Practica N 8 METABOLISMO BACTERIANO 1 1 1 1 2 Ballesteros, X. 211008 ; Grueso, P. 211022 ; Ortiz, M. 211040 ; Ussa, V. 208576 ; Valencia, J.

507010 1 2 Zootecnia , Ingeniera Ambiental . Universidad Nacional de Colombia- Sede Palmira.

RESUMEN Palabras claves: Bioqumica de Microorganismos INTRODUCCIN Todos los seres vivos llevan a cabo el procesamiento de los nutrientes que los mantienen vivos. A este conjunto de procesos, se le conoce como metabolismo y consiste de un gran nmero de reacciones qumicas destinadas a transformar las molculas nutritivas en elementos que posteriormente sern utilizados para la sntesis de los componentes estructurales; como pueden ser las protenas. Otra parte importante del metabolismo es la de transformar y conservar la energa que est contenida en una reaccin qumica en algn proceso que requiera de energa, como puede ser el trabajo o el movimiento (DREYFUS, 1987). El metabolismo bacteriano se clasifica con base en tres criterios importantes: el origen del carbono, la fuente de energa y los donadores de electrones. Segn la fuente de carbono, las bacterias se pueden clasificar como: hetertrofas, cuando usan compuestos orgnicos, auttrofas, cuando el carbono celular se obtiene mediante la fijacin del dixido de carbono. Las bacterias auttrofas tpicas son las cianobacterias fotosintticas, las bacterias verdes del azufre y algunas bacterias prpura. Pero hay tambin muchas otras especies quimiolitotrofas, por ejemplo, las bacterias nitrificantes y oxidantes del azufre. Segn la fuente de energa, las bacterias pueden ser: fototrofas, cuando emplean la luz a travs de la fotosntesis. quimiotrofas, cuando obtienen energa a partir de sustancias qumicas que son oxidadas principalmente a expensas del oxgeno (respiracin aerobia) o de otros receptores de electrones alternativos (respiracin anaerobia). Segn los donadores de electrones, las bacterias tambin se pueden clasificar como: littrofas, si utilizan como donadores de electrones compuestos inorgnicos, organotrofas, si utilizan como donadores de electrones compuestos orgnicos (Hellingwerf, 1994). El objetivo de la prctica fue distinguir las principales pruebas bioqumicas utilizadas en el metabolismo bacteriano para la identificacin bacteriana, que nos lleve a comprender y entender el fundamento bioqumico y su correcta interpretacin de los resultados obtenidos. MATERIALES Y MTODOS Prueba de Catalasa En un portaobjetos se coloc una gota de perxido de hidrogeno 3% y se transfiri a este una alcuota del microorganismo emulsionado con el asa bacteriana (las asas no deben contener hierro ya que puedo producir falsos positivos). Prueba de Oxidasa. Se parte de un cultivo fresco del microorganismo en un medio no selectivo y libre de colorantes, se tom con ayuda de un asa bacteriana una alicuota y se lleva a una tira de papel filtro sobre un porta objetos; previo a esto se le adiciono un reactivo Diclorhidrato de dimetil -pfenilendiamina o clorhidrato de tetrametil pfenilendiamina. Prueba de Oxidacin Fermentacin. Se utilizaron dos tubos los cuales contenan agar de semislido de Hugh-Leifson, a estos se les inoculo por picadura con un asa micolgica siendo previamente esterilizada. Por ltimo se sella uno de los tubos con parafina y, se dejaron incubando a 35 C por 48 horas. Fermentacin de glucosa. Un caldo de glucosa (proteasa de peptona 10g, glucosa 10g, purpura de bromocresol 0.015 g,cloruro de sodio 5g, agua destilada1L) se dispenso en un tubo y se le agrego una campana de Durham invertida, agregndole a su vez las bacterias con ayuda del asa bacteriolgica. Fermentacin de azucares en agar TSI Un medio de agar TSI (Extracto de carne 3g, Peptona 15g, proteosa peptona 5g, lactosa 10g, sacarosa 10g, glucosa 1g, cloruro de sodio 5g, sulfato ferroso 0.2g, tiosulfato de sodio 0.3g, agar agar 12g, rojo fenol 0.024g, agua destilada 1L, pH 7.4 0.2) se dispenso en tubos en bisel, se inoculo por siembra mixta y se dej incubando a 35C por 24 horas. Crecimiento aerobio anaerobio. Lo tubos con caldo tioglicolato (Extracto de levadura 5g, casitona 15g, glucosa 5.5 g, NaCl 2.5, L- Cistina 0,5g, tioglicolato de sodio 0.5g, Agar 0.75g, rezasurina 0,001 g y agua destilada destilada de 1L) se inocularon con ayuda de asa bacteriolgica, se dejaron incubar a 35C por 48 horas. Produccin de Indol En un medio de cultivo rico en triptfano (caldo de triptfano, agua peptonada, etc.) dispuesto en un tubo, se inoculo con ayuda del asa bacteriana, y se dej inoculando a 35C por 24 horas, despus se aadieron cinco gotas del reactivo de Kovacs. Prueba de Rojo de Metilo Voges proskauer (RM-VP) Dos tubos con (peptona 7g, glucosa 5g, fosfato dipotasico 5g, agua destilada 1L, pH 6.9 0.1) se inocularon con ayuda de asa bacteriolgicas, y se dejaron incubando a

