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BIOTECNOLOGA VEGETAL PREGUNTAS DE EXAMEN CURSO 2012-2013

1. Describe brevemente las etapas de la propagacin de plantas mediante cultivo in vitro. Existen 5 etapas principales: 1. Seleccin del explanto: Entre los factores que influyen en la seleccin del explanto tenemos la edad ontolgica y fisiolgica de la planta donadora, el estado sanitario de la planta donante, la estacin en la que se recolecta, el tamao, el tipo de rgano que se utilizar como explanto. Es recomendable hacer crecer la planta donadora en un medio de cultivo mnimo para poder controlar su estado sanitario. As mismo los mejores explantos sern los que procedan de rganos jvenes; los materiales con mayor capacidad regenerativa son los tejidos meristemticos jvenes como yemas adventicias, yemas axilares, embriones y semillas. La primavera es la estacin ms fructfera ya que las yemas estarn activas y no en estado de dormicin. En la obtencin de los explantos debemos asegurarnos que se hace una correcta seleccin, aislamiento y esterilizacin. Para esto ltimo se realizan lavados sucesivos con agua, luego con etanol al 70%, concentraciones variables de hipoclorito sdico con tensoactivos, y finalmente enjuague con agua destilada. 2. Establecimiento del cultivo: Esta etapa se alcanza cuando el explanto se desarrolla. Los medios de cultivo deben facilitarle al explanto reguladores del crecimiento tales como auxinas, citoquininas y cido giberlico; as como las condiciones de crecimiento (luz, fotoperiodicidad) fuente de carbono, minerales, etc. 3. Micropropagain: Obtencin de varios cultivos independientes a partir de un nico explanto. El objetivo es mantener y aumentar la capacidad de los brotes para futuros nuevos ciclos de multiplicacin y en algn momento derivarlos a la etapa de produccin. Se recogen los explantos que brotaron en la etapa anterior, se cortan en brotes individuales. Luego se eligen los brotes de mayor tamao y se pasan a un medio de multiplicacin 4. Regeneracin: En esta etapa se regenera la planta completa. Pueden usarse dos aproximaciones, la organognesis y la embriognesis. Organognesis: Formacin sucesiva de los rganos de la planta. Se obtienen vstagos unipolares que en etapas sucesivas enrazan.

Embriognesis: Regeneracin de una planta a partir de una clula somtica siguiendo el patrn de desarrollo embrionario. Se forma el embrin somtico o embrioide que es una estructura bipolar 5. Aclimatacin de las plntulas: Las plntulas provienen de un ambiente estril y cerrado. Se les pasa a un medio fresco con condiciones controladas para evitar el estrs fotosinttico. Luego de forma gradual se les va pasando por tierra hmeda, invernadero y al medio ambiente. 2. Qu tipos de componentes contienen los medios para el cultivo in vitro de plantas? Por qu son necesarios? Basicamente deben contener: Fuente de carbono, son casi hetertrofos as que necesitan una fuente de carbno. La sacarosa es la ms utilizado, luego la glucosa. Minerales, los macro y micronutrientes son necesarios para generar plantas enteras. Destaca el Nitrgeno y el Potasio. Vitaminas, de todos los que se aaden para un buen crecimiento destaca el papel de la tiamina. Sustancias regulares del crecimiento: Dependiendo de lo que estemos buscando se aadir auxina, citoquinina, cido giberlico o ABA. Agente gelificante, en el caso se los medios semislidos, este nos proporciona el soporte. Otros compuestos, se pueden incorporar tambin a veces cidos orgnicos, aminocidos, etc. 3. Micropropagacin: qu es, tipos, ventajas e inconvenientes de cada tipo. Consiste en la propagacin de un genotipo a gran escala a travs de tcnicas de cultivo in vitro. Esto es posible gracias a la propiedad de totipotencia, es decir el poder regenerar una planta completa a partir de clulas vegetales cuando se les proporciona estmulos adecuados Tipos: Por brotacin de yemas axilares, es genticamente ms estable. Por brotacin de yemas adventicias (directa o indirecta) La desventaja de la forma indirecta es que se pasa por una etapa de desdiferenciacin con lo que aumentan las probabilidades de variacin somaclonal, aunque tambin podra ser una ventaja si lo que estamos buscando es encontrar una mejor variante. La directa es ms estable genticamente pero tiene menor capacidad de multiplicacin.

4. Explica las formas en que se puede realizar la regeneracin en un cultivo in vitro. Regeneracin: En esta etapa se regenera la planta completa. Pueden usarse dos aproximaciones, la organognesis y la embriognesis. Organognesis: Formacin sucesiva de los rganos de la planta. Se obtienen vstagos unipolares que en etapas sucesivas enrazan. Embriognesis: Regeneracin de una planta a partir de una clula somtica siguiendo el patrn de desarrollo embrionario. Se forma el embrin somtico o embrioide que es una estructura bipolar 5. Cmo se pueden obtener clones a partir de una planta minimizando la variacin somaclonal? Describe brevemente las distintas etapas La variacin somaclonal son los cambios ocurridos en las plantas regeneradas y que se transmiten a su progenie. Los factores que se deben tener en cuanta son: seleccin del explanto (quimerismo dentro de la planta donadora), evitar la formacin de un callo, regular el medio de cultivo, la temperatura, el oxgeno (la anaerobiosis da lugar a etanol que puede actuar como un mutgeno), evitar la acumulacin de metabolitos, uso de reguladores del crecimiento, los nmeros de subcultivos posibles. Para evitarla se debera utilizar como explanto una yema axilar. Luego esterilizamos el explanto. Lo pasamos a un medio de cultivo. Cuando haya crecido separamos los brotes y los pasamos a un medio de multiplicacin. En cuanto a la regeneracin, elegimos la organognesis formndose as la parte area primero y finalmente las races.

6. Qu es un embrin somtico? Para qu se puede utilizar? En qu se diferencia de un embrin zigtico? Un embrin somtico se genera a partir de una clula somtica. Se desarrolla sin fertilizacin. La ventaja es que se obtiene una mayor cantidad de embriones bipolares es decir que se obtiene una planta indiviual. Adems el desarrollarse a partir de una clula somtica representa una gran potencialidad de producir duplicados de un genotipo especfico. Es decir se puede conseguir la propagacin clonal. En cambio el embrin zigtico se forma por la unin de 2 gametos. Es decir se da de forma natural y no in vitro. 7. Cultivos de protoplastos: cmo se obtienen y para qu se utilizan. Los protoplastos son el material ms usado para la manipulacin de plantas. El quitar las paredes celulares y la conservacin simultnea de los componentes citoplasmticos y nucleares de la clula necesarios para la divisin de la celulula, deja a la membrana del plasmalema expuesta. Por lo que esta queda como la nica barrera entre el medio ambiente y el interior

de la clula totipotente. As tambin al no tener pared son ms fcilmente mutagenizables. Esto pues, facilita los experimentos diseados para la investigacin y manipulacin de la membrana, y los experimentos para poder seguir el efecto de la endocitosis de partculas extraas (RNA y DNA), molculas, virus, etc. Adems tambin estas membranas de los plasmalemas pueden fusionarse baja ciertas condiciones permitiendo as el proceso de hibridacin somtica para as obtener hbridos somticos. Para obtenerlas se debe tener en cuenta siempre las condiciones aspticas para su manipulacin y un buen manejo. Se pueden usar diversas partes de la planta: callos, pices de raz, pice de tallo, frutos, ndulos, microsporas, tubos polnicos. En la actualidad se usan tejidos del mesfilo de las hojas jvenes. Para su aislamiento se utilizan 2 enzimas: celulasa y pectinasa (a veces se necesita tambin hemicelulasa) Se quitan las paredes celulares sin causar dao irreversible a los protoplastos. Luego se debe asegurar el mantenimiento de un ambiente osmtico adecuado para estabilizar los protoplastos. Las fases del proceso son: Obtencin, propagacin y desinfeccin del material vegetal Eliminacin de la pared vegetal usando enzimas lticas en una solucin de alto contenido osmtico Recuperacin de los protoplastos (centrifugacin), eliminacin de enzimas por lavado y el paso a un medio de cultivo para la recuperacin de la pared y la promocin de las primeras divisones celulares de las clulas obtenidas de los protoplastos Cultivo de los microcallos obtenidos Regeneracin de plntulas a partir del tejido del callo Transplante y aclimatacin de las plantas

8. Describe cmo se obtienen las plantas haploides. Se vio que cuando se ponan granos (gimnospermas) de polen en un cultivo estos cambiaban su desarrollo esperado (como formar polen, tubos o gametos) y formaban un callo. En angiospermas se utilizaron anteras intactas que dentro tenan los granos de polen. En ambas se podan inducir los embriones para formar plantas haploides. Se hace de 3 formas:

