA helicasa

DNA polimerasa a(p)* 3'OH 5P

Un
Ligasa

Placa de reparacin

FIGURA 13-29. Reparacin con excisin de nucletidos. Los pasos se describen en e! texto.

568

CAPITULO 13 - Duplicacin y reparacin del DNA

contenido en el dplex nicamente por puentes de hidrgeno a las bases de la otra cadena. Recordemos que durante la duplicacin del DNA los puentes de hidrgeno que mantienen junto al dplex son separados por una DNA hecasa. Tambin se cree que una DNA helicasa es la encargada de desmontar el oligonucletido daado para separarlo de la cadena complementaria intacta durante la reparacin por excisin (paso 3, fig. 13-29). Una vez practicada la excisin, la hendidura se llena mediante la accin de una DNA pomerasa (paso 4) y la cadena se sella por la DNA ligasa (paso 5}. La reparacin por excisin de nucletido consta de dos vas: 1. Una va "preferencial" para reparar de preferencia la plantilla de la cadena de genes que se transcriben activamente. Se cree que la reparacin de la cadena de la plantilla ocurre conforme se transcribe el DNA empleando algunos de los elementos que componen el mecanismo de transcripcin (pg. 449). Esta va de reparacin preferencial garantiza que los genes de mayor importancia para la clula, que son los genes que la clula transcribe activamente, reciban la ms alta prioridad en la "lista de reparaciones". 2. Una va menos eficiente, ms lenta, que corrige las cadenas DNA en el resto del genoma. Reparacin por excisin de bases Tanto en clulas eucariotas como procariotas opera un sistema de reparacin por excisin de manera totalmente independiente para eliminar algunos de los nucletidos alterados y que producen menos deformacin de la doble hlice (paso 1, fig. 13-30). En este mecanismo alterno de reparacin por excisin, una DNA glucosilasa inicia la respuesta reconociendo la alteracin y eliminando la base por desdoblamiento del enlace glucosdico que sostiene dicha base al fragmento del azcar (paso 2, fig. 13-30). Se han identificado algunos tipos diferentes de DNA glucosilasas, cada una ms o menos especfica para un tipo particular de base alterada, incluyendo uracilo (que se forma por el desdoblamiento hidroltico del grupo amino de la citosina), 8-hidroxiguanina (que resulta del dao causado por radicales libres de oxgeno, pg. 34), y 3-metladenna (causada por agentes alquilantes). Una vez extrae la purina o la pirimidna alterada, el fosfato de desoxirribosa "decapitado" que permanece en el sitio se elimina por accin de una endonucleasa, una fosfodiesterasa ampla la abertura y luego una DNA polimerasa la llena (pasos 3 a 5, fig. 13-30). Por ltimo, la cadena se sella mediante accin de una DNA (gasa (paso 6). El hecho de que el uraco se pueda formar a partir de citosina quiz sea la razn de que la seleccin natural favoreci el empleo de timina como base en el DNA en vez de uracilo, el cual al parecer se encontraba en el RNA que previamente haba servido como material gentico. Si se hubiera retenido el uracilo como una de las bases del DNA, podra causar dificultad a los sistemas de reparacin para distinguir entre un uracilo "perteneciente" a un sitio particular y otro que se hubiera formado por alteracin de

DNA-uracilo glucosilasa

DNA ligasa

FIGURA 13-30. Reparacin por excisin de bases. Los pasos se describen en el texto.

CAPITULO 13 Duplicacin y reparacin del DNA

569

la citosina. Es interesante saber que la enzima que elimina el uracilo del DNA (uracilo-DNA glucosilasa) es una de las protenas ms conservadas entre E. coli y seres humanos, compartiendo 56% de la identidad en la secuencia de aminocidos. Reparacin de las desigualdades En una seccin anterior (pg. 562) se hizo notar que las clulas pueden eliminar bases no coincidentes incorporadas por la DNA polimerasa durante la duplicacin las cuales escaparon de la correccin de pruebas de la enzima endonucleasa. La desigualdad de un par de bases provoca deformacin de la geometra de la doble hlice, que puede ser reconocida por una enzima de reparacin. Pero cmo puede la enzima reconocer el nucletido incorrecto en el par no coincidente? Si tuviera que eliminar uno de los nucletidos al azar, la seleccin sera equivocada en 50% de los casos generando una mutacin permanente en el sitio. Por lo tanto, para reparar la desigualdad luego que la DNA polimerasa pasa por el sitio, es indispensable que el sistema de reparacin pueda distinguir la cadena recin sintetizada, que contiene el nucletido incorrecto, de la cadena

progenitura, que contiene el nucletido correcto. En las bacterias, las dos cadenas se distinguen por la presencia o ausencia de grupos metilo. La cadena progenitura posee grupos metilo presentes en ciertos residuos de adenosina que no se aaden a la cadena recin sintetizada sino hasta cierto tiempo despus de la duplicacin. El sistema de reparacin revisa el DNA antes de este paso de metilacin; cuando reconoce desigualdad, la enzima siempre elimina y sustituye nucletidos de la cadena no metilada, lo que garantiza que retorna el par de bases a su estado original. Puesto que en muchos eucariotes no hay metilacin de DNA, se piensa que las clulas eucariotas deben emplear algn otro mecanismo para reparar las desigualdades. La importancia de la reparacin del DNA se puede apreciar examinando los efectos en el hombre que resultan de las deficiencias en la reparacin de DNA, tema que analizaremos en La perspectiva humana acompaante. El estudio de estas enfermedades humanas ha suministrado una ventana a travs de la cual se puede echar una mirada a la naturaleza de las protenas implicadas en la reparacin del DNA. Estos estudios, que se describen en la Va experimental, al final del captulo, constituyen una de las reas ms estimulantes de los estudios actuales en Biologa molecular.

LA PERSPECTIVA HUMANA
Deficiencias en la reparacin por excisin de nucletidos en el ser humano
Debemos nuestra existencia a luz del sol que suministra la energa capturada durante la fotosntesis. Pero el sol tambin emite una corriente continua de rayos ultravioleta que envejece y provoca mutaciones a la clulas de nuestra piel. Los efectos nocivos del sol se ilustran de manera ms notable por una rara enfermedad gentica recesiva, el xeroderma pigmentosum (XP). Como se analiza con mayor detalle en La va experimental, las vctimas de XP poseen un sistema de reparacin deficiente incapaz de eliminar los segmentos de DNA daados por la radiacin ultravioleta. Como resultado, las personas que padecen XP son sumamente sensibles a la luz del sol; incluso la exposicin inuy limitada a los rayos directos del sol pueden provocar la aparicin de un gran nmero de manchas pigmentadas de color oscuro sobre las regiones expuestas del cuerpo (fig. PH 13-1) y un riesgo mucho mayor de desarrollar cncer cutneo desfigurante mortal. Cerca de 20% de, los pacientes con XP tambin presentan degeneracin neurolgica y retraso mental. La XP no es la nica enfermedad gentica caracterizada por deficiencia del sistema de reparacin por excisin. El sndrome de Cockayne (SC) es un trastorno hereditario caracterizado por sensibilidad a la luz, disfuncin neurolgica debida a desmielinizacin de las neuronas y varias anomalas del desarrollo, pero con incremento escaso o ausente de la probabilidad de padecer cncer. Las clulas de las personas con SC tienen deficiencias en la va preferencial para reparar DNA de transcripcin activa (pg. 568), pero el resto del genoma se repara a una tasa normal, que al parecer es la razn por la cual estos individuos no estn sujetos a mayor probabilidad de cncer cutneo. Aunque eJ perfil clnico de las dos enfermedades es muy diferente, ambas parecen ser consecuencia de defectos en el mismo gen. Las clulas de ciertos pacientes con XP y de ciertos pacientes con SC se pueden corregir mediante la introduccin del mismo gen clonado. Cmo se pueden producir dos enfermedades totalmente diferentes a partir de la deficiencia en el mismo gen? Una probable explicacin es que en las dos enfermedades se afectan partes diferentes del polipptido, y que estas distintas partes se encargan de diver-

570

CAPITULO 13 Duplicacin y reparacin del DNA

KICURA PH 13-1, En este nio con xeroderma pigmentosum son evidentes las regiones pigmentadas de color oscuro en la piel. El rea de la piel situada debajo del mentn, protejida del sol, est relativamente desprovista de lesiones. (Ken Greer/Visuals Unlimited.)

sas actividades. Por ejemplo, un dominio del polipptido debiera ser particularmente importante durante la transcripcin, y por lo tanto un defecto en este gen sera la causa del fracaso de la expresin de ciertos genes. Este fracaso, a su vez, producira las consecuencias especficas, como desarrollo anormal del sistema nervioso observa-

do en personas con sndrome de Cockayne. Por lo contrario, otro dominio del polipptido podra ser particularmente importante en a reparacin del DNA y las mutaciones de esta porcin del gen causaran la elevada frecuencia de cncer en personas con xeroderma pigmentosum. Las vctimas de xeroderma pigmentosum no son los nicos individuos que deben preocuparse acerca de la exposicin al sol. Incluso en clulas de la piel cuyo sistema de reparacin funciona a niveles ptimos, cierta fraccin de las lesiones no son escindidas ni sustituidas. Las alteraciones en el DNA conducen a mutaciones que pueden provocar malignizacin de las clulas (cap. 16). Por lo tanto, una de las consecuencias del fracaso para corregir el dao inducido por rayos UV es el riesgo de cncer cutneo. Consideremos las siguientes estadsticas. En Estados Unidos, cada ao ms de 600 000 personas desarrollan una de las tres formas de cncer cutneo, y la mayor parte de estos casos se atribuyen a exposicin excesiva a los rayos ultravioleta del sol. Por fortuna, las dos formas ms comunes de cncer cutneo, o sea carcinoma de clulas bsales y carcinoma de clulas escamosas, raras veces se propagan a otras partes del cuerpo y en general se pueden escindir en el consultorio mdico. Ambos tipos de cncer se originan a partir de las clulas de la piel. Sin embargo, el tercer tipo de cncer cutneo, el melanoma maligno, es potencialmente mortal. A diferencia de

los otros, el melanoma se desarrolla a partir de las clulas pigmentadas de la piel. Se puede originar en un lunar no maligno ya existente, o puede aparecer en un sitio donde previamente no haba lunar alguno. El nmero de casos de melanoma diagnosticado en Estados Unidos est creciendo a una tasa alarmante de 4% anual, debido al incremento en los ltimos decenios de la cantidad de tiempo que las personas permanecen al sol. Muchos cientficos predicen que la tasa de melanomas se elevar aun con mayor rapidez en lo futuro si la capa de ozono que absorbe la radiacin ultravioleta de la atmsfera contina deteriorndose. Los individuos de piel clara son particularmente susceptibles a desarrollar melanoma, igual que aqullos con parientes consanguneos que han padecido la enfermedad o quienes viven en regiones muy soleadas. Por ejemplo, la tasa ms elevada de melanoma se observa en Australia, que tiene un clima soleado tropical y est poblada principalmente por personas de piel blanca descendientes del norte de Europa. De manera similar, en Estados Unidos la frecuencia de melanoma en Arizona es el doble a la observada en Michigan. Pruebas crecientes sugieren que uno de los mayores factores de riesgo para desarrollar melanoma en la edad adulta es la ocurrencia de quemaduras solares graves durante la infancia o la adolescencia. Por lo tanto, evidentemente es importante prevenir dichas quemaduras en los nios.

CAPITULO 13 Duplicacin y reparacin del DNA

571

LA VIA

EXPERIMENTAL

Papel de las deficiencias en la reparacin por escisin de nucletidos en el ser humano en la investigacin para reparar el DNA
En 1968, James Cleaver, de la Universidad de California, hizo un descubrimiento que abri un nuevo campo en Biologa molecular y Gentica humana. Se saba que personas afectadas de una rara enfermedad hereditaria, el xeroderma pigmentosum (XP), eran sumamente sensibles a la exposicin a la luz solar (analizado, adems, en La perspectiva humana). Cleaver haba estado estudiando la capacidad de clulas cultivadas de mamfero para efectuar reparacin del DNA. Previamente se haba demostrado que las bacterias con mayor sensibilidad a la radiacin ultravioleta eran portadoras d mutaciones en uno de los genes requeridos para la reparacin del DNA. Cleaver se pregunt si el xeroderma pigmentosum poda ser causado por un tipo similar de mutacin en el genoma humano. Para probar esta posibilidad, se tomaron biopsias de piel de tres pacientes con XP y de un sujeto normal saludable, los tejidos se colocaron en cultivo y se aislaron fibroblastos de cada una de las muestras de piel. A continuacin se determin la capacidad de ios fibroblastos de cada una de estas fuentes para reparar daos al DNA producidos por radiacin ultravioleta.1 Como se estudi en la pgina 568, para eliminar dmeros de pirimidina de una cadena de DNA se requieren endonucleasas que corten la cadena y polimerasas para rellenar la abertura. Este ltimo proceso se denomina reparacin por duplicacin y se puede probar midiendo la incorporacin de tirnidina marcada con istopos radiactivos en las clulas que no participan en la duplicacin del DNA durante la fase S. En una serie de experimentos, Cleaver irradi cultivos de fibroblastos con varias dosis de luz ultravioleta, marc las clulas con 3H-timidina durante tres horas y luego las fij y proces para autorradiografa. E! porcentaje de clulas marcadas en cada uno de los cuatro cultivos se muestra en el cuadro VE 13-1. Observ que todas las clulas normales sometidas a radiacin UV participan en la reparacin por duplicacin, pero slo una cuarta parte de las clulas de personas con XP presentaron radiactividad muy leve, no mayor que las clulas XP de los cultivos testigo no irradiados (cuadro VE 13-1, columna izquierda). Las cuentas de granos plateados situados sobre los ncleos de las clulas marcadas indicaron que aun las clulas XP marcadas contienen una concentracin mucho menor de tirnidina incorporada en comparacin con las clulas normales (fig. VE 13-1). Estos resultados indican que la reparacin por duplicacin en fibroblastos de personas con XP puede estar completamente ausente u ocurrir a un nivel mucho menor en comparacin con clulas de individuos saludables. Los estudios de los mecanismos de reparacin del DNA en bacterias revelan que la reparacin del DNA daado por UV requiere la actividad de diferentes enzimas para excindir la lesin, reparar la cadena de DNA y ligar el DNA sustituto a la porcin no reparada de la cadena. A raz de los estudios iniciales de Cleaver sobre clulas XP, varios laboratorios comenzaron a analizar las deficiencias especficas a nivel molecular, lo que gener el fenotipo XP. Uno de los primeros estudios fue realizado por R.B. Setlow y sus colegas, en Oak Ridge National Laboratory.2 En una serie de experimentos, estos investigadores compararon la capacidad de clulas normales y de clulas derivadas de XP para excindir dmeros de pirimidina, que es el primer paso en la va de la reparacin (fig. 13-29). Se incubaron dos tipos de clulas con 3H-timidina durante 24

CUADRO VE 13-1. ndice de marcado de fibroblastos de piel humana incubados durante tres horas en timidina-3H luego de varias dosis de luz ultravioleta Testigo Normal Xeroderma pigmentosum (5 aos de edad, sexo masculino) Xeroderma pigmentosum (9 aos de edad, sexo femenino) Xeroderma pigmentosum (29 aos de edad, sexo masculino) 41.2% 24.2% 19.0% 22.2% 100 erg/mm2 100 % 25.3% 23.2% 28.9% 500 erg/mm2 100 % 24.6% 21.0% 29.2%

1 000 erg/mm2
100% 27.4 % 15.0% 26.0%

FUENTE: Reimpreso con permiso de J.E. Cleaver, Nature 218:655, 1968. Copyright 1968, Macmillan Magazines Ltd.

572

CAPITULO 13 Duplicacin y reparacin del DNA

60

CLULAS NORMALES

Clulas de Xeroderma pigmentosum

50

36 30

48

12

24

J6

TIEMPO DE INCUBACIN (HORAS)

20

10

10

100
Dosis UV (erg/mm2)

1.000

FIGURA VE 13-2. Cuando las clulas normales se someten a radiacin UV (curvas de a izquierda) se forman dmeros que contienen timina en el DNA, pero con el tiempo desaparecen segn lo explica el descenso de cada una de las curvas, que representan experimentos separados con diferentes exposiciones a UV. En contraste, los dmeros que contienen timina formados en el DNA de clulas XP luego de exposicin UV similar, no desaparecen con el tiempo (curvas de la derecha). Las curvas individuales representan experimentos separados. (Segn R.B. Setlow y cois. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 64:1038, 1969.)

FIGURA VE 13-1. Nmero de granos plateados contados sobre los ncleos de clulas que no participan en la duplicacin premittica (fase S). Las clulas se expusieron a diferentes dosis de radiacin UV, a continuacin se incubaron durante tres horas en 3H-timidina, se lavaron para liberarlas de! istopo no incorporado y se prepararon para autorradiografa. Los tringulos macizos son cuentas sobre los ncleos de las clulas normales de 3a piel, los crculos cerrados son cuentas sobre los ncleos de clulas XP, y los crculos abiertos son el nmero basal de granos plateados sobre una regin de la laminilla equivalente a un ncleo celular. La incorporacin de 3H-timidina por las clulas XP no es significativamente diferente del nivel basal, lo que explica la virtual ausencia de la sntesis de DNA para reparacin. (Reimpreso con permiso de /.E. Cleaver, Nature 215:655, 1968; copyright 1968 Macmillan Magazines Limited.)

horas, de modo que su DNA fuera marcado con radiactividad. Luego del periodo de marcado, las clulas se lavaron para liberar las del istopo, se aadi medio no marcado a los cultivos, y las clulas se irradiaron a travs del fondo de cajas de Petri con luz ultravioleta. Luego del periodo de irradiacin se extrajeron muestras de los dos grupos de clulas y se determin la proporcin de timina marcada presente como dmeros de pirimidina que contienen timina mediante hidrlisis acida del DNA seguida por cromatografa en papel. Los resultados de los experimentos se muestran en la figura VE 13-2. En tanto que las clulas normales pudieron eliminar 50 a 70% de los dmeros en un periodo de 24 horas, las clulas XP mostraron excisin escasa o ausente. La tasa inicial promedio de excisin en las clulas XP era menor a la dcima parte de la observada en las clulas testigo. En una segunda parte del estudio, los investigadores intentaron determinar el nmero relativo de roturas en la cadena simple del DNA de clulas normales y de clulas XP sometidas a radiacin UV. La presencia de roturas en la cadena simple demuestra la actividad de endonucleasa requerida para eliminar un dmero de pirimidina en el primer plazo de la reparacin con excisin del nucletido (fig. 13-29). Para investigar las roturas en la cadena simple, se extrajo DNA de clulas

irradiadas, se extendi en una capa sobre un gradiente de sacarosa alcalina y se someti a ultracentrifugacin durante 90 minutos a 30 000 rpm. Los fragmentos ms grandes de DNA {con mayor coeficiente de sedimentacin) se desplazan ms rpido durante la centrifugacin, comparados con fragmentos ms pequeos y, como resultado, se localizan ms cerca del fondo del tubo al concluir el periodo de sedimentacin. La alcalinidad de los gradientes provoca la separacin de las dos cadenas de cada DNA dplex, y por lo tanto las cadenas que presentan roturas en su longitud se comportan como molculas ms pequeas en los gradientes en comparacin con las que carecen de dichas roturas. Los resultados de este tipo de experimentos efectuados sobre clulas normales se muestran en la figura VE 13-3. Diez horas despus de la irradiacin, la constante de sedimentacin de DNA de clulas irradiadas es considerablemente menor que la de las clulas no irradiadas, !o que indica la presencia de roturas en las cadenas simples. Cerca de las 24 horas, el DNA de las clulas irradiadas y no irradiadas muestra un perfil similar de sedimentacin indicando que la rotura de las cadenas simples se ha reparado. Por lo contrario, el perfil de sedimentacin del DNA extrado de clulas XP irradiadas permanece igual en todo momento despus de la irradiacin, lo que demuestra la ausencia de roturas en las cadenas simples del DNA. Estos resultados sugieren que las clulas XP carecen de endonucleasa funcional capaz de efectuar la incisin en la cadena de DNA que contiene un drnero de pirimidina. La reparacin por excisin de nucletidos es un proceso complicado y de mltiples pasos y no hay razn para esperar que todos los pacientes con XP tengan presente el mismo gen defectuoso. En 1969 se desarroll una manera relativamente sencilla de probar esta premisa utilizando la fusin celular.3 Como se ilustra en la figura 4-25, es una tcnica en la cual se fusionan dos clulas de tipo diferente para producir una clula hbrida que contiene los cromosomas combinados de ambas clulas participantes. Consideremos lo que sera de esperar si

CAPITULO 13 Duplicacin \j reparacin del DNA

573

I05hr

10a

101

10a

10'

10a

10'

o< O- Q
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FRACCIN NUMERO

FIGURA VE 13-3. Patrones de sedimentacin del DNA extrado de clulas normales que sirvieron como testigos no irradiados (crculos abiertos) o irradiados en el tiempo cero con 150 ergs/mm 2 de uz UV (tringulos cerrados). Las clulas crecieron durante los tiempos indicados antes de sedimentar el DNA a travs de un gradiente de densidad en sacarosa alcalina (la alcalinidad garantiza que los sedimentos de DNA correspondan a cadenas sencillas). En el lado izquierdo de cada curva se muestra el sedimento del fondo de cada tubo de la centrfuga (que contiene las cadenas de mayor tamao). La presencia de actividad para reparacin del DNA est indicada por el pico de cadenas de DNA de menor tamao a las 10.5 horas, lo que refleja la presencia de roturas en la cadena sencilla que acompaa al proceso de reparacin. Este pico desaparece despus que se une el DNA reparado a las cadenas no alteradas. Las flechas indican las posiciones esperadas del DNA de cadena nica con pesos moleculares de 107 y 10S, segn se pudo estimar por experimentos separados de sedimentacin de DNA marcado con 3H-timidina de un fago. (Segn R.B. Setlow y cois. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 64:1039, 1969.)

tanto recupere su capacidad para reparar DNA. Este fue precisamente el resultado observado.4 Cuando se fusionaron clulas de varios pacientes con XP en diferentes combinaciones, algunos de los hbridos retuvieron su sensibilidad a UV indicando que ambas clulas contenan defectos en el mismo gen. Otros hbridos mostraron complementacin gentica, segn pudo juzgarse por la escasa incorporacin de 3H-timidina, revelada autorradiogrficamente. En la figura VE 13-4 se muestra un ejemplo de este tipo de experimento, en el cua! es evidente que la timidina se incorpora al DNA como parte de un proceso de reparacin ms bien que como parte de la duplicacin normal que ocurre durante la fase S, puesto que el nivel de incorporacin es varios rdenes de magnitud menor que el observado en la fase S de las clulas. Adems, la escasa incorporacin de este tipo de reparacin nunca se observa en hbridos formados entre dos clulas de la misma cepa de XP (o sea, del mismo paciente), sino que slo ocurre cuando las clulas fusionadas proceden de cepas diferentes. En los siguientes aos se efectuaron numerosos estudios para probar la capacidad de las clulas XP de diferentes pa-

se fusionaran dos clulas que contengan diferentes defectos genticos. Puesto que la clula hbrida debe contener los alelos normales para ambas funciones genticas, debe poseer un fenotipo normal. En otras palabras, los cromosomas de las dos clulas pueden complementarse entre s puesto que los defectos se encuentran en genes separados. Por lo contrario, si las dos clulas participantes tienen defectos en genes iguales, entonces la clula hbrida carecer de un gen normal para esta caracterstica y mostrar el mismo defecto gentico de ambas clulas participantes. La primera prueba de esta premisa se realiz utilizando dos cepas diploides masculinas humanas, cada una portadora de una mutacin diferente vinculada al cromosoma X. Una cepa era incapaz de producir glucosa 6-fosfato deshdrogenasa funcional y la otra de producir hipoxantina-guanina-fosforribosil transferasa funcional. Las clulas hbridas resultantes mostraron que podan sintetizar productos normales de ambos genes, confirmando la capacidad de los cromosomas X de las dos clulas para complementarse entre s.3 La primera vez que se us la hibridacin celular para probar la complementacin intergnica en el xeroderma pigmentosum se efectu en 1972 en el laboratorio de Dirk Bootsma, en la Universidad Erasmus de Holanda. Se sospechaba que el XP poda ser resultado de dificiencias en diferentes sitios del gen, puesto que no todas las personas con la enfermedad mostraban los mismos sntomas o gravedad de la enfermedad. Si diferentes personas con XP presentan mutaciones en diversos sitios del gen, entonces sera de esperar que alguno de los hbridos resultantes de la fusin de clulas de distintos pacientes posea un complemento ntegro del gen "normal", y por lo

FIGURA VE 13-4. Empleo de la fusin de clulas para demostrar que el XP puede ser por defectos en diferentes genes de distintos pacientes. Se marcaron fibroblastos de dos pacientes con XP por inclusin de esferitas de ltex de diverso dimetro y luego fusionadas entre s mediante la adicin de un virus Sendai inactivado. A continuacin el cultivo se someti a irradiacin UV y despus se incub en presencia de 3H-tirnidina. Mediante radiografas se vigil la incorporacin de los precursores marcados al DNA como resultado de la reparacin por excisin de nucletidos. El nivel de reparacin del DNA en un ncleo se refleja en el nmero de granos plateados observados sobre dicho ncleo. La micrografa muestra tres clulas: una clula hbrida y dos clulas no fusionadas. La clula no fusionada del grupo XP-C contiene las esferitas de mayor tamao y la clula no fusionada del grupo XP-G contiene las esferitas de menor tamao. Una de dichas clulas no muestra capacidad para reparacin del DNA y la otra muestra actividad muy limitada. La clula hbrida situada cerca del centro de la micrografa contiene dos ncleos, uno de cada paciente (segn se indica por la presencia de ambos tipos de esferitas en el citoplasma). Los dos ncleos muestran granos plateados, lo que significa la capacidad de los genes de uno de los ncleos para suplir el defecto de los genes del otro ncleo. (Segn }an H.J. HoejmcAers, Trends in Genetics 9:211, 1993.)

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CAPITULO 13 Duplicacin y reparacin del DNA

cientes para complementarse entre s utilizando la prueba de fusin celular. El anlisis de los hbridos formados a partir de un gran nmero de combinaciones sugiere que las clulas de los pacientes XP se pueden dividir en siete "grupos de complementacin" diferentes conocidos como XP-A a XP-G.5 Siempre que se fusionaron dos clulas de diferentes grupos de complementacin, los hbridos recuperaron su capacidad para efectuar reparacin del DNA. Estos resultados sugieren que cuando menos siete genes diferentes codifican productos necesarios para reparar DNA daado por UV, lo que refleja la complejidad del proceso. Conforme prosiguieron los estudios en el hombre, otros investigadores pudieron aislar clulas de roedores sensibles a la luz UV y se asumi que mostraban deficiencias de reparacin del DNA similares a las observadas en clulas aisladas de personas con XP.6 Estas estirpes de clulas de roedores demostraron ser valiosas como medio para aislar genes humanos implicados en la reparacin con excisin de nucletidos. Consideremos una clula de roedor que tiene la misma deficiencia que una persona incluida en uno de los grupos XP. Si esta clula captara un fragmento de DNA humano que contenga el gen normal en el sitio correspondiente, entonces esta clula transfectada debe recuperar su capacidad de reparar DNA y mostrar resistencia normal a la luz UV. Las pocas clulas de la poblacin que recuperan su capacidad normal de reparar DNA se pueden seleccionar entonces exponiendo el cultivo de clulas a la luz UV, tratamiento que debe matar a las clulas todava con reparacin deficiente. (La seleccin tambin se puede efectuar incorporando genes que resisten la accin de ciertos frmacos en los fragmentos de DNA humano y seleccionando las clulas transfectadas usando el frmaco.) Una vez obtenido un cultivo de clulas transfectadas resistentes a UV se puede extraer el DNA, y el fragmento de DNA humano encargado de corregir la deficiencia de reparacin del DNA se puede aislar e identificar e producto que codifica. Los fragmentos de DNA humano pueden purificarse selectivamente a partir del DNA de roedores debido a que contienen secuencias de DNA marcadoras que se pueden usar como blancos para las sondas de DNA utilizadas durante e procedimiento de aislamiento. Utilizando esta tcnica de transfeccin-correccin, los investigadores pudieron aislar varios genes de DNA humano que codifican protenas para reparar DNA. Puesto que se aislaron debido a su capacidad de complementar defectos en clulas de roedores, estos genes humanos se denominan genes KECC (reparacin por excisin cruzada complementaria). El primero de estos genes aislado se llam RECC1, y la secuencia de aminocidos codificada mostr homologa significativa con un gen denominado RADIO aislado de clulas de levadura y que se saba participaba en la reparacin por excisin de DNA.7 Adems de suministrar una base para investigar el papel de los genes de reparacin humanos en comparacin con sus contrapartes, las levaduras, cuya funcin estaba bastante bien establecida, estos experimentos proporcionaron la primera indicacin de que los sistemas de reparacin de DNA eran altamente conservados en organismos eucariotas, desde levaduras hasta el hombre. En los siguientes aos se establecieron otras correlaciones entre los genes RECC humanos y los genes RAD de levaduras.

Por ejemplo, se descubri un segundo gen humano capaz de corregir una deficiencia de reparacin de DNA en clulas de roedores sensibles a la radiacin UV y se le design como RECC2. El anlisis de la secuencia de nucletidos del RECC2 indica que codifica un polipptido homlogo al RAD3, un gen de levadura cuyo producto acta como DNA helicasa 5' 3' dependiente de ATP.8 Las helicasas son enzimas que participan en el desenrollamiento del DNA dplex durante transcripcin, duplicacin, reparacin y recombinacin (p^g. 557). Tambin se descubri un tercer gen humano, RECC3, que codifica una protena con actividad de DNA helicasa. De igual importancia, la RECC3 fue capaz de corregir la sensibilidad UV de las clulas de uno de los grupos de complementacin XP, especficamente XP-B.9 Anlisis subsecuentes indicaron que uno de los pacientes afectados con XP cuyas clulas corresponden al grupo de complementacin XP-B era portador de una mutacin del gen RECC3 en el cual una citidina del DNA estaba sustituida por una adenina. En los siguientes aos se aislaron algunos genes de DNA humano capaces de corregir las deficiencias de reparacin de DNA en estirpes de clulas de roedores y en fibroblastos de piel derivados de pacientes con XP, y se pudieron correlacionar con genes RAD de levaduras.Revisado en 10 Un conocimiento importante acerca del papel del producto del gen RECC3 provino de un estudio efectuado en 1993 sobre un tema que se pensaba no tena relacin alguna con la reparacin del DNA. En la pgina 449, se describi que el inicio de la transcripcin requiere el ensamblado de un complejo de preinicio constituido por RNA polimerasa junto con algunas protenas conocidas como factores generales de transcripcin. Uno de los factores que opera con la RNA polimerasa II se denomina TFIIH, una protena de mltiples subunidades que previamente se haba demostrado que actuaba como proteincinasa para fosforilar el dominio C terminal de la polimerasa antes de la transcripcin. Estudios efectuados en los laboratorios de Jean-Marc Egly, en Estrasburgo, Francia, demostraron que el TFIIH purificado poda actuar corno helicasa dependiente de ATP en diferentes tipos de ensayes. Por ejemplo, TFIIH poda desplazar un oligonucletido marcado de una cadena complementaria a la cual se encontraba enlazado mediante un puente de hidrgeno. Se cree que la apertura del DNA dplex por la helicasa suministra acceso a la RN, A polimerasa a la plantilla de DNA de la cadena. Cuando se determinaron las secuencias de aminocidos del trptico digerido de subunidades de polipptido de TFIIH se hizo un sorprendente descubrimiento.11 La secuencia de aminocidos de una de las subunidades era idntica a la determinada previamente para el producto del gen RECC3. Estos datos sugieren que el producto del gen RECC3 tiene un doble papel en el desenrollamiento del DNA para preparar tanto la transcripcin como la reparacin del mismo. Esta expectativa pronto se confirm al demostrar que la helicasa de RAD25, el equivalente de RECC3 en las levaduras, tambin se requiere para la transcripcin mediada por la RNE polimerasa II.12-13 Algunas publicaciones recientes demuestran que el producto del gen RECC2 tambin es una subunidad del compiejo TFIIH. Estos descubrimientos pueden indicar por qu se repara preferencialmente la plntula de la cadena de genes activos a

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nivel de transcripcin. Si una RNA polimerasa se desplaza a lo largo de la plantilla de la cadena y se detiene al encontrar una lesin en su camino, entonces TFIIH puede "desembarcarse" del mecanismo de transcripcin y desenrollar el DNA dplex

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generando regiones de una sola cadena accesible a otras protenas de reparacin. Uno de los primeros pasos en la reparacin por excisin de nucletido es una incisin de cinco nucletidos en el lado 5' de la lesin. Datos recientes indican que esta incisin tiene lugar gracias a una endonucleasa codificada por el gen XPG, o sea, el gen defectuoso en personas con XP cuyas clulas caen dentro del grupo de complementacin XP-G.14 Uno de los experimentos descritos en este trabajo se ilustra en la figura VE 13-5. En este experimento se construy una molcula de doble cadena de DNA de 90 pares de bases de longitud, incluyendo una regin central de 30 pares de bases no complementarias que formaban una burbuja de una sola cadena. Se cree que esta estructura de burbuja es parecida a la que se forma cuando el DNA daado se desenrolla en la regin de una lesin en masa, como un dmero de pirimidina. El extremo 5' de una de las cadenas fue marcado con 32P, segn se indica con el asterisco en la figura. El DNA que contiene la burbuja se incub con una preparacin de protena purificada codificada por el gen XP-G y los productos de la reaccin del DNA se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida bajo condiciones desnaturalizadoras (o sea, condiciones donde el DNA puede presentarse como cadenas simples). Los resultados de la electroforesis se muestran en la columna dos de! gel, indicando la presencia de una cadena de DNA aproximadamente de 63 nucletidps de longitud. Como se muestra en el dibujo acompaante, estos resultados indican que la protena XPG desdobla la cadena marcada de la burbuja cercana al extremo 3' de la regin donde no hay pares, aproximadamente a tres bases de la regin adyacente de doble cadena (indicada por la flecha en el diagrama). As se demostr que la endonucleasa XPG desdobla una molcula de DNA que contiene una burbuja semejante a un sitio especfico donde debe efectuarse una reparacin en la estructura. Como era de esperar, las clulas cultivadas de pacientes XP-G no producen protenas con esta actividad endonucleoltica particular. Conforme se purifiquen ms y ms protenas implicadas en la reparacin por excisin de nucletidos y se determine su actividad in vitro, ms pronto se dilucidar la secuencia de acontecimientos necesarios para este tipo de reparacin.

BIBLIOGRAFA i
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FIGURA VE 13-5. a) XPG (producto del gen XPG) secciona la estructura del DNA mostrado aqu en el lado 3' de la burbuja, segn se describe en el texto. El asterisco en el extremo 5' de una de las cadenas es el sitio del tomo 3!P radiactivo, b) Resultado de la electroforesis en gel de poliacrilamida. La lnea 1 contiene oligonucletidos marcados con 32P de tamao conocido (indicadas a la izquierda del gel), que sirve para calibrar el gel. La lnea 2 contiene los productos del experimento descrito en el texto en el cual se incub la burbuja del sustrato de DNA con XPG antes de la electroforesis. El ncleo ti do-63, con una cadena de DNA marcada, se gener por la actividad endonucleoltica de XPG. La lnea 3 muestra un experimento que verifica la estructura del sustrato. La lnea 4 seala un testigo en el cual la burbuja de sustrato de DNA no se incub con XPG. (Reimpreso con permiso segn Arme O'Donovan \j cois. Nature 371:432, 1994; copyright 1994 Macmillan Magazines Limited.)

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6. Thompson, L.H. 1981. Genetic diversity of UV-sensitive DNA repair mutants of Chnese hmster ovary cells. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78:3734-3737. 7. van Duin, M. 1986. Molecular characterization of the human excisin repair gene ERCC-1: cDNA cloning and amino acid homology with the yeast DNA repair gene RADIO. Cell 44:913-923. 8. Weber, C.A. y cois. 1990. ERCC2: cDNA cloning and molecular characterizaon of a human nucieotide excisin repair gene with high homology to yeast RAD3. EMBO }. 9:1437-1447. 9. Weeda, G. y cois. 1990. A presumed DNA helicase encoded by ERCC-3 is involved in the human repair disorders xeroderma pigmentosum and Cockayne's syndrome. Cell 62:777-791. 10. Hoeijmakers, J.H.J, 1993. Nucieotide excisin repair II: From yeast to marnmals. Trenas Cenetics 9:211-217.

11. Schaeffer, L. y cois. 1993. DNA repair heicase: A component of BTF (TFIIH) basic transcription factor. Science 260:58-63. 12. Drapkin, R. y cois. 1994. Dual tole of TFIIH in DNA excisin repair and in transcription by RNA polymerase II. Nature 368:769772. 13. Guzder, S.N. y cois. 1994. RAD25 is a DNA helicase required for DNA repair and DNA polymerase II transcription. Nature 369: 578-581. 14. O'Donovan, A. y cois. 1994. XPG endonuclease makes the 3' incisin in human DNA nucieotide excisin repair. Nature 371:432-435.

SINOPSIS
La duplicacin del DNA es semiconservadora, lo que quiere decir que durante la divisin celular cada una de las clulas hijas recibe una mitad del dplex original. Este mecanismo ae duplicacin ru sugerido por primera vez por Watson y Crick corno parte de su modelo de la estructura del DNA. Ellos sugirieron que la duplicacin ocurre por separacin gradual de las cadenas debido al rompimiento de los puentes de hidrgeno, de modo que cada cadena puede servir como plantilla para la formacin de una cadena complementaria. Pronto se confirm este modelo en clulas bacterianas y eucariotas al demostrar que las clulas de una generacin transferidas a medios marcados con radiactividad producen clulas hijas cuyo DNA posee una cadena marcada y una cadena no marcada Una de las cadenas recin sintetizadas (la cadena delantera) crece en direccin hacia la bifurcacin de duplicacin y se
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zada (la cadena retrasada) crece alejndose de la bifurcacin y se sintetiza de manera discontinua. En clulas bacterianas, la cadena retrasada se sintetiza como fragmentos de unos 1 000 a 2 000 nucletidos de largo, denominados fragmentos de Okasaki, que se unen por enlaces covalentes entre s medante una DNA ligasa. En contraste, la cadena delantera se sintetiza como cadena simple continua. La DNA poimerasa no puede iniciar la cadena continua ni los fragmentos de Okasaki, sino que slo puede formar un iniciador RNA corto sintetizado por

un tipo d.g RN.A polimerasa. Despus de ensamblar Q! iniciadot RMA*, laDNApc.\Yme?asa contina sintetizando la cadena o el fragmento como DNA. A continuacin el RNA se descompone y la abertura se llena con un DNA (/'- 553). Lt> -qu-e orarte en la bifurcacin de duplicacin requiere diferentes tipos de protenas con funciones especializadas. Entre estas se incluye una DNA girasa, que es un tipo de topoisornerasa II requerida para liberar la tensin que se genera como resultado del desenrollamiento del DNA; una DNA helicasa que desenrolla el DNA separando las cadenas; protenas que se uneYi selectivamente al DNA de una sola cadena y evitan que se vuelvan a reasociar; una RNA primasa, que es la enzima que sintetiza los iniciadores RNA al principio de cada fragmento de Okasaki; y una DNA ligasa que sella los fragmentos de la cadena retrasada para formar un polinucletido continuo. La DNA poimerasa III es la enzima sintetizadora de DNA primaria que aade nucletidos a cada iniciador RNA, en tanto que la DNA poimerasa I se encarga de eliminar los iniciadores RNA y remplazarlos con DNA. Se cree que dos molculas de DNA poimerasa III se desplazan juntas en forma de un complejo en direcciones opuestas a lo largo de sus respectivas plantillas. Esto se logra manteniendo la plantilla de la cadena retrasada enroscada hacia atrs sobre s misma. El inicio de la duplicacin requiere protenas adicionales que se enlazan a secuencias repetitivas de nucletidos dentro del origen, lo que provoca la separacin de las cadenas y el reclutamiento de las protenas necesarias para la duplicacin (p- 550).

Los mecanismos de duplicacin son mejor comprendidos en la clula bacteriana. La duplicacin se inicia en un solo origen sobre el cromosoma bacteriano circular y procede hacia frica en ambas direcciones como un par de bifurcaciones de duplicacin. Las bifurcaciones de duplicacin son sitios donde se desenrolla la doble hlice y se incorporan nucletidos en ambas cadenas recin sintetizadas (p. 548). La sntesis de DNA es catalizada por una familia de DNA polimerasas. La primera de estas enzimas que se caracteriz fue la DNA poimerasa I de . cali. Para catalizar la reaccin de polimerizacin, la enzima requiere cuatro trifosfatos de desoxiribonuclesido, una plantilla de la cadena que debe copiar y un iniciador que contenga un 3' OH libre al cual se puedan aadir nucletidos. El iniciador es necesario porque la enzima no puede empezar la formacin de una cadena de DNA. Ms bien, slo es capaz de aadir nucletidos a la terminal 3' hidroxilo de una cadena existente. Otra caracterstica inesperada de la DNA polirnerasa I es que slo puede polimerizar una cadena en la direccin 5' -> 3'. Se supone que las dos cadenas nuevas seran sintetizadas en direcciones opuestas por polimerasas que se mueven en direcciones opuestas a lo largo de dos plantillas de las cadenas progenituras. Este descubrimiento se explic al demostrar que las dos cadenas se sintetizan de manera muy diferente (p. 551).

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Las DNA polimerasas poseen sitios catalticos separados para la polimerizacin y la descomposicin de las cadenas de cidos nucleicos. La mayor parte de las DNA polimerasas poseen exonucleasas 5' -> 3' y 3' - 5'. La primera de estas dos nucleasas se usa para degradar a los iniciadores RNA al principio de los fragmentos de Okasaki, y la segunda se utiliza para eliminar un nucletido inapropiado luego de su incorporacin equivocada, contribuyendo as a la fidelidad de la duplicacin. Se estima que cerca de uno de cada 109 nucletidos se incorporan de manera incorrecta durante la duplicacin en E. coli. Este elevado grado de fidelidad se mantiene mediante tres comprobaciones separadas: 1) la DNA polimerasa puede calibrar la geometra del par de bases formado por un nucletido recin incorporado antes que el nucletido se una por enlace covalente al extremo del iniciador; 2) cuando se incorpora un nucletido incorrecto, de ordinario es eliminado por la actividad exonucleasa 3' > 5' de la polimerasa, que acta como mecanismo corrector de pruebas; 3) se puede eliminar un nucletido incorrecto incorporado despus de la duplicacin mediante un proceso de reparacin de bases no coincidente (p. 560). La duplicacin en clulas eucariotas sigue mecanismos similares y emplea protenas semejantes a las empleadas en procariotes. Hasta la fecha se han aislado cinco DNA polimerasas diferentes de las clulas eucariotas; todas ellas alargan las cadenas de DNA en la direccin 5' 3'. Ninguna de ellas puede iniciar la sntesis de una cadena sin iniciador. La mayor parte posee actividad exonucleasa 3' > 5', garantizando que la duplicacin ocurra con alta fidelidad. A diferencia de los procariotes, la duplicacin en eucariotes se inicia simultneamente en muchos sitios a lo largo de un cromosoma con bifurcaciones de duplicacin que proceden hacia afuera en ambas direcciones a partir del sitio de inicio. Los estudios con levaduras indican que la duplicacin se origina en sitios que contienen un lugar especfico de enlace para un complejo multiprotenico esencial (p. 562). La duplicacin en clulas eucariotas est ntimamente relacionada con estructuras nucleares. Las pruebas indican que gran parte del mecanismo necesario para la duplicacin se relaciona con la matriz nuclear. Adems, las bifurcaciones de duplicacin activas en cualquier momento dado al parecer se

localizan entre unos 50 a 250 sitios llamados focos de duplicacin, que tambin contienen las enzimas encargadas de metilar DNA despus de su sntesis. El DNA recin sintetizado rpidamente se asocia a los nucleosomas. Los octrneros de histona presentes antes de la duplicacin permanecen intactos y pasan a las hijas dplex, en tanto que las histonas recin sintetizadas se ensamblan en una nueva partcula central. Se cree que las partculas centrales nuevas y viejas se distribuyen al azar entre los complejos de hijas (p. 564). El DNA est expuesto a muchas influencias ambientales nocivas, incluyendo radiacin ionizante, sustancias qumicas comunes y radiacin ultravioleta. Las clulas poseen varios sistemas para reconocer y reparar los daos resultantes. Se estima que menos de una base se modifica en 1 000 salvamentos efectuados por los sistemas de reparacin de la clula. En algunos casos, el dao se puede reparar directamente, pero en la mayor parte la seccin daada debe ser escindida y sustituida por DNA recin sintetizado. Se conocen tres principales tipos de sistemas para reparacin del DNA. Los sistemas de reparacin por excisin de nucletido (REN) operan por eliminacin de una pequea parte de la cadena de DNA que contiene una lesin generalizada, como los dmeros de pirimidina. Durante la reparacin REN, una endonucleasa efecta un par de incisiones, una hclicasa elimina el oligonucletido daado, la abertura se llena mediante la accin de una DNA polimerasa y una DNA ligasa sella la cadena. Las plantillas de cadenas para genes activamente transcritos tienen prioridad en el sistema de reparacin por excisin de nucletido. La reparacin por excisin de bases acta eliminando los nucletidos alterados que provocan deformaciones menores en la hlice de DNA. Las clulas poseen varias glucosilasas capaces de reconocer y eliminar algunos tipos de bases alteradas. Una vez eliminada la base, la porcin restante del nucletido se separa mediante una endonucleasa, la abertura se ampla gracias a la accin de una fosfodiesterasa, y se llena y sella mediante una polimerasa y una ligasa. La reparacin de los pares de bases no coincidentes es un mecanismo que se encarga de eliminar a los nucletidos incorrectos incorporados durante la duplicacin que escaparon a la correccin de pruebas efectuada por la actividad de la polimerasa. La falta de grupos metilo en la cadena recin sintetizada en comparacin con la cadena progenitora indica que debe ser reparada (p. 565).

PREGUNTAS DE REPASO
1. En su hiptesis original para la duplicacin del DNA, Watson y Crick propusieron la sntesis continua de cadenas de DNA. Cmo y por qu razn se ha modificado este concepto en los aos subsecuentes? 2. Qu significa duplicacin semiconservadora? Cmo se demostr esta caracterstica de la duplicacin en clulas bacterianas? En clulas eucariotas? 3. Por qu no se observan bandas pesadas en la parte superior de los tubos de centrfuga de la figura 13-3? 4. Cmo se pueden obtener mutantes cuyos defectos se siten en los genes requeridos para una actividad esencial, como la duplicacin del DNA? 5. Describir lo que ocurre durante un origen de duplicacin al inicio de la misma, tanto en clulas bacterianas como en levaduras. Qu significa que la duplicacin es bidireccional? 6. Por qu razones especficas las molculas de DNA mostradas en la figura 13-7, a, no estimulan la polimerizacin de nucletidos por la DNA polimerasa I? Cules son las propiedades de una molcula de DNA que le permiten servir como plantilla para incorporar nucletidos gracias a la accin de la DNA polimerasa I? 7. Describir el mecanismo de accin de las DNA polimerasas que operan sobre las cadenas de ias dos plantillas y el

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CAPITULO 13 Duplicacin y reparacin del DNA

efecto que tienen sobre la sntesis de la cadena retrasada en comparacin con la cadena delantera. 8. Contrastar el papel de las DNA polimerasas I y III en la duplicacin bacteriana. 9. Describir el papel de la DNA helicasa, las cadenas nicas enlazadas, las pinzas fi, la DNA girasa, y la DNA ligasa durante la duplicacin de una bacteria. 10. Cul es la ventaja de mantener el DNA de la plantilla de la cadena retrasada enrollada sobre s misma hacia atrs, como en la figura 13-16, al 11. En qu difieren las dos actividades exonucleasa de la DNA polimerasa I entre s? Cules son sus respectivos papeles en el proceso total de duplicacin?

12. Describir los factores que contribuyen a la elevada fidelidad de la duplicacin del DNA. 13. Cul es la principal diferencia entre la duplicacin bacteriana y la eucariota que permite a una clula eucariota duplicar su DNA en un periodo razonable? 14. Comparar lo que ocurre durante la reparacin por excisin de nucletido y la reparacin por excisin de base. 15. Por qu es importante en la reparacin de bases no coincidentes que la clula pueda reconocer diferencias entre la cadena progenitura y las cadenas recin sintetizadas? Cmo se logra dicho reconocimiento?

PREGUNTAS ANALTICAS
1. Asumiendo que la mayor parte de las mutaciones ocurren durante la duplicacin, sera de esperar que la frecuencia de mutaciones de leucocitos adultos muestre alguna diferencia en comparacin con as de clulas musculares o esquelticas? Por qu s o por qu no? 2. De ordinario se dice que la molcula de DNA polimerasa se desplaza a lo largo de la plantilla conforme sintetiza una cadena complementaria de DNA. En el modelo que se muestra en la figura 13-25, cmo se podra corregir esta afirmacin? 3. Supongamos que Meselson y Stahl efectuaron su experimento desarrollando clulas en un medio con 14N y luego transfirieron las clulas a un medio con 15N. Cmo apareceran las bandas en el tubo de la centrfuga si la duplicacin fuera semiconservadora? Si fuera conservadora? Si fuera dispersiva? 4. Observar la autorradiografa de la figura 13-5; cmo aparecera esta molcula de DNA luego de dos vueltas completas de duplicacin en 3H-timidina? Despus de 2.8 vueltas? 5. Cmo apareceran los cromosomas en el experimento efectuado sobre clulas eucariotas mostrado en la figura 13-4 si la duplicacin ocurre por un mecanismo conservador o dispersivo? 6. Qu propiedades de oriC hacen indispensable incluir un origen de duplicacin en un experimento in vitro para probar el papel de una protena particular de duplicacin? 7. Dibujar una molcula de DNA de doble cadena parcial que no sirva como plantilla para la sntesis del DNA mediante la accin de la DNA polimerasa I. 8. Algunos imitantes bacterianos sensibles a temperatura detienen de inmediato la duplicacin luego de elevacin de la temperatura, en tanto que otros continan duplicando su DNA por un apso antes de detener dicha actividad, e incluso otros continan hasta que concluye la vuelta de duplicacin. Cmo se pueden diferenciar estos tres tipos de imitantes? 9. Asumiendo que la tasa de errores durante la duplicacin fuera igual en clulas humanas que en clulas bacterianas (cerca de 10~9), cul sera el impacto sobre estas dos clulas diferentes? 10. La figura 13-22 muestra los resultados de un experimento en el cual se incubaron clulas con 3H-tirnidina durante menos de 30 minutos antes de fijarlas. Cul sera el aspecto de esta fotografa despus de un periodo de una hora de marcado? Se podra concluir que todo el genoma se duplica en una hora? En caso negativo, por qu no? 11. Por qu durante el inicio de la duplicacin se puede separar una cadena sin ayuda de la DNA helicasa, pero en otros sitios la separacin de cadenas requiere este tipo de enzima? 12. Qu ventaja sera de esperar si la duplicacin de DNA ocurre junto con la duplicacin de la matriz nuclear y no con la del nucleoplasma? Cules son las ventajas de que la duplicacin ocurra en un pequeo nmero de focos de duplicacin? 13. Por qu razn sera de esperar que las clulas humanas cuenten con sistemas de reparacin ms eficientes en comparacin con las clulas de una rana? 14. Supongamos que se comparan autorradiografas de dos clulas expuestas a 3 H-timidina, una que particip en la duplicacin de DNA (fase S) y la otra no. Cul sera la expectativa entre las autorradiografas de dichas clulas? 15. Construir un modelo que explique la reparacin preferencial del DNA activo a nivel de transcripcin en comparacin con el DNA silencioso a nivel de transcripcin.

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CAPITULO

14

Reproduccin celular
14-1 El ciclo-de la clula 11-2 Fase M: mitosis y citocinesis 14-3 Meiosis La perspectiva humana: No disyuncin meitica y sus consecuencias La va experimental: Descubrimiento y caracterizacin del factor promotor de maduracin (FPM)

FIGURA 14-A. Microgmfa de fluorescencia de una clula cultivada del pulmn de una salamandra acutica en el proceso de mitosis. El huso mittico aparece de color verde despus de ser marcado con un anticuerpo monoclonal contra tubulna, en tanto que los cromosomas aparecen en azul luego de marcarlos con una coloracin fluorescente. (Cortesa de Conhj L Rieder, State University of New York, Albam/.)

egn el tercer principio de la teora celular, slo se originan nuevas clulas a partir de otras clulas vivientes; este proceso se denomina divisin celular. En un organismo multicelular, como el hombre o un rbol de encino, incontables divisiones de un cigoto unicelular producen un organismo de sorprendente complejidad y organizacin celular. La divisin celular no se detiene con la formacin del organismo maduro, sino que contina durante toda la vida. Se estima que en el adulto humano ms de 25 millones de clulas sufren divisin cada segundo. Esta enorme produccin de clulas es necesaria para sustituir las que han envejecido o muerto. Por ejemplo, las clulas sanguneas desgastadas son eliminadas y sustituidas por nuevas clulas a una velocidad de casi 100 millones por minuto. ada clula en etapa de divisin se denomina clula madre, y sus descendientes se llaman clulas hijas. Hay una razn para usar estos trminos "familiares". La clula madre transmite copias de su informacin gentica a sus clulas hijas, que representan la siguiente generacin celular. A su vez, las clulas hijas legarn a ser clulas madres de sus propias clulas hijas, transmitiendo los mismos genes que heredaron de su madre a otra nueva generacin de clulas. Por esta razn, la divisin celular con frecuencia se-denomina reproduccin celular. La divisin celular es algo ms que la simple produccin de clulas; es la base para la reproduccin de los organismos a travs de la formacin de gametos celulares. Por lo tanto, la divisin celular constituye el enlace entre un progenitor y su descendencia; entre especies vivientes y sus ancestros ya extinguidos, y entre los seres humanos y los primeros organismos celulares ms primitivos.

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14-1

El ciclo de la clula

Suele pensarse acerca de los procesos biolgicos en trminos de ciclos, que incluyen los de vida, los metablicos y los fisiolgicos. La vida es un proceso continuo en el tiempo y debe existir una renovacin continua o retorno a un estado inicial, de modo que el proceso pueda ocurrir una y otra vez. Se puede decir que cualquier clula tiene vida, igual que cualquier organismo determinado. La vida de una clula se inicia con su formacin a travs de la divisin de una clula madre y termina con la formacin de sus clulas hijas o con su muerte. Las etapas a travs de las cuales pasa la clula desde una divisin celular a la siguiente constituyen el ciclo de la clula (fig. 14-1). El ciclo de la clula se divide en dos fases principales segn las actividades celulares fcilmente visibles con el microscopio de luz; stas son la fase M (M = mittica) y la interfase. La fase M incluye: 1) mitosis, durante la cual los cromosomas duplicados se reparten entre dos ncleos, y 2) citocinesis, durante la cual toda la clula se divide fsicamente en dos clulas hijas. Segn el porcentaje promedio relativamente pequeo de clulas en mitosis observadas en un tejido o en un cultivo en cualquier momento, es evidente que la mayor parte del ciclo de la clula transcurre en interfase. La fase M de ordinario slo dura de 30 minutos a una hora, pero la interfase puede prolongarse horas, das, semanas o mayor tiempo segn el tipo de clula. Como se analiza ms adelante, en la fase M la clula se concentra en las actividades necesarias para la divisin celular: periodo donde la sntesis de macromolculas por lo general se suprime. En

contraste, la interfase es un periodo donde la clula crece en volumen y efecta funciones metablicas activas, como oxidacin de glucosa, transcripcin, traduccin y duplicacin. En la fase M, el contenido de la clula se divide fsicamente y durante la interfase ocurren numerosos preparativos para la mitosis inminente, incluyendo los importantes sucesos que implican la duplicacin del DNA celular. Podramos imaginar que una clula llega a su etapa de duplicacin a travs del periodo de interfase, pero estudios iniciales sobre clulas cultivadas demostraron que ste no era el caso. Cuando se administra 3H-tirnidina a un cultivo de clulas durante un breve periodo {p. ej.,30 minutos) y luego se toma una muestra de dichas clulas, se fija, se seca sobre una laminilla y luego se examina mediante autorradiografa, se encuentra que cierto porcentaje de las clulas presentan ncleos radiactivos. Sin embargo, ninguna de las clulas que participan en la mitosis en el momento de la fijacin (segn puede juzgarse por sus cromosomas condensados) incorpora el compuesto radiactivo. Los cromosomas de clulas mittcas no estn marcados porque no participan en la duplicacin del DNA durante el periodo de mareaje. Si se espera de una a pocas horas antes de tomar la muestra de clulas, en general todava no se encuentran clulas en mitosis marcadas (fig. 14-2). A partir de estos resultados se puede concluir que hay un perodo definido, llamado Gj (de segunda abertura), entre el final de la sntesis de DNA y el inicio de la fase M. La duracin de G2 se manifiesta continuando la toma de muestras de clulas del cultivo hasta observar cromosomas mitticos marcados. Las

Interfase

G,:

Las clulas crecen v efectan el metabolismo normal; los organelos se duplican

S: Duplicacin del DNA y duplicacin de los cromosomas

G2:

FIGURA 14-1. Ciclo de la clula eucariota. Este diagrama del ciclo celular indica las etapas de la clula desde una divisin a la siguiente. El ciclo celular se puede dividir en dos etapas: fase M e interfase. La fase M incluye las etapas sucesivas de mitosis y citocinesis. La interfase se divide en fases G], S y Gi, siendo la fase S equivalente al periodo de sntesis de DNA.

Las clulas crecen y se preparan para la mitosis

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capacidad de crecer y dividirse. Podemos reconocer tres categoras muy ampias de clulas: 1. Clulas con especializacin estructural extrema, como las clulas nerviosas, clulas musculares, o eritrocitos que han perdido la capacidad de dividirse. Una vez diferenciadas, permanecen en ese estado hasta su muerte. 2. Clulas que normalmente no se dividen, pero que pueden iniciar la sntesis de DNA cuando se enfrentan a un estmulo apropiado. En este grupo se encuentran las clulas hepticas, las cuales pueden proliferar cuando se extirpa quirrgicamente una parte del hgado, y los linfocitos que proliferan cuando interactan con el antgeno apropiado. 3. Clulas que normalmente poseen un nivel relativamente alto de actividad mittica. Ciertos tejidos del cuerpo estn sujetos a renovacin continua y deben formarse continuamente clulas nuevas mediante divisin celular. En esta categora se incluyen las clulas gomales (oogonias y espermatogenias) que dan lugar a los gametos, las estirpes celulares generadoras de leucocitos y eritrocitos, y las clulas epiteliales que revisten las cavidades y la superficie del cuerpo. Las clulas no especializadas del sistema meristmico apical localizadas en los extremos de las races y tallos de las plantas tambin muestran divisin celular rpida y continua. El anlisis de los ciclos celulares de una gran variedad de clulas revela la enorme variabilidad en la duracin de sus ciclos celulares, en particular cuando se examinan en diferentes etapas del desarrollo. Los ciclos celulares pueden variar desde menos de 30 minutos en las clulas de muy rpida divisin del embrin en crecimiento (diferentes de los mamferos que se dividen muy lentamente) hasta ciclos que duran varios meses en los tejidos de crecimiento lento, como el hgado de mamfero. Las clulas adultas de rpido crecimiento tpicamente se dividen cada 12 a 36 horas. De las tres etapas de la interfase, GI es la ms variable, aunque tambin pueden encontrarse diferencias mayores en S y G2Con algunas notables excepciones, las clulas que han detenido su divisin, sea de manera transitoria o permanente, en el cuerpo o en el medio de cultivo, se encuentran en etapa previa al inicio de la sntesis de DNA. Las clulas "detenidas" en esta etapa de ordinario se dice que se encuentran en estado GO para distinguirlas de la fase tpica GI que pronto se contina con la fase S. Como veremos ms adelante, una clula debe recibir una seal para proseguir desde GI a la fase S. Una vez recibida la seal para iniciar la duplicacin del DNA, la clula casi invariablemente completa la vuelta de sntesis de DNA y contina con la mitosis.

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Horas despus de la adicin de 3H-tmidin3 FIGURA 14-2. Los resultados experimentales demuestran que la duplicacin ocurre durante un periodo definido del ciclo celular. Se incubaron clulas HeLa cultivadas durante 30 minutos en un medio con 3H-timidina y luego se siguieron durante tiempos diferentes antes de fijarlas y prepararlas para autorradiografa. El plato de cultivo se rastre en busca de clulas en mitosis en el momento de ser fijadas, y el porcentaje de las clulas mitticas con cromosomas marcados se indica en la grfica mostrada. (Segn un estudio de R. Baserga y F. Wiebel.)

primeras mitosis marcadas que aparecen representan clulas que se encontraban en las ltimas etapas de la sntesis del DNA en el momento que se inici la administracin de 3H-timdina. El tiempo transcurrido entre el inicio del periodo de marcacin y la aparicin de clulas con figuras mitticas marcadas representa la duracin de G2La fase del ciclo celular durante la cual ocurre la duplicacin se denomina fase S, cuya duracin se puede determinar mediante seguimiento continuo del porcentaje de mitosis marcadas. Cuando se lleva a cabo este seguimiento se observa que el porcentaje aumenta hasta alcanzar una cifra constante (meseta) y luego desciende (fig. 14-2). El tiempo transcurrido para que aumente el nmero de mitosis marca la duracin de la fase S, cuya duracin tambin se puede determinar de manera ms directa. El porcentaje de clulas que participan en una actividad particular es una medida aproximada del porcentaje de tiempo que esta actividad ocupa en la vida de las clulas. Por lo tanto, si sabemos la duracin de todo el ciclo celular, la duracin de la fase S se puede calcular directamente a partir del porcentaje de clulas cuyos ncleos presenten marca radiactiva durante un breve pulso con 3H-timidina. De manera similar, se puede calcular la duracin de la fase M a partir del porcentaje de clulas dentro de la poblacin que participa en mitosis o citocinesis. Cuando se suman los periodos G2 + S + M es evidente que falta por explicar un periodo adicional en el ciclo de la clula. Esta otra fase, denominada Gj (de primera abertura), se interpone entre M e I y representa el periodo que sigue a la mitosis y precede al inicio de la sntesis de DNA. Ciclos celulares in vivo Una de las propiedades que distingue a los diferentes tipos de clulas dentro de una planta o animal multicelular es su

Actividades de sntesis durante el ciclo de la clula

Cuando se cuantifica ia tasa total de sntesis de RNA o de protenas en clulas del mismo tipo en diferentes etapas del ciclo celular, se observa que la tasa de estas actividades de sntesis es relativamente constante durante todo el periodo

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de interfase y va seguido por un marcado descenso en la sntesis de protenas y el cese virtual de la sntesis de RNA durante la mitosis. De manera similar, cuando se sigue la sntesis de las principales protenas de una clula a travs del ciclo celular mediante elecrororesis bidimensional en gel (seccin 17-7), casi todas las especies de protenas parecen sintetizarse a tasas relativamente constantes durante la interfase. La principal excepcin de esta regla se refiere a las historias, cuya sntesis ocurre casi exclusivamente durante la fase S ffig. 14-3). No slo la sntesis de este grupo de protenas cromosmicas es la que se restringe a la fase S, sino tambin la sntesis de sus RNAm. Una vez concluida la duplicacin, las histonas mensajeras se destruyen selectivamente. Control del ciclo celular La investigacin del mecanismo que controla si una clula permanece en interfase o prosigue hasta la siguiente divisin no slo es importante en biologa celular, sino tambin tiene enormes implicaciones prcticas en la lucha contra el cncer, enfermedad producida por alteraciones en Ja capacidad de la clula para regular su propia divisin. Como veremos en las siguientes pginas, hay dos sucesos en el ciclo de la clula sobre los cuales se enfocan los mecanismos de control de la clula; uno es el inicio de la duplicacin del DNA, que ocurre en el punto de transicin entre GI y S, y el otro es el inicio de la mitosis, que ocurre en la transicin entre GZ y M. En 1970, Potu Rao y Robert Johnson, de la

Universidad de Colorado, efectuaron una serie de experimentos de fusin celular que abrieron la puerta al conocimiento de la regulacin de estos dos acontecimientos clave en el ciclo celular. Rao y Johnson queran saber si el citoplasma de las clulas contiene factores reguladores capaces de afectar el estado del ncleo. Investigaron esa posibilidad fusionando clulas en diferentes etapas del ciclo celular. Por ejemplo, en un experimento, fusionaron clulas en etapa Gj con clulas en etapa S y plantearon la pregunta de si el citoplasma donado por la clula en fase GI no duplicante contiene factores que impiden la duplicacin del ncleo en fase S, o si el citoplasma de la clula duplicante en fase S contiene factores que estimulan Ja duplicacin del ncleo en fase GI. Observaron que el ncleo del hbrido procedente de la clula en fase Ga era activado para iniciar la duplicacin mucho antes del momento en que deba ocurrir si no se hubiera fusionado. Este experimento sugiri que el citoplasma de una clula duplicante contiene uno o ms factores que estimulan el inicio de la sntesis del DNA. Los resultados de otros experimentos de fusin celular sugirieron que la transicin desde GI hasta M tambin era desencadenada por factores citoplsmieos. Por ejempo, cuando se fusionaron clulas mitticas con clulas en otras etapas del ciclo celular (fig. 14-4), las clulas mitticas siempre indujeron condensacin de la cromatina en el ncleo de la clula no mittica. Si se fusionan tina clula en fase GI y otra en fase M, Ja cromatina del ncleo en fase GI sufre condensacin cromosmica prematura para formar un. conjunto de cromosomas condensados alargados (fig. 14-4, a). Si la clula no mittica se encuentra en la etapa Gi, la condensacin produce cromosomas visiblemente duplicados, lo que releja el hecho de una duplicacin previa (fig. 14-4, c). Aunque tanto la cromatina de la fase GI como la de la fase GI sufrieron condensacin extensa, la relacin de empacamiento (pg. 495) nunca alcanz la observada en cromosomas verdaderamente mittcos. La fusin de una clula mittica con una clula en fase S tambin produce condensacin de la cromatina en fase S (fig. 14-4, &), Sin embargo, la cromatina de una clula duplicante es particularmente sensible al dao, y la condensacin da como resultado a formacin de fragmentos cromosmicos "pulverizados" en vez de los cromosomas intactos compactados. Los resultados de estos experimentos sugieren que las transiciones desde GI a S y de G2 a M se encuentran ambas bajo control positivo; o sea, ambas son inducidas por la presencia de algn agente estimulador.
Papel de las proteincinasas

Horas despus de hepatectoma parcial FIGURA 14-3. Demostracin experimental de la sntesis coordenada de DNA e histonas. Se practic hepatectoma parcial en ratas (extirpacin de una parte del hgado) para estimular la proliferacin sincronizada de celdillas hepticas. En diferentes momentos despus de la intervencin se inyect a los animales 3H-leucina y 14 C-timidina, y una hora despus se extirp el hgado para determinar la radiactividad en el DNA (crculos cerrados) e histonas (crculos abiertos). (Reimpreso con permiso de Nature vol. 219:861, 1968, por S. EaM y cois. Copyright 1968, MacmiUan Magazines Ltd.)

Los conocimientos acerca de la naturaleza de los agentes que desencadenan la duplicacin del DNA y conducen a la clula a la mitosis (o meiosis) se descubrieron en una serie de experimentos sobre oocitos y embriones tempranos de ranas y varios invertebrados (incluyendo almejas y erizos marinos). Los resultados de estos experimentos se describen en La va experimental, al final del captulo. En resumen, estos experimentos demostraron que la entrada de la clula a la fase M se desencadena por la activacin de una protenv c'masa denominada factor promotor de maduracin (FPM), que consiste en dos subunidades, una cataltica que efecta la

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CAPITULO 14 Reproduccin celular

Fragmentos de cromosomas pulverizados

(b)

(c)

FIGURA 14-4. Demostracin experimental de que las clulas contienen factores que desencadenan su entrada en mitosis. Las fotografas muestran los resultados de la fusin de una clula HeLa en fase M con una clula PtK2 de rata canguro que se encuentra en fase GI (a), fase S (b) o fase G2 (c) en el momento de la fusin celular. Como se describe en el texto, la cromatina de las fases GI y G2 de las clulas de la rata canguro sufre condensacin prematura, en tanto que las clulas en fase S se pulverizan. Las cromtides alargadas de la clula en fase GI en C se encuentran duplicadas en comparacin con aquellas de la clula GI en a. (Segn Kar Sperling y Potu N. Rao, Humangenetik 23:237, 1974.)

transferencia de los grupos fosfato del ATP a los residuos especficos de serna y treonina de sustratos especficos de protenas, y una subunidad reguladora que consta de una protena denominada ciclina. El trmino "ciclina" se acu para indicar que la concentracin de estas protenas reguladoras se eleva y desciende siguiendo un patrn predecible conforme el ciclo de la clula avanza (fig. 14-5). Cuando la concentracin de ciclina es baja, la cinasa carece de la subunidad ciclina y como resultado es inactiva. Cuando la concentracin de ciclina alcanza un nivel suficiente, la cinasa se activa y desencadena la entrada de la clula a la fase M. Estos resultados sugieren que: 1) la clula avanza a travs del ciclo celular dependiendo de una enzima cuya nica actividad es fosforlar otras protenas, y 2) la actividad de esta enzima es controlada por una "pareja" cuya concentracin vara de una etapa del ciclo celular a otra. En aos recientes, numerosos laboratorios han puesto su atencin en enzimas parecidas a FPM denominadas cinasas dependientes de ciclinas (o Cdks). La atencin se ha desviado de oocitos y embriones en desarrollo a clulas que pueden crecer en cultivo, principalmente clulas de levaduras y de mamfero. Las clulas de levadura son particularmente tiles por la disponibilidad de mutantes cuyas protenas anormales afectan los diferentes procesos que contribuyen al ciclo celular. La investigacin acerca de factores que controlan el ciclo celular en levaduras se inici con el descubrimiento de un gen llamado cdc2. Cuando una mutacin afecta a este

gen, el crecimiento de la clula se detiene en uno de dos puntos distintos del ciclo celular: justo antes de la duplicacin del DNA o justo antes de la mitosis. El producto del gen cdc2l es homlogo a la subunidad cataltica de FPM; en otras palabras, es una cinasa dependiente de ciclina. Investigaciones subsecuentes acerca de levaduras, y tambin de muchas clulas de diferentes mamferos, apoyan el concepto de que la progresin de la clula a travs de su ciclo es regulada principalmente en dos etapas distintas del ciclo celular, una que ocurre casi al final de GI y la otra cerca del final de G2. Ambas etapas representan puntos en el ciclo celular donde la clula est comprometida a iniciar un acontecimiento crucial: sea el inicio de la duplicacin o su entrada en mitosis. El paso por cada uno de estos puntos de compromiso requiere la activacin transitoria de Cdks por ciclinas especficas (fig. 14-6). Luego de su activacin al final de GI, se cree que la Cdk inicia la fosforilacin de algunas protenas especficas necesarias para conducir la clula a la fase S. Aunque no se han

1 El producto de este gen o de un gen homlogo en otros eucariotes con frecuencia se denomina p34fdc2 en las publicaciones; nos referiremos a este producto simplemente como cdc2. Podemos notar que el gen procedente de la fisin de la levadura (Saccharomyces pombc) de ordinario se conoce como cdc2, en tanto que el homlogo procedente de la gemacin de la levadura (S. cerevisiae) en general se conoce como CDC28.

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Mitosis

Mitosis

Mitosis

Interfase Actividad FPM

Interfase

Interfase Alta

Baja Ciclina Alta Baja

(a)

FIGURA 1 1-6. Modelo para la regulacin del ciclo celular en levaduras. El ciclo celular est controlado principalmente en dos puntos, INICIO y la transicin G2-M. El paso de una clula a travs de cada una de estas uniones crticas requiere la activacin de cdc2 cinasa por un tipo diferente de ciclina.

(b)
\'H',\~R\. Variacin de la concentracin de ciclina y de FPM durante el ciclo celular, a) Cambios cclicos durante el desarrollo temprano de una rana cuando ocurren divisiones mitticas sincronizadas en todas las clulas del embrin. E! trazo de arriba muestra la alternancia entre periodos de mitosis e interfase, el trazo de enmedio muestra los cambios cclicos en la actividad FPM, y el trazo de abajo muestra los cambio cclicos en la concentracin de ciclinas que controlan la actividad relativa de la cinasa del FPM. b) Vista ms prxima a los cambios en la concentracin de FPM y de ciclina durante el ciclo de una sola clula en levaduras, (a: Reimpreso con permiso de A.W. Murraij y M. Kirschner, Science 246:616, 1989; copyright 1989 American Association for thc Advanceirtent of Science.)

identificado claramente los sustratos de la fosforilacin, se cree que incluyen ciertos factores de transcripcin que estimulan la expresin de genes requeridos para la duplicacin del DNA. Se piensa que la estimulacin de la actividad Cdk al final de G2 para fosforilar un grupo diferente de sustratos es un requerimiento especfico para permitir que la clula entre en mitosis. Entre estos sustratos se incluyen como candidatos protenas nucleares como la histona Hl, cuya fosforilacin ayuda a compactar los cromosomas, y lminas nucleares (pg. 489), cuya fosforilacin conduce al desensamblado de la envoltura nuclear. Cdk tambin fosforila protenas citoplsmicas, incluyendo las protenas re-

queridas para cambios dinmicos en la organizacin del citoesqueleto que caracteriza el trnsito de interfase a mitosis. En clulas de levaduras, la misma Cdk (cdc2 cinasa) se encarga del paso a travs de ambos puntos de compromiso, aunque acompaada de una serie sucesiva de ciclinas diferentes. El primer punto de transicin, denominado INICIO, ocurre justo antes del final de GI; el paso a travs de INICIO requiere la activacin de cdc2 por una o ms ciclinas G. El paso a travs del segundo punto de compromiso, justo antes del final de G2, requiere la activacin de cdc2 por un grupo diferente de ciclinas (ciclinas mitticns). La concentracin de cada uno de los diferentes tipos de ciclina se eleva y desciende conforme las clulas avanzan a travs del ciclo (fig. 14-6). La concentracin de cada ciclina en diferentes puntos del ciclo celular se regula ajusfando las tasas de sntesis y de destruccin de la molcula de la protena segn las condiciones en ese momento. Se cree que la destruccin programada de una ciclina particular despus de activar una cinasa desempea un papel crucial para que la clula se mueva a la siguiente etapa del ciclo. Como resultado, los mutantes incapaces de descomponer la ciclina luego de iniciada la mitosis se detienen en mitosis de modo que las clulas no reinicien la etapa GI. La descomposicin de las ciclinas se lleva a cabo por la va de la ubiquitina, descrita en la pgina 534. Debe hacerse notar que el enlace de una ciclina a cdc2 no es suficiente para activar por s misma la actividad de

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CAPITULO 14 - Reproduccin celular

cinasa de la protena antes de la mitosis. Primero debe fosforilarse un residuo de treonina crtico en la subunidad Cdk (Tre 161 en la figura 14-7), lo cual en levaduras se logra por accin de otra proteincinasa denominada CAK (cinasa activadora de Cdk). La fosforilacin de Tre 161 activa la Cdk cinasa, pero la fosforilacin de los otros dos residuos {Tre 14 y Tir 15) inhibe la actividad de la misma. Otra cinasa (denominada weel en levaduras) aade estos fosfatos inhibidores. Por lo tanto, como se muestra en el paso 1 de la figura 14-7, la accin de weel inactiva la enzima cdc2. Sin embargo, la enzima inactivada puede activarse al eliminar los dos grupos fosfato inhibidores, accin efectuada por una fosfatasa llamada cdc25 en levaduras (paso 2, figura 14-7). Por lo tanto, la fosfatasa cdc25 y la weel cinasa compiten entre s, una estimula a cdc2 y la otra inhibe su actividad. Versiones homologas de cada una de estas enzimas se encuentran en clulas de mamferos. Las pruebas indican que la competencia entre las actividades weel y cdc25 constituye un factor determinante crtico para iniciar la mitosis. La actividad de estas dos enzimas es regulada, a su vez, por otras cinasas y fosfatasas, de modo que el sistema que controla el ciclo celular es muy complicado. La participacin de una serie de enzimas en el mecanismo para activar (e inhibir) Cdks suministra algunos puntos especficos donde la informacin del interior y el exterior de la clula puede impactar el avance del ciclo celular (analizado ms adelante). Las protenas y los procesos que participan en el control del ciclo celular son notablemente conservadas por toda la gama de clulas eucariotas, desde levaduras hasta plantas y animales evolutivamente ms elevados. Aunque participan los mismos tipos de protenas, cuando menos se ha implicado a ocho ciclinas diferentes y una media docena de cinasas dependientes de ciclina en el control del ciclo celular de mamferos (a diferencia del ciclo celular de levaduras en el cual aparentemente slo opera cdc2 en todas las etapas}. Ondas sucesivas de sntesis y descomposicin de diferentes ciclinas tal vez desempeen un papel clave en la conduccin de la clula a partir de una actividad a la si-

guiente. La formacin de pares entre ciclinas y Cdk es sumamente especfica y slo se observan ciertas combinaciones (fig. 14-8). Por ejemplo, un complejo formado entre ciclina E y Cdk2 es activo en la transicin Gj-S, en tanto que un complejo entre ciclina B y Cdkl (tambin conocido como CDC2} es activo en la transicin G2-M. Puesto que mltiples complejos ciclina-Cdk son activos simultneamente y diferentes ciclinas-Cdk pueden fosforilar grupos superpuestos de sustratos de protenas, es difcil investigar el papel especfico de cada uno de los compiejos.
Puntos de verificacin, inhibidores de cinasas y respuestas celulares

Como se indic antes, cuando menos hay dos puntos en el ciclo celular. La transicin G^-S y la transicin Ga-M, donde se requiere la actividad de cinasas dependientes de ciclina (Cdks) para impulsar el paso de las clulas de una fase dei ciclo a la siguiente. Pruebas crecientes indican que estos puntos del ciclo celular (y probablemente otros ms) sirven como puntos de verificacin donde la clula puede detener su avance continuo si no se han llenado ciertas condiciones. Por ejemplo, en una clula de levadura, al parecer la clula debe alcanzar cierta masa en el momento de llegar al punto de verificacin GI antes que pueda continuar a la fase S e iniciar la duplicacin de DNA. De manera similar, si una clula de levadura (o de mamfero) se trata con un frmaco inhibidor de la sntesis de DNA o se expone a luz UV, que causa dao al DNA, la clula detiene su avance antes de entrar en mitosis. Esto proporciona a la clula tiempo para perfeccionar ia duplicacin de su DNA o reparar el dao, en vez de seguir a la siguiente etapa del ciclo celular que probablemente la conduzca a su muerte. Por lo tanto, en todos estos casos, el cese del ciclo celular es una respuesta protectora que impide a a clula participar en una actividad autodestructiva y garantizar la produccin de clulas hijas normales. Cmo puede una clula detener el avance de una etapa del ciclo celular a la siguiente? Estudios recientes revelan que las clulas pueden sintetizar algunas protenas que

O
Interfase (G2) TM5-P

Inactiva

Ciclina Inactiva

Ciclina Activa {

Inactiva Ciclina }

Degradacin FIGURA 14-7. El avance a travs del ciclo celular requiere la fosforilacin y desfosforilacin de ciertos residuos crticos. Durante 62, cdc2 interacta con una ciclina mittica, pero permanece inactiva como resultado de la fosforilacin de dos residuos (Tir 15 y Tre 14} por la cinasa weel (paso 1). Una cinasa separada, llamada CAK, transfiere un fosfato a un tercer residuo (Tre 161), requerido para la actividad cdc2 tarda en el ciclo celular. La eliminacin de los fosfatos inhibidores por la fosfatasa cdc25 activa la cinasa cdc2, que se cree desencadena la entrada de la clula en mitosis (paso 2). AI final de la mitosis (paso 3}, la ciclina se separa de cdc2 y el grupo fosfato es eliminado de Tre 161 por accin de otra fosfatasa. Posteriormente se degrada la ciclina libre y la clula inicia otro ciclo. (Segn T.R. Coleman y W.G. Dunphy, Curr. Opin. Cell Biol. 6:877, 1994.)

CAPITULO 14 Reproduccin celular

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Ciclina B/A + Cdkl

Inhibe la activacin

O
Ciclina A + Cdk2 Ciclina D's + Cdk2 Cdk4 Cdk5

Ciclina E + Cdk2 HOURA 14-8. Combinaciones entre varias ciclinas y cinasas dependientes de ciclina en diferentes etapas del ciclo celular de mamferos. (Segn C./. Shcrr, Cell 73:1060, 1993; con permiso de Cdl Press.) FIOURA 14-9. Efectos aparentes de dao al DNA sobre diversas actividades que ocurren como parte del ciclo celular. Segn se analiza en el texto, el dao al DNA activa al gen p53, lo que a su vez estimula la transcripcin del genp21 cuyo producto acta para evitar el avance del ciclo celular tanto en GI (# 1) como en S (# 2). El dao al DNA tambin puede evitar la entrada de las clulas en mitosis por activacin de los genes roa y hu? (# 3) y deteniendo la activacin de la fosfatasa cdc 25 requerida para estimular la actividad cinasa de la ciclina B-Cdkl (# 4). (Reimpreso con permiso de Nature, vol. 369:520, 1994, por J. Fines. Copyright 1994, Macmillan Magnzines Ltd.)

actan inhibiendo el avance a travs del ciclo celular. Algunas de estas protenas actan directamente sobre el complejo Cdk-ciclina para inhibir su actividad de proteincinasa; otras al parecer pueden detener la actividad continua del mecanismo de duplicacin del DNA; y todava otras ms actan como factores de transcripcin que estimulan o reprimen la transcripcin de genes clave cuyos productos participan en actividades del ciclo celular. En la actualidad, las pruebas sugieren que mutaciones en algunos de estos genes causan desajustes en el mecanismo de! ciclo celular que pueden conducir al desarrollo de muchos tipos diferentes de cncer. Consideremos un ejemplo. Casi 50% de todos los tumores humanos estudiados hasta ahora muestran mutaciones en un solo gen denominado p53 porque su producto es un polipptido con peso molecular de 53 kilodaltons. Esto no significa que las mutaciones en este gen causen 50% de los cnceres humanos; la mayor parte de las clulas cancerosas contienen algunos genes defectuosos y se cree que la deficiencia combinada de todos estos productos de gen maligniza a la clula. No obstante, las lesiones del gen p53 claramente desempean un papel clave en el avance gradual de muchas clulas diferentes, desde una condicin normal a una maligna. (Esta progresin se analiza con mayor detalle en el captulo 16.) El gen p53 se conoce como gen supresor de tumores porque la protena que codifica ayuda a evitar que las clulas se malignicen. La protena codificada por el gen p53 es un factor de transcripcin que activa la expresin de otros genes. Un gen controlado por la protena ^53 codifica a un inhibidor (llamado p21) del complejo ciclina E-Cdk2 cuya actividad cinasa es necesaria para que una clula pase por el punto de verificacin GI (#1, fg. 14-9). Adems, p21 puede actuar inhibiendo la duplicacin en clulas que ya se encuentran en fase S (#2, fig. 14-9). Cuando ambas copias del gen p53 de una clula suh'en mutaciones de modo que su producto no sea funcional, la clula ya no puede producir el inhibidor p21. Por consiguiente, la clula ya no ejerce control por retroalimentacin que impida a la clula entrar a la fase S o conti-

ne a travs de la fase S cuando no est preparada para hacerlo. Datos recientes indican que las clulas contienen algunos genes, adems del p53, cuyos productos ejercen accin inhibidora sobre la progresin a travs del ciclo celular. Por ejemplo, en levaduras, se conocen varios genes (p. ej., radI7 y husT) cuyos productos son necesarios para detener el ciclo celular en GS como respuesta a la presencia de dao al DNA (#3, fig. 14-9). Tambin se sabe que en clulas de mamfero el dao al DNA impide la entrada de las clulas a la mitosis porque interfiere con la activacin del complejo ciclina BCdkl (#4, fig. 14-9). Cuando las clulas que han sufrido mutaciones que provocan prdida funcional de algn producto de estos genes son irradiadas, continan entrando en mitosis a pesar de la presencia de dao extenso al DNA causado por la radiacin. Las clulas de pacientes humanos que sufren una rara enfermedad hereditaria llamada ataxia-telan giectnsia (AT) muestran las mismas caractersticas. Normalmente, cuando se someten fibroblastos humanos a dosis subletales de radiacin X, el inicio de la duplicacin en la fase S (o inicio en los nuevos orgenes de duplicacin durante la fase 5} se retrasa en tanto se repara el dao. De manera similar, las clulas normales irradiadas con rayos X mientras se encuentran en fase G2 retrasan su entrada en mitosis en tanto se repara el dao al DNA. Por lo contrario, las clulas de pacientes con AT no presentan control alguno por retroalimentacin y continan sintetizando DNA y dividindose

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CAPITULO 14 Reproduccin celular

por mitosis a pesar de la presencia de DNA daado. Esta incapacidad de inhibir el avance del ciclo celular tiene graves consecuencias; los pacientes con AT muestran una ocurrencia mucho mayor de cncer, en particular tumores linfoides. Las alteraciones en genes que codifican inhibidores del ciclo celular probablemente desempeen un papel en el desarrollo de gran variedad de cnceres humanos. Al mismo tiempo, el descubrimiento de estos inhibidores gener la oportunidad de sintetizar nuevos tipos de frmacos anticancergenos que bloquean el crecimiento celular descontrolado imitando los efectos de estos inhibidores.

14-2 Fase M: mitosis y citocinesis

El nombre "mitosis" proviene del vocablo griego mitos, que significa "hilos". El nombre se emple por primera vez en el decenio de 1870 para describir los cromosomas filiformes que parecan bailar alrededor de la clula justo antes de dividirse en dos. La mitosis es un proceso de divisin nuclear en el cual los cromosomas duplicados se separan con gran precisin produciendo dos ncleos, cada uno con una copia fiel de cada cromosoma. La mitosis de ordinario se acompaa de citocinesis, proceso durante el cual la clula se separa en dos, partiendo el citoplasma en dos paquetes regularmente iguales. Las dos clulas hijas formadas por mitosis y citocinesis poseen un contenido gentico idntico entre s y al de la clula madre de la cual provienen. Por lo tanto, la mitosis mantiene el nmero de cromosomas y genera nuevas clulas para crecimiento, conservacin y reparacin de un organismo. La mitosis puede ocurrir en clulas diploides o haploides. Ejemplos de esto ltimo se encuentran en plantas gametofitas y unos cuantos animales (incluyendo abejas macho conocidas como znganos). Ms que en cualquier otra etapa del ciclo celular, la mitosis es el momento donde la clula dedica prcticamente toda su energa a una sola actividad: separar los cromosomas duplicados. Como resultado, la mitosis es un momento en el cual la mayor parte de las actividades metablicas de la clula, incluyendo transcripcin y traduccin, estn muy reducidas y la respuesta de la clula a los estmulos externos es escasa. La mitosis generalmente se divide en cinco etapas (fig. 14-10): profase, prometa/ase, meta/ase, ana/ase y telo/ase, cada una caracterizada por una serie particular de acontecimientos. No debemos olvidar que cada etapa corresponde a una parte de un proceso continuo; la divisin de la mitosis en fases arbitrarias se efecta slo para facilitar el anlisis y la experimentacin.

Profase Durante la primera fase de la mitosis, profase, los cromosomas duplicados se preparan para separarse y se ensambla el mecanismo mittico.
Formacin de cromosomas mitticos

El ncleo de una clula en interfase contiene fibras de cromatna de longitud enorme dispersas a travs de todo el

compartimiento nuclear. La cromatina de ia interfase en estado extendido es ideal para el proceso de transcripcin y duplicacin, pero no para repartirse entre dos clulas hijas. Para separar los cromosomas duplicados, la clula primero los compacta en fibras ms gruesas y ms cortas, visibles al principio de la profase (fig. 14-11, y tambin fig. 14-10). Como se describi en la seccin 12-1, los cromosomas de una clula mittica se pueden aislar como estructuras distintas en forma de bastoncillos. El examen de un cromosoma mittico bajo el microscopio revela que cada uno de ellos se encuentra "seccionado" longitudinalmente en dos componentes distintos (fig. 14-12, a). Cada uno de estos miembros en forma de bastoncillo es una cromtide; el par de cromtides reunidas corresponde a las dos copias idnticas formadas durante la duplicacin en la interfase previa (fig. 14-12, b). Las dos cromtides de cada cromosoma estn conectadas firmemente entre s y a sus centrmeros y ms laxamente a lo largo de toda su longitud {fig. 14-12, a). Como se describi en la pgina 497, la cromatina de una clula en interfase se organiza en fibras de casi 30 nm de dimetro. Los cromosomas mitticos se componen de tipos similares de fibras, segn se observa en el examen con microscopio electrnico de cromosomas ntegros aislados de clulas mitticas (fig. 14-13, a). Al parecer, la transformacin de un cromosoma en interfase en un cromosoma mittico no implica grandes alteraciones en la naturaleza de la fibra de cromatina, sino ms bien afecta la manera de empacar la fibra de cromatina. Las protenas que median la compactacin del cromosoma forman un armazn estructural o molde cuya presencia en el cromosoma mittico se puede revelar mediante el tratamiento de cromosomas con soluciones que solubilizan las histonas y la mayor parte de las protenas no histona. Las micrografas electrnicas de estos cromosomas as extrados muestran que constan de un armazn residual que retiene la forma bsica del cromosoma mittico (fig. 14-13, b). Se encuentran asas de DNA fijas en su base a las protenas no histona que constituyen el molde del cromosoma (mostrado con mayor aumento en la fig. 12-14, a). La compactacin de cromosomas que ocurre durante la profase requiere la presencia de una topoisomerasa II activa, una de las principales protenas no histona del molde del cromosoma mittico (fig. 14-13, c). La.topoisomerasa se enlaza a una secuencia altamente repetitiva rica en A-T cuya distribucin dentro del cromosoma mittico se revela mediante un compuesto fluorescente, la daunomicina (fig. 14-13, d). El mecanismo encargado de la compactacin de cromosomas todava no est muy claro. Se cree que el proceso se desencadena por activacin de una cinasa dependiente de ciclina al final de G2, lo que conduce a la fosforilacin de algunas protenas, incluyendo los apndices N terminal y C terminal de las molculas de histona Hl relacionadas con el DNA de los cromosomas (fig. 12-10). Sera de esperar que la fosforilacin de las histonas reduzca la atraccin mutua entre las histonas y el esqueleto del DNA, lo que a su vez disminuye la fuerza de unin de las histonas al DNA. De qu manera este cambio en la interaccin DNA-histona puede producir la compactacin de las fibras de cromatina, todava es tema de especulacin.

