Processo downstream II: rompimento celular, proteção e precipitação da biomolécula alvo

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Processo downstream II
Rompimento celular, proteo e precipitao da biomolcula alvo
Aula 10 Profa. Dra Ilana L. B. C. Camargo Cincias Fsicas e Biomoleculares IFSC - USP
Processo downstream
Etapas de diferentes passos envolvidos no isolamento e purificao
Fermentao
Separao das clulas do meio de fermentao (clarificao)
Purificao inicial ou concentrao
Purificao especfica do metablito
Purificao final
Formulao
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Rompimento celular
Aps as etapas de separao e lavagem das clulas obtidas ao final do cultivo
Critrios para a seleo da tcnica de rompimento celular:

-Tamanho da clula; -Tolerncia a tenses de cisalhamento; -Necessidade de controle de temperatura; -Tempo de operao; -Rendimento de processo; -Gasto de energia; -Custo e capital de investimento
Rompimento celular
Bactrias Gram-positivo 10-80 nm
Parede celular (Murena/peptdeoglicano)

Espao periplasmtico Membrana citoplasmtica
8 nm Bactrias Gram-negativo 3 nm
Membrana externa Murena Espao periplasmtico Membrana citoplasmtica
Parede celular
Leveduras 75 nm
Lipdios Protenas Manana Glicano
Parede celular
Membrana citoplasmtica
Glicano
Fungos filamentosos
Glicoprotena Quitina/microfibrila Membrana citoplasmtica
Parede celular
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Rompimento celular
Parede totalmente rompida Parede parcialmente permeabilizada
Permite que a molcula alvo seja liberada sem a formao de fragmentos celulares
Mtodos divididos em 4 classes:

