Mutagnesis

DEFINICIN
Alteracin de la secuencia de ADN de un organismo. La forma sin modificaciones del ADN (salvaje o wild type, WT) se convierte en otra, portadora de la modificacin, denominada mutante. Las mutaciones tienen lugar en todo el genoma, nuclear o mitocondrial, en secuencias codificantes o no y en distintos tipos de clulas.

CLASIFICACION
Segn tipo de clula
Germinal (heredable) Somtica (no heredable)

Segn magnitud
Grandes mutaciones (anomalas cromosmicas) Mutaciones medianas Mutaciones pequeas o puntuales

Segn mecanismo
Mutaciones endgenas (espontneas)
Errores en la replicacin; desaminacin oxidativa de bases; inestabilidad qumica N-glicosdica; mutgenos endgenos.

Mutaciones exgenas (inducidas)

Agentes qumicos: accin directa; alquilantes e intercalantes bifuncionales Agentes fsicos: radiaciones UV y radiaciones ionizantes Agentes biolgicos: virus y transposones

TIPOS DE MUTACIONES
PUNTUALES SILENCIOSAS

Generalmente implican un slo nucletido Generan cambios que podran afectar la estructura y funcin de las protenas.

A pesar del cambio en la secuencia de ADN no se altera la secuencia de la protena.

NO SILENCIOSAS La alteracin de la secuencia de nucletidos afecta a la protena, porque codifica uno o varios AA diferentes respecto a la secuencia original Pueden ser benficas o perjudiciales (ms frecuentes)

INGENIERIA DE PROTEINAS
No es difcil obtener mutantes para determinado proceso, lo difcil es encontrar qu mutacin produce el defecto de una determinada protena. Se utiliza para dos propsitos:
Diseccin de la estructura y actividad de protenas existentes mediante alteraciones sistemticas de sus estructuras y la examinacin de los cambios en sus propiedades; Produccin de nuevas protenas para uso en medicina e industria.

Propiedades de enzimas que pueden se modificadas

Propiedades cinticas (KM y kcat) Termoestabilidad y temperatura optima Estabilidad y actividad en solventes no acuosos Especificidad de sustrato Requerimiento de cofactores pH optimo Resistencia a proteasas Regulacin alostrica Tamao y estructura de sub-unidades

Mtodos para llevar a cabo la ingeniera de protenas

Genticos (los mas utilizados):
Sntesis total de genes nuevos Mutagnesis al azar Mutagnesis sitio-dirigida (optimo: combinacin de los dos ltimos)

Qumicos:
Modificacin qumica de protenas Sntesis total de pptidos (Merrifield) Semi-sintesis

MUTAGENESIS DE SITIO DIRIGIDA

Diseo mas racional Modificaciones en la secuencia nucleotdica (reemplazo de una base por otra) (el mas comn) Deleciones Inserciones
Ventajas: se puede planificar el lugar y tipo de mutacin que se desea realizar.

Desventajas: donde realizar la mutacin? Se requiere conocimiento PREVIO de propiedades de la protena (estructura; mecanismo de accin). Purificacin de la enzima mutada y determinacin de sus propiedades.

MUTAGENESIS DE SITIO DIRIGIDA

Se producen modificaciones en el ADN en un sitio definido, por lo cual la secuencia wild type debe ser conocida. Las tcnicas ms utilizadas son:
Superposicin y extensin Extensin por megaprimer Intercambio de segmentos Reaccin en cadena combinada (CCR) PCR inversa QuickChange (Stratagene)

Superposicin y extensin

Extensin por mega primer

Intercambio de segmentos

PCR inversa

QuickChange

QuickChange

PROCESO para MUTAGENESIS DE SITIO DIRIGIDO

1. 2.
3. 4. 5. 6. 7.