CAPITULO 14 Reproduccin celular

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1. El material cromosmico se condensa para formar cromosomas miticos compactos 2. Los cromosomas compuestos de dos cromtides se unen al centrmero 3. Se ensambla el huso mittico 4. El citoesqueleto y la envoltura nuclear desaparecen. Complejo de Golgi y fragmento RE Prometafase 1. Los microtbulos cromosmicos se fijan a los cinetocoros de los cromosomas 2. Los cromosomas se desplazan hacia el ecuador del huso ' V

Metalase 1. Los cromosomas se alinean a lo largo de la placa metafsica, unidos por microtbulos cromosmicos a ambos polos V

1. Desdoblamiento de los centrmeros y separacin de las cromtides 2. Los cromosomas se mueven hacia los polos opuestos del huso 3. Los polos del huso se separan

1. Los cromosomas se agrupan en polos opuestos del huso 2. Los cromosomas se dispersan 3. Se ensambla la envoltura nuclear alrededor de los grupos de cromosomas 4. El complejo de Golgi y el RE se reconstituyen 5. Citocinesis

FIGURA 14-JO. Los pasos de la mitosis. (Micrografas de Andrew Bajer.)

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CAPITULO 14 - Reproduccin celular

5 pm

FIGURA 1 4 - 1 1 . Los cromosomas de este ncleo en profase temprana han iniciado el proceso de compactacin que los convierte en cromosomas mitticos, cortos, semejantes a bastones que se separan en una etapa tarda de la mitosis. (Segn A.T. Sumner, Chromosoma 100:411, 1991.)

Centrmeros y cinetocoros. La marca ms notable sobre un cromosoma mittico es una indentacin muy visible, o constriccin primaria, que seala la posicin del centromero (fig. 14-13, a). El centrmero es el sitio donde residen las secuencias de DNA altamente repetidas (fig. 10-21) que sirven como sitio de enlace para protenas especficas. El examen con microscopio electrnico de cortes a travs del centrmero de un cromosoma mittico revela la presencia de una estructura parecida a una placa, llamada cinetocoro, situada en la superficie externa del centrmero (fig. 14-14, ,fc). Como veremos en breve, el cinetocoro acta como sitio de fijacin del cromosoma a los microtbulos del huso mittico (como en la figura 14-14, a) y tambin es sitio donde residen algunas protenas motoras. Estas observaciones indican que el cinetocoro desempea un papel clave en el movimiento de los cromosomas durante la mitosis. La estructura del cinetocoro es motivo de debate. Algunos investigadores consideran que el cinetocoro es una estructura proteincea separada, fija a la superficie externa de la cromatina, en tanto que otros ven al cinetocoro como una regin de cromatina especializada ensamblada a partir del centrmero y que contiene DNA y protena. La investigacin de la estructura bioqumica del cinetocoro se inici en 1980 con la observacin de que la sangre de pacientes con una enfermedad autoinmunitaria particular, llamada esclerodermia, contiene antianticuerpos que reaccionan con el centrmero de los cromosomas en metafase. Los anticuerpos suministran la sonda necesaria para aislar y

FIGURA 14-12. Cromosomas mitticos. a) Gammagrafa electrnica de varios cromosomas humanos en metafase mostrando la unin de pares de cromtides idnticas a lo largo de su longitud y unidas firmemente al centrmero. Las cromtides no se separan entre s hasta la anafase. b) Locazacin de una secuencia de DNA no repetida dentro de un conjunto de cromosomas mitticos humanos mediante hibridacin in situ con fluorescencia. El sitio de la secuencia de DNA est indicado por el par de puntos en posicin simtrica sobre uno de los cromosomas. La presencia de la misma secuencia en el mismo sitio de ambas cromtides suministra una confirmacin visual de que las cromtides se originan por duplicacin durante la interfase. (a: Segw A.T. Sumner, Chromosoma 100:415, 991; b: cortesa de E. ViegasPequignot.)

caracterizar algunas protenas restringidas a esta porcin del cromosoma. Estos anticuerpos tambin se uen como sitios especficos dentro de los ncleos de clulas en interfase, suministrando un medio para localizar los centrmeros de cromosomas en interfase, los cuales de otro modo seran invisibles (fig. 14-15). Las protenas a las que se enlazan estos anticuerpos al parecer son necesarias para la mitosis, puesto que la inyeccin de los anticuerpos en una clula bloquea el avance de la mitosis.

CAPITULO 14 Reproduccin celular

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FIGURA 14-13. Compactacin de cromosomas durante la mitosis. a) Micrografa electrnica de una preparacin con montaje total de un cromosoma mittico humano. Se observa que la estructura se compone de una fibra nudosa de 30 nm de dimetro, similar a la observada en cromosomas en inferase, b) Aspecto de un cromosoma mittico despus de eliminar las histonas y la mayor parte de las protenas no histonas. Las protenas residuales forman un armazn del cual surgen asas de DNA (las asas de DNA se muestran con mayor claridad en la figura 12-14, a), c) Demostracin de la topoisomerasa 11 en un cromosoma mittico humano revelada por anticuerpos fluorescentes dirigidos contra dicha protena, d) El compuesto fluorescente daunomicina se une especficamente a secuencias DNA ricas en A-T, que se cree forman los sitios de enlace para las protenas del armazn. En este cromosoma se observa que la localizacin de la daunomicina (fluorescencia roja) muestra la misma distribucin que la topoisomerasa del armazn, (a: Cortesa de Gunther F. Eahr; b: segn ames R. Paulson y Ulrich K. Laemmli, Cell 12:820, 1977; c-d: segn Yasushi Saioh }/ Ulrich K. Laemmli, Cell 76:616, 1994; b-d: con permiso de Cell Press.)

Formacin del huso mittico

En el captulo 9 estudiamos de qu manera se inician los microtbulos del citoesqueleto mediante la organizacin de una estructura microtubular especial llamada centrosoma (pg. 337). Conforme la clula progresa y pasa por la etapa 2 para entrar en mitosis, los microtbulos del citoesqueleto se desensamblan antes de volver a ensamblarse para formar los componentes de una "mquina" formada por microtbulos denominada huso mittico. Para entender la formacin del huso mittico es necesario examinar el ciclo del centrosoma conforme avanza en coordinacin con el ciclo celular (fig. 14-16, a).

Cuando una clula animal sale de la mitosis, posee un solo centrosoma que contiene dos centrolos situados en ngulo recto entre s. Puesto que los cromosomas se duplican en el ncleo durante la fase S, el par de centrolos inicia su "duplicacin" en el citoplasma. La formacin de cada nuevo centroio comienza con la aparicin de un centrolo hija junto a un centrolo existente y orientado en ngulo recto respecto del mismo (fig. 14-16, b). El alargamiento subsecuente de los microtbulos del centrolo hija lo convierte en un centrolo maduro, proceso que no concluye sino hasta que se inicia la mitosis. Aunque los centrolos madre e hija se orientan de manera predecible entre s, no

592

CAPITULO 14 Reproduccin celular

Cinetocoro

Microtbulo Heterocromatina centromrica

Corona fibrosa
(contiene protenas motoras)

Placa interna Placa externa

(se une a los mprolbulos cromosrnicos)

(b)

FIGURA 14-14. El cinetocoro. a) Micrografa electrnica de un corte a travs del cinetocoro de un cromosoma de mamfero en metafase, mostrando su estructura de tres capas (trilaminar). Se puede ver que los microtbulos del huso mittico terminan en el cinetocoro. b) Representacin esquemtica del cinetocoro que contiene una placa interna y otra externa electrnicamente densas. La placa externa contiene material fibroso que se une a las protenas motoras que participan en el movimiento de cromosomas/ en tanto que la placa interna se encuentra fija a la heterocromatina centromrica del cromosoma. (a: Cortesa de Pcntii T. okelanen.)
0.2 p

hay conexin evidente entre ellos, ni prueba de donacin alguna de material del centrolo madre a su hija. La primera etapa en la formacin del huso en una clula animal tpica es la aparicin de microtbulos en disposicin de "flama solar" o ster (figs. 14-10 y 14-17) alrededor de cada centrosoma durante la profase inicial. El examen atento de los microtbulos astrales con el microscopio electrnico indica que no estn en contacto fsico directo con los micro t bu los de los centrolos. Ms bien/ los microtbulos del ster, igual que sus predecesores en el citoesqueleto de la interfase (pg. 338), surgen del material pericentriolar (MPC) electrnicamente denso en la regin que rodea los centrolos. Igual que el citoesqueleto, el MPC acta como sitio de nucleacin para los microtbulos del ster que se desarrollan con sus extremos ms (+) (crecimiento ms rpido) alejndose del centrosoma. El incremento de la actividad iniciadora del microtbulo del MPC durante la mitosis puede estimularse mediante fosforilacin de protenas clave por [os Cdk mitticos recin activados que controlan el avance de la clula desde G2 hasta M (pg. 590). El proceso de formacin del ster va seguido por la separacin de los centrosomas y su emigracin subsecuente alrededor del ncleo hacia sitios opuestos de la clula. Puesto que los pares de centrolos se separan, los microtbulos que sufren estiramiento entre ellos aumentan en nmero y se alargan (fig. 14-17). Por ltimo, los dos centrosomas alcanzan puntos opuestos entre s, lo que establece os dos polos del huso mittico. Despus de la mitosis, los centrosomas se distribuyen, uno para cada clula hija.

Los centrolos no son componentes esenciales en la formacin del huso mittico. Varios tipos diferentes de clulas animales (incluyendo el embrin temprano del ratn) carecen de centrolos en sus husos mitticos, y la mayor parte de las plantas evolutivamente elevadas carecen por completo de centrolos. La primera demostracin de la formacin de un huso en clulas vegetales es la aparicin de una zona clara que rodea al ncleo. Rpidamente aparecen microtbulos en esta zona durante la profase, primero en disposicin desorganizada y luego con organizacin ms orientada en forma de huso. En clulas mcticas, como las de las levaduras y los mohos, el huso se forma por completo dentro de ncleo (fig. 14-18); los microtbulos surgen de los cuerpos polares del huso, que se encuentran integrados a la envoltura nuclear.
Disolucin de la envoltura nuclear y fragmentacin de organelos citoplsmicos

Puesto que el huso mittico se ensambla en el citoplasma y los cromosomas se compactan en el nucleoplasma, debe haber algn mecanismo que permita que los dos componentes interacten. En la mayor parte de las clulas eucariotas esto es posible conforme la envoltura nuclear se desensambla al final de la profase. La desintegracin de la envoltura nuclear, como se le denomina, es uno de los acontecimientos mejor comprendidos de la mitosis. Las lminas nucleares, principales componentes de la lmina nuclear situados en la superficie interna de la envoltura nuclear (pg. 489), estn incluidas entre los sustratos de la Cdk activa-

CAPITULO 14

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FIGURA 14-15. Localizacin de los cinetocoros de una clula en interfase. Micrografa con fluorescencia de una clula en fase GZ doblemente teida con anticuerpos fluorescentes contra material del cinetocoro y tambin contra el centrosoma. Se observa el centrosoma nico de la clula hacia la parte de arriba de la micrografa y los cinetocoros ms pequeos se notan duplicados, reflejando el hecho de que la duplicacin de la cromatina ocurre durante la fase 5 previa. (Segn S.L. Brenncr y B.R. Erinklcy, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 46:250, 1981.)

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da al final de G2. El desensamblado de los filamentos que constituyen la lmina nuclear es favorecido por la fosforilacin de las molculas de la lmina por accin de las Cdk. Las propias membranas nucleares pronto son fragmentadas, al principio para formar vesculas saculares aplanadas (internas) que rodean la cromatina condensada y finalmente en una poblacin de pequeas vesculas esfricas (70 nm). Algunos organelos membranosos del citoplasma pasan por la mitosis relativamente intactos; entre estos se incluyen mitocondrias, lisosomas, peroxisomas y los cloroplastos de una clula vegetal. Otros, como el retculo endoplsmico y el complejo de Golg, sufren fragmentacin extensa para formar gran nmero de vesculas citoplsmicas que se dispersan a travs del citoplasma. Este notable proceso de fragmentacin y dispersin facilita la reparticin de estas redes membranosas entre las dos clulas hijas. Prometafase La disolucin de la envoltura nuclear marca el inicio de la siguiente fase de mitosis, prometafase, durante la cual se forma el huso mittico definitivo y los cromosomas se mueven hacia una posicin en el centro de la clula. Al principio de la prometafase, los cromosomas condensados se disper-

(b)
FIGURA 14-16. Ciclo del centrosoma. a) En la fase GI se observa que los ccntrosomas contienen un solo par de centrolos orientados en ngulo recto entre s. Los microtbulos surgen del centrosoma con su extremo "ms" de crecimiento rpido alejndose del centro organizador.'Durante la fase S, cuando se duplica el DNA, los centrolos hijas comienzan ?. formar centrolos adyacentes al progenitor, de modo que se observan dos pares de centrolos dentro del centrosoma (vase b). Los centrolos hijas se siguen alargando durante la fase 62 y, al principio de la mitosis, los dos centrosomas se apartan dirigindose a polos opuestos de la clula. Conforme los centrosomas se desplazan, organizan las fibras de los microtbulos que constituyen el huso mittico. b) Se observa el centrosoma de esta clula cultivada que contiene dos pares de centrolos. Los centrolos hijas ms cortos estn indicados por las flechas. (Segn D.R. Kellog y cois., reproducido con permiso de Annual Rcview of Biochemistry, vol. 63, 1994, por Aunad Revieivs Inc.; b: segn crome B. Rattner y Stephanie G. Philips, ]. Cell Biol. 57:363, 1973; con permiso de RockefeUer University Press.)

san a travs del espacio que corresponda a la regin nuclear. Conforme los microtbulos del huso penetran en este espacio, los extremos libres de algunos microtbulos que

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CAPITULO 14 Reproduccin celular

FIGURA 14-17. Formacin del huso mittico. Durante la profase, cuando los cromosomas comienzan a condensarse, os centrosomas se separan en tanto organizan los haces de microtbulos que forman el huso mittico. a) Clula cultivada de pulmn de salamandra en profase temprana, teida con anticuerpos fluorescentes contra tubulina, que revelan la distribucin de los microtbulos celulares (verde). Los microtbulos del huso mittico en desarrollo emanan como estrellas a partir de dos sitios dentro de la clula. Estos sitios corresponden a las localizaciones de los dos centrmeros, que se mueven hacia polos opuestos en esta etapa de la profase. Conforme los centrosomas se separan entre s, los microtbulos de] huso en desarrollo se alargan y aumentan en nmero, b) La misma clula mostrada en a, pero con dob!e marcado, para microtbulo y material cromosmico (azul). Se observan los centrosomas situados justo por fuera del ncleo ntegro en esta etapa de la mitosis. (Segn Jennifer C. Waiers, Richard W, Col y Coniey L. Ricder, por ]. Cell Biol. 122:364, 1993; con permiso de Rockefeller University Press.)

han crecido en la regin adyacente al cromosoma son "capturados" por un cinetocoro. Se asume que el extremo de los microtbulos penetra en el cuerpo del cinetocoro y, como resultado, queda firmemente unido al cromosoma. Sin embargo, datos crecientes sugieren que el cinetocoro hace contacto inicial con la superficie lateral de un microtbulo ms bien que con su extremo. Una vez que se hace el contacto, se puede observar que algunos cromosomas se desplazan activamente a lo largo de la superficie lateral del microtbulo,

FIGURA 14-IJt. Uso mittico de una clula de levadura. A diferencia de la mayor parte de las clulas cucariotas, en una clula de levadura en divisin la envoltura nuclear no se rompe al final de la profasc. Las fibras del huso permanecen dentro del ncleo de la clula estiradas entre los corpsculos polares del huso, que se pueden observar situados en extremos opuestos del ncleo celular, integrados a la envoltura nuclear. Los corpsculos polares del huso son centros organizadores de microtbulos (COMT) con funcin similar a la de los centrosomas en clulas animales. (Cortesa de Mark Winey.)

aparentemente impulsados por protenas motoras localizadas en el cinetocoro (vase pgina 599). Sin embargo, pronto el cinetocoro tiende a relacionarse de manera estable con los extremos "ms" de uno o ms microtbulos cromosmicos (como se muestra en la figura 14-14). En casos en que un solo cinetocoro se une a los microtbulos a partir de ambos polos del huso, las conexiones sobre uno de los polos se desestabilizan y subsecuentemente se desconectan. Como resultado, las dos cromtides hermanas de un cromosoma mittico se conectan a los microtbulos que se extienden de polos opuestos. La observacin de cromosomas durante la prometafase en clulas vivientes indica que los cromosomas no se mueven directamente al centro del huso, sino que oscilan hacia atrs y hacia adelante a lo largo de los microtbulos cromosmicos con velocidad relativamente rpida (10 a 50 /m/ min).,El anlisis de las fuerzas ejercidas sobre dichos cromosomas sugiere que cuanto ms largo el microtbulo mayor tensin ejercer en comparacin con los microtbulos ms cortos, y como resultado, el cromosoma tiende a dirigirse haca el polo desde el cual se extiende el microtbulo ms largo. Conforme los cromosomas se mueven hacia el centro del huso mittico a media distancia entre los polos, los microtbulos ms largos se acortan como consecuencia del desensamblado, en tanto que los microtbulos ms cortos se alargan por adicin de subunidades de tubulina (fig. 14-19). Finalmente, cada cromosoma se mueve a una posicin situada a lo largo de un plano en el centro del huso, de modo que los microtbulos de cada polo son equivalentes en longitud. En la figura 14-20 se muestra el movimiento desde atrs del cromosoma a partir de un sitio perifrico en direccin al centro del huso mittico durante la prometafase.

CAPITULO 14 Reproduccin celular Adicin rpida de subunidades de tubulina

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DesPh; menzacion lenta

Prdida rpida de subunidades de tubulina

Despolimerizacin lenta

Polo

Polo

Despolimerizacin lenta Polimerizacin lenta Polimerizacin lenta

Despolimerizacin lenta

1. Microtbulos astrales que se irradian hacia afuera a partir del centrosoma en la regin situada por fuera del cuerpo del huso. Probablemente ayuden a colocar en posicin el aparato del huso dentro de la clula y determinen el plano de citocinesis. 2. Microtbulos croinosmicos (o cinetocoro) que se extienden desde el centrosoma a los cinetocoros de los cromosomas. Son necesarios para el desplazamiento de los cromosomas hacia los polos durante la anafase. 3. Microtbulos polares (o interpolares) que se extienden desde el centrosoma hasta pasar los cromosomas. Los microtbulos polares forman una canastilla estructural que mantiene la integridad del huso. Los microtbulos individuales de un centrosoma no se extienden a travs de la hendidura completa hacia el otro polo, sino que se entrelazan con sus contrapartes del centrosoma opuesto. Cuando se observan en cmara lenta videos o pelculas de la mtosis, la metafase aparece como una etapa durante la cual la clula hace una breve pausa, como si todas las actividades mitticas sbitamente se detuvieran. El anlisis experimental de la clula en metafase revela que es una impresin equivocada. Ms bien, la metafase es un momento de actividad considerable, aunque hay pocas pruebas de movimiento. Por ejemplo, la metafase es uno de los puntos de verificacin del ciclo celular, donde la clula de alguna manera percibe o vigila el estado de lo que ocurre para "decidir" si debe avanzar a la siguiente etapa. Este proceso de vigilancia es ms notable cuando uno o ms cromosomas ya se han alineado de manera apropiada en la placa metafsica. Cuando esto ocurre, como se puede comprobar experimentalmente al desplazar uno de los cromosomas para alejarlo de la placa metafsica con una aguja microscpica, la clula retrasa el inicio de la siguiente etapa hasta que el cromosoma mal colocado adopte su sitio apropiado a lo largo del ecuador del huso. Se cree que los cromosomas que no estn alineados de manera apropiada en el ecuador emiten una seal reconocida por la clula como una orden para retrasar el paso hacia la mitosis. S una clula no pudiera posponer la separacin de las cromtides, elevara mucho el riesgo de dotar a las clulas hijas de un nmero anormal de cromosomas. Es muy probable que este mecanismo de retroalimentacn opere a travs de un punto de verificacin que requiere la actividad de la Cdk para impulsar a la clula de la metafase a la anafase, similar al que controla el paso de la clula de GI a S o de G2 a la profase. Aunque no se observa un cambio evidente en la longitud de los microtbulos cromosmicos conforme los cromosomas se alinean sobre la placa de la metafase, los datos derivados de un gjan nmero de estudios usando tubulina fluorescente indican que los microtbulos existen en estado altamente dinmico. Por ejemplo, las subunidades se pierden y se aaden con rapidez en los extremos "ms" de los microtbulos cromosmicos, aunque al parecer estos extremos se encuentran unidos al cinetocoro. Asi, el cinetocoro no acta como casquete en el extremo del microtbulo que bloquea la entrada y salida de subunidades terminales, sino ms bien es un sitio de actividad dinmica. Puesto que se aaden ms subunidades al extremo "ms" de las que se pierden, hay adicin neta de subunidades al cinetocoro.

Corona fibrosa

Placa externa del cinetocoro

Material pericentrioar de los polos

HCl'RA 14-19. Conducta de los microtbulos durante la formacin de la placa metafsica. Inicialmente, el cromosoma est conectado a los microtbulos de los polos opuestos, que son muy diferentes en longitud. Conforme la prometafase contina, este desequilibrio se corrige como resultado del acortamiento de uno de los microtbulos debido a la prdida rpida de subunidades de tubulina a nivel del cinetocoro y ei alargamiento de los otros microtbulos debido a la accin rpida de subunidades de tubulina a nivel del cineocoro. Estos cambios se superponen a una polimerizacin-despolirnerizacin mucho ms lenta, que ocurre continuamente y confiere a los microtbulos del huso mittico un carcter dinmico. Los recuadros proporcionan una vista esquemtica de la adicin de subunidades al cinetocoro y de la prdida de subunidades en los polos.

Metafase
Una vez que todos los cromosomas se encuentran alineados en el ecuador del huso, con una cromtide de cada cromosoma conectada a un polo y su cromtide hermana conectada al polo opuesto, la clula ha alcanzado la etapa de metafase (fig. 14-21). El plano de alineacin de ios cromosomas durante la metafase se conoce como placa de la metafase. El huso mittico de la clula en metafase tiene disposicin altamente organizada de microtbulos que es ideal para la tarea de separar los cromosomas duplicados que residen en el centro de la clula. Funcionalmente, los microtbulos del huso de la metafase se pueden dividir en tres grupos (fig. 14-21). Todos ellos tienen la misma polaridad. Estos son:

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CAPITULO 14 - Reproduccin celular

10 pm

FIGURA 14-20. Participacin del cromosoma en la metafase y su movimiento en la placa metafsica. Esta serie de fotografas tomadas de un video muestra los movimientos de los cromosomas de una clula de pulmn de salamandra en un periodo de 100 segundos durante la prometafase. Aunque la mayor parte de los cromosomas de la clula se encontraban casi totalmente alineados en la placa metafsica al inicio de la secuencia, uno de los cromosomas no se encuentra fijo a las fibras del uso (flecha). Los cromosomas traseros se unen al uso en 6 y despus se desplazan en direccin al polo con velocidad variable hasta alcanzar una posicin estable en F. La posicin del polo esta indicada por la cabeza de la flecha en A. (Segn Stephen P. Alexander y Conh/ L. Rieder, ]. Cell Biol. 113:807, 1991; con permiso de Rockefelkr Uniuersity Press.)

No obstante, los extremos polares de los microtbulos experimentan prdida neta, y por lo tanto se cree que las subunidades se mueven a travs de los microtbulos cromosmicos ("rueda de molino") del cinetocoro hacia el polo. En el experimento ilustrado en la figura 14-22 se indica el flujo en direccin al polo de las subunidades de tubulina en un huso mittico. Anafase Las cromtides hermanas de cada cromosoma en metafase son comprimidas una contra otra a lo largo de las superficies internas, y aparentemente se mantienen juntas mediante una protena de "pegamento" no cromosmica. La anafase se inicia cuando las cromtides hermanas sbitamente se separan, lo cual se acompaa de liberacin de a protena de "pegamento" dentro del citoplasma. Tal vez la anafase se

desencadene por un rpido descenso de actividad de la proteincinasa dependiente de ciclina, la cual se acompaa por descomposicin rpida de la ciclina mittica. Sin embargo, aunque esto se logre, el corte de las conexiones de las cromtides hermanas no es resultado de la actividad del microtbulo, puesto que ocurre aun despus que los microtbulos cromosmicos son despolimerizados mediante tratamiento con colquicina. La separacin de las cromtides hermanas requiere la presencia de la actividad de topoisomerasa II (pg. 401}, que sugiere que las molculas de DNA de las cromtides duplicadas todava se encuentran entrelazadas. Al parecer, esta condicin es continuacin de una falla de los dplex para separarse por completo luego de la duplicacin del DNA en la fase S. Todos los cromosomas de la placa metafsica se separan de manera sincronizada y las cromtides (ahora conocidas como cromosomas, puesto que ya no se encuentran fijas a sus duplicados) inician su migracin hacia los polos (fig.

CAPITULO 14 Reproduccin celular

Fibras astrales del huso

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Fibras astrales del huso

Material pericentriolar

Fibras cromosmicas del huso

Fibras polares del huso

Material pericentriolar

FIGURA 14-21. El huso mittico de una clula animal. Cada polo del huso contiene un par de centrolos rodeado por material pericentriolar amorfo en el cual los microtbulos son nucleados. Son evidentes tres tipos de fibras del huso: astrales, cromosmicas y polares, y sus funciones se describen en el texto.

14-10). El movimiento de cada cromosoma hacia un polo se acompaa del acortamiento de los microtbulos fijos a su cinetocoro. El acortamiento se debe principalmente a la prdida neta de subunidades a nivel del cinetocoro durante la anafase (lo que revierte la tendencia de las subunidades a aadirse a este extremo del microtbulo durante la profase y la metafase). Conforme el cromosoma se mueve, el centrmero se observa sobre el borde delantero con los brazos del cromosoma hacia atrs (fig. 14-23). El movimiento de los cromosomas hacia los polos se conoce como anafase A, para distinguirla de un movimiento simultneo pero separado denominado anafase B, en la cual los dos polos del huso se separan entre s. Recordemos que los microtbulos polares procedentes de polos opuestos se superponen en la regin del ecuador del huso (fig. 14-23). Por consiguiente, la separacin de los polos se puede efectuar deslizando los microtbulos superpuestos desde polos opuestos, uno sobre otro, en direcciones opuestas. El alargamiento del huso mittico durante la anafase B se acompaa de la adicin neta de subunidades de tubulina a los extremos "ms" de los microtbuios polares. Por lo tanto, se pueden aadir subunidades preferencialmente a microtbulos polares y retirarlos de los microtbulos cromosmicos al mismo tiempo en diferentes regiones de la misma clula. El movimiento de los cromosomas hacia polos opuestos es muy lento en relacin con otros tipos de movimientos celulares, y prosigue a una velocidad aproximada de 1 //m por minuto, cifra que un investigador de mitosis ha calculado que equivale a que un viaje de Carolina del Norte a Italia, en Estados Unidos, tarde unos 14 millones de aos. Puesto que las distancias de las clulas son pequeas, el movimiento de los cromosomas a cualquier parte debe concluir en dos a 60 minutos. Se cree que la lenta velocidad de

movimiento de los cromosomas garantiza que los cromosomas se separen con precisin y sin enredarse. Las fuerzas que impulsan los movimientos en la anafase A y B se analizan en la siguiente seccin. Telofase Conforme los cromosomas se acercan a sus respectivos polos, tienden a reunirse en una sola masa, lo que marca el inicio de la etapa final de la mitosis, la telofase (figs. 14-10 y 14-24). La telofase es la etapa durante la cual la clula retorna a su condicin de interfase. La envoltura nuclear se reconstituye conforme las vesculas membranosas se unen a la superficie de los cromosomas y luego se fusionan lateralmente entre s para formar una cubierta de doble membrana cada vez ms grande. A medida que la envoltura nuclear se reconstituye, los cromosomas se dispersan cada vez ms hasta que desaparecen del campo del microscopio. Entre tanto, las vesculas que formaron parte del retculo endoplsmico o del complejo de Golgi se fusionan con vesculas de composicin similar para iniciar la reconstitucin de estas redes citoplsmicas membranosas. La verdadera reparticin del citoplasma entre las dos clulas hijas ocurre gracias a un proceso que analizaremos en breve. Sin embargo, primero consideraremos la naturaleza de las fuerzas necesarias para los movimientos de los cromosomas durante la mitosis. Fuerzas requeridas para movimientos mitticos La mitosis es un proceso caracterizado por movimientos amplios de las principales estructuras celulares. La profase

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CAPITULO 14 Reproduccin celular

Flujo de tubulina

Flujo de tubulina

FIGURA 14-23. El huso mittico y los cromosomas en anafase tarda. Se observan los brazos de los cromosomas tirados por los cinetocoros fijos a las fibras crornosmicas del huso en direccin hacia los respectivos polos. Las fibras crornosmicas en esta etapa tarda de la anafase son sumamente cortos y ya no aparecen entre los bordes delanteros de los cromosomas y los polos. Sin embargo, son claramente visibles las fibras polares en la zona situada entre los cromosomas que se separan. Se cree que la actividad de estas fibras polares causa la separacin de los polos observada durante la anafase B. (Segn ]. Richard Mclntosh, cu Microtubules, /. Hyams i/ C.L. Lloi/d, cas. Wey, 1994.)

MCl'liA 14-22. Flujo de tubulina a travs de los microtbulos del huso mittico en la metafase. Aun cuando en esta etapa los microtbulos parecen estacionarios, la inyeccin ce subunidadcs de tubulina marcadas con fluorescencia indica que los componentes del huso se encuentran en estado de flujo dinmico. Las subunidades se incorporan de manera preferencia! a los cinetocoros de los microtbulos cromosmicos y los extremos ecuatoriales de los microtbulos polares, y se pierden preferencialmente de los extremos "menos" de los microtbulos en la regin de los polos. Como resultado, se observa que las subunidades marcadas se desplazan a travs de los microtbulos conforme se prolonga el experimento.

porque son portadoras de una mutacin en un gen que codifica parte de la protena, y 2) inyeccin de anticuerpos contra la protena motora a clulas en diferentes etapas de la mitosis. Aunque an es muy temprano para extraer conclusiones firmes acerca de las funciones de diferentes protenas motoras, se pueden intentar algunas interpretaciones (fig. 14-25). Se cree que las protenas motoras localizadas a lo largo de los microtbuios polares desempean un papel clave para mantener los polos separados (fig. 14-25, n,b). Las protenas motoras residentes en el cinetocoro probablemente sean importantes para los movimientos oscilatorios de los cromosomas durante la prometafase (fig. 14-25,), para mantener los cromosomas en la plaC de la metafase (fig. 14-25, b) y para separar los cromosomas durante la anafase (fig. 14-25, c], segn se analiza ms adelante. Las protenas motoras situadas a lo largo de los microtbulcs entrelazados en la regin del ecuador del buso tal vez se encarguen de alargar dicho huso durante la anafase B (fig. 14-25, c).
Fuerzas requeridas para el movimiento de cromosomas en la anafase

se acompaa del movimiento de los polos del huso haca lados opuestos de la clula, la prometafase por el movimiento de los cromosomas hacia el ecuador del huso, la anafase A por el movimiento de los cromosomas desde el ecuador del huso hacia sus polos, y la anafase B por el alargamiento del huso. Se sabe relativamente poco acerca de las fuerzas encargadas de producir estos movimientos. En los ltimos 10 aos se han identificado varios motores moleculares diferentes en diferentes sitios de las clulas mitticas o de especies muy diversas. Todos los motores que se cree que participan en los movimientos mitticos son motores microtubulares, incluyendo algunos de protenas relacionadas con diferentes cinecinas (pg. 336) y dincnas citoplsmicas. Algunos motores se mueven hacia el extremo "ms" del microtbulo, otros hacia el extremo "menos". Las protenas motoras se localizan en los polos del huso, a lo largo de las fibras del mismo y dentro de los cinetocoros de los cromosomas. El papel de las protenas motoras especficas se ha obtenido principalmente de dos tipos de estudios: 1) anlisis del fenotipo de las clulas que carecen de protenas motoras

La observacin de pelculas detenidas de la mitosis y el examen de cortes de clulas en divisin con el microscopio electrnico condujeron a los primeros investigadores a concluir que los cromosomas eran tirados hacia los polos durante la anafase A de la misma manera que se puede arrastrar un pez al interior de un bote con un carrete y cuerda de pescar. Segn este punto de vista, conocido como hiptesis

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(a)

1 1 - 2 1 . Telofase. Micrografa electrnica de un corte a travs de una clula granulosa del ovario en telofase. (Segn ].A. Rijoiii, Histology, Oxford, 1974.)

de la cuerda, los microtbulos actan como la cuerda que tira de los cromosomas. El acortamiento observado de los microtbulos cromosmicos ocurre conforme se desensamblan por prdida de subunidades a nivel de los polos. Este punto de vista aparentemente lgico y no complicado de los movimientos del cromosoma se abandon luego de varias observaciones incompatibles. Principalmente, el descubrimiento de que la despolarizacin de los microtbulos cromosmicos ocurre a nivel de los cinetocoros y no en los polos. Durante el decenio de 1980 se identificaron dinenas citoplsmicas y cinecinas relacionadas con protenas dentro de los cinetocoros de cromosomas mitticos, lo que indica que los cromosomas estn provistos de todo el equipo motor necesario para moverse de un lugar a otro a lo largo de un microtbulo. Durante la interfase, los anticuerpos contra dinenas muestran que la protema se localiza en el cito-

FIGURA 14-25. Actividad hipottica de las protenas motoras durante la mitosis. a) Prometafase. Las dos mitades del huso mittico se desplazan separndose entre s hacia polos opuestos; se cree que esto es resultado de la accin de motores dirigidos hacia el extremo "ms" y relacionados con los microtbulos polares (paso 1). Entre tanto, los cromosomas se fijan a los microtbulos cromosmicos y se pueden observar oscilando hacia atrs y hacia adelante a lo largo de los microtbulos. Estos movimientos hacia atrs y hacia adelante pueden ser resultado de motores en los extremos "menos" (paso 2) y en los extremos "rns" residentes en los cinetocoros. b) Metafase. Las' dos mitades del huso mantienen su separacin como resultado de la actividad de motores situados en los extremos "ms" relacionados con los microtbulos polares (paso 4). Se cree que los cromosomas se mantienen en el plano ecuatorial gracias a la actividad equilibrada de protenas motoras residentes en el cinetocoro (paso 5). CJ Anafase. El movimiento de los cromosomas hacia los polos puede ser resultado de la actividad de motores en el extremo "menos" de los cinetocoros (paso 6), en tanto que la separacin de los polos (anafase B) es resultado de la actividad continua de motores en el extremo "ms" de los microtbulos polares (paso 7). (Segn K.E. Sawin y JM, Scholey, Trends Cell Biol. 1:122, 1991.)

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CAPITULO 14 Reproduccin celular

plasma. Sin embargo, a medida que la clula entra en mitosis la protena motora se localiza en ambos polos del huso y en los cinetocoros. En la figura 14-26 se muestra la localizacin de la dinena citoplsmica en la regin de los cinetocoros de una clula de mamfero en prometafase. La importancia de los motores del cinetocoro es apoyada por estudios del movimiento de cromosomas mitticos aislados in miro, capaces de movimientos rpidos sobre la superficie de los microtbulos en ambas direcciones. Los anticuerpos para varias de estas protenas motoras pueden bloquear el movimiento de los cromosomas luego de ser inyectados en una clula mittica. Aunque se cree que los motores microtubulares constituyen la fuerza ms probable para el movimiento de los cromosomas, una teora alternativa propuesta nicialmente por Shinya Inou, del Marine Biolgica! Laboratory at Woods Hole, todava permanece como alternativa viable. Inou propuso que el desensamblado de los microtbulos cromosmicos durante la anafase no es simplemente una consecuencia de movimiento de los cromosomas, sino la causa del mismo. Inou sugiri que el desensamblado de los microtbulos que componen una fibra del huso pueden generar suficiente fuerza para tirar del cromosoma hacia adelante. No sera de esperar que la disolucin de una fibra en un extremo suministre fuerza de tensin suficiente; sin embargo, los clculos revelan que se requiere muy poca fuerza para mover un objeto tan pequeo como un cromo-

soma una distancia tan corta: tal vez 10~8 dinas (equivalente a 20 a 30 molculas de ATP). El apoyo experimental para el modelo del desensamblado proviene de estudios en los cuales los cromosomas fijos a microtbulos sufren movimientos como resultado de la despolimerizacin de los microtbulos. En la figura 14-27 se muestra un ejemplo de estos experimentos. En este caso, ocurren movimientos in vitro de un cromosoma enlazado a un microtbulo (flechas) luego de diluir el medio. La dilucin reduce la concentracin de tubulina soluble, lo que a su vez favorece la despolimerizacin de los microtbulos. Este movimiento ocurre en ausencia de ATP, que sera necesario si la fuerza fuera generada por una protena motora. A partir de este y de otros experimentos, parecera que el desensamblado de microtbulos por s solo puede generar suficiente fuerza para tirar de los cromosomas a distancias considerables, pero todava est abierto a debate si este es o no el mecanismo utilizado por las clulas. Aun si el desensamblado de microtbulos no genera las fuerzas que participen en el movimiento del cromosoma, el acortamiento de las fibras cromosmicas todava debe ser el paso ms lento en el proceso total, y por lo tanto debe controlar la velocidad del movimiento cromosmico. Visto de esta manera, el desensamblado de los microtbulos acta como control que mantiene lenta la velocidad de movimiento de los cromosomas a pesar de fuerzas ejercidas por motores que de otro modo provocaran que o movimiento de los cromosomas fuera mucho ms rpido. Se cree que la separacin lenta de los cromosomas es importante para evitar que stos se enreden y garanticen que cada clula hija reciba una dotacin completa de informacin gentica.

Cito emesis
En tanto la mitosis efecta la separacin de los cromosomas duplicados en dos ncleos hijas, la clula se divide en dos clulas hijas mediante un proceso separado denominado citocinesis. El desdoblamiento de una clula en dos es un hecho notable que ha intrigado a los bilogos celulares durante muchos aos. El primer indicio de citocinesis se observa durante la anafase tarda como indentacin en la superficie de la clula dentro de una banda estrecha alrededor de la misma. Conforme avanza e! tiempo, la indentacin se profundiza y se convierte en un surco que rodea por completo a la clula. El plano del surco se sita en el mismo plano que ocupaban previamente los cromosomas de la placa de la metafase. O sea, el plano del surco es perpendicular al eje largo del huso mittico, lo que garantiza que los dos conjuntos de cromosomas se separen finalmente en dos clulas. El surco contina profundizndose hasta que las superficies opuestas hacen contacto en el centro de la clula y la clula se separa en dos (fig. 14-28). Nuestra idea actual del mecanismo encargado de la citocinesis proviene de una proposicin hecha por Douglas Marsland en el decenio de 1950, conocida como la teora del anillo contrctil (fig. 14-29). Marsland propuso que la fuerza necesaria para separar una clula se genera en una delgada banda de citoplasma contrctil justo por debajo de la membrana plasmtica, o sea la corteza, en la regin del

FIGURA 1 1-126. Localizacin de la dinena citoplsmica en la regin del cinetocoro de cromosomas en prometaf ase. La dinena citoplsmica se observa como puntos de color azul brillante contra el color azul prpura de los cromosomas condensados. (Cortesa de Curt Pfarr,}. Cell Biol. vol. 115, cover ofno. 3, 1991; con permiso de RockefeUer Uivcrfity Press.)

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601

5 um

FIGURA 14-27. Demostracin experimental de que el desensamblado del microtbulo puede desplazar in vitro a los cromosomas fijos. La estructura situada en la parte inferior izquierda es el residuo de la lisis de un protozoario encerrado dentro de una cmara llena de lquido. En presencia de tubulina se usaron los corpsculos bsales de la superficie del protozoario como sitios para iniciar los microtbulos, que crecieron hacia afuera dentro del medio. Una vez formados los microtbulos, se introdujeron cromosomas mitticos condensados en la cmara y se les permiti unirse a los extremos de los microtbulos. La concentracin de tubulina soluble dentro de la cmara fue disminuida por dilucin, provocando la despolimerizacin de los microtbulos. Como se muestra en esta secuencia de video, los microtbulos se encogieron y el encogimiento fue acompaado por el movimiento del cromosoma fijo (flechas). Barra igual a 5 //m. (Segn Martine Couc, Vivan A. Lambillo y /. Richard Mclritosh, J. Cell Biol. 112:1169, 1991; con permiso de Rockefeer Universify Press.)

propio surco. El examen microscpico de la corteza situada por debajo del surco de una clula en divisin revela la presencia de numerosos filamentos de actina (figs. 14-30, a,

K K i L K A 1-I-2R. Divisin del huevo de un erizo de mar en dos clulas por citocinesis. (Cortesa de Tnjggve Gusta/son.)

y 14-31, a). Utilizando tcnicas pticas especializadas, se observa que los filamentos de actina estn alineados paralelamente al surco de separacin (fig. 14-30, b). Interpuestos entre los filamentos de actina se encuentra un pequeo nmero de filamentos cortos bipolares de miosina. Estos filamentos se componen de miosina II, segn se demuestra por su enlace a anticuerpos antimiocina II (fig. 14-31, b). La importancia de la miosina II en la citocinesis es evidente por el hecho de que los anticuerpos antimiocina II provocan el cese inmediato de la citocinesis cuando se inyectan a una clula en divisin (fig. 14-31, c], y a partir de estudios que muestran que las clulas que carecen de un gen de miosina II funcional pueden efectuar la divisin nuclear por mitosis, pero no se pueden dividir en clulas hijas. Estas diferentes observaciones demuestran que la fuerza generadora del mecanismo que opera durante la citocinesis es similar a la contraccin de clulas musculares basada en actinamiosina. En tanto que el deslizamiento de los filamentos de actina de una clula muscular provoca el acortamiento de la fibra muscular, el deslizamiento de los filamentos del anillo contrctil tira de la corteza y de la membrana plasmtica a la cual est fija en el centro de la clula. Uno de los aspectos ms notables del anillo cortical es la rapidez con la cual se ensambla antes de la citocinesis y se desmantela una vez concluida sta. Los filamentos de actina y miosina que aparecen en el anillo contrctil se componen de las mismas subunidades previamente presentes como parte del citoesqueleto de la clula en interfase. El

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CAPITULO 14 Reproduccin celular

Filamento de actina

Filamento de miosina

Clulas hijas

FIGURA 14-29. Formacin y operacin del anillo contrctil en ia citocinesis. Los filamentos de actina se ensamblan para formar un anillo en el ecuador de las clulas. La contraccin del anillo, que requiere la accin de miosina, provoca la formacin de un surco que separa la clula en dos.

anillo contrctil siempre se forma en un plano situado a la mitad de la distancia entre los polos del huso, aun si alguno de estos polos se desplaza experimentalmente mediante una microaguja introducida en la clula. Los estudios de este tipo sugieren que el plano en el cual se ensambla el anillo contrctil es determinado por una seal que proviene de los polos del huso, Como se indica en los experimentos descritos a continuacin, se cree que la seal ejerce su accin antes del inicio de la metalase. Aunque mitosis y citocinesis normalmente estn en estrecha vinculacin, es posible un sorprendente grado de disociacin. Los experimentos demuestran que la formacin del surco puede ocurrir luego de eliminar o destruir por completo el aparato mittico, pero slo si esto se efecta despus del inicio de la metafase. Por ejemplo, todo el aparato mittico se puede succionar hacia afuera de una clula en anafase, mucho antes de la formacin del surco, y la citocinesis ocurrir en el mismo sitio que habra tenido lugar si la clula no se hubiera alterado. La figura 14-32 mues-

FIGURA 14-30. Filamentos de actina del anillo contrctil, a) Micrografa electrnica del corte de un huevo de erizo de mar en desdoblamiento paralelo al surco y, por lo tanto, paralelo a los microfilamentos del anillo contrctil, b) Imagen generada por computadora que muestra la orientacin de los filamentos de actina en una clula de roedor en divisin. La barra de color amarillo rojo brillante, en la parte media de la imagen, indica la alineacin preferencial de los filamentos de actina paralela al surco de separacin, (a: Cortesa de Thomas E. Schroeder; b: segn Douglas J. Fishkind y Yu-Li Wang, J. Ccll Biol. vol. 123, cover of no. 4, 1993; con permiso de Rockcfeller University Press.)

tra el surco en una clula en la cual se han colocado grandes gotas de aceite durante la anafase antes de iniciarse la citocinesis. En este caso, la gota de aceite desplaza por completo al huso mittico, pero el surco se forma a lo largo del mismo plano que se habra formado si no se hubiera inyectado el aceite.
Citocinesis en clulas vegetales: formacin de la placa celular

Las clulas vegetales, encerradas por una pared celular inextensible, dividen su contenido citoplsmico en clulas hijas

CAPITULO 14 Reproduccin celular

603

FIGURA 14-32. Demostracin experimental de que la citocinesis no depende de un huso mittico intacto. La microinyeccin de una gota de aceite en este huevo de erizo de mar en anafase trastorna por completo el aparato, pero no tiene efecto sobre la posicin de la citocinesis en curso. (Cortesa de Y. Hiramoto.)

IW

30 pm

FICUKA 14-31. Demostracin experimental de la importancia de la miosina en la citocinesis. a-b) Localizacin de la actina y la miosina II en la amiba DictyOSteHurn durante la citocinesis, segn se puede demostrar con doble tincin inmunofluorescente. a) Los filamentos de actina (color naranja) se localizan en el surco de separacin y en la periferia de la clula, donde desempea un papel clave en el movimiento celular (seccin 9-7). b) Miosina II (color verde), localizada en el surco de separacin, como parte del anillo contrctil que rodea al ecuador, c) Huevo de una estrella de mar a la cual se le inyect un anticuerpo contra la miosina de la estrella de mar segn se observa bajo luz polarizada (los husos mitticos aparecen ms brillantes o ms oscuros que el fondo debido a la presencia de microtbulos orientados, seccin 17-1). La citocinesis est completamente suprimida por los anticuerpos, pero la mitosis (revelada por los husos mitticos) contina sin ser afectada, (a: Cortesa de Yoshio Fukui; b: segn Daniel P. Kiclmrt, Issei MnbucM \j Shimja Inou, }. Cell Biol. 94:167, 1982; con permiso de Rockefetler University Press.)

por un mecanismo de tipo muy diferente. En vez de contraer a la clula mediante un surco que avanza haca adentro a partir de la superficie celular externa, las clulas vegetales construyen una membrana celular y una pared celular denominada placa celular, que crece hacia afuera de las paredes laterales existentes. La construccin de una nueva placa celular se puede seguir si se coordinan observaciones sobre clulas vivientes con el microscopio de luz y clulas ya fijadas en el microscopio electrnico. La clula vegetal

mejor estudiada es la de una endosperma del lirio sanguneo africano Haemanthus, que se puede aislar desde la semilla y cultivar in vitro durante una divisin celular adicional. El primer signo d formacin de una placa celular se observa en la anafase tarda-telofase inicial con la aparicin de un material denso regularmente alineado en el plano ecuatorial de la placa previa de la metafase. En las primeras etapas, este material se restringe a la regin central de la clula. El examen con microscopio electrnico de esta regin, llamada fragmoplasto (fig. 14-33, a), muestra que consta de grupos de microtbulos entrelazados orientados perpendicularmente a la futura placa, juntos mediante algn tipo de material electrnicamente denso acompaante. Los microtbulos de los grupos tal vez se originen a partir de residuos del huso mittico y tambin por la formacin de nuevas subunidades de tubulina. Con el tiempo, el material denso de los grupos de microtbulos se alinea mejor en el plano que corresponde a la silueta previa del plano de la futura pared celular. Despus de la formacin del fragmoplasto, las vesculas pequeas se mueven hacia dicha regin, quiz transportadas por los propios microtbulos. Las vesculas que se originan a partir del sistema RE-Golgi, contienen el material para construir la placa celular, precursora de la pared celular madura. Conforme las vesculas se desplazan a esa posicin en el plano ya establecido del fragmoplasto, se fusionan entre s para formar largas cadenas (fig. 14-33, b). La membrana de las vesculas se convierte en la membrana plasmtica de las dos clulas hijas adyacentes, en tanto que el material dentro de las vesculas se convierte en la placa celular interpuesta. El proceso inicia cerca del centro de la clula y luego avanza lateralmente a medida que los grupos de microtbulos y vesculas forman las paredes laterales de la placa celular creciente. La placa celular se extiende con rapidez hasta alcanzar las paredes ya establecidas de la clula. Una vez que la formacin de la placa celular concluye, se aaden materiales adicionales para producir la pared celular madura.

604

CAPITULO 14 Reproduccin celular

(b)
FIGURA 14-3;i. Formacin de una placa celular entre dos clulas vegetales hijas durante la citocinesis. a) Fragmopasto que muestra los haces de microtbulos que cruzan el centro de la clula en disposicin superpuesta. Entre cada haz se puede notar una regin ms densa que regularmente cae en el plano de la futura placa celular, b) Micrografa de menor resolucin en etapa tarda. Las vesculas de secrecin procedentes de los complejos de Golgi cercanos se encuentran alineadas a lo largo del plano ecuatorial y comienzan a fusionarse entre s. La membrana de las vesculas forma la membrana plasmtica de las dos clulas hijas y el contenido de las vesculas proporciona el material que forma la placa celular para separar a las clulas. Ms tarde, otras vesculas de secrecin suministran material adicional para construir la pared celular, (a: Segn P.K. Hepler y W.T. Jackson, ]. Cell Biol. 38:442, 1968; con permiso de RockefeUer Universty Press; b: David Phillips/Photo Researchers.)

14-3 Meiosis
La produccin de un descendiente por reproduccin sexua! incluye la unin de dos clulas, cada una con un juego completo de cromosomas. Como se analiza en el captulo 10, la duplicacin del nmero de cromosomas que ocurre durante la fertilizacin se compensa por una reduccin equivalente del nmero de cromosomas en una etapa previa a la formacin de los gametos. Meiosis es el proceso durante el cual el nmero de cromosomas se reduce de modo que se forman clulas que slo contienen un miembro de cada par de cromosomas homlogos. As, la meiosis garantiza la produccin de una fase haploide en el ciclo de vida, y la fertilizacin asegura una fase diploide. Sin meiosis, la reproduccin sexual sera imposible. A diferencia de la mitosis, en la cual los cromosomas se duplican y luego se dividen entre dos ncleos hijas en una sola divisin, la duplicacin de los cromosomas antes de la meiosis va seguida por dos divisiones en secuencia que distribuyen los cromosomas entre cuatro ncleos (fig. 14-34). Para asegurar que cada ncleo hija formado durante la meiosis posea un miembro de cada par de cromosomas homlogos, ocurre un elaborado proceso de formacin de pares de cromosomas que no tienen contraparte en la mitosis. A medida que se forman los pares, los cromosomas homlogos participan en un proceso de recombinacin gentica que produce cromosomas con nuevas combinaciones de alelos maternos y paternos.

El examen de varios eucariotes ndica que hay notables diferencias respecto de la etapa de) ciclo vital durante la cual ocurre la meiosis y en la duracin de la fase haploide. Con esta base se pueden identificar los tres grupos siguientes (fig. 14-35): 1. Meiosis terminal o gamtica. En este grupo, que incluye todos los animales multicelulares, muchos protozoarios, y unas pocas plantas inferiores, las divisiones meticas estn ntimamente relacionadas con la formacin de los gametos (fig. 14-35, izquierda). Por ejemplo, en vertebrados macho (fig. 14-36, a), la meiosis ocurre justo antes de la diferenciacin de los espermatozoides. La espermatogonia se convierte en esperma toritos primarios, que despus sufren dos divisiones meiticas para formar cuatro espermtides relativamente indiferenciadas, cada una de las cuales sufre una transformacin compleja para convertirse en espermatozoide altamente especializado. En los vertebrados hembra {fig. 14-36, b), la oogonia se convierte en oocitos primarios, que despus entran en profase meitica prolongada. Durante esta profase, e! oocito primario crece y se llena de yema y otros materiales. Slo despus de esta diferenciacin el oocito est completo (o sea, el oocito alcanza esencialmente el mismo estado que cuando se fertiliza) y puede ocurrir la divisin meitica. Los huevos de vertebrados tpicamente se fertilizan en una etapa anterior a la conclusin de la meiosis (de ordinario en la

CAPITULO 14 Reproduccin celular Gamtica o terminal Gametos (n) Cigoto (2n} Esprica o intermedia Cigtica o inicial

605

Interfase

Profase I

Meiosis

Generacin diploide f2n) Metafase

Anafase I

Generacin haploide

(n)

Gametofito (n)

Meiosis

Gametos (n)

KICUKA 14-35. Comparacin de los tres principales grupos de organismos con base en la etapa dentro del ciclo vital donde ocurre la meiosis y la duracin de la fase haploide. (Adaptado de E.B. Wilson, The Cell in Development and Heredity, 3a. ed., 1925; reimpreso con permiso de Macmillan Publishing Co., Inc.)

FIGURA 14-34. Etapas de la meiosis.

metafase II). La meiosis concluye despus de a fertilizacin, en tanto el esperma resida en el citoplasma del vulo. Meiosis inicial o cigtica. En este grupo, que incluye slo unas pocas algas, protozoarios y hongos, las divisiones meiticas ocurren justo despus de la fertilizacin (fig. 14-35, derecha). Por consiguiente, todas las clulas son haploides; la etapa diploide del ciclo vital se restringe a un breve periodo despus de la fertilizacin. Meiosis intermedia o por esporas. En este grupo, que incluye todas las plantas evolutivamente elevadas, las

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CAPITULO 14 Reproduccin celular

Espermatogonia Mitosis (varias generaciones)

Oogonia Espermatocito primario

Espermatocitos secundarios

Espermtides

/\o clulas espermatozoides

FIGURA 14-36. Etapas de la gametognesis: comparacin entre la formacin de espermatozoides y vulos. En ambos sexos, una poblacin relativamente pequea de clulas germinales primordiales prolifera por mitosis para formar una poblacin (espermatogenia u oogonia) a partir de las cuales se diferencian los gametos. En el macho (a) ocurre la meiosis antes de la diferenciacin, en tanto que en la hembra (b) la meiosis ocurre despus de la diferenciacin. Cada espermatocito primario generalmente da lugar a cuatro gametos viables, en tanto que cada oocito primario slo forma un huevo fertilizable y dos o tres corpsculos polares.

divisiones meiticas tienen lugar en una etapa no relacionada con la formacin de gametos ni con la fertilizacin (fig. 14-35, centro). Si consideramos que el ciclo de vida se inicia con la unin de un gameto masculino (clula del polen} y un gameto femenino (el vulo), el cigoto diplode formado sufre mitosis y se desarrolla para dar un esporofita diploide. En alguna etapa del desarrollo del esporofita ocurre la esporognesis (que incluye la meiosis), produciendo esporas que germinan directamente para formar un gametofito haploide. El gametofito puede ser una etapa independiente o, como en el caso de las plantas con semilla, una pequea estructura retenida dentro de los vulos. Cualquiera que sea el caso, los gametos se producen en el gametofito haploide por mitosis.

Etapas de la meiosis
Como en toda divisin celular, el preludio de la meiosis incluye la duplicacin del DNA. La fase S premeitica generalmente se prolonga ms que la fase S premittica. La profase de la primera divisin meitica (o sea, profase I) se

considera extraordinariamente alargada cuando se compara con la profase de una divisin mittica. Por ejemplo, en la mujer, casi todos los oocitos del ovario han entrado en la profase meitica I en el momento del nacimiento. Puesto que no se producen oocitos adicionales durante el periodo de vida de un individuo particular, muchos de estos oocitos permanecen en la misma etapa aproximada de profase durante varios decenios. Debido a que la primera profase meitica es tan larga y compleja, se acostumbra dividirla en varias etapas (fig. 14-37). La primera etapa de la profase I es la leptotena, durante la cual los cromosomas gradualmente se hacen visibles con el microscopio de luz. Aun cuando se sabe que los cromosomas se duplican en etapa muy temprana, el microscopio de luz no indica si cada cromosoma realmente se compone de un par de cromtides idnticas. Sin embargo, con el microscopio electrnico se observa que los cromosomas se componen de pares de cromtides. Un denso filamento proteinceo, o cordn axial, se sita en el surco entre las cromtides hermanas de cada cromosoma. La compactacin de los cromosomas contina a travs del leptoteno hasta alcanzar un punto donde los homlogos estn listos para asociarse. El proceso para juntar homlo-

CAPITULO 14 Reproduccin celular Centrmero

607

Tetrada

Nuclolo

Complejo sin apto drmico

Leptoteno

Cigoteno

Paquiteno

Quiasma

Diploteno

Diacinesis

Metafase 1

FIGURA 14-37. Etapas de la profase I. Lo que ocurre en cada etapa se describe en el texto.

gos entre s se denomina sinapsis y ocurre durante el cigoteno, segunda etapa de la profase I. La sinapsis es un acontecimiento intrigante sealado por preguntas importantes an no respondidas. En base a qu se reconocen los homlogos? Cmo se puede alinear perfectamente el par formado? En qu momento ocurre el primer reconocimiento entre homlogos? Las respuestas a estas preguntas han sido motivo de acalorado debate durante aos, y estudios recientes en levaduras aadieron nuevos argumentos a la discusin. En general, se asume que la interaccin entre cromosomas homlogos comienza cuando los cromosomas inician la sinapsis. Sin embargo, estudios en clulas de levaduras efectuados por Nancy Kleckner y sus colegas, en la Universidad de Harvard, indican que los segmentos homlogos del DNA procedente de cromosomas homlogos realmente hacen contacto entre s durante el leptoteno y que la condensacin del cromosoma y la sinapsis durante el cigoteno simplemente hacen visible esta disposicin bajo el microscopio. Segn se analiza en la pgina 615, el primer paso en la recombinacin gentica es la ocurrencia de roturas en las dobles cadenas de las molculas de DNA alineadas en preparacin para el entrecruzamiento. Los estudios en levaduras indican que estas roturas ocurren antes del inicio de la sinapsis, lo que sugiere que la recombinacin gentica empieza antes que los cromosomas sean pares visibles. Como se hace notar ms adelante, la recombinacin contina durante las etapas subsecuentes de la meiosis.

El examen con el microscopio electrnico revela que la formacin de pares de cromosomas homlogos tpicamente ocurre en dos etapas. En la primera etapa, los cromosomas se alinean regularmente pero permanecen separados casi 300 nm. En la segunda etapa, los cromosomas homlogos se aproximan entre s ms estrechamente y alcanzan una relacin precisa punto a punto a lo largo de su longitud, pero todava permanecen separados por una distancia aproximada de 100 nm. Las micrografas electrnicas indican que la sinapsis de los cromosomas ocurre por la formacin de una estructura compleja denominada complejo sinaptonmico. El complejo sinaptonmico (CS) es una estructura parecida a una escalera (figs. 14-38 y 14-39) compuesta de tres barras paralelas con muchas fibras transversales que conectan la barra central con las dos barras laterales. La cromatina de cada homlogo est ntimamente relacionada con una de las barras laterales del CS que sostiene unidos a los pares de cromosomas. Observaciones sobre el ensamblado del CS indican que sus elementos laterales se derivan directo de los cordones axiales de los cromosomas leptotenos. El CS se puede imaginar como la estructura que sostiene cada par de cromosomas homlogos en la posicin apropiada para iniciar la recombinacin gentica entre cadenas de DNA a medida que se prolonga hacia el centro de la estructura en forma de escalera formada por ambos homlogos. Si la recombinacin gentica se inicia durante el leptoteno, mucho antes de la formacin del CS, entonces

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CAPITULO 14 Reproduccin celular

FIGURA 14-38. Complejo sinaptonmico. a) Micrografa electrnica de un corte a travs del espermatocito bivalente de un saltamontes. Los cromosomas homlogos se mantienen juntos por el complejo sinaptonmico, del cual se observan los elementos laterales teidos de oscuro y su elemento central ms opaco. El material ms oscuro en la periferia del cromosoma es parte del nuclolo que se encuentra fijo a este cromosoma particular, b) Micrografa electrnica del complejo sinaptonmico despus de tratamiento con DNasa para eliminar las fibras cromosmicas. La estructura restante es la propia estructura semejante a escalera de naturaleza proteincea. (a: Cortesa de Petcr B. Mocns; b: segn D. Comings y T. Okada, Exp. Cell Res. 65:104, 1971.)

(b)

el CS puede funcionar principalmente como un armazn para permitir que las molculas de DNA interactuantes continen sus actividades de entrecruzamiento. El complejo formado por un par de cromosomas homlogos unidos por sinapsis se denomina bivalente o tetrada, dos trminos sinnimos. El primer trmino refleja el hecho de que el complejo contiene dos homlogos, en tanto que el ltimo trmino llama la atencin a la presencia de cuatro cromtides. El fin de la sinapsis marca la terminacin del cigoteno y el inicio de la siguiente etapa de la profase I, llamada paquiteno (fig. 14-37}. El paquiteno es la primera etapa de la profase que tiende a ser excesivamente prolongada. En tanto leptoteno y cigoteno por lo general duran unas pocas horas, el paquiteno con frecuencia se extiende por un periodo de das o semanas. Durante este lapso, los homlogos se mantienen unidos por un complejo sinaptonmico (fig. 14-39). Bajo el microscopio electrnico se observan algunos corpsculos electrnicamente densos de casi 100 nm de dimetro a intervalos regulares en el centro del complejo sinaptonmico. Estas estructuras reciben el nombre de nodulos de recombinacin porque se cree que contienen el mecanismo que facilita la recombinacin gentica. El inicio de diploteno, la siguiente etapa de la profase meitica I, en general se reconoce por la disolucin del CS y la tendencia a separarse de los cromosomas homlogos de los bivalentes. Los cromosomas homlogos se separan, pero se puede observar que permanecen fijos en puntos especfi-

cos denominados quiasmas {fig. 14-40). Los quiasmas por lo genera! se localizan en los sitios del cromosoma donde ocurre el intercambio gentico durante el entrecruzamiento previo. Aunque no siempre hay correlacin 1:1 entre entrecruzamiento y quiasmas, la presencia de estos puntos de fijacin suministra una gua visual notable del grado de recombinacin. Durante el desarrollo de la mayor parte de los oocitos, el diploteno es una fase sumamente prolongada de oognesis en la cual ocurre el crecimiento en masa de la clula. Por lo tanto, la etapa de diploteno que ocurre a mitad de la profase meitica es un periodo de intensa actividad metablica. Se puede observar esta actividad en la conducta de los cromosomas. En tanto que los cromosomas paquiteno son compactos, los cromosomas diploteno de clulas masculinas {espermatocitos primarios) y femeninas {oocitos primarios) tpicamente son difusos y difciles de observar con el microscopio. En muchos espermatocitos y oocitos, los cromosomas diploteno se dispersan en una configuracin particular que no se observa en ningn otro momento del ciclo de vida del organismo. Los cromosomas con esta configuracin se denominan cromosomas ampbrush {fig..12-14, b) y se caracterizan porque tienen un esqueleto axial desde el cual se extienden pares de asas hacia afuera en direcciones opuestas. Las asas se originan en pares porque cada cromosoma consta de pares de cromtides duplicadas y cada

CAPITULO 14 Reproduccin celular

609

&**&
(b)

(a)

FIGURA 14-4-0. Demostracin visible de entrecruzamiento. a-b) Par de bivalentes diploteno procedente de un saltamontes que muestra los quiasmas formados entre cromtides de cada cromosoma homlogo, c) Gammagrafa electrnica de un bivalente de sitios desiertos con tres quiasmas (flechas), (a-b: Segn Bernard John, Meiosis, 1990; reimpreso con permiso de Cambridge University Press; c: segn Klaus Werner Wolf, Bioess. 16:108, 1994.)

(b)

Fibras crornosmicas de las cromtides hermanas 1 y 2 (paternas)

Fibras cromosmicas de las cromtides hermanas 3 y 4 {maternas}

FIGURA 14-39. Entrecruzamiento y el complejo sinaptonmico. a) Micrografa electrnica de un cromosoma paquiteno humano que muestra el par de cromtides reunidas en disposicin paralela firmemente ordenada (K, cinetocoro). La punta gruesa de la flecha apunta a una barra densa que se observa dentro del complejo sinaptonmico. b) Diagrama del complejo sinaptonmico y las fibras cromosmicas acompaantes. Los granulos densos (nodulos de recombinacin) observados en el centro del CS pueden contener el mecanismo enzimatico requerido para la recombinacin gentica, que se cree ocurre en etapa mucho ms temprana de la profase I. (Micrografa de Alberto . Salan, Chromosoma 81:330, 1980.)

asa es una prolongacin de una sola cromtide. Los dos cromosomas homlogos todava permanecen unidos entre s a nivel de los quiasmas. El esqueleto de un cromosoma lampbrush contiene DNA y protena firmemente asociada, y es transcripcionalmente inactivo. Por lo contrario, el DNA de las asas est muy extendido y es sitio de intensa actividad de transcripcin. Los cromosomas lampbrush del oocito proporcionan el RNA utilizado para la produccin

de protenas, tanto durante la oognesis como durante el desarrollo embrionario temprano despus de la fertilizacin. En la etapa final de la profase meitica I, llamada diacinesis, los cromosomas se preparan para fijarse a las fibras del huso meitico. En aquellas especies donde los cromosomas se dispersan extensamente durante el diploteno, durante la diacinesis se vuelven a condensar. La diacinesis termina con la desaparicin de los nuclolos, la rotura de la envoltura nuclear y el desplazamiento de las tetradas haca la iliaca de la metafase. En oocitos de vertebrados esto se desencadena por un incremento del grado de actividad de la proteincinasa del factor promotor de maduracin. En realidad, el FPM se identific primero por su capacidad para iniciar estos acontecimientos, que representan la maduracin del oocito (vase La va experimental). En la mayor parte de las clulas eucariotas se puede observar que los cromosomas homlogos alineados en la placa de metafase de la meiosis I an contienen quiasmas, y en realidad estos sitios parecen ser el medio primario mediante el cual los homlogos permanecen juntos como bivalente. De hecho, cada par de homlogos forma cuando menos un quiasma, en tanto que los cromosomas ms largos tienden a presentar varios. En los casos donde no se encuentra un quiasma entre cromosomas homlogos por lo general hay una falla del bivalente para mantenerse unido despus de la disolucin del complejo sinaptonmico. La

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CAPITULO 14 Reproduccin celular

ausencia de quiasma aumenta la probabilidad de que los cromosomas homlogos no se separen durante la primera divisin meitica, lo que provoca segregacin anormal de cromosomas. La consecuencia de un acontecimiento de esta naturaleza se analiza en La perspectiva humana en este captulo. En la metafase I se encuentra un par de cromosomas homlogos orientados de tal manera que ambas cromtides de un cromosoma se enfrentan al mismo polo. Por consiguiente, los centrmeros unidos de las cromtides hermanas se sitan lado a lado en relacin al eje largo del huso, y las fibras cromosmicas de un polo dado estn conectadas a ambas cromtides de un solo cromosoma (fig. 14-37). Durante la anafase I, los cromosomas homlogos se separan. Puesto que no hay interaccin entre una tetrada y otra, los cromosomas materno y paterno de cada tetrada se segregan en dos clulas hijas independientemente de los otros cromosomas (fig. 14-34). La anafase I es el suceso citolgico que corresponde a la ley de Mendel de la permutacin independiente (pg. 392). Durante el movimiento hacia la anafase, se puede observar que cada cromosoma est compuesto de dos cromtides todava asociadas y conectadas entre s por sus centrmeros. La telofase I de la meiosis produce cambios menos espectaculares en comparacin con la telofase de la mitosis,

puesto que en general los cromosomas no se revierten a un estado de verdadera nterfase. Aunque en muchos casos los cromosomas muestran cierto grado de dispersin, no alcanzan el estado de extensin extrema del ncleo en interfase. De manera similar, la envoltura nuclear puede o no reconstituirse durante la telofase I. La etapa entre las dos divisiones meiticas se denomina intercinesis y por lo general es de corta duracin. En animales, las clulas en etapa fugaz se conocen como espermatocitos secundarios u oocos secundarios. Se caracterizan porque tiene un nmero haploide de cromosomas pero una cantidad diploide de DNA nuclear, puesto que cada cromosoma an est representado por un par de cromtides unidas. La intercinesis va seguida por la profase II, una profase mucho ms simple que su predecesora. Los cromosomas simplemente se vuelven a condensar y se alinean en la placa de la metafase. En constraste con su orientacin durante la rnetafase I, los cinetocoros de las cromtides hermanas de la metafase II se enfrentan a polos opuestos y por ltimo se fijan a conjuntos opuestos de fibras cromosmicas del huso. La metafase II es la etapa durante la cual los oocitos de vertebrados detienen su avance a travs de la meiosis y esperan la fertilizacin (fig. 14-41). Slo si el huevo no fertilizado entra en contacto con un espermatozoide ser estimulado para concluir la segunda divisin meitica. La

10 pm

FIGURA 14-41. Huevo no fertilizado de un anfibio detenido en metafase II. Igual que en otros vertebrados, la meiosis prosigue despus de la segunda metafase meitica donde espera por la fertilizacin antes de concluir la meiosis. a) Vista lateral mostrando los cromosomas del huso meitico. b) Vista polar de la misma etapa mostrando la distribucin de los cromosomas alrededor de la periferia de la clula. (Segn David L Gara, Develop. Biol. 351:523, 1992.)

CAPITULO 14 Reproduccin celular

611

LA PERSPECTIVA HUMANA
No disyuncin meitica y sus consecuencias
La meiosis es un proceso complicado, y en el ser humano al parecer los errores durante la misma son sorprendentemente comunes. Cromosomas homlogos a veces no se separan durante la meiosis I, o cromtides hermanas a veces no se separan durante la meiosis II. Cuando ocurre cualquiera de estas dos situaciones se forman gametos que contienen un nmero anormal de cromosomas, sea un cromosoma extra o un cromosoma menos (fg. PH 14-1). Si algunos de estos gametos se fusionan con un gameto normal y forma un cigoto con un nmero anormal de cromosomas, sobrevienen consecuencias graves. En la mayor parte de los casos, el cigoto da lugar al desarrollo de un embrin anormal que muere en alguna etapa entre la concepcin y el nacimiento. Sin embargo, en unos pocos casos, el cigoto se desarrolla y da lugar a un lactante cuyas clulas poseen un nmero anormal de cromosomas, estado que se conoce como aneuploidia. El efecto de la aneuploidia depende de que el cromosoma o los cromosomas estn afectados. En el ser humano, el nmero normal de cromosomas es de 46, o sea, 22 pares de autosomas y un par de cromosomas sexuales. Un cromosoma extra (que produce un nmero total de 47 cromosomas) genera un estado que se conoce como trisoma (fig. PH 14-2). Una persona cuyas clulas contienen un cromosoma 21 extra, por ejemplo, padecen trisoma 21. La prdida de un cromosoma (que produce un total de 45 cromosomas) genera una monosoma. Iniciaremos considerando los efectos del nmero anormal de autosomas. La ausencia de un cromosoma autosmico, cualquiera que sea el cromosoma afectado, invariablemente es mortal en alguna etapa durante el desarrollo embrionario o fetal. Por consiguiente, un cigoto que contenga una monosoma autosmica no dar lugar a un feto a trmino. Aunque no sera de esperar que poseer un cromosoma extra genere una enfermedad que ponga en riesgo la vida, el hecho es que las trisomas no se desempean mucho mejor que los cigotos monosmicos. De los 22 autosomas diferentes de la dotacin completa de cromosomas humanos, slo las personas con trisoma 21 pueden sobrevivir ms all de las primeras pocas semanas o meses de vida. La mayor parte de las otras trisomas posibles son mortales durante el desarrollo, en tanto que las trisomas para los cromosomas 13 y 18 con frecuencia permiten la vida, pero muestran anomalas tan graves que pronto causan la muerte despus del nacimiento. Se estima que casi 25% de los fetos de abortos espontneos son portadores de una trisoma cromosmica. Se piensa que muchos ms cigotos portadores de una cifra anormal de cromosomas producen embriones que mueren en etapa temprana del desarrollo antes de diagnosticar el embarazo. Por ejemplo, por cada cigoto trismico formado durante la fertilizacin, al parecer hay un nmero igual de cigotos mono-

Primera divisin meitica No disyuncin

4 \l
Segunda divisin meitica Norma! Normal Normal No disyuncin

Gameto con Gametos que cromosoma han perdido un extra cromosoma

Gametos normales

'Gametos Gametos con erocon un mosoma cromosoma extra menos

FIGURA PH 14- L. No disyuncin meitica. Ocurre cuando los cromosomas no se separan entre s durante la meiosis. Si la falta de separacin ocurre durante la primera divisin meitica, llamada no disyuncin primaria, todas las clulas haploides tendrn un nmero anormal de cromosomas. Si la no disyuncin ocurre durante la segunda divisin meitica, llamada no disyuncin secundaria, slo dos de las cuatro clulas haploides sern afectadas.

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CAPITULO 14 Reproduccin celular

Sndrome de Down

XX
7

1 0

11

12

13
U K

U
14
V V

15

KK
16 17 18

XX
19

XX
20

*IUE 21

22

n
X

FIGURA PH 14-2. Cariotipo de una persona con sndrome de Down. El cariotipo muestra un cromosoma 21 extra (trisoma 21).

smicos mucho menos afortunados. Los resultados de un estudio sugieren que hasta 33% de las mujeres embara-

zadas abortan espontneamente en una etapa donde todava el embarazo no es reconocible. Si estas cifras son correctas, y nadie argumenta que no lo sea, entonces la no disyuncin meitica en el ser humano ocurre a una tasa notablemente elevada. Aunque el cromosoma 21 es el ms pequeo de los cromosomas humanos, contiene casi 1 500 genes, la presencia de una copia extra de este material gentico tiene consecuencias graves que provocan un trastorno llamado sndrome de Down. Las personas con sndrome de Down muestran dao mental, alteracin de algunas caractersticas del cuerpo, problemas circulatorios frecuentes, mayor susceptibilidad a enfermedades infecciosas, riesgo mucho mayor de desarrollar leucemia y el inicio de la enfermedad Alzheimer en edad temprana. Se cree que todos estos problemas mdicos son resultado de la actividad anormal de genes localizados en el cromosoma 21. La presencia de un nmero anormal de cromosomas sexuales es mucho menos nociva para el desarrollo humano. Un cigoto con un solo cromosoma X y sin segundo cromosoma sexual (denominado XO) da lugar a una mujer con sndrome de Turner, con detencin del desarrollo genital en eta-

pa juvenil, los ovarios no se desarrollan y la estructura del cuerpo es ligeramente anormal. Puesto que un cromosoma Y determina sexo masculino, las personas que posean un cromosoma Y cuando menos se desarrollan con el sexo masculino. Un individuo del sexo masculino con un cromosoma X extra (XXY) desarrolla el sndrome de Klinefelter, que se caracteriza por retraso mental, genitales poco desarrollados, y la presencia de caractersticas fsicas femeninas (como glndulas mamarias grandes). Alternativamente, un cigoto con un Y extra (XYY) da lugar al desarrollo de un individuo de sexo masculino de apariencia normal, excepto que tal vez sea de talla ms elevada que el promedio. Hay gran controversia respecto de la idea de que los hombres XYY tienden a mostrar conducta ms agresiva, antisocial en comparacin con los hombres XY. Pero esta correlacin nunca se ha comprobado objetivamente. La probabilidad de tener un hijo con sndrome de Down se eleva de manera espectacular con la edad de la madre: de 0.05% para madres de 19 aos de edad hasta casi 3% para mujeres mayores de 45 aos. Casi todos los estudios concuerdan en que no se observa una relacin parecida entre la

anafase II se inicia con el desdoblamiento sincronizado de los enlaces que contienen unidas a las cromtides hermanas, lo que permite que se desplacen hacia polos opuestos de la clula. La meiosis II termina con la telofase II en la cual los cromosomas una vez ms quedan encerrados por una envoltura nuclear. Los productos de la meiosis son clulas haploides, tanto en el contenido del DNA nuclear como en el nmero de cromosomas. Recoinbinacin gentica durante la meiosis Adems de reducir el nmero de cromosomas, un requisito para la reproduccin sexual, la meiosis desempea un papel importante al incrementar la variabilidad gentica de una generacin a la siguiente dentro de una poblacin de organismos. La permutacin independiente permite entremezclar los cromosomas paternos y maternos durante la formacin de los gametos, y la recombinacin gentica tambin permite lo mismo a los alelos maternos y paternos de un cromosoma determinado (fig. 14-34). Sin la recombina-

cin gentica, los alelos presentes a lo largo de un cromosoma particular permaneceran atados generacin tras generacin. La mezcla de alelos maternos y paternos dentro de cromosomas homlogos por medio de la meiosis genera organismos con nuevos fenotipos y genotipos sobre los cuales puede actuar la seleccin natural. En la figura 10-6 se ilustra un ejemplo de recombinacin entre alelos sobre uno de los cromosomas de la mosca de la fruta. En el captulo 10 tambin se hizo notar que la frecuencia de recombinacin entre dos alelos sobre un cromosoma es proporcional a la distancia entre ellos, caracterstica que permiti a los genetistas mapear las posiciones relativas de genes a lo largo del cromosoma en organismos que van desde bacterias hasta seres humanos. Los primeros conocimientos en el proceso de recombinacin se obtuvieron gracias a los genetistas clsicos durante el primer decenio de este siglo. En la primera descripcin, efectuada por T.H. Morgan y otros, la tensin generada por la torsin de los cromosomas alrededor de s mismos durante la profase meitica provoc la fractura de los mismos, de modo que pedazos de cromtides pudieran intercam-

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edad del padre y la probabilidad de engendrar un hijo con trisoma 21. Las estimaciones ms recientes, segn comparaciones de secuencias de DNA entre descendientes y progenitores, indican que casi 95% de las trisomas para cromosoma 21 se pueden seguir hasta falta de disyuncin ocurrida en la madre. Hay varias posibles razones para que una madre de edad avanzada tenga mayor probabilidad de dar a luz un nio con sndrome de Down. Los fetos con anomalas cromosmicas de ordinario se pierden por aborto espontneo. Es posible que las mujeres de mayor edad presenten menor probabilidad de abortar un feto con trisoma 21, en comparacin con mujeres ms jvenes. Esta posibilidad se contradice por el estudio de fetos abortados procedentes de madres de diferentes edades, que sugiere que las mujeres ms jvenes tienen la misma probabilidad de gestar un feto con trisoma 21 a trmino que una mujer de edad ms avanzada. Otra posibilidad es que las mujeres de mayor edad practiquen el coito con menor frecuencia que las mujeres ms jvenes y, por lo tanto, en promedio, sus vulos probablemente permanezcan en el oviducto durante periodos ms prolongados luego de la ovulacin

antes de ser fertilizados. Las pruebas no apoyan ninguna de estas posibilidades. Ms bien, sugieren que la explicacin ms directa es la correcta: las mujeres de mayor edad son ms susceptibles a la no disyuncin meitica en comparacin con mujeres ms jvenes. La mayora de los genetistas creen que el mayor riesgo es resultado principalmente del envejecimiento de la clula germinal, puesto que permanece por periodos ms prolongados en el ovario. En este captulo se mencion que todos los oocitos del ovario humano entran en meiosis casi al momento de nacer. Los vulos fertilizados posteriormente durante la vida reproductiva de la mujer han estado suspendidos en la profase I durante varios decenios. Para entender por qu un retraso en la conclusin de la oognesis debe incrementar la probabilidad de no disyuncin, es necesario saber ms acerca de la etapa de la meiosis que al parecer est afectada. Ya antes se hizo notar que una cifra anormal de cromosomas puede ser resultado de la no disyuncin en cualquiera de las dos divisiones meiticas (fig. PH14-1). Aunque estos diferentes acontecimientos de no disyuncin producen el mismo efecto en nmero de cromosomas en el cigoto, se pueden

distinguir mediante anlisis gentico, puesto que la no disyuncin primaria transmite dos cromosomas homlogos al cigoto, en tanto que la no disyuncin secundaria transmite dos cromtides hermanas (con mayor probabilidad de ser alteradas por entrecruzamiento) al cigoto. Los estudios indican que la mayor parte de los errores ocurren durante la meiosis I. Por ejemplo, en un estudio de 433 casos de trisoma 21 provocados por no disyuncin materna, 373 fueron resultado de errores ocurridos durante la meiosis I y 60 resultado de errores durante la meiosis II. Por qu la meiosis I es ms susceptible a no disyuncin que la meiosis II? En un estudio con mapeo gentico de trisoma para el cromosoma 21 se observ que los cromosomas heredados de la madre muestran mucha menor probabilidad de sufrir recombinacin gentica. En la pgina 609 se hizo notar que los quiasmas, o indicadores visuales de recombinacin gentica, desempean un papel importante para mantener junta a la tetrada. Se deduce que la menor posibilidad de recombinacin gentica, que conduce a reduccin de la probabilidad de la formacin de quiasmas, provocara mayor riesgo de no disyuncin en la meiosis I.

biarse entre cromosomas homlogos. En este concepto, se piensa que el entrecruzamiento implica un verdadero rompimiento y reunin fsica del material cromosmico. La demostracin de que la recombinacin ocurre por rompimiento y reunin en eucariotes se confirm por primera vez mediante autorradiografa utilizando cromosomas meicos del saltamontes marcados con timidina radiactiva. En estos experimentos, las clulas germinales se expusieron al precursor de DNA radiactivo durante la fase S de la divisin mittica previa, de modo que para el momento que se alcanz la primera profase meitica slo una cromtide de cada cromosoma estara marcada. A continuacin se tomaron autorradio grafas despus de que ocurri el entrecruzamiento, y se observ que ciertas cromtides contienen granos plateados que slo cubren parcialmente su longitud (fig. 14-42). Esto indica que ocurri intercambio fsico entre cromtides marcadas y no marcadas. Ms an, los segmentos marcados y no marcados de una cromtide mostraron un patrn recproco al de otra cromtide de la misma tetrada. Cuando se propuso por primera vez el concepto de rompimiento y reunin se asumi que cada cromosoma

homlogo se separa por completo transversalmente en dos pedazos, y un pedazo de un cromosoma se intercambia con el correspondiente pedazo de su homlogo. Sin embargo, luego que se comprob que los cromosomas meiticos contienen numerosas fibras de DNA situadas lado a lado, fue evidente que el rompimiento de una cromtide entera compactada afectara a cientos de genes que no sera posible volver a unir con sus contrapartes de otro cromosoma. Los estudios de recombinacin gentica entre diferentes genomas virales o bacterianos enfocaron su atencin a las molculas simples de DNA y a los mecanismos que podan romperlas y recombinarlas. Como se analiza a continuacin, la recombinacin implica el rompimiento fsico de las molculas de DNA y la fusin de los extremos separados de un DNA dplex con los otros extremos separados del dplex del cromosoma homlogo. La recombinacin es un proceso de notable precisin que ocurre entre sitios correspondientes entre molcul as de DNA homologas sin adicin o prdida de un solo par de bases. La precisin de la recombinacin est garantizada por la participacin de enzimas de reparacin de DNA capaces de llenar las brechas que se

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CAPITULO 14 Reproduccin celular

FIGURA 14-42. Demostracin experimental de rompimiento y reunin de cromosomas durante el entrecruzamiento. Autorradiografa de un par de cromtides hermanas aisladas de los testculos de un saltamontes en metafase II utilizando colquicina para detener los acontecimientos en esa etapa. La clula a partir de la cual se prepar este cromosoma haba incorporado 3H-timina un ciclo antes de la interfase premeitica, de modo que en ausencia de entrecruzamiento, una cromtide de cada cromosoma duplicado deba estar completamente marcada y una sin marca. Puesto que las cromtides contienen segmentos marcados y no marcados, indica que ocurre intercambio de material cromosmico entre las cromtides en la profase I precedente. La flecha indica la posicin de los centrmeros terminales que localizan dnde se juntan las dos cromtides hermanas. (Segn ]. Herbert Taylor, J. Cell Biol. 25:63, 2965; con permiso de Rockefeer Universiy Press.)

forman durante el proceso de intercambio. Se conoce relativamente poco acerca del mecanismo especfico empleado durante la recombinacin gentica en clulas eucariotas, pero estudios sobre genomas virales y fagos proporcionan bases para visualizar un escenario factible. En el modelo ms sencillo, los dos DNA dplex que estn a punto de recombinarse se alinean uno a continuacin del otro como resultado de algn tipo de bsqueda de homologa, durante la cual las molculas de DNA homologas se reconocen entre s en preparacin para la recombinacin (fg. 14-43, paso 1). Una vez alineadas, se producen roturas en sitios correspondientes de cada cadena del dplex (fg. 14-43, paso 2). Las cadenas rotas se separan a continuacin de su respectiva pareja complementaria y cada una deja su propio dplex e invade a la otra molcula de DNA, enlazndose al hidrgeno de la cadena complementaria en el dplex vecino (fig. 14-43, pasos 3 y 4). En E. coli, este proceso durante el cual una sola cadena puede invadir un dplex homlogo y desplazar la cadena correspondiente dentro del dplex, es catalizada por una protena multifuncional denominada protema recA. Como resulta-

do de este intercambio recproco de cadenas de DNA, los dos dplex se unen entre s para formar una estructura interconectada denominada estructura Holliday, por el nombre del investigador que la propuso, segn se muestra en la figura 14-43, paso 5. Este tipo de intermediario no necesariamente es una estructura esttica, puesto que el punto de unin debe tener capacidad para desplazarse en una direccin u otra (suceso conocido como migracin de rama] mediante la rotura de los puentes de hidrgeno que sostienen a los pares originales de cadenas y que reconstituyen a los enlaces de hidrgeno entre las cadenas de los dplex recin unidos (fig. 14-43, paso 6). Se cree que con el desplazamiento del punto de entrecruzamiento por medio de la migracin en rama tambin se requiere la ayuda de enzimas de recombinacin de DNA. Mediante el examen con microscopio electrnico de molculas de DNA aisladas de clulas bacterianas sorprendidas en el acto de recombinacin se han obtenido pruebas directas de la existencia de un intermediario para recombinacin del tipo mostrado en la figura 14-43, paso 6. La figura 14-44 muestra dos genomas del bacterifago 1 unidos de tal manera que una cadena de cada dplex se contina con la cadena del otro dplex. Este par de molculas de DNA tiene el tipo de conexin por entrecruzamiento pronosticada por el modelo de Holliday, como se puede observar cuando el intermediario mostrado en la figura ,14-43, pasos 5 al 7, se gira segn se muestra en la figura 14-43, paso 8, de modo que adopta una configuracin (fig. 14-43, paso 9) en la cual se observan cuatro segmentos de doble hlice que surge de un anillo de conexin al DNA de cadena simple, Este mismo tipo de intermediario de recombinacin se puede obtener in vitro si se mezclan molculas de DNA en presencia de extractos de clulas bacterianas. Como se analiza a continuacin, el extracto bacteriano contiene protenas capaces de catalizar las reacciones apropiadas de rompimiento y reunin mediante las cuales las molculas de DNA separadas se"pueden unir a enlaces covalentes. Se presume que en clulas eucariotas hay protenas similares. El intermediario de recombinacin mostrado en la figura 14-43, paso 9, se forma por el rompimiento de dos cadenas simples y la fusin subsecuente de ambas entre s. Para reconstituir un par de dplex de DNA discreto, debe ocurrir otra vuelta de rompimiento y fusin de DNA. En la figura 14-43 se muestran dos vas alternas de rompimiento y fusin. En un caso (fig. 14-43, paso 10, izquierda), las mismas cadenas previamente desdobladas se rompen una vez ms, lo que produce dos dplex que slo contienen tramos cortos intercambiados genticamente (fig. 14-43, paso 12, izquierda). En contraste, si las cadenas no se han separado previamente y en esta segunda etapa de la recombinacin se forman muescas sobre las mismas (fig. 14-43, paso 10, derecha), entonces el dplex de una molcula de DNA se une al dplex de la molcula homologa generando una fusin de los cromosomas materno y paterno (fig. 14-43, paso 12, derecha), o sea, un entrecruzamiento. Este ltimo tipo de suceso se descubre en estudios para conocer la frecuencia de recombinacin entre alelos maternos y paternos (pg. 393). La secuencia de eventos mostrados en la figura 14-43 se inicia por el rompimiento que ocurre sobre una sola ca-

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FIGURA 14-43. Mecanismo propuesto para la recombinacin gentica iniciada por el rompimiento de cadenas simples. Los pasos se describen en el texto. (Segn H. Poder y D. Dresser, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 73:3003, 1976.)

zx

xz

ifi

FIGURA 14-44. Visualizacin del intercambio de cadenas de DNA. Micrografa electrnica de dos molculas del fago 1 unidas a un sitio de entrecruzamiento (flecha). Se cree que esta imagen corresponde al diagrama de la figura 14-43, paso 9. (Segn Manuel Valenzuela y Ross B. tornan, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 72:3024, 1975.)

dena de cada dplex. Habiendo revisado los pasos implicados en este proceso, que se cree ocurre extensamente durante la recombinacin de clulas bacterianas, estamos en mejor situacin para considerar un modelo alternativo de secombinacin (fig. 14-45), que implica una serie ms complicada de acontecimientos, pero que tiene mayor probabilidad de ser la causante del entrecruzamiento durante la meiosis en clulas eucariotas. La diferencia primaria entre el proceso ilustrado en la figura 14-43 y el que se muestra en la figura 14-45 es que este ltimo se inicia por rompimiento de la doble cadena ms bien que por rompimiento en cadenas simples, y el proceso mostrado en la figura 14-45 implica la actividad de nucleasas y polimerasas para llenar las brechas en las diferentes cadenas, similar a lo que ocurre durante la reparacin del DNA (pg. 568). Los pasos en el mecanismo propuesto se describen en el pie de la figura acompaante. Prcticamente nada se conoce acerca de genes especficos y sus productos capaces de dirigir las complejas actividades de la recombinacin del DNA que ocurren durante la meiosis en clulas eucariotas.