1. Mecnicos 2. No-mecnicos ou fsicos 3. Qumicos 4. Enzimticos
Rompimento celular
1. Rompimento mecnico
Mais utilizado na Indstria!! Homogeneizador a alta presso
Constitudo de pistes projetados para aplicar altas presses, forando a passagem da suspenso celular por um orifcio estreito seguida de coliso contra uma superfcie rgida e imvel em uma cmara presso atmosfrica, ou coliso contra um segundo fluxo sob presso elevada. A reduo instantnea da presso associada ao impacto provoca o rompimento celular sem danificar biomolculas.
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Rompimento celular
Prensa Francesa escala laboratorial
Prensa Francesa
mbolo
cilindro jato orifcio
Rompimento celular
Fatores que afetam o desempenho de um homogeneizador a alta presso: Presso de operao Velocidade de alimentao Temperatura Fase de crescimento do microrganismo Condies de cultivo Tipo de clula Concentrao de clulas
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Rompimento celular
Homogeneizador a alta presso Provoca aumento de temperatura
Sistema eficiente de refrigerao (principalmente se a molcula alvo for termossensvel) O processo pode aumentar a temperatura em 1,5C para cada 1.000 psi 1 ciclo a 10.000 psi Aumento de 15C
Rompimento celular
Homogeneizador a alta presso A quantidade de clulas rompidas proporcional presso na alimentao Em geral: Presso 5.000 a 20.000 psi Velocidade 180 a 280 m/s Concentrao celular 450 a 750 g/L (massa mida) Melhoramento da eficincia do rompimento: Recirculao do material Desvantagens: Custo Degradao da molcula alvo Gerao de fragmentos celulares pequenos
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Rompimento celular
Homogeneizador a alta presso
Condies de crescimento microbiano podem influenciar a eficincia do rompimento em homogeneizador de alta presso
E. coli em meio sinttico E. coli em meio complexo
Condies mais brandas de rompimento
H formao de parede celular espessa E. coli com crescimento rpido tem parede celular mais fina que as de crescimento lento (alteraes no metabolismo)
Rompimento celular
Homogeneizador a alta presso
Para a ampliao de escala no processo de rompimento celular, deve-se manter constante: -Velocidade de alimentao; -Presso; -Temperatura de operao; -Nmero de passagens atravs da vlvula do homogeneizador; -Viscosidade; -Concentrao celular da alimentao
Presso: 0~30,000 psi/207 mpa/2,070 bar Volume: 9 l 60L/h
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Rompimento celular
Homogeneizador a alta presso Muito utilizado em escala industrial, porm nem sempre o equipamento mais adequado Fungos filamentosos bloqueio da vlvula de descarga
Moinho de bolas o equipamento mais adequado
Rompimento celular
Moinho de bolas -Fungos filamentosos -Leveduras -Microalgas Esquema do Moinho de bolas
Cmara de rompimento
Rompimento devido fora de cisalhamento aplicada pelas esferas de vidro contra a parede celular das clulas
Sada Eixo rotativo
Alimentao
Motor
Esferas
Discos Rotativos Separador
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Rompimento celular
Moinho de bolas Condies facilmente controlveis
- Eficincia depende: 1. Geometria da cmara de rompimento (horizontal+ esferas, ou vertical), relao tima de comprimento/dimetro = 2,5 a 3,5 2. Velocidade de agitao Organismos menores como bactrias, precisam de velocidades maiores que por exemplo, leveduras. 3. Tipo de agitador Projetados para proporcionar a mxima transferncia de energia cintica para as esferas
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3. Tipo de agitador
A) B) C) D) E)
Disco com fendas fechadas Discos com fendas abertas Disco perfurado Disco Excntrico Agitador de pinos
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3. Tipo de agitador Agitadores podem estar dispostos no eixo central ou fora dele, perpendicular ou oblquo
Rompimento celular
4. Tamanho e composio de esferas Composio: -Vidro, -Ao inox -Cermica Tamanho: Bactrias 0,1 mm Leveduras 0,5 mm Dimetros menores proporcionam rompimentos mais eficientes, pois h maior probabilidade de cisalhamento com clula intactas Biomolcula localizada no espao periplasmtico esferas maiores que auxiliaro na liberao sem necessidade de rompimento total
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5. Carga de esferas
Cmara horizontal esferas devem ocupar entre 80 85% do volume Cmara vertical esferas devem ocupar entre 50 - 60% do volume Carga pequena no haver frequncia de coliso suficiente Carga grande diminui a eficincia do processo, aumentam a temperatura e o consumo de energia
Rompimento celular
6. Concentrao celular Exerce pouca influncia 30 50% (v/v) Concentraes menores geram menos calor, mas aumentam o consumo de energia por unidade de massa de celular 7. Velocidade de alimentao Fluxo timo depende: velocidade do agitador, da carga de esferas, da geometria do equipamento e das propriedades do microrganismo
Quanto maior a velocidade menor a frao de clulas rompidas, pois diminui o tempo de residncia no rompedor
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Rompimento celular
8. Temperatura Recomendao 5 15oC Prevenir a destruio da biomolcula alvo Deve-se ter manta de resfriamento diminuir a quantidade de calor liberada nesse processo
Rompimento celular
Tempo de rompimento no moinho de bola
Esferas de vidro de 0,5 mm Microrganismo Saccharomyces cerevisiae
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Rompimento celular
Rompimento celular
1. Rompimento mecnico Ampliao da escala Moinho de Bolas
Manter constante: - Tamanho das esferas; - Proporo em volume entre a suspenso celular e as esferas de vidro; - Velocidade de rotao do eixo ou velocidade perifrica das ps do agitador. Mais comum: manter velocidade perifrica constante (10 a 15 m/s) Independe do tamanho da cmara de rompimento, apesar de depender da viscosidade do meio e tipo de agitador
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Rompimento celular
Ultra-som Energia ultra-snica gerada pelo sonicador transmitida por uma onda
Ondas sonoras (da ordem de 20kHz) so convertidas em vibraes em um meio lquido e causam o fenmeno de cavitao Vibraes geram focos de baixa presso no lquido Bolhas muito Pequenas
Onda de choques Impacto
Colapso
rompimento celular
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Ultra-som
Deve-se controlar o calor Alternativa: pulsos Recomendao da potncia: 0,2 a 3,0m W/mL Valores maiores causam danos a sonda e reduz eficincia
Rompimento celular
Ultra-som
Uso em larga escala invivel Necessidade de utilizar grande quantidade de sondas dispostas em srie e instalar um eficiente sistema de refrigerao Economicamente invivel!!
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Rompimento celular
Desvantagens Elevadas foras de cisalhamento podem destruir organelas celulares e desnaturar complexos enzimticos e enzimas localizadas prximas membrana Gera rompimento integral da clula liberando cidos nuclicos, organelas e fragmentos junto com a molcula alvo contaminantes e viscosidade aumentada!!
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2. Rompimento no-mecnico
A) Choque osmtico B) Congelamento/descongelamento C) Termlise D) Mtodos qumicos Lise enzimtica
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A) Choque osmtico 30 minutos soluo de sacarose de 20% (m/v) Centrifugao Ressuspender em gua destilada a 4oC No h rompimento integral Promove permeabilizao seletiva
Indicado para bactrias Gram-negativo com parede celular mais sensvel
Rompimento celular
B) Congelamento/descongelamento Formao intracelular de cristais de gelo que perfuram a clula Rompimento total ou leso parcial formando poros Fatores que influenciam o rompimento: -Tipo da clula -Idade da clula -Temperatura -Nmero de ciclos Alguns microrganismos apresentam resistncia, em especial os produtores de crioprotetores intracelulares como alguns biopolmeros Demorado, elevado custo e inadequado para biomolculas sensveis ao congelamento
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C) Termlise Autlise adequada para processos em alta escala Temperatura da suspenso em banho termostatizado Injeo de vapor direto Tambor rotativo Spray drier (nebulizao) til para o rompimento de: -algas, -fungos filamentosos, - leveduras - bactrias
Spray Drying is a unique method to convert a solution, suspension or emulsion into a solid powder in one single process step.
http://www.buchi.com/Spray-Drying.69.0.html
Rompimento celular
C) Termlise A temperatura e o tempo de incubao depende da clula: Kluyveromyces fragilis proporciona a liberao de 100% da inulinase intracelular quando aquecido a 50C, em pH 5,0 6,0, por 12 14 horas (Levedura) E. coli: 90C por 15 minutos rompimento total (Gram negativo) Bacilus megaterium: 90C por 15 minutos rompimento de menos da metade das clulas (Gram positivo)
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C) Termlise
Em comparao com o mtodo de ultra-som, o rompimento por termlise apresenta a vantagem de gerar fragmentos celulares com maiores dimenses e por isso mais fceis de serem removveis por filtrao ou centrifugao
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3. Rompimento Qumico
A) lcalis B) Detergentes C) Solventes D) Lise enzimtica
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A) lcalis Simples, barato e adequado para aplicaes em alta escala QUANDO A BIOMOLCULA ESTVEL A pH maior que 11!!
-Amnia -Hidrxido de sdio Rompem e inativam os patgenos ou microrganismos geneticamente modificados Desvantagem: Gerao de poluentes
Rompimento celular
A) lcalis
Exemplo: Erwinia carotovora - extrao de L-asparaginase pH 11,5 por 30 minutos e reduz para pH 6,5 com cido actico Centrifuga-se o homogeneizado
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B) Detergentes Modo de ao: dissociam protenas e lipoprotenas das paredes celulares, provocam poros e liberam molcula-alvo. Exemplo de tensoativos: Sais biliares Lauril sulfato de sdio Dodecil sulfato de sdio (SDS) Triton Desvantagens: Formao de espuma Desnaturao e/ou precipitao de protenas Eficincia do rompimento depende: pH Temperatura Pode ser aumentada por pr-tratamento base de solvente orgnico como acetona que estimula a autlise
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B) Detergentes
Exemplos: Triton 0,5% Nocardia sp para extrao de colesterol oxidase Leveduras produo de -galactosidase
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C) Solventes Desidratantes qumicos da clula Solventes mais usados: Etanol Metanol Tolueno Acetona Exemplo: invertase de leveduras (intracelular ou do espao periplasmtico) Suspenso com 60% de clulas (massa mida) a 40C Tolueno a 0,1M Adiciona-se papana (auxiliar de rompimento) Precipitao da invertase com etanol a 95% (v/v)
Rompimento celular
D) Lise enzimtica Mecanismo: hidrlise da parede celular seguido de rompimento da membrana citoplasmtica devido presso osmtica interna Recomendao: para recuperao de biomolculas sensveis temperatura, tenso de cisalhamento ou presses de trabalho geradas pelos mtodos mecnicos necessrio um estudo da eficincia de atuao enzimtica Variveis: pH Temperatura Fora inica Concentrao celular Concentrao enzimtica
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D) Lise enzimtica A enzima para a lise depende muito da composio da parede Bactrias Gram-positivo e Gram-negativo Principal estrutura = peptdeoglicano (estrutura mais rgida)
N-acetil glicosamina (NAG) N-acetil murmico (NAM)
Enzimas com ao nas ligaes covalentes envolvidas na estrutura do peptidoglicano: Ligaes Ligaes Ligaes Ligaes glicosdicas - 1,4 peptdicas entre os polissacardios entre os peptdios
Rompimento celular
D) Lise enzimtica Principais enzimas bacteriolticas: Glicosidases Acetilmuramilalanina amidases Neuroaminidases Endopeptidases Proteases (trispina, quimiotripsina, bromelina e papana)
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D) Lise enzimtica
N-acetil glicosamina (NAG) N-acetil murmico (NAM) Cadeias laterais de aminocidos Ponte cruzada de aminocidos
Lisozima (da clara do ovo) Hidrlise das ligaes glicosdicas - 1,4

