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PRCTICA 4: SEPARACIN DE AMINOCIDOS DE JUGOS DE FRUTOS POR CROMATOGRAFA BIDIMENSIONAL EN CAPA FINA INTRODUCCIN La cromatografa fue inventada por el botnico ruso Mikhail Tswett a principios del siglo XX, empleando esta tcnica para separar algunos pigmentos de las plantas, el nombre de este mtodo viene del griego choma (color) y graphein (escritura); el cual es un mtodo de separacin, identificacin y determinacin de los componentes qumicos de mezclas complejas ocupando dos fases inmiscibles entre ellas. En la cromatografa en capa fina, se utiliza una placa( generalmente de aluminio) que se recubre con fase estacionaria que puede ser almina o silica gel, en la cual se presentara un fenmeno de adsorcin selectiva. La fase mvil ascender por capilaridad por la placa arrastrando a su paso los componentes de la mezcla (o tambin llamados solutos) logrando separarlos; las fases involucradas en este tipo de cromatografa son: solido-liquido, las separaciones estn basadas en las diferencias en la velocidad de migracin entre los componentes de la fase mvil, polaridad (generalmente la fase estacionaria ser ms polar que la fase mvil, de forma que los componentes menos polares se desplazaran con una mayor velocidad) , tamao de la partcula, temperatura, pureza de los disolventes, entre otros. La cromatografa bidimensional, se basa en desarrollar un cromatograma con dos fases mviles distintas en diferentes direcciones .(Aguilar, 2009) En la cromatografa, en general se fundamentan en las velocidades de migracin de las distintas sustancias que se quieren separar , que estn gobernadas por su solubilidades relativas en la fase estacionaria polar y la fase mvil no polar . En un solo paso de separacin cada soluto se distribuye entre ambas fases de acuerdo con su coeficiente de particin ( es una constante de equilibrio definido) .Para un sistema de solventes y un tipo de papel determinado , cada sustancia tiene un valor de Rf caracterstico. Una mezcla compleja que no se separa por completo en un solo cromatograma en papel usa la cromatografa bidimensional en papel. Basada en el principio anterior , con la diferencia en la tcnica , la muestra se aplica en una esquina y el cromatograma se corre en forma paralela a uno de los bordes del papel, al terminar el primer cromatograma la hoja se rota 90 y se realiza una cromatografa paralela al segundo borde utilizando otro sistema desolventes. Dado que cada compuesto migra a una velocidad caracterstica en un sistema de solventes determinado, la segunda cromatografa debera incrementar en grado sustancial la separacin de la mezcla de componentes .( Braitwaite,1985)

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OBJETIVO GENERAL Identificar aminocidos presentes en jugos de frutas mediante cromatografa bidimensional en capa fina por comparacin de valores Rf con los de soluciones tipo.

OBJETICO ESPECIFICO Comparar el grado de resolucin de la cromatografa bidimensional con el de la unidimensional para sealar ventajas y desventajas. Analizar los aminocidos presentes en el jugo de frutas experimental mente y el encontrado en la literatura PROCEDIMIENTO

1. PREPARACIN DE LA MUESTRA PROBLEMA Se pesaron 20 g del fruto (por ejemplo: limn, naranja, pia, etc), se obtuvp el jugo, se filtr a travs de gasa, medir volumen obtenido y centrifugar 2000 rpm/min. 2. PREPARACIN DEL CROMATOFOLIO Se tomaron tres cromatofolios cortados de la siguiente manera. * Una en dos mitades de 12.5 cm x 20 cm, para los cromatogramas unidimensionales (I y II) * Las otras dos, en cuadrados de 20 cm2 para los cromatogramas bidimensionales (Ill y IV) Se marcaron cada una de los cromatofolios de la manera siguiente: en uno de los extremos del cromatofolio se trazaron con un lpiz la lnea de aplicacin a 0.5cm. Esta operacin se realiz en los cuatro cromatofolios. En los dos cromatofolios para cromatrograma unidimensional, sobre la lnea de aplicacin, se trazaro 11 puntos equidistantes para la aplicacin de las soluciones tipo de aminocidos y del problema, indicando en cada punto el nombre del aminocido ( ver Manual, Figura 1 y 2, pg. 22)

