Master Universitario in Monitoraggio e valutazione del risc io a!"ientale !

utageno# cancerogeno e teratogeno$

MARCATORI MOLECOLARI IN EPIDEMIOLOGIA

Annalisa Quattrocchi
Dipartimento GF Ingrassia Universit degli Studi di Catania

Polimorfismo genetico

Differenza genetica relativamente comune in una popolazione

Frequenza nella popolazione di almeno l1%

Single Nucleotide Polymorphisms S!Ps"

#e varianti genetiche$ sia allo stato omozigote che eterozigote$ nei geni di suscetti%ilit possono conferire differenti caratteristiche fenotipiche rispetto al wild type Alcune varianti di singole paia di %asi sono definite Single Nucleotide Polymorphisms S!Ps" e sono potenzialmente responsa%ili della suscetti%ilit alle malattie

&A'CA()'I &)#*C)#A'I DI SUSC*((I+I#I(A,

3

-. ID*!(IFICA/I)!* DI S!Ps

Co!e identi%icare &NPs in ca!'ioni di DNA(

Cariotipo
#0analisi del cariotipo permette di evidenziare eventuali anomalie cromosomiche$ sia numeriche 1uali trisomie$ monosomie"$ che strutturali traslocazioni$ delezioni ed inversioni" #e cellule vengono %loccate in metafase e i cromosomi vengono colorati con sostanze che si fissano selettivamente a determinate zone cromosomiche$ dando luogo ad un caratteristico aspetto a %ande2 %ande Q$ G o ' secondo la tecnica di colorazione utilizzata #a fase successiva comprende l,osservazione al microscopio2 i cromosomi vengono contati$ analizzati e fotografati Dalle fotografie i cromosomi vengono poi appaiati a due a due in %ase alle dimensioni$ alla posizione del centromero una strozzatura del cromosoma" e al %andeggio
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Co!e identi%icare &NPs in ca!'ioni di DNA(

Cariotipo
'ivela solo grossi cam%iamenti nel materiale genetico
!umeriche e strutturali2 delezioni molto grandi$ trisomie 3

Co!e identi%icare &NPs in ca!'ioni di DNA(

Se1uenziare i campioni
Poco pratico Costoso !ecessita di grosse 1uantit di D!A

-. ID*!(IFICA/I)!* DI S!Ps2 &etodi %asati sulla PC' 4 Amplificazione Allele specifica - Multiplex PCR - PCR-RF P

Amplificazione della se1uenza specifica mediante Pol5merase chain 'eaction PC'

Amplificazione selettiva di una se1uenza nota di D!A in un campione eterogeneo di se1uenze #a reazione di amplificazione avviene attraverso cicli se1uenziali *, una reazione a catena2 i filamenti neo4sintetizzati agiscono da stampo per l,ulteriore sintesi di D!A nel ciclo successivo #a reazione consente di ottenere circa 678 copie della se1uenza specifica

Amplificazione della se1uenza specifica mediante PC'

#a reazione 9 catalizzata da una D!A polimerasi termosta%ile$ in presenza dei : deossiri%onucleosiditrifosfato dA(P$ dC(P$ dG(Pe d((P" #a reazione 9 innescata in corrispondenza di due oligonucleotidi 684-8 %p$ singolo filamento" disegnati nelle regioni fiancheggianti la se1uenza da amplificare Primer" 4 4 4 )gni ciclo 9 costituito da tre passaggi2 denaturazione ;<4;8=C" i%ridazione del D!A stampo con gli oligo 884>8=C" sintesi del D!A ?-=C"

Complessivamente vengono effettuati -84<7 cicli

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PCR) gli ingredienti

@ D!A genomicoA stampo @ P'I&*' A oligonucleotidi sintetici per l,innesco della reazione di sintesi @ (AQ P)#I&*'ASI A D!A polimerasi termoresistente @ d!(Ps A dA(P B dT(P B dG(P B dC(P
ALLUNGAMENTO

DENATURAZIONE

APPAIAMENTO

@ +uffer @ &gCl11

12

2. Visualizzazione dei risultati: Gel Elettroforesi

#,elettroforesi separa il D!A in %ase alle dimensioni Il D!A migra verso il polo positivo #e molecole piu, grandi si muovono piu, lentamente

