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dition scientifique Avril 2011

Mthodes
de dtection
et de dnombrement
de Legionella
dans leau
Avis de lAnses
Rapport dexpertise collective
dition scientifique Avril 2011
Mthodes
de dtection
et de dnombrement
de Legionella
dans leau
Caractristiques dtailles
et pertinence de leur mise
en uvre dans les eaux chaudes
sanitaires et les tours
arorfrigrantes
Avis de lAnses
Rapport dexpertise collective
Anses Saisine 2009-SA-330
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Le directeur g.n.raI
Maisons-Alfort, le 7 avril 2011,
AVIS
de I'Agence nationaIe de s.curit. sanitaire de I'aIimentation,
de I'environnement et du travaiI
reIatif Ia saisine M.thodes de d.tection et de d.nombrement de Legionella dans
I'eau
L'Anses a pour mission de contribuer [ assurer la szcuritz sanitaire dans les domaines de
l'alimentation, de l'environnement et du travail et d'zvaluer les risques sanitaires qu'ils
peuvent comporter.
Elle fournit aux autoritzs compztentes toutes les informations sur ces risques ainsi que
l'expertise et l'appui technique nzcessaires [ l'zlaboration des dispositions lzgislatives et
rzglementaires et [ la mise en uvre des mesures de gestion du risque (article L.1313-1
du Code de la santz publique).
1. PRESENTATION DE LA QUESTION POSEE
L'Agence franaise de s.curit. sanitaire de l'environnement et du travail (Afsset)
1
a .t.
saisie le 29 juillet 2009 par la Direction g.n.rale de la sant. (DGS) et la Direction g.n.rale
de la pr.vention des risques (DGPR) afin de :
1. D.crire les m.thodes pr.-analytiques (pr.paration de l'.chantillon avant analyse) et
analytiques connues pour la d.tection et le d.nombrement sp.cifique de l.gionelles dans
l'eau (culture, biologie mol.culaire (Polymerase Chain Reaction : PCR), immuno-d.tection,
etc.). Cette description avait notamment pour finalit. d'identifier les questions auxquelles
r.pondent les m.thodes et leurs limites th.oriques. Elle devait tre bas.e sur une
recherche bibliographique ;
2. Etudier la pertinence (avantages et inconv.nients) de la mise en 8uvre de ces
m.thodes analytiques pour le contr?le sanitaire des eaux chaudes et le contr?le
r.glementaire des eaux de circuits de refroidissement des tours a.ror.frig.rantes, en
fonction de leurs besoins et contraintes respectives :
D dans un premier temps, cette .tude devait viser analyser les avantages et
inconv.nients des diff.rentes m.thodes, notamment sur les questions des
contraintes de faisabilit. technique et des co`ts ;
D dans un second temps, si des m.thodes apportant une plus-value technique par
rapport la m.thode par culture .taient mises en .vidence, la pertinence de leur
mise en 8uvre dans le cadre des contr?les r.glementaires devait tre .valu.e.
S'agissant des m.thodes identifi.es, une r.flexion pouvait notamment tre men.e
concernant les seuils r.glementaires et, le cas .ch.ant, leur r.vision.
3. Si n.cessaire, identifier les essais exp.rimentaux permettant de v.rifier ou d'infirmer les
hypothses avanc.es concernant la pertinence des m.thodes recens.es, et le cas .chant
le lancement des .tudes n.cessaires.
1
L'Afsset et l'Agence franaise de s.curit. sanitaire des aliments (Afssa) ont fusionn. pour donner naissance l'Agence
nationale de s.curit. sanitaire (Anses), le 1
er
juillet 2010.
Agence nationale de s.curit. sanitaire de l'alimentation, de l'environnement et du travail,
27-31 av. du G.n.ral Leclerc, 94701 Maisons-Alfort Cedex - T.l.phone : + 33 (0)1 49 77 13 50 - T.l.copie : + 33 (0)1 46 77 26 26 - www.anses.fr
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2. CONTEXTE
L'incidence de la l.gionellose a diminu. en France depuis 2006 pour se stabiliser aux
alentours de 1200 cas d.clar.s par an (1206 cas enregistr.s en 2009, BEH n31-32 du 27
juillet 2010), grce notamment une meilleure identification des sources potentielles de
contamination.
La surveillance environnementale de Legionella spp. ou de Legionella pneumophila est
encadr.e par la r.glementation :
D elle est obligatoire :
U dans les eaux min.rales destin.es des usages th.rapeutiques dans les
.tablissements thermaux, une fois par mois aux points d'usage les plus sensibles
(arrt. 19 juin 2000)
1
U dans les tours a.ror.frig.rantes, une fois par mois (en cas d'autorisation) ou tous
les deux mois (en cas de d.claration) pendant la p.riode de fonctionnement de
l'installation (arrt.s du 13 d.cembre 2004)
;
2
U dans les r.seaux d'eau chaude sanitaire des .tablissements de sant., les
.tablissements sociaux et m.dico-sociaux d'h.bergement pour personnes g.es,
les autres .tablissements sociaux et m.dico-sociaux, les h?tels, les r.sidences
de tourisme, les campings et les .tablissements, p.nitentiaires une fois par an
aux points d'usage repr.sentatifs (arrt. du 1
er
f.vrier 2010)
;
3
D compter du 1er janvier 2012, l'arrt. du 1
er
f.vrier 2010 la rend obligatoire dans les
autres .tablissements recevant du public, une fois par an, aux points d'usage
repr.sentatifs des r.seaux d'eau chaude sanitaire.
;
Cette r.glementation impose l'utilisation de la m.thode par culture, telle que d.crite dans
la norme NF T90-431 "Recherche et d.nombrement de Legionella spp. et de Legionella
pneumophila par culture sur milieux g.los.s".
La DGS et la DGPR soulignent dans la lettre de saisine que la m.thode par culture, telle
que d.crite dans la norme NF T90-431, pr.sente certains inconv.nients :
D le rendu des r.sultats d.finitifs n.cessite un d.lai minimum de 8 jours aprs la mise
en culture (des r.sultats interm.diaires pouvant cependant tre rendus au bout de 3
5 jours). Ce d.lai peut poser des problmes pour la gestion des installations
concern.es, notamment pour lever des mesures restrictives d'utilisation d'eau ;
D l'ensemble des diff.rentes formes de Legionella potentiellement pr.sentes dans l'eau
n'est pas pris en compte par cette m.thode. En effet elle ne permet de d.nombrer que
les Legionella libres, viables et cultivables, dans les .chantillons d'eau.
3. ORGANISATION DE L'EXPERTISE
L'expertise a .t. r.alis.e dans le respect de la norme NF X 50-110 Qualit. en expertise
Prescriptions g.n.rales de comp.tence pour une expertise (Mai 2003) avec pour
objectif de respecter les points suivants : comp.tence, ind.pendance, transparence,
traabilit..
1
Arrt. du 19 juin 2000 modifiant lSarrt. du 14 octobre 1937 modifi. relatif au contr?le des sources dSeaux min.rales
2
Arrt. du 13 d.cembre 2004 relatif aux prescriptions g.n.rales applicables aux installations class.es pour la protection de
lSenvironnement soumises d.claration sous la rubrique n 2921 nstallations de refroidissement par dispersion dSeau dans
un flux dSair
Arrt. du 13 d.cembre 2004 relatif aux installations de refroidissement par dispersion dSeau dans un flux dSair soumises
autorisation au titre de la rubrique n 2921
3
Arrt. du 1er f.vrier 2010 relatif la surveillance des l.gionelles dans les installations de production, de stockage et de
distribution dSeau chaude sanitaire
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Ces probl.matiques relvent des comp.tences du comit. d'experts sp.cialis.es (CES)
.valuation des risques li.s aux eaux et aux agents biologiques . L'Anses a confi.
l'expertise au groupe de travail M.thodes de d.tection et de d.nombrement de
Legionella dans l'eau . Les travaux ont .t. soumis r.gulirement au CES tant sur les
aspects m.thodologiques que scientifiques. Ce dernier en a adopt. les conclusions le 25
f.vrier 2011.
Cette expertise est ainsi issue d'un collectif d'experts aux comp.tences compl.mentaires.
Le pr.sent avis se fonde pour les aspects scientifiques sur le rapport final issu de cette
expertise collective (M.thodes de d.tection et de d.nombrement de Legionella dans l'eau
- Caract.ristiques d.taill.es et pertinence de leur mise en 8uvre dans les eaux chaudes
sanitaires et les tours a.ror.frig.rantes).
4. ARGUMENTAIRE
Afin de r.pondre la saisine, l'expertise a pris en compte les .l.ments suivants.
4.1. Les espces de Legionella responsabIes de I.gioneIIoses
A ce jour 58 espces de bact.ries du genre Legionella ont .t. identifi.es. Ces espces
sont sub-divis.es en s.rogroupes (environ 70 s.rogroupes actuellement connus). En
France, Legionella pneumophila est responsable de 98 % des cas d.clar.s de
l.gionellose qui ont fait l'objet d'une identification aprs un pr.lvement pulmonaire
4
Des espces autres que Legionella pneumophila peuvent cependant tre l'origine de
l.gionelloses, en particulier chez les sujets dont l'immunit. est compromise (patients
haut risque
.
5
En revanche, la bibliographie ne met pas en .vidence de cas de l.gionellose li. une
espce autre que Legionella pneumophila qui soit imputable une tour a.ror.frig.rante.
Par ailleurs, les donn.es franaises ne mettent pas en .vidence de cas de l.gionellose
d.clar.e, imputable une Legionella d'une autre espce que pneumophila et qui aurait
pour origine la contamination d'une tour a.ror.frig.rante.
). Les souches responsables de certains de ces cas ont pu tre retrouv.es
dans des circuits d'eau chaude sanitaire utilis.s par, ou proximit. du malade.
N.anmoins, il faut souligner la difficult. que pr.sente l'identification de l'origine
environnementale des cas de l.gionellose. En France, oM le systme de surveillance des
l.gionelloses est trs d.velopp., cette origine reste cependant non identifi.e dans 80%
des cas.
Quoi qu'il en soit, d'un point de vue sanitaire, Legionella pneumophila apparat comme
l'espce la plus pertinente d.nombrer aussi bien dans les circuits d'eau chaude sanitaire
que dans les tours a.ror.frig.rantes.
4.2. Les bases sanitaires et techniques du choix des espces de Legionella
d.nombrer dans Ie cadre de Ia surveiIIance r.gIementaire
Les diff.rents textes r.glementaires qui encadrent la surveillance environnementale des
Legionella rendent obligatoire le d.nombrement de Legionella pneumophila, l'espce la
plus pertinente d'un point de vue sanitaire, l'exception des deux arrt.s du 13 d.cembre
2004 relatifs aux installations de refroidissement par dispersion d'eau dans un flux d'air
4
Pr.lvement des s.cr.tions respiratoires.
5
Circulaire DGS 2002 243, du 22 avril 2002 : les patients dits patients haut risque sont les immunod.prim.s s.vres,
et particulirement les immunod.prim.s aprs transplantation ou greffe dSorgane et les immunod.prim.s par corticoth.rapie
prolong.e (0,5 mg/kg de prednisone pendant 30 jours ou plus, ou .quivalent) ou r.cente et haute dose (cSest--dire
sup.rieure 5 mg/kg de prednisone pendant plus de 5 jours)
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soumises autorisation et d.claration, commun.ment appel.es tours a.ror.frig.rantes.
Ces deux arrt.s rendent obligatoire le d.nombrement de Legionella spp., alors que ce
choix n'est pas .tay. d'un point de vue sanitaire.
D'un point de vue technique, le d.nombrement de Legionella spp. peut n.anmoins avoir
une utilit. pour les gestionnaires d'installations, notamment pour d.tecter des
dysfonctionnements. Toutefois, cette question n'a pas fait l'objet d'une r.flexion
approfondie dans le cadre de la pr.sente expertise.
4.3. Critres prendre en compte pour .vaIuer une m.thode de d.nombrement de
Legionella
La performance attendue d'une m.thode de d.nombrement de micro-organismes en
routine est .valu.e sur la base des critres commun.ment admis suivants : s.lectivit.,
sp.cificit., sensibilit., r.p.tabilit., reproductibilit., justesse, fid.lit., rendement. Dans le
contexte particulier des eaux chaudes sanitaires et des tours a.ror.frig.rantes, des
critres suppl.mentaires devront tre pris en compte. Ces critres ont .t. r.pertori.s et
hi.rarchis.s. ls concernent :
D le d.nombrement sp.cifique des Legionella (Legionella spp., Legionella pneumophila,
Legionella pneumophila du s.rogroupe 1, autres s.rogroupes, etc.) ;
D l'.tat physiologique des Legionella d.tect.es ;
D l'interpr.tation des r.sultats ;
D les champs d'application des m.thodes (types d'eau, etc.).
La liste d.taill.e et la hi.rarchisation de ces critres sont pr.sent.es dans le rapport
d'expertise et la note de synthse associ.s cet avis.
Le critre de co`t est important prendre en compte dans le choix d'une m.thode
analytique. Cependant, dans le cas pr.sent, il doit tre consid.r. comme moins prioritaire
que la pertinence d'une m.thode de d.nombrement des l.gionelles dans l'eau pour
assurer une surveillance sanitaire efficace des eaux chaudes sanitaires et des tours
a.ror.frig.rantes. Les co`ts des m.thodes plus particulirement investigu.es sont
aujourd'hui du mme ordre de grandeur mais sont par ailleurs susceptibles d'.voluer en
fonction des d.veloppements venir. Ce critre .conomique n'a donc pas .t. pris en
compte dans le cadre de cette expertise et il pourra tre .valu. une fois l'efficacit. des
techniques bien document.e : caract.ristiques intrinsques et capacit. r.pondre aux
besoins des utilisateurs en routine.
4.4. Les m.thodes .vaIu.es
L'analyse des avantages et inconv.nients propres chaque m.thode a .t. r.alis.e au
regard des critres .voqu.s dans le chapitre 4.3. Elle a .t. appliqu.e :
D aux .tapes de pr.traitement n.cessaires : filtration, centrifugation, s.paration
immuno-magn.tique.
D aux m.thodes de d.nombrement sp.cifiques de Legionella bas.es sur un principe
unique :
U croissance : culture, Direct Viable Count (DVC), etc. ;
U amplification g.nique : PCR quantitative en temps r.el (q-PCR), PCR Viable (v-
PCR), etc. ;
U affinit. mol.culaire (immuno-d.tection, hybridation in situ par mol.cules
fluorescentes (FSH), etc. ;
D aux m.thodes de d.nombrement sp.cifiques de Legionella bas.es sur plusieurs
principes : mmunological double-staining (DS), culture-FSH, et d'autres .volutions
possibles (DVC-FSH, Desorption-ionisation laser assist.e par matrice (MALD-TOF),
Chromatographie liquide haute pression en condition d.naturante (dHPLC) coupl.e
la PCR, S.paration immuno-magn.tique (MS) - ATP-m.trie) ;
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D aux techniques d'analyses compl.mentaires : analyse de la flore totale (culture, ATP-
m.trie), d.tection des amibes, analyse du biofilm, des a.rosols.
Le d.tail de la description des m.thodes figure dans le rapport d'expertise. De l'analyse
des avantages et des inconv.nients propres chaque m.thode, il ressort que les
m.thodes qui rassemblent le plus grand nombre d'avantages sont : la culture, la q-PCR et,
pour autant qu'on puisse la juger compte tenu du peu d'exemples d'utilisation publi.s, la v-
PCR. Cependant ce criblage trs factuel ne prend pas en compte les niveaux de
d.veloppement respectifs, parfois trs diff.rents, de chacune des m.thodes et leur
ad.quation une application en routine.
4.5. Les m.thodes pertinentes pour une utiIisation en routine court terme
Le choix d'une m.thode de d.nombrement ne peut se fonder seulement sur ses
avantages et ses inconv.nients intrinsques. En effet, certains avantages identifi.s
l'.chelon exp.rimental peuvent tre pris en d.faut lorsque la m.thode est confront.e aux
r.alit.s du terrain. Aussi, il apparat important de prendre en compte le niveau de
d.veloppement de la m.thode : standardisation du protocole, confirmation de ses
performances par diff.rents laboratoires, application possible diff.rents types
d'.chantillons environnementaux, robustesse, existence de standards et d'.talons, etc.
Pour une application en routine dans le cadre de la surveillance r.glementaire, il importe
de disposer d'une m.thode .prouv.e, dont le protocole est valid. par de nombreux
laboratoires et sur un grand nombre d'.chantillons. Actuellement, seules les m.thodes de
d.nombrement des Legionella dans l'eau par culture (normes NF T90-431 et NF EN SO
11731-2
6
D'autres m.thodes semblent prometteuses mais elles demandent tre d.velopp.es,
stabilis.es et test.es grande .chelle, avant d'envisager leur application en routine.
) et par q-PCR (norme NF T90-471) offrent ces garanties, ces deux normes
int.grant le pr.traitement des .chantillons. Les recommandations en vue d'une mise en
8uvre court terme dans un cadre r.glementaire ne peuvent donc raisonnablement
porter que sur la culture et la q-PCR.
4.6. Choix des critres d'interpr.tation des r.suItats seIon Ies m.thodes
L'utilisation d'une m.thode analytique va de pair avec la d.finition de critres
d'interpr.tation de ses r.sultats. Aussi, avant d'envisager l'utilisation d'une m.thode de
d.nombrement de Legionella, dans le cadre de la surveillance sanitaire des eaux chaudes
sanitaires et des tours a.ror.frig.rantes, il apparat n.cessaire de fixer des valeurs cibles
au-del desquelles des actions de gestion pourraient tre envisag.es.
A l'heure actuelle, ces valeurs cibles ne peuvent pas tre bas.es sur les seules donn.es
.pid.miologiques du fait :
D du peu de publications disponibles sur le sujet et des fortes incertitudes qu'elles
mettent en .vidence ;
D de la difficult. d'identification de l'origine environnementale des cas de l.gionellose
(possible dans 20% des cas d.clar.s) ;
D du grand nombre de facteurs autres que la concentration en Legionella pneumophila
dans l'eau des installations intervenant dans la survenue des l.gionelloses
(m.t.orologie, taille des gouttelettes produites par les installations, .tat de viabilit. et
de virulence des souches de Legionella pr.sentes dans l'eau, etc.).
Aussi, la d.termination des valeurs cibles doit se fonder sur une approche pragmatique,
en exploitant les .l.ments disponibles.
6
Etant donn. le peu d'exemples d'application de la norme NF EN SO 11731-2 en France, les pr.sentes recommandations
sont essentiellement bas.es sur la norme NF T90-431.
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4.6.1.VaIeurs cibIes pour Ia m.thode par cuIture
En 2001, le Conseil sup.rieur d'hygine publique de France (CSHPF) a propos. des
valeurs cibles, sur la base des connaissances scientifiques et des observations de terrain
disponibles la date de cette proposition. Les valeurs cibles propos.es n'.taient pas
fond.es sur une dose-r.ponse
7
Ces valeurs cibles ont .t. reprises dans la r.glementation franaise.
chez l'homme.
D Dans le cas des eaux chaudes sanitaires
Pour la population g.n.rale, la r.glementation franaise en vigueur, fixe la vaIeur cibIe en
L. pneumophila 10
3
UFC/L.
Pour les patients haut risque (immunod.prim.s), la r.glementation pr.conise de ne pas
d.passer le seuil de d.tection de la m.thode par culture (selon la norme NF T90-431).
Selon les donn.es de la litt.rature, la concentration en L. pneumophila en dessous de
laquelle le risque de l.gionellose est n.gligeable ou acceptable pour la population
g.n.rale est comprise entre 10
4
ou 10
5
UFC/L dans les eaux chaudes sanitaires, malgr.
l'absence de dose-r.ponse connue chez l'homme.
L'examen de la bibliographie et les auditions d'acteurs du systme de surveillance des
Legionella dans les eaux chaudes sanitaires n'ont pas mis en .vidence d'argument
justifiant, d'un point de vue sanitaire, une modification de ces valeurs cibles.
D Dans le cas des tours a.ror.frig.rantes
La r.glementation franaise en vigueur, concernant les tours a.ror.frig.rantes, fixe des
vaIeurs cibIes en Legionella spp. :
- seuil d'acceptabilit. de l'eau d'appoint : limite de quantification de la m.thode
normalis.e utilis.e ;
- seuil d'action pour l'eau de l'installation : 10
3
UFC/L ;
- seuil d'arrt pour l'eau de l'installation : 10
5
UFC/L.
La litt.rature et les auditions d'acteurs du systme de surveillance des tours
a.ror.frig.rantes mettent en .vidence une difficult. d'interpr.tation des r.sultats li.e au
choix de la cible du d.nombrement. En effet, l'espce responsable de la plupart des cas
de l.gionelloses d.clar.s .tant Legionella pneumophila, il est difficile d'interpr.ter un
d.passement de seuil en Legionella. spp. d'un point de vue sanitaire. Ces valeurs doivent
avant tout tre consid.r.es comme des valeurs de gestion.
4.6.2.VaIeurs cibIes pour Ia m.thode par q-PCR
Le niveau de connaissance actuel ne permet pas d'.tablir une valeur cible de L.
pneumophila la q-PCR (en UG/L) sur les bases d'une dose r.ponse chez l'homme.
Cependant, les b.n.fices sanitaires potentiels de l'utilisation de la q-PCR, du simple fait
de la rapidit. de sa mise en 8uvre et de l'obtention de r.sultats sp.cifiques de L.
pneumophila, incitent mettre en place les outils permettant l'utilisation de cette technique
en routine. En effet, dans de nombreux cas, elle permettrait de d.tecter et donc de g.rer la
contamination d'une installation beaucoup plus rapidement que la m.thode par culture.
Dans ce contexte, l'.tablissement de valeurs cibles est primordial.
Les seuls r.f.rentiels actuels sont les valeurs cibles d.j pr.sentes dans la r.glementation
pour la m.thode par culture. Les retours d'exp.rience li.s leur utilisation pour la
surveillance des l.gionelles dans l'eau ne mettent pas en .vidence la n.cessit. de les
modifier. l apparat donc raisonnable de d.finir les valeurs cibles applicables la q-PCR
7
Relation sp.cifique d'une voie entre des niveaux d'exposition un agent dangereux et l'indice observ. d'un
effet donn..
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de manire ce que le taux de r.sultats sup.rieurs ces valeurs cibles, obtenues avec
une mme s.rie de pr.lvement, soit .quivalent pour la culture et pour la q-PCR.
Cependant les unit.s des diff.rentes m.thodes de d.nombrement de Legionella
apparaissent h.t.rognes et difficilement comparables : unit.s g.nomes/L (UG/L) pour les
m.thodes par biologie mol.culaire et unit.s formant colonies/L (UFC/L) pour les m.thodes
par culture. En l'absence de donn.es publi.es, les valeurs propos.es sont principalement
bas.es sur les r.sultats de la surveillance des l.gionelles dans l'environnement, pr.sent.s
par deux acteurs auditionn.s.
D Dans le cas des eaux chaudes sanitaires
Sur la base de ce raisonnement des valeurs cibles peuvent tre .labor.es pour les points
d'usage risque
8
En ce qui concerne les points d'usage risque utilis.s par des patients haut risque dans
les .tablissements de sant., pour assurer une protection sanitaire maximale, il semble
raisonnable de proposer des valeurs cibles .gales au seuil de d.tection de la m.thode.
dans les .tablissements recevant du public, l'exclusion de ceux utilis.s
par des patients haut risque.
D Dans le cas des tours a.ror.frig.rantes
L'.tablissement de valeurs cibles en Legionella. spp., adapt.es la q-PCR, pourrait tre
envisag. sur la base du raisonnement d.velopp. ci-dessus.
Cependant, certains essais montrent une bien meilleure concordance relative entre les
r.sultats obtenus par culture et par q-PCR pour le d.nombrement de L. pneumophila que
pour celui de Legionella. spp. D'un point de vue analytique, il semble donc plus adapt. de
d.terminer une valeur cible en L. pneumophila pour la q-PCR.
D'un point de sanitaire, l'.tablissement de valeurs cibles en L. pneumophila apparat
.galement plus pertinent.
Les valeurs r.glementaires actuelles en Legionella. spp. pourraient tre consid.r.es plus
protectrices d'un point de vue sanitaire que les mmes valeurs appliqu.es L.
pneumophila, dans la mesure oM ces dernires font partie des Legionella spp. On
rappellera n.anmoins que :
- ce jour, aucune autre espce que L. pneumophila n'a pu tre identifi.e chez un
patient atteint de l.gionellose, dont l'origine de la contamination ait .t. attribu.e
une tour a.ror.frig.rante ;
- la proportion de L. pneumophila parmi les Legionella spp. varie fortement dans le
temps et il n'existe pas d'outil fiable permettant de la pr.voir.
Aussi, il parat fond. de proposer aujourd'hui des valeurs cibles en L. pneumophila, pour la
surveillance sanitaire des tours a.ror.frig.rantes, aussi bien pour la m.thode par culture
que pour la m.thode par q-PCR.
Ce dispositif pr.sente trois avantages importants :
- d'un point de vue sanitaire :
U faciliter l'interpr.tation des r.sultats de surveillance ;
U ouvrir la possibilit. d'utiliser la q-PCR pour la surveillance des tours
a.ror.frig.rantes, pour b.n.ficier de la grande r.activit. de cette technique,
avec la possibilit. de d.tecter une contamination beaucoup plus rapidement
que ce n'est le cas actuellement ;
8
L'arrt. du 1er f.vrier 2010 relatif la surveillance des l.gionelles dans les installations de production, de stockage et de
distribution d'eau chaude sanitaire, d.finit point d'usage risque comme tout point d'usage accessible au public et
pouvant produire des azrosols d'eau chaude sanitaire susceptible d'tre contaminze par les lzgionelles ; il s'agit notamment
des douches, des douchettes, des bains [ remous ou [ jets. L
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- du point de vue de la gestion des installations : le choix de d.nombrer L.
pneumophila dans les tours a.ror.frig.rantes la place de Legionella spp.
permettrait :
U d'arrter les installations uniquement pour une raison sanitaire. Le nombre
d'arrts de fonctionnement des tours a.ror.frig.rantes sans fondement
sanitaire s'en verrait significativement r.duit ;
U de v.rifier plus rapidement l'efficacit. des actions correctives men.es en cas
d'arrt d'une installation.
5. CONCLUSIONS ET RECOMMANDATIONS
Les conclusions et recommandations qui suivent sont bas.es sur les arguments
d.velopp.s dans le chapitre pr.c.dent. Pour autant, ces conclusions ne r.sultent pas
d'une .valuation des risques sanitaires, ce qui n'.tait pas l'objet de la saisine.
5.1. ConcIusions et recommandations court terme
5.1.1. Choix d'une m.thode appIicabIe aux eaux chaudes sanitaires et aux eaux des
tours a.ror.frig.rantes
En situation de surveiIIance de routine, dans lesquels les d.lais de recueil des r.sultats
d'analyse ne constituent pas un critre prioritaire, il est recommand. de laisser le choix au
gestionnaire d'utiliser, soit Ia m.thode par cuIture, soit Ia m.thode par q-PCR. Ce
choix pourra tre fait selon l'accessibilit. de la m.thode d'analyse, la pr.sence ou non
d'inhibiteurs dans l'eau, la pr.sence de flore interf.rente, etc. En cas de d.passement
des vaIeurs cibIes r.gIementaires, lorsque l'analyse aura .t. r.alis.e par q-PCR, il est
pr.conis. une mise en culture de l'.chantillon, afin de disposer de la souche d.nombr.e,
en vue d'.ventuelles analyses compl.mentaires.
En situation d'urgence sanitaire, en pr.sence de cas group.s de I.gioneIIose ou de
cas nosocomiaI, il est recommand. d'utiliser la m.thode qui fournira Ies r.suItats
dans Ie temps Ie pIus court. La m.thode de q-PCR semble appropri.e dans ce cas, au
regard de la rapidit. d'obtention de ses r.sultats. Un d.nombrement par q-PCR doit, dans
ce cas, tre compl.t. par la mise en culture d'une partie des .chantillons pr.lev.s, afin de
confronter les souches environnementales et cliniques lorsqu'elles sont disponibles. Au
cas oM la q-PCR ne serait pas disponible, la m.thode par culture est pr.conis.e. Elle
devra inclure l'identification du s.rogroupe en pr.sence d'une l.gionellose L.
pneumophila, ou l'identification de l'espce dans le cas d'une l.gionellose Legionella
spp.
5.1.2. Propositions de vaIeurs cibIes
Les valeurs cibles propos.es reposent sur un avis d'expert, en l'.tat actuel des
connaissances. Elles sont propos.es dans l'objectif d'am.liorer le niveau de s.curit.
sanitaire.
Les valeurs cibles propos.es pour la q-PCR n.cessitent d'tre consolid.es durant une
p.riode probatoire, pendant laquelle une .tude m.trologique devrait tre men.e afin de
comparer les r.sultats d'analyse obtenus avec les deux m.thodes utilis.es en parallle
portant sur un nombre suffisant d'.chantillons.
Les valeurs propos.es sont propres chaque m.thode. Elles visent cependant atteindre
les mmes objectifs en termes de gestion des risques.
Anses Saisine 2009-SA-330
9 / 12
5.1.2.1. Eaux chaudes sanitaires
D En situation de surveiIIance de routine
Comme justifi. pr.c.demment, pour la surveillance des eaux chaudes sanitaires, l'agence
propose des valeurs cibles en L. pneumophila (tableau 1).
TabIeau 1 : synthse des vaIeurs cibIes en L. pneumophila proposzes pour la qPCR,
compar.es aux vaIeurs r.gIementaires par cuIture
CuIture q-PCR
Dans le cas des eaux destin.es la consommation humaine fournies
au niveau de points d'usage risque
9
dans des .tablissements
recevant du public, l'exclusion de ceux utilis.s par des patients
haut risque
10
10
3
UFC /L
dans les .tablissements de sant.
5.10
3
UG /L
Dans le cas des eaux destin.es la consommation humaine fournies
au niveau de points d'usage risque utilis.s par des patients haut
risque dans les .tablissements de sant.
Limite de
d.tection
Limite de
d.tection
D'un point de vue sanitaire, concernant les points d'usage risque utilis.s par des patients
haut risque, il est recommand. en plus de la surveillance de Legionella pneumophila, de
proc.der des analyses .tendues au genre Legionella et toutes autres bact.ries
pathognes, quelle que soit la m.thode analytique utilis.e : culture ou q-PCR.
D En situation de surveiIIance aprs une d.contamination
Le circulaire DGS 2002 / 243 du 22 avril 2002 requiert une v.rification de l'efficacit. d'une
d.contamination chimique ou thermique, par le d.nombrement de L. pneumophila dans un
.chantillon pr.lev. quelques jours aprs le traitement. Le fascicule de documentation FD
T90-522, "Guide technique de pr.lvement pour la recherche de Legionella dans les eaux"
(2006), pr.conise de r.aliser le pr.lvement au minimum 48 heures aprs un traitement
de d.contamination choc, afin de minimiser les faux positifs (en q-PCR) et n.gatifs (en
culture).
L'Anses souligne l'importance du respect de la pr.conisation ci-dessus pour obtenir des
r.sultats de d.nombrement de Legionella interpr.tables.
Le choix de la m.thode de d.nombrement la plus appropri.e, culture ou q-PCR, peut tre
laiss. la discr.tion du gestionnaire de l'installation. Dans le cas de la culture, comme
dans celui de la q-PCR, la d.contamination pourra tre consid.r.e suffisante si le r.sultat
de l'analyse met en .vidence un nombre de L. pneumophila inf.rieur ou .gal la valeur
cible pr.c.demment propos.e (tableau 1). Dans le cas contraire, l'Anses recommande de
nouvelles actions de gestion jusqu' ce que les analyses fassent .tat de r.sultats
inf.rieurs cette valeur cible.
9
L'arrt. du 1er f.vrier 2010 relatif la surveillance des l.gionelles dans les installations de production, de stockage et de
distribution d'eau chaude sanitaire, d.finit point d'usage risque comme tout point d'usage accessible au public et
pouvant produire des azrosols d'eau chaude sanitaire susceptible d'tre contaminze par les lzgionelles ; il s'agit notamment
des douches, des douchettes, des bains [ remous ou [ jets. L
10
Circulaire DGS 2002 243, du 22 avril 2002 : les patients dits patients haut risque sont les immunod.prim.s
s.vres, et particulirement les immunod.prim.s aprs transplantation ou greffe dSorgane et les immunod.prim.s par
corticoth.rapie prolong.e (0,5 mg/kg de prednisone pendant 30 jours ou plus, ou .quivalent) ou r.cente et haute dose
(cSest--dire sup.rieure 5 mg/kg de prednisone pendant plus de 5 jours)
Anses Saisine 2009-SA-330
10 / 12
5.1.2.2. Eaux de tour a.ror.frig.rante
D En situation de surveiIIance de routine
Comme justifi. pr.c.demment, pour la surveillance des tours a.ror.frig.rantes, l'agence
propose des valeurs cibles en L. pneumophila (tableau 2).
TabIeau 2 : vaIeurs cibIes en L. pneumophila propos.es
CuIture q-PCR
Eau d'appoint : valeur cible
Limite de
quantification
Limite de
quantification
Eau de l'installation :
V valeur cible d'action
V valeur cible d'arrt
10
3
UFC /L
10
5
UFC /L
5.10
3
UG /L
5.10
5
UG /L
D'un point de vue technique, le suivi de Legionella spp. peut pr.senter un int.rt pour les
gestionnaires d'installation, notamment pour d.tecter des dysfonctionnements ou limiter
les d.rives de concentration en microorganismes, en particulier celles li.es aux Legionella
autres que pneumophila.
Par mesure de prudence, le remplacement .ventuel des seuils r.glementaires actuels, en
Legionella spp., par les valeurs cibles propos.es ci-dessus m.riterait d'tre subordonn.
une .valuation de la pertinence des modalit.s de surveillance et de gestion des
prolif.rations microbiennes dans les tours a.ror.frig.rantes. LSopportunit. du suivi
sp.cifique de Legionella spp. parmi les paramtres de surveillance devrait tre .galement
consid.r.e cette occasion.
Une augmentation relative de 2 log ou plus de la concentration en Legionella spp. dans
l'eau de l'installation par rapport l'eau d'appoint, pourrait titre d'exemple, constituer un
indicateur de dysfonctionnement de la tour a.ror.frig.rante. Le mme principe de suivi
d'une variation relative pourrait, par ailleurs, s'appliquer d'autres indicateurs bact.riens,
plus g.n.raux, tels que l'ATP-m.trie.
D En situation de surveiIIance aprs une d.contamination
En cas de d.contamination dSune installation d.j lSarrt, suite une contamination
excessive ou un cas de l.gionellose, la r.glementation recommande de rincer les circuits
afin dS.vacuer les bact.ries pr.sentes dans l'eau et, le cas .ch.ant, les r.sidus de
produits chimiques. Les proc.dures de d.sinfection sp.cifient que l'absence de r.sidus de
d.sinfection doit tre v.rifi.e aprs le rinage.
Dans ces conditions, le d.nombrement de Legionella sera peu perturb. par la pr.sence
de d.sinfectant (s'agissant de la m.thode par culture) ou la pr.sence de bact.ries mortes
(s'agissant de la m.thode par q-PCR). l est recommand. de laisser au gestionnaire le
choix de la m.thode (culture ou q-PCR).
5.1.3. Besoins d'.tudes et de recherches
En ce qui concerne la q-PCR et la culture, il convient de mener une .tude comparative sur
diff.rentes qualit.s d'eaux (Eaux chaudes sanitaires et tours a.ror.frig.rantes), avec un
grand nombre d'.chantillons, afin de tester et le cas .ch.ant d'affiner les valeurs cibles
propos.es dans le cadre de cette expertise.
5.2. ConcIusions et recommandations moyen et Iong termes
D De l'analyse des diff.rentes m.thodes, il ressort qu'actuellement, aucune des
m.thodes alternatives la culture et la q-PCR ne r.pond tous Ies besoins
Anses Saisine 2009-SA-330
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exprim.s en lien avec les critres sp.cifiques d.taill.s dans le rapport d'expertise,
pour le d.nombrement de Legionella dans les eaux chaudes sanitaires et les tours
a.ror.frig.rantes. Cependant, les principes et objectifs de certaines permettent
d'envisager de repousser certaines des limites, il est donc important d'encourager leur
d.veloppement :
U la q-PCR, la v-PCR, la culture, le FSH et l'DS pourraient, sous certaines
conditions, permettre une prise en compte des Legionella intra-amibiennes ou
intra-v.siculaires dans la quantification ;
U la DVC, la v-PCR, l'DS, le DVC-FSH ou la culture-FSH semblent permettre de
d.tecter uniquement les bact.ries viables ou de distinguer les bact.ries viables
et non viables ;
U la q-PCR, la v-PCR, l'immuno-d.tection, le FSH, et l'DS pourraient permettre
de d.tecter l'ensemble des Legionella viables et potentiellement pathognes ;
U la DVC, la q-PCR, la v-PCR, l'immuno-d.tection, le FSH, et l'DS permettent
une obtention relativement rapide des r.sultats d'analyse ;
U le d.lai d'obtention des r.sultats par culture pourrait tre r.duit par une
optimisation des milieux de culture ;
U l'immuno-d.tection, le FSH, l'DS, la q-PCR et la culture-FSH pourraient
permettre d'am.liorer la distinction et la quantification des s.rogroupes de L.
pneumophila autres que le s.rogroupe 1.
D Besoins d'ztudes et de recherches
A titre indicatif et sans tre exhaustif, l'agence suggre des pistes d'.tudes et de
recherches sur les thmes suivants :
Am.liorer les connaissances sur la pathog.nicit. des Legionella viables non cultivables
ainsi que leur dose infectieuse et sur la d.tection et la pathog.nicit. des diff.rents clones
de L. pneumophila sg1 identifi.s.
Pathogznicitz et gznomique
D.velopper des m.thodes de pr.lvement et d'.chantillonnage applicables aux a.rosols
et aux biofilms.
Przlvement et zchantillonnage
D.velopper et optimiser le pr.-traitement des .chantillons afin de l'adapter aux
caract.ristiques de la m.thode de d.tection pourraient permettre d'am.liorer le rendement
du d.nombrement de Legionella.
Prz-traitement des zchantillons
D.velopper des techniques de capture des bact.ries par le biais d'anticorps sp.cifiques
(s.paration immuno-magn.tique, etc.) dans le cas des eaux trs charg.es pour lesquelles
le d.nombrement reste probl.matique, quelque soit la m.thode d'analyse.
Etudier la s.lectivit. des diff.rents milieux de culture vis--vis des diff.rentes espces et
sous-types de Legionella.
Techniques analytiques
Mettre au point de nouveaux milieux de culture plus adapt.s la croissance de la fraction
non cultivable, pour am.liorer la m.thode par culture. Afin de rendre plus efficace la
discrimination entre Legionella et la flore interf.rente, de nouveaux antibiotiques devront
tre d.velopp.s.
S'agissant de la q-PCR, encourager les d.veloppements visant limiter l'impact des
inhibiteurs et optimiser l'.tape d'extraction de l'acide d.soxyribonucl.ique (ADN).
Anses Saisine 2009-SA-330
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La v-PCR pourrait fournir des informations sur l'.tat de viabilit. des bact.ries. Des .tudes
visant tester cette m.thode sur des eaux environnementales sont n.cessaires pour
v.rifier son potentiel.
L'hybridation mol.culaire peut .galement contribuer r.pondre au problme du
d.nombrement de Legionella dans des eaux trs charg.es. Elle est moins sensible aux
inhibiteurs que l'amplification g.nique et permet par ailleurs de d.tecter aussi bien les
cellules cultivables que les VBNC. Son d.veloppement est encourager.
Encourager le d.veloppement d'outils analytiques utilisables sur site afin de g.n.rer le
plus rapidement possible des r.ponses permettant d'am.liorer l'efficacit. de la
surveillance de la qualit. des eaux des installations.
Outils utilisables sur site
Les .cosystmes des l.gionelles sont encore mal caract.ris.s. Des .tudes
compl.mentaires sur les conditions environnementales permettraient de faire progresser
les connaissances dans ce domaine.
Matrices et zcosystmes
Bien que l'eau soit la source principale de contamination, les a.rosols sont la source
principale de diffusion de Legionella. Le comportement des Legionella dans les a.rosols
est encore trop m.connu et requiert des .tudes suppl.mentaires.
Des .tudes portant sur les .cosystmes microbiens complexes permettraient de faire
progresser les connaissances dans ce domaine et en particulier, l'.tude des biofilms et de
leur capacit. servir de r.servoir aux Legionella.
Etudier la contribution des protozoaires au d.veloppement des Legionella dans les
installations risque.
Des .tudes visant comparer les strat.gies de suivi des installations, au moyen de
diff.rentes m.thodes de d.nombrement, notamment la culture et la q-PCR, sont
encourag.es, pour optimiser les d.lais entre les traitements de d.contamination et les
pr.lvements.
Mettre en 8uvre des .tudes comparatives prenant en compte les diff.rentes m.thodes
ds que leur protocole est suffisamment standardis..
Interprztation des rzsultats
Lorsque plusieurs m.thodes auront atteint un niveau de d.veloppement et de robustesse
similaire, il semble pertinent d'introduire dans l'analyse le critre .conomique. l sera alors
envisageable d'.valuer le co`t / b.n.fice de leur utilisation, dans le contexte d'analyse de
routine pour la surveillance des eaux chaudes sanitaires et des tours a.ror.frig.rantes.
Pour cela, il conviendrait au-del du simple co`t analytique unitaire de disposer
d'estimations compl.mentaires concernant notamment le co`t sanitaire suppl.mentaire li.
la l.gionellose en cas de d.faut de surveillance des installations.
Aspect zconomique
Fait en six exemplaires,
Le Directeur g.n.raI
Marc Mortureux
Anses
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M.thodes de d.tection et de d.nombrement de
Legionella dans I'eau
Caract.ristiques d.taiII.es et pertinence de Ieur mise en 8uvre dans Ies eaux
chaudes sanitaires et Ies tours a.ror.frig.rantes
Saisine : 2009-SA-330
i_MMOKI
Comit. d'expert sp.ciaIis. "EvaIuation des risques Ii.s aux eaux et aux agents
bioIogiques"
Groupe de travaiI "M.thode de d.tection et de d.nombrement de Legionella
dans I'eau"
Version du 25/02/2011
Anses
F.vrier 2011 page 2 / 144
Mots cI.s
M.thodes analytiques, d.nombrement, Legionella, Legionella pneumophila, Legionella spp., eaux,
eaux chaudes sanitaires, tours a.ror.frig.rantes, seuils.