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3. APLICACIN DE LA MUESTRA Cromatogramas unidimensionales I y II. En el punto de aplicacin correspondiente a cada aminocido y solucin problema se colocaron 5 l de muestra. Cromatogramas bidimensionales, En el punto de interseccin, a los 3 cm, se aplicaron 5 I de cada solucin tipo de aminocidos, secando inmediatamente despus de la aplicacin de cada aminocido. En el cromatograma IV se hicieron un mnimo de 10 aplicaciones, de 5 L cada una, del jugo del fruto elegido, secando despus de cada aplicacin. 4. NEUTRALIZACIN CON VAPORES DE AMONIACO (HIDRXIDO DE AMONIO) Despus, se expusieron a los vapores de amoniaco 15 segundos. 5. SATURACIN CON LA PRIMERA FASE MVIL: BUTANOL- AC. ACTICO-AGUA Se colocaron los cromatogramas I, III y IV en la cmara previamente saturada con los disolventes de la fase mvil y se saturaron por un mnimo de 10 minutos. 6. DESARROLLO CON LA PRIMERA FASE MVIL Una vez saturados los cromatogramas se agregaron a la cubeta 120 ml de la mezcla de disolventes, que constituyen la primera fase mvil (ver apndice I. Preparacin de reactivos). Cuando el frente del disolvente haya alcanz las 3/4 partes del largo del cromatofolio se sacaron los cromatogramas, utilizando guantes, y se marc con lpiz el frente del disolvente. 7. ELIMINACIN DE LA PRIMERA FASE MVIL Se elimin la primera fase mvil por secado con calor en un horno para cromatografa. El indicador de temperatura marc 50 C. 8. SATURACIN CON LA SEGUNDA FASE MVIL: METANOL- ETANOLUREA-AGUA Se giraron 90 los dos cromatogramas didimensionales III y IV y se colocaron en la cmara de cromatografa; se colocaron tambin el cromatograma unidimensional II, que se desarrollaron nicamente en este sistema de disolventes. La saturacin de los cromatogramas en la segunda fase mvil, se llev acabo en un mnimo de 10

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minutos. 9. DESARROLLO CON LA SEGUNDA FASE MVIL Se adicionaron a la cubeta 150 ml de la segunda fase mvil (ver apndice I. Preparacin de reactivos), se dej desarrollar a lo largo del cromatofolio hasta 3/4 partes del mismo. Se sacaron los cromatogramas de la cmara, usando guantes y marcar con lpiz el frente del disolvente. 10. ELIMINACIN DE LA SEGUNDA FASE MVIL Se repitieron el paso 7 para eliminacin de la segunda fase mvil. 11. REVELADO POR ASPERSIN Se colgaron los cromatogramas en la campana de extraccin y se rociaron de

manera uniforme con una solucin de ninhidrina al 0.2 % en el etanol al 96 %, desde la lnea de aplicacin hasta el frente del disolvente. Se dejaron en la oscuridad al menos, 1 hora antes de obtener los valores de Rf. RESULTADOS 1. Representacin esquemtica de los cromatogramas

Imagen 1.0 Cromatografa

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Figura 1.1 Cromatoplaca de aminocidos bidimensional la cual no corri.

Figura 1.2 En sta foto se puede mostrar una cromatoplaca, la cual contiene las 6 muestras de los jugos problemas, los cuales como se puede apreciar tuvieron una elucin correcta a lo largo de la cromatoplaca. 2 mezcla de solventes

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Aminoacidos de Zanahoria
Triptofan Fenilalani na

7.8 cm midiendo del punto de aplicacin al final del frente de corrimiento

Figura 1.3 En sta foto se puede mostrar una cromatoplaca, la cual contiene las 6 muestras de los jugos problemas, los cuales como se puede apreciar tuvieron una elucin correcta a lo largo de la cromatoplaca. 1 mezcla de solventes

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Aminoacidos de Zanahoria

Histidina a Glicina Leucina Valina Metionina Fenilalanina

9 cm midiendo del punto de aplicacin al final del frente de corrimiento

Figura 1.3.1
Representacin de la fotografa superior

Las cromatoplacas bidimensionales no tuvieron corrimiento alguno por lo tanto no se representaron esquemticamente ni en tablas.

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1a Fase mvil

2a fase mvil

Frente del Aminocido Glutmico Prolina Histidina Alanina Lisina

Frente del

Rf

Frente del

Frente del

Rf

Disolvente Soluto 9cm 9cm 9cm 9cm 9cm 2.5cm Nada Nada 2.5 cm 1, 2.7cm

Disolvente Soluto 0.27 7cm 0 0 7cm 7cm 6.6cm Nada Nada Nada Nada 0.94 0 0 0 0

0.27 7cm 0.11 7cm 0.3

Triptofano Valina

9cm 9cm

5.7cm 2.9, 3.7cm

0.63 7cm 0.32 7cm 0.411

Nada 6.2cm

0 0.88

Arginina Tirosina Metionina

9cm 9cm 9cm

1.3cm 2.7cm Nada

0.144 7cm 0.3 0 7cm 7cm

6.8cm Nada Nada

0.97 0 0

Tabla1. Rf de Aminocidos tipo en placa unidimensional No. de mancha Frente del disolvente 1 9cm 1a Fase mvil Frente del Soluto 2cm 3cm 2 9cm 2cm 2.8cm 5cm 3 9cm 1.3cm 2cm 2.5cm 0.22 0.33 0.22 0.31 0.55 0.14 0.22 0.27 7.8cm 7cm 0.89 7.8cm 7.1cm 7.4cm 0.91 0.94 Rf 2a fase mvil Frente del Frente del Rf disolvente soluto 7.8cm 6.8cm 0.87

