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Contrle des produits nologiques : utilisation de l'lectrophorse capillaire.

CHAUVET S.(1), MDINA B.(1), PROTON B.(2) (1) Laboratoire Interrgional D.G.C.C.R.F., 351 cours de la libration, 33405 Talence cedex. labo33@dgccrf.finances.gouv.fr (2) D.G.C.C.R.F., Bureau D2, 59 boulevard Vincent Auriol 75703 Paris cdex 13. D2@dgccrf.finances.gouv.fr

L'utilisation des produits nologiques est strictement rglemente. La rglementation a pour but de garantir la scurit des consommateurs et de favoriser un bon droulement des vinifications ainsi qu'une bonne conservation des vins leur assurant ainsi une qualit satisfaisante.

nombre d'units de production apparaissent de plus en plus ncessaires ainsi que la parfaite connaissance des produits nologiques utiliss et la traabilit complte des traitements raliss en aval. L'emploi des produits nologiques est ancien. Aussi les mthodes de contrle utiliser n'intgrent-elles pas toujours les avances ralises au cours de ces vingt dernires annes par la chimie analytique. La refonte du codex nologique en cours depuis plusieurs annes l'O.I.V. cherche tenir compte la fois de ces progrs et de l'volution des produits nologiques. Les mthodes sparatives modernes sont encore cependant peu employes pour contrler la composition et mesurer l'efficacit des produits nologiques. En ce sens, il nous est apparu intressant d'appliquer l'lectrophorse capillaire ces contrles.

Aspect rglementaire

Les principaux textes rglementaires applicables aux produits nologiques sont les suivants : Le rglement CE n 1493/1999 qui porte sur l'organisation du march vitivinicole en listant les pratiques nologiques et leurs buts. Au titre V, chapitre I, Pratiques et traitements nologiques, Article 42, 2me alina de ce mme rglement, il est prcis : Les pratiques et traitements nologiques autoriss ne peuvent tre utiliss qu'afin de permettre une bonne vinification et une bonne conservation ou un bon levage du produit. Le rglement CE n1622/2000 du 24 juillet 2000 qui fixe les modalits d'application du rglement CE n1493/1999 et instaure un code communautaire des pratiques et traitements nologiques. L'arrt du 2 octobre 1997 modifi, relatif aux additifs pouvant tre employs dans la fabrication des denres destines l'alimentation. Cet arrt transcrit en droit franais notamment la directive 95/2/CE du 20 fvrier 1995 modifie sur les additifs autres que les colorants et les dulcorants et la directive 96/77/CE du 2 dcembre 1996 modifie sur les critres de puret spcifiques de ces additifs. Il s'applique aux seuls produits nologiques qui sont aussi des additifs alimentaires. Le codex nologique international et le code international des pratiques nologiques de l'O.I.V. qui contiennent des recommandations fixes par des experts internationaux, membres de l'office international du vin qui prennent en compte les usages de leur pays.

L'lectrophorse capillaire

3.1- Principe L'lectrophorse capillaire permet de sparer et de quantifier des soluts sous les effets de deux forces simultanes de mme sens ou de sens opposs. Ces forces sont dues : au champ lectrique, au flux lectroosmotique. Pour qu'un solut soit attir par un champ lectrique, il est ncessaire qu'il prsente une ou plusieurs charges lectriques, il doit donc tre sous forme ionise. Sous l'effet du champ lectrique, le sens de dplacement d'un solut dpend de la nature de sa charge lectrique et sa vitesse de dplacement est proportionnelle sa mobilit lectrophortique relle. Le flux lectroosmotique est un phnomne de transport des molcules de solvant d l'ionisation de la silice en contact direct avec le tampon de sparation. Suivant la constitution de la surface interne du capillaire et de son mode de remplissage, il est possible de sparer au choix des soluts en fonction de leur rapport masse sur charge, leur hydrophobicit, leur encombrement strique, leur chiralit, leur point isolectrique et leur affinit pour une phase donne, cela confre cette technique une trs grande souplesse.

Caractristiques des produits nologiques

Des essais raliss sur du vin au laboratoire dans les conditions aussi proches que possible de la pratique, seraient cependant des sources d'informations complmentaires voire indispensables pour s'assurer de la russite des futurs traitements et de l'absence de contaminations ventuelles. De la mme faon les dmarches qualit entreprises par bon

Les principaux avantages de cette technique sont le grand pouvoir de sparation de trs nombreux types de molcules, la rapidit et l'application de plusieurs principes de sparation avec le mme quipement pour un trs faible cot de fonctionnement. De plus, les champs lectriques peuvent tre produits avec une trs grande prcision et une forte intensit. Le principal inconvnient est parfois le manque de sensibilit pour certains composs qui n'absorbent pas dans l'ultraviolet ou qui ne fluorescent pas.