Anses
F.vrier 2011 page 3 / 144
TabIe des matires
Table des matires .................................................................................................................................. 3
Expertise collective : synthse et conclusions ........................................................................................ 5
Pr.sentation des intervenants............................................................................................................... 19
Abr.viations et acronymes .................................................................................................................... 23
ntroduction............................................................................................................................................ 25
Contexte ................................................................................................................................................ 25
Objet de la saisine................................................................................................................................. 26
Modalit.s de traitement : moyens mis en 8uvre et organisation.......................................................... 26
1 Description et sp.cificit.s du genre Legionella ............................................................................ 28
1.1 Caract.ristiques g.n.rales....................................................................................................... 28
1.2 Association de Legionella avec d'autres composantes du milieu............................................ 28
1.2.1 Association avec les protozoaires ................................................................................. 28
1.2.2 Association avec le biofilm ............................................................................................ 30
1.3 M.canismes conduisant la contraction d'une l.gionellose ................................................... 31
1.4 Pertinence du d.nombrement de Legionella versus d.tection ................................................ 31
1.5 Pertinence de la recherche de L. pneumophila versus L. spp ................................................. 32
1.6 Signification sanitaire de la pr.sence de Legionella viables non cultivables........................... 33
2 D.finitions des paramtres de caract.risation et de choix des m.thodes d'analyses ................. 35
2.1 Paramtres de performances................................................................................................... 35
2.1.1 Justesse......................................................................................................................... 35
2.1.2 Fid.lit. ........................................................................................................................... 36
2.1.3 Sensibilit. ...................................................................................................................... 37
2.1.4 Sp.cificit. et s.lectivit. ................................................................................................. 38
2.1.5 Rendement .................................................................................................................... 39
2.1.6 Lin.arit.......................................................................................................................... 39
2.2 Autres paramtres de choix d'une m.thode analytique........................................................... 39
2.2.1 Rapidit........................................................................................................................... 39
2.2.2 Champ dSapplication ...................................................................................................... 39
2.2.3 Robustesse.................................................................................................................... 40
2.2.4 Simplicit. ....................................................................................................................... 40
3 Attentes relatives une m.thode de d.nombrement de Legionella dans l'eau........................... 41
4 Description des .tapes de pr.paration et de pr.traitement des .chantillons pr.alables un
d.nombrement de Legionella................................................................................................................ 43
4.1 Echantillonnage........................................................................................................................ 43
4.2 Etape de concentration............................................................................................................. 43
4.2.1 Filtration......................................................................................................................... 43
4.2.2 Centrifugation ................................................................................................................ 44
4.2.3 S.paration immuno-magn.tique (MS) ......................................................................... 45
5 Description des m.thodes de d.nombrement s.lectives de Legionella utilisant un principe
unique.................................................................................................................................................... 46
5.1 M.thodes bas.es sur la croissance. ........................................................................................ 46
5.1.1 Culture ........................................................................................................................... 46
5.1.2 Direct Viable Count (DVC)............................................................................................. 50
5.1.3 Evolutions possibles des m.thodes bas.es sur la croissance, peu ou pas test.es pour
rechercher Legionella dans l'eau.................................................................................................. 52
5.2 M.thodes bas.es sur lSamplification g.nique........................................................................... 53
5.2.1 R.action de polym.risation en chane quantitative en temps r.el (q-PCR) ................. 53
5.2.2 PCR viable (v-PCR)....................................................................................................... 58
5.2.3 Evolutions possibles des m.thodes bas.es sur l'amplification g.nique, peu ou pas
test.es pour rechercher Legionella dans l'eau............................................................................. 61
5.3 M.thodes bas.es sur lSaffinit. mol.culaire .............................................................................. 63
5.3.1 mmuno-d.tection.......................................................................................................... 63
5.3.2 Fluorescence In Situ Hybridation (FSH) ....................................................................... 66
5.3.3 Evolutions possibles des m.thodes bas.es sur l'affinit. mol.culaire, peu ou pas
test.es pour rechercher Legionella dans l'eau............................................................................. 68
6 Description des m.thodes de d.nombrement s.lectif de Legionella utilisant plusieurs principes70
6.1 Double marquage immunologique (DS) .................................................................................. 70
6.2 Culture-FSH............................................................................................................................. 72
Anses
F.vrier 2011 page 4 / 144
6.3 Evolutions possibles des m.thodes utilisant plusieurs principes, peu ou pas test.es pour
rechercher et identifier Legionella dans l'eau........................................................................................ 74
6.3.1 DVC-FSH...................................................................................................................... 74
6.3.2 Desorption-ionisation laser assist.e par matrice (Spectrom.trie de masse MALD-TOF)
....................................................................................................................................... 74
6.3.3 La chromatographie liquide haute pression en condition d.naturante (dHPLC) coupl.e
la PCR ....................................................................................................................................... 75
6.3.4 MS - ATP-m.trie........................................................................................................... 76
7 Analyses susceptibles d'apporter une information d.cisionnelle compl.mentaire. ..................... 77
7.1 Recherche de flore totale ......................................................................................................... 77
7.1.1 Culture ........................................................................................................................... 77
7.1.2 ATP-m.trie..................................................................................................................... 77
7.2 Recherche d'amibes................................................................................................................. 77
7.3 Analyse du biofilm .................................................................................................................... 78
7.4 Analyse des a.rosols ............................................................................................................... 78
8 Comparaison des diff.rentes m.thodes....................................................................................... 80
8.1 Critres d'.quivalence de m.thodes de d.nombrement de microorganismes........................ 80
8.2 Comparabilit. des unit.s.......................................................................................................... 81
8.3 Comparabilit. des limites de d.tection et de quantification ..................................................... 82
8.4 Comparaison des m.thodes en fonction des diff.rents types d'eau ....................................... 83
8.4.1 Eaux ensemenc.es exp.rimentalement ....................................................................... 83
8.4.2 Eaux environnementales ............................................................................................... 86
9 R.flexion sur la signification des r.sultats et des valeurs cibles.................................................. 90
9.1 El.ments prendre en compte dans l'interpr.tation des r.sultats des m.thodes de
d.nombrement de Legionella................................................................................................................ 90
9.1.1 Cons.quence de l'existence de Legionella viables non cultivables et non viables vis--
vis des m.thodes de d.nombrement............................................................................................ 90
9.1.2 Cons.quence de l'association de Legionella avec les amibes ..................................... 90
9.1.3 Cons.quence de l'association de Legionella avec le biofilm........................................ 91
9.2 Seuils de gestion et mesures pr.conis.es par la r.glementation en vigueur.......................... 92
9.2.1 Cas g.n.ral des eaux chaudes sanitaires .................................................................... 92
9.2.2 Cas des eaux chaudes sanitaires dans les .tablissements de sant............................ 92
9.2.3 Cas des tours a.ror.frig.rantes et autres installations risque................................... 93
9.3 Signification sanitaire des valeurs cibles actuelles .................................................................. 96
9.3.1 Cas g.n.ral ................................................................................................................... 96
9.3.2 Cas des eaux chaudes sanitaires.................................................................................. 97
9.3.3 Cas des tours a.ror.frig.rantes.................................................................................... 97
9.4 D.termination de valeurs cibles pour les m.thodes alternatives la culture. ......................... 97
9.4.1 Cas des eaux chaudes sanitaires.................................................................................. 98
9.4.2 Cas des tours a.ror.frig.rantes.................................................................................... 98
10 Synthse des .l.ments recueillis ................................................................................................. 99
10.1 Synthse sur la base des .l.ments bibliographiques .............................................................. 99
10.2 Synthse sur la base des auditions........................................................................................ 103
11 Conclusions et recommandations............................................................................................... 110
11.1 Conclusions et recommandations g.n.rales court terme................................................... 110
11.2 Conclusions et recommandations moyen et long termes ................................................... 116
R.f.rences bibliographiques............................................................................................................... 119
Annexes............................................................................................................................................... 130
Annexe 1 : Courrier de saisine de l'Afsset par la DGS et la DGPR sur les m.thodes de d.tection des
l.gionelles dans l'eau .......................................................................................................................... 130
Annexe 2 : Textes r.glementaires et l.gislatifs relatifs aux Legionella,.............................................. 132
Annexe 3 : Normes r.f.renc.es dans le rapport ................................................................................ 135
Annexe 4 : R.glementation et guides internationaux.......................................................................... 136
Annexe 5 : Exemples de courriers de sollicitation utilis.s pour pr.parer les auditions men.es par le
groupe de travail "D.tection des l.gionelles dans l'eau". ................................................................... 137
Annexe 6 : Synthse des d.clarations publiques d'int.rts des experts par rapport au champ de la
saisine.................................................................................................................................................. 140
Anses
F.vrier 2011 page 5 / 144
M.thodes de d.tection et de d.nombrement de
Legionella dans I'eau
Caract.ristiques d.taiII.es et pertinence de Ieur mise en 8uvre dans Ies eaux
chaudes sanitaires et Ies tours a.ror.frig.rantes
Saisine : 2009-SA-330
hDPIW1JZ ZI ]OP]SHJVOPJ
Comit. d'expert sp.ciaIis. ".vaIuation des risques Ii.s aux eaux et aux agents
bioIogiques"
Groupe de travaiI "M.thode de d.tection et de d.nombrement de Legionella
dans I'eau"
Version du 25/02/2011
Anses
F.vrier 2011 page 6 / 144
1 Pr.sentation de Ia question pos.e
L'Agence franaise de s.curit. sanitaire de l'environnement et du travail (Afsset)
1
a .t. saisie le 29
juillet 2009 par la Direction g.n.rale de la sant. (DGS) et la Direction g.n.rale de la pr.vention des
risques (DGPR) afin de :
1. D.crire les m.thodes pr.-analytiques (pr.paration de l'.chantillon avant analyse) et analytiques
connues pour la d.tection et le d.nombrement sp.cifique de l.gionelles dans l'eau (culture, biologie
mol.culaire (Polymerase Chain Reaction : PCR), immuno-d.tection, etc.). Cette description avait
notamment pour finalit. d'identifier les questions auxquelles r.pondent les m.thodes et leurs limites
th.oriques. Elle devait tre bas.e sur une recherche bibliographique ;
2. Etudier la pertinence (avantages et inconv.nients) de la mise en 8uvre de ces m.thodes
analytiques pour le contr?le sanitaire des eaux chaudes et le contr?le r.glementaire des eaux de
circuits de refroidissement des tours a.ror.frig.rantes, en fonction de leurs besoins et contraintes
respectives :
D dans un premier temps, cette .tude devait viser analyser les avantages et inconv.nients des
diff.rentes m.thodes, notamment sur les questions des contraintes de faisabilit. technique et
des co`ts ;
D dans un second temps, si des m.thodes apportant une plus-value technique par rapport la
m.thode par culture .taient mises en .vidence, la pertinence de leur mise en 8uvre dans le
cadre des contr?les r.glementaires devait tre .valu.e. S'agissant des m.thodes identifi.es,
une r.flexion pouvait notamment tre men.e concernant les seuils r.glementaires et, le cas
.ch.ant, leur r.vision.
3. Si n.cessaire, identifier les essais exp.rimentaux permettant de v.rifier ou d'infirmer les
hypothses avanc.es concernant la pertinence des m.thodes recens.es, et le cas .chant le
lancement des .tudes n.cessaires.
2 Contexte
L'incidence de la l.gionellose a diminu. en France depuis 2006 pour se stabiliser aux alentours de
1200 cas d.clar.s par an (1206 cas enregistr.s en 2009, BEH n31-32 du 27 juillet 2010), grce
notamment une meilleure identification des sources potentielles de contamination.
La surveillance environnementale de Legionella spp. ou de Legionella pneumophila est encadr.e par
la r.glementation :
D elle est obligatoire :
U dans les eaux min.rales destin.es des usages th.rapeutiques dans les .tablissements
thermaux, une fois par mois aux points d'usage les plus sensibles (arrt. 19 juin 2000)
1
U dans les tours a.ror.frig.rantes, une fois par mois ou tous les deux mois pendant la p.riode
de fonctionnement de l'installation (arrt.s du 13 d.cembre 2004)
;
2
U dans les r.seaux d'eau chaude sanitaire des .tablissements de sant., les .tablissements
sociaux et m.dico-sociaux d'h.bergement pour personnes g.es, les autres .tablissements
sociaux et m.dico-sociaux, les h?tels, les r.sidences de tourisme, les campings et les
.tablissements, p.nitentiaires une fois par an aux points d'usage repr.sentatifs (arrt. du 1
er
f.vrier 2010)
;
3
D compter du 1er janvier 2012, l'arrt. du 1
er
f.vrier 2010 la rend obligatoire dans les autres
.tablissements recevant du public, une fois par an, aux points d'usage repr.sentatifs des r.seaux
d'eau chaude sanitaire.
;
1
Arrt. du 19 juin 2000 modifiant lSarrt. du 14 octobre 1937 modifi. relatif au contr?le des sources dSeaux min.rales
2
Arrt. du 13 d.cembre 2004 relatif aux prescriptions g.n.rales applicables aux installations class.es pour la protection de
lSenvironnement soumises d.claration sous la rubrique n 2921 nstallations de refroidissement par dispersion dSeau dans un
flux dSair
Arrt. du 13 d.cembre 2004 relatif aux installations de refroidissement par dispersion dSeau dans un flux dSair soumises
autorisation au titre de la rubrique n 2921
3
Arrt. du 1er f.vrier 2010 relatif la surveillance des l.gionelles dans les installations de production, de stockage et de
distribution dSeau chaude sanitaire
Anses
F.vrier 2011 page 7 / 144
Cette r.glementation impose l'utilisation de la m.thode par culture, telle que d.crite dans la norme NF
T90-431 "Recherche et d.nombrement de Legionella spp. et de Legionella pneumophila par culture
sur milieux g.los.s".
La DGS et la DGPR soulignent dans la lettre de saisine que la m.thode par culture, telle que d.crite
dans la norme NF T90-431, pr.sente certains inconv.nients :
D le rendu des r.sultats d.finitifs n.cessite un d.lai minimum de 8 jours aprs la mise en culture
(des r.sultats interm.diaires pouvant cependant tre rendus au bout de 3 5 jours). Ce d.lai
peut poser des problmes pour la gestion des installations concern.es, notamment pour lever
des mesures restrictives d'utilisation d'eau ;
D l'ensemble des diff.rentes formes de Legionella potentiellement pr.sentes dans l'eau n'est pas
pris en compte par cette m.thode. En effet elle ne permet de d.nombrer que les Legionella
libres, viables et cultivables, dans les .chantillons d'eau.
3 ModaIit.s de traitement : moyens mis en 8uvre et organisation
L'expertise a .t. men.e conform.ment aux exigences de la norme NF X 50-110 relative la qualit.
en expertise (AFNOR, 2003), avec l'appui du Comit. d'expert sp.cialis. (CES) ".valuation des
risques li.s aux eaux et aux agents biologiques".
Un groupe de travail (GT) a .t. constitu. en veillant notamment la comp.tence et l'ind.pendance de
ses membres. Le GT s'est r.uni 21 reprises entre le 15 f.vrier 2010 et le 14 octobre 2010. Sur la
base d'une synthse bibliographique produite par l'Afsset, le GT a poursuivi la collecte d'.l.ments
bibliographiques, proc.d. 7 auditions formelles
4
Les travaux ont .t. soumis r.gulirement au Comit. d'experts sp.cialis. Evaluation des risques li.s
aux eaux et aux agents biologiques pour avis et commentaires et adopt. le 24 f.vrier 2011.
et analys. l'ensemble des donn.es collect.es pour
formuler ses conclusions et recommandations. Ces auditions ont permis de compl.ter les informations
recueillies dans la bibliographie, en les comparants avec les tendances et hypothses d.j publi.es.
Le rapport .tablit une distinction entre les .l.ments issus de la bibliographie et ceux issus des
auditions.
4 Argumentaire
Pour r.pondre aux objectifs de la saisine et du contrat d'expertise, le GT charg. de l'expertise a pris
en compte les .l.ments suivants.
4.1 Les espces de Legionella responsabIes de I.gioneIIoses
A ce jour 58 espces de bact.ries du genre Legionella ont .t. identifi.es. Ces espces sont sub-
divis.es en s.rogroupes (environ 70 s.rogroupes actuellement connus). En France, Legionella
pneumophila est responsable de 98 % des cas d.clar.s de l.gionellose qui ont fait l'objet d'une
identification aprs un pr.lvement pulmonaire
5
Des espces autres que Legionella pneumophila peuvent cependant tre l'origine de l.gionelloses,
en particulier chez les sujets dont l'immunit. est compromise (patients haut risque
.
6
En revanche, la bibliographie ne met pas en .vidence de cas de l.gionellose li. une espce autre
que Legionella pneumophila qui soit imputable une tour a.ror.frig.rante. Par ailleurs, les donn.es
franaises ne mettent pas en .vidence de cas de l.gionellose d.clar.e, imputable une Legionella
d'une autre espce que pneumophila et qui aurait pour origine la contamination d'une tour
a.ror.frig.rante.
). Les souches
responsables de certains de ces cas ont pu tre retrouv.es dans des circuits d'eau chaude sanitaire
utilis.s par un malade, ou proximit. d'un malade.
4
Les 7 organismes auditionn.s sont : l'nstitut Pasteur Lille (PL) sant. environnement durable, Suez environnement, Veolia
environnement, EDF, le pr.sident de la Commission T 90E de l'Afnor, l'Association g.n.rale des laboratoires dSanalyse de
lSenvironnement (AGLAE) et des participants au projet europ.en Emile. Ces organismes ont .t. s.lectionn.s par le GT aprs
en avoir contact. pr.alablement prs de 45 pour .valuer la n.cessit. d'une audition
5
Pr.lvement des s.cr.tions respiratoires.
6
Circulaire DGS 2002 243, du 22 avril 2002 : les patients dits patients haut risque sont les immunod.prim.s s.vres, et
particulirement les immunod.prim.s aprs transplantation ou greffe dSorgane et les immunod.prim.s par corticoth.rapie
prolong.e (0,5 mg/kg de prednisone pendant 30 jours ou plus, ou .quivalent) ou r.cente et haute dose (cSest--dire
sup.rieure 5 mg/kg de prednisone pendant plus de 5 jours)
Anses
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N.anmoins, il faut souligner la difficult. que repr.sente l'identification de l'origine environnementale
des cas de l.gionellose. En France, oM le systme de surveillance des l.gionelloses est trs
d.velopp., cette origine reste cependant non identifi.e dans 80% des cas.
Quoi qu'il en soit, d'un point de vue sanitaire, Legionella pneumophila apparat comme l'espce la
plus pertinente d.nombrer aussi bien dans les circuits d'eau chaude sanitaire que dans les tours
a.ror.frig.rantes
4.2 Les bases sanitaires et techniques du choix des espces de Legionella
d.nombrer dans Ie cadre de Ia surveiIIance r.gIementaire
Les diff.rents textes r.glementaires qui encadrent la surveillance environnementale des Legionella
rendent obligatoire le d.nombrement de Legionella pneumophila, l'espce la plus pertinente d'un point
de vue sanitaire, l'exception des deux arrt.s du 13 d.cembre 2004 relatifs aux installations de
refroidissement par dispersion d'eau dans un flux d'air soumises autorisation et d.claration,
commun.ment appel.es tours a.ror.frig.rantes. Ces deux arrt.s rendent obligatoire le
d.nombrement de Legionella spp., alors que ce choix n'est pas .tay. d'un point de vue sanitaire.
D'un point de vue technique, le d.nombrement de Legionella spp. peut n.anmoins avoir une utilit.
pour les gestionnaires d'installations, notamment pour d.tecter des dysfonctionnements. Toutefois,
cette question n'a pas fait l'objet d'une r.flexion approfondie dans le cadre de la pr.sente expertise.
4.3 Les critres prendre en compte pour .vaIuer Ia pertinence d'une m.thode de
d.nombrement de Legionella
Le GT a d.fini les critres de performance attendus d'une m.thode de d.nombrement de Legionella
en routine, au premier rang desquels les sp.cifications techniques telles que : s.lectivit., sp.cificit.,
sensibilit., r.p.tabilit., reproductibilit., justesse, fid.lit. ou encore rendement. Cependant, la prise en
compte d'autres critres est apparue .galement n.cessaire pour .valuer la pertinence d'une m.thode
de d.nombrement de Legionella dans l'eau dans les contextes particuliers des eaux chaudes
sanitaires (ECS) et des tours a.ror.frig.rantes (TAR). Le tableau 1 pr.sente les critres retenus dans
le cadre de cette expertise, ainsi que le niveau d'importance relatif qui leur a .t. attribu., au regard de
la probl.matique pos.e.
Anses
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TabIeau 1 : Pertinence, pour le contr?le sanitaire et la surveillance, des critres de s.lection d'une m.thode de d.nombrement
de Legionella dans l'eau, dans les contextes du suivi des ECS, des TAR et des d.contaminations.
++++ indispensable ; +++ priorit. .lev.e ; ++ priorit. mod.r.e ; +/- peu ou pas pertinent
Le critre de co`t est important prendre en compte dans le choix d'une m.thode analytique.
Cependant, dans le cas pr.sent, il doit tre consid.r. comme moins prioritaire que la pertinence d'une
m.thode de d.nombrement des l.gionelles dans l'eau pour assurer une surveillance sanitaire efficace
des eaux chaudes sanitaires et des tours a.ror.frig.rantes. Les co`ts des m.thodes plus
particulirement investigu.es sont aujourd'hui du mme ordre de grandeur mais sont par ailleurs
susceptibles d'.voluer en fonction des d.veloppements venir. Ce critre .conomique n'a donc pas
.t. pris en compte dans le cadre de cette expertise et il pourra tre .valu. une fois l'efficacit. des
techniques bien document.e : caract.ristiques intrinsques et capacit. r.pondre aux besoins des
utilisateurs en routine.
4.4 Les m.thodes .vaIu.es
La r.flexion a port. sur les caract.ristiques techniques des m.thodes qui ont .t. r.pertori.es par le
groupe de travail, avec une description :
- des .tapes de pr.traitement : filtration, centrifugation, s.paration immuno-magn.tique ;
- des m.thodes de d.nombrement sp.cifiques de Legionella utilisant un principe unique :
U croissance : culture, Direct Viable Count (DVC), etc. ;
U amplification g.nique : q-PCR (PCR quantitative en temps r.el), v-PCR (PCR Viable), etc. ;
U affinit. mol.culaire (immuno-d.tection, hybridation in situ fluorescente (FSH), etc. ;
ECS TAR D.conta
mination
Critres reIatifs aux cibIes
Quantification de Legionella pneumophila
++++ ++++ ++++
Quantification de Legionella pneumophila avec distinction du
s.rogroupe 1
+++ +++ +/-
Distinction et quantification des s.rogroupes autre que sg1 ++ ++ +/-
Quantification de l'ensemble des Legionella species
++ ++ ++
dentification des diff.rentes espces de Legionella pr.sentent
dans l'.chantillon
+/- +/- +/-
Prise en compte des Legionella intra amibiennes ou intra
v.siculaires dans la quantification
+++ +++ +++
Quantification s.lective des Legionella intra amibiennes ou intra
v.siculaires
+/- +/- +/-
Critres reIatifs I'.tat physioIogique des Legionella
d.tect.es
Non d.tection des Legionella mortes
+++ +++ +++
D.tection notamment de l'ensemble des Legionella viables et
potentiellement pathognes
+++ +++ +++
Critres reIatifs au contexte pratique de mise en 8uvre
Rapidit. des r.sultats (hors crise) +++ +++ +++
Faisabilit., simplicit. ++ ++ ++
Equipements n.cessaires limit.s ++ ++ ++
Faibles co`ts (global) ++ ++ ++
Temps technicien faible ++ ++ ++
Critres reIatifs I'interpr.tation des r.suItats
nterpr.tation technique simple des r.sultats bruts ++ ++ ++
nterpr.tation pour le risque sanitaire disponible +++ +++ +++
Critres reIatifs aux champs d'appIication
Applicable sur des .chantillons d'eau charg.e ++ ++ +/-
Applicable sur des .chantillons d'eau trait.e +++ +++ +++
Permet de disposer de souches pour des .tudes compl.mentaires ++ ++ ++
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- des m.thodes de d.nombrement sp.cifique de Legionella utilisant plusieurs principes :
mmunological double-staining (DS), culture-FSH, et d'autres .volutions possibles (DVC-FSH,
Desorption-ionisation laser assist.e par matrice (MALD-TOF), dHPLC, S.paration immuno-
magn.tique (MS) - ATP-m.trie) ;
- des analyses compl.mentaires : flore totale (culture, ATP-m.trie), amibes, biofilm, a.rosols.
Dans le rapport d'expertise, chaque description de m.thode est assortie d'un tableau pr.sentant les
avantages et les inconv.nients intrinsques th.oriques de la m.thode, tels que d.finis en fonction,
des critres list.s et prioris.s dans le tableau 1. Le tableau 2, pr.sente ci-aprs une synthse des
r.sultats de cette analyse.
TabIeau 2 : Avantages (+), inconv.nients (-) ou critres non .valu.s (?) pour les diff.rentes m.thodes de d.nombrement de
Legionella examin.es par le groupe de travail, en regard des critres de s.lection pr.c.demment .valu.s comme de priorit.
.lev.e ou mod.r.e.
M.thodes Culture DVC q-PCR v-PCR mmuno-
d.tection
FSH DS Culture-
FSH
Critres priorit. .Iev.e
Quantification de Legionella pneumophila
+ ? + + + + + +
Quantification de Legionella pneumophila
avec distinction du s.rogroupe 1
+ ? + + + ? + ?
Prise en compte des Legionella intra
amibiennes ou intra v.siculaires dans la
quantification
- ? + + - ? ? -
Non d.tection des Legionella mortes
+ + - + - - ? +
D.tection notamment de l'ensemble des
Legionella viables et potentiellement
pathognes
- ? + + + + + -
Rapidit. des r.sultats
- + + + + + + +
Critres d'interpr.tation pour le risque
sanitaire disponibles
+ - - - - - - -
Applicable sur des .chantillons d'eau trait.e
+ ? + + ? ? ? +
Critres priorit. mod.r.e
Distinction et quantification des s.rogroupes
Lp autre que sg1
+ ? ? ? + - + +
Quantification de l'ensemble des Legionella
species
+ ? + + + + ? +
Applicable sur des .chantillons d'eau charg.e
- ? - - - ? - -
Faisabilit., simplicit.
+ ? + + + + ? +
Equipements n.cessaires faibles
+ ? + + - + - +
Temps technicien faible
- ? + + - - - -
nterpr.tation technique simple des r.sultats
bruts
+ ? + + + + + +
Permet de disposer de souches pour des
.tudes compl.mentaires
+ ? - - ? - ? +
4.5 Les m.thodes pertinentes pour une utiIisation en routine court terme
Le choix d'une m.thode de d.nombrement ne peut se fonder seulement sur ses avantages et ses
inconv.nients intrinsques. En effet, certains avantages identifi.s l'.chelon exp.rimental peuvent
tre pris en d.faut lorsque la m.thode est confront.e aux r.alit.s du terrain. Aussi, il apparat
important de prendre en compte le niveau de d.veloppement de la m.thode : standardisation du
protocole, confirmation de ses performances par diff.rents laboratoires, application possible
diff.rents types d'.chantillons environnementaux, robustesse, existence de standards et d'.talons,
etc.
Pour une application en routine dans le cadre de la surveillance r.glementaire, il importe de disposer
d'une m.thode .prouv.e, dont le protocole est valid. par de nombreux laboratoires et sur un grand
nombre d'.chantillons. Actuellement, seules les m.thodes de d.nombrement des Legionella dans
l'eau par culture (normes NF T90-431 et NF EN SO 11731-2
7
7
Etant donn. le peu d'exemples d'application de la norme NF EN SO 11731-2 en France, les pr.sentes recommandations
sont essentiellement bas.es sur la norme NF T90-431.
) et par q-PCR (norme NF T90-471)
offrent ces garanties, ces deux normes int.grant le pr.traitement des .chantillons. Les
recommandations en vue d'une mise en 8uvre court terme dans un cadre r.glementaire ne peuvent
donc raisonnablement porter que sur la culture et la q-PCR.
Anses
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D'autres m.thodes semblent prometteuses mais elles demandent tre d.velopp.es, stabilis.es et
test.es grande .chelle, avant d'envisager leur application en routine.
4.6 Comparaison de m.thodes recens.es dans Ia bibIiographie
Les .tudes de comparaison des diff.rentes m.thodes de d.nombrement de Legionella r.pertori.es
dans la bibliographie ont .t. examin.es. Les unit.s dans lesquelles sont exprim.s les r.sultats issus
des m.thodes consid.r.es ne sont souvent pas comparables. Toutefois, lorsqu'elles existent, des
corr.lations entre des r.sultats de d.nombrement exprim.s dans diff.rentes unit.s, permettent
d'alimenter la r.flexion relative l'.laboration de rgles d'interpr.tation des m.thodes alternatives la
culture. Pour l'analyse d'eaux environnementales, dont les qualit.s sont trs variables, les diff.rentes
m.thodes apparaissent rarement .quivalentes. N.anmoins, les corr.lations observ.es entre les
r.sultats des m.thodes compar.es sont sensiblement meilleures, pour l'analyse d'eaux relativement
peu charg.es, comme les eaux de r.seaux domestiques, que pour l'analyse d'eaux charg.es, comme
les eaux de tours a.ror.frig.rantes.
4.7 Choix des critres d'interpr.tation des r.suItats seIon Ies m.thodes
L'utilisation d'une m.thode analytique va de pair avec la d.finition de critres d'interpr.tation de ses
r.sultats. Aussi, avant d'envisager l'utilisation d'une m.thode de d.nombrement de Legionella, dans
le cadre de la surveillance sanitaire des eaux chaudes sanitaires et des tours a.ror.frig.rantes, il
apparait n.cessaire de fixer des valeurs cibles au-del desquelles des actions de gestion pourraient
tre envisag.es.
A l'heure actuelle, ces valeurs cibles ne peuvent pas tre bas.es sur les seules donn.es
.pid.miologiques du fait :
D du peu de publications disponibles sur le sujet et des fortes incertitudes qu'elles mettent en
.vidence ;
D de la difficult. d'identification de l'origine environnementale des cas de l.gionellose (possible
dans 20% des cas d.clar.s) ;
D du grand nombre de facteurs autres que la concentration en Legionella pneumophila dans l'eau
des installations intervenant dans la survenue des l.gionelloses (m.t.orologie, taille des
gouttelettes produites par les installations, .tat de viabilit. et de virulence des souches de
Legionella pr.sentes dans l'eau, etc.).
Aussi, la d.termination des valeurs cibles doit se fonder sur une approche pragmatique, en exploitant
les .l.ments disponibles.
4.7.1 VaIeurs cibIes pour Ia m.thode par cuIture
En 2001, le Conseil sup.rieur d'hygine publique de France (CSHPF) a propos. des valeurs cibles,
sur la base des connaissances scientifiques et des observations de terrain disponibles la date de
cette proposition. Les valeurs cibles propos.es n'.taient pas fond.es sur une dose-r.ponse
8
Ces valeurs cibles ont .t. reprises dans la r.glementation franaise.
chez
l'homme.
D Dans le cas des eaux chaudes sanitaires
Pour la population g.n.rale, la r.glementation franaise en vigueur, fixe la vaIeur cibIe en L.
pneumophila 10
3
UFC/L.
Pour les patients haut risque (immunod.prim.s), la r.glementation pr.conise de ne pas d.passer le
seuil de d.tection de la m.thode par culture (selon la norme NF T90-431).
Selon les donn.es de la litt.rature, la concentration en L. pneumophila en dessous de laquelle le
risque de l.gionellose est n.gligeable ou acceptable pour la population g.n.rale est comprise entre
10
4
ou 10
5
UFC/L dans les eaux chaudes sanitaires, malgr. l'absence de dose-r.ponse connue chez
l'homme.
L'examen de la bibliographie et les auditions d'acteurs du systme de surveillance des Legionella
dans les eaux chaudes sanitaires n'ont pas mis en .vidence d'argument justifiant, d'un point de vue
sanitaire, une modification de ces valeurs cibles.
8
Relation sp.cifique d'une voie entre des niveaux d'exposition un agent dangereux et l'indice observ. d'un effet donn.. l
existe trs peu d'agents biologiques pour lesquels sont publi.es des donn.es dose-r.ponse .
Anses
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D Dans le cas des tours a.ror.frig.rantes
La r.glementation franaise en vigueur, concernant les tours a.ror.frig.rantes, fixe des vaIeurs
cibIes en Legionella spp. :
- seuil d'acceptabilit. de l'eau d'appoint : limite de quantification de la m.thode normalis.e
utilis.e ;
- seuil d'action pour l'eau de l'installation : 10
3
UFC/L ;
- seuil d'arrt pour l'eau de l'installation : 10
5
UFC/L.
La litt.rature et les auditions d'acteurs du systme de surveillance des tours a.ror.frig.rantes
mettent en .vidence une difficult. d'interpr.tation des r.sultats li.e au choix de la cible du
d.nombrement. En effet, l'espce responsable de la plupart des cas de l.gionelloses d.clar.s .tant
Legionella pneumophila, il est difficile d'interpr.ter un d.passement de seuil en Legionella. spp. d'un
point de vue sanitaire. Ces valeurs doivent avant tout tre consid.r.es comme des valeurs de
gestion.
4.7.2 VaIeurs cibIes pour Ia m.thode par q-PCR
Le niveau de connaissance actuel ne permet pas d'.tablir une valeur cible de L. pneumophila la q-
PCR (en UG/L) sur les bases d'une dose r.ponse chez l'homme.
Cependant, les b.n.fices sanitaires potentiels de l'utilisation de la q-PCR, du simple fait de la rapidit.
de sa mise en 8uvre et de l'obtention de r.sultats sp.cifiques de L. pneumophila, incitent mettre en
place les outils permettant l'utilisation de cette technique en routine. En effet, dans de nombreux cas,
elle permettrait de d.tecter et donc de g.rer la contamination d'une installation beaucoup plus
rapidement qu'avec la culture. Dans ce contexte, l'.tablissement de valeurs cibles est primordial.
Les seuls r.f.rentiels actuels sont les valeurs cibles d.j pr.sentes dans la r.glementation pour la
m.thode par culture. Les retours d'exp.rience li.s leur utilisation pour la surveillance des l.gionelles
dans l'eau ne mettent pas en .vidence la n.cessit. de les modifier. l apparat donc raisonnable de
d.finir les valeurs cibles applicables la q-PCR de manire ce que le taux de r.sultats sup.rieurs
ces valeurs cibles, obtenus avec une mme s.rie de pr.lvements, soit .quivalent pour la culture et
pour la q-PCR.
Cependant les unit.s des diff.rentes m.thodes de d.nombrement de Legionella apparaissent
h.t.rognes et difficilement comparables : unit.s g.nomes/L (UG/L) pour les m.thodes par biologie
mol.culaire et unit.s formant colonies/L (UFC/L) pour les m.thodes par culture. En l'absence de
donn.es publi.es, les valeurs propos.es sont principalement bas.es sur les r.sultats de la
surveillance des l.gionelles dans l'environnement, pr.sent.s par deux acteurs auditionn.s.
D Dans le cas des eaux chaudes sanitaires
Sur la base de ce raisonnement des valeurs cibles peuvent tre .labor.es pour les points
d'usage risque
9
En ce qui concerne les points d'usage risque utilis.s par des patients haut risque dans les
.tablissements de sant., pour assurer une protection sanitaire maximale, il semble raisonnable
de proposer des valeurs cibles .gales au seuil de d.tection de la m.thode.
dans les .tablissements recevant du public, l'exclusion de ceux utilis.s par
des patients haut risque.
D Dans le cas des tours a.ror.frig.rantes
L'.tablissement de valeurs cibles en Legionella. spp., adapt.es la q-PCR, pourrait tre
envisag. sur la base du raisonnement d.velopp. ci-dessus.
Cependant, certains essais montrent une bien meilleure concordance relative entre les r.sultats
obtenus par culture et par q-PCR pour le d.nombrement de L. pneumophila que pour celui de
Legionella. spp. D'un point de vue analytique, il semble donc plus adapt. de d.terminer une
valeur cible en L. pneumophila pour la q-PCR.
D'un point de sanitaire, l'.tablissement de valeurs cibles en L. pneumophila apparat .galement
plus pertinent.
9
L'arrt. du 1er f.vrier 2010 relatif la surveillance des l.gionelles dans les installations de production, de stockage et de
distribution d'eau chaude sanitaire, d.finit point d'usage risque comme tout point d'usage accessible au public et
pouvant produire des azrosols d'eau chaude sanitaire susceptible d'tre contaminze par les lzgionelles ; il s'agit notamment des
douches, des douchettes, des bains [ remous ou [ jets. L
Anses
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Les valeurs r.glementaires actuelles en Legionella. spp. pourraient tre consid.r.es plus
protectrices d'un point de vue sanitaire que les mmes valeurs appliqu.es L. pneumophila,
dans la mesure oM ces dernires font partie des Legionella spp. On rappellera n.anmoins que :
U ce jour, aucune autre espce que L. pneumophila n'a pu tre identifi.e chez un patient
atteint de l.gionellose, dont l'origine de la contamination ait .t. attribu.e une tour
a.ror.frig.rante ;
U la proportion de L. pneumophila parmi les Legionella spp. varie fortement dans le temps
et il n'existe pas d'outil fiable permettant de la pr.voir.
Aussi, il parait fond. de proposer aujourd'hui des valeurs cibles en L. pneumophila, pour la
surveillance sanitaire des tours a.ror.frig.rantes, aussi bien pour la m.thode par culture que
pour la m.thode par q-PCR.
Ce dispositif pr.sente quatre avantages importants :
U d'un point de vue sanitaire :
- faciliter l'interpr.tation des r.sultats de surveillance ;
- ouvrir la possibilit. d'utiliser la q-PCR pour la surveillance des tours a.ror.frig.rantes,
pour b.n.ficier de la grande r.activit. de cette technique, avec la possibilit. de d.tecter
une contamination beaucoup plus rapidement que ce n'est le cas actuellement ;
U du point de vue de la gestion des installations : le choix de d.nombrer L. pneumophila dans les
tours a.ror.frig.rantes la place de Legionella spp. permettrait :
- d'arrter les installations uniquement pour une raison sanitaire. Le nombre d'arrts de
fonctionnement des tours a.ror.frig.rantes sans fondement sanitaire s'en verrait
significativement r.duit ;
- de v.rifier plus rapidement l'efficacit. des actions correctives men.es en cas d'arrt
d'une installation.
5 ConcIusions et recommandations
5.1 ConcIusions et recommandations g.n.raIes court terme
Les conclusions et recommandations qui suivent sont bas.es sur les arguments d.velopp.s dans le
chapitre pr.c.dent. Pour autant, ces conclusions ne r.sultent pas d'une .valuation des risques
sanitaires, ce qui n'.tait pas l'objet de la saisine.
5.1.1 Choix d'une m.thode appIicabIe aux eaux chaudes sanitaires et aux eaux des tours
a.ror.frig.rantes
En situation de surveiIIance de routine, dans lesquels les d.lais ne constituent pas un critre
prioritaire, il est recommand. de laisser le choix au gestionnaire d'utiliser, soit Ia m.thode par
cuIture, soit Ia m.thode par q-PCR. Ce choix pourra tre fait selon l'accessibilit. de la m.thode
d'analyse, la pr.sence ou non d'inhibiteurs dans l'eau, la pr.sence de flore interf.rente, etc. En cas
de d.passement des vaIeurs cibIes r.gIementaires, lorsque l'analyse aura .t. r.alis.e par q-PCR,
il est pr.conis. une mise en culture de l'.chantillon, afin de disposer de la souche d.nombr.e, en vue
d'.ventuelles analyses compl.mentaires.
En situation d'urgence sanitaire, en pr.sence de cas group.s de I.gioneIIose ou de cas
nosocomiaI, il est recommand. d'utiliser la m.thode qui fournira Ies r.suItats dans Ie temps Ie
pIus court. La m.thode de q-PCR semble appropri.e dans ce cas, au regard de la rapidit.
d'obtention de ses r.sultats. Un d.nombrement par q-PCR doit, dans ce cas, tre compl.t. par la
mise en culture d'une partie des .chantillons pr.lev.s, afin de confronter les souches
environnementales et cliniques lorsqu'elles sont disponibles. Au cas oM la q-PCR ne serait pas
disponible, la m.thode par culture est pr.conis.e. Elle devra inclure l'identification du s.rogroupe en
pr.sence d'une l.gionellose L. pneumophila, ou l'identification de l'espce dans le cas d'une
l.gionellose Legionella spp.
5.1.2 Propositions de vaIeurs cibIes
Les valeurs cibles propos.es ici reposent sur un avis d'expert en l'.tat actuel des connaissances.
Elles sont propos.es dans l'objectif d'am.liorer le niveau de s.curit. sanitaire.
Les valeurs cibles propos.es pour la q-PCR n.cessitent d'tre consolid.es durant une p.riode
probatoire, pendant laquelle une .tude m.trologique serait men.e afin de comparer les r.sultats
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d'analyse obtenus avec les deux m.thodes utilis.es en parallle sur un nombre suffisant
d'.chantillons.
Les valeurs propos.es ici sont propres chaque m.thode. Elles visent cependant atteindre les
mmes objectifs en termes de gestion des risques.
5.1.2.1 Eaux chaudes sanitaires :
D En situation de surveillance de routine
' Dans le cas des eaux destin.es la consommation humaine fournies au niveau de points
d'usage risque
10
dans des .tablissements recevant du public, l'exclusion de ceux utilis.s par
des patients haut risque
11
Pour les r.sultats d'analyses obtenus par cuIture, aucune des donn.es r.pertori.es ne permet de
justifier une modification de la r.glementation en vigueur en France concernant l'objectif de
concentration en L. pneumophila ne pas d.passer, soit 10
3
UFC /L.
dans les .tablissements de sant. :
Pour les r.sultats obtenus par q-PCR, la valeur cible en L. pneumophila ne pas d.passer est de
5.10
3
UG /L.
Ces deux vaIeurs cibIes sont ind.pendantes et ne sont pas sensu stricto .quivaIentes.
En cas de d.passement des valeurs cibles propos.es et en fonction de la m.thode de d.nombrement
choisie, des actions de gestion doivent tre envisag.es par le responsable de l'installation. Au cas oM
des r.sultats non satisfaisants
12
La gestion technique des installations d'eau chaude sanitaire peut permettre de d.tecter, voire
d'anticiper des dysfonctionnements. Elle peut tre r.alis.e par le d.nombrement de Legionella spp
comme par des indicateurs beaucoup plus simples, tels qu'un suivi rigoureux de temp.rature bas. sur
un nombre suffisant de points de mesure.
sont obtenus, il convient de rechercher l'origine de la contamination
en confrontant les r.sultats d'analyse d'eau pr.lev.e en diff.rents points du r.seau de distribution
d'eau chaude. l importe aussi de v.rifier la concentration en L. pneumophila dans l'eau du r.seau
d'eau froide. Le taux de points conformes et la localisation des points non-conformes peuvent
.galement apporter des informations utiles au gestionnaire de l'installation. Les mesures de gestion
de la qualit. des eaux incluent outre la d.sinfection, des am.liorations envisager telles que la
suppression de bras morts, et de points de soutirage non utilis.s ou l'.quilibrage du d.bit. Dans tous
les cas, une v.rification de l'efficacit. des mesures de gestion choisies sera indispensable.
' Dans le cas des eaux destin.es la consommation humaine fournies au niveau de points
d'usage risque utilis.s par des patients haut risque dans les .tablissements de sant. :
Selon la r.glementation en vigueur en France, (Arrt. du 1er f.vrier 2010
13
) l'objectif de concentration
en L. pneumophila ne pas d.passer est le seuil de d.tection de la m.thode par culture
14
. Le groupe
de travail pr.conise de conserver cet objectif pour les r.sultats de surveillance obtenus par culture et
recommande d'appliquer ce mme objectif de non d.passement du seuil de d.tection de la m.thode
utilis.e, aux r.sultats obtenus par q-PCR
15
Concernant les points d'usage risque utilis.s par des patients haut risque, il convient, en plus de la
surveillance vis--vis de Legionella pneumophila, de proc.der une analyse de risque .tendue au
genre Legionella et toutes autres bact.ries pathognes..
.
D En situation de surveillance aprs une d.contamination
10
L'arrt. du 1er f.vrier 2010 relatif la surveillance des l.gionelles dans les installations de production, de stockage et de
distribution d'eau chaude sanitaire, d.finit point d'usage risque comme tout point d'usage accessible au public et
pouvant produire des azrosols d'eau chaude sanitaire susceptible d'tre contaminze par les lzgionelles ; il s'agit notamment des
douches, des douchettes, des bains [ remous ou [ jets. L
11
Circulaire DGS 2002 243, du 22 avril 2002 : les patients dits patients haut risque sont les immunod.prim.s s.vres,
et particulirement les immunod.prim.s aprs transplantation ou greffe dSorgane et les immunod.prim.s par corticoth.rapie
prolong.e (0,5 mg/kg de prednisone pendant 30 jours ou plus, ou .quivalent) ou r.cente et haute dose (cSest--dire
sup.rieure 5 mg/kg de prednisone pendant plus de 5 jours)
12
D.passement des seuils de gestion fix.s
13
Arrt. du 1er f.vrier 2010 relatif la surveillance des l.gionelles dans les installations de production, de stockage et de
distribution dSeau chaude sanitaire
14
50 UFC /L
15
Selon la norme NF T90-471, le seuil de d.tection de la m.thode par q-PCR est variable en fonction des .ventuelles dilutions
appliqu.es l'.chantillon en pr.sence d'inhibiteurs. l est important que les dilutions .ventuelles n'impactent pas la valeur cible.
Anses
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Aprs une d.contamination chimique ou thermique, il est n.cessaire de v.rifier son efficacit. en
d.nombrant L. pneumophila dans un .chantillon pr.lev. quelques jours aprs le traitement (circulaire
DGS 2002 / 243 du 22 avril 2002). Le fascicule de documentation FD T90-522, "Guide technique de
pr.lvement pour la recherche de Legionella dans les eaux" (2006), pr.conise de r.aliser le
pr.lvement au minimum 48 heures aprs un traitement de d.contamination choc. Ce d.lai est
notamment pr.vu pour permettre le renouvellement de l'eau dans le r.seau et l'.limination des
.ventuelles bact.ries mortes. En termes d'impact sur les r.sultats des m.thodes, les risques de
d.nombrement de fortes proportions de bact.ries mortes, par q-PCR, ou de non d.nombrement de
fortes proportions de bact.ries viables mais non cultivables (VBNC) par culture sont limit.s. De
surcrot, dans le cas d'un traitement de l'eau par un d.sinfectant chlor., il est n.cessaire de traiter
lS.chantillon dSeau par du thiosulfate de sodium pour neutraliser le chlore. Dans ce cas, le risque
d'inhibition par le chlore de la croissance des bact.ries sur les milieux de culture et donc le risque de
faux n.gatifs, sont limit.s.
Le choix de la m.thode la plus appropri.e (culture ou q-PCR) peut tre laiss. la discr.tion du
gestionnaire de l'installation. Dans le cas de la culture, comme dans celui de la q-PCR, la
d.contamination peut tre consid.r.e suffisante si le r.sultat de l'analyse met en .vidence un nombre
de L. pneumophila inf.rieur ou .gal la valeur cible pr.c.demment propos.e. Dans le cas contraire,
une nouvelle action de gestion doit tre envisag.e jusqu' ce que les analyses fassent .tat de
r.sultats inf.rieurs cette valeur cible.