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3.3cm 3.9cm 5cm 4 9cm 0.6cm 1.5cm 2.3cm 3.3cm 5 9cm 1.2cm 1.9cm 3.2cm 5cm 6 9cm 1.6cm 4,4cm 5.3cm 7 9cm 0.7cm 1.2cm 2.4cm 3.3cm 4.4cm 5cm 8 9cm 0.9cm 1.6cm 2.2cm 2.8cm 3.3cm 4.1cm 5cm

0.36 0.43 0.55 0.066 7.8cm 0.16 0.25 0.36 0.13 0.21 0.35 0.55 0.17 0.43 0.58 0.07 0.13 0.26 0.36 0.48 0.55 0.1 0.17 0.24 0.31 0.36 0.45 0.55 7.8cm 7.4cm 0.94 7.8cm 7.8cm 6cm 6.5cm 7.3cm 5.9cm 7cm 0.76 0.83 0.93 0.75 0.89 7.8cm 6.3cm 7cm 7.4cm 0.80 0.89 0.94 6.4cm 7cm 7.4cm 0.82 0.80 0.94

Tabla 2. Rf de los jugos analizados. Placa unidimensional

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PRENGUNTAS ADICIONALES 1. Investigar en la literatura los aminocidos que contiene el jugo empleado como problema. Jugo Problema: UVA Aminocido reportado en literatura Alanina Arginina Cistina Fenilalanina Glicina Hidroxiprolina Histidina Metionina Prolina Serina Tirosina Treonina Triptofano Valina Aminocido encontrado Glutmico Prolina Histidina Alanina Lisina Triptofano Valina Arginina Tirosina Metionina

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2. Escriba la reaccin completa y con nombres, de la ninhidrina con un aminocido.

La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con aminocidos que tengan el grupo amino libre, dando lugar a la formacin de amoniaco y anhdrido carbnico, con reduccin del reactivo (ninhidrina) a hidrindantina. La hidrindantina reacciona a su vez con el amoniaco y otra molcula de ninhidrina para dar un compuesto de adicin doble que presenta una coloracin azul-prpura.

3. Es posible cambiar el orden de las fases mviles? Explique su respuesta. No es posible ya que las eluciones llevan un orden y conforme a la metodologa no saldra el rf 4. Mencione 3 aplicaciones de la cromatografa en capa fina, diferentes al utilizado, explique uno.

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Identificacin de alguna sustancia conocida en una mezcla por su comparacin con un patrn con una sustancia pura. Medir el grado de pureza de una muestra, si existen varias manchas en el cromatograma, es seal de que exisen varios componentes en la muestra. Obener una medida semi cuantitativa de algn componente, pichando la misma cantidad en la placa cromatogrfica, cuanto mayor sea la mancha obtenida en el cromatograma, la concentracin de esa sustancia ser mayor.

5.-Indique las posibles fuentes de error de esta tcnica. Que se aplicara una solucin muy cocentrada, no siempre es til para separar algunas sustancias por lo que se necesita repetir el experimento. Utilizar un eluyente con alta polaridad, puede desplazar demasiado a la muestra lo cual causaria errores en el cociente al momento de sacar el Rf 6. Explique como se podria cuantificar el analito y cuales seran las ventajas y desventajas de utilizar una curva de calibracin o un estndar de concentracin Obteniendo mediante un raspado de la cromatoplaca parte de la muestra y haciendo una dilucin en una celda para obtener sus absorbancias y sacar concentraciones por mtodo espectofotomtrico. Mtodo Curva de calibracin Ventajas Se obtienen concentraciones exactas Estndar de concentracin Desventajas No se sabe que interfiera en la muestra

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DISCUSIN Se utiliz la tcnica de cromatografa en capa fina, la cual se basa en la separacin de las molculas absorbidas a la capa de gel de slice de la cromatoplaca mediante el flujo de la columna de la mezcla de solventes de agua, butanol y cido actico. La fase estacionaria es la celulosa y la mvil los disolventes. Segn la solubilidad que tienen los aminocidos de la muestra respecto de las dos fases as fue su movilidad Las manchas de los aminocidos se observaron sobre la placa desarrollada, por la una solucin de ninhidrina rociada y al despus ponerla en la estufa. Los aminocidos aparecieron como manchas prpura sobre un fondo ligeramente amarillento. Sin embargo, la prolina (que no produce amonio libre al reaccionar con ninhidrina) genera una mancha de color amarillo oscuro. Se utiliz la ninhidrina debido a que sirve para la determinacin de aminocidos con el grupo amino libre .La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con aminocidos que tengan el grupo amino libre, dando lugar a la formacin de amoniaco y anhdrido carbnico, con reduccin del reactivo (ninhidrina) a hidrindantina. La hidrindantina reacciona a su vez con el amoniaco y otra molcula de ninhidrina para dar un compuesto de adicin doble que presenta una coloracin azul-prpura. La ninhidrina reacciona con los aminocidos formando aductos coloreados segn la reaccin:

El reparto de los aminocidos en el papel se debe a su naturaleza qumica. Las frmulas de los compuestos usados como patrn son:

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El reparto que se obtiene es el siguiente: los aminocidos apolares son los que mejor interaccionan con el solvente y son arrastrados por l; la lisina presenta la menor movilidad debido a que al pH del solvente, este aminocido presenta sus dos grupos amino cargados positivamente por lo que interacciona mal con el solvente, mayoritariamente apolar (n-butanol). Los dems aminocidos se separan entre los aminocidos apolares y el bsico. Al determinar los factores de retencin se puede observar que el triptofano es el que mayor factor de retencin obtuvo, esto debido a que es el que tiene mayor afinidad por el disolvente y el de menor factor de retencin fue la histidina, es decir, tuvo menor afinidad por el disolvente. CONCLUSIONES Esta tcnica de separacin cromatogrfica es de las ms simples, adems de que nos permiti estudiar esta tcnica y cualitativamente observar la reaccin producida por medio de la ninhidrina que permite identificar aminocidos ya que la reaccin de los aminocidos con ninhidrina se debe a la presencia del grupo NH2 en los mismos observndose as una coloracin morada o magenta. La prolina no tiene dicho grupo libre, sino NH- ya que forma parte del anillo de pirrolidina, y al reaccionar con ninhidrina se forma un color amarillo. El factor de retencin depende de la afinidad de los aminocidos con el disolvente o eluyente utilizado y esto mismo depende del tipo de aminocido que se utilice, es

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decir si son polares, apolares, neutros, etc., por lo cual es importante esta tcnica ya que de esta manera se nos facilitaran saber las caractersticas del aminocido que se este utilizando.

REFERENCIAS .Aguilar Zamora Emanuel 2009, Manual del Instituto Politcnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas Qumico Bacterilogo Parasitlogo, Mxico. .Braitwaite,L.and F,J .Smith 1985 Cromatographic Methods 43 ed,Chapman and Hall ,N.Y paginas 98-101

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PRCTICA 5: SEPARACIN DE UNA MEZCLA DE AZUL DE METILENO Y FLUORESCEINA USANDO CROMATOGRAFA POR ADSORCIN INTRODUCCIN La cromatografa consiste en una serie de mtodos que sirven para la separacin de una mezcla de solutos. Se basa en la diferente velocidad con que se mueve cada uno de los solutos a travs de un medio poroso, arrastrados por un disolvente en movimiento. El fundamento de la cromatografa consiste en el reparto o distribucin diferencial de dos o ms compuestos (solutos) entre dos fases, una de las cuales permanece fija, por lo que se denomina fase fija o estacionaria y otra que fluye a travs de ella, por lo que se le denomina fase mvil o eluyente. Como la fase estacionaria debe permanecer fija, su estado fsico se limita a slidos y lquidos, en tanto que la fase mvil requiere ser un lquido o un gas para poder fluir. Las separaciones por cromatografa de reparto, son particularmente interesantes para los compuestos solubles en agua. La cromatografa por adsorcin es el fenmeno de adhesin superficial cuyo mecanismo consiste en interacciones bipolares. Esta utiliza una fase lquida mvil y una fase estacionaria slida. Se puede tener en columnas o en capa fina. En esta cromatografa se sobresalta porque la diferencia principal es la composicin de la fase mvil; esta es de tal naturaleza que cuando el material se aplica al adsorbente, el soluto queda inmovilizado. La migracin empieza hasta que se aade una fase mvil.(Castellan, 1990)

Existen ciertas sustancias slidas, qumicamente inertes, que tienen la propiedad de adsorber o fijar dbilmente en su superficie a una gran cantidad de compuestos. La fortaleza con la que se adsorben las sustancias sobre un adsorbente dado vara de un compuesto a otro. Entre los adsorbentes ms usuales: slica Gel (xido de silicio), almina (xido de aluminio), celulosa, fluorosil (silicato de magnesio) y sulfato de calcio. La separacin se realiza por la diferente tendencia de adsorcin de los compuestos orgnicos por la fase estacionaria. La fase mvil desplaza y disuelve a los componentes de la mezcla segn sea su afinidad por la fase estacionaria es decir, los componentes ms polares estarn adsorbidos con ms fuerza y sern ms difciles de separar de la fase estacionaria que los componentes poco polares. Los menos polares no presentan una interaccin importante con la fase estacionaria (gel de slice) y no sern retenidos. En un proceso de adsorcin los componentes de la mezcla son adsorbidos por la fase estacionaria con diferente intensidad de tal forma que el proceso adsorcin. (Carrillo, 2009)

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OBJETIVO GENERAL Aplicar la tcnica de cromatografa por adsorcin para la separacin de dos colorantes.

OBJETIVO ESPECIFICO Comprobar la separacin con base en el perfil de elucin para sealar las ventajas y desventajas del mtodo.

