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2012 Volumen 4, No.

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Revista Cientfica de la Universidad Autnoma de Coahuila

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE CEPAS NATIVAS DEL SUELO MEXICANO DEL GNERO Azotobacter
Adriana Carolina Flores-Gallegos , Juan Carlos Contreras-Esquivel , Manuel Humberto Reyes-Valds y Ral Rodrguez-Herrera
2 1 1 1

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Facultad de Ciencias Qumicas, Universidad Autnoma de Coahuila, Boulevard Venustiano Carranza y

Jos Crdenas sin nmero, Col. Repblica Oriente. Saltillo, Coahuila, C.P. 25280, Tels (844) 416 92 13, 415 95 34. *Correo electrnico rrh961@hotmail.com
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Departamento de Fitomejoramiento, Universidad Autnoma Agraria Antonio Narro, Blvd. Antonio Narro

1923, Buenavista Saltillo, Coahuila, C.P. 25315, Tels (844) 411 02 72, 411 03 02.

RESUMEN Desde el siglo pasado, los microorganismos diaztrofos han sido objeto no solo de estudio en microbiologa de suelos, sino tambin en el desarrollo de productos biolgicos comerciales especialmente en Cuba, Mxico y Estados Unidos. Con el fin de aislar y caracterizar bacterias diaztrofas del gnero Azotobacter, se analizaron muestras de suelos mexicanos. El aislamiento se realiz empleando medio Ashby-sacarosa libre de nitrgeno. Los aislamientos se caracterizaron fenotpica y bioqumicamente, logrando identificar bacterias del gnero Azotobacter. La caracterizacin molecular se realiz mediante la amplificacin del ADNr 16S utilizando como cepa de referencia a Azotobacter vinelandii CDBB B-992. El gen 16S fue amplificado mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando los iniciadores FGPL y FGPS, que adems amplifican la regin polimrfica de los espacios intergnicos (IGS) 16S-23S. Se obtuvieron productos de 2000 pb aproximadamente tanto para los aislamientos como para la cepa de referencia. Posteriormente se obtuvo la secuencia de estos productos y se compar con la base de datos del GenBank mediante la herramienta BLAST obteniendo una similitud del 99% para Azotobacter vinelandii. As se demostr que las tcnicas moleculares en conjunto con las convencionales y la bioinformtica son herramientas fundamentales para la caracterizacin de bacterias diaztrofas de importancia en agricultura, estudios de biodiversidad, bioprospeccin y biotecnologa.

Palabras clave: diaztrofos, aislamiento, suelos mexicanos, PCR.

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INTRODUCCIN Actualmente la mayora de cultivos agrcolas dependen de los fertilizantes qumicos sintticos, los cuales proporcionan nutrimentos asimilables por las plantas. Sin embargo, su uso prolongado ocasiona contaminacin ambiental y daos ecolgicos, adems de un incremento en el costo de produccin y el impacto negativo en la salud animal y humana. Una
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alternativa es utilizar biofertilizantes para promover la agricultura orgnica y las tecnologas limpias y seguras. Las bacterias fijadoras de nitrgeno (diaztrofas) fueron las primeras en producirse comercialmente con fines de biofertilizacin. De este grupo, las ms utilizadas como biofertilizantes corresponden al gnero Azotobacter, el cual comprende siete especies a) A. chroococcum, b) A. vinelandii, c) A. beijerinckii,d) A. paspali, e) A. armeniacus, f) A. nigricans y g) A. salinestris (Dobereiner y Day, 1975; Tchan y New, 1984; Page y Shivprasad, 1991). Los microorganismos de este gnero fijan asimbiticamente nitrgeno y son solubilizadoras de fosfato. Adems realizan procesos de biodegradacin de plaguicidas como el endosulfan (Balandreau y col., 1986). En vida libre, fijan al menos 10 mg de N2 por gramo de carbohidrato consumido (Holt, 2000). Los mtodos ms utilizados para aislar bacterias del gnero Azotobacter incluyen el aislamiento en medio libre de nitrgeno, enriquecimiento en solucin de Winogradsky y posterior siembra en medio libre de nitrgeno, y siembra de grnulos individuales de suelo en medio libre de nitrgeno. Para su identificacin preliminar se emplean pruebas bioqumicas como la fermentacin de diferentes azcares (Holt, 2000). Sin embargo, las pruebas bioqumicas y morfolgicas resultan mtodos limitados para la identificacin y caracterizacin de bacterias diaztrofas a nivel de especie. Debido a esto, se han desarrollado tcnicas de huella gentica como RFLP (Restricting Fragment Length Polymorphisms), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), ARDRA (Amplified

