INTRODUCCIN.

E
l avance y sofisticacin de las
tcnicas en biologa molecular ha
permitido uno de los grandes
hitos de la ciencia moderna: la posi-
bilidad de recuperar material genti-
co de restos biolgicos antiguos. Las
posibilidades que esta nueva disci-
plina -a la que denominamos "pale-
ogentica"- ofrece son mltiples:
caracterizacin gentica de nuestros
antepasados prximos, anlisis del
material gentico de especies extin-
tas para tratar de esclarecer su
relacin con otras actuales -por
ejemplo, los Neandertales- o el
seguimiento de migraciones histri-
cas o prehistricas.
Toda la tecnologa empleada en el
estudio de biomolculas antiguas
tiene una base terica y fisicoqumi-
ca de gran importancia. Los orgenes
de esta nueva disciplina cabe bus-
carlos a mediados de los aos 80
con el trabajo pionero de Higuchi y
colaboradores.
1
Gracias a este
equipo se obtuvo por vez primera ADN de una especie
extinta: el cuagga (Equus quagga), un quido de frica
del Sur que se extingui hace aproximadamente 140
aos. Desde entonces se ha conseguido aislar ADN de
restos de una gran variedad de especies vegetales y
animales, incluido el hombre (ver figuras 1 y 2).
2-4
Desgraciadamente, este entusiasmo inicial se troc al
poco tiempo en escepticismo al ser puesta en duda la
autenticidad de algunos de los resul-
tados obtenidos. Algunos investi-
gadores creyeron que las secuen-
cias de ADN presuntamente
antiguas no eran sino ADN moderno
introducido en la muestra por fallos
de procedimiento; es decir, lo que los
especialistas denominan "contami-
naciones".
5-7
Con la llegada de la
Reaccin en Cadena de la
Polimerasa (PCR)
8,9
-y en parte con
la secuenciacin automtica- la tec-
nologa del ADN antiguo (ADNa) ha
sufrido una autntica revolucin (ver
figura 3). La PCR ha hecho posible
Fernndez
Domnguez E.
Prez-Prez A.
Unidad de Antropologa
Departamento de Biologa Animal
Facultad de Ciencias Biolgicas
Avda. Diagonal 645
08028-Barcelona.
1
Laboratorio de Biologa Forense
Departamento de Toxicologa y
Legislacin Sanitaria
Facultad de Medicina
Universidad Complutense de Madrid
28040-Madrid
E-mail: earroyop@med.ucm.es
Turbn D.
Arroyo-Pardo E.
1
Figura 1.
Esquema de la
situacin del
ADN dentro
del ncleo
celular.
Figura 2.
Dble hlice
de ADN.
Figura 3. Esquema de la Reaccin en Cadena de la
Polimerasa (PCR). El proceso iterativo (ciclos) aumenta
el nmero de copias de ADN.
27
ADN ANTIGUO: QUMICA Y APLICACIONES
adn antiguo2.qxd 17/04/2008 12:22 Pgina 27
la obtencin de informacin gentica a partir de canti-
dades nfimas y muy fragmentadas de ADN y el uso de
secuenciadores automticos ha permitido analizar de
forma rpida la variabilidad de las secuencias, para
comparar muestras antiguas con modernas, e inferir as
conclusiones filogenticas.
En general, hay que abordar tres problemas clave para
garantizar el xito en la recuperacin de ADNa:
a) La presencia de inhibidores de la Taq polimerasa,
derivados del suelo en que se ha conservado el resto o
de procesos bioqumicos degradativos acontecidos tras
la muerte del individuo.
b) El aislamiento de ADN "template" autnticamente
antiguo, libre de ADN exgeno moderno.
c) El dao molecular ocasionado en el ADN antiguo
recuperado.
Desde que aparecieron las primeras publicaciones
sobre ADNa a mediados de los aos 80, estos tres pun-
tos han sido objeto de controversia. Los trabajos ini-
ciales de Hss y Pbo
10
y de Tuross
11
no slo permi-
tieron en su momento profundizar en los fundamentos
moleculares de estas dificultades sino que sentaron las
bases para un estudio ms profundo del ADNa, que
exceda con mucho la mera recuperacin de fragmen-
tos mediante PCR. De hecho, fueron ellos los que
establecieron que la extraccin y amplificacin del ADN
antiguo se complica por todos aquellos mecanismos de
descomposicin que acompaan a las muestras ente-
rradas o suficientemente antiguas. Como demostraron
aquellos trabajos pioneros, el ADN se comporta como
otras molculas que, tras la muerte del individuo, pasan
de la biosfera a la geosfera.
12
Desgraciadamente, este
enfoque slo se abord decididamente a mediados de
los aos 90.
Por ltimo, a juicio de algunos autores
5
, a los resultados
obtenidos a partir de restos no humanos, se les debe
pedir un cierto "sentido filogentico"; es decir, que su
amplificacin produzca resultados no humanos y que,
adems, est de acuerdo con la informacin filogenti-
ca disponible para la especie en cuestin. Este criterio
-en parte discutible- no puede aplicarse con el mismo
rigor al caso de los restos humanos; pero debe sub-
rayarse en todos los dems aspectos el procedimiento
metodolgico es, salvo excepciones, el mismo en
humanos que en otros organismos vivos. A lo largo del
presente trabajo revisaremos las cuestiones ms can-
dentes desde los inicios de la bioqumica del ADN
antiguo hasta el presente.
1.- DAO Y DEGRADACIN DEL ADN ANTIGUO
El material de partida para los estudios de ADN antiguo
es variado, normalmente restos de tejidos blandos (por
ejemplo, piel y msculo) o huesos y dientes, siendo
estos dos ltimos materiales los que ofrecen resultados
ms satisfactorios (ver figura 4).
13
Particularmente los
dientes constituyen un depsito natural de cidos nu-
cleicos notablemente protegido de factores medioam-
bientales.