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A N A LY S E
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D'une faon gnrale le Codex nologique de l'O.I.V. fixe pour chaque produit tout ou partie des exigences suivantes : aspect, critres d'identification, solubilits dans des solvants appropris, teneurs en matires sches, absences ou limites en substances dangerosit reconnue, impurets classiques pour le produit en question, absence de conservateurs ou prsence en quantit limite, proprits physiques et bactriologiques et tests d'efficacit vis vis de solutions modles. Pour certains produits des rsultats maximum ou minimum obtenus pour les tests raliss sur des solutions autres que le vin.

L'appareillage est constitu d'un capillaire dont chacune des extrmits plonge dans un flacon o une lectrode est immerge. Les deux lectrodes sont relies un gnrateur lectrique. Chaque appareil ainsi constitu possde un systme d'injection (par pression, dpression ou lectrique) et un systme de dtection (optique, potentiomtrique, dtecteur de masse etc). Le schma de principe est donn dans la figure 1 (voir page suivante).

Systme d'injection Haute tension +

4.1.2- Conditions lectrophortiques Injection : pression 0.5 psi pendant 5 10 secondes Tampon : distribu par Agilent Technologies organic acids buffer for HPCE, rfrence 8500-6785. Capillaire : silice nue, longueur : 57 cm, diamtre intrieur : 50 m (prpar au laboratoire) Voltage : 18 KV Polarit du ct du dtecteur : positive Dtection : en UV inverse 214 nm Temprature : 30C Les signaux produits (on parle d'lectrophrogramme) sont donns dans la figure 2.
Absorbance

Cathode

Anode

Capillaire
Traitement des donnes

Dtecteur UV

Figure 1- Schma dun appareil dlectrophorse capillaire

0,002

3.2- Produits nologiques contrlables par lectrophorse capillaire Actuellement l'lectrophorse capillaire permet de contrler la puret de 16 produits nologiques. Ceux-ci sont ioniss en solution aqueuse et spars des autres ions de mme charge constituant des impurets. phosphate diammonique sulfate d'ammonium tartrate neutre de potassium sorbate de potassium bi tartrate de potassium tartrate de calcium sulfate de calcium acide tartrique acide sorbique acide citrique casine casinate de potassium ovalbumine lactoalbumine di chlorhydrate de thiamine tanins. La mise au point des mthodes a t dveloppe pour que souvent, une seule mthode permette de vrifier plusieurs produits nologiques appartenant la mme famille chimique. Elle peut tre utilise sur le vin ou d'autres produits (2).

1 = chlorure 2 = sulfate 3 = oxalate 4 = tartrate 5 = malate 6 = phosphate

4 5 2 3 6

2 3,5 Figure 2- Electrophrogramme d'anions

5 mn

4.2- Contrle de la puret de l'acide sorbique ou du sorbate de potassium Cette mthode permet le dosage des ions sorbates dans l'acide sorbique et le sorbate de potassium (mthode utilise au laboratoire pour doser les conservateurs dans les produits alimentaires). 4.2.1- Prparation des chantillons et des standards Les chantillons de sorbate de potassium sont solubiliss dans l'eau ultra pure une concentration voisine de 0.2 g/l puis filtrs sur une membrane au seuil de coupure de 0.45 m. Solution d'talon interne d'acide hippurique 1 g/l dans l'eau ultra pure. Solution de rfrence 250 mg/l de sorbate de potassium. Prparation de la solution injecter : dans une fiole de 50 ml introduire : 2 ml de la solution d'talon interne, 2 ml de la solution analyser ou 2 ml de la solution de rfrence, complter le volume 50 ml avec de l'eau ultra pure puis homogniser et filtrer sur membrane. 4.2.2- Conditions lectrophortiques Injection : pression 0.5 psi pendant 2 secondes Tampon : 5 mM de phosphate monosodique Prolabo Rectapur + 5 mM de phosphate disodique Prolabo R.P Normapur Capillaire : silice nue, longueur : 57 cm, diamtre intrieur de 75 m ou 27 cm de 50 m. (prpar au laboratoire) Voltage : 20 KV Polarit du ct du dtecteur : ngative Dtection : en UV 214 nm ou 235 nm Temprature : 35C L'lectrophrogramme correspondant est donn dans la figure 3.