+ eficiente em Gram-positivo Para eficincia em Gram-negativo, realizar pr-tratamento para desestabilizar a membrana externa: EDTA (desestabiliza LPS)
http://www.cryst.bbk.ac.uk/PPS95/course/10_interactions/NAMNAGb14_t.gif
Rompimento celular
D) Lise enzimtica
Tabela 1. Carboidratos cujos monmeros so ligados por ligaes glicosdicas - 1,4 e suas enzimas lticas
Carboidratos Peptidioglicano Celulose Lactose Xilana Quitina Celobiose
Enzimas Lisozima Celulases -galactosidase Xilanase Quitinase Celobio-hidrolase
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Rompimento celular
D) Lise enzimtica Leveduras
O sistema mais adequado para rompimento celular constitudo por glucanases, proteases e manases, que atuam em conjunto, pois elas hidrolisam componentes especficos da parede, como glucanas, protenas e mananas
Rompimento celular
D) Lise enzimtica Vantagens: Fcil controle de pH e temperatura do meio; Baixo investimento de capital; Alta especificidade para degradao da parede celular; Uso em associao com mtodos mecnicos ou no-mecnicos.
Alm disso, enzimas especficas podem ser utilizadas para liberar apenas biomolculas de interesse e, com isso, simplificar as etapas posteriores de purificao. Desvantagens: Alto custo da enzima (invivel em escala industrial) Variao da eficincia da lise enzimtica com fisiolgico do microrganismo o estado
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Preservao da biomolcula-alvo
Aps rompimento, protenas podem ser degradadas por proteases. Portanto, necessrio: 1) Diminuir a temperatura 2) Adicionar inibidores de proteases
Enzimas que possuem no Stio ativo grupamentos de sulfidrila livres podem ser inativado por: Oxidao (ex. grupamentos sulfidrilas livres no stio) por isso, deve-se adicionar agentes redutores ( -mercaptoetanol 5 a 20 mM) ou ditiotreitol (1 a 5 mM); ons metlicos adiciona-se agentes complexantes (EDTA 0,1 a 10mM) nas suspenses de rompimento. Exceo: enzimaalvo metal-dependente.
Inibidores de proteases
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Aumento da viscosidade aps o rompimento cidos nuclicos e protenas estruturais Adio de nucleases pode melhorar as caractersticas reolgicas do meio desde que no destruam a molcula-alvo A variao de pH tambm pode ser utilizada para reduzir a viscosidade do homogeneizado celular
Precipitao da molcula-alvo
Uma perturbao , qumica ou fsica, em uma soluo protica causa a formao de partculas insolveis de protena, recuperadas posteriormente por uma operao de separao slido-lquido
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Escala laboratorial
Escala industrial
Mtodo tradicional de concentrao e purificao
Precipitao: sem elevada capacidade de separao de diferentes protenas mtodo de moderado poder de purificao Precede processos de elevada resoluo: cromatografia
Mtodo agressivo Protenas precipitadas tm sua estrutura tridimensional modificada funo bioqumica depende da estrutura Portanto, s vivel quando a adequada conformao da protena recuperada aps a precipitao
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Precipitao fracionada
Os meios que contm a protena a ser purificada apresentam, em geral misturas de diferentes biomolculas e as precipitaes devem ser conduzidas em duas ou mais etapas Primeira etapa remoo de protenas indesejveis menos solveis Seguintes etapas precipitao de uma ou mais biomolcula alvo
Precipitao simples, em um nico estgio concentrao Precipitao fracionada largamente utilizada industrialmente para a purificao
Inconveniente: Pouca reprodutibilidade dos resultados obtidos em laboratrio Reduo da eficincia observada com o aumento da escala O sobrenadante de uma precipitao fracionada o material inicial para o prximo fracionamento e podem ocorrer sub ou superprecipitaes, mudanas conformacionais e perdas
Principal varivel a concentrao de precipitante. Porm, pH, temperatura, fora inica e concentrao de protenas tambm podem ser usadas como variveis
Resoluo de fracionamento melhor em concentraes menores de protena total, pois fenmenos de co-precipitao e perdas de material no precipitado so reduzidos
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Fracionamento em dois cortes ou dois estgios
Primeiro corte Adio de precipitante em concentrao suficiente para remover os contaminantes menos solveis que a protena de interesse Remove-se o precipitado formado Segundo corte Adiciona-se mais precipitante para promover a precipitao da protena desejada na nova fase precipitada e os contaminantes mais solveis que a protena de interesse permanecendo em soluo Em geral, um fracionamento com solventes orgnicos ocorre com 20 a 30% (v/v) de etanol ou acetona, e o segundo corte, acima de 50% (v/v)
Penicillium janthinellum
Fracionamento em 3 cortes Precipitao de xilanase e B-xilosidase
-xilosidase precipita em [menor] de etanol, pois sua massa molar bem maior (110 kDa) que a da xilanase (~20 kDa)
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Rendimento em atividade () = E1 E2 E1 = frao de atividade solvel no corte 1 E2 = frao de atividade solvel no corte 2
Aumento de pureza (AP) AP = E1 E2 P1 P2
P1 a frao de protena total solvel no corte 1 P2 a frao de protena total solvel no corte 2
Em solues aquosas a precipitao pode ocorrer: Com o aumento (salting-out) Com diminuio (salting-in) Concentrao de sais
Adio de solventes orgnicos Polieletrlitos Polmeros no inicos Calor Ajuste de pH
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Aumento da concentrao de sais (salting-out)

