Tema 10 Mecanismo de accin de las enzimas Despus de anlisis cinticos y estructurales ms o menos combinados, llegamos a conclusiones sobre la identidad

y secuencia de los complejos intermedios y las velocidades de interconversin. Con todo esto, nos queda proponer un mecanismo de reaccin en trminos cinticos y qumicos. Factores de los que depende el poder cataltico Antes de que podamos describir el mecanismo, necesitamos saber cuales son los factores que intervienen y de que manera. Efecto entrpico: Lleva a la formacin del complejo. Las fuerzas que intervienen son no covalentes. Para todas las enzimas. Estabilizacin del estado de transicin: Este salto a un nivel de energa superior, supone un coste energtico, el cual disminuye gracias a la estabilizacin que ejercen la mayora de las enzimas. Posteriormente se producir la catlisis, que podr ser cido"bsica y/o electrosttica. Varios estados de transicin: Algunas enzimas continan con vas de nivel energtico inferior a travs de varias etapas, mediante catlisis covalente, que puede ser electrfila y/o nuclefila. Lo ms importante es, sin duda, es la capacidad de las enzimas para disminuir la inestabilidad del estado de transicin, lo que se traduce en una menor energa de activacin (G"), como se observa en el grfico de las hojas. La alta energa de este estado depende de la generacin de cargas muy inestables (normalmente por estar muy cercanas), adems de que en muchos casos, la formacin del complejo implica la unin de varios componentes, algo no muy favorable termodinmicamente al disminuir la entropa. Teora del estado de transicin Hay que saber que toda reaccin debe pasar por un estado estacionario, por muy sencilla que sea. Depende de entidades fsicas, sustancias reaccionantes (con un estado basal o inicial) y otras especies ms inestables (que formarn parte de estados de transicin o activados). La grfica de las hojas nos muestra una de las estrategias de la vida, disminuir G" hacindolo pasar por varios complejos, en lugar de por uno con una gran G". Podemos entonces relacionar la eficiencia de una enzima frente a dos sustratos, ya que cuanto mejor est configurada para un determinado sustrato, mejor estabilizar su estado de transicin, menor ser G" y mayor ser la velocidad. Por el contrario, la velocidad ser mayor frente a un sustrato para el cual el C.A. no est del todo configurado, por lo que no podr estabilizar bien el estado de transicin, aumentando G", disminuyendo consiguientemente la velocidad. En definitiva si S1" es menos inestable que S2" (debido a su diferente estructura), querr decir que la enzima puede estabilizar mejor S1, o lo que es lo mismo, que est mejor diseada para S1, tiene mayor eficiencia para este sustrato. Estas diferencias nos permitirn dilucidar un mecanismo de reaccin, pero para ello necesitamos antes definir la velocidad de paso por los estados de transicin. Para ello, definimos la velocidad de desaparicin de S":

. La constante de proporcionalidad es (nu), que se define como constante de ruptura o transformacin de S" en P en el entorno qumico y como la frecuencia vibracional del enlace que se va a romper en el entorno fsico. Como frecuencia se relaciona con la constante de Planck y con la energa trmica, lo que nos define

, siendo K la constante de Boltzmann, T la temperatura (K) y h la constante de Planck. Tenemos, por tanto, la ecuacin de velocidad, pero Cmo definimos [S"]?. Lo haremos mediante la teora del estado de transicin, teniendo en cuenta que G" es quien controla el equilibrio. A la conclusin a la que se llega es la siguiente

Lo que nos relaciona de forma clara, la constante de velocidad de formacin del complejo con la energa de activacin, adems de con la temperatura. De este modo, k1 aumenta si: !T ! G" ! [especies reaccionantes] Con todo esto, ya podemos concluir que la catlisis se basa en la estabilizacin del estado de transicin respecto de las sustancias reaccionantes, o lo que es lo mismo, en la disminucin de G". Una vez sabiendo que elementos actan en la catlisis, los definiremos uno a uno. El efecto de la Temperatura Sacando logaritmos en la ecuacin anterior, llegamos a una recta:

