CLERA PORCINO Lesiones Las formas en las que se presenta producen las siguientes lesiones: Forma aguda Leucopenia

a y trombocitopenia Petequia y equimosis muy difundidas, especialmente en la piel, los ganglios linfticos, la laringe, la vejiga, el rin, la vlvula ileocecal El infarto multifocal del margen del bazo es caracterstico pero no siempre se produce Es comn la tumefaccin de ganglios linfticos hemorrgicos Encefalomielitis con manguito perivascular. Forma crnica Ulceras en forma de botn en el ciego y el intestino grueso Deplecin generalizada del tejido linfoide Las lesiones hemorrgicas e inflamatorias suelen estar ausentes. Forma congnita Dismielinogenia central, hipoplasia cerebelar, microencefalia, hipoplasia pulmonar, malformaciones hidropesa y otras

6. ASPECTOS INMUNITARIOS Los lechones nacidos de cerdas inmunes adquieren anticuerpos calostrales. Los cerdos inmunotolerantes permanecen infectados y excretan el virus continuamente. Los animales que curan del Colera Porcino tienen una inmunidad humoral de larga duracin. Los porcinos recuperados del Colera Porcino tienen anticuerpos precipitantes y neutralizantes del suero. El efecto protector de la inmunidad adquirida es variable, por la interferencia entre la respuesta inmune de la infeccin preexistente y de la vacuna. CONTROL El Per cuenta con Normas para el control del clera porcino dada el 26 de Agosto de 1982, que tiene como una de sus bases legales la Ley 4638 (21 de Marzo de 1923) de la Polica Sanitaria. En ella se dan directivas para el diagnstico, prevencin y control sobre esta enfermedad. El control se realiza por vacunacin de los lechones utilizando vacuna a virus vivo atenuado. Esta vacuna tiene la desventaja de producir reacciones postvacuna, en ocasiones severas, difundindose el virus. En ningn caso la poca de aplicacin de la vacuna contra el clera debe coincidir con el destete o la castracin. En los pases libres de la enfermedad o en los que est progresando la erradicacin, la vacunacin est generalmente prohibida En caso de infeccin, no hay tratamiento posible. Hay que sacrificar a los cerdos infectados y enterrar o incinerar las canales. Profilaxis mdica Medidas a tomar en los focos Sacrificio de todos los cerdos de criaderos afectados Eliminacin de las canales, camas, etc. Desinfeccin a fondo Identificacin de la zona infectada, con control de los desplazamientos de porcinos Investigacin epidemiolgica detallada, con rastreo de las fuentes posibles y de las posibilidades de propagacin de la infeccin Vigilancia de la zona infectada y de la regin circundante Vacunas con virus vivos modificados Las vacunas de tipo MLV se producen con cepas de CSFV que se atenan mediante pases en cultivo celular o en

una especie hospedadora adecuada que no pertenezca a la familia Suidae, basndose en un sistema de lotes de siembra. Los lotes deben ser validados respecto a identidad, esterilidad, pureza, seguridad, ausencia de transmisin, estabilidad e inmunogenicidad. Vacunas marcadoras Pese a la existencia de vacunas MLV seguras y eficaces contra la PPC, su uso no ha sido favorecido en la Unin Europea y algunos otros pases libres o casi libres de PPC, debido a que los anticuerpos que inducen tales vacunas no pueden distinguirse de los inducidos por el virus natural. Esta desventaja no se presenta en una vacuna marcadora que permite distinguir entre los animales infectados y los vacunados (DIVA). Esta vacuna es capaz de provocar una respuesta inmune protectora que puede distinguirse de la respuesta inmune inducida por el virus natural. Un prerrequisito adicional de la estrategia de cualquier DIVA es la disponibilidad de una prueba serolgica acompaante que es muy discriminatoria para demostrar la ausencia de infeccin y para el rastreo de infecciones residuales. 7. DIAGNOSTICO Para realizar el diagnstico se debe tomar en cuenta la historia clnica y los sntomas, pero el diagnstico ms concluyente se hace a nivel de laboratorio, aunque la mayora de las cepas del virus de CP al igual que DVB y EF no son citopatognicas en cultivo celulares, lo cual dificulta los trabajos de aislamiento si no se cuenta con cultivos celulares susceptibles y reactivos que permitan poner en evidencia la presencia viral, como los anticuerpos conjugados con fluorocromos (inmunofluorescencia) y/o enzimas (inmunoperoxidasa). Por lo tanto, un diagnstico positivo de CP siempre resulta difcil, sobretodo esto es particularmente cierto en las formas crnicas y menos dramticas de la enfermedad (forma subclnica y asintomtica), ya que una enfermedad altamente infecciosa, hemorrgica y fatal entre los cerdos, con un curso de 5 a 7 das entre animales no vacunados, deber siempre hacernos sospechar de Clera porcino. No obstante, hay enfermedades principales que semejan al CP como la Peste Porcina Africana (aunque es de mayor severidad), la dermatitis y el sndrome de neuropata porcinos (PDNS), el sndrome de debilidad multisistmica post-destete (PMWS), la prpura trombocitopnica, la actinobacilosis (producida por Actinobacillus suis), infecciones con Haemophilus parasuis, Erisipela aguda (produce hemorragias pero estas son subserosas equimticas), Pasteurelosis aguda, Salmonelosis (por acompaarse de enteritis y disnea) y Encefalomieltis viral (por producir signos nerviosos semejantes), por lo cual reafirmamos que es casi imposible distinguir clnicamente el CP sin pruebas de laboratorio. De hecho, las bacterias mencionadas causan infecciones concurrentes, por lo cual el aislamiento de estos patgenos puede enmascarar al virus de la PPC como la causa real de la enfermedad. De forma similar, los PDNS (sndromes de neuropata e n porcinos) pueden enmascarar una infeccin latente por PPC. De todos modos, un diagnstico presuntivo basado en sntomas clnicos y en lesiones post mrtem debe confirmarse con las investigaciones en el laboratorio. Los mtodos de laboratorio para el diagnstico de PPC se dirigen a detectar el virus, el cido nucleico vrico o los antgenos vricos, o bien a la deteccin de los anticuerpos especficos. Sin embargo, los mtodos de IF e IP son los ms usados. RECOLECCIN DE MUESTRAS Para el diagnstico de la PPC no se debe realizar el muestreo al azar, de manera que cuando se sospecha de CP, los tejidos que se enven debern proceder de rganos de animales enfermos o sospechosos, sacrificados o recientemente muertos. Para la toma de muestras de sangre, los animales deben encontrarse en estado febril o debe ser recogida en heparina o en etilndiamino tetraactico (EDTA).