6
Tras la muerte de un organismo su ADN es rpidamente
degradado por nucleasas endgenas. Ciertas condi-
ciones pueden ralentizar e incluso detener este proce-
so, como una rpida deshidratacin que impida la
actuacin de microorganismos, la presencia de ele-
vadas concentraciones de sales o las altas tempera-
turas (ver figuras 5 y 6). Una vez esta actividad
endonuclesica ha cesado, hongos y bacterias colo-
nizadoras continan el proceso degradativo. Tras la
accin de estos microorganismos el ADN todava queda
a merced de procesos de degradacin qumica medi-
ante reacciones de hidrlisis y oxidacin.
Figura 4. Imagen de un insecto encerrada en mbar. La
posibilidad de recuperar ADN de este tipo de fsiles ha sido
objeto de mucha controversia.
Figura 5. Los individuos momificados pueden ser objeto de
toma de muestras para estudios de ADN antiguo.
Figura 6. Yacimiento neoltico de Tell Halula (Siria). Las
condiciones climticas favorecen una rpida evaporacin del
agua, una elevada tasa de racemizacin y una preservacin
de cidos nucleicos.
28
ADN ANTIGUO: QUMICA Y APLICACIONES
adn antiguo2.qxd 17/04/2008 12:22 Pgina 28
Como consecuencia de estos procesos el material
gentico preservado en restos antiguos presenta un
conjunto de caractersticas que lo diferencian del ADN
de organismos actuales (ADN fresco) y que impone un
conjunto de limitaciones a su recuperacin (ver figura
7).
En primer lugar, el ADN antiguo est sumamente frag-
mentado. Algunos autores mantienen que no es posible
la amplificacin por PCR de fragmentos de ADN de
tamao superior a 150 pares de bases (bp) en tejidos
blandos.
3
Este lmite es sensiblemente superior en teji-
dos slidos como hueso o diente, siendo de 300 pares
de bases (bp) para ADN mitocondrial y de poco ms de
100 bp para material nuclear.
14,15
La longitud del frag-
mento a amplificar guarda una relacin inversamente
proporcional con la cantidad de producto obtenido tras
la amplificacin.
16
Sin embargo no parece existir una
correlacin entre la antigedad de la muestra y su
grado de fragmentacin.
3
Esto se debe a que la
degradacin del ADN depende ms de las condiciones
medioambientales en s, que del tiempo que ste ha
estado expuesto a ellas. As, aunque la cantidad total de
ADN antiguo presente en la muestra sea en principio
suficiente para garantizar su recuperacin mediante
una PCR exitosa, la fragmentacin de este material
hace que slo sean recuperables aquellos fragmentos
ms pequeos.
En la estructura del ADN existen dos lugares especial-
mente sensibles a la hidrlisis: los enlaces fosfodister,
que unen las diferentes desoxirribosas entre s, y los
enlaces glicosdicos, que conectan stas a las bases
nitrogenadas (ver figura 8). La rotura de los enlaces
fosfodister rompe la cadena de ADN y la de los
enlaces glicosdicos suele provocar la prdida de la
base nitrogenada correspondiente formndose sitios
apurnicos (AP sites) o sin base (baseless) en un pro-
ceso conocido como depurinizacin o depirimidinacin.
Este proceso tiene lugar "in vivo" aproximadamente
cada 10 horas, aunque puede verse acelerado por fac-
tores como la temperatura, la fuerza inica del entorno,
el pH o la presencia de metales pesados. Tras la pro-
duccin de un sitio apurnico, puede tener lugar la rotu-
ra, conocida como -eliminacin, de la cadena de ADN
en ese punto.
Adems del dao hidroltico, el ADN est sometido a
alteraciones de carcter oxidativo durante el proceso de
descomposicin. Este dao se da bien por efecto de
una radiacin ionizante directa sobre el ADN, bien por la
accin de radicales libres, generalmente del tipo
superxido (O
2
+
), perxido de hidrgeno (H
2
O
2
) e
hidroxilo (OH
-
), o bien por otras especies reactivas
como el electrn hidratado (e
aq
-
) y los protones (H
+
).
Todos estos compuestos, esencialmente subproductos
de reacciones celulares endgenas, tambin pueden
ser generados tras la exposicin de la clula a radia-
ciones ionizantes, luz ultravioleta o ser el resultado de
degradacin bacteriana y/o fngica. Algunas de estas
especies pueden reaccionar con las bases nitroge-
nadas del ADN modificndolas, como sucede con los
electrones hidratados y los protones producidos por
radiacin ionizante en solucin acuosa.
17,18
Otras en
cambio, como el radical superxido (O
2
-
) y el perxido
de hidrgeno (H
2
O
2
) no producen dao directo en el
ADN salvo cuando son convertidos en OH
-
.
19
Como
ejemplo de dao molecular fisiolgico, se ha comproba-
do in vivo que los radicales hidroxilo pueden modificar
las protenas asociadas al ADN originando enlaces
covalentes ADN-protena (DPCs: ADNprotein cross-
links). Tambin puede suceder que el radical hidroxilo
arranque un protn del grupo metilo de la timina.
17
Adems, la presencia de iones hierro, cobre y otros
compuestos, sobre todo cuando estos iones no estn
quelados, facilita la formacin de radicales hidroxilo a
partir de O
2
-
y H
2
O
2
que producen un dao extensivo
en el ADN.
20
La adicin de estas especies reactivas a los dobles
enlaces de la molcula de ADN se traduce en la forma-
cin de aductos con capacidad de bloquear la PCR,
haciendo que aunque se obtenga ADN endgeno, ste
sea inservible.
Tras analizar diversos extractos de ADN de tejidos de
diferentes pocas mediante Cromatografa de Gases /
Figura 7. Corte
esquemtico de
un diente. El
interior de la
cmara pulpar
retiene gran
cantidad de
ADN post-
mortem.
Figura 8. Posibles sitios moleculares susceptibles de dao
molecular.
29
ADN ANTIGUO: QUMICA Y APLICACIONES
adn antiguo2.qxd 17/04/2008 12:22 Pgina 29
Espectrometra de Masas (GC/MS) se comprob que
un gran porcentaje de las bases nitrogenadas estaba
modificado.
21
La 5-OH-5-Metil Hidantona es uno de los
productos mayoritarios resultantes de la degradacin de
la timina en ADN expuesto a radiaciones , mientras
que la 8-OH-Guanina se genera tras el ataque de radi-
cales hidroxilo. La cantidad de los dos primeros tipos de
modificaciones en los extractos de ADN guarda una
relacin inversa con la eficiencia de su amplificacin,
probablemente causada por el bloqueo que provocan
estos productos en la PCR.