Se debe disponer del gen Se inserta en un plsmido. Estos se replican en la bacteria en forma independiente del cromosoma principal Los plsmidos pueden ser purificados fcilmente con tcnicas bioqumicas Se separan las dos hebras del ADN y se asla la que interesa Se le agrega un oligonucletido complementario al Salvaje que tiene la modificacin que interesa Con la PCR se completa la sntesis de doble hebra Se introduce el plsmido mutado a la bacteria para muchas copias

MUTAGENESIS AL AZAR
Se producen modificaciones en el ADN en un sitio indefinido, por lo cual no es necesario conocer la secuencia a mutar Las tcnicas ms utilizadas son:
Mutgenos qumicos (nitrosoguanidina) PCR propensa a error Utilizacin de oligonucletidos degenerados Mutagnesis exploratoria por pentapptido Mezcla de ADN Por radiaciones (ultravioleta, rayos X) Evolucin dirigida (errores introducidos por Taq polimerasa)

 Ventajas: Permite seleccionar por aquella propiedad que se desea mejorar (por ej.: estabilidad trmica). No requiere conocimiento previo de la estructura y mecanismo Las mutantes se pueden mejorar en Mutagnesis sucesivas

Desventajas: Requiere el anlisis de muchos clones. Se necesita un mtodo de seleccin sensible y eficiente.

MUTAGENOS QUIMICOS
Se hace reaccionar un fragmento de ADNdc con un mutgenos qumico (cido nitroso o hidroxilamina) Se clona la mezcla de fragmentos mutados en un vector recombinante que contenga el resto del gen WT Los vectores que poseen la mutacin generalmente deben ser identificados por secuenciacin La frecuencia de recuperacin de mutantes por este mtodo es relativamente baja.

PCR propensa a errores

En presencia de Mn2+ o concentraciones anormales de Mg2+ la enzima Taq DNA Pol se puede hacer propensa al error Luego de varias rondas las mutaciones crecen en el ADN amplificado

Utilizacin de oligonucletidos degenerados

Es til cuando los codones a ser alterados se hallan en una secuencia corta de ADN Las secuencias mutantes no pueden distinguirse de las WT por los mtodos habituales de screening, slo por secuenciacin. La introduccin de oligonucletidos en sitios de restriccin facilitara la bsqueda.

Mutagnesis exploratoria por pentapptido

Se insertan nucletidos en posiciones al azar en el ADN blanco. Se introduce un cassette, del cual la mayora se remueve por digestin con endonucleasas de restriccin. La religacin del ADN molde resulta en la insercin de nucletidos que incluyen sitios de restriccin. Es til para el estudio estructural y funcional de protenas. Los segmentos superficiales de una protena toleran inserciones de pocos AAs conservando su funcionalidad, no as los segmentos internos.

Mezcla de ADN
Fragmentacin aleatoria

EJEMPLO DE APLICACION

BIODEGRADACION DE LA LIGNOCELULOSA

Dnde se encuentra?

Madera (blanda o dura) Plantas anuales (cultivos: gramneas, etc.) Desechos agrcolas (paja, corontas de choclo, etc.)

POR QUE ES VALIOSA LA LIGNOCELULOSA?

Material renovable Producido por la fotosntesis en las plantas verdes

DE QUE ESTA COMPUESTA LA LIGNOCELULOSA?

Dos polisacridos:
celulosa (polmero de glucosa) hemicelulosas (polmeros de manosa o xilosa)

Un polifenol:
la lignina

QUE ES LA BIODEGRADACION (O SACARIFICACION) DE LA LIGNOCELULOSA?

Estas enzimas son producidas por numerosos bacterias y hongos. Microorganismos del suelo (aerobios) y del rumen de los rumiantes (anaerobios) En su mayor parte son secretadas al medio (los componentes de la lignocelulosa son muy poco solubles o insolubles)

QUE NOS INTERESA A NOSOTROS?

Biodegradacin del xilano Enzimas participantes: purificacin, caracterizacin Qu funcin desempean? Uso de un hongo como modelo

Cultivo del hongo

Purificacin de enzimas

Aplicacin de la Mutagnesis de sitio dirigido por delecion

Alteracin de la especificidad de sustrato de la acetil xilano esterasa II (AXE II) de Penicillium purpurogenum. La enzima hidroliza grupos acetilo unidos a la cadena principal del xilano. ANTECEDENTES
La enzima muestra una gran especificidad por esteres de cidos grasos de cadena corta (acetato). Se conoce la secuencia y estructura tridimensional de la enzima. Inters biotecnolgico por enzimas que sinteticen esteres de cidos grasos de cadena larga. La cutinasa, una enzima que hidroliza esteres de cadena larga, tiene una estructura tridimensional similar.

Como modificar la estructura de la AXE II para que utilice esteres de cidos grasos de cadena larga?