13 13

14

&arcatori dei pesi molecolari

Gel *lettroforesi
Per poter visualizzare il D!A su un gel$ altrimenti invisi%ile$ %isogna colorarlo con +romuro di etididio$ un agente intercalante che emette fluorescenza 1uando eccitato a lunghezze d,onda ultraviolette Il %romuro d0etidio 9 un agente mutageno e puC indurre effetti carcinogenici e teratogenici2 necessita di molta attenzione nell0uso )ggi si usano altre molecole intercalanti fluorescenti piD sicure2 Sy!er Safe
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Gel *lettroforesi
I gel piD utilizzati sono 1uelli di agarosio con percentuali varia%ili tra 7$? e -E A %asse concentrazioni si risolvono meglio i pesi molecolari alti F6777 %p" Ad alte concentrazioni si risolvono meglio i pesi molecolari %assi G 6777 %p" Per frammenti di D!A molto piccoli tra 6 e -77 %p" si ricorre ad un gel di poliacrilammide

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Amplificazione Allele specifica

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A!'li%icazione allele*s'eci%ica ARM&

4'eazione di PC' nella 1uale vengono utilizzati separatamente primers complementari alla se1uenza normale e a 1uella mutata

A2 primer normale

+2 primer mutato

!ormale2 amplificato solo con A &utato omo2 amplificato solo con + &utato etero2 amplificato con A e +
4 #a presenza degli amplificati viene evidenziata mediante elettroforesi su gel elettroforetico e successiva colorazione

19 6;

Gene TP53

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S!P al codone ?- del gene p"#$ Amplificazione Allele specifica

PC' utilizzando - coppie di primer differenti$ complementari alla se1uenza del D!A stampo2 una per il codone per la Prolina ed una per il codone per l,Arginina. 6p8<ProBHp8<4 Pro 6" 2 8,4GCCAGAGGC(GC(CCCCC4<, -p8<ProBHp8<4 Pro -" 2 8,4CG(GCAAG(CACAGAC((4<, 6p8<BHp8<Arg4 Arg 6" 2 8,4(CCCCC((GCCG(CCCAA4<, -p8<BHp8<Arg4 Arg -" 2 8,4C(GG(GCAGGGGCCACGC4<,

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S!P al codone ?- del gene p"#$ Amplificazione Allele specifica

Per l,amplificazione sono utilizzate le IpuR% &a' Ready-&o-(o PCR !eadsJ Amersham )iosciences" che contengono all,interno$ una miscela di tutti i componenti necessari per la reazione di PC' #e reazioni sono state svolte in un termociclatore Mastercycler (radient* %ppendorf" programmato nel modo seguente2 ;8=C per 8 min $ ;8=C per <7 sec$ >6=C per -7 sec$ ?-=C per -7 sec$ per <8 cicli$ ?-=C per : min

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Polimorfismi al codone ?del gene p"#

C omozigoti per la Prolina2 una %anda a 6?? %p omozigoti per l,Arginina2 una %anda a 6:6 %p ines - e 8" *terozigoti 2 due frammenti di 6?? %p e di 6:6 %p ines 6$ < e :"
177 bp 141 bp

L 1 2 3 4 5

gel di agarosio al 3% 23

Multiplex PC'

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Geni (S&
Sette famiglie di geni (S& 4 (lutathione S-transferases 4 che codificano enzimi citosolici di fase II !ell,uomo si conoscono cin1ue classi di GS( solu%ili$ che comprendono alfa A"$ mu &"$ pi P"$ theta ("$ e zeta /" con varie sottofamiglie per ciascuna classe per es. A64 A:$ &64&8$ P6$(64(- e /6" *nzimi cruciali per garantire la protezione cellulare contro gli effetti citotossici

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3 polimorfismi dei geni (S&

Il gene (S&M+ 9 localizzato sul cromosoma 6p6<.< mentre il gene (S&&+ 9 localizzato sul cromosoma --166. i geni codificanti per il (S&M+ e (S&&+ presentano un polimorfismo da delezione$ che in caso di omozigosi genotipo nullo" porta all,assenza dell,attivit enzimatica

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3 polimorfismi dei geni (S&$ Multiplex PC'