Ribosomal DNA Restriction Analysis) y secuenciacin que permiten una identificacin y caracterizacin ms precisa. Adicionalmente, los genes nif y el gen ADNr 16S han sido reportados para la caracterizacin de diferentes gneros diaztrofos, ya que son muy conservados y se encuentran en todos los microorganismos fijadores de nitrgeno (Rodicio y Mendoza, 2004). En el presente trabajo se logr el aislamiento e identificacin fenotpica de cepas nativas del suelo mexicano fijadoras de nitrgeno, y se identificaron bioqumica y molecularmente a nivel especie empleando tcnicas bsicas de biologa molecular. METODOLOGA

Aislamiento de las cepas. Se muestrearon cinco suelos de distintas regiones del pas en zigzag y a una profundidad de 10-15 cm (Martyniuk y Martyniuk, 2002; Tejera y col., 2005). Las muestras se almacenaron en bolsas de cierre hermtico a temperatura ambiente. El pH de las muestra se verific de acuerdo al protocolo propuesto por Van Lierop (1981). Para lograr el aislamiento de cepas fijadoras de nitrgeno, se sembraron grnulos de cada uno de los suelos en agar Ashby http://www.postgradoeinvestigacion.uadec.mx/divulgacionAQM.html

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libre de nitrgeno a una distancia aproximada de 1 cm. Las placas fueron incubadas a 30C por 7 das (Aquilanti y col., 2004). Al trmino de este periodo se procedi a sembrar por agotamiento en placas de agar Azotobacter a partir de las colonias obtenidas incubando nuevamente a 30C durante 7 das. Las cepas obtenidas se conservaron en glicerol al 30% (v/v). Identificacin bioqumica. A cada aislamiento se le realiz una caracterizacin con base en el comportamiento bioqumico frente a la fermentacin de glucosa, manitol y benzoato. Tambin se realiz una prueba de asimilacin y crecimiento en benzoato, fenol y glicerol como fuente de carbono, prueba de la catalasa, prueba de Nessler y produccin de cido 3-indolactico (Torres-Rubio y col., 2000). Se llev a incubar a 282C durante 24 h para despus verificar la acidificacin del medio como indicativo de la fermentacin de azcares y benzoato. Finalmente se realiz la prueba de Nessler para determinar la desnitrificacin, la prueba de la catalasa y la prueba de la produccin de cido indolactico. Todas las pruebas bioqumicas se realizaron por triplicado. Cepa control. Para la identificacin bioqumica y caracterizacin molecular se utiliz la cepa A. vinelandii como control positivo. Esta cepa se adquiri de la Coleccin Nacional Mexicana de Cepas Microbianas del Centro de Investigacin y Estudios Avanzados del Instituto Politcnico Nacional (CINVESTAV), la cual se encuentra clasificada como CDBB B-992.
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Extraccin de ADN. Se llev a cabo la extraccin de ADN genmico siguiendo el protocolo propuesto por Maloy (1989). El procedimiento consisti en realizar la suspensin de una colonia de Azotobacter en 5 ml de caldo nutritivo e incubar 48 h a temperatura ambiente a 150 rpm. Se transfirieron 1.5 ml del cultivo a tubos eppendorf estriles para centrifugar a 13000 rpm por 2 min y se desech el sobrenadante. Las clulas se resuspendieron en 50 l de buffer TE 1X y las fracciones se reunieron en un solo tubo. Se agreg 1 ml de TE 1X y se lav suavemente agitando los tubos; se centrifug a 13000 rpm por 2 min y se descart el sobrenadante. Las clulas se resuspendieron en 350 l de TE 1X y se adicionaron 5 l de lisozima (50 mg/ml) y 2 l de RNAsa A (10 mg/ml). Se llev a incubar a 37C durante 10 min para posteriormente adicionar 3 l de proteinasa K (20 g/ml) y 30 l de SDS al 10% (p/v) y se volvi a incubar a 65C por 15 minutos hasta observarse una suspensin clara que indicara la lisis bacteriana. Una vez lisadas las clulas, se adicionaron 350 l de la mezcla fenol: cloroformo: alcohol isoamlico (25:24:1) y se mezcl por inversin 5 veces. El tubo fue centrifugado a 13000 rpm por 7 minutos recuperndose el sobrenadante en un tubo Eppendorf cuidando de no tomar la fase orgnica ni la interfase. Se adicionaron 350 l de cloroformo: alcohol isoamlico (24:1) y se mezcl por inversin 5 veces. Posteriormente se centrifug a 13000 rpm por 7 min. El sobrenadante obtenido fue transferido a otro tubo que contena 1 ml de etanol absoluto fro y se llev a incubar a -20C durante 1 h. Finalmente se centrifug a 10000 rpm por 5 min y se dej secar la pastilla obtenida durante 20 min a temperatura ambiente para despus resuspenderlo en 50 l de agua destilada estril para poder determinar su calidad.

