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PRTICA 6 EXTRAO DE DNA DE PLANTAS E FUNGOS QUANTIFICAO DE DNA

EXTRAO DE DNA Para o isolamento e purificao de cidos nucleicos, necessrio separ-los efetivamente dos outros constituintes celulares. No caso especial dos cidos nucleicos, tambm fundamental manter a integridade das molculas, que devem permanecer inalteradas durante o procedimento de extrao, pois as informaes contidas no N!"#N! dependem da sequ$ncia. !pesar do mtodo de extrao no afetar a sequ$ncia diretamente, alguns protocolos resultam na quebra dos pol%meros de N! ou #N!, causando a perda de informaes. Portanto, extremamente importante que os cidos nucleicos se&am extra%dos num estado mais intacto e inteiro poss%vel. Para N!, teoricamente, a extrao de molculas do taman'o de cromossomos seria o ideal. !pesar de ser poss%vel, especialmente para algumas aplicaes, tais como eletroforese de campo pulsado ()Pulsed *ield +el ,lectrop'oresis)-, as quantidades obtidas no so suficientes para a maioria dos usos. ,xiste, portanto, um balano entre a qualidade e praticidade. Para #N!, quase todos os mtodos de anlise requerem a purificao de molculas de #N! que se&am intactas e de taman'o completo (dentro do poss%vel.-. ! quebra dos pol%meros afeta mais N! do que #N!, mas a 'idr/lise en0imtica (nucleases- afeta mais os #N!s do que N!. ,xistem vrios mtodos descritos na literatura, e a escol'a depende do balano entre a praticidade, qualidade e a finalidade de uso do cido nucleico. e modo geral, os mtodos e extrao consistem dos seguintes passos1 2. ruptura dos tecidos atravs da moagem de tecidos congelados na presena de nitrog$nio l%quido ou gelo seco. 3. liberao de componentes celulares num tampo de moagem por lise das membranas com detergentes (4 4, sodium dodecil sufato5 ou 67!8, cetiltrimetilamonio brometo-. 9 tampo de extrao deve possuir p: entre ;,< e =,<, desfavorvel > ao de nucleases. ?. inativao de nucleases por esses detergentes e agentes quelantes (, 7!, et'ilenodiamonotetraacetato-. ,ste agente quelante imobili0a cations de @g, que so cofatores para vrias endonucleases. ! emulsificao da mistura de tampo e tecido com fenol ou clorof/rmio leva a desnaturao das prote%nas. Na extrao de N! de plantas, utili0a-se o PAP (polivinilpirrolidona- por possuir efeito antioxidante, e adicionado para evitar a oxidao de polifen/is. 9 agente redutor -mercaptoetanol inibe a atividade de peroxidases e polifenoloxidases. B. remoo dos res%duos celulares e precipitao das prote%nas por centrifugao. ! desproteini0ao obtida atravs de um tratamento com fenol ou clorof/rmio, pois esses solventes Crganicos desnaturam as proteinas e en0imas, e so separadas ap/s centrifugao, permanecendo na interface entre a fase aquosa (superior- contendo as cidos nucleicos e a fase Crganica (inferior-. !lguns protocolos incorporam proteases (proteinase D- para facilitar a separao do N! das prote%nas da cromatina.

E. F.

recuperao dos cidos nucleicos totais por precipitao em lcool (etanol ou isopropanol-. eliminao do #N! por digesto com #N!se, ou separao de #N! e N! por solubilidade diferencial em sais. 4ob condies de alta concentrao de sias (,x. G,E @ de !cetato de 4/dio-, N! e os #N! pequenos (principalmente t#N!- permanecem em soluo, enquanto que #N! (H que F< bases- precipita.