< coppie di primer differenti nella stessa reazione2 Per il gene per la K glo%ina2 +62 8,4CCAC((CA(CCACG((CACC4<, +-2 8,4GAAGACCCAAGGACAGG(AC4<, Per il gene (S&M+2 G6 2 8,4GAAC(CCC(GAAAAGC(AAAGC4<, G- 2 8,4G((GGGC(CAAA(A(ACGG(GG4<, Per il gene (S&&+2 (6 2 8,4(CCC((AC(GG(CC(CACA(C(C4<, (- 2 8,4(CACCGGA(CA(GGCCAGCA4<
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3 polimorfismi dei geni (S&$ Multiplex PCR

Per l,amplificazione sono state utilizzate le IpuR% &a' Ready-&o-(o PCR !eadsJ Amersham )iosciences" che contengono all,interno$ una miscela di tutti i componenti necessari per la reazione di PC' #e reazioni sono state svolte in un termociclatore Mastercycler (radient* %ppendorf" programmato nel modo seguente2 ;:= C per <7 sec$ >-= C per <7 sec$ ?-= C per :8 sec$ per <8 cicli.

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Visualizzazione dei risultati: Gel Elettroforesi

Presenza del gene (S&M+ 2 un frammento di -67 %p Presenza del gene (S&&+ 2 un frammento di :L7 %p #,assenza dell,amplificato specifico per il (S&M+ e per il (S&&+ indica il genotipo nullo ine67 "

480 bp

210 bp gel di agarosio al 3%

in tutti i campioni deve esserci la presenza del controllo interno costituito dal gene della globina che fornisce una banda di 268 bp
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Restriction Fragment Length Polymorphisms

Poli!or%is!i c e alterano la lung ezza dei %ra!!enti di restrizione

'F#Ps

Risultano da: cambiamenti (SNPs) che introducono o

alterano un sito di restrizione

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Digestione con enzi!i di restrizione R+LP

4 Gli enzimi di restrizione sono endonucleasi di origine %atterica in grado di riconoscere specifiche se1uenze di :4L nucleotidi e di tagliare in 1uelle posizioni il D!A. @ &utazioni che a%oliscono un sito di taglio @ &utazioni che creano un nuovo sito di taglio 4 &utazioni che modificano un sito di restrizione possono essere riconosciute direttamente mediante elettroforesi dopo digestione con l,enzima di restrizione appropriato

31 31

Un ca!"ia!ento in un singolo nucleotide 'u, %are la di%%erenza (

,ild-type allele

AGA(C( (C(AGA 'estriction site

Mutant allele

AGAGC( (C(CGA !ot a restriction site

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33

Il gene MTHFR
Codifica lenzima 5,10 metilenetetraidrofolato reduttasi (MTHFR), enzima chiave del metabolismo dei folati e della metionina

riduzione del 5,10 metilenTHF a 5metilTHF, la forma principale di folato circolante donatore di atomi di carbonio per la conversione dellomocisteina a metionina coinvolto nella produzione di dTMP e gioca un ruolo nella sintesi e nella metilazione del DNA
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Polimorfismi del gene MTHFR

C677T A1298C

Ala

222

Val

Glu

429

Ala

riduzione del 70% dellattivit enzimatica modesta iperomocisteinemia plasmatica Pu aumentare: il rischio di difetti del tubo neurale sindrome di Down malattie cardiovascolari alcuni tipi di cancro

riduzione dellattivit enzimatica in vitro (40%) iperomocisteinemia Non sembra influenzare direttamente la funzione dellenzima ma potrebbe avere effetto in combinazione con il polimorfismo C677T
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Polimorfismo M&-FR C>??( mediante PC' 'F#P 6.Amplificazione della se1uenza specifica -.Misualizzazione dei risultati <.'estrizione enzimatica :.Misualizzazione dei risultati

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6. Amplificazione della se1uenza specifica mediante PC'

C>??(6 F"2 8,4(GAAGGAGAAGG(G(C(GCGG4<, C>??(- '"2 8,4AGGACGG(GCGG(GAGAG(G4<, Per l,amplificazione sono state utilizzate le IpuR% &a' Ready-&o-(o PCR !eadsJ Amersham )iosciences" che contengono all,interno$ una miscela di tutti i componenti necessari per la reazione di PC' #e reazioni sono state svolte in un termociclatore Mastercycler (radient* %ppendorf" programmato nel modo seguente2 ;:= C per <7 sec$ >-= C per <7 sec$ ?-= C per :8 sec$ per <8 cicli.