5.1.2.2 Eaux de tour azrorzfrigzrante :
D En situation de suivi de routine
Actuellement, dans un contexte sanitaire, les seuils relatifs aux tours a.ror.frig.rantes fix.s par la
r.glementation franaise concernent Legionella spp. Le groupe de travaiI propose de ne pIus
rechercher Legionella spp., mais seuIement L. pneumophila. Les valeurs cibles en L.
pneumophila pr.conis.es sont les suivantes :
R.sultats obtenus par culture :
- vaIeur ne pas d.passer pour I'eau d'appoint : 250 UFC/L (limite de quantification de la
m.thode) ;
- vaIeur cibIe d'action pour l'eau de l'installation : 10
3
UFC /L ;
- vaIeur cibIe d'arrt pour l'eau de l'installation : 10
5
UFC /L.
R.sultats obtenus par q-PCR :
- vaIeur ne pas d.passer pour I'eau d'appoint : Iimite de quantification de la m.thode (limite
variable) ;
- vaIeur cibIe d'action pour l'eau de l'installation : 5.10
3
UG /L ;
- vaIeur cibIe d'arrt pour l'eau de l'installation : 5.10
5
UG /L.
Les vaIeurs cibIes propos.es pour Ia cuIture et pour Ia q-PCR sont ind.pendantes et ne sont
pas sensu stricto .quivaIentes.
Par ailleurs, une augmentation relative significative de la teneur en Legionella spp. par rapport l'eau
d'appoint (2 log ou plus) pourrait constituer un indicateur de dysfonctionnement de la tour
a.ror.frig.rante. Le mme principe pourrait par ailleurs s'appliquer d'autres indicateurs bact.riens,
tels que l'ATP-m.trie.
D En situation de surveillance aprs une d.contamination
En cas de traitement de d.contamination dSune installation lSarrt, par suite d'une contamination
excessive ou d'un cas de l.gionellose, il est n.cessaire de rincer les circuits afin dS.vacuer les
bact.ries pr.sentes dans l'eau et le cas .ch.ant les r.sidus de produits chimiques. Les proc.dures de
d.sinfection sp.cifient que l'absence de r.sidus de d.sinfection doit tre v.rifi.e aprs le rinage.
Ainsi, le risque de voir un d.nombrement perturb. par la pr.sence de d.sinfectant (pour la m.thode
par culture) ou la pr.sence de bact.ries mortes (pour la m.thode par q-PCR), est diminu.. l est donc
recommand. de laisser la possibilit. d'utiliser la m.thode par culture ou la m.thode par q-PCR. l
convient cependant de mettre les r.sultats disposition du gestionnaire le plus rapidement possible
(q-PCR ou culture selon les contextes locaux). L'interpr.tation des r.sultats devra prendre en compte
les performances analytiques et la particularit. des m.thodes utilis.es.
Selon la r.glementation en vigueur, dans le cadre du suivi de d.contamination, en cas de
d.passement du seuil d'action, il est n.cessaire de d.nombrer L. pneumophila dans un .chantillon
pr.lev. au maximum deux semaines aprs le traitement. En cas de d.passement du seuil d'arrt, la
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r.glementation demande un pr.lvement de contr?le 48h aprs la remise en service (Arrt. du 13
d.cembre 2004). La d.contamination est suffisante si le r.sultat de l'analyse met en .vidence un
nombre de L. pneumophila inf.rieur aux seuils d'action.
En cas de contaminations r.currentes d'un mme site, il convient de r.aliser des investigations
compl.mentaires incluant la conception hydraulique des installations, la pr.sence de biofilms ainsi
que celle de protozoaires.
5.1.3 Besoins d'.tudes et de recherches
L'absence de critres d'interpr.tation des r.suItats du point de vue sanitaire, quelles que soient les
m.thodes alternatives la culture, tient principalement au manque de donn.es analytiques obtenues
par ces diff.rentes m.thodes. A court terme, il est n.cessaire d'affiner les critres d'interpr.tation des
r.sultats retenus pour la q-PCR. A moyen ou long terme, il convient d'.laborer des critres pour les
autres m.thodes qui atteindront un niveau de d.veloppement suffisant.
5.2 ConcIusions et recommandations moyen et Iong termes
Des critres de choix des m.thodes ont .t. d.finis, discut.s et hi.rarchis.s dans le tableau 1
"Pertinence, pour le contr?le sanitaire et la surveillance, des critres de s.lection d'une m.thode de
d.nombrement de Legionella dans l'eau, dans les contextes du suivi des ECS, des TAR et des
d.contaminations".
Les m.thodes actueIIes ne r.pondent pas tous Ies besoins exprim.s. Les deux m.thodes
normalis.es (culture et q-PCR) qui font l'objet des recommandations court terme pr.sentent des
limites largement .voqu.es dans le rapport. Des informations suppI.mentaires sont
potentieIIement apport.es par certaines m.thodes aIternatives, sous r.serve de
d.veIoppements et d'.vaIuations in situ
Aucune des m.thodes alternatives de d.nombrement de Legionella d.crites dans le rapport ne
semble pouvoir satisfaire l'ensemble des attentes identifi.es par les experts. Cependant, les
principes et objectifs de certaines m.thodes d.crites permettent d'envisager de repousser certaines
des limites et il est important d'encourager leur d.veloppement.
Les m.thodes par q-PCR, v-PCR, culture, FSH et DS, pourraient sous certaines conditions,
permettre une prise en compte des Legionella intra-amibiennes ou intra-v.siculaires dans la
quantification.
Les m.thodes de d.nombrement par DVC, v-PCR, DS, DVC-FSH ou culture-FSH semblent
permettre de d.tecter uniquement les bact.ries viables ou de distinguer les bact.ries viables et non
viables.
Les m.thodes de d.nombrement par q-PCR, v-PCR, immuno-d.tection, FSH, et DS permettent
th.oriquement de d.tecter l'ensemble des Legionella viables et potentiellement pathognes.
Les m.thodes de d.nombrement par DVC, q-PCR, v-PCR, immuno-d.tection, FSH, et DS
permettent une obtention relativement rapide des r.sultats d'analyse.
Des am.liorations des milieux utilis.s pour les m.thodes de d.nombrement par culture pourraient
.galement permettre une r.duction du temps d'obtention des r.sultats de ces m.thodes.
Les m.thodes de d.nombrement par immuno-d.tection, FSH, DS, q-PCR et culture-FSH permettent
th.oriquement d'am.liorer la distinction et la quantification des s.rogroupes de L. pneumophila autres
que le s.rogroupe 1.
Besoins d'ztudes et de recherches
Les experts ont mis en .vidence des manques de connaissances qui pourraient justifier Ia
r.aIisation d'.tudes ou d'essais exp.rimentaux. A titre indicatif, et sans tre exhaustif, quelques
pistes d'.tudes et de recherches sont propos.es.
l semble opportun de mener des recherches pour am.liorer les connaissances sur les Legionella
pathognes, notamment des diff.rents clones de L. pneumophila sg1 d.j identifi.s en pathologie
humaine et leur d.tection. De mme, des recherches pourraient tre men.es pour am.liorer les
connaissances sur la notion de dose infectieuse ainsi que sur la pathog.nicit. des Legionella viables
non cultivables.
Pathogznicitz et gznomique
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Le pr.lvement et l'.chantillonnage constituent un enjeu fort des futurs travaux de d.veloppements.
En effet, dans ces deux cas, les m.thodes analytiques applicables l'eau sont utilisables en l'.tat,
condition d'arriver disposer d'un .chantillon repr.sentatif. Aussi, il convient d'encourager le
d.veIoppement de m.thodes de pr.Ivement et d'.chantiIIonnage appIicabIes aux a.rosoIs et
biofiIms.
Echantillonnage
Le d.veIoppement et I'optimisation des pr.traitements des .chantiIIons, pour adapter leurs
caract.ristiques aux m.thodes de d.tection d.j utilis.es ou en cours de d.veloppement, pourraient
permettre d'am.liorer les rendements globaux des d.nombrements de Legionella.
Prztraitement des zchantillons
L'analyse des eaux trs charg.es, reste probl.matique pour l'ensemble des m.thodes utilis.es. La
capture des bact.ries par Ie biais d'anticorps sp.cifiques (s.paration immuno-magn.tique, etc.)
est, dans ce domaine, une piste int.ressante qui demande tre d.velopp.e.
Chaque m.thode .tudi.e possde ses points faibles, que les d.veloppements ult.rieurs devront
s'attacher att.nuer.
Techniques analytiques
Ainsi, il s'agit de s'assurer que les milieux s.lectifs utilis.s en culture pr.sentent une s.lectivit.
.quivalente en termes de d.nombrement pour les diff.rentes espces et sous-types de Legionella.
Par ailleurs, la mise au point de nouveaux miIieux de cuItures pIus adapt.s, en particulier
permettant la croissance de la fraction actuellement non cultivable, est sans nul doute une voie
d'am.lioration de la m.thode par culture. l convient .galement d'.valuer l'efficacit. de nouveaux
antibiotiques, diff.rents de ceux actuellement utilis.s dans le milieu Glycine Vancomycine Polymyxine
Cycloheximide (GVPC), afin de rendre plus efficace la discrimination entre Legionella et flore
interf.rente.
La q-PCR pourrait .galement faire l'objet d'am.liorations. Des d.veloppements visant limiter
l'impact des inhibiteurs et optimiser l'.tape d'extraction de l'acide d.soxyribonucl.ique (ADN)
semblent une voie d'am.lioration int.ressante.
La v-PCR semble fournir une information sur l'.tat de viabilit. des bact.ries. Des .tudes visant
tester cette m.thode sur des eaux environnementales sont cependant encore n.cessaires pour
v.rifier son potentiel.
L'hybridation mol.culaire, peut .galement contribuer r.pondre au problme du d.nombrement de
Legionella dans des eaux trs charg.es. Elle est moins sensible aux inhibiteurs que l'amplification
g.nique et est par ailleurs capable de d.tecter aussi bien les cellules cultivables que les VBNC.
Le d.veloppement de kits prts l'emploi, bas.s sur les diff.rents principes d.j .voqu.s semble
.galement une voie d'am.lioration prometteuse.
Une demande a .t. fortement exprim.e lors des auditions par diff.rents acteurs. Elle concerne un
besoin de d.veIoppement d'outiIs utiIisabIes sur site afin de g.n.rer le plus rapidement possible,
directement sur les lieux d'installation, des r.ponses non ambigus permettant d'am.liorer l'efficacit.
de la surveillance de la qualit. des eaux.
Outils utilisables sur site
Les .cosystmes des l.gionelles sont encore mal caract.ris.s. Des .tudes compl.mentaires sur les
conditions environnementales permettraient de faire progresser les connaissances dans ce domaine.
Matrices et zcosystmes
Bien que l'eau soit la source principale de contamination, les a.rosols sont sa source principale de
diffusion. Leur comportement et constitution sont encore trop m.connus et requirent des .tudes
suppl.mentaires.
Une lacune dans la connaissance des .cosystmes microbiens complexes, en particulier des
biofiIms et de leur capacit. servir de r.servoir aux Legionella a .t. mise en .vidence. Cette lacune
impacte de faon dommageable les possibilit.s de contr?le et il est pr.conis. de la combler.
Le suivi des protozoaires (amibes et cili.s) dans les installations et leur contribution la dangerosit.
des installations risque est trop largement n.glig.. Une maitrise complte du risque ne pourra tre
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envisag.e sur le long terme que si ces deux paramtres sont pris en compte et un effort sensibIe de
Ia recherche dans ces deux domaines est pr.conis..
Des .tudes comparant Ies strat.gies de suivi des instaIIations mettant en 8uvre Ies diff.rentes
m.thodes de d.nombrement disponibles, en commenant par la culture et la q-PCR, pourraient tre
propos.es, notamment en cas de d.contamination, pour optimiser les d.lais entre traitements et
pr.lvements en fonction des m.thodes.
Enfin, il semble important que le d.veloppement des futurs r.seaux intgre la probl.matique des
Legionella et anticipe autant que possible les problmes hydrauliques l'origine de d.veloppement
bact.rien.
Interprztation des rzsultats
Le manque de coh.rence des essais comparatifs mettant en 8uvre les diff.rentes technologies
justifie de mettre en 8uvre des essais grande .cheIIe s'agissant des m.thodes non encore
rod.es. Ces essais permettront d'aboutir terme une standardisation des protocoIes, voire
leur normalisation et de disposer de donn.es suffisantes pour pouvoir les comparer.
Le Comit. d'expert sp.cialis. Eaux et agents biologique adopte le rapport d'expertise associ.
cette synthse et valide cette dernire, le 25 f.vrier 2011.
Maisons-Alfort, le 1
er
mars 2011,
Au nom des experts du CES Eaux et agents biologique ,
Madame Ia pr.sidente du CES
Sylvie Rauzy
Anses
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Pr.sentation des intervenants
Groupe de travaiI D.nombrement des I.gioneIIes dans I'eau
Pr.sident :
M. Claude-Olivier SARDE : Enseignant chercheur l'Universit. de Technologie de Compigne
Membres :
M. Pierre ABASQ : Responsable du laboratoire de microbiologie Environnement Sant. de l'DAC
(Nantes).
Mme S.verine ALLEGRA : Enseignant chercheur de l'Universit. Jean Monnet (Saint-Etienne) ;
M. Philippe CHANTELOUP : Chef du service de microbiologie environnementale du laboratoire du
Conseil G.n.ral du Var (Draguignan) ;
M. Didier HLARE : Chef du d.partement toxines bact.riennes du Centre d'.tudes du Bouchet (Vert
le Petit).
Mme Sophie JARRAUD : Co-directeur du Centre National de R.f.rence des l.gionelles (Lyon).
Mme Christine LAWRENCE : Responsable de l'.quipe op.rationnelle d'hygine de l'H?pital Raymond
Poincar. (Garches).
M. Pierre LE CANN : Enseignant chercheur l'Ecole des Hautes Etudes en Sant. Publique (Rennes).
Mme Marylin LECSO : Praticien attach. dans le service de Bact.riologie-Hygine du groupe
hospitalier de la Piti. Salptrire (Paris), Matre de conf.rences l'universit. Ren. Descartes (Paris)
M. Fabien SQUNAZ : Directeur du Laboratoire d'Hygine de la Ville de Paris (LHVP).
Anses
Coordination scientifique
M. R.mi PORER : Chef de projet l'Unit. d'.valuation des risques li.s l'eau et aux agents
biologiques
ReIecture
Mme Sylvie ZN : Chef de l'Unit. d'.valuation des risques li.s l'eau et aux agents biologiques
Secr.tariat administratif
Mme S.verine BOX : Assistante la Direction d'.valuation des risques
Adoption du rapport par Ie comit. d'experts sp.ciaIis.
Le pr.sent rapport a .t. pr.sent. au Comit. d'experts sp.cialis. Evaluation des risques li.s aux
eaux et aux agents biologiques pour avis et commentaires et adopt. le 25 f.vrier 2011.
Pr.sident du Comit. d'experts sp.ciaIis.
Mme Sylvie RAUZY. Docteur en hydrologie. Responsable qualit.. Office national de l'eau et des
milieux aquatiques (ONEMA). Chimie analytique
Membres du Comit. d'experts sp.ciaIis.
Anses
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M. Rafik ABS. Docteur, ng.nieur, Enseignant-chercheur l'cole de biologie ndustrielle Cergy-
Pontoise. Recherche en m.canique des fluides, hydraulique et mod.lisation.
M. Jean-Jacques BALLET. M.decin immunologiste. Professeur l'universit. et au CHU de Caen et
au Laboratoire d'mmunologie et mmunopathologie. mmunopathologie, infections (n'a pas particip.
aux travaux concernant cette saisine).
M. Jean-Marc BERJEAUD. Matre de conf.rences. Universit. de Poitiers et laboratoire de
microbiologie fondamentale et appliqu.e.
M. Jean-Luc BOUDENNE. Matre de conf.rences. Universit. de Provence, Chef de l'.quipe chimie et
m.trologie des eaux au Laboratoire de Chimie Environnement. M.trologie des eaux, chimie et qualit.
des eaux.
Mme Jeanne BRUGERE-PCOUX. Professeur, sp.cialiste de pathologie m.dicale du b.tail et des
animaux de basse-cour. cole Nationale V.t.rinaire d'Alfort.
M. Pierre-Jean CABLLC. ng.nieur ENGEES et ng.nieur du G.nie Sanitaire. Chef du d.partement
Sant. Environnement de la DDASS du Morbihan. Retrait.. Qualit. des eaux, assainissement,
baignades et process de traitement.
M. Patrick CAMUS. Cadre de Recherche, Chef de laboratoire l'nstitut franais de recherche pour
l'exploitation de la mer (FREMER). cologie, hydrologie, pollution et surveillance des eaux marines.
M. Edmond CREPPY. Professeur l'Universit. de Bordeaux 2, Directeur du Laboratoire de
Toxicologie et dSHygine Appliqu.e. Modes dSaction des toxiques de lSenvironnement.
M. Christophe CUDENNEC. Matre de conf.rences HDR en hydrologie, Agrocampus Ouest et NRA
Rennes. Hydrologie, ressources en eau, am.nagement du territoire, mod.lisation.
M. Christophe DAGOT. Professeur, Responsable Eau et Environnement de l'Universit. de Limoges et
de l'Ecole Nationale sup.rieures d'ing.nieurs de Limoges (ENSL). G.nie des proc.d.s, traitement
des eaux.
M. Sam DUKAN. Docteur en Microbiologie, Responsable d'.quipe au Laboratoire de Chimie
Bact.rienne au centre national de recherche scientifique (CNRS) de Marseille. Chimie bact.rienne,
m.canismes de survie bact.rienne (n'a pas particip. aux travaux concernant cette saisine).
M. Jean-Franois GEHANNO. M.decin du travail. Matre de Conf.rences des Universit.s - Praticien
Hospitalier au centre hospitalier universitaire (CHU) de Rouen au Service M.decine du Travail et
Pathologie Professionnelle - Risques professionnels en particulier biologiques et toxiques.
M. Jean-Pierre GUT. Professeur hospitalo-universitaire. Directeur de lSnstitut de virologie. Universit.
Louis Pasteur. Strasbourg.
M. Didier HLARE. Docteur, expert en microbiologie, Expert d.contamination la DGA - D.sinfection
des agents du risque biologique et stabilit. des agents biologiques dans l'environnement.
M. Jean-Franois HUMBERT. Docteur, Directeur de Recherche l'nstitut national de recherche
agronomique (NRA) de Thonon-les-Bains. cologie microbienne.
M. Abdel LAKEL. ng.nieur de recherche, co-responsable du domaine Air/Eau-Pollution Sant., Pilote
du d.partement Climatologie a.rodynamique pollution .puration au Centre scientifique des
techniques du btiment (CSTB). D.pollution des eaux us.es.
Mme Colette LE BACLE. M.decin du travail, Conseiller m.dical en Sant. au Travail, Pilote de la
th.matique Risques Biologiques l'nstitut national de recherche et de s.curit. (NRS). Risques
biologiques professionnels.
M. Patrick MARCHANDSE. Membre permanent du Conseil g.n.ral de l'environnement et du
d.veloppement durable (CGEDD), MEEDDM. Eau, assainissement, risques sanitaires
Mme Laurence MATHEU. Matre de conf.rences HDR, Ecole pratique des hautes .tudes. LCPME,
UMR 7564 CNRS/Nancy Universit.. Microbiologie, eau, a.rosol, exposition aux contaminants
biologiques
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M. G.rard MOGUEDET. Professeur, Hydrog.ologue agr.e en matire d'hygine publique, Vice
Pr.sident de l'Universit. d'Angers. Hydrologie, hydrog.ologie et pollution des eaux.
Mme Catherine MOUNEYRAC. Professeur en .cotoxicologie aquatique, Directrice de l'nstitut de
Biologie et d'cologie Appliqu.e l'Universit. Catholique de l'Ouest. Ecotoxicologie, biomarqueurs.
Mme Anne-Marie POURCHER. Matre de conf.rences, enseignant - Chercheur au CEMAGREF de
Rennes dans l'Unit. Gestion Environnementale et Traitement biologique des d.chets - Aspect
sanitaire des traitements biologiques des d.chets liquides et solides, survie bact.rienne.
Mme Ren.e RUNGO-MAGS. ng.nieur du centre national des arts et m.tiers (CNAM) en S.curit.
au Travail, ng.nieur S.curit. l'assistance publique-h?pitaux de Paris (APHP).Hygine et s.curit.
professionnelle.
Mme Marie-Pierre SAUVANT-ROCHAT. Professeur de sant. publique, Chef de service l'Universit.
d'Auvergne au Laboratoire Sant. publique et Environnement. Sant. publique et .pid.miologie.
Mme Nicole TANDEAU DE MARSAC. Docteur es Science, Directeur de recherche .m.rite au
Laboratoire de chimie bact.rienne au Centre national de la recherche scientifique (CNRS) de
Marseille. Microbiologie, cyanobact.ries.
Mme Michle TREMBLAY. M.decin en sant. communautaire, M.decin conseil en maladies
infectieuses et en sant. au travail l'nstitut national de sant. publique du Qu.bec (NSPQ) la
Direction de la sant. publique de Montr.al. Risques biologiques professionnels li.s aux eaux.
M. Bernard TRBOLLET. ng.nieur de l'cole Sup.rieure d'lectricit., Docteur d'tat, Directeur de
Recherches l'Universit. de Jussieu au Laboratoire nterfaces et Systmes lectrochimiques.
Biofilms, entartrage, corrosion des mat.riaux en milieux naturels.
Mme sabelle VLLENA. M.decin biologiste, Professeur des Universit.s - Praticien Hospitalier au CHU
de Reims au Laboratoire de Parasitologie et Mycologie. Parasitologie et mycologie, diagnostic et
traitement de zoonoses.
Anses
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Auditions
IPL sant. environnement durabIe : M. Matthieu BERNER, laboratoire PL Midi-Pyr.n.es
Suez environnement :
- Mme Sophie COURTOS : p?le Analyse et Sant., CRSEE (Centre de Recherche sur l'eau et
l'Environnement)
- M. Samuel ROBERT : d.partement Sant. et Environnement, P?le Analyse et Sant., CRSEE
VeoIia environnement :
- Mme Karine DELABRE : Veolia environnement recherche et innovation (VER)
- Mme Florence POTY : Veolia environnement Centre d'analyse environnementale (CAE)
- M. Jean-Philippe PUBARAUD : Veolia Environnement Dalkia (Veolia .nergie), Direction
technique, charg. du risque l.gionelle
EDF :
- Mme Marie BNET : service de recherche et d.veloppement
- Mme France WALLET : service des Etudes M.dicales
Commission T 90E de I'Afnor (charg.e de l'.laboration de la norme NF T90-471) : M. Laurent
GARRELLY, pr.sident de la commission
Association g.n.raIe des Iaboratoires dSanaIyse de ISenvironnement (AGLAE)
- M. Philippe GARN : Directeur d'AGLAE
- M. Olivier MOLNER : Statisticien d'AGLEA
- M. Jean-Marie DELATTRE : Pr.sident d'AGLAE
Participants au projet europ.en EmiIe (EnvironmentaI Monitoring Investigation of Legionella in
Europe)
- Mme Sirine ASSAF : GeneSystems
- M. Bertrand COSSAC : GeneSystems
- M. Philippe HARTEMANN : Universit. de Nancy
L'organisation des auditions men.es par le groupe de travail a .t. pr.c.d.e d'une phase de prise de
contact pr.alable avec prs de 45 laboratoires, industriels, organismes et personnalit.s comp.tentes
dans le domaine du d.nombrement de Legionella (utilisateurs de m.thodes, d.veloppeurs de
m.thodes). Compte tenu du temps disponible pour r.aliser cette .tude, il n'.tait pas envisageable que
le groupe de travail les auditionne tous. Ainsi, ces contacts pr.alables, r.alis.s par t.l.phone ou mail,
ont fait l'objet de comptes-rendus au groupe de travail, qui a ainsi pu .valuer l'int.rt de les compl.ter
ou non par une audition. Le choix des organismes et personnalit.s auditionn.s a ainsi .t. bas. sur
leur capacit. potentielle fournir des informations dont le groupe de travail ne disposait pas d.j.
Pr.alablement aux auditions, chaque organisme auditionn. a .t. sollicit. par un courrier pr.cisant les
informations que le groupe de travail souhaitait aborder (exemples de courriers en annexe 5).
L'objectif premier de ces auditions .tait de collecter des informations provenant d'observations de
terrain ou d'.tudes en cours. l n'y a pas eu de questionnaire mais une liste de points sur lesquels le
groupe de travail souhaitait recueillir la position ou une description des pratiques des personnes
entendues. Les points que le groupe de travail souhaitait aborder en priorit. portaient sur : les
m.thodes utilis.es, les contextes d'utilisation, (r.glementaires, technique, etc.), les informations
attendues, l'interpr.tation des r.sultats, le type de d.cision que pouvaient engendrer les r.sultats
obtenus et les essais de comparaison inter laboratoire.
En pratique, les auditions se sont d.roul.es sous la forme de pr.sentations des personnes
auditionn.es, suivies de discussion de 1 2 heures avec le groupe de travail. Chaque audition a fait
l'objet d'un compte rendu valid. par les personnes auditionn.es.
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Abr.viations et acronymes
ADN : acide d.soxyribonucl.ique,
ADNc : ADN compl.mentaire
ADNr : ADN ribosomal
AFNOR : Agence franaise de normalisation
AFSSA : Agence franaise de s.curit. sanitaire des aliments
AFSSET : Agence franaise de s.curit. sanitaire de lSenvironnement et du travail
ANSES : Agence nationale de s.curit. sanitaire alimentation, environnement, travail
ARN : Acide ribonucl.ique
ARNr : ARN ribosomal
ATP : Ad.nosine triphosphate
BCYE : Buffered charcoal yeast extract ; g.lose tamponn.e lSextrait de levure et au charbon actif
CCLN : Centre de coordination de la lutte contre les infections nosocomiales
CNRL : Centre national de r.f.rence des l.gionelles
CSHPF : Conseil sup.rieur dShygine publique de France
DGS : Direction g.n.rale de la sant.
dATP : D.soxyad.nosine tri-phosphate
dCTP : D.soxycytidine tri-phosphate
dGTP : D.soxyguanosine tri-phosphate
dHPLC: Denaturing High Performance Liquid Chromatography; Chromatographie liquide haute
pression en condition d.naturante
dNTP : D.soxynucl.otides tri-phosphates
dTTP : D.soxythymidine tri-phosphate
DVC : Dead and Viable Count ; comptage viable direct
ECS : Eau chaude sanitaire
EMA : Monoazide d'.thidium
EWGL : European Working Group for Legionella nfections
FAO : Food and Agricultural Organization ; Organisation des nations unies pour l'alimentation et
l'agriculture
FCM : Flow Cytometer ; cytomtre en flux
FSH : Fluorescence n Situ Hybridation ; Hybridation in situ fluorescente
GT : Groupe de travail
GVPC : Glycine Vancomycine Polymyxine Cycloheximide
DS : mmunological Double Staining ; double marquage immunologique
MS : S.paration immuno-magn.tique
nVS : nstitut de veille sanitaire
RDEFA : nstallations de refroidissement par dispersion d'eau dans un flux d'air
SO : nternational Standard Organization ; Organisation internationale de normalisation
LD : Limite de d.tection
LPS : lipopolysaccharides
LQ : Limite de quantification
MALD : Matrix Assisted Laser Desorption onization ; desorption-ionisation laser assist.e par matrice
mip : Macrophage nfectivity Potentiateur ; potentiateur d'infectivit. des m.crophages
PCR : Polymerase Chain Reaction ; r.action de polym.risation en chane
PMA : Monoazide de propidium
q-PCR : real time quantitative PCR ; PCR quantitative en temps r..l
RT-PCR : Reverse Transcriptase PCR ; PCR aprs transciption inverse
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r
2
: Coefficient de corr.lation
TAR : tour a.ror.frig.rante
TOF : Time-Of-Flight : temps de vol
TVC : Total Viable Count ; comptage viable total
UFC : Unit. formant colonie
UG : Unit. g.nome
VBNC : Viable But NonCulturable ; Viable mais non cultivable
VLEP : Valeurs limites d'exposition professionnelle
v-PCR : viability PCR ; PCR Viable
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Introduction
Contexte
L'incidence de la l.gionellose a diminu. en France depuis 2006 pour se stabiliser aux alentours de
1200 cas d.clar.s par an (1206 cas enregistr.s en 2009, BEH n31-32 du 27 juillet 2010), grce
notamment une meilleure identification des sources potentielles de contamination. Cependant, cette
identification se heurte aux limites des m.thodes de d.tection et de d.nombrement des l.gionelles
(Legionella) dans l'environnement.
Selon la r.glementation franaise actuellement en vigueur, la recherche et le d.nombrement de
Legionella spp. et / ou de Legionella pneumophila :
- est obligatoire :
U dans les tours a.ror.frig.rantes, une fois par mois pendant la p.riode de fonctionnement de
l'installation
1
U dans les eaux min.rales destin.es des usages th.rapeutiques dans les .tablissements
thermaux, une fois par mois aux points d'usage les plus sensibles (arrt. 19 juin 2000) ;
(arrt.s du 13 d.cembre 2004) ;
U dans les r.seaux d'eau chaude sanitaire des .tablissements de sant., des .tablissements
sociaux et m.dico-sociaux d'h.bergement pour personnes g.es, des autres .tablissements
sociaux et m.dico-sociaux, des h?tels, des r.sidences de tourisme, des campings et des
.tablissements p.nitentiaires, une fois par an aux points d'usage repr.sentatifs (Arrt. du 1
er
f.vrier 2010) ;
- sera obligatoire, une fois par an aux points d'usage repr.sentatifs (Arrt. du 1
er
f.vrier 2010),
compter du 1
er
janvier 2012 pour les autres .tablissements recevant du public.
l est clairement indiqu. dans les arrt.s du 13 d.cembre 2004, relatifs aux installations de
refroidissement par dispersion dSeau dans un flux dSair soumises autorisation et du 1
er
f.vrier 2010,
relatif la surveillance des l.gionelles dans les installations de production, de stockage et de
distribution d'eau chaude sanitaire, que seuls les r.sultats d'analyse produits avec la m.thode par
culture, telle que d.crite dans la norme NF T90-431 "Recherche et d.nombrement de Legionella spp.
et de Legionella pneumophila par culture sur milieux g.los.s", sont reconnus par les pouvoirs publics.
Les valeurs cibles r.glementaires, .tablies en unit.s formant colonies (UFC) par litre, reposent donc
sur la m.thode par culture. Elles sont d.taill.es dans le chapitre "Seuils de gestion et mesures
pr.conis.es par la r.glementation en vigueur".
Cette m.thode par culture est .galement syst.matiquement mise en 8uvre lors d'investigations
.pid.miologiques de cas de l.gionellose.
Toutefois la m.thode par culture, telle que d.crite dans la norme NF T90-431, pr.sente certains
inconv.nients :
D le rendu des r.sultats d.finitifs n.cessite un d.lai minimum de 8 jours aprs la mise en culture
(des r.sultats interm.diaires pouvant cependant tre rendus au bout de 3 5 jours). Ce d.lai
peut poser des problmes pour la gestion des installations concern.es, notamment pour lever
des mesures restrictives d'utilisation d'eau (ex : interdiction d'utilisation de douches dans
l'attente de r.sultats n.gatifs, etc.) ;
D l'ensemble des diff.rentes formes de Legionella potentiellement pr.sentes dans l'eau n'est
pas pris en compte par cette m.thode. En effet :
- la m.thode permet le d.nombrement de Legionella libres, viables et cultivables
2
- elle ne permet pas le d.nombrement de Legionella viables non cultivables ;
, dans
les .chantillons d'eau ;
- le d.nombrement par culture de Legionella contenues dans des protozoaires ou des
v.sicules externes de ces protozoaires est peu document. et il existe des incertitudes
quant la capacit. de cette m.thode les d.nombrer correctement.
Face ces inconv.nients, plusieurs autres techniques d'analyses ont vu le jour et sont aujourd'hui
utilis.es ou en cours de d.veloppement par les exploitants pour l'autosurveillance
3
1
Si, pendant une p.riode d'au moins 12 mois continus, les r.sultats des analyses mensuelles sont inf.rieurs 1 000 unit.s
formant colonies par litre d'eau, la fr.quence des pr.lvements et analyses des Legionella spp selon la norme NF T90-431
pourra tre au minimum trimestrielle
des installations.
2
Ces termes sont d.finis dans le chapitre 1.6.
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Par ailleurs de nouvelles approches bas.es sur des m.thodes ayant fait leurs preuves pour d'autres
applications ou sur des technologies .mergentes apparaissent dans la litt.rature ou sur le march..
Pour pouvoir .valuer la pertinence de chacune des m.thodes disponibles, pr.alablement toute
.tude d'.quivalence, il apparat n.cessaire de conduire une .tude des caract.ristiques et des
performances pour le d.nombrement de Legionella dans les r.seaux d'eau chaude sanitaire et dans
les eaux des circuits de refroidissement des tours a.ror.frig.rantes, de manire .valuer la
pertinence de leur mise en 8uvre en fonction du type d'eau analyser.
En compl.ment de cette description du contexte, des listes des textes r.glementaires, l.gislatifs et
normatifs relatifs aux Legionella sont propos.es en annexes 2 et 3 du pr.sent document.
Objet de Ia saisine
L'Agence franaise de s.curit. sanitaire de l'environnement et du travail (Afsset) a .t. saisie le 29
juillet 2009 par la Direction g.n.rale de la sant. (DGS) et la Direction g.n.rale de la pr.vention des
risques
4
Les objectifs du contrat d'expertise .taient plus particulirement les suivants :
sur les m.thodes de d.tection des l.gionelles dans l'eau (Annexe 1).
1. D.crire les m.thodes pr.-analytiques (pr.paration de l'.chantillon avant analyse) et analytiques
connues pour la d.tection et le d.nombrement sp.cifique de l.gionelles dans l'eau (culture, biologie
mol.culaire (PCR), immuno-d.tection, etc.). Cette description avait notamment pour finalit. d'identifier
les questions auxquelles r.pondent les m.thodes et leurs limites th.oriques. Elle devait tre bas.e
sur une recherche bibliographique ;
2. Etudier la pertinence (avantages et inconv.nients) de la mise en 8uvre de ces m.thodes
analytiques pour le contr?le sanitaire des eaux chaudes et le contr?le r.glementaire des eaux de
circuits de refroidissement des tours a.ror.frig.rantes, en fonction de leurs besoins et contraintes
respectives :
D dans un premier temps, cette .tude devait viser analyser les avantages et inconv.nients des
diff.rentes m.thodes, notamment sur les questions des contraintes de faisabilit. technique et
des co`ts ;
D dans un second temps, si des m.thodes apportant une plus-value technique par rapport la
m.thode par culture .taient mises en .vidence, la pertinence de leur mise en 8uvre dans le
cadre des contr?les r.glementaires devait tre .valu.e. S'agissant des m.thodes identifi.es,
une r.flexion pouvait notamment tre men.e concernant les seuils r.glementaires et, le cas
.ch.ant, leur r.vision.
3. Si n.cessaire, identifier les essais exp.rimentaux permettant de v.rifier ou d'infirmer les
hypothses avanc.es concernant la pertinence des m.thodes recens.es, et le cas .chant le
lancement des .tudes n.cessaires.
ModaIit.s de traitement : moyens mis en 8uvre et organisation
L'expertise a .t. men.e conform.ment aux exigences de la norme NF X 50-110 relative la qualit.
en expertise (AFNOR, 2003), avec l'appui du CES "Evaluation des risques li.s aux eaux et aux agents
biologiques".
Un groupe de travail (GT) a .t. constitu. en veillant notamment la comp.tence et l'ind.pendance de
ses membres.
Le GT s'est r.uni 21 reprises entre le 15 f.vrier 2010 et le 14 octobre 2010. Sur la base d'une
synthse bibliographique produite par l'Afsset, le GT a poursuivi la collecte d'.l.ments
bibliographiques, proc.d. 7 auditions formelles
5
3
Surveillance r.alis.e par les exploitants d'installation, distinguer du contr?le r.glementaire, reconnu par les autorit.s.
et analys. l'ensemble des donn.es collect.es pour
formuler ses conclusions et recommandations. Ces auditions ont permis de compl.ter les informations
recueillies dans la bibliographie, en les comparant avec les tendances et hypothses d.j publi.es. Le
rapport .tablit une distinction entre les .l.ments issus de la bibliographie et ceux issus des auditions.
4
L'Afsset et l'Agence franaise de s.curit. sanitaire des aliments (Afssa) ont fusionn. pour donner naissance l'Agence
nationale de s.curit. sanitaire (Anses), le 1
er
juillet 2010. Ainsi, la r.ponse la saisine de l'Afsset est donn.e sous forme d'un
rapport de l'Anses.
5
Les 7 organismes auditionn.s sont : l'stitut Pasteur Lille (PL) sant. environnement durable, Suez environnement, Veolia
environnement, EDF, le pr.sident de la Commission T 90E de l'Afnor, l'Association g.n.rale des laboratoires dSanalyse de
lSenvironnement (AGLAE) et des participants au projet europ.en Emile. Ces organismes ont .t. s.lectionn.s par le GT aprs
en avoir contact. pr.alablement prs de 45 pour .valuer la n.cessit. d'une audition.
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Les travaux d'expertise du groupe de travail ont .t. soumis r.gulirement au CES ".valuation des
risques li.s aux eaux et aux agents biologiques". Le rapport produit par le groupe de travail tient
compte des observations et .l.ments compl.mentaires transmis par les membres du CES.
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1 Description et sp.cificit.s du genre Legionella
1.1 Caract.ristiques g.n.raIes
Les bact.ries du genre Legionella appartiennent la famille des Legionellaceae. Actuellement 58
espces de Legionella sont identifi.es
6
, dont la plus fr.quemment isol.e chez les patients est
Legionella pneumophila. Ces espces peuvent tre divis.es en s.rogroupes
7
; ainsi environ 70
s.rogroupes de Legionella diff.rents sont actuellement connus. Pour l'espce L. pneumophila, 16
s.rogroupes ont .t. d.finis ce jour. Au sein d'un mme s.rogroupe, des sous groupes ont .t.
d.finis selon leurs propri.t.s immunologiques et g.nomiques (par exemple, une Legionella
pneumophila de s.rogroupe 1 peut tre de sous-type
8
Les bact.ries du genre Legionella sont des bacilles Gram n.gatif a.robies, qui mesurent de 0,2
0,9 0m de large sur 2 200m de long. Elles ne sont ni capsul.es, ni sporul.es, et peuvent tre
mobiles grce 1 ou 2 flagelles polaires. Elles sont caract.ris.es par une croissance relativement
lente et ont besoin pour se multiplier de L-cysteine et de Fer (Fe
2+
ou Fe
3+
). l a cependant .t. observ.
sur trois espces isol.es de cas cliniques (L. jordanis, L. oakridgensis, L. spiritensis) une perte de la
d.pendance vis--vis de la cyst.ine (Orrison et al. 1983).
Pontiac, Philadelphie, etc.). La classification
EWGL (European Working Group for Legionella nfections) tend homog.n.iser la classification
d.crite ici (Luck et al. 2009).
Dans l'environnement et le milieu hydrique en particulier, leur survie et leur croissance sont
influenc.es par de nombreux paramtres (Avril et al. 2000; Bhopal et al. 1991; Bollin et al. 1985;
Borella et al. 2004; Ciesielski et al. 1984; Den Boer et al. 2002; Dennis et al. 1984; Fields et al. 2002;
Habicht and Muller 1988; Hoebe and Kool 2000; Keller et al. 1996; Leoni et al. 2001; Pongratz et al.
1994; Rogers et al. 1994; States et al. 1985; Stout et al. 1985; Wadowsky et al. 1985; Zacheus and
Martikainen 1994) :
D la temp.rature : croissance optimale 35C, multiplication entre 20 et 45C ; survie entre 6 et
66C ;
D le pH (tol.rance d'une large gamme de pH entre 5,5 et 10) ;
D les concentrations en ions fer et zinc ;
D les conditions hydrauliques (stagnation .ventuelle de l'eau) ;
D la pr.sence d'autres microorganismes : les .tudes montrent que dans des conditions
environnementales d.favorables (temp.rature, pr.sence de d.sinfectant, etc.), Legionella spp
se d.veloppent beaucoup mieux et plus rapidement lorsqu'elles sont co-cultiv.es avec des
amibes. La pr.sence de certaines bact.ries et de biofilms
9
1.2 Association de Legionella avec d'autres composantes du miIieu
ou de cyanobact.ries qui agissent
sur la pr.sence de nutriments dans le milieu, peut .galement influer sur la suivie et/ou le
d.veloppement de Legionella (Declerck 2010).
1.2.1 Association avec Ies protozoaires
En dehors des bact.ries, les eaux douces sont g.n.ralement colonis.es par de nombreux
protozoaires, parmi lesquels figurent au premier rang les amibes et les cili.s (Cavalier-Smith 1993;
Finlay and Esteban 1998).
6
http://www.dsmz.de/microorganisms/bacterial_nomenclature_info.php?genus=LEGONELLA
*
Un s.rogroupe est th.oriquement une subdivision taxonomique dSune espce bas.e sur des caract.ristiques
immunologiques, savoir la pr.sence d'.pitopes antig.niques reconnus sp.cifiquement par un s.rum, g.n.ralement polyclonal
et produit chez le lapin. Toutefois, eu .gard la nature polyclonale de ce s.rum, une certaine r.activit. crois.e est possible
(par exemple, reconnaissance de bact.ries appartenant au genre mais pas lSespce concern.e).
Q
Un sous-type est une subdivision taxonomique bas.e sur l'identit. g.n.tique conf.r.e par l'analyse de s.quence ADN d'une
souche isol.e avec celle dSune souche de r.f.rence d.j caract.ris.e (par exemple dans le cas des legionelles, lors dSun
.pisode contaminant ant.rieur, le lieu de contamination : Paris, Corby, Bellingham, Philadelphia, Knoxville, Lens, etc...)
9
Un biofilm est un systme m.tastable, r.sultant (1) de la multiplication des bact.ries fix.es sur un support et du d.p?t de
bact.ries provenant de la phase eau, (2) de l'.rosion continue, conduisant un relargage constant de microorganismes dans la
phase eau (Ascon-Cabrera 1995; Declerck 2010; Rittman 1989). En d'autres termes, la contamination bact.rienne de l'eau d'un
r.seau est directement li.e au biofilm et particulirement la croissance et l'arrachage des bact.ries fix.es. A l'inverse, la
dynamique du biofilm est .galement influenc.e par la qualit. de l'eau son contact.
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Les amibes sont des protozoaires de taille variant entre 10 Vm et 1 mm de longueur (200 -500 Vm en
moyenne). Elles vivent en milieu aqueux, dans lequel elles se d.placent le plus souvent par reptation
l'aide de pseudopodes. Certaines sont .quip.es de flagelles pour assurer leur mobilit.. Elles se
reproduisent par fission binaire et se nourrissent par phagocytose de microalgues, de protozoaires
plus petits et de bact.ries (Corsaro et al. 2010). Leur implication dans le d.veloppement de nombreux
micro-organismes pathognes est d.sormais av.r.e (Berk et al. 1998; Pagnier et al. 2009; Thomas et
al. 2006). Dans leur milieu naturel, les conditions affectant g.n.ralement la croissance des amibes
sont le pH, la temp.rature, la salinit. et la teneur en souffre (acide sulfurique) (Rodriguez-Zaragoza
1994). Les amibes sont capables de se d.velopper des temp.ratures trs vari.es, dans des plages
sp.cifiques chaque espce (Griffin 1972). La temp.rature id.ale moyenne de croissance en milieu
liquide pour le genre Acanthamoeba semble se situer entre 30 et 37C. Cependant, il existe des
variantes thermor.sistantes susceptibles de crotre des temp.ratures plus .lev.es (De Jonckheere
1980).
Les cili.s sont des protozoaires binucl..s pouvant atteindre 2 mm de long et caract.ris.s par la
pr.sence constante ou provisoire de cils vibratiles leur surface. ls sont pr.sents dans les eaux
douces, saumtres et marines oM ils existent sous diverses formes : formes libres nageuses, formes
fixes p.doncul.es, formes coloniales, formes parasitaires non pathognes ou formes symbiotiques.
Les cili.s sont h.t.rotrophes et se nourrissent de particules organiques, de bact.ries, dSautres cili.s,
de flagell.s voire dSanimaux microscopiques. Leurs structures orales se sp.cialisent selon leur r.gime
alimentaire (Baroin-Tourancheau et al. 1992; Lynn and Corliss 1991).
La relation entre Legionella et protozoaires est connue depuis une trentaine d'ann.es. Elle a
particulirement .t. .tudi.e pour L. pneumophila (Rowbotham 1983), notamment avec des amibes
des genres Naegleria, Acanthamoeba (Kuiper et al. 2004; Newsome et al. 1985; Newsome et al.
