Prtica de Hematologia Contagemtotaldeleuccitos:

Quando realizada em cmara de Neubauer: 1. Pipetar 400 microlitros de Trk ou cido actico em tubo de ensaio; 2. Pipetar 20 microlitros de sangue homogeneizado; 3. Limpar o excesso de sangue da parte externa da ponteira com gaze ou papel e adicionar o sangue no tubo de ensaio com o diluente; 4. Montar a cmara de Neubauer e preencher um dos lados com a diluio homogeneizada (Fig.1); 5. Contar os quatro quadrados laterais maiores (Fig. 2 e 3) e multiplicar por 50. CLCULO DA CONTAGEM TOTAL DE LEUCCITOS: rea de cada quadrado maior: 1mm2 Profundidade: 1/10mm Diluio: 1:20. Nmero total de leuccitos = Nmero de clulas contadas x 10 (altura) x 20 (diluio) / 4 (nmero de quadrados) no total de leuccitos x 50 = no total de leuccitos/mm3 (ou microlitro L) de sangue.

Contagemtotaldeeritrcitos:
Proceder da mesma maneira, porm utilizar 4 mL (4.000 microlitros) de diluente. Os diluentes que podem ser utilizados so a soluo de Marcano (carnvoros e eqinos), Gower (ruminantes), ou a Sol. Fisiolgica (se realizada a contagem imediata). Contar as hemcias de 5 quadrados mdios centrais. Somar o resultado de cada um dos 5 quadrados mdios ((Fig. 2 e3) e multiplicar por 10.000. CLCULO DA CONTAGEM TOTAL DE ERITRCITOS: rea do quadrado central maior: 1mm2 Profundidade: 1/10mm Diluio: 1:200. Nmero total de hemcias = No de clulas contadas x 10 (altura) x 200 (diluio) x 5 (5 de 25 quadrados mdios) no de hemcias contadas x 10.000 = no total de hemcias/L) de sangue.

HematcritoouVolumeGlobular
Mtodo do Micro-Hematcrito 1. Encher dois teros de um capilar com sangue mais anticoagulante homogeneizado. 2. Limpar a extremidade com gaze ou papel higinico. 3. Fechar a extremidade do tubo na chama, protegendo o sangue com o dedo e rotacionando lentamente o tubo para que ele feche por igual, sem formar deformaes na ponta do capilar. 4. Centrifugar por 5 minutos a 11.500rpm. 5. Fazer a leitura no carto especial alinhando o incio da coluna de hemcias em zero e o final do plasma em 100% e obtenha o resultado em porcentagem. OBS: Podese usar um tubo heparinizado colhendo-se o sangue diretamente do animal, porm o resultado pode ser cerca de 3% maior que com EDTA.

Determinaodahemoglobina
H vrios mtodos de determinao da hemoglobina: O mtodo mais aceitvel o da cianometahemoglobina que realizada em colormetro, espectrofotmetro ou equipamentos automatizados. Podem-se utilizar kits comerciais, com reagentes semi-prontos e soluo padro comercial. Caso prefira possvel preparar as solues no prprio laboratrio: Tcnica: Adicionar 20 l de sangue homogeneizado num tubo contendo 5 mL de soluo de Drabkin (200mg de ferrocianeto de potssio, 50 mg de cianeto de potssio, 1g de bicarbonato de sdio e completar para 1000 mL de gua destilada). Agitar, deixar por 5 minutos e fazer a leitura colorimtrica com comprimento de onda de 540 nm, usando a soluo de Drabkin como branco. Anotar a leitura e compar-la com uma soluo padro. O procedimento de estabelecimento do fator de converso o mesmo descrito nas bulas dos kits comerciais;

Figura 1. Cmara de Neubauer. Local de preenchimento com a diluio.

Figura 2. Imagem do quadrante para contagem de hemcias ou leuccitos. Note que eles so delimitados por uma linha tripla.

L
H H H H H

L
Preparodoesfregao:

Figura 3. Cmara de Neubauer. Locais de contagem dos leuccitos e hemcias

1. Preparar duas lminas novas e desengorduradas, sendo uma lapidada e com os cantos recortados. (Tambm pode ser utilizada uma lamnula). 2. Colocar uma gota de sangue pequena em uma das extremidades da lmina. 3. Tomar a lmina de canto recortado e coloc-la frente da gota num ngulo de 45o, fazer um ligeiro movimento para trs at o sangue se espalhar totalmente na borda da lmina. 4. Com um movimento uniforme, para frente, fazer esta lmina deslizar sobre a outra. Ela arrastar atrs de si o sangue que se espalhar em fina camada. 5. Imediatamente aps, agitar a lmina ao ar at o esfregao secar-se completamente e identificar com lpis.

