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Uso delle risposte biologiche per lo studio del cancro associato allesposizione ambientale
BIOMARCATORI
Alterazioni cellulari, biochimiche e molecolari misurabili nei tessuti, nelle cellule e/o nei fluidi biologici, e vengono convenzionalmente classificate come: misure di esposizione misure di effetto misure di suscettibilit
BIOMARCATORI
BIOMARCATORI
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antracene
pirene
Benzo[a]pirene
Benzo[e]pirene
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Sorgenti naturali: biosintesi effettuata dalle piante e dai batteri, dagli incendi dei boschi e dalle emissioni gassose durante le eruzioni vulcaniche Attivit antropiche: residui di combustioni incomplete in impianti industriali, e delle emissioni degli autoveicoli Fra gli impianti di riscaldamento la maggiore emissione di IPA si ha da quelli alimentati a legna
Sono presenti ubiquitariamente in aria, dispersi sotto forma gassosa e sotto forma adsorbita al particolato
Gli IPA contenenti quattro anelli, o un numero inferiore, in genere rimangono in forma gassosa quando vengono immessi nellatmosfera; gli IPA con pi di 4 anelli non permangono a lungo nellatmosfera, ma tendono a venire adsorbiti su particelle di fuliggine o di cenere
Poich molte particelle di fuliggine hanno dimensioni tali da essere respirate, gli IPA possono penetrare nei polmoni mediante la respirazione
I gas ed il particolato emessi dagli scarichi degli autoveicoli a motore diesel, che recentemente sono stati indicati come probabili cancerogeni per luomo contengono non solo IPA, ma anche alcuni composti derivati che presentano il nitro-gruppo, NO2, come sostituente: composti ancora pi cancerogeni degli IPA corrispondenti E stato inoltre dimostrato che gli IPA si possono combinare con lacido nitrico dello smog fotochimico
NO2
NO2
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Non vengono generalmente rilevati nellacqua oppure sono rilevati a basse concentrazioni
I benzopireni sono idrocarburi (con base C20H12) della serie aromatica, policiclici a cinque anelli benzenici condensati I pi comuni sono il benzo(a)pirene (o 3,4-benzopirene) e il benzo(e)pirene (o 4,5-benzopirene)
Tra gli idrocarburi policiclici aromatici alcuni, come il benzo[a]pirene sono noti come mutageni, cancerogeni e teratogeni (ossia tossici nel periodo dello sviluppo prenatale) In particolare il benzo[a]pirene considerato un composto rappresentativo che esercita tutti e tre i tipi di effetto tossico
Alcuni IPA sono cancerogeni transplacentari come dimostrato in saggi biologici in grado di produrre tumori del fegato, del polmone, del tessuto linfatico e del sistema nervoso della prole
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Per la popolazione generale, le maggiori vie di esposizione al B(a)P sono rappresentate dallinalazione dellaria ambientale o indoor e dallingestione attraverso lacqua e gli alimenti, con una notevole variabilit in funzione della dieta e dello stile di vita
Dai dati riguardanti lassunzione dagli alimenti e dai livelli di IPA nellacqua potabile si pu stimare che circa l1% dellassunzione totale con la dieta derivi dal consumo di acqua potabile stimato in 2 L/die
Benzo[a]piren-7,8-ossido Lepossido subisce un attacco nucleofilo da parte dellacqua, con formazione di un diolo, pi idrosolubile e quindi pi facilemente eliminabile
OH
H2O
HO O
Benzo[a]piren-7,8-diidro-7,8-diolo
O
Una parte delle molecole del diolo vengono ulteriormente epossidate regioe stereoselettivamente.