1998; Tyndall and Domingue 1982; Wadowsky et al. 1991) ou des cili.s de genre Tetrahymena
(Faulkner et al. 2008; Fields et al. 1984; Gardu[o et al. 2006). Ces protozoaires sont des h?tes
naturels de Legionella (Fields et al. 2002) et constitueraient mme, selon certains auteurs, leur
principal r.servoir dans l'environnement (Cirillo et al. 1994; Fields et al. 1989). En effet, les Legionella
sont capables de se multiplier de manire importante en leur sein (Holden et al. 1984; Rowbotham
1983) et il est suppos. que les protozoaires, en particulier les amibes, constituent un
microenvironnement propice la multiplication bact.rienne dans un milieu ext.rieur d.favorable (par
exemple, carenc. en nutriment). La croissance de Legionella requiert en effet la pr.sence minimale
de nutriments sp.cifiques, ainsi qu'en t.moigne la composition particulire des milieux de culture
utilis.s pour leur isolement.
Une fraction des Legionella, appel.es viables non cultivables (VBNC), ne se d.veloppe pas dans les
conditions de culture usuelles. Or le s.jour de L. pneumophila l'int.rieur des protozoaires, en
particulier les amibes, permettrait de faire passer L. pneumophila d'un .tat viable non cultivable un
.tat viable cultivable
10
Le maintien ou la croissance des Legionella dans les protozoaires se produit au sein de v.sicules
digestives ayant des devenirs diff.rents selon que l'h?te est une amibe ou un cili. :
(Moritz et al. 2010; Oliver 2009). Ceci conduit consid.rer que certains
.l.ments, n.cessaires la croissance des VBNC, comme certains nutriments, ne seraient pas
pr.sents dans les milieux de culture, alors qu'ils le seraient dans l'environnement intracellulaire des
protozoaires (Fields et al. 2002).
V chez les cili.s, les v.sicules digestives accumulent les Legionella, lesquelles subissent ensuite
une digestion partielle. Le r.sultat de cette digestion est la formation d'une pelote contenant
la plupart du temps des Legionella dig.r.es et un nombre variable de Legionella intactes
potentiellement infectieuses. La pelote est ensuite relargu.e dans le milieu ext.rieur (Gardu[o et
al. 2006).
V chez les amibes, les Legionella ing.r.es subissent un cycle d'amplification intracellulaire dont le
principe a .t. d.crit pour L. pneumophila et l'h?te A. polyphaga par Robowtham. Succinctement,
des Legionella sont phagocyt.es et forment une v.sicule digestive oM elles se multiplient en
perdant leur mobilit.. La v.sicule perd ses capacit.s digestives et envahit peu peu le
cytoplasme. Elle est susceptible de se rompre, entrainant la lyse de l'amibe et la lib.ration de
Legionella redevenues mobiles. Dans certains cas, l'amibe libre .galement des v.sicules
10
Les diff.rents .tats de viabilit. d'une bact.rie sont d.finis ult.rieurement dans le chapitre Signification sanitaire de la
pr.sence de Legionella viables non cultivables
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F.vrier 2011 page 30 / 144
encore intactes dont le diamtre se situe majoritairement entre 1 et 5 Vm (Berk et al. 1998;
Rowbotham 1980; Rowbotham 1983; Rowbotham 1986). Ces petites v.sicules sont
souponn.es tre des vecteurs particulirement efficaces d'infection par les Legionella (Berk et
al. 1998; Philippe et al. 2006). En effet, leur taille les rend aptes tre inhal.es profond.ment
dans l'arbre bronchique et la membrane amibienne qui les entoure est suspect.e favoriser leur
fusion avec la membrane des cellules de l'.pith.lium pulmonaire (Berk et al. 1998). La survie de
ces v.sicules dans l'environnement peut tre extrmement longue (sup.rieure plusieurs mois),
ce qui en accentue la dangerosit. (Bouyer et al. 2007).
l est g.n.ralement admis que la prolif.ration de Legionella libres dans le milieu est optimale lorsque
la temp.rature avoisine les 35C ou a minima l'int.rieur d'une plage s'.tendant de 20 et 45C
(Fields et al. 2002). Le fait que les amibes constituent un important r.servoir multiplicatif suggre
fortement que l'association amibes - Legionella est .galement influenc.e par la temp.rature. l semble
d.sormais .tabli que L. pneumophila infecte de manire optimale les formes trophozoEtes
d'Acanthamoeba des temp.ratures sup.rieure 25C (Berk et al. 1998; Cirillo et al. 1994;
Rowbotham 1986).
Les observations ci-dessus tendraient montrer que c'est .galement vers 35C que le relarguage de
v.sicules par les trophozoEtes est optimal. Ces trophozoEtes amibiens sont toutefois susceptibles de
se transformer en kystes lors de l'apparition de conditions d.favorables (carence en nutriments,
exposition certains agents chimiques ou baisse de temp.rature). L'enkystement induit une digestion
partielle des v.sicules intracellulaires et paralllement un relarguage dans l'environnement d'une
fraction des v.sicules non ou partiellement dig.r.es, lesquelles contiennent donc de nombreuses
Legionella infectieuses (Berk et al. 1998; Ohno et al. 2008; Schuster 1979). l semble en effet que les
Legionella infectieuses (caract.ris.es par une reprise de mobilit.) soient susceptibles de r.sister la
digestion par l'amibe (Fields 1996).
De la mme manire, les amibes confrent aux Legionella qu'elles h.bergent une protection dans un
environnement d.favorable. Cette protection augmente encore dans l'amibe enkyst.e dont la paroi
est plus r.sistante que celle des trophozoEtes. Elle permet aux Legionella intracellulaires d'tre
prot.g.es vis--vis des temp.ratures trs .lev.es, normalement l.tales, voire vis--vis de la
chloration (Breiman et al. 1990; Cirillo et al. 1999; Fields et al. 2002; Holden et al. 1984; Kilvington and
Price 1990; Rowbotham 1980; Steinert et al. 2002; Thomas et al. 2004).
Le ph.nomne d'enkystement et de relarguage basse temp.rature (inf.rieure 20C) a .t. mis en
.vidence pour L. pneumophila h.berg.e par A. castellanii (Ohno et al. 2008). Ceci suggre que si une
hausse de temp.rature favorise l'augmentation de Legionella libres dans le milieu en stimulant leur
croissance, une baisse de temp.rature favorise .galement un accroissement de leur population dans
l'environnement et potentiellement de dangerosit. par un m.canisme non prolif.ratif, li. au relarguage
massif des v.sicules amibiennes suite l'enkystement. Berk et al. suggrent qu'un processus
similaire peut tre provoqu. par l'adjonction de biocides (Berk et al. 1998).
Les protozoaires constituent un r.servoir av.r. de Legionella et contribuent leur protection contre
les stress environnementaux (notamment les traitements de d.sinfection), favorisent leur
multiplication et leur revivification, et semblent accrotre leur pathog.nicit. pour l'homme. Compte tenu
de ces .l.ments, la pr.sence de protozoaires est un facteur prendre en consid.ration lors du suivi
des installations, en particulier la suite d'un traitement de d.sinfection, et pourrait tre l'origine
d'une recontamination plus rapide de l'installation.
1.2.2 Association avec Ie biofiIm
L. pneumophila est capable de survivre dans les biofilms pr.sents l'int.rieur de canalisations
(Declerck 2010; Fields et al. 2002; Frre 2009; Kuiper et al. 2004; Moritz et al. 2010). Une .tude de
Rogers et al., a montr. que la proportion de L. pneumophila cultivables dans le biofilm et dans la
phase planctonique varie avec la temp.rature (Rogers et al. 1994). Selon cette .tude oM les
Legionella ont .t. d.nombr.es par culture dans une installation simulant une canalisation d'eau
potable 20C, L. pneumophila repr.sente une faible proportion de la population bact.rienne
cultivable (0,1%), aussi bien dans la phase planctonique que dans le biofilm. A 40C, L. pneumophila
repr.sente 12 % des bact.ries cultivables de la phase planctonique et 50 % du biofilm. A 50C, L.
pneumophila, est encore capable de survivre, mais ne repr.sente plus que 0,7 % des bact.ries
Anses
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cultivables de la phase planctonique et 0,1 % du biofilm. A 60C la bact.rie est ind.tectable aussi bien
dans le biofilm que dans la phase planctonique.
Selon certains auteurs L. pneumophila peut se multiplier dans ces biofilms en pr.sence de
protozoaires comme l'amibe Hartmannella vermiformis (Abu Kwaik et al. 1998; Kuiper et al. 2004; Lau
and Ashbolt 2009; Moritz et al. 2010; Murga et al. 2001). Certains auteurs supposent .galement que
le complexe nutritif constitu. par un biofilm peut permettre une multiplication de Legionella en dehors
d'une cellule de protozoaire h?te. Cette dernire hypothse reste cependant encore v.rifier (Fields
et al. 2002; Rogers and Keevil 1992).
Ainsi L. pneumophila peut avoir .t. .limin.e de l'eau libre et persister dans les biofilms des
canalisations, probablement si un protozoaire h?te de Legionella y est .galement pr.sent, voire peut-
tre mme s'y multiplier en l'absence de protozoaire h?te. Lorsqu'elle est r.v.l.e par une analyse par
culture, l'absence de L. pneumophila dans un pr.lvement d'eau ne signifierait donc pas
n.cessairement que L. pneumophila est totalement absente du r.seau dans lequel le pr.lvement a
.t. effectu.. Cette mise en garde, l.gitim.e pour L. pneumophila, peut probablement tre .tendue
tout le genre.
Le biofilm constitue un r.servoir av.r. de Legionella et contribue leur survie et leur protection contre
les stress environnementaux, notamment les traitements. De surcrot, il favorise le d.veloppement de
nombreux protozoaires. Compte tenu de ces .l.ments, la pr.sence de biofilm est un facteur prendre
en consid.ration lors du suivi des installations et pourrait .galement contribuer la recontamination
plus rapide de l'installation, aprs un traitement de d.sinfection.
1.3 M.canismes conduisant Ia contraction d'une I.gioneIIose
Chez l'Homme, la contamination par les bact.ries du genre Legionella s'effectue par l'inhalation d'un
a.rosol compos. de fines gouttelettes d'eau contamin.e. L'infectiosit. d'un a.rosol est li.e
diff.rents paramtres : ses caract.ristiques physiques, dont la taille des gouttelettes, sa concentration
en Legionella et leur capacit. de survie dans l'a.rosol. Ainsi, il est admis qu'un a.rosol ne peut tre
infectieux que si les gouttelettes d'eau qui le composent sont suffisamment petites pour atteindre les
alv.oles pulmonaires (diamtre inf.rieur ou .gal 5 0m) (Bollin et al. 1985; Girod et al. 1982) et assez
grandes pour contenir une ou plusieurs bact.ries (diamtre sup.rieur 2 0m) (Baron and Willeke
1986).
Aprs avoir p.n.tr. dans l'arbre pulmonaire, L. pneumophila .tablit un foyer infectieux au sein de
l'alv.ole pulmonaire oM la bact.rie interagit avec les macrophages et les cellules .pith.liales (Mody et
al. 1993). Sur les modles exp.rimentaux animaux, un important accroissement de l'inoculum
bact.rien est observ. dans le cul de-sac alv.olaire, jusqu' la 48
me
72
me
heure aprs l'inoculation.
Aprs une p.riode de multiplication des L. pneumophila, la cellule infect.e est lys.e, causant
d'importantes l.sions au niveau de la barrire alv.olo-capillaire. Ceci peut expliquer la diss.mination
de L. pneumophila d'autres zones pulmonaires et la d.compartimentation extrapulmonaire par voie
h.matogne, un m.canisme mis en .vidence in vivo (Ader et al. 2008; Brieland et al. 1997).
1.4 Pertinence du d.nombrement de Legionella versus d.tection
L'attention s'est port.e sur le genre Legionella en 1976, quand 182 personnes logeant dans un h?tel
de Philadelphie ont pr.sent. des infections respiratoires provoquant 34 d.cs. La plupart des
malades participaient la 56
me
convention de lSAmerican Legion, d'oM le nom "maladie du
l.gionnaire".
La dose infectante chez l'homme est inconnue. Seules sont connues les doses infectantes obtenues
sur des modles exp.rimentaux animaux reproductibles et valid.s : cobayes, souris consanguines et
primates (Ader et al. 2008; Berendt et al. 1980; Breiman et al. 1990; Brieland et al. 1997).
Dans ces diff.rentes .tudes, l'infection se fait par le biais d'un a.rosol infect. ou par instillation intra-
trach.ale directe. Dans le cadre de ces .tudes, la biomasse bact.rienne n.cessaire pour induire une
infection in situ au contact de l'interface .pith.liale alv.olaire de l'animal expos. a pu tre .valu.e :
D un inoculum de 10
6
UFC provoque une l.gionellose de type fivre de Pontiac, avec une survie
de 100% des animaux expos.s ;
D un inoculum de 10
7
UFC provoque une l.gionellose chez les animaux expos.s avec un taux
de mortalit. proche de celui observ. chez de l'Homme soit 10 25% ;
D un inoculum sup.rieur ou .gal 10
8
UFC est syst.matiquement l.tal pour l'animal.
Anses
F.vrier 2011 page 32 / 144
Toutefois, ces observations ne prennent pas en compte certains paramtres tels que :
D le taux de transfert bact.rien air-alv.oles ;
D les modifications anatomo-fonctionnelles induites par les pathologies broncho-pulmonaires
chroniques, dont le tabagisme est le principal promoteur, qui facilitent l'implantation
bact.rienne.
Les scientifiques s'accordent sur les points suivants : le d.veloppement et la gravit. de la maladie
sont conditionn.s par le niveau d'exposition. Plus l'a.rosol v.hicule un nombre important de
Legionella viables, plus l'inoculum atteignant les voies a.riennes inf.rieures serait important et plus
cela aurait un impact sur la morbi-mortalit.. Au-del d'une valeur critique d'exposition repr.sentant la
quantit. minimale de bact.ries atteignant l'alv.ole n.cessaire l'induction d'une maladie, il existerait
une relation dose-r.ponse
11
proportionnelle entre exposition et d.veloppement de la maladie
traduisant un "effet inoculum". Ainsi, il apparat par exemple que plus la quantit. de Legionella rejet.e
dans les panaches des tours a.ror.frig.rantes est importante et plus le risque infecieux pour les
populations environnantes est .lev. (Berendt et al. 1980; Breiman et al. 1990; Brieland et al. 1997).
Compte tenu de ces .l.ments, il apparat important de d.nombrer les Legionella dans les .chantillons
d'eau et de ne pas se limiter leur d.tection.
1.5 Pertinence de Ia recherche de L. pneumophila versus L. spp
En France, les donn.es de l'nVS sur 11147 cas confirm.s de l.gionellose entre 1998 et 2008
montrent que 88 % des cas diagnostiqu.s par l'ensemble des tests d'antig.nurie, de s.rologie et de
culture, sont dus Legionella pneumophila s.rogroupe 1. Pour 18 % de l'ensemble des cas
diagnostiqu.s, des pr.lvements pulmonaires
12
En Europe, les donn.es sur 10 715 cas d.clar.s de l.gionellose en 2007 et 2008 rapport.s par 34
pays montrent que 79,6% des cas .taient dus L. pneumophila s.rogroupe 1, 15 % un autre
s.rogroupe de L. pneumophila et 5,4% une autre espce de Legionella. Sur les 1042 isolats
disponibles, 86,0% .taient des L. pneumophila s.rogroupe 1, 7.5% .taient des L. pneumophila
s.rogroupes 2-16, avec une pr.dominance du s.rogroupe 3 (3,2%) et du s.rogroupe 6 (1,2%), et
3,6% .taient des L. pneumophila de s.rogroupe inconnu ou non identifi.es. Dix neuf isolats .taient
identifi.s comme une espce Legionella non pneumophila: L. anisa (n=2), L. bozemanii (n=4), L.
dumoffii (n=1), L. gormanii (n=1), L. longbeachae (n=9), L. maceachernii (n=1), L. wadsworthii (n=1).
Pour 14 isolats, l'espce n'a pas .t. identifi.e (Joseph et al. 2010).
ont permis d'isoler des souches de Legionella
d'origine clinique. Parmi ces souches, l'espce Legionella pneumophila est identifi.e dans 98 % des
cas et le s.rogroupe 1 dans 93 % des cas (Campese et al. 2010).
Dans une .tude internationale r.alis.e par Yu et al. (Yu et al. 2002) sur 508 cas confirm.s par culture,
l'espce L. pneumophila constituait 91,5% des isolats et le s.rogroupe 1 .tait responsable de 84,2 %
des cas mondiaux.
La pr.dominance de L. pneumophila s.rogroupe 1 en pathologie humaine ne semble pas li.e une
pr.dominance environnementale. Une .tude franaise montre que ce s.rogroupe repr.sente moins
de 30 % des Legionella identifi.es dans l'environnement (Doleans et al. 2004). Elle pourrait tre li.e
une plus grande infectiosit. de ce s.rogroupe pour l'homme. Par ailleurs, il est .galement d.montr.
que la plupart des individus atteints de l.gionellose due une espce autre que L. pneumophila
souffrent d'une immunod.pression pr.existante s.vre (David et al. 2006; Doleans et al. 2004; Harris
et al. 1998; Joly et al. 1986; Lee et al. 2009; Meenhorst et al. 1985; Muder and Yu 2002).
Une .tude a .t. men.e sur 217 souches de Legionella pneumophila et 32 Legionella non
pneumophila, l'aide de puces ADN. Elle a montr. qu'un cluster
13
de gnes de biosynthse des
lipopolysaccharides
14
11
Relation sp.cifique d'une voie entre des niveaux d'exposition un agent dangereux et l'indice observ. d'un effet donn..
(LPS) d.terminant le s.rogroupe 1 .tait pr.sent dans des profils g.n.tiques trs
12
Pr.lvement des s.cr.tions respiratoires.
13
Des gnes appartenant la mme famille peuvent dans certains cas tre group.s les uns derrire les autres au niveau dSune
mme r.gion chromosomique, ils forment alors un cluster.
14
Composant de la paroi bact.rienne des bact.ries Gram n.gatif
Anses
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diff.rents. Cela suggre que le LPS du s.rogroupe 1 joue un r?le dans la haute pr.valence de la
l.gionellose humaine (Cazalet et al. 2010).
Au total, la litt.rature rapporte que, dans le monde, une vingtaine d'espces de Legionella autres que
pneumophila ont .t. impliqu.es dans au moins un cas de l.gionellose. Les plus souvent identifi.es
chez les patients atteints de l.gionellose sont L. longbeachae (3,9 % des cas) et L. bozemanii (2,4 %
des cas). Except. en Australie et en Nouvelle-Z.lande oM L. longbeachae devance L. pneumophila et
est l'origine de plus de cas.
En effet, alors que L. pneumophila est la principale cause de l.gionellose en Europe et aux USA, L.
longbeachae est responsable d'environ 30 % des cas de l.gionellose en Australie, Nouvelle Z.lande,
Nouvelle Cal.donie (Yu et al. 2002) et d'environ 50 % au sud de l'Australie et en ThaElande (Phares et
al. 2007). A la diff.rence des autres espces de Legionella, dont le r.servoir principal est l'eau
environnementale, L. longbeachae est fr.quemment isol.e dans les sols terreux et infecte
principalement des individus expos.s ces sols (Fields et al. 2002).
L'ensemble des tests de diagnostic disponibles actuellement (culture, s.rologie, antignurie) favorise
le diagnostic des cas de l.gionellose L. pneumophila et notamment du s.rogroupe 1 (d.tection des
antignes urinaires). Ainsi, le d.veloppement des m.thodes de d.tection mol.culaires (q-PCR) pour
le diagnostic, partir de pr.lvements pulmonaires, pourrait potentiellement augmenter le nombre de
cas li.s Legionella non pneumophila (Diederen et al. 2008; Yang et al. 2010), sans pour autant en
modifier fortement l'.pid.miologie.
Compte tenu de ces .l.ments, les informations n.cessaires pour le d.nombrement de Legionella,
dans les diff.rents contextes d'analyses, sont les suivantes :
- pour la gestion des risques sanitaires, concernant la population g.n.rale, le d.nombrement de L.
pneumophila peut tre suffisant, compte tenu de la raret. des cas de l.gionelloses attribu.s
d'autres espces de Legionella. Le d.nombrement s.lectif des L. pneumophila du s.rogroupe 1
peut apporter une information suppl.mentaire (ce s.rogroupe .tant responsable de 85 % des cas
de l.gionellose), mais ne peut remplacer le d.nombrement des L. pneumophila ;
- dans la mesure oM les individus atteints d'une immunod.pression s.vre peuvent tre infect.s
par L. pneumophila mais .galement par d'autres espces de Legionella, dans le cas particulier
de ces patients dits haut risque , (au sens de la circulaire DGS 2002 243, du 22 avril
2002
15
), le d.nombrement des L. spp apporte une information suppl.mentaire, notamment
lorsqu'elle est associ.e aux mesures de suivi et de traitement de l'eau sp.cifiques ce contexte,
d.j envisag.es dans la r.glementation en vigueur
16
- pour la gestion des installations d'eau chaude sanitaire et des tours a.ror.frig.rantes, le
d.nombrement de L. spp apporte des informations relatives l'.cosystme des installations de la
mme importance que celles apport.es par le d.nombrement de L. pneumophila.
;
1.6 Signification sanitaire de Ia pr.sence de Legionella viabIes non cuItivabIes
En pr.ambule ce chapitre, il est important de poser quelques d.finitions relatives aux diff.rents .tats
de viabilit. des bact.ries. Le concept de viabilit. des bact.ries est difficile appr.hender et de
nombreuses d.finitions sont possibles (Barer et al. 2000; Bogosian and Bourneuf 2001; Joux and
Lebaron 2000; Kell et al. 1998; McDougald et al. 1998; Oliver 2005). Pour le pr.sent rapport, le
groupe de travail adopte trois d.finitions bas.es sur celles propos.es par (Ducret 2009).
Viabilit. :
La viabilit. peut tre associ.e la capacit. d'une bact.rie se multiplier ou exprimer des caractres
physiologiques qui suggrent l'existence d'une int.grit. membranaire ; d'une activit. m.tabolique
(activit. enzymatique intracellulaire, activit. respiratoire, etc.).
15
Les patients dits patients haut risque sont les immunod.prim.s s.vres, et particulirement les immunod.prim.s aprs
transplantation ou greffe dSorgane et les immunod.prim.s par corticoth.rapie prolong.e (0,5 mg/kg de prednisone pendant
30 jours ou plus, ou .quivalent) ou r.cente et haute dose (cSest--dire sup.rieure 5 mg/kg de prednisone pendant plus de
5 jours)
16
Arrt. du 1er f.vrier 2010 relatif la surveillance des l.gionelles dans les installations de production, de stockage et de
distribution d'eau chaude sanitaire et Circulaire DGS/SD7A/SD5C/DHOS/E4 n 2002/243 du 22 avril 2002 relative la
pr.vention du risque li. aux l.gionelles dans les .tablissements de sant.
Anses
F.vrier 2011 page 34 / 144
Cultivabilit. :
La cultivabilit. est la facult. que pr.sente une bact.rie former en un temps donn., et sur un milieu
de culture g.los. d.fini une colonie visible par l'observateur. Cette d.finition intgre des notions de
d.veloppement, de temps, de sensibilit., et de qualit. du milieu de culture utilis.. Dans les cultures en
milieu liquide, la croissance se traduit par une turbidit. du milieu.
Viable non cultivable :
L'.tat viable mais non cultivable (VBNC) caract.rise les bact.ries qui perdent leur cultivabilit. tout en
conservant une certaine forme de viabilit. se traduisant par la conservation de l'int.grit. structurale
et/ou des activit.s m.taboliques. La pr.sence de bact.ries viables non cultivables est g.n.ralement
observ.e en association avec des conditions environnementales particulires ou li.e des stress. La
perte de cultivabilit. peut tre une r.action adaptative ces conditions ou au contraire un processus
d.g.n.ratif ou encore inh.rent la m.thode de culture utilis.e. Dans certaines conditions de culture
ou la suite des modifications de l'environnement les bact.ries viables non cultivables peuvent
retrouver leur cultivabilit..
Dans le pr.sent rapport, le groupe de travail pr.cise que seront appel.es non viables ou
mortes , toutes les bact.ries qui ne sont pas consid.r.es comme viables ou viables non cultivables
selon les d.finitions pr.cit.es.
Diff.rents facteurs chimiques et environnementaux sont souponn.s de provoquer l'.tat VBNC d'une
bact.rie Gram n.gatif non sporulante, dont l'indisponibilit. des nutriments ou les traitements
chimiques et thermiques de l'eau (Oliver 2000; Oliver 2009). L'existence d'un .tat VBNC a .t. d.crite
de longue date pour L. pneumophila (Hussong et al. 1987; Paszko-Kolvaa et al. 1992). En plus de la
capacit. survivre dans les biofilms et au sein des protozoaires, l'entr.e en .tat VBNC constitue pour
L. pneumophila une forme de survie dans des conditions environnementales d.favorables. Sa
r.sistance r.elle aux traitements chimiques lorsqu'elle est sous cette forme n'est pas connue, mais
celle-ci serait potentiellement accrue par rapport celle de la forme cultivable. En effet, une
augmentation de la r.sistance des substances chimiques telles que des antibiotiques et une
capacit. am.lior.e surmonter divers stress thermiques ou acides, ont .t. d.crits pour de
nombreuses espces bact.riennes lorsqu'elles sont sous forme VBNC (Oliver 2009).
Seules les Legionella viables peuvent tre l'origine d'infections humaines et repr.senter un enjeu
sanitaire. Parmi les Legionella viables, il est difficile de d.montrer l'infectiosit. des Legionella VBNC,
car il n'est actuellement pas possible de d.montrer que 100 % des bact.ries sont VBNC dans une
culture travaill.e pour en produire (Delgado-Viscogliosi et al. 2005). l est toutefois probable que ces
dernires puissent repr.senter un risque sanitaire, car elles peuvent retrouver leur capacit. de
multiplication lorsque les conditions sont favorables (Bej et al. 1991; Delgado-Viscogliosi et al. 2009;
Dusserre et al. 2008; Hwang et al. 2006). De plus, Steinert et al. ont d.montr., ds 1997, que les L.
pneumophila VBNC pouvaient retrouver leur cultivabilit. au contact d'amibes de l'espce
Acanthamoeba castellanii (Steinert et al. 1997). Garcia et al. ont .galement montr. que L.
pneumophila pouvait retrouver sa cultivabilit., perdue aprs un traitement de d.sinfection au chlore,
par un passage dans l'amibe Acanthamoeba polyphaga (Garcia et al. 2007; Oliver 2009).
L'existence de formes VBNC pourrait expliquer en partie les recontaminations rapides parfois
observ.es aprs le traitement d'un circuit d'eau chaude sanitaire par choc thermique ou chloration
(Steinert et al. 1998; Thomas et al. 2004), alors que la recherche de Legionella par culture est
n.gative. Pour .valuer leur r?le exact, il est .galement n.cessaire de prendre en compte une possible
pr.sence de Legionella (cultivable ou non) dans le biofilm ou dans les amibes (Allegra et al. 2008).
Compte tenu de ces .l.ments, le risque associ. la pr.sence de formes VBNC dans un .chantillon
d'eau doit tre pris en consid.ration dans l'interpr.tation des r.sultats.
Anses
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2 D.finitions des paramtres de caract.risation et de choix des m.thodes
d'anaIyses
2.1 Paramtres de performances
Les m.thodes d'analyse doivent tre choisies sur la base de leurs caract.ristiques de performances.
L'arrt. du 17 septembre 2003 relatif aux m.thodes dSanalyse des .chantillons dSeau et leurs
caract.ristiques de performances et la circulaire DGS/SD7A n 2003-445 du 17 septembre 2003
concernant les modalit.s dSapplication de cet arrt., apportent des pr.cisions sur ces paramtres de
performances. Une analyse des d.finitions de ces paramtres propos.es dans l'annexe de la
directive n98/83, relative la qualit. des eaux destin.es la consommation humaine, ainsi que dans
la norme XP T90-210 de d.cembre 1999
17
Depuis, la norme XP T90-210 a .t. r.vis.e et remplac.e par la norme NF T90-210 de mai 2009.
Cette norme intgre des d.finitions concernant les paramtres permettant d'.valuer les performances
des m.thodes d'analyse physico-chimiques appliqu.es au domaine de l'eau pour les paramtres
chimiques, notamment pour les termes : exactitude, fid.lit., justesse, .cart-type de r.p.tabilit., .cart-
type de fid.lit. interm.diaire, limite de d.tection, limite de quantification. Certains de ces paramtres
sont cit.s dans les annexes et V de l'arrt. du 17 septembre 2003. Les paramtres
microbiologiques sont .voqu.s, mais sans pr.cision sur d'.ventuelles exigences de performance.
, y est notamment propos.e pour la justesse, la fid.lit. et
les limites de d.tection et de quantification.
l existe des lignes directrices pour valider une m.thode d'analyse microbiologique (SO/TR
13843:2000), mais leur application est limit.e la validation de m.thodes bas.es sur le comptage
direct de particules microbiennes au microscope ou sur la quantification des cellules capables de se
multiplier sur un milieu de culture. Ces lignes directrices ne sont pas applicables pour la validation de
m.thodes bas.es sur la d.tection d'une activit. de microorganismes par d'autres principes que celui
de la culture. l semble donc d.licat d'en extraire des paramtres de performance permettant de
caract.riser l'ensemble des m.thodes de d.tection et de quantification de Legionella dans l'eau.
Les critres d'ordre math.matique, permettant d'.tablir l'.quivalence de m.thodes analytiques
microbiologiques, sont distinguer des paramtres de performances de ces mmes m.thodes. Le
pr.sent chapitre ne traite pas de ces critres math.matiques tels que d.crit dans la norme SO
17994:2004(E). Ces critres sont abord.s dans le chapitre 8.
Pour chaque paramtre .voqu. dans ce chapitre, dans un souci de clart., une d.finition a .t. choisie
par le groupe de travail sur la base de la bibliographie et de son expertise.
2.1.1 Justesse
La justesse, au sens de la norme XP T90-210 correspond l'exactitude telle que d.finie dans la
directive 98/83 : "lerreur systzmatique zgale [ la diffzrence entre la valeur moyenne dun grand
nombre de mesures rzpztzes et la valeur exacte".
Elle est exprim.e en pourcentage de la valeur de r.f.rence. Elle se d.termine soit par application du
paragraphe "justesse" de la norme XP T90-210 de d.cembre 1999 (paragraphe 6.3), soit par
lSutilisation de mat.riaux de r.f.rence certifi.s ou la participation des essais inter-laboratoires.
Le projet de norme exp.rimentale XP T90-465-1 "Protocole dSestimation de lSincertitude de mesure
associ.e un r.sultat dSanalyse pour les m.thodes de d.nombrement microbiologiques", du 15 f.vrier
2010, d.finit la notion de justesse comme "l'ztroitesse de laccord entre la valeur moyenne obtenue [
partir dune large szrie de rzsultats dessais et une valeur de rzfzrence acceptze."
Selon la norme NF T90-210 de mai 2009, comme dans le projet de norme exp.rimentale XP T90-465-
1 du 15 f.vrier 2010, l'exactitude est "l'ztroitesse d'accord entre des rzsultats et la valeur de
rzfzrence acceptze. Le terme exactitude, appliquz [ un ensemble de rzsultats, implique une
combinaison de composantes alzatoires (fidzlitz) et d'une erreur systzmatique commune ou d'un
composant biais (justesse)."
17
Norme XP T90-210 Qualit. de lSeau - Protocole dS.valuation initiale des performances dSune m.thode dans un laboratoire
de d.cembre 1999
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Le protocole Afnor "Protocole de validation d'une mzthode alternative commerciale par rapport [ une
mzthode de rzfzrence", dans sa version "Rzvision 0", adopt.e le 28 juillet 2008, introduit .galement la
notion d'exactitude reIative, qui correspond au niveau de correspondance entre la r.ponse obtenue
avec la m.thode de r.f.rence et la r.ponse obtenue avec la m.thode alternative sur les mmes
.chantillons.
La d.finition retenue est : la justesse (ou exactitude) est l'.troitesse d'accord entre des r.sultats et
la valeur vraie. L'exactitude reIative est l'.troitesse d'accord entre des r.sultats et la valeur de
r.f.rence accept.e.
2.1.2 Fid.Iit.
La fid.Iit. au sens de la norme XP T90-210 de d.cembre 1999 correspond la pr.cision telle que
d.finie dans la directive 98/83 : "Lerreur alzatoire est exprimze en gznzral comme lzcart-type ([
lintzrieur du lot et entre les lots) de lzventail des rzsultats sur la moyenne".
Dans la norme NF T90-210 de mai 2009, comme dans le projet de norme exp.rimentale XP T90-465-
1 du 15 f.vrier 2010, la fid.Iit. est d.finie par "l'ztroitesse d'accord entre des rzsultats d'essai
indzpendants obtenus sous des conditions stipulzes. Elle dzpend uniquement de la distribution des
erreurs alzatoires et n'a aucune relation avec la valeur vraie ou spzcifize". La fid.lit. est .gaIe deux
fois Ie coefficient de variation de reproductibiIit. intra-Iaboratoire dSun grand nombre de mesures
reproduites sur un .chantillon dSeau naturelle pr.sentant une concentration en analytes .gale la
valeur param.trique. Elle est exprim.e en pourcentage de la valeur param.trique.
Le protocole Afnor "Protocole de validation d'une mzthode alternative commerciale par rapport [ une
mzthode de rzfzrence", dans sa version "Rzvision 0", adopt.e le 28 juillet 2008, d.finit :
- la reproductibiIit. comme "l'ztroitesse de l'accord entre les mesurages successifs de la mme
quantitz, effectuzs dans les conditions de reproductibilitz".
- la r.p.tabiIit. comme "l'ztroitesse de l'accord entre les mesurages successifs de la mme
quantitz, effectuzs dans les mme conditions de mesurage".
Le projet de norme exp.rimentale XP T90-465-1 du 15 f.vrier 2010, reprend la mme d.finition de la
r.p.tabiIit., en pr.cisant que selon les pratiques du laboratoire, plusieurs techniciens peuvent
travailler au sein d'une mme s.rie analytique et qu'il n' y a donc pas lieu de restreindre la notion de
r.p.tabilit. l'analyse par un seul technicien.
Ce projet de norme propose par contre une d.finition l.grement diff.rente de la reproductibiIit. :
"l'ztroitesse de l'accord entre les rzsultats des mesurages de la mme quantitz, effectuzs dans des
conditions de mesurage variables".
Selon la norme XP T90-210 de d.cembre 1999, la reproductibiIit. intra-Iaboratoire est appr.ci.e
en r.p.tant des anaIyses dans un seul laboratoire avec la mme m.thode, en faisant intervenir
plusieurs op.rateurs ou instruments, et en particulier, en effectuant les mesures des dates
diff.rentes.
La norme NF T90-210 de mai 2009 d.finie .galement :
- I'.cart-type de r.p.tabiIit. comme "l'zcart-type de nombreuses rzpztitions obtenues dans un
seul laboratoire par un mme opzrateur sur un mme instrument, c'est-[-dire dans des conditions
de rzpztabilitz."
- L'.cart-type de fid.Iit. interm.diaire comme "l'zcart-type de rzpztitions obtenues dans un
mme laboratoire dans des conditions de fidzlitz intermzdiaire, c'est-[-dire avec des
changements de conditions, parmi lesquelles : opzrateur, ztalonnage, zquipements,
environnement, temps zcoulz entre les mesures".
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Les d.finitions retenues sont :
- la fid.Iit. (ou pr.cision) est l'.troitesse d'accord entre des r.sultats d'essais ind.pendants
obtenus sous des conditions stipul.es. Elle d.pend uniquement de la distribution des erreurs
al.atoires et n'a aucune relation avec la valeur vraie ou sp.cifi.e ;
- la r.p.tabiIit. est l'.troitesse de l'accord entre les mesurages successifs de la mme quantit.,
effectu.s dans les mmes conditions de mesurage ;
- la reproductibiIit. est l'.troitesse de l'accord entre les mesurages successifs de la mme
quantit., effectu.s dans des conditions de mesurage variables.
2.1.3 SensibiIit.
Les deux principaux paramtres qui permettent de mesurer la sensibilit. d'une m.thode analytique
sont ses limites de d.tection et le cas .chant de quantification.
Les limites de d.tection et de quantification des m.thodes d.pendent en partie du mode de
concentration de l'.chantillon qui est souvent le mme quelles que soient les techniques de d.tection
utilis.es ensuite (les deux techniques de concentration les plus r.pandues en routine sont la filtration
et la centrifugation). Ainsi, pour comparer les limites de d.tection et de quantification des m.thodes
analytiques, il est important de savoir si les valeurs affich.es tiennent compte de l'.tape de
concentration ou strictement de la m.thode de d.nombrement elle-mme.
2.1.3.1 Limite de d.tection
Selon la directive 98/83/CE, la limite de d.tection correspond "3 fois lzcart-type relatif [ lintzrieur du
lot dun zchantillon naturel contenant une concentration peu zlevze du paramtre, soit 5 fois lzcart-
type relatif [ lintzrieur du lot dun zchantillon vierge".
La d.finition propos.e dans la circulaire du 13 septembre 2003 est "la plus petite quantitz dun analyte
[ examiner dans un zchantillon, pouvant tre dztectze et considzrze comme diffzrente du blanc (avec
une probabilitz derreur donnze), mais non nzcessairement quantifize".
Quasi identique cette dernire, la d.finition propos.e dans la norme NF-T90-210 de mai 2009 est la
"plus petite quantitz ou concentration d'un analyte dans l'zchantillon d'essai qui peut tre distinguze
de manire fiable du zzro".
Selon le protocole Afnor "Protocole de validation pour kits de dztection et de dznombrement de
Legionella et Legionella pneumophila par concentration et amplification gznique par q-PCR", dans sa
version "R.vision 0", adopt.e le 26 septembre 2006, "l'estimation de la limite de dztection PCR
consiste [ conna#tre le plus petit nombre d'unitzs gznome gznzrant un rzsultat positif (une
amplification) au seuil de confiance de 90 % selon le mode opzratoire du laboratoire".
Selon le protocole Afnor "Protocole de validation d'une mzthode alternative commerciale par rapport [
une mzthode de rzfzrence", dans sa version "Rzvision 0", adopt.e le 28 juillet 2008, qui se r.fre au
projet de norme XP T90-465-1, la limite de d.tection correspond au "niveau de charge bactzrienne le
plus faible pour lequel la probabilitz
18
d'un rzsultat positif (observation d'au moins un germe) est
supzrieur ou zgale [ 95% ou 99%".
La d.finition retenue est : la Iimite de d.tection est la plus petite quantit. dSun analyte examiner
dans un .chantillon, pouvant tre d.tect.e et consid.r.e comme diff.rente du blanc (avec une
probabilit. dSerreur donn.e), mais non n.cessairement quantifi.e. Pour une limite de d.tection
donn.e, il est important de pr.ciser la probabilit. d'un r.sultat positif (observation d'au moins un
micro-organisme) dans un .chantillon contenant le micro-organisme recherch..
18
Selon une loi de probabilit. th.orique de type Poisson ou binomiale n.gative.
Anses
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2.1.3.2 Limite de quantification
Selon la norme XP T90-210, cSest "la plus petite grandeur dun analyte [ examiner dans un zchantillon
pouvant tre dzterminze quantitativement dans des conditions expzrimentales dzcrites dans la
mzthode avec une variabilitz dzfinie (coefficient de variation dzterminz)".
La circulaire du 13 septembre 2003 pr.cise qu'elle correspond "la plus petite valeur [ partir de
laquelle un rzsultat danalyse peut tre rendu avec une fidzlitz satisfaisante".
La d.finition propos.e dans la norme NF-T90-210 de mai 2009 reprend les .l.ments des ces deux
d.finitions : "plus petite grandeur d'un analyte [ examiner dans un zchantillon pouvant tre
dzterminze quantitativement dans des conditions expzrimentales dzcrites dans la mzthode avec une
exactitude dzfinie".
Elle est exprim.e dans lSunit. du paramtre et peut tre .valu.e selon le principe de calcul d.fini au
paragraphe 5.2. de la norme franaise NF T90-210.
Selon le protocole Afnor "Protocole de validation pour kits de dztection et de dznombrement de
Legionella et Legionella pneumophila par concentration et amplification gznique par PCR", dans sa
version "Rzvision 0", adopt.e le 26 septembre 2006, l'estimation de la limite de quantification q-PCR
consiste connatre le plus petit nombre d'unit.s g.nome g.n.rant un r.sultat quantifiable au seuil de
confiance de 95 % selon le mode op.ratoire du laboratoire.
La d.finition retenue est : la Iimite de quantification est la plus petite valeur partir de laquelle un
r.sultat dSanalyse peut tre rendu avec une fid.lit. satisfaisante. Pour une limite de quantification
donn.e, il est important de pr.ciser le seuil de confiance auquel la m.thode est capable de produire
un r.sultat quantifiable.
2.1.4 Sp.cificit. et s.Iectivit.
Aux quatre paramtres de performance d.j .voqu.s, particulirement pour les m.thodes d'analyse
microbiologiques, il est int.ressant, d'ajouter la sp.cificit. et/ou la s.Iectivit..
Selon la norme XP T90-210 de d.cembre 1999, "la spzcificitz est la propriztz d'une mzthode [
convenir exclusivement [ la dztermination de la grandeur [ mesurer, avec la garantie que le signal
mesurz provient exclusivement de la grandeur [ mesurer".
Dans le protocole Afnor "Protocole de validation d'une mzthode alternative commerciale par rapport [
une mzthode de rzfzrence", dans sa version "Rzvision 0", adopt.e le 28 juillet 2008 :
- la s.Iectivit. est d.finie comme "une mesure du degrz de non-interfzrence en przsence
d'analytes non ciblzs. Une mzthode est szlective si elle peut tre utilisze pour dztecter l'analyte
recherchz et s'il est certain que le signal dztectz peut tre gznzrz uniquement par l'analyte
concernz" ;
- la sp.cificit. relative est d.finie comme "la capacitz de la mzthode alternative [ ne pas dztecter
l'analyte lorsque la mzthode de rzfzrence ne le dztecte pas".
Une m.thode est s.lective si elle permet de s.lectionner un .v.nement parmi d'autres. C'est une
mesure de capacit. intrinsque.
Une m.thode est sp.cifique si elle donne le mme r.sultat que la m.thode de r.f.rence. C'est une
mesure comparative.
L'utilisation de "spzcifique" la place de "szlective" est de fait un abus de langage courant en biologie.
l est n.anmoins consacr. par l'usage dans nombres de cas oM la sp.cificit. et la s.lectivit. sont des
propri.t.s requises simultan.ment (on parle d'anticorps, de sondes, d'amorces, de marqueur
sp.cifiques) et confrent la chose d.sign.e une unicit..
Lorsque le terme s'applique strictement aux caract.ristiques d'une m.thode, les d.finitions retenues
sont :
- la s.Iectivit. est une mesure du degr. de non-interf.rence en pr.sence d'analytes non cibl.s ;
- la sp.cificit. est la capacit. de la m.thode ne pas d.tecter l'analyte lorsqu'il n'est pas
pr.sent ;
- la sp.cificit. reIative est la capacit. de la m.thode alternative ne pas d.tecter l'analyte
lorsque la m.thode de r.f.rence ne le d.tecte pas.
Anses
F.vrier 2011 page 39 / 144
2.1.5 Rendement
Dans la norme FD ENV SO 13843, d'octobre 2001 : "Qualitz de leau - Lignes directrices pour la
validation des mzthodes microbiologiques", le rendement est le terme g.n.ral d.signant le nombre de
particules estim.es dans une prise d'essai ou dans un .chantillon, sachant qu'il y a un nombre r.el
(mme sSil est inconnu) de particules dont 100 % ou moins est "rzcupzrz" par le d.tecteur (FD ENV
SO 13843).
Selon la circulaire DGS/SD7A n2003-445 du 17 septembre 2003 concernant les modalit.s
dSapplication de lSarrt. relatif aux m.thodes dSanalyse dS.chantillons dSeau et leurs caract.ristiques
de performances, "afin dtre validzes, les mzthodes utiliszes devront faire appara#tre un rendement
dextraction compris entre 60 % et 120 %". l est pr.cis. dans ce texte que des techniques
quantitatives valid.es permettent de quantifier les mol.cules recherch.es avec une justesse et une
fid.lit. acceptables par rapport aux exigences de lSarrt. du 17 novembre 2003.
La d.finition retenue pour le rendement d'une m.thode analytique est : l'expression en pourcentage
du nombre de particules d.tect.es dans une prise d'essai ou dans un .chantillon, rapport. au nombre
r.el de particules pr.sentes.
2.1.6 Lin.arit.
Le protocole Afnor "Protocole de validation d'une mzthode alternative commerciale par rapport [ une
mzthode de rzfzrence", dans sa version "Rzvision 0", adopt.e le 28 juillet 2008, introduit, dans le cas
des m.thodes quantitatives, la notion de Iin.arit.. Celle-ci correspond l'aptitude de la m.thode,
pour une matrice donn.e, fournir des r.sultats proportionnels la quantit. d'analyte pr.sente dans
l'.chantillon, cSest--dire qu' une augmentation de l'analyte correspond une augmentation lin.aire ou
proportionnelle des r.sultats.