Cultivo de anteras en medio semislido y la proliferacin de embriones derivados de polen y plntula por medio de la dehiscencia de anteras maduras. Cultivo de anteras en medio lquido y la liberacin del polen que dar lugar a embriones y plntulas (directamente formado del polen) Para un cultivo exitoso se debe tener el cuenta: la condicin fisiolgica de la planta donadora, tratamiento previo al cultivo aplicado a los capullos (fro o calor), el estado del desarrollo del polen cuando se recogen las anteras (primera divisin mittica de la ttrada), presencia o ausencia de reguladores del crecimiento en el medio (cambio de ruta gametognica a embriognica) 9. Obtencin de plantas libres de virus mediante cultivo in vitro. 1. Seleccin de un meristemo (se quitan hojas y primordios anteriores) Se utiliza el meristemo porque en esa zona hay una ausencia de tejidos de conduccin y la activa divisin de clulas estara dejando a estas fueras del alcance del virus 2. Esterilizacin de la superficie 3. Intoduccin en un medio de cultivo 4. Se incuba a 25 grados, 70% HR, fotoperiodo de 16 horas 5. Desarrollo del cultivo, en el transcurso de este proceso se pueden realizar repiques o subcultivos para ir midiendo el desarrollo y descartar tubos contaminados. 6. A los 75-80 dias se obtienen plntulas (con 4 o 5 nudos) y estas son micropropagadas en un medio adecuado 7. Con estas plntulas se realizan pruebas ELISA, PCR. Los que dan resultados negativos para virus se continan multiplicando. Se realizan 2 o 3 controles ms. 8. Regeneracin de plantas y algunas de estas plantas se transplantan a tierra ya que al tener mayor porte, aumenta la multiplicacin de las posibles partculas vricas. Se realiza esto por un ao antes de destinar el material a la multiplicacin masiva.

10.Enumera y define muy brevemente algunas de las principales etapas de la expresin gnica en eucariotas.
Controles transcripcionales Se elige qu genes encender o apagar, as como tambin regular la cantidad de ARNm producido. Esto se logra a travs de 2 mecanismos muy diferentes: El primero implica mantener apagados ciertos genes: en determinados tipos celulares, hay regiones de ADN que estn siempre apagadas y cuyos genes no se transcriben nunca. El segundo involucra el uso de regiones regulatorias, ubicadas en la secuencia anterior al inicio de la transcripcin. Estas secuencias permiten la unin de factores de transcripcin que pueden facilitar o impedir la unin de la ARN polimerasa al promotor, regulando de esta manera la cantidad de mensajeros producidos. Como ya vimos, para que la transcripcin ocurra es necesario que la ARN polimerasa se una al promotor del gen. Esta unin puede regularse utilizando ciertas protenas, denominadas factores de transcripcin, que se unen a secuencias especficas cercanas al promotor y pueden facilitar o impedir la transcripcin. Esta es una manera de regular la cantidad de molculas de ARN que se transcriben. Controles postranscripcionales Mecanismos de corte y empalme Mediante el splicing, los intrones secuencias no codificantes- son eliminados del pre-ARNm y los exones son unidos: el ARNm maduro est formado slo por exones. En ciertos casos, pueden quedar entre las secuencias de exones algunos intrones que son utilizados como molde en la traduccin. Esto se denomina splicing alternativo y en teora puede generar protenas diferentes, de manera proporcional al nmero de intrones que contenga el gen. Por medio de este mecanismo de regulacin se elige qu intrones sacar de la secuencia que va a ser traducida. Si una protena contiene tres intrones, se puede crear un ARNm con uno, dos o tres intrones entre la secuencia codificante. Como resultado obtenemos protenas similares, ya que los exones son iguales, pero su diferencia est dada por la secuencia de los intrones.

Edicin del ARN. En algunos casos, la secuencia del ARNm es modificada luego de ser transcripta. Los cambios incluyen la insercin de nucletidos en regiones especficas, lo que motiva un corrimiento en el marco de lectura y genera la expresin de protenas muy diferentes. Transporte del ARNm al citoplasma. Para poder ser transportado, el ARNm debe haber sido procesado correctamente; de lo contrario es degradado en el ncleo Iniciacin de la sntesis proteica. El ARNm contiene en sus extremos secuencias que no son traducidas y que sirven para regular la traduccin (5 UTR y 3 UTR, del ingls untraslated regions). Si esas secuencias son bloqueadas, el ARN no es reconocido por el ribosoma y no se puede traducir el mensajero. Por otro lado, las secuencias que flanquean el codn inicial (AUG) son determinantes. Si el ribosoma se saltea el saltea el primer AUG, comenzar la traduccin en el segundo codn produciendo una protena con menos aminocidos y/o secuencia diferente.

Estabilidad del ARNm. La vida media de un ARNm est determinada principalmente por la longitud de la cola poliA. Una vez en el citoplasma, la secuencia comienza a acortarse; cuando se hace demasiado corta el mensajero es degradado. Eliminacin de ARNm con errores. Los ribosomas junto con otras protenas- son capaces de detectar codones de terminacin en lugares errneos de la secuencia del mensajero (generados por algn error previo en el splicing o por mutaciones). Cmo lo hacen? Reconociendo las secuencias de unin entre los exones. Si el mensajero es adecuado, todos los lugares de unin entre los exones deberan

encontrarse antes del codn de terminacin. Si esto no ocurre, el ARNm fallado es degradado.

ARN de interferencia. Cuando una clula humana es infectada por un virus que fabrica una doble cadena de ARN, ciertas enzimas lo reconocen y lo degradan. Esto mecanismo permite la eliminacin de ciertos virus y puede ser utilizado tambin para regular la traduccin de un mensajero: si se introduce (o se transcribe en la misma clula) una cadena de ARN complementaria a un mensajero, este no podr ser traducido y adems ser detectado como forneo y degradado.

Controles postraduccionales Una vez sintetizadas, las protenas pueden ser modificadas mediante la unin de distintas molculas (grupos fosfato, adenilatos, azcares, etctera). Estos agregados permiten regular la accin proteica de manera muy rpida porque no dependen del proceso de sntesis. Existen adems ciertas protenas que contienen segmentos que, bajo ciertas condiciones, se activan y se separan de la molcula, que puede cambiar su actividad. Otro mecanismo de regulacin es la degradacin de protenas. La vida media de la protena puede ser un parmetro a regular que tambin acta de manera rpida. El sistema ubiquitina-proteosoma (que ya nombramos previamente) lleva a cabo la degradacin

11.Cules son los principales procesos en la expresin gnica del genoma nuclear en las plantas?. Explicar brevemente en qu consiste cada uno. Silenciamiento transcripcional: Su accin est dirigida hacia las secuencias regulatorias, como consecuencia deja de transcribirse el gen que se encuentra ro abajo. En este proceso los RNAs (silencing RNA) dirigen modificaciones en el DNA o en las protenas asociadas a l. Por ejemplo produciendo la metilacin de los residuos de citosina de ADN, como consecuencia modifican la cromatina. Tambin se modifican las histonas, las colas aminoterminales de las histonas que sobresalen del nucleosoma sobre todo H3 Y H4 constituyen una fuente de variabilidad. Existen modificaciones de dos tipos: Activadoras (acetilacin, metilacin de algunas Lys como en H3K4 y H3K36) y represoras (como en H3K9 y H3K27) Silenciamiento postranscripcional: Es un mecanismo inducible y especfico en el que la molcula blanco es el RNAm. Se desencadena la accin contra la RNAm por la homologa de la secuencia del RNAs que puede reconocer tanto el RNAm propio del individuo como el de un patgeno. En plantas se desencadena el silenciamiento postranscripcional por intermediarios de RNAds que pueden tener origen en: Transgenes nucleares cuyos transcritos forman naturalmente estructuras tipo horquilla. Transcritos aberrantes. Genes que se expresan a altos niveles Cualquiera sea el origen, una vez formando el RNAds ste es reconocido por la RNAasa DCR (Dicer) y procesada dando lugar a RNAsi (small interference). Estos se asocian al complejo Risc el cual degrada todo aquel ARN que comparta homologa con la secuencia que desencaden el proceso. Los RNAsi son capaces de migrar a las clulas adyacentes por medio de plasmodesmos, en la clula degradan el RNAm homlogo y se generan nuevos RNAsi amplificando as la seal. Los RNAmi son molculas de RNA de bajo pm que controlan la acumulacin de RNAm endgenos. Los RNAmi son codificados por genes endgenos con la particuliaridad de que no codifican para ninguna protena (Es decir el RNAm da RNAmi). Se originan por transcritos que se pliegan sobre s mismos de manera que una de las cadenas da el RNAmi y la otra es degradad. Una vez procesado, el RNAmi se incorpora al RISC que degradar el RNAm o inhibir su traduccin. Modificacin postraduccional: Si la protena est mal plegada se destruye por el NMD o por el proteosoma.