Mthodes

4.1- Produits nologiques trs faible absorbance dans l'ultraviolet La mthode de dosage des principaux anions des vins (en cours de validation au laboratoire (4)) permet galement de contrler la puret des produits nologiques, cette mthode est applique : Dosage des ions sulfates dans le sulfate d'ammonium et dans le sulfate de cuivre Dosage des ions phosphates dans le phosphate diammonique Dosage des ions tartrates dans le tartrate neutre de potassium, le tartrate de calcium, le bi tartrate de potassium et l'acide tartrique Dtermination de la puret de l'acide citrique Recherches d'impurets sous formes d'ions oxaliques, chlorures, sulfates, tartriques, citriques et phosphoriques dans les produits nologiques sous formes de sels ou d'acides. 4-1-1- Prparation des chantillons et des standards Les chantillons sont solubiliss dans l'eau ultra pure une concentration voisine de 1 g/l avant d'tre filtrs sur une membrane au seuil de coupure de 0.45 m. Cette solution mre est ensuite dilue 50 fois puis injecte. Solution talon d'acide organiques 20 mg/l (ref).

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Absorbance 0,04 Acide salicylique

4.4.2- Conditions lectrophortiques Injection : pression 0.5 psi pendant 5 10 secondes Tampon : distribu par Beckman Coulter C E Buffer 100, rfrence 664-1000 Capillaire : silice nue, longueur : 27 cm, diamtre intrieur : 20 m Voltage : 25 KV Polarit du ct du dtecteur : ngative Dtection : en UV 214 nm Temprature : 25C Les profils obtenus sont donns dans les figures 5 et 6.
Absorbance 0,02

Acide benzoque 0,02 Acide sorbique

Etalon interne

0 5,0

7,5

10,00

mn

Figure 3- Electrophrogramme de conservateurs

Ovalbumine normale

4.3- Contrle de la puret de la thiamine Le dosage des ions de chlorhydrate de thiamine s'effectue directement. 4.3.1- Prparation des chantillons et des standards Les chantillons de thiamine sont solubiliss dans l'eau ultra pure une concentration voisine de 0.2 g/l avant d'tre filtrs sur une membrane au seuil de coupure de 0.45 m. Une solution talon de 10 mg/l de thiamine est prpare. 4.3.2- Conditions lectrophortiques Injection : pression 0.5 psi pendant 5 secondes Tampon : ttraborate de sodium 20 mM Prolabo R.P Normapur + SDS 30 mM Sigma rf L-3771 PH : 9.00 Capillaire : silice nue, longueur : 67 cm, diamtre intrieur : 50 m Voltage : 25 KV Polarit du ct du dtecteur : ngative Dtection : en UV 235 nm Temprature : 35 C L'lectrophrogramme est donn dans la figure 4.
0,0020 Absorbance 0 mn 0 2 4 Figure 5- Electrophrogramme d'ovalbumine normale Absorbance 0,02 Ovalbumine dgrade 0,01

0,01 0,0016

0,0012

0,0008 0 2 0,0004 4 mn

Figure 6- Electrophrogramme d'ovalbumine dgrade

4.5- Contrle de l'tat des casines, casinates et lactalbumines


0,0000 7,5 10,0 mn

Figure 4- Electrophrogramme de thiamine

4.4- Contrle de la puret et de la stabilit de l'ovalbumine Le profil protique obtenu par lectrophorse capillaire de l'ovalbumine permet de mettre en vidence l'absence de dgradation durant sa prparation ou sa conservation. 4.4.1- Prparation des chantillons La prparation du produit se rsume une dilution dans l'eau ultra pure pour obtenir une concentration finale de 10 g/l.

Le profil protique obtenu par lectrophorse capillaire des protines du lait de vache permet de vrifier leur puret ainsi que l'absence de dgradation durant la prparation ou la conservation (1). Cette mthode de contrle des laits est ici mise profit pour contrler ces produits nologiques base de lait. 4.5.1- Prparation des chantillons Les produits analyser sont mis en solution dans l'eau la concentration de 30 g/l. 1 ml de la solution obtenue est ajout 9 ml d'un tampon de dnaturation. Filtration aprs 1 heure d'attente sur membrane dont le seuil de coupure est de 0.45m.