La representacin de la misma (en las hojas), nos muestra como aumenta k1 al aumentar la temperatura. Pero esta representacin no es del todo real, ya que en una reaccin enzimtica hay que tener en cuenta que una enzima es un ente biolgico, con lo que a altas temperaturas pierde su efectividad. Esto se observa si tenemos en cuenta Kcat, que llevara consigo la Ea global ya que engloba todas las constantes y, por tanto, veramos el efecto producido por la temperatura sobre todas las etapas (de transformacin), o slo sobre k1. La grfica en este caso sera ln Vmax Vs 1/T. En ella se observa claramente la desnaturalizacin que sufre la encima al pasar del lmite, justo despus del punto de mayor velocidad, a la que se denominar temperatura ptima. Hay que saber que esa temperatura hay que hallarla en condiciones de saturacin, para asegurarnos que la velocidad es realmente Vmax. Definimos entonces Q10 como el coeficiente de temperatura. ste se halla midiendo lo que asciende la velocidad al aumentar la temperatura en 10 . En las reacciones enzimticas es 2. Factores responsables del poder cataltico de las enzimas Formacin del complejo no covalente: ES

Se basa en la interaccin no covalente (puentes de hidrgeno, fuerzas electrostticas, interacciones hidrofbicas, etc.) entre tomos del sustrato(s) y aminocidos del centro activo, con el fin de bajar el nivel energtico del complejo ES. Eso se empieza a entrever en un ejemplo muy sencillo expuesto en las hojas,. En l se supone la formacin de un puente de hidrgeno entre la enzima y el sustrato, el cual, en el estado libre forman respectivos puentes con molculas de agua. El proceso est controlado por la ecuacin , ms exactamente por el trmino . Esto es as porque la entropa del medio aumenta notablemente debido a la reduccin de la organizacin que debe presentar la caja de solvatacin, lo que determina irremediablemente un descenso en G, con lo que el proceso es espontaneo. Se observa como no hay una ganancia en el nmero de puentes de hidrgeno, lo que no quiere decir que la energa asociada a los dos primeros sea la misma que en los dos segundos, pero aunque halla una diferencia a favor de los primeros, (antes de la formacin del complejo), esta es sin duda mucho menor que la energa proveniente de la ganancia en entropa del medio. Resumiendo: ! = H() " TGmedio!! Espontaneo. En las hojas pone que H=0 por la no formacin de nuevos puentes de hidrgeno. Si no me equivoco, esto no es exactamente as, ya que como se ha dicho antes todo depender de la energa asociada a los mismos, con lo que podr ser 0, mayor o menor, pero en todo caso se ver sobrepasada por el incremento en la entropa del medio. Se puede concluir, por tanto, que el proceso de formacin del complejo siempre ser favorable para todos los sistemas. Energa de unin Se define como Go' asociada a la formacin del complejo ES, igual a la energa libre (negativa) asociada a esa formacin, siempre en condiciones estndar. Esta energa libre de formacin, vendr determinada por las constantes k1 y k"1, y se relaciona directamente con la constante de equilibrio (todo en las hojas) e inversamente con la constante de disociacin Ks (k"1/k1). Si decamos que Km y Ks tenan unos valores del orden de 10"X (x= 2, 6, 7) , implica, o mejor dicho corrobora que G en espontanea, ya que la potencia negativa se corresponde con el mayor valor de k1 sobre k"1 (k1>k"1 formacin del complejo favorable). Con esto seguimos demostrando que la formacin del complejo est termodinmicamente favorecida. Consideramos GS como la que engloba a todas las individuales de las diferentes interacciones no covalentes entre la enzima y el sustrato. Por esto, la energa de unin definida es vlida para todas los supuestos, ya que, aunque en un principio planteamos la formacin de un solo puente de hidrgeno, la G que utilizamos puede ser vlida para otros modelos si la consideramos GS. Efecto entrpico: utilizacin de la energa de unin en la catlisis Se trata de ver como afecta esa energa de unin (favorable) a la catlisis. Mediante el modelo ms sencillo, el de M&M, en el cual definimos los pasos reversibles como GS y el de transformacin lo dejamos regido por Kcat, preguntndonos que energas intervendrn en ese proceso y que estar controlndolas. Seguimos recordando que normalmente la transformacin se suele producir en varias etapas, pero, por conveniencia hacemos que sea un solo paso de transformacin. De este modo podemos definir V como Kcat [ES], teniendo muy en cuenta que esto slo es cierto en el caso de un solo paso de transformacin, ya que si no, la constante que multiplicara a [ES] sera la del ltimo paso. Si utilizamos lo que obtuvimos para el estado de transicin, que nos dice que la energa de la reaccin es proporcional a la concentracin de especies de sustancias reaccionantes que han alcanzado el estado de transicin. Al contrario de lo que suceda en el 3