La d.finition retenue est : la notion de Iin.arit. correspond l'aptitude de la m.thode, pour une
matrice donn.e, fournir des r.sultats proportionnels la quantit. d'analyte pr.sente dans
l'.chantillon.
2.2 Autres paramtres de choix d'une m.thode anaIytique
Dans le cadre du choix d'une m.thode analytique, sa performance est d.terminante. Cependant,
d'autres paramtres peuvent .galement s'av.rer d.terminants en fonction du contexte. Sans que
cette liste ne soit exhaustive, quelques-uns sont signal.s dans le pr.sent chapitre.
Pour compl.ter cette approche, le lecteur pourra .galement se r.f.rer aux normes suivantes :
- NF SO 3534-1 : Statistique. Vocabulaire et symboles Partie 1 : probabilit. et termes statistiques
g.n.raux.
- PR EN SO 16140 : Microbiologie des aliments - Protocole pour la validation des m.thodes
alternatives - Partie 1: Terminologie pour la validation des m.thodes ; Partie 2: Protocole pour la
validation des m.thodes propri.taires par rapport une m.thode de r.f.rence.
2.2.1 Rapidit.
Pour .tudier des m.thodes analytiques potentiellement utilisables en routine, dans un cadre
r.glementaire, la rapidit., semble tre un paramtre de performance important prendre en compte
(FAO 1997).
2.2.2 Champ dSappIication
Le champ d'application est la gamme de matrices auxquelles sSappliquent les caract.ristiques de
performance (FAO 1997).
Anses
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2.2.3 Robustesse
Selon la norme FD ENV SO 13843, la robustesse est l'insensibilit. d'une m.thode d'analyse aux
faibles modifications de la m.thode. Elle correspond .galement la "fiabilit." telle que d.finie par la
FAO dans un rapport de 1997, qui la d.finie comme la "soliditz, non-dzpendance relative [ lzgard des
compztences de lopzrateur".
2.2.4 SimpIicit.
Dans le pr.sent document, ce paramtre est regroup. dans les mmes sous-chapitres que la
robustesse (FAO 1997).
Anses
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3 Attentes reIatives une m.thode de d.nombrement de Legionella dans
I'eau
Le premier r.flexe pour d.crire une m.thode analytique est d'examiner ses performances techniques,
pr.c.demment .voqu.es : s.lectivit., sp.cificit., sensibilit., r.p.tabilit. intra-laboratoire,
reproductibilit. inter-laboratoires, justesse, fid.lit. ou encore rendement. l est bien s`r souhaitable
que les m.thodes soient les plus performantes possibles vis--vis de l'ensemble de ces paramtres.
l apparat .galement important qu'une m.thode analytique destin.e au d.nombrement de Legionella
dans l'eau ait .t. .valu.e sur le plan du rendement
19
Le co`t est .galement un aspect important prendre en compte pour le choix d'une m.thode
analytique. Cependant il d.pend directement du nombre d'analyses envisag.. Par ailleurs, les
analyses de routine sont souvent r.alis.es par des laboratoires analytiques prestataires, pour le
compte de clients gestionnaires d'installations. Ainsi, le prix de vente unitaire des analyses est non
seulement fix. en fonction de leur co`t de revient, mais .galement en fonction de la strat.gie
commerciale du laboratoire. Dans ces conditions, .tant donn. les objectifs de ce rapport, il ne semble
pas opportun de retenir le co`t unitaire des analyses comme un critre de choix des m.thodes.
, qu'elle possde une limite de quantification
basse et le cas .ch.ant inf.rieure aux valeurs cibles r.glementaires et qu'elle soit s.lective de la cible
qui sera choisie (L. pneumophila, L. spp, bact.ries cultivables, bact.ries viables non cultivables,
bact.ries intracellulaires, etc.).
D'autres critres peuvent tre pris en compte pour .valuer la pertinence d'une m.thode de
d.nombrement de Legionella dans l'eau. Le tableau 1 pr.sente ces critres et les niveaux
d'importance qui ont .t. attribu.s dans le cadre de ce rapport, au regard de la probl.matique pos.e.
Par ailleurs, il est postul. que les utilisateurs des m.thodes d.crites sont des hommes de m.tier, qui
matrisent les pratiques courantes de laboratoire. Le pr.sent document nSabordera donc pas les
problmes de s.curit. inh.rents l'utilisation des m.thodes d.crites. l incombe aux utilisateurs de
mettre en 8uvre des pratiques appropri.es en matire dShygine et de s.curit. et de sSassurer de la
conformit. des proc.dures et des conditions de manipulation aux r.glementations nationales en
vigueur.
Chaque description de m.thode est assortie d'un tableau pr.sentant les avantages et les
inconv.nients intrinsques th.oriques de la m.thode. ls sont d.finis en fonction, des critres list.s et
prioris.s dans le Tableau 1, de leur pertinence pour le suivi des installations d'eau chaude sanitaire et
des tours a.ror.frig.rantes, et de leur d.contamination aprs le d.nombrement de Legionella des
niveaux sup.rieurs aux valeurs cibles rglementaires.
19
Fraction de la cible d.tect.e par rapport la cible pr.sente dans l'.chantillon.
Anses
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TabIeau 1 : Pertinence, pour le contr?le sanitaire et la surveillance, des critres de s.lection d'une m.thode de
d.nombrement de Legionella dans l'eau, dans les contextes du suivi des r.seaux d'eau chaude sanitaire (ECS),
des tours a.ror.frig.rantes (TAR) et des d.contaminations.
++++ indispensable ; +++ priorit. .lev.e ; ++ priorit. mod.r.e ; +/- peu ou pas pertinent
ECS TAR D.conta
mination
Critres reIatifs aux cibIes
Quantification de Legionella pneumophila
++++ ++++ ++++
Quantification de Legionella pneumophila avec distinction du
s.rogroupe 1
+++ +++ +/-
Distinction et quantification des s.rogroupes autre que sg1 ++ ++ +/-
Quantification de l'ensemble des Legionella spp
++ ++ ++
dentification des diff.rentes espces de Legionella pr.sentent
dans l'.chantillon
+/- +/- +/-
Prise en compte des Legionella intra amibiennes ou intra
v.siculaires dans la quantification
+++ +++ +++
Quantification s.lective des Legionella intra amibiennes ou intra
v.siculaires
+/- +/- +/-
Critres reIatifs I'.tat physioIogique des Legionella
d.tect.es
Non d.tection des Legionella mortes
+++ +++ +++
D.tection notamment de l'ensemble des Legionella viables et
potentiellement pathognes
+++ +++ +++
Critres reIatifs au contexte pratique de mise en 8uvre
Rapidit. des r.sultats (hors crise) +++ +++ +++
Faisabilit., simplicit. ++ ++ ++
Equipements n.cessaires limit.s ++ ++ ++
Faibles co`ts (global) ++ ++ ++
Temps technicien faible ++ ++ ++
Critres reIatifs I'interpr.tation des r.suItats
nterpr.tation technique simple des r.sultats bruts ++ ++ ++
nterpr.tation pour le risque sanitaire disponible +++ +++ +++
Critres reIatifs aux champs d'appIication
Applicable sur des .chantillons d'eau charg.e ++ ++ +/-
Applicable sur des .chantillons d'eau trait.e +++ +++ +++
Permet de disposer de souches pour des .tudes compl.mentaires ++ ++ ++
Anses
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4 Description des .tapes de pr.paration et de pr.traitement des .chantiIIons
pr.aIabIes un d.nombrement de Legionella
Les .tapes de pr.traitement des .chantillons influencent directement les r.sultats des
d.nombrements de Legionella dans l'eau exig.s par la r.glementation. Le pr.sent chapitre est
consacr. la description de leurs principes et objectifs.
Avant cela, il semble important d'.voquer l'impact que peut avoir l'.chantillonnage et la m.thode de
pr.lvement sur les r.sultats des m.thodes de d.nombrement mises en 8uvre.
4.1 EchantiIIonnage
l est clair que l'.chantillonnage et la m.thode de pr.lvement d'un .chantillon environnemental
influencent le r.sultat d'analyse obtenu. Diff.rents facteurs peuvent entraner des pertes de
rendement du d.nombrement des bact.ries r.ellement pr.sentes dans un .chantillon d'eau (Ballard
et al. 2000; Delgado-Viscogliosi et al. 2005) :
D la survie de la bact.rie cible dans les .chantillons pr.lev.s (conditions de conservation
appropri.es la m.thode d'analyse) ;
D l'.tape de concentration (centrifugation ou filtration) ;
D la d.contamination .ventuelle de l'.chantillon par la chaleur (30 minutes 50C) ou par une
solution acide (5 minutes pH = 2) ;
D la sonication et le grattage.
La description des m.thodes de pr.lvement ne fait pas l'objet du pr.sent document. Cependant, il
est important de pr.ciser que la compatibilit. de la m.thode de pr.lvement avec la m.thode
d'analyse choisie doit tre v.rifi.e.
l existe une norme SO 19458 (2006), relative l'.chantillonnage pour les analyses microbiologiques
des eaux. Cette norme g.n.rale d.crit le nombre d'.chantillons analyser pour d.terminer la
concentration moyenne de bact.ries pr.sentes dans l'eau, avec un niveau de confiance donn..
Plus sp.cifiquement, pour la recherche de Legionella dans les eaux, il existe un guide de
pr.lvement, sous la forme d'un Fascicule de documentation FD T 90-522 (2006). l est conu pour
l'.chantillonnage pr.alable la recherche de Legionella spp ou de L. pneumophila dans les eaux
chaudes sanitaires, les eaux d'agr.ment ou de baignade et les installations de refroidissement par
dispersion d'eau dans un flux d'air (RDEFA). Ce guide a .t. .labor. de manire tre compatible
avec les deux m.thodes de d.nombrement de Legionella les plus r.pandues : culture (NF T90-431) et
q-PCR (NF T90-471).
Dans les deux cas, les volumes de pr.lvement pr.conis.s sont variables en fonction des situations
et des m.thodes analytiques.
Dans certaines situations, il peut tre int.ressant que la m.thode analytique dans son ensemble ou
tout au moins le pr.lvement et l'.chantillonnage mis en 8uvre, permettent la r.alisation d'.tudes
compl.mentaires, notamment .pid.miologiques.
4.2 Etape de concentration
Trois m.thodes de concentration des .chantillons ont .t. r.pertori.es : la filtration, la centrifugation et
la s.paration immuno-magn.tique. Les deux premires ne sont pas s.lectives, contrairement la
s.paration immuno-magn.tique qui permet th.oriquement une concentration s.lective de la cible de
l'analyse.
4.2.1 FiItration
La filtration peut tre utilis.e dans le cas d'une eau suffisamment peu charg.e en matires en
suspension ou en colloEdes pour tre filtrable sans problme de colmatage du filtre. Le principe est de
faire passer un volume du liquide donn. sur un filtre qui va retenir notamment les bact.ries cibles de
l'analyse et laisser passer le liquide ainsi que les particules plus petites que le seuil de coupure du
filtre. Le retentt
20
20
Ce qui ne traverse pas la membrane de filtration.
obtenu contient les bact.ries recherch.es.
Anses
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Diff.rentes normes d.crivent des m.thodes de filtration pour la concentration pr.alable une
recherche de Legionella dans l'eau.
Selon la norme europ.enne NF EN SO 11731-2 (juillet 2008), relative la recherche et au
d.nombrement de Legionella - Partie 2 "M.thode par filtration directe sur membrane pour les eaux
faible teneur en bact.ries", le volume des .chantillons pr.lev.s d.pend de la nature de lSeau et de la
finalit. de lSexamen effectu.. l est donc pr.conis. de filtrer 10 mL 1 000 mL de lS.chantillon dSeau
sur membrane en nitrate de cellulose de porosit. moyenne 0,45 Vm. Pour r.duire au minimum la
croissance des bact.ries non Legionella, lS.chantillon doit tre trait. avec un tampon acide
directement dans lSentonnoir du filtre. l est important de noter que la filtration de volumes importants
dS.chantillon peut favoriser la concentration de substances toxiques vis--vis de la croissance sur la
membrane filtrante. Ainsi, une variation du rendement de r.cup.ration des bact.ries lorsque les
volumes de filtration sont plus importants peut-tre li.e la pr.sence de substances inhibitrices,
l'.tat physiologique des bact.ries pr.sentes et leurs capacit.s d'agr.gation. La membrane ainsi
obtenue est directement plac.e sur la bote du milieu de culture (milieu BCYE ou GVPC). La m.thode
d.crite dans cette norme, la suite de cette concentration, correspond une analyse de l'.chantillon
par culture. Une correspondance avec la norme franaise NF T 90-431 est d'ailleurs mentionn.e.
Selon la norme NF T90-431 (septembre 2003), relative la recherche et au d.nombrement de
Legionella spp et Legionella pneumophila - M.thode par ensemencement direct et aprs
concentration par filtration sur membrane ou centrifugation, 1 L dSeau, ou dans le cas des eaux sales
et/ou non filtrables 500 mL, doit tre filtr. sur une ou plusieurs membrane(s) en polycarbonate de
porosit. 0,45 Vm puis la membrane doit tre :
- soit gratt.e dans 5 mL d'eau purifi.e st.rile ou d'eau de l'.chantillon ;
- soit immerg.e dans 5mL d'eau purifi.e st.rile ou d'eau de l'.chantillon au sein d'un r.cipient
st.rile plac. au milieu d'une cuve ultrasons.
Le concentrt ainsi obtenu peut ensuite tre analys. par culture.
Selon la norme NF T90-471 (avril 2010), relative la d.tection et quantification de Legionella et/ou
Legionella pneumophila par concentration et amplification g.nique par r.action de polym.risation en
chane en temps r.el, lorsque des membranes filtrantes sont utilis.es, elles doivent tre en
polycarbonate ou tout autre compos. ayant une faible capacit. d'adsorption des prot.ines et de
l'ADN
21
Compte tenu de ces .l.ments il apparat que le principe et le mode op.ratoire de la m.thode de
concentration par filtration sont d.j pr.cis.ment d.crits. l faut cependant noter que des variantes
apparaissent en fonction du type d'analyse que doit subir l'.chantillon, notamment en termes de
volume d'.chantillon avant filtration n.cessaire et de remise en suspension ou pas de l'.chantillon
concentr..
, de porosit. nominale inf.rieure ou .gale 0,45 0m. Le volume d'.chantillon filtr. doit tre si
possible compris entre 100 mL et 1 L. Ce volume doit tre pris en compte pour l'expression de la
limite de quantification et la limite de d.tection. La r.duction du volume filtr. a un impact important sur
ces valeurs qui augmentent proportionnellement.
4.2.2 Centrifugation
La centrifugation est utilis.e dans le cas des eaux charg.es et/ou non filtrables. Le principe est de
soumettre l'.chantillon une force centrifuge, qui a pour effet d'acc.l.rer la s.paration des particules
en suspension dans le liquide. Ainsi, les bact.ries recherch.es se retrouvent concentr.es dans le
culot et en th.orie absentes du surnageant. Le concentrt analyser est obtenu aprs extraction du
surnageant.
Selon la norme NF T90-431, aprs homog.n.isation, 500 mL de l'.chantillon sont centrifug.s dans 1
ou 2 r.cipients st.riles fond conique 30 000 m.s
-2
(3000 g), pendant 30 min, une temp.rature
comprise entre 15 C et 25 C. Le surnageant est ensuite .limin. st.rilement par aspiration en
laissant le culot dans 5 mL du surnageant. Le concentrt ainsi obtenu pourra tre analys. par culture
aprs remise en suspension.
La norme exp.rimentale XP T90-471 (avril 2006), relative la d.tection et quantification de Legionella
et/ou Legionella pneumophila par concentration et amplification g.nique par r.action de
polym.risation en chane en temps r.el, mentionnait la possibilit. de r.aliser la concentration par
centrifugation, sous r.serve qu'elle fasse l'objet d'une optimisation, test.e par la validation du
21
Ne surtout pas utiliser de membrane contenant de la cellulose.
Anses
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rendement. Cependant sa version r.vis.e, la norme NF T90-471, n'.voque plus la possibilit. d'utiliser
une centrifugation comme moyen de concentration.
Ainsi, le principe et le mode op.ratoire de la m.thode de concentration par centrifugation sont
.galement d.j pr.cis.ment d.crits.
4.2.3 S.paration immuno-magn.tique (IMS)
Le principe de cette m.thode repose sur la capture s.lective des bact.ries par des anticorps fix.s sur
des billes magn.tiques, partir d'un .chantillon liquide plus ou moins complexe (eau chaude
sanitaire, eau de tour a.ror.frig.rante, biofilm dissoci., etc.). La m.thode permet th.oriquement la
capture des cellules pr.sentant l'.pitope cibl. par l'anticorps utilis. (Riffard et al. 2001).
La m.thode n'est pas normalis.e pour l'application aux Legionella. Toutefois, l'utilisation de cette
technique est d.crite dans la norme NF T90-455 de juillet 2001 "Qualit. de lSeau - Recherche et
d.nombrement dSoocystes de Cryptosporidium et de kystes de Giardia - M.thode de concentration et
de d.nombrement".
Sans tenir compte de la pr.paration de l'.chantillon, il faut compter au moins 30 minutes d'incubation
sous agitation entre le complexe billes magn.tiques-anticorps et l'.chantillon liquide et pr.voir ensuite
des lavages avant r.v.lation de la s.paration immuno-magn.tique (MS) par la technique d'analyse
choisie.
Les anticorps utilisables sont ceux pr.sentant une affinit. suffisante pour permettre une capture
s.lective des Legionella, notamment ceux utilis.s par les techniques d'immuno-d.tection appliqu.es
aux Legionella.
Dans le contexte Legionella, un kit d'immuno-capture est commercialis. avec pour objectif de
simplifier et d'augmenter la rapidit. d'obtention du r.sultat de d.tection de Legionella spp. dans des
.chantillons d'eau ou des .chantillons environnementaux. Ce kit est destin. tester plusieurs
espces de Legionella (Legionella pneumophila dont le s.rogroupe 1, L. bozemanii, L. brunensis, L.
dumoffii, L. micdadei et L. anisa) partir d'.chantillons d'eaux environnementales ou artificiellement
contamin.es, de biofilms ou de suspension complexes. Selon le fabricant, il permet de r.cup.rer des
Legionella partir d'un inoculum d'eau st.rile contenant moins de 100 UFC/L.
La limite de d.tection de l'analyse d.pend de la m.thode analytique mise en 8uvre aprs la
concentration. Les performances de la s.paration immuno-magn.tique peuvent tre .valu.es en
calculant un rendement de r.cup.ration, c'est dire en comparant le nombre, la quantit. ou l'intensit.
du signal r.cup.r. aprs la technique d'analyse choisie seule et aprs combinaison de l'MS avec la
technique d'analyse. Pour les 4 .tudes publi.es sur Legionella, les rendements de r.cup.ration
obtenus sur suspensions pures en Legionella ou faiblement contamin.es sont toujours sup.rieurs
50%. Le pourcentage de valeurs pr.dictives n.gatives est li. la sp.cificit. par rapport la cible de
l'anticorps. Ces pourcentages varient extrmement (de 8 % plus de 95 %) en fonction de la
complexit. des .chantillons : eaux chaudes sanitaires, eaux de tours a.ror.frig.rantes, biofilms
(Fuchslin et al. 2010; Riffard et al. 2001; Sethi et al. 2007; Yanez et al. 2005). Concernant l'utilisation
de l'MS en combinaison avec la culture, l'efficacit. de l'MS est d'autant plus forte que l'.chantillon
est complexe. A titre d'exemple, un .chantillon rendu non interpr.table en culture, cause d'une
importante flore interf.rente, peut tre rendu quantifiable en r.alisant une MS pr.alablement la
culture (Riffard et al. 2001).
Anses
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5 Description des m.thodes de d.nombrement s.Iectives de Legionella
utiIisant un principe unique
Ce chapitre est destin. d.crire le plus exhaustivement possible les m.thodes de d.nombrement de
Legionella dans l'eau. Certaines m.thodes encore trop peu d.velopp.es et document.es pour
permettre une .valuation de leurs avantages et inconv.nients sont succinctement d.crites dans les
sous chapitres Evolutions possibles des m.thodes .
Rappelons que l'objectif de ce travail est d'.valuer l'aptitude de ces m.thodes r.pondre aux besoins
du d.nombrement de Legionella dans le contexte des eaux chaudes sanitaires et des tours
a.ror.frig.rantes.
La m.thode de pr.lvement utilis.e doit prendre en compte la compatibilit. avec les modes de
pr.lvement faisant actuellement l'objet de guides techniques ou de norme.
5.1 M.thodes bas.es sur Ia croissance.
5.1.1 CuIture
La m.thode de d.nombrement de Legionella, dans l'eau, par culture, fait l'objet de la norme Afnor
NFT90-431 (septembre 2003). Actuellement, en France, elle est la seule m.thode officiellement
reconnue par les autorit.s sanitaires.
5.1.1.1 Principe
Le principe de la m.thode de d.nombrement par culture est d'ensemencer un .chantillon sur un
milieu de culture, pour compter le nombre de colonies qui se forment aprs une incubation une
temp.rature donn.e. La s.lectivit. de la m.thode d.pend de celle du milieu de culture utilis. et de la
temp.rature d'incubation.
La m.thode de recherche et de d.nombrement de Legionella spp. et de Legionella pneumophila dans
l'eau telle que d.crite dans la norme Afnor NF T90-431 pr.voit une incubation 36C, sur milieux de
culture s.lectifs (milieu GVPC) durant 8 10 jours et leur examen au moins trois reprises partir de
3 4 jours de culture, jusquS la fin de la p.riode dSincubation. Ces examens permettent le rep.rage
des colonies potentiellement positives.
Les colonies caract.ristiques de Legionella sont ensuite repiqu.es sur diff.rents milieux de culture
pour confirmation. Aprs une p.riode dSincubation de 2 4 jours, un examen de ces milieux permet le
d.nombrement de Legionella. Sont consid.r.es comme Legionella toutes les colonies qui se
d.veloppent sur le milieu GVPC et sur un milieu BCYE riche en L-cyst.ine, mais ne se d.veloppent
pas sur le milieu BCYE sans L-cyst.ine et/ou g.lose au sang ou g.lose nutritive, deux milieux non
s.lectifs. Les exigences nutritives des Legionella sont pr.cis.es dans la description des milieux de
culture, pr.sent.e dans le sous-chapitre "5.1.1.6. Mat.riel n.cessaire"
Lorsque Legionella est d.nombr.e, un test dSagglutination au latex ou par immunofluorescence directe
est pratiqu. afin dSidentifier l'espce L. pneumophila (NF T90-431). Ces tests permettent .galement
d'identifier le s.rogroupe 1 de L. pneumophila bien que cela ne figure pas dans les normes.
La m.thode d.crite dans la norme SO 11731-2 reprend le mme principe g.n.ral. Les bact.ries, y
compris les Legionella, sont concentr.es par filtration sur membrane. Aprs filtration, le filtre est trait.
avec un tampon acide plac. directement sur l'entonnoir, pour r.duire la croissance des bact.ries
autres que Legionella. La diff.rence essentielle avec la norme NF T90-431, r.side dans le fait que le
filtre est ensuite transf.r. sur une boite de culture et incub. 36 C pendant au moins 10 jours (SO
11731-2). Elle permet une culture de Legionella directement sur filtres mais qui contrairement la NF
T90-431 ne permet d'analyser que des eaux faible teneur en bact.ries, qui sont pr.cis.ment
d.finies dans le sous-chapitre "Matrice d'application". Si une inhibition ou une croissance importante
de microorganismes est suspect.e, cette norme pr.voit le r.examen de volumes plus faibles ou de
dilutions de l'.chantillon. Cette m.thode n'est actuellement pas pr.conis.e par la r.glementation
franaise.
5.1.1.2 nformations apport.es par les r.sultats
Les r.sultats des m.thodes de d.nombrement par culture sont exprim.s en nombre d'unit.s formant
colonies de Legionella spp. et Legionella pneumophila par litre d'eau (UFC/l) (NF T90-431 ; SO
11731-2).
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Seules les bact.ries cultivables sont d.nombr.es. Ainsi, quand les cellules de Legionella perdent leur
caractre cultivable (VBNC), mme si elles restent viables, elles ne sont plus d.tectables avec une
m.thode par culture. (Byrd et al. 1991; Delgado-Viscogliosi et al. 2009; Hay et al. 1995; Hussong et al.
1987; Murga et al. 2001; Oliver 2000; Oliver 2009; Yamamoto et al. 1996).
Le d.nombrement sur milieu de culture de Legionella contenues dans des protozoaires ou des
v.sicules externes de ces protozoaires est peu document.. l existe des incertitudes quant la
capacit. de la m.thode normalis.e par culture les d.nombrer (Hay et al. 1995).
5.1.1.3 Matrice d'application
La m.thode d.crite dans la norme NF T 90-431 est applicable tous les types d'eaux propres (eaux
destin.es la consommation humaine, eaux chaudes sanitaires, eaux min.rales naturelles usage
thermal, eaux r.cr.atives, etc.) et d'eaux sales (industrielles, naturelles, etc.). En pratique, le
d.nombrement de Legionella dans des eaux charg.es non filtrable reste cependant d.licat avec cette
technique. La concentration de l'.chantillon est r.alis.e par :
D filtration sur membrane de polycarbonate de 0,45Vm de porosit. pour une eau filtrable, suivie
d'une remise en suspension des bact.ries retenues sur la membrane dans 5 mL d'eau st.rile,
par sonication ou grattage (NF T90-431) ;
D ou par centrifugation pour les .chantillons non filtrables, suivie d'une remise en suspension du
culot dans 5 mL d'eau st.rile (Circulaire DGS 2005/315 ; NFT90-431).
La m.thode d.crite dans la norme SO 11731-2 est applicable uniquement aux eaux usage humain
(eau chaude, froide, lavage), eaux destin.es la consommation humaine et eaux de baignade
trait.es (piscines). Une norme SO 11731-1, en cours de pr.paration, devrait tre applicable aux
s.diments, d.p?ts et biofilm.
5.1.1.4 Echantillon n.cessaire
Selon la norme NF T90-431, le volume de l'.chantillon est d'1 L pour une eau filtrable (peu charg.e,
comme les eaux de consommation humaine) ou de 0,5 L pour une eau charg.e (non filtrable)
(Circulaire DGS 2005/315).
Selon la norme NF EN SO 11731-2, l'.chantillon est compos. de 10 mL 1 L (pour une eau filtrable).
La plupart des auteurs d'.tudes exp.rimentales qui mettent en 8uvre la culture utilisent des
.chantillons d'1 L. Ce volume permet un compromis entre sensibilit. de la m.thode et faisabilit. de sa
mise en 8uvre (Delgado-Viscogliosi et al. 2009; Yaradou et al. 2007).
Dans tous les cas l'.chantillon doit parvenir au laboratoire dans les 48 heures (stockage 4C)
(NFT90-431 ; NF EN SO 11731-2).
5.1.1.5 Paramtres de performance
5.1.1.5.1 Justesse
Cette m.thode sous estime le nombre de Legionella en pr.sence d'une flore interf.rente pouvant se
d.velopper plus rapidement que Legionella sur les milieux de culture non s.lectif (BCYE). Pour
r.soudre ce problme, la norme NF T90-431 impose l'utilisation du milieu s.lectif GVPC, cens.
inhiber la croissance de la flore interf.rente. Les faux positifs, la m.thode en minimise le nombre, du
fait de la s.lectivit. des milieux utilis.s. Cependant, cette inhibition n'est pas totale et ce milieu de
culture inhibe .galement la croissance de certaines Legionella (Allegra et al. 2008).
Concernant les faux n.gatifs, la m.thode ne d.tecte pas les bact.ries viables non cultivables. De ce
fait, selon certains auteurs, la concentration en Legionella dans les .chantillons environnementaux
serait largement sous-estim.e (Allegra et al. 2008; Doleans et al. 2004; Fields et al. 2002). Pour la
m.thode normalis.e, l'existence de faux n.gatifs a notamment .t. d.montr.e pour des .chantillons
contenant des amibes. Dans ce cas, elle est interpr.t.e comme une d.tection ou un d.nombrement
erron. des Legionella pr.sentes dans les amibes (Hay et al. 1995).
Concernant la r.p.tabilit., des pr.cisions, bas.es sur des donn.es d'analyse de routine, sont
apport.es dans la synthse des auditions men.es par le groupe de travail, pr.sent.e au point 10.2 de
ce rapport.
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5.1.1.5.2 Fidzlitz, reproductibilitz
Concernant la reproductibilit. de la m.thode, le coefficient de variation maximum observ. serait de
l'ordre de 10 % (Delgado-Viscogliosi et al. 2005). Sur ce point des pr.cisions, bas.es sur des
donn.es d'analyse de routine, sont apport.es dans la synthse des auditions men.es par le groupe
de travail, pr.sent.e au point 10.2 de ce rapport.
5.1.1.5.3 Sensibilitz
Parmi les facteurs qui peuvent entraner des pertes de rendement au cours des diff.rentes phases
aboutissant au d.nombrement des bact.ries par culture, la pr.sence de microorganismes autres que
Legionella, peut jouer un r?le majeur en envahissant les milieux nutritifs par un effet bact.ricide qui
leur est propre (Delgado-Viscogliosi et al. 2005).
l n'a pas .t. montr. si toutes les espces de legionella ont la mme capacit. de croissance en
culture sur le milieu GVPC (Luck et al. 2004).
Le rendement peut .galement varier en fonction des caract.ristiques de l'eau analys.e. Pour la
m.thode par culture, selon certains auteurs, il est de l'ordre de :
D 70 % pour l'analyse d'une eau de r.seau hospitalier (Wellinghausen et al. 2001) ;
D 10 30 % pour l'analyse d'eau environnementale
22
La limite de d.tection est variable en fonction des caract.ristiques de l'eau analys.e (NFT90-431 ;
Circulaire DGS 2005/315) :
(Ballard et al. 2000; Boulanger and
Edelstein 1995)
D 50 UFC/L pour un .chantillon d'eau peu charg.e filtrable, comme l'eau du robinet ;
D 100 UFC/L pour un .chantillon d'eau charg.e non filtrable, comme l'eau d'un circuit de
refroidissement, et qui n.cessite une centrifugation de l'.chantillon.
La limite de quantification est .galement variable en fonction des caract.ristiques de l'eau analys.e
(NFT90-431 ; Circulaire DGS 2005/315) :
D 250 UFC/L pour un .chantillon d'1 L d'eau peu charg.e filtrable ;
D 500 UFC/L pour un .chantillon d'1 L d'eau charg.e non filtrable.
5.1.1.5.4 Spzcificitz, szlectivitz
Selon la norme NF T90-431, la m.thode de d.nombrement par culture est sp.cifique de L.
pneumophila et de L. spp. l faut cependant noter ici que les milieux de culture utilis.s permettent
parfois la croissance d'autres genres que Legionella. Par ailleurs ils sont .galement susceptibles de
limiter la croissance de certaines espces du genre.
Le milieu de culture s.lectif pr.conis. dans la norme est le milieu GVPC. l permet une relativement
bonne s.lectivit. du genre Legionella, mme s'il n'exclut pas totalement la croissance d'autres
genres. Les tests compl.mentaires de croissance et immunologiques impos.s dans la norme AFNOR
T90-431 permettent de confirmer que les colonies cultiv.es sont bien du genre Legionella et
d'augmenter ainsi la sp.cificit..
5.1.1.5.5 Rapiditz
Selon la norme NF T90-431, le temps n.cessaire un d.nombrement de L. pneumophila par culture
est compris entre 8 et 14 jours ( r.ception au laboratoire) : 1 jour pour le pr.traitement de
l'.chantillon (filtration ou centrifugation, traitement acide ou thermique et ensemencements), 8 10
jours d'incubation et 2 4 jours de confirmation de l'identification.
En pratique, en cas de pr.sence de Legionella dans l'eau en grande quantit., la m.thode par culture
permet de mettre en .vidence un d.passement des valeurs cibles par une pr.-lecture aprs 3 5
jours d'incubation. Le cas .ch.ant, une premire information peut donc tre transmise plus
rapidement au gestionnaire que les 14 jours d.finis par la norme.
5.1.1.6 Mat.riel n.cessaire
Les milieux de culture utilis.s dans le cadre d'un d.nombrement par culture ont une importance
cruciale pour les r.sultats d'analyse, notamment dans la s.lectivit. de la m.thode. Leur description
22
Eau non pr.par.e artificiellement.
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pr.cise et la bonne compr.hension de leurs objectifs respectifs est importante. Les milieux dont
l'utilisation est pr.vue dans la norme NF T90-431 sont les suivants :
D BCYE (Buffered charcoal yeast extract) avec et sans L-cyst.ine:
Ces deux milieux g.los.s sont destin.s la confirmation des colonies obtenues sur g.lose
GVPC (d.fini ci-dessous). Leur composition est normalis.e (NFT90-431, NF EN SO 11731-
2). Les g.loses BCYE et BCYE sans cyst.ine ne diffrent que par la pr.sence ou non de
cyst.ine dans le milieu. L'extrait autolytique de levure constitue le substrat nutritif permettant
une croissance bact.rienne. Le charbon actif assure la d.composition du peroxyde
d'hydrogne produit par le m.tabolisme bact.rien, la capture du dioxyde de carbone et
modifie la tension superficielle (Feeley et al. 1979). Le tampon ACES
23
D GVPC (Glycine Vancomycine Polymyxine Cycloheximide) :
/KOH assure le
maintien du pH et permet d'incuber les milieux en a.robiose (Pasculle et al. 1980). La
cyst.ine, lorsqu'elle est pr.sente, et le pyrophosphate ferrique, repr.sentent des .l.ments
nutritifs indispensables pour la culture des Legionella (Feeley et al. 1978), alors que l'd-
c.toglutarate est un activateur de leur croissance (Edelstein 1981).
La g.lose s.lective GVPC pour Legionella est destin.e au d.nombrement, l'isolement et
la culture des espces de Legionella. Sa composition est d.crite pr.cis.ment dans la norme
NF T90-431. Elle est quasi identique la g.lose BCYE avec cyst.ine, la pr.sence prs de
glycine, vancomycine, polymyxine B (Wadowsky and Yee 1981) et cycloheximide (Dennis et
al. 1984), dont l'association peut inhiber la pr.sence d'une possible microflore secondaire
24
D G.lose au sang
.
Les colonies de Legionella ont le plus souvent un aspect caract.ristique la loupe binoculaire
dit en verre fritt..l
Peu s.lective, la g.lose au sang permet cependant dSappr.cier le pouvoir h.molytique de
certaines bact.ries (Afnor NFT90-431). Ce milieu de culture bien que relativement riche, ne
permet pas la culture de Legionella, de mme que le BCYE sans cyst.ine. Ainsi une culture
positive sur BCYE sans cysteine et sur G.lose au sang exclus une Legionella.
D G.lose nutritive
Selon la norme Afnor NFT90-431, La gzlose nutritive est un milieu de culture non szlectif de
composition souvent empirique, dont la formulation apporte les zlzments nutritifs nzcessaires
[ la croissance d'une grande variztz de germes non exigeants. Au stade de la confirmation
des colonies caractzristiques obtenues sur le milieu szlectif, la manifestation de cultures sur la
gzlose nutritive permet d'zliminer les germes non-cibles, infirmant ainsi la przsence de
Legionella dont la croissance est dzpendante de la przsence de cystzine, acide aminz absent
de la composition de ce milieu.
Le mat.riel n.cessaire la mise en 8uvre de cette m.thode comprend .galement :
D Les kits de test d'agglutination au latex ou les kits de test par immunofluorescence directe
pour caract.riser l'espce pneumophila et les s.rogroupes ;
D L'incubateur 36C ;
D La loupe binoculaire ;
D L'unit. de filtration et/ou la centrifugeuse ;
D Les cuves ultrasons ;
D Le bain-marie 50 +/- 1 C ;
D Le microscope en fluorescence ;
D Les consommables .voqu.s dans la norme NF T90-431.
5.1.1.7 Robustesse, comp.tences n.cessaires, simplicit.
La m.thode par culture est potentiellement matris.e par tout laboratoire de microbiologie pour la
recherche et l'analyse de routine en milieu hospitalier, environnemental, etc.)
23
Tampon ACES : acide N2-ac.tamido-2-amino-.thane-sulfonique
24
La vancomycine est une mol.cule inhibitrice de la synthse du peptidoglycane de la paroi bact.rienne. Mais, du fait de son
poids .lev., elle ne peut emprunter les porines de la membrane externe des Gram n.gatifs. Elle n'affecte donc que les
bact.ries Gram positifs. La concentration .lev.e en glycine inhibe .galement fortement la flore secondaire Gram+. La
polymyxine B est un surfactant cationique affectant la structure de la membrane de la cellule bact.rienne en interagissant avec
ses phospholipides. Elle possde un effet bact.ricide sur les bacilles Gram n.gatifs. Le cycloheximide est un inhibiteur de la
synthse prot.ique des cellules eucaryotes. l est utilis. ici comme antifongique, car il est inhibiteur de croissance des myctes.
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5.1.1.8 Avantages et inconv.nients th.oriques intrinsques de la m.thode par culture
TabIeau 2 : avantages et inconv.nients de la culture
Avantages Inconv.nients Non
.vaIu.
25
Critres
de
priorit.
.Iev.e
V Quantification de Legionella
pneumophila
V Quantification Legionella pneumophila
avec distinction du s.rogroupe 1
V Non d.tection des Legionella mortes
V Critres d'interpr.tation pour le risque
sanitaire disponibles
V Applicable sur des .chantillons d'eau
trait.e
V ncertitude sur la prise en compte
des Legionella intra amibiennes ou
intra v.siculaires dans la
quantification
V Ne d.tecte pas l'ensemble des
Legionella viables et potentiellement
pathognes
V M.thode lente
Critres
de
priorit.
mod.r.e
V Distinction et quantification des
s.rogroupes Lp autre que sg1
V Quantification de l'ensemble des
Legionella spp
V Faisabilit., simplicit.
V Equipements n.cessaires faibles
V nterpr.tation technique simple des
r.sultats bruts
V Permet de disposer de souches pour
des .tudes compl.mentaires
V Peut ne pas tre applicable
certaines eaux trs charg.es
(biologiquement, chimiquement ou
physiquement)
V Temps technicien important
5.1.2 Direct ViabIe Count (DVC)
La m.thode de d.nombrement de Legionella, dans l'eau, par DVC, ne fait actuellement pas l'objet
d'une norme.
5.1.2.1 Principe
La m.thode de d.nombrement appel.e DVC (direct viable count) (Kogure 1979 ; Joux 1997 ; Singh
1989 ; Peele 1981; Altug 2010 ; Barcina 1995) permet en un temps r.duit d'estimer la capacit. d'une
bact.rie se diviser et donc par extrapolation, d'appr.cier son potentiel de g.n.ration d'une colonie. l
est bas. sur l'utilisation d'un cocktail d'antibiotiques capables de bloquer la division bact.rienne sans
pour autant alt.rer le m.tabolisme bact.rien. Dans ces conditions, en pr.sence de nutriments et
d'antibiotiques quantitativement et qualitativement adapt.s, et d'un temps d'incubation une
temp.rature optimale, les bact.ries viables capables de s'allonger sans pouvoir se diviser vont ainsi
s'allonger et atteindre une taille plus importante que celle observ.e avant incubation. Au stade actuel
de d.veloppement du DVC, il est encore difficile de fixer une taille de cellule partir de laquelle elles
sont consid.r.es comme plus longues que la normale, d'autant plus pour les Legionella qui sont
connues pour filamenter dans certaines conditions environnementales stressantes. La d.tection des
bact.ries allong.es ou non se fait aprs marquage par des fluorochromes et comptages au
microscope .pifluorescence.
En optimisant le choix des antibiotiques, le proc.d. en lui-mme et surtout le milieu de culture, il est
possible d'estimer le nombre de L. pneumophila viables (capables de se diviser) dans un .chantillon,
en 12h. Afin de distinguer s.lectivement L. pneumophila des autres bact.ries ou cellules contenues
dans un .chantillon environnemental, il est n.cessaire d'y associer une technique d'identification
s.lective (ex : hybridation in situ FSH).
5.1.2.2 nformations apport.es par les r.sultats
Les r.sultats de cette m.thode sont exprim.s en nombre de cellules bact.riennes viables capable de
se diviser par litre d'eau (cellules/L). La lecture est r.alis.e au microscope.
En utilisant des milieux de culture adapt.s (BCYE), la m.thode DVC permet le d.nombrement de
Legionella spp. et L. pneumophila dans les eaux. Cette m.thode est cependant soumise des limites
25
Par manque de donn.es
Anses
F.vrier 2011 page 51 / 144
relativement proches de celle de la m.thode par culture telle que d.crite dans la norme (NF T90-431),
pour l'analyse des eaux charg.es (non filtrables).
5.1.2.3 Matrice d'application
Selon certains auteurs, cette m.thode permet de d.tecter s.lectivement les bact.ries d'une espce
donn.e dans un m.lange ou un .chantillon environnemental (Rudi et al. 2005). Cependant les
publications relatives son utilisation sur des .chantillons d'eaux environnementales sont rares.
5.1.2.4 Echantillon n.cessaire / le cas .ch.ant m.thode d'.chantillonnage pr.conis.e
Aucune donn.e r.pertori.e.
5.1.2.5 Paramtres de performance
5.1.2.5.1 Justesse
Aucune donn.e r.pertori.e.
5.1.2.5.2 Fidzlitz, reproductibilitz
Aucune donn.e r.pertori.e.
5.1.2.5.3 Sensibilitz
Aucune donn.e r.pertori.e.
5.1.2.5.4 Spzcificitz, szlectivitz
Aucune donn.e r.pertori.e.
5.1.2.5.5 Rapiditz
Le temps n.cessaire est de 1 2 jours, dont 12 heures d'incubation.
5.1.2.6 Mat.riel n.cessaire
Aucune donn.e r.pertori.e.
5.1.2.7 Robustesse, comp.tences n.cessaires, simplicit.
Aucune donn.e r.pertori.e.
Anses
F.vrier 2011 page 52 / 144
5.1.2.8 Avantages et inconv.nients th.oriques intrinsques de la m.thode DVC
TabIeau 3 : avantages et inconv.nients de la DVC
Avantages Inconv.nients Non .vaIu.
26
Critres
de
priorit.
.Iev.e
V Non
d.tection
des
Legionella
mortes
V Rapidit.
des
r.sultats
V Critres
d'interpr.tation
pour le risque
sanitaire non
disponibles
V Quantification de Legionella pneumophila
V Quantification de Legionella pneumophila avec distinction du
s.rogroupe 1
V Prise en compte des Legionella intra amibiennes ou intra
v.siculaires dans la quantification
V D.tection notamment de l'ensemble des Legionella viables et
potentiellement pathognes
V Applicable sur des .chantillons d'eau trait.e
Critres
de
priorit.
mod.r.e
V Pas de distinction et de quantification des s.rogroupes Lp
autre que sg1
V Quantification de l'ensemble des Legionella spp
V Applicable aux eaux trs charg.es
V Faisabilit., simplicit.
V Equipements n.cessaires
V Temps technicien important
V nterpr.tation technique simple des r.sultats bruts
V Permet de disposer de souches pour des .tudes
compl.mentaires
5.1.3 EvoIutions possibIes des m.thodes bas.es sur Ia croissance, peu ou pas test.es pour
rechercher Legionella dans I'eau
En s'appuyant sur le principe de la m.thode de d.nombrement de Legionella par culture, telle que
d.crite dans la norme NF T 90-431, il peut tre envisag. des variantes, potentiellement plus
performantes ou apportant une information suppl.mentaire. Diff.rents exemples peuvent tre
.voqu.s.
5.1.3.1 Pr.traitement des .chantillons
Certains pr.traitements de l'.chantillon, pourraient permettre d'optimiser les performances de la
m.thode de d.nombrement utilis.e. L'utilisation des m.thodes de concentration s.lectives, comme la
s.paration immuno-magn.tique, a d.j .t. .voqu.e dans le chapitre "Etapes de concentration". Elle
pourrait permettre de r.duire la pr.sence d'inhibiteurs de croissance et ainsi amener une
augmentation de la sensibilit. de la m.thode par culture.
5.1.3.2 Am.lioration des milieux de culture
L'utilisation de milieux de culture plus s.lectifs ou permettant de meilleurs rendements de culture
pourrait .galement tre envisag.e. Certaines .tudes .voquent notamment des milieux comme le
BMPA
27
ou le MWY
28
5.1.3.3 Am.lioration de la justesse
(Bartie et al. 2003; Edelstein 1981; Wadowsky and Yee 1981).
Au niveau de la lecture des r.sultats, il est envisageable d'identifier plus de colonies que ce qui est
actuellement pr.conis. dans la norme.