OH
HO OH
HO
benzo(a)pirene-7,8-diidrodiolo9,10-diidrodiossido,
benzo(a)pirene-7,8-diidrodiolo9,10-diidrodiossido,
H O H H N N HO HO OH N N NH
Il diolo epossidico viene legato al DNA attraverso attacco nucleofilo, ad esempio da parte della adenina Lattacco covalente del grosso residuo idrocarburico rappresenta un evidente danno per il DNA Questo danno provoca delle mutazioni e, con le mutazioni, una maggiore probabilit di cancerogenesi
Addotti IPA-DNA
Gli addotti IPA-DNA forniscono una misura del rischio potenziale di cancro perch rappresentano un passaggio critico nel processo di cancerogenesi e sono stati associati al rischio di cancro sia in studi sperimentali che nella ricerca epidemiologica osservazionale Gli addotti Benzo[a]pirene-DNA costituiscono una stima del danno al DNA da IPA e riflettono la variazione individuale nellesposizione, assorbimento, attivazione metabolica e riparazione del DNA, fornendo un dosimetro biologico individuale ed un marcatore del rischio
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Addotti IPA-DNA
Dati comparativi sui livelli di IPA-DNA nel sangue di madre e neonato sono stati studiati in 4 coorti:
Residenti a Manhattan Partecipanti allo studio degli effetti del disastro del World Trade Center (WTC disaster) Residenti a Cracovia, Polonia Residenti a Tongliang, Cina (CENTRALE ELETTRICA A CARBONE al centro della citt)
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Addotti IPA-DNA
Le coorti sono state scelte per rappresentare il range di esposizione ambientale agli inquinanti da combustione nellaria atmosferica in tutto il mondo o, nel caso dello studio sul disastro del WTC, per acquisire nuovi dati da un evento totalmente nuovo
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Addotti IPA-DNA
I dati disponibili sul monitoraggio dellaria indicano livelli medi di benzo[a]pirene che vanno da 0.5 ng/m3 a New York City (NYC) sino a >15 ng/m3 a Tongliang La coorte del disastro del WTC potrebbe avere una esposizione agli IPA maggiore della coorte di Manhattan a causa degli incendi del WTC Pertanto, le 4 coorti rappresentano un range di esposizione (30fold range) Northern Manhattan < WTC < Krakow < Tongliang
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OBIETTIVI
Determinare se i livelli di addotti al DNA differiscano nelle coorti in maniera coerente con il trend di esposizione ambientale stimata Studiare la potenziale diversa suscettibilit del feto al danno genetico e quindi al rischio di cancro rispetto alla propria madre
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All subjects in the four cohort studies are self-reported nonsmokers All subjects were interviewed prenatally using a questionnaire to elicit environmental and health histories, including exposure to tobacco smoke at home or work and dietary ingestion of PAH via smoked, broiled, barbecued, and grilled foods
METHODS
Briefly, a total amount of 100 mg DNA was used for each analysis. Many precautions were taken to avoid the presence of fluorescent contaminants: the absence of any fluorescent material in the purified HCl was checked by high performance liquid chromatography (HPLC); tubes, HPLC syringes, and other equipment were washed many times with HPLC-grade methanol; and a blank injection was done before each sample was subjected to HPLC analysis
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RISULTATI: MADRI
Among the mothers, there also was a significant trend across the four populations: Northern Manhattan < WTC < Poland < Tongliang t test for trend and regression analysis both, p< 0.001
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RISULTATI: NEONATI
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Risultati
NEONATI: la popolazione del Northern Manhattan non differisce significativamente dalla popolazione del WTC, ma entrambi i gruppi di neonati presentano valori significativamente pi bassi dei neonati delle popolazioni polacche e cinesi (p < 0.003)
MADRI: c un significativo trend tra le quattro popolazioni Northern Manhattan < WTC < Poland < Tongliang t test for trend e analisi di regressione, p < 0.001
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Risultati
In tutte le popolazioni, i livelli di addotti nei neonati sono simili o pi alti di quelli delle rispettive madri, nonostante basandosi su dati di laboratorio di esperimenti su animali, si stimi una dose 10 volte pi bassa nel feto