9s cidos nucleicos so poliInions solJveis em gua. 9s sais de s/dio e potssio de cidos nucleicos so insolJveis na maioria dos solventes orgInicos, incluindo numa mistura de etanol e gua, mas eles no so desnaturados por solventes orgInicos. 9 detergente catiCnico 67!8 solubili0a membranas celulares, e dependendo da concentrao de Na6l no tampo, 67!8 forma um complexo com o N!, e utili0ado para precipitar N! seletivamente. Para extrao de #N!, comum tratar as solues com dietil pirocarbonato ( ,P6- de forma a desnaturar #N!ses. ,ntretanto, em certos casos e situaes, apenas a estereli0ao em autoclave & suficiente para inativar ribonucleases. No necessrio tratar o tampo de extrao. 7odos os tubos de centr%fugas, cadin'os, almofari0, pipetas (plsticas ou de vidrodevem ser autoclavadas e secas antes do uso, ou tratados com ,P6. 9 uso de luvas obrigat/rio na preparao e manipulao de #N! para evitar a contaminao pelas nucleases da pele. Para anlise de N!, utili0ando a digesto por en0imas de restrio (ex. #*KP-, existe a necessidade de obter-se N! de boa qualidade. 6ontaminantes (polifen/is, polissacar%deos etc.interferem na atividade dessa en0imas, redu0indo a efici$ncia. ! contaminao por polissacar%deos consiste na principal contaminao afetando a pure0a do N! extra%do de plantas. ,sses carbo'idratos podem inibir a atividade de vrias en0imas usadas em manipulaes biol/gicas de N!, tais como ligases, polimerases, e en0imas de restrio. ! maioria dos mtodos de extrao empregados no separam eficientemente o N! dos polissacar%deos, provavelmente devido a similaridade estrutural entre esses dois tipos de pol%meros. ! contaminao por polissacar%deos depende da espcie, tecido, condies fisiol/gicas da planta amestrada, etc. 6ertas espcies )produ0em) um N! muito contaminado por polissacar%deo, tomando dif%cil a ressuspenso do pelet. Aer exemplo no trabal'o de *ang et al. (l==3-. Arios mtodos tem sido propostos tentando superar esse problema. ! contaminao por fen/is, e a consequente oxidao do N!, pode ser evitada agregando PAP, -mercaptoetanol ao tampo de extrao. ,m casos extremos, o composto dietilditiocarbamato (<,2 @- pode ser adicionado. 9s mtodos de extrao de N! mais antigos empregavam gradientes em 6s6l, que produ0em N! de alta qualidade, mas so caros e trabal'osos, requerendo uma ultracentr%fuga. 4olues com alta concentrao de cloreto de csio (E @- formam um gradiente de densidade sob alta centrifugao, e o sal de csio de N! possui uma densidade intermediria entre os extremos de concentrao (e portanto de densidade- desse gradiente. L poss%vel a separao de #N! do N!, assim como espcies de N! com densidade diferente devido a composio de bases, estrutura terciria etc. ,sses mtodos de extrao de N! necessitam de maiores quantidades de tecido, um problema quando se trabal'a com um grande nJmero de indiv%duos em anlises genticas. @ais recentemente, com o advento do P6#, vrios mtodos foram propostos, que utili0am pouca quantidade de tecido na extrao, resultando num N! com qualidade inferior,

mas bem aceitveis. ! maior parte dos protoclos de extrao dispon%veis derivam basicamente do mtodo descrito pro ellaporta et al. (2=;?- e aqueles que utili0am o detergente 67!8 (brometo de 'exadeciltetrametilamCnio-, ( oMle e oMle, 2=;G-, onde o N! solJvel sob altas concentraes de sal. Para maiores detal'es consultar 8rasileiro e 6arneiro (2==;-. PROTOCOLO DE EXTRAO DE DNA DE PLANTAS1 9 N! de plantas ser extra%do de acordo com protocolo modificado de oMle e oMle (l==<-. ,sse mtodo foi adaptado de um mtodo proposto por 4ag'ai-@aroof et al. (2=;B-. Ker consideraes em *erreira e +rattapaglia (2==E- (pg 232 a 2?=-. @todo de oMle e oMle1 2 . 6oletar as amostras de fol'as &ovens e saudveis das plantas, evitando reas atacadas por pragas e doenas. e modo geral deve-se lavar as fol'as em gua corrente, usando, sempre que necessrio gua sanitria e"ou sabo. ,nxaguar, e em seguida rinsar em gua destilada, e secar com papel toal'a. ,sse material pode ser congelado, liofili0ado, seco em estufa a aproximadamente Bo6, ou usado diretamente. 3. Ntili0ar cerca de 2E< mg de lIminas de fol'a frescas ou E< mg de fol'as liofili0adas ou secas. !s amostras sero trituradas em almofari0 na presena de nitrog$nio l%quido. Nma possibilidade utili0ar discos foliares cortados com a tampa dos microtubos ,ppendorf de 2,E ml. 9 material pode ser triturado em cadin'o e transferido para o tubo, ou diretamente no tubo usando um micro-pistilo. ?. 9 material ser transferido para um tubo de centr%fuga, e FE< 2 do tampo de extrao ser adicionado1 10 ml 2% CTAB 0,2 g do produto 1.4 M NaCl 2,8 ml do estoque 5 M NaCl 100 mM Tris- Cl !p 8,0" 1 ml estoque 1 M Tris Cl p 8,0 20 mM #$TA, p 8,0 400 l do estoque 0,5 M #$TA, p 8,0 1% poli%i&ilpirrolido&a M'10,000 0,1 g do produto !dicionar a uma al%quota do tampo a ser usado, pouco antes do uso1 <,3 O -mercaptoet'anol E< g ml-l de proteinase D B. @isturar os tubos em vortex, e coloc-los em ban'o-maria a EEo6 por F< minutos. E. !dicionar FE< l de clorof/rmio1lcool isoamil (3B12- e misturar at formar uma emulso.

