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Dossier Le temps biologique

Les outils gntiques dvelopps chez Drosophila melanogaster en ont fait un modle phare de la chronobiologie.

Les insectes, horloges modles


M. KAGE/BSIP

Les premiers gnes dhorloge ont t dcouverts chez la mouche drosophile. Depuis, les mthodes gntiques utilises chez cet insecte ont permis dtablir un modle molculaire en grande partie conserv chez les mammifres.
Franois Rouyer Directeur de recherche INSERM Institut de neurobiologie Alfred Fessard CNRS, Gif-sur-Yvette francois.rouyer@inaf.cnrs-gif.fr

Franois Rouyer

(1) Pittendrigh CS (1993)


Annu Rev Physiol 55, 16-54 (2) Dunlap JC et al. (2004) Chronobiology : Biological Timekeeping, Sinauer Associates Inc., US (3) Klarsfeld A (2009) Les Horloges Du Vivant, Odile Jacob, Paris (4) Konopka RJ (1971) Proc Natl Acad Sci USA 68, 2112-6 (5) Hardin PE et al. (1990) Nature 343, 536-40 (6) Hogenesch JB (2011) Nat Rev Genet 12, 407-16

ans les annes 1960, lide dun contrle des rythmes circadiens par une horloge interne a t dfinitivement accepte, en particulier grce aux travaux de Colin Pittendrigh, aux tats-Unis, sur lclosion des mouches drosophiles (1). Les caractristiques majeures des horloges circadiennes taient dfinies : priode denviron 24 heures persistant en conditions environnementales constantes, priode constante quelle que soit la temprature extrieure, synchronisation de la phase de lhorloge sur les cycles jour/nuit via la perception des changements de lumire et de temprature associs (2,3). Restaient mettre en vidence les composants cellulaires et molculaires impliqus. Les approches gntiques de lhorloge circadienne ont commenc dans les annes 1970, avec lisolement de mutants chez un champignon, Neurospora crassa, et chez la drosophile
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Drosophila melanogaster. Les outils gntiques dvelopps depuis le dbut du XXe sicle chez cet insecte en ont fait un modle phare de la chronobiologie molculaire et cellulaire.

Chronobiologie de la drosophile
Le dveloppement des drosophiles passe par diffrents stades larvaires suivis dune mtamorphose, et les jeunes adultes mergent une dizaine de jours aprs la ponte des ufs. Les mergences ont lieu au dbut de la journe en conditions jour/nuit artificielles (12h de lumire/12h obscurit), et ce rythme quotidien persiste en obscurit constante, ce qui en dmontre le caractre circadien. Les premiers mutants isols prsentaient un rythme dclosion priode courte (toutes les 20 heures environ), priode longue

(toutes les 28 heures environ) ou une absence complte de rythme (4). Leurs mutations affectaient galement leur comportement veille/sommeil. Lorsque des mouches adultes sauvages sont places en obscurit constante, elles prsentent une alternance activit/repos caractrise par un pic dactivit qui revient toutes les 24 heures. Or les mutations qui altrent le rythme dclosion modifient de la mme faon ce rythme activit/repos, indiquant quun mme oscillateur circadien contrle les deux rythmes. Ces mutations affectent le gne period (per). Ltude de la rgulation de lexpression de ce dernier a mis en vidence un mcanisme fondamental retrouv dans la plupart des oscillateurs circadiens, chez les mammiferes notamment : le contrle ngatif exerc par la protine PER sur la transcription de son propre gne (5,6). Aprs quarante annes de recherches, une quinzaine de gnes dont laltra-