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Determinacin de la calidad del ADN. Con el fin de conocer la integridad del ADN extrado por distintos mtodos se procedi a realizar una electroforesis en gel de agarosa al 1% p/v en TAE 1X. El ADN se ti con bromuro de etidio (0.5 g/ml). La electroforesis se llev a cabo en una cmara Thermo EC105 a 60 V por 1 h. Se colocaron en cada pozo 10 l del ADN y 3 l de azul de bromofenol. La visualizacin de los geles se realiz en un transiluminador de luz UV Spectroline. Amplificacin del ADN ribosomal 16S-IGS. Para lograr la amplificacin del gen ADNr 16S se utilizaron los iniciadores universales FGPL 132`-38 y FGPS 6-63 que amplifican adems los IGS (Cuadro 1) (Nour y col., 1994). La amplificacin se llev a cabo en un volumen de 50 l que contena: Buffer 1X, 2 mM MgCl2, 50 M dNTPs, 0.8 pmol de iniciador FGPL 132`-38 y 0.8 pmol de iniciador FGPS 6-63, 2.5U de Taq DNA Polimerasa recombinante de la marca InvitrogenTM ; el volumen de ADN se ajust para alcanzar una concentracin de 100 ng (Junior y col., 2004). La reaccin de amplificacin (PCR) se llev a cabo en un termociclador Px2 Thermal Cycler con un paso inicial de desnaturalizacin de 94C por 5 min; 35 ciclos con un programa de temperatura que consiste en: desnaturalizacin a 94C por 1 min, alineamiento a 54C por 1 min y elongacin a 72C por 1 min; y un paso final de extensin de 72C por 5 min (Quatrini y col., 2001).
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Cuadro 1. Secuencia de los iniciadores utilizados para la amplificacin del gen 16S. Iniciador FGPL 132-38 Forward FGPS 6- 63 Reverse Secuencia 5-CCGGGTTTCCCCATTCGG-3 5-GGAGAGTTAGATCTTGGCTC-3 Pares de bases 18 pb 20 pb