F. @icrocentrifugar a soluo por E minutos a 23<<< rpm. G.. 6oletar a fase aquosa superior e transferir para um novo tubo, com cuidado para no pipetar a interfase. 6aso o volume da fase superior no for superior > fase intermediria com fragmentos de tecido, adiconar mais tampo e misturar vigorosamente e re-centrifugue. ;. !dicionar 3<< l.tubo-2 do tampo de extrao sem proteinase D e -mercaptoetanol, e adicionar FE< l de clorof/rmio1lcool isoamil (3B12-, misturando at formar uma emulso. =. @icrocentrifugar a soluo por E minutos a 23<<< rpm. 2<. 6oletar a fase aquosa superior e transferir para um novo tubo, com cuidado para no pipetar a interfase. 22. #epetir esses tr$s passos anteriores mais uma ve0. 23. 6oletar a fase aquosa superior e transferir para um novo tubo, e adicionar um volume igual de isopropanol. 2?. 6entifugar o N! por E minutos a 23<<< rpm. 2B. Kavar o pellet com 2 ml de ,tanol G<O para remover sais por duas v$0es, e secar ao ar ou sob vcuo num dessecador. 15. #essupender o N! em 3< l de tampo 7, contendo ribonuclease P#N!seQ (2< g.ml-l-. ! #N!se deve ser fervida dependendo da origem comercial. Arias preparaes so contaminadas por N!ses, que so inativadas pela fervura, enquanto que as #N!ses no so (demonstrando a resist$ncia dessas en0imas-. ,m geral prepara-se estoque dissolvendo 2<< mg de #N!se em 2< m@ de 7ris-:6l (p: G,E- e 2E m@ Na6l5 aquecer em gua fervente por 2E minutos e resfriar lentamente a temperatura ambiente. *a0er al%quotas de 2 ml e arma0enar a R3<o6. EXTRAO DE DNA DE FUNGOS1 9 N! de fungos ser extra%do de acordo com dois protocolos1 o primeiro utili0a tampo com 67!8, proposto por Solan e PuTTila (l=;F-5 e o segundo foi proposto por #aeder e 8roda (2=;E-. ! extrao de N! de fungo pode ser considerada mais simples do que de plantas, devido ao menor quantidade elou nJmero de compostos secundrios, mas a contaminao com carbo'idratos tambm poss%vel. @todo de Solan e PuTTila (2=;F2. Nsar miclio liofili0ado, crescido em meio de cultura l%quida 3. @oer o miclio seco na presena de nitrog$nio l%quido. ?. 7ransferir o miclio mo%do para tubo de microcentr%fuga (cerca de 3< a B< mg-. B. !dicionar E<< gl de tampo de extrao1 2O 67!8 <,G @ Na6l 3< m@ 7ris :6l p: ;,< 2< m@ , 7! 2O -mercaptoetanol