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CAPITULO 14 Reproduccin celular Rompimiento de la doble cadena receptora

El rompimiento se ampla hasta formar una abertura con los extremos 3'

El extremo 3' emigra al otro dplex

La sntesis del extremo 3' desplaza una cadena con una regin de la abertura La cadena desplazada emigra al dplex receptor

\L

La sntesis de DNA ocurre en el otro extremo 3' La emigracin recproca genera un doble entrecruzamiento

FIGURA 14-45. Mecanismo propuesto para la recombinacin gentica iniciada con rompimiento de la doble cadena. En este modelo, la recombinacin se inicia con el rompimiento de la doble cadena en uno de los dplex (llamado dplex receptor) provocado por hidrlisis de los enlaces fosfodister en ambas cadenas mediante la accin de una endonucleasa (paso 1). Una vez cortada la cadena, la abertura se ampla por accin de otra nucleasa para producir extremos escalonados en los cuales la cadena superpuesta contiene un extremo 31 libre (paso 2). Uno de ios extremos 3' libres del dplex receptor invade a continuacin al dplex homlogo intacto (donador), desplazando la cadena correspondiente del dplex donador hacia la regin de la abertura (paso 3). Puesto que la cadena desplazada sobresale del dplex donador, la estructura se conoce como asa D, debido a que recuerda a la letra D. En el siguiente paso, una DNA polmerasa aade nucletidos al extremo 3' de la cadena invasora, desplazando ms nucletidos del dplex donador, alargando as el asa D (paso 4). Cuando la hendidura en el dplex donador se llena por sntesis de DNA, la cadena desplazada del dplex donador emigra hacia la hendidura en el dplex receptor (paso 5}, y la cadena complementaria del dplex receptor se llena en una segunda vueita de sntesis de DNA (paso 6). La estructura mostrada en el paso 7 generada por la secuencia de acontecimientos ya descritos contiene dos sitios donde os dplex permanecen desconectados; ambos sitios deben ser llenados por un proceso de tipo rompimiento y fusin indicado en la figura 14-43, pasos 10 a 12. Si las mismas cadenas se rompen y funden en ambos sitios de interconexin, entonces slo una corta regin de las molculas de DNA ser afectada. Por lo contrario, si se rompen y funden diferentes cadenas en los dos sitios, entonces los cromosomas materno y paterno se habrn fusionado y ocurre entrecruzamiento gentico. (Segn B. Lewin, Genes V, p. 974, Oxford University Press, 1994.)

LA VIA

EXPERIMENTAL

Descubrimiento y caracterizacin det factor promotor de maduracin (FPM)

Es frecuente imaginar el ncleo como centro de control de la clula, pero las actividades del ncleo estn firmemente controladas por agentes reguladores que se mueven dentro del nucleoplasma del citoplasma. Durante el decenio de 1960, se disearon varios sistemas experimentales que permitieron a los bilogos celulares iniciar el estudio de factores citoplsmicos capaces de desempear un papel en el gobierno de las actividades nucleares, incluyendo transcripcin, duplicacin y preparacin para la mitosis. Ya hemos analizado el empleo de la fusin de clulas en estos primeros estudios (pg. 583). En otro mtodo, se eliminaron ncleos de un tipo de clula y se inyectaron a clulas de diferente tipo para determinar los efectos que el nuevo ambiente citoplsmico poda tener sobre las actividades de ncleos recin trasplantados. Debido a su gran tamao, actividades sintticas definidas y vigorosa constitucin, los oocitos y vulos de anfibios se han empleado desde hacerfnucho como sistema de prueba para recibir materiales inyectados. En la mayor parte de estos estudios se emplea la rana leopardo Rana pipiens o el sapo con garras Xenopus laevis; ambos se pueden criar fcilmente en cautiverio y mediante inyeccin de hormonas producen un gran nmero de huevos. A finales del decenio de 1960, John Gurdon y sus colegas, de la Universidad de Oxford, efectuaron experimentos con Xenopus en los cuales inyectaron ncleos aislados de diferentes orgenes al citoplasma de oocitos o huevos fertilizados. Aunque el oocito y el huevo de un anfibio son rnuy similares (el ltimo se deriva del primero), sus actividades de sntesis son muy diferentes. Los oocitos empleados en estos experimentos sintetizan grandes cantidades de RNTA ribosmico y mensajero, pero no sintetizan DNA puesto que su duplicacin ocurre en una etapa anterior de la oognesis. Por lo contrario, un huevo recin fertilizado es un sintetizador activo de DNA,

CAPITULO 14 Reproduccin celular

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(b) FIGURA VE 14-1. a) Ncleos de tamao normal aislados de clulas de un embrin de Xenopus en etapa de blstula, b) El mismo tipo de ncleos mostrados en a luego de trasplantarlos al citoplasma de un oocito. Los ncleos estn amplificados casi 200 veces. (Cortesa de John B. Gurdon.)

(b)
FIGURA VE 14-2. Determinacin por medio de autorradiografa de incorporacin al DNA de timidina marcada luego de la inyeccin de ncleos de cerebro de rana en un oocito (a) y un vulo fertilizado (b). Los ncleos de cerebro normalmente sintetizan RNA pero no DNA. Cuando estos ncleos se trasplantan al interior del oocito (a), no se encuentran datos de sntesis de DNA. En contraste, cuando los ncleos se inyectan en el vulo activado (b), los ncleos cerebrales desencadenan la sntesis de DNA en respuesta a las condiciones del citoplasma en la clula husped. (Cortesa de John B. Gurdon.)

pero prcticamente no sintetiza RNA. Las protenas sintetizadas durante las primeras etapas del desarrollo de los anfibios se traducen a partir del RNAm sintetizado antes de la fertilizacin y almacenado en forma inactiva en el citoplasma del huevo (seccin 12-3). Gurdon observ que los ncleos trasplantados en una u otra de estas dos clulas adoptaron las caractersticas de sntesis conforme a su nuevo ambiente, cualquiera que sea su actividad en el momento del trasplante.1'2 Por ejemplo, si el ncleo de un embrin en etapa de blstula, caracterizado por su baja.tasa de sntesis de RNA y elevada tasa de sntesis de DNA, se trasplanta al interior de un oocito, el ncleo detiene la sntesis de DNA e incrementa notablemente la sntesis de RNA.

El ncleo responde as al estado de citoplasma en el cual se encuentra y sufre reprogramacin. No slo se modifica la actividad de sntesis del ncleo, sino tambin su aspecto morfolgico. El ncleo normal de! oocito, llamado vescula germinal, es enorme en comparacin con el ncleo de una blstula de tama-

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CAPITULO 14 Reproduccin celular

o normal. El trasplante del ncleo de la blstula al interior del oocito provoca hinchazn rpida del trasplante (fig. VE 14-1), que imita la morfologa de la propia vescula germinal del oocito. En un experimento de tipo inverso, se tomaron ncleos de un homogenado de tejido cerebral y se inyectaron a un huevo fertilizado y pronto participaron en la sntesis de DNA (fig. VE 14-2). Puesto que las clulas nerviosas son incapaces de efectuar divisin celular, la sntesis de DNA en estos ncleos trasplantados representa la activacin de una funcin inactivada aos atrs. Conforme un oocito de anfibio se aproxima a la final de la oognesis, la gran vescula germinal se desplaza a la periferia de la clula, la envoltura nuclear se desensambla, los cromosomas compactados se alinean en una placa metafsica cerca de un extremo (polo animal) del oocito, y fas clulas sufren la primera divisin meitica produciendo un gran oocito secundario y un pequeo corpsculo polar. Este proceso de desdoblamiento de la vescula germinal y primera divisin meitica se conoce como maduracin y se puede inducir en oocitos aislados totalmente desarrollados (o sea, oocitos eliminados del folculo ovrico) mediante tratamiento con la hormona esteroide progesterona. El primer signo de maduracin en el oocito tratado con la hormona se observa aproximadamente 13 a 18 horas despus conforme la vescula germinal se desplaza hacia la superficie del oocito. Pronto se desdobla la vescula germinal y el oocito alcanza la metafase de la segunda divisin meitica, ms o menos a las 36 horas despus del tratamiento con la hormona. Se observ que la progesterona es eficaz para inducir la maduracin slo si se aplica al oocito en el medio externo; si la hormona se inyecta dentro del oocito, ste no muestra respuesta.3 Al parecer, la hormona acta sobre la superficie celular para desencadenar cambios secundarios en el citoplasma del oocito que conducen a la rotura de la vescula germinal y a los otros cambios relacionados con la maduracin. Para conocer ms acerca de la naturaleza de los cambios citoplsmicos que desencadenan la maduracin, Yoshio Masui, de la Universidad de Toronto, y Clement Markert, de la Uni-

versidad Yale, iniciaron una serie de experimentos en los cuales retiraron citoplasma de oocitos aislados en diferentes etapas luego del tratamiento con progesterona, e inyectaron 40 a 60 nanolitros (ni) del citoplasma donador en oocitos inmaduros totalmente desarrollados que no fueron tratados con la hormona.4 Estos investigadores observaron que el citoplasma tomado de oocitos durante las primeras 12 horas despus del tratamiento con progesterona tenan poco o ningn efecto sobre los oocitos receptores. Sin embargo, luego de este periodo, el citoplasma adquiri la capacidad de inducir maduracin en el oocito receptor. Masui y Markert observaron que el citoplasma procedente del oocito donador mostraba mxima eficacia casi 20 horas despus del tratamiento con progesterona, y que esta eficacia disminua a las 40 horas, aproximadamente (fig. VE 14-3). Pero el citoplasma tomado de embriones tempranos todava mostraba cierta capacidad para inducir la maduracin del oocito, Masui y Markert denominaron a la sustancia con efecto sobre los oocitos receptores como factor promotor de maduracin, despus conocido como FPM. Desde entonces se asumi que FPM participa de manera especfica para desencadenar la maduracin del oocito, y se prest relativamente poco inters a la sustancia o a su posible mecanismo de accin. En 1978, Wifliam Wasserman y Dermis Smith, de la Universidad Purdue, publicaron un trabajo acerca de la conducta del FPM durante las primeras etapas del desarrollo.5 Se asuma que la actividad del FPM presente en el embrin temprano simplemente era un residuo de la actividad presente en el oocito. Pero Wasserman y Smith descubrieron que la presencia de actividad FPM en el embrin en desarrollo mostraba oscilaciones espectaculares correlacionadas con cambios en el ciclo celular. En una serie de experimentos sobre huevos en desarrollo de Rana {fig. VE 14-4), se encontr que el citoplasma tomado de estos huevos antes de 30 a 60 minutos despus de la fertilizacin mostraban actividad FPM escasa o no detectable en el ensaye por inyeccin a oocitos inmaduros. Sin embargo, empleando el mismo volumen de citoplasma inyectado se descubri actividad una vez ms en los huevos donadores 90 minutos despus de la fertilizacin, la cual al-

tnievo no fertilizado

Clula 4-128 Clula 2

FIGURA VE 14-3. Cambio de actividad del factor promotor de la maduracin en el citoplasma del oocito durante el curso de la maduracin y e! desarrollo temprano. Abscisa: Edad de los donadores {horas despus de la administracin de progesterona). Ordenada: Proporcin entre frecuencia de maduracin inducida y volumen de citoplasma inyectado. Cuanto mayor sea la proporcin, ms eficaz el citoplasma. Se observ que el citoplasma del oocito presenta una eficacia mxima entre 20 y 40 horas despus del tratamiento con progesterona. ni, Nanolitros de citoplasma inyectado. (Segn Y. Masut y C.L. Markert, J. Exp. Zoo!. 177:142, 1971.)

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619

10Q

Primero

Segundo

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120

180

240

3OO

TIEMPO DESPUS DE LA FERTILIZACIN (min) FIGURA VE 14-4. Actividad cclica de FPM en vulos fertilizados de R. pipiens. Ordenada: Porcentaje de oocitos receptores que sufren desdoblamiento de la vescula germinal en respuesta a 80 nanolitros de citoplasma procedente de vulos fertilizados. Abscisa: Tiempo despus de la fertilizacin cuando se prob la actividad del FPM en el citoplasma del huevo de rana. Las flechas indican el momento de las divisiones. (Segn W.J. Wasserman y L.D. Smith, J. Cell Biol. 78:R17, 1978; con permiso de Rockefeller University Press.)

mos, y que adems la naturaleza de la sustancia es altamente conservada. Por ejemplo, se observ que las clulas de mamferos que crecen en cultivo tambin poseen actividad FPM demostrable por la capacidad de sus extractos para inducir el rompimiento de vesculas germinales luego de inyectarlos en oocitos de anfibios.6 La actividad FPM de estas clulas vara con el ciclo celular, como ocurre en huevos de anfibio. Los extractos de clulas cultivadas HeLa preparados a partir de clulas en fase Gj inicial, GI tarda o S carecen de actividad FPM (fig. VE 14-5). El FPM apareci en el G2 temprano, se elev espectacularmente en el G2 tardo, y alcanz un mximo durante la mitosis. Otro elemento del mecanismo que regula el ciclo celular se descubri en estudios sobre embriones del erizo de mar. Los huevos del erizo de mar son materia favorita para estudios de divisin celular porque las divisiones mitticas que siguen a la fertilizacin ocurren con rapidez y estn separadas por intervalos muy predecibles. Si los huevos de erizo de mar se fertilizan en agua de mar que contenga un inhibidor de la sntesis de protenas, los huevos no sufren la primera divisin mittica, se detienen en etapa previa a la condensacin de cromosomas y del rompimiento de la envoltura nuclear. De manera similar se pueden bloquear las subsecuentes divisiones mitticas si se aade un inhibidor de la sntesis de protenas al medio mucho antes que ocurra la divisin normal. Este dato su-

100 -

canz un mximo a los 120 minutos y comenz a declinar una vez ms a los 150 minutos. Cuando los huevos sufrieron su primera citocinesis a los 180 minutos, no se pudo determinar actividad alguna en los huevos. A continuacin, conforme ocurri el segundo ciclo de desdoblamiento una vez ms reapareci la FPM alcanzando un mximo a los 225 minutos despus de fa fertilizacin y luego declin una vez ms a niveles sumamente bajos. Se observaron resultados similares utilizando huevos Xenopus, excepto que las oscilaciones de la actividad FPM ocurrieron con mayor rapidez que en Rana, lo que se correlaciona con la tasa ms rpida de divisiones en el embrin temprano Xenopus. Por lo tanto, la actividad FPM desaparece y reaparece en ambas especies de anfibios en una escala de tiempo que se correlaciona con la duracin del ciclo celular. En ambas especies, la actividad FPM mxima se correlaciona con el momento de rotura de ia membrana nuclear y la entrada de las clulas en mitosis. Estos datos sugieren que FPM tiene un papel mucho ms amplio que simplemente controlar el momento de la maduracin del oocito y, en realidad, puede desempear un papel clave en la regulacin del ciclo celular de clulas en divisin. 'En esa misma poca se puso de manifiesto que el FPM posee una actividad que no es peculiar a huevos y oocitos de anfibios, pero que aparece en una gran variedad de organis-

S -H-G2 "| Mtosis[G1| Fase del ciclo celular

FIGURA VE 14-5. Actividad promotora de la maduracin de extracto de clulas HeLa durante diferentes etapas del ciclo celular. Puesto que 228 ng de protena mittica inducen el desdoblamiento de la vescula germinal en 100% de los casos, se normaliz el porcentaje de actividad de otras fases del ciclo celular contra esta cantidad de protena. (Segn P.S. Sunkara, D.N. Wright y P.N. Rao, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 76:2501, 1979.)

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CAPITULO 14 Reproduccin celular

giere que se deben sintetizar una o ms protenas durante cada uno de los primeros ciclos celulares para que ocurra la inminente divisin mittica. Pero los primeros estudios acerca de la divisin de los huevos de erizo de mar no revelaron la aparicin de nuevas protenas durante ese periodo. En 1983, un estudio efectuado por Tim Hunt y sus colegas, en el Marine Biological Laboratory at Woods Hole, demostraron que se sintetizan varias protenas en el huevo de erizo de mar fertilizado que no se producen antes de la fertilizacin. Ms an, cuando menos una de las protenas cuya sntesis se activa despus de la fertilizacin al parecer se destruye cada vez que el embrin se divide y luego se resintetiza antes de la siguiente divisin.7 Estos datos fueron obtenidos fertilizando huevos en agua de mar que contena 35S-metionina y quitando las muestras a intervalos de 10 minutos, empezando 16 minutos despus de la fertilizacin. Se prepararon extractos crudos de protena a partir de las muestras y se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida, y se determin la localizacin de las protenas marcadas en el gel mediante autorradiografa. Se observaron varias bandas prominentes en geles de extractos de huevos fertilizados que no eran evidentes en extractos comparables elaborados a partir de huevos no fertilizados. Una de las bandas (correspondiente a un polipptido de 56 kD) que mostr mucha radiactividad en los primeros momentos despus de la fertilizacin prcticamente desapareci del gel de 85 minutos despus de la fertilizacin, lo que sugiere que la protena fue descompuesta selectivamente. Esta misma banda reapareci despus en geles de huevos fertilizados muestreados en momentos tardos y luego desapareci una vez ms en una muestra tomada a los 120 minutos despus de la fertilizacin. La variacin en la cantidad de esta protena se grfica en la figura VE 14-6 (protena banda A) junto con el ndice de desdoblamiento, que indica el curso temporal de las primeras dos divisiones celulares. La descomposicin de la protena ocurre casi al mismo tiempo que la clula sufre la primera y segunda divisin. Se observ una protena similar en los huevos de la almeja marina, otro invertebrado cuyos huevos se usan ampliamente para estudio. Estos investigadores denominaron "cicina" a la protena y observaron el notable paralelo en la conducta entre las variaciones de concentracin de la ciclina determinada por electroforesis en gel y la actividad FPM determinada en los ensayos de desdoblamiento de la vescula germinal en anfibios. Estudios subsecuentes demostraron que existen dos ciclinas distintas, A y B, las cuales son descompuestas en momentos diferentes durante el ciclo celular. La ciclina A se descompone durante un periodo de cinco a seis minutos, que se inicia justo antes de la transicin de la metafase a la anafase, y la ciclina B se descompone pocos minutos despus de esta transicin. El primer vnculo claro entre ciclina y FPM fue demostrado por Joan Ruderman y sus colegas, del Woods Hole Laboratory.8 En esos estudios se transcribi in vitro un RNAm que codifica ciclina A a partir de un fragmento de DNA clonado que contena toda la secuencia codificadora de ciclina A. Se verific la identidad de este RNAm permitiendo su traduccin en un sistema in vitro sintetizador de protenas donde demostr que codifica autntica ciclina A de almeja. Cuando se inyect a ciclina de RNAm en oocitos Xenopus, stos respondieron

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2 Horas

FIGURA VE 14-6. Correlacin de la concentracin de ciclina con el ciclo de divisin de a clula. Se fertiliz una suspensin de vulos y despus de seis minutos se aadi 35S-metionina. Se tomaron muestras para analizar en electroforesis en gel a intervalos de 10 minutos, iniciando 16 minutos despus de la fertilizacin. Se rastre la autoradiografa de la electroforesis en gel para determinar la densidad de a marca y se construy la grfica mostrada. La protena A, que vara segn el ciclo celular, se denomina ciclina, y se muestra como crculos slidos. La protena B que no muestra variacin con el ciclo celular, se grfica como tringulo slido. El porcentaje de clulas que sufren divisin en cualquier momento se muestra como ndice de divisin (cuadros abiertos). (Segn T. Evans y cois. Cell 33:391, 1983, con permiso de Cell Press.)

sufriendo maduracin segn lo indica el desdoblamiento de la vescula germinal y la condensacin de cromosomas con un curso temporal no muy diferente del inducido por el tratamiento con progesterona (fig. VE 14-7). Estos resultados sugieren que la elevacin de la ciclina A, que ocurre normalmente durante meiosis y mitosis, tiene un papel directo para promover la entrada a la fase M. A continuacin la cantidad de ciclina A desciende rpidamente y se debe resintetizar antes de la siguiente divisin, o las clulas no podrn volver a entrar en fase M. Pero cul es la relacin entre ciclinas y FPM? Una de las dificultades para responder esta pregunta fue el uso de organismos diferentes. El FPM ha sido estudiado principalmente en anfibios, y las ciclinas en erizos de mar y almejas. Las pruebas indican que los oocitos de rana contienen una reserva de molculas inactivas precursoras de FPM, las cuales se convierten a FPM activo durante a meiosis I. Por otra parte, la ciclina est totalmente ausente de los oocitos de almeja, pero aparece poco despus de la fertilizacin. Una posibilidad considerada por Ruderman y sus colegas fue que la ciclina A es activador de FPM. Retornaremos a esto en breve. Mientras tanto, en otra lnea de investigacin se intent purificar y caracterizar la sustancia encargada de la actividad del factor promotor de maduracin. En 1980, Michael Wu y

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40

20

Progesterona 25 ng RNA 5 ng RNA 2.5 ng RNA

15

25

Horas
FIGURA VE 14-7. Cintica de la activacin de un oocito de Xenopus por progesterona y RNAm de ciclina A. Se aislaron ooctos inmaduros grandes de fragmentos de ovario y se incubaron con progesterona o se les practic microinyeccin con cantidades variables de ciclina A de RNAm. A las tres o cuatro horas despus de la inyeccin se eliminaron los oocitos evidentemente daados (casi dos a cuatro por grupo inicial de 20) y se permiti el desarrollo de los restantes {que representan el valor 100%). El desdoblamiento de la vescula germinal (GVBD) y la activacin del oocito fueron indicados por la formacin de un punto blanco en la regin del polo animal y confirmada por la diseccin de los oocitos. (Segn K.L Swenson, K.M. Farrell y V. Ruderman, Cell 47:865, 1986, con permiso de Cell Press.)

John Gerhart, de la Universidad de California, efectuaron una purificacin de 20 a 30 veces la del FPM, precipitando la protena en sulfato de amonio y sometiendo el material disuelto a cromatografa en columna. Cuando se inyect el FPM parcialmente purificado al interior de oocitos receptores, estos investigadores observaron que, adems de estimular la maduracin del oocito, la inyeccin de FPM estimul la incorporacin de 32P a las protenas del oocito.9 Cuando se incub la preparacin de FPM purificado con 32P-ATP in vitro, hubo fosforilacin a nivel significativo de las protenas presentes en la muestra, lo que indica la presencia de proteincinasas activas en la preparacin. Estos resultados sugieren que el FPM puede actuar por s mismo como una proteincinasa. Experimentos subsecuentes confirmaron que el FPM purificado acta como una proteincinasa. Como se analiza en la seccin 17-7, la purificacin de una sustancia requiere de un ensaye capaz de identificar la fraccin donde se encuentra la sustancia en cada paso del procedimiento de purificacin. El ensaye usado para purificar FPM depende de una observacin previa utilizando ncleos de espermatozoides desmembranados e incubados con extractos citoplsmcos de huevos Xenopus. Cuando se aadi FPM a dichos extractos, la cromatina del ncleo del espermatozoide se condens como si entrara en fase' M.10 Por medio de este ensaye, se purific FPM ms de 3 000 veces a partir de extractos de huevos de Xenopus mediante una serie de seis pasos cromatogrficos sucesivos.11 La activi-

dad FPM en estas preparaciones purificadas se relacion consistentemente con dos polipptidos, uno con peso molecular de 32 kD y el otro de 45 kD. Adems de estimular a los ncleos para prepararse para entrar en mitosis, el FPM purificado posee un elevado nivel de actividad de proteincinasa segn puede determinarse por la incorporacin de radiactividad procedente de 32P-ATP a las protenas. Cuando se incub la preparacin purificada en presencia de 32P-ATP, el polipptido 45 kD result marcado. La preparacin de FPM purificado tambin es capaz de fosforilar histona Hl aadida, lo que resulta significativo porque se cree que la fosforilacin de esta protena cromosmica desempea un papel para iniciar la condensacin de la cromatina antes de la mitosis (pg. 499). A finales del decenio de 1980, los esfuerzos para descubrir el papel de las ciclinas y del FPM comenzaron a mezclarse con otra lnea de investigacin efectuada sobre levaduras. Se haba demostrado que ambas especies de levaduras, las que se dividen por gemacin y las que lo hacen por fisin, producen una proteincinasa con peso molecular de 34 kD y cuya actividad es necesaria para que estas clulas entren en fase M (estudiada en la pgina 585). La protena de la levadura se denomin p34cde2 o simplemente cdc2. La primera demostracin de un vnculo entre cdc2 y FPM provino como resultado de una colaboracin entre grupos de investigadores sobre levaduras y anfibios.12 Recordemos que estudios previos haban mostrado que la FPM contiene una protena de 32 kD y otra de 45 kD. Los anticuerpos formados contra cdc2 a partir de levaduras que se reproducen por fisin reaccionaron especficamente con el componente de 32 kD del FPM aislado de huevos de Xenopus. Estos datos indican que este componente del FPM es un homlogo de la cinasa de 34 kD de la levadura, y por lo tanto el mecanismo encargado de controlar el ciclo de divisin celular en levaduras y vertebrados depende de componentes conservados a travs de la evolucin. Un estudio similar empleando anticuerpos contra cdc2 de levadura demostr que la protena homologa en vertebrados no vara durante el ciclo celular.13 Esto apoya la hiptesis de que, en tanto que la protena de 32 a 34kD de las clulas de vertebrados acta como proteincinasa, su actividad depende de otra protena. El candidato ms probable para modulador es la ciclina, cuya concentracin se eleva en cada ciclo celular y a, continuacin se destruye cuando la clula entra en anafase. Esta hiptesis se verific posteriormente en varios estudios en los cuales se purific el FPM de anfibios, almejas y estrellas de mar, y se analiz su composicin de polipptidos.14"16 En todos estos casos se demostr que el FPM activo presente en la fase M de las clulas es un complejo que consta de subunidades de dos tipos: 1) una subunidad de 34 kD que contiene el sitio activo de la proteincinasa y es homlogo a la proteincinasa cdc2 de levaduras, y 2) una subunidad mayor identificada como ciclina cuya presencia es necesaria para la actividad cinasa. Los estudios descritos en La va experimental presente suministran un punto de vista integrado de la regulacin del ciclo celular en todos los organismos eucariotas. Adems, constituyen un marco para analizar el gran nmero de factores que controlan la actividad del FPM (cdc2) en varios puntos durante los cilos celulares de levaduras y mamferos, los cua-

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CAPITULO 14 Reproduccin celular

les se han convertido en el foco de atencin en los ltimos aos. Los datos ms importantes de estos estudios recientes se analizan en la primera seccin de este captulo.
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SINOPSIS
Las etapas a travs de las cuales pasa una clula desde una divisin celular a la siguiente constituyen el ciclo celular. El ciclo celular se divide en dos fases principales: fase M, que incluye el proceso de mitosis en el cual los cromosomas duplicados se separan en dos ncleos, y citocinesis, durante la cual toda la clula fsicamente se divide en dos clulas hijas; e interfase. Tpicamente, la interfase es mucho ms prolongada que la fase M y se subdivide en tres fases distintas segn el tiempo de duplicacin, confinado a un periodo definido dentro del ciclo celular. GI es el periodo que sigue a la mitosis y precede a la duplicacin; S es el periodo durante el cual ocurre la sntesis de DNA (y la sntesis de histonas); y G2 es el periodo que sigue a la duplicacin y precede al inicio de la mitosis. La divisin del ciclo celular y las fases que lo constituyen varan mucho de un tipo de clula a otro. Los sitios celulares pueden variar desde un tiempo tan corto como 30 minutos, aproximadamente, en los embriones de divisin rpida hasta un periodo de meses en tejidos de crecimiento muy lento. Ciertos tipos de clulas diferenciadas terminalmente, como el msculo esqueltico de los vertebrados y las neuronas, han perdido por completo su capacidad para dividirse. La mayor parte de las actividades de sntesis diferentes de la sntesis del DNA y de las histonas contina a travs de la interfase, pero todas disminuyen notablemente o se interrumpen por completo durante la mitosis (p. 581). El paso de una clula a travs del ciclo es controlado por varios factores. La primera indicacin de que el citoplasma contiene factores que controlan el ciclo celular provino de estudios de fusin de clulas en diferentes etapas del ciclo. Estos estudios indican que una clula duplicante contiene uno o ms factores que estimulan el inicio de la sntesis de DNA y que una clula mittica contiene uno o ms factores que inducen la condensacin de la cromatina. Subsecuentes experimentos demostraron que la entrada de una clula en fase M se desencadena por activacin de una proteincinasa llamada FPM (factor promotor de la maduracin). El FPM consta de dos subunidades: una subunidad cataltica que transfiere grupos fosfato a residuos de serina y treonina especficos de sustratos de protenas especficas, y una subunidad reguladora que consta de un miembro de una familia de protenas llamadas ciclinas. La subunidad cataltica se denomina cinasa dependiente de ciclina (Cdk). Cuando la concentracin de ciclina es baja, la cinasa carece de la subunidad ciclina y es inactiva. Cuando la concentracin de ciclina alcanza un nivel suficiente, la cinasa se activa y desencadena la entrada de la clula en fase M (p. 582). Las actividades que controlan el ciclo de la clula se centran principalmente en dos puntos: la transicin entre GI y S, y la transicin entre G2 y la entrada en mitosis. El paso por cada uno de estos puntos requiere la activacin transitoria de una Cdk por una ciclina especfica. En levaduras, la misma Cdk es activa en las transiciones de GI a S y de G2 a M, pero es estimulada por una ciclina diferente. La concentracin de las diferentes ciclinas se eleva y desciende durante el ciclo celular como resultado de cambios en las tasas de sntesis y destruc-

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cin de las molculas de protenas. Adems de la regulacin por ciclinas, la actividad Cdk tambin es controlada por el estado de fosforilacin de la subunidad cataltica, que a su vez es controlada en las levaduras por dos cinasas cuando menos (CAK y weel) y una fosfatasa (cdc25). En clulas de mamferos, ocho ciclinas diferentes y una media docena de Cdk diferentes cuando menos desempean un papel en la regulacin del ciclo celular (p. 584). Las clulas poseen controles por retroalimentacin que regulan el estado de los acontecimientos del ciclo celular, como duplicacin y condensacin de cromosomas, utilizando la informacin para determinar si el ciclo contina o no. Las transiciones Gi-S y G2-M son puntos donde se ejerce control primario. Por ejemplo, los factores de crecimiento exgeno influyen en las clulas que entran a la fase S a travs de la actividad de una cinasa dependiente de ciclina. Si una clula se somete a tratamientos que daen al DNA, el paso de GI a S se retrasa en tanto se repara el dao. La clula se puede detener en uno de los puntos de verificacin del ciclo celular gracias a la accin de inhibidores cuya sntesis se estimula con acontecimientos como dao al DNA. Estos inhibidores a veces tienen varios blancos especficos, incluyendo las ciclinas Cdk, el mecanismo de duplicacin y varios factores de transcripcin que activan genes que participan en el crecimiento de las clulas. Una vez estimulada la clula por agentes externos que rebasan el punto de verificacin Gi-S e inician la duplicacin, la clula por lo general contina sin estimulacin externa adicional a travs de la mitosis subsecuente (p. h La mitosis asegura que los dos ncleos hijas reciban una dotacin completa y equivalente de material gentico. La mitosis se divide en profase, prometafase, metafase, anafase y telofase. La profase se caracteriza porque prepara los cromosomas para ser separados y el ensamblado del mecanismo necesario para el movimiento de los cromosomas. Los cromosomas de la interfase se presentan en una configuracin ampliamente extendida, en tanto que los cromosomas de la mitosis son estructuras muy condensadas en forma de bastoncillos. Se puede observar que cada cromosoma mittico se desdobla longitudinalmente en dos cromtides, las cuales son duplicados recprocos formados por duplicacin durante la fase S previa. El proceso mediante el cual los cromosomas extendidos de la interfase se condensan para formar los cromosomas mitticos es poco comprendido. Se cree que se desencadena por la activacin de una cinasa dependiente de ciclina, que fosforila molculas de historia Hl entre otros sustratos. La condensacin del cromosoma requiere de la presencia de una topoisomerasa II activa, que es una protena no histona principal del armazn mittico del cromosoma. La principal constriccin sobre el cromosoma mittico marca el centrmero, que aloja una estructura en forma de plato, el cinetocoro, al cual se fijan los microtbulos del huso. La primera etapa en la formacin del huso en una cluia animal tpica es la aparicin de microtbulos en disposicin de "flamas solares", o ster, alrededor de cada uno de los dos centrmeros durante el inicio de la profase. La formacin del ster va seguida por el movimiento de los centrosomas separndose entre s en direccin a los polos. A medida que esto ocurre, los microtbulos que se apartan aumentan en nmero y se alargan. Por ltimo, los dos

centrosomas alcanzan puntos opuestos en la clula y establecen los dos polos. Algunos tipos de clulas, incluyendo las de plantas, ensamblan un huso mittico en ausencia de centrosomas. El final de la profase est indicado por la fragmentacin de la envoltura nuclear y la dispersin de sus membranas en forma de pequeas vesculas (p. 588). Durante la prometafase y la metafase, los cromosomas individuales se fijan primero a los microtbulos del huso que surgen de ambos polos y luego se desplazan a un plano en el centro del huso. Al principio de la prometafase, los microtbulos del huso en formacin penetran en la regin donde estuvo el ncleo y se fijan a los cinetocoros de los cromosomas condensados. Inicialmente se puede observar que los cromosomas se mueven activamente a lo largo de las superficies laterales de los microtbulos, aparentemente impulsados por protenas motoras localizadas en el cinetocoro. Sin embargo, pronto los cinetocoros se estabilizan al relacionarse con los extremos "ms" de los microtbulos cromosmicos procedentes de ambos polos del huso. Con el tiempo, cada cromosoma se mueve a una posicin situada a lo largo de un plano en el centro del huso, proceso que se acompaa por el acortamiento de algunos microtbulos debido a a prdida de subunidades de tubulina y al alargamiento de otros debido a la adicin de subunidades. Una vez que los cromosomas se alinean de manera estable, la clula ha llegado a la metafase. El huso mitotico de una clula animal tpica en la metafase consta de microtbulos astrales, que se irradian a partir del centrosoma; microtbulos cromosmicos, unidos a los cinetocoros, y microtbulos polares que se extienden desde el centrosoma ms all de los cromosomas y forman una canastilla estructural que mantiene la integridad del huso. Los microtbulos del huso durante la metafase pueden mostrar actividad dinmica, segn puede juzgarse por los movimientos dirigidos de las subunidades marcadas con fluorescencia ([>. 593), Durante la anafase y la telofase, las cromtides hermanas se separan entre s hacia regiones aparte de la clula en divisin, y los cromosomas retornan a su condicin de interfase. La anafase se inicia cuando las cromtides hermanas sbitamente se separan, proceso probablemente desencadenado por la actividad de una Cdk que requiere una topoisomerasa II. A continuacin los cromosomas separados se mueven hacia sus respectivos polos acompaados por el acortamiento de los microtbulos cromosmicos fijos, lo que ocasiona principalmente la prdida neta de subunidades a nivel de cinetocoro. El movimiento de los cromosomas, llamado anafase A, generalmente se acompaa de alargamiento del huso mittico y la consecuente separacin de [os polos, que se refiere como anafase B. La telofase se caracteriza por la reconstitucin de la envoltura nuclear, dispersin de los cromosomas y restablecimiento de las redes citoplsmicas membranosas. Se cree que los motores microtubulares, como la cinecina y la dnena, generalmente se encargan de los movimientos durante la anafase, pero la despolimerizacin de los microtbulos como mecanismo generador de fuerzas todava permanece como posibilidad alternativa (p. 596) La citocinesis, que es la divisin del citoplasma en dos clulas hijas, ocurre por constriccin en clulas animales y por

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CAPITULO 14 Reproduccin celular

construccin en clulas vegetales. Las clulas animales son estranguladas a la mitad por una indentacin o surco que se forma en la superficie de la clula y se desplaza hacia adentro. El surco contiene una banda de filamentos de actina, los cuales tal vez se deslicen uno sobre otro, y avanza impulsado por filamentos pequeos de miosina II generadores de fuerza. Se cree que el sitio de la citocinesis se elige gracias a una seal que se difunde a partir de los polos del huso. En las clulas vegetales, la citocinesis tiene lugar por la construccin de una membrana celular y una pared celular en un plano situado entre los dos polos. El primer signo de la formacin de una placa celular es la aparicin de un material electrnicamente denso que forma grupos de microtbulos entrelazados y dispersos. A continuacin, pequeas vesculas se desplazan hacia esa regin y se alinean en un plano. Las vesculas se fusionan entre s para formar cadenas largas sobre las cuales la membrana de las vesculas se convierte en membranas plasmticas de las clulas adyacentes, y el material encerrado forma parte de la pared celular (p. 600). La meiosis es un proceso que incluye dos divisiones nucleares en secuencia, produciendo ncleos hijas haploides que contienen un solo miembro de cada par de cromosomas homlogos, reduciendo as el nmero de cromosomas a la mitad. La meiosis puede ocurrir en diferentes etapas del ciclo de vida de la clula, segn el tipo de organismo. Para garantizar que cada ncleo hija slo tiene un conjunto de homlogos, ocurre un elaborado proceso de formacin de pares de cromosomas durante la profase I que no tiene contraparte en la mitosis. La formacin de pares cromosmicos se acompaa por la formacin de una estructura proteincea en forma de escalera denominada complejo sinaptonmico (CS). La cromatina de cada homlogo est ntimamente relacionada con una de las barras laterales del complejo sinaptonmico. Al formarse los pares de cromosomas homlogos se participa en la recombinacin gentica que produce cromosomas con nuevas

combinaciones de alelos maternos y paternos. En etapas subsecuentes, los cromosomas se condensan an ms, pero los homlogos permanecen fijos entre s en puntos especficos denominados quiasmas, que se cree que representan sitios donde ocurre la recombinacin en etapa previa. En los oocitos y espermatocitos de muchas especies animales, los cromosomas se dispersan durante la profase I para formar cromosomas lampbrush, que son sitios de expresin gentica extensa. Los pares de homlogos (llamados bivalentes o tetradas) se orientan a nivel de la placa metafsica de modo que ambas cromtides de un cromosoma enfrentan el mismo polo. Durante la anaf ase I, los cromosomas homlogos se separan. Puesto que no hay interaccin entre una tetrada y otra, los cromosomas maternos y paternos de cada tetrada se apartan entre s de manera independiente. Las clulas, que ahora tienen un contenido haploide en el cromosoma, progresan hasta la segunda divisin meitica durante la cual las cromtides hermanas de cada cromosoma se separan en diferentes ncleos hijas (p. 604). La recombinacin gentica durante la meiosis ocurre como resultado del rompimiento y reunin de las cadenas de DNA de diferentes homlogos de una tetrada. La recombinacin es un proceso mal comprendido en el cua! las regiones homologas sobre diferentes cadenas de DNA se intercambian sin adicin ni prdida de un solo par de bases. En paso inicial, dos dplex prximos a recombinarse se alinean uno a continuacin del otro como resultado de una bsqueda de homologa. Una vez alineados ocurre el rompimiento en alguna de ambas cadenas de uno de los dplex. En los siguientes pasos, las cadenas de DNA de un dplex invaden el otro dplex formando una estructura interconectada. Los pasos subsecuentes pueden incluir la actividad de nucleasas y poiimerasas para generar y llenar brechas en las diferentes cadenas, similar a lo que ocurre durante la reparacin del DNA (p. 613).

PREGUNTAS DE REPASO
1. Qu es el ciclo celular? Cules son las etapas del ciclo celular? Cmo vara el ciclo celular entre los diferentes tipos de clulas? 2. Describir cmo se puede usar la 3H-timidina y la autorradiografa para determinar la duracin de los diferentes periodos del ciclo celular. 3. Cul es el efecto de fusionar una clula en GI con una en S; de fusionar una clula en fase GI con una en M; de fusionar una clula en fase G2 o S con una en M? 4. Cmo puede variar la actividad del FPM a travs del ciclo celular? Cmo se correlaciona esto con la concentracin de ciclinas? Cmo afecta la concentracin de ciclina a la actividad del FPM? Qu factores determinan el nivel de una ciclina particular en cualquier momento determinado del ciclo? 5. Cul es la relacin entre el producto del gen cdc2 de una levadura y la subunidad cataltica del FPM? 6. Qu significa punto de verificacin del ciclo celular? Cul es su importancia? Cmo puede una clula detener su avance en uno de estos puntos de verificacin? 7. Cul es el papel del producto del gen p53? Cmo acta este producto en las clulas? Cul es su relacin con p21? En qu difieren las clulas de un paciente con ataxia-telangiectasia (AT) de las clulas normales? 8. Contrastar el papel ntegro de la mitosis y la meiosis en la vida de las plantas y los animales. En qu difieren los ncleos formados por estos dos procesos? 9. Cmo preparan los sucesos de la profase en la mitosis a las cromtides para su posterior separacin durante la anaf ase? 10. Cules son algunas de las actividades del cinetocoro durante la mitosis? 11. Describir lo que ocurre en una clula durante la prometafase y durante la metafase.

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12. Qu tipos de mecanismos generadores de fuerza pueden encargarse del movimiento de cromosomas durante la anafase? 13. Comparar lo que ocurre durante la citocinesis en clulas tpicas de plantas y animales. 14. Comparar los acontecimientos que tienen lugar durante la profase 1 y la profase II de la meiosis.

15, Cmo se demostr que la recombinacin gentica tiene lugar por un mecanismo de rompimiento y reunin? Describir una serie de pasos mediante los cuales el DNA de dos cromosomas homlogos pueden sufrir recombinacin.

PREGUNTAS ANALTICAS
1. De qu manera se vincula la divisin celular entre humanos y clulas eucariotas primitivas? 2. Qu tipos de acontecimientos de sntesis esperara usted que ocurrieran en GI que no ocurren en G2? 3. Supongamos que se marca una poblacin de clulas en crecimiento asincrnico con 3H-timidna. GI es de seis horas, S de seis horas, GI de cinco horas, y M de una hora. Qu porcentaje de las clulas estarn marcadas luego de un pulso de 15 minutos? Qu tiempo tendra que seguirse a estas clulas antes de observar algn cromosoma mittico marcado? Qu porcentaje de las clulas presentan cromosomas mitticos marcados si las clulas se siguen durante 18 horas? 4. Supongamos que se tiene un cultivo de las mismas clulas empleadas en la pregunta previa, pero en lugar de un pulso para marcarlas con 3H-timidina se marcan continuamente durante 20 horas. Trazar una grfica que muestre la cantidad de DNA radiactivo que estara presente en el cultivo despus de un periodo de 20 horas. Cul sera e tiempo mnimo necesario para garantizar que todas las clulas han incorporado algo de radiactividad en el experimento de arriba? Cmo se puede determinar la duracin del ciclo celular en este cultivo sin usar marcas radiactivas? 5. Fusionando clulas en fase GI y S se producen resultados diferentes a los obtenidos cuando se fusionan clulas en fase G2 con otras en fase S. Qu diferencia sera de esperar y cmo se puede explicar? 6. Cuando alguno de los genes que codifican CAK, weel y cdc25 sufre mutaciones, cul sera de esperar que detuviera la divisin continua de una clula? Sera de esperar que cuando sufran mutaciones puedan provocar la proliferacin descontrolada de la clula? 7. Por qu se requiere que ambas copias del gen p53 sufran mutacin antes que una clula pierda el control de su crecimiento? 8. Un sinctio es una "clula" que contiene ms de un ncleo; ejemplos son la fibra muscular esqueltica y una blstula del embrin de mosca. Estos dos tipos de sincitio se originan por dos vas muy diferentes. Cules son los dos mecanismos que podra visualizar que dieran como resultado la formacin de estos sincitios? Cules son los datos que le dan a conocer acerca de la relacin entre mitosis y citocinesis? 9. Qu tipo de anticuerpo se puede inyectar dentro de una clula para bloquear la compactacin de cromosomas? 10. Cuando se aade 3H-timidina a una clula que est sufriendo duplicacin (fase S) antes del inicio de la meiosis, qu porcentaje de los cromosomas de los gametos producidos quedarn marcados? Si uno de estos gametos, en este caso el espermatozoide, fertiliza un vulo no marcado, qu porcentaje de los cromosomas de la etapa de dos clulas quedarn marcados? 11. Si el nmero de cromosomas haploides en el hombre es de 23 y la cantidad de DNA haploide es 1C, cuntos cromosomas tiene una clula en la siguientes etapas: metafase de la mitosis, profase I de la meiosis, anafase I de la meiosis, profase II de la meiosis, anafase II de la meiosis? Cuntas cromtides tiene la clula en cada una de estas etapas? Cunto DNA {en trminos de nmeros de C) tiene la clula en cada una de estas etapas? 12. Granear la cantidad de DNA en el ncleo de una espermatogonia en etapa GI antes de la primera divisin meitica a travs de toda la meiosis. Marcar cada una de las principales etapas del ciclo celular y de la meiosis sobre la grfica. 13. Cuntos centrolos tiene una clula en la metafase de la mitosis? 14. Supongamos que usted piensa que la mayor parte de los casos de trisoma son resultado del envejecimiento de un vulo en el oviducto en tanto espera la fertilizacin. Qu tipo de datos se podran obtener examinando fetos abortados que confirmen esta sugerencia? Cmo concordara esto con los datos ya recopilados? 15. Supongamos que se incuba una clula meitica en 3H-timidina entre las etapas leptoteno y cigoteno, a continuacin se fija la clula durante el paquteno y se prepara una autorradiografa. Se observa que los quiasmas son sitios donde se concentran granulos plateados. Qu conclusin se puede obtener acerca del mecanismo de recombinacin?

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CAPITULO

15

Seales celulares: comunicacin entre clulas y su ambiente

15-1 Algunas caractersticas bsicas de los sistemas de seales celulares 15-2 Receptores acoplados a protena G y segundos mensajeros La perspectiva humana: Trastornos relacionados con receptores acoplados a protena G 15-3 Receptor de tirosincinasas {RTK}: un segundo tipo principal de sistemas de seales 15-4 Convergencia, divergencia e interferencia entre diferentes sistemas de seales 15-5 Otros sistemas de seales La va experimental: Descubrimiento y caracterizacin de las protenas enlazadas a GTP

l poeta ingls John Donne expres su conviccin respecto de la interdependencia del ser humano en la frase: "Ningn hombre es una isla." Lo mismo se puede decir de las clulas. Es evidente que las clulas dependen de su ambiente para obtener las materias primas necesarias que sostienen su vida. En el captulo 4 vimos que la membrana plasmtica de la clula contiene varios canales diferentes y transportadores que permiten a las clulas introducir selectivamente las sustancias inorgnicas y orgnicas necesarias para mantenerse y para liberar productos de desperdicio. Para su supervivencia tambin es esencial que las clulas se comuniquen con sus vecinas, vigilar las condiciones de su ambiente y responder de manera apropiada a diversos tipos de estmulos que inciden sobre su superficie. Las clulas llevan a cabo estas interacciones mediante un fenmeno conocido como emisin de seales celulares, en el cual se pasa informacin a travs de la membrana plasmtica al interior de la clula y con frecuencia al ncleo celular (g.> 15-1). En la mayor parte de los sistemas las seales celulares incluyen:

FIGURA 15-A. Corte a travs del ojo compuesto de la mosca de la fruta teido con anticuerpos fluorescentes para mostrar la distribucin de la protema calmodulina enlazada a calcio. (Cortesa de Jeffrey A. Porter y Craig Montdl, Tlie Johns Hopkins Universty.)

Reconocimiento del estmulo en la superficie externa de la membrana plasmtica mediante un receptor especfico integrado a la membrana. Transferencia de una seal a travs de la membrana plasmtica hacia la superficie citoplsmica de la misma.
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CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre las clulas y su ambiente Ligando extracelular

Sitio de contacto clula-clula

Activacin de la actividad de la enzima Cambios en la organizacin del citoesqueleto Cambio en la permeabilidad a iones Activacin de la sntesis de DNA Activacin de la sntesis de RNA

Matriz extracelular FIGURA 1 5 - 1 . Perspectiva de algunas formas como se pueden iniciar las seales intercelulares y los tipos de respuesta que pueden generar. La membrana plasmtica de una clula contiene receptores que se enlazan especficamente a ligandos solubles, matrices extraceiulares y componentes de la superficie de otras clulas. La estimulacin que se origina a partir de estos contactos se puede convertir (transducir) por la membrana celular en seales ntracelulares transmitidas a lo largo de diversas vas. Finalmente, estas seales pueden producir la activacin de enzimas, cambios en la organizacin del citoesqueleto, cambios en la permeabilidad inica, inicio de la sntesis de DNA, o la activacin o represin de la expresin de genes.

plasmtica en vez de actuar a nivel de la superficie celular. Tambin hay casos en los cuales las sustancias que se enlazan a los receptores de la superficie celular evocan una respuesta directa sin iniciar la emisin de seales dentro de la clula. El neurotransmisor acetilcolma acta por un mecanismo de este tipo cuando se enlaza a su receptor sobre la clula del msculo esqueltico, abriendo un canal inico situado entre el propio receptor (pg. 163). La emisin de seales puede afectar casi a todos los aspectos de la estructura y funcin celulares, y sta es una de las principales razones por las cuales este captulo aparece casi al final del libro. Por otra parte, el tema de la emisin de seales celulares puede servir para vincular varias actividades celulares, al parecer independientes. Ningn otro tema parece ilustrar el hecho de que las partes de una clula son elementos interdependientes e incapaces de funcionar en aislamiento. La emisin de seales celulares tambin est ntimamente relacionada con el proceso mediante el cual las clulas regulan su crecimiento y funcin, y este hecho confiere al estudio de las seales celulares importancia especial para comprender de qu manera una clula puede perder el control de su crecimiento y convertirse en tumor maligno.

15-1 Algunas caractersticas bsicas de los sistemas de seales celulares

El trmino "emisin de seales celulares" lleva implcito el concepto de que la clula responde a un estmulo de su ambiente transmitiendo informacin al compartimiento interno de la clula. En la mayor parte de los casos, el estmulo es una molcula secretada en el espacio extracelular por otra clula, pero el estmulo tambin se origina como resultado del contacto con otra clula o con un sustrato no celular (fg. 15-1). Cualquiera que sea su naturaleza, el agente que se enlaza al receptor en la superficie externa de la clula se conoce como ligando. A diferencia de la captacin de nutrientes o de iones, las seales celulares no incluyen la transferencia del agente estimulante a travs de la membrana; todo lo que se transmite a travs de dicha membrana es la seal de que se ha recibido un estmulo. Otro trmino comnmente empleado en relacin con este proceso es transduccin de seales, que indica que la naturaleza del estmulo recibido por el receptor de la superficie celular es totalmente diferente a la seal liberada en el interior de la clula. Como pronto veremos, la transduccin de seales es un proceso complejo que implica el paso de informacin a lo largo de vas de transduccin de seales, en general constituidas por una serie de diversas protenas. En ciertos aspectos, el paso de informacin a travs de la clula es anlogo al paso de electrones a lo largo de una cadena de transporte de electrones. En ambos casos, cada componente de la va es alterado por el elemento "antecedente" en ella, y a su vez altera al elemento "subsecuente" en dicha va. En vez de pasar electrones o alguna otra sustancia especfica, las protenas de una va de transduccin de seales por lo general actan alterando la conformacin de la siguiente protena en la serie, acontecimiento que activa o inhibe a dicha protena (fig. 15-2).

Transmisin de la seal a las molculas efectoras especficas sobre la superficie interna de la membrana o dentro del citoplasma que desencadenan la respuesta celular, la cual puede implicar un cambio en la expresin de genes, alteracin de la actividad en enzimas metablicas, reconfiguracin del citoesqueleto, cambio de permeabilidad a iones, activacin de la sntesis de DNA o incluso la muerte de la clula. Cese de la respuesta como resultado de la destruccin o inactivacin de la molcula emisora de seales combinada con disminucin del grado de estmulo extracelular. Antes de examinar estos pasos con mayor detalle debemos hacer notar que no toda la informacin se transmite desde el espacio extracelular al interior de la clula por medio de un receptor situado en la superficie de la misma. Por ejemplo, en el captulo 12 vimos que las hormonas esferoides actan sobre clulas especficas que atraviesan la membrana plasmtica por difusin e interactan con una protena receptora dentro de la clula, a la cual convierten en factor de transcripcin activo. En el presente captulo describiremos otro ejemplo donde un mensajero intercelular, denominado xido ntrico (NO), atraviesa la membrana

CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre las clulas \j su ambiente

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Proteincinasa 3 inactiva

Fosfato Proteincinasa 3 activa Fosfato

RESPUESTA
Proteinfosfatasa 3

Proteincinasa 1 inactiva

Fosfato Proteincinasa Sustrato de protena 1 activa inactivo (p. ej., factor de transmisin)

Sustrato de protena activa (p, ej., capaz de enlazar a la secuencia promotora en el DNA)

FIGURA 15-2, Las vas para transduccin de seales constan principalmente de proteincinasas y proteinfosfatasas cuya accin cataltica cambia la conformacin, y por lo tanto la actividad, de las protenas que modifican. En el ejemplo aqu mostrado, la proteincinasa 1 es activada por la proteincinasa 2. Una vez activada, la proteincinasa 1 fosforila a la proteincinasa 3 activando la enzima. En seguida, la proteincinasa 3 fosforiia un factor de transcripcin incrementando su afinidad por un sitio sobre el DNA que provoca la respuesta. Cada una de estas etapas de activacin puede ser invertida por una fosfatasa.

No es sorprendente, luego de leer otros temas de biologa celular, que los mecanismos ms importantes para que una protena de una va de transduccin de seales altere la actividad de la protena siguiente en la serie sea aadir o eliminar grupos fosfato (fig. 15-2). Como veremos, la va de transduccin de seales de ordinario contiene proteincinasas y fosfatasas, que parecen ser los agentes favoritos para provocar cambios reversibles rpidos en la actividad celular. Algunas de estas cinasas y fosfatasas son protenas citoplsmicas solubles; otras son protenas integrales de membrana. Algunas de estas enzimas poseen gran nmero de protenas como sustratos, en tanto que otras slo fosforilan o desfosforilan un sustrato de protena nico. Gran parte de los sustratos de estas enzimas son otras enzimas, pero los sustratos de protena pueden incluir canales inicos, factores de transcripcin y varios tipos de subunidades reguladoras. En general, aadir o eliminar grupos fosfato a partir del sustrato desencadena un cambio de conformacin en la protena que estimula o inhibe su actividad, y por lo tanto conduce a una respuesta especfica. Otra caracterstica prominente de las vas de seales celulares compartida por otros procesos celulares es el uso de protenas enlazadas a GTP como interruptores que inician o concluyen la actividad. Las protenas enlazadas a GTP se estudiaron en relacin con el trfico de vesculas en el captulo 6, la dinmica de microtbulos y microfilamentos en el captulo 9, y la sntesis de protenas en el captulo 11. En el presente captulo exploraremos su papel en la transmisin de mensajes a lo largo de "circuitos de informacin celular". El anlisis de la emisin de seales celulares en este captulo se centrar en dos tipos contrastantes de vas de transduccin de seales (fig. 15-3). En uno de los tipos de vas, la fijacin de un ligando a un receptor en la superficie celular se indica a travs de la activacin de una protena enlazada a GTP (protena G), en tanto que en el otro tipo de

respuesta, el enlace de ligandos se seala mediante activacin directa de la actividad enzimtica relacionada con el receptor.
Estmulo (ligando)

Receptor

Efector

Efector activado

Estmulo Receptor Receptor (ligando) cinasa activado (inactivo) FIGURA 15-3. Los dos tipos alternativos de vas para la transduccin de seales. En la va 1, el ligando enlazado activa una protena G, que activa un efector, liberando una seal. En la va 2, el ligando' enlazado activa una accin enzimtica (cinasa) del receptor, que activa un efector liberando una seal.

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CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre las clulas y su ambiente

L5-2 Receptores acoplados a protena G y segundos mensajeros

La oxidacin de la glucosa por la va catablica de la gluclisis y del ciclo de Krebs suministra a la mayor parte de las clulas su fuente primaria de energa. Dada la importancia de la glucosa en el metabolismo, la comprensin del mecanismo que controla el aprovechamiento de este azcar ha sido un objetivo importante de los bioqumicos y fisilogos por ms de 100 aos. Como se estudi en el captulo 3, la glucosa en los animales se almacena como glucgeno, un polmero insoluble de glucosa. La desintegracin del glucgeno en subunidades ricas en energa es controlada en vertebrados por algunas hormonas, ms notablemente el glucagon, secretado por el pncreas, y la epinefrina, secretada por la mdula suprarrenal. Cada una de estas hormonas se enlaza a un receptor que sobresale en la membrana plasmtica de la clula especfica. El enlace inicia una serie de reacciones que estimulan la enzima fosforilasa, la cual cataliza la reaccin para descomponer el glucgeno en glucosa fosfato, primer paso del catabolismo del azcar (fig. 15-4). Al mismo tiempo, el enlace de ambas hormonas inhibe a la enzima glucgeno sintasa, que cataliza la reaccin opuesta para polimerizar glucosa y formar glucgeno. Por lo tanto, los diferentes tipos de estmulo que inciden en la misma clula blanco pueden inducir la misma respuesta. En la siguiente seccin veremos de qu manera es posible esto. Descubrimiento de un segundo mensajero: AMP cclico La conexin entre el enlace de una hormona a la membrana plasmtica y los cambios de actividad de la fosforilasa y la glucgeno sintasa fue dilucidado mediante estudios iniciados a mediados del decenio de 1950 por dos grupos de investigadores: Earl Sutherland y sus colegas, en la Case Western Reserve University, y Edwin Krebs y Edmond

Fischer, en la Universidad de Washington. El objetivo de Sutherland era desarrollar un sistema in vitro en el cual se pudiera lograr la respuesta fisiolgica a una hormona. Luego de grandes esfuerzos, observ que se poda incubar epinefrina o glucagon con una preparacin de clulas despedazadas y demostrar activacin de la fosforilasa. Esta preparacin de clulas despedazadas se poda dividir mediante centrifugacin en una fraccin con partculas y una fraccin soluble. Aunque la fosforilasa slo se encuentra en la fraccin sobrenadante, se requieren las partculas materiales para la respuesta hormonal. Experimentos subsecuentes indicaron que la respuesta ocurre en dos pasos distintos cuando menos. Si se aisla la fraccin de partculas de un homogenado de hgado y se incuba con la hormona, se produce alguna sustancia nueva que cuando se aade a la fraccin sobrenadante puede activar a la molcula fosforilasa soluble. Sutherland identific a la sustancia liberada por las membranas de la fraccin dividida como monofosfato de adenosina cclico (AMP cclico, o simplemente AMPc). Como estudiaremos en detalle, el AMPc estimula la movilizacin de la glucosa al activar una proteincinasa que aade un fosfato a un residuo especfico de serina del polipptido fosforilasa. El AMP cclico es un ejemplo de segundo mensajero, sustancia liberada dentro de la clula como resultado del enlace de un primer mensajero, una hormona u otro ligando, a un receptor situado en la superficie externa de la clula. Subsecuentes trabajos efectuados por otros investigadores demostraron que el AMP cclico slo es uno de un gran nmero de sustancias que actan como segundos mensajeros en clulas eucariotas. En tanto que el primer mensajero se enlaza exclusivamente a una sola especie de receptor, el segundo mensajero generado en el citoplasma a menudo puede activar varias actividades celulares. Como resultado, el uso de segundos mensajeros permite a las clulas mostrar una respuesta coordinada a gran escala luego de la estimulacin por un solo ligando extracelular. En un momento retornaremos al mecanismo mediante el cual la seal del ligando enlazado se transmite a travs de la membrana,

CH2OH

CH2OH H]TvH

CH2OH HJ--~t\ Fosforilsa

CH^OH H/ \ {GlucosaJn _ Glucgeno

OH

OH

OH

P(
PP;

OH

Glucgeno
(glucosa),,

Glucgeno sintetasa UDP-glucosa (Glucosa)n -

Glucosa 1-fosfato

UTP

\a 6-fosfato

/ \a Glucosa
FIGURA 15-4. Reacciones que conducen al almacenamiento o movilizacin de la glucosa. En estas reacciones, la actividad de dos enzimas claves, fosforilasa y glucgeno sintetasa, estn controladas por hormonas que actan a travs de vas para la transduccin de seales. 6-fosfato Gluclisis i [\ Sangre I

CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre las clulas y su ambiente

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que es uno de los principales pasos en el proceso de emisin de seales, pero primero ilustraremos el mecanismo de accin de los sistemas con segundo mensajero para describir de qu manera se sintetiza el AMP cclico y cmo puede desencadenar la movilizacin de glucosa. Movilizacin de glucosa: ejemplo de respuesta inducida por AMPc Una protena integral de membrana sintetiza el AMPc. Esta protena se denomina adenililciclasa y su dominio cataltico reside en la superficie interna de la membrana plasmtica (fig. 15-5). Puesto que provoca la respuesta celular (efectos) mediante la sntesis de AMPc, la adenilciclasa se denomina ef ector. El enlace de glucagon o de epinefrma a la superficie externa de una clula heptica provoca un cambio de conformacin del receptor que es transmitido a travs de la membrana plasmtica y, segn se describe ms adelante, activa la adenililciclasa en la superficie interna de la membrana. Una vez activada la adenililciclasa, cataliza la conversin de ATP en molculas de AMPc que pueden difundir rpidamente al interior del citoplasma (fig. 15-5). El AMPc provoca su respuesta iniciando una cadena de reacciones, varias de las cuales incluyen modificacin por enlaces covalentes de una enzima por otra. Esta reaccin en cascada se ilustra en la figura 15-6. Ya se describi el primer

COOH

paso en la cascada de reacciones que ocurre a medida que la hormona se enlaza al receptor y estimula la sntesis de AMPc (pasos 1 y 2, fig. 15-6). Cada molcula de AMPc puede entonces enlazarse a un sitio alostrico sobre la subunidad reguladora de una proteincinasa especfica dependiente de AMPc, denominada proteincinasa A (PKA) (paso 3). Las subunidades reguladoras normalmente inhiben la actividad enzimtica de las subunidades catalticas de la enzima. El enlace del AMPc provoca disociacin de las subunidades inhibidoras liberando las subunidades catalticas en su forma activa. Los sustratos especficos de PKA de una clula heptica incluyen dos enzimas que desempean un papel crucial en el metabolismo de la glucosa, la glucgeno sintasa y la fosforilasa cinasa (pasos 4 y 5). La fosforilacin de la glucgeno sintasa inhibe su actividad cataltica y por lo tanto evita la conversin de glucosa a glucgeno. Por lo contrario, la fosforilacin de la fosforilasa cinasa activa la enzima para catalizar la transferencia de grupos fosfato a molculas de fosforilasa (paso 6). Krebsy Fischer descubrieron que la adicin de un solo grupo fosfato a un residuo serina especfico en la molcula de fosforilasa activa a esta enzima y estimula el desdoblamiento de glucgeno (paso 7). La glucosa 1-fosfato formada en la reaccin de la fosforilasa se convierte a glucosa, que difunde al interior de la sangre y alcanza los tejidos del cuerpo (paso 8). Uno de los grandes valores de la reaccin en cascada, como la mostrada en la figura 15-6, es que amplifica ampliamente el mensaje original (indicado por las flechas azules en la figura 15-6). En la sangre, la concentracin de hormonas por lo general es muy baja: menos de 10~8 M. Considerando el volumen de sangre en el cuerpo de un vertebrado, esta concentracin baja constituye una seal de comunicacin muy econmica. El enlace de una sola molcula de hormona en la superficie de la clula puede activar varias molculas de adenililciclasa, cada una de las cuales produce numerosos mensajeros AMPc en un breve periodo. Por lo tanto, la produccin del segundo mensajero representa un importante paso de amplificacin en el proceso. Cada molcula de AMPc puede entonces activar una sola molcula de PKA, que puede fosforilar a un gran nmero de molculas de PKA, las cuales a su vez pueden fosforilar un nmero an mayor de molculas de fosforilasa, que por su parte catalizan la formacin de un nmero mucho mayor de fosfatos de glucosa. As, lo que comienza como un estmulo apenas perceptible en la superficie de la clula, rpidamente se transforma en una gran movilizacin de glucosa dentro de ella. Otros aspectos de la va de transduccin de seales del AMPc Aunque los efectos ms rpidos y mejor estudiados de la produccin de AMPc se observan en el citoplasma, el ncleo y sus genes tambin participan en la respuesta. La mayor parte de las molculas PKA activadas permanecen en el citoplasma, pero una fraccin de ellas se transloca al interior del ncleo donde fosforilan protenas nucleares clave (paso 9, fig. 15-6), en particular un factor de transcripcin denominado CREB (siglas en ingls que significan elementa enlazado a protenas que responde al AMPc). La versin fosforilada del CREB se enlaza a diferentes sitios sobre el

0 0 0 ""^N II II II "OPOPOPOCH-j I I I 0~0~0

(T

^C.
H' OH

VH

H/H -C

OH

OH

I-'IGURA 15-5. La formacin de AMP cclico a partir de ATP es catalizada por adenililciclasa, una protena integral de membrana cuyo sitio activo se localiza en la superficie interna de la membrana. La actividad de la enzima es regulada por protenas enlazadas a GTP, segn se estudia ms adelante en el texto y se ilustra en la figura 15-11. La desintegracin del AMPc (no mostrado) se logra gracias a una fosfodiesterasa, que convierte el nucletido cclico a 5' monofosfato.

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CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre las clulas y su ambiente Glucagon, epinefrina, otros

Adenililciclasa

Citoplasma
!

Ncleo

x^^ Inactiva

w Activa
Glucgenosintasa

Fosfodiesterasa

Proteincinasa A Inactiva
,j-^ Activa Fosforilasa

O
Activa .

-
Activa ^
Fosfatas a

A s

(0

Fosforilasa cinasa
-.^

/""*!? "f A
Inactiva

Inactiva

Fosfatas a
CH,OPOf O

Activa

O
Glucosa
O
Torrente sanguneo

i)
Glucosa 1 -fosfato Glucgeno

Glucosa 6-fosfato

FIGURA 15-6. Respuesta de una clula heptica a glucagon o epinefrina. Etapas de la respuesta al estmulo hormonal que conducen a la movilizacin de la glucosa, segn se describe en el texto. Muchos de los pasos de la reaccin en cascada se acompaan de una amplificacin espectacular de la seal. Los pasos que conducen a [a amplificacin se indican por flechas azules.

Membrana plasmtica

DNA (paso 10) que contienen una secuencia particular de nucletidos (TGACGTCA) conocida como amplificador regulado de AMPc (ARA). De la pgina 518, recordemos que los amplificadores son sitios en el DNA donde los factores de transcripcin enlazados actan para incrementar la velocidad de inicio de la transcripcin. Se cree que los factores de transcripcin enlazados a los amplificadores actan al enlazarse a las protenas presentes en el complejo preinicial cerca del sitio de comienzo (fig. 12-36). Los amplificadores regulados de AMPc se localizan especficamente en regiones reguladoras del DNA que controlan la expresin de genes que desempean un papel en la respuesta al AMPc. En las clulas del hgado, por ejemplo, varias de las enzimas que participan en la gluconeognesis, va por la cual se forma la glucosa a partir de los intermediarios de la gluclisis (fig. 3-29), son codificadas por genes que contienen ARA cercanos. Por lo tanto, epinefrina y glucagon no slo activan enzimas catablicas participantes en el desdoblamiento de glucgeno, sino tambin conducen a la sntesis de enzimas anablicas necesarias para formar glucosa a partir de precursores ms pequeos. Como sera de esperar, debe haber un mecanismo para revertir los pasos mostrados en la figura 15-6; de otra manera, la clula permanecera en estado activado a partir de ese

momento. Las clulas hepticas contienen varias fosfatasas que catalizan la eliminacin de los grupos fosfato aadidos por las cinasas. La ms importante de estas enzimas, la fosfatasa-1, puede eliminar fosfatos de todas las enzimas fosforilables de la figura 15-6: fosforilasa cinasa, glucgeno sintasa y fosforilasa. Otra ventaja de una reaccin en cascada, adems de la amplificacin, es que cada una de las enzimas a lo largo de la cadena, sea cinasa o f osfatasa, es un sitio potencial donde la clula puede regular la respuesta celular. Por ejemplo, Ja tasa de actividad de fosfatasa-1 es controlada por una protena denominada nhibidor-1, que tambin sufre un ciclo de activacin y desactivacin por fosforilacin y desfosforilacin, respectivamente (fig. 15-7). La fosforilacin del inhibidor-1 es catalizada por la proteincinasa A, la misma cinasa dependiente de AMPc mencionada anteriormente. La activacin de esta cinasa asegura que cuando los niveles de AMPc se elevan, la fosfatasa-1 se inhibe. Sin embargo, tan pronto como desciende la concentracin de AMPc, el inhibidor se desfosforila y por lo tanto activa a la fosfatasa-1, que elimina el fosfato de la fosforilasa y detiene la descomposicin adicional de glucgeno. El AMPc se produce en muchas clulas diferentes en respuesta a una gran variedad de ligandos diferentes (es

CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre las clulas y su ambiente Hormona

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AMPc Forma inactiva del inhibidor-1

Forma activa del inhibidor-1

Incremento del *
nivel de fosforilacin de protena }

Disminucin del nivel de fosforilacin de protena FIGURA 15-7. Papel como fosforilador y desfosforilador del inhibidor-1 en la accin hormonal. La formacin de AMPc y la activacin subsecuente de la proteincinasa dependiente de AMPc (PKA) provoca: 1) aumento del nivel de la fosforilacin de protena y 2) fosforilacin y activacin del inhbidor-l, que a su vez provoca inactivacin de la fosfatasa-1, por lo que mantiene as el mayor nivel de fosforilacin de protena. Un descenso en la sntesis de AMPc conduce a la inversin de este estado.

decir, primeros mensajeros). En el cuadro 15-1 se presentan algunas respuestas mediadas por AMPc en clulas de mamferos. En invertebrados tambin se emplea el AMPc como segundo mensajero, segn se ilustra por la elevacin espectacular de la concentracin de AMPc que ocurre en ciertas clulas nerviosas de la liebre marina en respuesta al neurotransmisor serotonina (fig. 15-8). Puesto que el AMPc ejerce su efecto por activacin de PKA, el curso de los acontecimientos que ocurren en una clula dada en respuesta al AMPc ser determinado por las protenas especficas fosforiladas por dicha enzima (fig. 15-9 y cuadro 15-2). Aunque la activacin del PKA en una clula heptica en respuesta a la epinefrina produce descomposicin de glucgeno, la activacin de esta enzima en una clula del tbulo renal en respuesta a vasopresina provoca reduccin de la permeabilidad de la membrana al agua, y en las clulas tiroideas en respuesta a TSH provoca la secrecin de hormona tiroidea. La misma hormona tambin puede producir respuestas muy diferentes en distintas clulas, aun cuando se enlace al mismo receptor. Por ejemplo, la epinefrina se enlaza a un receptor /?-adrenrgico similar en las clulas hepticas, clulas adiposas y clulas del msculo liso del intestino, provocando la sntesis de AMPc en los tres tipos de clulas. Sin embargo, las respuestas son muy diferentes: en la clula heptica se desintegra glucgeno, en las clulas adiposas se desintegran tracilgliceroles, y las clulas del msculo Us se relajan. En todos los casos citados antes, la produccin de AMPc contina slo si se mantiene alta la concentracin del mensajero primario en el espacio extracelular. Cuando la concentracin desciende y estas molculas se disocian de los receptores de membrana de las clulas blanco, se desactiva la adenililciclasa y la sntesis de AMPc desciende de manera aguda (segn se ilustra en la ultima fotografa de la secuencia en la figura 15-8). Las molculas de AMPc ya presentes en el citoplasma se degradan por accin de una enzima, la fosfodiesterasa de nucletido cclica, que concluye la respuesta.

CUADRO 15-1. Ejemplos de respuestas inducidas por hormonas mediadas por AMPc Tejido Hgado Hormona Epinefrina y glucagon Respuesta Hidrlisis de glucgeno, sntesis de glucosa (gluconeognesis), inhibicin de la sntesis de glucgeno Hidrlisis de glucgeno, inhibicin de la sntesis de glucgeno Incremento de la contractilidad Catabolismo del triacilglicerol Incremento de la permeabilidad de las clulas epiteliales al agua Secrecin de hormona tiroidea Incremento de la resorcin de calcio Incremento de la secrecin de hormonas esteroides Incremento de a secrecin de glucocorticoide

Msculo esqueltico Msculo cardiaco Adiposo Renal Tiroideo Hueso Ovario Corteza suprarrenal

Epinefrina Epinefrina Epinefrina, ACTH y glucagon Vasopresina (ADH)

TSH Hormona paratiroidea LH

ACTH

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CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre las clulas y su ambiente

FIGUliA 15-8. Demostracin experimental de la sntesis de AMPc en respuesta a estimulacin especfica. Esta serie de fotografas muestran una clula nerviosa sensorial de la liebre marina Aplysia. La concentracin de AMPc libre (indicada en /M por la barra de color en el lado derecho de la ilustracin) se midi por mcroinyeccin de una molcula fluorescente cuyo espectro de emisin es sensible a la concentracin de AMPc. La imagen superior izquierda muestra la concentracin intracelular de AMPc en la neurona no estimulada, y las siguientes cuatro imgenes muestran los efectos de la estimulacin por el neurotransmisor serotonina (5-hidroxitriptamina) en los tiempos indicados. Cuando las clulas se lavan para liberarlas de serotonina, la concentracin de AMPc retorna a las cifras presentes cuando no hay estimulacin. (Reimpreso con permiso de Bran }. Backsai y cois., Science 260:223, 7993; copyright 1993 American Association for the Advancement of Science.)

Estructura y funcin de receptores acoplados a protena G El glucagon es una pequea protena de 29 aminocidos; la epinefrina es una pequea amina hdrfila
H H C-CH2-N-H

cin, una protena G heterotrimrica (fig. 15-10), cuyo descubrimiento y caracterizacin se analizan en La va experimental, al final del captulo. Estas protenas se conocen como protenas G porque se enlazan al nucletido de guanina, sea GDP o GTP. Se describen como heterotrimricas porque

Membrana plasmtica (transporte)

OH

XCH3

Microtbulos (ensamblado/ ^ desensamblado)

sintetizada a partir del aminocido rosina. Estas dos molculas prcticamente no tienen nada en comn desde el punto de vista estructural, pero ambas activan al mismo efector (adenililciclasa), que conduce a la sntesis de AMPc y la subsecuente fosforilacin de la fosforilasa. La similitud de la respuesta al enlace de estas dos hormonas se puede atribuir a la semejanza de sus mecanismos de accin. Los receptores de estos dos ligandos muy diferentes son miembros de la misma familia de protenas integrales de membrana, caracterizadas por siete hlices a que atraviesan la membrana (fig. 15-10). Los segmentos transmembrana estn conectados entre s por asas extracelulares cortas sobre la superficie externa de la membrana, y asas intracelulares cortas sobre la superficie interna de la misma. Los dos receptores difieren entre s sobre todo en la estructura de la bolsa que se enlaza al ligando sobre la superficie extracelular del receptor, que es especfica para una u otra hormona. No slo los dos receptores son muy similares en cuanto a estructura; tambin lo son las protenas que transmiten la seal del receptor enlazado al ligando al efector de adenililciclasa. La transmisin de la seal del receptor al efector se logra mediante un tercer elemento del sistema de transduc-

\o

Lipasa de triglicridc (sntesis de lpidos Glucgeno sintasa (sntesis de glucgeno) Fosforilase cinasa

endoplsmico (sntesis de Cinasa\)

Fosforilasa (desintegracin del glucgeno] Ncleo (sntesis de DNA, diferenciacin, sntesis de RNA)

FIGURA 15-'. Ilustracin esquemtica de los diferentes procesos que se pueden afectar por los cambios de concentracin del AMPc. Todos estos efectos son mediados por la activacin de una o varias proteincinasas.

CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre las clulas y su ambiente CUADRO 15-2. Muestra de sustratos PKA conocidos Glucgeno sintasa muscular (la). Fosforilasa cinasa a Proteinfosfatasa-1 Piruvatocinasa CREE Tirosina hidroxilasa heptica Receptor 6 de acetilcolina Inhibidor-1 de la proteinfosfatasa Protena ribosmica S6 Troponina de corazn de conejo Hormona sensible a lipasa Fosfofructocinasa Miosincinasa de cadena ligera Fructosa bisfosfatasa Fosforilasa cinasa /3 Sintasa de glucgeno muscular Acetil CoA carboxilasa FUENTE: D.A. Walsh y S.M. van Patten, FASEB /. 8:1234, 1994.

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y adelante entre dos estados que dependen de las condiciones prevalecientes. La conexin funcional entre un receptor transmembrana de siete hlices y una protena G heterotrimrica parece ser un mecanismo universal mediante el cual un estmulo extracelular inicia la movilizacin de un segundo mensajero en clulas eucariotas. Se han identificado ms de 100 diferentes receptores acoplados a protena G en organismos que van desde levaduras hasta plantas y animales evolutivamente elevadas. Estos receptores responden a una variada disposicin de hormonas, neurotransmsores, f eromonas (sustancias qumicas transmitidas de un miembro a otro de una especie), odorantes (molculas detectadas por receptores olfatorios que despiertan el sentido del olfato), y fotones (los receptores de la retina que detectan la luz son miembros de esta misma familia de molculas receptoras). En el cuadro 15-3 se presenta una lista de algunos ligandos que operan por medio de esta va y los efectores a travs de los cuales actan. En todos los casos examinados hasta la fecha, la estimulacin de receptores acoplados a protenas G sigue una secuencia similar de elementos, segn se indica en la figura 15-11 y se describe a continuacin. 1. Activacin de la protena G por el receptor. El enlace de los ligandos a su receptor especfico provoca un cambio de conformacin del receptor que aumenta su actividad por la protena G. Esta es la nica funcin del ligando extracelular. Como resultado del cambio de conformacin, el receptor enlazado al ligando se enlaza a la protena G sobre la superficie interna de la membrana formando un complejo de protena G-receptor (paso 1, fig. 15-11). La interaccin entre el receptor y la protena G es mediada por varias asas intracelulares en la superficie interna del receptor. La interaccin con el receptor provoca que la subunidad a de la protena G libere su GDP enlazado y se enlace a un sustituto de GTP (paso 2), que cambia a la protena G para llevarla a su estado activo (fig. 15-12). Mientras se encuentre en su estado activado, un solo receptor puede activar a varias molculas sucesivas de protena G, lo que suministra el primer paso en la amplificacin de la va. 2., Transmisin de la seal de la protena G al efector. El intercambio de nucletidos de guanina modifica la conformacin de la subunidad Ga, lo que provoca su disociacin del receptor y de las otras dos subunidades de la protena G, las cuales permanecen juntas como un complejo G^ (paso 3, fig. 15-11). Cada subunidad Ga disociada (con su GTP fijo) est libre para activar una molcula efectora, como la adenililciclasa, que pone en operacin al sistema del segundo mensajero (paso 4).1 En tanto el complejo Ga-GTP permanezca enlazado a una molcula de adenililciclasa (de ordinario en cuestin de segundos), la enzima contina produciendo

todas ellas constan de tres subunidades distintas de polipptido, denominadas a,$jy. Esta propiedad las distingue de otro tipo de protena G que estudiaremos ms adelante en este captulo y que consta de una sola subunidad. Cada protena G puede existir en dos estados: un estado activo en el cual la subunidad a de la protena G se enlaza a una molcula de GTP o un estado inactivo en el cual la subunidad a se enlaza a una molcula de GDP. Como veremos en breve, las protenas heterotrimricas G alternan hacia atrs

Ligando Receptor |
N.H2

Protena G FIGURA 15-10. Mecanismo enlazado a la membrana para la transduccin de seales por medio de un receptor transmembrana de siete hlices y la protena G heterotrimrica. Los receptores de este tipo, incluyendo los que se enlazan a epinefrina y glucagon, contienen siete hlices que atraviesan la membrana. Cuando se enlaza a su ligando, el receptor interacta con una protena G trimrica que a su vez sirve para activar a un efector, como la adenililciclasa.

1 Se conocen ejemplos en los cuales la subunidad a de la protena G inhibe la actividad del efector en vez de estimularla, pero estos casos no sern analizados.

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CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre las clulas y su ambiente CUADRO 15-3. Ejemplo de procesos fisiolgicos mediados por protena G Estmulo Epinefrina Serotonina Luz Complejos IgE-antgeno Pptido f-Met Acetilcolina Receptor Receptor /-adrenrgico Receptor a serotonna Rodopsina Receptor IgE de clulas cebadas Receptor quimiotctico Receptor muscarnico Efector Adenilil ciclasa Adeniiil ciclasa Fosfodiesterasa GMPc Fosfolipasa C Fosfolipasa C Canal de potasio Respuesta fisiolgica Desdoblamiento de glucgeno Conducta de sensibilizacin y aprendizaje en Aplisia Excitacin visual Secrecin Quimiotaxia Enlentecimiento de la actividad de marcapaso

Adaptado de L. Srryery H.R. Bourne, reproducido con permiso de Tlie Annual Reviews ofCell Biology, vol. 2, 1986 por Annual Reviews Inc.

molculas de AMPc (paso 5). Se cree que la subunidad formada por el complejo G^y acta independientemente de Ga activando otros efectores subsecuentes, y suministrando una va para transmitir seales adicionales hacia una clula especfica. 3. Las seales se retroalimentan a travs de la membrana. En algunos casos cuando menos, la disociacin de la subunidad Ga del receptor modifica la conformacin del mismo de modo que pierde su afinidad por el ligando, el cual se disocia de su sitio de enlace. Por lo tanto, el receptor no slo transmite una seal al interior del ligando de la protena G, sino que tambin recibe una seal que pasa hacia afuera de la protena G activada. 4. Fin de la respuesta. La subunidad Ga disociada tiene su propia actividad cataltica; acta como GTPasa, que hidroliza la GTP enlazada formando GDP enlazada (paso 6, fig. 15-11). Puesto que la hidrlisis del GTP suprime la capacidad de la subunidad para activar molculas efectoras adicionales, la subunidad a es por lo tanto capaz de inactivarse a s misma. Una vez que la GTP se hidroliza, el complejo Ga-GDP puede reasociarse a las subunidades G/y para reconstituir el complejo trimrico y retornar el sistema al estado de reposo (paso 7). La toxina del clera (producida por la bacteria Vibrio cholerae) ejerce su efecto modificando la subunidad Ga e inhibiendo su actividad GTPasa en las clulas del epitelio intestinal. Como resultado, las molculas de adenililciclasa permanecen en la modalidad activada, batiendo el AMPc, lo que provoca la secrecin de grandes volmenes de lquido intestinal al interior de la luz del intestino. La prdida de agua relacionada con esta respuesta inapropiada casi siempre provoca la muerte a causa de deshidratacin. En La perspectiva humana de este captulo se analizan los efectos de ciertas mutaciones en la funcin de receptores acoplados a protena G.
Especificidad de las respuestas acopladas a protena G

Es evidente que una gran variedad de agentes, incluyendo hormonas, neurotransmisores y estmulos sensoriales, pueden usar mecanismos similares para transmitir informacin

a travs de la membrana plasmtica y desencadenar una gran diversidad de respuestas celulares. Por ejemplo, el AMP cclico puede producir respuestas totalmente diferentes en distintas clulas debido a que este segundo mensajero activa una proteincinasa capaz de fosforilar varios conjuntos de protenas presentes en distintos tipos de clulas. Tambin puede haber considerable especificidad en el "extremo delantero" de la va respecto de diferentes receptores y protenas G. Puede haber un receptor para un ligando determinado en diferentes versiones (soformas) que se cree tienen distinta afinidad con el ligando y tambin afinidad diversa para una protena G particular. Por ejemplo, los investigadores han identificado nueve isoformas del receptor adrenrgico (el receptor que enlaza epinefrina) y 15 isoformas del receptor para serotonina, un neurotransmisor potente liberado por las clulas nerviosas en determinadas porciones del cerebro que gobiernan las emociones. Las isoformas de un receptor pueden coexistir en la misma membrana plasmtica o a veces aparecen en las membranas de diferentes tipos de clulas especficas. Las protenas G heterotrimricas que transmiten seales de receptor a efector tambin pueden existir en mltiples formas. Cuando menos se han identificado 20 subunidades Ga, cinco subunidades G^ y siete subunidades Gy diferentes. Se supone que diversas combinaciones de subunidades especficas sirven para construir protenas G que muestran diferentes propiedades en sus reacciones, tanto con receptores como con efectores. Se puede demostrar, por ejemplo, que un solo receptor puede activar rns de una va de seales en la misma clula. El receptor /3-adrenrgico, por ejemplo, puede activar adenililciclasa y estimular la abertura de canales de Ca2+, lo que conduce a un estado fisiolgico en el cual se pueden producir respuestas por AMPc y Ca2+ activados. Como se mencion en la nota al pie de la pgina 635, algunas protenas G actan inhibiendo a sus efectores. Que una protena G sea estimuladora (protena Gs) o inhibidora (protena G) depende de la naturaleza de la subunidad alfa. El mismo estmulo puede activar una protena G en una clula y una protena Gs en otra clula. Por ejemplo, cuando la epinefrina se enlaza a un receptor /-adrenrgico sobre una clula heptica, activa una protena Gs, que est-

CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre as clulas y su ambiente -Ligando

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FIGURA 15-11. Mecanismo de activacin (o inhibicin) mediado por receptor de los efectores a travs de protenas G heterotrimricas. En el paso 1, el ligando se enlaza al receptor alterando su conformacin e incrementando su afinidad por la protena G a la cual se enlaza. En el paso 2, la subunidad G intercambia GDP por GTP. En el paso 3, la subunidad G(, se disocia del complejo G^y. En el paso 4, la subunidad Ga se enlaza a! efector {en este caso, la adenililciclasa) activando el efector. En el paso 5, la adenlilciclasa produce AMPc. En el paso 6, la actividad GTPasa de Ga hidroliza el GTP enlazado, desactivando a Ga. En el paso 7, Ga se vuelve a asociar a G^, reconstituyendo la protena G trimrica, y el efector cesa su actividad.

mua la produccin de AMPc. Por lo contrario, cuando la epinefrina se enlaza a un receptor c-adrenrgico sobre una clula de msculo liso, se activa una protena G que inhibe la produccin de AMPc. Otros segundos mensajeros El AMPc fue el primer segundo mensajero que se descubri, y todava se estn descubriendo las respuestas que desencadena. Algunas otras vas para transduccin de seales pueden ser activadas por receptores acoplados a protena G. En las siguientes secciones exploraremos unos pocos ejemplos. Fosfatidilinositol derivado de segundos mensajeros Cuando el neurotransmisor acetilcolina se enlaza a superficies de una clula de msculo liso que reviste un vaso sanguneo, estimula a dicha clula muscular a contraerse estrechando el dimetro del vaso. Cuando un antgeno extrao se enlaza a la superficie de una clula cebada, estimula a la clula a secretar histamina, una sustancia que puede desen-

GDP

FIGURA 15-12. Modelo para el cambio de conformacin de una protena G que estimula el intercambio GDP-GTP. En este modelo, el enlace del receptor a la subunidad a tic la protena G afloja la red solidaria de enlaces hidrgeno (crculos amarillos), provocando que el dominio helicoidal (verde) gire alejndose del sitio de enlace del nucletido guanina y permitiendo el libre intercambio de GDP por GTP. (Segn H.R. Bourne, reimpreso con permiso de Nature vol. 366, p, 628, 1993, copyright 1993, MacmiHan Magazines Limited.)

