Crateur en 1991 du premier stage HACCP en France

Avec l'ouverture d'une unit de biologie molculaire, ASEPT Sarl poursuit le dveloppement de ses activits de laboratoire (voir http://www.asept.fr/labo.htm) et vous prsente une documentation succinte sur :

LES OUTILS DE LA BIOLOGIE MOLECULAIRE AU SERVICE DE LA MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE

Mthode PCR : dtection rapide de bactries pathognes Son atout : dtection des bactries pathognes dans vos produits alimentaires en moins de 30 heures, Principe : dtection de germes pathognes (Listeria et Salmonella ) dans les produits alimentaires par caractrisation gnotypique. Connaissance de l'cologie microbienne des ateliers de transformation

Caractrisation de souches bactriennes pathognes (Eschercichia coli, Listeria, Salmonella) ou non par mthode RFLP (digestion enzymatique de l'ADN bactrien) PGFE (sparation de longs fragments d'ADN par champ puls) ; mesure du pourcentage d'homologie entre les souches afin de connatre les origines et les voies de contaminations de vos produits.

Pour tout complment dinformation, contactez : Corine JABY : c.jaby@asept.fr Muriel COIGNARD : m.coignard@asept.fr

Rdaction : mai 1999 Mise jour avril 2001

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Sommaire

La technique PCR (Polymerase Chain Reaction) Dtection de Listeria monocytogenes par amplification gnique La technique Nested-PCR (nPCR) La technique RAPD ou AP-PCR La technique Reverse-Transcriptase (RT-PCR) Le Ribotypage Gnotypage des souches bactriennes par macrorestriction Les puces dADN (ou CHIPS) Gnotypage des bactries pathognes alimentaires Comparaison de techniques : Electrophorse en champs pulss (RFLPPFGE) et Ribotypage automatis (Riboprinter)

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LA TECHNIQUE PCR (Polymerase Chain Reaction)

HISTORIQUE

Dcouverte du concept technologique : K. Mullis, 1983 Dveloppement du concept : A. Herlich de la compagnie CETUS, 1985

PRINCIPE
La technique PCR permet damplifier spcifiquement une squence dADN ou un gne (amplification gnique) au moyen damorces et de la Taq polymerase. 1 CYCLE PCR comprend trois tapes :

DENATURATION HYBRIDATION ELONGATION

(94-95C) (35-55C) (72-74C)

A chaque cycle : il y a un DOUBLEMENT des copies du fragment dADN En gnral, on ralise 30-35 cycles de PCR (environ 2 h damplification)

AVANTAGES
SPECIFICITE (100 %), SIMPLICITE (kit prt lemploi+ automatisation de la mthode), RAPIDITE (extraction 2h, amplification 2h, dtection 1h30).

LIMITES
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CONTAMINATION (bien cloisonner les diffrentes tapes) DTECTION DE BACTRIES MORTES (recours au pr-enrichissement 16-36h) PRSENCE DINHIBITEURS DE LA TAQ-POLYMERASE (bien traiter ltape

dextraction dADN ou dARN) APPLICATIONS

DETECTION DES BACTERIES PATHOGENES ALIMENTAIRES DETECTION DES LEVURES et MOISISSURES IDENTIFICATION BACTERIENNE et FONGIQUE

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DETECTION DE LISTERIA MONOCYTOGENES PAR AMPLIFICATION GENIQUE

Facteur de pathognicit principal : la Listeriolysine O cod par le gne hlyA Gne hlya

DETECTION DE SALMONELLA PAR AMPLIFICATION GENIQUE

ST11

ST15

DETECTION DES FRAGMENTS AMPLIFIS : Gel dagarose (marqueur de poids molculaire) : rvlation avec le BET
Hybridation molculaire sur filtre (Dot-blot) en solution (tech. sandwich) sondes froides et sondes chaudes

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LA TECHNIQUE PCR MULTIPLEX

PRINCIPE :
Cette technique consiste utiliser dans un essai PCR : PLUSIEURS PAIRES DAMORCES (= multiplex) Cela permet de DETECTER PLUSIEURS MICRO-ORGANISMES la fois

EXEMPLES DAPPLICATIONS :
Recherche des LISTERIA et en particulier L. monocytogenes

Travaux de Border et al., 1990 Utilisation de 3 paires de primers : U1/U2 : primers universels U1/LI1 : primers Listeria spp. LM1/LM2 : primers de L.monocytogenes