tion modifie le fonctionnement de lhorloge ont t isols chez la drosophile. Le modle actuel de loscillateur circadien repose sur une double boucle de rgulation transcriptionnelle, dont le droulement temporel dpend de la rgulation fine de la dure de vie et de lactivit des protines quelles mettent en jeu (7,8) (figure ci-contre). Un complexe, constitu des facteurs de transcription CLOCK (CLK) et CYCLE (CYC), active lexpression des gnes per et timeless (tim) en fin de journe. Les protines PER et TIM saccumulent dans le cytoplasme de la cellule et forment des complexes au cours de la nuit, puis elles sont transfres dans le noyau, o a lieu la transcription. En fin de nuit, PER et TIM sassocient avec le complexe CLK/CYC pour en inhiber la fonction transcriptionnelle, donc lactivation des gnes per et tim. Le matin, les protines PER et TIM sont dgrades, ce qui permet CLK et CYC de dmarrer un nouveau cycle de transcription. Loscillation de lexpression des gnes per et tim nest possible que si les tapes dactivation et de rpression transcriptionnelles sont temporellement spares, en loccurrence activation en fin de journe et rpression en fin de nuit. Cette sparation est gnre par un retard de laccumulation nocturne des protines PER et TIM, qui napparaissent que plusieurs heures aprs le pic de transcrit. La gntique a permis disoler des composants impliqus dans ce retard. Les protines PER et TIM sont soumises des phosphorylations qui les rendent instables. Ces phosphorylations sont contrles par un quilibre entre kinases, qui ajoutent les phosphates, et phosphatases, qui les enlvent. Les protines phosphoryles sont reconnues par dautres enzymes qui ajoutent des chanes dubiquitine, une petite molcule dont la prsence sur PER et TIM constitue un signal de reconnaissance par une machinerie de dgradation des protines, le protasome. La comptition entre synthse et dgradation dfinit la vitesse daccumulation nocturne de PER et TIM. Par ailleurs, certaines phosphorylations contrlent lentre de PER et TIM dans le noyau de la cellule, puis leur capacit inhiber lactivit transcriptionnelle du complexe CLK/CYC. Enfin, la fin du cycle est dfinie par la dgradation complte des protines PER et TIM hautement phosphoryles par la voie ubiquitineprotasome (figure 1).

Oscillateur molculaire. Une boucle de rgulation transcriptionnelle ngative est couple au contrle de la stabilit des protines PER et TIM pour gnrer des oscillations molculaires dune priode de 24 heures.

Un oscillateur sensible la lumire


Bien quil ait une priode intrinsque denviron 24 heures, loscillateur circadien nest pas aussi stable quun mtronome, et doit donc se synchroniser sur les cycles jour/nuit imposs par la rotation de la terre. En laboratoire, si on soumet des drosophiles un changement de phase du cycle jour/nuit, comme celui que lon subit lorsquon fait un voyage transatlantique, les mouches se synchronisent en lespace dune journe sur la nouvelle phase (9). Cette efficacit enviable repose sur lutilisation conjointe du systme visuel et dune molcule photorceptrice prsente dans la plupart des cellules de lorganisme. Contrairement aux mammifres, chez lesquels la perte de la connexion entre lil et le cerveau rend lhorloge aveugle, des drosophiles mutantes, qui ne dveloppent pas dyeux, synchronisent toujours leur cycle veille/ sommeil avec les cycles jour/nuit. Lisolement dun gne codant pour la protine cryptochrome (CRY), un photorcepteur lumire bleue galement utilis par les plantes, a permis de comprendre pourquoi (10). Les mouches mutantes dpourvues la fois du systme visuel et du cryptochrome savrent incapables de se synchroniser sur les cycles jour/nuit. Les rles respectifs de la protine CRY et du systme visuel ne sont pas trs clairs, mais on a observ que les mouches dpourvues de lun ou de lautre mettent plusieurs jours recaler leur rythme veille/sommeil. La faon dont le systme visuel recale loscillateur molculaire nest pas connue. En revanche, le mcanisme