PROCEDIMIENTO Se llen tres cuartas partes de la columna de vidrio, se introdujo un disco de lana de vidrio previamente humedecido para formar un soporte en la base de la columna. Se pesaron 15 g de almina alcalina y se adicionaron a la columna. Una vez sedimentada la almina, se ajust la velocidad de elucin entre 15 y 20 gotas por minuto. Cuando el menisco del agua estaba 3 mm por encima de la columna de almina, se aplic 0.1 ml de la mezcla de colorantes en la parte central de la superficie del adsorbente, se comenz a colectar fracciones de 3.0 ml en tubos de ensaye previamente aforados; se adicion aproximadamente 1 ml de agua con pipeta Pasteur, resbalando por las paredes de la columna para introducir toda la mezcla de colorantes a la almina. Esta operacin se repiti unas tres veces, hasta que ya no hubiera colorantes en la superficie de la fase estacionaria. Se adicion agua destilada hasta el extremo superior de la columna de vidrio. Despus de que el primer colorante eluy, se sustituy el agua por el etanol cido y se continu la coleccin de fracciones obtenidas a 493 y 590 nm, Se ajust a 100 % T a 493 nm con agua y con alcohol cido a 590 nm.

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DATOS EXPERIMENTALES E INFORME 1. Elaborar la siguiente tabla

Tabla 1. Valores de absorbencia obtenidos para la separacin de fluorescena y azul de metileno No. de fraccin 1 2 3 4 5 6 7 8 A 493 0.023 0.022 0.03 0.034 0.008 0.17 0.026 0.0082 Fluoresceina A590 0.08 0.016 0.009 0.078 0.009 0.003 0.001 0.078 Azul de Metileno

PERFIL DE ELUCION

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Absorbancia para la separacion de fluoresceina y azul de metileno.

0.18 0.16 0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0 2 4 6 8 10

Absorbancias

A 493 A 559

Volumen de elucin

Figura 1.0 En este perfil de elucin se observan claramente dos picos el primero corresponde a la separacin de fluorescena ya que es el primer componente de la mezcla que se obtuvo, enseguida se observa un lapso en el que no se obtuvo ningn componente, es decir que las absorbancia fueron casi constantes y finalmente se observa otro pico que corresponde al azul de metileno ya que el colorante que se obtuvo al final.

3. Especifique y defina los elementos del sistema cromatogrfico para esta separacin Fase Estacionaria: Silica Alcalina. Puede ser un slido poroso que funciona de soporte para la elucin y poseen alta capacidad de adsorcin, interacciona con los compuestos a separar por puentes de hidrogeno e interacciones electrostticas. Fase Mvil: Agua y Etanol cido. Tambin conocida como eluyente es una mezcla de solventes que arrastra a los componentes que se encuentran adheridos a la fase estacionaria, son de gran importancia pues determinan con sus interacciones y afinidad el perfil de elucin. Columna: Columna de Vidrio: Es el instrumento de soporte de la fase estacionaria, en este caso se utiliza un trozo de lana-cristal para poder retener la silica en la columna. Gradiente: Agua y cambio a Etanol cido. Consiste en utilizar mezclas variables de dos o mas sustancias de distinta polaridad, la relacin de volumen de los disolventes vara segn el propsito y permite una elucin mejorada. Mezcla: Es un conjunto de 2 o ms sustancias que pueden ser separadas por un mtodo fsico o qumico.

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4. Defina el trmino adsorcin y describa, empleando frmulas, cuales son las fuerzas intermoleculares que participan en el proceso. Adsorcin: Fenmeno por el cual molculas de un gas o de un lquido se fijan dentro de una fina capa superficial de determinada sustancia en estado slido. Fluorescena

La fluorescena es una sustancia muy polar debido a los electrones no compartidos, esta misma caracterstica presenta el agua, sabemos que lo polar disuelve lo polar por lo tanto la fluorescena se disuelve en el agua, por lo tanto lo que eluye son ambas sustancias.

Fluorescena sdica Azul de metileno

agua

El azul metileno eluye con el etanol acido (ambas sustancias no polares) por que entre estas dos se da una competencia por el adsorbente, ya que se sabe que adsorbentes con superfiece activa alta adsorben a compuestos no polares

Azul de metileno

etanol

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DISCUSIN: A simple vista se observ que el primer elemento en separarse fue la fluorescena y posteriormente el azul de metileno. En el perfil de elucin se observan dos elevaciones: La primera se detecto a una longitud de onda de 493 nm que corresponde al agua, como sabemos el agua es una sustancia polar por lo tanto disolver compuestos semejantes. En la mezcla de colorantes el componente mas polar es la fluorescena, por lo tanto la elevacin en el perfil de elucin corresponde a la separacin de este compuesto. Hay algunos volmenes en los que a diferentes longitudes de onda la absorbancia es mnima lo cual indica que durante este lapso no se separo ningn componente de la mezcla. La almina (fase estacionaria) tiene una superficie activa alta, por lo cual adsorber mejor a compuestos no polares; al no presenta polaridad, el etanol y azul de metileno competirn por ser adsorbidos, lo cual les permitir que eluyan juntos, es por esto que se en el cromatograma se observa el segundo pico ya que este fue detectado a 668nm que corresponde a la longitud de onda para el etanol. CONCLUSIONES:
.