El radical hidroxilo reacciona con la mayora del ADN
por adicin a los dobles enlaces de las bases; sin
embargo, una pequea cantidad tambin reacciona con
el esqueleto de azcar arrancando un protn y origi-
nando radicales de azcares.
17
Estos azcares daa-
dos pueden encontrarse en forma libre o unidos todava
al ADN.
22,23
2.- AISLAMIENTO DEL ADN ANTIGUO Y
CONTAMINACIN
Otra de las dificultades del aislamiento del ADN antiguo
es la posibilidad de contaminacin con ADN moderno,
de manera que se amplifique ste en vez de aqul.
24
Desde los inicios de la disciplina del ADN antiguo se ha
propuesto un conjunto de criterios para tratar de contro-
lar esta contaminacin exgena.
Primero se propuso una esterilizacin extensiva de las
reas de trabajo con HCl seguida de su exposicin a luz
UV. Con el HCl se buscaba producir la hidrolisis cida
del ADN y con la radiacin UV, la formacin de aductos
covalentes no vlidos para la reaccin de PCR. El si-
guiente paso, la delimitacin de reas de trabajo -la
separacin de las reas de extraccin de ADN respec-
to de las de amplificacin del ADN- pretenda anular la
posibilidad de carry-over, trmino mediante el cual se
designa el arrastre de molculas de ADN provenientes
de amplificaciones anteriores.
25
Adems, se impuso el
uso de campanas de flujo laminar o de seguridad
biolgica, instrumentos imprescindibles que impedan la
contaminacin de las muestras en el rea de trabajo.
Todas estas medidas de seguridad "clsicas" siguen
todava hoy vigentes, si bien durante los ltimos aos
otras nuevas han venido a sumarse.
Con motivo de la polmica suscitada acerca de la ampli-
ficacin real de ADN antiguo, Braud-Colomb y cola-
boradores
26
describieron detalladamente en 1995 las
precauciones que deban tomarse para minimizar la
contaminacin potencial de ADN moderno exgeno,
aadiendo ocho medidas de seguridad adicionales a las
preexistentes (ver tabla 1). La novedad de sus pro-
puestas radicaba en un exhaustivo control de los re-
activos as como el empleo sistemtico de controles en
la reaccin de PCR.
Tras la secuenciacin en 1997 de la regin D-loop del
ADN mitocondrial de un resto neandertal por el equipo
de Svante Pbo
9
, Ward y Stringer introdujeron cuatro
puntos adicionales para la recuperacin fiable de este
tipo de material gentico en restos antiguos.
27
Su pro-
puesta incorporaba parmetros bioqumicos como
medida indirecta de la degradacin del ADN tales como
la racemizacin de aminocidos,
28
adems de la estima
del nmero de molculas "template" intactas. Segn
estos autores si la amplificacin se inicia a partir de un
nmero demasiado bajo de estas molculas, se pro-
ducen resultados inconsistentes y poco fiables.
Tradicionalmente esta determinacin se ha venido
haciendo por "PCR competitiva", pero actualmente este
mtodo est siendo desplazado por la PCR en tiempo
real o Real Time PCR (RT-PCR), mucho ms sensible y
especfico.
Otro punto novedoso del protocolo de Ward y Stringer
consiste en la clonacin de los productos amplificados.
Esta tcnica permite separar las diferentes molculas
de cada producto final de amplificacin, resultando til
para detectar ADN contaminante y posibles errores de
la Taq polimerasa introducidos durante el proceso de
amplificacin.
Por ltimo, los dos autores consideraban necesario
repetir las amplificaciones, para confirmar los resulta-
dos. El ltimo de estos criterios, introducido a raz del
trabajo de Krings et al
29
implica la replicacin del pro-
ceso de extraccin y amplificacin en dos laboratorios
independientes. De esta forma puede conseguirse
Tabla 1. Comparacin de tres protocolos para la extraccin
de ADNa.
30
ADN ANTIGUO: QUMICA Y APLICACIONES
adn antiguo2.qxd 17/04/2008 12:22 Pgina 30
monitorizar la contaminacin introducida por los investi-
gadores directamente implicados en el anlisis de las
muestras, as como el ya mencionado carry over in-
herente a cada laboratorio.
3.- INHIBIDORES DE LA REACCIN DE PCR:
La co-purificacin junto con el ADN procedente de teji-
dos blandos, huesos y dientes de otras sustancias fue
observada ya en los primeros estudios de ADN
antiguo.
2,3,30,31
Posteriormente, con la generalizacin
del uso de la PCR en el campo del ADNa, se relacion
esta observacin inicial con la presencia, en algunos de
estos extractos, de sustancias inhibidoras de esta re-
accin.
Los mecanismos de accin de estas molculas
inhibidoras continan siendo un misterio, pero existe un
conjunto de observaciones empricas que ofrecen
interesantes pistas al respecto.
Por ejemplo, la inhibicin aparece en diferentes extrac-
tos de diferente procedencia y el patrn de absorcin de
luz de ciertos extractos con poder inhibidor difiere de
aquellos que no tienen este poder. Muchos extractos
con capacidad inhibidora presentan una coloracin
marrn y, en algunos casos, al visualizar una alcuota
de los mismos en un gel de electroforesis se ha obser-
vado la emisin de fluorescencia. El protocolo de
extraccin convencional de ADN (mtodo Fenol-
Cloroformo) no consigue eliminar estas molculas
inhibidoras. Adems stas son retenidas por el filtro de
30000 daltons utilizado para concentrar el ADN en el
paso final de extraccin.
En todo caso existen estrategias para eliminar o ate-
nuar la inhibicin, bien aumentando la pureza del ADN
extrado, bien tratando de contrarrestar el efecto
inhibidor durante la propia reaccin de amplificacin. La
mayor parte de estas medidas resultan en un incre-
mento del riesgo de contaminacin con ADN exgeno
de la muestra, pues aumentan la manipulacin por
parte del investigador. Sin embargo existen otras que
producen mejoras sustanciales en la amplificacin y
que no presentan este inconveniente, como es el alma-
cenamiento de los extractos en fro durante varios das
previamente a su amplificacin. Este procedimiento
provoca la formacin de un precipitado blanquecino que
queda adherido a la pared del tubo y cuya eliminacin
por precipitacin consigue revertir la capacidad de
amplificacin.