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faisant appel au cryptochrome a t en partie lucid. La cuticule qui constitue lexosquelette de la drosophile est translucide, ce qui permet la lumire datteindre les cellules des diffrents organes. Dans les cellules, la capture dun photon par la protine CRY induit la formation dun complexe avec la protine TIM. Ce complexe phmre recrute plusieurs enzymes qui provoquent la phosphorylation puis lubiquitination de TIM, provoquant sa dgradation par le protasome. La disparition brutale de TIM sous laction de la lumire modifie ltat de loscillateur molculaire, dont la vitesse de reconstitution du rservoir de protine TIM dterminerait le sens du changement de phase, avance ou retard. Lexpression des gnes dhorloge dans lorganisme rvle que la quasi-totalit des cellules possdent une horloge circadienne. Si le rle de certains neurones dans le contrle des rythmes veille/sommeil est tabli, la fonction des horloges dans les tissus non crbraux reste largement inconnue. Une horloge a t mise en vidence dans lantenne de la drosophile, qui abrite de nombreux rcepteurs olfactifs. Il a t montr que cette horloge gouverne un rythme de sensibilit olfactive : les drosophiles sont plus sensibles certaines odeurs certains moments de la journe. En outre, cette horloge semble intervenir dans le contrle circadien des interactions sociales entre les individus. Il est vraisemblable que de nombreuses fonctions physiologiques sont contrles par des horloges prsentes dans les diffrents organes, comme cela a t montr chez les mammifres (dtoxification dans
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(7) Allada R, Chung BY


(2010) Annu Rev Physiol 72, 605-24 (8) Weber F et al. (2011) FEBS Lett 585, 1443-9 (9) Dubruille R, Emery P (2008) Mol Neurobiol 38, 129-45 (10) Stanewsky R et al. (1998) Cell 95, 681-92

Dossier Le temps biologique


semble avoir un rle proche de celui de la protine TIM de drosophile et sassocie PER. Lanalyse des gnes cry chez diffrents insectes indique que certains dentre eux, telle labeille, possdent un gne cry proche du gne de mammifre mais pas de gne tim, tandis que dautres (moustique, ver soie) possdent la fois un gne cry de type drosophile et un gne cry de type mammifre. Cette deuxime catgorie dinsectes pourrait donc reflter une situation ancestrale ayant volu diffremment chez la mouche et chez les mammifres (11). Chez les plantes ou les champignons, le scnario des boucles transcriptionnelles est conserv mais les acteurs diffrent. Enfin, une situation assez diffrente a t mise en vidence chez les cyanobactries, chez lesquelles loscillateur repose sur un complexe protique 12 sous-units, dont le niveau de phosphorylation cyclique est contrl par deux autres partenaires protiques (12). La phosphorylation du complexe dtermine sa capacit contrler les oscillations de compaction du chromosome bactrien, et par ce biais, la transcription cyclique de la quasi-totalit des gnes de la cyanobactrie, dont le mtabolisme oscille entre photosynthse et fixation de lazote. sence provoque la perte du rythme en obscurit constante, suggrant quil est un neurotransmetteur de lhorloge crbrale. Lorsque les mouches mutantes pour le PDF sont places en conditions jour/nuit, elles perdent leur activit du matin mais gardent une activit du soir. Ces donnes suggrent que diffrents groupes de neurones contrleraient diffrentes parties du comportement rythmique de lanimal. Une hypothse qui a pu tre teste directement, grce la relative facilit, chez la drosophile, cibler lexpression de gnes dans un groupe de cellules particulier. Des mouches mutantes pour le gne per ne montrent ni activit matinale ni activit vesprale. Lexpression dirige dun transgne per dans les neurones PDF de ces mmes mutants restaure lactivit du matin, mais pas celle du soir. En revanche, lorsque lexpression du transgne est cible dans un autre groupe, compos de quatre neurones dorso-latraux, les mouches montrent une activit du soir mais pas dactivit du matin. Lhorloge crbrale de la mouche contient donc au moins deux oscillateurs aux fonctions distinctes dans la rgulation du cycle veille/sommeil en conditions jour/nuit (13,14) (figure ci-dessus). De plus, ces oscillateurs neuronaux ragissent diffremment la lumire, loscillateur du matin tant inhib par celle-ci, tandis que loscillateur du soir en a besoin pour gnrer de lactivit. La prsence de plusieurs oscillateurs permettrait de mieux adapter le comportement de lanimal aux variations saisonnires de la dure du jour (photopriode). En effet, la contribution de loscillateur du matin semble primer en conditions hivernales (jours courts), tandis que la contribution de loscillateur du soir domine en conditions estivales (jours longs) (15). Tout comme de nombreux aspects du fonctionnement de loscillateur molculaire, larchitecture neuronale du systme circadien reste encore mal comprise. La distribution des diffrentes entres sensorielles (lumire, temprature) vers les multiples oscillateurs crbraux, de mme que la faon dont ces oscillateurs contrlent les centres moteurs de linsecte restent largement inconnues. Nanmoins, les outils gntiques et molculaires de plus en plus performants et les avances rcentes des techniques dimagerie crbrale laissent entrevoir des perspectives prometteuses pour le dcryptage molculaire des horloges circadiennes. G