Nel Northern Manhattan, gli addotti sono significativamente pi alti nei neonati rispetto alle madri (p = 0.03, by paired Wilcoxon test); ma gli altri tre confronti neonati/madri non sono significativi
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Limiti
Un limite di queste analisi che le quattro popolazioni sono di differente etnia e il contributo di questo fattore alle differenze osservate non stato considerato Esistono dati limitati sulleffetto della razza/etnia sul pathway molecolare nella formazione degli addotti e il cancro nelluomo, ma i polimorfismi genetici coinvolti nel metabolismo e nella riparazione del DNA potrebbero influenzare entrambi gli outcome
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Conclusione
Lo studio ha mostrato che allinterno del range di livelli di esposizione considerati:
-
gradiente di esposizione, nelle madri e nei neonati - anche bassi livelli di esposizione determinano la formazione di addotti e quindi allaumentare di questi c un incremento del rischio di cancro nelle madri e nei bambini
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Conclusione
Lo studio ha mostrato inoltre che il livello di danno genetico misurato tramite i livelli di addotti IPA-DNA nel feto consistentemente pi elevato nel feto che nella madre
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Benzene C6 H6
Idrocarburo aromatico incolore, liquido e infiammabile utilizzato come antidetonante anche nelle benzine cosiddette verdi
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BENZENE
E un importante inquinante ambientale Lesposizione al benzene aumenta il rischio di anemia aplastica, leucemia ed altri disordini del sangue I metaboliti del benzene, chinoni reattivi, sono capaci di legarsi fra di loro e danneggiare le macromolecole, incluso il DNA
I metaboliti del benzene possono dare origine a specie reattive dellossigeno (ROS) che possono agire sulle funzioni mitocondriali
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Benzene C6 H6
Il benzene stato definito cancerogeno certo dalla International Agency for Research on Cancer (IARC) Appartiene al gruppo 1 in quanto esso causa dapprima danni: 1. Ematologici 2. Genetici 3. Cancro sottoforma di leucemia Non descritto in letteratura alcun effetto acuto attribuibile allesposizione al benzene alle basse concentrazioni caratteristiche dellinquinamento urbano Sono invece ampiamente documentati gli effetti conseguenti allesposizione prolungata nel tempo
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Mitocondri
Generano energia per le cellule tramite la sintesi di adenosina 5 trifosfato (ATP) I ROS provenienti da sorgenti esogene, cos come i metaboliti del benzene, possono danneggiare questa catena di trasporto degli elettroni e quindi anche il DNA mitocondriale (mtDNA) Il DNA mitocondriale pi suscettibile al danno rispetto al genoma nucleare, in quanto il mtDNA non presenta introni e manca degli istoni protettivi
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OBIETTIVO Studiare in uno studio occupazionale cross-sectional lipotesi che i mitocondri e lmtDNA sono coinvolti nella tossicit correlata al benzene
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mtDNA Assay
Il DNA estratto dai leucociti (phenol/chloroform) stato utilizzato per determinare il numero di copie di mtDNA mediante fluorescence-based quantitative PCR Primers for the PCR determined both the nuclear gene b-globin and the mitochondrial gene ND1 threshold cycle number (Ct)
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Risultati
Caratteristiche demografiche simili tra gli esposti e i non esposti I soggetti sono stati confrontati tenendo conto del consumo di alcol, infezioni recenti, fumo e body mass index 44
Risultati
White blood cells (WBCs) and most WBC subtypes, as well as the platelet counts, were reduced in benzene-exposed workers compared with controls, especially in high exposed workers Il numero di copie di mtDNA era di 117 (SD: 32) nei controlli e aumenta del 4% e del 15% nei lavoratori esposti a 10 ppm e a >10 ppm di benzene
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DISCUSSION