32,33
La naturaleza del inhibidor est todava por determinar,
aunque se han propuesto un conjunto de molculas
candidatas, bsicamente compuestos del suelo o pro-
ductos de degradacin del organismo. A continuacin
se citan los ms importantes.
cidos hmicos y flvicos
La posible accin inhibidora de los cidos hmicos y
flvicos sobre las enzimas de biologa molecular fue
sealada por vez primera por Svante Pbo.
3
Los ci-
dos hmicos y flvicos son una familia de molculas
muy abundantes en el suelo, que pueden acompaar al
ADN en el proceso de purificacin y que son inhibidores
muy potentes de la reaccin de PCR (ver figuras 9 y
10). Tan solo 100 ngr. de cido flvico son suficientes
para la inhibicin total de una amplificacin control de
fago .
11
Las propiedades fluorescentes de esta familia
de compuestos se han relacionado con la fluorescencia
observada en agarosa de algunos de los extractos de
ADN antiguo.
Residuos de porfirinas o productos derivados de su
degradacin:
Los derivados de la porfirina o sus productos de
degradacin han sido sealados como tales inhibidores
por algunos autores durante los aos 90.
32,33
La accin
inhibidora de estas molculas se debe a su capacidad
para secuestrar iones metlicos, necesarios para el fun-
cionamiento de polimerasas, gracias a estructuras si-
milares al grupo hemo. Las porfirinas se encuentran
presentes en sangre, tejidos blandos y en hojas vege-
tales, y constituyen una familia molecular que puede
considerarse como derivada de un compuesto tetrapi-
rrlico original: la porfina. Las porfirinas ms abun-
dantes son las protoporfirinas y aunque pueden
describirse quince protoporfirinas ismeras, solo una
Figuras 9 . Estructura qumica del cido flvico.
Figura 10. Estructura qumica del cido hmico.
31
ADN ANTIGUO: QUMICA Y APLICACIONES
adn antiguo2.qxd 17/04/2008 12:22 Pgina 31
forma, la protoporfirina IX, est presente en la natu-
raleza.
La protoporfirina IX forma complejos quelatos tetraden-
tados con iones diversos (hierro, zinc, nquel, cobalto,
etc) y tambin con iones magnesio, en los que el metal
se une por enlaces coordinados a los 4 nitrgenos de
los anillos pirrlicos. La capacidad de la protoporfirina
IX para quelar iones magnesio, necesarios para el fun-
cionamiento de la Taq polimerasa, hace que este tipo
de compuestos presente un poder inhibidor de la re-
accin de PCR potencial.
1
Adems, los derivados por-
firnicos tienden a formar agregados que quedan as
retenidos junto al ADN en la membrana de muchos pro-
cedimientos de filtrado, como el Centriplus 30000,
empleados durante la extraccin de ADN antiguo.
Productos de Maillard
La reaccin de Maillard es sobradamente conocida en
el campo de la tecnologa de los alimentos desde me-
diados de los aos 60. Consiste en la reaccin de un
grupo carbonilo con un grupo amino para dar una serie
de intermediarios como compuestos carbonlicos (cade-
nas carbonlicas) y deoxiosonas, estos ltimos cuando
hay azcares implicados en la reaccin. Aunque los
productos de Maillard son muchos y variados -desde
grupos carbonilo unidos a cadenas cortas de carbono
hasta heterociclos como furanos y pirroles- el producto
final de la reaccin son las melanoidinas, cuya estruc-
tura es en buena parte desconocida. Su coloracin ma-
rrn y su elevado peso molecular -hasta 100.000 dal-
tons- ha sido relacionada por muchos autores con la
capacidad inhibidora de algunos extractos de ADNa.
3,4
Los productos de Maillard pueden tener numerosos gru-
pos reactivos, entre los que se cuentan los grupos
hidroxilo, carbonilo y metilo que pueden reaccionar con
el ADN.
El propio dao molecular en el ADN puede inducir la
produccin de reacciones de Maillard, puesto que las
pentosas liberadas tras la ruptura de sus enlaces fos-
fodister y N-glicosdico constituyen tambin un sustra-
to para esta reaccin.
Productos de degradacin del ADN
La degradacin del material gentico, sea por rotura de
sus enlaces o por modificaciones qumicas tales como
la reduccin de azcares, genera ciertos productos
capaces de inducir la inhibicin directa de su propia
amplificacin.
34-36
No hay que confundir sin embargo el poder inhibidor de
un extracto de ADNa con la imposibilidad de su amplifi-
cacin. El dao extensivo en el ADN (por frag-
mentacin, por modificacin de sus bases...) hace in-
viable su amplificacin. Sin embargo a menos que ste
genere productos capaces de interferir en la reaccin
de amplificacin no podr hablarse de inhibicin sensu
strictu.
Algunos autores han estudiado el efecto del dao post-
mortem en los resultados de secuencias de ADNa y han
podido detectar directamente transiciones denomi-
nadas de "tipo 1" (A->G T->C) y de "tipo 2" (C->T G-
>A) que pueden enmascarar como mutaciones lo que
no es ms que un dao molecular.
37
Por este motivo,
dado que una reduccin de 20C en la temperatura
implica una disminucin de entre 10 y 25 veces en la
tasa de reacciones qumicas, la congelacin de mues-
tras puede ser un factor determinante a la hora de
preservar un ADN durante largo tiempo. As, para mues-
tras de gran antigedad, en el perodo comprendido
entre 40000 y 50000 aos, la baja temperatura parece
ser de gran importancia para la ralentizacin de los pro-
cesos responsables de la degradacin de los cidos
nucleicos durante el perodo postmortem.