Adio de 1,5 a 3 M de sal resulta em aprisionamento das molculas de gua pela solvatao de ons; Regies hidrofbicas das protenas ficam expostas e interagem e se agregam entre si.
Com diminuio da concentrao de sais (salting-in)

Induz interaes inicas e agregao entre as molculas de protenas Globulinas precipitam sob fora inica baixa porque as foras eletrostticas repulsivas so insuficientes para estabilizar as protenas em soluo
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Sais neutros (Salting-out)
Mtodo mais comumente usado para separao de protenas Protena precipitada no desnaturada e a atividade recuperada aps dissoluo
Sais podem estabilizar as protenas contra: desnaturao, protelise ou contaminao bacteriana Sais mais adequados so aqueles que: -Apresentam elevada solubilidade
-Aumentam tenso superficial do solvente -Resultam no menor nvel de hidratao das zonas hidrofbicas -Aumentam a probabilidade de interao entre estas zonas
Sais mais empregados:

Citrato de sdio, Sulfato de sdio, Sulfato de amnia
Ampliao da escala: Difcil de ser reproduzida em larga escala
Solventes orgnicos Agregaes das protenas por interaes eletrostticas entre superfcies com cargas de sinais opostos em meio aquoso contendo solvente orgnico
Solvente orgnico Regio hidrofbica