26
Par manque de donn.es
27
Extrait de Levure (11.5 g/L), Charbon activ. (1,5 g/L), Tampon ACES (6,0 g/L), alpha-Cetoglutarate (1,0 g/L), Agar (14,0 g/L),
L-Cysteine HCl (0,4 g/L), Pyrophosphate ferrique (0,25 g/L), Cefomandole (0,004 g/L), Anisomycine (0,01 g/L), Polymixine B
(80 000 U) pH 6,9 +/- 0,1 25 C
28
Extrait de Levure (10 g/L), Charbon activ. (2 g/L), Tampon/KOH 10,0 g/L, alpha-cetoglutarate (1,0 g/L), Agar (14,0 g/L), L-
Cysteine HCl (0,4 g/L), Pyrophosphate ferrique (0,25 g/L), Glycine (3.0 g/L) Polymyxine B (50,000 U), Anisomycin (80 mg/L),
Vancomycine (1.0 mg/L), Bleu de Bromothymol (10 mg/L), Pourpre de Bromocresol (10 mg/L)
Anses
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5.1.3.4 M.thodes compl.mentaires la culture par examen de l'int.grit. des cellules bact.riennes
ou d.tection d'une activit. m.tabolique
Des m.thodes compl.mentaires donnent des informations relatives l'.tat de viabilit. des Legionella
isol.es. Elles sont bas.es sur l'examen de l'int.grit. via de l'activit. enzymatique, du potentiel de
membrane, etc. (Alonso et al. 2002; Hoefel et al. 2003; Joux and Lebaron 2000; Nebe-von-Caron et
al. 2000).
Elles font appel des marqueurs fluorescents, simples ou doubles, sp.cifiques des cellules
bact.riennes viables et, pour certaines m.thodes, .galement des marqueurs des cellules mortes.
L'observation et la quantification des cellules fluorescentes peuvent tre r.alis.es l'aide d'un
fluorimtre, d'un microscope fluorescence, d'un cytomtre en flux ou d'un cytomtre en phase
solide. Les caract.ristiques de ces appareils sont d.crites dans le chapitre "5.3.1.1.3".
A titre d'exemple, certaines m.thodes ont d.j .t. d.velopp.es en ce sens pour apporter une
information compl.mentaire aux m.thodes de d.nombrement de Legionella :
D marquage simple s.lectif des cellules vivantes (TVC pour total viable cell ) - activit.
m.tabolique :
Classiquement, un pr.curseur non fluorescent est mis en contact avec l'.chantillon tester.
Ce pr.curseur peut tre internalis. par Legionella et cliv. par des enzymes bact.riennes en
un produit fluorescent. Les cellules bact.riennes dont la membrane est intacte deviennent
fluorescentes et ne laissent pas s'.chapper le fluorochrome dans le milieu de culture. La
fluorescence r.vle donc une activit. enzymatique et une int.grit. membranaire que les
auteurs associent une viabilit. (Delgado-Viscogliosi et al. 2005; Dusserre et al. 2008).
D double marquage s.lectif des cellules vivantes et mortes - int.grit. membranaire :
Deux fluorochromes sp.cifiques des acides nucl.iques sont utilis.s : un marqueur fluorescent
vert (Syto9) dont les mol.cules peuvent p.n.trer dans les cellules en traversant la membrane
plasmique et un marqueur fluorescent rouge (odure de propidium (P)) dont les mol.cules ne
peuvent p.n.trer dans les cellules que lorsque leur membrane est endommag.e. Une
incubation de 5 minutes seulement permet daprs les auteurs de discriminer la proportion de
bact.ries viables dans leur ensemble (cultivable et VBNC) et non viables (Allegra et al. 2008;
Alonso et al. 2002; Rudi et al. 2005).
Les m.thodes bas.es sur l'examen de l'int.grit. des cellules sont applicables aux eaux propres
filtrables, mais restent limit.es pour l'analyse d'.chantillons environnementaux non filtrables. Ce sont
des outils valables pour analyser, caract.riser et d.crire les cellules VBNC dans une matrice matris.e
en laboratoire ou pr.alablement purifi.e et concentr.e en Legionella (Allegra et al. 2008; Dusserre et
al. 2008). Dans le cas d'un .chantillon d'eau environnementale, il est n.cessaire de pratiquer un
double marquage associant une d.tection de Legionella par un anticorps sp.cifique (Tyndall and
Domingue 1982) un marquage de viabilit.. Les r.sultats obtenus sont exprim.s en nombre
d'.vnements par cytomtrie en flux, en nombre de bact.ries par microscopie ou cytom.trie en phase
solide et en intensit. de fluorescence par fluorim.trie.
5.2 M.thodes bas.es sur ISampIification g.nique
5.2.1 R.action de poIym.risation en chane quantitative en temps r.eI (q-PCR)
La m.thode de d.nombrement de Legionella, dans l'eau, par q-PCR
29
Actuellement, il n'y a pas d'.quivalence officiellement reconnue entre les m.thodes par culture (NF
T90-431) et par q-PCR (NF T90-471), c'est--dire entre les r.sultats exprim.s en UG/L et ceux
obtenus par la culture exprim.s en UFC/L.
, fait l'objet de la norme Afnor
NF T90-471 "Qualit. de lSeau - D.tection et quantification des Legionella et/ou Legionella
pneumophila par concentration et amplification g.nique par r.action de polym.risation en chane
(PCR)" (avril 2010).
5.2.1.1 Principe
La Polymerase Chain Reaction (PCR), est une m.thode de biologie mol.culaire bas.e sur
l'amplification g.nique in vitro. Elle permet de copier en grand nombre une s.quence dSADN connue,
partir dSune faible quantit. initiale, par l'utilisation d'une enzyme ADN polym.rase et d'amorces
oligonucl.otidiques. La s.lectivit. de la technique vient du fait que les amorces nucl.otidiques
29
Egalement appel.e par certains auteurs RT (Real Time) PCR
Anses
F.vrier 2011 page 54 / 144
utilis.es sont sp.cifiques du gne amplifier. Ces dernires sont constitu.es dSoligonucl.otides de
synthse de taille d.termin.e (20 25 nucl.otides), permettant de d.limiter la s.quence amplifier
(Bej et al. 1991; Saiki et al. 1988).
La PCR en temps r.el (q-PCR ou Real-time PCR
30
) est une .volution de la PCR classique qui
consiste mesurer la quantit. d'ADN polym.ris. chaque cycle grce une sonde fluorescente ou
un agent fluorescent intercalant de l'ADN (Higuchi et al. 1992; Higuchi et al. 1993). Elle permet ainsi
de faire des mesures quantitatives (q-PCR) en comparant les niveaux de fluorescence ceux d'un
standard externe compos. de solutions de concentration calibr.e en unit.s g.nomes de Legionella
pneumophila amplifi.es (Bej et al. 1991; Wellinghausen et al. 2001).
La norme NF T 90-471 laisse le choix des amorces, dans la mesure oM elles sont sp.cifiques de
Legionella. Certaines amorces sont d.j couramment utilis.es pour le d.nombrement de Legionella
par q-PCR. Par exemple, une amorce sp.cifique du genre Legionella qui permet l'amplification d'un
fragment du gne codant pour l'ARNr 16S ou une amorce sp.cifique de l'espce Legionella
pneumophila qui permet l'amplification d'un fragment du gne mip (macrophage infectivity
potentiator), un gne codant pour un potentiateur bact.rien provoquer une infection intracellulaire de
protozoaires ou de macrophages humains (Wellinghausen et al. 2001). D'autres amorces sont
.galement utilis.es, comme des fragments des gnes codant pour l'ARNr 5S (Hayden et al. 2001) et
l'ARNr 23S (Nazarian et al. 2008) ou du gne rpoB codant pour l'ARN polymerase (Yong et al. 2010).
Des amorces sp.cifiques de L. pneumophila de s.rogroupe 1 sont .galement en cours de
d.veloppement et permettraient d'obtenir une information plus pr.cise sur la pr.sence dans l'eau de
ce s.rogroupe, le plus rencontr. en pathologie humaine (Luck et al. 2009; M.rault et al. 2009).
La norme r.vis.e (NF T 90-471) pr.conise un .talonnage chaque changement de lot de r.actifs, par
le raccordement de la solution de calibration de travail un .talon primaire. Elle d.finit ainsi,
l'utilisation d'un .talon primaire certifi. servant am.liorer la reproductibilit. des r.sultats et leur
comparaison entre les diff.rents laboratoires. A la demande de la Direction g.n.rale de la sant.
(DGS), cet .talon a .t. mis au point et est distribu. depuis octobre 2009 par le Centre national de
r.f.rence des l.gionelles (CNRL).
5.2.1.2 nformations apport.es par les r.sultats
Les r.sultats obtenus par cette m.thode sont exprim.s en nombre d'unit.s g.nome de Legionella
spp. et Legionella pneumophila par litre d'eau (en UG/L). Les bact.ries d.nombr.es sont celles
contenant de l'ADN amplifiable, qu'elles soient intactes ou endommag.es. Cette m.thode ne permet
pas de distinguer les cellules viables des cellules non viables (a priori non infectieuses) ou les cellules
cultivables des non cultivables (Ballard et al. 2000; Behets et al. 2007; Delgado-Viscogliosi et al. 2005;
Delgado-Viscogliosi et al. 2009; Dusserre et al. 2008; Joly et al. 2006; Wellinghausen et al. 2001;
Yaradou et al. 2007). Elle permettrait en revanche le d.nombrement de Legionella contenues dans
des protozoaires ou dans des v.sicules externes de ces protozoaires (Hay et al. 1995).
5.2.1.3 Matrice d'application
L'interpr.tation des r.sultats d'une quantification de Legionella pr.sentes dans un .chantillon donn.
par la m.thode q-PCR, d.pend largement des caract.ristiques de l'eau analys.e (Joly et al. 2006). l
existe des diff.rences importantes entre les r.sultats d'une analyse d'eau chaude sanitaire et d'eau
de circuit de refroidissement (Behets et al. 2007). La norme q-PCR (NF T90-471) est conue pour tre
applicable sur tout type d'eau sous r.serve de validation pr.alable de la m.thode vis--vis des
caract.ristiques de l'eau analyser, notamment de charge en particules. Une .tude de rendement
doit ainsi tre r.alis.e sur les diff.rents types d'eau. Jusque-l, la q-PCR a .t. utilis.e aussi bien pour
l'analyse d'eaux chaudes sanitaires que d'eaux de tours a.ror.frig.rantes, avec parfois des
diff.rences de performances selon le type d'eau.
5.2.1.4 Echantillon n.cessaire / le cas .ch.ant m.thode d'.chantillonnage pr.conis.e
Selon la norme NF T90-471, l'.chantillon est concentr. en filtrant le volume maximal d'.chantillon, si
possible compris entre 100 mL et 1 L. Comme pr.c.demment .voqu., cet .chantillon peut tre
concentr. par filtration. Les .chantillons doivent tre stock.s 4C (Delgado-Viscogliosi et al. 2009),
voire 20C (Joly et al. 2006).
30
Dans ce rapport la RT-PCR d.signe le reverse transcriptase PCR et non le real-time PCR
Anses
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5.2.1.5 Paramtres de performance
Tout laboratoire voulant utiliser la m.thode q-PCR selon la norme NF T 90-471 doit caract.riser la
m.thode :
D connatre ou .tudier l'inclusivit. et l'exclusivit.
31
D connatre ou estimer la limite de d.tection
des sondes et des amorces
D connatre ou estimer la limite de quantification
D .tudier la fonction d'.talonnage de la q-PCR
D ou estimer le rendement optimal de la m.thode
Les utilisateurs de kits commerciaux ne r.aliseront pas l'.tude d'inclusivit. et d'exclusivit. mais
demanderont les informations au fournisseur du kit. Par contre, ils r.aliseront toutes les autres .tapes
de caract.risation. La certification AFNOR d'un kit ne dispense pas de ces .tapes.
5.2.1.5.1 Justesse
Concernant les faux positifs, la q-PCR prend en compte aussi bien les bact.ries viables que non
viables. Ainsi, la surveillance de la pr.sence de Legionella dans l'eau par cette m.thode pourrait
entraner une surestimation du risque de l.gionelloses. En effet il est .tabli que l'ADN de bact.ries
non viables peut r.sister dans l'environnement, alors que seules les Legionella viables peuvent se
multiplier dans les macrophages pulmonaires et provoquer une pneumonie (Delgado-Viscogliosi et al.
2009; Fields 1996; Fields et al. 2002; Nocker and Camper 2006). L'ADN bact.rien peut tre pr.sent
dans le milieu aqueux ext.rieur soit par s.cr.tion active des cellules viables soit par relargage partir
des cellules mortes et il participe la constitution du biofilm (Steinberger and Holden 2005). Une
bonne partie de l'ADN lib.r. est probablement .galement dig.r.e par les protozoaires pr.sents dans
l'eau, mais l'efficacit. de ce processus est encore mal .tablie (Nielsen et al. 2007). Parce qu'il est
difficile de distinguer au sein de l'ADN pr.sent les mol.cules pures, celles qui sont encapsul.es dans
des particules virales ou des ultramicrobact.ries (<0,2 Vm) ou encore celles li.es aux colloEdes, le
terme d'ADN en solution est fr.quemment utilis. pour d.signer ces formes tout autant que l'ADN libre.
La concentration typique en ADN libre dans l'eau a .t. estim.e entre 1 et 17 UG/L, bien que des
niveaux sup.rieurs aient d.j .t. retrouv.s (Lorenz and Wackernagel 1994; Suida and Gude 1996).
La persistance long terme de fragments d'ADN dans l'environnement mime les r.sultats obtenus
dans les sols oM un signal peut tre obtenu par PCR des semaines aprs que l'inoculum ait perdu sa
viabilit.. La plupart des .tudes actuelles concluent que des mol.cules d'ADN extracellulaires sont
toujours pr.sentes bien que la d.gradation d'un ADN nu introduit se produise g.n.ralement en
quelques heures (Nielsen et al. 2007). D'un autre c?t., l'analyse s.lective de l'ADN extracellulaire
associ.e aux s.diments marins montre que ses teneurs sont voisines de celles observ.es dans l'eau
(comprises entre 7 et 24 UG/L) mais montre que ce dernier est g.n.ralement d.pourvu d'ADN 16S
amplifiable (Corinaldesi et al. 2005). Cependant, th.oriquement, les r.sultats de la m.thode par q-
PCR ne sont pas perturb.s pas la pr.sence .ventuelle d'ADN libre dans l'eau analys.e. Celui-ci est
normalement .limin. par l'.tape de filtration ou de centrifugation et ne peut donc tre l'origine de
faux positifs.
Concernant les faux n.gatifs, la m.thode par q-PCR limiterait le nombre de faux n.gatifs, notamment
en permettant la d.tection des Legionella contenues dans les protozoaires, qui sont difficilement
d.tect.es par culture (Hay et al. 1995). La proc.dure de pr.paration de l'.chantillon pr.conis.e dans
la norme NF T90-471 donne moins de d.tail quant l'intensit. de la centrifugation pr.conis.e. Sa
capacit. permettre l'extraction de l'ADN des bact.ries intra amibiennes peut donc se poser.
Toutefois, une publication de Wellinghausen et al., d.crit la m.thode permettant d'extraire l'ADN des
bact.ries intra amibiennes, pour permettre leur d.nombrement par q-PCR, qui impliquerait deux
s.dimentations par centrifugation 20 000g ( l'aide d'un kit commercial) (Wellinghausen et al. 2001).
Concernant la r.p.tabilit. de la m.thode, le coefficient de variation de la q-PCR (sans tenir compte de
l'extraction des acides nucl.iques) serait de l'ordre de 0.02 % (Behets et al. 2007). Sur ce point des
pr.cisions, bas.es sur des donn.es d'analyse de routine, sont apport.es dans la synthse des
auditions men.es par le groupe de travail, pr.sent.e au point 10.2 de ce rapport.
31
Les amorces et sondes utilis.es doivent donner les r.sultats attendus pour une liste des espces et de s.rogroupes (liste
pr.cis.s dans la norme), qui ont tous .t. isol.s chez l'homme : r.sultat positif pour l'inclusivit., et r.sultat
n.gatif pour l'exclusivit..
Anses
F.vrier 2011 page 56 / 144
5.2.1.5.2 Fidzlitz, reproductibilitz
Concernant la reproductibilit. de la m.thode, le coefficient de variation de la q-PCR (sans tenir
compte de l'extraction des acides nucl.iques) serait de l'ordre de 1 % (Behets et al. 2007). Sur ce
point des pr.cisions, bas.es sur des donn.es d'analyse de routine, sont apport.es dans la synthse
des auditions men.es par le groupe de travail, pr.sent.e au point 10.2 de ce rapport.
5.2.1.5.3 Sensibilitz
Pour l'analyse d'une eau de r.seau hospitalier, le ratio de d.tection de Legionella serait de l'ordre de
99 % (Wellinghausen et al. 2001). Le taux de r.cup.ration moyen dans un .chantillon ensemenc.
avec une quantit. de L. pneumophila connue (Behets et al. 2007) serait de :
D 93 % dans un .chantillon d'eau du robinet ;
D 56 % dans un circuit d'eau de tour a.ror.frig.rante.
La limite de d.tection de la m.thode est d.finie comme le plus petit nombre d'UG par essai ayant
montr. un r.sultat positif (une amplification) dans au moins 90 % des cas (NF T90-471). Elle est
variable selon les auteurs et les conditions exp.rimentales utilis.e :
D entre 30 250 UG/L avec la sonde correspondant au gne codant pour l'ARNr 16S
(sp.cifique de L. spp.) aprs 45 cycles de r.plication par q-PCR (Joly et al. 2006) ;
D entre 250 et 300 UG/L avec la sonde correspondant au gne mip (sp.cifique de L.
pneumophila) aprs 45 cycles de r.plication par q-PCR (Joly et al. 2006) ;
D 60 UG/L avec l'amorce correspondant au gne mip (sp.cifique de L. pneumophila) aprs 50
cycles de r.plication par q-PCR et une efficacit. d'amplification de 98% (Behets et al. 2007) ;
D 170 UG/L avec une sonde correspondant un gne sp.cifique de L. pneumophila (Dusserre
et al. 2008) ;
D 167 UG/L avec une sonde correspondant un gne sp.cifique de L. pneumophila (Yaradou et
al. 2007).
Par convention, la limite de quantification incompressible compte tenu de la dispersion
d'.chantillonnage est de 25 UG/puits (NF T90-471). Elle est d.finie comme le plus petit nombre d'UG
par essai dont le coefficient de variation des r.sultats est inf.rieur 25% (Joly et al. 2006). En
pratique, elle peut tre variable selon les auteurs et l'amorce utilis.e et le volume filtr. :
D 1000 UG/L avec l'amorce correspondant au gne mip (sp.cifique de L. pneumophila) aprs
50 cycles de r.plication par q-PCR dans des conditions exp.rimentales (Ballard et al. 2000) ;
D entre 500 et 5000 UG/L avec l'amorce correspondant au gne codant pour l'ARNr 16S
(sp.cifique de L. spp.) aprs 45 cycles de r.plication par q-PCR (Joly et al. 2006) ;
D entre 1000 et 5000 UG/L avec l'amorce correspondant au gne mip (sp.cifique de L.
pneumophila) aprs 45 cycles de r.plication par q-PCR (Joly et al. 2006) ;
D 833 UG/L avec une amorce correspondant un gne sp.cifique de L. pneumophila (Yaradou
et al. 2007).
La standardisation diminue la variabilit. entre les limites de d.tection et de quantification observ.es.
Celle-ci devrait avoir .t. r.duite depuis la mise au point de l'.talon national par le CNRL (octobre
2009). Sur ce point des pr.cisions, bas.es sur des donn.es d'analyse de routine, sont apport.es
dans la synthse des auditions men.es par le groupe de travail, pr.sent.e au chapitre 10.2. de ce
rapport.
Les limites de d.tection et de quantification peuvent tre largement affect.es par :
D le volume d'.chantillonnage : il doit tre pris en compte pour l'expression de la limite de
quantification (LQ) et la limite de d.tection (LD). Les valeurs de LQ et LD augmentent
proportionnellement avec la r.duction du volume de l'.chantillon filtr. (NF T90-471) ;
D la pr.sence d'inhibiteurs de la polym.rase dans l'.chantillon : l'utilisation d'un .talon interne,
comme pr.vu dans la norme NF T90-471, doit, le cas .ch.ant, permettre la mise en .vidence
de tels inhibiteurs. En cas de pr.sence d'inhibiteurs, il est pr.conis. dans la norme de diluer
l'.chantillon jusqu' ce que les inhibiteurs ne perturbent plus la q-PCR. Cependant cette
pratique a pour effet direct une relve des limites de d.tection et de quantification en rapport
avec le facteur de dilution appliqu. l'.chantillon.
Selon la norme NF T90-471, par convention, la limite de quantification incompressible, compte tenu
de la dispersion d'.chantillonnage (loi de Poisson), est de 25 UG/L +/-0,15 log, soit entre 17.7 et 35.3
UG/L.
Anses
F.vrier 2011 page 57 / 144
5.2.1.5.4 Spzcificitz, szlectivitz
Th.oriquement, la q-PCR est s.lective 100 % vis--vis de 15 s.rogroupes de L. pneumophila
(Behets et al. 2007). l est possible de rechercher s.lectivement une espce, un s.rogroupe, voire un
gne de virulence. Certains gnes de virulence de L. pneumophila sont d.j connus (Fields et al.
2002). Ainsi, des .tudes de la d.tection s.lective, dans l'environnement, de L. pneumophila
s.rogroupe 1 (M.rault et al. 2009) par q-PCR ont d.j .t. men.es. D'autres s.rogroupes ont
.galement .t. amplifi.s partir de cultures (Luck et al. 2009). l devrait tre possible, dans un avenir
proche, de d.tecter s.lectivement les souches appartenant aux grands clones responsables d'un
nombre important de cas de l.gionellose au niveau international (Cazalet et al. 2010).
5.2.1.5.5 Rapiditz
Le temps d'analyse global pour une q-PCR, pr.traitement compris, est de l'ordre de 2 4 h. l est
variable selon le mat.riel utilis. (CSHPF 2005; Delgado-Viscogliosi et al. 2009).
5.2.1.6 Mat.riel n.cessaire
Le mat.riel sp.cifique n.cessaire cette m.thode est essentiellement compos. d'un kit d'extraction
de l'ADN, d'un thermocycler de q-PCR, de kit d'amplification d'ADN et de microplaques de q-PCR. l
faut y ajouter les amorces sp.cifiques de Legionella spp. et L. pneumophila et les tampons de lyse
bact.rienne. Le reste du mat.riel n.cessaire est classiquement pr.sent dans un laboratoire
d'analyse : bain-marie, centrifugeuse, cong.lateur -20c, etc. (Behets et al. 2007).
l est important de pr.ciser que la norme NF T90-471 pr.conise, dans le cas oM il est choisi de ne pas
utiliser de kits de q-PCR commerciaux valid.s selon le protocole Afnor Protocole de Validation pour
les kits de d.tection et de d.nombrement de Legionella spp. et Legionella pneumophila par
concentration et amplification g.nique par r.action en chane de polym.risation (PCR) , la mise en
8uvre d'exigences suppl.mentaires pour valider le protocole utilis.. l est notamment pr.conis. de
v.rifier l'inclusivit. et l'exclusivit. des amorces et sondes. Elles doivent donner les r.sultats attendus
pour les espces et s.rogroupes suivants qui ont tous .t. isol.s chez l'homme.
D liste d'inclusivit. (micro-organismes test.s reconnus comme appartenant au genre Legionella)
: L. anisa, L. birminghamsis, L. bozemanii, L. cherrii, L. cincinnatiensis, L. dumofii, L. erythra,
L. feeleii , L. gormanii, L. hackeliae, L. jordanis, L. lansingensis, L. longbeachae, L.
maceachernii, L. micdadei, L. oakridgensis, L. parisiensis, L.. pneumophila 1 [ 15, L.
sainthelensi, L. tucsonensis, L. wadsworthii.
D liste d'inclusivit. (micro-organismes test.s reconnus comme appartenant l'espce L.
pneumophila) : quinze s.rogroupes de l'espce.
D liste d'exclusivit. (micro-organismes test.s reconnus comme n'appartenant pas au genre
Legionella et l'espce L. pneumophila.) Ces souches doivent pr.f.rentiellement tre
retrouv.es dans les mmes niches .cologiques que les Legionella et/ou tre
phylog.n.tiquement proches. Au minimum, la liste suivante doit tre test.e : Aeromonas
hydrophila, Alcaligenes faecalis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Clostridium,
Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Flavobacterium, Klebsiella oxytoca, Listeria
monocytogenes, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens,
Pseudomonas putida, Serratia marcescens, Stenotrophomonas maltophila,.
Les essais d'inclusivit. doivent tre r.alis.s sur des extraits d'ADN de faon obtenir environ 100
UG/puits. Les essais d'exclusivit. doivent tre r.alis.s sur des extraits d'ADN de faon obtenir au
minimum un .quivalent de 1000 UG / puits estim. par mesure de la densit. optique de la suspension
620 nm.
l faut enfin noter que dans le cas d'utilisation de kits, l'utilisateur ne connat pas la s.quence des
amorces et sondes utilis.es, mais le fabricant assure qu'elles sont sensibles et sp.cifiques.
5.2.1.7 Robustesse, comp.tences n.cessaires, simplicit.
Les r.sultats de cette m.thode semblent variables en fonction (Joly et al. 2006) :
D des caract.ristiques des eaux analyser : charge en particules, en mol.cules chimiques ;
D des variations dans les pratiques et les .quipements des laboratoires. Ce problme a .t.
partiellement r.gl. avec l'introduction d'un .talon interne commun (l'.talon national).
Anses
F.vrier 2011 page 58 / 144
5.2.1.8 Avantages et inconv.nients th.oriques intrinsques de la m.thode q-PCR
TabIeau 4 : avantages et inconv.nients de la q-PCR
Avantages Inconv.nients Non .vaIu.
32
Critres
de
priorit.
.Iev.e
V Quantification de Legionella pneumophila
V Quantification de Legionella pneumophila
avec distinction du szrogroupe 1 (en
dzveloppement)
V Prise en compte des Legionella intra
amibiennes ou intra v.siculaires dans la
quantification
V D.tection notamment de l'ensemble des
Legionella viables et potentiellement
pathognes
V Rapidit. des r.sultats
V Applicable sur des .chantillons d'eau trait.e
V D.tecte les Legionella
mortes aux membranes
intgres
V Critres d'interpr.tation pour
le risque sanitaire non
disponibles
Critres
de
priorit.
mod.r.e
V Quantification de l'ensemble des Legionella
spp
V Faisabilit., simplicit.
V Equipements n.cessaires de co`t mod.r.
V Temps technicien faible
V nterpr.tation technique simple des r.sultats
bruts
V Peut ne pas tre applicable
certaines eaux trs charg.es
(biologiquement,
chimiquement ou
physiquement)
V Ne permet pas de disposer
de souches pour des .tudes
compl.mentaires (mais
permet de disposer d'ADN)
V Distinction et
quantification
des
s.rogroupes
Lp autre que
sg1
5.2.2 PCR viabIe (v-PCR)
La m.thode de d.nombrement de Legionella, dans l'eau, par v-PCR, ne fait actuellement pas l'objet
d'une norme.
5.2.2.1 Principe
Cette m.thode combine la q-PCR et l'utilisation d'un agent intercalant qui p.ntre s.lectivement dans
les cellules pr.sentant des dommages membranaires, r.put.es non viables. Les agents intercalants
couramment utilis.s sont le monoazide dS.thidium (EMA)
33
Une photolyse de l'EMA produit des nitrnes qui forment des liaisons covalentes avec l'ADN, tout en
le clivant en petits morceaux (Delgado-Viscogliosi et al. 2005; Hixon et al. 1975; Riedy et al. 1991).
Cette liaison bloque l'amplification de l'ADN des cellules mortes ou endommag.es et r.duit le signal
q-PCR d` ces faux positifs.
ou le monoazide de propidium (PMA).
La membrane intacte des cellules viables interdisant la p.n.tration de l'EMA, seul l'ADN des cellules
intactes, consid.r.es comme viables, est amplifi. et quantifi.. Paralllement, une analyse de
l'.chantillon est men.e en utilisant la m.thode par q-PCR simple, de manire pouvoir comparer les
r.sultats de la v-PCR (le nombre d'UG correspondant aux cellules viables) et de la q-PCR (le nombre
d'UG correspondant la totalit. des cellules dont l'ADN est intact) et d.terminer ainsi le ratio de
cellules viables (potentiellement infectieuses) et non viables (Chang et al. 2009; Chen and Chang
2010; Delgado-Viscogliosi et al. 2009; Nocker and Camper 2006; Nocker et al. 2006; Roth et al. 1997;
Rudi et al. 2005; Soejima et al. 2007; Soejima et al. 2008).
D'aprs des .tudes r.centes, le monoazide de propidium (PMA) est quasi .quivalent l'EMA pour
ses qualit.s de p.n.tration dans les cellules endommag.es et de clivage de l'ADN g.nomique. Son
utilisation dans le cadre d'une m.thode de type v-PCR peut tre envisag.e, la place de l'EMA, pour
le d.nombrement de Legionella (Chang et al. 2009; Chang et al. 2010; Nocker et al. 2006).
A noter que cette m.thode est brevet.e pour son application pour le d.nombrement de Legionella.
32
Par manque de donn.es
33
EMA et PMA sont des d.riv.s du Bromure d'Ethidium, un agent intercalant couramment utilis. en biologie mol.culaire pour
la visualisation des acides nucl.iques.
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5.2.2.2 nformations apport.es par les r.sultats
Les r.sultats obtenus par cette m.thode sont exprim.s en unit. g.nome (UG) par litre d'eau. Le
nombre d'UG correspond aux cellules intactes contenant de l'ADN amplifiable. Elle permet
th.oriquement la diff.renciation des cellules de Legionella pneumophila viables et non viables (Chang
et al. 2009; Chang et al. 2010; Chen and Chang 2010; Delgado-Viscogliosi et al. 2009; Rudi et al.
2005). La v-PCR ne produit pas les mmes informations que la culture, mais apporte plus
d'informations que la q-PCR au regard de la viabilit. des Legionella d.tect.es (Chang et al. 2009;
Delgado-Viscogliosi et al. 2009).
5.2.2.3 Matrice d'application
La m.thode a .t. test.e, pour la d.tection de Legionella, sur des .chantillons d'eau chaude sanitaire
ou d'eaux environnementales (Chang et al. 2009; Chang et al. 2010; Delgado-Viscogliosi et al. 2009).
Selon le GT, dans un systme ferm., les bact.ries mortes restent dans le circuit d'eau et peuvent
tre d.nombr.es par la q-PCR sans l'tre par la v-PCR. En revanche, dans un systme ouvert avec
renouvellement de l'eau, les bact.ries mortes sont .vacu.es. La majorit. des bact.ries restantes
.tant suppos.es vivantes, les r.sultats de q-PCR et v-PCR devraient tre beaucoup plus proches.
Cela est susceptible de limiter sensiblement les diff.rences de r.sultats obtenus entre q-PCR et v-
PCR.
5.2.2.4 Echantillon n.cessaire / le cas .ch.ant m.thode d'.chantillonnage pr.conis.e
Selon la norme NF T90-471, l'.chantillon est concentr. en filtrant le volume maximal d'.chantillon, si
possible compris entre 100 mL et 1 L. Comme pr.c.demment .voqu., cet .chantillon peut tre
concentr. par filtration ou centrifugation. Les .chantillons doivent tre stock.s 4C (Delgado-
Viscogliosi et al. 2009), voire 20C (Joly et al. 2006).
5.2.2.5 Paramtres de performance
5.2.2.5.1 Justesse
Pour .valuer la proportion de r.sultats faux positifs produits par la v-PCR, certains auteurs ont
compar.s la q-PCR et la v-PCR en analysant de l'eau ensemenc.e exp.rimentalement. Selon eux, la
v-PCR ne d.nombre pas 99,9% des L. pneumophila non viables (faux positifs) prises en compte par
la q-PCR (Delgado-Viscogliosi et al. 2009). Nocker et al. suggrent que le signal plus faible .mis par
le v-PCR est due une perte d'ADN g.nomique par les cellules mortes pendant l'extraction, plus qu'
l'inhibition de l'amplification par la liaison des mol.cules d'EMA et de l'ADN des cellules mortes
(Delgado-Viscogliosi et al. 2009; Nocker and Camper 2006; Nocker et al. 2006). Cependant, Soejima
et al. ont r.cemment report. que le traitement direct de l'ADN avec l'EMA, suivi par une irradiation
dans les longueurs d'onde du visible, entraine une lyse de l'ADN chromosomique des bact.ries
mortes (Delgado-Viscogliosi et al. 2009; Soejima et al. 2007; Soejima et al. 2008). Dans les deux
hypothses, la v-PCR devrait minimiser les faux positifs par rapport la q-PCR.
Le protocole d'analyse d'eau environnementale utilis. par Delgado et al. est bas. sur celui de la
norme NF T90-471, compl.t. par une .tape de sonication des bact.ries pr.sentes sur le filtre, aprs
concentration de l'.chantillon, afin de les remettre en suspension (Delgado-Viscogliosi et al. 2009).
Cette .tape additionnelle est susceptible de tuer des bact.ries, ce qui peut tre de nature fausser
les .carts observ.s entre les r.sultats de v-PCR et de q-PCR. Ainsi, si en systme ferm. non filtr.
(sans renouvellement ou filtration de l'eau) l'abattement du signal est d.montr., en systme ouvert
filtr. (avec renouvellement et filtration de l'eau), il n'est pas certain que la diff.rence entre les r.sultats
de v-PCR et de q-PCR soit aussi importante.
Concernant les faux n.gatifs, le signal .mis par v-PCR est tre r.duit de plus de 99,9 % par rapport
la q-PCR. En utilisant du PMA la place de l'EMA, la diminution de plus de 3 log est lin.aire sur des
concentrations de 10
3
10
8
Legionella par filtre. Ainsi, avec 10
6
Legionella mortes sur le filtre, la v-
PCR ne quantifiera pas les Legionella car la quantit. sera inf.rieure sa limite de quantification
(M.rault et al. 2009).
Le traitement thermique des .chantillons (1h 70C) provoque une nette diminution du signal d.tect.
en v-PCR, jusqu' un signal plancher de l'ordre de 3,2 log d'UG/mL. Cela suggre que des bact.ries
tu.es par la chaleur ne sont plus quantifi.es. Le fait que le mme traitement thermique entraine la
disparition du signal r.v.lant la pr.sence de Legionella dans les .chantillons analys.s avec la
m.thode par culture, suggre que le signal d.tect. par v-PCR correspond des bact.ries VBNC.
Cependant, selon cette hypothse, il est difficile d'interpr.ter la stabilisation du signal .mis par la v-
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PCR aux environs de 3,2 log d'UG/mL, et ce, quelle que soit la dur.e du traitement thermique (1h, 3h,
ou 5h 70C). En effet, dans ces conditions il semble .tonnant de ne pas observer une diminution
progressive du signal de v-PCR au cours du temps, s'il correspond effectivement des bact.ries
viables (Delgado-Viscogliosi et al. 2009).
5.2.2.5.2 Fidzlitz, reproductibilitz
Aucune donn.e r.pertori.e.
5.2.2.5.3 Sensibilitz
La limite de d.tection observ.e en conditions exp.rimentales (Delgado-Viscogliosi et al. 2009; Rudi et
al. 2005), elle est de l'ordre de 200 UG/mL pour un .chantillon de 1 mL trait. par l'EMA.
5.2.2.5.4 Spzcificitz, szlectivitz
La s.lectivit. de la m.thode par v-PCR est li.e celle de l'.tape de q-PCR qu'elle intgre (Chang et
al. 2009). Comme cette dernire, la v-PCR est s.lective 100 % vis--vis de 15 s.rogroupes de L.
pneumophila (Behets et al. 2007), et permet th.oriquement de rechercher s.lectivement une espce,
un s.rogroupe, voire un gne de virulence (Fields et al. 2002).
Par ailleurs, contrairement la q-PCR, la v-PCR donne la possibilit. de d.nombrer les cellules viables
et non viables d'une espce particulire de bact.rie dans un m.lange d'espces diff.rentes (Rudi et
al. 2005). De la mme manire, elle permet de d.tecter et d.nombrer les L. pneumophila viables dans
un m.lange de cellules viables et non viables (Chang et al. 2009; Delgado-Viscogliosi et al. 2009).
5.2.2.5.5 Rapiditz
Le temps d'analyse global pour une v-PCR, pr.traitement compris, est proche de celui d'une q-PCR.
En l'.tat actuel de d.veloppement de la m.thode, la v-PCR n.cessite en plus une incubation de
l'.chantillon avec un perm.abilisant (de l'ordre d'1 heure), et un traitement de l'.chantillon par
l'intercalant (de l'ordre d'1 heure). Au total, la mise en 8uvre de cette m.thode n.cessite un peu plus
de 4 heures. Ce temps est .galement variable selon le mat.riel utilis. (Chang et al. 2009; CSHPF
2005; Delgado-Viscogliosi et al. 2009; Rudi et al. 2005).
5.2.2.6 Mat.riel n.cessaire
L'essentiel du mat.riel n.cessaire la mise en 8uvre d'une v-PCR est commun celui n.cessaire
la r.alisation d'une q-PCR (Behets et al. 2007).
l faut y ajouter les .l.ments n.cessaires (Chang et al. 2009; Delgado-Viscogliosi et al. 2005; Rudi et
al. 2005) :
D au traitement de perm.abilisation des membranes cellulaires : tolune et alcool isopropylique,
centrifugeuse ;
D au traitement intercalant : EMA solide commercial, Dimethyl sulfoxide, chambre noire pour
faire le m.lange des deux sans lumire, cong.lateur -20C, micro-tubes de centrifugation
opaques, lampe halogne, centrifugeuse (16000 g).
5.2.2.7 Robustesse, comp.tences n.cessaires, simplicit.
Th.oriquement, cette m.thode permet de quantifier les cellules viables et non viables d'une espce
bact.rienne, directement partir d'un .chantillon complexe, comme une eau environnementale
(Chang et al. 2009; Rudi et al. 2005).
Diff.rents auteurs observent que les r.sultats obtenus par v-PCR varient en fonction de la
concentration en EMA (Chang et al. 2009; Chen and Chang 2010).
Les r.sultats de cette m.thode varient .galement en fonction des mmes facteurs que la q-PCR (Joly
et al. 2006) :
D caract.ristiques des eaux analyser : charge en particules, en mol.cules chimiques ;
D pratiques et .quipements des laboratoires. Ce problme a .t. partiellement r.solu avec
l'introduction d'un .talon interne commun (l'.talon national).
Anses
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5.2.2.8 Avantages et inconv.nients th.oriques intrinsques de la m.thode v-PCR
TabIeau 5 : avantages et inconv.nients de la v-PCR
Avantages Inconv.nients Non .vaIu.
34
Critres
de
priorit.
.Iev.e
V Quantification Legionella pneumophila
V Quantification de Legionella pneumophila avec
distinction du s.rogroupe 1 (en d.veloppement)
V Prise en compte des Legionella intra amibiennes
ou intra v.siculaires dans la quantification
V Non d.tection des Legionella mortes
V D.tection notamment de l'ensemble des
Legionella viables et potentiellement pathognes
V Rapidit. des r.sultats
V Applicable sur des .chantillons d'eau trait.e
V Critres d'interpr.tation
pour le risque sanitaire
non disponibles
Critres
de
priorit.
mod.r.e
V Quantification de l'ensemble des Legionella spp
V Faisabilit., simplicit.
V Equipements n.cessaires faibles de co`t mod.r.
V Temps technicien faible
V nterpr.tation technique simple des r.sultats
bruts
V Peut ne pas tre
applicable certaines
eaux trs charg.es
(biologiquement,
chimiquement ou
physiquement)
V Ne permet pas de
disposer de souches
pour des .tudes
compl.mentaires
V Distinction et
quantification
des
s.rogroupes
Lp autre que
sg1
5.2.3 EvoIutions possibIes des m.thodes bas.es sur I'ampIification g.nique, peu ou pas
test.es pour rechercher Legionella dans I'eau
Sans changer le principe de la m.thode de d.nombrement de Legionella par q-PCR, telle que d.crite
dans la norme NF T 90-471, il est possible d'en envisager des variantes, potentiellement plus
performantes ou apportant une information diff.rente. Diff.rents exemples peuvent tre .voqu.s.
5.2.3.1 Am.lioration de l'extraction de l'ADN
Les performances des m.thodes de d.nombrement de Legionella bas.es sur l'amplification g.nique
d.pendent fortement de l'.tape d'extraction de l'ADN. Cette .tape et son rendement sont relativement
bien matris.s, pour le d.nombrement de bact.ries libres dans l'eau. En revanche, il subsiste des
incertitudes concernant le rendement de l'extraction de l'ADN des bact.ries intra amibiennes. Le
d.veloppement et la validation d'un pr.traitement adapt., pour tre s`r de les prendre correctement
en compte, semblent une piste d'am.lioration int.ressante. Certains auteurs .voquent par exemple
une extraction bas.e sur une centrifugation l'aide d'un kit sp.cifique (Wellinghausen et al. 2001).
5.2.3.2 Utilisation de sondes plus s.lectives
L'utilisation d'amorces ou de sondes s.lectives d'autres espces que L. pneumophila, ou s.lectives
de s.rogroupes ou sous-types particuliers, pourrait permettre de produire des r.sultats plus pr.cis et
plus facilement interpr.tables d'un point de vue sanitaire. Si des souches sont identifi.es comme plus
pathognes que d'autres, il est envisageable th.oriquement de les quantifier individuellement.
5.2.3.3 Reverse transcriptase - PCR (RT-PCR)
La RT-PCR est une technique qui associe la transcription inverse (RT) d'un brin d'ARN en ADN
compl.mentaire (ADNc), suivie d'une amplification de l'ADNc par PCR. Le brin compl.mentaire
d'ADNc est g.n.r. partir de l'ARN bact.rien grce l'adjonction d'ADN polym.rase ARN
d.pendante (Bej et al. 1991; Jones and Foulkes 1989). Cette m.thode permet de d.tecter et de
quantifier (en UG/l) l'ARN issu de l'expression de gnes sp.cifiques d'une bact.rie, qu'elle soit dans
un .tat viable cultivable ou VBNC (Mahbubani et al. 1991; Oliver 2009).
34
Par manque de donn.es
Anses
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En 1991, la limite de d.tection de la m.thode .tait de 1000 UG/mL, cette faible sensibilit. .tant
probablement due une faible efficacit. de l'extraction et la grande sensibilit. de l'ARN la
d.gradation (Bej et al. 1991). Les recherches bibliographiques n'ont pas permis de mettre en
.vidence de publication plus r.cente portant sur l'application de cette m.thode la recherche de
Legionella.
5.2.3.4 Kits de terrain tout en un
Actuellement, l'une des contraintes li.es au d.nombrement de Legionella dans l'eau par amplification
g.nique, est la n.cessit. de disposer d'un laboratoire proche et capable de faire ce type d'analyse. Le
d.veloppement de kits permettant la r.alisation de ces analyses directement sur le terrain pourrait
s'av.rer int.ressant dans certains contextes.
A titre d'exemple, il existe d.j des systmes de q-PCR qui permettent une analyse individuelle de
chaque .chantillon (avec un thermocycleur par .chantillon) et qui r.alisent la phase dSextraction et
dSamplification de manire automatis.e dans une seule cartouche. Ces outils "clef en main" existent
en routine pour le diagnostic rapide de plusieurs pathognes dans les pr.lvements biologiques mais
ne sont actuellement pas disponibles pour d.nombrer les Legionella dans lSenvironnement.
Anses
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5.3 M.thodes bas.es sur ISaffinit. moI.cuIaire
5.3.1 Immuno-d.tection
La m.thode de d.nombrement de Legionella, dans l'eau, par immuno-d.tection, ne fait actuellement
pas l'objet d'une norme.
5.3.1.1 Principe
L'immuno-d.tection regroupe les m.thodes permettant de mettre en .vidence une ou plusieurs
prot.ines ou .pitopes en utilisant des anticorps sp.cifiques des Legionella. Elle peut tre utilis.e pour
de la d.tection ou le d.nombrement en fonction des modalit.s de sa mise en 8uvre (Coons et al.
1942).
La sp.cificit. de la m.thode est li.e l'anticorps choisi. Plusieurs anticorps anti-Legionella
pneumophila ou anti-Legionella spp. existent : anticorps polyclonaux ou monoclonaux commercialis.s,
publi.s ou "maison" (Fuchslin et al. 2010; Helbig et al. 1995; Helbig et al. 1997; Riffard et al. 2001;
Sethi et al. 2007; Yanez et al. 2005). Des anticorps sp.cifiques de L. pneumophila sg1, sg 2-14, ou
des L. pneumophila spp sont .galement d.crits. De fortes sp.cificit.s peuvent notamment tre
observ.es avec certains anticorps dirig.s contre certains clones de L. pneumophila sg1 ou un
marqueur de virulence (Helbig et al. 1995; Helbig et al. 1997). De fait, la sp.cificit. des anticorps doit
tre test.e et pr.cis.e.
L'immunofluorescence regroupe les techniques dSimmuno-marquage qui permettent de mettre en
.vidence une ou plusieurs prot.ines par lSutilisation dSun anticorps sp.cifique portant un fluorochrome
(Coons et al. 1942).