21
4.- ESTEREOQUMICA DE AMINOACIDOS Y ADN
ANTIGUO:
Todos los aminocidos a excepcin de la Glicina
pueden presentarse en dos formas isomricas -L y D-
pero en la biosntesis proteica nicamente son uti-
lizadas las formas L. Cuando un organismo muere sus
aminocidos sufren un proceso de racemizacin
38
cuya
tasa difiere para cada aminocido y a su vez, depende
de factores tales como la presencia de agua, la tempe-
ratura, el pH y la quelacin de ciertos iones metlicos a
las protenas. Muchos de estos factores afectan tam-
bin a la principal reaccin hidroltica responsable de la
degradacin espontnea del ADN, la depurinizacin.
Por esta razn, se ha considerado el estudio de la
racemizacin de los aminocidos como un mtodo til a
la hora de estimar la probabilidad de recuperar informa-
cin gentica fiable de un resto antiguo. En 1975,
Helfman y Bada
28
observaron que durante el enveje-
cimiento se va produciendo una racemizacin gradual
del cido asprtico, en la dentina y en el esmalte den-
tario, de forma que el incremento de la concentracin de
D-asprtico es dependiente de la edad con una tasa de
transformacin del 0,1% al ao.
39
A partir de estos ha-
llazgos, han sido muchos los equipos de investigacin
que han utilizado la racemizacin de este aminocido
para estimar la edad de un resto cadavrico.
34,40
As, se
ha medido la racemizacin en tejidos con una baja tasa
de "turn-over" proteico, tales como sustancia blanca del
cerebro
40
, discos intervertebrales
41
, fibras elsticas del
parnquima pulmonar
42
, cristalino ocular
43
y hueso.
44
Teniendo en cuenta que la racemizacin de los amino-
cidos sigue una ley de tasa reversible de primer orden,
la reaccin de la racemizacin es:
donde D/L es la relacin de formas D y L y t es el tiem-
po. El trmino logartmico t=0 describe la cantidad de
cido D-asprtico formado mediante el procedimiento
de hidrlisis con HCl 6 M a 100C durante 6 horas y K
32
ADN ANTIGUO: QUMICA Y APLICACIONES
adn antiguo2.qxd 17/04/2008 12:22 Pgina 32
expresa la tasa de racemizacin.
Mediante esta ecuacin se ha podido observar que la
tasa de racemizacin es de 5,3 x 10
-3
para la fraccin
peptdica cido-soluble de la dentina
45,46
; de 3,1 x 10
-3
para el cartlago
39
, y de solo 1,8 x 10
-3
para la corres-
pondiente fraccin de hueso. En la fraccin de colgeno
cido-insoluble de la dentina es de 1,0 x 10
-3
y de 3,3 x
10
-3
en cartlago
47,48
, con un valor para hueso de solo
0,47 x 10
-3
.
49
No parece muy fcil explicar el porqu la
tasa de racemizacin difiere entre las dos fracciones de
hueso y no de cartlago. La diferencia entre los dos
compartimentos de la dentina es ms sencilla de
explicar dado que el colgeno en este tejido no est
sujeto a ninguna remodelacin, mientras que la fraccin
peptdica cido-soluble puede tener intercambio nutri-
cional con la circulacin a travs de los tbulos y per-
itbulos de dentina (ver figura 11).
Una de las explicaciones para justificar que la co-
rrelacin entre D/L y la edad sea menor en hueso que
en dentina o en cartlago, es la elevada remodelacin
del primero o que pueda existir contaminacin con pro-
tenas de otras fuentes como tejido conectivo y sangre
que pueden incrementar de forma significativa la canti-
dad de forma L.
Tambin se ha estudiado el grado de racemizacin de
otros aminocidos como alanina y leucina, pero el cido
asprtico tiene la ventaja de que tiene una alta energa
de activacin y su tasa de racemizacin es una de las
ms rpidas y es constante en un amplio rango de tem-
peratura (a pH neutro).
Segn parece, los factores que influyen en el proceso
de racemizacin son tambin responsables de la
degradacin del ADN.
38
Tras estudiar el grado de
racemizacin de muestras de diferentes organismos y
pocas, Poinar y colaboradores establecieron que para
relaciones D/L Asprtico mayores de 0.08 no era posi-
ble obtener una secuencia fiable de ADN. Pareca exis-
tir adems una relacin clara entre la amplitud de este
aminocido y la longitud de secuencia de ADN que
poda recuperarse: en muestras con una D/L igual a
0.05 se obtenan secuencias de entre 140 y 340 pares
de bases, mientras que en aquellas con una tasa de
racemizacin mayor tan slo era posible amplificar frag-
mentos ms cortos.
49
La ventaja de este mtodo es que permite identificar
aquellas muestras antiguas que no contienen ADN
antiguo endgeno y amplificable de una forma rpida y
sin necesidad de destruirlas totalmente. Sin embargo, al
carecer el mtodo de Poinar y colaboradores de una
estandarizacin en cuanto al tipo de tejido estudiado,
cabra plantearse si los valores de racemizacin pro-
puestos son extrapolables a otros estudios de ADN
antiguo realizados con un material diferente.
5.- REAL TIME-PCR y ADN ANTIGUO.
Los procedimientos de Real Time PCR (RT-PCR) han
desplazado hoy en da a otras tcnicas para la cuantifi-
cacin de ADN. Debido a su sensibilidad y especificidad
su uso se ha incorporado rpidamente en el campo del
ADNa.
La variante ms famosa de esta tcnica necesita de un
par de primers o cebadores e incorpora adems una
sonda marcada (sonda TaqMan) complementaria a la
regin de ADN que se quiere amplificar. Los pasos del
proceso pueden verse en la figura 12. La sonda en
cuestin presenta un reporter fluorescente (TAMRA) en
un extremo y un quencher no fluorescente en el otro,
que absorbe la fluorescencia emitida por el reporter
cuando ambos estn unidos a la sonda.
Si la secuencia blanco est presente, la sonda hibrida
con ella y se inicia la elongacin a partir del extremo 3'
del primer forward, como en una reaccin normal de
PCR. Ahora bien, cuando la cadena en elongacin,
junto con la polimerasa, alcanza el extremo 5' de la
sonda, sta es degradada por la actividad 5' exonu-
cleasa que presenta la polimerasa. El resultado es que
el quencher es separado del reporter de manera que la
seal del reporter se ve considerablemente aumentada.