En esta cromatografa se aplico el principio bsico polar disuelve polar, esto es lo que hizo posible que separar a la fluorescena de acuerdo a su polaridad, finalmente el otro componente se pudo separar ya que la fase estacionaria presentaba una superficie activa alta lo cual le hace tener gran afinidad por los compuestos no polares, al haber dos compuesto no polares en la cromatografa (azul de metileno y etanol) esto competiran por ser adsorbidos lo que ocasiono que eluyeran juntos. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Carillo del ngel Jos de Jess 2009 MANUAL DEL INSTITUTO POLITECNICO NACIONALESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICASDEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA 4IM2 SECCION III 2011500079 .Catellan, G.W.1990 Fisicoquimica .Fondo Educativo Interamericano, S.A, Mexico paginas 818-820.

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PRCTICA 6: VERIFICACIN DEL FUNCIONAMIENTO CORRECTO DE UN ESPECTROFOTMETRO INTRODUCCIN Un espectrofotmetro es un instrumento usado en el anlisis qumico que sirve para medir, en funcin de la longitud de onda, la relacin entre valores de una misma magnitud fotomtrica relativos a dos haces de radiaciones y la concentracin o reacciones qumicas que se miden en una muestra. Tambin es utilizado en los laboratorios de qumica para la cuantificacin de sustancias y microorganismos. Hay varios tipos de espectrofotmetros, puede ser de absorcin atmica o espectrofotmetro de masa y visuales. Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromtica a travs de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Esto le permite al operador realizar dos funciones: 1. Dar informacin sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra 2. Indicar indirectamente qu cantidad de la sustancia que nos interesa est presente en la muestra La espectrofotometra de absorcin en las regiones ultravioleta y visible del espectro electromagntico es, posiblemente, la ms utilizada en la prctica del anlisis cuantitativo de todas las tcnicas espectroscpicas. Asimismo, puede resultar de utilidad como tcnica auxiliar para la determinacin de estructuras de especies qumicas.(Murali,1980) La qumica es importante para realizar la lectura de un lquido en cualquier material volumtrico. Para esto deben coincidir la curva (ms bien la tangente de sta)(la parte central)con el aforo o graduacin. Siempre teniendo la vista perpendicular a ambas.

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El lquido restante del menisco que queda por encima del aforo (en caso de ser cncavo), generalmente queda en el recipiente una vez vertido el contenido.(Rand,1969)

CONTROL DE LA EXACTITUD DE LA LONGITUD DE NO APTO PARA FOTOCOLORMETROS NI AUTOANALIZADORES Frecuencia del control:

ONDA

El control se podr realizar en espectrofotmetros con selector continuo de longitudes de onda, no as en fotocolormetros de filtro ni en autoanalizadotes, ya que en estos no se pueden realizar espectros de barrido. Definicin: Grado de concordancia entre la longitud de onda que indica el seleccionador y la longitud de onda de referencia requerida. Se expresa en nm. Fundamento: Se utiliza el mtodo del punto isosbstico: el rojo Congo tiene la particularidad que los espectros de las formas cida y bsica del colorante en igual concentracin presentan la misma absorbancia a una longitud de onda denominada "punto isosbstico" (PI). Esta longitud de onda es independiente de la concentracin del colorante y de la temperatura de trabajo por lo cual resulta un parmetro fijo de referencia. Si el punto isosbstico hallado experimentalmente difiere del terico, indica que existe un corrimiento en la longitud de onda.(Frings,1979)

OBJETIVO GENERAL Realizar pruebas de control de calidad de un espectofotmetro para determinar la respuesta instrumental del equipo. OBJETIVO ESPECIFICO

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Analizar las siguientes pruebas: proporcionalidad o linealidad fotomtrica, exactitud de la escala de longitud de onda, presencia de radiacin dispersa, ancho de banda y exactitud para determinar la respuesta de diferentes equipos espectofotomtricos. PROCEDIMIENTO A) Se determin el volumen mnimo de lectura y se observ el Efecto menisco. Se ajust el aparato a cero con aire, a una longitud de onda de 500 nm. Se colocaron 0.2 ml de la solucin dicromato de potasio al 0.08 % y se tom la primera lectura. Se agregaron 0.2 ml de la solucin nuevamente y se registr la lectura. Se repiti la adicin de la misma cantidad de solucin tomando las lecturas hasta que permaneciera constante. Se determin el volumen mnimo de lectura. A) Exactitud de la escala de longitud de onda Se coloc el selector de longitud de onda en 380 nm y se ajust el instrumento al aire (0 %T) Se ajust a 100 %T con agua destilada y se insert el filtro de didimio en el portacubetas sin quitar la celda con agua y se ley la transmitancia a las diferentes longitudes de onda (ver manual, Tabla 2, pg 38) A.2) Mtodo de solucin qumica colorida. Solucin acuosa de NiSO4. 6H20 al 20 %. Se coloc el selector de longitud de onda en 400 nm y se ajust a 100 %T con una solucin de HCI al 1 %, empleada como blanco de reactivos. Se coloc la solucin del sulfato de nquel en el portacubetas y se ley la transmitancia de 380 a 600 nm en intervalos de l0 nm, ajustando a 100 %T con el blanco de reactivos cada vez que cambie la longitud de onda, tabla 3. A.2,1) 1. Se adicionaron 25 L de la solucin de rojo de cresol al 1 % en cada uno de tres matraces aforados de 25 mL. 2. Se aforaron cada uno de los matraces con las siguientes soluciones a) cido sulfrico 0.5 M b) Hidrxido de sodio 0.5 M c) Regulador de citratos 0.5 M pH 4.7