+++
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Solventes orgnicos O Solvente deve:
-Ser totalmente miscvel com a gua (lcoois e cetonas) -No reagir de modo direto com as protenas -Ter um bom efeito precipitante
Os mais utilizados:
Metanol, etanol, acetona N-propanol, i-propanol, 2-metoxietanol, e outros lcoois, steres ou cetonas
lcoois com maiores cadeias alifticas so mais desnaturantes
Solventes orgnicos Vantagem: Reduo da densidade do meio lquido favorecendo a sedimentao do precipitado, podendo eliminar, inclusive, o uso da centrfuga Parmetro crtico na ampliao da escala: Controle da transferncia de calor (manter temperaturas baixas!) Causa perda no rendimento e na qualidade final do produto
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Precipitao por polmeros Polietileno glicol (PEG) PEG alta massa molecular, neutro e miscvel com a gua disponvel em diversos graus de polimerizao Precipitaes so conduzidas em baixas concentraes de PEG (15 a 30% m/v) no muito viscosa e muitas protenas precipitam Efeito estabilizante resfriamento sobre protenas no necessita de
[PEG] necessria para uma dada separao depende do tamanho da protena e da massa molar do polmero e inversamente proporcional [protena] Remoo do PEG ultrafiltrao, adio de etanol e separao pela formao de duas fases pela adio de sais.
Precipitao por polmeros Polieletrlitos Polmeros inicos solveis em gua baixo custo e seu uso em baixa [ ] Mais usados: Poliction polietilenoimina (PEI) carga +, pKa de 10 a 11 Precipita cidos nuclicos e protenas Polinion cido poliacrlico (PAA) Uso restrito, pois a protena e o polieletrlito devem ter cargas opostas. Deve-se operar longe do PI, assim como do pH de estabilidade da enzima. Precipitao pode ser feita a T.A. Modo de ao (teorias): 1) Agregao do polmero protena por floculao 2) Mecanismo eletrosttico pela neutralizao de cargas
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Precipitao pela temperatura
Temperaturas prximas do ambiente favorecem a manuteno da protena em soluo
Variao de temperatura causa precipitao de protenas de duas formas: 1) Diminuio da Temperatura: provoca reduo da solubilidade de
protenas e sais
2) Aumento da Temperatura: induz interaes hidrofbicas e

aumenta a interferncia das molculas de gua nas ligaes de hidrognio, resultando em desnaturao da molcula, expondo os grupos hidrofbicos que interagem com outras molculas e formam agregados insolveis
Precipitao Isoeltrica Indstria alimentcia
- Mais expressiva para protenas com baixa constante de hidratao ou com alta superfcie hidrofbica (globulina e casena) Vantagem: Baixo custo dos cidos (2 a 10 M) e minerais utilizados (fosfrico, clordrico e sulfrico) Desvantagem: - O uso de cido pode causar desnaturao irreversvel - Muitas protenas so sensveis a baixos pH e desestabilizao provocada pelo nion, que pode ser evitada com o uso de cidos com ons estabilizantes, como acetato ou sulfato
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Precipitao por afinidade Interao especfica e seletiva de uma protena e um ligante, geralmente um substrato ou um inibidor se a protena uma enzima, que pode estar ligado a uma matriz insolvel ou livre em soluo.
Aplicao da tcnica limitada, pois ligantes estveis a preos razoveis ainda no esto disponveis.
Ex: Lactato desidrogenase - purificada com copolmero de cido metacrlico com um ligante de corante de Cibracon blue em metilmetracrilato que solvel em pH neutro e insolvel em pH cido, com rendimento de 50% e aumento de pureza de 13 vezes
Precipitao por afinidade Imunoprecipitao Adio de um anticorpo ligante especfico protena que causa uma interao molecular protena-anticorpo Formao de agregados precipitao
Protena de fuso engenharia gentica Protena + cauda de poli- histidina Purificao auxiliada com quelatos metlicos para precipitao por afinidade (Zinco, cobre, nquel e cobalto) O precipitado formado dissolvido com adio de um tampo contendo EDTA que solubiliza o quelato formado com a protena
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Precipitao por ons metlicos Classificao de grupos de ons de metais polivalentes podem ser eficientes na precipitao de protenas: 1) Ligam-se fortemente aos cidos carboxlicos ou aos compostos nitrogenados, como aminas: Mn2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+, e Cd2+. 2) Ligam-se aos cidos carboxlicos, porm no se ligam ao grupo amina: Ca2+, Ba2+, Mg2+ e Pb2+. 3) Ligam-se fortemente aos grupos sulfidril: Ag+ e Hg+ protena + on metlico: reduo da solubilidade por mudanas no pI e formao de ligaes cruzadas com outras protenas por se tratarem de ons multivalentes
Ampliao da escala
Principal problema no projeto do biorreator
Precipitao
Baixa desnaturao Permitir nucleao e bom crescimento das partculas precipitadas
Bom contato entre protena e precipitante
Evitar:
Altas concentraes localizadas do precipitante Danos aos agregados por cisalhamento Formao de espuma ou bolhas de ar Co-precipitao de protenas
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Ampliao da escala
Processo contnuo Tanque agitado mecanicamente Reator de fluxo pistonado