In this study, we found that the mtDNA copy number was increased proportionally with benzene exposure level, which may be a biological adaptation in response to the oxidative stress caused by benzene It may also indicate benzene-induced damage to mitochondria that is relevant to benzene-induced hematotoxicity It may be a biological marker of response to benzene exposure
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DISCUSSION
When physiological conditions are changed, the mtDNA copy number can be modulated
ROS and free radicals generated by environmental exposures (e.g., UV radiation, cigarette smoke, and air pollutants) and xenobiotics (e.g., drugs and betal quid) may induce the accumulation of mtDNA mutations in human tissue Oxidative stress-induced increase in mitochondria and mtDNA molecules may compensate for the decline of mitochondrial respiratory function. At the same time, ROS would be generated from the increased mitochondria in these cells. Consequently, it can cause more oxidative damage to mitochondria and other intracellular constituents
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CONCLUSION
This is the first report that benzene exposure was associated with increased mitochondria DNA copy number Benzene exposure may induce mtDNA amplification, possibly in response to oxidative stress caused by benzene The finding needs to be replicated by other studies
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DNA mitocondriale come biomarker deffetto: dallesposizione al benzene nelluomo al modello sperimentale in Armadillo officinalis
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Nelluomo lesposizione al benzene pu: - provocare danno cellulare - indurre amplificazione del DNA mitocondriale (mtDNA) in risposta allo stress ossidativo per compensare il danno sui mitocondri
OBIETTIVI
Armadillo officinalis Dumril, 1816
Gli isopodi terrestri sono organismi molto sensibili alle variazioni macro- e micro-climatiche e sono proposti come validi bioindicatori della qualit dellambiente
Validare lutilizzo di Armadillo officinalis come bioindicatore dellesposizione al benzene mediante un modello di studio sperimentale Obiettivo specifico: - mettere a punto un protocollo per la valutazione dellaumento del numero di copie di mtDNA in campioni di A. officinalis allaumentare delle esposizione al benzene
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50 mg/m3
5 mg/m3
0,5 mg/m3
RISULTATI
gene 16S
PCR qualitativa
Sample Name 15 5.0 ng (50 litri) 15 5.0 ng (50 litri) 6 5.0 ng (18.8 litri) 6 5.0 ng (18.8 litri)
ESPOSIZIONE
24 13 5.0 ng (18.8 litri) 25 26 27 28 13 5.0 ng (18.8 litri) 4 5.0 ng (11 litri) 4 5.0 ng (11 litri) 11 5.0 ng (11 litri)
Trend allaumento del numero di copie di mtDNA nei gruppi trattati a livelli crescenti di esposizione al benzene
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Risultati Epatopancreas
Gruppo Controllo: Non trattato
CONCLUSIONE
Possibilit di validare il nostro modello sperimentale e proporre A. officinalis come bioindicatore per il monitoraggio degli effetti del benzene per: - valutare e controllare la qualit dellambiente - evidenziare le correlazioni esistenti per la salute delle popolazioni umane che insistono sullo stesso ambiente
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Discussione e Conclusioni
Abbiamo quindi eseguito una quantificazione mediante PCR end-point ed stato evidenziato che, in campioni di epatopancreas, allaumentare dellesposizione al benzene aumenta il numero di copie di mtDNA. Questa correlazione non invece identificabile nei campioni ottenuti dal resto degli organi e tessuti L'epatopancreas, essendo il pi importante organo detossificatore di questi organismi, risulta essere maggiormente suscettibile ai danni causati dall'esposizione al benzene mostrando un aumento del numero di copie di mtDNA parallelamente all'aumento dell'esposizione allo xenobiotico
Discussione e Conclusioni
La presenza nell'ambiente di xenobiotici biologicamente attivi rappresenta uno stress spesso inaccettabile per gli organismi viventi. Attraverso lecosorveglianza si propone la quantificazione delle sostanze inquinanti nei fluidi biologici, nelle piante e negli animali e la valutazione degli effetti che le suddette sostanze producono Gli Isopodi rispondono rapidamente alle contaminazioni ambientali quindi alcuni ricercatori hanno usato gli isopodi per valutare la qualit dell'ambiente I risultati ottenuti nel presente studio confermano l'importanza di A. officinalis come bioindicatore utilizzabile per la valutazione dell'inquinamento ambientale, ma rivelano anche la necessit di approfondire le conoscenze riguardo a questi organismi, soprattutto in merito al miglioramento delle tecniche di estrazione del DNA