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3. Se leyeron las absorbencias de las tres soluciones en un espectrofotmetro, desde 360 nm hasta 680 nm con intervalos de 20 nm. Se ajust a cero con agua destilada despus de cada cambio de longitud de onda. B) Proporcionalidad o linealidad fotomtrica Se determin la absorbencia a 460 y 550 nm de la solucin de NiSO 4. 6H20 al 20 % ajustando previamente el aparato al aire y a 100 %T al 1 % (tabla 4, pg 39) C) Luz dispersa, espuria y errtica o extraa Se ajust el instrumento al aire (0 %T) y a 100 %T con HCI al 1 %. Se ley la transmitancia de la solucin estndar de sulfato de nquel al 20 % a 400 nm, para comprobar que no exista luz extraa a ambas longitudes de onda, se compar con las lecturas del experimento del inciso A.2. Se considera que existe luz extraa cuando hay un crecimiento de %T mayor a 3, con respecto a la lectura original a ambas longitudes de onda, (ver Tabla 5, pg 39) D) Ancho de la banda (ranura de salida) Se ley la transmitancia del sulfato de nquel al 20 % a 510 nm, se ajust previamente el aparato a 0 y 100 %T con HCI al 1 %. Se considera que hay cambios en el ancho de banda cuando hay decrementos del 3 %T con respecto a la lectura original (inciso B) (ver manual, Tabla 6, pg 39) E) Exactitud fotomtrica En una espectrofotmetro que trabaje en la regin ultravioleta, se determin la absorbancia de una solucin de referencia de dicromato de potasio. Se ajust el instrumento al aire y a 100 %T con H2SO4 0.005 M. La lectura se efectu en una cubeta de cuarzo de 1 cm de paso de luz, (ver Tabla 7, pg 40) COMPORTAMIENTO INTEGRAL DEL ESPECTROFOTMETRO a) Prepare por duplicado la curva de calibracin de acuerdo a la siguiente tabla Tabla No. 1 Preparacin de la curva de calibracin del sulfato de nquel, (ver manual, pg 37) Se determin la absorbencia de cada tubo de ambas series, a 400 nm ajustando al 100 % T con el tubo 1 y 1 ' respectivamente, (Tabla 8, pg 40)

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RESULTADOS Y ANALISIS
Tabla 1. Determinacin Del Volumen Mnimo De Lectura Y Efecto Menisco Volumen 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Absorbencia 0.117 0.121 0.379 0.833 0.833

La luz atraviesa de manera uniforme a un volumen mnimo de lectura de 1mL y presenta un efecto menisco a 0.8mL de la sustancia de bicromato (0.08%) a 500nm de longitud de onda. A) Exactitud de la escala de longitud de onda Tabla 2. Transmitancias del mtodo de solucin qumica colorida con la solucion de NiSO4. 6H20 al 20 % Longitud de onda (nm) 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 %T 34.0 24.4 24.7 32.8 51.4 75.2 89.3 96.2 99.2 102.5 106.2 107.4 108.0

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510 520 530 540 550 560 570 580 590 600

107.8 106.7 103.6 104.9 103.9 102.8 100.4 97.4 93.5 88.6

Espectro de Transmision
120 100 80 %T 60 40 20 0 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 Longitud de onda (nm) 600

Anexo 1 (espectro de transmision). Se muestra como pico de lectura a 500 nm con un transmitancia del 108%.
% Inexactitud fotomtrica = (Abs. hallada Abs. referencia) x 100 Abs. referencia

Exactitud de la escala de longitud de onda del espectrofot metro: %error = x 100 =

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Tabla 3. Mtodo de solucin qumica colorida Longitud de onda 360 380 400 420 H2SO4 0.523 0.021 0.022 0 NaOH 0.530 0.296 0.018 0 Citrato 0.063 0 -

Metodo de solucion quimica colorida

0.6 0.5 Absobencias 0.4 0.3 0.2 0.1 0 -0.1 340 360 380 400 420 Longitud de onda (nm) 440 H2SO4 Citrato NaOH

Anexo 2 Corrimiento (nm) = p. isosbstico hallado p. isosbstico terico El punto isosbstico terico del Rojo Congo es 541 nm. Corrimiento (nm) = 420 500 = 80 nm Ya que los limites de aceptabilidad se encuentran en un corrimiento de entre +/- 3 nm y un intervalo optimo de entre +/-2 nm, se determino que existe un gran corrimiento en la longitud de onda, mayor a 3 el cual fue de 101. Se debe tomar en cuenta que las mediciones se detuvieron en ese intervalo por lo cual no se llego a las mediciones adecuadas para obtener el punto isosbestico real para las tres disoluciones.
Absobancia de color Rojo. 500560

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B) Linealidad o proporcionalidad fotomtrica

Tabla 4. Linealidad o proporcionalidad fotomtrica Solucin de NiSO4. 6H20 al 20 % Longitud de onda (nm) 460 550 0.092 A

La proporcin de la intensidad de luz que llega al detector, es aproximada a 2:1.