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CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre ias clulas y su ambiente

LA PERSPECTIVA

HUMANA

Trastornos relacionados con receptores acoplados a protena G

Algunos de los mensajeros qumicos ms importantes del cuerpo, como epinefrina, hormona adrenocorticotrpica (ACTH) y las gonadotropinas, hacen sentir su presencia en el cuerpo al enlazarse a receptores que transmiten seales por medio de protenas G heterotrimricas. Algunos de los componentes en la va de sealamiento, como el propio receptor, slo participan en la respuesta a esta hormona particular, en tanto que otros componentes de la cadena, como la adenilciclasa, tal vez participen en las respuestas de clulas a muchos diferentes estmulos extracelulares. Por consiguiente, las mutaciones que afectan gravemente la actividad de las protenas, como la adenililciclasa, sera de esperar que sus efectos se propaguen ampliamente sobre las funciones corporales, efectos que pueden producir la muerte durante el desarrollo embrionario fetal. Por lo contrario/ las mutaciones que producen receptores defectuosos causaran trastornos con una gama ms estrecha de anomalas. En los ltimos aos, algunas enfermedades hereditarias se han atribuido a defectos en receptores de la superficie celular (fig. PH15-1) o def ectos en sus protenas G (cuadro PH 15-1). La diabetes inspida nefrgena congnita (DINC) es una rara enfermedad hereditaria en la cual los lactantes sufren deshidratacin grave como resultado de la incapacidad de sus riones para producir orina concentrada. Si no se diagnostica oportunamente, la deshidratacin crnica puede producir retraso mental, desarrollo inadecuado e incluso la muerte. La enfermedad se debe a la incapacidad de las clulas del rion para responder a la hormona vasopresina (hormona antidiurtica). Numerosos estudios en lactantes con esta enfermedad indican que se puede originar a partir de anomalas en los receptores de vasopresina. En la mayor parte de estos casos, el polipptido es anormalmente corto como resultado de una mutacin que introduce un codn para detener la sntesis de polipptido en el RNAm provocando la terminacin prematura de dicha sntesis (pg. 475). Una de las mutaciones estudiadas provoca cambio de un aminocidos situado en la unin entre el tercer segmento transmembrana y la segunda asa intracelular del receptor de siete hlices (sitio 4, fig. PH 15-1). Aunque este receptor todava puede enlazarse a la vasopresina en la superficie externa, la superficie interna del receptor es incapaz de activar la protena G y por lo tanto no puede pasar la seal hacia el efector. Una mutacin que provoca prcticamente el efecto opuesto sobre la interaccin entre receptor y protena G causa un tumor tiroideo benigno llamado adenoma. A diferencia de las clulas normales de tiroides que secretan hormona tiroidea slo en respuesta a la estimulacin por la hormona hipofisaria TSH, las clulas de estos adenomas tiroideos secretan grandes cantidades de hormona tiroidea sin ser estimuladas por TSH (se dice que el receptor acta constitutivamente). Los estudios indican que en el receptor de TSH de estas clulas hay sustitucin

NHc

Extra celular

COOH FIGURA PH 15-1. Representacin bidimensional de siete receptores transmembrana "compuestos" que muestran los sitios aproximados de varias mutaciones causantes de enfermedades humanas. La mayor parte de las mutaciones (nmeros 1, 2, 5, 6, 7 y 8) dan como resultado la estimulacin constitutiva del efector, pero otras (3 y 4) bloquean la capacidad del receptor para estimular el efector. Las mutaciones en los sitios 1 y 2 se observan en el receptor de MSH (hormona estimuladora de melanoctos), sitio 3 en el receptor de ACTH, sitio 4 en el receptor de vasopresina, 5 y 6 en el receptor de TSH (hormona estimuladora de tiroides), 7 en el receptor de LH (hormona luteinizante) y 8 en la rodopsina, el pigmento fotosensible de la retina.

CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre las clulas y su ambiente

639

de aminocidos que afectan la estructura de la tercera asa de la protena (fig. PH 15-1, mutaciones en el sitio 5 o 6). Como resultado de la mutacin, el receptor de TSH activa constitutivamente una protena G en su superficie interna y enva una seal continua a travs de la va que no slo provoca secrecin excesiva de hormona tiroidea, sino tambin crecimiento y divisin excesiva de la clula que causa el tumor. Esta conclusin se comprob introduciendo el gen mutante en clulas cultivadas que normalmente carecen de este receptor y demostrando que la sntesis de la protena mutante y su incorporacin a la membrana plasmtica conduce a la produccin continua de AMPc en clulas manipuladas genticamente. La mutacin que provoca los adenomas tiroideos no se observa en la

porcin normal de la glndula tiroides del paciente, sino slo en el sitio tumoral, lo que indica que la mutacin no es hereditaria sino que se origin en alguna clula tiroidea, la cual prolifera para dar lugar al tumor. Una mutacin en una clula del cuerpo, como una clula tiroidea, se denomina mutacin somtica, para distinguirla de una mutacin hereditaria que ocurre en todas las clulas individuales. Como veremos en el captulo 16, las mutaciones somticas son causa primaria de cncer humano. En el cuadro PH 15-1 se hace notar que las mutaciones en genes que codifican las subunidades de las protenas G heterotrimricas tambin pueden conducir a trastornos hereditarios, como se ilustra en un trabajo recientemente publicado acerca de dos pacientes varones afectados de una combinacin rara

CUADRO PH 15-1. Enfermedades humanas vinculadas con la va de la protena G

Enfermedad Protena G defectuosa"

Osteodistrofia hereditaria de Albright y seudohipoparatiroidismo Sndrome de McCune-Albright Tumores hpofisarios y tiroideos (encogen gsp) Tumores ovricos adrenocorticales {oncogen gip) Pubertad precoz mixta y seudohipoparatiroidismo
Enfermedad Receptor de protena C defectuoso

Hipercalcemia hipocalcirica familiar Hiperparatiroidismo grave neonatal Hipertiroidismo (adenoma tiroideo) Pubertad precoz masculina familiar Diabetes nefrgena inspida vinculada al cromosoma X Retinitis pigmentaria Ceguera a los colores, variaciones en la sensibilidad al espectro de luz Deficiencia familiar de glucocorticoides y deficiencia aisiada de glucocorticoides

Receptor humano anlogo de BoPCARl Receptor humano anlogo de BoPCARl (homocigoto) Receptor de tirotropina Receptor de hormona luteinizante (LH) Receptor de vasopresina V2 Receptor de rodopsina Receptor de opsina fusiforme Receptor de hormona adrenocorticotrpica (ACTH)

* Segn se describe en el texto, una protena G con G^ acta para estimular el efector, en tanto que una protena G con una G\ inhibe al efector. FUENTE: D.E. Clapham, reimpreso con permiso de Nature, vol. 371, p. 109, 1994. Copyright 1994 por Macmillan Magazines Limited.

de enfermedad endocrina: pubertad precoz e hipoparatiroidismo. Se observ que ambos pacientes tienen una sola sustitucin de un aminocido en una de las isoformas Ga. La alteracin en la secuencia de aminocidos caus dos efectos en la protena G de la cual forman parte. A temperaturas por debajo de la temperatura normal del cuerpo, la protena G mutante permaneci en estado activo, aun en ausencia de un ligando enlazado. En contraste, a la temperatura normal del cuerpo, la protena G mutante se mostr inactiva, tanto en presencia como en ausencia de un ligando enlazado. Los testculos, que se encuentran alojados fuera del centro del cuerpo, tienen temperatura menor que los rganos viscerales del cuerpo (33C en comparacin a 37C). En condiciones normales, las clulas endocrinas de los testculos inician la produccin de testosterona en el momento de la pubertad como respuesta a la hormona'hipofisaria LH, que se comienza a producir en ese momento. La LH circulante se enlaza a los receptores LH situados en la superficie de las clulas testiculares, y desencadena la sntesis de AMPc y la produccin subsecuente de la hormona sexual masculina. Las clulas testiculares del paciente portadoras de la mutacin de la protena G fueron estimuladas para sintetizar AMPc en ausencia del ligando LH, provocando la sntesis prematura de testosterona y pubertad precoz. En contraste, la mutacin en la subunidad Ga de las clulas de las glndulas paratiroides, que funcionan a una temperatura de 37C, inactivo a la protena G. Como resultado, las clulas de la glndula paratiroides no respondieron a los estmulos que normalmente causaran la secrecin de hormona paratiroidea, lo que condujo a la enfermedad hipoparatiroidismo. El hecho de que la mayor parte de los rganos del cuerpo funcionan de manera normal sugiere que esta subunidad Ga particular no es esencial en la actividad de la mayor parte de las otras clulas.

640

CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre las clulas y su ambiente

cadenar los sntomas de un ataque de alergia. Ambas respuestas, una que produce secrecin y la otra contraccin, son desencadenadas por el mismo mensajero celular, una sustancia derivada del compuesto fosfatidilinositol. Recordemos del captulo 4 que el fosfatidilinositol (PI) es uno de los componentes menores de la membrana celular (fig. 4-22). El fosfatidilinositol no slo es un componente estructural de la bicapa de lpidos, sino tambin es precursor de algunas molculas reguladoras claves cuyas estructuras se muestran en la figura 15-13. La adicin de un solo grupo fosfato al inositol del azcar de PI genera PI 4-fosfato (PIP), que se puede fosforilar una segunda vez para formar PI 4,5-difosfato (PIPz) (pasos 1 y 2, fig. 15-13). Cuando la acetilcolina se enlaza a una clula de msculo liso o un antgeno se enlaza a una clula cebada, el receptor enlazado activa una protena G heterotrimrica (paso 3), que a su vez activa al receptor fosfolipasa C, el cual (igual que la adenililciclasa) se sita en la superficie interna de la membrana (fig. 15-13).2 La fosfolipasa C es una enzima que cataliza una reaccin para separar PI?2 en dos molculas, inositol 1,4,5-trfosfato (IP^) y diacilglicerol (DAG) (paso 4); ambas reacciones desempean papeles importantes como segundos mensajeros en las seales celulares. Examinaremos cada uno de estos segundos mensajeros por separado.

2 La fosfolipasa C activada por las protenas G se identifica como PLQ3, para distinguirla de una isoforma llamada PLCy, activada por un receptor de tirosincinasa (pg. 672). Ambas formas catalizan la misma reaccin pero muestran diferentes propiedades.

Diacilglicerol (DAG). El diacilglicerol (fig. 15-13) es una molcula lpida que permanece en la membrana plasmtica despus de ser sintetizada por fosfolipasa C. All activa a un efector, llamado proteincinasa C (fig. 15-14), que fosforila residuos de serina y treonina sobre las protenas especficas. La proteincinasa C es en realidad miembro de una familia de enzimas relacionadas, algunas de las cuales son activadas slo por segundos mensajeros lpidos, como el DAG, en tanto que otras requieren la presencia simultnea de iones Ca2+ (de all la C en el nombre de la enzima) como coactivador. Igual que la proteincinasa A (la enzima activada por el AMPc), la proteincinasa C es una cinasa multifuncional, y serina y treonina son capaces de fosforilar a una gran variedad de protenas. La proteincinasa C tiene varios papeles importantes en el crecimiento y diferenciacin celular, el metabolismo celular y la activacin de transcripcin, la mayor parte de las cuales todava no son bien comprendidas (cuadro 15-4). En clulas hepticas, la proteincinasa C acta de manera sinrgica con la proteincinasa A; ambas cinasas fosforilan la glucgeno sintasa inhibiendo la actividad de esta enzima polimerizadora de glucosa. En mioblastos, o sea, clulas embrionarias que darn lugar a clulas musculares, la activacin de la proteincinasa C conduce a la fosforilacin de la protena miogenina, factor de transcripcin que desempea un papel clave en la diferenciacin de la clula muscular (fig. 12-41). La fosforilacin de miogenina inhibe su capacidad para enlazarse a DNA, y por lo tanto impide la diferenciacin de las clulas en fibras musculares. La aparente importancia de la proteincinasa C en el control del crecimiento se observa en estudios con un grupo de compuestos potentes de plantas llamados esteres deforbol.

Ligando

DAG

F1GUKA 15-13. Generacin de segundos mensajeros como resultado de la desintegracin inducida por ligando del osfatidilinocitol (PI) en la bicapa de lpidos. En los pasos 1 y 2 se aaden grupos osto al osfatidilinocitol (PI) para formar PIPj. Cuando el receptor recibe un estmulo, el receptor enlazado al gando activa una protena G heterotrimrica (paso 3), que activa la enzima fosfolipasa C fPLC), que cataliza la reaccin en la cual PI?2 se separa en diacilglicerol (DAG) y 1,4,5-trifosfato de inositol (1P3) (paso 4}. El 1P3 difunde al interior del citoplasma (paso 5) donde se enlaza a un receptor IPj en la membrana del retculo endoplsmico liso (paso 6), que tambin es un canal de Ca2+. El enlace de IP^ a su receptor conduce a la liberacin de iones calcio dentro del citoplasma (paso 7). En la siguiente figura se muestra la accin de diacilglicerol.

Receptor IP3

RE liso

o o

CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre as clulas y su ambiente

641

Inactiva

Membrana Sustrato

Activa FIGURA 15-14. Modelo de la activacin de una proteincinasa C (PKC). En este modelo, la molcula PKC consta de varios dominios, incluyendo un dominio cataltico (C), un dominio regulador (R), una bolsa para enlazar sustrato (S) que constituye el sitio activo, y un motivo seudosustrato (P) que consta de una parte de la protena que puede adaptarse sobre el sitio activo. En la parte de arriba se muestra la molcula PKC en el estado inactivo, en el cual P se une a S, impidiendo el acceso al verdadero sustrato. Cuando DAG es activado por lpidos, Ca2+ o ambos, la molcula sufre un cambio de conformacin (abajo) que permite el acceso al sustrato del sitio activo de la enzima. (Segn L.V. Dekkery P.J. Parker, Trends in Biochem. Sci. 19:73, 1994.)

tran un fenotipo maligno permanente en cultivo de clulas y son capaces de producir tumores en ratones susceptibles. 1,4,5-trifosfato de inositol (IP3). El 1,4,5-trifosfato de inositol (IPs) es un azcar fosfato, una pequea molcula hidrosoluble capaz de difundir con rapidez. Las molculas I?3 formadas en la membrana difunden hacia el interior del citoplasma (paso 5, fig. 15-13) y se enlazan a un receptor IPa especfico localizado en la superficie del retculo endoplsmico Uso (paso 6, fig. 15-13). En la pgina 281, se hizo notar que el REL es un sitio de almacenamiento de calcio en varias clulas. Su receptor IPs es ms que un receptor; tambin es un canal tetramrico de Ca2+. El enlace de IP3 abre el canal y permite difundir a los iones Ca2+ hacia el citoplasma (paso 7, fig. 15-13). Los iones Ca2+ tambin se pueden considerar como mensajeros celulares, puesto que difunden al citoplasma y se enlazan a diferentes molculas especficas desencadenando respuestas especficas. En los dos ejemplos mencionados antes, tanto la contraccin de una clula de msculo liso como la exocitoss de granulos secretorios que contienen histamina en una clula cebada son desencadenados por concentracin elevada de calcio. Igual es la respuesta de una clula heptica a la hormona vasopresina (la misma hormona con actividad antidiurtica en el rion). La vasopresina se-une a su receptor a nivel de la superficie celular y genera una serie de descargas de liberacin de Ca2+ mediada por IPs, que aparecen como oscilaciones de la concentracin de calcio libre ert el registro mostrado en la figura 15-15. El efecto de IPs de ordinario es transitorio debido a su rpida inactivacin por medio de enzimas. En el cuadro 15-5 se presenta una lista de algunas respuestas mediadas por TP$.
Ms acerca del calcio

Estos compuestos activan la proteincinasa C en varias clulas normales cultivadas, lo que provoca prdida de control del crecimiento y comportamiento transitorio como clulas malignas. Cuando se elimina el ster de forbol del medio, las clulas recuperan sus propiedades de crecimiento normal. En contraste, las clulas manipuladas genticamente para expresar en forma constitutiva la proteincinasa C mues-

CUAURO 1 5-4. Ejemplos de respuesta mediada por proteincinasa C Tejido Plaquetas sanguneas Clulas cebadas Mdula suprarrenal Pncreas Clulas de la hipfisis Tiroides Testculos Neuronas Msculo liso Hgado Tejido adiposo Respuesta Liberacin de serotonina Liberacin de histamina Secrecin de epinefrina Secrecin de insulina Secrecin de GH y LH Secrecin de calcitonina Sntesis de testosterona Liberacin de dopa mina Incremento de la contractilidad Hidrlisis de glucgeno Sntesis de grasa

FUENTE: U. Kikkawa y Y. Nishzuka, reproducido con permiso de Amiital Review ofCell Biology, vol 2, 1986 por Annual Revicws Inc.

Los iones calcio desempean un papel clave en una notable variedad de actividades celulares importantes, incluyendo divisin celular, secrecin, endocitosis, fertilizacin, transmisin sinptica, metabolismo y movimiento celular. Se han desarrollado tcnicas de imgenes computadorizadas que emplean colorantes fluorescentes que se enlazan a calcio para revelar la concentracin de iones libres de calcio en diferentes partes de una clula en distintos momentos. Estas tcnicas suministran imgenes espectaculares de los cambios de concentracin del calcio citoplsmico libre que ocurre en respuesta a diferentes tipos de estmulo. Dependiendo del tipo de clula, un estmulo particular puede inducir oscilaciones en la concentracin de iones libres de calcio, segn se muestra en la figura 15-15, producir una onda de liberacin de Ca2+ que se puede propagar desde un extremo de la clula al otro, o desencadenar liberacin transitoria localizada de Ca2+ en una parte de la clula. La figura 15-16 muestra el espectacular incremento transitorio de la concentracin de iones calcio en ciertas partes de una clula fagocitaria sangunea cuando se pone en contacto con un objeto en su ambiente y se mueve para engullirlo. El incremento de [Ca2+] en el fagocito tal vez refleje su papel en la regulacin de los cambios en la actividad del citoesqueleto necesarios para la fagocitosis. Aunque el ion calcio es muy diferente en estructura a un nucletido cclico o un fosfato de inositol y no es una sustancia sintetizada enzimticamente, comparte una propiedad importante con estos otros mensajeros citoplsmi-

642

CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre las clulas y su ambiente 0.4 nM de vasopresina (a)

600

400

(C)

200

10

20

30

Tiempo (minutos) FIGURA 15-15. Demostracin experimental de cambios en la concentracin de calcio libre en respuesta a la estimulacin hormonal. A una clula heptica se le inyect aecuorina, protena extrada de ciertas medusas que muestran luminiscencia cuando se enlazan a iones calcio. La intensidad de la luminiscencia es proporcional a la concentracin de iones calcio libres. La exposicin de la clula a vasopresina provoca varias ondas de calcio libre a intervalos peridicos. Esta respuesta se obtuvo en una clula expuesta a 0.4 nM de vasopresina, que se encuentra en el extremo inferior del lmite fisiolgico. Esta clula previamente se haba expuesto a 0.2 nM de vasopresina y no hubo respuesta. (Segn NM. Woods, K.S. Cuthbertson y P.H. Cobboid. Reimpreso con permiso de Nature, val 366, p. 628, 1986. Copyright 1986, Macmilan Magazines Limited.)

(e)

5jin FIGURA 15-16. Demostracin experimental de los cambios transitorios en la concentracin de calcio intracelular en un macrfago durante la fagocitosis de una sola esterilla recubierta de IgG. Los macrfagos fueron cargados previamente con un colorante fluorescente sensible a calcio y luego incubados con las esfrulas recubiertas de IgG. a) Se muestra un macrfago en una imagen de campo brillante luego de enlazarse a una sola esfrula, y b) la correspondiente imagen con fluorescencia revela la [Ca2+] en diferentes regiones de la clula. Luego de 66.6 segundos, la esfrula enlazada permanece en el mismo sitio y el mismo foco (c), pero la [Ca2+] se eleva hasta un valor mximo (d); la [Ca2+] retorna posteriormente a un nivel cercano a la basal (/) y las esfrulas se mueven al interior de las clulas. La flecha indica el sitio de la esfrula. (Segn Takashi Hishikawa y cois. ]. Cell Biol. 115:62, 1991; con permiso de Rockefeller University Press.)

eos; a saber, su concentracin en el citoplasma es determinada por acontecimientos que ocurren dentro de una membrana. En circunstancias normales, la concentracin de Ca2+~ se mantiene a niveles muy bajos dentro del citoplasma, tpicamente alrededor de 10~7 M. En contraste, la concentracin de este ion en el espacio extracelular o entre ciertos organelos citoplsmicos, como el REL o las mitocondrias, puede ser

CUADRO 15-5. Resumen de respuestas celulares producidas por adicin de IPs a clulas permeabilizadas o ntegras Tipo de clula Msculo liso vascular Msculo liso del estmago Msculo esqueltico Moho del fango Plaquetas sanguneas Bastoncillos de salamandra Gocitos de Xenopus Huevos de erizo de mar Glndula lagrimal Respuesta Contraccin Contraccin Contraccin Formacin de GMP cclico, polimerizacin de actina Cambio de forma, agregacin Modulacin de la respuesta a la luz Movilizacin de calcio, despolarizacin de la membrana Despolarizacin de la membrana, reaccin cortical Incremento de la corriente de potasio

Adaptado de MJ. Berridge, reproducido con permiso de Annua! Rcview of Biochemistry, vol. 56, 1987 por Annual Reviews Inc.

ms de 10 000 veces mayor. La concentracin citoplsmica de calcio se mantiene muy baja debido a la relativa impermeabilidad de las membranas a este ion y gracias a la presencia en la membrana plasmtica y las membranas celulares de un sistema de transporte que bombea calcio hacia afuera del citoplasma. Muchos estmulos diferentes, que van desde un espermatozoide fertilizante hasta un impulso nervioso que llega a la clula muscular, inducen su respuesta en una clula especfica, lo que provoca un incremento sbito de la concentracin de Ca2+ er el citoplasma. En el cuadro 15-6 se muestran algunos objetivos especficos del [Ca2+] elevado. Algunas de las respuestas inducidas por calcio son mediadas por el segundo mensajero IPs, pero se conocen diversos factores que abren transitoriamente los canales de calcio en el REL o en la membrana plasmtica.

CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre las clulas y su ambiente CUADRO 15-6. Ejemplos de protenas de mamfero desencadenadas por Ca2+
Protena Funcin de a protena

643

Troponina C Calmodulina Calretinina, retinina, vicinina Calcineurina B Calpain PLC especfica de inositol fosfolpido cr-Actinina Anexina Fosfolipasa A2 Proteincinasa C Gelsolina Receptor I?3 Receptor de rianodina Intercambiador de Na+Ca 2+ Ca2+ ATPasa Antiportadores de Ca2+ Caldesmon Vilina Arrestina Calsecuestrina

Modulador de la contraccin muscular Modulador ubicuo de proteincinasas y otras enzimas (MLCK, CaM cinasa I!, adenilciclasa I) Activador de guanililciclasa Fosfatasa Proteasa Generador de IPs y diacilglicerol Protena formadora de haces de actina Implicada en endocitosis y exocitosis, inhibicin de PLA^ canal inico? Productor de cido araquidnico Proteincinasa ubicua Protena seccionadora de actina Efector de liberacin de Ca2+ intracelular Efector de liberacin de Ca2+ intracelular Efector del intercambio de Ca2+ para Na2+ a travs de la membrana plasmtica Bombeo de Ca2+ a travs de las membranas Intercambiador de Ca2+ para iones monovalentes Regulador de la contraccin muscular Organizador de actina Finalizador de la respuesta fotorreceptora Amortiguador Ca2+

Adaptado de D.E. Clapham, CeU. 80:260, 1995, con permiso de Cell Press.

Los receptores lP- pertenecen a uno de dos tipos principales de canales intracelulares para Ca2+; a los otros se les denomina receptores de rianodina porque son sensibles al alcaloide vegetal rianodina. Los receptores de rianodina se observan principalmente en clulas excitables y son mejor estudiados en clulas de msculo esqueltico, donde se encargan de la liberacin de Ca2+ del retculo sarcoplsmico luego de la llegada de un potencial de accin a lo largo del tbulo T (pg. 365). Segn el tipo de clula, una variedad de agentes puede abrir los receptores de rianodina, pero al parecer no por IPs- Entre los agentes que pueden abrir los canales de Ca2+ de rianodina se encuentra el propio calcio. El flujo hacia adentro de una cantidad limitada de calcio a travs de los canales en la membrana plasmtica induce la abertura de los receptores de rianodina en el REL, lo que provoca la liberacin de Ca2+ hacia el citoplasma (fig. 15-17). Este fenmeno, denominado liberacin de calcio inducida por calcio, puede generar con rapidez una onda transitoria de iones calcio que se propaga a travs del citoplasma.
FIGURA 15-17. Liberacin de calcio inducida por calcio, la cual ocurre en clulas excitables como las del msculo cardiaco. Un cambio del voltaje de la membrana provoca la abertura de los canales de calcio gobernados por voltaje en la membrana plasmtica, lo que permite la entrada de una pequea cantidad de Ca2+ (paso 1). Los iones calcio se enlazan al receptor de rianodina en la membrana de! REL (paso 2), provocando la liberacin del calcio almacenado (paso 3). A continuacin los iones calcio se liberan del citoplasma por accin de una bomba de Ca2+ localizada en la membrana del REL (paso 4). (Segn MJ. Berridge, reimpreso con permiso de Nature, vol. 361, p. 317, 1993. Copyright 1993, Macmillan Magazines Limited.)

Canal Ca+ controlado por voltaje

Receptor de rianodina o o

Bomba de Ca2+

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CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre las clulas y su ambiente

La elevacin de la concentracin del ion calcio es transitoria porque los iones rpidamente son bombeados hacia afuera del citoplasma y regresan al REL o al exterior de la clula en el espacio extracelular. Una de las ondas ms espectaculares de Ca2+ ocurre antes del primer minuto, aproximadamente, despus de la fertilizacin y es indicada por el contacto del espermatozoide con la membrana plasmtica del vulo (fig. 15-18). La sbita elevacin de la concentracin de calcio en el citoplasma es un importante factor desencadenante para iniciar procesos del desarrollo embrionario temprano, incluyendo activacin de cinasas dependiente de ciclinas (pg. 583) que impulsan al huevo fertilizado hacia su primera divisin mittica. Se cree que esta onda de calcio se inicia por la sntesis en la superficie interna de la membrana celular de un segundo mensajero denominado ADPRc (ribosa de difosfato de adenosina cclica, figura 15-19, a). Las molculas ADPRc se difunden al citoplasma donde provocan la abertura de los canales de Ca2+ receptores de rianodina en la membrana del retculo endoplsmico Uso. La inyeccin de cantidades muy pequeas de ADPRc a un huevo no fertilizado de erizo de mar puede desencadenar la liberacin de Ca2+ de los almacenes de la membrana (fig. 15-19, b) con activacin completa del vulo. Se ha considerado al ADPRc como un segundo mensajero que abre los canales de Ca2+ de rianodina en una gran variedad de clulas, incluyendo clulas beta pancreticas, donde produce secrecin de la hormona insulina en respuesta a la elevacin de la concentracin de glucosa en sangre. A diferencia de los nucletidos cclicos, cuya accin invariablemente es mediada por estimulacin de una pro-

teincinasa, el calcio puede afectar a diversos tipos de efectores celulares, entre ellos a proteincinasas dependientes de calcio. Segn la clula, la concentracin elevada de calcio puede producir activacin o inhibicin de varias enzimas y sistemas de transporte, cambios en la permeabilidad inica de membranas, fusin de membranas y alteraciones en la funcin contrctil del citoesqueleto. En estado inico libre, el calcio de ordinario no acta sobre estos diferentes efectores, sino que se enlaza a un pequeo nmero de protenas que se enlazan a calcio, que a su vez despiertan la respuesta celular. Slo una de estas protenas que se enlazan a calcio est extensamente distribuida; es la calmodulina, un pequeo polipptido descubierto en tejido cerebral a finales de los aos 1960. Cada molcula de calmodulina (fig. 15-20, a) contiene cuatro sitios de enlace para calcio; el enlace de uno o ms iones Ca2+ modifica la conformacin de la protena incrementando su afinidad por muchas otras protenas. Segn la clula, el complejo calcio-calmodulina puede unirse a una proteincinasa, una nucletido fosfodiesterasa cclica, o incluso al sistema de transporte de calcio de la membrana plasmtica. En este ltimo caso, la concentracin elevada de calcio activa al sistema encargado de desembarazar a la clula de cantidades excesivas de este ion, constituyendo as un mecanismo autorregulador para conservar baja la concentracin de calcio intracelular. La calmodulina se encuentra en todas las plantas, animales y microorganismos eucarotas, y prcticamente tiene la misma secuencia de aminocidos en toda la gama de eucariotes. En la figura 15-20, b, se muestra la distribucin de calmodulina en el ojo compuesto de la mosca de la fruta.

FIGURA 15-18. Onda de calcio en el vulo de una estrella de mar inducida por un espermatozoide fertilizante. Se inyect un colorante fluorescente sensible a calcio en el vulo no fertilizado y en el vulo fertilizado, y se tomaron fotografas cada cinco segundos con un microscopio confocal. La liberacin de Caz+ se propaga desde el punto de entrada del espermatozoide (flecha) a travs de todo el vulo. El color azul indica concentracin baja [Ca2+] libre, en tanto que el color rojo indica concentracin elevada de calcio. (Cortesa de Stephen A. Stricker.)

15 nm

CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre las clulas \j su ambiente

645

ADP-ribosil cJclasa

HO NAD

OH

w
HO

OH

(a)

ADP-rbosa cclica

(b)

FIGURA 15-19. La ADP-ribosa cclica tal vez sea un segundo mensajero para despertar la respuesta de fertilizacin, a) Formacin de ADPRc a partir de NAD + . b) Este huevo de erizo de mar fue cargado previamente con colorante sensible a calcio y luego se le aplic una microinyeccin de una solucin de ADPRc. El cambio de color dentro del huevo refleja elevacin de la concentracin de calcio intracelular desde 100 nM (azul y verde) hasta 900 nM (rojo y amarillo) luego de la inyeccin, (b: Reimpreso con permiso de Antony Galione, Science 259:325, 1993; copyright 1993 American Association for the Aduancement of Science.)

Regulacin de la concentracin de calcio en clulas vegetales Se cree que los iones calcio (que actan junto con la calmodulina) son segundos mensajeros importantes para desen-

C terminal

cadenar respuestas en clulas vegetales. La concentracin de calcio citoplsmico cambia de manera espectacular en ciertas clulas vegetales en respuesta a varios estmulos, incluyendo cambios de la iluminacin, presin, gravedad y la concentracin de hormonas de la planta, como el cido abscsico. La concentracin de Ca2+ en el citoplasma es regulada por la permeabilidad de los canales de Ca2+ localizados en la membrana plasmtica y tambin por la disponibilidad del Ca2+ almacenado en la vacuola. Se cree que la membrana (tonoplasto) que rodea la vacuola posee canales de Ca2+ que, igual que en las clulas animales, son abiertos por molculas de trifosfato de inositol (IPs) producidas por una fosfolipasa C enlazada a la membrana plasmtica. El papel de la concentracin cambiante de Ca2+ citoplsmico se puede observar ms claramente en las clulas de defensa, cuya funcin es regular el dimetro de los poros microscpicos (estomas) a travs de los cuales el C2 atmosfrico alcanza las clulas de las hojas que contienen cloroplastos (fig. 15-21, a). Como se analiza en la pgina 228, los estomas son la va principal para perder agua, y se debe controjar su dimetro de abertura para evitar la desecacin.

.* f

- ' -/^

- --

-1*

FIGURA 15-2D Calmodulina. a) Diagrama de la calmodulina en forma de listn con cuatro iones calcio enlazados, b) El ojo compuesto de Drosophila consta de cientos de fotounidades individuales llamadas ommatidia. Cada ommatidia contiene ocho clulas fotorreceptoras. Seis de las ocho clulas fotorreceptoras se extienden a toda la profundidad de la ommatidia, en tanto que las otras dos ocupan las porciones superior o inferior de una ommatidia; por consiguiente, slo siete clulas fotorreceptoras estn presentes en cualquier seccin transversal determinada (izquierda). La distribucin espacial de la protena calmodulina enlazada a calcio es revelada por inmunofluorescencia (derecha) y se observa que ocupa una parte de cada uno de los fotorreceptores. (b: Reimpreso con permiso de feffrey A. Portcr y cois., cortesa de Craig Montell, Science 262:1039, 1993; copyright 1993 American Association for the Advancement of Science.)

646

CAPITULO 15 Seaks celulares: comunicacin entre las clulas y su ambiente

Clula guardin A
HjO

H?0

Cierre del poro del estoma

HjO

H,0
Membrana plasmtica
ABA

\l de flujo
Canal de flujo hacia adentro de K+ (cerrado)

hacia afuera de K+ (abierto)

Tonoplasto

Vacuola FIGURA 15-21. Papel del calcio como segundo mensajero en el cierre de las clulas guardianes, a) Fotografa de los poros estomquicos, cada uno flanqueado por un par de clulas guardin. Los estomas se conservan abiertos en tanto la presin por turgencia se mantenga elevada entre las clulas guardianes, provocando que sobresalgan hacia afuera, como se observa aqu, b) Uno de los factores que controla el tamao del poro de los estomas es la hormona cido abscsico (ABA). Cuando la concentracin de ABA se eleva, los canales de ion calcio en la membrana plasmtica se abren, permitiendo el ingreso de Ca2+ (paso 1), que desencadena la liberacin de Ca2+ de los almacenes internos (paso 2). La subsecuente elevacin de [Ca2+] intracelular provoca el cierre de los canales de flujo hacia adentro de K+ (paso 3a) y la abertura de Jos canales de flujo hacia afuera de K + (paso 3b), lo que conduce a un descenso de la concentracin interna del soluto y la prdida de agua por osmosis (paso 4). (a: Jeremy Burgess/Photo Researchers.)

Condiciones adversas, como temperaturas altas y escasa humedad, estimulan la liberacin de cido abscsico, que acta sobre las clulas protectoras para incrementar la permeabilidad de los canales de calcio en la membrana plasmtica (fig. 15-21, b). El flujo hacia adentro de Ca2+ desencadena la liberacin de Ca2+ adicional procedente de los almacenes intracelulares que actan para cerrar los canales de ingreso de K+ en la membrana plasmtica, en tanto que abre los canales de salida de K + . Estos cambios inducen flujo neto hacia afuera de iones potasio y disminucin de la presin de lquido (turgencia) dentro de la clula, lo que a su vez disminuye la abertura de los estomas.

15-3 Receptor de tirosincinasas (RTK): un segundo tipo principal de sistemas de seales

Iniciamos el anlisis de la transduccin de seales con el mecanismo de accin de glucagon y epinefrina, dos hormonas que actan para poner la glucosa a disponibilidad de los tejidos. La hormona insulina acta sobre clulas hepticas y musculares para iniciar una serie de reacciones opuestas en

las cuales la glucosa se elimina del torrente sanguneo y se polimeriza para formar glucgeno. Adems de sus efectos sobre la captacin y metabolismo de la glucosa, la insulina tambin es un potente estimulante de la sntesis de lpidos (en las clulas adiposas), sntesis de protenas, as como del crecimiento y proliferacin de las clulas. El mecanismo mediante el cual la insulina estimula estas diferentes respuestas ha eludido los esfuerzos de los investigadores durante muchos aos. Pero en el ltimo decenio se hicieron grandes avances para aclarar el mecanismo mediante el cual interacta la insulina con la superficie externa de clulas especficas e indica su presencia a varios efectores dentro de la clula. La insulina acta por medio de una va de seales diferente en muchos aspectos de la empleada por glucagon y epinefrina.

Mecanismo de accin de la insulina! seales por un RTK

Las clulas capaces de responder a la insulina poseen un receptor para insulina en su superficie, El receptor para insulina es algo ms que una simple protena que se enlaza a un ligando; tambin es una enzima: una proteincinasa de

CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre las clulas y su ambiente

647

tirosina, enzima que aade el grupo fosfato a residuos de tirosina especficos de otras protenas. La tirosincinasa forma parte de una superfamilia distinta de la cinasas de serina y treonina que operan en la reaccin en cascada analizada anteriormente en relacin con la movilizacin de glucosa (fig. 15-6), aunque un pequeo nmero de tirosincinasas poseen una doble especificidad y tambin son capaces de fosforilar residuos de serina y treonina (un ejemplo es la PAMKK de la figura 15-27). Las tirosincinasas participan principalmente en el control del crecimiento y la diferenciacin celular, ms bien que en el control del metabolismo intermediario. Puesto que el receptor para insulina tiene esta actividad enzimtica, se le conoce como receptor de tirosincinasa (o RTK). Se han identificado ms de 50 diferentes RTK y su nmero aumenta con rapidez. A diferencia de los receptores acoplados a protena G, que tienen siete segmentos transmembrana, cada monmero de RTK atraviesa la membrana una sola vez. El receptor de insulina es una protena tetramrica compuesta de dos cadenas de polipptido a y dos cadenas de polipptido/?. Las cadenas a residen en la superficie extracelular de la membrana y contienen los sitios para enlazar insulina, en tanto que las cadenas/ atraviesan la membrana y transmiten la seal a travs de la misma hasta su superficie interna (fig. 15-22). En ausencia de insulina enlazada, la funcin de la tirosincinasa del receptor es inactiva. El enlace de insulina cambia la conformacin del receptor activando su tirosincinasa, la cual entonces aade fosfatos a: 1) residuos especficos de tirosina de la otra subunidad /? del complejo, reaccin llamada autofosforilacin, y 2) una docena o ms de residuos de tirosina localizados estratgicamente en cuando menos dos sustratos de protena llamados sustratos receptores de insulina (SRI) (fig. 15-22). Al parecer, los SRI fosforados slo tienen una funcin, que es la de enlazar y activar a varios efectores "subsecuentes". Para comprender cmo ocurre esto se necesita un parntesis en este momento. El receptor de tirosincinasa no fosforita toda la tirosina en una protena del sustrato; slo fosforila a las que estn presentes en cierta secuencia de aminocidos conocidas como " motivos de f osf otirosina". Estudios recientes han revelado que varias protenas implicadas en las seales celulares contienen dominios, llamados dominios SH2, con sitios de elevada afinidad para enlazarse a "motivos de fosfotirosna" (fig. 15-23).3 Los dominios SH2 presentan afinidad escasa o ausente para protenas cuyos residuos de tirosina no estn fosforilados. Slo despus que una SRI ha sido fosforilada por el receptor de insulina puede actuar como "imn" para enlazar protenas que posean dominios SH2 con estructura apropiada. El enlace a un motivo de fosfotirosina puede tener efectos diferentes, dependiendo de la protena particular que contenga el SH2. La interaccin puede poner en marcha una actividad enzimtica de la protena, cambiar la conformacin de la misma provocando su enlace a otras protenas, o causar la translocacin de la protena a una parte diferente de la clula.

Sitio de enjace
para insulina

FIGURA 15-22. Respuesta del receptor de insulina para enlace de un ligando. El receptor de insulina es un tetrmero que consta de dos subunidades a y dos 5, Cuando la insulina se enlaza a la subunidad a se produce un cambio de conformacin en las subunidades j$, que activa la accin de tirosincinasa de las subunidades /J, lo que a su vez cataliza la transferencia de grupos fosfato hacia residuos de tirosina localizados en el dominio citopismico del receptor y tambin a varios sustratos del receptor de insulina (SRI),

3 Dominio SH2 es un acrnimo de dominio Src de homologa, lo que denota que este dominio que se enlaza a fosfotirosina fue identificado por primera vez en la protena codificada por el oncogen src.

Aunque operan por mecanismos diferentes, hay gran paralelismo entre la protena G y las vas de sealamiento del receptor de tirosincinasa. En las vas de la protena G, los cambios de conformacin de una protena G constituyen el interruptor molecular que transmite la seal al interior de la clula, en tanto que en la va del RTK, la fosforilacin de la tirosina ejecuta una funcin similar. Las protenas con dominios SH2 se pueden considerar los efectores de RTK, as como la adenciclasa o la fosf olipasa C son efectores para los receptores acoplados a protena G. Puesto que diferentes clulas pueden contener distintos efectores con dominios SH2 similares, el mismo ligando puede desencadenar respuestas muy diferentes en diversas clulas especficas. Retornemos a la respuesta de insulina. Una vez activado el receptor de insulina, las protenas SRI fosforiladas sirven como "atracaderos" para numerosas protenas con dominios SH2, cada una de las cuales puede activar una va separada para transmisin de seales (fig. 15-24). Como resultado, el mensaje de que se ha enlazado insulina a la

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CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre las clulas y su ambiente

Seal

Seal

Fosfato FIGURA 15-23. Interaccin entre un dominio SH2 de una protena y un pptido que contiene un residuo de f osf otirosina. Se muestra el dominio SH2 de un corte con la superficie accesible representada por puntos rojos y el esqueleto del polipptido como un listn de color prpura. El heptapptido que contiene fosfotirosina (Pro-Asn-pTirGlu-GIu-Ile-Pro) se muestra como un modelo de espacio lleno cuyas cadenas laterales se presentan en color verde y ?1 esqueleto en color amarillo. El grupo fosfato se muestra en color blanco. El residuo de tirosina fosforilado y el residuo de isoleucina (+3) se proyectan dentro de bolsas sobre la superficie del dominio SH2, creando una interaccin firmemente adaptada, pero slo cuando el residuo de tirosina clave est fosforilado. (Segn Gabriel Wakstnan y cois., cortesa de John Kuriyan, Cell 72:783, 1993; con permiso de Cell Press.)

PK41-P, PI(4,5)-P2

PI(3,4)-P2, PI(3,4,5>-P3

Seal Seal

Seal

superficie de la clula puede propagarse hasta el interior celular a lo largo de varias vas independientes. As, una va puede estimular la sntesis de DNA y la divisin celular, otra el movimiento de transportadores de glucosa hacia la membrana celular donde pueden introducir molculas adicionales de glucosa (pg. 147), otra puede activar factores de transcripcin encargados de expresar un conjunto de genes especficos de insulina, y aun otra va ms puede conducir a la activacin de la sntesis de protenas (pg. 651). Uno de los efectores mejor estudiados con un dominio SH2 que se sabe se enlaza a SRI fosforilado es la enzima fosfatidilinositol 3-hidroxicinasa [o PI(3) K]. La PI(3)K cataliza una reaccin en la cual se aade un grupo fosfato a la posicin 3' del anillo de azcar del fosfatidilinositol (PI). Los productos de la enzima, que incluyen 3,4-dfosfato PI y 3,4,5-trifosfato PI (fig. 15-24), sirven como precursores para algunos mensajeros celulares que contienen inositol con diversas funciones en las clulas. De mayor importancia es que la concentracin de estos PI fosforilados se relaciona estrechamente con los cambios en el estado de crecimiento de las clulas especficas, y se ha demostrado que son parte de la va mediante la cual la insulina puede estimular el crecimiento y la proliferacin celulares. En la siguiente seccin hablaremos an ms de las vas para estimular el crecimiento.

FIGURA 15-2J. Papel de los SRI fosforilados de tirosina para activar varias vas de emisin de seales. Se sabe que la fosforilacin de SRI por el receptor activado de insulina activa las vas PI(3)K, proteincinasa C y Ras, todas analizadas en el captulo. Otras vas menos bien definidas tambin son activadas por sustratos receptores de insulina.

Papel del RTK en otras actividades celulares Una gran variedad de agentes extracelulares interactan como con los RTK sobre la superficie de clulas especficas y regulan diversas funciones, incluyendo crecimiento y proliferacin celulares, curso de la diferenciacin celular, captacin de partculas extraas por fagocitosis, y supervivencia de la clula. Entre estos agentes, los mejor estudiados son hormonas como la insulina y la hormona del crecimiento; factores de crecimiento de origen sanguneo, como el factor de crecimiento epidrmico (FCE), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (FCDP) y el factor de crecimiento de fibroblastos (FCF); y las atocinas, que son agentes secretados por un tipo de clula inmunolgica que induce una respuesta en otro tipo de clula inmunolgica, incluyendo, por ejemplo, interferones (INF) e interleucinas (IL). Todos estos agentes actan por vas para transduccin de seales que se inician con la activacin de un receptor de tirosincinasa.

CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre las clulas y su ambiente

649

A diferencia del receptor de insulina descrito antes, la mayor parte de los RTK se presentan como monmeros en una clula no estimulada. Slo despus que un ligando se une al RTK, los monmeros interactan entre s para formar dmeros (fig. 15-25). La dimerizacin de los polipptidos RTK activa su funcin de tirosincinasa y entonces una subunidad del dmero fosforila algunos residuos de tirosina situados en el dominio citoplsmico de la otra subunidad del dmero. La fosforilacin de grupos RTK pone en movimiento una cadena de reacciones que recuerda la reac-

cin en cascada descrita en relacin con la respuesta de una clula heptica al enlace de glucagon o de epinefrina. Un elemento clave de muchas reacciones RTK en cascada es la protena Ras. Importancia de la protena Ras La protena Ras se descubri originalmente como un oncogen viral, o sea, un gen presente en ciertos virus tumorales que es capaz de malignizar clulas normales. Investigaciones subsecuentes demostraron que, igual que otros oncogenes, ras siempre est presente como parte del genoma normal de animales y del hombre. A principios del decenio de 1980 se observ que el DNA extrado de varios tumores humanos contena una versin mutante de ras. Cuando se introdujo en ciertas clulas cultivadas, se not que esta versin mutada del gen ras transforma las clulas en clulas tumorales malignas, lo que sugiere que las alteraciones en este gen causan en la clula la prdida de control del crecimiento normal. Estudios subsecuentes han demostrado que una versin alterada del gen ras se encuentra en 30 a 40% de todos los tumores humanos. Dada la importancia de este gen en el desarrollo del cncer humano, gran nmero de investigadores han enfocado su atencin a dilucidar el mecanismo de operacin del producto del gen ras, y slo en los ltimos aos se ha logrado este objetivo. Ras es una pequea protena G monmera que reside en la superficie interna de la membrana plasmtica, donde desempea un papel clave en varias vas internas para transmisin de seales. Igual que otras protenas G, Ras muestra ciclos entre una forma inactiva enlazada a GDP y una forma activa enlazada a GTP. En su forma activa Ras estimula efectores situados hacia adelante en la va de transmisin de seales. Como otras protenas G, Ras tiene actividad GTPasa intrnseca que hidroliza la GTP enlazada para formar GDP enlazada, actuado as como interruptor que desactiva la protena.4 Las mutaciones en el gen ras que conducen a la formacin del tumor generalmente son aquellas que evitan que la protena hidrolice la GTP enlazada para retornar a la forma GDP. Como resultado, la versin mutante de Ras permanece en la posicin "activada", enviando un mensaje continuo hacia adelante a lo largo de la va de transmisin de seales que mantienen a la clula en la modalidad proliferativa. Se han descubierto otras versiones, mutantes de Ras que previenen el enlace de GTP y por lo tanto impiden la divisin celular. Se cree que Ras participa en varias vas diferentes para transmisin de seales, actuando quiz como uno de los puntos focales a partir del cual irradian varias vas (fig. 15-31). En su papel mejor estudiado, Ras es un elemento clave dentro de una va que se extiende a travs de la clula desde la superficie externa de la membrana plasmtica hasta el material gentico que reside en el ncleo. Los hecho?, se

-Ligandt

Monmeros inactivos

Dmeros activos

Trans autofosforilacin

.o

Seal de transmisin

Domini SH2

ommio SH2

FIGURA 15-2.i Pasos en la activacin generalizada de un receptor de tirosincinasa (RTK). En el estado no activado los receptores estn presentes en la membrana como monmeros. El enlace del ligando conduce a la dimerizacin del receptor y activacin de su actividad cinasa, aadiendo grupos fosfato al dominio citoplsmico del receptor. Los residuos de fosfotirosina recin formados del receptor sirven como sitios de enlace para protenas especficas que contienen dominios SH2, activados como consecuencia de su interaccin con el receptor. (Segn J. Schlessinger y A. Ulrich, Neuron 9:384, 1992, con permiso de Cell Press.)

4 La actividad GTPasa intrnseca de Ras es relativamente dbil comparada con la de la subunidad a de las protenas G heterotrimricas analizadas anteriormente. En la clula, la actividad GTPasa de Ras es estimulada por algunas protenas activadoras de GTPasa (PAG), que desempean un papel importante para concluir la respuesta.

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CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre las clulas y su ambiente

inician con el enlace de varios factores de crecimiento, como FCE o FCDP, al dominio extracelular de su respectivo receptor (corno en la figura 15-25). La. cascada de proteincinasa activada por mitogao En las figuras 15-26 y 15-27 se muestra la secuencia de sucesos que ocurren en la va Ras para transmitir seales luego del enlace del factor de crecimiento al receptor de tirosincinasa,

Receptores inactivos

Ras inactivo

Activacin n del receptor W

En breve, las fosfotirosinas generadas en el dominio citoplsmico del RTK por autofosforilacin actan como sitios de enlace para una protena SH2 especfica llamada Grb2, que se enlaza a la superficie interna de la membrana junto con otra protena denominada Sos (fig. 15-26, a).5 En este punto es donde Ras entra en la descripcin. En la clula no estimulada, Ras permanece enlazada a GDP. Cuando un ligando se enlaza a RTK y recluta a Grb2-Sos en la superficie interna de la membrana, la protena Sos se enlaza a Ras, causando la prdida de su GDP, que es reemplazada por GTP, activando de esta manera a Ras (fig. 15-26, i?). La funcin primaria, y quiz la nica, de Ras-GTP es reclutar otra protena, llamada Raf, en la membrana plasmtica (fig. 15-26, c). Una vez localizada en la membrana plasmtica, Raf se convierte en una proteincinasa activa que inicia una cadena ordenada de reacciones de fosforilacin denominada cascada de proteincinasa activada por mitgeno (cPAM),6 detallada en la figura 15-27. La cascada cPAM es similar a la de reacciones desencadenadas por AMPc durante la movilizacin de la glucosa (g. 15-6), pero incluso ms complicada (fig. 15-28).7 La ltima proteincinasa en la cascada (cPAM) entra al ncleo y fosforila factores de transcripcin especficos. Estos factores de transcripcin se enlazan a sitios sobre el DNA que contiene secuencias de nucletidos conocidas como elementos sricos de respuesta (ESR), porque son activados por seales provenientes de factores de crecimiento presentes en el suero. Varios de los genes expresados codifican protenas que se cree que participan en la activacin del ciclo celular, que finalmente conduce a! inicio de la sntesis de DNA y despus a la divisin celular. Al parecer, el ncleo no es el nico objetivo de la cascada de proteincinasas activadas por mitgeno. Estudios recientes indican que otro objetivo es una protena citoplsmica denominada PHAS-I (fig. 15-29). En estado no fosforilado, PHAS-I al parecer se enlaza a uno de los factores clave de inicio (eFI4E) requerido en clulas eucariotas para permitir que el ribosoma se fije al RNAm e inicie la traduccin (pg. 472). En tanto PHAS-I permanezca enlazado al factor de inicio, dicho factor no puede realizar su papel en la sntesis de protenas. En estado activado, cPAM aade un fosfato a PHAS-I, cambiando su conformacin para desprenderlo de eF4E, que a su vez permite al factor de inicio rea-

FIGURA 15-26. Etapas en la activacin de Ras por RTK. Algunos receptores diferentes, incluyendo los que se enlazan al factor de crecimiento epidrmico (FCE) y el factor de crecimiento derivado de plaquetas (FCDP), actan como se indica en esta figura, a) En el estado inactivo, los receptores se presentan como monmeros y Ras se combina con GDP, y por lo tanto es inactivo. V) El enlace de un ligando desencadena la dimerizacin del receptor, lo que conduce a la~ autofosforilacin de los dominios citoplsmicos del dmero receptor. Los residuos de fosfotirosina recin formados actan como sitios para el enlace de Grb2-Sos, que inducen la sustitucin de GTP por GDP sobre Ras. c) El Gtp-Ras activado acta como sitio de enlace para Raf, localizando as a esta protena en la membrana plasmtica donde desencadena la cascada cPAM detallada en la siguiente figura.

5 Grb2 es un acrnimo en ingls para receptor de factor de crecimiento que se enlaza a proteina, y Sos corresponde a son of sevenless, donde sevenless es un gen identificado en Drosophila que participa en la diferenciacin de fotorreceptores. 6 cPAM (en ingls MAP kinase) es un acrnimo para proteincinasa activada por mitgeno, porque es una cinasa activada por factores de crecimiento que estimulan la mitosis {o sea, mitgenos). No debe confundirse con las cinasas que fosforilan protenas relacionadas con microtbulos, que se denominan PRM y que en ingls tambin aparecen como MAP. 7 En realidad, el cuadro es mucho ms complejo de lo que se indica. Las clulas pueden tener varias vas cPAM distintas que constan de variantes en los diferentes elementos que constituyen la cascada. Por ejemplo, las clulas de levadura tienen cuando menos tres distintas vas cPAM que controlan la construccin de la pared celular, la respuesta al estrs osmtico y la respuesta a feromonas de apareamiento.

CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre las clulas y su ambiente Factor de crecimiento

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PAMKKK (Ra) 0

FIGURA 15-27. Etapas de la cascada cPAM. El enlace del factor de crecimiento a su receptor (1) conduce a la autofosforilacin de los residuos de tirosina del receptor (2) y el subsecuente reclutamiento de las protenas Grb2-Sos (3). Este complejo activado provoca el intercambio GTP-GDP de Ras (4), que recluta a la protena Raf en la membrana activando su funcin serina-proteincinasa (5). Raf tambin se conoce como PAMKKK (PAM cinasa cinasa cinasa) porque fosforila a PAMKK (PAM cinasa cinasa, tambin conocida como MEK), activando por lo tanto su funcin cinasa (6). PAMKK es una cinasa de doble especificidad, trmino que significa que es capaz de fosforilar residuos de tirosina y tambin residuos de serina y treonina. Como su nombre implica, PAMKK fosforila a PAMK (cPAM) activando su funcin cinasa de serina y treonina (7). Se cree que cPAM activado fosforila cuando menos dos tipos de sustrato de protena: factores de transcripcin (FT, paso 8) y otra cinasa llamada Rsk (o p90rsk) (paso 8a), que a continuacin fosforila a un factor de transcripcin (8b). La fosforilacin de los factores de transcripcin incrementa su afinidad por sitios reguladores sobre el DNA, provocando un incremento de los genes especficos de transcripcin que participan en !a respuesta de crecimiento (paso 9). Uno de los genes cuya expresin se estimula codifica una cPAM fosfatasa (MKP-1) (paso 10). Se cree que esta jnzima elimina grupos fosfato de cPAM (11), y por lo tanto inactiva la :uncin cinasa de cPAM y detiene una mayor actividad de emisin de seales a lo largo de la va. (Segn H. Sun y N.K. Tonks, Trends Biochem. 3ci. 19:484, 1994.)

Transcripcin

MKP-1

lizar su papel en la traduccin. A partir de estos datos parecera que la cascada cPAM desempea un papel clave en la regulacin de la transcripcin y la traduccin en la clula especfica. Generalidad de la cascada cPAM. En todos los eucariotes investigados, desde levaduras hasta moscas y de nematodos a mamferos, se observa la misma va bsica desde RTK a travs de Ras para la activacin de los factores de transcripcin. La evolucin adapt la va para satisfacer muchos fines diferentes. Por ejemplo, en las levaduras, la cascada cPAM es necesaria para conservar la forma de la clula y responder a feromonas de apareamiento, en tanto que en la mosca de la fruta la va se utiliza durante la diferenciacin de los receptores en el ojo compuesto. Como se analiza en el siguiente captulo, los oncogenes pueden identificarse gracias a su capacidad para convertir a las clulas en clulas cancerosas cuando el gen sufre mu-

tacin o activacin anormal. Cuando se descubrieron los oncogenes se pronostic que codifican protenas cuyas contrapartes normales participan en el control del crecimiento celular. Esta prediccin se ha confirmado repetidas veces. Por ejemplo, muchos de los elementos de la va Ras para transmisin de seales son protenas codificadas por genes descubiertos por primera vez como oncogenes causantes de cncer. Esto incluye Ras, Raf y algunos factores de transcripcin activados al final de la va (p. ej., c-fos). Los genes de varios RTK situados al principio de la va, incluyendo receptores para FCE y FCDP, tambin se identifican entre las diferentes docenas de genes conocidos como oncogenes. De todos los oncogenes, Ras parece desempear el papel ms importante en el desarrollo del cncer humano. El hecho de que tantas protenas de esta va sean codificadas por genes que pueden provocar cncer cuando sufren mutacin subraya la importancia de la va en el control del crecimiento y proliferacin celulares. Se espera que los conocimientos recientes en el papel de Ras en las actividades normales de la clula conduzcan a una mejor comprensin de los mecanismos encargados de la prdida de control del crecimiento en las clulas cancerosas que contienen genes ras alterados y al desarrollo de mejores estrategias para el tratamiento del cncer.

15-4 Convergencia, divergencia e interferencia entre diferentes sistemas de seales

La va para la transmisin de seales mitgenas descrita antes e ilustrada esquemticamente en la figura 15-27 es una va lineal que conduce directo desde un receptor en la superficie celular al DNA en el ncleo de la clula. Aunque esta es la nica va en la cual se ha identificado cada eslabn de la cadena, no es la nica va disponible para transmitir

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CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre as clulas y su ambiente

FIGURA 15-28. (Di!M;o por Tony Bramley, Trends Biochem Sci. 19:469, I994.J

seales desde la superficie celular por medio de un RTK activado. Los datos de estudios recientes indican que los circuitos de informacin dentro de la clula son complejos; por ejemplo:

Seales procedentes de varios factores de crecimiento no relacionados, cada uno enlazado a su propio receptor, pueden converger para activar a un efector comn, como Ras o proteincinasa activada por mitgeno.

Factores de crecimiento, por ejemplo: FCE, FCDP

RNAm

Sntesis de protenas

FIGURA 15-29. Papel de la cascada cPAM para controlar la traduccin. La activacin de la actividad cinasa de cPAM conduce a la fosforilacin de la protena PHAS-1, lo cual causa que se disocie del factor de inicio de traduccin eFI4E, activando al factor y estimulando la sntesis de protena.

CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre las clulas y su ambiente

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Seales del mismo ligando, como FCE o insulina, pueden divergir para activar varios efectores diferentes, lo que provoca respuestas celulares diversas. Pueden pasar seales hacia atrs y hacia delante en diferentes vas, fenmeno conocido como interferencia. Estas caractersticas de las vas para transmisin de seales se ilustran esquemticamente en la figura 15-30. A partir de la figura 15-27 es evidente que la va Ras desempea un papel central para dirigir la informacin a travs de la clula, de manera parecida a la orientacin de la informacin en el sistema nervioso central desde los diferentes rganos del cuerpo y hacia ellos. El sistema nervioso central recoge informacin acerca del ambiente a travs de los diferentes rganos de los sentidos, en tanto que la clula recibe informacin acerca de su ambiente a travs de la estimulacin de diferentes receptores en su superficie. Igual que los rganos de los sentidos sensibles a formas especficas de estmulos (p. ej., luz, presin u ondas sonoras), los receptores de la superficie celular slo pueden enlazarse a ligandos especficos y no son afectados por la presencia de una gran variedad de molculas no relacionadas. Una sola clula puede tener docenas de receptores diferentes capaces de enviar seales simultneas al interior de la clula. Se cree que muchas de las seales que llegan a travs de estos receptores lo hacen a travs de la va Ras. Las seales que abandonan la va Ras pueden entonces canalizarse hacia vas orientadas "hacia afuera" que pueden provocar que la clula se divida, cambie de forma, active una va metablica

particular o incluso causen el suicidio de la clula, como se analizar en la siguiente seccin. De esta manera, la clula al parecer es capaz de integrar la informacin que llega de diferentes fuentes y elaborar una respuesta integral apropiada.

Ejemplos de vas convergentes para transmisin de seales

Uno de los ejemplos ms interesantes de convergencia de vas para la transduccin de seales surgi recientemente de estudios acerca de la respuesta a insulina. En la pgina 648 se hizo notar que la insulina se enlaza a un receptor para insulina desencadenando la fosforilacin de un sustrato del receptor para insulina y la activacin de PI(3)K (fig. 15-24). La insulina tambin desencadena otras respuestas celulares, incluyendo activacin de la sntesis de protenas y estimulacin del crecimiento. En la figura 15-31 se muestra la va donde ocurre esto. La fosforilacin del sustrato del receptor de insulina genera un sitio de estacionamiento para Grb2, la misma protena SH2 que se une al FCE fosforilado o al receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas. Por lo tanto, las vas para transmisin de seales iniciadas por el enlace de estos tres ligandos (FCE, FCDP e insulina) convergen para activar a Ras y a la cascada cPAM, lo que provoca la transcripcin y traduccin de un grupo similar de genes promotores de crecimiento en la clula especfica.

Receptores unidos a protena G

Acetilcolma, histomina NA, 5-HT, ATP, FAP, TXA;, Glutamato, Angiotensina II, Vasopresina, Bradicinina, Sustancia P, Bombesina, Neuropptido Y, Trombina, Colecistocinina, Endotelina, Neuromedina, TRH, GnRH, PTH Odorantes, Luz

"

i " y* \G -* T PKC i

Receptores unidos a tirosincinasa

<^\

Actividad

FCDP, FCE, etc.

PI(3)K

PIP_

celular V mitognesis

I
KI<;URA 15-30. Ejemplos de convergencia, divergencia e interferencia entre diferentes sistemas de transduccin de seales. Este dibujo muestra un esquema de las vas para transduccin de seales iniciadas por receptores que actan a travs de protenas G hcterotrimricas y receptores de tirosincinasa. La dos vas convergen por activacin de diferentes isoformas fosfolipasa C, y en ambas se producen los mismos segundos mensajeros (IPs y DAG). La activacin del receptor de tirosincinasa por el FCDP o por el FCE conduce a la transmisin de seales a lo largo de tres vas diferentes, un ejemplo de divergencia. La interferencia entre los dos tipos de vas se ilustra por los iones calcio liberados del REL por IPs y que entonces pueden actuar sobre diferentes protenas, incluyendo proteincinasa C (PKC) cuya actividad tambin es estimulada por diacilglicerol. (Segn M.]. Berridge, reimpreso con permiso de Nature, val 363, p. 315, 1993. Copyright 1993 por Macmillan Magazines Limited.)

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CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre las clulas y su ambiente Factores de crecimiento, p. ej.: FCE, FCDP

Insulina
\rv x^fe

Sustratos

DAG

Cascada cPAM

FIGURA 15-32. Las seales transmitidas desde el receptor del factor de crecimiento epidrmico pueden divergir hacia distintas vas.

FIGURA 15-31. Las seales transmitidas desde el receptor de insulina y el receptor FCE o FCDP convergen sobre Ras y a continuacin se transmiten a lo largo de la cascada de proteincinasa activada por mitgeno.

Ejemplos de vas divergentes para transmisin de seales

En la seccin previa vimos que el enlace del FCE o del FCDP a sus correspondientes receptores conduce a la autofosforilacin del receptor y al reclutamiento de la protena Grb2 SH2en la membrana plasmtica (fig. 15-26). Grb2 no es la nica protena que contiene un dominio SH2 que se enlaza a fosfotirosina capaz de enlazarse a un receptor FCE fosforilado o a un factor de crecimiento derivado de plaquetas. Cuando menos otras dos protenas SH2, PI(3)K y fosfolipasa C, tambin se pueden enlazar a estos receptores (fig. 15-32) y activarse como resultado de esta interaccin. Ambas enzimas fueron estudiadas anteriormente en relacin con otro tipo de estmulo. PI(3)K se describi como enzima que fosforila al fosfatidilinositol (pg. 648), y la fosfolipasa C como enzima que desdobla el fosfatidilinositol fosforilado en IPs y DAG, ambos segundos mensajeros (pg. 639). Estas dos enzimas permanecen a la cabeza de sus propias vas para transmisin de seales, y por lo tanto el enlace de FCE o FCDP con sus correspondientes receptores no slo enva una seal a lo largo de la va Ras-cPAM, sino tambin a lo largo de vas separadas generadas por la fosforilacin del inositol (fig. 15-32). El trmino "Ras" se usa en dos contextos diferentes. Por una parte, Ras es una protena especfica, producto del gen ras. Por la otra, el trmino "Ras" se usa para describir una superfamilia de pequeas protenas homologas enlazadas a GTP codificadas por cuando menos 50 genes diferentes. Las protenas codificadas por varios de estos genes (princi-

plmente miembros de la subfamilia Rho) son elementos clave de las vas que transmiten seales desde los receptores de la membrana plasmtica al citoesqueleto, provocando cambios en la disposicin de los filamentos de actina que afectan la forma, la motilidad y las propiedades de adherencia de la clula. Los efectos de la inyeccin de una protena Rho sobre la configuracin del citoesqueleto de un fibroblasto activado se muestra en la figura 15-33.

Interferencia entre las vas para transmisin de seales

En las secciones previas examinamos algunas vas para transmisin de seales como si funcionaran de manera independiente siguiendo una cadena de sucesos lineales. En realidad, los circuitos de informacin que operan en las clulas probablemente recuerden ms una red interconectada en la cual les elementos producidos en una va pueden participar en lo que ocurre en otras vas. Cuanto ms se conoce acerca de la informacin transmitida en las clulas, ms se descubre acerca de interferencias entre las vas para transmitir seales. En vez de tratar de clasificar las vas que pasan informacin en una y otra direccin dentro de la clula, consideraremos un par de ejemplos que implican al AMPc para ilustrar la importancia en este tipo de interferencia. El AMP cclico se estudi en la pgina 631 como iniciador de una reaccin en cascada que conduce a la movilizacin de la glucosa. Datos recientes indican que el AMPc tambin puede inhibir el crecimiento de varias clulas, incluyendo fibroblastos y adipositos, por bloqueo de las seales transmitidas a travs de la cascada de la proteincinasa activada por rnitgeno. Se cree que el AMP cclico realiza esto activando la cinasa dependiente de AMPc (PKA) capaz de fosforilar e inhibir a Raf, la protena que permanece a la

CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre las clulas y su ambiente

655

FIGURA 15-33. Resultados de un experimento en el cual se inyecta protena de la familia Rho a un cultivo de fibroblastos. Las clulas no inyectadas se muestran en a y c, las clulas inyectadas con Rho se muestran en b y d. El aspecto de cada una de estas clulas en el microscopio de contraste de fases se muestra a la izquierda y la imagen inmunofluorescente de la clula correspondiente se muestra a la derecha. El espectacular efecto sobre la forma de estas clulas se observa comparando las micrografas del contraste de fases a y b o de c y d. Los correspondientes efectos sobre el dtoesqueleto se observan comparando las imgenes por inmunofluorescencia. Las clulas en a y b fueron teidas con faloidina fluorescente para revelar la distribucin de filamentos de actina, en tanto que las clulas en c y d se tieron con anticuerpos fluorescentes contra tubulina para revelar la distribucin de los microtbulos. (Segin Hugh F. Pctterson y cois. J. Cell Biol. 111:1005, 1990; con permiso de Rockefeller Unversty Press.)

cabeza de la cascada cPAM (fig. 15-34). En secciones previas se hizo notar en otro ejemplo que tanto Ca2+ como AMPc son segundos mensajeros que evocan respuestas distintas en clulas especficas. Pero estos dos mensajeros pueden tener efectos profundos sobre otras vas. Por ejemplo, Ca2+ (junto con calmodulina) puede activar a la adenilcclasa {que sintetiza AMPc) y la AMPc fosfodiesterasa (que descompone a AMPc). Inversamente, la proteincinasa dependiente de AMPc puede fosforilar los canales del ion calcio alterando su capacidad para liberar Ca2+ hacia el citoplasma. Adems, varias protenas, incluyendo el factor de transcripcin CREB (pg. 631), la glucgeno sintasa y la fosforilasa cinasa, que desempean papeles importantes en el metabolismo de la glucosa, pueden ser fosforiladas por cinasa dependiente del AMPc y la cinasa dependiente de Ca 2+ -calmodulina. Es evidente que las vas para transmi-

sin de seales de una clula son muy interdependientes, y que descifrar los factores que controlan a las vas de transmisin de informacin a travs de los diferentes tipos de clula todava mantendrn ocupados a los investigadores durante muchos aos.

15-5 Otros sistemas de seales

Las vas mejor estudiadas para transmitir seales se inician por el contacto entre ligandos extracelulares y receptores acoplados a protena G o receptores de tirosincinasa, pero tambin se han identificado muchos otros caminos que conducen desde el medio extracelular hasta el interior de la clula. Algunas de las vas ms importantes se analizan en la siguiente seccin.

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CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre las clulas y su ambiente

Receptor Factor de de FCE crecimiento Receptorx Epinefrina I

La desactivacin metablica del NO genera los nitratos que aparecen en la orina de animales cuyos macrfagos participan en actividad fagocitaria extensa durante la inflamacin. El xido ntrico result ser un mensajero en un nmero cada vez mayor de actividades biolgicas. Por ejemplo, las clulas endoteliales que revisten la superficie interna de los vasos sanguneos producen NO en respuesta a la acetilcolina liberada por nervios autnomos que inervan a los vasos (fig. 15-35). El enlace de acetilcolina a la superficie externa de la clula endotelial (paso 1, fig. 15-35) indica elevacin de la concentracin citoplsmica de Ca2+ (paso 2), que activa a la sintasa de xido ntrico (paso 3). El NO formado en las clulas endoteliales difunde a travs de la membrana plasmtica al interior de las clulas de msculo liso adyacentes (paso 4), donde estimula a la guanililciclasa (paso 5), enzima que sintetiza GMP cclico (GMPc), un segundo mensajero importante de estructura similar a AMPc. El GMP cclico desencadena la respuesta que conduce a la relajacin de la clula muscular (paso 6) y la dilatacin subsecuente del vaso sanguneo. El descubrimiento de la dilatacin de vasos sanguneos mediada por NO explica la accin de la nitroglicerina, empleada durante muchos aos para tratar el dolor de la angina de pecho resultante de flujo sanguneo inadecuado al miocardio. La nitroglicerina se desintegra en el cuerpo para formar xido ntrico, que estimula la relaja-

Actividad del gen FIGURA 15-34. Ejemplo de interferencia entre dos vas principales para la emisin de seales. Las pruebas sugieren que el AMP cclico puede actuar en algunas clulas por medio de una PKA cinasa dependiente de AMPc para impedir la transmisin de seales desde Ras a Raf, que tiene el efecto de inhibir la activacin de la cascada de proteincinasa activada por mitgeno.

Clula endotelial

ACh Papel del NO y del CO como mensajeros celulares En 1985 se aisl una cepa muante de ratones cuyos macrfagos carecan de la capacidad habitual para fagocitar clulas anormales o bacterias. Estos ratones tambin mostraron anomalas en el metabolismo del nitrgeno. En tanto la inflamacin resultante de la infeccin bacteriana se acompa de incremento en la excrecin de nitratos en la orina de ratones normales, en los miembros de esta cepa mutante no se observ esta respuesta. En aquel momento la relacin entre inflamacin y excrecin de nitratos era totalmente confusa. Posteriormente se descubri que la actividad fagocitaria en los macrfagos normales en cultivo de clulas dependa de la presencia de arginina en el medio; en ausencia de este aminocido, los macrfagos eran incapaces de engullir materiales extraos. Pronto se descubri que la arginina es un sustrato de una enzima llamada sintasa de xido ntrico, que ibera xido ntrico (NO) como uno de los productos de oxidacin de la arginina. A continuacin el NO acta corno mensajero intracelular que estimula la actividad fagocitaria de la clula. Por lo tanto, la sustancia NO, alguna vez considerada slo como contaminante txico de la atmsfera, result ser un mensajero fisiolgico esencial.

Sintasa de xido ntrico

'Clulas de msculo liso

Fl<;i KA 1 5-33. Va para la transduccin de seales que incluye NO y GMP cclico, que produce dilatacin de los vasos sanguneos. Los pasos ilustrados en la figura se describen en el bexto. (Segm R.G. Kuowes y S. Moneada, Trcnds Biochem Sci. 17:401, 1992.)

CAPITULO 15

657 por protenas dimricas que se encuentran en sitios de clula-sustrato y en contacto clula-clula. Numerosos datos indican que la interaccin entre el dominio extracelular de una integrina con un ligando extracelular, como una molcula de fibronectina de la matriz extracelular, genera seales en la clula que pueden conducir a la liberacin de Ca2+ al interior del citoplasma, a incremento de la sntesis de segundos mensajeros de inositol, a incremento del grado de fosforilacin de tirosina de las protenas celulares y a cambios en la expresin de genes. Uno de los efectores causantes de dichos cambios es una protena tirosincinasa llamada nasa de adherencia foca! (CAF), as denominada porque se concentra en adherencias focales, o sea, sitios especializados en la membrana plasmtica donde las clulas hacen contacto con el sustrato (pg. 249). Se cree que la cinasa de adherencia focal acta como efector en las respuestas mediadas por integrina que requieren reorganizacin del citoesqueleto, lo que puede afectar el curso del desarrollo y la conducta celulares. La figura 15-36 muestra las adherencias focales presentes donde !a superficie subyacente de fibroblastos de rata entran en contacto con el plato de cultivo. Los filamentos de actina aparecen de color verde en la micrografa, en tanto que los residuos de fosfotirosina al parecer generados por CAF se tien de rojo. Las reas de color naranja son sitios donde los microfilamentos y los residuos de fosfotirosina coinciden en la adherencia focal. La cinasa de adherencia focal tambin se considera como un efector que desencadena la agregacin de plaquetas, los elementos no nucleados de la sangre encargados del cierre de las heridas en los vasos sanguneos. La agregacin de plaquetas se estimula por contacto de sus superficies con ciertas protenas sanguneas, como el fibringeno (fig. 7-15). Los datos indican que el enlace de fibringeno al dominio

cin de los msculos lisos que revisten los vasos sanguneos del corazn incrementando el flujo de sangre a ese rgano. Muchos investigadores piensan que la produccin de NO en el cuerpo es el determinante aislado ms importante de la presin arterial de una persona. Las concentraciones ms elevadas de sintasa de xido ntrico se encuentran en las clulas nerviosas localizadas en ciertas partes del cerebro y en los nervios raqudeos que inervan varios rganos perifricos. Se cree que el NO producido en las neuronas acta como neurotransmisor para producir respuestas especficas en clulas blanco, incluyendo las contracciones peristlticas de la capa de msculo liso del intestino y el llenado con sangre del pene durante la ereccin. La investigacin acerca de la NO sintasa condujo a los investigadores a otra enzima, la hem oxigenasa, que cataliza la destruccin del grupo hem de la hemoglobina eliminada de las clulas sanguneas viejas y gastadas. Pero la hem oxigenasa tambin se encuentra en concentraciones relativamente altas en ciertas clulas nerviosas, donde es muy poco probable que participe en la degradacin del hem. El papel de la hem oxigenasa en las clulas nerviosas es ms evidente que cuando se comprueba que uno de los productos de la reaccin que cataliza es el monxido de carbono (CO), el cual, igual que el NO, es un contaminante txico de la atmsfera. Cada vez se acumulan ms pruebas de que el CO acta como mensajero qumico para estimular la produccin de GMPc en clulas especficas. La demostracin de un papel para el CO en la funcin nerviosa proviene del estudio de neuronas olfatorias, que normalmente responden a la presencia de molculas odorantes estimulantes con elevacin de la concentracin de GMPc. Cuando se trata a animales con un frmaco que inhibe la hem oxigenasa, la GMPc ya no se eleva en las neuronas olfatorias.

Seales originadas por contactos en la superficie celular

Todas las seales estudiadas antes se originan por interaccin de la clula con sustancias disueltas en su ambiente. Las clulas tambin pueden responder a contactos que hacen con objetos insolubles en su ambiente, incluyendo sustratos no celulares (como membranas bsales) y las superficies de otras clulas. En el captulo 7 se describi de qu manera las clulas desarrollan contactos altamente especializados con otras clulas y con la matriz extracelular. Tpicamente, estos contactos son sitios donde ciertos tipos de protenas de membrana se agrupan y actan como puentes entre el objeto extracelular con el que hacen contacto y las disposiciones especficas de elementos citoesquelticos situados en la superficie interna de la membrana plasmtica. Se cree que estas protenas de membrana y las regiones especializadas del citoesqueleto actan en conjunto como conductos para transmitir seales desde el medio externo hasta el interior de la clula. De los diversos tipos de protenas de membrana que participan en la transmisin de seales celulares desde "el exterior al interior", las integrinas estn sometidas a mayor investigacin. Como se estudi con detalle en el captulo 7, las integrinas son los receptores de membrana constituidos

FICUEtA 15-36. Demostracin experimental de la presencia de residuos de fosfotirosina en los sitios de adherencia focal en fibroblastos de rata. Los filamentos de actina, que se irradian a partir de las reas de contacto en las adherencias focales, estn teidos con faioidina conjugada a fluorescena (verde). Los residuos de fosfotirosina se localizan mediante un anticuerpo fluorescente rojo. Los sitios de superposicin de los filamentos de actina y residuos de fosfotirosina en las regiones de contacto focal aparecen de color naranja. (Cortesa de Keiti Burridge.)

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CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre las clulas y su ambiente

extracelular en la membrana plasmtica de la plaqueta transmite una seal a travs de la membrana que activa las molculas de cinasa de adherencia focal citoplsmicas (fig. 15-37), lo que conduce a la fosforilacin de protenas citoplsmicas necesarias para la agregacin. Esto explicara por qu las plaquetas de pacientes que padecen trombastenia de Glanzmann, quienes carecen de esta integrina particular, no se pueden activar por fibringeno.

Papel de las fos alagas en la transmisin de seales celulares

En este captulo se subraya el papel de las proteincinasas para estimular (e inhibir) la actividad de otras protenas. La fosforilacin de protenas es una modificacin reversible, de modo que cualquier fosfato aadido por una proteincinasa puede eliminarse mediante una proteinfosfatasa. Por lo tanto, las cinasas y las fosfatasas muestran efectos opuestos sobre su sustrato: cuando la fosforilacin activa al sustrato, la desfosforilacin lo inactiva, y viceversa. Igual que las proteincinasas, algunas fosfatasas son multifuncionales y capaces de eliminar fosfatos de varias protenas diferen-

tes, en tanto que otras son muy especficas y slo pueden eliminar fosfatos de uno o dos sustratos. La mayor parte de las fosfatasas, como las cinasas que revierten, pueden extraer fosfatos, sea de residuos de serina y treonina o de residuos de tirosina, pero no de ambos. Sin embargo, se conocen unas pocas fosfatasas con doble especificidad capaces de eliminar fosfatos de los tres tipos de residuos aminocidos. Todas las proteinfosfatasas estudiadas hasta ahora son enzimas citoplsmicas solubles. Recientemente, se descubri una nueva clase de fosfatasas que atraviesan la membrana plasmtica y al parecer actan como receptores de superficie celular que participan en la transmisin de seales celulares y en la adherencia entre clulas. Estas molculas se denominan/os/ftesas parecidas a receptores de proteintirosina (FRPT). El papel de las FRPT como molculas de adherencia celular fue sugerido por experimentos en los cuales un gen de una de estas protenas (FRPTm) se introdujo en clulas de insectos normalmente no adherentes entre s. Luego de captar al gen y expresar el producto en su superficie, estas clulas transfectadas se agregaron para formar grumos (fig. 15-38) asociados por interacciones especficas entre las clulas FRPT con sus vecinas. La porcin extracelular de FRPT contiene dominios similares a los observados en otras molculas para adherencia celular, incluyendo fibronectina (pg. 243), y se cree que suministran un enlace directo entre los procesos de adherencia celular y la transmisin de seales a travs de la membrana.

Vas que conducen a la muerte celular

Consideremos los siguientes acontecimientos, los cuales ocurren durante el desarrollo embrionario: muchas ms neuronas salen del sistema nervioso central en direccin a un rgano especfico que las requeridas para inervar dicho rgano; se producen linfocitos T (clulas inmunolgicas encargadas de destruir clulas anormales o infectadas) que tienen capacidad de atacar a las propias clulas del cuerpo; las formas ms primitivas de la mano del ser humano recuerdan una paleta sin espacio alguno entre los tejidos que se convertirn en los dedos. En cada una de estas situaciones, las clulas que ya no son necesarias (como las neuronas en exceso o las clulas situadas entre los dedos) o que poseen ta capacidad de daar al individuo (como los linfocitos T) sufren un proceso llamado apoptosis. A diferencia de la muerte de las clulas que se produce por lesiones tisulares (suceso denominado necrosis), la apoptosis es un tipo de muerte celular ordenada, o programada, en la cual la clula responde a ciertas seales iniciando una respuesta normal que conduce a su propia muerte. Se cree que la apoptosis requiere la activacin de un conjunto especfico de genes que ha evolucionado para destruir a la clula de manera que su muerte tenga el menor efecto sobre el ambiente que la rodea. La muerte por apoptosis se caracteriza por la compactacin total de la clula y su ncleo (fig. 15-39), la diseccin ordenada de la cromatina en pedazos por accin de una endonucleasa especial que separa DNA, y el rpido engullimiento de la clula muerta por fagocitosis. Como se ilustra en los ejemplos anteriores, la apoptosis es un suceso comn durante el desarrollo embrionario, pero tambin ocu-

Espectrina actinina

CAF
FIGURA 15-37. Activacin de la cinasa de adherencia focal (CAF) en las plaquetas sanguneas. La interaccin del fibringeno en la superficie extracelular de la integrina nbft conduce a la transmisin de una seal a travs de varias protenas relacionadas con la membrana {incluyendo talina y actina) hacia la CAF, activada para fosforilar varias protenas de sustrato incluyendo Src, que es una tirosincinasa. Estas acciones promueven la agregacin de plaquetas. (Segn E.A. Clark, S.J. Shattit y J.S. Bruce, Trends Biochem Sci. 29:467, 1994.)

CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre las clulas y su ambiente

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(a)

(b)

FIGURA 15-38. Resultados de un experimento que sugieren que las fosfatasas parecidas a receptores de proteintirosina puede participar en la adherencia clula-clula. a) Las clulas testigo muestran poca tendencia a adherirse entre s. b) Las clulas del mismo tipo mostradas en a fueron manipuladas por ingeniera gentica para expresar una fosfatasa similar a receptor de proteintirosina sobre su superficie. A diferencia de las clulas testigo, las clulas manipuladas genticamente se adhieren entre s formando grumos. (Segn M.artijn Gebbink y Gerben Zondag, Science 261:633, 1993; reimpreso con permiso.)

rre en tejidos adultos y puede ser un arma particularmente importante para la destruccin de clulas que potencialmente pueden desarrollarse para formar tumores malignos (comentado en la seccin 16-3). En este momento se sabe muy poco acerca de las vas para transmitir seales que inducen a una clula a suicidarse, pero esto tal vez cambie en los siguientes aos, puesto

que ahora la investigacin se ha enfocado en la apoptosis. Las pruebas sugieren que la apoptosis puede desencadenarse por algunas condiciones externas, segn el tipo de clula. Muchas clulas cultivadas diferentes son estimuladas a entrar en apoptosis cuando se eliminan factores de crecimiento del medio; quiz la disyuntiva sea crecer y dividirse o morir. Las clulas epiteliales de la prstata entran

FIGURA 15-39. Comparacin de clulas normales y clulas apoptticas. a-b) Micrografas con microscopio de luz de una clula cultivada HL-60 normal (a) y una apopttica (b). El ncleo de la clula apopttica est altamente condensado y fragmentado, c-d) Micrografas electrnicas de una clula T hibridoma normal (c) y apopttica (d). La clula apopttica muestra muchas burbujas en su superficie que brotan desde el interior de la clula. (Segn Seamus J. Martin, Douglas R. Creen y Thomas G. Cotter, Trends Biochem Sci. 19:28, 1994. Micrografa electrnica por Y. Shi y D.R. Creen.)

(b)

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CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre las clulas y su ambiente

en apoptosis cuando se suprime la hormona sexual masculina testosterona. Esta es la razn de que el cncer prosttico propagado a otros tejidos se pueda tratar con frmacos que interfieran con la sntesis de testosterona. Cualesquiera que sean las seales externas que desencadenan la apoptosis, al parecer el proceso es mediado principalmente por liberacin de Ca2+ al interior del citoplasma y la activacin de proteincinasas.

Sistemas para transmisin de seales en plantas

La investigacin acerca de las vas para transmitir seales en clulas vegetales ha permanecido muy por detrs de los

estudios en clulas animales, pero se est efectuando un nmero cada vez mayor de estudios en plantas. Los datos de estos estudios indican que las plantas y los animales comparten ciertos mecanismos bsicos para transmitir seales, incluyendo el uso de Ca 2+ (pg. 641) y de mensajeros f osfoinositdicos, pero que ciertas vas son peculiares de cada reino. Por ejemplo, los nucletidos cclicos, que pueden ser el mensajero celular ms ubicuo en animales, al parecer desempean un papel sin importancia, si es que tiene alguno, en la transmisin de seales en clulas vegetales. Por otra parte, como se estudia a continuacin, las plantas contienen un tipo de proteincinasa ausente en clulas animales. Desde hace mucho se sabe que las clulas bacterianas contienen una proteincinasa capaz de fosforilar residuos de histidina y desempea un papel clave en la mediacin de la

LA VIA E X P E R I M E N T A L

Descubrimiento y caracterizacin de las protenas enlazadas a GTP

A finales de los anos 1950 y 1960, Earl Sutherland y sus colegas, en la Case Western Reserve University, descubrieron que ciertas hormonas, como la epinefrina, actan al enlazarse a un receptor especfico en la superficie de la clula que activa a la enzima adenililciclasa sobre el lado interno de la membrana. La activacin de la adenililciclasa induce la produccin de un segundo mensajero, AMP cclico, que se difunde al citoplasma e inicia la respuesta celular, revisado en 1 A finales del decenio de 1960, el concepto de segundo mensajero estaba ya bien establecido, pero poco se saba acerca del mecanismo molecular preciso que permite a una hormona (u otro ligando) enlazada en el exterior de la membrana activar fa adenililcicasa. Una posibilidad era que el sitio activo de la adenililciclasa fuera parte del propio receptor de la hormona. Para conocer ms acerca de la relacin entre receptores hormonales y adenililciclasa, Martin Rodbell y Lutz Birnbaumer, de los National Institutes of Health, comenzaron una serie de experimentos sobre membranas plasmticas aisladas de adipocitos y clulas hepticas.2 Una de las primeras preguntas que intentaron responder fue si estas clulas, que responden a varias hormonas diferentes produciendo AMPc, poseen una sola adenililciclasa activada por las diferentes hormonas o tienen diferentes adenililciclasas para cada una de las hormonas a las cuales responden. Se eligieron clulas adiposas para los estudios iniciales debido a que son fciles de aislar y liberar de otros tipos de clula, responden a varias hormonas que causan rpido incremento en la concentracin intracelular de AMPc (estimulando enzimas que participan en la descomposicin de lpidos), y sus membranas plasmticas pueden aislarse como "fantasmas" mediante lisis osmtica. Seis hormonas diferentes (ACTH, epinefrina, glucagon, TSH, LH y proactina) mostraron accin estimulante sobre la actividad de adenililciclasa en fantasmas de clulas adiposas aisladas. En la figura VE 15-1 se muestran las curvas de dosis y respuesta de las primeras tres de estas hormonas actuando por separado. Como se muestra en el cuadro PH 15-1, cuando estas hormonas se combinan en grupos de dos o tres, sus efectos sobre la actividad de adenililciclasa no son aditivos, lo que sugiere que cada una de estas hormonas estimula a la misma poblacin de molculas de adenililciclasa. En experimentos subsecuentes se demostr que las diferentes hormonas interactan con receptores espacialmente distintos. Estos datos juntos condujeron a Rodbell y Birnbaumer a proponer que, aunque los diferentes receptores hormonales estimulan una poblacin comn de molculas de adenilifciclasa, los receptores adenililcicasa existen por separado en la membrana plasmtica de las clulas adipesas. En 1971, Rodbell y sus colegas publicaron una serie de trabajos acerca de la actividad de glucagon y epinefrina sobre la estimulacin de adenililciclasa en membranas plasmticas aisladas de clulas hepticas. Una de las tcnicas adoptadas en estos estudios fue vigilar la capacidad de las molculas de glucagon marcadas con istopos radiactivos para enlazarse a sus correspondientes receptores sobre las membranas plasmticas aisladas. Puesto que el ATP es un sustrato de la reaccin adenililciclasa, se pudo vigilar el efecto de la presencia del ATP sobre e! enlace del glucagon marcado, y tambin los efectos de los otros tres trifosfatos de nuclesido comunes, UTP, CTP y GTP. Durante estas investigaciones se notaron por primera vez los efectos especiales de GTP.3 Uno de los efectos observados de los trifosfatos de nuclesido fue que causan disociacin del glucagon marcado enlaza-

CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre as clulas y su ambiente

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respuesta celular a varias seales ambientales desencadenado cambios en la expresin de genes o modificando la conducta de la clula. Hasta 1993, se pensaba que estas enzimas se restringan a clulas bacterianas, pero entonces se descubrieron tanto en levaduras como en plantas que producen flores. En ambos tipos de eucariotes, las enzimas son protenas transmembrana que se cree poseen un dominio receptor extracelular y un dominio histdincinasa citoplsmico. Las seales generadas por estas enzimas al parecer alimentan a una cascada de proteincinasa activada por mitgeno. Las pruebas indican que la hstidincinasa de plantas (codificada por el gen Efr) desempea un papel clave en la respuesta del organismo al gas etileno, hormona que regula el crecimiento e induce la maduracin de las frutas.