El nmero de molculas iniciales de ADN es propor-
cional a la intensidad de fluorescencia emitida.
Figura 11. Toma
de muestra de
dentina para su
posterior empleo
en anlisis de
aminocidos. Se
trabaja en entorno
estril con un ta-
ladro.
Figura 12. Esquema de la PCR en tiempo real o Real
Time PCR.
33
ADN ANTIGUO: QUMICA Y APLICACIONES
adn antiguo2.qxd 17/04/2008 12:22 Pgina 33
Midiendo esta fluorescencia puede estimarse la con-
centracin de un ADN problema comparndola con
unos patrones de concentraciones conocidas.
Recientemente la casa comercial Applied Biosystems
ha comercializado una nueva modalidad de sondas,
denominadas TaqMan MGB (Minor Groove Binding),
que presentan la particularidad que se unen al surco
pequeo de la doble hlice de ADN y aumentan as la
temperatura de desnaturalizacin Tm, permitiendo el
uso de sondas con menos pares de bases.
La ventaja de este procedimiento es que permite cuan-
tificar una secuencia de ADN especfica y no la cantidad
total de ADN, tal y como sucede con otras tcnicas
como la espectrofotometra. Adems, marcando dife-
rentes sondas con diferentes fluorocromos pueden
cuantificarse distintas secuencias a la vez. La principal
desventaja es que este mtodo requiere una sonda
diferente para cada secuencia a cuantificar, lo que suele
encarecer bastante el proceso. Un ejemplo de RT-PCR
puede verse en la figura 13.
6.- ALGUNOS EJEMPLOS DE ANLISIS DE ADNa:
Identificacin del Duque de Widukind:
El duque de Widukind vivi en el siglo VIII y fue el jefe
de los sajones que combati por la fuerza de las armas,
durante 7 aos, la cristianizacin y el imperio franco de
Carlomagno, antes de bautizarse finalmente en 785.
Tras su muerte, acaecida entre el 900 y el 910 d.C., su
cuerpo fue enterrado en la Iglesia de Enger, en
Westfalia (Alemania). El estudio realizado en su sepul-
tura encontr, junto al supuesto esqueleto de Widukind,
el de otros dos individuos de origen desconocido.
50
Las
condiciones de enterramiento hicieron posible la recu-
peracin de secuencias de ADN mitocondrial de los tres
individuos (ver figura 14). Dos de ellos posean las
mismas mutaciones mitocondriales indicando la posible
relacin por va materna, ya que el ADN mitocondrial se
hereda solo matrilinealmente, mientras que el tercero
difera en una nica mutacin de los otros dos. A fecha
de hoy, el estudio molecular de los restos de la iglesia
de Enger contina realizndose en la Universidad de
Gttingen (Alemania) y, de momento, nada ha podido
concluirse acerca de la identidad de los tres individuos
estudiados.
La identificacin de los Romanov:
Durante el golpe de estado bolchevique en la Rusia de
1917, la familia imperial zarista fue apresada por los
insurgentes. El Zar Nicols II, la Zarina Alejandra y sus
cinco hijos, Olga, Tatiana, Mara, Anastasia, y el
Zarevich Nicols fueron capturados y, el 16 de julio de
1918, asesinados junto a dos sirvientes y al doctor
Botkin, mdico de la familia, en la casa Ipatiev, en
Ekaterimburgo (ver figura 15). Los cadveres fueron
rociados con cal viva y enterrados en una fosa comn,
si bien por el relato de los propios asesinos, dos cuer-
pos fueron enterrados en un lugar diferente (supuesta-
mente los de Anastasia y el Zarevich Nicols). En 1919
el forense Nicolai Sokolov document el hecho pero
Figura 13. Ejemplo de un resultado de RT-PCR producido
por un extracto de ADN procedente del yacimiento neoltico
de Tel-Hallula (Siria), con una antigedad aproximada de
unos 10.000 aos. Los colores verde y rojo corresponden a
dos rplicas de la misma muestra que aparecen casi super-
puestas. Como se ve, a partir de los 33 ciclos de PCR -eje
de abcisas- la fluorescencia crece exponencialmente
(Imagen de los autores).
Figura 14. Estructura gentica del ADN mitocondrial.
Figura 15.
Retrato de la
familia imperial
Zarista. El mis-
terioso destino
de la princesa
Anastasia solo
pudo resol-
verse por el
estudio del
ADN de sus
restos.
34
ADN ANTIGUO: QUMICA Y APLICACIONES
adn antiguo2.qxd 17/04/2008 12:23 Pgina 34
hubo que esperar hasta 1991 en que unos historiadores
amateur descubrieron una fosa comn con 9 cuerpos.
En 1992, se inici un estudio gentico para tratar de
aclarar la procedencia de los restos. Se estudiaron
diferentes marcadores genticos: ADN mitocondrial,
secuencias cromosmicas de microsatlites y ADN de
cromosomas sexuales (gen de la amelogenina). Este
ltimo tipo, utilizado comnmente para asignar molecu-
larmente el sexo a una muestra, permiti saber que se
trataba de 4 restos de varn y 5 de mujer, tal y como
estableca el registro histrico. El estudio de los
microsatlites de ADN demostr que los esqueletos 4 y
7 eran padres de 3, 5 y 6. Los restos 1, 8 y 9, al no estar
relacionados, podran ser los sirvientes. Para saber si
los individuos estudiados eran o no los Romanov se
recurri a comparar su ADN con el de descendientes
actuales vivos por lnea materna. El prncipe Felipe de
Inglaterra, actual duque de Edimburgo, al estar rela-
cionado por va materna con la Zarina Alejandra, deba
compartir con ella su mismo ADN mitocondrial. De la
misma manera, el ADN mitocondrial de los descen-
dientes de Louisse de Hessen-Cassel, emparentados
deba ser idntico al del Zar Nicols II (ver figura 16).
El resultado de los anlisis realizados apoya la hipte-
sis de que los restos se correspondan con los del
crimen de Ekaterimburgo: los individuos 4 y 7 eran el
Zar y la Zarina respectivamente; 3, 5 y 6 eran sus hijas;
1, 8 y 9 eran los sirvientes y el 2 era el Dr. Botkin.