apartado anterior, donde tratbamos de averiguar la energa de la unin de la enzima y el sustrato, ahora ya tenemos el sustrato en el centro activo, y lo que tenemos que hacer es encontrar la expresin de la energa de transformacin, o lo que es lo mismo como superar la barrera energtica a la que de nuevo se enfrenta la enzima, pasar de ES a ES". Teniendo en cuenta, por tanto, que el sustrato se encuentra en el centro activo y aplicando la teora del estado de transicin llegamos a la siguiente expresin:

Esta nos indica que Kcat siempre se relaciona con G" independientemente de las constantes microscpicas que englobe e independientemente del nmero de etapas. La formacin del estado de transicin implica necesariamente la prdida de entropa a varios niveles, rotacional, (es rgido a todos los niveles); traslacional, (sobre todo en reacciones catalizadas); interna, (rotacional, vibracional). En la formacin del complejo ES, disminuimos la rotacional y la traslacional (el sustrato queda fijado al C.A.) y al pasar al ES" disminuimos la que nos quedaba, la entropa interna. Se ve ahora claro como las enzimas lo que hacen es dividir los cargos energticos en dos para as poder controlarlos mejor, y se aprovechan de la energa favorable debida al aumento de la entropa del medio. El efecto entrpico se define, por tanto, como las prdidas en entropa rotacional y traslacional se producen en un proceso termodinmicamente favorable (formacin del complejo ES). De este modo, el coste energtico para llegar al estado de transicin, queda reducido a la disminucin de entropa interna (como coste) ya que el resto se ha solventado mediante la ganancia de entropa del medio. Por esto, y como se ve en las imgenes, la GT", compuesta por una GS" y G", queda reducida debido al signo negativo de GS". Esta es la diferencia sustancial entre los procesos catalizados y los no catalizados, estos ltimos deben afrontar el coste energtico para pasar al estado de transicin de un golpe (siempre hacia arriba), mientras que los procesos catalizados, hacen primero una bajada de energa mediante un proceso espontaneo y despus afrontan la subida, que desde abajo es del mismo coste que sin enzima, pero contabilizndo la energa desde el sustrato hasta el estado de transicin, el escaln es mucho ms pequeo que sin enzima. Olvidndonos de los pasos intermedios, tenemos una energa de activacin, la energa de transicin global (GT"), y analizando la reactividad (unin + transformacin), definida por la constante de especificidad mediante la teora del estado de transicin, tenemos que sta se relaciona con la energa de transicin global, de forma equivalente a como Kcat se relacionaba con la energa activacin; y Ks con la energa de unin (G"). De esta forma, cada una de las constantes a la que llamamos macromtricas se relaciona con las distintas barreras energticas que aparecen durante la catlisis. Maximizacin de la energa de unin Conseguiremos un mejor efecto entrpico mediante la maximizacin del nmero de interacciones estabilizantes entre la enzima y el estado de transicin. Ser, por tanto, la mejor forma de rebasar la energa de activacin, consiguiendo el mayor nmero de interacciones no covalentes entre la enzima y el estado de transicin. Se trata entonces de conseguir que cada grupo potencial del sustrato tenga su equivalente en la enzima, que sean lo ms equivalentes posible. Fischer, intuy algo parecido, pero se quedo en las puertas, afirmando que exista complementareidad enzima"sustrato, algo no del todo cierto, y que ms tarde consiguieron Haldane y Pauling, diciendo que el mayor nmero de interacciones se consegua en el estado de transicin, enunciando la complementareidad enzima"estado de transicin. Con esta teora, se observa como la energa de unin (GS" negativa) es la suma 4