12.Qu tipos de RNA polimerasas transcriben el DNA nuclear en plantas? Explicar brevemente el papel de cada una de ellas. Las plantas tienen al igual que los animales 3 RNA polimerasas que se pueden diferenciar por sus propiedades fsicas, localizacin y funcin. RNAI: Se encarga del ARN ribosomal (28S, 5.8S, 18S) Se encuentra en el ncleo RNAII: Se encarga de los ARN mensajeros. Se encuentra en el nucleoplasma RNAIII: Se encarga de los ARN de transferencia, RNA ribosomales y otros RNAsn 13.Enumera y define muy brevemente algunas de las principales modificaciones que pueden sufrir las protenas despus de originarse por traduccin del mensajero correspondiente y que son necesarias para su funcionalidad. El control de la expresin de los genes en los vegetales no termina en la transcripcin. Existen niveles de control en la regulacin del RNAm, en la capacidad de la maquinaria celular para traducir estos RNAm y en las modificaciones postraduccionales de las protenas. Un aspecto estudiado en las protenas es su destino final en la clula. Las clulas vegetales tienen compartimentalizados en rganulos subcelulares la mayora de sus procesos metablicos. Con la excepcin de aquellas protenas que se sintetizan en cloropastos y mitocondrias, en resto de las protenas se sintetizan en el citosol o en ribosomas ligados a membranas. El RE es el lugar de sntesis, procesamiento y ensamblaje de las protenas secretoras o de aquellas que residirn en los diferentes compartimentos del sistemas de endomembranas o tambin llamado sistema secretor. El trnsito de una protena recin translocada al RE hacia el espacio intercelular hacia la membana plasmtica implica su transporte secuencial a travs de una serie de compartimentos ( RE, Golgis, vacuolas, lisosomas, membrana, etc) conectados por vesculas transportadoras. La entrada a la va de secrecin y posteriores procesos de transporte requieren una informacin especfica que est contemplada en la propia secuencia de la protena. El primer paso, la translocacin de una protena del citoplasma al RE depende de un pptido seal hidrofobico prsente en la secuencia N terminal de la protena. Una vez en el lumen del RE, muchas protenas son modificadas postraduccionalmente (por N glucosilacin, hiroxilacin, fosforilacin, formacin de puentes disulfuro) y/o ensambladas formando oligmeros para ser transportadas por va secretora. La ausencia de seales adicionales de retencin o de transporte en una protena conlleva su salida del RE y su secrecin al exterior de la clula.

Las que si tiene seales de retencin se encuentran en un compartimento especfico. Estas postraduccionales. seales de retencin pueden ser modificaciones

Adems para que una protena sea funcional debe plegarse en una conformacin tridimensonal. Esto ocurre de manera natural o por medio de chaperonas Tambin puede darse la ubiquitinizacin, donde las protenas que van a ser degradadas se ubiquitinizan y son conducidas al proteosoma.

14.Enumera y define muy brevemente algunas de las caractersticas principales del genoma de cloroplastos as como los principales mecanismos implicados en el control de su expresin en plantas vasculares. Son propios de organismos eucariotas o procariotas? El genoma de los cloroplastos es circular, de doble hebra y con mltiples copias por cloroplasto. La proporcin de bases GC es menor en el ADN cloroplstico que en el ADN nuclear. El ADN de los cloroplastos se localiza en ciertas regiones del cloroplasto denominadas nucleoides que presentan un punto a la envoltura del cloroplasto. El ADN de los cloroplastos codifica para tdos los ARN ribosomales de los ribosomas de los cloroplastos y todos los ARN de transferencia de cloroplastos, y algunas protenas. Se dice que los clroplastos tiene una autonoma gentica parcial pues algunas prtenas del cloroplasto son codificadas por el propio genoma del cloroplasto pero otras proceden del genoma nuclear. Las protenas codificadas en el ADN cloroplstico se sintetizan exclusivamente en los ribosomas de los cloroplastos. No se ha identificado ninguna protena sintetizada en cloroplasto que pasa a citoplasma. En cambio muchas protenas codificadas en el ncleo se incorporan a los cloroplastos. Los genes que se transcriben sufren un control gnico post-transcripcional que incluye: eliminado de intrones, edicin de transcritos (residuos de citosina se cambian a uracilo) y splicing de ARNm policistrnico. Los cloroplastos son capaces de producir protenas eucariotas porque permiten el plegamiento y la formacin de puentes disulfuro gracias a a presencia de chaperonas y sistemas enzimticos endgenos.

15.Describe la estructura general del plsmido Ti de Agrobacterium tumefaciens haciendo referencia a las diferentes regiones y su funcin. Explica brevemente tipos de vectores que se utilizan para transformacin de plantas con esta bacteria. La capacidad patognica de Agrobacterium se debe a la presencia de megaplsmidos Ti o Ri. Durante la patognesis un fragmento de estos plsmidos llamado TDNA es transferido a la planta y se integra en su DNA. El TDNA contiene genes llamados oncogenes que se expresan edificentemente en la clula vegetal y producen sntesis de hormonas. Adems tienen genes responsables de la sntesis de opinas (Fuente de C y N) El TDNA est delimitado por dos repeticiones: borde izquierdo y borde derecho. Y son los nicos elementos necesarios para dirigir el procesamiento del TDNA. El TDNA es grande y contiene genes con secuencias regulatorias tpicamente eucariotas (promotores y secuencias de poliadenilacin) y por eso son tan eficientes en vegetales. Luego de que Agrobacterium se adhiere a la clula vegetal, se produce la transferencia del TDNA mediada por el gen vir. Para realizar la transformacin se reemplazan los genes de opinas y oncogenes por un gen de seleccin y un gen de inters. Resultad difcil introducir genes en el TDNA usando tcnicas habituales de ADN recombinante. Por esto se han desarrollado dos sistemas de vectores: Vectores cointegrados: Se introduce por recombinacin homloga Vectores binarios: Tienen un TDNA no oncognico en un plsmido helper pequeo. Se basa en la capacidad de los genes vir de actuar en trans movilizando el TDNA presente en otro plsmido. 16.A qu llamamos genes marcadores o informadores y genes de seleccin en transformacin gentica de plantas? brevemente y poner algn ejemplo de cada uno de ellos. Explicar

Los genes de seleccin permiten a la clula transgnica crecer en un medio de seleccin (Ex: resistencia a antibiticos). Tambin pueden permitir utilizar diferencialmente un sustrato (Ex: poder utilizar la manosa) Los genes informadores posibilitan ver directamente las clulas que lo expresan. Estos genes codifican para protenas no presentes en las clulas vegetales y producen un fenotipo caracterstico fcilmente visualizable. Ex: Gen gus, luciferasa y GFP. Gus A codifica para la B glucoronisada. En presencia de un sustrato especfico esta enzima cataliza la produccin de un precipitado azul. Ex: estudio de expresin de un promotor en plantas.

Se pone en el vector con la secuencia Gus a bajo el control del promotor de estudio y una secuencia de terminacin de transcripcin. Se introduce en Agrobacterium y luego esta infecta a la clula vegetal. Se obtiene la planta transgnica y se estudia la expresin del promotor (dnde y cundo se expresa) por tincin histoqumica

17.Queremos modificar una funcin en una planta. Describe brevemente las tcnicas que se pueden utilizar para identificar el gen responsable. Tcnicas: Investigacin de bibliotecas genmicas y de cDNA: si la funcin es la produccin de protenas, se puede determinar la secuencia de aminocidos y podra sintetizarse qumicamente un oligonucletido. El oligonucletido hibrida con la secuencia de hebras simplexa del DNA de la biblioteca si estuviera presente el gen que codifica par la protena. Tambin se puede aislar los genes especficos del desarrollo o de tejido se usa el mtodo de la hibridacin diferencial. Las bibliotecas de cDNA se elaboran a partir de los tejidos. Una de las bibliotecas se sondea independientemente con cada una de las bibliotecas marcadas radioactivamente, o con mRNA, y los clones que sean comunes a ambos tejidos hibridarn con ambas. No obstante, los clones de inters, no hibridarn con las dos bibliotecas y podrn clonarse.