@isturar bem em vortex e manter por ?< minutos a temperatura ambiente. @isturar ocasionalmente. F. !dicionar E<< l de clorof/rmio1alc/ol isoamil (3B12-. @isturar at formar uma emulso por inverso e centrifugar por E minutos a 23<<< rpm. G. 7ransferir a fase aquosa (superior- para um tubo novo. ;. #epetir esse passo por mais 3 ve0es. =. !dicionar um volume igual da fase aquosa de isopropanol para precipitar os cidos nucleicos. 2<. 6entrifugar o N! por E minutos a 23<<< rpm. 11. Kavar o pellet com E<< l de ,tanol G<O para remover sais por duas v$0es, e secar ao ar ou sob vcuo num dessecador. 23. #essupender o N! em E< l de tampo 7, contendo ribonuclease P#N!seQ (2< g.ml-l-. 2?. Uncubar a ?Go6 por ?< minutos 2B. !nalisar a qualidade do N! obtido em gel de agarose @todo de #aeder e 8roda (2=;E-. 2. Nsar micllo liofili0ado, crescido em meio de cultura l%quida. 3. @oer o miclio seco na presena de nitrog$nio l%quido. ?. 7ransferir o miclio mo%do para tubo de microcentr%fuga (cerca de 2<< mg4. !dicionar GE< l de tampo de extrao1 3E< m@ Na6l 3<< m@ 7ris :6U p: ;,< 3E m@ , 7! <,EO 4 4 E. @isturar bem em vortex e incubar a FEo6 por 3< minutos. @isturar ocasionalmente. (. Adi)io&ar 4*5 l de +e&ol equili,rado - 225 l de )loro+.rmio. Misturar at/ +ormar uma emuls0o por i&%ers0o. G. 6entrifugar por E minutos a 23<<< rpm. ;. 7ransferir a fase aquosa (superior- para um tubo novo. =. !dicionar <,F volumes da fase aquosa, de isopropanol para precipitar os cidos nucleicos. 2<. 6entrifugar o N! por E minutos a 23<<< rpm. 11. Kavar o pellet com E<< l de ,tanol G<O para remover sais por duas ve0es, e secar ao ar ou sob vcuo num dessecador. 23 #essupender o N! em E< l de tampo 7, contendo ribonuclease P#N!seQ Q (2< g.ml-l-. 2?. Uncubar a ?Go6 por ?< minutos 2B. !nalisar a qualidade do N! obtido em gel de agarose

ESTIMATIVA DE CONCENTRAO DE DNA ! estimativa da concentrao de N! depende do tipo e quantidade de amostra dispon%vel. Para amostras com certo grau de pure0a, com baixo n%vel de contaminao por prote%nas, fen/is, polissacar%deos, alc/ol, ou outros cido nucleicos, a estimativa por espectrofotCmetro, medida pela absorbIncia das bases a 3F< nm consiste num mtodo simples, rpido e com certa preciso. Para quantificao de N!, as leituras devem ser feitas entre 3?< nm at ?3< nm. ! leitura a !3F<nm permite o clculo da concentrao da cidos nucleicos na amostra. Nma 9 ( ensidade /ptica- de l corresponde aproximadamente a E< g ml-2 para N! dupla fita, B< g ml-2 para N! e #N! fita simples, e cerca de 3< g ml-2 para oligonucleot%deos. ! relao entre !3F<nm e !3;<nm ( 93F<" 93;<- fornece uma estimativa da pure0a dos cidos nucleicos. 4olues puras de N! e #N! possuem valores de 93F<" 93;< entre 2,; e 3, respectivamente. 4e existe contaminao com fenol ou prote%nas, a relao 9 3F<" 93;< ser muito menor, e a preciso nas quantidades de cidos nucleicos ser baixa. 9 uso de protocolos de extrao de N! simplificados, que utili0am pouco material de origem, ou possuem poucos passos de purificao, tendem a produ0ir cidos nucleicos com maior contaminao. ,m plantas tropicais, existe um grande problema de contaminao com polifen/is e polissacar%deos. Nesses casos, a estimativa por espectrofotometria no permitem uma determinao acurada da concentrao de N!. Nesse caso, o mtodo de escol'a consiste na fluorometria. ! amostra de N! a ser estimada tratada com um corante espec%fico para N! dupla fita (ex. :oec'st ??3E;-, e esse corante excitado a um comprimento de onda (?FE nm- e com emisso a BF< nm proporcional a concentrao de N!. #N!, prote%nas e nucleot%deos no afetam as leituras. (ver descrio na pgina 23B-23E de *erreira e +rattapaglia, 2==E-. 9utros mtodos empregados utili0am a cartacter%stica da fluoresc$ncia em ultravioleta indu0ida pela intercalao de brometo de et%deo na dupla fita de N!. ! fluoresc$ncia proporcional a concentrao de N!, e pode-se determinar a quantidade de N! numa amostra por comparao com padres con'ecidos. ! comparao de fluoresc$ncia pode ser feita num mini-gel, que permite tambm a separao de N! do #N!. Nma outra possibilidade aplicar a amostra num placa de petri com 2O agarose contendo brometo de et%deo (<,E mg ml-2-, e comparar com padres. @anter a placa a ?GV6 por cerca de ?< minutos e observar no transiluminador. (usar <,E g de agarose 2O em E< ml de tampo 7!,, adicionar E l de brometo de et%deo 2< mg"ml e analisar al%quotas de 3 microlitros-. ESPECTROFOTOMETRIA Nessa prtica utili0aremos o espectrofotCmetro, gel de agarose, fluorCmetro e placa de Petri com padro. 2. 3. ?. B. Kigar o espectrofotCmetro 2E minutos antes. 6olocar o comprimento de onda para ?3< nm. *a0er uma soluo dilu%da em gua da amostra de N! (212<<, 21 E<<, ou at 21 2<<<-. Serar o instrumento com gua em !bs?3<nm. *a0er leituras de !bs3?<nm, !b43F<nm, !bs3;<nm e !bs?3<nm