Otra va nica para transmisin de seales de las plantas se inicia por el ataque de un microorganismo patgeno o de una plaga de insectos. La porcin daada de la planta responde a la amenaza produciendo un mensaje qumico, que se cree est compuesto de cido saliclico (un sucedneo de la aspirina, que es el cido acetilsaliclico). El cido saliclico (AS) se propaga por toda la planta y es detectado por una protena que se enlaza al AS, probablemente la enzima catalasa. La catalasa es una enzima protectora que destruye especies reactivas de oxgeno (pg. 199). Cuando el AS se enlaza a la enzima, inhibe su actividad cataltica conduciendo a a formacin de ciertas especies de oxgeno que pueden actuar como segundos mensajeros para generar una respuesta sistmica de defensa.

do a las membranas plasmticas aisladas. En tanto ATP, UTP y CTP no afecten la disociacin del glucagon de las membranas en concentraciones menores de 100 fiM, GTP estimula la disociacin a concentraciones tan bajas como 0.05 fM. En la figura VE 15-2 se comparan los efectos de ATP y GTP para provocar !a disociacin del glucagon de las membranas. (Ntese que la concentracin se grfica en una escala logartmica indicando diferencias muy grandes en la eficacia de los dos trifosfatos.) Estos resultados sugirieron a los autores que los nucletidos de guarni inducen un cambio en el estado o las propiedades de los sitios de enlace del glucagon que disminu-

yen su afinidad por glucagon. Adems, se observ que las membranas de hgado poseen una actividad nucleotidasa capaz de hidrolizar GTP y que esta actividad GTPasa es inhibida por EDTA, un compuesto que se enlaza a iones calcio y magnesio. En el ltimo trabajo publicado de la serie, intentaron responder la pregunta de si los efectos de los nucletidos de guanilo sobre ef enlace de glucagon implica alguna relacin con las acciones de glucagon sobre el sistema adenililciclasa de las membranas hepticas.4 Como se muestra en la figura VE 15-3, el GTP estimula la actividad basal de adenililciclasa y lo hace a concentraciones tan bajas como 10 nM. Ninguno de los otros nucletidos pose esta actividad. Los autores concluyeron que los nucletidos de guanio son necesarios para que el glucagon active la adenililciclasa. Los nucletidos se enlazan a sitios distintos de los sitios de enlace de glucagon y al parecer
X?

Epinefrina
3.0

CTP
ACTH Glucagon

60

ATP

W
i/
A A*

2.0

_
i.o

_J
-9

L
-8 -7 -6 -5 -4
GTP o ATP (log[MI)

-3 -2 ~ -1

J 10'

L.L

L-t-L IO'T I0' IO'9 Concentracin de la hormona (M)

10"

FIGURA VE 15-1. Efecto de concentraciones variables de ACTH, epinefrina y glucagon sobre Ja actividad de adenililciclasa de fantasmas de clulas adiposas. La inea punteada representa la actividad en ausencia de hormonas aadidas (la adenililciclasa inicialmente se denomin adenilcidasa y posteriormente se le llam adenilato ticlasa). (Segn L Birnbaumer \j M. Rodbell, J. Biol. Chem. 244:3478, 1969.)

FIGURA VE 15-2. Efecto de concentraciones variables de GT y ATP sobre la disociacin de 125I-glucagon de las membranas plasmticas de clulas hepticas. En este experimento las membranas se incubaron previamente durante 15 minutos en un medio que contena glucagon marcado. A continuacin se aadi GTP o ATP en presencia de un gran exceso de gmcagon no marcado. Luego de 15 minutos de incubacin en uno u otro trifosfato de nuclesido, se tomaron muestras para medir el glucagon marcado que permaneca enlazado. El porcentaje de glucagon marcado enlazado que se disocia durante la incubacin con ATP o con GTP se calcul comparando la radiactividad de enlace presente al inicio y al final de los 15 minutos de incubacin con el trifosfato de nuclesido. (Segn M. Rodbel! y cois. J. Bio!. Chem. 246:1873, 1971.)

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CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre las clulas y su ambiente

CUADRO VE 15-1. Efectos de las combinaciones de hormonas, a concentracin supramxima, sobre la actividad de adenililciclasa en fantasmas de clulas grasosas* Cambio de la actividad de adenililciclasa debido a hormonas Experimento 1 (37) Adiciones ACTH Epinefrina Glucagon ACTH + epinefrina Epinefrina + glucagon ACTH + glucagon ACTH 4- epinefrina + glucagon Encontrado 0.57 1.00 0.32 0.80 0.99 0.64 0.85 0.02 0.06 0.01 0.04 0.05 0.02 0.04 Calculado si se aade Encontrado 1.19 1.79 0.57 2.04 2.13 1.33 2.30 0.07 0.11 0.04 0,12 0.10 0.06 0.10 Experimento 2 (30) Calculado si se aade

1.57 1.26 0.89 1.88

2.98 2.36 1.76 3.55

* La actividad de la adenililciclasa se calcul a 37 en ausencia del sistema de regeneracin de ATP o a 30 en presencia del mismo. Se usaron las siguientes concentraciones de la hormona, tanto individualmente como de manera combinada: ACTH, 400 ug por mi; epinefrina, 400/g por mi; glucagon, 60 ( g por mi. Los valores son el medio de triplicar determinaciones desviacin estndar. FUENTE: L. Birnbaumer y M. Rodbell, /. Bol. Chem. 244:3479, 1969.

1000 I-

ID MINUTOS

FIGURA VE 15-3. Efecto del ion fluoruro, glucagon y una combinacin de glucagon y GTP sobre la sntesis de AMP cclico con una preparacin de membranas plasmticas aisladas de clulas hepticas. La notable estimulacin del GTP aqu mostrada se logr con una concentracin de GTP de 0.01 mM. Tambin se encontr que el ion fluoruro es un activador eficaz ce adenililciclasa y se emple en un gran nmero de ensayos subsecuentes. (Segn M. Rodbell y cois. J. Biol. Chem. 246:1879, 1971.)

regulan la respuesta de adenililciclasa a la hormona. Estudios subsecuentes en otros laboratorios demostraron que GTP incrementa la respuesta de los sistemas adenililciclasa a otras hormonas, incluyendo hormonas de pptidos, catecolarninas (p. ej., epinefrina) y prostagandinas. Los anlogos no hidrolizables de los trifosfatos de ncleosido son tiles porque permiten a los investigadores distinguir entre los efectos del enlace de nucletidos y la hidrlisis de nucletidos. Cuando un anlogo no hidrolizable de GTP, 5'-guanililmododifosfato, o Gpp(NH)p, se incuba con membranas plasmticas de hgado, glucagon, ATP y otros ingredientes necesarios para el sistema adenililciclasa, Gpp(NH)p imita los efectos estimuladores de GTP y lo hace de manera ms eficiente. Rodbell y sus colegas observaron que Gpp(NH)p provoca notable estimulacin de la actividad adenililciclasa en membranas aisladas de diferentes clulas eucariotas, cualquiera que sea la naturaleza de los receptores acoplados a estos sistemas. Ms an, el anlogo GTP no hidrolizable fue capaz de activar la adenililciclasa incluso en ausencia de hormonas.5 Puesto que GTP inhibe de manera competitiva la activacin de adenililciclasa por Gpp(NH)p, se supone que actan sobre el mismo sitio regulador. Estos resultados indican que el enlace de GTP, y no su hidrlisis, desempea un papel importante en la activacin de la estimulacin mediada por hormona de la formacin de AMP cclico. La principal diferencia entre las actividades de GTP y sus anlogos GTP no hidrolizables es que el primero estimula la adenililciclasa de manera transitoria, en tanto que los ltimos estimulan la actividad por un periodo prolongado. Estos datos condujeron a los investigadores a enfocarse en el mecanismo para la hidrlisis normal de GTP en el sistema adenililciclasa. A mediados de los aos 1970, varios laboratorios, incluyendo el de Rodbell, identificaron una GTPasa localizada en las membranas plasmticas de diferentes clulas. En un estudio clave, Don Cassel y Zvi Selinger, de la Universidad Hebrea

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de Jerusaln, encontraron que la adicin de isoproterenol (una hormona catecolamina similar a epinefrina) a un sistema para ensayar GTPasa de la membrana plasmtica provoc incremento de 30 a 70% en la hidrlisis de 32P-GTP estimado por la liberacin de 32P {fig. VE 15-4).6 La estimulacin de la actividad GTPasa por la catecolamina fue independiente de la actividad adenililciclasa. Esta conclusin se basa en el hecho de que: 1) la adicin de AMPc en el ensayo de GTPasa no tiene efecto sobre la tasa de hidrlisis de GTP, y 2) el tratamiento de la membrana con N-etilmaleimida, un compuesto que inactiva ciertas protenas atacando sus grupos sulfidrilo (-SH), provoc 98% de inhibicin de adenililciclasa pero no tuvo efecto sobre la hidrlisis de GTP estimulada por catecolamina. Todava no se sabe si las actividades de GTPasa y de adenililciclasa residen en la misma protena o en dos protenas separadas. De cualquier manera, Cassel y Selinger propusieron que la hidrlisis de GTP por la GTPasa sirve para desactivar la adenililciclasa activada y retornar la enzima a estado basal inactivo. En un estudio subsecuente, estos mismos investigadores demostraron que la activacin del receptor por enlace de la hormona provoca la liberacin de GDP enlazado formado por hidrlisis en intercambio de GTP que entra al sitio de enlace del nucletido de guanilo de la protena reguladora.7 Esta funcin de intercambio fue demostrada al incubar preparaciones de membranas de eritrocitos de pavo con una hormona de catecolaminas adems de 3H-GTP, lavado de las membranas y luego incubacin de la preparacin con ms hormona. En estas condiciones, la hormona indujo la liberacin de casi 25% del nucletdo radiactivo enlazado a la membrana. El anlisis

250 r

200 -

10 TIEMPO (minutos)

15

FIGURA VE 15-4. Curso temporal de la hidrlisis de GTP en presencia y en ausencia de la catecolamina isoproterenol por membranas de eritrocitos aisladas de pavo. El efecto de la hormona se observa en la curva inferior, en la cual se grfica la diferencia en la hidrlisis de GTP entre las preparaciones tratadas con hormona y las preparaciones testigo. (Segn D. Cassel y Z. Selinger, Bioc. Biop. Acta 452:543, 1976.)

del nucletido liberado por la hormona indic que era 3HGDP. Estos estudios sugirieron que, en presencia de la hormona, el GTP se enlazaba inicialmente por el sitio de enlace del nucetido de guanilo y luego era hidrolizado por actividad GTPasa con la liberacin subsecuente del producto GDP. La liberacin de GDP inducida por la hormona se estimula por la presencia de concentraciones bajas de GTP, lo que sugiere que el nucletido liberado por la hormona es reemplazado de manera concurrente por el nucletido de guanilo presente en el medio. Segn estos resultados, se propuso que la reaccin GTPasa en el sitio de enlace de nucletido de guanil (conocido como sitio regulador) produce un GDP fuertemente enlazado que inactiva la adenililciclasa. El enlace de una molcula de hormona al receptor desencadena un cambio de conformacin en el sitio nucletido de guanilo, lo que permite su acceso al medio que lo rodea (fig. 15-12). Puesto que las clulas mantienen una concentracin mucho ms alta de GTP en comparacin con GDP, el acceso al sitio de enlace del nucletido favorece que una molcula de GTP desplace al GDP enlazado, provocando la activacin transitoria de la actividad adenililciclasa. Los resultados de los diferentes experimentos que acabamos de describir demuestran la existencia de un componente regulador del sistema hormona-adenililciclasa activado por el enlace de GTP y desactivado por la hidrlisis de GTP. Se ha vuelto la atencin a otras preguntas. La protena enlazada a GTP, como se le llama, es parte integral de la adenililciclasa o un elemento separado? Si la protena enlazada a GTP es un elemento separado, cul es su estructura y de qu manera interacta con los otros elementos principales del sistema, el receptor y la adenililciclasa? Para tomar el camino que conduce a responder estas cuestiones se requiere una breve disgresin. El clera es una enfermedad causada por una toxina bacteriana que provoca diarrea excesiva acompaada de prdida de agua en los individuos afectados. A principios del decenio de 1970, varios laboratorios determinaron que la toxina del clera acta estimulando la adenililciclasa en las clulas del epitelio intestinal. Experimentos subsecuentes revelaron que el efecto de la toxina no se confina a las clulas intestinales, sino que es eficaz para evocar varias respuestas mediadas por la estimulacin hormonal de la adenililcicasa. Se hizo evidente que la toxina del clera imitara la accin de las hormonas al actuar sobre uno de los elementos comnmente presentes en el sistema adenililciclasa. En 1977, Cassel y Selinger demostraron que la toxina acta inhibiendo la actividad GTPasa de la membrana, que equivale al efecto de mantener la adenililciclasa en estado de estimulacin prolongada (fig. VE 15-5).8 Esta observacin demostr ser una de las claves para purificar la protena enlazada a GTP. La coenzima NAD+ est formada por un grupo ADPribosa unido a una fraccin nicotinamida (fig. 3-26). La toxina del clera inactiva a la protena enlazada a GTP transfirindole un grupo ADP-ribosa desde el NAD + a la protena, reaccin conocida como ADP-ribosilacin. Se observ que cuando las membranas plasmticas de los eritrocitos de pichn se incuban con la toxina del clera en presencia de NAD + marcado con 32P, la radiactividad se transfiere desde el NAD+ a una protena de membrana que tiene un peso molecular de 42 kD determinado por electroforesis en gel de poliacrilamida con

664

CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre as clulas y su ambiente

350r
CH C 1 _ffl
^

CUADRO VE 1 >-2. Purificacin del elemento regulador

1U

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300

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(G/F) de la adenililciclasa del hgado de conejo"

Unidades total (nmol/ min) 4380 2930 1820 740 Actividad especfica (nio! min mg)

< c 250
o E o a a 200 - /
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Paso Extracto de colato de membranas DEAE-sefacel nlfrvilTal /ALrto** ArA^d. Ljirrugci HeptilaminaBpfirnRa

Protena (mg) 2020

Recuperacin (%)

10

i
vi
0) (B

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-~~ "* "

c -I to 150

100 67 42 17 8.0 6.6 3.5

2.2 26 190 1060 1200 1600 3800

L 0

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1 1ti1

114 9.8 0.70 0.30 0.18 0.039

0.5

1.0

20

Hidroxiapatita GTP-sefarosa DEAE-sefacel

FIGURA VE 15-5. Efecto de la toxina del clera sobre las actividaclasa (derecha) con diferentes concentraciones de GTP. Las membranas tratadas previamente en ausencia (crculos abiertos) o presencia (crculos cerrados) de toxina se ensayaron para actividad GTPasa y adenililciclasa a las concentraciones indicadas de GTP. (Segn D. Cassel y Z. Selinger, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 74:3309, 2977.)

350 290 150

dodecilsulfato de sodio (EGPA-DSS).9 Un estudio similar efectuado por otro grupo de investigadores demostr que cuando menos dos protenas, de 45 kD y de 52 a 53 kD, eran ADP ribosilado por la toxina del clera cuando se ensayaron en una estirpe de clulas cultivadas de linfoma de ratn (llamadas clulas 549) .10 Se emplearon estas clulas en particular porque se dispona de una estirpe muante de ellas incapaz de producir AMPc en respuesta a diferentes hormonas que de otro modo habran provocado dicha respuesta. Esta variante de la estirpe celular, conocida como cyc~, posee adeniilciclasa activable, pero al parecer carece de algn otro componente necesario para la respuesta hormonal. Cuando se incubaron clulas cyc~ con toxinas del clera en presencia de 32P-NAD+, las bandas marcadas por clulas nativas estaban ausentes o muy reducidas. Estos resultados confirman fuertemente la idea de que: 1) los elementos reguladores del sistema de respuesta a adenililciclasa son fsica y genticamente separables de la propia adenililciclasa, y 2) uno o ms de estos elementos reguladores separables (como parte de la protena enlazada a GTP) es un sustrato de la toxina del clera. En 1980, Alfred Gilman y sus colaboradores, de la Universidad de Virginia, lograron purificar la protena enlazada a GTP luego de varios aos de trabajo preliminar. La purificacin se logr extrayendo protenas de membranas plasmticas de hgado en detergente y sometiendo la mezcla a seis procedimientos cromatogrficos sucesivos (cuadro VE 15-2).11 Igual que en cualquier procedimiento de purificacin se requiri un ensayo para identificar la protena buscada en las diferentes fracciones generadas por cada uno de los procedimientos cromatogrficos. El ensayo para la protena enlazada a GTP (o G/F, como se le denomin en este estudio) se bas en la observacin justamente descrita de que las clulas muanles S49 cyc~ del linfoma carecen de esta protena reguladora clave y por lo tanto no responden a la estimulacin hormonal. La adicin de fracciones purificadas de la protena enlazada a GTP a

*Se extrajeron membranas plasmticas de hgado de conejo (8.6 g de protena) y se purificaron. La actividad se midi mediante reconstitucin de la actividad de adenililciclasa activada por fluoruro en membrana cyc~. La actividad especfica se define como la cantidad de actividad reconstituida por cantidad de G/F aadida a la mezcla de reconstitucin. Las recuperaciones son acumulativas a travs de la preparacin. FUENTE: J.K. Northup y cois. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 77:6518, 1980.

membranas plasmticas aisladas de clulas cyc restituy a las preparaciones su capacidad de responder a los estmulos (en este caso iones fluoruro, que imitan la accin de GTP} por activacin de la adenililciclasa. La actividad especfica de la protena enlazada a GTP en cada paso de la purificacin (cuadro VE 15-2) se define como la cantidad de actividad de adenililciclasa restituida observada por cantidad de protena aadida a las membranas. Como se indica en el cuadro, la actividad especfica del extracto de detergente incrementa aproximadamente 2 000 veces durante el procedimiento de purificacin, que corresponde a una purificacin de 5 000 a 10 000 veces de las membranas plasmticas, o casi 100 000 veces de la protena celular total. Cuando la protena purificada enlazada a GTP se someti a EGPA-DSS, se observ la presencia de tres polipptidos distintos (pesos moleculares de 52, 45 y 35 kD), lo que indica que la projena reguladora es un complejo de mltiples subunidades. De los tres polipptidos identificados en el estudio inicial, el polipptido de 52 kD estaba presente en cantidades mucho rns pequeas y ms variables y finalmente se observ que no era un miembro de la protena enlazada a GTP. El polipptido de 45 kD se conoci como subunidad a y el polipptido de 35 kD como subunidad /3. Posteriormente se descubri un tercer polipptido de 9 kD. De las tres subunidades, se demostr que la subunidad a de 45 kD es el polipptido que contiene el sitio de enlace del GTP y tambin es e polipptido ADP-ribosilado por la toxina del clera. Conforme se efectuaban estos estudios, en el laboratorio de Gilman se sigui otra lnea de investigacin enfocada sobre una protena que inhibe la adenililciclasa mediante un proceso dependiente de GTP. Se observ que la protena inhibidora es inactivada por una toxina (llamada IAP) producida por la bac-

CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre las clulas \j su ambiente

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teria (BordeteUa pcrtusss) que causa la tos ferina. Cuando las preparaciones plasmticas de ciertas clulas que muestran control inhibidor sobre adenilciclasa se tratan con la toxina IAP purificada, se incrementa la actividad de adenilciclasa, sugiriendo que la toxina inactiva al inhibidor. Estudios adicionaes indicaron que la toxina IAP puede inactivar al inhibidor dependiente de GTP por la misma reaccin (ribosilacin de ADP) empleada por la toxina del clera para inactivar la protena estimuladora enlazada a GTP. Cuando se incubaron membranas plasmticas de hgado con la toxina IAP en presencia de 32P-NAD+, se encontr que la radiactividad se transfiere a una protena compuesta de dos subunidades con pesos moleculares de 41 kD y 35 kD.12 De las dos subunidades, el polipptido de 41 kD es el sustrato aparente de la toxina. Ninguno de estos polipptidos fue marcado por la toxina del clera. Datos adicionales indican que el polipptido de 41 kD contiene un sitio de enlace para GTP. Luego de incubacin con un anlogo GTP hidrolizable, la protena inhibidora enlazada a GTP (mencionada en esas publicaciones como sustrato IAP) se disocia en sus dos subunidades de manera anloga a como lo hace la protena estimuladora enlazada a GTP (mencionada como G/F}. Estos resultados apuntan a una fuerte homologa entre G/F y el sustrato IAP. Ambas protenas fueron purificadas siguiendo los mismos pasos; ambas respondieron de manera similar a los anlogos GTP no hidrolizables y la activacin por fluoruro; las subunidades ms grandes de ambas protenas (45 kD para G/F y 41 kD para IAP) contienen sitios para la ribosilacin de ADP por toxinas especficas y sitios de enlace para GTP; y las subunidades menores de 35 kD fueron indistinguibles. Estos investigadores concluyeron con la afirmacin: "Es posible que la actividad cataltica de [adenilciclasa] sea modulada de manera recproca por un par de homlogos de protenas reguladoras enlazadas a GTP, G/F (Gs) y el sustrato IAP (G). Adems, es intrigante el hecho de que la transducina, una protena reguladora enlazada al nucletdo guanina del segmento ms externo de los bastones [de la retina] que interacta con una fosfodiesterasa GMP cclica activada por luz, muestre notables semejanzas estructurales funcio-

nales. Una interesante familia de protenas que parece estar surgiendo." BIBLIOGRAFA
1. Robison, G.A., Butcher, R.W. y Sutherland, E.W. 1969. Cyclic AMP. Ann. Rev. Biochem. 37:149-174. 2. Birnbaumer, L. y Rodbell, M. 1969. Adenyl cyclase in fat cells. II. Hormone receptors. /, Biol Chem. 244:3477-3482. 3. Rodbelf, M. y cois. 1971. The glucagon-sensitive adenyl-cyclase system in plasma membranes of rat liver. IV. Effects of guanyl nucleotides on binding of 125l-glucagon. /. Biol. Chem. 246:187218764. Rodbell, M. y cois. 1971. The glucagon-sensitive adenyl cyclase system in plasma membranes of rat liver. V. An obligatory role of guanyl nucleotides in glucagon action. /. Biol. Chem. 246:18771882. 5. Londos, C. y cois. 1974. 5'Guanylylimidodiphosphate, a potent activator of adenylate cyclase systems in eukaryotic cells. Proc. Nati. Acad. Sd. U.S.A. 71:3087-3090. 6. Cassel, D. y Selinger, 2. 1976. Catecholamine-stimulated GTPase activity in turkey erythrocyte membranes. Biochem. Biop. Acta 452:538-551. 7. Cassei, D. y Selinger, Z. 1978. Mechanism of adenylate cyclase activation hrough the /?-adrenergic receptor: Catecholamine-induced displacement of bound GDP by GTP. Proc. Nati Acad. Sci. U.S.A. 75:4155-4159. 8. Cassel, D. y Selinger, Z. 1977. Mechanisrn of adenylate cyclase activation by cholera toxin: Inhibition of GTP hydrolysis at the regulatory site. Proc. Nati Acad. Sci. U.S.A. 74:3307-3311, 9. Gil, D.M. y Meren, R. 1978. ADP-ribosylation of membrane proteins catalyzed by cholera toxin: basis of the activation of adenylate cyclase. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 75:3050-3054. 10. Johnson, G.L., Kasow, H.R. y Bourne, H.R. 1978. Genetic evidence that cholera toxin substrates are regulatory components of adenylate cyclase. /. Biol. Oan. 253:7120-7123. 11. Northup, J. y cois. 1980. Purifcation of the regulatory component of adenylate cyclase. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 77:6516-6520. 12. Bokoch, G.M. y cois. 1983. Identification of the predominan! substrate for ADP-ribosylation by islet activating protein. /. Biol. Chem. 258:2072-2075.

SINOPSIS
La transmisin de seales en una clula es un fenmeno mediante el cual se transmite informacin a travs de la membrana plasmtica al interior de la clula y con frecuencia al ncleo celular. La emisin de seales celulares tpicamente incluye reconocimiento, del estmulo en la superficie externa de la membrana plasmtica; transferencia de la seal a travs de la membrana plasmtica, y transmisin de la seal al interior de la clula, desencadenando una respuesta. Las respuestas pueden incluir cambio en la expresin de genes, alteracin de la actividad de enzimas metabcas, reconfiguracin de! citoesqueleto, cambio de la permeabilidad a iones, activacin de la sntesis del DNA, o la muerte de la clula. Con frecuencia este proceso se denomina transduccin de seal, puesto que el estmulo recibido en la superficie de la clula es totalmente diferente de la seal liberada en el interior de la misma. Dentro de la clula, la informacin pasa lo largo de vas para transduccin de seales, que con frecuencia incluyen varias proteincinasas y protemfosfatasas capaces de activar o inhibir sus sustratos mediante cambios de conformacin. Otra caracterstica prominente de las vas para emisin de seales es el uso de as protenas enlazadas a GTP que sirven como interruptores para activar o desactivar las actividades. La informacin no siempre se transmite desde el espacio extracelular al interior de la clula mediante un receptor en la superficie celular; hormonas esteroides y xido ntrico, por ejemplo, difunden a travs de la membrana celular y actan directamente en el interior de la clula (/'. 628). Muchos estmulos extracelulares {primeros mensajeros) inician sus respuestas interactuando con un receptor acoplado a

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CAPITULO 15 Seales celulares: con unican entre las clulas y su ambiente

protena G sobre la superficie externa de la clula y provocando la liberacin de un segundo mensajero dentro de la misma. La captacin y aprovechamiento de la glucosa son controlados por este tipo de vas para emisin de seales. La desintegracin del glucgeno en glucosa es estimulada por las hormonas epinefrina y glucagon, que actan como primeros mensajeros al enlazarse a sus respectivos receptores sobre la superficie externa de clulas especficas. El enlace de las hormonas activa un efector, adenilciclasa, en la superficie externa de la membrana, lo que conduce a la produccin de un segundo mensajero difusible, el AMP cclico (AMPc). El AMP cclico induce su respuesta a travs de una reaccin en cascada en la cual se modifican una serie de enzimas por enlaces covalentes. Las molculas de AMP cclico se enlazan al sitio regulador de una proteincinasa dependiente de AMPc denominada PKA, la cual fosforila fosforilasa cinasa y glucgeno sintasa, activando a la primera enzima e inhibiendo a la ltima. Las molculas activadas de fosforilasa cinasa aaden fosfatos a la glucgeno fosforilasa, activando a esta ltima enzima, lo que conduce a desintegracin del glucgeno para formar glucosa fosfato, que se convierte a glucosa. Como resultado de esta reaccin en cascada, el mensaje original, entregado por enlace de la hormona en la superficie celular, se amplifica extensamente y se reduce mucho el tiempo de respuesta. Otra ventaja de este tipo de reaccin en cascada es la posibilidad de regulacin en diferentes sitios. La alteracin de las funciones de la protena como resultado de adicin de grupos fosfato por las cinasas es revertida por fosfatasas que eliminan los fosfatos. El AMP cclico se introduce en muchas clulas diferentes como respuesta a una gran variedad de primeros mensajeros. El curso de acontecimientos en la clula efectora depende de las protenas especficas fosforiladas por la cinasa dependiente de AMPc (p. 631). Tanto glucagon como epinefrina, y tambin muchos otros primeros mensajeros, actan por enlace a receptores que son protenas integrales de membrana que contiene siete hlices a que atraviesan la membrana. La seal se transmite desde el receptor al efector por medio de una protena G enterotrimrica. Estas protenas se conocen como enterotrimricas porque tienen tres subunidades (a, fi y y) y como protena G porque se une a nucletidos de guanina, sea GDP o GTP, Cada protena G puede existir en dos estados: uno activo con una GTP enlazada o un estado activo con GDP enlazado. Se han identificado ms de 100 diferentes receptores acoplados a protena G que responden a una gran variedad de estmulos diferentes. Todos estos receptores actan a travs de un mecanismo similar. El enlace del ligando a su receptor especfico provoca un cambio de conformacin del receptor que incrementa su actividad por la protena G. Como resultado, el receptor enlazado al ligando se enlaza a la protena G, a continuacin la protena G libera su GDP enlazado y se enlaza a un sustituto GTP, que activa a la protena G. El intercambio de nucletidos de guanina modifica la conformacin de la subunidad Ga, que se disocia de las otras dos subunidades, las cuales permanecen juntas como un complejo Gpy. Cada subunidad Ga disociada con su GTP fijo puede activar molculas aceptoras especficas, como adenililciclasa. La subunidad Ga disociada tambin es una GTPasa que acta para hidrolizar GTP enlazado y formar GDP enlazado, que suprime la capaci-

dad de la subunidad para activar molculas efectoras adicionales. El complejo Ga-GDP se asocia de nuevo con las subunidades G/ty para reconstituir el complejo trimrico y retornar el sistema a su estado de reposo. Cada una de las tres subunidades que constituyen una protena G enterotrimrica pueden existir en diversas isoformas. Diferentes combinaciones de subunidades especficas sirven para construir protenas G con propiedades diferentes en sus interacciones con receptores y efectores (p. 634). La fosfolipasa C es otro efector importante situado en la superficie interna de la membrana plasmtica que puede ser activada por protenas G enterotrimricas. La fosfolipasa C acta para separar el 4,5-difosfato de fosfatidilinositol (PIP2) en dos segundos mensajeros diferentes, 1,4,5-trisfosfato de inositol (IP3) y 1,2-diacilglicerol (DAG). El DAG permanece en la membrana plasmtica donde activa a la enzima proteincinasa C, que fosforila residuos de serina y treonina sobre varias protenas especficas, incluyendo enzimas del metabolismo intermedio, como la glucgeno sintasa, y factores de transcripcin, como la rniogenina. La activacin constitutiva de la proteincinasa C conduce a prdida del control del crecimiento. El IPs es una molcula pequea hidrosoluble que puede difundir hacia el citoplasma, donde se enlaza a receptores IPs localizados en la superficie del RE liso. Los receptores IPj son canales tetramricos para el ion calcio; su enlace con IP^, abre el canal inico y libera Ca2+ en el citoplasma (p. 639). La rpida elevacin del Ca2+ citoplsmico, sea provocado por la abertura de los canales inicos en la membrana citoplsmica o de canales inicos en la membrana plasmtica, desencadena una gran variedad de respuestas celulares. La concentracin de Ca2+ normalmente se conserva a 10~7 M, aproximadamente, dentro del citoplasma por accin de bombas de Ca2+ localizadas en la membrana plasmtica y en el RE liso. Muchos estmulos diferentes, que van desde el espermatozoide fertilizante hasta la llegada de un impulso nervioso en la clula muscular, provocan elevacin sbita del [Ca2+] citoplsmico, que puede ocurrir despus de la abertura de los canales del Ca2+ en la membrana plasmtica, receptores de IPs, o receptores de rianodina, que son un tipo diferente de receptor-canal de calcio localizado en la membrana del retculo endoplsmico liso. Segn el tipo de clula, los canales de rianodina pueden abrirse por un potencial de accin que llega a la'clula, por la sntesis del segundo mensajero ribosa de difosfato de adenosina cclica (ADPRc), o por el flujo hacia adentro de una pequea cantidad de Ca2+ a travs de la membrana plasmtica. Entre las respuestas, el [Ca2+] elevado puede activar o inhibir varias enzimas y sistemas de transporte, provocar fusin de la membrana o alteraciones en el citoesqueleto, o funciones contrctiles. El calcio no acta sobre estos diferentes efectores en su estado inico libre, sino que se enlaza a algunas de las escasas protenas enlazadas a calcio, que a su vez despiertan la respuesta. La ms ampliamente difundida de estas protenas es la calmoduna, que contiene cuatro sitios para enlazar calcio. El ion calcio es un segundo mensajero particularmente importante en clulas vegetales, donde es mediador de la respuesta a varios estmulos, incluyendo cambios en la luz, presin, gravedad y concentracin de hormonas vegetales, como el cido abscsico (p. 641).

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Muchos estmulos extracelulares inician una respuesta celular porque se enlazan al dominio extracelular de un receptor de tirosincinasa (RTK), que inicia la actividad de tirosincinasa de la protena localizada en la superficie interna de la membrana plasmtica. La insulina inicia muchas de sus acciones sobre clulas receptoras mediante interaccin con el receptor de insulina, que es un RTK. La cinasa activada aade grupos fosfato a residuos de tirosna localizadas en el receptor y en sustratos selectivos (SRI). Los SRI fosforilados entonces pueden enlazarse y activar a varios efectores por delante de la va. Los residuos de tirosina fosforilados en un SRI sirven como "atracaderos" para protenas que poseen dominios SH2, las cuales se activan al enlazarse al SRI. Puesto que algunas protenas diferentes que contienen dominios SH2 pueden enlazarse a SRI fosforilados, se pueden activar varias vas separadas para transmisin de seales. En tanto una va pueda estimular la sntesis de DNA y la divisin de la clula, otra quiz estimule el movimiento de los transportadores de glucosa hacia la membrana celular, y otra ms todava pueda activar factores de transcripcin que inicien la expresin de un grupo de genes especficos para insulina (p. 646). Diversos agentes extracelulares interactan con los RTK sobre la superficie de clulas efectoras especficas y regulan diversas funciones, incluyendo crecimiento y proliferacin celular, el curso de la diferenciacin celular, la captacin de partculas extraas y la supervivencia de la clula. Los ligandos estimuladores del crecimiento mejor estudiados, como FCDP, FCE y FCF, activan la va de transmisin de seales denominada cascada cPAM, que incluye una pequea protena monomrica enlazada a GTP llamada Ras. Igual que otras protenas G, Ras oscila entre una forma inactiva enlazada a GDP y una forma activa enlazada a GTP. En su forma activa, Ras estimula efectores situados hacia adelante en la va de emisin de seales. Igual que otras protenas G, Ras tiene una actividad GTPasa intrnseca que hidroliza al GTP enlazado para formar GDP enlazado, modificando a s misma su estado para desactivarse. Cuando un ligando se enlaza a RTK, la autofosforilacin del dominio citoplsmico del receptor conduce al reclutamiento de Ras en la superficie interna de la membrana y al intercambio de GDP enlazado por un GTP, activando as la protena G. El Ras activado tiene mayor afinidad por otra protena denominada Raf, reclutada en la membrana plasmtica donde se convierte en una proteincinasa activa que inicia una cadena ordenada de reacciones de fosforilacin, delineadas en la figura 15-27. Los efectores finales de la cascada cPAM son los factores de transcripcin que estimulan la expresin de genes cuyos productos desempean un papel clave en la activacin del ciclo celular que conduce al inicio de

la sntesis de DNA y divisin de la clula. La cascada cPAM tambin estimula la sntesis de protenas liberando la inhibicin ejercida por una protena citoplsmica llamada PHAS-1 que se enlaza a uno de los factores clave de inicio (eFI4E). La cascada cPAM se observa en todos los eucariotes, desde levaduras hasta mamferos, aunque ha sido adaptada por la evolucin para despertar muchas respuestas diferentes en distintos tipos de clulas (p. 648). Diferentes sistemas para emisin de seales a menudo se interconectan de modo que las seales de varios ligandos no relacionados puedan convergir para activar un ef ector comn, como Ras; las seales del mismo ligando pueden divergir para activar a varios efectores, y se pueden pasar seales hacia atrs y hacia adelante entre distintas vas (interferencia). La convergencia entre vas para emisin de seales se ilustra por el enlace de FCE, FCDP e insulina, todos los cuales activan Ras y la cascada cPAM. La divergencia tambin se ilustra con estos mismos ligandos, los cuales despus de enlazarse a sus respectivos RTK pueden activar varias vas adems de la cascada de proteincinasa activada por mitgeno. Las vas estimuladas por AMPc y Ca2+ participan en la interferencia ejemplificada por la capacidad de los iones calcio para activar adenilciclasa y por la proteincinasa dependiente de AMPc (PKA) para fosforilar canales del ion Ca2+ (p. 651), El xido ntrico (NO) acta como mensajero intercelular capaz de difundir directamente a travs de la membrana plasmtica de la clula efectora. Entre las actividades estimuladas por NO se incluyen la fagocitosis por macrfagos, relajacin de las clulas de msculo liso que reviste los vasos sanguneos, y la contraccin peristltica del msculo liso del intestino. El NO se produce por accin de la enzima sintasa de xido ntrico, que usa arginina como sustrato. NO acta activando la guanilil ciclasa para producir el segundo mensajero GMPc (p. 656). Las vas para emisin de seales pueden terminar en apoptosis: muerte programada de la clula. Ejemplos de apoptosis incluyen la muerte del exceso de clulas nerviosas, muerte de tejido embrionario no deseado, muerte de linfocitos T capaces de reaccionar contra los propios tejidos del cuerpo y la muerte de clulas potencialmente cancerosas. La muerte por apoptosis se caracteriza por compactacin total de la clula y su ncleo y la diseccin ordenada de la cromatina por endonucleasas especiales. AI parecer, la apoptosis es mediada principalmente por la liberacin de Ca2+ y la activacin de ciertas proteincinasas, y requiere la activacin de un grupo especfico de genes (p. 658).

PREGUNTAS DE REPASO
1. Describir, en trminos generales, los pasos que ocurren durante la emisin de seales celulares desde la secrecin de un factor de crecimiento u hormona por un tejido hasta la respuesta por una clula efectora. 2. Qu se entiende con el trmino transducdn de seal y por qu se utiliza? 3. En qu se parece una va para emisin de seales, como la cascada cPAM, a un sistema de transporte de electrones? En qu es diferente? 4. En la figura 15-2, el ltimo elemento de la va es un factor de transcripcin. Describir los pasos de una va en la cual sea fosforilado un factor de transcripcin.

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CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre las clulas y su ambiente

5. Cmo es posible que el mismo primer mensajero, como la epinefrina, pueda inducir respuestas diferentes en distintas clulas efectoras? Que el mismo segundo mensajero, como AMPc, pueda tambin evocar respuestas diferentes en distinas clulas efectoras? Que la misma respuesta, como la desintegracin de glucgeno, se pueda iniciar por diferentes estmulos? 6. Describir los pasos que conducen desde la sntesis del AMPc en la superficie interna de la membrana plasmtica de una celdilla heptica hasta la liberacin de glucosa en el torrente sanguneo. Cmo se puede controlar este proceso mediante inhibidores enzimticos, como el inhibidor-1? Mediante proteinfosfatasa? Mediante AMPc fosfodiesterasa? 7. Qu se entiende por el trmino amplificacin en relacin con la transduccin de seales? De qu manera el uso de una reaccin en cascada produce una amplificacin de la seal? Cmo incrementa las posibilidades de regulacin metablica? 8. Describir los pasos que ocurren entre el enlace de un Hgando, como glucagon, a un receptor de siete hlices y la activacin de un efector, corno a adeniilciclasa. De qu manera se atena normalmente la respuesta? 9. Qu determina si un estmulo que acta a travs de una protena G heterotrimrica ser estimulador o inhibidor para un efector?

10. Mencione dos estmulos extracelulares que conduzcan a la formacin de IPs. Cul es el mecanismo de formacin de este segundo mensajero? Cul es la relacin entre la formacin de IP3 y la elevacin de [Ca2+] intracelular? 11. Describir la relacin entre fosfatidilinositol, diacilglicerol, iones calcio y proteincinasa C. De qu manera interfieren los esteres de forbol con las vas para emisin de seales en las cuales participa diacilglicerol? 12. Describir el papel del calcio en la mediacin del dimetro de los estomas por las clulas guardianes. 13. Describir los pasos entre el enlace y una molcula de insulina en la superficie de una clula especfica y la activacin del efector PI(3)K. En qu difiere la accin de la insulina de los otros ligandos que actan por medio de un receptor de tirosincinasa? 14. Cul es el papel de Ras en las vas para transduccin de seales? De qu manera promueve la divergencia y la convergencia en estas vas? 15. Cmo altera la cascada cPAM la actividad de transcripcin y de traduccin en una clula? 16. Describir los pasos en la va para emisin de seales mediante la cual el xido ntrico media la dilatacin de los vasos sanguneos.

PREGUNTAS ANALTICAS
1. Hicimos notar que el terna de la emisin de seales celulares se coloc casi al fin del libro porque est ntimamente vinculado con muchos temas diferentes en biologa celular. Ahora que usted ha ledo el captulo, estara de acuerdo o en desacuerdo con esta afirmacin? Apoye sus conclusiones con ejemplos. 2. Supongamos que la va de emisin de seales de la figura 15-2 conduce a la activacin de un gen que inhibe una cinasa dependiente de ciclina. Cmo afectara una mutacin debilitante en la fosfatasa-2 al crecimiento de la clula? Cmo afectara una mutacin similar en la proteincinasa-3 al crecimiento de la clula? 3. Cul sera el efecto sobre la funcin heptica de una mutacin en un gen que codifica AMPc fosfodiesterasa? De una mutacin en un gen que codifica un receptor para glucagon? De una mutacin en un gen que codifica fosforilasa cinasa? De una mutacin que altere el sitio activo de la subunidad GTPasa de una Gnl 4. Ca2+, I?3 y AMPc son segundos mensajeros muy diferentes. En qu se parecen sus mecanismos de accin? En qu son diferentes? 5. En la reaccin en cascada ilustrada en la figura 15-27, qu pasos conducen a la amplificacin y cules no? 6. Supongamos que la epinefrina y la norepinefrina pueden iniciar una respuesta similar en una clula efectora particular. Cmo se podra demostrar que los dos compuestos actan enlazndose a! mismo receptor en la superficie de la clula? 7. Uno de los experimentos claves para demostrar que las uniones de abertura (pg. 215} permiten el paso de molculas pequeas se llev a cabo permitiendo que las clulas de msculo cardiaco (que responden a la norepinefrina contrayndose) formen uniones de abertura con clulas de la granulosa ovrica (que responden a la FSH al ser sometidas a varios cambios metablicos). A continuacin los investigadores aadieron FSH a la mezcla del cultivo celular. Qu resultados sera de esperar y cmo apoyan el papel de las uniones de abertura en la transmisin de seales entre las clulas? 8. Gomo afectara un anlogo de GTP no hidrolizable a los sucesos de emisin de seales que tienen lugar durante la estimulacin de una clula heptica con glucngon? Cu sera el efecto del mismo anlogo sobre la omisin de seales de una clula epitelial estimulada por el factor de crecimiento epidrmico, FCE? Cmo se compararan los efectos de la toxina del clera sobre estas mismas clulas? 9. Se esperara que la osfatidiicolina pudiera servir como precursor para un segundo mensajero que desencadena la seccin de una hormona en un tipo de clula endocrina cultivada que usted estaba estudiando. Adems, se sospechara que el segundo mensajero liberado por la membrana plasmtica en respuesta a un estmulo fuera fosfato de colina. Qu tipos de experimentos podran efectuarse para verificar su hiptesis? 10. La figura 15-16 muestra los cambios localizados en Ca2+ dentro de un macrfago durante la fagocitosis. Los iones

CAPITULO 15 Seales celulares: comunicacin entre las clulas y su ambiente de calcio son agentes pequeos rpidamente difusibles. Cmo una clula puede mantener concentraciones diferentes de este ion libre en diferentes regiones de su citoplasma? Qu sospechara usted que ocurriera si se inyecta un pequeo volumen de solucin de cloruro de calcio en una clula inyectada previamente con una sonda de calcio fluorescente? 11. Formular una hiptesis para explicar de qu manera el contacto de un espermatozoide fertilizante sobre 3a superficie exterior de un vulo en un sitio determinado puede provocar una onda de liberacin de Ca2+ que se propaga a travs de todo el vulo, segn se muestra en la figura 15-18. 12. Puesto que la calmodulina puede activar muchos efectores diferentes (p. ej., proteincinasas, fosfodiesterasas, protenas transportadoras de calcio), una molcula de calmodulina debe tener muchos sitios de enlace sobre su superficie. Estara usted de acuerdo con esta afirmacin? Por qu s

669

o por qu no?

13. La diabetes es una enfermedad que puede ser resultado de varios efectos, todos los cuales implican la funcin de la insulina. Describa tres diferentes anomalas moleculares en una clula heptica que podran causar a diversos pacientes un cuadro clnico similar, incluyendo, por ejemplo, concentracin elevada de glucosa en sangre y orina. 14. Esperara usted que una respuesta celular a FCE fuese ms sensible a la fluidez de la membrana plasmtica que su respuesta a insulina? Por qu si o por qu no? 15. Esperara usted que una mutacin en Ras actuara de manera dominante o recesiva como causa de cncer? Por qu? (Una mutacin dominante muestra su efecto cuando slo uno de los alelos homlogos presenta la mutacin, en tanto que una mutacin recesiva requiere que ambos alelos del gen presenten la mutacin.) 16. Especular acerca de un mecanismo mediante el cual la apoptosis pueda desempear un papel crucial para combatir el desarrollo del cncer, tema analizado en el siguiente captulo.

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CAPITULO

16

Cncer
16-1 Biologa del cncer 16-2 Causas del cncer 16-3 Gentica del cncer La va experimental: El descubrimiento de los oncogenes

FIGURA 16-A. Mamografa que muestra la presencia de un tumor. (Vu SlU/Visuals Unmited.)

l cncer es una enfermedad producida por cambios en la conducta de las clulas, provocada por modificaciones en la informacin gentica subyacente de las mismas. Debido a estas alteraciones, las clulas cancerosas proliferan sin control formando tumores malignos que tienden a crecer de manera invasiva (fig. 16-), destruyendo tejidos y rganos normales. En tanto el crecimiento del tumor permanezca localizado, la enfermedad de ordinario se puede tratar y curar por extirpacin quirrgica del tumor y el tejido que lo rodea. Sin embargo, una de las caractersticas prominentes de los tumores malignos es su tendencia a formar metstasis, o sea, clulas que se desprenden de la masa original entran a la circulacin linftica o sangunea y se propagan a sitios distantes en el cuerpo, donde establecen tumores secundarios (metstasis) que ya no son susceptibles de extirpacin quirrgica. Los cambios en la superficie celular que promueven la conducta metasttica de las clulas cancerosas se analizan en La perspectiva humana del captulo 7. Debido a su impacto sobre la salud humana y a la esperanza de encontrar una curacin, el cncer ha sido foco de esfuerzos intensos de investigacin durante decenios. Aunque estos estudios han conducido a un notable avance en el conocimiento de las bases celulares y moleculares del cncer, prcticamente no tienen impacto en la prevencin o el aumento de la tasa de supervivencia de personas afectadas con la mayor parte de los tipos de cncer. En la figura 16-2 se muestra la tasa de ocurrencia de diferentes tipos de cncer y la mortalidad consecuente en Estados Unidos. Los tratamientos actuales, como la quimioterapia y la radiacin, son incapaces de destruir selectivamente a las clulas cancerosas sin daar en forma simultnea a clulas normales, segn puede juzgarse por los graves efectos colaterales que acompaan a estos tratamientos. Como resultado, los pacientes por lo general no se pueden someter a dosis suficientemente alt.is para destruir todas las clulas tumorales de su cuerpo.

671

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CAPITULO 16 Cncer

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contra dichas clulas para destruir hasta la ltima de ellas. Gran parte de este optimismo se desvaneci en aos recientes conforme se acumularon datos de que el sistema inrnunolgco no es tan eficiente para destruir clulas cancerosas, como alguna vez se pens. Aunque en la actualidad se estn planeando pruebas clnicas de numerosos agentes estimuladores inmunolgicos o "vacunas contra el cncer", las expectativas alguna vez relacionadas con este tipo de ensayos clnicos han disminuido notablemente.

16-1

Biologa del cncer

FIGURA 1 6 - 1 . Invasin del tejido normal por un tumor en crecimiento. Esta micrografa de luz de un corte de hgado humano muestra metstasis de un melanosarcoma (en rojo) que invade el tejido heptico normal. (Micrografa por Astrid y Hanns-Frieder Michler/ Science Photo Library/Photo Researchers, Inc.)

Es difcil afirmar si esta situacin puede cambiar en un futuro cercano. En la actualidad se han identificado muchos de los genes y productos de gen causantes de los cnceres humanos, y ios investigadores tienen mejores objetivos que cumplir. La idea del tratamiento del cncer mediante geneterapia se analiz en La perspectiva humana del captulo 10 (pg. 423). Una curacin basada en la geneterapia puede ser la mejor expectativa a largo plazo en la guerra contra el cncer, pero los tratamientos de este tipo requieren que la mayor parte, si no es que todas, de las clulas tumorales se alteren genticamente. En el momento actual, la modificacin del genoma de miles de millones de clulas malignas enterradas profundamente en los tejidos del cuerpo todava es un proyecto distante. La mayor parte de los esfuerzos actuales para lograr tratamientos innovadores contra el cncer se centran en los intentos de obtener que el sistema inmunolgico participe de manera ms activa en la lucha contra las clulas malignas. Hace diez o veinte aos, aproximadamente, hubo gran optimismo por la posibilidad de inducir en el sistema inmunolgico de una persona la capacidad para reconocer clulas cancerosas como cuerpos extraos y establecer un ataque

Gran parte del conocimiento adquirido acerca de la conducta de clulas cancerosas humanas proviene de estudios en los cuales se cultivan clulas derivadas de un tumor. A nivel celular, la caracterstica ms importante de una clula cancerosa, ya sea que resida en el cuerpo o en un plato de cultivo, es la prdida de control de su crecimiento. La capacidad de crecimiento y divisin no es tan diferente entre una clula cancerosa y la mayor parte de las clulas normales. Cuando estas ltimas crecen en un cultivo de tejidos, bajo condiciones que favorecen la proliferacin celular, se desarrollan y dividen a una velocidad similar a la de sus contrapartes malignas. Sin embargo, cuando las clulas normales proliferan hasta el punto de cubrir el fondo del plato de cultivo, su tasa de crecimiento disminuye notablemente y tienden a permanecer como una capa simple (monocapa] de clulas (fig. 16-3, a,b). La disminucin de la tasa de crecimiento se debe a que las clulas responden a influencias inhibidoras de su ambiente. Estas influencias inhibidoras del crecimiento pueden surgir como resultado de deplecin de factores del crecimiento en el medio de cultivo o de contacto con clulas circunvecinas en el plato de cultivo. En contraste, cuando se cultivan clulas malignas en las mismas condiciones, continan creciendo, apilndose una encima de otra para formar grumos (fig. 16-3, c,d). Es evidente que las clulas malignas no responden a las influencias que causan el cese de crecimiento y divisin en sus contrapartes normales. Esta misma falta de respuesta a seales externas es la razn de que las clulas cancerosas constituyan una amenaza dentro del cuerpo. El crecimiento incontrolado, combinado con la tendencia a producir metstasis, confiere a las clulas malignas su caracterstica de amenaza mortal. Retornaremos

300
mE

_ [/) :=

250 200

= E

150

FIGURA 16-2. Incidencia de varios tipos de cncer en Estados Unidos y nmero de muertes que causan por ao. Tomado de los datos comunicados por el National Cncer Institute.

I
Mamas Pulmn y Prstata bronquios

Colon/ Unfoma no Leucemias Pncreas Todos recto de Hodgkin los dems

CAPITULO 16 Cncer Clulas normales

673

FIGURA 16-3. Propiedades del crecimiento de clulas normales y clulas cancerosas. Tpicamente, las cWissi Tiwnireies ciecen en un p'iaXo e cuYirvo "nasta que cubren la superficie del plato como una monocapa (ay b). En contraste, las clulas transformadas por virus o carcingenos qumicos (o clulas malignas cultivadas a partir de tumores) de manera peculiar crecen formando

(a)

Las clulas normales crecen err rrrorracape Clulas cancerosas

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de G. Stevcn Martin.)

Las clulas cancerosas crecen en grumos (focos) (e)

(d)

a los tipos de cambios celulares que sirven como marcas caractersticas de as cufas malignas., pero primero consideraremos algunas de las propiedades morfolgicas y bioqumicas que distinguen a las clulas normales de las malignas. Fenotipo de una clula cancerosa Se han catalogado numerosas diferencias, tanto estructurales como bioqumicas, entre clulas normales y clulas cancerosas. Sin embargo, tambin hay muchas variables de un tipo de cua cancerosa a otra, haciendo imposible describir las propiedades de una clula cancerosa "tpica". Tambin resulta difcil afirmar cules, de todas las diferencias entre clulas normales y cancerosas, son la principal causa de que la clula se vuelva potencialmente una amenaza para la vida, y cules son las propiedades secundarias que resultan de los cambios primarios. La conducta de las clulas cancerosas es ms fcil de estudiar cuando las clulas crecen en cultivo. Se pueden obtener clulas de este tipo extirpando un tumor maligno, disociando el tejido para separar las clulas y luego cultivando las clulas in vitro. Alternativamente, las clulas normales se pueden convertir en "clulas cancerosas" mediante tratamiento con un carcingeno qumico, radiaciones o un virus tumoral infeccioso. Las clulas as transformadas por sustancias qumicas o virus en cultivo por lo general pueden formar un tumor cuando se introducen en un animal husped apropiado. Las alteraciones ms notables despus de la transformacin ocurren en los cromosomas. En general, las clulas normales conservan su dotacin cromosmica diploide normal conforme crecen y se dividen, tanto in vivo como in vitro. En contraste, las clulas cancerosas con frecuencia presentan

dotacin cromosmica muy aberrante,, alteracia denomina da aneuploidia (ftg. 16-4). Estos caotipos muy aberrantes al parecer son resultado de crecimiento anormal de las clulas cancerosas, ms bien que una causa de las mismas. De todas maneras, es evidente que el crecimiento de las clulas cancerosas depende mucho menos de un contenido cromosmico normal en comparacin con las clulas normales. Los cambios morfolgicos ms notables que ocurren en el citoplasma casi siempre afectan al citoesqueleto. En tanto una clula normal por lo general contiene una red bien organizada de microtbulos, microflamentos y filamentos intermedios, el citoesqueleto de las clulas cancerosas a menudo est reducido, desorganizado, o ambas cosas (fig. 16-5). Tambin se ha comunicado que ocurren numerosos cambios en la superficie celular, incluyendo la aparicin (o incremento) y desaparicin (o disminucin) de componentes particulares^ Algunas clulas cancerosas poseen nuevas protenas en la superficie celular conocidas como antgenos asociados al tumor porque pueden inducir la formacin de anticuerpos dirigidos contra las clulas. Debido a los cambios en la superficie celular, tpicamente las clulas cancerosas son menos adherentes, tanto entre s como a los sustratos no celulares. Se cree que esta prdida de adhesividad se correlaciona con la capacidad de las clulas cancerosas para abandonar una masa tumoral y emigrar a otros sitios dentro del cuerpo. La disminucin de las interacciones adhesivas entre clulas tumorales tambin se refleja en la reduccin de su tendencia a formar uniones de abertura entre s (pg. 271). Tambin se puede distinguir a las clulas cancerosas de las normales por su movilidad en cultivo. Como se hizo notar en el captulo 9, la membrana de una clula normal, cuando entra en contacto con otra clula, cesa su actividad y

674

CAPITULO 16 - Cncer

** 11
12

16
* 19
20

17

21

22

FIGURA 16-4. Cariotipo de un tumor maligno de pncreas en un paciente varn, mostrando una dotacin de cromosomas totalmente anormal. La clula a partir de ia cual se prepar este cariotipo contiene un total de'60 cromosomas en vez del nmero normal de 46 (fig. 12-17, c) con dos cromosomas (nmeros 18 y 21) totalmente ausentes. La redisposicin de los cromosomas est indicada por flechas pequeas. (Segn Suresh C. ]hanwar, Memorial Sloan-Kettcring Cncer Center.)

lireccin original. Cuando las clulas normales son rodeadas por todos lados por otras clulas, su motilidad cesa; no pueden desplazarse una sobre otra y formar una capa en ef foncfo cfef pato efe cuftivo. Las cernas cancerosas por lo general ignoran las seales transmitidas
por clulas vecinas y continan sus actividades locomotoras

acostumbradas. Como se hizo notar antes, la vecindad de otras clulas tiene poco efecto sobre el crecimiento de las clulas cancerosas que continan proliferando en cultivo celular hasta afcanzar una densidad cefufar muy afta en comparacin con sus contrapartes normales (como en la figura 16-3, d).

(a)

(b)

FIGUKA 16-5. Comparacin del citoesqueleto microtubular en clulas cultivadas transformadas y testigos. La disposicin de los microtbulos en estas clulas se revel mediante inmunofluorescencia utilizando anticuerpos antitubulina. a) Estos fibroblastos se infectaron con un virus tumorai sensible a temperatura y se cultivaron a temperatura ms alta restrictiva en la cual la protena que transforma las clulas no es funcional. Las propiedades de crecimiento y la disposicin de los microtbulos son normales, b) Las clulas del mismo cultivo mostradas en a crecen a la temperatura permisiva ms baja en la cual se expresa el fenotipo transformado. El aparato citoesqueltico est muy desorganizado. (Segn Rala L Brown y cois. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78:5595, 1981.)

CAPTULO 16 Cncer

675

Las clulas cancerosas tambin dependen mucho menos de la presencia de suero (fig. 16-6), el cual les suministra factores de crecimiento, como el factor de crecimiento epidrmico (FCE) o insulina. La falta de dependencia del suero refleja la capacidad de las clulas cancerosas de proliferar sin depender de seales transmitidas desde sus receptores de superficie (cap. 15). Adems, a diferencia de las clulas normales, que requieren un sustrato slido sobre el cual crecer, las clulas cancerosas generalmente pueden crecer suspendidas en un medio formado por agar suave o metilcelulosa viscosa. Por esta caracterstica, se dice que'las clulas cancerosas han perdido su dependencia a la fijacin, de la cual depende el crecimiento de clulas normales. Ms importante an, las clulas normales en cultivo muestran capacidad limitada para la divisin celular; luego de un nmero finito de divisiones mitticas sufren un proceso de envejecimiento que las incapacita para continuar creciendo y dividindose. Por otro lado, las clulas cancerosas aparentemente son inmortales en el sentido de que continan dividindose de manera indefinida.

Clulas cancerosas - factores de crecimiento Clulas cancerosas del suero - factores de crecimiento del suero Clulas normales - factores de crecimiento del s Clulas normales + factores de crecimiento del suero

Tiempo de cultivo (das)

FIGURA 16-6. Efectos de la privacin de suero sobre el crecimiento de las clulas normales y transformadas. En tanto contine el crecimiento de las clulas cancerosas, independientemente de la presencia o ausencia de factores de crecimiento exgenos, las clulas normales requieren estas sustancias en su medio para que el crecimiento siga adelante. El desarrollo de las clulas normales se interrumpe conforme se agotan los factores de crecimiento en el medio.

16-2

Causas del cncer

En 1775, el cirujano britnico Percival Pott estableci la primera correlacin conocida entre un agente ambiental y el desarrollo de cncer cuando concluy que la elevada incidencia de cncer en la cavidad nasal y en la piel del escroto, observada en limpiadores de chimeneas, se deba a su exposicin crnica al holln. En los ltimos decenios de esta poca se han aislado sustancias qumicas carcingenas del holln junto con cientos de otros compuestos que demostraron capacidad para causar cncer en animales de laboratorio. Adems de varias sustancias qumicas, se ha demostrado que un gran nmero de otros tipos de agentes son carcingenos, incluyendo varios tipos de radiacin ionizante y algunos virus que contienen DNA y RNA. Todos estos agentes muestran una propiedad en comn: pueden provocar cambios en el genoma. Las sustancias qumicas carcingenas, como las presentes en el holln o el humo de cigarrillos, casi siempre se puede demostrar que son mutgenos directos o se pueden convertir en compuestos rnutgenos por accin de las enzimas celulares (fig. 16-7). De igual manera, la radiacin ultravioleta, causa principal del cncer de piel, tambin es fuertemente mutgena (pg. 567). Algunos virus son capaces de infectar clulas de vertebrados y transformarlas en clulas cancerosas. Estos virus se dividen en dos grandes grupos: virus DNA tumorales y virus RNA tumorales, segn el tipo de cido nucleico encontrado en la partcula viral madura. Entre los virus DNA capaces de transformar clulas se erA.cuen.tran. el virus polioma, el virus del simio 40 (SV40), el adenovirus y virus parecidos al herpes. Los virus RNA tumorales o retrovims tienen una estructura similar al HIV (fig. 1-21) y son el tema de La va experimental al final de este captulo. Aunque el uso de virus tumorales en el laboratorio es muy valioso para identificar genes que participan en la carcinognesis, dichos virus slo causan unos cuantos tipos menores de cncer humano, indicados en el cuadro 16-1. Los virus tumorales pueden transformar clulas debido a que contienen

genes cuyos productos interfieren con las actividades normales de regulacin del crecimiento de la clula. La determinacin de las causas de diferentes tipos de cncer es una tarea realizada por epidemilogos. La causa de ciertos tipos de cncer es evidente; por ejemplo, fumar causa cncer de pulmn y la exposicin a la radiacin ultravioleta genera cncer de piel. Pero a pesar de numerosos estudios, todava se desconoce la causa de la mayor parte de los otros tipos de cncer humano. Por ejemplo, es imposible determinar el nmero de tipos de cncer que se pueden atribuir a carcingenos sintticos en comparacin con carcingenos naturales presentes en la dieta. El hombre vive en ambientes complejos y est expuesto a muchos carcingenos potenciales en un patrn cambiante durante periodos de varios decenios. Los intentos para determinar causas de cncer 3 partir e una montaa de atos estadsticos obtenidos de respuestas a cuestionarios acerca de los estilos de vida individuales han demostrado ser una tarea casi irrealizable. Esto se ilustra por los resultados recientemente obtenidos a partir de un estudio de 16 aos de duracin efectuado por 120 000 enfermeras que sugieren que la ingestin de grasas en la dieta no puede ser un factor significativo en el desarrollo de cncer mamario, como generalmente se piensa. Al mismo tiempo, el estudio suministr mayores datos para establecer un vnculo entre la ingestin de grasa en la dieta y el desarrollo de cncer de colon. El anlisis de algunos tipos de mutaciones causadas por carcingenos especficos ha proporcionado informacin ms especfica, como la causa de algunos pocos tipos de cncer. Por ejemplo, se cree que la aflatoxina B producida por ciertos mohos es uno de los principales factores que contribuyen a la elevada ocurrencia de cncer heptico en China, donde los granos y las nueces se almacenan en condiciones que favorecen el crecimiento del moho. La aflatoxina B causa una sustitucin caracterstica G >T en un par de bases del codn 149 dentro del gen p53 supresor del' tumor, y de esta manera permite a los epidemilogos efec-

676

CAPITULO 16 Cncer Precarcingeno Carcingeno parcial Posibles carcingenos primarios

sulfotransferasa(s) Ac RE heptico (P-450)

,, +NADPH + O-,

V
2-Acetilaminofluoreno (AAF)
O Ac

CH3

M
M

RE heptico ^ (no P-450) +NADPH + 0 2

sulfotransferasa(s) heptica + PAPS

CH3

oso;

A/-metil-4-aminoazobenceno (MAB}

enz.

Nitro na FIGURA 16-7. Activacin de un compuesto para convertirse en carcingeno activo mediante la accin de enzimas celulares. Ninguno de los dos compuestos a la izquierda es carcingeno, pero ambos pueden convertirse en carcingenos activos por accin de las enzimas hepticas. (PAPS [3'-fosfoadenosina-5'fosfosulfato] es un donador de sulfato activado empleado por algunas enzimas que transfieren sulfato.) (Segm }.A. Miller y E.C. Miller, Origins o Human Cncer, Hiatt, H.H. y co/s., eds. 1977. Colci Spring Hnrbor Labornton/ Press.)

CUADRO 1 6 - 1 . Virus vinculados con tumores humanos Tipo e virus Virus de Epstein-Barr Leucoplasia pilosa Mononucleosis infecciosa Linfoma de Burkitt Cncer nasofarngeo Linfoma de clulas B en pacientes inmunosuprimidos Carcinoma hepatocclular Carcinoma cutneo, de ordinario en sitios expuestos al sol en pacientes con aloinjerto renal y en pacientes con EV Cncer cervical Cncer vulvar Cncer de pene Cncer anal y j. anal Carcinoma verrugoso de vulva y pene, tumores de Buschke-Lowenstein Leucemia de clulas T del adulto

Virus de la hepatitis B Virus del papiloma humano tipos 5, 8, 14, 17, 20

Hiperplasia focal heptica Placas cutneas y papilomas en pacientes con EV**

Virus del papiloma humano tipos 16, 18, 31*, 33, 35*, 39*, 45*, 51*, 52, 56*, 58*, 59*, 61* Virus del papiloma humano tipos 6, 11

Neoplasia cervical intraepitelial; vulvar, del pene y neoplasias intraepiteliales perianales Condiloma acuminado

Virus de la leucemia humana de clulas T de tipo I

Leucemia latente

* Rara vez se encuentran. ** Epidermodisp]asia verruciforme. FUENTE: H. zur Hausen, Science 254:1168,1991. Copyright 1991 American Association Cor the Advancement of Science.

CAPITULO 16 - Cncer

677

tuar algunas determinaciones acerca del efecto del carcingeno en la poblacin.

16-3 Gentica del cncer

El cncer es una de las dos principales causas de muerte en los pases occidentales. Ms o menos afecta a uno de cada tres individuos. As considerado, el cncer es una enfermedad muy comn. Pero a nivel celular el desarrollo de un cncer es un acontecimiento notablemente raro. Siempre que se estudian en gentica las clulas de un tumor canceroso, casi de manera invariable se descubre que se originan a partir de una sola clula. Por lo tanto, a diferencia de otras enfermedades que requieren la modificacin de un gran nmero de clulas, el cncer se produce por la proliferacin descontrolada de una sola clula descarriada (por esta razn se dice que es motiodonal). Consideremos por un momento que el cuerpo humano contiene trillones de clulas, billones de las cuales sufren divisin celular en cualquier momento determinado. Aunque casi cualquiera de estas clulas en divisin tiene la posibilidad de cambiar su composicin gentica y desarrollar un tumor maligno, esto slo ocurre en casi un tercio de la poblacin humana durante todo su ciclo de vida. Una de las principales razones de que la mayor parte de las clulas no generen tumores cancerosos es que la transformacin maligna requiere ms que una simple alteracin gentica. El desarrollo de un tumor maligno (tumorignesis) es un proceso de mltiples etapas caracterizado por la progresin de alteraciones genticas que reducen cada vez ms la capacidad de respuesta de las clulas al mecanismo regulador normal del cuerpo y las vuelve ms capaces de invadir tejidos normales, lo que causa que el tumor amenace cada vez ms la vida de la persona. La evolucin de un tumor con frecuencia se compara a la evolucin biolgica. La evolucin biolgica y el avance del tumor son impulsados por un proceso en el cual el xito individual se mide por el nmero de descendientes que produce. Las clulas dentro de un tumor que crecen con mayor rapidez y de la manera menos controlada son favorecidas en comparacin con otras clulas del tumor que producen un menor nmero de clulas hijas. Como veremos en breve, las mutaciones en genes diferentes confieren propiedades diferentes a la clula en la cual ocurren. El resultado es la seleccin de cambios genticos que tienden a promover crecimiento y divisin descontrolados, y las clulas en las cuales ocurre esto tienden a convertirse en el tipo de clula predominante del tumor. En muchos casos, la primera etapa en el desarrollo de un tumor maligno es la formacin de un tumor benigno compuesto de clulas que ya no responden al control de crecimiento normal, pero que carecen de la capacidad para invadir tejidos normales, o provocar metstasis en sitios distantes. Algunos tumores benignos tienen pocas probabilidades de convertirse en malignos, pero otros, como los plipos que pueden aparecer en la pared del colon (fig. 16-17), es muy probable que produzcan clulas que atraviesan la frontera entre los estados benigno y maligno. Elfrotis de Papanicolaou es una prueba en busca de clulas pre-

cancerosas en el epitelio de revestimiento del cuello uterino. El desarrollo de cncer del cuello uterino tpicamente dura ms de 10 aos y se caracteriza por clulas de aspecto crecientemente anormal (menos bien diferenciadas que las clulas normales, con ncleos de mayor tamao, como en la figura 16-8), Cuando se descubren clulas de aspecto anormal, se puede localizar y destruir el sitio precanceroso en el cuello uterino mediante tratamiento con rayo lser, crioterapia o ciruga. Como se demostrar en el siguiente anlisis, los genes que participan en la carcinognesis constituyen un subconjunto especfico del genoma cuyos productos estn implicados en actividades tales como progresin de una clula a travs del ciclo celular, adherencia de la clula con sus vecinas y reparacin de daos al DNA. Estudios de diferentes tipos de cncer humano, como cncer de colon, cncer mamario o cncer renal, revelan que algunos genes pueden participar en varios tipos de cncer diferente, en tanto que otros genes slo participan en la formacin de uno o unos pocos tipos de cncer. Algunos genes tienden a sufrir mutaciones en las primeras etapas del desarrollo de un cncer particular y otros genes muestran tendencia a sufrir mutaciones en etapas tardas. Un ejemplo de este tipo de evolucin gentica que puede conducir al desarrollo de cncer de colon se muestra en la figura 16-9. La mayor parte de los estudios de cambios genticos en diferentes etapas de avance del tumor sugieren que e! orden preciso en el cual se pierden o alteran las funciones del gen tiene menor importancia que los efectos acumulativos de las prdidas. En otras palabras, se cree que el efecto combinado de varias mutaciones es la causa del desarrollo de un estado maligno completo. Antes de iniciar un estudio detallado de algunos genes prominentes en el desarrollo de cncer humano es necesario hacer notar que los cambios genticos no son los nicos factores importantes. Una clula puede mostrar algunos cambios genticos que sera de esperar produjeran el desarrollo de un tumor maligno, pero dichos cambios pueden permanecer en estado latente por el resto de la vida del individuo. No se sabe mucho acerca de las influencias no genticas, o "epigenticas", que actan sobre una clula para permitirle expresar su fenotipo maligno, pero dichas influencias repetidamente han demostrado que desempean cierto papel en la gnesis de numerosos tipos de cncer. La existencia de influencias no genticas en la tumorignesis fue demostrada por primera vez por Isaac Berenblum, de la Universidad de Oxford, en estudios sobre piel de ratn. En estos experimentos se demostr que se pueden distinguir dos fases distintas; stas se conocen como inicio y promocin. Berenblum observ que la aplicacin repetida de sustancias mutgenas a la piel, como alquitrn de hulla, provoca la aparicin de piel malignizada en animales de laboratorio, pero que la aplicacin de una sola dosis baja del agente no es suficiente para lograr este fin. Sin embargo, si la nica aplicacin de alquitrn de hulla va seguida de tratamiento con otro tipo de agente, como aceite de crotn, entonces se puede inducir la formacin de tumores en la piel. La mayor parte de los tumores fueron papilomas benignos, pero un pequeo porcentaje dio lugar a car-

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CAPITULO 16 Cncer

(a)

(b)

FIGURA 16-8. Deteccin de clulas anormales (premalignas) en un frotis de Papanicolaou. a) Clulas epiteliales escamosas normales del cuello uterino. Las clulas presentan forma uniforme con un pequeo ncleo localizado en el centro, b) Clulas anormales de un caso de carcinoma in situ que constituye un cncer preinvasivo del cuello uterino. Las clulas tienen formas heterogneas y ncleos grandes. (Micrografa segn Visuals Unlimited/ Cabisco.)

cinomas malignos. El aceite de crotn por s mismo no es carcingeno, y requiere una aplicacin previa de alquitrn de hulla, El aceite de crotn es ms bien promotor del desarrollo de tumores ya iniciados por el carcingeno. Todava se pueden desarrollar tumores aun si el tratamiento con aceite de crotn se retrasa durante varios meses despus de la aplicacin del alquitrn de hulla, hecho que ilustra el cambio hereditario permanente inducido por el alquitrn de hulla mutgeno. En tanto los iniciadores del tumor acten provocando mutaciones genticas, se cree que los promotores tumorales funcionan principalmente estimulando el crecimiento y la proliferacin de las clulas, lo que favorece que ocurran mutaciones adicionales causantes de cncer necesarias para la rnalignizacin completa de las clulas. Por ejemplo, en 60% de los adenomas benignos ms pequeos del colon se observan mutaciones del gen PAC, lo que sugiere que este gen acta como iniciador en la formacin del cncer de colon (fig. 16-9). Una vez que el gen PAC sufre mutacin, el rpido crecimiento celular que ocurre en la capa epitelial del colon incrementa la probabilidad de alteraciones genticas subsecuentes que conducen a la aparicin del tumor maligno. Los estrgenos pueden actuar como promotores de tumor en el desarrollo del cncer mamario. Los datos epidemiolgicos indican una correlacin entre tiempo de exposicin de la mujer al estrgeno circulante y riesgo de desarrollar cncer mamario. Por ejemplo, las mujeres a quienes se les quitan los ovarios en etapas tempranas de vida y no se les suministra teraputica de sustitucin con estrgenos rara
Prdida del gen PAC Prdida de los grupos metilo del DNA

vez presentan cncer mamario. Puesto que el estrgeno no es mutgeno, al parecer la elevacin del riesgo de generar un tumor es por favorecer el crecimiento y la divisin de las clulas especficas. A la inversa, los compuestos que bloquean la accin estrognica pueden disminuir el riesgo de cncer mamario. El tamoxifn es un compuesto no esteroide que se enlaza a los receptores de estrgeno y bloquea su enlace, inhibiendo as el crecimiento de clulas cancerosas mamarias que con frecuencia depende de la estimulacin por estrgenos. Se ha empleado tamoxifn durante ms de 10 aos para tratar pacientes con cncer mamario, pero recientemente se aprob para ensayos a gran escala en mujeres saludables cuya historia familiar indica que se encuentran en alto riesgo de desarrollar la enfermedad. El protocolo de estos ensayos es motivo de gran debate, porque el tratamiento con tamoxifn puede incrementar el riesgo de una persona para desarrollar cncer endometrial y trastornos circulatorios. Carcinomas comunes, como los de mama, colon, prstata y pulmn, se originan en tejidos epiteliales que en general son afectados en un nivel relativamente elevado de divisin celular. Lo mismo se puede afirmar de las leucemias, que aparecen en las clulas sanguneas precursoras en rpida divisin. Estos tejidos contienen una poblacin de estirpes celulares que se dividen por mitosis, conservando un nmero relativamente constante de las estirpes celulares, aunque tambin suministra las clulas que se diferencian en clulas especializadas de vida corta del epitelio o de la sangre. Conforme se dividen, las estirpes celulares pueden
Prdida del gen DCC

Mutacin del gen ras

Prdida del gen p53

Prdida de otros genes

FIGURA 16-*J. Una de las diferentes secuencias posibles de cambios genticos en un linaje celular que puede conducir al desarrollo de cncer de colon. Las funciones de la mayor parte de estos genes se analizan posteriormente en el captulo.

CAPITULO 16 Cncer

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acumular varias mutaciones que causan la transformacin maligna. Genes supresores de tumor y oncogenes Los genes implicados en la carcnognesis se dividen en dos amplias categoras: genes supresivos de tumor y oncogenes. Los genes supresores de tumor codifican protenas que restringen el crecimiento celular y evitan que las clulas se malignicen (fig. 16-10, a). Originalmente se descubri la existencia de estos genes por estudios efectuados a fines del decenio de 1960, en los cuales se fusionaron entre s clulas malignas y clulas normales de roedores. Se observ que algunas de las clulas hbridas formadas por este tipo de fusin perdieron sus caractersticas malignizantes, lo que sugiere que las clulas normales poseen alguna propiedad capaz de suprimir dichas caractersticas en las clulas cancerosas luego de la fusin. Se reunieron mayores datos acerca de la existencia de genes supresores de tumor a partir de la observacin de que regiones especficas de un cromosoma particular siempre se encuentran borradas en las clulas de ciertos tipos de cncer. Si se correlaciona la ausencia de estos genes con el desarrollo de un tumor, entonces se deduce que la presencia de estos genes normalmente evita la formacin del tumor. Una vez identificada una regin del cromosoma como sitio probable de un gen supresor de tumor, los genetistas moleculares pueden iniciar la bsqueda de dicho gen en esa regin del DNA. Las funciones de las protenas codificadas

por un gran nmero de estos genes es en la actualidad tema de intensa investigacin. Se dice que los genes supresores del tumor actan de manera recesiva porque ambas copias del gen fua de cada cromosoma homlogo) deben borrarse al sufrir mutacin antes de perder su funcin protectora. Los oncogenes, por otro lado, codifican protenas que promueven la prdida de control del crecimiento y la conversin de una clula a un estado maligno (fig. 16-10, b). La existencia de oncogenes se descubri en una serie de investigaciones acerca de virus RNA tumorales reseadas en La va experimental de este captulo. Estos virus pueden transformar una clula normal en una clula maligna porque son portadores de un gen que codifica una protena que interfiere con las actividades normales de la clula. Debido a su capacidad para transformar clulas, estos genes virales reciben el nombre de "oncogenes". El punto crtico en estos estudios se present en 1976 cuando se descubri que un oncogen llamado src que se encontraba en un virus RNA tumoral, llamado virus del sarcoma aviario (VSA), tambin estaba presente en el genoma de clulas no infectadas (comentado en la pgina 693). En realidad, el oncogen no es un gen viral, sino un gen celular incorporado al genoma del virus durante una infeccin previa. Pronto se comprob que las clulas poseen varios genes, ahora conocidos como protooncogenes, con potencial para alterar las actividades propias de la clula y llevarla hacia el estado maligno (fig. 16-11). Segn analizaremos ms adelante, los protooncogenes codifican protenas que tienen funciones diversas en las actividades normales de una clula. Los protooncogenes pue-

Protooncogenes

Crecimiento normal de la clula Gen supresor de tumor mutado Crecimiento normal de la clula Crecimiento normal de la clula Copias del gen supresor del tumor sobre ambos homlogos mutados El protooncogen mutado se convierte en oncogen

Crecimiento normal de la clula

Crecimiento normal de la clula

Prdida de control del crecimiento

Prdida de contro| del crecimiento

(a)

(b)

FIGURA 16- IO. Efectos contrastantes de mutaciones en genes supresores de tumor y en oncogenes. En tanto una mutacin en una de las dos copias (alclos) de un oncogene sea suficiente para causar la prdida de control del crecimiento, se deben alterar ambas copias tic un gen supresor de tumor para inducir el mismo efecto.

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CAPITULO 16 - Cncer

den convertirse en oncogenes (activados) de diferentes maneras (fig. 16-11). Por ejemplo, 1. El gen puede sufrir mutaciones de modo que se alteran las propiedades del producto del gen y ya no puede efectuar su actividad normal. 2. Una mutacin en alguna secuencia reguladora cercana puede alterar la expresin del gen, de modo que el producto del gen es demasiado poco o excesivo. 3. Puede ocurrir redisposicin del cromosoma que lleva una secuencia DNA desde un sitio distante en el genoma hasta un punto muy prximo del gen, lo que puede alterar la expresin del gen o la naturaleza del producto del mismo, segn se indica en la figura 16-11, c. Cualquiera de estos tipos de alteraciones genticas puede causar que una clula responda menos a los controles normales de crecimiento y se comporte de cierta manera como clula maligna. A diferencia de los genes supresores de tumor que actan con carcter recesivo, los oncogenes actan con carcter dominante, o sea que una sola copia del oncogen puede provocar que la clula exprese el fenotipo alterado, sin importar si existe o no una copia normal no activada del gen sobre el cromosoma homlogo (fig. 16-10,
Protena codificada con funcin, estructura o ambas alteradas

b). Los investigadores han tomado ventaja de esta propiedad para identificar oncogenes introduciendo el DNA sospechoso de contener el gen en clulas cultivadas y observando las clulas en busca de datos de alteracin de las propiedades de crecimiento. Anteriormente se haba establecido que el desarrollo de malignidad en el hombre requiere ms que una simple alteracin gentica. La razn de esta afirmacin ser ms evidente ahora que hemos observado que hay dos tipos de genes causantes de la formacin del tumor. Se cree que mientras una clula posea su dotacin completa de genes supresores de tumor, estar protegida contra los efectos de un oncogen por razones que sern evidentes cuando analicemos las funciones de estos genes, ms adelante. Puesto que el efecto protector de un supresor de tumores slo se pierde despus de inactivar ambas copias del gen, es evidente que deben ocurrir dos mutaciones o supresiones independientes antes que la clula sea vulnerable a los sucesos que inician la formacin de un tumor. Adems, puesto que la mayor parte de los tumores contienen alteraciones tanto en los genes supresores de tumor como en los oncogenes, al parecer la prdida de las funciones de un supresor de tumor dentro de la clula de ordinario no es suficiente, por s mismo, para que la clula sufra un proceso de con-

Mutacin por supresin Incremento de la sntesis de la Protena codificada

Regin reguladora

Protooncogen

Protena codificada por protooncogen

La secuencia reguladora de DNA translocada desde un sitio distante altera la expresin del gen subsecuente

Sntesis de una protena que contiene porciones codificadas por genes diferentes. La fusin de protenas ya no se encuentra bajo control normal

Un gen que codifica protenas translocadas desde sitios distantes se fusiona con una parte del gen que provoca la formacin de un gen perfusin

Incremento de la sntesis de la protena codificada MGl'KA H-1 1. Activacin de un protooncogen para convertirlo en oncogen. La activacin se puede lograr de varas maneras, segn se indica en esta figura. En la va a, una mutacin del gen altera la estructura y funcin de la protena codificada. En la va b, una mutacin en una secuencia reguladora subsecuente altera el nivel de expresin del gen. En la va c, una redisposicin del DNA produce un nuevo segmento de DNA en la vecindad o adelante del gen, alterando su expresin o la naturaleza de la protena codificada.

CAPITULO 16 Cncer

681

versin maligna. Ms bien, cuando menos en la mayor parte de los casos, la prdida de las funciones del supresor de tumor debe acompaarse de la conversin de un protooncogen en un oncogen antes que las clulas se malignicen por completo. Aun entonces, a veces la clula no muestra todas las propiedades requeridas para invadir a los tejidos que la rodean o para formar colonias secundarias por metstasis, sino que puede requerir mutaciones oncognicas adicionales para configurar el fenotipo completo que ponga en riesgo la existencia del individuo. En general, el nmero de genes alterados aumenta paralelamente con la evolucin de la virulencia maligna del tumor. Los estudios de carcinoma colorrectal indican, por ejemplo, que se requieren mutaciones hasta de cuatro a seis genes diferentes para el desarrollo de un tumor completamente maligno (fig. 16-9). Podemos ahora retornar a las funciones de los productos codificados por genes supresores de tumor y oncogenes, y examinar de qu manera las mutaciones en estos genes pueden provocar que una clula se convierta en maligna.
Genes supresores de tumor

El desarrollo de casi todos los tipos de cncer humano parece acompaarse de la prdida o la mutacin de uno o ms genes supresores de tumor. En el momento actual, casi una docena de genes se han implicado como supresores de cncer humano (cuadro 16-2), y se espera que su nmero crezca rpidamente en unos cuantos aos ms. Algunos de los genes supresores de tumor identificados participan como factores causales en el desarrollo de una amplia gama de diferentes tipos de cncer, en tanto que otros parecen desempear un papel en la formacin de slo uno o un pequeo nmero de tipos de cncer. El descubrimiento de la importancia de los genes supresores de tumor en la carcinognesis humana abri la puerta al desarrollo de nuevas estrategias para luchar contra el cncer. Por ejemplo, si se pudiera introducir una copia normal de un gen supresor de tumor en clulas tumorales que carecen de una copia fun-

cional, entonces sera posible llevar de nuevo a la clula a obedecer los controles normales de crecimiento. Este tipo de geneterapia se ha aplicado con xito a clulas cancerosas aisladas de tumores humanos y desarrolladas en cultivo, pero todava est por verse si pueden o no aplicarse a clulas cancerosas que crecen en el cuerpo. Una estrategia alternativa podra ser tratar a los pacientes con frmacos que simulen los efectos de los productos del gen supresor de tumor, pero esto an es un proyecto lejano. El primer gen supresor de tumor bajo estudio se relaciona con un cncer raro de la infancia en la retina, llamado retinoblastoma. La ocurrencia de retinoblastoma sigue dos patrones distintos: aparece con elevada frecuencia en miembros de ciertas familias, y con baja frecuencia (espordicamente) entre los miembros de la poblacin general. El gen causante de esta enfermedad se denomina RB (o Rb). El hecho de que el retinoblastoma aparezca en ciertas familias sugiere que este cncer puede ser hereditario. El examen de las clulas de nios afectados de una versin hereditaria del retinoblastoma indica que un miembro del 13o. par de cromosomas homlogos carece de un pequeo fragmento de la parte interior del cromosoma. La supresin se encuentra en todas las clulas del nio, tanto en las clulas del cncer retiniano como en clulas de cualquier parte del cuerpo, lo que indica que la aberracin cromosmica se hereda de alguno de los progenitores. Puesto que la presencia de una supresin en uno solo de los dos cromosomas homlogos se acompaa del desarrollo de retinoblastoma, se dice que la enfermedad se hereda con rasgo gentico dominante. Sin embargo, el examen ms atento de la forma de transmisin del retinoblastoma revela que a diferencia de la mayor parte de las enfermedades hereditarias dominantes, como la enfermedad de Huntington, en la cual el individuo que hereda genes alterados o ausentes invariablemente desarrolla la enfermedad, los nios que heredan un cromosoma que ha perdido el gen del retinoblastoma heredan una fuerte disposicin a desarrollar retinoblastoma y no la propia enfermedad. En realidad,

CUADRO 16-2. Algunos genes conocidos o candidatos a supresores de tumor

Gen
PAC DCC NF1 NF2 p53 RR RET VHL 7W-I

Tipo de cncer Carcinoma de colon Carcinoma de colon Neurofibromas Schwannomas y meningiomas Cncer de colon; muchos otros Retinoblastoma Carcinoma de tiroides; feocromocitoma Carcinoma de rion Nefroblastoma

Localizador/ del producto Citoplasma? Membrana Citoplasma Membrana interna? Ncleo Ncleo Membrana Membrana? Ncleo

Modo de accin

Sndrome hereditario Poliposis adenomatosa familiar

7 Molcula de adherencia celular Activador GTPasa Unin de membrana al citoesqueleto? Factor de transcripcin

Neurofibromatoss tipo 1 Neurofibromatosis tipo 2 Sndrome L-Fraumeni Retinoblastoma Neoplasia endocrina mltiple tipo 2 Enfermedad de von Hippel-Lindau Tumor de Wilms

Factor de transcripcin Receptor de tirosincinasa

1

Factor de transcripcin

FUENTE: J. Marx, Science 261:1385, 1993. Copyright 1993 American Association for the Advancement of Science.

682

CAPITULO 16 Cncer

casi 10% de los individuos que heredan un cromosoma con supresin de RB nunca desarrollan cncer de retina. Sin embargo, la mayora de los individuos con esta predisposicin gentica presentan varios tumores de retina que se originan independientemente entre s y afectan ambos ojos. En contraste, pueden aparecer casos espordicos de .la enfermedad en forma de un tumor simple en un solo ojo, Las bases genticas del retinoblastoma fueron explicadas por primera vez en 1971 por Alfred Knudson, de la Universidad de Texas. Knudson propuso que el desarrollo de retinoblastoma requiere que ambas copias del gen RB de una clula retinal deben estar suprimidas o sufrir mutacin antes que la clula pueda dar origen a un retinoblastoma. En otras palabras, el cncer se origina como resultado de dos "golpes certeros" independientes. Entre las personas que desarrollan espordicamente este raro cncer, el tumor se inicia a partir de una clula de la retina en la cual ambas copias del gen RB han sufrido mutaciones sucesivas (fig. 16-12, a). Puesto que la probabilidad de que ambas copias del gen RB en la misma clula sean blanco de una mutacin debilitante es sumamente improbable, la ocurrencia del cncer en la poblacin general tambin es muy rara. En contraste, las clulas de una persona que hereda un cromosoma con supresin RB ya tienen recorrida "la mitad del camino" para la conversin maligna, lo que explica por qu

razn los individuos en estas condiciones estn ms predispuestos a desarrollar cncer. Una mutacin del gen RB restante en cualquiera de las clulas de la retina produce una clula que carece de un gen RB normal y por lo tanto es incapaz de producir una protena RB funcional (llamada pRb) (g. 16-12, b). Esto se confirma examinando clulas tumorales de pacientes con predisposicin heredada al retinoblastoma y la observacin de que una copia del gen ha sufrido supresin, y la otra, mutacin. La ausencia del producto funcional de un gen RB parece ser suficiente para promover el desarrollo de este cncer particular. Aunque las deficiencias del gen RB se manifiestan primero por el desarrollo de cncer de retina, este no es el fin de la historia. Las personas que sufren la forma hereditaria de retinoblastoma tambin estn en alto riesgo de desarrollar otros tipos de tumores en etapa tarda de la vida, particularmente sarcoma de tejido blando (tumores de origen mesenquimatoso). Adems, estudios recientes revelan que las mutaciones en ambos alelos RB son un hecho comn en clulas de muchos tumores diferentes, incluyendo los tumores de mama, prstata y pulmn.1 Cuando se cultivan
1 La razn de que las personas con un defecto hereditario en un alelo del gen RB desarrollen retinoblastoma y sarcomas de tejido blando, pero no cnceres ms comunes, todava se desconoce.

Clula retinal Crecimiento normal de la clula Mutacin espontnea de una copia del gen RB

( HrTT" Gen fiB mutado heredado \^/ de un progenitor

Crecimiento normal de la clula Crecimiento normal de la clula Crecimiento normal de la clula Prdida de control del crecimiento

Crecimiento normal de las clulas Mutacin espontnea en una segunda copia del gen RB Crecimiento normal de las clulas

Mutacin espontnea en una segunda copia del gen RB

Prdida de control del crecimiento

(b)
FHUKA J 6 - 1 2 . Mutaciones en el gen RB que pueden producir retinoblastoma. a) En casos espontneos (no familiares) de esta enfermedad, un individuo tiene al principio de su vida dos copias normales del gen RB en el cigoto, y el retinoblastoma aparece slo en aquellos casos raros donde una clula determinada de la retina acumula mutaciones independientes en ambas copias de genes homlogos, b) En casos familiares de la enfermedad, el individuo inicia su vida con una copia anormal del gen RB, que de ordinario presenta supresin. Por lo tanto, todas las clulas de la retina han perdido la funcin de cuando menos uno de los dos alelos RB. Si el otro alelo RB en una clula retinal se inactiva por alguna razn, en general como resultado de mutacin puntual, esta clula dar lugar a un tumor retinal.