U1/U2 : gne codant lARNr 16S U1/LI1 : gne codant lARNr 16S LM1/LM2 : gne hlyA

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LA TECHNIQUE Nested-PCR (nPCR)

Cette technique est base sur la ralisation de DEUX PCR SUCCESSIVES destines amplifier spcifiquement une squence dADN prcise. PCR-1 : couple damorces externes PCR-2 : couple damorces internes

ADN cible
PCR-1

Produit PCR-1

PCR-2 Principal produit PCR-2

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Avantages :

augmenter le rapport de spcificit entre produits spcifique et non spcifiques diluer lchantillon porteur dinhibiteurs ventuels

Problme de la PCR
On ne peut pas augmenter indfiniment le nombre de cycles car il existe un plateau damplification. Parfois le produit PCR reste toujours indtectable do la prsence de faux ngatifs.

RECOURS LA n-PCR SOUTHERN-BLOT

Sensibilit : n-PCR + BET = sPCR + Southern-Blot nPCR est 10 2 103 plus sensible que la sPCR

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LA TECHNIQUE RAPD ou AP-PCR

Raction damplification avec des amorces arbitraires

RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA AP-PCR : Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction Cette technique , simple et rapide, permet de dtecter des diffrences sur des petites squences dADN et ainsi diffrencier des souches entre elles.
Gnome bactrien

Amplification

Gnration de fragments PCR plus ou moins longs

Sparation des fragments amplifis par lctrophorse en gel dagarose diverses concentrations Analyse des profils lectrophortiques afin dapprcier la similarit des souches dun point gnomique

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LA TECHNIQUE Reverse-Transcriptase (RT-PCR)

La transcriptase reverse catalyse la raction :

ARN m 5
ARN m

ADN c 3
AAAAA

Transcriptase rverse

5
ARN m ADN c Dnaturation

AAAAA TTT

ADN c ADN Polymrase I

TTT

Nuclase S1

ADN c
La raction damplification seffectue partir de lADN c. Cette technique est intressante dans la mesure o elle permet damplifier un gne qui est exprim dans la cellule bactrienne. Ensuite, il est possible de conduire des analyses fines de squenage sur le gne amplifi.

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LE RIBOTYPAGE
Cette technique consiste digrer lADN gnomique par des enzymes de restriction et hybrider les digests avec une sonde complmentaire de lADNr

GENOTYPAGE DES SOUCHES BACTERIENNES PAR MACRORESTRICTION

Cette mthode de gnotypage est une combinaison de deux techniques : la RFLP et la PFGE RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism PFGE : Pulsed Field Gel Electrophoresis LANALYSE RFLP Cest une technique qui permet dtudier le polymorphisme de la squence dADN laide denzymes de restriction.
Une enzyme de PALINDROMES. restriction coupe lADN des sites spcifiques appels

Il existe une cinquantaine denzymes de restriction connues

EcoRI

GAATTC CTTAAG GT(A/C)(T/G)AC CA(T/G)(A/C)TG

AccI

La digestion de lADN gnomique, par des enzymes de restriction qui ont des sites de coupure rares, gnre de grands fragments (50 100 kb)

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La sparation des grands fragments se fait ELECTROPHORESE EN CHAMP PULSE (Schwartz et Cantor, 1984)

ELECTROPHORESE EN CHAMP PULSE Principe :

La sparation repose sur leffet tamisant du support solide (agarose ou gel de polyacrylamide) Les acides nucliques sont chargs ngativement car ils renferment un groupement phosphate. Vitesse de migration = f (Taille de la molcule) Les molcules sont soumises deux champs lectriques dorientations diffrentes et appliqus de faon alternative. Les molcules dADN migrent en adoptant un mouvement de reptation. A chaque changement de direction du champ lectrique, les molcules subissent un phnomne de rorientation. Cest lcart dans les dures de rorientation que lon obtient la sparation de deux molcules de tailles diffrentes. Diffrentes techniques sont utilises en PFGE notamment la technique CHEF (ContourClamped Homogeneous Electric Field)

LES PUCES DADN (ou CHIPS)

Cette mthode, actuellement en phase exprimentale, permettra didentifier et de doser les constituants dun mlange complexe dADN ou dARN grce lhybridation en parallle sur une centaine de microsurfaces greffes avec des sondes. En dautres termes : analyse simultane de plusieurs dizaines de milliers despces dARNm, dont les niveaux dexpression varieront de 1 10 000 transcrits / cellule. Une puce ADN peut tre compare un four dhybridation miniaturis