5.3.1.1.1 Immunofluorescence directe
Un anticorps dirig. contre une prot.ine dSint.rt (ou lSantigne au sens large) est dit anticorps
primaire. LorsquSil est directement coupl. au fluorochrome, on parle dSimmunofluorescence directe
(Coons et al. 1942).
5.3.1.1.2 Immunofluorescence indirecte
Le plus souvent, lSanticorps primaire ne porte pas le fluorochrome. On utilise alors un deuxime
anticorps (anticorps secondaire), coupl. au fluorochrome, sp.cifique de lSisotype de lSanticorps
primaire. On parle alors dSimmunofluorescence indirecte (Dusserre et al. 2008).
5.3.1.1.3 Mzthodes de dztection des anticorps fluorescents
Le choix de la m.thode de d.tection et la quantification des anticorps marqu.s par le fluorochrome a
un impact sur les performances de la m.thode, notamment en termes de rapidit. et de robustesse
(Cherry and Thomason 1969) :
D La microscopie en fluorescence est une technique de microscopie optique qui tire profit du
ph.nomne de fluorescence pour observer divers compos.s. Comme toute technique de
microscopie optique, elle est limit.e par la diffraction de la lumire. Le pouvoir de r.solution
est donc de 200 nm environ. La lecture est manuelle et sa qualit. d.pend de l'entrainement
du technicien.
D La cytom.trie est une technique permettant de faire d.filer des particules, mol.cules ou
cellules grande vitesse devant le faisceau dSun laser. La lumire r..mise (par diffusion ou
fluorescence) permet de classer les populations de particules suivant plusieurs critres et de
les trier. Elle permet donc de compter les bact.ries marqu.es par certains fluorochromes,
dans un .chantillon, de manire automatique et rapide. l existe des cytomtres en flux (FCM)
pour l'analyse d'un .chantillon fluide (Riedy et al. 1991) et des cytomtres en phase solide
(Dusserre et al. 2008; Mignon-Godefroy et al. 1997) pour l'analyse d'un .chantillon pr.sent
sur support solide (filtre). Ces derniers donnent un r.sultat en quelques minutes (Delgado-
Viscogliosi et al. 2005).
Anses
F.vrier 2011 page 64 / 144
5.3.1.2 nformations apport.es par les r.sultats
Ces m.thodes permettent de d.nombrer des cellules de L. pneumophila ou d'autres espces du
genre Legionella, sans distinction entre les cellules viables et non viables (Delgado-Viscogliosi et al.
2005).
5.3.1.3 Matrice d'application
De manire g.n.rale, les m.thodes mettant en 8uvre l'immuno-d.tection sont applicables aux eaux
peu charg.es pour tre filtrables, mais restent limit.es pour l'analyse d'.chantillons environnementaux
non filtrables (Dusserre et al. 2008). Cependant la nature des matrices analysables par l'immuno-
d.tection d.pend en grande partie de la m.thode utilis.e pour d.tecter les cellules marqu.es par
fluorescence. Dans le cas oM les cellules d.nombrer sont rares et qu'il est n.cessaire de concentrer
l'.chantillon par filtration, il ne sera pas possible d'utiliser la m.thode de d.tection par cytom.trie en
flux pour laquelle les .chantillons analys.s doivent tre liquides. Les techniques de d.tection par
cytom.trie en phase solide ou par microscopie en fluorescence permettent l'analyse d'.chantillons
pr.alablement filtr.s. Compte tenu de leurs limites de d.tection respectives, seule la m.thode par
cytom.trie en phase solide permet de d.nombrer les cellules dans un .chantillon trs peu concentr.
(Aurell et al. 2004; Lemarchand et al. 2001).
Des micro-biocapteurs pour l'immuno-d.tection en temps r.el de Legionella pneumophila dans les
pr.lvements environnementaux seraient en cours de d.veloppement et d'.valuation.
5.3.1.4 Echantillon n.cessaire / le cas .ch.ant m.thode d'.chantillonnage pr.conis.e
Le volume d'.chantillon n.cessaire d.pend de la concentration en cellules marqu.es, par rapport aux
cellules non marqu.es (ne portant pas l'antigne recherch.). Plus la concentration en cellules non
marqu.es est importante et plus il est n.cessaire que la concentration en cellules marqu.es soit
importante pour que cette m.thode soit applicable.
5.3.1.4.1 Cas d'une dztection par microscopie en fluorescence
Dans ce cas, titre d'exemple, avec une concentration en cellules non marqu.es de 1,36.10
8
cellules
/ litre, les volumes n.cessaires calcul.s, dans le cadre d'une .tude, .taient de (Lemarchand et al.
2001) :
D 1 mL pour une concentration en cellules marqu.es sup.rieure ou .gale 10
7
/L ;
D 10 mL pour une concentration en cellules marqu.es sup.rieure ou .gale 10
6
/L ;
D 100 mL pour une concentration en cellules marqu.es sup.rieure ou .gale 10
5
/L.
D'aprs cette .tude, la m.thode est non applicable si la concentration en cellules marqu.es est
inf.rieure 10
5
/L, valeur en dessous de laquelle la distribution des cellules sur la membrane n'est plus
homogne.
5.3.1.4.2 Cas d'une dztection par cytomztrie en flux
Dans ce cas, titre d'exemple, avec une concentration en cellules non marqu.es de 1,36.10
8
cellules/L, les volumes n.cessaires calcul.s, dans le cadre d'une .tude, .taient de (Lemarchand et al.
2001) :
D 100 0L pour une concentration en cellules marqu.es sup.rieures ou .gale 10
7
/L ;
D 1 mL pour une concentration en cellules marqu.es sup.rieures ou .gale 10
6
/L.
La m.thode est non applicable pour un .chantillon de moins de 100 0L.
Pour garantir un taux de reproductibilit. acceptable et parce que l'analyse du volume n.cessaire
prendrait trop de temps, la m.thode est non applicable si la concentration en cellules marqu.es est
inf.rieure 10
6
/L, car les volumes analyser seraient trop importants pour le cytomtre en flux.
5.3.1.4.3 Cas d'une dztection par cytomztrie en phase solide
Dans ce cas, titre d'exemple, dans le cadre d'une .tude, avec une concentration en cellules non
marqu.es de 1,36.10
8
cellules/L, les volumes n.cessaires calcul.s .tait de (Lemarchand et al. 2001) :
D 0,1 0L pour une concentration en cellules marqu.es sup.rieures ou .gale 10
7
/L ;

D 1000 mL pour une concentration en cellules marqu.es sup.rieures ou .gale 1/L.


Anses
F.vrier 2011 page 65 / 144
5.3.1.5 Paramtres de performance
5.3.1.5.1 Justesse
Concernant les faux positifs, il est difficile d'en .valuer la proportion, pour l'analyse d'.chantillons
naturels. Ceci est d` d'une part au manque de r.f.rence pour les "vrais positifs", d'autre part la
fluorescence endogne. En effet, les m.thodes par culture et par immuno-d.tection ne mesurant pas
la mme chose, respectivement le nombre de cellules cultivables et le nombre total de cellules, il est
difficile de d.terminer le nombre de "vrais positifs" avec exactitude dans un .chantillon d'eau
environnementale (Lemarchand et al. 2001).
Concernant les faux n.gatifs, leur proportion est trs faible si l'eau analys.e est propre et si l'anticorps
sp.cifique est bien choisi (Lemarchand et al. 2001). En revanche, si l'eau est charg.e il y a un risque
d'adsorption de Legionella sur les matires en suspension, ce qui peut rendre les anticorps
inaccessibles.
5.3.1.5.2 Fidzlitz, reproductibilitz
Concernant la reproductibilit., selon certains auteurs, avec une d.tection par cytom.trie en phase
solide, le coefficient de variation est de l'ordre de quelques pourcents et rarement sup.rieur 10 %
(Lemarchand et al. 2001).
5.3.1.5.3 Sensibilitz
Dans le cas de l'immunofluorescence indirecte la limite de d.tection th.orique est d'une bact.rie par
.chantillon filtr. (Dusserre et al. 2008). En pratique, avec une d.tection par microscopie en
fluorescence, selon certains auteurs, la limite de quantification est de l'ordre de 5.10
6
cellules
marqu.es par litre d'.chantillon. Cette valeur .tant inf.rieure la limite de d.tection de la m.thode,
elle semble donc non applicable.
Les cellules marqu.es ne peuvent pas tre d.tect.es quand elles repr.sentent moins de 0,01 % de la
quantit. de cellules pr.sentes dans l'.chantillon, car leur marquage fluorescent est masqu. par les
cellules non marqu.es (Lemarchand et al. 2001).
Si l'eau n'est pas trop charg.e, dans le cas oM les cellules d.nombrer dans l'.chantillon sont rares, il
est possible de les concentrer par filtration. Avec une d.tection par cytom.trie en flux, la limite de
d.tection avec un marquage de L. pneumophila sg1 serait de l'ordre de 2000 cellules/mL d'.chantillon
pass. en cytom.trie (Fuchslin et al. 2010). La limite de quantification serait de l'ordre de 10
6
cellules
marqu.es par litre d'.chantillon. Avec une d.tection par cytom.trie en phase solide (Lemarchand et
al. 2001), la limite de quantification est de une cellule marqu.e par litre d'.chantillon. Dans le cas oM
les cellules d.nombrer sont rares cette m.thode permet de les concentrer par filtration d'un volume
d'.chantillon important.
5.3.1.5.4 Spzcificitz, szlectivitz
D'aprs la bibliographie, la sp.cificit. de l'immunofluorescence directe serait trs bonne, si des
anticorps monoclonaux sp.cifiques de L. pneumophila sont utilis.s. Elle a .t. test.e sur des
.chantillons d'eau du robinet (Aurell et al. 2004).
La microscopie en fluorescence permet de distinguer visuellement les cellules bact.riennes marqu.es
par le fluorochrome des .ventuels autres .l.ments fluorescents.
La cytom.trie en flux compte l'ensemble des .l.ments fluorescents, qu'ils correspondent des
cellules bact.riennes ou pas.
5.3.1.5.5 Rapiditz
La d.tection des anticorps par cytom.trie en phase solide est une m.thode relativement rapide qui
permet de mener l'analyse complte d'un .chantillon par immunofluorescence en moins de 4 heures
(Aurell et al. 2004; Delgado-Viscogliosi et al. 2005).
5.3.1.6 Mat.riel n.cessaire
Le mat.riel d.di. cette m.thode est principalement constitu. de l'appareil de d.tection : cytomtre
en phase solide ou en phase liquide et/ou microscope en fluorescence. l est .galement n.cessaire de
Anses
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disposer des fluorochromes adapt.s et des anticorps sp.cifiques de Legionella spp. ou Legionella
pneumophila.
Le reste du mat.riel n.cessaire est relativement commun dans un laboratoire d'analyse.
5.3.1.7 Robustesse, comp.tences n.cessaires, simplicit.
Peu de donn.es ont .t. r.pertori.es concernant la robustesse des m.thodes bas.es sur ce principe.
l faut cependant noter l'apparition de kits de terrain bas.s sur l'immuno-d.tection. Des kits de ce type,
notamment commercialis.s en Grande Bretagne, sont vendus pour la r.alisation d'analyses semi-
quantitatives de L. pneumophila sg1 ("M.thode de d.tection : Lateral flow immunochromatographic
assay").
5.3.1.8 Avantages et inconv.nients th.oriques intrinsques de la m.thode par immuno-d.tection
TabIeau 6 : avantages et inconv.nients de l'immuno-d.tection
Avantages Inconv.nients Non .vaIu.
35
Critres
de
priorit.
.Iev.e
V Quantification Legionella
pneumophila
V Quantification de Legionella
pneumophila avec distinction du
s.rogroupe 1
V D.tection notamment de
l'ensemble des Legionella viables
et potentiellement pathognes
V Rapidit. des r.sultats
V Non prise en compte des
Legionella intra amibiennes ou
intra v.siculaires dans la
quantification
V D.tecte les Legionella mortes
V Critres d'interpr.tation pour le
risque sanitaire non disponibles
V Applicable sur
des .chantillons
d'eau trait.e
Critres
de
priorit.
mod.r.e
V Distinction et quantification des
s.rogroupes Lp autre que sg1
V Quantification de l'ensemble des
Legionella spp (th.oriquement,
mais d.velopper)
V Faisabilit., simplicit. (mod.r.e)
V nterpr.tation technique simple des
r.sultats bruts
V Pas applicable certaines eaux
trs charg.es (biologiquement,
chimiquement ou physiquement)
V Equipements n.cessaires
importants (d.pend fortement de
la m.thode de d.tection adopt.e)
V Temps technicien important
V Permet de
disposer de
souches pour des
.tudes
compl.mentaires
(Th.oriquement
possible)
5.3.2 FIuorescence In Situ Hybridation (FISH)
La m.thode de d.nombrement de Legionella, dans l'eau, par FSH, ne fait actuellement pas l'objet
d'une norme.
5.3.2.1 Principe
La m.thode FSH est une technique de biologie mol.culaire utilisant une sonde nucl.ique sp.cifique
de la cible, coupl.e un fluorochrome, qui semble permettre de d.tecter et quantifier simultan.ment
des Legionella spp et des L. pneumophila (Amann et al. 2001; Amann et al. 1995). Aprs traitement
avec une solution contenant des sondes sp.cifiques de Legionella spp et de certains s.rogroupes de
L. pneumophila, l'.chantillon est observ. ou scann. sous microscope fluorescence. Les Legionella
spp apparaissent d'une couleur diff.rente des L. pneumophila.
5.3.2.2 nformations apport.es par les r.sultats
En utilisant des sondes adapt.es, cette m.thode pourrait permettre le d.nombrement de L.
pneumophila (sonde sp.cifique de l'ARNr 16S pour L. pneumophila) ou spp viables, avec comme
inconv.nient la possibilit. de d.tecter les bact.ries mortes intgres, aussi bien cultivables que non
cultivables, dans un .chantillon d'eau (Amann et al. 2001; Amann et al. 1995).
5.3.2.3 Matrice d'application
La m.thode est th.oriquement applicable tout type d'eau, eau chaude sanitaire comme eaux de
tours a.ror.frig.rantes.
35
Par manque de donn.es
Anses
F.vrier 2011 page 67 / 144
Les r.sultats sont g.n.ralement satisfaisants avec des eaux peu charg.es, moins en pr.sence de
particules. Cela rend son application aux biofilms (biofilms mis en suspension) probl.matique : en
effet, les L. pneumophila situ.es au sein d'amas de matire organique ont une accessibilit. la sonde
diminu.e et / ou voient leur fluorescence masqu.e. l faut .galement tenir compte de la fluorescence
endogne.
5.3.2.4 Echantillon n.cessaire / le cas .ch.ant m.thode d'.chantillonnage pr.conis.e
Le volume d'.chantillon filtr. doit tre adapt. la charge particulaire de la suspension, ce qui diminue
la sensibilit. de la d.tection, dans le cas de l'analyse d'une eau trs charg.e.
5.3.2.5 Paramtres de performance
5.3.2.5.1 Justesse
Aucune donn.e r.pertori.e.
5.3.2.5.2 Fidzlitz, reproductibilitz
Aucune donn.e r.pertori.e.
5.3.2.5.3 Sensibilitz
La sensibilit. de la m.thode est d.pendante de la technique de lecture utilis.e. Elle est limit.e si la
visualisation est r.alis.e l'aide d'un microscope (.vnements rares non d.tect.s). Elle peut tre
am.lior.e si la visualisation des r.sultats est r.alis.e l'aide d'un scanner automatique.
5.3.2.5.4 Spzcificitz, szlectivitz
l existe plusieurs sondes "Legionella" : LEG226 et LEG705 marquant les Legionella spp., tandis que
LEGPNE1 est sp.cifique de L. pneumophila s.rogroupe 1,3,4 et 6 (Grimm et al. 1998). l a .t.
d.montr. depuis, que cette sonde marque .galement les s.rogroupes 2, 7 et 11 ainsi que certaines L.
pneumophila de s.rogroupe 9, 10 et 13. Par contre sa sp.cificit. a .galement .t. remise en question
car elle marquerait aussi L. micdadei s.rogroupe 1 ; L. gormanii s.rogroupe 1, L. feeleii s.rogroupe 1,
L. jordanis s.rogroupe 1, etc. L'une des alternatives serait d'utiliser une sonde PNA (peptide nucleic
acid) telle que PLPNE620 (Wilks and Keevil 2006), dans laquelle des liaisons 2-aminoethyl-glycine
remplacent les liaisons phosphodiester. Ces sondes sont plus petites et peuvent donc acc.der des
zones de l'ARN 16S qui sont inaccessibles aux sondes classiques, ce qui leur donnerait une meilleure
sp.cificit.
5.3.2.5.5 Rapiditz
Le temps de marquage est de l'ordre de quelques heures et, lecture de chaque lame comprise, les
r.sultats peuvent tre obtenus dans la journ.e. La lecture manuelle des lames est fastidieuse (Wilks
and Keevil 2006).
5.3.2.6 Mat.riel n.cessaire
La m.thode n.cessite un microscope .pifluorescence voire un scanner automatique, .quip. dSune
cam.ra pour la prise de photos, car la comparaison du mme champ color. au diamidino-4S,6-
ph.nylindol-2 dichlorhydrate
36
5.3.2.7 Robustesse, comp.tences n.cessaires, simplicit.
est obligatoire pour .viter des faux-positifs, particulirement sur les
lames charg.es en particules.
L'un des principaux int.rts de cette m.thode est sa simplicit.. L'identification de Legionella en culture
est r.serv.e du personnel trs qualifi. alors qu'une d.tection de fluorescence peut tre
automatis.e. Cette technique ne n.cessite aucune .tape de culture.
Dans le cas d'une application non automatis.e, cette technique n.cessite un important temps
op.rateur.
36
Le diamidino-4S,6-ph.nylindol-2 dichlorhydrate (DAP) est un colorant fluorescent qui appartient au groupe des colorants
indol. Le DAP est utilis. pour la coloration de l'ADN, pour la coloration nucl.aire, pour la coloration de cellules vivantes et pour
la contre-coloration dans les colorations fluorescentes de mat.riel botanique et humain et dans la cytom.trie de flux.
Anses
F.vrier 2011 page 68 / 144
5.3.2.8 Avantages et inconv.nients th.oriques intrinsques de la m.thode FSH
TabIeau 7 : avantages et inconv.nients du FSH
Avantages Inconv.nients Non .vaIu.
37
Critres
de
priorit.
.Iev.e
V Quantification Legionella
pneumophila
V D.tection notamment de
l'ensemble des Legionella
viables et potentiellement
pathognes
V Rapidit. des r.sultats
V D.tecte les Legionella
mortes
V Critres d'interpr.tation
pour le risque sanitaire
non disponibles
V Quantification de Legionella
pneumophila avec distinction
du s.rogroupe 1
V Prise en compte des
Legionella intra amibiennes
ou intra v.siculaires dans la
quantification
V Applicable sur des
.chantillons d'eau trait.e
(Th.oriquement oui)
Critres
de
priorit.
mod.r.e
V Quantification de l'ensemble
des Legionella spp
V Equipements n.cessaires
faibles
V nterpr.tation technique simple
des r.sultats bruts
V Faisabilit., simplicit.
V Distinction et de
quantification des
s.rogroupes Lp autre que
sg1
V Temps technicien
important
V Ne permet pas de
disposer de souches pour
des .tudes
compl.mentaires
V Applicable aux eaux trs
charg.es (En
d.veloppement)
5.3.3 EvoIutions possibIes des m.thodes bas.es sur I'affinit. moI.cuIaire, peu ou pas
test.es pour rechercher Legionella dans I'eau
Toujours sur le principe de l'affinit. mol.culaire, il est possible d'envisager le d.veloppement de
m.thodes plus performantes, ou apportant des informations suppl.mentaires par rapport celles d.j
utilis.es pour le d.nombrement de Legionella dans l'eau. Diff.rents exemples peuvent tre .voqu.s.
5.3.3.1 M.thode bas.e sur l'affinit. des groupes d'hydrates de carbone la surface des cellules
En parallle de la d.tection des bact.ries par immunocapture, une capture bas.e sur l'affinit. des
groupes d'hydrates de carbone (sucres) a .t. d.velopp.e r.cemment (El-Boubbou et al. 2007). En
effet la premire .tape de l'infection bact.rienne est la fixation de la bact.rie sur des groupes
d'hydrates de carbone la surface des cellules. El Boubbou a donc eu l'id.e de fixer des sucres sur
des billes magn.tiques pour capter les bact.ries. l a test. son modle sur Escherichia coli et Bacillus
anthracis. a montr. une sensibilit. de 10
4
bact.ries par mL. Cette m.thode pourra peut-tre
s'appliquer aux Legionella.
5.3.3.2 M.thode bas.e sur la d.tection de prot.ases sp.cifiques
Une m.thode de dosage d'une activit. enzymatique sp.cifique de Legionella pneumophila au moyen
d'un substrat s.lectif fluorencence r.prim.e serait .galement en cours de d.veloppement. Elle
pourrait permettre leur d.nombrement dans l'eau (brevet non publi. ce jour). Aucune publication
n'est encore disponible sur le sujet.
5.3.3.3 M.thode mettant en 8uvre des biocapteurs
Depuis une vingtaine d'ann.es, des systmes de d.nombrement de bact.ries automatisables ont .t.
test.s. De nouveaux systmes d.nomm.s biocapteur, immunocapteur ou nanodetecteur, font leur
apparition. Un biocapteur peut d.tecter des compos.s chimiques et biologiques dans un .chantillon
environnemental, ceci provoquant un signal suite la liaison avec un bior.cepteur. Ce signal peut tre
quantifi.. La reconnaissance de l'analyte cibl. peut se faire l'aide d'antignes, d'anticorps, d'acides
nucl.iques, de cellules entires ou d'enzymes sp.cifiques combin.s ou non un transducteur. Le
signal produit par la liaison de l'analyte et de son bior.cepteur peut tre d.tect. par un systme
37
Par manque de donn.es
Anses
F.vrier 2011 page 69 / 144
optique, .lectrochimique, calorim.trique, acoustique, pi.zo-.lectrique, magn.tique, etc. (Nayak et al.
2009; Velusamy et al. 2010).
Quelques-uns de ces systmes ont .t. conus pour la d.tection d'.vnements rares comme la
pr.sence de Legionella (Cooper et al. 2009; Oh et al. 2003; Yoon et al. 2003).
Parmi les m.thodes sensibles, on peut citer les m.thodes .lectrochimiques : par exemple, Miranda-
Castro et al proposent un test permettant la d.tection de l'ADN de L. pneumophila dans les
.chantillons environnementaux partir de 10
2
g.nomes, avec possibilit. d'observer une diff.rence
significative avec 10
3
et 10
4
g.nomes (Miranda-Castro et al. 2009).
Le d.veloppement de puces ADN, sp.cifiquement pour la d.tection, voire le d.nombrement de
Legionella dans l'eau, semble .galement envisageable (Brevet WO 2008/082290 (A1)).
Wolter et al., proposent quant eux un systme d'anticorps coupl.s biotine/streptavidine fix. sur un
support original permettant la d.tection en 13 minutes de trois pathognes simultan.ment : S.
typhimurium, L. pneumophila et E. coli O157:H7, avec respectivement une limite de d.tection de
3.10
6
, 10
5
et 3.10
3
cellules/mL. ls pr.cisent .galement que ce systme peut tre combin. des
.tapes d'enrichissement par filtration ou s.paration immuno-magn.tiques abaissant la limite de
d.tection 1 cellule/100 mL d'eau (Wolter et al. 2008).
Ces technologies peuvent .galement tre associ.es un montage fluidique (g.om.trie,
rh.odynamique) permettant une recirculation de l'.chantillon et optimisant la capture des cellules
rares (projet non publi. en cours).
Anses
F.vrier 2011 page 70 / 144
6 Description des m.thodes de d.nombrement s.Iectif de Legionella utiIisant
pIusieurs principes
Certaines m.thodes encore trop peu d.velopp.es et document.es pour permettre une .valuation de
leurs avantages et inconv.nients sont succinctement d.crites dans les sous chapitres Evolutions
possibles des m.thodes .
6.1 DoubIe marquage immunoIogique (IDS)
La m.thode de d.nombrement de Legionella dans l'eau, par DS (mmunological double-staining), ne
fait actuellement pas l'objet d'une norme.
6.1.1 Principe
Cette m.thode combine la m.thode TVC (d.crite dans le chapitre "5.1.3.4. M.thode par examen de
l'int.grit. des cellules bact.riennes ou d.tection d'une activit. m.tabolique") pour compter les
cellules vivantes et l'immuno-d.tection (immunoflorescence directe) pour compter les Legionella
s.lectivement marqu.es par un autre fluorochrome. La proportion des cellules viables et non viables
est d.termin.e visuellement, sur un .chantillon de 100 cellules, par comptage au microscope optique
(Delgado-Viscogliosi et al. 2005).
6.1.2 Informations apport.es par Ies r.suItats
Cette m.thode permet le d.nombrement de cellules de Legionella spp. ou de L. pneumophila viables.
(Delgado-Viscogliosi et al. 2005).
6.1.3 Matrice d'appIication
Cette m.thode a .t. utilis.e pour l'analyse d'eau environnementale. Elle est adapt.e des eaux peu
charg.es, pour lesquelles il est envisageable de concentrer les cellules de Legionella par filtration. A
titre d'exemple, cette m.thode est applicable aux eaux chaudes sanitaires. En revanche, il semble
d.licat d'analyser de l'eau provenant de tours a.ror.frig.rantes avec cette m.thode, car leur charge
en particules est susceptible d'interf.rer avec l'analyse microscopique (Delgado-Viscogliosi et al.
2005).
6.1.4 EchantiIIon n.cessaire / Ie cas .ch.ant m.thode d'.chantiIIonnage pr.conis.e
Les particules pr.sentes dans les .chantillons d'eau environnementale peuvent poser problme pour
le comptage et la visualisation des bact.ries, en augmentant le bruit de fond (des particules autres
que les bact.ries peuvent tre marqu.es par les fluorochromes). Ainsi, pour chaque .chantillon d'eau
environnementale, un volume (50 100 mL) est filtr. en fonction de sa charge en particules. Pour un
.chantillon d'eau environnementale, la filtration de plus de 100 mL n'est pas recommand.e car les
particules pr.sentes dans l'eau sont susceptibles de g.n.rer un bruit de fond trop important
(Delgado-Viscogliosi et al. 2005).
6.1.5 Paramtres de performance
6.1.5.1 Justesse
Aucune donn.e r.pertori.e.
6.1.5.2 Fid.lit., reproductibilit.
Concernant la reproductibilit., le coefficient de variation maximum observ. serait de l'ordre de 1 %
(Delgado-Viscogliosi et al. 2005).
6.1.5.3 Sensibilit.
La sensibilit. de la m.thode d.pend du volume d'.chantillon filtr. et du nombre de zones
microscopiques examin.es sur le filtre. Selon Delgado-Viscogliosi, elle est de 176 cellules de
Legionella par litre, pour un .chantillon de 100 mL et 100 zones du filtre examin.es. Elle peut
th.oriquement atteindre 1 cellule de Legionella par litre si l'ensemble de la membrane de filtration est
examin.. Des essais comparatifs semblent montrer que la m.thode par DS serait plus sensible que
la m.thode par culture (Delgado-Viscogliosi et al. 2005).
Anses
F.vrier 2011 page 71 / 144
6.1.5.4 Sp.cificit., s.lectivit.
S.lectivit. et sp.cificit. de la m.thode d.pendent des caract.ristiques des anticorps vis--vis de leur
cible. Pour la recherche de L. pneumophila, un anticorps sp.cifique 100 % est disponible. Pour la
recherche de L.spp, l'anticorps disponible serait sp.cifique 75 % (Delgado-Viscogliosi et al. 2005).
6.1.5.5 Rapidit.
Une analyse complte r.alis.e l'aide de cette m.thode prendrait de l'ordre de quelques heures
(Delgado-Viscogliosi et al. 2005).
6.1.6 Mat.rieI n.cessaire
Le mat.riel n.cessaire pour la m.thode DS est principalement constitu. de l'appareil de d.tection
n.cessaire l'immuno-d.tection (cytomtre en phase solide ou en phase liquide et/ou microscope en
fluorescence), des fluorochromes adapt.s et des anticorps sp.cifiques de L. spp. ou L. pneumophila.
A ceci, il faut ajouter le marqueur de viabilit. n.cessaire la partie TVC de la m.thode : pr.curseur
non fluorescent, qui une fois internalis. par la cellule bact.rienne vivante peut tre cliv. par des
enzymes bact.riennes en un produit fluorescent (Delgado-Viscogliosi et al. 2005). Le reste du
mat.riel n.cessaire est relativement commun dans un laboratoire d'analyse.
6.1.7 Robustesse, comp.tences n.cessaires, simpIicit.
La pr.sence de particules accumul.es pendant la phase de concentration des .chantillons peut
parfois interf.rer avec le comptage des cellules r.alis. au microscope (Delgado-Viscogliosi et al.
2005).
L'.num.ration des cellules au microscope n.cessite un entrainement du personnel. Les cellules de
Legionella pr.sentes dans les .chantillons d'eau environnementale sont plus petites que celles
pr.sentes dans les cultures in vitro. Cette op.ration peut tre l'origine d'une fatigue de l'op.rateur
(Delgado-Viscogliosi et al. 2005).
L'automatisation de la m.thode par l'utilisation de la cytom.trie en phase solide est possible, mme si
elle ne permettrait pas un gain de temps important. En effet, il est n.cessaire de valider chaque
.chantillon positif par d.nombrement au microscope pour .viter les faux positifs (Delgado-Viscogliosi
et al. 2005).
6.1.8 Avantages et inconv.nients th.oriques intrinsques de Ia m.thode IDS
TabIeau 8 : avantages et inconv.nients de l'DS
Avantages Inconv.nients Non .vaIu.
38
Critres
de
priorit.
.Iev.e
V Quantification Legionella
pneumophila
V Quantification de Legionella
pneumophila avec distinction du
s.rogroupe 1
V D.tection notamment de
l'ensemble des Legionella viables
et potentiellement pathognes
V Rapidit. des r.sultats
V Critres d'interpr.tation pour
le risque sanitaire non
disponibles
V Prise en compte des
Legionella intra
amibiennes ou intra
v.siculaires dans la
quantification
V Applicable sur des
.chantillons d'eau trait.e
V Non d.tection des
Legionella mortes
Critres
de
priorit.
mod.r.e
V Distinction et de quantification
des s.rogroupes Lp autre que
sg1
V nterpr.tation technique simple
des r.sultats bruts
V Peut ne pas tre applicable
certaines eaux trs charg.es
(biologiquement,
chimiquement ou
physiquement)
V Equipements n.cessaires
important (d.pend fortement
de la m.thode de d.tection)
V Temps technicien important
V Quantification de
l'ensemble des Legionella
spp (th.oriquement, mais
d.velopper)
V Faisabilit., simplicit.
V Permet de disposer de
souches pour des .tudes
compl.mentaires
(Th.oriquement possible)
38
Par manque de donn.es
Anses
F.vrier 2011 page 72 / 144
6.2 CuIture-FISH
La m.thode de d.nombrement de Legionella, dans l'eau, par culture-FSH, ne fait actuellement pas
l'objet d'une norme. Par ailleurs l'ensemble des .l.ments relatifs cette m.thode sont issus d'une
seule publication.
6.2.1 Principe
Cette m.thode fait appel deux principes distincts : celui de la culture et celui du FSH. Comme le
FSH, elle est bas.e sur l'utilisant de sondes nucl.iques sp.cifiques permettant de d.tecter et
quantifier simultan.ment Legionella spp et L. pneumophila. Cette d.tection est r.alis.e aprs une
.tape de culture. Un volume d'eau est filtr. sur membrane de nitrocellulose de porosit. 0,45 Vm.
Aprs traitement acide, les membranes sont d.pos.es sur milieu MWY et incub.es 36C pendant 3
jours. Aprs traitement avec une solution contenant des sondes sp.cifiques des Legionella spp et L.
pneumophila, la membrane est observ.e ou scann.e sous microscope fluorescence. Les Legionella
spp apparaissent d'une couleur tandis que les L. pneumophila apparaissent d'une autre couleur
(Ditommaso et al. 2010).
6.2.2 Informations apport.es par Ies r.suItats
Dans la mesure oM la phase de culture dure 3 jours, cette m.thode est conue pour la d.tection et le
comptage des L. pneumophila cultivables, plus rapidement que par la m.thode par culture
conventionnelle.
6.2.3 Matrice d'appIication
La m.thode est, a priori, applicable tout type d'eau, avec les mmes limites que la culture (flore
interf.rentes, etc.) : eaux de r.seaux d'eau chaude sanitaire, eaux de tours a.ror.frig.rantes.
Cependant, peu de publications faisant l'objet d'une application de cette m.thode des .chantillons
d'eau chaude sanitaire ou d'eau de tour a.ror.frig.rante ont .t. r.pertori.es. Ditommaso a utilis.
cette technique en r.alisant des analyses en culture classique et en culture-FSH en parallle, sur 79
.chantillons d'eau provenant de 10 h?pitaux en talie (Ditommaso et al. 2010).
6.2.4 EchantiIIon n.cessaire / Ie cas .ch.ant m.thode d'.chantiIIonnage pr.conis.e
Bas.e en partie sur la culture, cette m.thode traite a priori des volumes .quivalents. Cependant
Ditommaso a utilis. cette technique en analysant en parallle des .chantillons de 1 L par culture
classique et de 50 mL par culture-FSH (Ditommaso et al. 2010).
6.2.5 Paramtres de performance
6.2.5.1 Justesse
Aucune donn.e r.pertori.e.
6.2.5.2 Fid.lit., reproductibilit.
Aucune donn.e r.pertori.e.
6.2.5.3 Sensibilit.s
La sensibilit. du test est estim.e 91%, en utilisant la culture comme standard. l faut cependant
noter que les concentrations trouv.es sont syst.matiquement sup.rieures avec la technique de
culture par rapport culture-FSH. Cependant les r.sultats de cette .tude sont prendre avec
pr.caution, car les m.thodes sont utilis.es sur des volumes diff.rents et les eaux sont filtr.es sur des
filtres diff.rents (Ditommaso et al. 2010).
6.2.5.4 Sp.cificit., s.lectivit.
La sp.cificit. est de l'ordre de 82% (Ditommaso et al. 2010). Les limites li.es aux sondes sont les
mmes que celles d.j .voqu.es dans le chapitre relatif la m.thode FSH.
Anses
F.vrier 2011 page 73 / 144
6.2.5.5 Rapidit.
Selon la seule .tude r.pertori.e sur le sujet, l'analyse d'un .chantillon par cette m.thode demande
environ 3 jours (Ditommaso et al. 2010).
6.2.6 Mat.rieI n.cessaire
La m.thode n.cessite : des sondes mol.culaires sp.cifiques de Legionella spp et des L.
pneumophila ; du milieu MWY (milieu BCYE suppl.ment. de glycine, polymyxine B, anisomycine,
vancomycine), une .tuve 36C, un microscope fluorescence voire un scanner automatique.
6.2.7 Robustesse, comp.tences n.cessaires, simpIicit.
Cette m.thode, plus rapide que la culture classique, pr.sente l'int.rt d'tre relativement simple
mettre en 8uvre. Elle peut de surcrot tre automatis.e.
6.2.8 Avantages et inconv.nients th.oriques intrinsques de Ia m.thode CuIture FISH
TabIeau 9 : avantages et inconv.nients de la culture FSH
Avantages Inconv.nients Non .vaIu.
39
Critres
de
priorit.
.Iev.e
V Quantification Legionella
pneumophila
V Non d.tection des Legionella mortes
V Applicable sur des .chantillons
d'eau trait.e
V Rapidit. des r.sultats
V Pas de prise en compte des
Legionella intra amibiennes ou
intra v.siculaires dans la
quantification
V Ne d.tecte pas l'ensemble des
Legionella viables et
potentiellement pathognes
V Critres d'interpr.tation pour le
risque sanitaire non disponibles
V Quantification
de Legionella
pneumophila
avec distinction
du s.rogroupe 1
Critres
de
priorit.
mod.r.e
V Distinction et quantification des
s.rogroupes Lp autre que sg1
V Quantification de l'ensemble des
Legionella species
V Equipements n.cessaires faibles
V nterpr.tation technique simple des
r.sultats bruts
V Permet de disposer de souches pour
des .tudes compl.mentaires
V Faisabilit., simplicit.
V Peut ne pas tre applicable
certaines eaux trs charg.es
(biologiquement, chimiquement
ou physiquement)
V Temps technicien important
39
Par manque de donn.es
Anses
F.vrier 2011 page 74 / 144
6.3 EvoIutions possibIes des m.thodes utiIisant pIusieurs principes, peu ou pas
test.es pour rechercher et identifier Legionella dans I'eau
Toujours en combinant plusieurs principes d'analyse, le d.veloppement d'autres m.thodes plus
performantes ou apportant des informations suppl.mentaires est envisageable. Diff.rents exemples
sont .voqu.s ci-aprs, cette liste n'.tant pas exhaustive.
6.3.1 DVC-FISH
6.3.1.1 Principe
Ce proc.d. consiste : mettre lS.chantillon en contact avec une source nutritive de cellules et un
inhibiteur de la division cellulaire, cet .chantillon est ensuite mis en contact avec au moins une sonde
oligonucl.otidique marqu.e par fluorescence, s.lective de L. pneumophila, dont le signal est
d.tectable et amplifiable (Brevet WO2009EP53299 20090320 ; Abr.g. WO 2009/121727 (A1).
Aucune publication relatant l'application de cette m.thode au d.nombrement de Legionella n'a .t.
r.pertori.e.
6.3.1.2 nformations apport.es par les r.sultats
Cette m.thode est conue pour permettre la d.tection et le d.nombrement de microorganismes
viables dans un .chantillon.
6.3.1.3 Matrice d'application
Aucune donn.e r.pertori.e.
6.3.2 Desorption-ionisation Iaser assist.e par matrice (Spectrom.trie de masse MALDI-TOF)
6.3.2.1 Principe
La spectrom.trie de masse MALD-TOF, coupl.e ou non une amplification g.nique, permet
l'identification et le typage des micro-organismes (bact.ries, virus, champignons) partir des colonies
ou des pr.lvements. L'identification repose sur l'analyse des prot.ines totales ou d'une fraction
amplifi.e de l'ADN, g.n.ralement un amplicon de l'ADN 16 S. Cette analyse consiste en l'ionisation
des mol.cules avec la technique de d.sorption laser assist.e par la matrice d'inclusion de
l'.chantillon (MALD : Matrix Assisted Laser Desorption onization). Le produit identifier (souche ou
pr.lvement) est inclus dans une matrice et immobilis. sous forme de cristaux sur un support inerte.
Le complexe produit-matrice est bombard. par un faisceau laser .mettant dans la zone d'absorption
de la matrice. Les ions g.n.r.s dans la chambre d'ionisation sont acc.l.r.s dans un champ .lectrique
et l'analyseur permet de s.parer et de classer les ions acc.l.r.s selon leur temps de vol libre (TOF :
Time-Of-Flight). Selon le rapport masse/charge (m/z), les mol.cules les plus petites sont les
premires arriver au d.tecteur. Les mol.cules qui ont le mme rapport m/z sont s.par.es grce
un miroir .lectrostatique. Les spectres sont lus dans la gamme de masse 2000 20000 daltons. La
qualit. de l'identification est fonction de la richesse de la banque de spectres enregistr.s (Courcol
2009).
Seules 3 publications internationales concernant la spectrom.trie de masse appliqu.e
l'identification
40
La spectrom.trie de masse permet de d.tecter de l'ADN de bact.ries amplifi. par PCR. Cela a .t.
d.crit pour Legionella (Hurt et al. 2010). La m.thode permet, aprs avoir dessal.
des Legionella (Moliner et al. 2010) et le typage (Fujinami et al. 2011) .taient
disponibles en mai 2010.
41
40
dentification de l'ADN de bact.ries amplifi.es
les amplicons et
.limin. les r.sidus non amplifi.s, l'identification de fragments de 40 168 r.sidus (Courcol 2009; Hurt
et al. 2010). Cette m.thode a .t. appliqu.e aux gnes de l'ADNr 16 S en y associant des
am.liorations pour la lecture de fragments de plus grande taille (Von Wintzingerode et al. 2002). Les
modifications de s.quence nucl.otidique sont d.termin.es selon les modifications de la masse. Les
signaux de masses obtenus sont compar.s ceux g.n.r.s par les s.quences publi.es de l'ADNr 16
S. Cette technique permet de caract.riser aussi bien les bact.ries cultiv.es que non cultivables.
41
Purification des amplicons pour .liminer les r.sidus non amplifi.s.
Anses
F.vrier 2011 page 75 / 144
Dans le cas de l'analyse des prot.ines totales, la m.thode ne peut s'appliquer un m.lange bact.rien
complexe. Elle n.cessite de disposer d'une colonie isol.e ou d'un m.lange compos. d'un faible
nombre d'espces distinctes. L'.clatement du prot.ome de la colonie constitue une signature
sp.cifique permettant l'identification de la bact.rie par comparaison avec une banque de signatures.
Le m.lange des signatures rend l'analyse des r.sultats d'autant plus complexe que les souches en
pr.sence sont nombreuses.
6.3.2.2 nformations apport.es par les r.sultats
Cette m.thode est robuste pour lidentification de Legionella au niveau de l'espce. Elle ne permet
pas de discriminer les Legionella au niveau des s.rogroupes et notamment les s.rogroupes de
Legionella pneumophila (Moliner et al. 2010).
Aucune donn.e r.pertori.e ne concerne la quantification de bact.ries par cette approche.
6.3.2.3 Matrice d'application
L'identification de Legionella partir d'un .chantillon complexe est encore l'.tude. Trs peu de
donn.es sont disponibles concernant l'application de la spectrom.trie de masse aux pr.lvements
environnementaux. R.cemment, Penannec et al. (2010) ont d.crit un protocole appliqu. 2
.chantillons d'eau (TAR) (Pennanec et al. 2010). Les r.sultats sont encore trs pr.liminaires et ne
permettent pas de conclure. Cette technique d'identification, trs rapide, pourrait permettre
d'augmenter la sensibilit. et la s.lectivit. de la m.thode par culture (cela est d.taill. dans la
pargraphe 5.1.3.3).
6.3.3 La chromatographie Iiquide haute pression en condition d.naturante (dHPLC) coupI.e
Ia PCR
6.3.3.1 Principe
La dHPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatography) est une m.thode
chromatographique par couplage d'ions en phase inverse permettant la d.tection rapide de
polymorphismes de l'ADN. nitialement mise au point pour la recherche des mutations ponctuelles
(Frueh and Noyer-Weidner 2003), c'est une m.thode d'analyse qualitative et semi-quantitative qui fait
normalement suite une r.action d'amplification par PCR et permet de d.terminer la teneur en
espce(s) mol.culaire(s) de l'amplicon g.n.r. et .ventuellement leur identit. par comparaison avec
une banque de signatures mol.culaires. L'amplicon peut tre simple (espce mol.culaire unique) ou
complexe (m.lange d'espces). L'amplification par PCR permet la fois de disposer d'une quantit.
suffisante de mat.riel, d'homog.n.iser la taille de l'ADN analys. et d'introduire, grce l'une des
amorces, une s.quence GC riche (GC-clamp) afin de cr.er une zone haute temp.rature de fusion
(donc plus r.sistante la d.naturation) une des extr.mit.s du produit PCR (Wurzburger et al.
2003).
Le systme d'analyse se compose d'un appareil HPLC, d'une cartouche de phase stationnaire
constitu.e de billes non poreuses de styrne-divinylbenzne alkyl. et une phase mobile comprenant
de l'ac.tate de tri.thylammonium (TEAA) et de l'ac.tonitrile. La cartouche de phase stationnaire est
plac.e dans un four temp.rature constante afin d'obtenir une d.naturation partielle de l'amplicon. La
neutralisation par le TEAA des charges n.gatives permet l'adsorption de l'ADN sur la phase
stationnaire. Cette adsorption varie en fonction de la temp.rature de fusion (TM), laquelle est li.e la
composition en base des espces mol.culaires pr.sentes dans l'.chantillon. L'.lution progressive est
obtenue par un gradient lin.aire d'ac.tonitrile. La teneur en ADN de l'.lut est analys.e 260 nm par
un d.tecteur UV et retranscrite sous forme d'un chromatogramme.
6.3.3.2 nformations apport.es par les r.sultats
La position des pics obtenus sur le chromatogramme correspond la signature de l'espce ou des
espces mol.culaires repr.sent.e(s) dans l'.chantillon. L'aire des pics reflte leur abondance relative.
Dans le cas d'un amplicon simple, cette abondance peut tre pr.cis.e en utilisant lors de l'.tape
initiale une q-PCR, au lieu d'une PCR simple, la quantification .tant alors en UG/L. Le systme
permet aussi bien de rechercher une espce particulire en utilisant un couple d'amorces hautement
sp.cifiques que d'.valuer la composition d'un m.lange en utilisant des amorces g.n.riques.