35C por 48 horas, luego se le adiciono a un tubo el revelador rojo de metilo y revelador VP para el otro tubo. Prueba de Ureasa. En un tubo con caldo Urea de Stuart (Extracto de levadura 0.1g, fosfato monopotasico 9.1g, fosfato disodico 9.5 g, urea 20g, rojo de fenol 0.01g y agua 1L) se inoculo la bacteria con ayuda del asa, y se dej incubando durante 24 horas a 35C. Utilizacin de citrato como nica fuente de carbono En tubo inclinado o en bisel se dispenso el agar citrato de Simmons (fosfato diacido de amonio 1g, fosfato dipotasico1g, cloruro de sodio 5g, citrato de sodio 2g, sulfato de magnesia 0.2g, agar-agar 15g, azul de bromotimol 0.08g, agua destilada 1L, pH 6.9) y se hizo siembra mixta con ayuda del asa micolgica, se incubo durante 24 horas a 35C. Decarboxilacion de Lisina y Ornitina . En un tubo con medio base Moller se adiciono el aminocido lisina 10g, y se inoculo la bacteria con ayuda del asa, se dej incubando durante 24 horas a 35C. Fenilalanina deaminasa En un tubo en bisel con agar fenilalanina (DL fenilanannina 2g, extracto de levadura 3g, cloruro de sodio 5g, fosfato de sodio 1g, agar-agar 12g, agua destilada 1L; pH 7.3) Prueba de descarboxilacin de lisina en agar (LIA) Se utiliz un tubo en bisel con agar LIA (peptona 5g, extracto de levadura 3g, glucosa 1g, L-lisina HCl 10g, citrato frrico amnico 0.5g, Tiosulfato de sodio 0.04g, purpura de bromocresol 0.02g, agar agar 15g, agua peptonada 1L pH 6.7 0.2), y se inoculo con un asa micolgica por siembra mixta. Se incubo a 35 C por 24 horas. Prueba de DNASA Desoxirribonucleasa. En una caja de Petri esteril se dispenso un medio de agar DNasa (triptosa 20g, ADN 2g, NaCl 5g, agar 15g, azul de toluidina, 0.1g y agua destilada 1L), se hizo una siembra por agotamiento de la bacteria con ayuda del asa, y por ltimo se incubo a 35C por 24 horas. Produccin de Pigmentos. En un tubo de ensayo se dispenso un medio King A (peptona 20g, glicerol 10g, K2SO4 1.5g, MgSO4, 1.4g agar-agar 15g, agua destilada 1L) y en otro tubo se dispenso un medio con King B (Proteasa peptona 20g, glicerol 10g, K2HPO4 1.5g, MgSO4 7H2O 1.5g, agar-agar 15g y agua destilada 1L), se inocularon por siembra en estra y se incubaron durante 24 horas con 35C. Pasado el tiempo se observ el Kin B en una cmara oscura con luz UV. Prueba de coagulasa o factor antiguagulante. En un tubo estril con 0.5ml de plasma de conejo y 0.5ml de caldo BHI (infusin cerebro corazn) se inocularon las bacterias y se incubo durante 24 horas a 35C.