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GENOTYPAGE DES BACTRIES PATHOGENES ALIMENTAIRES

TECHNIQUES
PCR-RFLP : amplification spcifique + digestion par 1 ou 2 enzymes de restriction RFLP-PFGE : digestion par 1 ou 2 enzymes de restriction + champ puls RAPD-PFGE : amplification alatoire + champ puls RIBOTYPAGE : digestion de lADN gnomique par 1 ou 2 enzymes de restriction + lectrophorse + hybridation avec une sonde

FINALITE DE CES TECHNIQUES :

EMPREINTE GNTIQUE POUR CHAQUE SOUCHE BACTRIENNE (sous forme de CODE BARRE)

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GENOTYPAGE DES BACTRIES PATHOGNES ALIMENTAIRES

OBJECTIF :
Meilleure tracabilit des souches bactriennes

APPLICATION :
Dlai : 1 semaine Cot : entre 600 et 700 F H.T.

INTERPRETATION :
M A B C R A : souche A B : souche B C : souche C

R : souche de rfrence M : marqueur de PM

Coeff. de Dice = 2 nAB nA + nB nBnB

nAB : nombre de bandes communes entre A et B nA : nombre total de bandes dans la piste A nB : nombre total de bandes dans la piste B

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Comparaison de techniques Electrophorse en champs pulss (RFLP-PFGE) Ribotypage automatis (Riboprinter)

Ce sont deux mthodes permettant dobtenir lempreinte gntique des bactries. La technique dlectrophorse en champs pulss consiste digrer lADN bactrien par des enzymes de restriction sites de coupure rares. Ainsi, des fragments dADN de taille > 20 Kb sont gnrs. Ces fragments sont ensuite spars par lectrophorse en champs pulss. Le principe du ribotypage automatis repose sr la digestion de lADN bactrien par une enzyme de restriction (choix possible entre ces 4 enzymes : EcoRI, PvuII, PstI et NotI). Les fragments dADN, spars par lectrophorse, sont ensuite hybrids avec une sonde chimioluminescente correspondant lADNr dE.coli. Le profil (ou ribotype) dune souche correspond aux fragments hybrids. Seule une partie du chromosome bactrien est analyss linverse de la technique RFLP-PFGE. Le ribotypage laide du Riboprinter est une mthode automatise qui utilise un protocole standard permettant une reproductibilit inter-laboratoires. La technique RFLP-PFGE est une mthode manuelle difficilement reproductible entre tous les laboratoires. Le Riboprinter ne requiert pas une formation spcifique, par contre le RFLP-PFGE sadresse un biologiste molculaire confirm. En effet, lanalyse des gels seffectue manuellement. Les pulsotypes et ribotypes sont stocks dans des bases de donnes. La mise jour de la base du Riboprinter est assure par le fournisseur (Qualicon) au moyen dInternet. Le Riboprinter permet didentifier et de caractriser un isolat inconnu. Ceci nest pas possible par lautre mthode. Plusieurs genres bactriens sont recencs dans la base de donnes du Riboprinter : Listeria, Bacillus, Enterococcus, Escherichia, Lactobacillus, Salmonella, Pseudomonas, Staphylococcus, Campylobacter, Lactococcus, Pediococcus, Leuconostoc et Vibrio. Le Riboprinter peut analyser 8 isolats simultanment. Lanalyse dun isolat dure 8 heures. Au total, 3 sries (dcales dans le temps) de 8 isolats peuvent tre analyses soit 32 souches ribotypes par jour. Cinq jours sont ncessaires pour caractriser 30 souches par RFLP-PFGE avec un appareil dlectrophorse en champs pulss. Lavantage majeur de la technique dlectrophorse en champs pulss est son fort pouvoir discriminant (coefficient de discrimination suprieur 0,90). Kerouanton et coll. (1998) ont compar le ribotypage et le pulsotypage sur Listeria monocytogenes. Sur 35 souches analyses, 10 ribotypes et 12 pulsotypes ont t obtenus. Lindice de discrimination du ribotypage tait de 0,849. La combinaison des deux techniques a donn un excellent indice de discrimination de 0,978. La complmentarit des techniques RFLP-PFGE et ribotypage permet dobtenir une caractrisation fine des souches.

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