Mutagnesis por transposn: consiste en la alteracin estructural y funcional o la inactivacin de un gen que tiene lugar cuando una secuencia de DNA extrao introducida en la planta se inserta en l. Si la introduccin de este transposn da lugar a un fenotipo alterado, podr utilizarse una secuencia de DNA marcada radioactivamente complementaria de la del transposn para sondear fragmentos de DNA de una biblioteca genmica preparada a partir de plantas transformadas, de manera que las secuencias gnicas que flanquean el transposn puedan aislarse. 18.Sistemas modelo en biotecnologa vegetal: qu son, por qu son necesarios. Ventajas y limitaciones de Arabidopsis thaliana como planta modelo. Son especies que por sus caractersticas y por la informacin permiten realizar estudios de una forma ms sencilla. conocida corto.

Ventaja: tamao pequeo, forma miles de semillas pequeas, ciclo de vida

Permite hacer 3 4 generaciones en un ao, admite autopolinizacin y la polinizacin cruzada, genoma relativamente pequeo, fcil de transformar sin pasar por una fase de regeneracin, se dispone de variedad de genotipos, genoma muy conservado. mucha informacin, leosas. gran No

Limitaciones: Es una herbcea. No es posible como modelo para las permite el estudio de la maduracin de frutos y ptalos.

19.Mtodos para la introduccin de varios genes en el genoma de una planta. La transformacin gentica permite introducir variabilidad gentica como expresin de secuencias antes no presentes en la especie, expresin de nuevas formas allicas, expresin de secuencias codificantes ya presentes pero ahora bajo el control de nuevas secuencias regulatorias Un inconveniente es la incorporacin de varios genes, que se pueden necesitar para una ruta biosinttica, o para la obtencin de resistencia a enfermedades. Para lograr esto se utiliza: Cruzamiento de 2 plantas transgnicas Contransformacin en el mismo evento: La estrategia ms sencilla es la co-

transformacin de una misma clula con dos cepas de Agrobacterium portando construcciones diferentes, una conteniendo el transgn de inters y otra el gen selector
Transgenes policistrnicos, Protenas de fusin Bombardeo de micropartculas: ms fcil no necesita vir ni los bordes 20.Explica brevemente las siguientes afirmaciones: 1- Se pueden utilizar plantas transgnicas para determinar la funcin de un gen: Cuando tu haces una transgnicas lo que haces es modificar un gen, tras hacer esto puedes estudiar su funcin. Esto se debe a que puede hacer una planta transgenica que tengo un gen silenciado o sobreexpresarlo y ves el fenotipo que tiene; en el primer caso sera la ausencia del fenotipo y en el otro ser la formacin del fenotipo. 1- La genmica permite abordar el estudio de los caracteres complejos en plantas: La genmica es una subdisciplina de la gentica que se ocupa del mapeo, secuenciacin y anlisis de las funciones de genomas completos. Podemos saber que gen regula a quien, conocer sus promotores, comparar secuencias, realizar predicciones acerca de todas las protenas codificadas por una especie, establecer las variaciones genticas entre distintas poblaciones de una misma especie, comparar secuencias de diferentes especies y entender procesos evolutivos 2- Los sistemas modelo vegetal: simplifican se debe la a investigacin que al tener en biotecnologa Esto mucho

informacin de una sola planta puedes hacer investigaciones en ella y por lo tanto puedes simplificar la investigacin debido a que ya tienes casi todo hecho. Por ejemplo en el caso de Arabidopsis: Genoma pequeo (125 Mb total), mapas genticos y fsicos completos de sus cinco cromosomas, un corto ciclo de vida (alrededor de 6 semanas desde la germinacin a la formacin de semillas), produccin prolfica(se reproduce fcilmente) de semillas y fcil cultivo en cmaras

de cra, eficiente transformacin utilizando Agrobacterium tumefaciens, un alto nmero de mutantes disponibles (Stock Centers). 3- Los sistemas de expresin transitoria de genes permiten optimizar la obtencin de protenas en plantas: La expresin transitoria de genes de plantas implica la expresin de protenas recombinantes sin necesidad de transformacin del material gentico de la planta. Mediante distintos mtodos se consigue producir grandes cantidades de RNA mensajero, que se traduce a protenas en el citoplasma de parte de las clulas de la planta. Una vez traducido a protenas la planta lo degrada. Se utiliza para evaluar la funcionalidad de las construcciones que se utilizan para la transformacin estable, y para evaluar la calidad del producto que se obtiene. 21.Pon un ejemplo de la mejora de la productividad vegetal mediante la obtencin de una planta transgnica. Golden Rice: Es un arroz que sintetiza B caroteno desde el endospermo. Se utiliza el arroz porque es la principal fuente de alimentos para ms del 30% de la poblacin mundial. El arroz silvestre no produce carotenos, los carotenoides son provitaminas para la sntesis de vitamina A. La avitaminosis A produce ceguera irreversible y baja activacion del SI, el caroteno en mamiferos interviene en la sntesis de retinol. Uno de los principales precursores de la sntesis de carotenos es el Geranil geranil difosfato (GGPP). En el arroz el GGPP se destina hacia la sntesis de clorofla y giberelina. Para la sntesis de carotenoides en el arroz se utilizaron genes del Narciso (Narcissus pseudonarcissus) y de una bacteria (Erwinia uredovora) donde l gen psy codifica para la fitoeno sintasa, el gen crtl codifica para la fitoeno desaturasa y la caroteno desaturasa, el gen Icy codifica para la licopeno ciclasa. El gen de inters se aade al plsmido Ti de la bacteria.La bacteria transformada se cultiva para la clonacin del plsmido. Se cocultiva el callo con A.tumefaciens transformadas. Las bacterias inocularn el plsmido Ti a las clulas.Los callos se pasan a un medio

restrictivo y se procede a su seleccin.

22.Se

desea

obtener

una

Brassica

nigra

tolerante

las

bajas

temperaturas mediante la sobreexpresin de un gen regulador. Qu herramientas se podran utilizar para identificar un gen candidato? Cmo se podra analizar la funcin del gen identificado? Mediante la clonacin posicional Parentales con fenotipos contrastantes Construccin del mapa a partir de la F2 utilizando marcadores moleculares y

sobre este marco se identifican las regiones cromos micas asociadas al control de dicha tolerancia. Ya identificado, se debe aumentar la resolucin: Esto se logra saturando dicha regin con nuevos marcadores moleculares e incrementando el n mero de individuos de la poblacin, a fin aumentar las posibilidades de encontrar recombinantes entre marcadores estrechamente ligados. Muchos de estos marcadores pueden obtenerse del mapeo comparativo en regiones cromosmicas ortlogas de especies emparentadas con genomas menos complejos. (cebada, sorgo, arroz) Se contina con el chromosome walking, se selecciona de la biblioteca del genoma de la Brassica aquellos clones que hibriden con los marcadores flanqueantes al intervalo portador del gen Los clones seleccionados en la hibridacin contra la biblioteca son digeridos con enzimas de restriccin para identificar en cada caso fragmentos compartidos y no compartidos. Los fragmentos no compartidos corresponden a los extremos de estos clones parcialmente solapados entre s . Estos extremos se utilizan como nuevos marcadores para extender la caminata cromosmica hacia el gen, reiniciando la bsqueda de clones en la biblioteca genmica. Este proceso contina hasta lograr que el mapa fsico (secuencia nucleotdica) que se ha iniciado desde cada marcador flanqueante forme un continuo o "contig" de fragmentos de ADN genmico de Brassica. Este contig contiene la secuencia del gen en estudio. El paso siguiente consiste en la secuenciaci n del contig. A partir de esta informacin, y por anlisis de secuencia con herramientas bioinformticas, se determinan los genes presentes y aquellos posibles candidatos del carcter en estudio. La prueba definitiva para establecer el hallazgo del gen en cuesti n es la prueba de complementacin. Esto consiste en transformar una planta que carece del car cter en estudio (siguiendo con el ejemplo, una variedad de Brassica intolerante al fro) con cada uno de los genes candidatos y determinar cu l de ellos le confiere el carcter.

23.Describe las ventajas e inconvenientes de la utilizacin de genes R para obtener plantas transgnicas resistentes a patgenos. Los genes R son los genes de resistencia vegetal que participan en la defensa de la planta de hongos, bacterias y nematodos. Se cree que la mayora de genes R codifican para receptores protecos que reconocen y se unen a las molculas especficas generadas por los patgenos. Estas uniones alertan a la planta de la presencia del patgeno. Los productos de los genes R estn distribuidos en ms de un lugar de la clula (exterior de la membrana, citoplasma). Se puede lograr la resistencia a patgenos de dos maneras: Resistencia horizontal: La resistencia a patgenos se establece a travs de la va de induccin de seales del cido saliclico. Es una respuesta duradera y resistente ya que es poco probable que evolucin a resistir muchos genes que slo a uno. Resistencia vertical: Se da el reconocimiento especfico del producto del gen Avr del patgeno y el producto R de la planta. Provee de una resistencia total pero es temporal. Puede evolucionar porque es un gen del patgeno. Ventajas: El uso de genes R puede servir para aumentar la resistencia frente a un patgeno o varias cepas del patgeno pero a menudo la sntesis de su protena depende a menudo de complejos caminos metablicos. Cuando es inducida en el momento y por el perodo preciso, las respuestas iniciadas pueden detener eficientemente el proceso de infeccin con un dao mnimo para la planta. Desventajas: Su uso como genes para conferir resistencia se limita a aquellas especies o variedades relacionadas con la original portadora del gen, puesto que se requiere la presencia en la planta de toda la cadena de transduccin de seales acoplada al producto del gen R. El monocultivo de variedades portadoras de un gen R determinado puede llevar rpidamente a la aparicin de cepas de patgenos resistentes. Muchos productos de los genes R slo confieren resistencia a un nmero limitado de cepas y, por lo tanto, su espectro de accin es parcial.