Tempo de reteno da mistura no pode ser elevado e o rendimento varia com as condies da mistura; Incorpora-se uma zona de turbulncia ao reator para evitar problemas de precipitao no-uniforme; Vantagens na mistura e transferncia de calor
Processo descontnuo Tanque agitado mecanicamente
Processos com tempos de nucleao elevados (evitar efeitos de desnaturao e coprecipitao); Vantagem de incorporar precipitao longos perodos de envelhecimento para assegurar o aumento do agregado adequadamente
Ampliao da escala
Precipitao muitos atrativos No aumento da escala perda no rendimento perda na qualidade final do produto devido a problemas relacionados ineficincia da mistura e transferncia de calor em volumes grandes de trabalho
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Ampliao da escala
Em geral, manter constante
pH, concentrao do precipitante e temperatura do processo Potncia transmitida por unidade de volume durante a agitao e o tempo do processo No modificar a tenso de cisalhamento imposta obter agregados de precipitados de densidade e tamanhos constantes
Na precipitao por ao de solventes:
Controlar a transferncia de calor Tanque agitado mecanicamente Reatores de fluxo pistonado Oferecem vantagens no controle desses parmetros resultando em um fracionamento mais preciso e reduo de perdas por desnaturao
Extrao Lquido-Lquido em sistemas de duas fases imiscveis
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Extrao Lquido-Lquido em sistemas de duas fases imiscveis

Fase aquosa + Solvente purificao de antibiticos e cidos orgnicos h 60 anos!! Protenas altamente sensveis desnaturao, podem ser purificadas em sistemas constitudos por duas fases aquosas imiscveis (SDFA) em decorrncia de uma partio diferenciada da molcula alvo e impurezas entre as fases lquidas. Alto teor de gua (75 80% em massa) garante a manuteno das propriedades biolgicas das protenas. As propriedades superficiais das protenas so fatores
decisivos: massa molecular, carga eltrica e hidrofobicidade
Extrao Lquido-Lquido em sistemas de duas fases

Substncia P mais solvel na fase de topo em relao a de fundo. Haver um aumento do grau de pureza da molcula alvo caso os contaminantes apresentem mais solubilidade na fase de fundo
CP PC C PC PC P C PCC P
P P P P P C C CC C C C C P P
Fase de Topo (T) Fase de Fundo (F)
Sistema de duas fases aquosas imiscveis. T, fase de topo (leve), F,fase de fundo (pesada), P, produto e C, contaminantes
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Fases so formadas pela reunio de determinados polmeros, polieletrlitos, ou ainda, polmeros em combinao com solutos de baixa massa molar, em uma mesma soluo formando 4 grupos: 1) Sistemas formados por 2 polmeros no inicos: Polietilenoglicol (PEG) / Ficoll; PEG/dextrana (Dx); PEG/polivinil lcool; polipropilenoglicol (PPG)/Dx; metilcelulose/hidroxipropildextrana; Ficoll/Dx 2) Sistemas formados por um polieletrlito e um polmero noinico: Sulfato dextrana de sdio/polipropileno glicol Carboximetilcelulose de sdio/metil celulose

3) Sistemas de 2 polieletrlitos: Sulfato dextrana de sdio/carboximetildextrana de sdio carboximetildextrana de sdio/carboximetilcelulose de sdio 4) Sistemas compostos por um polmero no-inico e um composto de baixa massa molar: polipropilenoglicol (PPG)/glicose PEG/glicose PEG/sulfato de magnsio PEG/citrato de sdio Sistemas PEG/sal so muito utilizados devido rpida separao de fases, baixo custo e, principalmente, maior seletividade na separao das molculas
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Diagrama de fases
Curva de equilbrio ou binodal
Composio em massa da molcula com maior concentrao na fase superior (menor densidade) Fase superior Composio inicial
Decantao
PEG Fosfato
Fase inferior
Mistura
Ambos os componentes do sistema na fase inferior (maior densidade) esto presentes nas fases lquidas
Molcula com maior concentrao
Reta TMB = linha de amarrao (tie-line)

Sistemas cuja composio inicial encontra-se sobre uma mesma linha de amarrao possuem a mesma composio final (fase de topo e de fundo), porm a relao de volumes entre as fases diferente para cada composio, de acordo com a razo entre TM e BM
PEG Fosfato
Mistura
Quanto maior a massa molecular do polmero, menor a concentrao necessria para a formao de duas fases; Valores de pH e temperatura tambm so variveis que influenciam a curva binodal.
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Partio de protenas entre as duas fases regida pela condio de menor potencial qumico ou maior solubilidade Biomolcula apresentar maior concentrao na fase onde sua solubilidade for maior Coeficiente de partio K = Cti/Cfi
Cti = [soluto i] na fase de topo (g/L) Cfi = [soluto i] na fase de fundo (g/L)
K usado para avaliao da extenso das separaes nos sistemas de duas fases aquosas. K distintos para a molcula de interesse e para as demais indicam a ocorrncia de purificao. Hidrofobicidade, carga superficial e massa molar das protenas assim como pH e fora inica da soluo so determinantes para o valor de K