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2. Visualizzazione dei risultati: Gel Elettroforesi

(utti i campioni presentavano una %anda di 6;L %p$ indicando la corretta amplificazione della se1uenza genica

38 38

<. Digestione con enzima di restrizione

I prodotti ottenuti mediante PC' sono stati digeriti con l,enzima di restrizione -inf. Il S!P genera un nuovo sito di restrizione pertanto dal frammento di 6;L %p si ottengono due frammenti di 6?8 e -< %p se la se1uenza contiene il polimorfismo

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4. Visualizzazione dei risultati

L 1 2 3 4 5 6 7

omozigoti normali CC 198 bp (Line 2) omozigoti mutati TT: 175 e 23 bp (Lines 6 e 7) eterozigoti CT: 198, 175 e 23 bp (Line 5)

198bp 175 bp

23 bp PCR RFLP gel di agarosio al 4%

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Il DNA cos pre-trattato pu essere valutato tramite PCR (polymerase chain reaction) con primers specifici per le sequenze metilate e non metilate, o mediante microarrays o in spettrometria di massa La valutazione sia qualitativa (sequenza metilata vs non metilata) con definizione dellepigenotipo della/e sequenza/e indagata/e, che quantitativa (% sequenze metilate vs non metilate) Possono essere caratterizzate sia la metilazione specifica a carico di uno o pi geni, che la metilazione complessiva, a livello genomico In questo caso la caratterizzazione pu essere sia indiretta, valutando come surrogato il grado di metilazione di sequenze ripetitive disperse nel genoma [sequenze Alu (circa il 10% del genoma umano) e LINE-1 (lunghi elementi nucleari disseminati - famiglia 1; circa 17% del genoma umano)] che diretta ramite microarrays genomici

Epitect Bisulfite Sequencing Kit (Qiagen)

- starting material: DNA 1 ng - 2 g - good sensititvity for most applications - faster (cca 6 hours)

http://www1.qiagen.com/Products/Epigenetics/Epitect/EpitectBisulfiteKit.aspx?ShowInfo=1

Clean4up

P5ro&arN PC' Oit

Location o% L- '.rose/uencing sites -*01 C'G island region o% t e u!an L1 transposon 2Gen3an4 accession no1 567896# nucleotide 'osition - to --:9; PelloQ highlights represent single CpG sites$ and red highlights Site6$ Site - and Site <" represent the CpG sites anal5zed %5 p5rose1uencing. Rorizontal arroQs indicate the location of primers F$ forQard primerS '$ reverse primerS 4%io$ %iotin5lated primer" (he se1uencing primer is underlined$ the complementar5 strand Qas anal5zed

ForQard primer 8,4((((((GAG((AGG(G(GGG4<," 'everse %iotin5lated primer 8,4%iotin4(C(CAC(AAAAAA(ACCAAACAA4 <," p5rose1uencing primer 8,4GGG(GGGAG(GA(4<," Dispensing )rder2 G(CGA((AG(AG(CAG(CGC( Se1uence to anal5ze2 (PGA((((((AGG(GPG((PG((A PACH(" Piyathilake et al., 2011

Primer

& T 6 T 6-T 6<T 6LT 6;T -6T--T

~ 290 bp

& T -:T :6 T :< T C T & TU&TO4T

Upon PC' amplification$ uracil is amplified as th5mine Qhile 84&eC residues remain as c5tosines$ alloQing meth5lated CpGs to %e distinguished from unmeth5lated CpGs %5 presence of a c5tosine UCU versus th5mine U(U residue during se1uencing

I!!o"ilization o% PCR Products to &tre'tavidin &e' arose <P 3eads

Chimica del saggio Pyrosequencing

http2HHQQQ.1iagen.comHmediaHproduct4 toolsHflashHP5rose1uencingH-76-767>HindeV.html

http2HHQQQ.1iagen.comHOnoQledge4and4SupportHMideos4and4Mirtual4 DemosHMideosHP5rose1uencingE-7CascadeE-7'eactionH