de la energa, tambin negativa, debida a las interacciones entre la enzima con el sustrato (GS) y la que se produce (GR< 0) cuando el sustrato alcanza el estado de transicin. Esto contribuye, por tanto, a la maximizacin de la energa de unin, lo que determina una bajada en la energa de activacin, determinante en los procesos biolgicos. Esto repercutir a su vez en Kcat y la constante de especificidad, de modo que cuanto ms baje la energa de activacin ms ascender Kcat (el resultado un aumento en la velocidad). Una bajada en la energa global GT", har que aumente la constante de especificidad. Evidencias experimentales Trataremos de evidenciar dos puntos: La energa de unin se utiliza para disminuir la energa de activacin La mxima complementareidad se da en el complejo ES" (complementareidad E"estado de transicin). Esto se consigue mediante experimentos con anlogos del estado de transicin, de manera que se observa como las Ks de estos anlogos son menores que los de los sustratos naturales: Como se observa de esta relacin, una Ks menor para los anlogos del estado de transicin, implica una menor tendencia a la salida del C.A. Tambin se utilizan diferencias en potenciales sitios de interaccin no covalente en sustratos alternativos y anlisis del comportamiento cintico (Km; Kcat) de enzimas (normalmente proteasas) al ponerlas en contacto con distintos sustratos alternativos. En este tipo de anlisis, en los que consideramos Km = Ks, se observa un aumento de la constante de especificidad, debidos a cambios superiores en Kcat que en Km. De esta forma, un descenso en la energa de activacin para S2 implicar un aumento de Kcat, (ver la frmula que las relaciona), que unido a una ligera subida en valor absoluto de la energa de unin, hace que aumente la constante de especificidad. Por el contrario, para S1, la energa de activacin es mayor y, por tanto, Kcat disminuye, que unido a un leve aumento de Km (seguimos recordando que tenemos la condicin Km = Ks) har que disminuya la constante de especificidad. Esto se resume diciendo que la enzima puede establecer ms interacciones con S2 que con S1 (GS1" < GS2") y con S"2 que con S"1 (G1" > G2"). Otra forma de comprobarlo es mutando los potenciales sitios de unin con el sustrato en el C.A. y realizar los pertinentes anlisis cinticos. Lo que se observa en las enzimas mutadas es una bajada muy importante en Kcat, lo que implica un aumento en la energa de activacin debida a la prdida de interacciones estabilizantes del intermediario de reaccin. Tambin aumenta la Km, aunque de forma ms leve, lo que significa que el efecto entrpico es ms dbil. Esta menor variacin en Km que en Kcat parece confirmarnos que si es ms importante (como siempre todo es relativo) la estabilizacin del intermediario de reaccin (interacciones enzima"estado de transicin) que la unin de la enzima al sustratro, donde casi siempre existir alguna interaccin ms o menos especfica que derive en un efecto entrpico. Ya hemos comentado la importancia de los coenzimas, sin ir ms lejos, la tirosil t"RNA sintetasa, es capaz de catalizar la unin de la tirosina a AMP en ausencia del t"RNA, que queda unido a la enzima en forma de complejo ES". Modelos de interaccin enzimtica Modelo de distorsin de enlaces: Enunciado por Haldane y Pauling, afirma que la enzima es rgida, y distorsiona al sustrato al estar este en el C.A. para llevarlo a ES". Se trata de complementareidad enzima"intermedio de reaccin. Modelo de ajuste inducido: Enunciado por Koshland, afirma que la enzima sufre cambios 5

conformacionales. Se trata de complementareidad enzima"intermedio de reaccin. En la actualidad se asumen los dos modelos. Cuando se forma el complejo ES y ES"cambiar de conformacin el que est ms favorecido energticamente o los dos. La ecuacin de la recta se encuentra en las hojas. En relacin con un ejercicio de la hoja 1. Sinceramente no estoy muy seguro de ello, pero as debe ser, ya que as me lo explic ella despus de ponerme como mal un desarrollo a partir de esa frmula en el examen, por haberla generalizado. ENZIMOLOGA 1 Mecanismo de accin de las enzimas GT" energa global G" energa de activacin GS" energa de unin E+S E"S ES" Ks Kcat Kcat/ Km G G Kcat/ Km Kcat Ks

ES1" E"S E + S1 GS" energa de unin G" energa de activacin GT" energa global Kcat/ Km Kcat Ks ES2" E"S E + S2 GS" energa de unin G" energa de activacin GT" energa global