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Mitochondria
Involved in many intracellular metabolic pathways Provide energy to the cell through oxidative phosphorylation
Mitochondrial DNA
Mitochondrial DNA (mtDNA) is vulnerable to oxidative injuries due to the proximity of generated reactive oxygen species (ROS) and a low level of DNA repair mtDNA damage including mutations and/or rearrangements are considered to play an important role in the pathology of human disease
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Mutazioni Singole consistono in delezioni o inserzioni a carico del DNA presente nei mitocondri La divisione clonale dei mitocondri determina il propagarsi di queste mutazioni Mutazioni Multiple possono accumularsi nei tessuti post mitotici dei pazienti con mutazioni ereditarie nei geni nucleari, come Polimerasi Gamma del genoma mitocondriale (POLG1), coinvolta nella stabilit del DNA
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Quando le delezioni del mtDNA si accumulano al di l di una certa soglia, queste mutazioni sono associate a difetti patologici e fisiologici tra cui lo stress ossidativo, disfunzioni nella catena respiratoria e lesioni dei tessuti
La carenza di Folati provoca sia lesioni al DNA cromosomico e mutazioni del DNA mitocondriale
Un saggio di delezioni del mtDNA e carenza di folati effettuato su campioni di sangue venoso pu servire come marker utile per monitorare la correlazione tra folati e genotossicit del mtDNA
ACIDO FOLICO
Folati: composti ad attivit vitaminica correlati con lacido folico (AF)
Lacido folico, unica forma attiva dei folati alimentari assorbiti dallorganismo, una vitamina idrosolubile necessaria per tutte le reazioni di sintesi, riparazione e metilazione del DNA, nel metabolismo dellomocisteina e di altre importanti reazioni biochimiche
Per questo motivo sia i bambini che gli adulti necessitano di acido folico per produrre normalmente i globuli rossi e prevenire forme di anemia
LAF o acido pteroilglutammico una vitamina del gruppo B, la B9 LAF si compone, strutturalmente, dell'unione di tre molecole: 6-metilpterina, acido p-aminobenzoico (PABA) ed acido glutammico
Lacido folico pi stabile al calore rispetto gli altri folati presenti negli alimenti e per questo motivo viene usato in moltissimi paesi per fortificare le farine alimentari
Grazie a questa pratica stata ridotta in modo assolutamente evidente lincidenza delle malformazioni neonatali: Quelle a carico del sistema nervoso centrale come i DTN
I dati embriologici sottolineano limportanza dellapporto di folati in epoca periconcezionale nel ridurre linsorgenza di queste anomalie Nelle donne che intendono concepire, in Italia, fortemente raccomandata lassunzione di 0,4 mg al giorno di AF In casi selezionati a scopo profilattico, si raccomandano dosaggi pi elevati: 4-5 mg al giorno La prevenzione delle malformazioni fetali e dei DNT prevede lassunzione di acido folico alle dosi previste: un mese prima e fino tre mesi o pi dopo il concepimento
Tuttavia, va considerato che la cottura distrugge circa il 90% della vitamina contenuta negli alimenti
Caratterizzare le delezioni del mtDNA nei linfociti in relazione alla carenza di folato e valutare la loro associazione con le patologie connesse alle mtDNA deletions in vari tessuti tramite real-time PCR La dieta integrata con 8 mg acido folico/kg stata designata come dieta di controllo Ratti maschi Wistar appena svezzati (n=18) sono stati suddivisi a random ed alimentati con una dieta FD (Folate-Deficient) e una dieta controllo. Entrambi i regimi alimentari si sono protratti per 2 e 4 settimane (periodo di alimentazione), i ratti sono stati sacrificati per la raccolta del sangue e dei tessuti
Relazione tra livelli di folati nel citosol e nel mitocondrio di ratti alimentati con diete controllo e dieta FD
Linfociti Polmone
Stomaco
Muscolo
Intestino
Livelli di Folati nei linfociti e nei vari tessuti di ratti di controllo e alimentati con una dieta folate-deficient (FD)