24.Describe las ventajas e inconvenientes que presenta la obtencin de sustancias exgenas en plantas transgnicas con respecto a otros sistemas de produccin. Ventajas: Sistema barato, escalable (en funcin de la demanda del producto), organos/orgnulos de almacenamiento naturales, tecnologa bien desarrollada (tcnicas agrcolas, recoleccin, procesamiento), fFlexibilidad

metablica: permite la modificacin de rutas sin transferir en el desarrollo o metabolismo. Retos y limitaciones: Regulacin de la homeostasis (impredecible), puesta a punto (paso a campo), Extraccin y purificacin encarece el proceso, diferenciacin del consumo alimentario. Microorganismos: tienen la ventaja de facilidad en las tcnicas de ingeniera gentica, tecnologa bien desarrollada y productividad, pero tienen el inconveniente de condiciones esteriles en todo momento. Sntesis qumica: la ventaja es la pureza del producto, pero el inconveniente es un elevado coste, contaminacin con metales pesados, y no tienen estereoespecificidad. 25.Qu problemas plantea la modificacin de la lignina mediante la obtencin de plantas transgnicas? La lignina es un componente importante de la pared celular de plantas vasculares y durante mucho tiempo ha sido reconocida por su impacto negativo sobre la calidad del forraje, en la fabricacin de papel y ms recientemente en la obtencin de biocombustibles a partir de celulosa. Para las dos este componente un estorbo, sin embargo, es la razn de ser de los rboles, ya que est encargada de transportar el agua y los nutrientes y proporciona la rigidez propia de la madera, adems, defiende a las plantas del ataque de los virus y de las bacterias Los efectos negativos de la lignina sobre la digestibilidad dependen de su contenido, composicin de monmeros y grupos funcionales y del grado de entrecruzamiento con los polisacridos de la pared celular. Existen tres niveles de control para la manipulacin gentica de ligninas, a saber: la sntesis de monolignoles, el transporte de los mismos desde el sitio de sntesis al de polimerizacin, y el de polimerizacin de monolignoles para dar los productos finales. Estrategias para mejorar a digestibilidad: Regulacin negativa de las enzimas involucradas en su biosntesis de monolignoles: Se ha encontrado que los genes pal, c4h , c3h y 4cl . Tambin comt, ccoaomt y cad son buenos blancos para alterar el contenido y composicin de ligninas. 26.Describe las ventajas e inconvenientes de la utilizacin de cultivos celulares para la produccin de metabolitos secundarios. Los callos obtenidos a partir de un explanto pueden disgregarse para obtener una suspensin celular. Esta suspensin celular se utiliza para obtener embriones somticos o puede cultivarse para obtener metabolitos secundarios. Ventajas: Independizarse de factores externo como: Cambios de T, sequas, plagas, variabilidad de la produccin, etc. Evitar la extincin de especies vegetales. Disposicin de condiciones controladas para los procesos de extraccin y biosntesis. Aumentar la variabilidad en la produccin de compuestos con 1 o ms C quirales. (ms econmico). Obtencin de

compuestos no presentes en la planta a madre. Desventajas:

Establecimiento de

procesos de biotransformacin llevados a cabo por enzimas vegetales.

Es caro porque el personal es especializado. El medio de cultivo es especfico dependiendo del metabolito que se quiere obtener, no se puede utiliza cualquier biorreactor si no uno especfico, inestabilidad gentica, posible contaminacin. 27.Cmo se selecciona y mantiene una lnea celular altamente productiva para la obtencin de un metabolito secundario? Cuando obtenemos una lnea muy productiva lo que se hace es obtener callos y de estos se seleccionan los ms productivos. Se hace una suspensin celular y se plaquea. Se dejan crecer y se vuelven a seleccionar (2 o 3 veces) A partir de la lnea seleccionada se hace crioconservacin y se toman muestras para la produccin. Luego de aquellas destinadas a la produccin, se introducen en un medio (con hormonas como auxinas y citoquininas) y proliferan las clulas. Para la proliferacin se necesitan nutrientes en cambio para la produccin no deben haber macronutrientes ni hormonas salvo la ABA que es una hormona de estrs. La produccin se puede realizar de 3 formas: continuo, discontinuo, y semicontinuo. 28.Explica qu son y para qu sirven los medios de proliferacin y de produccin en los cultivos celulares. Medio de proliferacin: Este medio permite la multiplicacin de las clulas vegetales, que involucra un crecimiento de las mismas, y por tanto un aumento de la biomasa. Contiene gran cantidad de nutrientes y de hormonas como auxinas y citoquininas. Medio de produccin: Se trata de un medio que aporta las condiciones necesarias para que se genere el compuesto de inters, activan el camino metablico del metabolito deseado. Se ha visto que la produccin mejora si en el medio no hay macronutrientes ni hormonas de crecimiento, y que aumenta cuando se aaden al medio hormonas de estrs como ABA. Se ha visto que condiciones de cultivo que promueven la proliferacin, no favorecen la produccin, y viceversa. Esta relacin inversa entre las sntesis de protenas y de metabolitos secundarios se puede explicar por la utilizacin diferencial y antagnica de precursores comunes. Por ejemplo: La limitacin en la fuente de nitrgeno tiende a suprimir el crecimiento, y en algunos sistemas a aumentar la sntesis del producto deseado.

29.Optimizacin de la produccin de metabolitos en cultivos celulares. Debida a la demanda y utilidad de los metabolitos en la industria farmacutica y alimentaria, donde por ejemplo se consigue mentol y las drogas anticancergenas, como los taxoles y algunos edulcorantes. Es necesario optimizar su produccin Se plantean diversas estrategias: Seleccin de especies vegetales apropiadas. Seleccin de lneas celulares mejoradas. Optimizacin de las condiciones de cultivo. Agregado de precursores. Suspensiones, rganos y Cel. Inmovilizadas. Uso de elicitores microbianos y de estreses abiticos. Permeabilidad y remocin in situ. Contar la pregunta 27 y pregunta 30

30.Cultivos de clulas inmovilizadas: cmo se obtienen, ventajas con respecto a otros sistemas de cultivo de clulas. Se emplean en la obtencin de metabolitos secundarios de inters que se secretan al medio. Primero se da una etapa de proliferacin y posteriormente se inmovilizan la clulas, sostenidas por algn tipo de sustrato biolgicamente inerte y plano. Existen dos tcnicas de uso habitual para su obtencin: Imbibicin: las clulas estn embebidas en un gel polimrico (Alginato clcico, agar, agarosa). Adsorcin: las clulas estn inmovilizadas en esferas o mallas porosas, o sistemas de membrana de fibra hueca. Acetato de celulosa (fibra) Policarbonato de silicona (fibra) La inmovilizacin celular tiene como ventaja: La biomasa producida puede ser utilizada continuamente, es un medio ms estable que dura mucho tiempo porque no prolifera. Tiene altos niveles de produccin de biomasa. Se crea un microambiente en el que son ms viables, la aireacin es mejor Las clulas pueden ser separadas fcilmente del medio de cultivo.

31.Ventajas de las plantas como sistemas de produccin de protenas exgenas. El cultivo in vitro ofrece tambin la posibilidad de sintetizar protenas forneas en determinadas situaciones que incluyen protenas teraputicas y antignicas. El proceso de extraccin puede ser ms simple, rpido y eficiente Los tiempos de produccin son ms cortos que en animales transgnicos. El coste del proceso es menor. Ausencia de contaminantes, patgenos y toxinas de origen animal. Procesamiento post-traduccional mejor que en microorganismos. rganos naturales de acumulacin, donde se mantiene estable. Posibilidad de consumo directo.