El suero debe proceder concretamente de animales sospechosos restablecidos y de hembras con camadas presuntamente infectadas congnitamente. Las muestras suelen ser raspados o biopsia de tonsilas, ganglios linfticos (farngeos, mesentricos o gastrohepaticos), bazo, rion, leon (porcin distal) cerebro, pncreas, sangre y suero sanguneo. El cerebro, secciones del intestino y otros rganos internos se envan en formol al 10%, el pncreas intacto, los ganglios linfticos, las tonsilas completas y pedazos grandes de bazo sin preservador, en envases hermticamente sellados, enviadas cuanto antes al laboratorio y conservadas en refrigeracin. A) MTODOS INMUNOLGICOS

INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA La prueba de inmunofluorescencia (IFD) es una prueba rpida que puede utilizarse para detectar el CSFV en cortes finos de amgdalas, bazo, rin, ndulos linfticos o porciones distales del leon. Los tejidos deben recogerse de varios animales (febriles y o enfermos) (4) y transportarse sin conservantes en fro, pero no congelados. Los cortes se tien directamente con inmunoglobulina anti-PPC conjugada con isotiocianato de fluorescena (FITC) o indirectamente utilizando un conjugado secundario con FITC, y se examinan en un microscopio de fluorescencia. El tejido de las amgdalas es el ms adecuado durante la primera fase de la infeccin, ya que es el primero en ser afectado independientemente de la ruta de infeccin (25). En casos subagudos y crnicos, el leon es con frecuencia positivo y a veces, puede ser el nico tejido que muestre fluorescencia. Un resultado negativo por IFD no elimina por completo la presencia de infeccin de la PPC. Cuando se mantiene la sospecha de PPC, se deben obtener ms muestras o intentar el aislamiento del virus en cultivo celular (por ejemplo, en rin porcino [PK-15] u otra lnea celular de origen porcino que sea sensible y que se conozca que est libre de contaminacin con Pestivirus). Existe un riesgo relativamente alto de resultados falsos (positivos y negativos) cuando la IFD es utilizada por los laboratorios no muy familiarizados con el mtodo. Por tanto, la IFD debera utilizarse solo por laboratorios que tienen experiencia en el uso de esta tcnica, en aplicarla de forma rutinaria y hayan tenido entrenamiento en la interpretacin de la fluorescencia. Procedimiento de la prueba En cada serie de muestras de rganos para examen deben incluirse cortes de control positivo y negativo.
i) ii) iii)

iv) v)

vi)

Se corta un trozo de las amgdalas, bazo, rin o leon, de aproximadamente 1 1 0,5 cm, y se monta con un compuesto criosttico o con agua destilada en un criostato. Se congela el trozo de rgano en el criostato. Se cortan secciones de un grosor menor de 48 m y se montan en cubres libres de grasa de 10 32 mm con una esquina cortada. Todos los cortes se montan con esta esquina en la misma posicin (por ejemplo, arriba a la derecha). Despus de secar, los cortes montados se fijan con acetona (de grado analtico) durante 10 minutos a temperatura ambiente, o al aire durante 20 minutos a 37C. Los cortes se sumergen brevemente en una solucin salina tamponada con fosfato (PBS), se elimina el exceso de lquido con papel absorbente y se colocan (con la esquina cortada arriba a la derecha) en una cmara de incubacin hmeda con un pequeo volumen de agua colocada en el fondo de la cmara. Se deposita la solucin de trabajo de inmunoglobulina anti-PPC en los cortes y se incuban en la cmara cerrada durante 30 minutos a 37C. Si se requiere un segundo conjugado con FITC, se lava el corte cinco veces durante 2 minutos cada vez con PBS a temperatura ambiente, y luego se aade la dilucin de trabajo del conjugado con FITC, incubndose como se ha descrito antes. Los cortes se lavan cinco veces durante 2 minutos cada vez con PBS a temperatura ambiente. Se elimina el exceso de PBS con papel absorbente y se monta el cubre con el tampn de montaje en un porta para microscopio (con el corte entre el cubre y el porta).

