Engenharia Biomdica

Bioqumica e Biologia Molecular

Relatrio

Cintica da Enzima Invertase

Relatrio realizado por: Ana Calhau n54605 Drcio Silva n54214 Jos Frazo n54198 1 Semestre, Ano Lectivo 2005/2006

Sumrio
Usam-se diversas abordagens no estudo do mecanismo de aco de enzimas purificadas, mas a abordagem principal determinar a taxa da reaco enzimtica e como muda em resposta mudana dos parmetros experimentais, esta conhecida como cintica enzimtica. Neste trabalho experimental o objectivo era estudar a cintica da enzima invertase, ou seja, determinar o valor da velocidade mxima (mxima velocidade a que a enzima degrada o substrato) e determinar o valor do Km que uma medida da afinidade enzimtica para o substrato (essa afinidade igual a 1/km). Se Km for elevado a afinidade baixa. A invertase uma enzima que catalisa a degradao da sacarose em glucose e frutose. Inicialmente, obteve-se a absorvncia e a concentrao dos acares redutores (tendo-se feito dois ensaios). Depois, calculou-se a velocidade de reaco para cada concentrao inicial de sacarose. Para se obter os valores usou-se a equao da recta Y=0,0004x-0,0186, em que Y a absorvncia. Em seguida colocaram-se estes resultados num grfico (concentrao de sacarose x velocidade de reaco), obtendo-se uma curva de Michaelis-Menten (fig.1).

Fig.1 Variao da velocidade de reaco em funo da concentrao de substracto curva de Michaelis-Menten. Esta curva descrita pela equao que leva o mesmo nome:

Apesar de ser possvel calcular o valor de Km e da velocidade mxima atravs desta curva frequente utilizar-se a representao grfica de 1/v em funo de 1/[S] representao de Lineweaver-Burkpois torna mais simples o estudo da cintica bioqumica, j que o

traado de uma recta exige menos leituras experimentais (menos pontos) do que o da curva e permite uma determinao de Km mais expedita.

Fig.2 Representao de Lineweaver-Burk para a determinao de Km Esta representao descrita pela equao

Assim, o objectivo de estudar a cinemtica da enzima invertase foi alcanado, obtendo-se valores de Km iguais a 12,52 g/L (36,6mM) pela interpretao linear de Lineweaver-Burk e de 11,5 g/L (33,6mM) pela interpretao de Michaelis Menten. Os valores da velocidade mxima foram de 1,84g/(L.min) e 1,6 g/(L.min) respectivamente.

Resultados
Nos primeiros resultados, aps se ler a densidade ptica, obtiveram-se logo valores mximos para a velocidade. Assim, reduziu-se a quantidade de invertase utilizada. Aps a reduo a 1/5 de invertase quantos aos resultados, obteve-se, relativamente cor, que esta passava de transparente para amarelo, aps adio da invertase, qualquer que fosse a concentrao de sacarose. Aps passagem pelo banho de gua a 100C passava a castanho. Contudo, para os tubos aos quais no foi adicionado invertase e que correspondem ao tempo zero para cada uma das concentraes de sacarose verificou-se a passagem do transparente para o amarelo e a permanncia desta cor. Quanto aos valores obtidos para a absorvncia e para a concentrao os resultados so os seguintes: Valores obtidos para as concentraes de 15, 30 e 45 g/l Ensaio 1
Concentrao de sacarose 15g/L 0 1 2 3 4 5 6 7 Absorvncia 0,1 0,24 0,59 0,85 1 1,1 1,2 1,35