32.Qu problemas plantea la utilizacin de plantas transgnicas como sistemas de produccin de protenas exgenas? Qu estrategias se utilizan para resolver esos problemas? Se deben optimizar una serie de convenientes: Nivel de expresin bajo o inconsistente: Como se deben conseguir plantas con una expresin consistente se han modificado: - Los promotores adecuados: 35S en dicotiledneas, y ubiquitina en monocotiledneas. - Promotores especficos para cada tipo de planta. - Correccin de codones ms frecuentes en plantas. - Extremos 5 y 3 UTRs, que aportan estabilidad a los transcritos, y eficiencia de traduccin. - Uso de intrones (cereales). - Acumulacin en RE (retculo endoplasmtico), donde las protenas sufren glicosilacin y el Golgi sigue el proceso, al aadir la secuencia KDEL (LysAsp-Glu-Leu), queda retenida en el RE y no se glicosila, de manera que se genera un entorno muy estable que favorece el ensamblaje de la protena. - Transformacin de cloroplastos, se produce mucha ms cantidad de protena. - Expresin transitoria con virus, agroinfiltracin.

Patrn de glicosilacin: Afecta a la protena porque interviene en la adicin de cadenas de manosa (RE), resduos de xilosa y fucosa (Golgi). Afecta a estabilidad y actividad biolgica de la misma: Solucin: humanizacin de glicanos vegetales mediante: - Expresin de galactosil-transferasa. - Silenciamiento de xilosil- y fucosil-transferasas. - Retencin en RE.

Silenciamiento: Mediante la correccin de codones y evitando repeticiones de secuencias.

Extraccin y purificacin: Aumenta mucho los costes. La extraccin es acuosa en fro. - Problemas: la oxidacin por fenoles y la degradacin proteoltica. - Soluciones: la adicin de estabilizantes, inhibidores de proteasas para evitar la senescencia.Tambin se utilizan fusiones con oleosina o con pptidos sintticos, como protenas quimricas que se quedan en la fase oleosa y es ms fcil de purificar, puesto que el resto estarn en la fase acuosa.

Control dosis Separacin de la cadena alimentaria Contaminacin ambiental: Se utilizan promotores inducibles para evitarla, o en la produccin postcosecha. Puesta a punto: Se emplea la expresin transitoria

33.Describe las ventajas y desventajas que presenta la produccin de protenas en cloroplastos de plantas transgnicas. Se trata de un sistema de expresin integrativos, un sistema que permite la integracin estable de una construccin gentica en el genoma vegetal. La transformacin de cloroplastos, orgnulo que contiene su propio genoma, es una alternativa muy interesante para la expresin de protenas por: El gran nmero de cloroplastos por clula y el gran nmero de copias de su material gentico dentro de cada cloroplasto, lo que permitira alcanzar altos niveles de expresin. Las protenas sintetizadas son mantenidas en el cloroplasto y no son transportadas a otros compartimentos celulares. Al no transmitirse los cloroplastos al polen en la mayora de las plantas, el riesgo de transmisin horizontal a especies relacionadas es nulo, es una transformacin estable y heredable. Insercin dirigida del transgn: La incorporacin del transgn se produce por recombinacin homloga en una zona precisa y conocida evitndose el efecto de posicin. No se produce el fenmeno del silenciamiento gnico. Existen varios sistemas de eliminacin del gen marcador de seleccin con posterioridad a la transformacin. Vectores policistrnicos: Gracias a la maquinaria procaritica de expresin en los plastidios se puede expresar varios genes simultneamente con un solo opern. Pero tambin presenta algn inconveniente: Requiere etapas de cultivo de tejidos y mtodos de transformacin eficientes. Es un proceso lento y costoso. Transferencia de los transgenes: Se puede producir transferencia horizontal entre plastidios y bacterias, debido a la homologa que existe entre ambos genomas. Ausencia de glicosilacin: Que se produce en el retculo endoplasmtico y en el aparato de Golgi. Tecnologa no rutinaria, principales obstculos: i) Inexistencia de protocolos optimizados de regeneracin in vitro. ii) Ausencia de vectores de transformacin eficientes para los diferentes cultivos. iii) Falta de marcadores de seleccin adecuados.

34.Utilizacin de virus vegetales para la obtencin de protenas exgenas en plantas: para qu sirve, ventajas e inconvenientes. Otra estrategia para obtener plantas transgnicas son los virus

recombinantes capaces de expresar transgenes durante su replicacin en el husped. Uno de los sistemas virales ms utilizados es el virus del mosaico del tabaco (VMT) y los vectores derivados. La principal ventaja de los sistemas virales es su capacidad para amplificar el nmero de copias del gen insertado, lo que se traduce en un mayor nivel de expresin. Los inconvenientes son la inestabilidad y la necesidad de inocular cada planta, lo cual dificulta mucho la produccin a gran escala. Se utiliza para la obtencin de planticuerpos.

35.Disea un

sistema para

obtener una planta transgnica que

produzca un planticuerpo de secrecin. La expresin de anticuerpos en plantas puede lograrse mediante la utiizaicon de vectores vricos vegetales insertando los genes que codifican para la cadena ligera y pesada en posicin 5 con respecto a la secuencia de genes que codifican protenas de la cpside del virus. Los transcritos vricos correspondientes se generan in vitro y se inoculan en las hojas de la planta. Conforma progresa la infeccin se sintetizan IgG maduras que se acumulan en el rgano deseado (por ejemplo en el TMV en el R.E) Dos estrategias: Coinfeccin de la planta con distintos vectores vricos vegetales los transcritos vricos se inoculan en las hojas de la planta progreso de la infeccin sntesis de anticuerpos. Introducir los genes que codifican para las cadenas en distintas plantas realizar cruzamientos entre las plantas seleccionar las que posean todos los transgenes deseados. Es necesario dirigir su sntesis al RE para que se produzca un ensamblaje adecuado de los distintos componentes del anticuerpo y se realice una glicosilacin adecuada

36.Qu ventajas presenta

la obtencin de anticuerpos en plantas

transgnicas con respecto a otros sistemas de produccin? Resulta posible sintetizar en las plantas un conjunto prcticamente ilimitado de anticuerpos(planticuerpos) para su utilizacin teraputica en los animales. En particular se ha conseguido expresa en la plantas IgG e IgA compeltas, construcciones quimricas de IgG-IgA, IgG e IgA segregabes, fragmentos de cadena pesada, anticuerpos de cadena sencilla (constituidos

por fragmentos de la regin variable) e incluso anticuerpos generados a partir de la fusin de fragmentos diferentes de la regin variable que se asocian mediante un pptido de unin flexible. Estos anticuerpos funcionan igual de bien que los anticuerpos obtenidos de clulas de mamferos. La expresin de anticuerpos en plantas puede lograrse mediante la utiizaicon de vectores vricos vegetales insertando los genes que codifican ara la cadena ligera y pesada en posicin 5 con respecto a la secuencia de genes que codifican las protenas de la cpside del virus. Los transcritos vricos correspondientes se generan in vintro y se inoculan en las hojas de la planta. Conforma progresa la infeccin se sintetizan IgG maduras que se acumulan en el rgano deseado (por ejemplo en el TMV en el R.E) Ventajas: Pueden expresarse y acumulare en tejidos vegetales Mayor produccin Los anticuerpos producidos en plantas son bastante estables tanto a temperatura ambiente como a 4C. Simpleza de purificacin si se dirige el producto a semillas o tubrculos Desventajas: Su purificacin si es que no se ha dirigido a semilla si no a tejido. Patrn de glicosilacin, si no es correcto no es seguro que sus propiedades sean idnticas a las de las inmunglobulinas endgenas. Puede afectar esto a su conformacin, estabilidad, suceptibilidad a proteasas ya que los residuos de xilosa y fucosa presentes en los glucanos unidos a asparragina (modificados en el Golgi y en el RE) son los eptopos responsables de la alerginicidad Los planticuerpos carecen de residuos de cido saliclico (10% del contenido de azcares de un anticuerpo monoclonal tpico) 37.Qu problemas presenta la obtencin de vacunas en plantas transgnicas? Qu soluciones se plantean para esos problemas? Los mtodos convencionales de obtencin de vacunas podran ser sustituidos por sistemas vegetales transgnicos productores de la protena recombinante. Adems la generacin de plantas transgnicas comestibles evitara la purificacin e inyeccin de la protena recombinante. La ingesta oral de la planta transgnica permitir la absorcin intestinal y la posterior estimulacin del sistema inmunitario del individuo. Problemas: Una preocupacin importante con las vacunas orales es la degradacin de los antgenos en el estmago e intestino antes de que puedan inducir una respuesta inmune.