Hidrolisis de almidn. En una caja Petri se dispenso agar almidn (Extracto de carne 3g, almidn soluble 10g, agar-agar 12g, agua destilada 1000mL), y se sembr por agotamiento la bacteria, por ltimo se incubo por 24 horas a 35C. Prueba de Billis Esculina. En una caja Petri esterilizada con agar Billis Esculina (peptona 5g, extracto de carne 3g, Billis de buey 40g, Esculina 1g, Citrato frrico 0.5g, agar-agar 15g y agua destilada 1L), se inoculo por siembra en aislamiento y se incubo a 35C por 24 horas.

RESULTADOS Y DISCUSIONES

Prueba Resultado Hidrolisis de Reaccin negativa almidn TSI agar hierro Acido/Acido triple azcar gas (-) H2S (-) (glucosa, lactosa, sacarosa)

Hidrolisis almidn

de Reaccin negativa

Indol

Reaccin negativa

Interpretacin La bacteria no presenta amilasa El microorganismo fermenta la glucosa y lactosa y/o sacarosa. Sin produccin de gas ni de H2S El microorganismo no produce gelatinasa El microorganismo no hidroliza el triptfano

Antibiograma

Crecimiento aerobioanaerobio

Fermentacin glucosa

El organismo es capaz de utilizar el oxgeno como aceptor final de electrones; son capaces de crecer bien tanto en ausencia como en presencia de una concentracin de oxigeno similar a la del aire (21%) aerobios respirando y anaerobios por fermentacin. Se presenta de Lactosa acido(+) gas fermentacin de (+) lactosa, maltosa Maltosa acido con presencia de

LIPS 0,8 0,9 0,8 C30 0,1 FUS 50 no hay Crece tanto en aerobio como anaerobio, pero su crecimiento es mejor en medio aerobio. (Anaerobios facultativos)

Rojo de metiloVoges proskaver (Rm-Vp)

Citrato

Oxidacinfermentacin carbohidratos (OF) Movilidad

de

Descarboxilacion de lisina y ornitina duda ver guia

Reduccin nitritos

de

(+) gas (+) gas Sacarosa acido adicionalmente (+) gas (-) fermentacin de sacarosa con ausencia de gas o sin produccin de gas con pH cidos. Reaccin Rm Prueba de Rm (+) (+) Vp (-) quiere decir que el microorganismo fermento la glucosa por va acido-mixta, con una buena produccin de cido. Vp (-) no tiene presencia de diacetilo. Reaccin El negativa microorganismo no tiene la capacidad de utilizar como nica fuente de carbono en su metabolismo el citrato. Reaccin El negativa microorganismo es inactivo frente a la glucosa. Reaccin Se present negativa movilidad a lo largo de la puncin realizada en el agar lo que determina que el microorganismo no tiene flagelos ni movilidad por el resto del agar. Reaccin El positiva microorganismo posee enzimas descarboxilasa de aminocidos y como consecuente formacin de aminas. Reaccin Posee la positiva capacidad de reducir los nitratos a nitritos

DNasa

Reaccin positiva

Bilis esculina

Reaccin negativa

Coagulasa o factor Reaccin negativa de aglutinacin

a nitrgeno elemental o a hidroxilamina El microorganismo tiene la capacidad de degradar ADN a fracciones de menor peso molecular. La bacteria no es capaz de crecer en presencia de bilis, ni de hidrolizar esculina. La bacteria no presenta coagulasa entonces no es capaz de transformar el fibringeno en fibrina por lo tanto no existe presencia de coagulos.

Oxidasa Catalasa

Reaccin negativa Reaccin negativa

La bacteria no posee catalasa, por lo tanto no descompone el perxido de hidrogeno en oxgeno y agua (H2O2 H2O+O2)

Salinidad Pigmentos

Reaccin negativa King A(-) El King B(-) microorganismo no tiene fluorescencia

Ureasa
BIBLIOGRAFA DREYFUS G., C. (1987). Metabolismo bacteriano. Vol. 1. Disponible en: http://bibliotecadigital.ilce.edu.mx/sites/ciencia/html/biologi a.html Hellingwerf K, Crielaard W, Hoff W, Matthijs H, Mur L, van Rotterdam B (1994). Photobiology of bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek 65 (4): pp. 331 47