K tambm varia com o pH e com a massa molar de PEG
PEG Fosfato
Amiloglicosidase 67.000 Da PEG - 300 Da PEG - 400 Da PEG - 600 Da
K Topo K fundo
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Extraes baseadas em afinidade Ligante, substncia que se ligar molcula alvo, acoplado por ligao covalente ao polmero. Ligante pode ser substncia natural ou molcula sintetizada
Aumenta o rendimento da purificao

Extraes baseadas em afinidade Exemplos de material purificado por partio de afinidade Sistema PEG/palmitato PEG/fosfato PEG/dextrana Dextrana/hidropro pildextrana PEG/fosfato Material Purificado BSA e alactalbumina Protena A Tripsina Quimiosina Amido Ligante cidos graxos IgG humana Inibidor de tripsina pepstatina Glicoamilase
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Clarificao de suspenses microbianas
Extrao de clulas e fragmentos Slidos de pequena dimenso (fragmentos de membrana) Densidade prxima da gua (bolores) Inviabilizam centrifugao, pois Fc deve ser alto!
Reduo de nmero de operaes unitrias no processo -Fase de topo: protenas e molcula alvo -Interface ou fase fundo (rica em sal): clulas, fragmentos e cidos nuclicos e polissacardeos

No laboratrio
Funil de separao
Extrao descontnua
www.qmc.ufsc.br/organica/exp7/liquido.html
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Equipamentos na indstria
Seja qual for o tipo do equipamento, em geral, eles so operados de forma contnua, com alimentao em contracorrente das fases
Pesquisa rea de Biotecnologia operao semicontnua com uma das fases sendo mantida estacionria e outra alimentada continuamente na forma de fase dispersa.

Fases
Fase contnua (onde se tem a amostra) Fase dispersa (fase adicionada para extrao) Extratores e colunas de extrao lquido-lquido tm basicamente duas funes: 1. Estabelecer o contato entre as fases lquidas no sistema pela disperso de uma fase na outra, com o objetivo de possibilitar a transferncia de massa; 2. Separar os dois lquidos depois da extrao.
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Fases
Mistura: conjunto de gotas de uma fase dispersas no contnuo da outra Gotas de pequeno dimetro: elevada rea de contato entre fases e possibilita boa eficincia de transferncia de massa
Muito pequenas dificuldades para posterior decantao e separao das duas fases

Tempo de separao
Separao obtida rapidamente aps homogeneizao Depende: - Velocidade de coalescncia das bolhas - Tipo de agitao exercida - Fatores relacionados composio do sistema polmero/sal Mais rpido polmero/polmero mais lento (Viscosidade)
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Equipamentos na indstria 1. Equipamentos por estgios
Compostos por subunidades discretas (estgios) onde as fases so colocadas em contato, misturadas, separadas e enviadas para subunidades adjacentes. O equilbrio entre as fases alcanado em cada estgio
2. Equipamentos de contato diferencial

Fornecem rea de contato para a transferncia de massa ao longo de praticamente todo o comprimento do equipamento. O equilbrio no estabelecido em nenhum ponto do extrator, sendo as fases separadas somente na extremidade deste

1. Equipamentos por estgio Misturador-decantador
http://labvirtual.eq.uc.pt/siteJoomla/index.php?Itemid=148&id=63&option=com_content&task=view
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1. Equipamentos por estgio Extrao em operao em corrente cruzada Srie de misturadores-decantadores

1. Equipamentos por estgio Extrao em operao em corrente cruzada Srie de misturadores e decantadores
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1. Equipamentos por estgio Coluna de pratos perfurados Fase dispersa = leve Forma-se barragem abaixo do prato, onde fase leve se acumula Passagem atravs dos pratos provoca a disperso em nmero elevado de gotas e gera rea de transferncia de massa do estgio superior Fase pesada, escoa descendentemente e entre um estgio e outro passa pela regio externa das barragens

2. Equipamento de contato diferencial Extrao sem regies de separao de fases ao longo da coluna Coluna spray Fase dispersa alimentada por distribuidor para que haja melhor disperso
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2. Equipamento de contato diferencial
Coluna spray Vantagem: Construo muito simples
Desvantagem: Baixa eficincia de transferncia de massa (inexistncia de acessrios para melhorar disperso ou nveis altos de mistura axial)

2. Equipamento de contato diferencial Coluna de Recheio ou Empacotadas Recheio tipo aleatrio Tamanho < 1/8 do dimetro da torre Ex: anel de Raschig e outros cilindros Material: plstico, cermico, metlico Recheio tipo estruturado Unidades maiores
Reduz o efeito da mistura axial, mas taxas de transferncia de massa no elevada
constitudas de placas finas ou folhas de material plstico ou metlico recurvado, densamente empacotado, geometria regular
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2. Equipamento de contato diferencial Coluna de discos rotativos