Coloraodalmina(Leishman,RosenfeldouWright)
1. Colocar 15 gotas do corante sobre a lmina durante 3-5 minutos. 2. Em seguida adicionar 15 gotas de H2O destilada e/ou soluo tamponada sobre o corante e a lmina. 3. Deixar corando por 15 minutos. 4. Escorrer o corante e lavar em gua corrente, secar e examinar ao microscpio com objetiva de imerso. Alternativa: podem-se utilizar os corantes rpidos, tipo pantico, com colorao sequencial rpida em trs solues. Ajustar o tempo de colorao em cada frasco, a depender da qualidade do corante. Pra uma maior durabilidade, fixe na primeira por mais tempo (5 minutos) e/ou substitua-a por Metanol P.A.

Examediferencialdeleuccitos
Fazer a contagem diferencial dos leuccitos identificando cada clula. Para isso contar 100 leuccitos (identificar 100 clulas para cada 10.00 leuccitos, em animais com leucocitose, pode ser necessrio contar 200-300 clulas para fazer o diferencial) e calcular a porcentagem de cada uma delas. Realizar a leitura em linhas gregas (Fig. 4) ao longo dos bordos do esfregao, ou atravessando-o de um lado ao outro em zigue-zague, sempre na regio da monocamada. As clulas normais da srie branca so: Bastonetes, Neutrfilos, Eosinfilos, Basfilos, Linfcitos, Moncitos.

Figura 4. Esquema de varredura para o exame diferencial de leuccitos

Soluesdiluentes
MARCANO, Soluo para diluir hemcias de carnvoros e eqinos - Sulfato de Na 50g - gua destilada 1000mL - Formol 40% 10mL GOWER, Soluo para diluir hemcias de ruminantes - Sulfato de Sdio 62,5g - cido Actico Glacial 166,8mL - gua Destilada Q.S.P. 1000mL HAYEN, Soluo para diluir hemcias - Sulfato de Sdio 12,5g - Cloreto de Sdio 2,5g - Cloreto de Mercrio 1,25g - gua Destilada 500mL TRK, Soluo para diluir leuccitos - cido Actico Glacial 15mL - Violeta Genciana 1% 10mL - gua Destilada 1000mL BRECHER, Soluo para diluir plaquetas (Oxalato de Amnio 1%) Oxalato de Amnio 2g gua Destilada 200mL

Testedecompatibilidadesangneaemanimais
Colher sangue do receptor e doador em frascos diferentes contendo anticoagulante EDTA ou com citrato a partir da bolsa (doador) CUIDADO: evitar hemlise Determinar Ht e PPT do receptor e do doador 1. Centrifugar o sangue do receptor e do doador 2. Separar o plasma e as hemcias do receptor e do doador 3. Lavar o concentrado de hemcias em salina por trs vezes, desprezando o sobrenadante (250 L de sangue + 4 mL salina) 4. Preparar as suspenses de hemcias adicionando 2 gotas do concentrado em 3 mL de salina (soluo 3 a 5%) 5. Misturar uma gota da suspenso de hemcias do receptor com trs gotas do plasma do doador (Prova Menor) 6. Misturar uma gota da suspenso de clulas (ou 1 gota do concentrado) do doador com trs gotas do plasma do receptor (Prova Maior) 7. Misturar por inclinao da lmina, deixar na cmara mida por 10 minutos e examinar em microscpio ou contra um fundo escuro. 8. Verificar se h aglutinao. Diferenciar a formao de Rouleaux da aglutinao verdadeira.

Verificao de hemlise. Preparar mais um tubo de cada uma das provas, conforme os itens 5 e 6. Homogeneizar e incubar os tubos a 37C por 15. Centrifugar e observar a ocorrncia de hemlise. Realizar provas de autocontrole do receptor e do doador, misturando o plasma com a suspenso de cada animal. Animais doadores com aglutinao positiva no autocontrole devem ser retirados do programa de doao. Opcionalmente a formao de aglutinao macro pode ser realizada nos tubos ao invs das lminas. Outros protocolos para provas de compatibilidade sangunea podem ser obtidas em: Day, M. et al. Manual of canine and feline haematology and transfusion medicine. BSAVA, 2000. 320p.