Tramite confronto con i controlli, 2 settimane di dieta FD ha portato ad un aumento di 2.5 volte della frequenza di delezioni del mtDNA nei linfociti di ratto (P< 0.05)
Dopo aver consumato la dieta FD per 4 settimane, i linfociti di ratti con delezioni del mtDNA avevano accumulato fino a 3.5 volte il valore del controllo
Discussione
Laccumulo di mtDNA deletions nei linfociti sono stati osservati nelle prime 2 settimane di dieta priva di folati e rilevabili anche dopo 4 settimane di carenza di folati. Tutto ci suggerisce che le mtDNA deletions nei linfociti possono essere considerati utili biomarcatori
Carenza di Folati mtDNA deletions nei Linfociti mtDNA deletions nei tessuti periferici
In carenza di folato nella dieta, l'accumulo di delezioni del DNA mitocondriale stata osservata simultaneamente nei tessuti come il cervello, fegato, cuore, reni, pancreas, e muscoli
La carenza di folati pu interessare in generale tutti gli organi dei mammiferi, tra cui linfociti e tessuti periferici caratterizzati da un elevato stress ossidativo (fegato e tessuto muscolare), tutto ci pu causare gravi patologie correlate allinstabilit del mtDNA
Lalta sensibilit del mtDNA agli stress ossidativi e l alta quantit di mutazioni che accumula nelle lesioni neoplastiche lo promuovono come marker di abberazioni genomiche. Recenti studi dimostrano che l insufficienza di folati sia associata con linstabilit del mtDNA e che tutto ci favorisca la carcinogenesi
In questo studio lobiettivo quello di andare a monitorare le delezioni del mtDNA nei linfociti umani in relazione al livello di folati ematici Quest ipotesi stata validata con uno studio casocontrollo effettuato su 90 pazienti affetti da HCC e da 90 controlli divisi per sesso ed et
MATERIALI E METODI
Per evitare bias:
Casi e controlli sono stati reclutati nella medesima area geografica I controlli sono stati selezionati tra i non affetti da epatocarcinoma e inoltre privi di infezioni virali, malattie croniche al fegato, non facenti abuso di alcool
linfociti:
- Estrazione linfociti dal sangue - Lisi cellulare - Quantificazione concentrazione folati tramite ELISA READER Analisi delle delezione del mtDNA tramite real-time PCR - Amplificazione dei geni ND1 (livelli delezioni basse) e di ND4 (livelli delezioni elevati) mediante lutilizzo di primers e probes specifici - Quantificazione delle delezioni mediante la formula:
RISULTATI
Associazione tra delezioni dellmtDNA nei linfociti e livelli di folati nel sangue con rischio di HCC
Conclusione
I dati ricavati mostrano che, individui con alte frequenze di delezioni del mtDNA dei linfociti hanno un aumento del rischio di sviluppare lHCC (OR 77, 95% CI 198, 299; P=0003)
Laccumulo delle delezioni al mtDNA possono causare Alterata sintesi delle mt proteine Malfunzionamento della catena respiratoria Eccessiva produzione di ROS
Dai dati si evince che nei soggetti studiati (n=180) il numero di delezioni dellmtDNA inversamente proporzionali al livello dei folati nel siero (r 0155; P=0041) e nei linfociti (r -0314; P=00001).
Mitochondrial genomic stability and folate status in lymphocytes of healthy women of childbearing age
More frequent in tissues with high metabolic rate and low proliferative index
Delezione mtDNA4977 bp
Interessa una regione di 4977 bp (dal nucleotide 8.470 al 13.477) e comprende geni coinvolti nella fosforilazione ossidativa, tra cui varie subunit della NADH deidrogenasi (ND3, ND4, ND4L e ND5)
ND4 ND1
pi frequente nei tessuti con alto tasso metabolico e basso indice proliferativo
Il 31% dei fumatori e solo il 23% dei non fumatori presentavano almeno una mutazione somatica del mtDNA nelle cellule buccali: in particolare la delezione 4977 stata rilevata nel 4,8% dei fumatori e nel 3,3% dei non fumatori
La densit di mutazioni somatiche dellmtDNA (numero di mutazioni/10000 bp per individuo), significativamente pi alta nei fumatori (0.68) rispetto ai non fumatori (0.20)
Differenza statisticamente significativa nei profili di mutazioni tra fumatori e non fumatori
Questi risultati indicano che lesposizione al fumo di sigaretta influenza in misura maggiore lmtDNA delle cellule buccali dei fumatori
X2:: 23.21 (p<0,01) between individual age ranges and deletion rate
Quando le delezioni del mtDNA si accumulano al di l di una certa soglia, queste mutazioni sono associate a difetti patologici e fisiologici : stress ossidativo disfunzioni nella catena respiratoria lesioni ai tessuti