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Composition du tampon de dnaturation : 73 mg de citrate tri sodique di hydrat (Fluka rf : 71405) + 18 g d'ure (Prolabo rf : 28 877.292) + 38 mg de DL dithiothritol pour lectrophorse ( Sigma rf D-913) et eau ultra pure en quantit suffisante pour un volume final de 50 ml. 4.5.2- Conditions lectrophortiques Injection : pression 0.5 psi pendant 30 secondes Tampon de sparation : citrate trisodique di hydrat 20 mM + ure 6 M et Hydroxy propyl methyl cellulose (Fluka rf : methocel 90 HG n 64480 ) 0.1 %. Solution de rfrence mlange de casine et de lactalbumine de lait : Capillaire : silice coate supelco hydrophobic P150, longueur 57 cm, diamtre intrieur : 50m. Voltage : 25 KV Polarit du ct du dtecteur : ngative. L'lectrophrogramme est donn dans la figure 7.
Absorbance 4 7

Polarit du ct du dtecteur : ngative Temprature : 35C Les diffrents lectrophrogrammes des tanins en fonction de leurs origines botaniques sont donns dans la figure 8
Absorbance 0,015 Pellicules

0,01

0,005

0 mn 2 4 Figure 8a- Tanin de raisins 6

Absorbance 6 0,04 2 5 0,02 1 3 0,005 0,01 0,015 Quebracho

0 0 20 1= 2= 3= 4= 40 mn mn 2 4 Figure 8b- Tanin de quebracho 6

7= ine BB 0,015

Absorbance

Figure 7- Electrophrogramme de lactalbumine et casines de lait

Noix de Galles 0,01

4.5.3- Discussion Le contrle est effectu ici par rapport la casine et permet de vrifier l'tat de la puret et/ou de dgradation ventuelle dans diffrents composants de la casine des produits nologiques. 4.6- Contrle des tanins nologiques Du fait de leur composition trs complexe, les tanins sont parmi les produits nologiques les moins bien dfinis. La composition de ces extraits est en relation avec la nature des vgtaux et les modes d'extractions utiliss pour leur obtention. Les ions de faible poids molculaire sont spars par lectrophorse capillaire et permettent de donner des profils caractristiques de leur origine botanique. 4.6.1- Prparation des chantillons Les tanins nologiques sont mis en solution dans l'eau la concentration de 1 g/l puis filtrs sur membrane dont le seuil de coupure est de 0.45m. 4.6.2- Conditions lectrophortiques Injection : pression 0.5 psi pendant 1 seconde Tampon : phosphate monosodique Prolabo rectapur 5 mM + phosphate di sodique Prolabo r.p normapur 5 mM Capillaire : silice nue, longueur 57 cm, diamtre intrieur : 50 m. Voltage : 20 KV

0,005

0 mn 2 4 Figure 8c- Tanin de galles Absorbance 0,015 Tara 0,01 6

0,005

0 mn 2 4 Figure 8d- Tanin de tara 6

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Absorbance 0,015 Chtaignier 0,01

4.7.1- Prparation de lchantillon Solution 1 g/l dans de leau pure. 4.7.2 Conditions lectrophortiques Tampon : Il est compos dacide phosphorique 80 mM et dhydroxy-propyl-mthyl-cellulose (H.P.M.C.) 0,1 %. Capillaire : - matriau : silice non revtue - diamtre intrieur : 75 m - longueur : 20 cm Diffrence de capillaire : 8 KV Polarit des lectrodes : charge ngative du ct dtection Temprature : 20 C Injection : 2 secondes 0.5 psi (figure 9 voir colonne prcdente). 4.7.3- Observations Absence dimpurets dans lchantillon analys ; cette mthode est en cours de validation pour le dosage directement dans les vins.

0,005

0 mn 2 Absorbance 0,015 Chne 0,01 4 6 Figure 8e- Tanin de chtaignier

Contrle de l'efficacit des produits nologiques


Absorbance

0,005 0.024 0 mn 2 4 Figure 8f- Tanin de chne 6 0.020

Figure 8- Electrophrogramme des tanins en fonction de leurs origines botaniques

0.016

4.6.3- Discussion Les profils obtenus permettent de diffrencier sans ambigut les tanins en fonction de leurs origines botaniques. On peut aussi classer les tanins nologiques en tanins condenss ou hydrolysables et diffrencier les tanins galliques des tanins ellagiques. Cette mthode rapide de tri vient complter les mthodes rcentes de caractrisation des tanins qui ont t adoptes par l'assemble gnrale de l'O.I.V. Brastislava en 2002 (Rsolution no12/2002). Cette mthode est en cours de dveloppement au laboratoire pour caractriser l'ajout de tanins nologiques au vin. 4.7- Le Lysozyme Le lysozyme ou muramidase est une protine qui prsente une activit N-acethylmuramide glycanohydrolase. Son point isolectrique est compris entre pH 10.5 et 11.0.
Absorbance 0.0800 0.020 0.012

0.008

0.004

0.000 20 30 40 50 60 70

mn Figure 10a- Sylvaner tmoin Absorbance

0.024

0.0600

0.016

0.012

0.0400 0.008

0.0200

0.004 0.000 -0.004 20 30 40 50 60 mn 70

0.0000 0.00 5.00 10.0 Figure 9- Exemple dlectrophrogramme obtenu du lysozyme

Figure 10b- Sylvaner tmoin aprs bentonitage 50 g/hl mn Figure 10- Electrophrogramme de protines du vin : influence de la bentonite.