C) Luz dispersa Tabla 5. Transmitancia de la solucin estndar de sulfato de nquel al 20 % a 400 nm

Procedimiento A.2 C

%T 24.7 25

No existe una luz extraa o longitud de onda distinta a la seleccionada por el monocromador, que alcanza el detector, ya que no supera el 3% de transmitancia.

D) Ancho de banda Tabla 6. Ancho de banda. Longitud de onda (nm) 510 550 100.3 92% %T

Existe un cambio mayor al 3% por lo tanto se considera un cambio en el ancho de

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banda para el espectrofotometro.

E) Exactitud fotomtrica Tabla 7. Exactitud fotomtrica. Valores experimentales esperados de la solucin de referencia de dicromato de potasio Longitud de onda (nm) A esperada Tolerancia aceptada E (1%, 1cm) A medida 235 min 0.748 0.740-0.756 24.54 0.792 257 mx 0.865 0.856-0.874 144.2 0.912 313 min 0.292 0.289-0.295 48.62 0.298 350 mx 0.640 0.634-0.646 106.56 0.667

Tabla 8. Verificacin del funcionamiento del espectrofotmetro. Experimento Exactitud de la escala de longitud de onda. Proporcionalidad o linealidad fotomtrica. Luz dispersa, espuria y errtica o extraa. Ancho de la banda (Ranura de salida). Exactitud fotomtrica.
%Error = Am Aref x 100 Aref

Datos obtenidos E = m- ref

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El espectrofotometro (Genesis ) utilizado en la practica ---- tiene exactidud-

Causas de erros: Cambio en el ancho de banda. Alteracin de la respuesta relativa o rendimiento instrumental.

F) Funcionamiento integral del espectrofotmetro.

Tabla 9. Funcionamiento integral del espectrofotmetro Tubo No. a 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 b 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Concentracin de NiSO4. 6H20 (M)
0 9.50x10-03 0.0285 0.0665 0.1045 0.1425 0.152 0.171 0.1805 0.19

A400 Serie a 0 0.028 0.084 0.202 0.363 0.468 0.570 0.607 0.646 0.670 Serie b 0 0.034 0.159 0.222 0.357 0.532 0.562 0.619 0.658 0.701

Serie ajustada por regresin lineal

0 0.03 0.095 0.24 0.37 0.51 0.54 0.61 0.65 0.68

Curava de calibracion

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0.8 0.7 0.6 Abs (400nm) 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 -0.1 0

Curva de calibracion del funcionamiento integral

y = 3.6025x + 0.0079 R = 0.9935 Serie A Serie B Linear (Serie A) Linear (Serie B)

0.05

0.1 concentracion (M)

0.15

0.2

Anexo 3 (curva de calibracion) c) Cmo se interpretan estos valores para esa curva?

d) Concluya respecto a la linealidad en la respuesta del detector

DISCUSIN:
El efecto menisco que se lee en el espectrofotometro genesis es de 0.8 mL y su volumen minimo al cual leera de forma correcta sera de 1.0 mL el cual es similar en la mayoria de los espectrofotometros. Exactitud de la escala de longitud de onda Las ventajas del metodo a partir de una solucion colorida, es que la longitud de onda que se obtienen del colorante es independiente de la concentracin del colorante y de la temperatura de trabajo por lo cual resulta un parmetro fijo de referencia y a partir de un valor ya

establecido se puede obtener una exactitud aproximada de la escala de longitud sin embargo, si no se llevan a cabo las disoluciones de manera correcta los datos obtenidos marcaran un grado de inexactitud al que se deberia obtener. Y que el espectro de transmision solo nos dara un valor maximo, aunque si se obtienen dos puede que exista un error, por que las celdas estan rayadas.

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En este espectrofototmetro no existe una luz extraa o longitud de onda distinta a la seleccionada por el monocromador, que alcanza el detector, por lo tanto no existe una luz que interfiera en las lecturas o que aunmente el grado de error en estas de forma significativa.

Existe un cambio mayor al 3% por lo tanto se considera un cambio en el ancho de banda para el espectrofotometro.

CONCLUSIONES: _______________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ___________________________________________________ REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 1:Murali Dharan. Control de calidad de instrumentos y equipamientos de laboratorio. En: Murali Dharan. Control de Calidad en las Laboratorios Clnicos. Madrid: Ed. Revert S.A; 1980. p. 145-62. 2: Rand RN. Practical spectrophotometric standards. Clin Chem 1969; 15 (9): 83963. 3: Frings CS, Broussard LA. Calibration and monitoring of spectrometers and spectrophotometers Clin Chem 1979; 25 (6): 1013-7.