Equipamento centrfugo
Escoamento contra-corrente Extrator Podbielniak
http://www.chemicalonline.com/article.mvc/Podbielniak-Contactor-A-Unique-Liquid-Liquid-0001
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Equipamento centrfugo Extrator Podbielniak Pod
Tempo de residncia baixo Separa sistemas de compostos que apresentam diferenas de densidade muito pequenas
Pode-se combinar um misturador externo e uma centrfuga

Equipamento centrfugo
Centrfuga de discos
Decantador
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Equipamento de contato diferencial Extrao contra-corrente

Vantagens da extrao lquido-lquido em sistemas de duas fases
1. Possibilidade de operao contnua em larga escala temperatura ambiente; 2. Manuteno das protenas em soluo em meio a polmeros ou sais que as protegem da desnaturao; 3. Possibilidade de eliminao de algumas etapas do processo de purificao para molculas intracelulares, devido separao de clulas e seus fragmentos em uma determinada fase (geralmente fundo) simultnea ao fracionamento de protenas e outras molculas.
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Esquema completo
Pessoa Jr, A & Kilikian BV. Purificao de Produtos Biotecnolgicos. 1ed., Ed Manole, Barueri, SP, 2005. Captulos 2, 5 e 6
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Processo downstream II: rompimento celular, proteção e precipitação da biomolécula alvo

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Processo downstream II: rompimento celular, proteção e precipitação da biomolécula alvo

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Separao das clulas do meio de fermentao (clarificao)

Purificao inicial ou concentrao

Purificao especfica do metablito

Critrios para a seleo da tcnica de rompimento celular:

Parede celular (Murena/peptdeoglicano)

Membrana externa Murena Espao periplasmtico Membrana citoplasmtica

Lipdios Protenas Manana Glicano

Glicoprotena Quitina/microfibrila Membrana citoplasmtica

Mtodos divididos em 4 classes:

E. coli em meio sinttico E. coli em meio complexo

Condies mais brandas de rompimento

Presso: 0~30,000 psi/207 mpa/2,070 bar Volume: 9 l 60L/h

Moinho de bolas o equipamento mais adequado

Sada Eixo rotativo

Discos Rotativos Separador

Esferas de vidro de 0,5 mm Microrganismo Saccharomyces cerevisiae

Onda de choques Impacto

A) Choque osmtico B) Congelamento/descongelamento C) Termlise D) Mtodos qumicos Lise enzimtica

Indicado para bactrias Gram-negativo com parede celular mais sensvel

Lisozima (da clara do ovo) Hidrlise das ligaes glicosdicas - 1,4

Carboidratos Peptidioglicano Celulose Lactose Xilana Quitina Celobiose

Enzimas Lisozima Celulases -galactosidase Xilanase Quitinase Celobio-hidrolase

Mtodo tradicional de concentrao e purificao

Aumento de pureza (AP) AP = E1 E2 P1 P2

Adio de solventes orgnicos Polieletrlitos Polmeros no inicos Calor Ajuste de pH

Aumento da concentrao de sais (salting-out)

Com diminuio da concentrao de sais (salting-in)

Sais mais empregados:

Ampliao da escala: Difcil de ser reproduzida em larga escala

Solvente orgnico Regio hidrofbica

lcoois com maiores cadeias alifticas so mais desnaturantes

2) Aumento da Temperatura: induz interaes hidrofbicas e

Bom contato entre protena e precipitante

Processo contnuo Tanque agitado mecanicamente Reator de fluxo pistonado

Processo descontnuo Tanque agitado mecanicamente

Na precipitao por ao de solventes:

Extrao Lquido-Lquido em sistemas de duas fases imiscveis

Extrao Lquido-Lquido em sistemas de duas fases imiscveis

decisivos: massa molecular, carga eltrica e hidrofobicidade

Extrao Lquido-Lquido em sistemas de duas fases

Fase de Topo (T) Fase de Fundo (F)

Extrao Lquido-Lquido em sistemas de duas fases

Extrao Lquido-Lquido em sistemas de duas fases

Extrao Lquido-Lquido em sistemas de duas fases

Molcula com maior concentrao

Reta TMB = linha de amarrao (tie-line)

Extrao Lquido-Lquido em sistemas de duas fases

Extrao Lquido-Lquido em sistemas de duas fases

Extrao Lquido-Lquido em sistemas de duas fases

Amiloglicosidase 67.000 Da PEG - 300 Da PEG - 400 Da PEG - 600 Da

Extrao Lquido-Lquido em sistemas de duas fases

Aumenta o rendimento da purificao

Extrao Lquido-Lquido em sistemas de duas fases

Extrao Lquido-Lquido em sistemas de duas fases

Extrao Lquido-Lquido em sistemas de duas fases

Extrao Lquido-Lquido em sistemas de duas fases

Extrao Lquido-Lquido em sistemas de duas fases

Extrao Lquido-Lquido em sistemas de duas fases

Extrao Lquido-Lquido em sistemas de duas fases

Extrao Lquido-Lquido em sistemas de duas fases

2. Equipamentos de contato diferencial

Extrao Lquido-Lquido em sistemas de duas fases