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ix)

Se elimina el exceso del lquido de montaje con papel absorbente y se examinan los cortes para la fluorescencia en un microscopio de luz UV. Un corte positivo para PPC muestra clulas con fluorescencia verde brillante. En las amgadalas, la fluorescencia es particularmente evidente en la lnea epitelial de las criptas. En cortes de rin, la fluorescencia es ms abundante en los tbulos proximales y distales del crtex renal y en los conductos colectores de la mdula. En el leon, la fluorescencia es ms destacable en las clulas epiteliales de las glndulas de Lieberknhn, mientras que en el bazo la reactividad es ms difusa, con concentraciones de clulas linfoides en la lmina linfoide periarterial (PALS).

La IFD requiere utilizar una inmunoglobulina anti-PPC preparada a partir de un anticuerpo policlonal contra el CSFV que no distingue entre los antgenos de diferentes pestivirus. Los conjugados utilizados para IFD en cortes o en cultivos celulares inoculados deben prepararse de gama-globulinas anti-CSFV de cerdos libres del patgeno especfico. La dilucin de trabajo de los conjugados (al menos 1/30) debe combinar un mximo de brillo con un mnimo de fondo. La prueba debera realizarse solo en muestras de animales recin muertos, dado que la autolisis y la contaminacin bacteriana a menudo dan como resultado una tincin de fondo alta. Las cepas de virus vacunales vivos modificados (MLV) se multiplican principalmente en los ndulos linfoides regionales y en el epitelio de las criptas de las amgdalas. Los cerdos vacunados con cepas MLV pueden dar la prueba IFD positiva 2 semanas despus de la vacunacin (22, 28). La inoculacin en conejo se utiliza para diferenciar entre las cepas de CSFV adaptadas a conejo y las cepas de campo. A diferencia de las cepas de campo, las cepas adaptadas a conejo causan una reaccin febril e inducen una respuesta inmune en los conejos cuando se suministran intravenosamente.CSFV adaptadas al conejo. Dado que la secuenciacin del cido nucleico empieza a estar disponible y es ms fiable, la inoculacin de los animales ya no se considera necesaria para diferenciar entre las cepas de campo y las cepas vacunales del CSFV. En la prueba IFD, los cerdos infectados con pestivirus de rumiantes pueden dar reacciones positivas falsas. Las infecciones congnitas con pestivirus de rumiantes pueden ocasionar sntomas clnicos y lesiones patolgicas indistinguibles de las presentes en la PPC crnica (31, 33, 35). Las infecciones por CSFV o por pestivirus de rumiantes se pueden diferenciar probando sueros de la cerda y de la camada, o de otros animales en contacto con un lechn IFD-positivo, para anticuerpos neutralizantes frente a cada virus. Si se asla el virus o se puede detectar el cido nucleico vrico utilizando la RT-PCR, las secuencias posteriores proporcionan una herramienta rpida y precisa para distinguir entre los pestivirus de los rumiantes y el CSFV. INMUNOPEROXIDASA DIRECTA

La utilizacin de un conjunto de tres anticuerpos monoclonales (MAbs), conjugados con peroxidasa de rbano (HRPO) o con FITC, o usados en conjuncin con un conjugado anti-ratn, que sean capaces de detectar de modo especfico todas las cepas naturales de CSFV, las cepas vacunales de CSFV y los pestivirus de rumiantes, respectivamente, permitiran, por una parte, una diferenciacin inequvoca entre las cepas de campo y las cepas vacunales del CSFV y, por otra, distinguir entre el CSFV y otros pestivirus (11, 36, 38). Un prerrequisito es que el MAb contra el VPPC reconozca todas las cepas de campo y que el MAb anti-vacunal reconozca todas las cepas vacunales empleadas en el pas. No hay ningn MAb que reaccione selectivamente con todos los pestivirus de los rumiantes (11). En reas no vacunadas, se puede omitir el MAb para diferenciar la cepa vacunal. Como control positivo puede servir una inmunoglobulina policlonal anti-PPC conjugada a HRPO. Se debe tener cierta cautela cuando se utiliza un solo MAb como nica confirmacin de que un aislamiento corresponde a la PPC. Un prerrequisito es que el MAb contra el CSFV reconozca todas las cepas de campo y que el MAb anti-vacunal reconozca todas las cepas vacunales empleadas en el pas. No hay ningn MAb que reaccione selectivamente con todos los pestivirus de rumiantes (10). En reas no vacunadas, se puede omitir el MAb para diferenciar la cepa vacunal. Como control positivo puede servir una inmunoglobulina policlonal anti-PPC conjugada a HRPO. Se debe tener cierta cautela cuando se utiliza un solo MAb como la nica confirmacin de que un aislamiento corresponde a PPC. Procedimiento de la prueba i) Se cortan ocho o ms secciones (48 m) de las amgdalas que son positivas por IFD, o de otro rgano positivo si no se dispone de amgdalas.

ii) iii)

iv) v) vi) vii) viii) ix)

x)