CAPITULO 16 - Cncer

683

clulas de estos tumores in vitro, la reintroduccin de un gen RB de tipo nativo al interior de las clulas es suficiente para suprimir su fenotipo canceroso, indicando que la prdida de la funcin de este gen contribuye de manera significativa a la tumorignesis. Dada la importancia del gen RB en la regulacin del crecimiento de una gran variedad de tejidos, muchos laboratorios han dirigido su atencin a determinar el papel del producto del gen RB. Papel de la pRb en la regulacin del ciclo celular. La importancia del ciclo celular en el crecimiento y proliferacin de las clulas se analiz en los captulos 14 y 15, donde se hizo notar que los factores que controlan el ciclo celular pueden desempear un papel crucial en el desarrollo de cncer. Datos procedentes de diversos estudios indican que uno de los papeles primarios de la pRb es regular el paso de clulas desde la etapa GI del ciclo celular a la fase S, durante la cual ocurre la sntesis de DNA. Como se analiza en la pgina 585, captulo 14, la transicin de G^ a S es un momento de compromiso para la clula, puesto que una vez que la clula entra a S invariablemente prosigue a travs del resto del ciclo celular y entra en mitosis. La sntesis del DNA requiere de las diferentes enzimas que participan en la duplicacin, analizada en el captulo 13, pero tambin requiere muchas actividades adicionales que deben coordinarse estrechamente. Por ejemplo, la duplicacin de DNA requiere la sntesis de cuatro tipos de precursores nucletidos, en tanto que la duplicacin de los cromosomas requiere la sntesis de las histonas incorporadas en los nucleosomas recin ensamblados. Por consiguiente, la transicin de GI a S se acompaa de activacin de la expresin de una amplia variedad de genes diferentes, que al parecer estn controlados por diversos factores de transcripcin. Entre los factores de transcripcin implicados en la activacin de genes requeridos para las actividades de la fase S se encuentran los miembros de la familia E2F, que son objetivos clave de la pRb (fig. 16-13). El avance de las clulas desde GI a S se acompaa de fosforilacin de la pRb por la cinasa dependiente de ciclina que regula la transicin Gi-S. Al parecer, la forma no fosforilada de la pRb interacta con factores de transcripcin E2F, evitando que se una al DNA y activando los genes requeridos para ciertas actividades de la fase S. Una vez fosforilada la pRb, la protena libera su E2F unido, permitiendo que el factor de transcripcin active la expresin del gen. La importancia de la pRb en la regulacin del ciclo celular se observa en los resultados de varios experimentos. Por ejemplo, la inyeccin de cantidades excesivas de la protena pRb no fosforilada a clulas durante GI impide la progresin de las clulas hacia la fase S. Todava ms revelador es el hecho de que diversos virus DNA tumorales (incluyendo adenovirus, virus del papiloma humano y SV40) codifiquen una protena que se enlaza a pRb, bloqueando su capacidad para enlazarse a E2F. Al parecer, la capacidad de estos virus para inducir cncer en clulas infectadas depende de su capacidad para bloquear la influencia negativa que tiene pRb en la progresin de una clula a travs del ciclo celular. Empleando estas protenas bloqueadoras de pRb, estos virus pueden lograr el mismo resultado que ocu-

Protena codificada

FIGUKA 16-13. Papel de la pRb en el control de la transcripcin de genes requeridos para la progresin del ciclo celular. Durante C-, la pRb no fosforilada se enlaza a los factores de transcripcin E2F (paso 1). La activacin de la cinasa dependiente de ciclina (Cdk) conduce a la fosforilacin de la pRb que ya no puede enlazarse a un E2F (paso 2). Los factores de transcripcin liberados se enlazan a secuencias reguladoras en el DNA (paso 3), provocando la sntesis de los productos del gen (paso 4) requeridos para la progresin de las clulas desde GI a la fase S del ciclo celular (paso 5).

rre cuando el gen sufre supresin o mutacin durante el desarrollo de tumores humanos. Algunos de los estudios ms interesantes acerca del gen retinoblastoma provienen de la investigacin de los ratones knockout, o sea, ratones manipulados con tcnicas de ingeniera gentica que carecen de ambas copias del gen RB (son ratones RB"/"). Dado el papel aparente de la pRb en la restriccin del ciclo celular, se puede esperar que las clulas de ratones RB~/~ se dividan de manera descontrolada y produzcan embriones totalmente aberrantes. Pero en realidad, as etapas muy tempranas del desarrollo prosiguen de manera ms bien normal, sin efecto evidente alguno en el ciclo celular, lo que indica que pRb no juega un papel regulador crucial en toda la transicin Gj-S. El examen atento de ciertos tejidos, sin embargo, muestra claras pruebas de defectos en el ciclo celular, segn se ilustra en el siguiente ejemplo. Cuando un embrin normal alcanza cierta etapa, las clulas del cristalino en desarrollo se detienen en GI y luego se diferencian en las clulas altamente especializadas del cristalino. En contraste, estas mismas clulas en ratones RB ~l~ continan sintetizando DNA despus de este tiempo cuando sus contrapartes normales han sido eliminadas del ciclo celular, y en seguida las clulas mueren por un proceso de autodestruccin (llamado apoptosis, pg. 658) en vez de diferenciarse en clulas del cristalino. Estos resulta-

684

CAPITULO 16 Cncer

dos sugieren que el producto del gen RB normalmente controla la interrupcin del ciclo de las clulas del cristalino en GI, requerida para una diferenciacin normal del cristalino. Los embriones RB~f~ mueren al da 12 o 13 como resultado de una falla general del sistema nervioso central en desarrollo y de la eritropoyesis (formacin de eritrocitos). Todava no se aclara la razn de que estos ratones no puedan realizar estos procesos del desarrollo. El papel del gen RB en la formacin de tumores es ms evidente en ratones heterocigotos (RB+!~). Los animales con este genotipo se desarrollan durante el periodo embrionario y luego muestran un riesgo mucho mayor de desarrollar cncer, justo como el hombre, que posee un genotipo RB +/ ~; sin embargo, a diferencia de los humanos, estos ratones son afectados sobre todo por tumores de la hipfisis ms bien que retinoblastomas (que nunca se han observado en ratones). Estos resultados confirman la importancia del gen RB para suprimir la formacin de tumores, pero tambin indican que hay diferencias importantes entre roedores y humanos, y puede ser difcil extrapolar a los humanos los estudios de carcinogenicidad efectuados en ratones y ratas. Papel de p53 en la carcinognesis humana. A pesar de su nombre tan modesto, el gen p53 puede tener mucho qu hacer en el desarrollo del cncer humano en comparacin con cualquier otro componente del genoma. El genoma debe su nombre al producto que codifica, p53, que es un polipptido con peso molecular de 53 000 daltons. Durante muchos aos se crey que p53 era un oncogen con accin de naturaleza dominante, pero en 1990 se le reconoci como gen supresor de tumor que, cuando est ausente, causa una rara enfermedad hereditaria llamada sndrome de L-Fraumeni, cuyas vctimas sufren ciertos cnceres con elevada ocurrencia, incluyendo cncer mamario y leucemia. Como los individuos con la forma hereditaria de retinoblastoma, las personas con el sndrome de L-Fraumeni slo heredan una copia funcional del gen supresor de tumores v53, y por lo tanto son muy susceptibles al cncer como resultado de las mutaciones al azar que eliminan la funcin en la copia residual del gen. La importancia de p53 como arma antitumoral es ms evidente a partir del dato de que casi 50% de todos los cnceres humanos contienen clulas con mutaciones puntuales o supresiones en ambas copias del gen p>53. Adems, el grado de alteracin de p53 en un tumor puede servir

mos. En el captulo 14 vimos de qu manera acta p53 como factor de transcripcin que activa la expresin de un gen que codifica una protena (p21) e inhibe la cinasa dependiente de ciclina reguladora del avance de la clula a travs del ciclo celular (pg. 586). Como consecuencia de esta cascada de acontecimientos, las clulas que no estn preparadas para entrar a la fase S por alguna u otra razn son bloqueadas en el punto de verificacin G--S en tanto no estn listas para proseguir. Como se estudi en ei captulo 14, una de las mejores maneras de detener el ciclo celular por medio de p53 es someter el DNA de las clulas a dao mediante radiaciones. Este tratamiento estimula a la clula a producir protena p53, que detiene el ciclo celular en tanto se repara el dao al DNA. En realidad, los datos recientes sugieren que p53 puede desempear un papel directo en la estimulacin del proceso de reparacin del DNA. Los estudios indican que adems de retrasar el ciclo celular y posiblemente participar en la reparacin del DNA, p53 tambin puede dirigir a las clulas a lo largo de un camino que conduce a muerte por apoptosis. Por ejemplo, cuando un gen p53 normal se reintroduce en una clula cancerosa que ha perdido ambas copias de p53, la clula manipulada genticamente casi siempre responde por autodestruccin. Se cree que p53 desencadena la apoptosis en clulas que sufren daos del DNA ya imposibles de reparar o estn alteradas de alguna manera, lo que las hace candidatas para desarrollar un tumor. Son tantas las diferentes funciones atribuidas a p53 que se conoce como "guardin del genoma". Segn este concepto, cuando se inactivan ambas copias de p53, las clulas capaces de sobrevivir carecen de la integridad gentica necesaria para permanecer saludables (fig. 16-15). Sin la salvaguarda de p53 en su sitio, las clulas son genticamente inestables y acumulan dao gentico cada vez mayor, lo que las conduce a un fenotipo crecientemente maligno. La inactivacin de p53 tambin explica por qu las clulas cancerosas muestran exposicin extravagante de los cromosomas, incluyendo cromosomas extra y redisposicin de los cromosomas, que nunca se observa en clulas normales, sin afectar su capacidad para sobrevivir y proferar (fig. 16-4). Despus de todo lo dicho acerca del gran nmero de papeles de p53, se podra pronosticar que un embrin que carece de ambas copias de este gen no puede llegar muy lejos. --Sin embargo, este no es el caso, puesto que ratones que carecen totalmente de un gen p53 (p53~/~, ratones knockout) pueden desarrollarse a trmino y nacer con un
li-lL.^J 1.A . .m.J^H\AU ^i^iinJUL-ii^l^u ^, ,..v~ J ~ ^m..^-^^,

como indicador de la virulencia del mismo; los tumores

compuestos de clulas portadoras de mutaciones en p53 tienden a ser ms invasivos y con mayor probabilidad de provocar metstasis, y esto se correlaciona con una menor tasa de supervivencia. Est claro que la eliminacin de la funcin p53 es un paso importante en el avance de muchas clulas cancerosas hacia un estado de malignizacin completa. Se han identificado ms de mil diferentes mutaciones p53 entre muestras de tumores humanos, lo que indica que el funcionamiento apropiado de la protena es muy sensible a cambios incluso ligeros en la secuencia de aminocidos (fig. 16-14). Los estudios sugieren que p53 puede suprimir la formacin de clulas cancerosas mediante diferentes mecanis-

fenotipo normal. Entonces, es claro que el gen p53 no es

indispensable para regular el proceso normal relacionado con crecimiento y divisin o diferenciacin celular en un ratn. Despus de varias semanas de vida, sin embargo, estos animales comienzan a presentar tumores malignos cuyas clulas casi siempre se caracterizan por un nmero anormal de cromosomas. Este dato apoya claramente el papel propuesto de p53 de suprimir la formacin de tumores y mantener la estabilidad gentica aun en animales de corta vida, como los ratones. Los ratones p53~~ tambin suministran informacin acerca del papel de p53 en la apoptosis. Cuando se colocan en cultivo Hnfocitos procedentes de glndulas de timo inmaduras de un ratn normal, responden a dosis baja de

CAPITULO 16 Cncer
R175

685

100

L ii JL
150 160

VDSTPPPGTRVRAMAIYKQSr PGTRVRAMAIYKQSQHMTEVVRRCPHHERCSDSDGLAPPQHLIRVEGN 170 180 190 200

AL
Hl

m>
S4
24fi

R273

-R282

LRVEYLDORWTFRHSVWPYEPPEVGSOCTTIHYNYMCNSSCMGGMNRRPLTIITLEDSSGLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELP 201
=>

*ilL
280

210 S6

220

230

240

250

260

270

290

300

tm>
S7

310

H2

FIGURA 16-14. Residuos aminocidos imitados con mayor frecuencia en p53 de tumores humanos, a) Mapa de la frecuencia de mutaciones de p53 del dominio central. La secuencia de aminocidos est indicada con nomenclatura de una sola letra (fig. 2-26). Los residuos subrayados son los ms altamente conservados en la proieina ac diferentes especies. El nmero de mutaciones sin sentido derivadas del tumor en cada residuo est indicado por la altura de las barras. Se identifican los seis residuos que sufren mutaciones con mayor frecuencia. Las flechas y los cilindros representan las cadenas/ y las hlices a. b) Dibujo de listn que muestra la estructura tridimensional de la parte del polipptido p53 cuya frecuencia se indica en la parte a y su interaccin con la hlice de DNA. Los residuos mutados con mayor frecuencia en el cncer humano ocurren en la interfase protena-DNA o cerca de ella. (Reimpreso con autorizacin de Y. Cha, S. Gorma, P.D. Jeffrey y N.D. Pavletich, Science 265:352, 1994; copyright 1994 American Association for the Advancement of Science.)

radiacin nociva para DNA sufriendo apoptosis. Por lo contrario, los linfocitos tomados de ratones knockout p53~/~ sometidos al mismo tipo de radiacin no responden con autodestruccin. Estos resultados confirman la hiptesis planteada anteriormente de que el control del dao al DNA requiere un gen p53 funcional, encargado de que las clulas que contienen lesiones en el DNA sigan una va que conduce a la apoptosis. Dada su capacidad para desencadenar la apoptosis, el gen p53 puede desempear un papel crucial en el tratamiento del cncer mediante radiacin y quimioterapia. En general, se asume que las clulas cancerosas son ms susceptibles que las normales a frmacos y radiacin debido a que las clulas cancerosas se dividen con mayor rapidez. Pero con frecuencia las clulas cancerosas se dividen ms lentamente que sus contrapartes normales, pero aun as son ms susceptibles a frmacos y radiacin. Una teora alterna-

tiva sugiere que las clulas normales resisten ms los frmacos o las radiaciones, porque una vez que sufren dao gentico, tal vez detengan su ciclo celular en tanto se repara dicho dao. Por lo contrario, las clulas cancerosas que han sufrido dao gentico tienen mayor probabilidad de sufrir apoptosis en tanto posean un genp53 funcional. Si las clulas cancerosas pierden la funcin p53, no pueden sufrir apoptosis y se vuelven mucho ms resistentes a tratamiento adicional (fig. 16-16). Esta quiz sea la principal razn de que los tumores cuyas clulas carecen de un gen p53 funcional respondan muy poco a la radiacin y a la quimioterapia en comparacin con tumores que poseen una copia del tipo nativo del gen. Funciones en colaboracin de RB y p53. Ahora que hemos analizado los mecanismos mediante los cuales se cree que actan dos genes supresores de tumor, RB y p53, podemos

686

CAPITULO 16 Cncer Reparacin antes de divisin La elevacin de j*^ la concentracin ( *\e p53 Dao detiene al DNA aGI ^ / Divisin aun con el dao (mutacin, aneuploidia) Falta p53 ^^s Falta { H-Tumor detencin deG,

.0 0 '
(a)

Dao al DNA /

^>

o apoptosis

Falta de mitosis y muerte celular

(bi

FIGURA 16-15. Modelo de la funcin de p53. a) Normalmente la divisin celular no requiere la participacin de p53. b) Sin embargo, si el DNA de una clula se daa como consecuencia de la exposicin a mutgenos, la concentracin de p53 se eleva y acta para detener la progresin de la clula a travs de la fase G] o para dirigir la clula hacia la apoptosis. c) Cuando se inactivan ambas copias del gen p53, las clulas pierden la capacidad para detener el ciclo celular o de que la clula cometa apoptosis despus de dao al DNA. Como resultado, la clula muere por fallas en la mitosis o contina proliferando con una dotacin cromsomica anormal, que puede conducir a la formacin de crecimiento maligno. (Segn D.P. Lae, reimpreso con permiso de Nature 358:15, 1992. Copyright 1992, Macmiilan Magazines Ltd.)

ver de qu manera los productos de estos dos genes actan en conjunto como armas anti tumor ales. Reconsideraremos brevemente el fenotipo del cristalino en los ratones RB~~ knockout descritos anteriormente. Hicimos notar que a diferencia de las clulas del cristalino normal, las clulas de ratones deficientes RB no se detienen en la fase Gj del ciclo celular, y en vez de diferenciarse en las clulas fibrosas del cristalino mueren por apoptosis. Hemos visto cmo p53 codifica una protena que puede dirigir a una clula anor-

mal a lo largo de una va que conduce a la autodestruccin. Por lo tanto, sera de esperar que p53 fuera encargada de que las clulas del cristalino RB~~ sufran apoptosis. Esta posibilidad fue sometida a prueba recientemente en ratones con doble deficiencia en ambos tipos de genes supresores de tumor (ratones RB~/~, p53~!~}. El examen del cristalino en desarrollo de estos ratones doblemente knockout revela el fenotipo preciso pronosticado en los comentarios precedentes. Debido a la falta de un gen RB, estas clulas no

Sin tratamiento

5-fluorouracilo

Etopsido

Adriamicina

FIGURA 16-1 (>. Demostracin experimental del papel de p53 en la supervivencia de clulas tratadas con agentes quimioteraputicos. Se cultivaron clulas de ratn que tenan dos copias de un gen funcional p53 (lnea de arriba), una copia funcional del gen >53 (lnea de enmedio), o carecan de una copia funcional del gen (lnea de abajo). Los cultivos de cada uno de estos tipos de clulas se desarrollaron en ausencia de un agente quimoteraputico (primera columna) o en presencia de alguno de los tres compuestos indicados en la parte superior de las otras tres columnas. Es evidente que los compuestos tienen un efecto espectacular para detener el crecimiento e inducir la muerte celular {apoptosis) en clulas normales, en tanto que las clulas p53~!~ continan proliferando en presencia de estos compuestos. (Segn S.W. Lowe, H.E. Ritley, T. jacks y D.E. Housman, Cell 74:959, 1993; con permiso de Cell Press.)

CAPITULO 16 Cncer

687

se detienen en GI y se diferencian, pero a causa de que tambin carecen de un gen p53, en vez de sufrir apoptosis continan proliferando y finalmente forman tumores. Por lo tanto, al parecer estos dos genes actan en colaboracin para evitar la formacin de tumores, y al parecer esta es la razn de que en muchas clulas tumorales se observan versiones mutadas de ambos genes. Otra indicacin de las actividades en colaboracin de pRb y p53 proviene del estudio de virus DNA tumorales. Anteriormente se describi de qu manera estos virus codifican protenas que se enlazan a pRb interfiriendo con su capacidad para mantenerse en E2F. Estos virus tambin codifican otra protena cuya funcin es enlazarse a p53, inhibiendo su capacidad para actuar como factor de transcripcin. Por lo tanto, para transformar una clula normal en una clula maligna, estos virus mantienen inactivos a ambos genes supresores de tumor. En realidad, cuando se infectan clulas con virus DNA tumoral cuyo p53 enlazado a protena ha sufrido mutacin, las clulas ya no pueden ser transformadas y en vez de ello sufren apoptosis. En estas condiciones, parecera que la protena viral de tipo nativo que se enlaza a pRb provoca la entrada de las clulas a la fase S, pero la protena p53 no inactivada por el virus mutante reconoce las condiciones de crecimiento anormal y lleva a cabo la autodestruccin de la clula. Otros genes supresores de tumor. Las mutaciones en los genes RB y p53 se relacionan con la formacin de una gran variedad de procesos malignos en el hombre, pero las mutaciones en otros genes supresores de tumor slo se descubren en unos pocos tipos de cncer. Por ejemplo, algunos genes supresores de tumor de ordinario se encuentran inactivados en clulas provenientes de cncer del colon. En Estados Unidos y Europa, el cncer de colon, segundo cncer ms comn entre individuos del sexo masculino (despus del cncer pulmonar) y tercero ms comn en mujeres (des-

pus de cncer mamario y cncer pulmonar) es resultado de la acumulacin de mutaciones en varios genes diferentes (cuadro 16-3 y figura 16-9). Igual que con el gen RB, los genes supresores de tumor relacionados con cncer de colon fueron identificados originalmente en estudios de genomas de miembros de familias con alto riesgo de desarrollar esta enfermedad. La poliposis adenomatosa coli (PAC) es una enfermedad hereditaria en la cual los individuos desarrollan un gran nmero de plipos premalignos (adenomas) en las clulas epiteliales que revisten la pared del colon (fig. 16-17). Si no se eliminan, las clulas de estos plipos tienen gran probabilidad de progresar hasta una etapa totalmente maligna. Se observ que las clulas de pacientes con esta enfermedad contienen supresin en una pequea porcin del cromosoma 5, la cual posteriormente se identific como sitio del gen supresor de tumor llamado PAC. La persona que hereda supresin PAC se encuentra en posicin similar a la que hereda supresin RB; si la segunda copia del gen se daa, se pierde la funcin protectora de dicho gen. Se supone que la prdida de la segunda copia de PAC es causa de que la clula pierda algn aspecto del control de su crecimiento, lo que permite que la clula prolifere para formar plipos. La conversin de las clulas del plipo a un estado ms maligno, caracterizado por su capacidad para provocar metstasis e invadir otros tejidos, al parecer se logra por acumulacin de mutaciones adicionales, incluyendo mutaciones en p53. Aunque todava no se determina la funcin de PAC, la mutacin del gen no slo se observa en cncer de colon de personas con PAC, sino tambin en ms de 50% de los tumores espordicos del colon, lo que sugiere que el gen desempea un papel importante en el desarrollo de esta enfermedad. Se estima que el cncer mamario afecta aproximadamente a una de cada ocho mujeres que viven en Estados Unidos. De estos casos, casi 5% se presentan en familias

CUADRO 16-3. Genes alterados en el cncer de colon

Gen
"CHNPC"

Cromosoma

Tumores con mutaciones

Clase

Accin Mantiene la precisin durante la duplicacin del DNA Molcula de sea! intraceluiar Ayuda a regular el ciclo celular Receptor de factor de crecimiento Actividad reguladora del gen Desconocida Molculas de adherencia celular Regula la actividad del gen

-15%

K-Ras Ciclinas neu/HER2

12

-50% 4% 2% 2%

Oncogen Oncogen Oncogen Oncogen Tumor supresor Tumor supresor Tumor supresor

Varios

17

PAC DCC p53

5 18 17

>70% >70% >70%

FUENTE: J. Marx, Science 260:752, 1993. Copyright 1993 American Association for the Advancement of Science.

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CAPITULO 16 - Cncer

(a)

pus de un esfuerzo intensivo efectuado en varios laboratorios, en 1994 se identificaron dos genes llamados BRCA1 y BRCA2 como causantes de la mayor parte de los casos hereditarios de cncer mamario. BRCA1 tambin predispone a las mujeres a desarrollar cncer ovrico, que tiene una tasa de mortalidad especialmente elevada. Las secuencias de nucletidos de estos genes relacionados demuestran que codifican polipptidos que contienen motivos de dedos de zinc enlazados a DNA (pg. 520); esto sugiere que las protenas codificadas actan como factores de transcripcin. En general, se supone que BRCA1 y BRCA2 son genes supresores de tumor, porque al parecer una mujer hereda un gen defectuoso (o supresin) y la otra copia del gen debe ser inactivada antes de que se desarrolle el tumor. Esto es una caracterstica primaria de los genes supresores de tumor. Pero a diferencia de otros genes supresores de tumor, ninguno de los genes BRCA parece sufrir mutacin en las formas espordicas del cncer. La razn de esta discrepancia todava no se ha determinado.
Oncogenes

(b)
t'H',l~.K\. Plipos premalignos en el epitelio del colon humano, a) Fotografa de un colon extirpado de un paciente con sndrome de Gardner que muestra el patrn de formacin de plipos. Se observan patrones similares en el colon de personas con la enfermedad hereditaria de poliposis adenomatosa coli (PAC), b) Amplificacin mayor de una porcin del colon mostrado en a, con un patrn discreto de poliposis. (Cortesa de Randall W. Burt.)

cuyos miembros tienen mayor riesgo de padecer la enfermedad y se puede atribuir a la herencia de un gen que predispone al individuo a desarrollar cncer mamario. La forma hereditaria de la enfermedad explica cerca de 25% de los casos diagnosticados antes de los 30 aos de edad. Des-

Como se describi anteriormente, los oncogenes codifican protenas que promueven la prdida de control del crecimiento y la conversin de una clula a un estado maligno. Se han identificado casi 100 oncogenes diferentes, muchos de ellos incluidos como parte del genoma de virus RNA tumorales, pero slo en una docena de ellos se ha demostrado un papel en la carcinognesis humana (cuadro 16-4). El encogen implicado con mayor frecuencia en los tumores humanos es ras, que codifica una protena (Ras) cuya funcin se describi en detalle en el captulo 15 (pg. 649). A diferencia de los genes supresores de tumor, en los cuales se ha comprobado que son causa de algunas formas hereditarias del cncer, ningn tipo de trastorno se puede atribuir a un encogen heredado (o sea, un protooncogen mutado). Por lo tanto, siempre que aparece un tumor, se supone que el oncogen se presenta como resultado de una mutacin somtica. Es posible que un oncogen hereditario conduzca a la muerte del embrin, lo que explicara por qu dichos genes no se relacionan con la predisposicin hereditaria a desarrollar cncer. Muchos de los oncogenes conocidos codifican protenas que tienen los siguientes tipos de funciones (fig. 16-18). Oncogenes que codifican factores de crecimiento o sus receptores. Los oncogenes se identificaron por primera vez como elementos del genoma de virus tumorales, segn se expone en La va experimental al final de este captulo. La primera relacin entre oncogenes y factores de crecimiento se estableci en 1983, cuando se descubri que el virus del sarcoma del simio (SIS) causante de cncer contena un oncogen (sis) derivado del gen celular que codifica al factor de crecimiento derivado de plaquetas (FCDP), una protena presente en la sangre humana. Las clulas cultivadas tratadas con este virus se convierten en cancerosas porque secretan grandes cantidades de FCDP en el medio, lo que provoca proliferacin celular de manera descontrolada. Aunque se ha demostrado que FCDP se produce en clulas cancerosas extradas de varios tumores humanos, todava no est claro si es un factor causal de la carcinognesis humana.

CAPITULO 16 Cncer CUADKO 16-4. Protooncogenes y tumores humanos: algunas incriminaciones consistentes
Pi-oto-

689

Factores de crecimiento p. ej., FCDP (sis)

Nsoplasia(s)

Lesin Translocacin Amplificacin Amplificacin Mutaciones puntuales Mutaciones puntuales Translocacin Amplificacin Amplificacin Amplificacin Mutaciones puntuales Mutaciones puntuales Mutaciones puntuales Redisposicin ? Amplificacin ? ? Redisposicin

Receptores de factores de crecimiento p. ej., receptor FCE ferbB)

abl ei'bB
nea 8V SSP mic

L-mic N-imc H-ras

K-ras N-ras
re ros K-sam sis src trk

Leucemia mielgena crnica Carcinoma de clulas escamosas; astrocitoma Adenocarcinoma mamario, ovrico y gstrico Carcinoma de ovario y de glndula suprarrenal Adenoma hipofisario, carcinoma tiroideo Linfoma de Burkitt Carcinoma de pulmn, glndula mamaria y cuello uterino Carcinoma de pulmn Neuroblastoma, carcinoma pulmonar de clulas pequeas Carcinoma de colon, pulmn y pncreas; melanorna Leucemia aguda mielgena y linfoblstica; carcinoma de tiroides, melanoma Carcinoma genitourinario y tiroideo; melanoma Carcinoma tiroideo Astrocitoma Carcinoma de estmago Astrocitoma Carcinoma de colon Carcinoma tiroideo

Src (src} CiclinaCdk Rasras) Proteincmasas o protenas que activan proteinci nasas

Protenas que controlan e! ciclo de la clula p. ej., ciclina D (bcID 0 Protenas que afectan la apoptosis p. ej., Bcl2 lbc!2)

Factores de transcripcin p. ej., Mic (mic)

FIGURA 16-18. Diagrama que resume los tipos de protenas codificadas por oncogenes. En estas se incluyen factores de crecimiento (1), receptores para factores de crecimiento (2), proteincinasas y las protenas que las activan (3), protenas que participan en el control del ciclo celular (4), protenas que activan o inhiben la apoptosis (5), y protenas enlazadas a DNA (6).

FUENTE: J.M. Bshop, Cell 64:236, 1991, con permiso de Cell Press.

Se ha observado que otro virus encogen, el virus de la eritroblastosis aviaria, es portador de un encogen (erbB) que dirige la formacin de un receptor FCE alterado, o sea, un receptor que ha perdido parte del dominio extracelular de la protena que se enlaza al factor de crecimiento. Se podra esperar que el receptor alterado fuera incapaz de sealar a una clula en el momento de dividirse, pero ocurre justamente lo contrario. Esta versin alterada del receptor estimula en forma constitutiva a la clula, independientemente de la presencia o ausencia del factor de crecimiento en el medio. Esta es la razn de que las clulas cultivadas portadoras del gen alterado proliferen de manera descontrolada. Se ha observado que algunos tipos de cncer humano espontneo contienen clulas con alteraciones genticas que afectan a receptores del factor de crecimiento. Con mayor frecuencia, las clulas malignas contienen un nmero mucho mayor de receptores en sus membranas plasmticas en comparacin con clulas normales. La presencia de un exceso de receptores provoca mayor sensibilidad de las clulas a concentraciones mucho menores de factor de crecimiento, y por lo tanto son estimuladas para dividirse en condiciones que no afectaran a clulas normales. Los protooncogenes que codifican a receptores para factores de

crecimiento tambin pueden activarse por mutaciones o translocaciones que inducen dimerizacin en receptores monmeros en ausencia de ligando exgeno, lo que conduce a la activacin de la actividad de su proteincinasa ffig. 15-25). Oncogenes que codifican proteincinasas citoplsmicas. Algunas proteincinasas citoplsmicas, incluyendo serintreonincinasas y tirosincinasas, se incluyen en la lista de oncogenes. Por ejemplo, Raf es una serintreonincinasa que se sita a la cabeza de la cascada cPAM, la va primaria para el control del crecimiento en muchas clulas. -Es evidente que Raf se encuentra en buena posicin para causar estragos dentro de una clula cuya actividad enzimtica debe alterarse como resultado de una mutacin en el gen raf. Igual que con los receptores de factor de crecimiento y Ras, las mutaciones que convierten a Raf en una enzima que. siempre permanece en la posicin "activa" tiene mayor probabilidad de convertir el protooncogen en un encogen y contribuir a que la clula pierda el control de su crecimiento. El primer encogen descubierto, src, tambin es una proteincinasa, pero fosforila residuos de tirosina sobre sustratos de protena, en vez de residuos de serina o treonina. La transformacin de una clula por un src contenido en el' virus tumoral se acompaa de la fosforilacin de una gran

690

CAPITULO 16 Cncer

variedad de protenas. Entre los aparentes sustratos de la proteincinasa Src se incluye entre un gran nmero de protenas que participan en la transduccin de seales (incluyendo proteinfosfatasas y protenas G heterotrimricas, pg, 634), protenas implicadas en el control de la configuracin del citoesqueleto y protenas que participan en la adherencia celular. Dada la naturaleza de las funciones afectadas, no es difcil entender por qu una protena Src alterada puede ser carcingena, pero las mutaciones src slo aparecen rara vez entre los cambios genticos encontrados en las clulas tumorales humanas. Adems, los ratones que han perdido el gen src no muestran efectos obvios del crecimiento, lo que indica que el producto del gen no es indispensable para el crecimiento de la clula y sugiere que las clulas contienen otras protenas que pueden efectuar la funcin del Src perdido. Oncogenes que codifican factores de transcripcin nucleares. Algunos oncogenes codifican protenas cuya estructura indica que actan como factores de transcripcin, pero todava no se identifican con claridad los genes cuya expresin controlan. La progresin de clulas a travs del ciclo celular requiere la activacin coordinada (y represin) de gran variedad de genes cuyos productos contribuyen de diferente manera al crecimiento y divisin celular. Por lo tanto, no es sorprendente que las alteraciones de protenas que controlan la expresin de estos genes puedan modificar gravemente a los patrones de crecimiento normal de la clula. Tal vez el oncogen mejor estudiado cuyo producto se cree que acta como factor de transcripcin sea mic. En la pgina 582 se hizo notar que las clulas que no se encuentran en crecimiento o divisin activa tienden a salirse del ciclo celular y entrar a una etapa conocida como GQ, de la cual pueden ser recuperadas. La protena Mic normalmente es una de las primeras protenas que aparecen cuando una clula en esta etapa de reposo se estimula para reingresar al ciclo celular y dividirse por adicin de factores cte crecimiento al medio. Mic. contina ntetSl\dQe en tanto las clulas se sigan dividiendo, lo que sugiere que la protena participa en la continuacin de la proliferacin celular. Cuando se bloquea selectivamente la expresin de mic utilizando ogonucletidos contra sentido, se bloquea la progresin de la clula a travs de GI. Uno de los oncogenes alterados en el cncer humano es mic, que con frecuencia se observa amplificado o redispuesto dentro del genoma como resultado de una inversin o translacin de cromosomas. Se cree que estos cambios cromosmicos apartan el gen mic de sus influencias reguladoras normales e incrementan su nivel de expresin celular, produciendo un exceso de protena Mic. Dado su papel en la promocin del avance del ciclo celular, se ha sugerido que la sobreexpresin de mic pueden causar que las clulas continen prollteranao porque superan las influencias inhibidoras ejercidas por los productos de genes supresores de tumor, como pRb y p53. Uno de los tipos ms comunes de cncer entre los pobladores de frica, llamado linf orna de Burkitt, ocurre como resultado de la translocacin de un gen mic a la posicin

cin que da como resultado la expresin del gen mic inicia el proceso maligno. En frica, la enfermedad se presenta principalmente en personas que se han infectado con el virus de Epstein-Barr parecido al del herpes. Por alguna razn, este mismo virus slo provoca infecciones menores (p. ej., mononucleosis) en personas que viven en pases occidentales y no se acompaa de tumorignesis. Oncogenes que codifican productos que afectan la apoptosis. La apoptosis puede ser uno de los mecanismos claves del cuerpo para librarse por s mismo de clulas tumorales en etapa temprana de su avance hacia la malignidad. S esta afirmacin es cierta, entonces toda alteracin en una clula que tienda a disminuir la capacidad de la misma a la autodestruccin sera de esperar que aumente la probabilU dad de que una clula produzca un tumor. El oncogen ms estrechamente vinculado con la apoptosis es bcl-2, que codifica una protena enlazada a membrana que normalmente acta para inhibir la apoptosis en estos tejidos. El papel de bcl-2 en la apoptosis se nota con mayor claridad en los fenotipos de los ratones knockout que carecen del gen bcl-2. Una vez formado, el tejido linfoide de estos ratones sufre regresin espectacular como resultado de una apoptosis ampliamente propagada. Igual que el mic, el producto del gen bcl-2 se convierte en oncognico cuando se expresa a niveles ms elevados que lo normal, como puede ocurrir cuando el gen se transloca a un sitio anormal sobre el cromosoma. Ciertos tipos de cncer linfoide humano (llamados linfomas foliculares de clulas B) se correlacionan con la translocacin del gen bcl-2 a la proximidad de un gen que codifica la cadena pesada de molculas de anticuerpos. Se ha sugerido que la sobreexpresin del gen bcl-2 conduce a suprimir la apoptosis en los tejidos linfoides, permitiendo proliferar a las clulas anormales para formar tumores linfoides. Bcl-2 tambin puede participar en la disminucin de la eficacia de las sustancias quimioteraputicas manteniendo vivas y con capacidad de proliferar a clulas daadas por los frmacos-.
Genes que promueven la formacin de tumores a travs de efectos secundarios sobre otros genes

Si consideramos que el cncer es una enfermedad conocida por alteraciones en el DNA de clulas somticas, entonces se dic que toda actividad que incremente la frecuencia de mutaciones genticas probablemente aumente el riesgo de desarrollar cncer. En el captulo 13 se describi de qu manera los nucletdos incorporados incorrectamente durante la duplicacin son eliminados selectivamente de las cadenas recin sintetizadas mediante un proceso llamado reparacin de las desigualdades (pg. 569). La reparacin de desigualdades requiere la accin coordinada de varias protenas, incluyendo aquellas que reconocen la lesin, que eliminan una parte de la cadena que contiene la lesin, y que sustituyen el segmento equivocado con nucletidos complementarios. Si alguna de estas protenas es defectuosa, sera de esperar que ia clula afectada muestre una tasa elevada anormal de mutaciones, lo que a su vez incrementa el riesgo de rnalignizacin.

adyacente a un gen que codifica una cadena de polipptidos de una molcula de anticuerpo. Se cree que la activa-

La primera gran demostracin de QUG un defecto en la

reparacin de desigualdades poda ser un factor en el desa-

CAPITULO 16 Cncer

691

rrollo de cncer fue dada a conocer en 1993 a partir de estudios efectuados en clulas de pacientes con la forma hereditaria ms comn de cncer de colon, llamada cncer hereditario no poliposo de colon (CHNPC) para distinguirlo del tipo que forma plipos descrito anteriormente. El gen defectuoso causante de CHNPC se encuentra en casi 0.5% de la poblacin y explica hasta 15% de los casos de cncer de colon. En la pgina 406, se hizo notar que el genoma contiene un gran nmero de secuencias DNA repetitivas muy cortas llamadas microsatlites. El anlisis de DNA de personas con CHNPC revela que los microsatlites de las clulas tumorales con frecuencia son de longitud diferente en comparacin con la secuencia correspondiente en el DNA de clulas normales. Se podran esperar estas variaciones en el DNA de individuo diferentes, pero no en el DNA de clulas diferentes de la misma persona. Los cambios de longitud de una secuencia microsatlite se deben a errores durante la duplicacin cuando la cadena plantilla copiada y la nueva cadena que se sintetiza se deslizan en cuanto a sus posiciones relativas entre s. Este tipo de deslizamiento ocurre con mayor frecuencia en regiones que contienen secuencias cortas altamente repetidas. Segn la direccin del deslizamiento, la cadena recin sintetizada

contiene nucletidos adicionales o falta de nucletidos en comparacin con la cadena plantilla. La diferencia de longitud en la secuencia de nucletidos de las dos cadenas genera una pequea asa de DNA donde no se forman pares en el dplex hija, que normalmente se reconocen por enzimas reparadoras de desigualdades y la reparacin efectuada. Este dato sugiere que una deficiencia en el sistema de reparacin de desigualdades puede ser la causa del desarrollo de estos tipos de cncer hereditario. El apoyo de esta hiptesis proviene de estudios sobre el DNA y las clulas de personas con CHNPC. En tanto los extractos de clulas normales puedan efectuar la reparacin de desigualdades in vitro, los extractos de clulas tumorales CHNPC presentan defectos de reparacin. El anlisis del DNA de un gran nmero de personas con HNPCC revela supresiones o mutaciones debilitantes en algunos de os genes que codifican protenas para establecer la va DNA para reparacin de desigualdades. Las clulas incapaces de reparar apropiadamente los sitios que contienen asas de una sola cadena o nucletidos mal apareados, pueden acumular mutaciones secundarias a travs de todo el genoma, incluyendo alteraciones que inactvan genes supresores de tumor y oncogenes activados. Estas clulas se encuentran en mucho

LA VIA

EXPERIMENTAL

El descubrimiento de los oncogenes

En 1911, Peyton Rous, del RockefeUer Institute for Medical Research, public un trabajo de menos de una pgina de extensin (comparti la pgina con una nota acerca del tratamiento de la sfilis) y prcticamente no tuvo impacto en la comunidad cientfica. Pero en este trabajo se public una de las observaciones ms perspicaces en el campo de la biologa celular y molecular.1 Rous haba estado trabajando con un sarcoma de pollo que se poda transmitir de una gallina a otra inoculando a un husped de la misma cepa con pedazos de tejido tumoral. En el trabajo de 1911, Rous describi una serie de experimentos que sugeran fuertemente que el tumor se poda transmitir de un animal a otro mediante un "virus filtrable", trmino acuado unos 10 aos antes para describir agentes patgenos lo suficientemente pequeos para pasar a travs de filtros impermeables a bacterias. En este experimento, Rous extirp los tumores de la pechuga de la gallina, moli las clulas en un mortero con arena estril, centrifug las partculas materiales para formar un pellet, elimin el sobrenadante, y forz el lquido sobrenadante a travs de un filtro de porosidad variable incluyendo algunos de tamao lo bastante pequeo para evitar el paso de bacterias. A continuacin inyect el filtrado en el msculo de li pechuga de una gallina receptora y observ que un porcentaje significativo de los animales inyectados desarrollaban tumor. El virus descubierto por Rous en 1911 es un virus que contiene RNA. A fines del decenio de 1960 se encontraron virus similares relacionados con tumores mamarios y leucemia en roedores y gatos. Se han criado ciertas cepas de ratones que desarrollaron tumores especficos con frecuencia muy elevada. Se pudieron observar partculas virales que contienen RNA dentro de las clulas tumorales y tambin como yemas de la superficie celular, segn se muestra en la micrografa de la figura VE 16-1. Es evidente que los tumores desarrollados en e^ta cepas puras se transmiten verticalmente, o sea, a-travs del vulo fertilizado de la madre a la cra, de modo que.los adultos de cada generacin invariablemente desarrollan el tumor. Estos estudios suministraron pruebas de que el genoma viral se puede heredar a travs de los gametos y transmitirse subsecuentemente de una clula a otra por medio de la mitosis sin mostrar efecto evidente alguno sobre la conducta de las clulas. La presencia de los genomas virales no es una peculiaridad de las cepas criadas en el laboratorio, puesto que se demostr que ratones salvajes (feral) tratados con carcingenos qumicos desarrollan tumores que a menudo contienen los mismos antgenos caractersticos de los virus tumorales RNA y muestran partculas virales al microscopio electrnico. Una de las principales preguntas respecto de la transmisin vertical de los virus RNA tumorales era si el genoma viral

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CAPITULO 16 Cncer

mayor riesgo de convertirse en malignas. La razn de que estas mutaciones conduzcan principalmente a cncer de colon en oposicin a otros tipos de cncer todava es un enigma.
Conclusiones importantes acerca de la gentica del cncer

Iniciamos este captulo con un punto de vista pesimista acerca de los proyectos inmediatos para tratamiento del cncer. Ahora que hemos estudiado algunos de los datos recientes acerca de las bases genticas de la formacin de tumores, podemos entender por qu la lucha contra el cncer quiz requiera en ltimo trmino que se deba alterar permanentemente la composicin gentica de las clulas de un tumor. Mientras tanto, se espera desarrollar algn otro tipo de tratamiento eficaz contra el cncer sin recurrir a modificaciones genticas. Es til puntualizar que los conocimientos recin obtenidos acerca del papel de genes especficos en la tumorignesis ha cambiado una perspectiva importante acerca del cncer. Hace 10 aos, una de las afirmaciones escuchadas con mayor frecuencia era que el cncer consista en grupo de enfermedades muy diferentes y

cada tipo de cncer tal vez tuviera que ser tratado de manera particular. Hasta ahora hemos tenido la experiencia de que ciertos compuestos quimioteraputicos son ms adecuados para destruir un tipo de cncer en comparacin con otros. Pero el dato de que muchos tipos diferentes de cncer comparten los mismos defectos genticos, como alteraciones en p53, RB, ras, o todos juntos, nos hace concebir la esperanza de que muchos tipos de cncer distintos pueden tratarse mediante una tcnica comn. Por ejemplo, si se pudiera desarrollar un frmaco que imite los efectos de las protenas p53 o Ras, entonces sera posible tratar una gran variedad de tipos de cncer con el mismo agente. La identificacin de defectos genticos especficos tambin plantea la posibilidad de desarrollar procedimientos de deteccin capaces de identificar personas que debido a ciertos alelos que poseen se encuentran en mayor riesgo de desarrollar algn tipo particular de cncer. Puesto que cuanto ms temprano se descubra un cncer mayor es la probabilidad de supervivencia, estos procedimientos de deteccin podran tener un impacto significativo en la disminucin de la mortalidad debida a cncer.

se pasa de los padres a la descendencia como molculas RNA Ubres o integradas de alguna manera al DNA de la clula husped. Las pruebas indican que la infeccin y la transformacin efectuadas por estos virus requieren la sntesis de DNA. Howard Temin, de la Universidad de Wisconsin, sugiri que la duplicacin de los virus RNA tumorales poda ocurrir por medio de un DNA intermedio, un provirus, que entonces servira como plantilla para la sntesis del RNA viral. Pero este modelo requiere una enzima nica, una DNA polimerasa dependiente de RWA que nunca se na encontrado en agin fipo de clula. Esta situacin se modific en 1970 cuando se descubri una enzima con esta actividad independientemente por David Baltimore, del Massachusetts Institute of Technology, y por Temin y Satoshi Mizutani.2-3 Baltimore examin los virones (partculas virales maduras) de dos virus RNA tumorales, virus Rauscher de la leucemia murina (VRLM) y el virus del sarcoma de Rous (VSR). Se incub una preparacin de virus purificada bajo condiciones que promueven la actividad de una DNA polimerasa, incluyendo Mg2+ (o Mn2+), NaCl y ditiotreitol (que evita la oxidacin de los grupos -SH de la enzima}, y los cuatro fosfatos desoxirribonuclesidos, uno de los cuales (TTP) se marc con 3H. Se encontr que la preparacin incorpora los precursores DNA marcados en un producto cido insoluble (cuadro VE

16=1) aue mostr lis propiedades del DNA. Por ejemplo, 1

FIGURA VE 16-1. Micrografa electrnica del virus Friend de la leucemia murina surgiendo como una yema desde la superficie de una clula leucmica cultivada. (Cortesa de E. de Haruen.)

producto de la reaccin se convirti en cido soluble (indicando que se haba convertido a productos de bajo peso molecular) mediante tratamiento con la desoxirribonucleasa pancretica o la nucleasa microccica, pero no fue afectado por la ribonucleasa pancretica o por la hidrlisis alcalina (a las cuales es sensible el RNA) (cuadro VE 16-2). Se encontr que la enzima sedimenta junto con las partculas virales maduras, o

CAPITULO 16 Cncer

693

CUADRO VE 16-1. Propiedades de la DNA polimerasa del virus Rauscher de a leucemia murina pmoles 3H-TMP incorporado en 45 min

25

Sistema de reaccin Completo Sin acetato de magnesio Sin acetato de magnesio + 6 mM de MnCl2 Sin ditiotreitol Sin NaCl Sin dATP Sin dCTP Sin dGTP

20

3.31 0.04 1.59 0.38 2.18 <0.10 0.12 <0.10

15

10

FUENTE: D. Baltimore, reimpreso con permiso de Nature 226:1209, 1970. Copyright 1970, Macmillan Magazines Ltd.

que sugiere que forma parte del virin mismo y no es una enzima donada por la clula husped. Aunque el producto fue insensible al tratamiento con la ribonucleasa pancretica, la plantilla fue muy sensible a esta enzima (fig. VE 16-2), en particular cuando se trat el virin previamente con la ribonucleasa antes de la adicin de los otros componentes de la mezcla de reaccin (fig. VE 16-2, curva 4). Estos resultados fortalecen la hiptesis de que el RNA viral suministra la plantilla para la sntesis de una copia del DNA, la cual presumiblemente sirvi como plantilla para la sntesis del RNAm viral requerido para a infeccin y la transformacin. Estos experimentos no slo sugieren que la transformacin celular efectuada por un virus RNA tumoral procede a travs de un DNA intermedio, sino tambin modificaron el antiguo concepto originalmente propuesto por Francis Crick conocido como el dogma central, que establece que la informacin en una clula siempre fluye del DNA al RNA y a la protena. La DNA polimerasa dependiente de RNA se conoce como transcriptasa inversa. Durante el decenio de 1970 la atencin se volvi a la identificacin de genes de virus tumorales que causan la transformacin y al mecanismo de accin de ios productos del gen. Las pruebas de anlisis genticos indican que se pueden aislar

30

60
Mi u los

90

3H-TTP

FIGURA VE 16-2. Incorporacin de la radiactividad a partir de en un precipitado cido insoluole por accin de la DNA polimerasa del virus Rauscher de a leucemia murina en presencia y ausencia de ribonucleasas. Curva 1, sin adicin de ribonucleasa; curva 2, preincubacin sin adicin de ribonucleasa durante 20 minutos antes de aadir 3H-TTP; cuma 3, ribonucleasa aadida a la mezcla de reaccin; curva 4, preincubacin con ribonucleasa antes de aadir 3H-TTP. (Segn D. BaUimore, reimpreso con permiso de Nature 226:1210, 1970. Copyright 1970, Macmiilnn Magazines Ltd.)

cepas mutantes de virus que conservan la capacidad de crecer en clulas husped, pero que son incapaces de transformar la clula en otra que muestre propiedades malignas.4 Por lo tanto, la capacidad de transformar una clula reside en una porcin restringida del genoma viral. Estos datos fueron el antecedente de una serie de trabajos publicados por Harold Varmus, J. Michael Bishop, Dominique Stehein y sus colaboradores, de la Universidad de California,

CUADRO VE 16-2. Caracterizacin dei producto de la polimerasa Radiactividad insoluole en cido Porcentaje de producto no digerido

Exper. 1

Tratamiento
Sin tratamiento 20 fig desoxirribonucleasa 20 fig nucleasa microccica 20 fig ribonucleasa Sin tratamiento NaOH hidrolizado

1425 125 69 1361 1644 1684

(100) 9 5 96 (100) 100

FUENTE: D. Balttmore, reimpreso con permiso de Nature 226:1210, 1970. Copyright 1970, Macmillan Magazines Ltd.

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CAPITULO 16 Cncer

en San Franciso. Estos investigadores comenzaron aislando cepas mutantes del virus del sarcoma aviario {VSA) portador de supresiones de 10 a 20% del genoma, constituyendo un virus incapaz de inducir sarcoma en pollos y transformar fibroblastos en cultivo. El gen encargado de la transformacin, que est ausente en estos mutantes, se conoce como src (para el sarcoma). Para aislar el DNA correspondiente a las regiones borradas, que al parecer son portadoras de los genes requeridos pasa, lateansQtrcva.o&sx,se emple la svguievte estaate.'jia experimental.5 Se emple RNA de los genomas de viriones completos (encgenos) como plantilla para la formacin de una cadena nica complementaria de DNA marcada con istopo radiactivo (DNAc) por medio de transcriptasa inversa. A continuacin se hibrid el DNAc marcado (presente como fragmentos) con RNA obtenido de uno de los mutantes con supresiones. Los fragmentos de DNA que no lograron hibridar al RNA representan porciones del genoma que han sufrido supresin a partir del muante defectuoso para la transformacin, y por !o tanto se supone que contienen el gen requerido por el virus para causar la transformacin. Los fragmentos de DNA que no hibridan al RNA se pudieron separar de los que forman parte e hbridos DNA -RNA, permitiendo que la mezcla pase a travs de una columna que contiene una sal particular de fosfato de calcio llamada hidroxapatita (extrada de tejido seo), Mediante esta estrategia bsica, se aisl una secuencia de DNA conocida como DNAcsarc, que corresponde aproximadamente a 16% del genoma viral (1 600 de los 10 000 nucletidos que constituyen toda la longitud del genoma). Una vez aislado, el DNAcsarc demostr ser muy til como sonda. AI menos se demostr que este DNAc marcado puede hibridar al DNA extrado de varias especies de aves (gallinas, pavos, codornices, patos y avestruz australiana), lo que indica que los genomas celulares de estas aves contienen una secuencia de DNA estrechamente relacionada a src.6 Por lo contrario, en estos primeros experimentos no se descubri homologa entre DNAcsarc y el DNA de mamferos (ratones y terneras). La cintica de la reaccin entre los DNA de estas aves y el DNAc sarc indica que las secuencias complementarias estn presentes como parte de fracciones no repetidas del genoma (pg. 425), y por lo tanto slo se presentan una vez (o muy pocas veces) por conjunto haploide de DNA. Estos datos suministraron la primera gran demostracin de que un gen presente en un virus tumoral que causa transformacin celular tambin est presente en el DNA de clulas normales (no infectadas) y por lo tanto al parecer es parte del genoma normal de las clulas. Estos resultados indican que los genes transformadores del genoma viral (oncogenes) no son verdaderos genes virales, sino ms bien genes celulares captados por el RNA del virus tumoral durante una infeccin previa. Este gen entregado por la clula al parecer confiere al virus el poder de transformar a las mismas clulas en las cuales se encuentra normalmente dicho gen. El hecho de que la secuencia src se encuentre en todas las especies aviarias estud iadas sugiere que la secuencia se ha conservado durante toda la evolucin de las aves y, por lo tanto, se asume que gobiernan una actividad bsica de las clulas normales. En un estudio subsecuente se efectu hibridacin entre el DNAc S3rc y el DNA celular procedente de varios animales bajo

condiciones estrictas, lo que permiti formar dplex con un porcentaje considerable de bases formando pares incorrectos. En estas condiciones se observ que DNAcsarc puede enlazarse al DNA de todas las ciclasas de vertebrados, incluyendo mamferos, pero no al DNA del erizo de mar, la mosca de la fruta o bacterias. Una manera de determinar el grado de bases mal apareadas en los dplex consiste en vigilar la temperatura a la cual se separan los complejos DNA-RNA (fusin). Cuanto ms elevada la tempe^ata^ de usvrv, mavOT eV posterA^e de pares de bases apropiadas (A-T y G-C). En el cuadro VE 16-3 se muestran ios resultados de estos experimentos. Las reducciones de la temperatura de fusin sugieren 3 a 4% de pares de bases impropias entre DNAc snrc con DNA de pollos y otro 10% de pares de bases impropias con el DNA de otros vertebrados. Segn estos resultados, es posible concluir que el gen src'no slo est presente en el RNA del genoma VSA y el genoma de las clulas de pollo que puede infectar, sino que tambin se encuentra un gen homlogo en el DNA de vertebrados evolutivamente distantes, lo que sugiere que desempea alguna funcin crtica en las clulas de todos los vertebrados.7 Los resultados de estos experimentos plantearon muchas preguntas, algunas e mayor importancia, que fueron: 1) Cu) es la funcin del producto del gen src? 2) De qu manera la presencia del gen viral src (referido como v-src) altera la conducta de una clula normal que ya posee una copia del gen (conocida como c-src)? El producto del gen src inicialmente fue identificado por Ray Erikson y sus colaboradores, de la Universidad de Colorado, por medio de dos procedimientos independientes: 1) precipitacin de la protena contenida en extractos de clulas transformadas por anticuerpos preparados a partir de animales infectados con VSR, y 2) sntesis de la protena en un sistema sintetizador de protena libre de clulas empleando el gen viral aislado como plantilla. A travs de estos procedimientos se encontr que el producto del gen src es una protena de 60 000 daltons, a la cual se le dio el nombre pp6sn:.8 Cuando la protena pp6O~V se incub con ^-P-ATP, se transfirieron grupos fosfato radiactivos a las cadenas pesadas de las molculas del anticuerpo relacionado (IgG) empleado en la inmunoprecipitacin. Este dato sugiere que el gen src codifica una enzima que posee actividad de proteincinasa/' Se obtuvieron datos para confirmar estos estudios de la protena producida por un muante del VSA sensible a temperatura capaz de transformar clulas cuando crecen a 35C pero no a 41C. Las pruebas indican que el producto del gen src codificado por estos mutantes se desnaturaliza irreversiblemente a la temperatura ms elevada. Para estudiar la actividad del producto del gen mutante src se infectaron cultivos parelelos de clulas de pollo con el mutante (designado NY68) o con el virus no defectuoso (designado nd), y se desarrollaron las clulas a 41C o a 35C (cuadro VE 16-4). De cada uno de los cuatro cultivos se prepararon extractos de clulas, la protena pp6O~'v fue inmunoprecipitada y el precipitado se analiz en busca de actividad de proteincinasa. En el cuadro VE 16-4 se puede ver que, en tanto la protena inmunoprccipitada codificada por el virus no defectuoso mostr elevada actividad de proteincinasa a 41C, la misma protena de la cepa sensible a temperatura mostr actividad muy disminuida. Estos datos suministraron mayo-

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CUADRO VE l6-:i. Estabilidad trmica de los dplex entre DNAcsarc y DNA celular DNA XC* Pollo Hombre Ternera Ratn Salmn en los dplex 65 55 29 24 28 19 79 74.5 66.5 65 65.5 66.5 0 -4.5 -12.5 -14 -13.5 -12.5

* Las clulas XC son clulas de ratas infectadas que contienen casi 20 copias del genoma del virus del sarcoma aviario. El DNA XC y el DNAcSarc deben contener secuencias que son precisamente complementarias, de modo que la hibridacin de estos dos DNA suministra un estndar interno en cada anlisis. FUENTE: D.H. Spector, H.E. Varmus y J.M. Bishop, Proc, Nati. Acad. Sd. U.S.A. 75:4105, 1978.

res pruebas acerca de que el producto src es la proteincinasa. Cuando se fijaron clulas infectadas con VSA, se practicaron cortes y se incubaron con anticuerpos marcados con ferritina contra la protena pp60src, los anticuerpos se localizaron sobre la superficie interna de la membrana plasmtica, lo que sugiere una concentracin del producto del gen src en esa parte de la clula (fig. VE 16-3). Estos fueron los primeros estudios para dilucidar la funcin de un oncogen. Una proteincinasa es el tipo de producto del gen que sera de esperar tuviera posibilidad de actividad transformadora porque puede regular las actividades de un gran nmero de otras protenas, cada una de las cuales sirve a una funcin crtica en una u otra actividad relacionada con el crecimiento de la clula. Anlisis posteriores del papel del producto del gen src revelaron un dato inesperado. A diferencia de todas las proteincinasas cuya funcin se haba estudiado, la protena pp60src transfiri grupos fosfato a residuos de tirosina sobre la protena sustrato en vez de hacerlo sobre residuos de serina o treonina.11 La existencia de residuos de tirosina fosforilados no se haba descubierto previamente porque los

CUADRO VE 16-4. Incremento dependiente de temperatura de la actividad fosforante de la protena src inmunoprecipitada en clulas de pollo infectadas con un muante de transformacin ts del VSA Actividad fosforilante Temperatura de crecimiento Virus SR-VSA (nd) SR-VSA (nd) SR-NY68 SR-NY68
32P incorporado (fmol/mg protena)

WGL'RA VE 1 (>-.'[. Micrografa electrnica de un corte a travs de un par de fibroblastos adyacentes tratados con anticuerpos marcados con ferritina contra la protena pp60src. La protena se encuentra localizada (segn lo revelan los granulos densos de ferritina) en la membrana plasmtica de la clula y particularmente concentrada en los sitios de uniones de abertura. (Segn Mark C. Willingliam, Gilbert jay e Ira Pastan, Cell 18:128, 1979, con permiso de Cell Press.)

ec)
35 41 35 41

16.6 35.8 19.8 1.7

FUENTE: M.S. Collet y R.L. Erikson, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 75:2023, 1978.

residuos de serina y treonina fosforilados son aproximadamente 3 000 veces ms abundantes en las clulas y porque los residuos de fosfotreonina y fosfotirosina son difciles de separar por los procedimientos tradicionales de electroforesis. No slo el producto del gen viral src (v-src) codifica una tirosincinasa, sino tambin la sintetiza la versin celular del gen c-src. Sin embargo, el nmero de residuos de tirosina fosforilados en las protenas de clulas RSV transformadas es aproximada-

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mente ocho veces mayor que en las clulas testigo. Este dato sugiere que la versin viral del gen puede inducir transformacin porque funciona a nivel de actividad ms alto que la versin celular. La fosforilacin de residuos de tirosina adicionales en las protenas celulares se supone que es indispensable para la transformacin maligna de las clulas efectuada por el virus del sarcoma de Rous. Todava debe determinarse si los productos de los genes v-src y c-src son o no equivalentes funcionalmente. Los resultados del estudio del VSR suministraron datos preliminares de que un incremento en la actividad del producto de un oncogen poda ser la clave para convertir a una clula normal en clula maligna. Pronto se demostr que el fenotipo maligno tambin poda ser inducido por un oncogen que contiene una secuencia alterada de nucletidos. El estudio fundamental en este sentido fue realizado por Robert Weinberg y sus colegas, del Massachusetts Institute of Technology, utilizando la tcnica de transfeccin de DNA (seccin 17-12).12 Weinberg inici los estudios obteniendo 15 diferentes estirpes de clulas malignas derivadas de clulas de ratn tratadas con una sustancia qumica carcingena. As, estas clulas se haban convertido en malignas sin exponerlas a virus. El DNA de cada una de estas estirpes celulares se extrajo y utiliz para transfectar un tipo de fibroblasto de ratn no maligno llamado clula NIH3T3. Las clulas NIH3T3 se seleccionaron para estos experimentos porque captan DNA exgeno con gran eficiencia y se transforman rpidamente en clulas malignas en cultivo. Despus de la transfeccin con el DNA de las clulas tumorales los fibroblastos se desarrollaron in vitro, y los cultivos fueron estudiados en busca de la formacin de grumos (focos) que contienen clulas transformadas por el DNA aadido. De las 15 estirpes celulares probadas, cinco de ellas produjeron DNA capaz de transformar a las clulas NIH3T3 receptoras. El DNA de las clulas normales carece de esta capacidad. Estos resultados demostraron que las sustancias qumicas carcingenas producen alteraciones en a secuencia de nucletidos de genes que confieren a los genes alterados la capacidad para transformar otras clulas. As, los genes celulares se podan convertir en oncogenes de dos maneras diferentes: como resultado de su incorporacin al genoma de un virus o por alteracin mediante carcingenos qumicos. Hasta este punto, prcticamente todos los estudios acerca de genes causantes de cncer se haban efectuado en ratones, pollos y otros organismos cuyas clulas eran muy susceptibles a la transformacin. En 1981, la atencin se torn hacia el cncer humano cuando se demostr que el DNA aislado de clulas tumorales humanas tena capacidad de transformar a las clulas NIH3T3 de ratones despus de la transfeccin.13 De los 26 diferentes tipos de tumores humanos ensayados en este estudio, dos suministraron DNA capaz de transformar a los fibroblastos receptores de ratn. En ambos casos el DNA se extrajo de estirpes celulares procedentes de carcinoma de vejiga (identificados como EJ y J82). Se emprendieron grandes esfuerzos para determinar si los genes se derivan de virus tumorales, pero no se encontraron datos de DNA viral en estas clulas. Estos resultados proporcionaron la primera demostracin de que algunas clulas de cncer humano contienen un

oncogen activado que se puede transmitir a otras clulas y causar su transformacin. El conocimiento de que el cncer se puede transmitir de una clula a otra mediante fragmentos de DNA suministr una base para determinar qu genes de una clula, cuando son activados por mutacin o por algn otro mecanismo, se encargan de provocar la malignizacin de la clula. Para efectuar esta determinacin fue necesario aislar el DNA que cuando se capta causa a transformacin de la clula. Una vez aislado el DNA extrao causante de la transformacin se pudo analizar la presencia de alelos causantes de cncer. En 1982, en plazo de dos meses, tres laboratorios diferentes comunicaron el aislamiento y clonacin de un gen hasta entonces no identificado en clulas del carcinoma de vejiga humana capaces de transformar fibroblastos NIH3T3 de ratn.14'16 En uno de estos estudios, el DNA clonado capaz de transformar clulas se utiliz para examinar DNA humano normal en busca de la presencia de secuencias homologas.15 Se descubri que el DNA aislado de fibroblastos humanos normales contiene un fragmento de DNA que hibrida con la sonda oncogen del carcinoma de vejiga. Este dato indica que el DNA humano normal contiene una secuencia muy similar, hasta en lo ms mnimo, a la secuencia que activa el oncogen, por lo que es un argumento contra la posibilidad de que la secuencia entre a la clula por infeccin viral. Cuando se compar la susceptibilidad a la restriccin enzimtica de los dos DNA, del gen transformador, aislado de las clulas del carcinoma vesical humano y del gen homlogo aislado de fibroblastos humanos normales, no se encontraron diferencias en las posiciones de los sitios de restriccin, lo que indica que si hay diferencias entre las dos versiones del gen, deben ser muy sutiles. Estos resultados suministran fuerte apoyo a la proposicin de que las clulas cancerosas se originan como resultado de alteraciones en genes celulares preexistentes (o sea protooncogenes) que los convierten en genes activos causantes de cncer (oncogenes). En 1982 se haban identificado varios genes virales transformadores, cada uno de los cuales se demostr que tena un homlogo celular. Una vez aislado y clonado el gen transformador de las clulas del cncer de vejiga humana, el siguiente paso lgico era determinar si este gen muestra alguna relacin con los oncogenes de los virus RNA tumorales. Una vez ms, en plazo de dos meses se publicaron tres trabajos de diferentes laboratorios comunicando resultados similares.17'19 Las tres publicaciones demostraron que el oncogen capaz de transformar clulas NIH3T3 es el mismo oncogen {denominado ras) que se encuentra en el virus del sarcoma de Harvey, el cual es un virus RNA turnoral murino. Las comparaciones preliminares de las dos versiones de ras, la versin viral y su homlogo celular, no mostraron diferencia alguna, lo que indica que os dos genes son muy similares o idnticos. Estos datos sugirieron que el cncer que se desarrolla espontneamente en la poblacin humana se debe a una alteracin gentica similar a los cambios que ocurren en las clulas transformadas en el laboratorio por medio de virus. Es importante hacer notar que los tipos de cncer inducidos por el virus del sarcoma de Harvey (sarcomas y eritroleucemias) son muy diferentes de los tumores de vejiga, cuyo origen es epitelial. Esta fue la primera indicacin de que las alteraciones en el mismo gen, el ras, pueden

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provocar el desarrollo de una amplia gama de tumores diferentes. A fines de 1982 se publicaron tres trabajos ms de diferentes laboratorios acerca de los cambios precisos en el gen ras que lo activan para convertirse en encogen.20'22 La comparacin de fragmentos de DNA de restriccin preparados a partir de clulas malignas y clulas normales indica que la activacin de ras no significa cambios burdos en el DNA. Luego de ubicar con precisin la seccin del fragmento de DNA grande causante de la transformacin, est indicado el anlisis de la secuencia de nucletidos activada por el DNA de clulas vesicales malignas como resultado de la sustitucin de una sola base dentro de la regin codificante del gen. Es notable que las clulas de ambos tipos de carcinoma vesical estudiados (identificados como EJ y T24) contienen precisamente la misma alteracin: un nucletido que posee guanina en un sitio especfico del DNA del protoncogen es sustituida por una timidina en el encogen activado. Esta sustitucin de bases da como resultado el reemplazo de una valina por una glicina como el residuo aminocido nmero 12 del polipptido. La determinacin de la secuencia de nucletidos del gen v-ras del virus del sarcoma de Harvey revel una alteracin en la secuencia de bases que afecta precisamente al mismo codn modificado en el DNA del carcinoma de vejiga humana. El cambio en el gen viral consiste en sustituir la glicina normal por una arginina. Es evidente que este residuo glicina particular desempea un papel crtico en la estructura y funcin de esta protena. Es interesante hacer notar que el gen ras es un protooncogen, el cual, igual que src, se puede activar por unin a un promotor viral. Por lo tanto, ras puede ser activado para inducir la transformacin a travs de dos vas totalmente diferentes: incrementando su expresin o alterando la secuencia de aminocidos del polipptido que codifica. La investigacin descrita en La va experimental actual significa un gran paso hacia adelante en el conocimiento de las bases genticas de la transformacin maligna. Gran parte de la investigacin inicial acerca de virus RNA tumorales se origin de la idea de que estos agentes pueden ser causas importantes para el desarrollo de cncer humano. La bsqueda de la causa viral del cncer condujo al descubrimiento del encogen, que a su vez llev a comprobar que el oncogen es una secuencia celular adquirida por e! virus, lo que finalmente condujo al descubrimiento de que un oncogen puede causar cncer sin la participacin de un genoma viral. As, los virus tumorales, que por s mismos no participan directamente en la mayor parte de los tipos de cncer humano, han proporcionado la perspectiva necesaria a travs de la cual se puede visualizar nuestra propia herencia gentica en busca de informacin que quiz conduzca a nuestra propia destruccin.

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SINOPSIS
El cncer es una enfermedad que implica defectos hereditarios en los mecanismos de control celular, que dan como resultado la formacin de tumores invasivos capaces de liberar clulas que propagan la enfermedad a sitios distantes del cuerpo. Muchas de las caractersticas de las clulas tumorales se pueden observar en cultivo. En tanto las clulas normales proliferen en cultivo hasta formar una sola capa (monocapa) en el fondo del plato de cultivo, las clulas cancerosas continuarn creciendo apilndose una sobre otra para formar grumos. Otras caractersticas reveladas con frecuencia en las clulas cancerosas son su capacidad para crecer cuando estn suspendidas en agar suave, tendencia a mostrar un nmero anormal de cromosomas; capacidad para continuar dividindose de manera indefinida; desorganizacin del citoesqueleto; y falta de respuesta a las clulas vecinas, particularmente en relacin con actividades locomotoras (p. 672). Las clulas normales se pueden convertir en clulas cancerosas mediante tratamiento con una gran variedad de sustancias qumicas, radiacin ionizante y varios virus que contienen DNA y RNA; todos estos agentes actan provocando cambios en el genoma de la clula transformada. El anlisis de las clulas de un tumor canceroso casi siempre muestra que las clulas se originan por el crecimiento de una sola clula (se dice que el tumor es monoclonal). El desarrollo de un tumor maligno es un proceso de mltiples etapas caracterizado por progresin de las alteraciones genticas que disminuyen cada vez ms la respuesta de las clulas a los mecanismos reguladores normales y les confieren mayor capacidad para invadir tejidos normales. Los genes que participan en la carcinognesis constituyen un subconjunto especfico del genoma cuyos productos participan en actividades como control del ciclo celular, adherencia entre las clulas y reparacin del DNA. Se cree que es el efecto en conjunto de varias mutaciones y no la secuencia particular de las mismas lo que es importante para el desarrollo del estado maligno. Adems de alteraciones genticas, el crecimiento de clulas tumorales tambin est bajo la influencia de factores no genticos o epigenticos que permiten a la clula expresar su fenotipo maligno. Por ejemplo, los estrgenos parecen promover el desarrollo de tumores mamarios (/?, 675). Los genes implicados en la carcinognesis se dividen en dos amplias categoras: genes supresores de tumor y oncogenes. Los genes supresores de tumor codifican protenas que restringen el crecimiento de la clula y evitan la malignizacin de las mismas. Los genes supresores de tumor actan con caracterstica recesiva, puesto que se deben borrar ambas copias o sufrir mutacin antes que se pierda su funcin protectora. Los oncogenes, en contraste, codifican protenas que promueven a prdida de control del crecimiento y la malignizacin. Los oncogenes se originan de protooncogenes, genes que codifican protenas con participacin en las actividades normales de la clula. Las mutaciones que alteran la protena o su expresin provocan que el protooncogen acte de manera normal y promueva la formacin de tumor. Los oncogenes actan con caracterstica dominante; o sea, slo se requiere una sola copia para que la clula exprese el fenotipo alterado. La mayor parte de los tumores contienen alteraciones en ambos genes supresores de tumor y oncogenes. Mientras la clula tenga cuando menos una copia de todos sus genes supresores de tumor, debe estar protegida contra las consecuencias de la formacin del oncogene. Por lo contrario, la prdida de la funcin de los supresores de tumor no debe ser suficiente, por s soia, para provocar que la clula se malignice (/>. 679). El primer gen supresor de tumor identificado fue RB, causante de un raro tumor de la retina llamado retinoblastoma, que aparece con mayor frecuencia en ciertas familias pero tambin puede ocurrir espordicamente. Los nios con la forma familiar de la enfermedad heredan una copia mutada de genes. Estos individuos desarrollan el cncer slo despus de dao espordico al segundo alelo en una de las clulas de la retina. RB codifica una protena llamada pRb, que participa en la regulacin del paso de una clula de GI a S en el ciclo celular. La forma no fosforilada de pRb interacta con ciertos factores de transcripcin evitando que se unan al DNA y activando los genes requeridos para ciertas actividades de la fase S. Una vez fosforilado pRb, la protena libera su factor de transcripcin enlazado, que entonces puede activar la expresin del gen, conduciendo al inicio de la fase S (p. 681). El gen supresor del tumor implicado con mayor frecuencia en el cncer humano es p53, cuyo producto (p53) puede evitar la formacin de cncer mediante varios mecanismos diferentes. En una de sus acciones, p53 acta como factor de transcripcin que activa la expresin de una protena (p21) inhibidora de la cinasa dependiente de ciclina que mueva a la clula a travs del ciclo celular. El dao al DNA provoca la sntesis de p53, lo que conduce a la detencin del ciclo celular en tanto se repara el dao. p53 tambin puede reorientar clulas en camino hacia la malignizacin y dirigirlas por vas alternas que conducen a una muerte programada, o apoptosis. El p53 de ratones knockout inicia el desarrollo de tumores varias semanas despus del nacimiento. Otros genes supresores de tumor incluyen a PAC, que cuando sufre mutacin predispone a la persona al desarrollo de cncer de colon, y BRCA1 y 2, que cuando sufren mutacin predisponen a las mujeres a desarrollar cncer mamario (i. 6S4). La mayor parte de los oncogenes conocidos se derivan de protooncogenes que participan en las vas que transmiten seales de crecimiento desde el ambiente extracelular al interior de la clula, particularmente al ncleo celular. A diferencia de los genes supresores de tumor, los oncogenes no se han implicado en las formas hereditarias de cncer. Se han identificado algunos oncogenes que codifican factores de crecimiento o sus receptores, incluyendo sis, el gen que codifica a! factor de crecimiento derivado de plaquetas (FCDP), y crbB, el gen que codifica al receptor del factor de crecimiento epidrmico (FCE). A veces las clulas malignas contienen un nmero mucho mayor de uno de estos receptores de factores de crecimiento en sus membranas plasmticas en comparacin con clulas normales. El exceso de receptores hace sensibles a las

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clulas a concentraciones ms bajas del factor de crecimiento, y por lo tanto, las estimula para dividirse en condiciones que no afectaran a clulas normales. Algunas proteincinasas citoplsmicas, incluyendo cinasas de serina-treonina y de tirosina, se encuentran en la lista de oncogenes, Estas incluyen raf, que codifica una proteincinasa en la cascada cPAM. Las mutaciones en ras se encuentran entre los oncogenes ms comunes observados en el cncer humano. Como se analiza en el captulo 15, Ras activa la funcin de proteincinasa de Raf. Si Raf permanece en estado activado, contina enviando seales a lo largo de la va cPAM, que conducen a la estimulacin continua de la proliferacin celular. Algunos oncogenes, como mic, codifican protenas que actan como factores de transcripcin. Mic normalmente es una de las primeras protenas que aparecen cuando se estimula una clula para reingresar al ciclo celular a partir de la fase en reposo GQ. La sobreexpresin de mic puede provocar que las clulas continen proliferando porque superan las influencias inhibidoras ejercidas por los productos de los genes supresores de tumor. Otro grupo de oncogenes, como el bd-2, al parecer codifica protenas que participan en la apoptosis. Las pruebas sugieren que la sobreexpresin del gen

bd-2 conduce a la supresin de la apoptosis de tejidos linfoides, permitiendo proliferar a clulas anormales para formar tumores linfoides (p. 638).

Los genes que codifican protenas que participan en la reparacin del DNA tambin se han implicado en la carcinognesis. El genoma de pacientes con la forma hereditaria ms comn de cncer de colon, llamado cncer hereditario no poliposo de colon (CHNPC), contiene secuencias microsatlites de varios nucletidos anormales. Los cambios de longitud de una secuencia microsatlite son productos de errores durante la duplicacin, que normalmente son reconocidos por enzimas encargadas de reparar los pares de bases impropios. Esto sugiere que el defecto en este sistema puede ser causa de cncer. Esta conclusin se apoya en el dato de que extractos de clulas de tumores CHNPC muestran deficiencia en la reparacin del DNA. Sera de esperar que las clulas con estas deficiencias muestren un nivel mucho mayor de mutaciones en los genes supresores de tumor y en los oncogenes que provocaran un riesgo mucho mayor de malignizacin (/>, 690).

BIBLIOGRAFA
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CAPITULO

17

Tcnicas en biologa celular y molecular

1 7 - 1 El microscopio de luz 17-2 Microscopio de transmisin electrnica 1 7-3 Microscopio electrnico tridimensional 17-1 Uso de radioistopos 17-5 Cultivo de clulas 17-6 Fraccionamiento del contenido de una clula por centrifugacin diferencial 17-7 Aislamiento, purificacin y fraccionamiento de protenas

* 17-8

Determinacin de la estructura de una protena mediante anlisis de difraccin de rayos X

17-9 Purificacin y fraccionamiento de cidos nucleicos 17-10 Cuantificacin de las concentraciones de protenas y cidos nucleicos mediante espectrofotometra 1 7 - 1 1 Ultracentrifugacin 17-12 Tecnologa del DNA recombinante 17-13 Uso de anticuerpos

adas las dimensiones verdaderamente pequeas de los objetos materiales que estudia, la biologa celular y molecular depende mucho ms del desarrollo de nuevos instrumentos y tcnicas en comparacin con cualquiera otra rama de la biologa. Por consiguiente, es difcil estudiar biologa celular y molecular sin aprender tambin algo acerca de la tecnologa necesaria para recopilar los datos. Estudiaremos los mtodos utilizados con mayor frecuencia en este campo sin profundizar en todos los detalles y las variaciones que se emplean. Estos son los objetivos del presente captulo: describir de qu manera se usan las diferentes tcnicas y proporcionar ejemplos del tipo de informacin que se puede obtener utilizando dichas tcnicas. Iniciaremos con el instrumento que permiti a los bilogos descubrir la existencia fsica de las clulas, que es el punto de partida de toda la informacin presentada en este texto.

17-1 El microscopio de luz

FIGURA J 7-A. Autorradiografia de un corte a travs de un agregado de moho de fango durante la formacin de un cuerpo fruta!, mostrando los sitios de incorporacin del azcar marcado con radiactividad. Los granos plateados aparecen en color blanco debido a que la muestra se ve bajo iluminacin en campo oscuro. Con este tipo de iluminacin, la luz del condensador incide sobre la muestra pero no penetra a la lente objetivo. Como resultado, el fondo es oscuro en tanto que la muestra es brillante (fotografa del autor).

El diagrama del microscopio de luz mostrado en la figura 17-1 indica sus elementos ms importantes. Una fuente de luz que puede ser externa al microscopio o integrada en su base, necesaria para iluminar la muestra. Se requiere un condensador debajo de la platina para concentrar los rayos

701

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CAPITULO 17 Tcnicas en biologa celular y molecular

Lente ocular

Lente objetivo Muestra

Lente condensador

Fuente de luz FIGUIA 17-i. Diagrama de un corte de un microscopio compuesto.

de luz dispersos procedentes de la fuente e iluminar la muestra con un pequeo cono de luz con intensidad suficiente para permitir observar las partes muy pequeas de la muestra luego de la amplificacin. La manera de iluminar la muestra puede ser de importancia extrema para definir la calidad de la imagen obtenida. Los rayos de luz enfocados

sobre la muestra por el condensador tambin son recolectados por la lente objetivo del microscopio. Desde este punto de vista, es necesario considerar dos grupos de rayos de luz que penetran a la lente objetivo: los modificados por la muestra y los que no lo son (fig. 17-2}. El ltimo grupo forma un cono de luz procedente de la lente del condensador que atraviesa directamente hacia la lente objetivo y constituye la luz de fondo sobre el campo visual. El primer grupo de rayos de luz son los que surgen, en cierto sentido, de los diferentes puntos que constituyen la muestra. Los rayos de luz procedentes de la muestra son conducidos al foco por la lente objetivo para formar una imagen real amplificada del objeto dentro de la columna del microscopio ffig. 17-1). La imagen formada por la lente objetivo se emplea entonces como objeto por un segundo sistema de lentes, la lente ocular, que utiliza como objeto la imagen formada por la lente objetivo para formar una imagen virtual amplificada. Un tercer sistema de lentes, localizado enfrente del ojo, usa como objeto la imagen virtual producida por la lente ocular para generar una imagen real sobre la retina. Cuando se gira el botn para enfocar el microscopio de luz, la distancia relativa entre la muestra y la lente objetivo cambia permitiendo que la imagen final se enfoque sobre el plano de la retina. La amplificacin total alcanzada por el microscopio es producto de la amplificacin producida por la lente objetivo y la producida por la lente ocular. Resolucin Hasta aqu slo hemos considerado la amplificacin de un objeto empleando las propiedades de refraccin de las lentes sin prestar atencin alguna a la calidad de la imagen producida, o sea, en qu grado la imagen retiene los detalles de la muestra. Asumiremos que se est mirando una estructura en el microscopio utilizando una lente objetivo de potencia relativamente alta (por ejemplo 63 x) y una lente ocular que amplifique la imagen de la lente objetivo otras cinco veces (un ocular 5x). Supongamos que el campo se compone de cromosomas y es importante determinar el nmero de stos, pero algunos de ellos estn muy prximos y no se pueden distinguir como estructuras separadas (fig. 17-3, t). Una solucin aparente del problema podra ser cambiar el ocular para incrementar el tamao del objeto que se observa. Si se cambiara de un ocular 5x a un lOx, probablemente se podra incrementar la capacidad para determinar el nmero de cromosomas presentes (fig. 17-3, b) porque ahora la imagen de los cromosomas producida por la lente objetivo se ha extendido sobre una mayor superficie de la retina. Cuanto ms fotorreceptores se incluyan para suministrar informacin relacionada con la imagen, se observarn ms detalles (fig. 17-4). Sin embargo, si se cambia a un ocular 2X, tal vez no se vean detalles adicionales, aunque la imagen sea de mayor tamao que la previamente observada (fig. 17-3, c), o sea, ocupar una mayor superficie de la retina. La razn de la falta de discriminacin adicional luego de este segundo cambio es que la imagen producida por la lente objetivo no posee detalles adicionales amplificables con el mayor poder de la lente

Plano de foco de la imagen

Plano de foco de la fuente de luz

Plano de la muestra

Lmpara

(- - ) Rayos de luz que forman la imagen [ ) Luz de fondo en el campo FIGURA 17-2. Trayectoria de los rayos de luz que forman la imagen y la de aquellos que constituyen la luz de fondo en el campo.

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.V
(a)

(b)

que a continuacin se muestra: 0.611 nseno 6 donde D es la distancia mnima que debe separar a dos puntos de la muestra para ser resueltos, A es la longitud de onda de la luz (527 nm para luz blanca) y u es el ndice de refraccin del medio. Theta (9) es el ngulo mostrado en la figura 17-2, que mide la capacidad de la lente para concentrar la luz y se relaciona directamente con su abertura. El denominador de tal ecuacin se denomina abertura numrica (A.N.). La abertura numrica es una constante de cada lente y mide su calidad para concentrar luz. Para una lente objetivo diseada para usar en el aire, la A.N. mxima posible es de 1.0, puesto que el seno del ngulo teta mximo posible, 90, es 1 y el ndice de refraccin del aire es 1.0. Para un objetivo diseado para sumergir en aceite, la mxima A.N. es de aproximadamente 1.5. Una regla nemotcnica comn es que la amplificacin til para un microscopio es de aproximadamente 1 000 veces la abertura numrica de la lente objetivo que se emplea. Cuando se intenta aumentar la imagen ms all de este punto se obtiene una amplificacin vaca con deterioro de la calidad de imagen. Utilizando lentes de distancia focal corta, que pueden colocarse muy cerca de la muestra, se logra una abertura numrica elevada. Si en la ecuacin precedente se sustituyen longitud de onda mnima y mayor abertura numrica posible se puede determinar el lmite de resolucin del microscopio de luz. Efectuando estas sustituciones se obtiene un valor ligeramente menor de 0.2m (o 200 nm), suficiente para resolver los organelos celulares ms grandes, como el ncleo y las mitocondrias. En contraste, el lmite de resolucin del ojo desnudo, cuya abertura numrica es de casi 0.004, es de aproximadamente 0.1 mm (0.0036 pulgadas). Adems de estos factores tericos, la resolucin de las lentes puede estar notablemente afectada por ciertas aberraciones. Hay siete tipos principales de aberraciones que indican los inconvenientes que deben superarse para producir lentes objetivos cuyo verdadero poder de resolucin se aproxime a su lmite terico. La razn de construir entes objetivos con una serie complicada de lentes en vez de una sola lente de tipo convergente es eliminar estas aberraciones. Tpicamente, una sola lente logra la amplificacin, en tanto que las otras compensan los errores de la primera lente para suministrar una imagen total correcta.

n<;i,i|iA 1 7-3. Amplificacin comparada con resolucin. La transicin desde a a b suministra al observador una mayor amplificacin y resolucin, en tanto que la transicin de b a c slo proporciona mayor amplificacin (amplificacin vaca).

ocular. El incremento de la imagen ms all del punto donde la retina suministra mayor informacin simplemente es amplificacin vaca (como en la figura 17-3, c). La calidad ptica de una lente objetivo determinada se mide por el grado con que se pueden discriminar o resolver los detalles finos presentes en una muestra. Resolucin se define ms simplemente como la capacidad para ver dos puntos vecinos en el campo visual como entidades diferentes. Si las dos partes distintas de un objeto no estn separadas por una distancia suficiente (como en la figura 17-4), se vern como una sola estructura; o sea, no sern resueltas. Los factores que determinan cul puede ser una distancia suficiente son muchos; algunos factores limitantes son inherentes a todo sistema de lentes, en tanto que otros se corrigen con microscopios de mejor calidad. La resolucin alcanzable por un microscopio est limitada por la longitud de onda de la luz segn la ecuacin

o o o o o o o

O O O O O

o o o o oooo o*c oooo oo oooo

Visibilidad
El aspecto ms prctico del microscopio respecto del lmite de resolucin es el tema de la visibilidad relacionada con los factores que permiten observar en realidad un objeto. Esto puede parecer un asunto trivial; si hay un objeto debe poder observarse. Consideremos el caso de una cuenta de vidrio. En la mayor parte de las situaciones, o sea, cualesquiera que sean las condiciones de la luz de fondo, la cuenta es claramente visible. Toda persona que ha pasado algn tiempo observando una amiba puede apreciar el problema de la visibilidad cuando emplea el microscopio de luz.

FIGURA 17-4. Poder de resolucin del ojo. Ilustracin muy esquematizada de la relacin entre la estimulacin de fotorreceptores individuales (arriba) y la escena resultante que percibe el ojo (abajo). El diagrama ilustra la importancia de que la imagen caiga en un rea de tamao suficiente en la retina.