Para observar los productos de la amplificacin del ADNr 16S se corri una electroforesis en gel de agarosa al 1.0% (p/v) en TAE 1X teido bromuro de etidio (0.5 g/ml). La electroforesis se llev a cabo en una cmara Thermo EC105 a 60 V por 1 h. Se colocaron en cada pozo 10 l del ADN y 3 l de azul de bromofenol. Se utiliz el marcador de peso molecular de 100 pb (InvitrogenTM). La visualizacin de los geles se realiz en un transiluminador de luz UV Spectroline. Secuenciacin. La secuenciacin se realiz en un equipo Perkin Elmer de Applied Biosystems Modelo 3730 por el mtodo de terminadores fluorescentes (Taq FS Dye Terminator Cycle Sequencing Fluorescence-Based Sequencing). Las secuencias obtenidas se compararon con la base de datos del GenBank mediante la herramienta BLAST (Basic Local Aligment Search Tool) de la base de datos del NCBI, optimizando para las secuencias altamente similares. Los datos obtenidos mediante BLAST se utilizaron para la construccin del rbol filogentico por el mtodo Neighbor-Joining y un valor de bootstrap de 1000 empleando el modelo de sustitucin nucleotdica de dos parmetros de Kimura con distribucin gamma.

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RESULTADOS Y DISCUSIN

Medicin de pH de las muestras de suelo. Se encontraron valores de pH de los suelos muestreados cercanos a la neutralidad. Para el caso del suelo 4 se obtuvo un valor de 7.56, mientras que para el suelo 2 se registr un valor de 6.48. Estos valores se encuentran en el rango ptimo reportado para el crecimiento de bacterias del gnero Azotobacter cuando realizan la fijacin del nitrgeno (7.0-7.5) (Balandreau, 1986). Sin embargo, se han reportado especies que pueden crecer desde pH alrededor de 5.5 tales como A. chroococcum y A. vinelandii (Saribay, 2003). Identificacin morfolgica de bacterias diaztrofas aerobias asimbiticas. El aislamiento secundario en medio Azotobacter permiti obtener un total de 6 aislamientos de bacterias aerobias fijadoras de nitrgeno asimbiticas. Este medio selectivo permite el aislamiento de bacterias fijadoras de nitrgeno adems de que posee microelementos importantes para la fijacin del nitrgeno como el FeSO4. En el total de los aislamientos se evidenciaron dos morfologas diferentes de colonia. Las colonias en la mayora de los aislamientos fueron de color crema, medianas, irregulares y brillantes (C1, C2, C3 y C5) muy similares a las reportadas para el gnero Azotobacter, sin embargo, se presentaron aislamientos con colonias pequeas, traslcidas y brillantes como en el caso de los cepas 4 y 6 (C4 y C6). Adems, se logr identificar tres morfologas celulares. En algunas cepas se evidenci la formacin de quistes, ya que las bacterias del gnero Azotobacter cuando provienen del suelo se encuentran en un estado de resistencia a las condiciones ambientales (Vela, 1974). En un cultivo, estos quistes pueden formarse despus de la fase de crecimiento exponencial, cuando las condiciones son adversas por falta de nutrientes o nutrimentos complejos como el - hidroxibutirato o bien, cuando se degradan los PHBs (Hitchins y Sadoff, 1973), as como por la accin de los iones calcio en el medio (Hitchins y Sadoff, 1970). Por otro lado, estas estructuras de resistencia no son formadas exclusivamente por especies del gnero Azotobacter, sino que tambin son caractersticas de especies del gnero Beijerinckia, aunque para el caso de Azotobacter los quistes se agrupan en pares. Asimismo, se observaron bacilos gram negativos, grandes y cortos (C3 y C5) como los reportados para Azotobacter sp. (Holt, 2000). Sin embargo, en algunas cepas se presentaron bacilos gram negativos cortos y pequeos (C1, C2, C4 y C6) (Cuadro 2). Identificacin bioqumica. La identificacin bioqumica se realiz empleando tcnicas convencionales para la identificacin del gnero Azotobacter. Las pruebas empleadas se basaron en la utilizacin de cuatro azcares, benzoato y fenol como fuente de carbono, prueba de la catalasa, prueba de Nessler, hidrlisis de almidn y produccin de cido 3indolactico. Estas pruebas bioqumicas se utilizaron ya que permiten diferenciar el gnero Azotobacter de otras bacterias fijadoras de nitrgeno asimbiticas (Tejera y col., 2005). De las cepas aisladas, nicamente dos fueron positivas para la glucosa (C3 y C5). Por lo tanto estas cepas fueron identificadas como bacterias del gnero Azotobacter. Adems se tomaron en cuenta las observaciones macro y microscpicas (morfologa celular y de la colonia) as como la pigmentacin en medio Ashby-benzoato para la identificacin preliminar (Cuadro 3).
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Cuadro 2. Descripcin de las colonias aisladas. Cepa C1 C2 C3 C4 C5 C6 Control Suelo S1 S1 S1 S3 S4 S5 A: B: X: Y: Z: Morfologa colonial B A A B A B A Morfologa celular Z Z X Z Y Z X Pigmentacin Sin pigmentacin Sin pigmentacin Caf-claro Sin pigmentacin Caf-claro Sin pigmentacin Caf-claro