51
Este
mismo estudio permiti aclarar el enigma de la supues-
ta princesa Anastasia -Ana Anderson- que desde 1921
deca ser hija del Zar y que finalmente present una
secuencia mitocondrial inconsistente con los restos
encontrados.
52
A pesar de todo, esta investigacin ha
recibido tambin crticas.
53
El enigma de los neandertales.
Los neandertales (Homo sapiens neanderthalensis)
poblaron Europa y Oriente Prximo entre hace 200.000
y 30.000 aos aproximadamente (ver figura 17). En
torno al 40.000-30.000 B.P. comenz a proliferar y
extenderse una nueva forma humana que los expertos
han pasado a denominar hombre anatmicamente
moderno (Homo sapiens sapiens), debido a su mor-
fologa ms grcil, semejante a la actual. Durante algn
tiempo ambas subespecies coexistieron hasta que los
neandertales fueron absorbidos o desplazados por los
hombres anatmicamente modernos. Este hecho ha lle-
vado a los paleontlogos a preguntarse hasta qu punto
no hubo hibridacin entre ambas formas y si entre
ambos taxa no existi relacin filogentica.
En 1997, Mathias Krings, del equipo de Svante Pbo,
consigui secuenciar la regin de control I (HVR-I) de
un ADN mitocondrial extrado de un hmero derecho del
ejemplar tipo del hombre de Neandertal, encontrado en
la cueva de Feldhofer, en Alemania, cerca de
Dsseldorf, en 1856, y que se conservaba en el
"Rheinisches Landesmuseum" de Bonn.
29
Los fsiles
hallados en Feldhofer fueron datados entre 40.000 y
50.000 aos. El procedimiento empleado consisti en
amplificar mediante PCR una serie de fragmentos cor-
tos solapantes a partir de 3.5 gr de polvo de hueso. Se
realiz un estudio de racemizacin de aminocidos y,
adems, cada fragmento amplificado fue clonado hasta
8 veces, establecindose una secuencia consenso.
Finalmente, los fragmentos fueron ensamblados hasta
completar la secuencia de la regin en cuestin. Este
anlisis fue replicado por Mark Stoneking y Anne Stone
en Pennsylvania State University (USA) para monito-
rizar la posible introduccin de ADN exgeno a la mues-
tra.
El estudio comparado de la secuencia neandertal
obtenida y un gran nmero de secuencias humanas
actuales demostr que aquella se situaba totalmente
fuera del rango de variacin de estos ltimos: la
secuencia neandertal present 27 diferencias con
Figura 16. Arbol genealgico de la Zarina Alejandra (a) y
del Zar Nicols II (b). Los individuos sombreados com-
parten el mismo ADN mitocondrial (Tomado de Gill et al.
1994, Ref. 51).
Figura 17. Crneo de Hombre
de Neanderthal. Pese a su
antigedad (30000-150000
aos), este tipo de restos pre-
senta cierto nmero de copias
integras de ADN.
35
ADN ANTIGUO: QUMICA Y APLICACIONES
adn antiguo2.qxd 17/04/2008 12:23 Pgina 35
respecto a una secuencia consenso
de referencia
54
, mientras que los
humanos actuales difirieron tan solo
en 5-8 posiciones. Posteriormente,
fue secuenciada la regin de control
II (HVR-II) del mismo ejemplar tipo e
incluso otros ejemplares de nean-
dertal, que resultaron ser consis-
tentes con la primera secuencia
original.
55-57
Krings, Pbo y cola-
boradores a partir de estos resulta-
dos concluyeron de forma explcita
en su artculo que los neandertales
no haban contribuido al "pool"
gentico de los humanos actuales,
a pesar de que su trabajo se basa-
ba en una secuencia nica. Este tra-
bajo y las conclusiones derivadas
del mismo han sido objeto de
numerosas controversias.
58,59
AGRADECIMIENTOS.
Este artculo ha sido parcialmente
financiado por el proyecto
BMC2002-2741 (DT).
1.- R. Higuchi, B. Bowman, M.
Freiberger, O. A. Ryder, A. C.
Wilson, Nature, 1984, 312, 282.
2.- S. Pbo, Nature, 1985, 314,
644.
3.- S. Pbo, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 1989, 86, 1939..
4.- S. Pbo, Sci. Am., 1993, 269
(5), 86.
5.- M. Stoneking, Am. J. Hum.
Genet., 1995, 57, 1259.
6.- A. Cooper, Am. J. Hum.
Genet., 1997, 60, 1001.
7.- T. Lindahl, Cell, 1997, 90, 1.
8.- K. B. Mullis, F. A. Faalona,
Meth. Enzymol., 1987, 155, 335.
9.- R. K. Saiki, D. H. Gelfand, S.
Stoffel, S. J. Scharff, R. Higuchi, G.
T. Horn, K. B. Mullis, H. A. Erlich,
Science, 1988, 239, 487.
10.- M. Hss, S. Pbo, Nucl.
Acids Res., 1993, 21, 3913.
11.- N. Tuross, Experientia, 1994,
50, 530.
12.- G. H. Logan, M. J. Collins, G.
Eglinton, En: Taphonomy:
Releasing the Data Locked in the
Fossil Record. Eds. P. A. Allison and
D. E. G. Briggs. Plenum, New York.
1991.
13.- D. De Gusta, C. H. Cook, G.
Sensabaugh, Ancient ADN
Newsletter, 1994, 2(1), 13.
14.- E. Hagelberg, L.S. Bell, T.
Allen, A. Boyde, S. J. Jones, J. B.
Clegg, Phil. Trans. R. Soc. Lond. B.,
1994, 333, 399.
15.- W. W. Hauswirth, C.D.
Dickel, D. A. Lawlor, En: Ancient
ADN. B. Herrmann y S. Hummel.
Eds. Springer Verlag New York, p.
104-121. 1994.
16.- S. Pbo, J. A. Gifford, A. C.
Wilson, Nucl. Acid. Res., 1987,
16(20), 9775.
17.- C. von Sonntag, The chemi-
cal basis of radiation biology. Taylor
& Francis. London, 1987.