Se fijan los cortes con acetona (grado anlitico) durante 10 minutos en cubres libres y dejar secar al aire. Se preparan diluciones de trabajo de los respectivos MAbs conjugados con peroxidasa en PBS + 0,01% de Tween 80 + suero de caballo al 5%, pH 7,6. (tambin puede utilizarse MAb conjugado con FITC, as como MAb sin conjugar siempre que se emplee un conjugado secundario). Despus de lavar con PBS, se depositan en la dilucin de trabajo del conjugado monoclonal respectivo dos cortes, y otros dos en la dilucin de trabajo del conjugado policlonal (controles). Se incuba durante 1 hora a 37C en una cmara hmeda. Se lavan seis veces los cortes en PBS, durante 10 segundos cada vez. Se tien los cortes con una solucin recin preparada de cromgeno del substrato1 durante 5 15 minutos a temperatura ambiente. Se lavan los cortes con acetato sdico 0,05 M, pH 5,0, en agua destilada y montarlos en portas para microscopa. Se examinan las secciones en un microscopio de fondo claro. La tincin del citoplasma de las clulas del epitelio de las criptas de las amgdalas de un color rojo oscuro indica el reconocimiento del virus aislado por el conjugado respectivo, y se considera positivo. Interpretacin de la prueba:

ELISA Para un diagnstico rpido de PPC en cerdos vivos, se han desarrollado enzimoinmunoensayos de captura del antgeno (ELISA) para investigar en piaras en las que se sospecha que se han infectado recientemente. Las pruebas ELISA son del tipo de doble anticuerpo en sandwich, que emplean anticuerpos monoclonales y/o policlonales contra varias protenas vricas en el suero, en la fraccin leucocitaria de la sangre o en sangre completa anticoagulada; adems, se pueden utilizar algunos kits de prueba para probar homogeneizados titulares clarificados (8). La tcnica es relativamente simple de realizar, no requiere servicios de cultivo de tejidos, se puede automatizar y se pueden conseguir los resultados en medio da. La desventaja de que es menos sensible que el aislamiento del virus, sobre todo en cerdos adultos y en casos suaves o subclnicos, puede compensarse probando todos los cerdos de la piara sospechosa con pirexia. No obstante, debe tenerse tambin en cuenta la baja especificidad de estas pruebas. La prueba no es apropiada para el diagnstico de la PPC en un solo animal. B) AISLAMIENTO DE VIRUS El aislamiento de virus en cultivos celulares es un mtodo de diagnstico de PPC ms sensible, pero ms lento, que la inmunofluorescencia con cortes congelados. El aislamiento se realiza mejor en clulas PK-15, que se dividen rpidamente, y que se siembran sobre cubres simultneamente con una suspensin de las amgadalas al 2% en medio de cultivo. Para el aislamiento del CSFV se pueden utilizar otras lneas celulares, pero deberan ser por lo menos tan sensibles como las clulas PK-15. Los cultivos se examinan para focos fluorescentes por IFD despus de 2472 horas o, despus de 4 das de incubacin, se fijan por tincin con inmunoperoxidasa. Para fines de diagnstico, el rgano ms adecuado para aislar el virus de los cerdos muertos o sacrificados son las amgdalas. Alternativamente, tambin se pueden utilizar el bazo, el rin, el leon o los ndulos linfticos. El procedimiento es el siguiente: i) Se prepara una solucin base concentrada 100 veces de glutamina-antibitico: disolver la glutamina (2,92 g) en 50 ml de agua destilada (solucin A) y se esteriliza por filtracin. Se disuelve cada uno de los

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iii)

iv) v)

vi)

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viii)