E.

,stimar a concentrao de N! pela f/rmula (!bs3F<nm !bs?3<nm- x E< x fator de diluio W P N!Q em g ml-2

9bs. ,xiste um superestimativa da concentrao por espectrofotCmetro devido a impure0as na soluo. F. *a0er um estoque de trabal'o com a concentrao de E ng l-2

FLUOROMETRIA1 *luorCmetro1 9 equipamento que usaremos ser o :oefer MN! Xuant 3<<, que um fotCmetro com filtro de fluoresc$ncia com uma fonte fixa de passagem de excitao a ?FE nm e um filtro de passagem de emisso a BF< nm. ,le foi desen'ado para a quantificao de baixas concentraes de N! usando o corante c'amado de :oec'st ??3E;, tambm c'amadao de bisben0imida. 9 corante :oec'st ??3E; apresenta alteraes nas caracter%sticas de fluoresc$ncia na presena de N!, que permite a estimativa da concentrao na soluo. Na aus$ncia de N!, o espectro de excitao do corante :oec'st ??3E; possui um pico a ?EF nm e o espectro de emisso possui um pico fraco a B=3 nm. Xuando :oec'st ??3E; liga-se ao N!, esses picos movem-se para ?FE nm de excitao e BE; nm de emisso. No poo da cuveta, a amostra exposta a lu0 filtrada (?FE nm Y G nm- de uma lImpada de mercJrio. ,ssa lu0 excita o complexo corante- N!, causando a lu0 a emitir um pico a BE; nm. 9 filtro de emisso colocado em frente ao fotodetector, permite apenas fluoresc$ncia de BF< Y 2E nm ser detectada. Portanto, a fluoresc$ncia medida um indicador direto da concentrao de N!. ! medida de fluoresc$ncia no uma unidade absoluta e sim relativa a um branco e a um padro com concnetrao con'ecida. 2. Preparar as so !"#es necessrias para o ensaio e a soluo N!49KN\],4 ,479XN,4 7ampo 2< x 7N, 4oluo ,stoque (2<< m@ 7ris, 2< m@ , 7!, 3 @ Na6l, 2<< ml7ris base (P@ W 232,2B2,322 g , 7!, sal diss/dico, di'idratado (P@ W ?G3,3<<,?G3 g Na6l 22,F;= g 6ompletar volume at G< ml com gua mX :6l concentrado at p: G,B 6ompletar volume at 2<< ml *iltrar antes do uso (<,BE m-. !rma0enar a Bo6 por at ? meses. N! padro (Zcalf t'Mmus[