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Lhorloge crbrale de la drosophile contient au moins deux oscillateurs (neurones dorsolatraux et neurones ventro-latraux) aux fonctions distinctes dans la rgulation du cycle veille/sommeil en conditions jour/nuit.

(11) Yuan Q et al. (2007)


Mol Biol Evol 24, 948-55 (12) Johnson CH et al. (2011) Annu Rev Biophys 40, 143-67 (13) Grima B et al. (2004) Nature 431, 869-73 (14) Stoleru D et al. (2004) Nature 431, 862-8 (15) Stoleru D et al. (2007) Cell 129, 207-19

le foie, production durine dans le rein). Ces horloges non crbrales, encore appeles priphriques, sont, chez la drosophile, capables de percevoir la lumire via le photorcepteur CRY. Chez les mammifres, la connexion il-cerveau assure la synchronisation des noyaux suprachiasmatiques, qui jouent le rle de chef dorchestre en synchronisant lensemble des oscillateurs priphriques. Le rle photorcepteur de CRY chez la drosophile confre aux horloges priphriques la capacit percevoir la lumire indpendamment du cerveau. Ainsi est-il possible de synchroniser les oscillateurs circadiens des cellules de pattes, dil ou dantenne en exposant les organes en culture des cycles jour/nuit. Les insectes ont donc adopt une organisation circadienne dcentralise, o la lumire synchronise les oscillateurs circadiens des diffrents organes via le photorcepteur CRY, sans intervention du cerveau.

Horloges circadiennes et volution


Les gnes gouvernant les rythmes circadiens de la drosophile sont trs conservs et ont permis disoler de nombreux gnes dhorloge chez les mammifres. Chez ces derniers, des protines homologues PER, CLK et CYC composent une boucle de rgulation transcriptionnelle, et leurs modifications post-traductionnelles semblent assures en grande partie par les mmes enzymes de phosphorylation et dubiquitination que chez la mouche (lire p. 31). Une surprise est apparue lorsque des souris dpourvues de cryptochrome ont t gnres. Contrairement aux mutants de drosophile, les souris cry- ne prsentent pas de dfaut de synchronisation de leur horloge, puisquelles perdent tout simplement leur rythme veille/ sommeil. Chez les mammifres, CRY
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Dans le cerveau, des oscillateurs du matin et du soir


De nombreux animaux ont des cycles dactivit/repos montrant une distribution journalire bimodale, avec un pic dactivit le matin et un autre le soir. Les drosophiles maintenues en laboratoire en conditions jour/nuit (12 heures/12 heures) mergent de leur sommeil nocturne ou de leur sieste quelques heures avant lallumage ou lextinction de la lumire. Lhorloge qui gouverne ce rythme veille/sommeil repose sur environ 150 neurones le cerveau dune mouche en contiendrait environ 100 000 rpartis de faon symtrique en plusieurs groupes dorsaux et latraux dans le cerveau (9). Un groupe de huit neurones ventro-latraux exprime le neuropeptide PDF (Pigment Dispersing Factor), dont lab-