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CAPITULO 17 Tcnicas en biologa celular y molecular

Lo que vemos a travs de una ventana, o del microscopio, son los objetos que la luz afecta de manera diferente a la iluminacin del fondo. Otro trmino para visibilidad en este sentido de la palabra es contraste, o diferencia entre partes adyacentes de un objeto o de un objeto contra el fondo iluminado. Para lograr visibilidad en el mundo macroscpico, examinamos los objetos cuando la luz incide sobre ellos (luz incidente) y luego observamos la luz reflejada por el objeto hacia nuestros ojos. En microscopa, colocamos el objeto entre la fuente de luz y nuestros ojos, y observamos la luz transmitida a travs del objeto. Si llevamos un objeto al interior de una habitacin donde hay una fuente de luz y lo sostenemos entre la fuente de luz y el ojo quiz podamos apreciar parte de la dificultad con ese tipo de iluminacin; aunque para ello es necesario que el objeto examinado sea casi transparente, o sea, translcido. En esto estriba otro aspecto del problema: los objetos "casi transparentes" pueden ser difciles de ver. Una de las mejores maneras de elaborar muestras delgadas, translcidas, visibles con el microscopio es teirlas con algn colorante que solo absorba ciertas longitudes de onda del espectro visible. Las longitudes de onda que no se absorben se transmiten al ojo y como resultado el objeto teido aparece de un color. Los diferentes colorantes se enlazan a diferentes tipos de molculas biolgicas y, por lo tanto, estos procedimientos no slo incrementan la visibilidad de la muestra, sino tambin pueden indicar dnde se encuentran las sustancias en las clulas o en los diferentes tipos de tejidos. Un buen ejemplo es la tincin de Feulgen, especfica para DNA, gracias a la cual el DNA aparece de color bajo el microscopio (fig. 17-5). El ncleo de la clula es almacn de DNA, y cuando se emplea la tincin de Feulgen se vuelve visible. Uno de los principales problemas con las tinciones es que en general no pueden usarse en clulas vivientes; de ordinario son txicas, o las condiciones de tincin son mortales, o no penetra a travs de la membrana plasmtica. Por ejemplo, la tincin de Feulgen requiere hidrlisis acida del tejido antes de aplicarse. Unas pocas tinciones, llamadas tinciones vitales, son adecuadas para usar en clulas vivientes (por ejemplo las mitocondrias observadas en la figura 5-21), pero su uso es limitado. Cuando un condensador situado debajo del portaobjetos obliga a la luz procedente de la fuente a convergir sobre la muestra formando un cono de luz brillante que puede entrar a la lente objetivo, el microscopio se denomina de campo brillante. La luz que ilumina el campo se observa como un cono brillante contra el cual se puede contrastar la imagen de la muestra. El microscopio de campo brillante es ideal para muestras con alto contraste, como cortes de tejido teidos, pero quiz no proporcione visibilidad ptima para otras muestras. En Jas siguientes secciones consideraremos varios mtodos alternativos de aumentar la visibilidad de la muestra con el microscopio de luz. Microscopio de contraste de fases Muestras pequeas sin teir, como la clula viviente, pueden ser muy difciles de observar en un microscopio de campo brillante (fig. 17-6, a). El microscopio de contraste

FIGUKA 17-.S. Tincin de Feulgen. Este procedimiento de tincin es sumamente especfico para DNA, segn lo indica la localizacin del colorante en los cromosomas en las clulas del extremo de las races de la cebolla que se encontraba en la me tarase de micosis en el momento de ser fijada. (Por Ed Reschke/Peter Arnnld, Inc.)

de fases supera esta dificultad haciendo ms visibles objetos muy transparentes (fig. 17-6, b). La posibilidad de observar las diferentes partes de un objeto depende de la capacidad de dichas partes para afectar la luz de manera diferente. Una caracterstica bsica en la cual difieren los organelos intracelulares es su ndice de refraccin. Los organelos celulares estn formados de varias molculas de diferentes proporciones: DNA, RNA, protenas, lpidos, carbohidratos, sales y agua. Las regiones de composicin diferente tal vez tengan ndices de refraccin diferentes. Sin embargo, en condiciones normales nuestros ojos no pueden determinar estas diferencias. El microscopio de contraste de fases convierte las diferencias del ndice de refraccin en diferencias de intensidad (brillo y oscuridad relativas), que entonces se hace,n visibles al ojo. Esta conversin depende de la capacidad de las ondas de luz para interactuar entre s, propiedad denominada interferencia. Gracias a su estructura, el microscopio de contraste de fases ejecuta dos funciones que el microscopio de campo brillante no puede realizar: separa la luz directa (luz de fondo en el campo) de la luz difractada por el objeto, y desfasa estos dos tipos de ondas luminosas ms o menos una mitad de la longitud de onda, de modo que al interactuar pueden cancelarse y provocar cambios de intensidad. Por un momento podemos asumir que todas las partes del objeto examinado tienen exactamente igual ndice de refraccin que el medio donde estn suspendidas. Si ste fuera el caso, toda la luz del objeto y la luz directa estaran desfasadas una mitad de la longitud de onda, y al interferir la intensidad disminuira de manera uniforme (como en la figura 17-7). Consideremos ahora un objeto cuyas diferentes par-

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tes muestran diversos ndices de refraccin, todos mayores que el correspondiente al medio que los rodea. Los diferentes ndices de refraccin generan cambios de fase de los rayos de luz que pasan a travs de las distintas partes de la muestra (fig. 17-8). El brillo u oscuridad relativa de cada parte de la imagen refleja la interferencia de la luz procedente de esa parte con la luz directa. Puesto que las partes de la muestra tienen diversos ndices de refraccin, las diferentes partes de dicha muestra aparecen en la imagen con intensidad variable y por lo tanto suministran el contraste necesario para visualizarlas. El contraste ptico de fases es muy til para examinar componentes intracelulares de clulas vivas con resolucin relativamente elevada. Por ejemplo, se puede observar y filmar la dinmica de la motilidad de las mitocondrias, cromosomas mitticos y vacuolas. La simple observacin de minsculas partculas y vacuolas chocando dentro de la clula totalmente al azar induce un sentimiento acerca de los seres vivientes, inalcanzable por la observacin de clulas muertas teidas. La observacin de clulas vivientes sobre una pantalla de televisin mediante una cmara de video proporciona imgenes especialmente espectaculares de las actividades dinmicas de una clula. El mayor beneficio obtenido de la invencin del microscopio de contraste de fases no es el descubrimiento de nuevas estructuras, sino su uso cotidiano en laboratorios de investigacin y enseanza para mirar clulas de manera mucho ms reveladora. El microscopio de contraste de fases slo es apropiado para observar clulas aisladas o en capas delgadas. Adems, tiene el inconveniente ptico de disminuir la resolucin y producir sombras y halos de interferencia que generan bordes donde el ndice de refraccin cambia bruscamente. El microscopio de contraste de fases es un microscopio de interferencia. Se han construido otros tipos de microscopios de interferencia que reducen al mnimo los artefactos pticos y separan por completo los rayos de luz directa y de luz difractada mediante el uso de prismas y transmisin de la luz a travs de vas complicadas. Un tipo de interferencia ptica, llamada contraste por interferencia diferencial (CID) o a veces interferencia de Nomarski por su descubridor, suministra una imagen de calidad aparentemente tridimensional (fig. 17-6, c}. En la microscopa CID, el contraste depen,de de la tasa de cambio del ndice de refraccin a travs de una muestra. Como consecuencia, los bordes de las estructuras, donde el ndice de refraccin vara notablemente en una distancia relativamente pequea, se observan con contraste especialmente satisfactorio.
(c) HGl'IA 17-6. Comparacin de las clulas observadas con diferentes tipos de microscopio de luz. Micrografa de luz de clulas de levadura (Candida albicanf) en desarrollo sobre el epitelio vaginal observadas en campo brillante (a), contraste de fases (b) y contraste por interferencia diferencia! (CID) (o de Nomarski). Ntese que las clulas del epitelio vaginal de la derecha son prcticamente invisibles con iluminacin en campo brillante, pero claramente observadas bajo microscopa de contraste de fases y contraste por interferencia diferencial. (Micragrafia por M.L Walkar/Photo Rescarchers, Inc.)

r\ r\A 17-7. Interferencia de

tan desfasadas una mitad de la longitud de onda. Cuando las ondas se encuentran, se combinan para cancelarse.

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CAPITULO 17 Tcnicas en biologa celular y molecular

Fuente de luz FIGURA 17-t. Diagrama de los diferentes grados de retraso dlos rayos de luz conforme pasan a travs de diversas parte de una clula. Los rayos de luz que surgen de las distintas partes de una clula se encuentran en diferentes fases de su ciclo, por lo que interfieren con los rayos de luz directa en diferente grado, produciendo distintos grados de brillo y de oscuridad en la imagen final.

biolgica a un nivel menor del lmite de resolucin del microscopio de luz. Esto se logra gracias a que estructuras submicroscpicas bien alineadas poseen una propiedad ptica llamada birrefrngencia. Un objeto posee birrefringencia cuando emite brillo (fig. 17-9) si se coloca entre dos filtros polarizantes orientados con sus respectivos planos de transmisin perpendiculares entre s. La luz que atraviesa el primer filtro se convierte en un plano polarizado; o sea, las ondas de luz vibran en una sola direccin. En ausencia de una muestra birrefringente, los rayos de luz polarizada no pueden atravesar el segundo filtro y el campo del microscopio aparece oscuro. Sin embargo, si la muestra contiene elementos cuya orientacin permite girar la luz polarizada, el objeto aparece brillante contra el fondo oscuro. La figura 17-9, a, muestra la birrefrngencia del huso mittico provocada por la alineacin de los microtbulos que en gran nmero entran en su composicin. Otras estructuras celulares birrefringentes incluyen filamentos de miosina en el msculo estriado (fig. 17-9, b), cloroplastos (debido al apilamiento de sus membranas internas), paredes de clulas vegetales y diferentes tipos de inclusiones cristalinas.

Microscopa de fluorescencia Ciertas molculas (llamadasfluorocromos)absorben radiacin invisible, longitud de onda ultravioleta, y liberan parte de la energa en forma de longitud de onda ms larga, luz visible, provocando destellos contra un fondo oscuro. Gracias a esta propiedad se puede descubrir la distribucin de estas molculas dentro de un tejido mediante examen con microscopio de luz. En algunos estudios, el compuesto fluorescente se inyecta a una clula viviente y se sigue su destino dentro de la clula en tanto contina sus actividades normales. Por ejemplo, se pueden usar fluorocromos para estudiar el tamao de las molculas capaces de pasar entre las clulas (fig. 7-32) como indicadores de potenciales a travs de la membrana (fig. 5-21), o como sondas para determinar la concentracin de Ca2+ libre en el citoplasma (fig. 15-15). Alternativamente, se pueden unir fluorocromos mediante enlaces covalentes (conjugados) a una protena particular como actina o tubulina y la protena as marcada con fluorescencia se puede inyectar dentro de una clula viviente. Las protenas marcadas participan en las actividades normales de la clula y se les puede seguir por medio del microscopio para conocer las actividades dinmicas en las cuales participan (figs. 9-3 y 9-75). De manera similar, cuando se inyectan anticuerpos fluorescentes a una clula o se aaden a un corte de tejido, se puede determinar la posicin del antgeno correspondiente (figs. 9-5 y 12-20). Tambin se pueden usar fluorocromos en estudios de hibridacin de DNA-RNA, segn se describe en la pgina 406 y se ilustra en la figura 10-21. Microscopio de polarizacin El microscopio de polarizacin tiene una funcin especial que permite obtener informacin acerca de la organizacin

(a)

(b)
FIGURA 17-9. Visualizacin de las estructuras subcelulares compuestas de elementos alineados en el microscopio de polarizacin. a) El huso metafsico de un oocito muestra una notable birrefrngencia en un gran nmero de microtbulos orientados, b) Las bandas A de las sarcmeras de una sola miofibrilla aislada de un msculo esqueltico aparecen birrefringentes debido a los filamentos de actina y miosina alineados, (a: Segn Shiin/a nou \j Hideini Sato, J. Gen. Physiol. 50:262, 1967; b: segn Richard H. Colby, }. Cell Biol. 51:765, 1971; con permiso de Rockefeller Uiversih/ Press.)

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Videomicroscopia y procesamiento de imagen El campo microscpico se puede observar con la vista o fotografiar con una cmara, pero tambin se puede filmar con videocmara. Las videocmaras ofrecen algunas ventajas para visualizar las muestras. Por ejemplo, se pueden construir cmaras muy sensibles a la luz que permiten filmar un campo microscpico con iluminacin muy baja. Esto es particularmente til cuando se observan muestras vivas, fciles de daar por el calor de una fuente de luz, y muestras teidas con colorantes fluorescentes que se desvanecen con rapidez al exponerse a la luz. Adems, las videocmaras incrementan mucho el contraste de una imagen de modo que se pueden visualizar objetos muy pequeos. En la fotografa mostrada en la pgina 381 por ejemplo, se presenta la imagen de un microtbulo individual (dimetro 0.025,m) que normalmente se encuentra muy por debajo del lmite de resolucin del microscopio de luz (analizado en La va experimental del captulo 9). Adems, las imgenes captadas mediante videocmara se pueden someter a diferentes tipos de procesamiento por computadora, lo que incrementa mucho la informacin obtenida. Por ejemplo, en una computadora se pueden almacenar los distractores del fondo del campo visual y despus restarlos de la imagen que contiene la muestra. Este tipo de procesamiento de imagen aumenta notablemente la claridad del objeto. De manera similar, las diferencias en el brillo de una imagen pueden convertirse en diferencias de color y hacer el objeto mucho ms aparente al ojo, y tambin permiten someter el objeto a diferentes tipos de anlisis matemtico. Microscopio tridimensional confocal Una de las maneras ms informativas (y tediosas) de obtener mayor informacin acerca de la estructura interna de un objeto de inters biolgico, como la disposicin espacial de los diferentes tipos de clulas que constituyen un rgano, es seccionar un bloque del tejido mediante una serie de cortes sucesivos conocidos como cortes seriados. Cada uno de los cortes seriados puede entonces examinarse por separado y reconstruir la organizacin tridimensional de todo el objeto, de memoria o con ayuda de fotografas. Con el desarrollo de imgenes electrnicas y procesamiento de las mismas es posible examinar "cortes" de un objeto sin necesidad de seccionarlo con cuchilla. Cortes fotogrficos del cerebro humano efectuados por rastreo con TAC suministran un ejemplo bien conocido de esta tcnica. Normalmente, cuando se examina con el microscopio de luz una clula ntegra o un corte grueso de un rgano, el observador puede ver la muestra a diferente profundidad cambiando la posicin de la lente objetivo al girar el botn para enfocar la imagen. Mediante esta maniobra, las diferentes partes de la muestra caen dentro y fuera de foco. El hecho de que la muestra se pueda enfocar a diferentes niveles disminuye la capacidad para formar una imagen ntida porque las partes de la muestra situadas arriba y debajo del plano de foco interfieren con los rayos de luz procedentes de las partes situadas en dicho plano focal. En el ltimo decenio se desarroll un nuevo tipo de microscopio de luz

denominado microscopio tridimensional confocal, con el cual se puede resolver este problema. En este tipo de microscopio la muestra se ilumina con un delgado rayo lser concentrado en un foco que recorre rpidamente la muestra a una profundidad constante iluminando as slo un delgado plano ("corte ptico") dentro del objeto. Tpicamente, este microscopio se emplea para muestras teidas con colorantes fluorescentes y la luz emitida en el corte ptico iluminado se emplea para formar una imagen de dicho corte sobre una pantalla de video. La figura 17-10 muestra imgenes del ncleo de una clula aislada tomadas en tres planos diferentes. En esta serie de fotografas es evidente que los objetos que quedan fuera del plano de foco tienen poco efecto sobre la calidad de la imagen de cada corte. Es posible almacenar en una computadora imgenes de cortes pticos separados tomadas a diferentes profundidades y emplearlas para reconstituir una imagen tridimensional computadorizada del objeto ntegro. Preparacin de muestras para microscopio de luz Las muestras observables con el microscopio de luz caen dentro de dos categoras muy amplias: montaje completo y cortes. Un montaje completo es un objeto intacto, vivo o muerto, y puede ser un organismo microscpico entero, como un protozoario o una pequea parte de un organismo de mayor tamao. Si el objeto es lo bastante transparente se puede observar mediante luz transmitida. Los objetos opacos casi siempre se pueden hacer translcidos sustituyendo el agua de la muestra con alcohol y sumergiendo el objeto en solventes como tolueno o xileno, en los cuales la muestra aparece transparente. La mayor parte de los tejidos vegetales y animales son demasiado opacos para analizar al microscopio, excepto cuando se examinan rebanadas muy delgadas, o cortes. El primer paso de este proceso es matar las clulas sumergiendo el tejido en una solucin qumica llamada fijador. Un buen fijador penetra con rapidez a travs de la membrana celular e inmoviliza todo el material macromolecular, de modo que la estructura de las clulas se conserva lo ms cercana posible a la del estado viviente. Esto tiene importancia obvia cuando se examina la estructura celular al final de un procedimiento para tener la certeza de que lo observado refleja la verdadera estructura de la clula viviente y no es un artefacto producido a travs del proceso de fijacin. Los fijadores ms comunes para microscopio de luz son soluciones de formaldehido, alcohol o cido actico. Luego de la fijacin, el tejido se deshidrata pasndolo a travs de una serie de alcoholes e integrndolo a parafina, que suministra el apoyo mecnico para efectuar los cortes. Una de las grandes ventajas de la parafina como medio de soporte es la facilidad para disolverla y separarla de los cortes mediante diferentes solventes orgnicos. Para quitar la parafina basta con sumergir en tolueno las laminillas que contienen estos cortes, dejando el tejido unido a la laminilla donde se puede teir o tratar con enzimas, anticuerpos u otros agentes. Luego del procedimiento de tincin se coloca

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CAPITULO 17 Tcnicas en biologa celular y molecular

17-2 Microscopio de transmisin electrnica

Se han desarrollado bsicamente dos tipos diferentes de microscopio electrnico: el microscopio de transmisin electrnico (MTE), que forma imgenes a partir de electrones transmitidos a travs de una muestra, y el microscopio electrnico tridimensional (MET), que utiliza los electrones que rebotan de la superficie de la muestra. Todos los comentarios expresados en esta seccin del captulo se refieren al empleo del MTE; el MET se estudia por separado en la pgina 713. El microscopio de transmisin electrnico suministra una resolucin mucho mayor que el microscopio de luz, segn se ilustra comparando las dos fotografas de la figura 17-11 tomadas de cortes adyacentes del mismo tejido a la misma amplificacin utilizando estos dos tipos de microscopio. La fotografa de la figura 17-11, a, se aproxima al lmite de resolucin del microscopio de luz, y la fotografa de la figura 17-11, b, es ejemplo de micrografa electrnica de muy baja potencia. El gran poder de resolucin del microscopio electrnico deriva de las propiedades ondulatorias de los electrones. La ecuacin para el lmite de resolucin de una lente, D = 0.61 K (n seno 9), indica claramente la importancia de la longitud de onda de la radiacin luminosa. A diferencia de un fotn, la longitud de onda de un electrn no es una distancia constante, sino que se relaciona con la velocidad a la cual viaja la partcula, que a su vez depende del voltaje acelerador aplicado al microscopio. Esta relacin se define por la ecuacin

FIGURA I 7-10. Microscopa de rastreo confocal de tres cortes pticos de 0.3 ^m de espesor a travs del ncleo de una levadura teido con dos anticuerpos diferentes marcados con fluorescencia. (Vase la figura 12-22 para el anlisis del contenido de la micrografa.) (Segn Thierry Laroche y Susan M. Gasser, Cell 75:543, 1993, con permiso de Cell Press.)

un cubreobjetos sobre el tejido empleando un medio de montaje con el mismo ndice de refraccin de la laminilla de vidrio del portaobjetos y del cubreobjetos.

donde A es la longitud de onda en angstroms y V es el voltaje de aceleracin en voltios. El MTE opera con un voltaje que va de 10 000 a 100 000 V. A 60 000 V, la longitud de onda de un electrn es de aproximadamente 0.05 . Si se sustituye la abertura numrica alcanzable con el microscopio de luz en la ecuacin de arriba para calcular D, el lmite de resolucin sera de casi 0.03 . Cuando se considera que la distancia tpica entre el centro de los tomos de una molcula es del orden de 1 A, el resultado es sorprendente. En realidad, la resolucin alcanzable con el microscopio electrnico es casi dos rdenes de magnitud menos que su lmite terico. La razn es el difcil problema de la aberracin esfrica que sufre la lente encargada de enfocar los electrones, cuya solucin requiere que la abertura numrica de la lente sea muy pequea (en general entre 0.01 y 0.001). El lmite prctico de resolucin de los MTE estndar se encuentra en el intervalo de 3 a 5 . Cuando se observa una estructura celular, el verdadero lmite de ordinario se encuentra en el intervalo de 10 a 15 A. El microscopio electrnico consta principalmente de una alta columna cilindrica hueca donde se confina el rayo de electrones, y de una consola con un panel de botones giratorios que controlan electrnicamente las operaciones efectuadas dentro de la columna. La parte superior de la columna contiene el ctodo, un filamento de tungsteno que cuando se calienta acta como fuente de electrones. Los electrones se desprenden del filamento caliente y se aceleran para

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(a)

(b)
FIGURA 17-11. Comparacin de la informacin contenida en imgenes tomadas con microscopio de luz y con microscopio electrnico a amplificacin comparable de 4 500 veces el tamao real, a) Fotografa de tejido muscular esqueltico integrada en plstico, seccionada a un espesor de 1 /m, y fotografiada con un microscopio de luz bajo lente objetivo de inmersin en aceite, b) Corte adyacente al usado para la parte a cortado a 0.025 m y examinado con microscopio electrnico con amplificacin comparable a la utilizada en a. La imagen resultante muestra un incremento de resolucin de 100 a 200 veces. Ntese la diferencia en los detalles de las miofibrillas musculares, mitocondrias y el eritrocito contenido en los capilares. Aunque el microscopio de luz no pudiera suministrar informacin adicional alguna a la obtenida en a, el microscopio electrnico suministrara mucha mayor informacin, produciendo imgenes, por ejemplo, de la estructura de membranas individuales dentro de una pequea porcin de una de las mitocondrias (como en la figura 5-22). (Cortesa de Douglas E. Kelly y M.A. Cahill.)

17-12 se comparan los sistemas de lentes de un microscopio de luz y de un microscopio electrnico. Entre la fuente de electrones y la muestra se colocan lentes condensadores que se encargan de enfocar el rayo de electrones sobre la muestra. La propia muestra se sostiene sobre una pequea rejilla de metal delgado (3 mm de dimetro), que se introduce con pinzas en un soporte para la rejilla, el cual se introduce en la parte media de la columna del microscopio de modo que la rejilla se mantenga perpendicular al haz de electrones. Puesto que la distancia focal de las lentes de un microscopio electrnico se puede modificar cambiando la corriente suministrada, una lente objetivo puede recorrer toda la gama de amplificaciones sin necesidad de cambiar lentes, como en el microscopio de luz. Igual que en el microscopio de luz, la imagen producida por la lente objetivo sirve como objeto para un sistema adicional de lentes. La imagen suministrada por la lente objetivo se amplifica unas 100 veces, pero a diferencia del microscopio de luz, los detalles presentes en esta imagen son suficientes para amplificarlos unas 10 000 veces ms, lo que permite apreciar con la vista la informacin contenida. Modificando la corriente aplicada a las diferentes lentes del microscopio se puede variar la amplificacin desde casi 1 000 hasta 250 000 veces. La imagen que el observador ve es resultado de los electrones que pasan a travs de la muestra enfocados sobre una pantalla localizada en la parte inferior de la columna. Los electrones que golpean la pantalla excitan un recubrimiento de crista-

Pantalla para visualizar la imagen final

Lente ocular o proyector Imagen intermedia Lente objetivo Muestra

formar un delgado haz mediante la aplicacin de un voltaje entre el ctodo y el nodo. Antes de la operacin se extrae el aire de la columna para producir un vaco donde se desplazarn los electrones. Si no se extrae el aire, los electrones pueden dispersarse prematuramente por colisin con las molculas de gas. Puesto que los electrones son partculas con carga elctrica, se pueden desviar de su trayectoria y poner en foco mediante un campo magntico. Las lentes de un microscopio electrnico son electroimanes potentes localizados en la pared de la columna que rodea el centro de la columna al vaco. La fuerza de los imanes est controlada por la corriente suministrada, que a su vez es determinada por la posicin de los diferentes botones de la consola. En la figura

Lente condensador

Lmpara Microscopio de luz

Filamento Microscopio electrnico

FKiL'HA 1 7 - 1 2 . Comparacin de los sistemas de lentes de los microscopios de luz y electrnicos. (Segn W. Agar, Principies and Practice of Electron Microscope Operation, EIscvier North-HoHnna. 1974.)

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les fluorescentes que emiten su propia luz visible percibida por el ojo como una imagen de la muestra. La formacin de una imagen en el microscopio electrnico depende de la dispersin diferencial de electrones por las partes de la muestra. Consideremos un haz de electrones emitidos por el filamento y enfocados sobre la pantalla por la lente. En ausencia de,una muestra, todo el campo ser uniformemente brillante, iluminado de manera homognea por el haz de electrones que incide sobre la pantalla. Cuando se coloca una muestra en la trayectoria del haz, un porcentaje de electrones golpea los tomos de la muestra y se dispersan alejndose en cierto ngulo. Los electrones que rebotan de la muestra no atraviesan la abertura sumamente pequea situada atrs ^el plano focal de la lente objetivo, y por lo tanto se pierden y no participan en la formacin de la imagen. La dispersin de electrones por una porcin de la muestra es proporcional a la cantidad de materia presente en dicha porcin, o sea, su espesor de masa, que es una medida del nmero de tomos por unidad de rea y de su densidad atmica. Puesto que el material insoluble de las clulas consta de tomos de nmero atmico relativamente bajo, como carbono, oxgeno, nitrgeno e hidrgeno, el material biolgico posee muy poca capacidad intrnseca para dispersar electrones. Para lograr un buen contraste se confiere densidad atmica a la muestra fijando y tiendo el tejido con soluciones de metales pesados (descrito ms adelante). Estos metales penetran en la estructura de las clulas y forman complejos selectivamente con diferentes partes de los organelos. Es indispensable una afinidad diferencial por ios metales, porque si cada parte de una clula se une a los tomos de metal con la misma intensidad, todo el campo mostrara densidad uniforme y no se producira imagen alguna. Las partes de las clulas con mayor concentracin de tomos metlicos permiten el paso de menor nmero de electrones que participarn en la formacin de la imagen bajo la accin de las lentes. Cuanto menor sea el nmero de electrones enfocados sobre un punto determinado de la pantalla por unidad de tiempo ms oscura ser la pantalla en dicho punto, en tanto que cuanto mayor sea el nmero de electrones ms brillante ser el punto. La imagen se puede fotografiar desplazando la pantalla hacia afuera de la trayectoria de los electrones y permitiendo que stos incidan sobre una placa fotogrfica colocada en posicin debajo de la pantalla. Puesto que la emulsin fotogrfica es directamente sensible a los electrones, casi igual que a la luz, se puede registrar sobre la pelcula una imagen de la muestra. Preparacin de muestras para microscopio electrnico En la mayor parte de los casos, los tejidos examinados en el microscopio electrnico deben fijarse, montarse en algn material y practicar cortes igual que con el microscopio de luz, aunque los pasos son diferentes. En tejidos para microscopio electrnico (fig. 17-13), la fijacin es mucho ms importante que para el microscopio de luz, puesto que los cortes se someten a escrutinio mucho mayor. El fijador debe

interrumpir la vida de la clula sin alterar de manera significativa la estructura de la misma. A nivel de resolucin del microscopio electrnico, son muy aparentes los daos relativamente menores, como mitocondrias hinchadas o roturas del retculo endoplsmico. Para lograr una fijacin ms rpida y por lo tanto daar menos a las clulas, se preparan pedazos muy pequeos de tejido. Tambin es indispensable que el fijador no genere estructuras artificiales ausentes en la clula viva. Los fijadores son sustancias qumicas que desnaturalizan y precipitan a las macromolculas de la clula. Las sustancias qumicas capaces de esta accin pueden coagular o precipitar materiales que en la clula viviente carecen de estructura, y formar un artefacto. El mejor argumento de que una estructura particular no es un artefacto es demostrar su existencia en clulas fijadas con diferentes tcnicas, o todava mejor, sin fijador alguno. En este ltimo caso el tejido se congela de inmediato en vez de fijarlo con sustancias qumicas, y se utilizan tcnicas especiales para revelar su estructura (vase duplicacin de fracturas por congelacin, descrita ms adelante). Los fijadores ms comunes para observaciones con microscopio electrnico son glutaraldehido y tetrxido de osmio; este ltimo es un metal pesado que no slo fija a la clula, sino que adems le confiere propiedades para dispersar un colorante electrnicamente denso. Una vez fijado el tejido, se le debe extraer el agua mediante deshidratacin sumergindolo en soluciones de concentracin alcohlica creciente, y llenar os espacios entre el tejido con un material que soporte los cortes efectuados en el mismo. La observacin en microscopio electrnico demanda como requisito que los cortes examinados sean muy delgados. Con la mayor parte de las ceras empleadas para microscopio de luz es difcil obtener cortes ms delgados que 5 m, en tanto que los cortes para microscopio electrnico deben ser menores de 0.1 //m (espesor equivalente a casi cuatro ribosomas). Estos cortes son tan pequeos y delgados que si todas las secciones cortadas por un microscopista electrnico durante su vida se apilaran una sobre otra, probablemente seran equivalentes a menos 1 crn cbico. Desde 1961, el medio de material para embeber muestras es un plstico epxco llamado Epon. Se dispone de varios ultramicrotomos capaces de seccionar este plstico con el tejido que contiene a un espesor suficiente (0.02 a 0.1 //m) para examinar en el microscopio electrnico. Los cortes se obtienen deslizando lentamente el bloque de plstico sobre el borde sumamente afilado de una cuchilla (fig. 17-13) elaborada a base de vidrio o la arista de un diamante finamente pulido. Los cortes que se desprenden del borde de la cuchilla flotan sobre la superficie del agua contenida en un depsito situado justamente por debajo del borde de la cuchilla. A continuacin se recogen los cortes con la rejilla para muestra y se secan. El tejido se tie haciendo flotar la rejilla sobre gotas de soluciones de metal pesado, principalmente acetato de uranlo y citrato de plomo, que proporcionan masa con el espesor necesario para dispersar el rayo de electrones. Adems de los colorantes estndar, los cortes de tejido se pueden tratar con anticuerpos marcados con metal u otros materiales capaces de reaccionar con molculas especficas en el corte de tejido. Tambin se dispone de al-

CAPITULO 17 Tcnicas en biologa celular y molecular

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Tejido disecado y colocado en solucin fijadora

Luego del lavado, el tejido se deshidrata colocndolo en concentraciones cada vez ms elevadas de acetona o de alcohol

El tejido se encuentra ahora colocado en solucin diluida de un medio plstico para embeberlo

Frasco con la muestra

Soporte de la muestra para microtomo

Muestra

Cuando el plstico se endurece, el bloque se corta a ras y est listo para practicar secciones

El tejido se coloca en una mezcla para su integracin final y el plstico se polimeriza en un horno

Las secciones se practican con un ultra microtomo mediante cuchilla de vidrio o de diamante. Los cortes flotan por fuera del borde de la cuchilla sobre la superficie del agua

Las secciones se recogen de la superficie con una rejilla de cobre

Luego que los cortes se secan, estn listos para observar en el microscopio electrnico

FI<;UKA 17-13. Preparacin de una mezcla para observacin en el microscopio electrnico. (Segn W.A, Jensen y R.B. Park, Cell Ultrastructure, 1967; Wadsworth, reimpreso con permiso de! editor.)

gunos procedimientos citoqumicos, como el descrito en la pgina 302, para determinar la presencia de fosfatasa acida.
Tincin negativa

El microscopio electrnico tambin es muy adecuado para examinar partculas materiales sumamente pequeas, incluyendo agregados de peso molecular elevado como virus, ribosornas, enzimas de mltiples subunidades, elementos del citoesqueleto y complejos con protena. Adems, puede resolver la forma de protenas y cidos nucleicos individuales siempre y cuando presenten contraste suficiente

en relacin con las estructuras circunvecinas. Una de las mejores maneras de hacer visibles estas sustancias es emplear procedimientos de tincin negativa, en los cuales el metal pesado se deposita sobre toda la rejilla que sostiene la muestra, excepto en los sitios donde hay partculas. Como resultado, la estructura de la muestra destaca por su brillo relativo sobre la pantalla fluorescente. Para este procedimiento se coloca una gota de la solucin de tincin (acetato de uranilo o fosfotungstato de potasio) sobre una rejilla que contiene las partculas que deben examinarse y se permite evaporar la mayor parte de la gota hasta sequedad. Como consecuencia de la tensin superficial, la tincin suele ro-

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CAPITULO 17 Tcnicas en biologa celular y molecular

dear la partcula sobre la pelcula de apoyo y penetrar en todas las irregularidades abiertas en la superficie de la partcula. El resto de la partcula acumula poca tincin. El mtodo es particularmente satisfactorio para revelar la organizacin de cualquier subunidad dentro de la partcula. En la figura 17-14, a, se muestra un ejemplo de una muestra teida en negativo.
Moldeado de sombras

Otra tcnica ampliamente utilizada para hacer visibles partculas muy pequeas es emplear dichas partculas como objetos para moldear su sombra. La tcnica se describe en la figura 17-15. Las plantillas se colocan en una cmara sellada en donde se ha practicado el vaco. En la cmara se encuentra un filamento compuesto de un metal pesado (de ordinario platino) y carbn. El filamento se calienta a temperatura elevada provocando su evaporacin y depsito de un recubrimiento metlico sobre las superficies accesibles dentro de la cmara. Como resultado, el metal se deposita sobre las superficies enfrentadas al filamento, en tanto que las superficies opuestas de la muestra y el espacio que ocupa la rejilla en su sombra carecen de revestimiento y no pueden dispersar electrones. Por consiguiente, las reas dentro de la sombra aparecen brillantes sobre la pantalla, en tanto que las regiones revestidas de metal aparecen de color oscuro. Esta relacin se invierte sobre una placa fotogrfica, que es un negativo de la imagen. La convencin para ilustrar las sombras de las muestras es imprimir una imagen negativa en la cual aparece la partcula iluminada por una luz blanca brillante (correspondiente a la superficie recubierta) con una sombra del relieve de la partcula de color oscuro (fig. 17-14, b). Esta tcnica suministra un excelente contraste para materiales aislados y produce un efecto tridimensional. Duplicacin de fracturas por congelacin y congelacin al "aguajuerte" En varias tcnicas para examen microscpico se emplean tejidos congelados rpidamente en ausencia de fijador o despus de fijacin. Para evitar el dao producido por la formacin de cristales de hielo, el tejido se infiltra con ciertos compuestos, como glicerol, y luego se congela rpidamente en lquidos de muy baja temperatura de congelacin (como fren lquido, punto de fusin -150C), o colocando la muestra contra un bloque de metal enfriado con helio lquido. El tejido congelado casi siempre se observa mediante la tcnica de duplicacin de fracturas por congelacin, ilustrada en la figura 17-16. Se colocan pedazos pequeos de tejido sobre un disco metlico y luego se congelan rpidamente, como se describi antes. A continuacin el disco se coloca en un soporte especial y se golpea el bloque de tejido congelado con el borde de una cuchilla, provocando un plano de fractura o fisura que se extiende a partir del punto de contacto desdoblando el tejido en dos partes. Consideremos lo que ocurre a medida que un plano de fractura avanza a travs de una clula compuesta de gran variedad de organelos diferentes. Estas estructuras tienden a desviar el plano de fractura hacia arriba o hacia abajo, lo que provoca la formacin de elevaciones y depresiones en las superficies del plano de fractura que reflejan el contorno

(a)

(b)
FIGURA 17-14. Ejemplos de muestras tenidas en negativo y sombreado metlico. Micrografas electrnicas de un virus cascabel del tabaco luego de tincin negativa con foto tu ngs tato de potasio (a) o molde sombreado con cromo (b). (Cortesa de M. K. Corbctt.)

del protoplasma atravesado. En otras palabras, la superficie expuesta por la fractura contiene informacin acerca del contenido de la clula. El objetivo es hacer visible esta informacin. Esto se logra mediante el proceso de duplicacin utilizando la superficie de fractura como una plantilla sobre

CAPITULO 17 Tcnicas en biologa celular y molecular Evaporacin del metal a partir de un alambre de platino

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se puede evaporar una capa de hielo (sublimar) de la superficie de la muestra. Luego de quitar el agua circunvecina se puede recubrir la superficie de la estructura con metal pesado (fig. 4-19). A fines del decenio de 1970 se desarroll la tcnica de aguafuerte profundo con congelacin inmediata, con lo que se logr una nueva visin fascinante de los organelos celulares. En las figuras 17-17 y 9-49 se muestran ejemplos de muestras preparadas con esta tcnica. En cada caso se observa la estructura celular con todas sus partes en relieve profundo contra el fondo. Esta tcnica suministra muy alta resolucin y se puede emplear para revelar la forma de complejos macromoleculares, corno microlamentos, microtbulos y agregados de protenas de membrana en la forma que se supone existe dentro de la clula viva.

FIGURA 17-15. Procedimiento para moldeado de sombras como medio para suministrar contraste en el microscopio electrnico. Este procedimiento se emplea con frecuencia para visualizar partculas muy pequeas, como los virus mostrados en ia figura previa. Las molculas de DNA y RNA casi siempre se hacen visibles mediante una modificacin de este procedimiento, conocida como sombreado rotatorio, en el cual se evapora el metal a un ngulo muy pequeo en tanto la muestra va girando.

17-3 Microscopio electrnico tridimensional

Aunque el ME de transmisin se utiliza ms ampliamente para examinar estructuras internas de las clulas, el ME tridimensional constituye el medio para examinar con gran claridad y detalle la superficie de objetos cuyo tamao va desde un virus hasta la cabeza de un animal (fig. 17-18). La construccin y operacin del MET son muy diferentes comparadas con el MTE. La preparacin de una muestra para MET tiene como objetivo producir un objeto con forma y propiedades de superficie iguales a las del estado viviente, pero totalmente deshidratado. Puesto que el agua constituye un porcentaje muy elevado del peso de las clulas vivientes y se presenta prcticamente en toda macromolcula, eliminarla puede tener un efecto muy destructivo sobre la estructura celular. Cuando las clulas se secan simplemente al aire, la destruccin se produce por efecto de la tensin superficial en las interfases aire-agua. Las muestras para examinar con el MET generalmente se preparan mediante la tcnica de secado hasta el punto crtico, que se basa en la existencia de una temperatura y presin crticas para cada solvente dentro de un recipiente cerrado donde la densidad de vapor sea igual a la densidad de lquido. En este punto no hay tensin superficial entre el gas y lquido, El solvente de la clula se sustituye con un fluido de transiciqn en estado lquido (por lo general dixido de carbono), que se vaporiza bajo presin de modo que las clulas no se expongan a tensin superficial alguna que podra deformar su configuracin tridimensional. Una vez deshidratada la muestra se recubre con una capa de carbn y luego otra de metal (en general oro u oropaladio), que la convierte en "blanco" adecuado para un haz de electrones. En el MTE, la lente condensador enfoca el rayo de electrones para iluminar simultneamente todo el campo visual. En el MET, los electrones se aceleran y forman un haz delgado (5 nm de dimetro) que rastrea la muestra. En el MTE, los electrones que forman la imagen son los que atraviesan la muestra. En el MET, la imagen se forma por electrones reflejados hacia atrs a partir de la muestra (retrodispersin) o por electrones secundarios desprendidos de la muestra luego que son golpeados por el haz de electrones primarios. Estos electrones inciden so-

la cual se deposita una capa de metal pesado. El metal pesado se deposita sobre la superficie recin expuesta de tejido congelado dentro de la misma cmara a medida que ocurre la fractura. El metal se deposita a cierto ngulo y genera sombras que acentan la topografa local (fig. 17-16, &), segn se describe en la seccin acerca de moldeado de sombra. A continuacin se deposita una capa de carbn sobre la capa metlica dejando caer el carbn verticalmente, ms bien que en ngulo, de modo que se forma un capa uniforme para reunir los parches de metal en una capa slida. Despus de formar un molde de la superficie se puede derretir, retirar y desechar el tejido que sirvi de plantilla; la rplica metal-carbn se coloca sobre la rejilla para muestras y se observa con el haz de electrones. Las variaciones de espesor del metal sobre las diferentes partes de la rplica provocan cambios en el nmero de electrones incidentes que alcanzan la pantalla del microscopio y suministran el contraste necesario en la imagen. Como se estudi en el captulo 4, los planos de fractura recorren el camino de menor resistencia a travs del bloque congelado, lo que con frecuencia los conduce a pasar por el centro de las membranas celulares. Por consiguiente, esta tcnica es particularmente adecuada para examinar el interior de las membranas (pg. 135). La duplicacin de fractura por congelacin representa en s una tcnica sumamente valiosa, pero puede proporcionar an mayor informacin si se incluye una etapa denominada congelacin "al aguafuerte". En esta etapa, la muestra congelada y fracturada, aun en su sitio dentro de la cmara de congelacin, se expone a vaco y temperatura elevada por uno o unos pocos minutos, durante los cuales

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CAPITULO 17 Tcnicas en biologa celular \j molecular

Muestra

Fren lquido M2 lquido Soporte para la muestra _^? Campana de vidrio Cuchilla fra Cuchilla fra

FIGURA 17-16, Rplicas de fracturas por congelacin, a) Procedimiento para la formacin de rplicas de fracturas por congelacin segn se describe en el texto, b) Rplica de una fractura por congelacin en una clula de raz de cebolla mostrando la envoltura nuclear (KE) con sus poros (NP), el complejo de Golgi (G) y una vacuola citoplsmica (V), y la pared celular (CW). (b: Cortesa de Daniel Branton.)

Sombreado metlico

Rplica para observar en el microscopio electrnico

\ Capa de carbn depositada > despus del sombreado

(a)

bre un detector localizado cerca de la superficie de la muestra. En el MET la imagen se forma indirectamente comparada con la del MTE. Adems del haz que rastrea la superficie de la muestra, otro haz de electrones en movimiento lo hace frente al tubo de rayos catdicos. La imagen observada sobre este tubo se parece a la imagen vista en una pan-

talla de televisin. Los electrones que rebotan de la muestra y alcanzan el detector controlan directamente la intensidad de la seal del rayo situado dentro del tubo de rayos catdicos. Cuantos ms electrones procedentes de la muestra se acumulen en un punto determinado, ms fuerte ser la seal al tubo y mayor la intensidad del rayo sobre la pantalla en el punto correspondiente. El resultado es una imagen que refleja la topologa de la superficie de la muestra, puesto que esta topologa (grietas, prominencias y depresiones) determina el nmero de electrones recopilados en las diferentes partes de la superficie. Las propiedades ms notables del MET son su extensa gaa de amplificacin y la tremenda profundida'd de su foco, unas 500 veces mayor que el del microscopio de luz a una amplificacin correspondiente. Esta propiedad confiere a las imgenes MET su calidad tridimensional. Ms importante an, a nivel celular, el MET permite visualizar la superficie externa de la clula y las diferentes prolongaciones, extensiones y materiales extracelulares que participan en las interacciones de la clula con su medio.

17-4 Uso de radioistopos

Un trazador es una sustancia que manifiesta su presencia de alguna manera y por lo tanto permite a un investigador

CAPITULO 17 Tcnicas en biologa celular y molecular

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FIGURA 17-17. Aguafuerte profundo. Mcrografa electrnica de un axoncma ciliar del protozoario Tetrahymena. Los axonemas se fijaron, congelaron y fracturaron, y el agua congelada en la superficie del bloque fracturado se evapor dejando el relieve de una porcin del axonema, segn se observa en esta rplica metlica. La flecha indica una lnea distinguible de los brazos de dinena externos. (Segn rsula W. Goodenmtgh y John E. Heuser, J. Cell Biol. 95:800, 1982; con permiso de Rockefeller University Press.)

seguirla durante un experimento. A todo lo largo de este libro se han mencionado, trazadores electrnicamente densos, fluorescentes, con giro visible, con densidad marcada y, con mayor frecuencia, trazadores marcados con istopos radiactivos. Cada uno de estos tipos de trazadores confiere al grupo marcado la posibilidad de ser detectados dentro de una molcula sin afectar la especificidad de sus interacciones. Por ejemplo, no se pueden conocer las diferencias entre una molcula de glucosa 6-fosfato que contiene un tomo de hidrgeno, carbono o fosfato radiactivo en vez de uno de estos tomos no radiactivo. Las molculas radiactivas participan en las mismas reacciones que las especies no radiactivas, pero se puede seguir y cuanticar su presencia. La identidad de un tomo (de hierro, cloro o algn otro tipo), y por lo tanto sus propiedades qumicas, estn definidas por el nmero de protones con carga positiva en su ncleo. Todos los tomos de hidrgeno tienen un solo protn, los tomos de helio dos protones, los tomos de litio tres protones, y as sucesivamente. Sin embargo, no todos los tomos de hidrgeno, helio o litio tienen el mismo nmero de neutrones. Los tomos que poseen igual nmero de protones y diferente nmero de neutrones se dice que son istopos entre s. Incluso el hidrgeno, el elemento ms simple, puede existir en forma de tres istopos diferentes, segn si el tomo tiene 0,1 o 2 neutrones en su ncleo. De

FIGURA 17-ll. Microscopio electrnico tridimensional. Micrografa electrnica tridimensional de: a) bacterifago T4 (X 275 000) y b) cabeza de un insecto (x 40). (a: Reimpreso con permiso de A.N. Broers, B.J. Panessa y /.F. Geunaro, Science 189:635, 1975; copyright 1975 American Association for the Advancement of Science; b: cortesa de H.f. Howden y L.E.C. Ling.)

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CAPITULO 17 Tcnicas en biologa celular y molecular

estos tres istopos de hidrgeno, slo el que contiene dos neutrones es radiactivo; se le conoce como tritio (3H). Los istopos son radiactivos cuando contienen una combinacin inestable de protones y neutrones. Esta inestabilidad confiere al tomo una tendencia a fragmentarse y alcanzar as una configuracin ms estable. La desunin o desintegracin de un istopo radiactivo da como resultado la liberacin de energa en forma de una partcula o radiacin electromagntica, y ambas pueden reconocerse mediante sistemas de deteccin apropiados. Los istopos radiactivos se encuentran a travs de toda la tabla peridica de los elementos, y tambin se pueden producir en el laboratorio a partir de elementos no radiactivos. Por consiguiente, es posible obtener casi cualquier tipo de molcula biolgica en estado radiactivo, o sea, que contenga uno o ms tomos radiactivos como parte de su estructura. Adems de la identidad del elemento, las propiedades ms importantes de un istopo radiactivo son: 1) el tipo de radiacin que emite; 2) la energa de la radiacin, y 3) la vida media del istopo. Durante su desintegracin, los tomos pueden liberar tres formas principales de radiacin. El tomo puede liberar una partcula alfa, que consta de dos protones y dos neutrones y equivale al ncleo de un tomo de helio; una partcula beta, que equivale a un electrn, o ambos tipos de partculas simultneamente; y radiacin gamma, que consiste en radiacin electromagntica o fotones, de manera aislada o junto con las dos partculas anteriores. De los tres tipos de radiacin, las partculas alfa son la de menor energa y los "rayos" gamma los de mayor energa. Casi todos los istopos de importancia biolgica emiten partculas beta, el tipo de radiacin ms fcil de detectar y cuanticar, y el nico tipo que consideraremos en el siguiente anlisis. Las partculas beta contienen energa que vara desde muy dbil, como la emitida por el tomo de tritio (0.018 millones de eV), hasta energas muy elevadas, como la emitida por el tomo 32P (1.71 millones eV). Esta diferencia del contenido de energa se manifiesta en la distancia que la partcula beta viaja antes de detenerse, valor conocido como longitud de va y su poder de penetracin. Aunque la partcula beta emitida por un tomo 3H slo viaja unos pocos micrmetros y no puede penetrar las paredes de un recipiente de vidrio, la partcula beta procedente de un tomo 32P puede atravesar una habitacin, de modo que las soluciones altamente radiactivas se mantienen en el laboratorio detrs de una placa de plomo para proteger a los trabajadores. La vida media (t1/2) de un istopo radiactivo es una medida de su inestabilidad. Cuanto ms inestable sea un istopo particular, mayor ser la probabilidad de que un tomo determinado se desintegre en cierto tiempo. Si se comienza con un Curie1 de tritio, la mitad del material radiactivo se perder en unos 12 aos (esta es la t1/2 de este radioistopo). La vida media de una sustancia de ordinario no es muy importante en investigaciones biolgicas, siempre y cuando sea lo bastante prolongada para permitir su empleo en estudios individuales. En los primeros aos de

investigacin en fotosntesis y otras vas metablicas, el nico istopo de carbono disponible fue 11C, con una vida media aproximada de 20 minutos. Los experimentos con nC fueron literalmente realizados de prisa, de modo que la cantidad de istopo incorporada pudiera medirse antes que la sustancia casi desapareciera. No es sorprendente que la disponibilidad del 14C, un radioistopo con vida media de 5 700 aos, fuera celebrada con gran jbilo. Los radioistopos de mayor importancia en investigaciones de biologa celular se muestran en el cuadro 17-1, junto con la informacin acerca de su vida media y naturaleza de su radiacin. Los istopos radiactivos se emplean extensamente por la facilidad para detectarlos y cuantificarlos con precisin. Los istopos de uso ms comn son los emisores beta, que se pueden determinar con dos tcnicas diferentes: espectrometra de centelleo lquido y autorradiografa. Se emplea un contador de centelleo lquido cuando se quiere determinar la cantidad de radiactividad en una muestra determinada, como la contenida en una fraccin tomada del gradiente de sacarosa mostrado en la figura 17-32, c. En contraste, la autorradiografa se emplea cuando se desea conocer dnde se localiza un istopo particular, sea en una clula, en un gel de poliacrilamida o en un filtro de nitrocelulosa. En la siguiente seccin estudiaremos la autorradiografa. La espectrometra de centelleo lquido se basa en la propiedad de ciertas molculas, llamadas fosforescentes o centelleantes, para absorber parte de la energa de una partcula emitida y liberar esa energa en forma de luz. En la preparacin de muestras para centelleo lquido, la solucin del fosforescente se mezcla con la muestra en un recipiente de vidrio o de plstico especial para centelleo. As, el fosforescente y el istopo radiactivo entran en contacto muy estrecho, de modo que se pueda medir con eficacia la radiacin aun de los emisores beta ms dbiles. Una vez hecha la mezcla se coloca el recipiente en el instrumento contador, donde desciende a un pozo cuyas paredes estn provistas de un dispositivo fotodetector sumamente sensible. La desintegracin de tomos radiactivos dentro del frasco genera emisin de partculas que activan las partculas centelleantes que emiten destellos de luz. La luz se detecta y la seal se amplifica mediante un tubo fotomultiplicador situado dentro del contador. Luego de someter a deteccin electrnica para eliminar el ruido de fondo, la magnitud de la radiactividad presente en el frasco se revela en forma de cuentas por minuto sobre el aparato de registro del contador.

Auto rr adiogr afa

La autorradiografa es una tcnica bien fundamentada para visualizar sitios donde se localiza la radiactividad en diferentes tipos de muestras, incluyendo clulas fijadas, gel de electroforesis o hbridos DNA-RNA contenidos en cortes. En la pgina 278 se describi la importancia de la autorradiografa en la bsqueda de informacin acerca de las actividades de sntesis en las clulas. En esos experimentos se incubaron clulas con aminocidos marcados con istopo radiactivo y se observ el destino de la radiactividad incorporada desde el sitio de ensamblado de la protena

1 Un Curie es la cantidad de radiactividad necesaria para producir 3.7 x 1010 desintegraciones por segundo.

CAPITULO 17 Tcnicas en biologa celular y molecular CUADRO 17-1. Propiedades de algunos radioistopos comnmente usados en investigacin biolgica Nmero atmico Smbolo y peso atmico
3H

717

Vida meda 12.3 aos 20 min 5 700 aos 15.1 hora 14.3 das 87.1 das 12.4 horas 152 das 45 das 5.3 aos 12.8 horas 250 das 8.0 das

Tipo de partculas emitidas Beta Beta Beta Beta Gamma Beta Beta Beta Gamma Beta Beta Gamma Beta Gamma Beta Gamma Beta Gamma Beta Gamma

Energa de la partcula (millones de eV)

1 6 11 15 16 19 20 26 27 29 30 53

"C

HC
24Na
32p 35S 42K

Ca
59Fe

6Co

"Cu

"5Zn
131T

0.018 0.981 0.155 1.39 2.75, 1.37 1.71 0.167 3.58, 2.04 1.395 0.260 0.460, 0.26 1.30, 1.10 0.308 1.317, 1.115 0.657, 0.571 1.35 0.32 1.11 0.605, 0.250 0.164, etc.

en el retculo endoplsmico rugoso hasta su salida al espacio extracelular por exocitosis (fig. 8-3). En la autorradiografa se aprovecha que las partculas emitidas por un tomo radiactivo pueden activar una emulsin fotogrfica, de igual manera que la luz o los rayos X pueden activar la emulsin que recubre un pedazo de pelcula. Cuando se pone en ntimo contacto la emulsin fotogrfica con una fuente radiactiva, las partculas emitidas por la fuente aparecen en la emulsin como minsculos granulos negros plateados al revelar la fotografa. La autorradiografa se emplea para localizar radioistopos inmovilizados dentro de cortes de clulas y tejidos sobre una laminilla o una rejilla para micrografa electrnica. En la figura 17-19 se muestran los pasos para preparar una autorradiografa para microscopio de luz. La emulsin se aplica en forma de capa muy delgada que cubre los cortes colocados sobre la laminilla o la rejilla, y la muestra se coloca en un recipiente a prueba de luz para permitir que la emulsin slo se exponga a las emisiones. Cuanto ms tiempo se deje la muestra antes de revelar la pelcula mayor ser el nmero de granulos plateados que se formen. Cuando se examina al microscopio la laminilla o la rejilla despus del revelado, la localizacin de los granulos plateados en la capa de emulsin justo arriba del tejido indica dnde se localiza la radiactividad en las clulas (fig. 17-20). En la autorradiografa para localizar radioistopos dentro de las clulas, la limitacin ms grave del microscopio electrnico es su resolucin. En las clulas examinadas, la localizacin de los radioistopos se determina por la posicin de los granulos plateados suprayacentes. Si los granu-

los plateados son demasiado grandes en relacin con el organelo donde se origina la radiactividad, puede ser imposible identificar el sitio desde el cual se emiten las partculas. De manera similar, la partcula emitida por la fuente radiactiva puede viajar cierta distancia desde su punto de origen antes de golpear la emulsin. Como resultado, la localizacin del granulo plateado, o sea el sitio donde la partcula interacta con la emulsin, puede ser cualquier distancia a partir de la fuente de emisin dentro del tejido. Por esta razn, slo aquellos radioistopos que emiten partculas cuya va es de longitud corta, como 3H y 14C, son adecuados para uso amplio en autorradiografa microscpica.

17-5

Cultivo de clulas

A travs de todo este libro hemos subrayado el enfoque de la biologa celular en el que se intenta entender procesos particulares mediante el anlisis in vitro de sistemas simplificados y controlados. El mismo enfoque se puede aplicar al estudio de las propias clulas, puesto que tambin se pueden aislar de las influencias a las cuales estn sometidas normalmente dentro de un complejo organismo multicelular. La capacidad de las clulas para crecer fuera del organismo, o sea, en cultivo de clulas, es uno de los logros tcnicos ms valiosos en todo el estudio de la biologa. Una rpida revisin de cualquier publicacin peridica de biologa celular revela que la mayor parte de los artculos describen investigaciones efectuadas en cultivo de clulas. Las

718

CAPITULO 17 Tcnicas en biologa celular y molecular Corte en plstico

Lavado y fijacin de las clulas

Clulas Clulas deshidratadas e integradas en

cera o plstico.
Clulas incubadas en un compuesto radiactivo Bloque de cera o de plstico para las Lamni|la Clulas en fijador secciones

Laminilla

Emulsin lquida Seccin Vaso para el remojo Laminillas almacenadas en una caja oscura hasta que el proceso concluya Revelado Vista superior Vista lateral
Ca P? . d ,e Granulos plateados emulsin

Laminillas remojadas en una emulsin sensible a radiacin en el cuarto oscuro

. ~7 I Laminilla Co'rte Granos plateados Granos p|ateados sobre la clula ""' '"Al111' del fondo Laminilla despus de procesamiento

Clula

FIGURA 17-19. Procedimiento paso a paso para la preparacin de una autorradiografa.

razones de esto son abundantes, incluyendo: la facilidad para obtener clulas en gran cantidad; el hecho de que la mayor parte de los cultivos slo contienen un tipo nico de clula; la amplia variedad de los diferentes tipos de clulas que pueden crecer en cultivo; el gran nmero de diferentes actividades celulares que se pueden estudiar, incluyendo endocitosis, movimiento celular, divisin de la clula, trfico a travs de la membrana y sntesis de macromolculas; la oportunidad de estudiar la diferenciacin celular, que es el proceso mediante el cual las clulas embrionarias no diferenciadas se convierten en clulas de tipo altamente especializado, y el hecho de que las clulas cultivadas respondan al tratamiento con frmacos, hormonas, factores de crecimiento y otras sustancias activas. Segn se describe en la pgina 378, el primer intento de cultivar clulas vivientes de vertebrados fuera del cuerpo se realiz con xito en 1907. En los siguientes decenios, varios investigadores afinaron las condiciones ptimas para desarrollar clulas animales fuera del cuerpo y

conservar los cultivos libres de contaminacin con microorganismos. En los primeros estudios de cultivos de tejido se emplearon medios que contenan una gran variedad de sustancias desconocidas. El crecimiento de las clulas se logr aadiendo lquidos obtenidos de sistemas vivientes, como linfa, suero sanguneo u homogenado de embriones. Se observ que las clulas requieren gran variedad de nutrientes, hormonas, factores de crecimiento y cofactores para permanecer saludables y creciendo. Incluso en la actualidad, la mayor parte de los medios de cultivo contienen una cantidad considerable de suero. La principal meta del cultivo de clulas es desarrollar medios definidos Ubres de suero que apoyen el crecimiento de las clulas. Utilizando un mtodo pragmtico en el cual se combinaron varios ingredientes para probar su capacidad de apoyo al crecimiento y proliferacin celular, se cultiv con xito un nmero cada vez mayor de tipos celulares en medios completamente "artificiales" que carecen de suero o de otros lquidos naturales. Como sera de esperar, la composicin de estos medios qumicamente definidos es relativamente compleja y consta de una mezcla de nutrientes y vitaminas, junto con varias protenas purificadas, incluyendo insulina, factor de crecimiento epidrmico y transferrina (que suministra a las clulas hierro aprovechable). En el cuadro 17-2 se proporciona una lista de los suplementos empleados con mayor frecuencia en medios libres de suero. Adems de un medio complejo, casi todas las clulas requieren una superficie apropiada sobre ia cual crecer. A diferencia de la mayor parte de las clulas cancerosas, capaces de crecer en suspensin, las clulas normales requieren un sustrato slido, como vidrio o plstico. Una vez asentadas las clulas en el fondo del plato de cultivo, secretan materiales extracelulares como colgena, fibronectina y laminina, que las ayudan a conservarse fijas al sustrato. El primer paso para el cultivo es obtener las clulas. En la mayor parte de los casos slo es necesario extraer de un tanque de nitrgeno lquido un frasco de clulas previamente cultivadas y congeladas, derretir el contenido del frasco y transferir las clulas al medio que espera por ellas. Un cultivo de este tipo se conoce como cultivo secundario, porque las clulas se derivan de un cultivo previo. Por otra parte, en un cultivo primario las clulas se obtienen a partir del propio organismo. Los cultivos primarios de clulas animales se obtienen en su mayor parte de embriones cuyos tejidos son ms fciles de disociar en clulas aisladas comparados con tejidos adultos. La disociacin se efecta quitando el tejido del embrin y de ordinario se trata con una enzima proteoltica, como tripsina, capaz de digerir el material protenceo que mantiene juntas a las clulas. A continuacin se lava el tejido para liberarlo de la enzima y por lo general se suspende en una solucin salina sin iones Ca2+ pero con una sustancia, corno cido etilendiaminotetra-actico (EDTA), que enlaza iones calcio (quelatos). Como se estudi en el captulo 7, los iones calcio desempean un papel clave en la adherencia clula-clula, y su eliminacin de los tejidos facilita mucho la separacin de las clulas. Una vez disociadas las clulas en suspensin de clulas aisladas, se pueden cultivar directamente o ser separadas segn su propio tipo, y a continuacin colocarlas en cultivo.

CAPITULO 17 Tcnicas en biologa celular y molecular

719

affi. -/V. *, v*

"-" '".

(a)

(b)

FIGURA 1 7-20. Ejemplos de autorradiografa con microscopio de luz y con microscopio electrnico, a) Autorradiografa con microscopio de luz de un cromosoma politeno del insecto Chironomus, mostrando la extensa incorporacin de 3 H-uridina en el RNA de las regiones esponjadas del cromosoma. Las autorradiografas de este tipo confirman que los cromosomas esponjados son sitios de transcripcin. Esta micrografa se puede comparar con la de la figura 10-7, b, que muestra el mismo cromosoma observado con el microscopio electrnico tridimensional, b) Autorradiografa con microscopio electrnico de una clula de mdula sea incubada en 35SO4 durante cinco minutos y fijada de inmediato. La incorporacin de sulfato, segn se revela por los granos plateados de color oscuro, se.localiza principalmente en e! complejo de Golgi (flecha), (a: Segn C. Pelling, Chromosoina 15:98, 1964; b: segn R.W. Yoting, J. Cell Biol. 67:177, 1973; con permiso de Rockefeller University Press.)

Las clulas se pueden separar mediante algunas tcnicas, como centrifugacin diferencial o el uso de un clasificador celular fluorescente activado. En esta ultima tcnica, la suspensin de clulas se trata con un anticuerpo fluorescente que se enlaza especficamente a la superficie del tipo de clula que se intenta cultivar y luego se pasa la suspensin a travs de un instrumento electrnico capaz de apartar en un tubo separado clulas marcadas con fluorescencia de aquellas que carecen de marca. Una vez separadas las clulas se pueden iniciar dos tipos bsicos de cultivo primario. En un cultivo de masa se aade un gran numero de clulas al plato de cultivo, que se asientan y fijan al fondo del plato y forman una capa relativamente uniforme de clulas. Las clulas que sobreviven crecen y se dividen, y luego de algunas generaciones forman una monocapa de clulas que cubre el fondo del plato (fig. 17-21, a). En el otro tipo de cultivo, llamado cultivo clonal, se aade una cantidad relativamente pequea de clulas a un plato de cultivo; despus de asentarse y fijarse a la superficie del fondo, cada una se encuentra a cierta distancia de sus vecinas; en este caso, la proliferacin de las clulas genera colonias individuales o cinos de clulas (fig. 17-21, b) cuyos miembros se derivan de la misma clula original. Las clulas normales (no malignas) slo pueden efectuar un nmero limitado de divisiones celulares (tpicamente 50 a 100) antes de sufrir un proceso de senectud y muerte. Debido a esto, muchas de las clulas comnmente utilizadas en estudios de cultivo de tejidos han sufrido modificaciones genticas que les permiten crecer de manera indefinida. Las clulas de este tipo se conocen como estirpe celular, y en

condiciones tpicas pueden crecer para formar tumores malignos cuando se inyectan a un animal de laboratorio susceptible. La frecuencia de transformacin espontnea de una clula normal que crece en cultivo a una estirpe celular, se relaciona con la especie de la cual se deriva. Por ejemplo, las clulas de ratn a menudo se transforman de esta manera; las clulas humanas slo lo hacen raras veces. Muchos tipos diferentes de clulas vegetales tambin pueden crecer en cultivo de clulas. El primer paso en la formacin de estos cultivos es tratar las clulas con la enzima celulasa capaz de digerir la pared que rodea la clula, y liberar la clula desnuda o protoplasto. Los protoplastos pueden entonces crecer en un medio qumicamente definido qup promueve su desarrollo y divisin. En condiciones adecuadas, las clulas pueden crecer formando grumos de clulas indiferenciadas llamados callos, en los cuales se puede inducir el desarrollo de retoos para regenerar nuevas plantas.

17-6 Fraccionamiento del contenido de una clula por centrifugacin diferencial

La mayor parte de las clulas contienen gran variedad de diferentes tipos de organelos. Cuando se pretende estudiar una funcin particular de las mitocondrias o aislar una enzima particular del complejo de Golgi, es de suma utilidad poder aislar el organelo relevante en estado puro. El aislamiento de un organelo particular en cantidad apreciable

720

CAPITULO 17 Tcnicas en

celular y molecular

CUADRO 17-2. Suplementos de un medio libre de suero Concentracin Hormonas y factores de crecimiento Insulina Glucagon Factor de crecimiento epidrmico Factores de crecimiento nervioso Factor Gimmel Factor de crecimiento de fibroblastos Hormona foliculoestimulante Hormona de crecimiento Hormona luteinizantef Hormona liberadora de tirotropina Hormona liberadora de hormona luteinizante Prostaglandina Ej Prostaglandina F2 Triyodotironina Hormona paratiroidea Somatomedina C Hidrocortisona Progesterona Estradiol Testosterona Protenas de enlace Transferrina BSA libre de cido graso! Factor de fijacin y dispersin Globulina insoluble al fro Factor srico de propagacin Fetuinaf Gel de colgena Recubrimiento de polisina Factores nutrientes de bajo peso molecular H3SeO3 CdSO4 Putrescina Acido ascrbico c-Tocoferol Retinol Acido linoleico 0.1-10 g/ml 0.05-5 g/ml 1-100 ng/ml 1-10 ng/ml 0.5-10 g/ml* 1-100 ng/ml 50-500 ng/ml 50-500 ng/ml 0.5-2 g/ml 1-10 ng/rnl 1-10 ng/ml 1-100 ng/ml 1-100 ng/ml 1-100 pM 1 ng/ml 1 ng/ml 10-100 nM 1-100 nM 1-10 nM 1-10 nM 0.5-100 g/ml 1 mg/ml

2-10 g/ml 0.5-5 g/ml 0.5 mg/ml Cubierta de sustrato Cubierta de sustrato
10-100 nM

100 /(M

sucesivamente mayor se pueden aislar de la suspensin los organelos citoplsmkos ms grandes (mitocondrias, cloroplastos, lisosomas y peroxisomas), a continuacin se separan los microsomas (fragmentos de membranas vacuolares y reticulares del citoplasma) y por ltimo los ribosomas. Este ltimo paso requiere una ultracentrfuga capaz de generar velocidades de. 75 000 revoluciones por minuto, produciendo fuerzas equivalentes a 500 000 veces la gravedad. Una vez extrados los ribosomas, el sobrenadante contiene la fase soluble de la clula y las partculas demasiado pequeas para quitar con facilidad mediante sedimentacin. Los pasos iniciales de la centrifugacin diferencial por lo general no separan fracciones puras de un organelo particular, por lo que de ordinario se requieren pasos adicionales. En muchos casos se logra mayor purificacin centrifugando la preparacin cruda a travs de un gradiente de densidad de sacarosa, como se muestra en la figura 17-22, b. La centrifugacin a travs de un gradiente distribuye el contenido de la fraccin en varias capas, segn la densidad de los componentes (estudiado con mayor detalle en el tema de centrifugacin de equilibrio en un gradiente de densidad, en la pgina 730). Los organelos celulares aislados mediante centrifugacin diferencial retienen sus actividades normales un nivel notablemente elevado, siempre y cuando no se expongan a condiciones desnaturalizantes durante el aislamiento. Se pueden usar organelos aislados con este procedimiento en sistemas libres de clulas para estudiar una gran variedad de actividades que ocurren dentro de la clula viviente, incluyendo sntesis de protenas enlazadas a las membranas, transporte de solutos y desarrollo de gradientes inicos, y fosforilacin oxida tiva.

10/g/ml
10/ig/ml 10 ng/ml 3-5/g/ml

17-7 Aislamiento, purificacin y fraccionamiento de protenas

A todo lo largo de este libro hemos considerado las propiedades de una u otra protena. Para obtener informacin acerca de la estructura o funcin de una una protena particular es necesario aislarla y purificarla antes de anlisis adicionales. Puesto que la mayor parte de las clulas contienen miles de protenas diferentes, la purificacin de una sola especie, en particular si est presente en un componente relativamente menor, puede ser una meta desafiante. El propsito de esta seccin es analizar brevemente las tcnicas ms relevantes en estudios de protenas efectuados por bilogos celulares y moleculares. Para el propsito presente se pueden dividir los mtodos de purificacin de protenas en dos amplias categoras: preparatorios y analticos. Las tcnicas preparatorias se emplean para aislar y purificar una protena particular eliminando molculas contaminantes. El trmino preparatorio implica que despus de aislado el material ser usado para otros estudios. Los procedimientos analticos permiten estimar la diversidad de molculas presentes en una preparacin determinada y definir las propiedades de especies individuales de molculas. El trmino analtico implica desarmar el todo para examinar sus partes. Por ejemplo, si se desea determinar el nmero de diferentes tipos de macro-

* La concentracin depende de la pureza de la preparacin. f La actividad promotora de crecimiento se debe a impurezas. No estimulante a menos que se aada con un cido graso cisinsaturado. No estimulante a menos que se aada con BSA. FUENTE: D. Barnes y G. Sato, Anal. Biochem. 102:258, 1980.

por lo general se logra mediante la tcnica de centrifugacin diferencial, que depende del principio siguiente: si se colocan partculas materiales ms densas que el medio que las rodea en un campo de centrifugacin, las de diferente tamao y forma viajan hacia el fondo del tubo de la centrfuga a diferente velocidad. Primero las clulas se rompen mediante alguna tcnica, casi siempre agitacin mecnica en solucin isotnica amortiguada (con frecuencia contiene sacarosa) utilizando un homogeneizador mecnico. A continuacin se somete el ho'mogenado a una serie de centrifugaciones secuenciales ffig. 17-22, a). Al principio, el homogenado se somete a fuerzas centrfugas de baja intensidad durante un breve periodo, de modo que slo los organelos celulares de mayor tamao, los ncleos (y algunas clulas residuales completas) se sedimenten para formar un pellet. Con fuerza centrfuga

CAPITULO 17 Tcnicas en biologa celular y molecular

721

(a)

(b)

I-'IGUIA 17-2 1. Dos tipos de cultivo de clulas, a) Micrografa del luz que muestra una pequea porcin de una masa de cultivo de clulas L de ratn desarrollndose sobre la superficie de un plato de cultivo en un medio qumicamente definido, b) Micrografa con bajo poder de amplificacin de colonias dispersas sobre la superficie de un plato de cultivo. En este cultivo clonal, cada colonia contiene clulas descendientes de una clula original nica. Este cultivo se inici aadiendo slo unas 100 clulas al plato. (Cortesa de Charity Wnymouth.)

molculas presentes en ribosomas bacterianos y sus diferentes pesos moleculares, el primer paso sera preparatorio para obtener una muestra purificada de ribosomas a partir de la cual se puedan obtener los componentes solubles. Los pasos subsecuentes requieren separar los componentes de alguna manera para investigar su diversidad y peso molecular. En los procedimientos analticos es necesario fraccionar la mezcla en sus ingredientes elementales. En muchos casos, ambas metas se logran con el mismo tipo de tcnicas, puesto que el fraccionamiento de una mezcla simultneamente logra la purificacin de cada sustancia. La purificacin de una protena por lo general se lleva a cabo eliminando gradualmente los contaminantes. Dos protenas pueden compartir una propiedad similar, como carga elctrica total, aunque pueden ser muy diferentes respecto de otra propiedad, como peso molecular. Por consiguiente, la purificacin completa de una proteina determinada de ordinario requiere el uso de tcnicas sucesivas que aprovechan las propiedades diferentes de las protenas que deben aislarse. La purificacin se cuantifica como incremento de la actividad especfica, que es la relacin entre la cantidad de dicha protena y la cantidad total de la protena presente en la muestra. Se debe utilizar alguna caracterstica identificable de la protena especfica para disear un ensayo capaz de determinar la cantidad relativa de dicha protena en la muestra. Si la protena es una enzima, se puede ensayar su actividad cataltica para medir la purificacin. Alternativamente, los ensayos pueden basarse en criterios inmunolgi-

cos, electroforticos, de microscopa electrnica y otros. La cuanticacin de protena total en una muestra se puede efectuar de varias maneras, incluyendo nitrgeno total, que puede medirse con gran precisin y es muy constante casi a 16% del peso seco de toda protena. Precipitacin selectiva El primer paso en la purificacin debe poder efectuarse en preparaciones muy impuras y lograr un gran incremento de la actividad especfica. Este primer paso de ordinario aprgvecha diferencias de solubilidad entre protenas para precipitar selectivamente la protena deseada. La solubilidad de una protena depende del equilibrio relativo entre las interacciones protena-solvente que tienden a conservarla en solucin, y las interacciones protena-protena que tienden a causar la formacin de agregados y precipitacin. La fuerza inica de la solucin es particularmente importante para determinar cul de estos tipos de interaccin predomina. Con fuerza inica de poca intensidad las interacciones con el solvente se incrementan y las protenas tienden a permanecer en solucin; se dice que son protenas disueltas en sal. Sin embargo, cuando la intensidad inica se eleva, la solubilidad de la protena puede disminuir con rapidez. La sal empleada con mayor frecuencia para la precipitacin selectiva de protenas es el sulfato de amonio, altamente soluble en agua y de fuerza inica elevada. La purificacin se logra aadiendo gradualmente solucin sa-

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CAPITULO 17 Tcnicas en biologa celular y molecular

Quitar el tejido Rebanar con hoja filosa en pedazos pequeos Suspender en medio de homogeneizacin isotnico fro |p. ej., sacarosa 0.25M) Homogeneizar el fragmento de tejido Mortero triturador del homogeneizador Tubo de vidrio muy ajustado

turada de sulfato de amonio al extracto crudo de la proten. Conforme se adiciona la sal, las protenas contaminantes precipitan cada vez en mayor cantidad y el precipitado puede descartarse. Por ltimo, se alcanza un punto en el cual la protena bajo estudio sale de la solucin. Este punto se reconoce por la prdida de actividad en la fraccin soluble cuando se somete al ensayo particular utilizado. Una vez precipitada la protena buscada, las protenas contaminantes permanecen en la solucin y pueden descartarse, en tanto que la protena buscada puede redisolverse.

Cromatografa
Cromatografa es un trmino que se refiere a una gran variedad de tcnicas para fraccionar una mezcla de componentes disueltos conforme se desplazan a travs de algn tipo de matriz porosa. Una tcnica cromatogrfica ofrece a los componentes de la mezcla dos fases alternativas con las cuales pueden asociarse: una fase mvil que contiene el solvente que se desplaza y una fase inmvil que consta de la matriz a travs de la cual se desplaza el solvente. En los procedimientos cromatogrficos descritos ms adelante, la fase inmvil consta de materiales empacados en una columna. Las protenas que deben fraccionarse se disuelven en el solvente y luego pasan a travs de la columna. Los materiales que constituyen la fase inmvil contienen sitios a los cuales se pueden unir las protenas disueltas. Conforme las molculas individuales interactan con los materiales de la matriz, su avance a travs de la columna se retrasa. Por lo tanto, cuanto mayor sea la afinidad de una molcula particular por el material de la matriz, ms lento ser su paso a travs de la columna. Puesto que los diferentes componentes de la mezcla poseen distinta afinidad por la matriz, sern retardados diferencialmente. A medida que el solvente pasa por la columna y se desliza hacia el fondo se puede recolectar comofraccionesen una serie de tubos. Los componentes de la mezcla con menor afinidad por la columna aparecen en las primeras fracciones que emergen de dicha columna. En aos recientes mejor la resolucin de muchos procedimientos cromatogrficos con el desarrollo de la cromatografa lquida de alto rendimiento (CLAR), en la cual se emplean columnas largas y estrechas y la fase mvil pasa bajo presin elevada a travs de una matriz firmemente empacada. Cromatografa por intercambio de iones Las protenas son grandes electrlitos polivalentes y es improbable que muchas protenas en una preparacin parcialmente purificada tengan la misma carga total. En varias tcnicas se emplea la carga inica como base de purifica-

Hielo Homogenado (suspensin del material procedente de la clula rota) Componente subcelular aislado del homogenado mediante centrifugacin diferencial

B00g/10 min Homogenado- -

Sobrenadante posnuclear Pellet que contiene ncleos y clulas no rotas

12 0009/20 min Sobrenadante posnuclear Pellet que contiene partculas especficas (mitocondras, lisosomas, microcorpsculos)

50 000 g/2 hr

Sobrenadante posmitocondrial

Pellet que contienemicrosomas {fragmentos pequeos de membrana)

300 000 g/3 hr

Sobrenadante - posmicrosmico

Sobrenadante posribosomal

Pellet que contiene ribosomas libres

(a)
Material resuspendido dePelletsde 1 2 0 0 0 g Sacarosa 1 molal

FIGURA 1 7-22. Fraccionamiento celular, a) Procedimiento paso a paso para la purificacin de organelos mediante centrifugacin diferencial, b) Pasos subsecuentes de purificacin mediante centrifugacin con equilibrio en un gradiente de densidad. En este ltimo tipo de centrifugacin, el medio se compone de un gradiente de densidad y las partculas sedimentan hasta que alcanzan un sitio en el tubo igual a su propia densidad, sitio en donde forman bandas.

65 000 g/2 hr J\

MI MMM M M

Lisosomas |1.12gram/ml) Mitocondrias [1.18 gram/ml}

\a N"^

'

'

'Gradiente de densidad de sacarosa

3.4 molal (b)

\^/ ^ Microcorpsculos (1.23 gram/ml)

CAPITULO 17 Tcnicas en biologa celular y molecular

723

cin (o fraccionamiento analtico), incluyendo la cromatografa por intercambio de iones. La carga total de una protena es la suma de todas las cargas individuales de sus aminocidos componentes. Puesto que la carga de cada aminocido depende del pH del medio (fig. 2-27), la carga de cada protena tambin depende del pH. Conforme el pH desciende, los grupos con carga negativa se neutralizan y aumenta el nmero de grupos con carga positiva. Incrementando el pH se puede obtener un resultado opuesto. Existe un pH para cada protena donde el nmero de cargas negativas es igual al nmero de cargas positivas. Este pH es el punto isoelctrico, en el cual la protena es neutra. El punto isoelctrico de la mayor parte de las protenas es menor de pH 7. La cromatografa por intercambio inico depende de la asociacin inica entre protenas y grupos con carga enlazados a un material inerte de sostn, como la celulosa. Las dos resinas de intercambio inico empleadas con mayor frecuencia son dietilaminoetil (DEAE)-celulosa y carboximetil (CM)-celulosa. La DEAE-celulosa posee carga positiva y por lo tanto acta enlazndose a molculas con carga negativa; es un intercambiador amnico. La CM-celulosa posee carga negativa y acta como intercambiador catinico. La resina se encuentra empacada en una columna y la solucin de protenas se desliza a travs de la columna en un amortiguador cuya composicin favorece el enlace de algunas o todas las protenas a la resina. Las protenas enlazadas a la resina pueden desplazarse a continuacin incrementando la fuerza inica del amortiguador (que aade iones pequeos para competir con los grupos cargados de las macromolculas por los sitios sobre la resina), cambiando el pH, o ambas cosas. El desplazamiento de las protenas enlazadas se puede efectuar de manera gradual aadiendo en secuencia una serie de diferentes amortiguadores o de manera continua aadiendo una solucin de fuerza inica o pH (un gradiente) continuamente variable. La figura 17-23 muestra una representacin esquemtica de la separacin de dos especies de protenas mediante elusin gradual en una columna de intercambio inico. Cromatografa por filtracin en gel La filtracin en gel puede separar protenas (o cidos nucleicos) principalmente por su peso molecular. Igual que en la cromatografa por intercambio inico, el material de separacin consta de minsculas esferitas empacadas en una columna a travs de la cual pasan lentamente las protenas en solucin. Las esferitas empleadas en la filtracin en gel se componen de polisacridos con enlaces transversos (dextranos o agarosas) de porosidad diferente. La tcnica se ilustra mejor mediante un ejemplo (fig. 17-24). Consideremos que la protena que debe purificarse tiene un peso molecular de 125 000 daltons y se encuentra en solucin con dos protenas contaminantes de 250 000 daltons y 75 000 daltons. Una manera de purificar la protena buscada es pasar la mezcla a travs de una columna de Sephadex G150, que consta de esfrulas que slo permiten el paso a su interior de molculas menores de 200 kD. Cuando la solucin que contiene estas protenas pasa por el lecho de la columna, a protena de 250 kD no puede penetrar a las esfrulas y, por lo tanto, permanece disuelta en la fase m-

Mezcla de/ protenas I cargadas + y~

Cuantas de celulosa DEAE cargada +

!=> Nmero de la fraccin FIGURA 1 7-23. Cromatografa por intercambio inico. Separacin de dos especies de protena mediante DEAE-celulosa. En este caso se emplea una resina de intercambio inico con carga positiva para enlazar protenas cargadas ms negativamente.

Mezcla de tres protenas

Cuantas

porosas

Volumen (250000 de lecho daltons) Fraccin excluida

(125000 daltons)

(175000 daltons)

Volumen eluido

FIGURA 17-24. Cromatografa por filtracin en gel. Separacin de. tres protenas dependiendo de su peso molecular, segn se describe en el texto.

724

CAPITULO 17 Tcnicas en biologa celular y molecular

vil del solvente y ser eludida tan pronto como el solvente preexistente en la columna (volumen del lecho) se deslice. En contraste, las otras dos protenas pueden difundir hacia los intersticios entre las esfrulas y retardan su paso a travs de la columna. A medida que se desplaza ms y ms solvente a travs de la columna estas protenas continan su trayecto y salen por el fondo, pero a diferente velocidad. Para protenas capaces de penetrar a las esfrulas, las especies ms pequeas se retardan en mayor extensin comparadas con las ms grandes. Por consiguiente, la protena de 125 kD ser eludida en estado purificado, en tanto que la protena de 75 kD permanece en la columna. Cromatografa por afinidad En las tcnicas descritas hasta aqu se utilizan las propiedades de la masa de una protena para efectuar la purificacin o el fraccionamiento. Otra tcnica de purificacin, llamada cromatografa por afinidad, aprovecha las propiedades estructurales nicas de una protena que permiten eliminar la molcula especficamente de la solucin en tanto que las otras permanecen disueltas (fig. 17-25). Las protenas interactan con compuestos especficos: enzimas con sustratos, receptores con ligandos, anticuerpos con antgenos, y as sucesivamente. Cada uno de estos tipos de protenas se puede eliminar de la solucin pasando la mezcla de protenas por una columna donde la molcula interactuante especfica (sustrato, ligando, antgeno, etc.) se encuentra inmovilizada por unin a un material inerte (la matriz). Por ejemplo, si se pasa una preparacin impura de receptores de

insulina a travs de una columna con esfrulas de agarosa unidas a la protena insulina, el receptor se enlazar especficamente a las esfrulas en tanto las condiciones dentro de la columna sean adecuadas para promover esta interaccin. Una vez que todas las protenas contaminantes pasan a travs de la columna y salen por el extremo inferior, las molculas del receptor de insulina se pueden desplazar de la matriz cambiando la composicin inica del solvente dentro de la columna. Por lo tanto, a diferencia de los otros procedimientos cromatogrficos que separan protenas con base en el tamao o la carga elctrica, la cromatografa por afinidad puede eliminar de una muestra compleja de protenas una protena especfica, y con frecuencia la purificacin lograda de la molcula deseada es casi total en un solo paso. En La va experimental de los captulos 4 y 15 se ilustra el empleo de estos diferentes procedimientos cromatogrficos. Electroforesis en gel de poliacrilamida Otra tcnica especialmente poderosa y muy utilizada para fraccionar protenas es la electroforesis. Hay gran variedad de tcnicas para electroforesis, y todas dependen de la capacidad de molculas con carga para desplazarse cuando se colocan en un campo elctrico. La separacin de protenas por electroforesis de ordinario se logra mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (EGPA), en la cual las protenas se mueven por accin de una corriente elctrica aplicada a travs de un gel compuesto de una pequea molcula orgnica (acrilamida) unida mediante enlaces transversos para formar una criba molecular. El gel puede formarse como una delgada capa entre dos placas de vidrio o como un cilindro dentro de un tubo de cristal. Una vez polimerizado el gel, la placa (o tubo) se suspende entre dos compartimientos que contienen amortiguador dentro del cual se sumergen electrodos con carga opuesta. La muestra que contiene las protenas concentradas se extiende en una placa de gel en surcos situados a lo largo de la parte superior del gel, segn se muestra en la figura 17-26. La muestra de protenas se prepara en solucin de sacarosa o glicerol cuya densidad evita que la muestra se mezcle con el amortiguador en el compartimiento superior. Se aplica entonces un voltaje entre los compartimientos de amortiguador y la corriente fluye a travs de la placa causando que las protenas se desplacen hacia electrodos con carga opuesta. Tpicamente, la separacin se efecta utilizando amortiguadores alcalinos que confieren carga elctrica negativa a las protenas y las obligan a desplazarse hacia el nodo con carga positiva en el extremo opuesto del gel (fig. 17-26). El movimiento relativo de protenas a travs de un gel de poliacrilamida depende del tamao, forma y densidad de carga (carga por unidad de masa) de las molculas. Cuanto mayor la densidad de carga, la protena avanza con mayor fuerza a travs del gel y por lo tanto su velocidad de migracin es ms rpida. Sin embargo, puesto que la poliacrilamida forma una criba molecular con enlaces transversos, cuanto mayor sea la protena ms se enredar conforme avanza y por lo tanto menor ser su velocidad de

Protenas que deben purificarse (p. ej., receptor de insulina)

Ligando (p. ej., insulina)

(a)
Mezcla de

protenas
buscadas() contaminante (A)

00

OQOc

OoOc

oooc crcR

oo# o??od

KHLUtA 17-25. Cromatografa por afinidad, a) Representacin esquemtica de cuantas recubiertas de agarosa con las cuales slo se pueden combinar protenas especficas, b) Pasos en el procedimiento croma togrfico.

CAPITULO 17 Tcnicas en biologa celular y molecular

725

bandas individuales de protenas por su interaccin con anticuerpos especficos. EGPA-DSS De ordinario, EGPA se realiza en presencia del detergente dodecilsulfato sdico, que posee carga negativa y se enlaza en gran cantidad a todo tipo de molculas de protena. La repulsin electrosttica entre las molculas DSS enlazadas causa que las protenas se desdoblen en barras cilindricas semejantes, eliminando as la diferencia de forma como factor que impida la separacin. El nmero de molculas DSS enlazadas a la protena regularmente es proporcional al peso molecular de la misma. Por consiguiente, una especie de protena, cualquiera que sea su tamao, siempre tiene la misma densidad de carga y ser impulsada a travs del gel con la misma fuerza. Sin embargo, puesto que la poliacrilamida presenta abundantes enlaces transversales, retiene las protenas de mayor tamao en mayor extensin comparadas con las protenas ms pequeas. Como resultado, las protenas se separan segn una sola propiedad: su peso molecular. Adems de separar las protenas de una mezcla, la EGPA-DSS se puede emplear para determinar el peso molecular de diferentes protenas comparando la posicin de las bandas contra las producidas por protenas de tamao conocido. En las pginas 163 y 316 se muestran ejemplos de EGPA-DSS.
Tcnica del punto isoelctrico

Ctodo { - )

Armazn de plstico

nodo ; +

Amortiguador

FIGURA \. Electroforesis en gel de poliacrilamida. Las muestras de protena de ordinario se disuelven en una solucin de sacarosa cuya densidad evita que la muestra se mezcle con el amortiguador y luego se carga en cubetas con una fina pipeta, segn se muestra en la figura. Se aplica una corriente directa a travs del gel, que produce desplazamiento de las protenas dentro de la poliacrilamida a lo largo de lneas paralelas. Cuando se efecta en el detergente DSS, que por lo general este es el caso, las protenas se mueven como bandas a velocidades inversamente proporcionales a su peso molecular. Las bandas que aqu se muestran con propsitos de ilustracin de ordinario no seran visibles sino hasta despus de la electroforesis y luego de eliminar el gel del marco y teir en una bandeja.

movimiento. La capacidad de una protena de determinado tamao para desplazarse a travs del gel depende de la concentracin de la poliacrilamida empleada para constituir la criba. Cuanto menor sea la concentracin (hasta un mnimo cercano a 2%) de acrilamida, menor ser el nmero de enlaces cruzados y determinada molcula de protena se desplazar con mayor rapidez. La forma tambin es un factor, puesto que protenas globulares compactas se mueven con mayor rapidez en comparacin con protenas fibrosas, alargadas, de peso molecular comparable. El avance de la electroforesis se puede seguir si se observa el desplazamiento de la huella de un colorante con carga elctrica que se mueve justo adelante de las protenas ms rpidas. Luego de cierto tiempo se interrumpe la corriente y se elimina el gel del contenedor. El gel se puede teir para investigar la localizacin de las protenas. Si las protenas estn marcadas con istopo radiactivo se puede determinar su sitio presionando el gel contra un fragmento de pelcula radiogrfica para producir una autorradiografa. Alternativamente, se puede seccionar el gel en porciones y aislar las protenas individuales, o tambin presionar el gel contra un pedazo de papel filtro de nitrocelulosa y someter a tratamiento adicional de electroforesis para desplazar las protenas fuera del gel y absorberas sobre la superficie de la nitrocelulosa. Este ltimo procedimiento, llamado mancha Western, se puede emplear para identificar

La tcnica del punto isoelctrico es un tipo de electroforesis efectuada en un gel que contiene una mezcla de anfolitos, polmeros de bajo peso molecular con proporcin variable de grupos amino cargados positivamente y grupos carboxilo cargados negativamente. Cuando se aplica un voltaje a travs de este gel, las molculas de anfolitos se redistribuyen y las ms negativas se aproximan al nodo en tanto que las ms positivas se desplazan al ctodo. Este movimiento establece un gradiente estable de pH de un extremo al otro del gel. Conforme las protenas se mueven a travs del gel en respuesta al campo elctrico, se exponen a un pH que cambia continuamente, generando un cambio continuo en su carga inica. En algn punto a lo largo del gel cada protena encuentra un pH igual a su punto isoelctrico donde la protena se convierte en una molcula neutra y detiene su desplazamiento. Como resultado, cada especie de protena se localiza a lo largo del gel en una banda muy precisa, en posicin muy predecible.
Electroforesis bidimensional en gel

En 1975 se desarroll una nueva tcnica bidimensional para separar protenas basada en diferentes propiedades de las molculas. Primero se separan las protenas segn su punto isoelctrico dentro de un gel tubular. Despus de la separacin, se elimina el gel y se coloca sobre una placa de poliacrilamida saturada de dodecilsulfato de sodio y se somete a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio. Las protenas se mueven en el gel de la placa y se separan segn su peso molecular (fig. 17-27), La resolucin de esta tcnica es tan grande que prcticamente se puedendistinguir todas las protenas presentes en cantidades de-

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CAPITULO 17 Tcnicas en biologa celular y molecular

PH

Pelcula fotogrfica

7.45 I

7.3 7.2 7.1 7.0 i i i I

6.8 6.55 6.3 6.1 6.0 5.9 l I. I I 1 i

V
90 -80 70 -60 r-50
40 -2
-30

Fuente de los rayos X incidentes

Cristal Rayos X difractados

te)

-20

L15

FIGURA 17-27. Electrooresis bidimensional engel. Gelbidimensional de poliacrlamida de protenas cromosmicas no de histona de clulas HeLa marcadas con 35S-metionina. (Segn ].L. Peterson y E.H. McConkey, J. Biol. Chem. 251:550, 1976.)

tectables dentro de una clula. Mediante este procedimiento se pueden aislar ms de 1 000 protenas diferentes.