4oluo de 6orante :oesc't ??3E; ( 2mg"ml-

N4, @^46!#! , KNA!4 :oesc't ??3E; 2< mg ^gua mX 2< ml No filtrar. !rma0enar a Bo6 por at F meses protegendo da lu0. Padro de N! Zcalf t'Mmus[ (2<< g"ml4oluo estoque 2 mg"ml de padro 2<< l 2< x 7N, 2<< l ^gua mX ;<< l So !"$o %e Tra&a 'o ( ) TNE *a+)a ,o-,e-.ra"$o /A0 (concentrao final do N! a medir entre 2< a E<< ng"ml<,2 g"ml de : ??3E; em 2 x 7N, (<,3 @ Na6l, 2< m@ 7ris-6l, 2 m@ , 7!, p: G,Bsoluo estoque de : ??3E; 2< x 7N, ^gua mX destilada 2< l 2< ml =< ml

3. 1erar o +-s.r!2e-.o. Prepare um branco usando 3 ml da soluo de trabal'o ! (baixa concentrao-. 4eque o lado da cubeta com leno de papel. Unsira a cubeta no poo, fec'e a tampa, e aperte o boto 31ERO4. epois que aparecer < no displaM, remova a cubeta. 1. Ca +&rar o +-s.r!2e-.o. !plique 3 l da soluo de N! padro nos 3 ml de 4oluo de 7rabal'o !. @isture com pipetagem vrias ve0es. 6oloque a cubeta no poo, fec'e a tampa e aperte o boto 3CALI*4. igite 2<< e aperte _ENTERH. epois que o valor aparecer no displaM, remova a cubeta. B. 1erar o +-s.r!2e-.o. #etire a cubeta, esva0ie e rinse. 4eque a cubeta sobre leno de papel. !dicione 3 ml da soluo de trabal'o ! (baixa concentrao- .Unsira a cubeta no poo, fec'e a tampa, e aperte o boto 31ERO4. epois que aparecer < no displaM, remova a cubeta. 5. Ler a a2os.ra. !dicionar 3 l da amostra e misture bem. 6oloque a cubeta no poo, fec'e a tampa e registre a leitura. F. Ler as a2os.ras s!&se5!e-.es. #epetir os passos B e E para cada amostra. Umportante1 - ligue o instrumento 2E minutos para estebili0ar alImpada antes de medir - use luvas pois o corante pode ser mutag$nico. - 7oda as solues devem estar > temperatura ambiente antes de medir a fluoresc$ncia - Preparar soluo de trabal'o fresca para uso do dia - *iltrar o tampo 7N, antes de acrescentar o corante

GEL ELETROFORESE ! eletroforese em gel permite o fracionamento eficiente da cidos nucleicos, e possui um importante papel anal%tico, e as ve0es um papel preparativo. ! matri0 de separao usada normalmente agarose e seus derivativos. 9utra possibilidade empregada o gel de poliacrilamida, usada normalmente para o fracionamento de molculas de baixo peso molecular (i.e. _ 2 Tilopares de base-. 9 poder de resoluo da poliacrilamida permite a deteco de diferenas de taman'o de at um par de base, comumente usada em gis de sequenciarnento e microssatlites. !lgumas aplicaes sero mencionadas na prtica sobre mercadores moleculares (ex. ++,, 446P etc.-. 9s gis podem ser nativos (sem tratamento- ou desnaturantes (com a adio de urea, formamida etc.- para evitar a formao de estruturas secundrias, evitando a interfer$ncia na mobilidade atravs do gel. 9s cidos nucleicos migram com base nas diferenas de peso molecular. e modo geral, todos cidos nucleicos possuem aproximadamente uma densidade de carga por base, e a conformao da molcula em geral semel'ante.. Portanto, a dificuldade de penetrao no gel proporcional ao peso molecular. ! mobilidade aproximadamente inversamente proporcional ao logaritmo do peso molecular. ParImetros afetam a mobilidade do N! em gel eletroforese 2 . 6oncentrao de agarose1 com a maior concentrao de agarose, a separao de fragmentos maiores redu0ida. @enores concentraes facilitam a separao de fragmentos de maior peso molecular. ! faixa de trabal'o encontra-se entre <,EO at 3O de agarose. 3. +radiente de voltagem1 expressa em A"cm. 6onsiste no ponto cr%tico na separao de fragmentos de N!. 6orrendo um gel sob alto gradiente, redu0 tremendamente a separao de fragmentos de alto peso molecular, apesar de ser aceitvel us-lo para c'ecar a qualidade de digesto (teste mais rpido-. ,ntretanto, a separao t%pica de digestes usando en0imas de restrio mel'or condu0ida a baixos gradientes (l a 3 A"cm- por toda a noite. 9 problema consiste na difuso dos fragmentos de baixo peso molecular (_2 Tpb- e resultam em bandas menos distintas. ,sses fatores devem ser considerados dependendo do uso e anlise. 6omo aproximao, a distIncia de migrao de um fragmento de N! proporcional ao log do seu taman'o. !o plotar migrao por peso num papel semi-log (antigamente.-, obtin'a-se uma curva padro com o peso dos fragemtos e peso descon'ecido. L sempre recomendvel incluir padres de peso molecular em todos os gis.