[] (mg/L)
296,5 646,5 1521,5 2171,5 2546,5 2796,5 3046,5 3421,5

Tempo (s) 0 60 120 180 240 300 360 420

Concentrao de sacarose 30g/L 0 1 2 3 4 5 6 7

Absorvncia 0,011 0,525 1,112 1,561 1,867 2,936 2,37 2,59

[] (mg/L)
74 1359 2826,5 3949 4714 7386,5 5971,5 6521,5

Tempo (s) 0 60 120 180 240 300 360 420

Concentrao de sacarose 45g/L 0 1 2 3 4 5 6 7

Absorvncia 0,018 0,622 1,171 1,693 1,967 2,35 2,597 2,697

[] (mg/L)
91,5 1601,5 2974 4279 4964 5921,5 6539 6789

Tempo (s) 0 60 120 180 240 300 360 420

Ensaio 2
Concentrao de sacarose 15g/L

Absorvncia 0,032 0,574 1,021 1,392 1,76 2,048 2,338 2,516

[] (mg/L) 126,5 1481,5 2599 3526,5 4446,5 5166,5 5891,5 6336,5

Tempo (s) 0 60 120 180 240 300 360 420

0 1 2 3 4 5 6 7

Concentrao de sacarose 30g/L

Absorvncia 0,023 0,565 0,921 1,21 1,52 1,845 2,121 2,235

[] (mg/L) 104 1459 2349 3071,5 3846,5 4659 5349 5634

Tempo (s) 0 60 120 180 240 300 360 420

0 1 2 3 4 5 6 7

Concentrao de sacarose 45g/L

Absorvncia 0,009 0,779

[] (mg/L) 69 1994

Tempo (s) 0 60

0 1

2 3 4 5 6 7

1,304 1,834 2,48 2,467 2,81 2,744

3306,5 4631,5 6246,5 6214 7071,5 6906,5

120 180 240 300 360 420

Valores obtidos para as concentraes de 45, 60 e 75 g/l Ensaio 1

Concentrao de sacarose 60 g/L

Absorvncia 0,008 0,64 1,311 1,828 2,221 2,535 2,672 2,809

[] (mg/L) 66,5 1646,5 3324 4616,5 5599 6384 6726,5 7069

Tempo (s) 0 60 120 180 240 300 360 420

0 1 2 3 4 5 6 7

Concentrao de sacarose 75g/L

Absorvncia 0,009 0,638 1,145 1,604 2,076 2,326 2,59 2,684

[] (mg/L) 69 1641,5 2909 4056,5 5236,5 5861,5 6521,5 6756,5

Tempo (s) 0 60 120 180 240 300 360 420

0 1 2 3 4 5 6 7

Concentrao de sacarose 100g/L

Absorvncia 0,024 0,941 1,428

[] (mg/L) 106,5 2399 3616,5

Tempo (s) 0 60 120

0 1 2

3 4 5 6 7 Ensaio 2
Concentrao de sacarose 60 g/L

1,997 2,406 2,598 2,759 2,836

5039 6061,5 6541,5 6944 7136,5

180 240 300 360 420

Absorvncia 0,185 0,850 1,400 2,203 2,479 2,626 2,814 2,848

[] (mg/L)
509,000 2171,500 3546,500 5554,000 6244,000 6611,500 7081,500 7166,500

Tempo (s) 0 90 150 210 270 330 390 450

0 1 2 3 4 5 6 7

Concentrao de sacarose 75g/L

Absorvncia 0,58 1,456 2,04 2,405 2,72 . -

[] (mg/L)
1496,5 3686,5 5146,5 6059 6846,5

Tempo (s) 0 60 120 180 240 300 360 420

0 1 2 3 4 5 6 7

Concentrao de sacarose 100g/L

Absorvncia 0,038 0,787 1,4 1,864 2,191 2,546 2,741

[] (mg/L)
141,5 2014 3546,5 4706,5 5524 6411,5 6899

Tempo (s) 0 60 120 180 240 300 360

0 1 2 3 4 5 6

2,666

6711,5

420

Assim, a mdia para cada grupo de valores obtidos :

Concentrao de sacarose 15g/L 0 1 2 3 4 5 6 7

Absorvncia 0,066 0,407 0,8055 1,121 1,38 1,574 1,769 1,933

[] (mg/L) 211,5 1064 2060,25 2849 3496,5 3981,5 4469 4879

Tempo (s) 0 60 120 180 240 300 360 420

Concentrao de sacarose 30g/L 0 1 2 3 4 5 6 7

Absorvncia 0,017 0,545 1,0165 1,3855 1,6935 1,845 2,2455 2,4125

[] (mg/L) 89 1409 2587,75 3510,25 4280,25 4659 5660,25 6077,75

Tempo (s) 0 60 120 180 240 300 360 420

Concentrao de sacarose 45g/L 0 1 2 3 4 5 6 7

Absorvncia 0,0135 0,7005 1,2375 1,7635 2,2235 2,4085 2,7035 2,7205

[] (mg/L) 80,25 1797,75 3140,25 4455,25 5605,25 6067,75 6805,25 6847,75

Tempo (s) 0 60 120 180 240 300 360 420

Concentrao de sacarose 60g/L

Absorvncia 0,008 0,64 1,311 1,828 2,221 2,535 2,672 2,809

[] (mg/L) 66,5 1646,5 3324 4616,5 5599 6384 6726,5 7069

Tempo (s) 0 60 120 180 240 300 360 420

0 1 2 3 4 5 6 7

Concentrao de sacarose 75g/L

Absorvncia 0,009 0,638 1,145 1,604 2,076 2,326 2,59 2,684

[] (mg/L) 69 1641,5 2909 4056,5 5236,5 5861,5 6521,5 6756,5

Tempo (s) 0 60 120 180 240 300 360 420

0 1 2 3 4 5 6 7

Concentrao de sacarose 100 g/L

Absorvncia 0,024 0,941 1,428 1,997 2,406 2,598 2,759 2,836

[] (mg/L) 106,5 2399 3616,5 5039 6061,5 6541,5 6944 7136,5

Tempo (s) 0 60 120 180 240 300 360 420

0 1 2 3 4 5 6 7

Desta forma, graficamente obtemos:

8

Conc de Aucares Reduzidos (g/L )

Conc.S acaros e 15g/L Conc.S acaros e 30g/L Conc.S acaros e 45g/L Conc.S acaros e 60g/L Conc.S acaros e 75g/L Conc.S acaros e 100g/L

0 0 1 2 3 4 Tempo (min) 5 6 7 8

Pelo clculo do declive das rectas anteriores obtm-se a curva de Michaelis-Menten:

1,8 1,6 1,4 1,2 1 Srie2 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 15 30 45 C onc. Sacaros e (g/L ) 60 75 100

Velcidades (g/L .min)

Desta forma (pela aplicao das frmulas apresentadas no sumrio), obtm-se: Km=11,5 g/L (33,6mM) Vmx=1,6 g/(L.min) Pela inverso dos valores dos eixos acima obtm-se o grfico de Lineweaver-Burk:
1,5

y = 6,806x + 0,5435

1,3

1,1

0,9

0,7 Srie1 Linear (Srie1)

0,5

0,3

0,1 -0,1 -0,05 0 0,05 0,1

-0,1

-0,3

-0,5 1/[ ]

Mais uma vez, pela aplicao das frmulas apresentadas no sumrio, obtm-se: Km=12,52 g/L (36,6mM) Vmx=1,84 g/(L.min)

Discusso
Os primeiros resultados obtidos evidenciaram, muito inicialmente, valores de velocidade mxima, uma vez que, a reaco deu-se muito depressa devido ao excesso de produto, ou seja, utilizou-se enzima em excesso, tendo-se, posteriormente, devido a tal acontecimento, diminudo a sua quantidade em 1/5. Quanto colorao obtida, verifica-se que, apenas para o tubo correspondente ao tempo zero esta no muda pois no foi adicionada invertase, que ao reagir provoca o escurecimento da soluo. Para a construo dos grficos e clculo das mdias foram desprezados valores, os correspondentes a tempos diferentes e valores em que a velocidade mxima era rapidamente atingida. Para o grfico da concentrao de aucares reduzidos (g/L) por unidade de tempo (s) foi desprezado um valor correspondente ao tubo 5 de concentrao 30g/L por apresentar um valor anmalo derivado a um erro de leitura. O valor terico de Km para a enzima invertase (segundo o Brenda) de 14,09 g/L (41,02mM). O valor obtido neste trabalho experimental foi diferente do valor terico possivelmente porque as condies requeridas para estipular um valor tabelado so muito mais exigentes e precisas do que as que conseguidas numa aula laboratorial. Por outro lado, foi tambm diferente o valor de Km obtido, dependendo este da representao utilizada a de Michaelis-Menten (Km=11,5 g/L (33,6mM)) ou a de Lineweaver-Burk (Km=12,52 g/L (36,6mM)) - devido diferente preciso dos mtodos. Contudo, verificase, nitidamente, que o valor obtido pela recta de Lineweaver-Burk bem mais aproximado ao terico, devido, precisamente, sua maior preciso. Vrias podem ter sido as razes que explicam a diferena entre os valores obtidos e os tericos, assim como a diferenas nos ensaios para iguais concentraes de sacarose. Destacam-se: - A impossibilidade de garantir que ao termostatizar a 45C a soluo de sacarose esta estivesse exactamente a 45, visto que o sistema partilhado por 4 grupos o que pode originar pequenas oscilaes de temperatura, assim como a impossibilidade de garantir que o banho de gua estivesse a 100C pelas mesmas razes. - O prprio facto de se agitar o tubo de forma diferente e durante tempos diferentes aps de adicionar a invertase pode influenciar o resultado, uma vez que, se formam agregados mais ou menos maiores;

- Mau manuseamento do material em especial das pipetas. Podem surgir erros ao pipetar e ao transferir para o recipiente; - O facto de ser impossvel cumprir escrupulosamente com os tempos estipulados no protocolo; - Aproximaes no tratamento dos resultados; - Erros de leitura no espectrofotmetro, nomeadamente, erros de paralaxe, uma vez que os valores foram lidos por ns; - O facto de terem sido desprezados vrios pontos no traado das rectas cujo declive d a velocidade. A escolha dos pontos pode no ter sido a mais correcta. Como as velocidades foram utilizadas na determinao das constantes cinticas, pode ter ocorrido propagao de erros. Contudo, apesar de todas as diferenas verificadas, pode concluir-se que se obteve valores aceitveis de Km e de velocidade mxima (constantes cinticas) pela leitura da recta de Lineweaver-Burk.

Bibliografia
Campos, Lus S., Entender a Bioqumica, 4 edio. Escolar Editora. Lisboa, 2005;