Para protegerlos de la degradacin se han desarrollado varios mtodos. Entre stos se encuentran el uso de cepas recombinantes de microorganismos atenuados (v. gr. Salmonella), de vehculos de bioencapsulacin. En teora, la especie ideal para expresar los antgenos debera consumirse en fresco y tener altos niveles de protena soluble; en este sentido, frutos como el pltano y el tomate o, alternativamente, los cereales, son sistemas convenientes para este fin. La respuesta no es demasiado fuerte, se plantea el uso de adyuvantes o mejorar la direccin de la selectividad para el sistema inmunitario como unin de los antgenos a molculas que se enganchen bien en las clulas M, componentes del sistema inmunitario que se encuentran en el forro interno del intestino Se debe asegurar que las vacunas deben potenciar la respuesta inmunitaria no inviertan el sentido de su accion y supriman la inmunidad.

38.Bancos de germoplasma: qu son, para qu sirven, qu tcnicas utilizan para la conservacin del germoplasma. El objetivo de un banco de germoplasma es conservar, con la mayor integridad posible, la variabilidad gentica de las poblaciones seleccionadas. La estrategia a seguir depende del material vegetal, su ciclo de vida, el modo de reproduccin y el tamao de sus individuos. Los mtodos de conservacin de germoplasma se dividen en: Mtodos de conservacin in situ: Se basa en la conservacin en el hbitat natural Mtodos de conservacin in vitro: Se basa en el mantenimiento del material biolgico en bancos de semillas, bancos de cultivo in vitro, colecciones de plantas en campos, viveros, etc. Los bancos de semillas: Liofiizacin: Se recomienda su desecacin hasta un 3-7% de humedad y su almacenamiento a bajas temperaturas (-18C). Cultivo in vitro de tejidos (ralentizacin): Se establecen bancos de germoplasma utilizando cultivo de tejidos vegetales. Se logra haciendo cambios en el ambiente de cultivo para desacelerar el crecimiento de las clulas y de los tejidos. Este mtodo cubre un amplio espectro de tcnicas que implican el cultivo, bajo condiciones de asepsia de rganos o fragmentos de rganos en un medio de cultivo artificial definido, bajo condiciones ambientales controladas: reducir la temperatura, reducir las condiciones de luminosidad, modificar el medio de cultivo, adicionar al mismo inhibidores osmticos o retardantes del crecimiento, deshidratadores de tejido o modificar la fase gaseosa del recipiente de cultivo. Crioconservacin: Consiste en el almacenamiento a temperatura del nitrgeno lquido (-196C) con lo cual se consigue la supresin del crecimiento hasta llegar a un estado de "suspensin animada". Permite la conversacin a largo plazo, es de bajo costo de mantenimiento, fcil manipulacin y no depende de suministro elctrico Ahora han surgido nueva tcnicas: Encapsulacin-deshidratacin, encapsulacinvitrificacin, desecacin, precultivo, vitrificacin, gota congelada

39.Qu caractersticas debe tener una planta hiperacumuladora para que pueda ser utilizada para la eliminacin de contaminantes del suelo? Existen especies de plantas conocidas como hiperacumuladoras que tienen la capacidad de acumular compuestos fitotxicos (particularmente metales) en concentraciones entre 50 y 500 veces superiores a una planta promedio. El alto poder de concentracin del compuesto txico, fcil recoleccin, crecimiento rpido, sumado a un sistema eficiente de transporte desde la raz al tallo, califica a las hiperacumuladoras como candidatas promisorias para ciertos procesos de detoxificacin. El proceso de fitorremediacin depende de una serie de procesos biolgicos. Algunos de los parmetros ms importantes a tomar en cuenta son: Biodisponibilidad del contaminante, procesos rizosfricos, captacin por la planta, quelacin y compartimentalizacin, degradacin.

40.Disea

una una planta transgnica que pueda utilizarse para la

proteccin del medio ambiente. Una posible herramienta para procesos de fitorremediacin es el cultivo de races transformadas con Agrobacterium rhizogenes ("races en cabellera"). Las races de tomate tratadas con esta bacteria contienen altos niveles de peroxidadas, y en consecuencia son capaces de remover fenoles. En un trabajo realizado se obtuvieron races en cabellera transgnicas de tomate que sobreexpresan el gen tpx1. Este gen codifica una peroxidasa bsica que se localiza en la pared celular de las races de tomate. Se analiz la capacidad de dichas races para remover fenol utilizando como controles races en cabellera de plantas no transgnicas. Las races transgnicas fueron capaces de remover hasta un 85% del fenol adicionado, mientras que los controles no transgnicos slo removieron un 15%. Estos resultados sugieren que las races en cabellera podran resultar herramientas muy tiles para la limpieza de efluentes contaminados. 41.-Explica los problemas de bioseguridad que plantea el cultivo de plantas transgnicas y las soluciones que se plantean en la actualidad. Problemas de las plantas transgnicas: Alergenicidad, la transferencia horizontal y la resistencia a los antibiticos, el empleo de marcadores de la resistencia a los antibiticos en el desarrollo de cultivos transgnicos ha despertado inquietudes acerca de la posibilidad de que los cultivos transgnicos promuevan la prdida de nuestra capacidad de tratar las enfermedades con medicamentos antibiticos . Una de las preocupaciones se vincula con la transferencia horizontal de genes del transgnico a los microorganismos de nuestro cuerpo. Si bien el riesgo generado por genes de la resistencia a los antibiticos en las plantas transgnicas parece ser escaso, se estn tomando medidas para reducir ese riesgo y eliminar gradualmente el empleo de dichos genes. La ingestin de ADN extrao, cuando los cientficos desarrollan una planta transgnica, insertan fragmentos de ADN que originalmente no existan en esa planta. A menudo esos fragmentos de ADN provienen de especies totalmente diferentes, como virus y bacterias. Pero hasta el momento, no hay pruebas de que el ADN de cultivos transgnicos sea ms peligroso para nosotros que el ADN de los cultivos tradicionales, los animales y los microorganismos acompaantes que hemos estado ingiriendo durante todas nuestras vidas.

Modificacin de las cantidades de nutrientes, es la calidad nutricional de los alimentos genticamente modificados equiparable a la de los alimentos tradicionales? Por ejemplo las isoflavonas desempean una funcin en la prevencin de cardiopatas, cncer de mama y osteoporosis, varios investigadores han estudiado el contenido de isoflavonas de las soyas RoundupReady. Los estudios indican que las diferencias encontradas en los experimentos parecen pequeas o moderadas en comparacin con la variacin natural de las concentraciones de isoflavonas. Es decir, los componentes tradicionales son similares en los alimentos transgnicos y los alimentos tradicionales El flujo de genes desde los cultivos a la maleza , la hibridacin de los cultivos con las malezas cercanas tal vez permita que stas adquieran caractersticas que desearamos que no tuvieran, como la resistencia a los herbicidas. Se debe evaluar individualmente cada cultivo para determinar el riesgo del flujo de genes en la zona donde se lo producir. La resistencia a los antibiticos, tambin existe inquietud por la posibilidad de que las plantas transgnicas cultivadas en el campo transfieran sus genes de la resistencia a los antibiticos a microorganismos del suelo , con lo cual se producira un aumento general del grado de resistencia a los antibiticos en el medio ambiente. La filtracin de protenas transgnicas en el suelo Muchas plantas derraman compuestos qumicos en el suelo a travs de sus races. Hay inquietudes acerca de que las plantas transgnicas pudieran derramar compuestos diferentes de los de las plantas tradicionales, como una consecuencia no buscada de la modificacin de su ADN.. Los intentos de descubrir si las plantas transgnicas estn modificando el suelo y si las modificaciones son benficas o nocivas, se ven obstaculizados por nuestra falta de conocimientos cientficos bsicos. La hibridacin de cultivos transgnicos con cultivos tradicionales cercano, muchos factores influyen en las posibilidades de que se produzca el flujo de genes de un cultivo a otro. Algunos cultivos son muy propensos a la fecundacin cruzada y el polen es transportado a otros campos por el viento y los insectos. Otras especies son muy autgamas y son escasas las probabilidades de que haya una transferencia de polen a plantas vecinas. Como consecuencia de las diferencias entre las especies de cultivos, es preciso evaluar en forma individual cada caso para determinar las posibilidades de contribuir al flujo de genes desde los cultivos transgnicos a los tradicionales 42.-Cmo se puede detectar la presencia de una planta transgnica en muestras de alimentos? Un alimento transgnico debe llevar etiquetado esto si es que lleva a partir de un 1% d ingrediente ug en su contenido. Existe un cdigo especfico para cada transgnico y se lleva un registro de todos los transgnicos aceptados e incluso los rechazados. Aqu se muestra donde han sido cultivados. La metodologa de deteccin tambin debe de ser de fcil rastreo y reproducible. Se hace por Southern Blot, Northern blot, Western Blot, ELISA, MALDI-TOF, etc. Cualquiera de estas tcnicas tiene que tener una gran sensibilidad porque los transgnicos se encuentran en cantidades nfimas. Ahora se est desarrollando una tecnologa que podra facilitar el rastreo y deteccin de transgnicos. Esto consistira en aadir una misma y nica secuencia

de ADN a todos los organismos genticamente modificados. Este ADN no codificara para ninguna protena de forma que afectara a las propiedades de las plantas de forma que un nico anlisis de ADN bastara para detectarla, como si se tratara de un cdigo de barras. Se contempla la posibilidad de aadir una serie de secuencia de ADN que aporten ms informacin como quien hizo el transgen y que es lo que modific.