Testedeaglutinaoemsalina
Diluir uma parte de sangue com 3 a 5 partes de soluo salina em um tubo de ensaio (exemplo:20 microlitros de sangue em 100 microlitros de salina). Homegeneizar e pipetar uma gota para visualizao entre lmina e lamnula (preferencialmente 24x60mm). Aguardar 5 minutos em cmara mida para visualizar a formao ou no de aglutinao. No confundir coma formao de rouleaux. O teste positivo indicativo de AHIM, porm o negativo no descarta a possibilidade da doena.

PesquisadeclulasLE
Colher 20 mL de sangue Deixar coagular a temperatura ambiente por 15 min Incubar em banho-maria a 37oC por 1h30min ou em temperatura ambiente por 2 a 3 horas Esmagar o cogulo em peneira e depositar em um grau Agitar em banho-maria a 37oC por 15 minutos ou deixar a temperatura ambiente por 1 hora Com uma pipeta flexvel, preencher tubos de Wintrobe Centrifugar a 2.000rpm por 10 minutos Desprezar o soro e fazer vrias lminas da capa leucocitria Corar e observar ao microscpio Encontrar pelo menos trs clulas LE tpicas para dar o resultado como positivo. A presena de vrias rosetas apenas sugestiva de um processo imunomediado.

Fibrinogniopelomtododorefratmetro(precipitaopelocalor)
Preencher dois capilares de microhematcrito Calibrar o refratmetro com gua destilada (em 1.000) 1 leitura do microhematcrito = PPT Banho-maria a 56-58C por 3 (desnaturao do FBG) Centrifugao a 12.000rpm por 3 2 leitura = PPT - FBG FBG (g/dL) = PPT 2 leitura

Contagemdereticulcitos:

Misturar partes iguais de sangue e um corante supra-vital (Azul de cresil brilhante ou Novo azul de metileno) Incubar em banho-maria a 37oC por 10-15 minutos Confeccionar um esfregao espesso Contracorar com corante de rotina hematolgico Contar 500 hemcias e estabelecer a % de reticulcitos

Contagem corrigida de reticulcitos: Contagem obtida x VG do animal VG mdio normal para a espcie VG normal: co - 45%; gato 37%

Contagem absoluta de reticulcitos: Contagem obtida (%) x nmero de hemcias por microlitro 100

Azul de cresil brilhante: Azul de cresil brilhante 1g Citrato de sdio P.A. 0,4g Soluo fisiolgica q.s.p. 1000mL Novo azul de metileno: Novo azul de metileno 0,5g Oxalato de potssio 1,6g gua destilada q.s.p. 100mL OU Novo azul de metileno 0,5g Soluo salina 0,85% q.s.p. 100mL Formalina 1 mL:100mL

Hematologiacomparada

As contagens de hemcias, leuccitos e trombcitos de aves, rpteis, peixes e anfbios so realizadas em uma nica soluo, sendo necessrio e sempre que possvel, que a diferenciao entre os tipos celulares seja feita pela morfologia na cmara de Neubauer.

Soluo de Azul de Toluidina: Sol. Estoque: 0,1 g de azul de toluidina em 100 mL de soluo fisiolgica (salina 0,9%) Diluir 1 parte da sol. estoque para 9 de salina e filtrar imediatamente antes do uso.

Soluo de Natt & Herrick: NaCl 38,8g Na2SO4 2,5g Na2HPO4.12H2O 2,91g KH2PO4 0,25g Formalina 37% 7,5mL Metil violeta 2B 0,10g H2O destilada 1000 mL q.s.p. pH da soluo= 7,3

Qualquer que seja a soluo diluidora, a diluio costuma ser feita na proporo de 1:100, a depender da espcie. As hemcias podem ser contadas em cinco quadrados centrais menores e os leuccitos e trombcitos nos quatro laterais maiores. Opcionalmente podem-se preencher os dois lados da cmara para a realizao de duas contagens e obteno de uma mdia. Fator para a multiplicao de hemcias = 5.000 (100 da diluio; 10 da altura da cmara e 5 para a correo da rea de 1 mm2) Fator para a multiplicao de leuccitos e trombcitos = 250 (100 da diluio; 10 da altura da cmara e 1/4 para a correo da rea de 1 mm2)