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Polymerase Chain Reaction: resa teorica

Resa teorica: 2n P = (2)n T Il prodotto (P) incrementa esponenzialmente con il numero di cicli di PCR (n) Il prodotto di PCR dipende da T, numero di copie di template di partenza

Polymerase Chain Reaction: plateau


Resa effettiva: effetto plateau
Il processo di duplicazione non procede allinfinito, esso limitato da: Quantit dei primer Attivit della Taq polimerasi Reannealing dei filamenti

Raggiunto il plateau non si osserva pi un incremento nei prodotti (resa massima)


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Polymerase Chain Reaction:

Log[DNA]

Plateau Lineare Prodotto variabile

Esponenziale

N cicli termici

PCR Qualitativa
Presenza/assenza di una sequenza di DNA Possiamo utilizzare soli i dati end-point della fase del plateau in cui il prodotto di PCR non proporzionale al template iniziale Non possiamo disporre di dati quantitativi sul template iniziale

- Presenza in campioni alimentari di DNA derivante da OGM (PCR qualitativa)

- Numero di copie di DNA derivante da OGM in un campione per confrontarlo con i valori soglia (PCR quantitativa)

PCR quantitative

Obiettivo: ottenere la quantificazione del template iniziale

Soluzioni per avere dati quantitativi


Utilizzare i dati ottenuti durante la fase esponenziale nella quale il prodotto di PCR proporzionale al template iniziale (da quantificare) Questo reso possibile mediante il rilevamento, di una fluorescenza, che proporzionale al prodotto di PCR La fluorescenza, durante ogni ciclo di amplificazione, pu essere rilevata utilizzando uno strumento quantitativo ma anche dei marcatori fluorescenti il cui accumulo segue la stessa cinetica della reazione di PCR
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REAL TIME PCR (RT-PCR)


Misura l'amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale della PCR, quando cio l'efficienza di amplificazione influenzata minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di ottenere risultati molto pi accurati rispetto alla PCR tradizionale "end point" Lanalisi del prodotto amplificato non avviene, quindi come nella PCR classica, al termine della stessa, ma durante la reazione stessa in real time

RT-PCR quantitativa
Rilevamento della fluorescenza associata allamplificazione Il prodotto di PCR non viene analizzato su gel di agarosio Analisi del prodotto di fluorescenza tramite computer

Incremento di fluorescenza

Cicli di PCR

Chimiche fluorescenti per PCR Real-Time

La fluorescenza si genera durante la PCR per effetto di diverse possibili reazioni chimiche Le chimiche principali: - legame di coloranti fluorescenti che si intercalano nella doppia elica di DNA (SYBR Green) - ibridazione di sonde specifiche (Taq Man)

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Utilizza una molecola fluorescente - colorante intercalante non specifica che si lega ai solchi minori del DNA

SYBR Green: principio

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TaqMan
La Real-Time PCR si pu realizzare mediante limpiego: sonde (o probe) ad ibridazione, specifiche per il frammento di interesse, marcate con molecole fluorescenti

Esistono diversi tipi di sonde: Dual-labeled (come le sonde TaqMan)

Molecular beacons Scorpion Sonde FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)


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Real-Time PCR: la reazione


COMPONENTI DELLA REAZIONE: 1) DNA target 2) DNA polimerasi 3) Due oligonucleotidi (primer) 4) dNTPs 5) Sonda fluorescente

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Real-Time PCR: DNA polimerasi

LAmpliTaq Gold DNA polymerase ha attivit

esonucleasica 5 3 fondamentale per la degradazione della sonda che emetter la fluorescenza

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Sonde TaqMan
La sonda di tipo TaqMan un oligonucleotide che, come i primer della PCR, viene disegnato per essere complementare alla sequenza bersaglio da amplificare
R 3 5 Sequenza da amplificare
5

Primer

TaqMan

Q 3 Primer 3 5 5 3

La sonda disegnata in modo da ibridarsi allinterno del frammento amplificato nella reazione di PCR
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Sonda TaqMan
Presenta allestremit 5 un fluoroforo Reporter ed allestremit 3 una molecola Quencher

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Sonde TaqMan

Sonda oligonucleotidica complementare alla

sequenza target, interna ai primer di PCR La sonda marcata con un fluoroforo reporter - ad una estremit ed un quencher allaltra La distanza tra reporter e quencher tale da bloccare lemissione di fluorescenza
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Reporter-Quencher
Dye 5,6 FAM HEX/JOE Texas Red/ROX Cy5/Quasar670 Quencher BHQ-1/TAMRA BHQ-2 BHQ-2 BHQ-2 ( or-3)

6-carbossifluoresceina 6-carbossitetrametilrodamina

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Reporter-Quencher
Possibilit di utilizzare vari tipi di fluorocromi per marcare sonde diverse per rilevare contemporaneamente pi di una sequenza target in una sola reazione, realizzando cos una reazione in

multiplex

Uno svantaggio sta invece nellobbligo di sintetizzare, per ogni target, una sonda ad hoc

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Reporter-Quencher
5 REPORTER (R): fluorocromo ad alta energia che emette fluorescenza 3 QUENCHER (Q): fluorocromo a bassa energia che spegne la fluorescenza del reporter

R
5

Q
3

Se R e Q si trovano vicini, Q spegne l'effetto di R perch i fotoni di R vengono assorbiti da Q


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Sonde TaqMan: come funzionano


Denaturazione: nessuna fluorescenza Annealing: la sonda lega la sequenza target, ma non si sviluppa fluorescenza Estensione: lazione dalla polimerasi prima sposta lestremit 5 della sonda, e quindi stacca la molecola reporter mediante lattivit esonucleasica 5-3. Il reporter libero dal quencher, emette fluorescenza, e si accumula ad ogni ciclo Lettura della fluorescenza Read) in qualsiasi fase (Plate