1. Se sabe que los triglicridos de la semilla de palma son ricos en cido cprico (un cido graso) debido a la accin de una tioesterasa especfica. Cmo se podra obtener una planta de colza transgnica que acumule en semilla triglicridos ricos en cido cprico? Planta de colza: Se seleccionan los explantos, se infectan con Agrobacterium. Se pone en un medio de cultivo con el marcador selectivo Extremo 5 Promotor especfico de semilla Gen: Codifica para la tioesterasa especfica gen de seleccin ahas (confiere resistencia a herbicida imidazolinonas) Terminador Extremo 3 Luego se seleccionan los explantos con los brotes y se regenera la planta por organognesis. Luego se autofecunda la colza y se comprueba que estas semillas tengan niveles elevados de cido cprico.

2. La biosntesis de cidos grasos en plastidios tiene lugar segn el esquema siguiente:


C4-ACP KAS I C16-ACP TE Palmtico KAS II C18-ACP TE Esterico DSP C18:1-ACP TE Oleico

Se desea obtener una colza transgnica cuyas semillas sean ricas en cido esterico. Plantea dos posibles estrategias y describe los elementos que habra que introducir en el plsmido Ti. (ACP: protena transportadora de acilos; KAS: cetoacil-ACP-sintasa; DSP: desaturasa soluble plastidial; TE: tioesterasa)m Cultivo in vitro de explantos de colza. Se seleccionan los explantos, se infectan con Agrobacterium. Se regenera por organognesis. Se autopoliniza y se recogen las semillas Sumergir la inflorescencia en una suspensin bacteriana que incluye un surfactante. Las semillas se germinan en un medio selectivo, crece la planta, se autofecunda. Se recogen estas semilas Borde Derecho Promotor de semila Gen de seleccin ahas Gen KAS II Terminador Borde Izquierdo

Borde Derecho Promotor de semilla Gen que codifica ARNi dirigido a la regin 3 del DSP Gen de seleccin ahas Terminador Borde Izquierdo

3. Disea un sistema para obtener una colza transgnica que acumule insulina humana en la semilla, y describe los elementos que habra que introducir en el plsmido Ti. Estrategia: Planta de colza al vaco con Agrobacterium. Esta da semillas, germinan, crecen, se autofecundan y a partir de estas semillas se realiza la separacin. Se homogenizan las semillas. Se centifugan para separar la fase acuosa de la lipdica. Esta ltima se separa, se resuspende y se trata con la proteasa. Luego se vuelve a centrifugar y nuestra proinsulina estar en la fase acuosa. Borde derecho Promotor gen oleosina (secuencia proteasa Gen proinsulina terminador Borde izquierdo)

Este mtodo permite reducir el costo de la purificacin. Las olesinas son protenas pequeas que se encuentran insertadas en la monocapa de fosfolpidos de los cuerpos grasos. Estas protenas se acumulan en las semillas de las plantas oleaginosas a niveles elevados. En colza, representan entre el 8 y el 20% del total de las protenas de la semilla. Las construcciones incluyen una secuencia de reconocimiento especfica para una proteasa. Una vez realizada la purificacin, la protena de inters se rescata de la fusin por tratamiento con la proteasa que reconoce esta secuencia peptdica.

4. Disea un sistema para producir nicotina a partir de un cultivo de races pilosas de Nicotiana tabacum. En primer lugar, se seleccionarn aquellos individuos que sean ms productivos. Se toman explantos de hojas, se esterilizan y se ponen en un medio donde se infecta con Agrobacterium rhizogenes (con un gen de seleccin). En el lugar dnde se ha producido el dao aparecen races. Se cogen estas races y se ponen en un medio de cultivo de seleccin. Las races en cabellera son un tipo de tumor que se forma cuando las plantas son infectadas por la bacteria del suelo Agrobacterium rhizogenes. Finalmente, el hospedador desarrolla un sistema de races finas y enruladas cerca del sitio de la infeccin. Estas races en cabellera son transgnicas, es decir, contienen tanto los genes de la planta como el gen nuevo. La principal caracterstica de la Nicotiana tabacum es su capacidad para sintetizar en la raz, y posteriormente almacenar y conservar en las hojas un alcaloide denominado nicotina.

5. Cmo se puede obtener una planta transgnica que acumule una protena en los cuerpos lipdicos? Explica cmo sera la construccin a introducir en el vector de Agrobacterium. Qu ventajas tiene este sistema para la produccin de protenas en plantas? Estrategia: Planta de colza al vaco con Agrobacterium. Esta da semillas, germinan, crecen, se autofecundan y a partir de estas semillas se realiza la separacin. Se homogenizan las semillas. Se centifugan para separar la fase acuosa de la lipdica. Esta ltima se separa, se resuspende y se trata con la proteasa. Lueg se vuelve a centrifugar y nuestra proinsulina estar en la fase acuosa. Borde derecho Promotor gen oleosina (secuncia proteasa Gen proinsulina terminador Borde izquierdo) Este mtodo permite reducir el costo de la purificacin. Las olesinas son protenas pequeas que se encuentran insertadas en la monocapa de fosfolpidos de los cuerpos grasos. Estas protenas se acumulan en las semillas de las plantas oleaginosas a niveles elevados. En colza, representan entre el 8 y el 20% del total de las protenas de la semilla. Las construcciones incluyen una secuencia de reconocimiento especfica para una proteasa. Una vez realizada la purificacin, la protena de inters se rescata de la fusin por tratamiento con la proteasa que reconoce esta secuencia peptdica. 6. Se sabe que el alga Hematococcus pluvialis sintetiza el carotenoide cantaxantina, a partir de b-caroteno, por accin del enzima bcaroteno-cetolasa. Cmo podra obtenerse una Daucus carota (zanahoria) transgnica que acumule cantaxantina en cromoplastos de raz? En la zanahoria se encuentra la ruta del B-caroteno y de dnde se extrae este aceite es de la raz, o sea la raz es rica en B-carotenos. Por lo que se tomaran races como explantos se introduce en el medio, se les infecta con Agrobacterium. Se ponen en un medio de cultivo con el agente selector. Luego se ponen los recogen los explantos con los brotes y se regenera por organognesis. Promotor de cromoplastos de raz Gen B caroteno cetolasa Gen de resistencia a antibiticos Terminador

7. Se puede obtener licopeno a partir de fitoeno en una reaccin directa catalizada por una fitoeno desaturasa bacteriana. Cmo obtendras una colza transgnica que acumule licopeno en la semilla? Explantos de hojas de colza se infectan con Agrobacterium. Se pasan a un medio de cultivo y luego los que han brotado se regeneran. Promotor de semillas Terminador Gen fitoeno desaturasa Gen de seleccin ahas

8. Qu problemas plantea la modificacin de las protenas de reserva de las semillas de cereales? Las gramneas y en general todas las monocotiledneas presentan gran resistencia a Agrobacterium por lo cual este mtodo es bastante inviable en un extenso grupo de plantas de gran importancia econmica. El uso de protoplastos, que son clulas vegetales a las que se les ha liberado de la pared celular. Mediante esta tcnica se consigui por primera vez cereales transgnicos en 1988. Puede realizarse una transferencia directa de genes mediante la fusin de protoplastos (la clula vegetal sin la pared) mediante qumicos como el PEG (polietilenglicol), de donde se obtienen hbridos nucleares y luego clulas transgnicas por recombinacin, tambin puede emplearse liposomas.

9. Plantea una estrategia para mejorar la composicin de las protenas de reserva en las semillas de arroz. El arroz hasta la fecha se ha transformado mediante Agrobacterium, Biobalstica, electroporacin, microinyeccin. Se hacen protoplastos de hipocotilo de arroz y por microinyeccion se le aade el DNA. Se regenera la pared de la clula. Se induce un callo y a partir de l se regenera la planta. La lisina es el aminocido esencial limitante del arroz. Se han utilizado tcnicas de ingeniera gentica expresando AK (aspartato quinasa) Y DHPS (dihidropicolinato sintasa) para aumentar la sntesis de Lisina. Tambin se ha utilizado ARNi para la LKR (Lisina ketoglutrica reductasa) y SDR (Sacaropina dehidropina deshidrogenasa) para reducir su catabolismo.