siguientes antibiticos en 510 ml de agua destilada estril: penicilina (106 Unidades Internacionales [UI]; estreptomicina (1 g); mycostatn (5 105 U); polimixina B (15 104 U); y kanamicina (1 g). Se juntan estas soluciones (solucin B). Se mezclan aspticamente las soluciones A y B, y se completa hasta 100 ml con agua destilada estril y se guarda a 20C en alcuotas de 5 ml. La constitucin exacta del antibitico no es definitiva siempre que se consiga la esterilidad y las clulas no estn afectadas. Se cortan en trozos pequeos 12 g de tejido y se machacan en un mortero u otro aparato con arena estril y un pequeo volumen de medio de cultivo hasta formar una pasta homognea. Alternativamente, se puede utilizar una trituradora a 4C. Se hace una suspensin al 20% (p/v) aadiendo solucin salina equilibrada de Hanks (BBS) o medio mnimo esencial de Hanks (MEM); por cada 10 ml de suspensin, se aade 1 ml del base de glutamina-antibitico. La mezcla se mantiene a temperatura ambiente hasta 1 hora. Se centrifuga a 1.000 g durante 15 minutos Se tripsiniza una monocapa de clulas PK-15, se centrifuga la suspensin celular a 160 g durante 10 minutos y se resuspende para que contenga aproximadamente 2 106 clulas/ml en medio de cultivo (MEM de Eagle con sales de Earle; 5% de suero bovino fetal libre de pestivirus de rumiantes y de anticuerpos contra pestivirus; y 0,2 ml de la solucin stock de glutamina-antibitico por cada 10 ml de la suspensin celular). Como gua, una botella de 75 cm2 dar aproximadamente 50 ml de suspensin celular a una concentracin adecuada. O bien Inoculacin con la suspensin. Se mezclan nueve partes de la suspensin celular (del paso (v)) y una parte del sobrenadante (del paso (iv)) y se inocula 1,01,5 ml en 68 tubos Leighton con cubres, o en otros recipientes apropiados de cultivo celular. Tres tubos se inoculan como controles con solo 1,0 1,5 ml de suspensin celular. Despus de completar las inoculaciones de la muestra, se inoculan tres tubos como controles positivos con CSFV. Hay que tener cuidado en evitar la contaminacin con esta suspensin vrica positiva. Tambin deben prepararse cultivos negativos. Se incuba a 37. O Inoculacin por monocapas preformadas: para cada tejido, inocular 1,01,5 ml de suspensin de clulas (preparadas como en el paso (v)) en 68 tubos de Leighton con cubres u otros frascos de cultivo celular apropiados. Se Incuba a 37C durante un mnimo de 4 horas y un mximo de 36. Luego se escurre el medio, se inocula 0,2 ml de lquido sobrenadante (del paso (iv)), se incuba durante 1 hora a 37C, se lava y se recubre con 1 ml de medio de crecimiento y se incuba a 37C. En los das 1, 2 y 3 post-inoculacin, se lavan dos cultivos, junto con un cultivo control positivo y otro negativo, dos veces durante 5 minutos cada vez con BBS de Hanks, MEM de Hanks o PBS, se fijan con acetona fra (de grado analtico) durante 10 minutos, y se tien con un conjugado directo anti-CSFV a la dilucin de trabajo apropiada, o bien se tien indirectamente, como se describe en la Saccin B.1.a. Si la suspensin de amgdalas al 2% resulta txica para las clulas, la prueba debe repetirse utilizando una dilucin mayor u otro rgano. El uso del mtodo en el que se emplean monocapas preformadas (indicado antes) nos ayudar a evitar la repeticin de la prueba. Despus de lavar tres veces con PBS durante 5 minutos cada una, los cubres se montan en 90% de glicerol tamponado con carbonato/bicarbonato, pH>8,0, y se examinan para focos de fluorescencia.

ix)

En lugar de tubos Leighton, pueden utilizarse placas de 6 pocillos con cubres. Alternativamente, pueden usarse tambin para el aislamiento del virus cultivos en placas de microtitulacin de fondo plano o placas M24. En tal caso, las placas se fijan y se tien como se describe ms adelante para la prueba de neutralizacin ligada con peroxidasa (NPLA). La sangre completa (tratada con heparina o EDTA) de cerdos clnicamente enfermos es una muestra adecuada para diagnosticar PPC. Se puede utilizar la fraccin de leucocitos u otros componentes, pero por razones de sensibilidad y sensibilidad, es preferible la sangre completa (10). El procedimiento es el siguiente:
i) ii) iii)

Se congela una muestra de sangre completa a 20C y se descongela en un bao a 37C. Se inoculan 300 l de sangre hemolizada en una monocapa de clulas PK-15 crecidas hasta un 75% de confluencia2 en una placa M24, y se permite la adsorcin durante 1 hora a 37C. Se elimina el inculo, se lava la monocapa una vez con BBS de Hanks o MEM de Hanks, y se aade

iv)

medio de cultivo. Despus de una incubacin de 34 das, las placas se lavan, se fijan y se tien, como se describe ms adelante para NPLA, utilizando en cada paso un volumen de 300 l para compensar la mayor superficie celular.