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Colonias color crema, medianas y brillantes Colonias pequeas, traslcidas y brillantes Quistes Bacilos gram-negativos grandes Bacilos gram-negativos pequeos Cuadro 3. Perfil bioqumico de las cepas aisladas.

Prueba Glucosa Sacarosa Manitol Glicerol Benzoato Indol Nessler Catalasa

C1 + D D D + +

C2 + + +

C3 + + + + + + + +

C4 + + + +

C5 + + + + + + + +

C6 + + + + + +

Control + + + + + D + +

Identificacin molecular con base en el ADNr 16S. Una vez obtenido el ADN de alto peso molecular, se procedi a realizar la amplificacin con los iniciadores FGPL y FGPS los cuales han sido utilizados en la amplificacin del ADNr 16S de bacterias diaztrofas (Nour y col., 1994), sin embargo, no son especficos para bacterias del gnero Azotobacter. Se obtuvo un fragmento de 2000 pb aproximadamente, correspondiente a el gen 16S y los IGS 16-23S, acorde con lo reportado por McDonald y Melton (1998) y Farajzadeh (2009) para los aislamientos C3 y C5, as como para la cepa control.

Secuenciacin.

Se obtuvieron secuencias en ambos sentidos, las cuales fueron ensambladas empleando la

herramienta CAP contig del software Bioedit. Una vez obtenida la secuencia, se llev a cabo la comparacin con las secuencias reportadas en la base de datos del GenBank mediante el programa BLAST 2.2.20 (Basic Local Aligment Search Tool) (Zhang y col., 2000), obteniendo la mxima identidad con Azotobacter vinelandii en ambos casos. El anlisis filogentico demostr que los aislamientos se encuentran agrupados en el mismo clado que Azotobacter vinelandii, teniendo como vecino al clado que contiene a A. chrococcum y A. salinestris. Finalmente, se logr observar http://www.postgradoeinvestigacion.uadec.mx/divulgacionAQM.html

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que estas especies de Azotobacter guardan una estrecha relacin con Pseudomonas alcaligenes, como lo ha reportado Fialho y col. (1990) (Figura 2).
M 1 2 3 4 5
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2072 pb 1500 pb 600 pb

Figura 1. Amplificacin del ADNr 16S-IGS de las cepas aisladas 1) Cepa Control; 2) C3; 3) C5; 4 y 5) Control negativo M) Marcador de peso molecular (100 pb)

Figura 2. rbol filogentico de los aislamientos C3 C5 construido por el mtodo Neighbor Joining con un valor de bootstrap de 1000. El valor anotado debajo de la figura indica el nmero de sustituciones nucleotdicas por residuo.

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CONCLUSIN Los suelos mexicanos evaluados presentaron caractersticas que permitieron la recuperacin de dos aislamientos correspondientes a bacterias diaztrofas. Estos aislamientos pudieron ser caracterizados mediante tcnicas bsicas de biologa molecular y el anlisis de las secuencias obtenidas empleando los recursos bioinformticos. Asimismo, se logr la ubicacin taxonmica y establecimiento de la relacin filogentica con bacterias relacionadas. De esta manera, dichos aislamientos podran ser empleados en la formulacin de un biofertilizante y as promover el uso de tecnologas limpias y seguras en la agricultura moderna.
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