Obiettivi
Descrivere le caratteristiche generali della popolazione in studio, anche in riferimento allo stato nutrizionale Caratterizzare la presenza e la distribuzione della delezione mtDNA4977 nei linfociti delle donne arruolate nello studio, in relazione allo stato di gravidanza, allet, allo stato nutrizionale e alle altre caratteristiche rilevate
Estrazione del DNA da sangue intero mediante Illustra blood genomicPrep Mini Spin Kit (GE Healthcare)
Quantification of deletion
Real-time PCR relative-quantitative, of genes ND1 and ND4 to evaluate gene amounts and to obtain gene deletions value Use of specifics forward primer (L34853504), reverse primer (H35323553) for ND1 and ND4 genes
Specifics probes for ND1 and ND4 genes labeled with FAM e JOE fluorochromes
ND1
ND4
2 min a 50C 10 min a 95C 40 cicli di denaturazione a 95C per 15 e annealing-extension a 60C per 1
Le sonde TaqMan sono sonde ad ibridazione, specifiche per il frammento di interesse, marcate con molecole fluorescenti
Come i primers della PCR, vengono disegnati per essere complementari alla sequenza bersaglio da amplificare La sonda disegnata in modo da ibridarsi allinterno del frammento amplificato nella reazione di PCR
Costituita da un oligonucleotide che contiene allestremit 5 un marcatore fluorescente chiamato reporter e al 3 un quencher (un gruppo colorante in grado di mascherare lemissione luminosa)
Durante il processo di amplificazione lattivit esonucleasica 5-3 della Taq-polimerasi scalza la sonda determinando la separazione del reporter dal quencher, con una conseguente emissione di fluorescenza
Ct = CtND4 - CtND1
Un valore positivo di Ct indica una diminuita quantit del gene ND4 rispetto a ND1 Maggiore il valore di Ct maggiore il livello di delezioni
Results
Mean Age 28,4 years
Pregnant status
50,6%
Pregnant
49,4%
Non-pregnant
41,1%
Sigarette smoke
42,0%
15,8%
Smokers Non-smokers
58,0%
25,3%
52,3%
Underweight
39,2%
100%
80%
60% 40% 20% 0%
83%
88% 17%
Pregnant women Non pregnant women
Inadequate Adequate
Variables Age 1st quartile (14-23 years) Age 2nd quartile (24-28 years)
p-value
124 125
Age
3rd quartile
(29-34 years)
111
105 233 232 196 266 213 252 243 222 229 236 301 164 212 253 95 370
1.20 0.51
1.23 0.52 1.28 0.54 1.20 0.51 1.21 0.50 1.26 0.54 1.21 0.49 1.27 0.55 1.04 0.26 0.99 0.26 1.24 0.52 1.24 0.53 1.29 0.55 1.14 0.44 1.24 0.53 1.24 0.51 1.00 0.24 1.05 0.26
0.67
Age 4th quartile (35-49 years) Age 27 years (median value) Age > 27 years Smokers Non-smokers Inadequate folate intakea Adequate folate intake Folate deficiencyb No folate deficiency Pregnant Non-pregnant Underweight and normal weightc Overweight and obese Supplement users Supplement non-users Homozygous 677TT mutated genotype Other genotypesd
0.09
0.29
0.20
0.22
0.96
<0.01
0.97
0.19
Population characteristics
Multivariate analysis
and variables
p Age (below the median value: 27 years) Smokers Pregnant Overweight and obese Inadequate folate intake 46.8% (109) 46.1% (107) 48.9% (114) 38.6% (90) 46.8% (109) 53.4% (124) 38.7% (89) 49.6% (115) 31.9% (74) 44.8% (104) 0.77 0.92 0.25 0.32 0.55
OR (CI 95%)bc 1.09 (0.62-1.89) 0.97 (0.57-1.65) 1.68 (0.70-4.03) 0.75 (0.43-1.32) 1.52 (0.39-6.00)
0.18 0.33
22.4% (59)
18.0% (36)
0.43
1.27 (0.71-2.27)
Discussione
Il livello di delezioni del mtDNA nei linfociti di donne sane troppo basso per causare effetti biochimici significativi
Il basso livello di delezioni osservato potrebbe essere dovuto in parte al veloce turnover delle cellule del sangue Il range det delle donne reclutate piuttosto ristretto e let media bassa, quindi eventuali differenze relative allaccumulo delle delezioni del mtDNA con let potrebbero non essere state identificate
Discussione
Non stata osservata uninfluenza statisticamente significativa del fumo o dello stato nutrizionale sulle delezioni del DNA mitocondriale
Tutto ci potrebbe essere dovuto ad unelevata capacit delle cellule nucleate del sangue di riparare velocemente i danni dellmtDNA (von Wurmb-Schwark et all. 2010)
I risultati riportati nello studio potrebbero essere utilizzati come termine di confronto in successivi studi su popolazioni affette da patologie, per le quali la delezione potrebbe costituire un biomarcatore di esposizione o di effetto