Preparao de +el de !garose1 Preparar gel de <,G a l O para analisar qualidade e quantidade do N! 2. Pesar l g de agarose por 2<< ml de tampo de corrida l x 7!, (estoque E<x- num erlenmeMer e cobrir com vidro ou plstico e nunca papel alum%nio. 3. !quecer por cerca de 3 minutos em forno de microondas at ferver. ?. @isturar com cuidado, pois a soluo ferve para fora do frasco. B. ,sperar a soluo esfriar at cerca de E<o6 (ponto que tolere encostar na sua pele-, para evitar danos > forma do gel. E. Aerter o gel na forma fec'ada nas extremidades e com o pente em posio. F. ,sperar esfriar e remover bol'as com ponteiras. G. #emover o pente com cuidado (levantar um lado primeiro com cuidado.;. 6olocar o gel na cuba e completar o volume do tampo at cobrir o gel =. ,nquanto isso, preparar as amostras a serem carregadas no gel 10. !dicionar o volume necessrio de amostra num tubo (2 a E l-, e acrescentar o tampo de amostra (2 l- contendo a0ul de bromofenol. ! funo do tampo da amostra aumentar a densidade (com glicerol ou sucrose-, e o a0ul de bromo fenol corre no gel com taman'o equivalente a ?<< pares de base. 22. 7ransferir as amostras para os poos do gel 23. 6onectar os eletrodos > fonte e ligar. 9s cidos nucleicos encontram-se no p: do tampo 7!, carregados negativamente e migram para o positivo - correm para o vermel'o. 2?. !p/s a corrida, transferir o gel para uma bande&a contendo brometo de et%deo em gua (2< l de uma soluo 2< mg"ml de brometo de et%deo em E<< ml de gua- e agitar com cuidado por 3< minutos - 8#9@,79 , ,7` ,9 L 6!#6UN9+aNU69 , @N7!+aNU69 - N4, KNA!4 4,@P#, XN!N 9 @!NUPNK^-K9. 9bservar sob lu0 ultravioleta no transiluminador. 9bservar a presena de rastros indicadores de #N!5 formao de banda simples de N!5 comparar a intensidade das bandas das amostras5 detectar a presena de degradao e"ou contaminao nas amostras.

2B.

Re6er7-,+as ellaporta, 4.K.5 bood, c. e :icTs, c.8. 2=;?. ! plant N! minipreparation1 version UU. Plant @olecular 8iologM #eporter 212=-32. oMle, c.c. e c.K. oMle. 2=;G. ! rapid N! isolation procedure for small quantities of fres' leaf tissue. P'Mtoc'emical 8ulletin 2=122-2E. oMle, c.c. e c.K. oMle. 2==<. Usolation of plant N! from fres' tissue. *ocus 2312?-2E. *ang, +., :ammar, 4. e +rumet, #. 2==3. ! quicT and inexpensive met'od for removing polMsacc'arides from plant genomic N!. 8iotec'niques 2?(2-1E3-EB. #aeder, N. e 8roda, P. 2=;E. #apid preparation of N! from filamentous fungi. Ketters in !pplied @icrobiologM 21 2G-3<. 4ag'ai-@aroof, @.!., 4oliman, D.@., corgensen, #.!., e !llard, #.b. 2=;B. Proc. Natl. !cad. 4ci (N4!- ;21;<2B. billiams, c.+.D., DubeliT, !.#., KivaT, D.c., #afalsTi, c.!. and 7ingeM, 4.A. 2==<. N! polMmorp'isms amplifled bM arbitrarM primers are useful genetic marTers. Nuclei !cids. #es. 2;, FE?2-FE?E. Solan, @. e PuTTila, P. 2=;F. Un'eritance of N! met'Mlation in Coprinus cinereus. @ol. 6ell 8iol. F12=E-3<<