18.- M. Dizdaroglu, Biotechni-
ques, 1986, 4, 536.
19.- Y. Fridovich, Arch. Biochem.
Biophys., 1986, 247, 1.
20.- B. Halliwell, J. M. C.
Gutteridge, Iron as a biological pro-
oxidant. ISI Atlas Sci. Biochem.,
1988, 1, 48.
21.- M. Hss, P. Jaruga, T. H.
Zastawny, M. Dizdaroglu, S. Pbo,
Nucl. Acids Res., 1996, 24(7), 1304.
22.- F. Beesk, M. Dizdaroglu, D.
Schulte-Frohlinde, C. von Sonntag,
Int. J. Radiat. Biol., 1979, 36, 565.
23.- M. Dizdaroglu, D.
Henneberg, C. von Sonntag, Org.
Mass Spectr., 1974, 8, 335.
24.- S. Kwok, R. Higuchi, Nature,
1989, 339, 237.
25.- E. Hagelberg, B. Sykes,
Nature, 1989, 342, 485.
26.- E. Braud-Colomb, R.
Roubin, J. Martin, N. Maroc, A.
Gardeisen, G. Trabuchet, M.
Goosens, Am. J. Hum. Genet.,
1995, 57, 1267.
27.- R. Ward, C. Stringer, Nature,
1997, 388, 225.
28.- P. H. Helfman, J. L. Bada,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1975,
72, 2891.
29.- M. Krings, A. Stone, R.
Schmitz, H. Kranitzki, M. Stoneking,
S. Pbo, Cell, 1997, 90, 19.
30.- K. Brown, T. Brown, Ancient
ADN Newsletter, 1992, 1(1), 18.
31.- C. D. Dickel, W.W.
Hauswirth, Ancient ADN Newsletter,
1992, 1(1): 9.
32.- R. Higuchi, Ancient ADN
Newsletter, 1992, 1(1), 5.
33.- R. Montiel, A. Malgosa, E.
Subir, Ancient Biomol., 1997, 1,
221.
34.- P. D. Goodyear, S. Mac-
Laughlin-Black, I. J. Mason, Bio-
techniques, 1994, 15(2), 232.
35.- P. Francalacci, Hum. Evol.,
1995, 10(1), 51.
36.- E. Arroyo-Pardo, M. A.
Ocaa, J. J. Arroyo, A. Prez Prez,
D. Turbn, G. Trancho, M. S.
Rodrguez Albarrn, J. D. Casas, F.
Bandrs, Ancient Biomol., 2002,
4(1), 33.
37.- M. Thomas, P. Gilbert, A. J.
Hansen, E. Willerslev, L. Rudbeck,
I. Barnes, N. Lynnerup, A. Cooper,
Am. J. Hum. Genet., 2003, 72, 48.
38.- M. S. Rodrguez Albarrn, J.
D. Casas, M. Garca-Bartual, E.
Arroyo-Pardo, Paleopath. News-
letter, 1999, 106, 9.
39.- H. Pfeiffer, H. Mrnstad, A.
Teivens, Int. J. Legal Med., 1995,
108, 19.
40.- S. Ohtami, K. J. Yamamoto,
Forensic Sci. Int., 1991, 36, 792.
41.- S. Ritz, H. W. J. Schtz,
Forensic Sci. Int., 1993, 38, 633.
42.- S. D. Shapiro, S. K. Endicott,
M. A. Provance, J. A. Pierce, E. J.
Campell, J. Clinical Inv., 1991, 87,
1828.
43.- P. M. Masters, J. L. Bada, J.
S. Jr. Zigler, Science, 1977, 268, 71.
44.- A. Turzynski, S. Ritz, Exp.
Clin. Endocrinology, 1994, 102 (1),
104.
45.- H. Mrnstad, H. Pfeiffer, A. J.
Teivens, J. Forensic Sci., 1994, 39,
1425.
46.- H. Poinar, M. Hss, J. L.
Bada, S. Pbo, Science, 1996,
272, 864.
47.- E. H. Man, M. E. Sandhouse,
J. Burg, G. H. Fisher, Science, 1983,
220, 1407.
48.- P. M. Masters, Forensic Sci.
Int., 1986, 32, 179.
49.- H. Pfeiffer, H. Mrnstad, A.
Teivens, Int. J. Legal Med., 1985,
108, 24.
BIBLIOGRAFIA
36
ADN ANTIGUO: QUMICA Y APLICACIONES
adn antiguo2.qxd 17/04/2008 12:23 Pgina 36
50.- S. Hummel, Ancient ADN
Typing: methods, strategies and
applications. Springer Verlag,
Heidelberg, Berln, Nueva York, pp.
193-197. 2003.
51.- P. Gill, P. L. Ivanov, C.
Kimpton, R. Piercy, N. Benson, G.
Tully, I. Evett, E. Hagelberg, K.
Sullivan, Nat. Genet., 1994, 6(2),
130.
52.- Sin autores, Nat. Genet.,
1994, 8(3), 205.
53.- L. A. Zhivotovsky, Ann. Hum.
Biol., 1999, 26(6), 569.
54.- S. A. T. Anderson et al.,
Nature, 1981, 290, 457.
55.- M. Krings, H. Geisert, R. W.
Schmitz, H. Krainitzki, S. Paabo,
Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 1999,
96(10), 5581.
56.- I. V. Ovchinnikov, A.
Gotherstrom, G. P. Romanova, V. M.
Kharitonov, K. Liden, W. Goodwin,
Nature, 2000, 404(6777), 490.
57.- M. Krings, C. Capelli, F.
Tschentscher, H. Geisert, S. Meyer,
A. von Haeseler, K. Grossschmidt,
G. Possnert, M. Paunovic, S.
Paabo, Nat. Genet., 2000, 26(2),
144.
58.- G. Gutierrez, D. Sanchez, A.
Marin, Mol. Biol. Evol., 2002, 19(8),
1359.
59.- J. D. Hawks, M. H. Wolpoff,
Int. J. Org. Evolution, 2001, 55(7),
1474.
BIBLIOGRAFIA
37
ADN ANTIGUO: QUMICA Y APLICACIONES
adn antiguo2.qxd 17/04/2008 12:23 Pgina 37