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Real-Time PCR: attivit 5>3 esonucleasica


Quando la sonda intatta non viene emessa fluorescenza: spento l'effetto di R perch i fotoni di R vengono assorbiti da Q Durante la fase di annealing la sonda ibrida con il filamento specifico Durante lestensione ad opera dellAmpliTaq Gold DNA polymerase che ha attivit esonucleasica, 5 3, la sonda viene degradata, R liberato dal Q e conseguente emissione di fluorescenza alla lunghezza donda specifica del fluoroforo R
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Real-Time PCR: attivit 5>3 esonucleasica


R
5 3 3 5

R Q
5 3 5

R
5 3

Q
5

Lo sviluppo della fluorescenza del reporter si ha solo se i primer e la sonda legano il DNA target (elevata specificit specificit) 23

Laumento di fluorescenza del Reporter direttamente proporzionale al numero di ampliconi generati

Forward primer

Probe

Reverse primer

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Principio base della Real-Time PCR


I laser a ioni argon o le lampade al tungsteno durante la PCR eccitano i fluorocromi presenti nei campioni e convogliano la fluorescenza emessa in risposta, lungo fibre ottiche fino ad uno spettrografo che provvede a separare le componenti del reporter e del quencher Appositi software acquisiscono lo spettro di emissione di ogni singolo campione per tutta la durata della PCR e convertono la variazione di fluorescenza del reporter in una rappresentazione in tempo reale della cinetica damplificazione

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Analisi: curve di amplificazione

Plot lineare

Fluorescenza

Cicli di amplificazione

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Analisi: curve di amplificazione


I parametri che caratterizzano il grafico delle curve di amplificazione di unanalisi di real-time PCR sono: - linea di base (baseline): linea orizzontale che indica il valore al di sopra del quale inizia laccumulo di fluorescenza; - linea di soglia (threshold line): linea parallela alla linea di base, che interpola le curve di amplificazione nella fase esponenziale; - ciclo di soglia (Ct) (threshold cycle): ciclo di PCR misurato per ciascun campione, in cui la curva di amplificazione interseca la linea di soglia;
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Fluorescenza

Cicli di amplificazione

Plot di amplificazione
Normalised reporter fluorescence (Rn) Linea soglia scelta d a l l o p e r a t o r e In maniera da intersecare le curve di tutti i campioni nella fase esponenziale

Indica il valore al di so pra del quale inizia laccumulo di un amplificato

E il ciclo della reazione in cui il segnale di fluorescenza del campione maggiore rispetto a quello della Threshold PCR cycle number
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Curve di amplificazione
Plot lineare

Fluorescenza

Cicli di amplificazione Per ogni campione si ottiene una curva di amplificazione il cui CT (=Threshold Cycle) inversamente proporzionale alla quantit di template iniziale 30

Quantificazione

I CAMPIONI SONO QUANTIFICATI IN MODO: - ASSOLUTO - RELATIVO

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Quantificazione Assoluta
I campioni sono quantificati in modo assoluto Si ricava il numero esatto di copie di template iniziale Necessita di standard di cui si conosce la concentrazione assoluta (utilizzo di una standard curve) Per tutti gli unknowns devono essere saggiate identiche quantit di campioni

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La quantificatione assoluta nella PCR Real-Time

Una curva di referenza costruita con i Ct di campioni standard a contenuto di DNA noto consente poi lestrapolazione del contenuto di DNA nei campioni incogniti

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La quantificatione assoluta nella PCR Real-Time

Vantaggio rispetto alle PCR tradizionali: - Quantificare il DNA al ciclo soglia (Ct), che sempre calcolato nella fase esponenziale della reazione PCR, fase in cui i reagenti sono ancora lontani dallesaurimento e gli elementi di variabilit sono cos ridotti al minimo - Il CT inversamente proporzionale alla quantit di template iniziale

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La quantificatione assoluta nella PCR Real-Time

unknown sample

Threshold

Amplificando quantit note si costruisce una curva

standard, le quantit ignote si ricavano per interpolazione dalla curva standard


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Quantitativa assoluta
Ct 10 1 35 unknown sample 25 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 3500 copies 15 10 7

log10 quantity
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Quantificazione relativa
La quantificazione viene effettuata paragonando i CT quanto aumentano o diminuiscono le copie (o lespressione) di un gene dopo un trattamento? Necessita di controlli endogeni o gene housekeeping la cui quantit (o espressione) sempre la stessa (non si utilizza una standard curve) Gli unknowns vengono quantificati paragonando il loro CT con quello del controllo noto

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Standards
Espresso in tutte le cellule Simile numero di copie in tutti le cellule Subiscono variazioni di espressione poco significative in seguito a trattamenti sperimentali

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Quantitativa relativa
Plot di amplificazione Control Sample

Numero di cicli
differenza tra il valore di Ct ottenuto con la curva di amplificazione del campione in esame ed il Ct ottenuto con la curva di amplificazione del gene standard misurata per ciascun campione
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CT

Quantitativa relativa: analisi dei dati


Normalizzare il target con un controllo endogeno (r) espresso costitutivamente (CT) 2(CT,r- CT,cb)=

2-

CT

Il valore cos ottenuto permette di determinare la concentrazione relativa del target

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Real-Time PCR: applicazioni


Quantificazione virale Quantificazione dell dellespressione genica Efficacia della terapia farmacologica Misura dei danni al DNA Controllo di qualit qualit e validazione dei saggi Controllo degli OGM SNPs

Genotyping

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