Nota: este mtodo es menos sensible que el aislamiento convencional del virus para la deteccin de PPC aguda. REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA DE TRASCRIPCIN INVERSA Se han descrito muchos mtodos de (RT-PCR) y otros se estn an desarrollando. Este mtodo aceptado internacionalmente es rpido y ms sensible que los ELISA de captura de antgeno, el aislamiento vrico o la RT-PCR, lo que lo hace particularmente adecuado para el diagnstico preclnico. Se han descrito varios protocolos de PCR convencionales y en tiempo real (14, 20, 24, 26, 27) y se puede obtener un protocolo adecuado en la literatura o en los laboratorios de referencia de la OIE para la PPC. Debido a su rapidez y sensibilidad, la RT-PCR posee un enfoque adecuado para analizar casos sospechosos de enfermedad y est aceptada por varios pases y por la Unin Europea. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que pueden ocurrir resultados positivos falsos debidos a la contaminacin del laboratorio as como resultados negativos falsos debidos a los inhibidores contenidos en la muestra. Cualquier resultado positivo de brotes deberan confirmarse siempre con otras pruebas. Es obligatorio incluir un nmero adecuado de controles positivos y negativos en cada serie; tambin es recomendable que se incluyan controles internos. La prueba puede aplicarse a muestras de sangre individual o colectiva as como a rganos slidos, y se ha utilizado con xito para controlar brotes. La epidemiologa molecular de la PPC se basa en la comparacin de diferencias genticas entre los virus aislados. La amplificacin del ARN del CSFV por RT-PCR y la secuenciacin nucleotdica es el mtodo ms simple de obtener los datos de secuencias para hacer estas comparaciones. Se pueden analizar varias regiones diferentes del genoma del CSFV para estudios epidemiolgicos moleculares. Se han estudiado en particular dos regiones que permiten suministrar muchos datos de la secuencia para comparar nuevos aislamientos. Una de estas zonas se encuentra en la regin 5 no codificante (5NCR) del genoma (150 nucletidos) y la otra en el gen de la glicoprotena mayor E2 (190 nucletidos). En resumen, el mtodo usado consiste en extraer el ARN vrico de cultivos de clulas PK-15, realizar una RT-PCR para amplificar una o ambas zonas dentro de 5NCR o del gen E2, y luego determinar la secuencia nucleotdica de los productos y comparar con la informacin acumulada en las bases de datos. En el Laboratorio de Referencia de la OIE para PPC (Hanover, Alemania) existe una base de datos disponible de estas secuencias. C) PRUEBAS SEROLGICAS La deteccin de los anticuerpos especficos contra el virus es til cuando se sospechan infecciones con cepas de PPC de baja virulencia. Debido al efecto inmunosupresor del VPCC, no se pueden detectar anticuerpos hasta 21 das post-infeccin. Las investigaciones serolgicas dirigidas a detectar focos residuales de infeccin, especialmente en piaras de produccin, pueden ser tambin tiles para la erradicacin de PPC en una fase terminal. Como la incidencia de la infeccin con pestivirus de rumiantes puede ser elevada en instalaciones de cra, solo resultan tiles las pruebas que discriminen entre anticuerpos contra PPC y contra DVB/EF. Las pruebas NV y ELISA que utilizan MAbs satisfacen los requisitos de sensibilidad, pero los resultados positivos deberan confirmarse por pruebas NV comparativas. Las pruebas de neutralizacin se realizan en cultivos celulares utilizando un mtodo virus constante/suero variable. Como el CSFV no es citoptico, cualquier virus no neutralizado debe detectarse, tras su multiplicacin, por un sistema indicador. La NPLA (29) y la prueba de neutralizacin vrica con anticuerpo fluorescente (FAVN) (18) son las tcnicas ms ampliamente utilizadas. Ambas pruebas se pueden llevar a cabo en microplacas. El sistema NPLA es actualmente el preferido, es fcil de leer y tiene la ventaja de que puede determinarse mediante el uso de un microscopio de luz invertida, aunque puede realizarse a simple vista una primera valoracin del ttulo.

a)

Prueba de la neutralizacin ligada a la peroxidasa (prueba obligada para el comercio internacional) La NPLA se realiza en placas de microtitulacin de fondo plano. Los sueros se inactivan antes a 56C durante 30 minutos. A efectos del mercado internacional, es mejor probar una dilucin inicial de suero de 1/5 (dilucin final 1/10). Para los programas de seguimiento en un pas, puede ser suficiente una dilucin al 1/10. En cada prueba deben incorporarse los controles apropiados para asegurar la especificidad y la sensibilidad de las reacciones.
i)

ii)

iii) iv) v) vi) vii) viii)

Procedimiento de la prueba En dos pocillos de una placa de microtitulacin se depositan 50 l de diluciones de suero en medio de crecimiento (MEM de Eagle, suero fetal bovino al 5% y antibiticos). El suero fetal bovino debe estar libre de BVDV y de anticuerpos contra dicha enfermedad. Para cada muestra se puede incluir un tercer pocillo con suero y sin virus como un control del suero (para citotoxicidad y/o tincin inespecfica). Se aade a los pocillos 50 l de suspensin vrica, diluida en un medio de crecimiento hasta contener aproximademente 100 DICT50/50 l, y se mezcla el contenido en un agitador de microplacas durante 20 segundos. Se incuban las placas en un incubador de CO2 durante 1 hora a 37C. Se aaden a todos los pocillos 50 l de medio de crecimiento con 2 105 clulas/ml. Se dejan crecer las clulas a 37 en una atmsfera con un 5% de CO2 hasta confluencia, normalmente en 34 das. Se elimina el medio de crecimiento y se lavan las placas una vez con NaCl 0,15 M. Se secan las placas en papel absorbente. Las monocapas celulares pueden fijarse por uno de los siguientes mtodos:

Se incuban las placas 45 minutos a 37C, y luego a 20C durante al menos 45 minutos. Se sacan las placas del congelador, se llenan los pocillos con 100 l de paraformaldehido al 4% en PBS y se reincuban a temperatura ambiente durante 510 minutos. Se elimina el paraformaldehido y las placas se lavan con NaCl 0,15M; o Se incuban las placas a 7080C durante 12 horas; o Se fijan las placas en acetona al 80% y se incuban a 7080 durante una hora; o Se fijan las placas en acetona al 20% en PBS durante 10 minutos seguidos de un secado total a 25 30C durante 4 horas. (Esto se puede acelerar mediante la ayuda de un secador de pelo se obtiene un secado completo despus de 35 minutos segn se observa por el color blanquecino de la monocapa celular). ix) Se aade a cada pocillo 50 l de un suero porcino hiperinmune contra la PPC o un anticuerpo monoclonal, diluido en NaCl 0,5 M que contiene 1% de Tween 80 + 0,1 ml de azida sdica, pH 7,6. Incubar a 37C durante 15 minutos. La dilucin de trabajo del antisuero debe determinarse mediante titulacin previa: es decir, un suero con un ttulo por NPLA de 1/30.000 puede utilizarse a 1/100. x) Se lavan cinco veces las placas con NaCl 0,15 M que contenga 1% de Tween 80, pH 7,6. xi) Se aaden a cada pocillo 50 l de un conjugado de Ig-HRPO anti-cerdo o anti-ratn (segn convenga), diluido a su dilucin de trabajo con NaCl 0,5 M que contenga 1% de Tween 80, pH 7,6, y luego se incuba durante 10 minutos a 37C. xii) Se lavan las placas cinco veces con NaCl 0,15 M que contenga 1% de Tween 80, pH 7,6. xiii) Se aaden 50 l de solucin de cromgeno del substrato a cada pocillo y teir durante 1530 minutos a temperatura ambiente. Esta solucin se describe en la Seccin B.1.a. Diferenciacin de pestivirus mediante anticuerpos monoclonales por el procedimiento de la inmunoperoxidasa. xiv) Se lee la prueba visualmente. Las capas celulares infectadas se tien total o parcialmente de color marrn rojizo. Debe examinarse la monocapa por microscopa a baja resolucin para determinar el punto final de la titulacin. El citoplasma de las clulas infectadas se tie de rojo oscuro. xv) En la prueba se incluyen los siguientes controles: control de clulas, de suero positivo y de titulacin del virus problema. La titulacin del virus debe confirmar que el virus se ha utilizado a una concentracin entre 30 y 300 DICT50/ 50 l. Nota: El tiempo de incubacin dado anteriormente es solo como orientacin. Para conservar los reactivos, pueden utilizarse tiempos de incubacin mayores con diluciones de reactivos adecuadas a dichos tiempos.

b)

Prueba de neutralizacin vrica con anticuerpos fluorescentes (prueba prescrita para el comercio internacional) i) Se siembra una suspensin de clulas PK-15 a una concentracin de 2 105 clulas/ml en tubos Leighton con un cubre. ii) Se incuban los cultivos 12 das a 37C hasta que alcancen el 7080% de confluencia. iii) Se inactivan los sueros durante 30 minutos a 56C. A efectos del mercado internacional, es mejor probar con una dilucin inicial del suero de 1/5 (dilucin final 1/10). iv) Se incuban durante 12 horas a 37C volmenes iguales de suero diluido y de suspensin vrica que contenga 200 DICT50 (dosis infectiva del 50% en cultivo de tejidos) por 0,1 ml durante 12 horas a 37C. De esta forma se utiliza una cantidad constante de CSFV de 100 DICT50 por cada pocillo de reaccin. v) Se retiran los cubres de los tubos Leighton, Se lavan brevemente en medio sin suero, Se cubre la capa celular con la mezcla virus/suero (del paso iv) e incubar durante 1 hora a 37C en una atmsfera hmeda. vi) Se colocan los cubres en un tubo Leighton limpio y se incuban los cultivos en un medio de mantenimiento durante dos das ms. vii) Se retiran los cubres de los tubos Leighton, se lavan las monocapas dos veces con PBS, pH 7,2, durante 5 minutos cada vez, se fijan con acetona pura durante 10 minutos y se tien con la solucin de trabajo del conjugado durante 30 minutos a 37C antes de lavar. viii) Se montan los cubres en portas sin grasa con 90% de glicerol tamponado con carbonato/bicarbonato, pH > 8,0, y se examinan para flluorescencia. Cuando la prueba FAVN se realiza en placas de microtitulacin, se puede seguir el procedimiento para la NPLA (ver ms adelante) hasta el paso (viii). Las placas se tien a continuacin con la dilucin de trabajo del conjugado durante 30 minutos a 37C y se examinan para fluorescencia. Nota: cuando se detecte la fluorescencia, las microplacas se examinan mejor desde arriba, utilizando una lente objetivo de longitud focal larga. En ocasiones, los sueros de cerdos infectados con el BVDV o el BDV reaccionan a baja dilucin en las pruebas FAVN o NPLA como si estuvieran infectados por el CSFV. La intensidad de la reaccin cruzada depende de la cepa de pestivirus del rumiante que est implicada y del intervalo entre la infeccin y el tiempo de muestreo (37). Los altos niveles de anticuerpos que se alcanzan normalmente despus de exposicin a la infeccin por PPC, incluso con cepas de baja virulencia, permiten el uso de diluciones relativamente altas en las pruenas NPLA para anticuerpos contra PPC, lo que evita muchas, aunque no todas, las reacciones cruzadas (29, 30). En caso de duda continuada, son tiles las pruebas comparativas que utilizan una cepa de CSFV, una cepa de BVDV y una cepa de BDV que sean representativas del pas o de la regin. Las pruebas comparativas de neutralizacin son titulaciones a punto final en las que la misma serie de diluciones dobles de la muestra de suero sospechoso se prueba por duplicado contra 100 DICT50 de cada cepa vrica seleccionada. Las pruebas comparativas se realizan segn los protocolos descritos para FAVN o NPLA; las lneas celulares deben ser adecuadas para el BVDV y el DVB. Los ttulos de neutralizacin se expresan como el inverso de la dilucin ms alta de suero que evita el crecimiento celular en el 50% de dos pocillos duplicados. Una diferencia de tres veces o ms entre los puntos finales de dos titulaciones debe considerarse decisiva para una infeccin por la especie de virus que da el ttulo ms alto. Para obtener un resultado definitivo, podra ser necesario utilizar diferentes cepas del mismo genotipo, y/o probar varios cerdos de una piara infectada.