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Les comparaisons des profils protiques des vins additionns de tanins, de bentonite ou de kaolin avec des tmoins non traits rendent compte de l'efficacit de ces traitements vis vis des protines des vins. La figure 10 montre les rsultats d'un collage la bentonite sur un vin de Sylvaner. Les dosages des acides et des conservateurs ainsi que la possibilit de trs bien sparer les acides amins, les peptides et les protines des vins par lectrophorse capillaire permettent de mesurer l'efficacit de bon nombre de traitements nologiques. 5.1- Effets des bentonitages sur les teneurs en protines solubles, efficacit de la bentonite vis--vis des protines des vins 5.1.1- Prparation de lchantillon Dialyse pendant vingt quatre heures contre de leau pure laide dune membrane Spectra/por 6 dont le seuil de coupure moyen correspond au poids molculaire 8000. 5.1.2- Conditions lectrophortiques Tampon : il est compos dacide phosphorique 80 mM et dhydroxy-propyl-mthyl-cellulose (H.P.M.C.) 0,1 %. Capillaire : - matriau : silice non revtue - diamtre intrieur : 75 m - longueur : 20 cm Diffrence de potentiel : 8 KV Polarit des lectrodes : charge ngative du ct de la dtection Temprature : 20 C Injection : 30 secondes 0.5 psi Observations : les lctrophrogrammes obtenus permettent dobserver, par comparaison avec ceux raliss sur le mme vin non trait, les proprits des bentonites dliminer partiellement ou compltement certaines protines.

Les sparations selon les encombrements striques des ions ou leur affinit pour une phase ne sont ralises que pour des travaux de recherches. L'utilisation de cyclodextrines est envisageable pour sparer les produits nologiques qui prsentent plusieurs enantiomres (tartrique, malique). La possibilit d'utiliser le mme quipement pour sparer des composs par isotachophorse et par focalisation isolectrique est encore tester. Ces nouvelles possibilits de dosages sont adapter et les mthodes de dosage qui en dcouleront pourront tre appliques aux produits nologiques aprs validation.

CONCLUSION
L'lectrophorse capillaire permet de dterminer la puret de bon nombre de produits nologiques et de caractriser leur origine et leur qualit. La simple observation visuelle des profils lectrophortiques nous permet de classer les tanins nologiques selon leur origine botanique. L'tat de dgradation des colles albumineuses, (ovalbumine, lactalbumine) ainsi que celui des casines est devenu facilement vrifiable par lectrophorse capillaire. Il en est de mme pour le contrle de la thiamine et du lysozyme. En permettant une meilleure connaissance de ces produits, l'lectrophorse capillaire contribue une efficacit plus grande et plus sre des traitements des vins.

RFRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
(1) CHAUVET S., POULIT M., MEDINA B., Application de l'lctrophorse capillaire l'valuation des caractristiques des laits, Ann. Fals. Exp. Chim., avril, mai, juin 2001, n955, p115. (2) RAFFARD C.,2001. Application en lectrophorse capillaire dans le domaine agro-alimentaire : mise au point et validation de mthode. Rapport de stage DESS Universit de Bordeaux I. (3) RSOLUTION OENO 12/2002, tanins nologiques, O.I.V. 2002 Assemble gnrale de Brastislava, La Lettre de l'O.I.V., page 4, aot 2002, n14. (4) FEUILLET VERT DE L'O.I.V., Dosage des acides organiques dans les vins par ECHP, ref 1131.

Perspectives

L'utilisation de l'lectrophorse capillaire en nologie est rcente. Une petite partie seulement de ses possibilits est actuellement mise profit. Dans la plupart des cas, comme ceux prsents ici, seule l'lectrophorse de zones qui ne tient compte que des rapports masse/charge des ions est utilise. L'lectrophorse micellaire qui permet la sparation des composs en fonction de leur mobilit et de leur hydrophobicit est encore peu employe.

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