17-8 Determinacin de la estructura de una protena mediante anlisis de difraccin de rayos X

El primer paso para analizar una protena particular por cualquier tcnica es obtener una preparacin de la misma en la forma ms pura posible. En la difraccin de rayos X (o cristalografa de rayos X) se emplean cristales de protenas, preparacin que garantiza la mejor pureza molecular. Un cristal consta de una disposicin regularmente repetida de una unidad celular, en este caso una molcula individual de protena. Para el anlisis de difraccin de rayos X se bombardea un cristal con un delgado haz de rayos X de una sola longitud de onda (monocromtico) (fig. 17-28, a,b). La radiacin dispersada (difraccin) por los electrones de los tomos de la protena incide sobre una placa fotogrfica colocada detrs del cristal. Igual que la molcula de protena se repite de manera peridica dentro del cristal, as tambin cada tomo dentro de la molcula. El patrn de difraccin producido por un cristal es determinado por la estructura interna de la protena; el gran nmero de molculas dentro del cristal incrementa el nmero de reflexiones y el cristal se comporta como una molcula gigante. La posicin e intensidad de los puntos sobre la placa se puede relacionar matemticamente con la densidad de electrones dentro de las protenas, puesto que los electrones de

FIGURA 17-28. Anlisis por difraccin de rayos X. a) Diagrama de la difraccin de rayos X por los tomos de un plano de un cristal sobre una placa fotogrfica. La disposicin ordenada de los tomos dentro del cristal produce una serie repetitiva de ondas circulares superpuestas que se propagan e intersectan la placa de pelcula. Igual que con ia difraccin de luz visible, las ondas forman un patrn de interferencia reforzndose entre s en algunos puntos sobre la pelcula y cancelndose en otros puntos, b) Cristales de mioglobina como los utilizados para el anlisis por difraccin de rayos X. (b: Cortesa de ahu Kendrew.)

los tomos producen dichos puntos. Debido a la manera de bombardear el cristal, cada placa representa una rebanada de la molcula y se deben analizar muchas placas antes de obtener el patrn total de difraccin. En la figura 2-34 se muestra una sola placa fotogrfica empleada para determinar la estructura tridimensional de la mioglobina. Los puntos ms prximos al centro del patrn se deben a la dispersin de los rayos X con ngulos de menor abertura a partir del cristal y suministran informacin acerca de los aspectos ms burdos de la protena, o sea, los espacios ms grandes dentro de la molcula. Los puntos ms prximos a la periferia de la fotografa contienen informacin de los lados de las molculas ms prximos en el espacio dentro del cristal, La resolucin obtenida mediante difraccin de rayos X depende del nmero de puntos analizados. La mioglobina fue la primera protena cuya estructura se determin mediante difraccin de rayos X. Esta protena se analiz sucesivamente a 6, 2 y 1.4 A, y transcurrieron varios aos antes de concluir cada determinacin. Conside-

CAPITULO 17 Tcnicas en biologa celular y molecular

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rando que las uniones covalentes se encuentran entre 1 y 1.5 A de longitud y las uniones no covalentes entre 2.8 y 4 de longitud, la descripcin obtenida de la protena depende en gran medida de la resolucin. Esto se ilustra comparando la densidad de electrones de una pequea molcula orgnica en cuatro niveles de resolucin (fig. 17-29). En la mioglobina es suficiente una resolucin de 6 A para demostrar el plegamiento y localizacin de la cadena de polipptidos de la fraccin hem, pero no basta para mostrar la estructura dentro de la cadena. Con una resolucin de 2 A se pueden separar los grupos de tomos, en tanto que a 1.4 A se pueden ver tomos individuales, El anlisis por difraccin de rayos X tambin se usa en el estudio del DNA y fue una de las fuentes ms importantes de datos que condujeron a Watson y Crick a proponer en 1953 la estructura de la doble hlice. El anlisis del DNA se realiza utilizando fibras que contienen molculas orientadas de DNA en vez de cristales y no suministra un nivel de resolucin tan alto como el obtenido con protenas.

17-9 Purificacin y fraccionamiento de cidos nucleicos

Los pasos para purificar cidos nucleicos son muy diferentes a los empleados en la purificacin de protenas, lo que refleja las diferencias bsicas en la estructura de estos dos tipos de macromolculas, El primer paso en la purificacin del DNA por lo general consiste en homogeneizar las clulas y aislar los ncleos de los cuales se extrae el DNA. El medio de extraccin de ordinario contiene un detergente, como el DSS, que sirve para lisar los ncleos y liberar el DNA, hecho que incrementa notablemente la viscosidad de la solucin. El detergente tambin inhibe cualquier actividad nucleasa presente en la preparacin. El principal objetivo de los subsecuentes pasos de purificacin es separar el DNA de materiales contaminantes, como RNA y protenas. La desproteinizacin en general se logra agitando la mezcla con un volumen de fenol. El fenol

(o alternativamente cloroformo) es un desnaturalizador activo de protenas que suprime la solubilidad de las protenas en la preparacin y las precipita. Puesto que el fenol y las soluciones salinas amortiguadas no se mezclan, slo se requiere centrifugar la suspensin para separar las fases, permaneciendo el DNA (y el RNA) en la solucin dentro de la fase acuosa de arriba y la protena presente como un precipitado floculento concentrado en la interfase. La fase acuosa se retira del tubo y se somete a ciclos repetidos de agitacin con fenol y centrifugacin hasta agotar toda la protena de la solucin. A continuacin los cidos nucleicos se precipitan de la solucin aadiendo etanol fro. El etanol fro casi siempre forma una capa arriba de la solucin acuosa de DNA, el cual se enrolla sobre una varilla de vidrio conforme sale de la solucin en la interfase entre el etanol y la solucin salina. En contraste, el RNA sale de la solucin como precipitado floculento que se asienta en el fondo del vaso. Luego de este primer paso de purificacin, se redisuelve el DNA y se trata con ribonucleasa para eliminar el RNA contaminante. A continuacin se destruye la ribonucleasa mediante tratamiento con una proteasa. En seguida se quita la proteasa por desproteinizacin con fenol y se vuelve a precipitar el DNA con etanol. Generalmente el RNA se purifica de manera similar utilizando DNasa en los pasos finales de la purificacin en vez de ribonucleasa. Separacin de los DNA mediante electroforesis en gel De las diferentes tcnicas empleadas para fraccionar protenas, estudiadas anteriormente, la electroforesis en gel se utiliza ms ampliamente en la separacin de cidos nucleicos de diferente peso molecular (longitud de nucletidos). Las molculas RNA o DNA pequeas, de unos pocos cientos de nucletidos o menos, por lo general se separan mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. Las molculas de mayor tamao tienen problemas para desplazarse a travs de la cerrada trama de la poliacrilamida y en general

(a)

6.0 A de resolucin

(b) . 2.0 A de resolucin

(c)

1.5 A de resolucin

(d)

1.1 A de resolucin

I-'ICUIA 17-2<>. pistritJUftn de la densidad electrnica de una molcula orgnica pequea (dicetopiperazina) calculada a diferentes niveles de resolucin. Con la resolucin ms baja (a) slo se puede distinguir el anillo natural de la molcula, en tanto que a mayor resolucin (d) se observa la densidad electrnica que rodea cada tomo (indicada por las lneas circulares). (Segn D. Hodgkin, reimpreso con permiso tic Narure 88:445, 1960; copyright 1960, Macmillan Magazines Ltd.)

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CAPITULO 17 Tcnicas en biologa celular y molecular

se fraccionan en gel de agarosa, que tiene mayor porosidad. La agarosa es un polisacrido extrado de algas marinas; se disuelve en solucin amortiguadora caliente, se vierte en un molde y luego se forma el gel descendiendo simplemente la temperatura. El gel con agarosa en baja concentracin (0.3%) se emplea para separar fragmentos de DNA de mayor tamao. La separacin de cidos nucleicos mediante electroforesis en gel se basa en principios similares a los que operan durante el fraccionamiento de protenas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio. A diferencia de las protenas, todas las molculas de cido nucleico, cualquiera que sea su longitud, tienen una densidad de carga similar (nmero de cargas negativas por unidad de masa) y, por lo tanto, todas tienen un potencial equivalente para desplazarse en un campo elctrico. El gel de poliacrilamida o de agarosa suministra la resistencia necesaria para el desplazamiento, de modo que cuanto mayor sea el peso molecular de una molcula de RNA o DNA, ms lentamente se desplaza a travs del gel. La sensibilidad de la electroforesis en gel es tan grande que con esta tcnica se pueden separar molculas de DNA o de RNA que slo difieren por un nucletido, caracterstica que le confiere un gran valor como mtodo para secuenciar DNA (pgina 742). En la figura 17-30, a, se ilustra un ejemplo de electroforesis en gel para identificar fragmentos de RNA que contienen un gen particular, como el gen que codifica la insulina humana. En este ejemplo, los fragmentos de DNA buscados se identifican por su capacidad para enlazarse a un fragmento de DNA, explorador marcado que contiene la secuencia de la insulina. Alternativamente, se pueden localizar todos los fragmentos de DNA presentes sumergiendo el gel en una solucin de bromuro de etidio, que se intercala en la doble hlice y provoca fluorescencia en las bandas de DNA cuando se observan con luz ultravioleta (fig. 17-30, b).

be luz ultravioleta), denominada cubeta, la cual se coloca en el trayecto del haz de luz del espectrofotmetro. La cantidad de luz que pasa a travs de la solucin sin absorberse, o sea la luz transmitida, se mide mediante fotoceldas situadas en el lado opuesto de la cubeta. De los 20 aminocidos incorporados a protenas, dos de ellos, tirosina y fenilalanina, absorben luz en el intervalo ultravioleta, y ambos presentan una absorbancia mxima cercana a los 280 nm. Por lo tanto, si las protenas estudiadas presentan un porcentaje tpico de estos aminocidos, a absorbancia de la solucin a esa longitud de onda suministra una medida sensible de la concentracin de protenas. Alternativamente, se pueden emplear varios anlisis qumicos, como la tcnica de Lowry o de Biuret, en la cual la protena en solucin participa en una reaccin que produce una sustancia de color cuya concentracin es proporcional a la concentracin de la protena. Los cidos nucleicos presentan absorcin mxima a 260 nm (fig. 10-15), y por lo tanto es la longitud de onda de referencia para medir las concentraciones de DNA o RNA.

17-11 U Itracentrifligacin
La experiencia comn indica que la estabilidad de una solucin (o suspensin) depende de la naturaleza de los componentes. La crema flota encima de la leche cruda, un precipitado fino se asienta gradualmente en el fondo del recipiente y una solucin de cloruro de sodio permanece estable indefinidamente. Gran nmero de factores determinan si un componente dado sedimentar a partir de un medio lquido, entre los que se incluyen tamao, forma y densidad de la sustancia, y densidad y viscosidad del medio. Para que una sustancia sedimente hacia el fondo de un tubo debe tener mayor densidad que el medio que la rodea. Incluso si la sustancia satisface el requisito de densidad, el proceso de sedimentacin, que tiende a concentrar la molcula, ser contrarrestado por su tendencia a redistribuirse uniformemente como resultado de la difusin. Si otros factores permanecen constantes, la sedimentacin de una poblacin particular de molculas depender de su tasa de difusin comparada con la fuerza centrfuga opositora que se aplica. Las protenas de mayor tamao (o cidos nucleicos) difunden as lentamente que las especies de menor tamao. Con el desarrollo de las ultracentrfugas, en la actualidad es posible generar fuerzas centrfugas (hasta 500 000 veces mayores que la fuerza de gravedad) lo bastante intensas para provocar la sedimentacin de macromolculas. La velocidad de una partcula determinada durante centrifugacin en un medio lquido es directamente proporcional al cuadrado de la velocidad angular (o) y la distancia de la partcula al centro del rotor (r): v - s (a>2r) En esta ecuacin, a)2r se denomina aceleracin radial y est dada en centmetros por segundo al cuadrado. El trmino s, en segundos, es el coeficiente de sedimentacin, equivalente a la velocidad promedio por unidad de aceleracin. La aceleracin centrfuga en general se expresa con relacin a la

17-10 Cuantificacin de las concentraciones de protenas y cidos nucleicos mediante espectro fotometra
Uno de los mtodos ms simples y utilizado con mayor extensin para determinar la cantidad de protena o de cido nucleico presente en una solucin determinada es medir la cantidad de luz de una longitud de onda especfica absorbida por la solucin. El instrumento empleado para esta medicin es un espectrof ot metro. En el captulo 6 se mencion que para absorber luz de una longitud de onda particular, una molcula debe absorber un quantum entero de luz, o sea, la energa que impulsa un electrn desde un orbital ms bajo a uno ms elevado. La energa de la luz debe equilibrar exactamente la diferencia de energa del electrn entre las dos posiciones. S se conocen las caractersticas de absorbancia de un tipo particular de molculas, entonces la cantidad de luz de longitud de onda apropiada absorbida por una solucin de dicha molcula suministra una medida sensible de su concentracin. Para efectuar este tipo de medicin, se coloca la solucin en un recipiente especial de cuarzo de caras aplanadas (se emplea cuarzo porque, a diferencia del vidrio, no absor-

CAPITULO 17

729

Clula

Enzima de restriccin
v-niil naiaznal Aaff

Gen de la insulina Fragmentos de DNA

FIGURA 17-3O. Separacin de los fragmentos de DNA obtenidos por restriccin mediante electroforesis en gel. a) Identificacin de los fragmentos obtenidos por restriccin que contienen la secuencia de nucletidos del gen insulina. Una vez separados los fragmentos de DNA por electroforesis a travs de gel de agarosa, el de DNA se extiende formando una mancha sobre una placa de papel filtro de nitrocelulosa (no mostrado en el dibujo) y luego se incuba con la sonda de DNA de insulina marcada. Luego de un periodo de incubacin se lava el exceso de sonda marcada y se determina la localizacin de la radiactividad enlazada mediante autorradiografa. b) Todos los fragmentos de DNA presentes en un gel se pueden revelar sumergiendo el gel en una solucin de bromuro de elidi y luego observando el gel bajo luz ultravioleta, (b: Fotografa por Phillipe Plailly/Sence Photo Library/Photo Rcseardicrs.)

Hendidura para mezclar los fragmentos de restriccin

Direccin del movimiento de los fragmentos de DNA durante la electroforesis

Electroforesis en gel Solucin amortiguadora

"i
Electrodo negativo

Fragmentos de DNA separados por tamao luego de electroforesis

Placa de gel de agarosa

\e Fuente de poder Electrodo positivo elctrico El gel se retira del aparato de electroforess luego que los fragmentos de DNA se separan por tamao (los fragmentos ms cortos se desplazan con mayor rapidez)

I! II

Fragmentos de DNA separados por tamao

Incubacin con sonda de DNA de insulina radiactiva Bandas correspondientes al gen de insulina reveladas en una placa de rayos X

(a)
(b)

aceleracin gravitacional de la Tierra, que tiene un valor de 980 cm/s2. Por ejemplo, una aceleracin radial de 4.9 x 107 cm/s 2 equivale a 500 000 veces la fuerza gravitacional, o sea, 50 000 g. En todo este libro nos hemos referido a diferentes macromolculas y sus complejos mediante un valor particular S. La unidad S (o Svedberg, inventor de la ultracentrfuga) equivale a un coeficiente de sedimentacin de 10~13 s. Puesto que la velocidad de movimiento de una partcula a travs de una columna lquida depende de varios factores, incluyendo su forma, el coeficiente de sedimentacin por s mismo no suministra el peso molecular. Sin embargo, en tanto se refiera al mismo tipo de molcula, el valor S suministra una buena estimacin del tamao relativo. Por ejem-

plo, los tres RNA ribosmcos de . coli, las molculas 55, 16S y 23S, poseen nucletidos con longitud de 120,1 600 y 3 200 bases, respectivamente. Hay dos tipos de ultracentrfugas, modelos analticos y modelos preparativos. Las centrfugas del tipo preparativo estn diseadas simplemente para generar grandes fuerzas centrfugas durante un periodo establecido. La centrifugacin procede en un ambiente casi al vaco para reducir al mnimo la resistencia friccional. En ciertos casos, los rotores (cabezas de la centrfuga) se construyen para permitir que los tubos oscilen externamente para que las partculas se muevan en direccin paralela a las paredes del tubo. Se dice que este tipo de rotor contiene cubetas oscilantes (fig. 17-31). En el otro tipo de rotor, la variedad de ngulo fijo, los tubos

730

CAPITULO 17 Tcnicas en biologa celular y molecular

FIOl'IA 1 7-3 1 . Variedad de rotores utilizados en una ultracenrrfuga para preparacin. Cada rotor tiene una hendidura en la parte inferior de la porcin cilindrica central que se adapta firmemente sobre la parte superior de un eje situado debajo de la cmara de la centrfuga. Luego de colocar el rotor sobre el eje, se cierra la tapa y se evaca el aire de la cmara antes de que el motor de la centrfuga se ponga en marcha. Se puede observar que los rotores situados hacia atrs contienen cubetas oscilantes. Conforme el rotor incrementa su velocidad, la cubeta oscila hacia afuera segn se indica en la siguiente figura. Los tubos en los otros rotores se adaptan en rendijas que conservan un ngulo fijo. (Cortesa de Bcckman Instruments, Inc.)

se mantienen en un ngulo oblicuo especfico. En la ultracentrifugacin preparativa todas las determinaciones se llevan a cabo luego de retirar el tubo de la centrfuga. El trmino preparativo se refiere al uso de este tipo de centrfuga para purificar componentes que despus sern sometidos a estudios adicionales. La ultracentrfuga analtica contiene dispositivos e instrumentos que permiten seguir el avance de las sustancias en los tubos (denominados celdas) durante la centrifugacin. Se puede estimar varias veces la velocidad de sedimentacin durante el proceso de centrifugacin y determinar valores de peso molecular, pureza, etctera. Conducta de los cidos nucleicos durante la sedimentacin Mediante tcnicas de ultracentrifugacin se han analizado ampliamente molculas de DNA (y RNA). Para el propsito presente consideraremos dos de las tcnicas de centrifugacin ms comnmente empleadas en el estudio de cidos nucleicos, ilustradas en la figura 17-32. Con la tcnica de velocidad de sedimentacin, las molculas de cido nucleico se separan segn la longitud de sus nucletidos. La muestra que contiene la mezcla de molculas de cidos nucleicos se extiende cuidadosamente formando una capa sobre una solucin que contiene sacarosa en concentracin creciente (u otra sustancia adecuada), Este gradiente preformado incrementa su densidad (y viscosidad) de arriba hacia abajo. Cuando se somete a fuerzas centrfugas intensas, las molculas se desplazan a travs del gradiente con una velocidad determinada por su coeficiente de sedimentacin. Cuan-

to mayor sea el coeficiente de sedimentacin ms lejos se desplazar la molcula en determinado periodo de centrifugacin. Puesto que la densidad del medio es menor que la de las molculas de cido nucleico, incluso en el fondo del tubo (aproximadamente 1.2 g/ml para la solucin de sacarosa y 1.7 g/ml para los cidos nucleicos), estas molculas siguen sedimentando en tanto se siga centrifugando el tubo. En otras palabras, la centrifugacin nunca alcanza el equilibrio. Luego del periodo descrito, se retira el tubo de la centrfuga, se fracciona su contenido (como se muestra en la figura 17-32, c) y se determina la posicin relativa de las diferentes molculas. La presencia de la sacarosa viscosa evita que las molculas contenidas en el tubo se mezclen por conveccin o durante el manejo, lo que permite que molculas de valor S idntico permanezcan en su sitio formando una banda. En presencia de molculas marcadoras con coeficiente de sedimentacin conocido, se puede calcular el valor S desconocido de los otros componentes. En el otro tipo de centrifugacin analtica, sedimentacin de equilibrio (o isojrcnica) (fig. 17-32, b), las molculas de cido nucleico se separan segn su densidad de flotacin. En este procedimiento por lo general se emplea una solucin salina altamente concentrada del metal pesado cesio. El anlisis se inicia mezclando el DNA con una solucin de cloruro o sulfato de cesio en el tubo de la centrfuga y luego sometiendo el tubo a centrifugacin prolongada (p. ej., dos a tres das con fuerza intensa). Durante la centrifugacin, los iones pesados de cesio se desplazan muy lentamente hacia el fondo del tubo estableciendo un gradiente continuo de densidad a travs de la columna lquida. Despus de un tiempo, la tendencia de los iones a concentrarse en el fondo del tubo ser contrarrestada por la tendencia opuesta de los mismos a redistribuirse por difusin y el gradiente se estabiliza. Conforme se va formando el gradiente de cesio, las molculas individuales de DNA se dirigen hacia abajo o flotan hacia arriba en el tubo hasta alcanzar una posicin donde la densidad de flotacin equivale a su propia densidad, y en ese punto ya no estn sometidas a movimiento adicional alguno. Molculas de densidad equivalente forman bandas estrechas dentro del tubo. Esta tcnica es lo bastante sensible para separar molculas de DNA con diferente composicin de bases (como se ilustra en la figura 17-32, b) o aquellas que contienen diferentes istopos de nitrgeno ( I 5 N en comparacin con 14N, como se muestra en la figura 13-3).

Hibridacin de cidos nucleicos

Hibridacin de cido nucleico es un trmino para describir varias tcnicas relacionadas basadas en la observacin de que dos molculas de cido nucleico de cadena simple con secuencias complementarias de bases forman un hbrido de doble cadena. Consideremos una situacin donde se tiene una mezcla de cientos de fragmentos de DNA de longitud idntica y composicin total de bases que slo difiere en su secuencia de bases. Se puede asumir, por ejemplo, que uno de los fragmentos de DNA constituye una parte del gen de globina /5 y los otros fragmentos contienen genes no relacionados. La nica manera de distinguir entre el fragmento

CAPTULO 17 Tcnicas en biologa celular y molecular

731

que contiene la informacin para el polipptido de globina fi y todos los otros es efectuar un experimento de hibridacin molecular utilizando molculas complementarias como fragmentos exploradores. En el presente ejemplo, incubando la mezcla de fragmentos de DNA desnaturalizados con un exceso de RNAm de globina /?, los fragmentos de globina formaran hbridos DNA-RNA de doble cadena, aislando los otros fragmentos de DNA de cadena simple. Hay varias maneras de separar los hbridos de los fragmentos de cadena simple. Por ejemplo, se puede pasar la mezcla a travs de una columna de hidroxiapatita en condiciones inicas que obliguen a los hbridos a enlazarse a las sales de fosfato de calcio en la columna, en tanto que las molculas de DNA no hibridadas pueden pasar a travs de la misma sin enlazarse. A continuacin, los hbridos pueden liberarse de la columna cambiando la concentracin del amortiguador eluyente. En los experimentos de hibridacin de cidos nucleicos es necesario incubar dos poblaciones de cidos nucleicos de cadenas simples complementarias en condiciones (fuerza inica, temperatura, etc.) que promuevan la formacin de molculas de doble cadena. Segn el tipo de experimento, las dos poblaciones de molculas reactantes pueden estar en solucin o una de las poblaciones estar inmovilizada, por ejemplo, adsorbida a un filtro o localizada en un cromosoma. En experimentos de hibridacin con frecuencia una de las poblaciones de cidos nucleicos de cadena simple est inmovilizada dentro de un gel para electroforesis. Por ejemplo, la huella digital de DNA mostrada en la figura 10-23 se obtuvo fraccionando una mezcla de fragmentos restrictivos mediante electroforesis, desnaturalizando el DNA, transfiriendo las fragmentos de cadena nica a un pedazo de papel filtro de nitrocelulosa {formando una mancha) y luego incubando el filtro con un fragmento explorador de DNA de cadena simple marcado con radiactividad capaz de hibridar un grupo de fragmentos complementarios. A continuacin, se lav la radiactividad no enlazada y se determin la localizacin del fragmento explorador unido mediante autorradiografa. Este procedimiento para identificar fragmentos de DNA especficos, fraccionados median-

te electroforesis en gel por medio de fragmentos de DNA marcados (sondas) se denomina mancha Southern (por Edward Southern, quien lo desarroll). En una mancha Southern se pueden identificar uno solo o unos cuantos
Solucin de sacarosa

Muestra

Sacarosa a 5%

Sacarosa a 20% Molculas de DNA de tamao pequeo1 Molculas de DNA de tamao mediano"

(a)

Molculas de DNA de tamao grande

CsCl. Molculas de DNA ricas en AT Molculas de DNA ricas en GC

(b)

FKl'KA I7-.H2. Tcnicas de sedimentacin de cido nucleico, a) Separacin de molculas de DNA de tamao diferente por la velocidad de sedimentacin. Se forma un gradiente de densidad de sacarosa dentro del tubo (paso 1) permitiendo que una solucin de sacarosa de concentracin gradualmente mayor escurra a lo largo de la pared del tubo. Una vez formado el gradiente, la muestra se extiende con cuidado formando una capa arriba del gradiente (pasos 2 y 3) y se somete el tubo a centrifugacin (p. e)., 50 000 rpm durante cinco horas), segn se ilustra en el paso 4. Las molculas de DNA se separan segn su tamao (paso 5). b) Separacin de molculas de DNA mediante sedimentacin en equilibrio conforme la diferencia de densidad de flotacin. La muestra de DNA se mezcla con una solucin CsCl (paso 1) y se somete a centrifugacin prolongada (p. ej., 50 000 rpm durante 72 horas) (paso 2). Durante la centrifugacin se forma el gradiente CsCl y entonces las molculas de DNA forman bandas en regiones de densidad equivalente (paso 3). c) Se punciona el tubo utilizado en el experimento b y se permite derramar el contenido en tubos sucesivos, fraccionando por lo tanto el contenido del tubo. Se mide ]a absorbancia de la solucin en cada fraccin y se elabora una grfica como la mostrada.

1.65gram/ml CsCl Molculas de DNA ricas en AT Molculas de DNA ricas en GC 1.75gram/mlCsCI

E
c
CM

o u> nj

q O

Abajo
(O

fe i s s 10 11 12 u Nmero de fraccin Arriba

<3

732

CAPITULO 17 Tcnicas en biologa celular y molecular

fragmentos de restriccin que contienen una secuencia particular de nucletidos, aun si hay miles de fragmentos no relacionados en el gel. Las molculas de RNA separadas por electroforesis tambin se pueden identificar con una sonda de DNA marcada luego de practicar una mancha sobre un filtro de nitrocelulosa. En la figura 11-37 se muestra un ejemplo de este procedimiento, llamado mancha Northern. La hibridacin de cido nucleico tambin se puede emplear para estimar la similitud de la secuencia de nucletidos entre dos muestras de DNA obtenidas, por ejemplo, de dos organismos diferentes. Cuanto ms distantes se encuentren evolutivamente las dos especies, mayor ser la divergencia de sus secuencias de DNA. S se mezcla el DNA purificado de las especies A y B, se desnaturaliza y se permite su reconstitucin, un porcentaje de los dplex de DNA ser formado por cadenas de DNA procedentes de ambas especies. Puesto que contienen pares impropios de bases, estos dplex son menos estables que los formados por cadenas de DNA de la misma especie, y esta inestabilidad se refleja por la menor temperatura a la cual se funden. Cuando se permite la reconstitucin de DNA de diferentes especies en diferentes combinaciones, la temperatura de fusin (Ty, pgina 403) de los dplex hbridos suministra una medida de la distancia evolutiva entre los dos organismos.

17-12 Tecnologa del DNA recombinante

Durante los ltimos dos decenios se lograron enormes avances en el anlisis de genomas eucariotas. Estos adelantos se lograron cuando los bilogos moleculares aprendieron a construir molculas de DNA recombinante, que son molculas que contienen secuencias derivadas de ms de una fuente. El DNA recombinante se puede usar de mil maneras; comenzaremos considerando una de sus aplicaciones ms importantes: aislar un segmento de DNA particular que codifica un poUpptido especfico. Supongamos que nos interesa aislar el gen que codifica la insulina humana de modo que pueda sintetizarse in viiro esta importante protena. El genoma humano contiene unos 3 000 millones de pares de bases, en tanto que el gen de la insulina slo constituye unos cuantos cientos de estos nucletidos. Uno de los primeros pasos para aislar el gen de la insulina es fragmentar las grandes molculas de DNA extradas de clulas humanas en una poblacin definida de fragmentos ms pequeos mediante incubacin con enzimas restrictivas. Como se analiz en la pgina 418, las enzimas restrictivas reconocen secuencias especficas (sitios de restriccin) de cuatro a ocho nucletidos y efectan cortes en sitios especficos sobre ambas cadenas del dplex. Puesto que en toda la longitud de las cadenas las secuencias particulares de nucletidos ocurren con demasiada frecuencia simplemente por azar, aparecen en todos los tipos de DNA (viral, bacteriano, vegetal y animal) y por lo tanto son susceptibles de ser fragmentadas por estas enzimas. El DNA recombinante se puede formar de diferentes maneras. En el mtodo mostrado en la figura 17-33, las

molculas de DNA de dos fuentes diferentes se tratan con una enzima de restriccin que ejecuta cortes escalonados en el dplex de DNA. Estos cortes dejan en las cadenas simples apndices cortos que actan como "extremos pegajosos" que se pueden enlazar a otros apndices complementarios de una cadena nica de otra molcula de DNA para restablecer una molcula de doble cadena.2 En el caso mostrado en la figura 17-33, una de las preparaciones de fragmentos de DNA se obtiene aadiendo una enzima restrictiva a una preparacin de plsmidos bacterianos purificados, que son molculas de DNA pequeas, circulares, de doble cadena que fueron separadas del cromosoma bacteriano principal. La otra preparacin de fragmentos de DNA mostrada en la figura 17-33 se obtuvo mediante tratamiento de DNA extrado de clulas humanas con la misma enzima restrictiva. Podemos asumir que uno de los fragmentos contiene el gen de la insulina que se intenta purificar. Este fragmento particular slo representa una minscula porcin del nmero total de fragmentos formados. La meta es aislar el fragmento buscado de esta gran poblacin heterognea. El primer paso hacia dicho objetivo es incubar las preparaciones de DNA de plsmido y humano en presencia de un DNA ligasa para formar recombinantes circulares que contienen los dos tipos de fragmentos de hidrgeno unidos entre s mediante un par de bases. Las primeras molculas de DNA recombinante fueron formadas con este mtodo en 1973 por Paul Berg, Herbert Boyer, Annie Chang y Stanley Cohn, de la Universidad Stanford y de la Universidad de California, en San Francisco, dando origen a la moderna ingeniera gentica. Siguiendo este procedimiento que acabamos de describir se puede ahora producir un gran nmero de diferentes molculas recombinantes, cada una de las cuales contiene un plsmido bacteriano con un segmento de DNA humano incorporado en su estructura circular. Puesto que el objetivo es obtener preparaciones purificadas de un tipo de DNA recombinante que contenga el fragmento que codifica insulina, se debe separar este fragmento nico de todos los dems. Esto se logra mediante un proceso denominado clonacin del DNA. Retornaremos a la bsqueda del gen de la insulina luego de describir la metodologa bsica de la clonacin del DNA.

Clonacin del DNA

La clonacin del DNA es una tcnica fundamental para producir grandes cantidades de un segmento de DNA especfico. El segmento de DNA que debe clonarse primero se une a un DNA vector, que es un vehculo para transportar DNA extrao a una clula husped adecuada, como la bacteria E. coli. El vector contiene secuencias que le permiten duplicarse dentro de la clula husped. Comnmente se

2 El DNA recombinante tambin se puede formar a partir de fragmentos de DNA generados por enzimas restrictivas que producen extremos romos. Los extremos del plsmido y del fragmento de restriccin se modifican subsecuentemente para permitirles "pegarse" entre s.

CAPITULO 17 Tcnicas en biologa celular y molecular Cromosoma humano

733

Plsmido X' bacteriano

La misma enzima de restriccin desdobla ambos tipos de DNA

Gen de insulina

KTrr^
' i . '

>'
K
El gen de insulina se une con el plsmido mediante extremos pegajosos; las muescas son selladas por la enzima

FIGL'KA 17-33. Formacin de una molcula de DNA recombinante. En este ejemplo se trata de DNA de un plsmido y de DNA humano, ambos conteniendo el gen de la insuiina, con la misma enzima de restriccin, de modo que el DNA de ambas fuentes forme "extremos aglutinantes" complementarios. Como resultado, las dos molculas de DNA se unen mediante enlaces no covalentes y luego son selladas por enlaces covalentes por la ligasa de DNA, formando una molcula de DNA recombinante.

Gen de insulina

usan dos tipos de vectores para clonar DNA dentro de bacterias husped. En una tcnica, el segmento de DNA que ser clonado se introduce a un plsmido, segn se describi anteriormente, y luego se junta a una clula bacteriana cuando dicha clula bacteriana capta el plsmido del medio. En una tcnica alternativa, el segmento de DNA se une a una porcin del genoma del virus bacteriano lambda (A) y luego se permite que este virus infecte un cultivo de clulas bacterianas produciendo un gran nmero de virus, cada uno conteniendo el segmento de DNA extrao. De cualquier manera, una vez que el segmento de DNA se encuentra en el interior de la bacteria ser duplicado junto con el de DNA bacteriano (o viral) y repartido a las clulas hijas (o progenie de las partculas virales). As, el nmero de molculas de DNA recombinante se incrementa en proporcin al nmero de clulas bacterianas (o progenie viral) que se forma. Si se empieza con un solo plsmido recombinante o un genoma viral dentro de una sola clula bacteriana, en corto plazo se formarn millones de copias de DNA. Una vez que por amplificacin se alcanza la cantidad deseada de DNA, se puede purificar el DNA recombinante y emplear en otros procedimientos, Adems de proporcionar un medio para amplificar la cantidad de una secuencia de DNA particular, la clonacin tambin se puede emplear como tcnica para

aislar en forma pura cualquier fragmento de DNA especfico entre una gran poblacin heterognea de molculas de DNA. Iniciaremos el anlisis de la clonacin de DNA utilizando plsmidos bacterianos.
Clonacin de DNA eucariota en plsmidos bacterianos

El DNA extrao que debe clonarse se introduce en el plsmido para formar una molcula de DNA .recombinante. Los plsmidos empleados para la clonacin de DNA son versiones modificadas de los observados en clulas bacterianas. Igual que sus contrapartes naturales de las cuales se derivan, estos plsmidos contienen un origen de duplicacin y uno o ms genes que confieren a la clula receptora resistencia contra uno o ms antibiticos (pgina 98). La resistencia a los antibiticos permite a los investigadores seleccionar las clulas que contienen el plsmido recombinante. Como demostraron por primera vez Avery, Macleod y McCarty (pgina 427), las clulas bacterianas pueden captar DNA de su medio. Este fenmeno, conocido como transformacin, constituye la base para la clonacin de plsmidos en clulas bacterianas (fig. 17-34). En este procedimiento, a un cultivo bacteriano pretratado con iones calcio se aaden plsmidos recombinantes, cada uno con diferente

734

CAPITULO 17 Tcnicas en biologa celular y molecular

Cromosoma cali

Plsmido

^}

\-S

Purificacin del DNA humano

Purificacin del DNA del plsmido

o.o

o
J~. I
Los fragmentos se unen para formar DNA recombinante mediante DNA ligasa Tratamiento con fcoRI para desdoblar tanto el DNA humano como el bacteriano en fragmentos de diferente tamao

DNA extrao. Cuando estas bacterias se someten a un breve choque de calor, se estimulan para captar DNA de su medio. De ordinario slo un porcentaje muy pequeo de las clulas tiene capacidad para captar y retener una de las molculas de plsmido recombinante. Una vez captado, el plsmido se duplica de manera autnoma dentro de la clula receptora pasando a su progenie durante la divisin celular. Las bacterias que contienen el plsmido se pueden seleccionar porque crecen en presencia del antibitico contra el cual confiere resistencia el gen introducido al plsmido. Despus de alcanzar la cantidad de amplificacin deseada, se cosechan las clulas, se extrae el DNA y el plsmido de DNA recombinante se puede separar con facilidad del cromosoma bacteriano mucho ms grande (fig. 17-35). Tambin se pueden tratar plsmidos recombinantes aislados con la misma enzima restrictiva utilizada en su sntesis, la cual libera los segmentos de DNA clonados del resto de DNA que sirvi como vector. A continuacin, el DNA clonado se puede separar del plsmido. Iniciamos este comentario teniendo como objetivo estudiar el procedimiento para aislar un pequeo fragment de DNA que contiene la secuencia del gen de la insulina. Para lograrlo, se form una gran poblacin de diferentes plsmi-

O *' \o
Incubar clulas culi

Poblacin de plsmidos que contienen diferentes segmentos del DNA humano

en condiciones donde captan plsmidos

del medio

Plsmido libre de coli

Gen de insulina

Gen RNA ribosmico

KI<;i;iA 1 7-34. Ejemplo de clonacin de DNA utilizando plsmidos bacterianos. Se extrae DNA de clulas humanas, fragmentado con EcoRl, y ios fragmentos se introducen en una poblacin de plsmidos bacterianos. Una vez que las clulas bacterianas captan un plsmido del medio, estas clulas originan una colonia que contiene la molcula de DNA recombinante. En este ejemplo, la mayor parte de las bacterias contienen DNA eucariota de funcin desconocida (?), en tanto que una contiene una porcin del DNA que codifica RNA ribosmico y otra contiene DNA que codifica insulina.

Kl(;i KA I 7-:.">. Separacin del DNA de un plsmido del DNA de un cromosoma bacteriano principal. Se puede observar que este tubo de centrfuga contiene dos bandas, una del DNA del plsmido portador de un segmento de DNA extrao clonado dentro de la bacteria y la otra contiene DNA cromosmico procedente de la misma bacteria. Los dos tipos de DNA se separan durante la centrifugacin. El investigador retira el DNA del tubo con aguja y jeringa. El DNA dentro de] tubo se puede hacer visible utilizando el compuesto bromuro de etidio que se enlaza al DNA y que provoca fluorescencia bajo luz ultravioleta, (f-'ata^rafia de Tn Speigel/BIttck Star.)

CAPITULO 17

735

dos recombinantes, unos pocos con el gen buscado (como en la figura 17-35). Uno de los grandes beneficios de la clonacin del DNA es que adems de producir grandes cantidades de un DNA particular permite separar diferentes DNA de una mezcla, Al principio se hizo notar que las bacterias que contienen plsmidos se pueden seleccionar mediante tratamiento con antibiticos. Una vez efectuado este tratamiento, las clulas que poseen plsmidos se pueden sedimentar a baja densidad sobre placas de Petri, de modo que toda la progenie de cada clula (un clono de clulas) permanezca fsicamente separada de la progenie de otra clula. Dado el gran nmero de diferentes plsmidos recombinantes inicialmente presentes en el medio, diferentes clulas sobre el plato de cultivo contienen diversos fragmentos de DNA extra-

(a)
Plato de cultivo con colonias bacterianas (o placas de fago) que contienen DNA recombinante

os. Luego que las clulas que contienen los distintos plsmidos crecen en colonias separadas, el investigador puede identificar entre las colonias aquellas pocas que contienen el gen buscado, en este caso el gen de la insulina. En los platos de cultivo que contienen colonias bacterianas (o placas de fagos) se investiga la presencia de una secuencia de DNA particular empleando las tcnicas combinadas de duplicacin de placas e hibridacin in situ. Segn se ilustra en la figura 17-36, a, la duplicacin de placas permite preparar un gran nmero de platos de cultivo que contienen colonias representativas de una misma bacteria precisamente en la misma posicin en cada plato. A continuacin se emplea una de las rplicas para localizar la secuencia de DNA buscada (fig. 17-36, b), procedimiento que requiere lisar las clulas y fijar el DNA sobre la superficie de un filtro. Una vez fijado el DNA en su sitio, se desnaturaliza como preparacin para hibridacin in situ (pg. 407), durante la cual el filtro se incuba con una sonda de DNA marcada que contiene la secuencia complementaria a la buscada, Despus de la incubacin, la sonda no hibridada se lava del filtro y se determina la localizacin de los hbridos marcados mediante autorradiografa. Se puede entonces seleccionar representativos vivientes de los cinos identificados a partir de las rplicas y desarrollar las clulas aisladas en cultivos de mayor amplitud, de modo que e! fragmento de DNA deseado, como el portador de la secuencia para el gen de la insulina, se pueda aislar en estado puro. Aunque es fcil la bsqueda de un solo gen humano utilizando el procedimiento justamente descrito, no es un mtodo prctico puesto que la clonacin de cientos de miles de diferentes fragmentos de DNA (en cientos de miles de diferentes colonias bacterianas) requiere cientos de platos de Petri separados. Ms bien, este tipo de experimento se efecta mejor utilizando un vector viral en vez de un vector plsmido, como se explica a continuacin.
Clonacin del DNA encala en genomas de fago

Colonia de bacterias

Transferir las clulas

representativas a un filtro de eritrocelulosa mediante la tcnica de plaqueamiento de rplicas

Colonia bacteriana

DNA desnaturalizado adherido al filtro

Las clulas se usan y tratan para desnaturalizar el DNA y provocar que la cadena simple de DNA se adhiera al filtro en su sitio Granos de plata sobre la placa de rayos X mostrando la posicin del hbrido marcado

El otro vector importante para clonacin es el bacterifago lambda, que se muestra en la figura 17-37. El genoma de lambda es una molcula de DNA lineal de doble cadena, aproximadamente de 50 kb de longitud. La cepa modificada que se emplea en la mayor parte de los experimentos de clonacin contiene dos sitios de desdoblamiento para la enzima EcoRl, que fragmenta el genoma en tres grandes segmentos. Afortunadamente, toda la informacin indispensable para el desarrollo de una infeccin est contenida en os dos segmentos exteriores, de modo que el fragmento medio

(b)

Incubar con sonda marcada con radiactividad y efectuar la autorradiografa

Autorradografa

FIGURA 17-36. Localizacin de una colonia bacteriana que contiene la secuencia' de DNA deseada mediante rplica en placa e hibridacin in situ. a) Una vez que las placas de clulas bacterianas del plato de cultivo se desarrollan en colonias, dicho plato se invierte sobre un pedazo de papel filtro y se permite que algunas de las clulas de cada colonia se adsorban al papel. A continuacin se inocula el plato de cultivo vaco presionndolo contra el papel filtro para producir placas rplica, b) Procedimiento para seleccionar las clulas de un plato de cultivo para las colonias que contienen el DNA recombinante de inters. Una vez identificadas las colonias relevantes, se pueden quitar las clulas del plato original y desarrollarlas por separado para producir grandes cantidades de los fragmentos de DNA buscados.

736

CAPITULO 17 Tcnicas en biologa celular y molecular

Mutante cuyo DNA contiene dos sitios fcoRI Extracto de DNA para tratar r 7 con EcoRl V

1
Separar los fragmentos, descartar la parte de enmedio

1
Ensamblado con fragmento eucariota

DNA recombinante Empacamiento del DNA recombinante en la cabeza del fago

Bacteria husped infectada Campo de bacterias Placa transparente de fago

Plato de cultivo FIGURA 17-37. Protocolo para la clonacin de fragmentos de DNA eucariotas en el fago lambda. Los pasos se describen en el texto.

sustituible se puede reemplazar con un fragmento de DNA hasta de 25 kb, aproximadamente. Se pueden empacar in vitro molculas de DNA recombinante en las cabezas del fago, y emplear estas partculas de fago manipuladas genticamente para infectar bacterias husped. Una vez dentro de la bacteria, el segmento de DNA eucariota se amplifica junto con el DNA viral y luego se empaqueta en una nueva generacin de partculas virales liberadas cuando la clula sufre lisis. Las partculas liberadas infectan nuevas clulas y pronto se observa un punto transparente (o placa) en el "tejido" bacteriano sobre el sitio de infeccin. Cada placa con-

tiene millones de partculas de fago y cada una es portadora de una sola copia del mismo fragmento de DNA eucariota. Lambda es particularmente atractivo como vector para clonacin porque el DNA se encuentra bien empaquetado en una forma fcil de almacenar y de extraer. Ms an, en un solo plato de Petri se pueden acomodar ms de 10 000 diferentes placas. Por lo contrario, el mismo plato de cultivo slo tiene espacio para unas cuantas colonias bacterianas portadoras de plsmidos recombinantes. Una vez formadas las placas de fago, se identifica un fragmento particular por un proceso similar al de duplicacin de placas e hibridacin n stu descritas en la figura 17-36 para la clonacin de plsmidos recombinantes. Formacin de una biblioteca de DNA. Una de las razones ms tiles para clonar los fragmentos genmicos es producir bibliotecas de DNA, que son conjuntos do fragmentos de DNA que representan todo el genoma de un organismo. En una de las tcnicas para la formacin de una biblioteca de DNA, el DNA genmico se trata con una o dos enzimas restrictivas que reconocen secuencias muy cortas de nucletidos en condiciones de concentracin enzimtica baja, de modo que slo se desdobla un pequeo porcentaje de sitios realmente susceptibles. Las dos enzimas usadas comnmente que reconocen secuencias de tctranucletidos son Haelll (reconoce GGCC) y Sn/3A (reconoce GATC). Sera de esperar que si un tetranucleHdo dado ocurre por azar con frecuencia tan elevada, cualquier segmento cuantificable de DNA ser sensible a la fragmentacin. Una vez digerido parcialmente el DNA, el producto de la digestin se fracciona mediante electroforesis en gel y los fragmentos de tamao adecuado (p. ej., 20 kb de longitud) se seleccionan para incorporar las partculas del fago lamba y usarlas para producir el medio milln, aproximadamente, de placas necesarias para garantizar que est representado todo segmento simple de un genoma de mamfero. Puesto que se seleccionan grandes pedazos de DNA luego del tratamiento con enzimas en condiciones en las cuales la mayor parte de los sitios susceptibles no se han desdoblado, para todo propsito prctico el DNA ha sido fragmentado al azar. Una vez producidos los fagos recombinantes se pueden almacenar para uso posterior y de esta manera constituyen un conjunto permanente de todas las secuencias de DNA presentes en el genoma de las especies. Siempre que un investigador desea aislar una secuencia particular de la biblioteca, se puede desarrollar el fago dentro de la bacteria y analizar las diferentes placas (cada una originada a partir de la infeccin de un solo fago recombinante) en busca de la presencia de dicha secuencia. El uso de DNA desdoblado al azar tiene una ventaja en la elaboracin de una biblioteca porque genera fragmentos superpuestos que se pueden emplear en el anlisis de regiones de los cromosomas que se extienden en ambas direcciones a partir de una secuencia particular, tcnica conocida como marcha de cromosoma. Por ejemplo, si se aisla un fragmento que contiene la regin que codifica un gen de globina, ese fragmento particular se puede marcar y utilizar como sonda para aislar fragmentos con los cuales se superpone. A continuacin, se repite el proceso utilizando los nuevos fragmentos como sondas marcadas en sucesivos pasos de la bsqueda, y de esta manera gradualmente se

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aisla una parte cada vez ms larga de la molcula de DNA original. Utilizando esta tcnica se puede estudiar la organizacin de secuencias relacionadas en una amplia regin del cromosoma. Clonacin de fragmentos de DNA ms grandes en vectores de clonacin especializados Ni los plsmidos ni los vectores fago lambda son adecuados para clonar DNA de mayor tamao que 20 kb a 25 kb de longitud. Se han desarrollado varios vectores que permiten a los investigadores clonar fragmentos de DNA de tamao mucho mayor. El ms importante de estos vectores se denomina cromosoma artificial de levadura (CAL). Como su nombre implica, estos elementos de clonacin son versiones artificiales de un cromosoma normal de levaduras. Contienen todos los elementos de un cromosoma de levadura necesarios para duplicar la estructura durante la fase S y separar las clulas hijas durante la mitosis, incluyendo uno o ms orgenes de duplicacin, telmeros en los extremos de los cromosomas y un centrmero al cual se pueden unir las fibras del huso durante la separacin de los cromosomas. Adems de estos elementos, los CAL contienen en su estructura: 1) un gen que codifica un producto para seleccionar clulas que contienen CAL y separarlas de las que carecen de dicho elemento, y 2) el fragmento de DNA que se quiere clonar. Igual que otras clulas, las clulas de levadura captan DNA de su medio (pg. 738), lo que suministra la tcnica para introducir CAL en las clulas. Los fragmentos de DNA clonados en CAL tpicamente varan de 100 kb a 1 000 kb (un milln de pares de bases) de longitud. Los fragmentos de dimensiones tan grandes de ordinario producidos por tratamiento de DNA con enzimas restrictivas que reconocen secuencias de nucletidos particularmente largas (7 a 8 nucletidos), contienen dinucletidos CG. Como se hizo notar en la pgina 523, los dinucletidos CG tienen una funcin especial en el genoma del mamfero y al parecer sta es la razn de que no aparezcan con la frecuencia pronosticada en base a la probabilidad. La enzima restrictiva Notl, por ejemplo, reconoce la secuencia de ocho nucletidos GCGGCCGC, que tpicamente desdobla el DNA de mamferos en fragmentos de casi milln de pares de bases de largo. Los fragmentos de esta longitud se pueden incorporar a un CAL y clonar dentro de clulas husped de levadura. El desarrollo de la tecnologa de CAL ha sido un elemento clave en el xito del proyecto del genoma humano (pg. 417). Clonacin de DNAc Hasta este punto, el anlisis se ha restringido a la clonacin de fragmentos de DNA aislados del DNA extrado, o sea, fragmentos genmicos. Cuando se trabaja con DNA genmico, en general se intenta aislar un gen particular o una familia de genes entre cientos de miles de secuencias no relacionadas. Adems, el aislamiento de fragmentos genmicos permite estudiar varios temas, incluyendo: 1) las secuencias reguladoras que flanquean la porcin codificante de un gen; 2) las secuencias no codificantes interpuestas; 3) los diferentes miembros de una familia multigen que con frecuencia estn en ntima proximidad en el genoma; 4) evolucin de las secuencias de DNA, incluyendo su dupli-

cacin y redisposicin, como se observa a! comparar DNA de especies diferentes, y 5) la dispersin interna de elementos genticos desplazarles. La clonacin del DNAc ha demostrado ser muy importante en el anlisis de la estructura y expresin de los genes. Para clonar DNAc, se aisla una poblacin de RNAm y luego se utiliza como plantilla para formar un complemento de DNA de una sola cadena (fig. 17-38), la cual posteriormente se convierte en una poblacin de doble cadena mediante una de DNA polimerasa y luego se combina con el vector deseado. Las poblaciones de RNA mensajero tpicamente contienen miles de especies diferentes, e igual que en los experimentos donde se emplean fragmentos de DNA genmico, se deben rastrear los cinos para aislar una secuencia
Poli(A)

Reconstruccin del poli(dT) primario del apndice poli(A) del RNAm

RNAm

IMi
Formar copias de DNA con transcriptasa J W inversa
'*.; -

Primario

Separar las cadenas de DNA y de RNA con lcali

Primario

Hacer copias de
DNA con DNA

polimerasa I

mimmimiiiiiiiiiiimiiimiiE
Asa terminal digerida con nucleasa 81

imiNiiiiimtiiifimiiiiiNiimiiii
DNAc integrado en el vector plsmido

Bacterias en las cuales se puede clonar DNA FIGURA 17-H8. Sntesis de DNAc para clonacin en un plsmido. En el segundo y cuarto pasos se requieren iniciadores, porque ni la enzima polimerizante de DNA (transcriptasa inversa o DNA polimerasa I) pueden iniciar la sntesis de una cadena de DNA; ambas requieren 3' OH libre del iniciador.

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CAPITULO 17 Tcnicas en biologa celular y molecular

particular a partir de poblaciones heterogneas de molculas recombinantes. El anlisis del DNAc clonado satisface varios objetivos. Generalmente es ms fcil estudiar una poblacin diversa de DNAc que la correspondiente poblacin de RNAm, por lo que se puede usar el DNAc para conocer algo ms acerca de la variedad de RNAm presente en una clula, el porcentaje de RNAm compartido por dos tipos diferentes de clulas, o e\o de copias RNAm presente en una clula. Una sola especie de DNAc amplificado tambin es una molcula muy til. El DNAc slo contiene la informacin presente en el RNAm, por lo que la comparacin entre el DNAc y su correspondiente locus genmico puede suministrar informacin acerca de la localzacin precisa de las secuencias interpuestas no codificantes dentro del DNA. En proyectos ms prcticos, el DNAc purificado se puede secuenciar con facilidad para abreviar la determinacin de la secuencia de aminocidos de un polipptido; el DNAc marcado se utiliza como sonda para detectar secuencias complementarias entre cinos recombinantes; y debido a la falta de intrones, el DNAc tiene una ventaja sobre fragmentos genmcos cuando se intenta sintetizar protenas eucariotas en cultivos de clulas bacterianas.
Clonacin expresada

Un procedimiento alternativo para identificar una placa fago que contiene un DNAc particular se denomina donacin expresada. En esta tcnica, el de DNAc que debe clonarse se introduce por delante de un promotor bacteriano fuerte, lo que garantiza que el DNA extrao ser transcrito y traducido durante el proceso infeccioso, As, aquellos fagos que originalmente incorporan el gen buscado formarn placas que contienen la protena codificada por dicho gen. La identificacin de las placas que contienen el gen se lleva a cabo sobre placas duplicadas preparadas, como se describi con anterioridad, utilizando una sonda marcada que se une especficamente a la protena codificada. Las sondas empleadas ms comnmente para encontrar una protena deseada son anticuerpos formados contra dicha protena. Una vez localizada una placa sobre la rplica el gen, se puede aislar de los virus sobre la placa original.

Sntesis qumica y mutagnesis dirigida a un sitio

El desarrollo de tcnicas qumicas para sintetizar polinucletidos con una secuencia de bases especfica se inici con los trabajos de H. Gobind Khorana a principios del decenio de 1960 como parte de un proyecto para descifrar el cdigo gentico. Khorana y sus colaboradores continuaron perfeccionando sus tcnicas y casi 10 aos despus de su trabajo inicial acerca del cdigo lograron sintetizar un gen de RNAt completo de una tirosina bacteriana, incluyendo la regin promotora no transcrita. El gen, en total 126 pares de bases, se reuni a partir de 20 segmentos, cada uno de los cuales se sintetiz individualmente y luego se juntaron por mtodos enzimticos. A continuacin, este gen artificial se introdujo en clulas bacterianas portadoras de mutaciones para este RNAt y el DNA sinttico pudo realizar la funcin previamente deficiente.

Un segundo acontecimiento importante en el campo de la sntesis de genes se produjo en 1977 cuando Kechi Itakura y sus colaboradores, del City of Hope Medical Center, sintetizaron un gen que codifica la hormona somatostatna, un pequeo pptido hipotalmico (14 residuos de aminocidos). El gen se introdujo por delante de un plsmido especialmente elaborado a partir de secuencias bacterianas reguladoras dentro de E. coli, donde fue transcrito y traducido. En 1981 se sintetiz un gen para la primera protena "de tamao promedio", el interfern humano, esfuerzo que requiri la sntesis y ensamblado de 67 fragmentos diferentes para producir un solo dplex de 514 pares de bases con seales de inicio y terminacin reconocidas por la RNA polimerasa bacteriana. El desarrollo de los procedimientos qumicos requeridos para el ensamblado de nucletdos condujo en los ltimos 10 aos, aproximadamente, a la construccin de mquinas automatizadas para sintetizar DNA capaces de sintetizar polinucletidos de cualquier secuencia deseada (o secuencias generadas al azar) de unos 75 nucletidos de longitud. Una vez sintetizados estos fragmentos se pueden enlazar entre s mediante uniones covalentes para generar molculas de DNA sintticas de longitud considerable. La tcnica desarrollada para la sntesis qumica de DNA tambin es muy valiosa porque permite a los investigadores modificar la secuencia de nucletidos en elementos genticos que ocurren en la naturaleza. A diferencia de sus colegas que trabajan con bacterias, los genetistas han tenido poca suerte en el aislamiento de mutantes de genes eucariotas que contengan alteraciones en las secuencias promotoras, terminadoras u otras reguladoras. Utilizando tcnicas in vitro, se pueden borrar pequeas porciones de una secuencia de DNA, introducir nucletidos adicionales, o se puede cambiar una base especfica por otra. Este procedimiento, desarrollado por Michael Smith, de la University of British Columbia, se denomina mutagnesis dirigida a un sitio (SDM). De ordinario, la tcnica SDM se realiza sintetizando primero un oligonucletido de DNA que contiene la modificacin deseada, hibridando este oligonucletido con el DNA normal y a continuacin utilizando el oligonucletido como iniciador para la polimerasa de DNA. La polimerasa alarga al iniciador aadiendo nucletidos complementarios al DNA normal. Los pedazos de DNA modificado pueden entonces clonarse y determinar el efecto de la alteracin gentica introduciendo el DNA en una clula husped apropiada. Si el sitio bajo investigacin es parte de una regin reguladora, entonces se puede observar el efecto de la alteracin sobre la tasa de expresin del gen. S el sitio se localiza dentro de la regin codificante de un gen, la alteracin resultante en la secuencia de aminocidos suministra conocimientos acerca del papel que ese sitio desempea en la estructura total y funcin de la protena.

Transferencia de genes en clulas eucariotas y embriones de mamfero

En secciones previas analizamos de qu manera se pueden codificar y amplificar genes eucariotas. En esta seccin consideraremos alguna de las tcnicas mediante las cuales se

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pueden introducir dichos genes en las clulas eucariotas. Se dispone de algunos procedimientos para introducir DNA en clulas cultivadas, proceso denominado transf eccin. Es muy frecuente que las clulas estn suspendidas en presencia de un fino precipitado de calcio del DNA. Se estima que slo una clula en 105 a 106 capta el DNA y lo incorpora de manera estable a los cromosomas. Se desconoce la razn de que este pequeo porcentaje de clulas de la poblacin sean competentes para ser transfectadas, pero aquellas que lo son por lo general captan varios fragmentos. Una manera de seleccionar las clulas que captan el DNA extrao es incluir un gen que permita desarrollar las clulas transfectadas en un medio particular en el cual no puedan sobrevivir clulas no transfectadas. Puesto que las clulas transfectadas por lo general captan ms de un fragmento/ el gen empleado para la seleccin no debe localizarse sobre el mismo fragmento de DNA que el gen cuyo papel se investiga (llamado transgen). Otro procedimiento para lograr la transfeccin de clulas vegetales y animales se denomina electroporacin. En este procedimiento, las clulas se incuban con DNA en frascos especiales que contienen electrodos capaces de aplicar un breve choque elctrico. Al aplicar la corriente, la membrana plasmtica transitoriamente se hace permeable a las molculas de DNA, algunas de las cuales llegan hasta el ncleo y se integran a los cromosomas. Una de las maneras ms directas de introducir genes extraos en una clula es la inicroinyeccin directa de DNA dentro del ncleo de las clulas. Los ncleos de oocitos y de vulos son particularmente adecuados para esta tcnica. Por ejemplo, los oocitos de Xenopus se utilizan desde hace mucho tiempo para estudiar la expresin de genes extraos. El ncleo del oocito contiene todo el mecanismo necesario para la sntesis de RNA; cuando se inyecta DNA extrao dentro del ncleo, se transcribe con facilidad. Adems, el RNA sintetizado por las plantillas inyectadas se procesa y transporta normalmente al citoplasma, donde se traduce en protenas que pueden detectar el sistema inmunolgico gracias a su actividad especfica (fig. VE 4-6). Otro "blanco" favorito para el DNA inyectado es el ncleo de un embrin de ratn (fig. 17-39). La meta de tales experimentos no es observar la expresin del gen en la clula inyectada, sino integrar el DNA extrao en los cromosomas del vulo para que pasen a todas las clulas del embrin y al adulto subsecuente. Los animales manipulados genticamente de modo que sus cromosomas contengan genes extraos se denominan animales transgnicos, y suministran un medio para observar cundo y dnde se expresan los genes en el embrin particular (como en la figura 12-41), y para determinar el impacto de copias extra de genes particulares sobre el desarrollo y la vida del animal.
Animales y plantas transgnicos

FIGURA 17-39. Microinyeccin de DNA dentro del ncleo de un vulo de ratn recin fertilizado. Los vulos se colocan en su sitio mediante pipeta de succin, mostrada en la parte de abajo, en tanto que la pipeta de inyeccin se muestra en el momento de penetrar al vulo en la parte de arriba de la figura. (Segn Tilomas E. Wagner y cois. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78:6377, 1981.)

En 1981, Ralph Brinster, de la Universidad de Pennsylvania, y Richard Palmiter, de la Universidad de Washigton, produjeron los primeros animales transgnicos. Introdujeron con xito un gen de rata para hormona de crecimiento (GH) en vulos fertilizados de ratones. El DNA inyectado se elabor de manera que contena la porcin codificante del gen GH de rata en una posicin justo adelante de la regin promoto-

ra del gen metalotionena del ratn. En condiciones normales, la sntesis de metalotionena aumenta mucho luego de administrar metales como cadmio o zinc, u hormonas glucocorticoides (pg. 517). El gen metalotionena contiene un fuerte promotor y la expectativa era que colocando el gen GH por delante de dicho promotor, el gen GH sera expresado luego del tratamiento de los ratones transgnicos con metales o glucocorticoides. Como se ilustra en la figura 17-40, esta expectativa se cumpli totalmente. La formacin de animales transgnicos constituye un medio til para determinar los efectos de la expresin excesiva de una secuencia de DNA particular, Un JflplQ de este tipo de experimento se ilustra en la figura 9-47, que muestra una seccin de la mdula espinal de un ratn que expresa de manera excesiva el gen de uno de los pptidos que forman neurofilamentos. La sobreexpresin del gen conduce a un tipo de degeneracin neurolgica que recuerda lo que ocurre en la enfermedad humana esclerosis lateral amiotrfica (ELA).

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CAPITULO 17 Tcnicas en biologa celular y molecular DNA extrao

Preparar DNA recombinante

Introducir en la bacteria Agrobacterum tumefaciens

FIGURA 1 7-40. Ratones transgnicos. Esta fotografa muestra un par de miembros de la misma carnada a la edad de 10 semanas. El ratn de mayor tamao fue desarrollado a partir de un vulo al cual se inyect DNA con gen para hormona del crecimiento de rata colocada hacia adelante del promotor metalotionena. El ratn ms grande pesa 44 g; el ratn testigo no inyectado y de menor tamao pesa 29 g. El gen de raa GH fue transmitido a los descendientes que crecieron mucho ms que los testigo. (Cortesa de Ralph L Brinster, segn el trabajo comunicado de R.D. Palmiter y col?. Nature 300:611, 1982.)

Discos cortado de las hojas

Plato de cultivo

Este ltimo ejemplo ilustra de qu manera la ingeniera gentica puede producir modelos animales, animales de laboratorio que padecen una enfermedad humana particular que en condiciones normales no padecen. Tambin se han desarrollado animales transgnicos como parte de la biotecnologa agropecuaria. Por ejemplo, los cerdos a los que se incorpora hormona del crecimiento extraa en sus cromosomas, se desarrollan con mucho menos grasa que los animales testigo que carecen de dichos genes. La carne de los animales transgnicos es magra porque el exceso de hormona de crecimiento estimula la conversin de nutrientes en protenas en vez de grasas. Las plantas son candidatos principales para la ingeniera gentica. En la pgina 514, se indic que se pueden cultivar plantas completas a partir de cultivo de clulas de plantas individuales. Esto brinda la oportunidad de alterar la composicin gentica de plantas introduciendo DNA en el cromosoma de clulas cultivadas que posteriormente pueden desarrollarse en plantas maduras. Una manera de introducir genes extraos es incorporarlos en el plsmido Ti
C la Lia.\-lCln / I g l ulfiH.it, I t w m IHIJH^H,!.'.-!^ (flf,27* 2). rW

Clulas transfectadas que crecen a partir de los discos de hojas y que dan lugar a plantas portadoras de transgenes

FIGURA 17-41. Formacin de plantas transgnicas utilizando el plsmido Ti. El transgen se separa en el DNA del plsmido Ti, que a continuacin se puede emplear para transfectar clulas que son parte de discos cortados en las hojas de la planta. A continuacin las clulas transfectadas pueden crecer para formar plantas ntegras.

del laboratorio, esta bacteria vive en asociacin simbitica con plantas dicotiledneas, donde forman masas tumorales llamadas crestas de gallo. Durante una infeccin, el plsmido Ti pasa de la bacteria al interior de la clula vegetal donde se incorpora a los cromosomas e induce a la clula a proliferar y suministrar nutrientes para la bacteria. El plsmido Ti se puede aislar de bacterias y unir con genes extraos para

producir un plsmido recombinante que pueda ser captado por clulas indiferenciadas de plantas dicotiledneas cultivadas, incluyendo zanahorias y tabaco. Esta tcnica, denominada transformacin T-DNA, se emplea para la transfeccin de clulas vegetales con genes derivados de bacterias que

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codifican toxinas para matar insectos, y por lo tanto protegen a las plantas de insectos depredadores. En la actualidad se estn desarrollando otros procedimientos para introducir genes extraos en clulas de plantas monocotiledneas. En una de las tcnicas ms exticas, las clulas vegetales pueden servir como "blanco" para esfrulas microscpicas de DNA recubiertas con tungsteno y disparadas con una "pistola de genes". Esta tcnica se emplea para transfectar algunos tipos diferentes de clulas vegetales. Las dos actividades ms importantes que los genetistas de plantas esperan mejorar con estas maniobras de ingeniera gentica son la fotosntesis y la fijacin de nitrgeno, ambas funciones cruciales desde el punto de vista bioenergtico. Cualquier mejora significativa en la eficiencia de las plantas para efectuar la fotosntesis significa un gran incremento en la produccin de cosechas. Como se analiza en La perspectiva humana del captulo 6, se espera que una versin modificada de la enzima fijadora de CC>2 se pueda manipular genticamente de modo que sea menos susceptible a la fotorrespiracin. La fijacin de nitrgeno es una actividad realizada por ciertos gneros de bacterias (p. ej., Rhizobium) que viven en relacin simbitica con ciertas plantas (p. ej., frijol de soya, cacahuates, trbol, alfalfa y guisantes). La bacteria reside en hinchazones, o nodulos leguminosos, localizados en las races, donde eliminan N2 de la atmsfera, lo reducen a amonio y entregan el producto a las clulas de la planta. Se espera aislar los genes que participan en esta actividad a partir del genoma bacteriano e introducirlos en los cromosomas de plantas no leguminosas que en la actualidad dependen en gran medida de la adicin de fertilizantes para reducir sus compuestos nitrogenados. Alternativamente, quiz sea posible alterar el genoma de cualquier planta o bacteria de modo que se puedan desarrollar nuevos tipos de relaciones simbiticas. Ratones knockout. En algunos puntos de este texto describimos el uso de ratones que carecen de un gen funcional que normalmente contienen. Por ejemplo, se hizo notar que los ratones que carecen de una copia funcional del gen para la protena PrP no pueden desarrollar el prin de la enfermedad encefalitis espongiforme (pg. 25), en tanto que los ratones que carecen de un gen p53 funcional casi con certeza desarrollan tumores malignos. Estos animales, que se denominan ratones knockout, suministran una perspectiva nica de las bases genticas de una enfermedad humana, y tambin un mecanismo para estudiar las diferentes actividades celulares en las que puede participar el producto de un gen particular. Los ratones knockout nacen como consecuencia de una serie de procedimientos experimentales mostrados en la figura 17-42. El primer paso es aislar un tipo muy poco habitual de clula que prcticamente tiene potencial ilimitado de diferenciacin. Estas clulas, llamadas clulas de estirpe embrionaria, se encuentran en blastocitos de mamferos, que es una de las primeras etapas del desarrollo embrionario comparable a la blstula de otros animales. Un blastocito de mamfero (fig. 17-42) se compone de dos partes distintas: una delgada capa externa de clulas y una masa interna de clulas. La capa externa constituye el trofectodermo, que da lugar a la mayor parte de las membranas extraembrionarias caractersticas del embrin de mamfero. La superficie interna del

Blastocito Masa celular interna (contiene clulas EE) Clulas trofoectodrmicas

Las clulas se disocian de los blastocitos y se cultivan como clulas EE Clulas EE Monocapa de clulas que no se encuentran en divisin

^ Las clulas se transCZj>feclan con DNA quej *J> contiene el gen mulante 1 , Clulas transfectadas-

Leiuias bt

(^terocigotos para el gen mulante)

Clulas que crecen en medio selectivo Inyeccin de clulas EE transfectadas en el blastocito husped Blastocito quimrico

que contiene una

masa celular interna con dos tipos

de clulas

en la

Colocar el embrin madre alternativa para su desarrollo a trmino

Ratn quimrico con clulas germinales procedentes de las clulas EE inyectadas

Aparear a los ratones quimricos heterocigotos para obtener ratones homocigotos para el gen mutante

FIGURA 17-42. Formacin de ratones knockout. Los pasos se describen en el texto.

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CAPITULO 17 Tcnicas en biologa celular y molecular

trofectodermo entra en contacto con el grupo de clulas llamado masa de clulas internas, que se prolonga al interior de la cavidad (blastocelo). La masa de clulas internas es la parte del blastocito que da lugar a las clulas que constituyen el embrin del mamfero. La masa de clulas internas contiene las clulas de estirpe embrionaria (EE) capaces de diferenciarse en los diferentes tejidos que contiene un mamfero. Las clulas EE se pueden aislar de blastocitos y cultivar in vitro en condiciones que favorecen el crecimiento y proliferacin de las clulas. Las clulas EE se transfectan entonces con fragmentos de DNA que contengan un alelo imitante del gen que se quiere alterar, y tambin genes que se puedan usar para seleccionar las clulas que han incorporado el DNA alterado en su genoma. De las clulas que captan el DNA, aproximadamente una por cada 104 sufre un proceso de recombinacin homologa en el cual el DNA transfectado sustituye la secuencia de DNA homologa que contiene el alelo normal. Mediante este procedimiento se producen clulas EE heterocigotas para el gen en cuestin y luego se seleccionan segn su resistencia a frmacos. El siguiente paso es inyectar algunas de estas clulas EE dentro del blastocelo del blastocito de un ratn e implantar el embrin inyectado en el oviducto de un ratn hembra hormonalmente preparada para llevar el embrin a trmino. Conforme el embrin se desarrolla en su madre alternativa, las clulas EE inyectadas se unen a la masa de clulas internas del propio embrin y contribuyen a la formacin de los tejidos embrionarios, incluyendo las clulas germinales de las gnadas. Las cras de estos ratones son heterocgotos para el gen en cuestin y se pueden aparear entre s para producir descendientes homocigotos para el alelo muante. Estos ratones carecen ahora de una copia funcional del gen.

nentes. A continuacin se enfra la mezcla para permitir que Jos iniciadores se enlacen a los extremos 3' de ambas cadenas del DNA especfico y la polimerasa aada nucletidos a los extremos 3' de los iniciadores. A medida que la polimerasa alarga los iniciadores, copiando selectivamente el DNA especfico, forma nuevas cadenas de DNA complementarias. Elevando una vez ms la temperatura, las cadenas de DNA originales y las recin formadas se separan. En seguida se enfra la muestra para permitir que los iniciadores sintticos en la mezcla se unan una vez ms a los extremos 3' del DNA especfico, que ahora est presente en cantidad doble de la original. Este ciclo se repite una y otra vez, y en cada ocasin se duplica la cantidad de la regin de DNA especfica flanqueada por los iniciadores enlazados. En unas cuantas horas se pueden generar miles de millones de copias de esta regin especfica. Adems de emplearse para amplificar fragmentos de DNA especficos, la RCP puede generar grandes cantidades de DNA a partir de muestras mnimas. Por ejemplo, la tcnica de RCP se puede usar en la investigacin de crmenes para producir cantidades detectables de DNA a partir de una diminuta mancha de sangre seca encontrada en las ropas del sospechoso o incluso a partir del DNA presente en alguna parte de un solo folculo piloso hallado en la escena del crimen.

Secuencias de DNA
En 1970 se haba determinado la secuencia de aminocidos de una larga lista de protenas, pero prcticamente no se haba progresado en la secuencia de nucletidos de DNA. Haba varias razones para este estado de cosas. A diferencia de las molculas de DNA, los polipptidos tienen longitud definida y manejable; una especie determinada de polipptidos se puede purificar con facilidad; se dispone de varias tcnicas para desdoblar el polipptido en diferentes sitios y producir fragmentos superpuestos, y la presencia de 20 aminocidos diferentes con propiedades muy diversas hace de la separacin y secuenciamiento de pptidos pequeos una tarea sin grandes complicaciones. Entonces, a mediados del decenio de 1970, ocurri una revolucin en la tecnologa para secuenciar DNA; en 1977 se public la secuencia completa de nucletidos de un genoma viral ntegro, el de 0X174 de unos 5 375 nucletidos de longitud. Este acontecimiento decisivo en biologa molecular se logr en el laboratorio de Frederick Sanger, quien 25 aos antes haba determinado la primera secuencia de aminocidos de un polipptido (insulina). En 1970, secuenciar un segmento de DNA de unas pocas docenas de nucletidos de longitud poda tomar un ao; 15 aos despus, la misma tarea se pudo lograr en un solo da. Esta situacin cambi gracias a varios avances notables. De mayor importancia fue la disponibilidad de enzimas restrictivas que suministraron los medios necesarios para preaparar una poblacin de fragmentos de DNA pequeos definidos. Despus, con el advenimiento de la tecnologa para clonacin de DNA, cualquier fragmento determinado se pudo amplificar enormemente para producir material suficiente y efectuar los procedimientos bioqumicos nece-

Amplificacin enzimtica de DNA por RCP

En 1983, Kary Mulls, de Cetus Corporation, desarroll una nueva tcnica que en la actualidad se usa ampliamente para amplificar un fragmento de DNA especfico sin necesidad de clulas bacterianas. Se sabe que la polimerasa de DNA de especies de bacterias que viven en fuentes termales es estable a temperaturas de 90C, muy por enzima de la temperatura que destruye la actividad de otras polimerasas de DNA. MuIHs y sus colaboradores aprovecharon esta enzima para desarrollar la tcnica reaccin en cadena de la polimerasa (RCP), en la cual una sola regin de DNA, que a veces se presenta fugazmente en mnimas cantidades, se puede amplificar con rapidez y poco costo. En la figura 17-43 se muestra el procedimiento bsico empleado en la reaccin en cadena de la polimerasa. Una muestra de DNA se mezcla con los cuatro desoxirribonucletidos y una polimerasa de DNA resistente a temperatura, junto con los dos fragmentos de DNA sintticos cortos (oligonucletidos) complementarios de las secuencias de DNA en los extremos 3' de la regin de DNA que se desea amplificar. Los oligonucletidos sirven como iniciadores (pg. 553) a los cuales se aaden los nucletidos durante los pasos de duplicacin descritos a continuacin. La mezcla se calienta a 92-94C, lo bastante caliente para separar las molculas de DNA de la muestra en sus cadenas compo-

CAPITULO 17 Tcnicas en biologa celular y molecular

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La mezcla de reaccin conDNA "blanco" tiene secuencias de DNA especficas que deben amplificarse, dos iniciadores P2 (P1, P2) y una polimerasa resistente a! calor Poiimerasa resistente a calor La mezcla de reaccin se calienta para separar las cademw as del DNA "blanco". El t enfriamiento subsecuente V : imnnmimimm permite a los iniciadores unirse a las secuencias complementarias en el DNA "blanco"

iiiiiiimiiiiiir
La polimerasa prolonga las cadenas complementarias a partir de los iniciadores El primer celo de sntesis produce dos copias de la secuencia de DNA "blanco"

Las cadenas de DNA se separan de su enlace con los iniciadores Cadenas de DNA .nuevas prolongadas

Hniiiiiiiiiiinnniiin
IIIIIIDIIIIIIIIIIIIIIHH
E) segundo ciclo de sntesis produce cuatro copias de ta secuencia de DNA *blanco"

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FIGURA 17-43. Reaccin en cadena de polimerasa (RCP), Segn se analiza en el texto, el procedimiento se basa en una polimerasa de DNA resistente al calor cuya actividad no se destruye cuando se eleva la temperatura para separar las dos cadenas de la doble hlice. Con cada ciclo de duplicacin se separan las cadenas. Los segmentos flanqueadores (iniciadores) se enlazan a los extremos 3' de la regin seleccionada, y la polimerasa copia el segmento interpuesto.

sarios, Pero adems de estos avances, fue necesaria una nueva metodologa de secuenciamiento independiente de la generacin de fragmentos superpuestos, como se requiere en el secuenciamiento de polipptidos. Casi simultneamente se desarrollaron dos tcnicas diferentes, una por Sanger y A.R. Coulson, del Medical Research Council en Cambridge,

Inglaterra, y la otra por Alian Maxam y Walter Gilbert, de Harvard University. En esta seccin consideraremos brevemente la tcnica Sanger-Coulson (o tcnica dideoxi), que es la ms ampliamente utilizada. Este procedimiento se inicia con una poblacin de fragmentos de DNA idnticos hasta de casi 500 pares de bases

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de longitud obtenidos por tratamiento de DNA con una enzima restrictiva. A continuacin la preparacin se divide en cuatro muestras, cada una tratada de manera ligeramente distinta. El DNA se desnaturaliza en sus cadenas simples (paso 1, fig. 17-44) y luego se incuba con un oligonucletido corto marcado con radiactividad, complementario del extremo 3' de uno de los fragmentos de cadena,simple (paso 2). La mezcla de reaccin tambin contiene una DNA polimerasa (con mayor frecuencia, DNA polimerasa I bacteriana), los cuatro precursores de trifosfato de desoxirribonuclesido (dNTP) y un precusor modificado en baja concentracin, llamado trifosfato de didesoxirribonuclesido, o ddNTP. A cada una de las cuatro muestras se aade un ddNTP diferente (ddATP, ddCTP, ddTTP o ddGTP). Cuando se incuban las mezclas de reaccin en condiciones apropiadas, el oligonucletido marcado se une a los extremos 3' de los fragmentos de cadena simple (paso 3, fig. 17-44) y sirven como iniciadores para la adicin de nucletidos en una cadena complementaria en crecimiento. Los didesoxiribonucletidos carecen de un grupo hidroxilo en las posiciones 2' y 3'; una vez incorporado uno de estos nucletidos sobre el extremo de una cadena en crecimiento, la falta del 3' OH imposibilita a la polimerasa a aadir otro

5 GGACATGAGCT 3 3 CCTGTACTCGA 5 DNA desnaturalizado 3 CCTGTACTCGA 5' Oligonucletido GGA + polimerasa de DNA + dATP, dGTP, dCTP, dTTP + uno de los cuatro ddNTP

V
5 GSA 3

3 CCTGTACTCGA 5'

ddGTP

ddATP

ddCTP

<T

ddTTP

GGACA GGAC GGACAT GGACATGAG GGACATGA GGACATGAGC GGACATGAGC

GGACATG

nucletido, y por lo tanto concluye la cadena (paso 4). Puesto qije el ddNTP est presente en la mezcla de reaccin en concentracin mucho ms baja que la concentracin del correspondiente dNTP, la incorporacin del didesoxinucletido es poco frecuente y al azar; se puede incorporar cerca del principio de una cadena, cerca de la mitad de otra cadena o hasta el extremo de una tercera cadena. Cualquiera que sea el punto donde se incorpora el ddNTP, el crecimiento de la cadena cesa en dicho punto. Cada una de las cuatro muestras contiene una poblacin de fragmentos de DNA incompletos con marca radiactiva de diferente longitud, y todos terminan en el mismo nucletido. Las cuatro muestras diferentes poseen fragmentos que terminan en cuatro nucletidos distintos. Los productos de las cuatro mezclas de reaccin se cargan en pozos separados en la parte de arriba del gel de electroforesis y se fraccionan en sus componentes a lo largo de lneas paralelas (paso 5, fig. 17-44). Como se hizo notar anteriormente, mediante electroforesis en gel se pueden separar fragmentos cuya longitud slo difiere por un nucletido. Por ejemplo, si el fragmento inicial contiene 100 nucletidos, entonces cada uno de los 100 fragmentos marcados de longitud diferente se desplazarn a un sitio especfico en el gel; dentro de las cuatro lneas se deben encontrar bandas marcadas presentes en las 100 localizaciones posibles. Puesto que bandas marcadas sucesivas corresponden a fragmentos con un extremo 5' comn, pero con longitud mayor por un nucletido, y puesto que el nucletido terminal 3' de cada fragmento se conoce gracias a la lnea en la cual se encuentra, se puede leer directamente la secuencia de toda la molcula exponiendo las bandas del gel. Una vez determinada la secuencia de nucletidos de un segmento de DNA, es relativamente sencillo deducir la secuencia de aminocidos de un polipptido codificado utilizando la carta de codones mostrada en la figura 11-41. Para lograr este objetivo, es necesario determinar en la secuencia el sitio donde comienza y donde termina la traduccin e identificar cada uno de los intrones en el DNA que interrumpen la codificacin. Puesto que cada intrn comienza y termina con una secuencia precisa de nucletidos, los intrones se pueden identificar sin gran dificultad. Una vez deducida la secuencia de aminocidos se puede comparar con otras secuencias conocidas para obtener informacin acerca de la posible funcin del polipptido. La secuencia de aminocidos tambin suministra indicios acerca de la estructura terciaria de la protena, particularmente aquellas partes del polipptido que pueden actuar como segmentos que atraviesan la membrana en protenas integrales de membrana. Como se analiz en La pcrpcctiva hiniwnn del captulo 10, la tecnologa para secuenciar DNA se usa en la actualidad como parte de un proyecto de cooperacin a travs de todo el mundo para determinar la secuencia de nucletidos del genoma humano completo.

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MtU'ltA 17-4-1. Secuenciacin de DNA. Secuenciacin de un pequeo fragmento hipottico mediante la tcnica Sanger-Coulson (dideoxi), segn se describe en el texto.

Uso de anticuerpos

Segn se estudi en el captulo 2, los anticuerpos son protenas producidas por tejidos linfoides en respuesta a la pre-

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sencia de materiales extraos, o antgenos. Una de las propiedades ms notables de los anticuerpos, que les confiere su gran utilidad en investigacin biolgica, es su notable especificidad. Una clula puede contener mus de protenas diferentes, pero una preparacin de anticuerpos slo se enlaza a aquellas molculas seleccionadas dentro de la clula que tenga una pequea porcin capaz de ocupar el sitio de enlace del antgeno en la molcula del anticuerpo. Con frecuencia se obtienen anticuerpos capaces de distinguir entre dos polipptidos que slo difieren por un aminocido. Los bilogos han sacado gran provecho de la existencia de los anticuerpos y han desarrollado una amplia variedad de tcnicas para utilizarlas. Bsicamente hay dos diferentes mtodos para preparar molculas de anticuerpos capaces de interactuar con un antgeno determinado. En el mtodo tradicional, se inyecta repetidamente a un animal (de ordinario un conejo o una cabra) con el antgeno y despus de un periodo de varias semanas se le extrae sangre que contiene los anticuerpos deseados. Esta sangre ntegra se somete a tratamiento para eliminar clulas y factores de coagulacin y producir un antisuero, en el cual se pueden ensayar sus ttulos de anticuerpos y a partir del cual se pueden purificar inmunoglobulinas. Aunque este mtodo de produccin de anticuerpos todava se usa, tiene ciertas desventajas inherentes. Corno resultado del mecanismo de sntesis de anticuerpos (estudiado en la pgina 515), un animal invariablemente produce gran variedad de especies diferentes de inmunoglobulinas, o sea, inmunoglobulinas con regiones V distintas en sus cadenas de polipptidos, aunque se prepare a base de un antgeno altamente purificado. Si el antisuero contiene varias inmunoglobulinas capaces de enlazarse al mismo antgeno, se dice que es polivalente. Puesto que las inmunoglobulinas que deben fraccionarse son tan similares en estructura, a veces es imposible utilizar tcnicas estndar para obtener un preparacin con una sola especie de anticuerpo purificado mediante esta tcnica. En 1975, Cesar Milstein y George Kohler, del Medical Research Coundl en Cambridge, Inglaterra, efectuaron algunos experimentos cruciales que condujeron al desarrollo de preparaciones monovalentes de anticuerpos. Para comprender este trabajo, es necesario hacer un breve parntesis. Un clono determinado de clulas productoras de anticuerpos (derivada de un slo linfocito B) produce anticuerpos con sitios idnticos para combinarse con antgenos, o sea, anticuerpos con las mismas regiones V de una molcula a otra. La heterogenicidad de los anticuerpos producidos cuando se inyecta un solo antgeno purificado a un animal se debe a la activacin de muchos linfocitos B diferentes, cada uno con anticuerpos enlazados en su membrana con diferente afinidad para diferentes partes del antgeno. Se plantea una pregunta importante: ser posible superar este problema y obtener una sola especie de molcula de anticuerpo? Consideremos por un momento los resultados de un procedimiento en el cual se inyecta a un animal un antgeno purificado, se espera un periodo de semanas para que los anticuerpos se produzcan, se retira el bazo u otros tejidos linfoides, se prepara una suspensin de clulas aisladas, se aislan las clulas capaces de producir el anticuerpo deseado y estas clulas particulares se cultivan como colonias separa-

das para obtener grandes cantidades de la inmunoglobulina particular. S se siguiera este procedimiento, se obtendra una preparacin de molculas de anticuerpos producidos por una sola colonia (o clono) de clulas, conocida como anticuerpo monoclonal. Infortunadamente, las clulas productoras de anticuerpo no crecen ni se dividen en cultivo,

Inyectar al ratn protena X

Las clulas mutantes de mieloma de ratn son incapaces de crecer en el medio HAT

Algunos linfocitos de ratn procedentes del bazo (azul) forman anticuerpos a X

Mezclar y fusionar clulas, transferir al medio HAT

Las clulas no fusionadas mueren

Los hibridomas crecen

Cultivar clulas nicas en cubetas separadas

Ensayar en cada cubeta el anticuerpo para protena X MGL'RA 17-45. Procedimiento empleado en la formacin de anticuerpos monoclonales. El medio HAT debo su nombre a que contiene hipoxantina, ametopterina y timina. Este mudio permite crecer a las clulas con una hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa (HGPRT) funcional, pero no apoya el crecimiento de las clulas que carecen de esta enzima, como las clulas de mieloma no fusionadas empleadas en este procedimiento.

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por lo que se debe introducir algn tipo de manipulain adicional para obtener anticuerpos monoclonales. En la pgina 64 se mencion que existe un tipo de clula maligna, clula del mieloma, que crece rpidamente en cultivo y contina produciendo grandes cantidades de anticuerpos. Sin embargo, aunque las molculas de anticuerpo producidas por clulas de mieloma son de gran valor en el estudio de anticuerpos, tienen poca aplicacin como herramientas analticas porque se forman en respuesta a la presencia de un antgeno particular. Las clulas del mieloma ms bien se desarrollan a partir de la conversin al azar de un Hnfocito normal al estado maligno y, por lo tanto, producen el anticuerpo que el Hnfocito particular sintetiza antes de malignizarse. Mstein y Khler combinaron estos dos tipos de clulas, el linfocito normal productor de anticuerpos y la clula del mieloma maligno. Lograron esta hazaa fusionando los tipos de clulas para producir clulas hbridas, denominadas hibridomas, que crecen y proliferan produciendo gran cantidad de un anticuerpo nico (monoclonal). El anticuerpo producido es el sintetizado por el linfocito normal antes de fundirse con la clula del mieloma. El procedimiento para producir anticuepos monoclonales se ilustra en la figura 17-45. El antgeno (presente en forma soluble o como parte de una clula intacta) se inyecta a un ratn para provocar la proliferacin de clulas formadoras de anticuerpos especficos. A continuacin se retira el bazo y los linfocitos fusionados con una poblacin de clulas malignas de mieloma, que confieren inmortalidad a los hbridos, o sea, la propiedad de efectuar divisiones celulares indefinidas. Los hbridos se selecccionan de clulas no fusionadas por su capacidad para crecer en cierto medio y a continuacin se detectan individualmente por la produccin de anticuerpos contra el antgeno estudiado. Las clulas hbridas que contienen el anticuerpo apropiado pueden a continuacin clonarse in vitro o in vivo (porque crecen como clulas tumorales en un animal receptor), y se pueden preparar grandes cantidades del anticuerpo monoclonal. Una de las caractersticas ms importantes de esta metodologa es que no es necesario iniciar con un antgeno purificado para obtener un anticuerpo. En realidad, el antgeno contra el cual se busca producir un anticuerpo monoclonal puede ser incluso un componente menor de toda la mezcla. Por ejemplo, consideremos el experimento mostrado en la figura 4-30. Estas micrografas fluorescentes muestran el enlace de tres anticuerpos diferentes a diversos antgenos sobre la superficie de un espermatozoide. En este experimento, los antgenos que deben determinarse nunca

fueron purificados y son de naturaleza desconocida. Los anticuerpos se produjeron por inyeccin de extractos crudos de espermatozoides al animal del cual se prepararon posteriormente los linfocitos del bazo. Despus de obtener un anticuerpo monoclonal se puede utilizar en subsecuentes etapas para aislar antgeno purificado mediante cromatografa por afinidad. Adems de su uso en investigacin, los anticuerpos monoclonales desempean un papel valioso en diagnstico mdico como pruebas para determinar la concentracin de protenas especficas en sangre u orina. Por ejemplo, una concentracin inusitadamente alta de antgeno prosttico especfico (APE), que se mide por su interaccin con un anticuerpo monoclonal, proporciona el primer indicio de que un paciente varn puede estar desarrollando cncer de prstata. Con una preparacin de molculas de anticuerpos a la mano, obtenida mediante tcnicas inmunolgicas convencionales o con el empleo de hibridomas, estas molculas se pueden usar como sondas altamente especficas para investigar la presencia del antgeno correspondiente mediante varias tcnicas analticas. Para utilizar anticuerpos en la localizacin de antgenos intracelulares, los anticuerpos deben conjugarse con una sustancia que los haga visibles, pero que no interfiera con la especificidad de sus interacciones. Para examinar con microscopio de luz, generalmente se forman complejos entre un anticuerpo y una pequea molcula fluorescente para producir derivados que a continuacin se incuban con las clulas o cortes de clulas. Los sitios de enlace se pueden observar con el microscopio de fluorescencia. Esta tcnica se llama inmunoflcreseencia directa. Casi siempre es preferible localizar un antgeno mediante una variacin de esta tcnica, denominada inmunofluorescencia indirecta. En la inmunofluorescencia indirecta, las clulas se incuban con anticuerpo no marcado, al cual se le permite formar un complejo con el antgeno correspondiente. La localizacin de la pareja antgeno-anticuerpo se revela a continuacin en un segundo paso utilizando una preparacin de anticuerpos marcados con fluorescencia cuyos sitios se dirigen contra las molculas del anticuerpo empleado en el primer paso. La inmunofluorescencia indirecta da como resultado una imagen ms brillante debido a que se pueden enlazar numerosas molculas de anticuerpos secundarios al anticuerpo primario nico. La loralizacin del antgeno con el microscopio electrnico se logra utilizando anticuerpos marcados con materiales electrnicamente densos, como la ferritina, una protena que contiene hierro, o con partculas de oro. En las pginas 137 y 695 se muestran ejemplos de estas tcnicas.