c)

Enzimoinmunoensayo (prueba prescrita para el comercio internacional) Las tcnicas competitivas, bloqueantes e indirectas pueden utilizarse con cualquier soporte adecuado y se han descrito varias de ellas (por ejemplo: 5, 13, 17, 21, 34). Las pruebas utilizadas deben minimizar las reacciones cruzadas con el BVDV y otros pestivirus. Sin embargo, el sistema de prueba debe asegurar la identificacin de todas las infecciones de PPC, y a todas las fases de la respuesta inmune a la infeccin. Antgeno: El antgeno debe derivar de, o corresponder a, protenas vricas de una de las cepas recomendadas de CSFV. Las clulas utilizadas para preparar antgeno deben estar libres de cualquier otra

infeccin con Pestivirus. Antisueros: Los antisueros policlonales para pruebas competitivas o bloqueantes deben obtenerse de cerdos o conejos infectados con una de las cepas recomendadas de CSFV o con la cepa C adaptada a conejo. Los MAbs deben estar dirigidos contra una protena vrica inmunodominante del CSFV. Los ensayos indirectos deben utilizar una inmunoglobulina anti-cerdo que detecte tanto IgG como IgM. La sensibilidad de la prueba ELISA debe ser lo bastante grande como para considerar positivo cualquier suero de animal convaleciente, es decir, que reaccione en la prueba de neutralizacin al menos 21 das despus de la inoculacin. La prueba ELISA solo puede utilizarse con muestras de suero o plasma derivadas de cerdos individuales. Si el procedimiento ELISA empleado no es especfico para la PPC, las muestras positivas deben analizarse adems por pruebas diferenciales para distinguir entre PPC e infecciones por otros pestivirus. El ELISA bloqueante de captacin de complejos (5) es un mtodo de un solo paso muy adecuado para utilizar en sistemas ELISA automatizados. Los sueros se emplean sin diluir. La prueba es rpida y fcil de realizar, y detecta anticuerpos contra las cepas de CSFV de baja virulencia en las primeras fases de la infeccin. Como los MAbs son especficos para el CSFV, el ELISA bloqueante de captacin de complejos detectar anticuerpos contra el BVDV solo muy raramente, aunque los anticuerpos contra EF pueden ser ms problemticos. Los sueros positivos se vuelven a probar por NPLA para confirmacin. Recientemente se ha descrito un nuevo ELISA que utiliza protenas de fusin derivadas de pptidos vricos (19). Se alega que esta prueba proporciona una mayor sensibilidad y una deteccin de anticuerpos ms rpida que las obtenidas mediante el ELISA convencional, pero, en este momento, se desconoce su reactividad con el anticuerpo causada por diversas cepas de la PPC. Se puede obtener ms informacin sobre los kits comerciales de los laboratorios de referencia de la OIE. 8. CONCLUSIONES Uno de los aspectos relevantes en relacin al virus del CP, es el conocimiento de la funcin de las protenas estructurales del virus, denominadas glicoproteinas E1, E2 y E3 asociadas a la envoltura externa viral. La E1 y en menor grado la E2, son las responsables de la formacin de los anticuerpos neutralizantes o protectores del animal, pues la E1, contiene los determinantes o dominios antignicos o epitopos que intervienen en el mecanismo de la neutralizacin del virus por los anticuerpos neutralizantes presentes en el animal expuesto. Las variaciones antignicas del virus del CP, ocurren en la E1, posiblemente como un mecanismo de persistencia viral frente a presiones inmunolgicas, aspecto de gran significancia epidemiolgica. Adems, la E1 est siendo utilizada en la preparacin de vacunas recombinantes que se emplean actualmente en pases donde el CP est en proceso de erradicacin. La aparicin de cepas de baja virulencia asociadas a infecciones congnitas ha complicado no solamente la patognesis de la enfermedad, sino tambin, hace ms difcil establecer un programa de control. Cuando las cepas de baja virulencia infectan a marranas gestantes pueden dar lugar a un conjunto de fetopatias dependiendo de la edad de los fetos en el memento de la infeccin. Si la infeccin ocurre antes de los 45 das, los lechones pueden nacer con infeccin persistente e inmunotolerantes al virus del CP y se transforman en fuentes del virus. Algunos de estos animales pueden llegar a la edad reproductiva y sus cras tendrn la misma condicin. Los animales con infeccin persistente son detectados mediante pruebas serolgicas como ELISA y ltimamente PCR. Estos animales no forman anticuerpos ante la exposicin al virus vacunal o al virus de campo, por tanto, aquellos animales que no tienen anticuerpos o muestran una pobre respuesta inmunolgica, deben ser eliminados de la granja. Uno de los aspectos centrales del programa de control de CP y DVB, es la identificacin y eliminacin de estos animales de la granja o del hato. Actualmente, ante el uso evidente de las vacuna recombinantes, una tcnica serolgica que permita diferenciar a los anticuerpos producidos por la vacuna o por el virus de campo, ser de gran utilidad, como ocurre en los pases que estn en proceso de erradicacin del CP.