Mme si elle a .t. utilis.e pour l'analyse d'.chantillon d'eau (Barlaan et al. 2005), la m.thode n'a pas
encore .t. test.e sur Legionella. Elle devrait th.oriquement tre capable d'apporter une r.ponse
rapide des questions complexes comme la composition de m.langes d'espces diff.rentes de
Legionella dans une installation, en permettant d'identifier lesdites espces et leurs proportions
Anses
F.vrier 2011 page 76 / 144
relatives dans le m.lange sans passer par la culture. Chaque variation de s.quence se traduisant par
un d.placement de la position du pic dans le chromatogramme.
6.3.3.3 Matrice d'application
Les matrices d'applications sont th.oriquement les mmes que celles utilisables pour la q-PCR et la v-
PCR. Les limites sont identiques, en particulier vis--vis des inhibiteurs de la PCR. Cependant, ce
jour, aucune publication r.pertori.e ne relate l'utilisation de cette m.thode pour le d.nombrement de
Legionella dans l'eau.
6.3.4 IMS - ATP-m.trie
6.3.4.1 Principe
Cette m.thode associe la s.paration immuno-magn.tique, (d.crite dans le chapitre 4.3.1.) pour
concentrer les bact.ries cibles l'aide d'anticorps s.lectifs, et l'.valuation du taux de bact.ries cibles
vivantes par ATP-m.trie (d.crite dans le chapitre 7.1.2.) (Bushon et al. 2009; Lee et al. 2010).
6.3.4.2 nformations apport.es par les r.sultats
Cette m.thode pourrait th.oriquement permettre d'.valuer sp.cifiquement le taux de Legionella spp
ou L. pneumophila dans un .chantillon d'eau. l n'existe cependant actuellement aucune publication
relatant sa mise en 8uvre pour la d.tection de Legionella vivantes.
6.3.4.3 Matrice d'application
Les matrices d'applications sont th.oriquement les mmes que celles utilisables avec la s.paration
immuno-magn.tique et l'ATP-m.trie, l'eau environnementale en faisant partie. Cependant, ce jour,
aucune publication r.pertori.e ne relate l'utilisation de cette m.thode pour le d.nombrement de
Legionella dans l'eau.
La combinaison de l'MS et de l'ATPm.trie ne pr.sente pas de difficult. de mise en 8uvre majeure et
il pourrait tre envisageable de l'utiliser sur le terrain.
Anses
F.vrier 2011 page 77 / 144
7 AnaIyses susceptibIes d'apporter une information d.cisionneIIe
compI.mentaire.
Les m.thodes .voqu.es dans le pr.sent chapitre ne sont pas des m.thodes de d.nombrement de
Legionella dans l'eau. A ce titre, elles sortent du champ de la saisine et font l'objet d'une description
succincte. Cependant, le groupe de travail a estim. important d'examiner les principes et objectifs de
m.thodes susceptibles d'apporter une information compl.mentaire aux d.nombrements de Legionella
dans l'eau, notamment dans les contextes particuliers de gestion des installations d'eaux chaudes
sanitaires et de tours a.ror.frig.rantes.
7.1 Recherche de fIore totaIe
7.1.1 CuIture
La flore m.sophile a.robie totale est un indicateur sanitaire qui permet dS.valuer le nombre dSUFC
(Unit. Formant une Colonie) pr.sentes dans un .chantillon. Ce d.nombrement se fait 30C ce qui
permet de d.nombrer la flore m.sophile (entre 20C et 40C) et de la distinguer des flores
thermophile (temp.rature optimale de croissance sup.rieure 40-45C) et psychrophile (temp.rature
optimale de croissance inf.rieure 20C).
La croissance s'effectuant sur g.lose nutritive standard, la plupart des micro-organismes cultivables
peuvent se d.velopper, l'exception de ceux qui sont exigeants (tel que Legionella) et les micro-
organismes ana.robies stricts. l est donc plut?t pr.f.rable de parler de "flore m.sophile a.robie"
30 C que de flore totale .
Dans le contexte des eaux chaudes sanitaires ou des eaux de tours a.ror.frig.rantes, le
d.nombrement de la flore m.sophile a.robie 30C peut, dans certaines situations, apporter une
information suppl.mentaire, interpr.ter en parallle des r.sultats de d.nombrement de Legionella.
Le d.nombrement de la flore m.sophile a.robie est r.alisable sur tout type d'eau.
7.1.2 ATP-m.trie
Le principe est de d.tecter un indicateur de l'activit. m.tabolique des bact.ries pour prouver la
pr.sence de bact.ries vivantes dans l'.chantillon. L'indicateur d'activit. m.tabolique recherch. est
l'ATP. L'ATP-m.trie peut tre appliqu.e pour la d.tection et la quantification d'une activit. bact.rienne
totale, en laboratoire ou sur le terrain. Elle peut tre int.ressante dans le cadre de suivi de
d.sinfection, pour aider la prise de d.cision (Lee and Deininger 2004; Trudil et al. 2000).
L'objectif est de d.tecter et .ventuellement quantifier une activit. m.tabolique dans un .chantillon, qui
peut t.moigner d'une contamination biologique. A titre d'exemple, l'ATP-m.trie peut tre utilis.e pour
.valuer la biomasse et donc le niveau d'encrassement d'une tour a.ror.frig.rante (Van der Kooij et al.
2005). Cette m.thode peut venir en compl.ment d'une autre m.thode plus sp.cifique. Elle permet la
quantification de l'ATP et la d.tection des bact.ries viables cultivables et non cultivables.
L'ATP-m.trie est a priori utilisable sur tout type d'eau.
7.2 Recherche d'amibes
Le principe le plus r.pandu pour la recherche d'amibes est la culture. En laboratoire, les amibes sont
g.n.ralement cultiv.es 25C sur milieu d'agar non nutritif
42
A noter que les recherches d'amibes sont relativement lourdes mettre en 8uvre et co`teuses
ensemenc. avec des bact.ries (e.g. E.
coli) servant de substrat nutritif. La temp.rature de culture doit cependant tre adapt.e
sp.cifiquement chaque espce. Ce milieu permet .galement leur isolement (Srikanth and Berk
1993). Le typage des amibes peut se faire sur une base morphologique ou par une approche
mol.culaire avec l'utilisation de la q-PCR (Behets et al. 2006; Pelandakis and Pernin 2002) partir
d'ADN (Myjak et al. 1997; Pilcher et al. 2007a) ou d'ARN ribosomique 18S purifi. (Pilcher et al.
2007b).
42
G.lose qui ne sert que de support
Anses
F.vrier 2011 page 78 / 144
Dans le contexte des eaux chaudes sanitaires ou des eaux de tours a.ror.frig.rantes, la recherche
des amibes peut, dans certaines situations, apporter une information suppl.mentaire, interpr.ter en
parallle de r.sultats de d.nombrement de Legionella.
7.3 AnaIyse du biofiIm
L'analyse n.cessite l'accs aux surfaces des r.seaux d'eau et circuits de refroidissement, suivi d'une
r.cup.ration du biofilm. Une fois le biofilm r.cup.r., la pr.sence, la quantification de Legionella ou la
quantification de biomasse peuvent tre d.termin.es par toutes les techniques de d.nombrement de
Legionella pr.c.demment .voqu.es, en adaptant les protocoles aux sp.cificit.s du biofilm. Les
microorganismes du biofilm n'.chappent pas aux notions de viabilit., cultivabilit..
Dans le contexte des eaux chaudes sanitaires et des tours a.ror.frig.rantes, l'analyse du biofilm peut
avoir au moins deux objectifs :
D la recherche de Legionella ;
D le suivi d'une installation.
Dans les deux cas, la difficult. repose principalement sur le mode et le lieu du pr.lvement, si l'on
veut qu'il soit repr.sentatif du circuit et reproductible. C'est sans doute ce qui freine aujourd'hui son
utilisation. On peut citer quelques points critiques du pr.lvement, qui peuvent avoir une grande
influence sur les r.sultats d'analyse obtenus (Ditommaso et al. 2010; Stout and Yu 2010) :
D .couvillonnage direct sur une surface accessible de bassin de TAR, au robinet ou dans la
pomme de douche ;
D utilisation de manchettes t.moins plac.es sur le circuit, avec r.cup.ration du biofilm par
.couvillonnage, ultrasons, d.capage chimique ou autre technique, en vue d'analyses
ult.rieures
D utilisation de manchettes t.moins plac.es sur le circuit avec extraction des supports en vue de
mesures directes sans enlvement du biofilm : microscopie, goniom.trie ;
D mesure directe, capteur de biofilm : capteur thermique, capteur .lectrochimique (.lectrode
disque tournant) ; ces capteurs ne sont cependant pas sp.cifique du biofilm, mais d'un
encrassement, dans lequel le biofilm a un r?le variable.
Les recherches de Legionella dans le biofilm peuvent permettre de confirmer leur pr.sence latente
dans une installation, alors que les analyses d'eau pr.sentent des r.sultats n.gatifs. Les exp.riences
de gestion d'installation ou de pr.vention du risque li. aux Legionella bas.es sur l'analyse du biofilm
sont rares (Farhat et al. 2010).
7.4 AnaIyse des a.rosoIs
La structure des a.rosols est de nature complexe. Les gouttelettes le composant comportent aussi
bien des .l.ments viables (cellules ou spores bact.riens, fragments de myc.lium et spores fongiques,
cellules et kystes de protozoaires, etc.) que des virus et des .l.ments non viables (fragments
cellulaires et composants de la paroi, en particulier des endotoxines). Ces .l.ments peuvent se
pr.senter sous la forme d'.l.ments biologiques individualis.s (cellules, spores, kystes) ou
d'assemblages complexes d'.l.ments biologiques entre eux (agr.gats, v.sicules, etc.) ou avec des
.l.ments non-biologiques.
La composition des a.rosols est extrmement variable en fonction de la source d'origine. Elle diffre
.galement sensiblement de cette dernire par l'.tat des .l.ments qui le compose. Ainsi certains
auteurs ont montr., en r.alisant des essais comparatifs d'appareil de collecte et de m.thode de
d.nombrement, que L. pneumophila .tait affect.e par lSa.rosolisation et le pr.lvement d'air et en
particulier que sa cultivabilit. .tait fortement diminu.e en d.pit d'une composition en bact.ries viables
et infectieuses quasi inchang.e (Berthelot et al. 2009; Deloge-Abarkan et al. 2007). Par ailleurs, les
conditions environnementales (temp.rature, hygrom.trie, etc.) impactent fortement sa composition.
La mesure des microorganismes dans les a.rosols a .t. envisag.e dans son aspect r.glementaire
pour l'.valuation et la surveillance des microorganismes sur les lieux de travail et des rgles
appliquer dans ce domaine sont d.finies depuis 2000 par la norme NF EN 13098. Toutefois, l'heure
actuelle, il n'existe pas de valeurs limites d'exposition professionnelle (VLEP) pour les bioa.rosols
microbiens en milieu professionnel, car on ne dispose que de peu d'.l.ments sur la relation dose-effet
de ces agents. l existe seulement des valeurs-guides (encore appel.es critres d'action) .tablies sur
la base des publications existantes (Goyer et al. 2001). Les rares recommandations de valeur limite
existantes concernent les activit.s qui produisent de grandes quantit.s de moisissures, comme
Anses
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certains postes de salaison et charcuterie. D'une manire g.n.rale, plus l'a.rosol est charg. en
micro-organismes, plus son pouvoir pathogne est consid.r. comme .lev. (G.hin et al. 2009).
Les m.thodes de d.tection et de quantification des microorganismes dans les a.rosols sont calqu.es
sur celles utilis.es pour la d.tection et la quantification dans l'eau (culture, amplification g.nique,
m.thodes immunologiques hybridation, etc.). Elles pr.sentent donc exactement les mmes limites et
avantages que celles d.crites dans le pr.sent document. Mais elles sont de plus trs fortement
impact.es par le mode de pr.lvement des .chantillons, lequel d.pend de l'appareillage de collecte
pour lequel il n'existe ni norme, ni standard. Cet appareillage peut faire appel trois principes
fondamentaux : l'impaction (oM le flux d'air aspir. traverse une grille avant de venir impacter une
surface cible servant de support de collecte, g.n.ralement un milieu g.los.), la filtration (oM le flux
d'air traverse un m.dia filtrant de type capillaire ou poreux retenant les .l.ments en suspension) et
l'impingment (une variante de l'impaction dans laquelle la collecte se fait par contact entre le flux d'air
entrant et un liquide de collecte, le plus souvent de l'eau ou du s.rum physiologique) (Duquenne and
Greff-Mirguet 2005).
Certains de ces appareils revendiquent une possibilit. de quantification de Legionella. Cependant, la
prise de d.cision sur la base de r.sultats obtenus avec ces appareils reste compliqu.e, notamment
en cas d'une d.tection un taux .lev.. En effet, aucune r.f.rence bibliographique n'a .t. r.pertori.e
concernant les concentrations dans 'air pr.sentant un risque pour la population. Par ailleurs, le
pouvoir pathogne v.hicul. par les a.rosols diminue normalement en fonction de l'augmentation de la
distance la source d'.mission. Mais cette d.croissance n.cessite d'tre pond.r.e ainsi le paramtre
.olien qui modifie fortement le rayon d'action potentiel, rend l'.valuation de la dangerosit. plus
d.licate.
Dans le cas des L. pneumophila, l'.valuation du pouvoir infectieux d'un a.rosol n.cessite .galement
la prise en compte d'autres paramtres que la stricte quantit. des bact.ries d.nombr.es. Ainsi la taille
des gouttelettes v.hicul.es a un impact important sur l'infectiosit.. Un a.rosol contenant des L.
pneumophila est consid.r. comme poss.dant un pouvoir infectieux .lev. si les gouttelettes d'eau qui
le composent sont comprises entre 2 et 5 0m (Baron and Willeke 1986; Bollin et al. 1985; Girod et al.
1982). Ce paramtre essentiel n'est que difficilement .valuable avec les appareils de collecte actuels.
Plusieurs auteurs ont montr. la relation .troite existant entre amibes et L. pneumophila, et en
particulier la capacit. des amibes g.n.rer des v.sicules charg.es en L. pneumophila d'une taille
compatible avec l'inhalation (entre 2 et 5 Vm) (Berk et al. 1998; Rowbotham 1980). La pr.sence de
ces v.sicules l'.tat libre dans le milieu source pourrait tre facteur de dangerosit. suppl.mentaire
lors de la formation d'a.rosols. En effet, ces v.sicules sont r.sistantes aux d.sinfections. Elles
peuvent rester intactes au del de 6 mois sans que les bact.ries qu'elles h.bergent perdent leur
pouvoir infectieux (Bouyer et al. 2007). Selon certains auteurs, cet assemblage complexe pourrait
rendre les L. pneumophila h.berg.es susceptibles d'tre facilement transport.s lorsque des a.rosols
sont .mis. L'existence de ces v.sicules pourrait expliquer certains paradoxes au regard de la dose
infectieuse, tels que le fait que certaines tours a.ror.frig.rantes avec un relativement faible nombre
de L. pneumophila puissent tre des sources de L.gionellose, ou encore que des tours restent des
sources d'infection 24 heures aprs un traitement par des biocides ou encore que des cas de
l.gionelloses ait .t. identifi.s des kilomtres d'une source, distance laquelle les bact.ries libres
sont normalement affect.es par la dessiccation (Berk et al. 1998). De fait, le cas des a.rosols
constitue un problme de complexit. sup.rieure celui de l'eau qui m.riterait lui seul un traitement
part.
Anses
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8 Comparaison des diff.rentes m.thodes
8.1 Critres d'.quivaIence de m.thodes de d.nombrement de microorganismes
Les critres d'ordres math.matiques permettant d'.tablir une .quivalence entre diff.rentes m.thodes
de d.nombrement de microorganismes, doivent tre distingu.s des paramtres de performances
intrinsques chaque m.thode.
En application de la directive 2006/7/CE du Parlement europ.en et du Conseil, la d.cision de la
Commission du 21 janvier 2009 d.signe la norme SO 17994:2004(E) en tant que norme pour
l'.quivalence des m.thodes microbiologiques (CE 2009). Cette norme d.finit une proc.dure
d'.valuation qui permet de comparer deux m.thodes visant d.tecter ou quantifier le mme groupe
cible ou la mme espce de micro-organisme. Elle fournit les bases math.matiques pour .valuer les
performances relatives moyennes des deux m.thodes par rapport des critres d'.quivalence
d.termin.s
43
Dans son avis de 2008, relatif l'.quivalence des m.thodes alternatives par rapport aux m.thodes de
r.f.rence dans le domaine des eaux destin.es la consommation humaine (Saisine 2007-SA-0192),
l'Afssa (AFSSA 2008), recommande, dans le cadre d'une .valuation d'.quivalence de deux m.thodes
analytiques, d'ajouter aux principes de la norme EN SO 17994 :2004, une .tude pr.alable visant
v.rifier ou mme .valuer l'.quivalence de la m.thodologie alternative par rapport la m.thode de
r.f.rence. Cette .valuation se ferait sur des critres classiques de validation et dans le domaine de
l'eau de consommation (s.lectivit., lin.arit., exactitude relative, r.p.tabilit.).
.
L'Afssa pointe .galement une ambiguEt. de la norme EN SO 17994 :2004 d'un point de vue
statistique. Contrairement au titre de la norme, le test dS.galit. par lequel elle se conclue n'est pas
r.ellement un test dS.quivalence, car il exclut la notion de tol.rance. En effet c'est l'hypothse nulle
qui est test.e, et plus l'.cart type des diff.rences entre les r.sultats est .lev., plus il est facile de
valider l'.quivalence, alors qu'un .cart-type faible entre les r.sultats de la m.thode alternative rend la
validation plus difficile, en comparaison avec la m.thode de r.f.rence. LSun des risques majeurs de
cette pratique est la possibilit. de rejeter, sur cette base statistique, les m.thodes les plus
performantes selon les critres classiques de caract.risation des m.thodes analytiques.
Dans le cadre du pr.sent rapport, il est soulign. deux difficult.s suppl.mentaires pour l'application de
la norme EN SO 17994 :2004 l'.valuation de l'.quivalence de m.thodes de d.nombrement de
Legionella dans l'eau.
En premier lieu, l'application de cette norme implique l'existence d'une m.thode de r.f.rence donnant
des r.sultats avec une justesse satisfaisante. Dans le cas du d.nombrement de Legionella dans l'eau,
la m.thode de r.f.rence d'un point de vue r.glementaire (culture - norme NF T90-431), d.nombre les
seules bact.ries cultivables. Comme .voqu. pr.c.demment, la question de l'int.rt sanitaire de
d.tecter certaines bact.ries non cultivables reste pos.e. Ainsi, la pertinence d'utiliser la m.thode par
culture comme r.f.rence dans le cadre d'une .ventuelle .tude d'.quivalence peut tre discut.e. Dans
le cas oM la m.thode par culture ne serait pas retenue comme m.thode de r.f.rence pour une telle
.tude, le choix d'une autre m.thode de r.f.rence semble probl.matique.
En second lieu, selon la norme EN SO 17994 :2004, celle-ci est applicable "deux m.thodes
quelconques de d.nombrement fond.es sur des comptages (de colonies ou de tubes positifs) ou
deux m.thodes quelconques de d.tection (m.thodes pr.sence/absence) visant au mme objectif".
43
Pour .valuer le r.sultat de la comparaison, "lSintervalle de confiance" de lSincertitude .largie autour de la moyenne se calcule
en .valuant :
- la limite inf.rieure : L = m-U
- la limite sup.rieure : H = m+U
ou m = moyenne arithm.tique de la diff.rence relative en %.
et U = incertitude .largie, calcul.e partir de lSincertitude-type de la moyenne des diff.rences relatives (issue de lS.cart-
type de la diff.rence relative), avec un facteur dS.largissement = 2
U = 2x(.cart-type)/racine(nombre dS.chantillons)
Un .cart maximal admissible est choisi en fonction du contexte et des objectifs fix.s (par exemple D=10%).
Deux m.thodes sont dites "sans diff.rence" lorsque : -D < L < 0 et 0 < H < D
Cette proc.dure permet de comparer deux m.thodes visant au mme objectif.
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En d'autres termes, cette norme est applicable des m.thodes de d.nombrement microbiologique
donnant des r.sultats partir de boites ou de tubes de culture, dans les mmes unit.s. Elle ne pr.voit
pas d'application la comparaison de m.thode donnant des r.sultats dans des unit.s diff.rentes.
Pour ces diff.rentes raisons, l'utilisation de la norme EN SO 17994 :2004 pour .tablir une
.quivalence entre les diff.rentes m.thodes de d.nombrement de Legionella semble peu pertinente.
Toujours dans le cadre du d.nombrement de Legionella dans l'eau, l'application du protocole Afnor
"Protocole de validation d'une m.thode alternative commerciale par rapport une m.thode de
r.f.rence", dans sa version "R.vision 0", adopt.e le 28 juillet 2008 (Afnor 2008), semble se heurter
aux mmes difficult.s que celles .voqu.es pour la norme EN SO 17994 :2004, avec la mme
conclusion concernant sa pertinence.
Dans le domaine alimentaire, il semble int.ressant de signaler la norme NF EN SO 16140, d'octobre
2003. Elle est utilis.e pour valider des m.thodes alternatives, et utilisant des principes de d.tection
des microorganismes trs variables (imp.dancem.trie, PCR, etc..), par rapport des m.thodes de
r.f.rences, g.n.ralement la culture sur botes g.los.es. Elle peut s'appliquer des m.thodes
qualitatives ou quantitatives. Ses principes reprennent les paramtres de description et de choix des
m.thodes d'analyses d.j list.es dans ce rapport, en y associant des calculs dSexactitude relative et
des biais. l pourrait tre envisag. d'utiliser cette norme pour tenter de comparer diff.rentes m.thodes
de d.nombrement de Legionella dans l'eau. Cependant, aucun exemple de son application des
m.thodes d'analyse d'eau n'a .t. r.pertori.. De surcrot, elle n'aborde pas du tout le problme de la
diversit. des unit.s d'expression des r.sultats.
Aucune m.thode normalis.e n'ayant fait ses preuves pour .tablir l'.quivalence entre diff.rentes
m.thodes de d.nombrement microbiologique dans l'eau n'a .t. identifi.e. De surcrot, les publications
revues par le groupe de travail qui d.crivent des comparaisons de r.sultats obtenus partir de
plusieurs m.thodes n'utilisent pas les normes cit.es ci-dessus. En cons.quence, pour la suite de ce
chapitre, la discussion relative la comparabilit. des unit.s et des m.thodes ne tient pas compte des
normes pr.cit.es.
8.2 ComparabiIit. des unit.s
Les unit.s dans lesquelles les r.sultats de d.nombrement de Legionella sont exprim.s sont li.es au
type de m.thode mise en 8uvre. Ainsi, les r.sultats peuvent tre exprim.s en UG/L (m.thode par
biologie mol.culaire), UFC/L (m.thode par culture) ou cellules/L (cytom.trie ou microscopie), avec
pour cons.quence des difficult.s de comparaison.
Pour rappel, l'unit. des r.sultats obtenus par culture est l'UFC (Unit. formant colonie), qui correspond
une colonie observ.e sur un milieu de culture lors du d.nombrement, et l'unit. des r.sultats obtenus
par q-PCR ou v-PCR est l'UG (Unit. g.nome), qui correspond chez les bact.ries un r.plicon
44
Le fait que la concentration bact.rienne d'un mme .chantillon .valu.e par amplification g.nique (en
UG/L) soit sensiblement sup.rieure la concentration de ce mme .chantillon .valu. par culture (en
UFC/L), peut avoir diff.rentes explications :
(Delgado-Viscogliosi et al. 2009).
- une part importante des Legionella de l'.chantillon peut tre compos.e de cellules mortes mais
contenant encore leur ADN ;
- de la mme manire, l'.chantillon peut contenir beaucoup de VBNC (Delgado-Viscogliosi et al.
2009; Joly et al. 2006) ;
- s'agissant de la culture, certaines publications .voquent l'hypothse selon laquelle plusieurs
cellules de Legionella pourraient tre agr.g.es et n'tre l'origine que d'une colonie, minimisant
ainsi le r.sultat (Delgado-Viscogliosi et al. 2009). La norme SO 8199:2005 indique cependant
que "Pour des raisons pratiques, chaque colonie est consid.r.e comme provenant dSun seul
micro-organisme ou dSun agr.gat de micro-organismes...". Aucune r.f.rence bibliographique
44
Mol.cule dSADN ou dSARN, ou une r.gion dSADN ou dSARN pouvant se r.pliquer partir dSune seule origine de r.plication. Le
r.plicon est lSunit. de r.plication de lSADN bicat.naire.
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permettant de confirmer cette hypothse n'ayant .t. trouv.e, notamment pour Legionella, le
groupe de travail ne peut se positionner sur ce point ;
- certaines souches de Legionella sont susceptibles de contenir un nombre de copies de la zone
g.nomique amplifier plus important que la souche utilis.e pour .tablir la courbe .talon servant
la quantification (Joly et al. 2006). L'.talon national maintenant disponible pour le
d.nombrement de Legionella par q-PCR prend en compte cette possibilit. ;
- la croissance de Legionella sur un milieu de culture peut tre inhib.e par la pr.sence d'autres
microorganismes, qui n'influencent pas les r.sultats de la q-PCR ou de la v-PCR (Delgado-
Viscogliosi et al. 2009) ou cause des pr.traitements (acide ou thermique) appliqu.s
l'.chantillon avant l'ensemencement (Joly et al. 2006; Yaradou et al. 2007) ;
- les m.thodes mettant en 8uvre la q-PCR peuvent tre simplement plus sensibles que les
m.thodes par culture (Dusserre et al. 2008), mme si les r.sultats des deux m.thodes et leurs
unit.s ne sont pas strictement comparables (Delgado-Viscogliosi et al. 2009).
Pour les m.thodes dont les donn.es disponibles permettent d'envisager une comparaison, il est
constat. que les unit.s dans lesquelles sont exprim.s les r.sultats ne sont pas strictement
comparables. Toutefois, il semble int.ressant de tenter d'.tablir des corr.lations entre les r.sultats
exprim.s dans diff.rentes unit.s.
8.3 ComparabiIit. des Iimites de d.tection et de quantification
La comparaison des limites de d.tection et de quantification doit tre modul.e en fonction des cibles
de la m.thode et des ajustements que permettent par les pr.traitements.
Selon la norme NF T90-431, la limite de d.tection th.orique de la culture est de 50 UFC/L et sa limite
de quantification est de 250 UFC/L. Ces donn.es ne tiennent pas compte du rendement. Toujours
pour la culture, selon la norme SO 11731-2, la limite de d.tection est de 1 UFC/L, pour un rendement
de 100 %.
Joly et al. ont conduit une .tude qui amne plus d'informations sur le cas du d.nombrement de
Legionella par q-PCR dans les eaux chaudes sanitaires (223 .chantillons) ou les tours
a.ror.frig.rantes (37 .chantillons). Les cibles choisies .taient le gne mip pour le d.nombrement des
L. pneumophila (Cloud et al. 2000) et le gne codant pour l'ARNr 16S pour le d.nombrement des L.
spp. (Wellinghausen et al. 2001). Deux laboratoires ont particip. l'.tude. Dans les conditions de
cette .tude, les limites de d.tection et de quantification de la q-PCR .taient comprises entre 250 et
300 UG/L et entre 1000 et 5000 UG/L pour L. pneumophila, et entre 30 et 250 UG/L et 500 et 5000
UG/L pour L.spp, selon le laboratoire. l est noter que cette .tude ne prend pas en compte la
pr.sence .ventuelle de d.sinfectants dans les eaux analys.es (Joly et al. 2006).
Morio et al., ont men. une .tude par q-PCR sur des eaux chaudes sanitaires trait.es et non trait.es
(68 .chantillons issus d'eau trait.e au chlore, 6 l'acide perac.tique et 15 filtr.s). La cible choisie
pour le d.nombrement des L. pneumophila .tait le gne mip. Les limites de d.tection et de
quantification mesur.es dans ces conditions .taient respectivement de 100 UG/L et 800 UG/L. Ces
valeurs sont du mme ordre de grandeur que celles obtenues par Joly et al. Les auteurs n'apportent
pas de commentaires concernant l'influence des traitements de l'eau sur les r.sultats des m.thodes
par q-PCR et culture test.es (Morio et al. 2008).
Selon Dusserre et al. la m.thode par q-PCR (limite de d.tection : 170 GU/L) est moins sensible que
les m.thodes TVC (limite de d.tection : 1 cellule par .chantillon filtr.) et par immuno-d.tection avec
lecture par cytom.trie d'image (limite de d.tection : 1 cellule par .chantillon filtr.) (Dusserre et al.
2008). Cette indication reste cependant prendre avec pr.caution, d'autant plus que
l'exp.rimentation a .t. r.alis.e sur de l'eau distill.e dop.e en Legionella, ce milieu n'.tant pas
n.cessairement repr.sentatif des eaux environnementales.
Selon Lemarchand et al., la limite de quantification des m.thodes par immuno-d.tection serait
comprise entre 10 et 5.10
7
cellules/L, cependant l'.tude r.alis.e par cette .quipe ne porte par sur le
d.nombrement de Legionella mais sur E. coli. Cette limite est peut-tre extrapolable, mais de fait non
av.r.e (Lemarchand et al. 2001).
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Pour envisager la comparaison des limites de d.tection et de quantification relatives diff.rentes
m.thodes il est n.cessaire que celles-ci soient .prouv.es et stabilis.es, par exemple par
l'introduction d'une norme. Des m.thodes de d.nombrement alternatives apparaissent prometteuses,
mais elles n'ont pas encore .t. valid.es par une application sur un grand nombre d'.chantillons
d'eau naturelle et par un grand nombre d'utilisateurs.
8.4 Comparaison des m.thodes en fonction des diff.rents types d'eau
L'.valuation ou la comparaison des m.thodes de d.nombrement de Legionella peuvent tre r.alis.es
sur diff.rents types d'eaux : eaux ensemenc.es exp.rimentalement, eaux chaudes sanitaires, eaux
de tours a.ror.frig.rantes. Le pr.sent chapitre porte sur les principales .tudes de comparaison
r.pertori.es dans la litt.rature.
8.4.1 Eaux ensemenc.es exp.rimentaIement
La plus grande partie des .tudes destin.es comparer des m.thodes de d.nombrement de
Legionella a .t. men.e avec des eaux ensemenc.es exp.rimentalement.
Selon plusieurs auteurs, l'analyse d'un .chantillon d'eau non trait.e, ensemenc. exp.rimentalement
avec 10
6
UFC/L de L. pneumophila, donne des r.sultats comparables, quelle que soit la m.thode
utilis.e : q-PCR (avec ou sans filtration pr.alable de l'.chantillon), TVC, immuno-d.tection, ou culture.
Les r.sultats obtenus sont tous proches de 10
6
, qu'ils soient exprim.s en CFU /L, UG/L ou cellules/L
(Delgado-Viscogliosi et al. 2005; Dusserre et al. 2008).
Une .tude r.cente mettant en jeu d'autres m.thodes, men.e sur une eau du robinet st.rilis.e, puis
artificiellement contamin.e par L. pneumophila sg 1, semble parvenir aux mmes conclusions.
L'objectif .tait de comparer la m.thode d'analyse par culture (9 .chantillons analys.s) deux
m.thodes de d.tection aprs marquage immuno-fluorescent des cibles : d.tection par cytom.trie en
flux (6 .chantillons analys.s) et d.tection par microscopie (30 .chantillons analys.s). Les trois
m.thodes semblent corr.l.es. Cependant, le faible nombre d'.chantillons empche de tirer des
conclusions significatives de cette .tude (Fuchslin et al. 2010).
L'analyse d'un .chantillon d'eau trait.e par des concentrations croissantes de chlore libre, dop.e en
.l.ments organiques (peptones), puis ensemenc.e exp.rimentalement avec 10
6
CFU/L de L.
pneumophila (incubation de 24h), abouti des r.sultats trs diff.rents en fonction de la m.thode
utilis.e (Dusserre et al. 2008) :
- la m.thode par culture, que ce soit sur milieu BCYE ou GVPC, ne permet plus de d.tecter la
pr.sence de L. pneumophila ds 0,5 mg/L de chlore, indiquant que la croissance de L.
pneumophila est inhib.e ;
- la m.thode TVC d.tecte de moins en moins de cellules de L. pneumophila partir de 0,5 mg/L
de chlore jusqu' une d.tection nulle 30 mg/L ;
- la m.thode par immuno-d.tection d.tecte une quantit. identique de cellules jusqu' 3 mg/L puis
n'en d.tecte plus 30 mg/L ;
- la m.thode par q-PCR d.tecte la mme quantit. de cellules jusqu' 1 mg/L et n'en d.tecte plus
3 mg/L.
Par ailleurs, d'aprs Delgado-Viscogliosi et al. (2009), les signaux .mis par culture et par v-PCR
diminuent ds 0,4 mg/L de chlore libre, alors que celui .mis par la q-PCR ne diminue qu' partir de
0,6 mg/L de chlore libre (Delgado-Viscogliosi et al. 2009).
D'aprs Dusserre et al. (Dusserre et al. 2008) :
- le chlore affecte la viabilit. (mesur.e par TVC ou v-PCR) et la cultivabilit. (mesur.e par culture)
de L. pneumophila, des concentrations moindres que celles qui affectent l'ADN bact.rien
(mesur. par q-PCR) et les prot.ines cibles de l'immuno-d.tection ;
- dans un .chantillon d'eau trait.e par le chlore, la m.thode par culture se r.vle tre la moins
sensible pour la d.tection de la pr.sence de L. pneumophila ;
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- les m.thodes par q-PCR et par immuno-d.tection d.tectent la fois les L. pneumophila viables
(cultivables ou non cultivables) et non viables, alors que les m.thodes par culture et TVC
mesurent respectivement les bact.ries cultivables et viables ;
- un petit nombre de bact.ries, incluant probablement quelques cellules viables, sont pr.sentes
dans certains .chantillons trait.s avec 3 mg/L de chlore, dans lesquels la q-PCR ne d.tecte rien
alors que les m.thodes par TVC et par immuno-d.tection r.vlent un signal.
Ces r.sultats confirment ceux d'une .tude (Bej et al. 1991) men.e sur des eaux st.rilis.es puis
ensemenc.es exp.rimentalement, avec les m.thodes de d.nombrement par q-PCR (cible : gne mip,
selon Mahubani, 1987) et par culture (culture sur milieu BCYE). Ces m.thodes sont utilis.es en
parallle sur des .chantillons trait.s par le chlore (10
-4
mg/L pendant diff.rents temps) ou par la
chaleur (70C pendant diff.rents temps). Le traitement de l'eau par la chaleur semble avoir le mme
effet sur les r.sultats obtenus avec les deux m.thodes : aprs 10 minutes 70C, les L. pneumophila
ne sont plus d.tect.es. En revanche, il semble que le traitement de l'eau par le chlore fasse diminuer
le signal obtenu par culture plus vite que celui obtenus pas q-PCR. Aprs 2 minutes de traitement par
le chlore, les r.sultats obtenus par culture sont inf.rieurs la limite de d.tection de la m.thode, alors
que ceux obtenus par q-PCR r.vlent la pr.sence de Legionella aprs 10 minutes de traitement. Les
auteurs expliquent cela comme le passage de Legionella dans un .tat viable mais non cultivable sous
l'effet du chlore, en prenant comme hypothse discutable que la q-PCR ne d.tecte que les bact.ries
viables.
Une m.thode par immuno-d.tection a .galement .t. test.e sur ce type d'eau. Une .quipe de
recherche a test. des .chantillons d'eaux st.riles artificiellement contamin.es, partir de diff.rentes
souches de Legionella d.j isol.es, l'aide de la cytom.trie en flux, aprs un marquage sp.cifique
des cellules cibles par deux fluorochromes. Douze souches de Legionella ont .t. test.es : 7 souches
de L. pneumophila sg 1 (Philadelphia, Paris, 044, 066, BAC, MAR et VAR), une souche de L.
pneumophila sg 4, une souche de L. pneumophila sg 6, une souche de L. pneumophila sg 13, une
souche de L. anisa et une souche de L. micdadei). Aprs un choc thermique de 30 minutes 70C, tel
que pr.conis. par les autorit.s franaises pour la d.contamination des circuits d'eau des
.tablissements de sant. (Circulaire DGS du 22 avril 2002), pour 6 de ces souches, 10 25 % des
cellules restent viables (Allegra et al. 2008) ce qui peut paratre inqui.tant.
Les m.thodes de d.nombrement de Legionella par q-PCR sont susceptibles de surestimer le nombre
de bact.ries infectieuses. En effet, la d.tection d'un gne ou d'une prot.ine sp.cifique d'une bact.rie
ne renseigne pas sur son .tat de viabilit. et d'infectiosit. (Delgado-Viscogliosi et al. 2005). Selon
Yaradou et al., cela rend les r.sultats de d.nombrement de Legionella obtenus par q-PCR difficiles
interpr.ter d'un point du vue sanitaire (Yaradou et al. 2007).
A contrario, la culture conduirait sous-estimer la concentration de Legionella pr.sentes dans les
.chantillons, d'autant plus dans des conditions environnementales susceptibles de stresser les
Legionella, comme les traitements chimiques ou thermiques de l'eau (Delgado-Viscogliosi et al. 2009).
l est .tabli que l'ADN de bact.ries non viables peut r.sister dans l'environnement (Nocker and
Camper 2006). Cependant, au-del d'une certaine concentration de chlore, l'int.grit. de l'ADN semble
affect.e, au point d'empcher toute amplification par PCR, aussi bien par q-PCR que par v-PCR.
Selon Delgado-Viscogliosi et al., cette concentration en chlore est de l'ordre de 1 mg/L (Delgado-
Viscogliosi et al. 2009), alors que Dusserre et al., qui utilisent un tampon phosphate, dans le cadre de
leurs analyses, la situent entre 1 et 3 mg/L (Dusserre et al. 2008). Une .tude de Chang et al., men.e
avec une m.thode trs proche, combinant l'utilisation de l'EMA et la q-PCR, semble confirmer les
r.sultats de Dusserre et al (Chang et al. 2009).
Concernant les traitements susceptibles d'affecter diff.remment les r.sultats des diff.rentes
m.thodes, 3 m.thodes d'analyse (culture, q-PCR et v-PCR) ont .t. test.es pour .valuer leur
pertinence dans le cadre du suivi de l'efficacit. de traitements d'eau (eaux domestiques
artificiellement ensemenc.s).
V Traitement thermique :
D'aprs une exp.rimentation men.e par Delgado et al., sur un .chantillon contenant avant
traitement environ 7,5 log d'UG ou UFC/mL de L. pneumophila, aprs 1h 70C (Delgado-
Viscogliosi et al. 2009) :
U la m.thode par q-PCR r.vle une concentration en L. pneumophila en UG/L inchang.e :
environ 7,5 log d'UG/mL ;
Anses
F.vrier 2011 page 85 / 144
U la m.thode par v-PCR r.vle une forte diminution de la concentration en L. pneumophila
en UG/L : une r.duction du signal q-PCR proche de plus de 99,9 % (environ 3,2 log
d'UG/mL restant) ;
U la m.thode par culture (norme Afnor NFT90-431), r.vle une absence de L. pneumophila
cultivables (UFC).
Une .tude de Chang et al., men.e avec une m.thode trs proche, combinant l'utilisation d'EMA
et de la q-PCR, semble confirmer les r.sultats de l'.tude pr.c.dente (Chang et al. 2009).
V Traitement par le chlore :
Dans le cadre d'une exp.rimentation men.e avec un .chantillon d'eau contenant avant
traitement 10
5
UFC/L de L. pneumophila, les analyses sont r.alis.es aprs 24 h d'exposition
aux diff.rentes concentrations en chlore test.es (Delgado-Viscogliosi et al. 2009) :
U le signal .mis par la culture d.crot partir d'une concentration en chlore de 0,2 mg/L et
n'est plus d.tect. partir de 0,5 mg/L. Cela signifie qu' partir de cette concentration, il
n'y a plus de L. pneumophila cultivable.
U le signal .mis par la m.thode q-PCR est de l'ordre de 10
6
UG/L de L. pneumophila avant
traitement (10
5
UFC/L mesur.s par culture). Ce signal diminue fortement 1 mg/L de
chlore.
U le signal .mis par la m.thode v-PCR est de l'ordre de 10
6
UG/L de L. pneumophila en
avant traitement (10
5
UFC/L mesur.s par culture). Ce signal commence diminuer
partir 0,5 mg/L de chlore et n'est plus d.tect. 1 mg/L.
Pour expliquer l'absence de signal par la m.thode par culture ds 0,2 mg/L de chlore alors que
les m.thodes par q-PCR et v-PCR ne r.vlent pas de diminution des concentrations en UG/L,
deux hypothses sont formul.es par les auteurs :
U soit la pr.sence de chlore cette concentration stresse les cellules de Legionella au
point de les rendre non cultivables, mais sans pour autant avoir un effet sur leur int.grit.
membranaire,
U soit le chlore, cette concentration, ne permet pas une perm.abilisation suffisante des
membranes pour laisser p.n.trer les mol.cules d'EMA dans les cellules, la trop faible
quantit. d'EMA au contact de l'ADN ne pouvant pas, dans ce cas, affecter l'intensit. du
signal v-PCR.
A partir de 0,5 mg/L de chlore, les membranes des cellules commenceraient laisser passer les
mol.cules d'EMA qui se lient avec l'ADN des cellules endommag.es, en empchant son
amplification PCR. Ainsi, cette concentration, il semble que le signal de la v-PCR repr.sente
les cellules de Legionella viables ou conservant une bonne int.grit. membranaire, alors que le
signal q-PCR repr.sente l'ensemble des cellules, viables et non viables (Delgado-Viscogliosi et
al. 2009).
V Traitement par le glutaraldehyde :
D'aprs une exp.rimentation men.e par Delgado et al., avec un .chantillon d'eau contenant
avant traitement 10
5,3
UFC/L de L. pneumophila (Delgado-Viscogliosi et al. 2009) :
U le signal .mis par culture disparat aprs 30 minutes de traitement avec 500 mg/L de
glutarald.hyde. Cela signifie qu' partir de ce couple temps/concentration, il n'y a plus de
L. pneumophila cultivable.
U le signal .mis par la m.thode q-PCR, de l'ordre de 10
6
UG/L de L. pneumophila (10
5,3
UFC/L mesur.s par culture), varie peu au cours de l'exp.rimentation.
U le signal .mis par la m.thode v-PCR, de l'ordre de 10
6
UG/L de L. pneumophila (pour
1.10
5
UFC/L mesur. par culture), diminue fortement (4,5 log) pendant les 30 premires
minutes du traitement, ce qui semble indiquer une forte baisse du nombre de L.
pneumophila viables. La concentration en L. pneumophila viable remonte ensuite
progressivement (de 1 log en 48h).
Sur la base de ces r.sultats, Delgado-Viscogliosi et al. estiment le signal de v-PCR plus repr.sentatif
du potentiel pathog.nique d'une eau chaude sanitaire contenant des L. pneumophila, que celui
mesur. par q-PCR. Des essais doivent encore tre men.s pour v.rifier que cette m.thode est
utilisable dans le contexte des tours a.ror.frig.rantes (Delgado-Viscogliosi et al. 2009).
Anses
F.vrier 2011 page 86 / 144
D'aprs les .tudes men.es sur des eaux pr.par.es en laboratoire, dans des conditions id.ales de
croissance maitris.e et sans stress ajout. (d.sinfectant, traitement thermique, etc.), certaines
m.thodes (culture, q-PCR, TVC, immuno-d.tection) apparaissent .quivalentes. Tout .cart par rapport
ces conditions id.ales, notamment un traitement thermique de l'eau ou la pr.sence de chlore,
affecte les r.sultats de faon diff.rente selon les m.thodes et perturbe leur .quivalence.
8.4.2 Eaux environnementaIes
Aussi int.ressants que soient les r.sultats d'.tudes men.es avec des eaux exp.rimentales, dans le
cadre d'un travail portant sur des m.thodes d'analyse d'eaux environnementales en routine, les
.tudes qui g.nrent le plus d'informations pertinentes sont celles r.alis.es avec des eaux
environnementales.
L'analyse r.alis.e en systme ferm. cons.cutivement un traitement (thermique, chlore,
glutaraldehyde) semble confirmer que la m.thode par culture est susceptible de sous-estimer et la q-
PCR de surestimer le nombre de bact.ries viables. Ce dernier .l.ment doit toutefois tre pond.r. car
il est directement issu de la comparaison entre la q-PCR et la v-PCR dans des conditions diff.rentes
de celles appliqu.es aux .chantillons r.els, les auteurs .tant partis du principe que les r.sultats de
culture et v-PCR sont trs proches, sans le d.montrer (Delgado-Viscogliosi et al. 2009).
En effet, une partie des r.sultats de v-PCR a .t. g.n.r. en systme ferm.. Ces r.sultats ne tiennent
pas compte du fait qu'en conditions r.elles, le traitement d'une installation est g.n.ralement suivi d'un
rinage du systme, lequel .limine une grande partie des bact.ries en circulation, notamment les
bact.ries mortes.
Une grande partie des .tudes destin.es comparer des m.thodes de d.nombrement de Legionella,
men.es avec des eaux environnementales, portaient sur les m.thodes par culture et par q-PCR.
Ainsi, Wellinghausen et al. ont .tudi. le rapport entre les r.sultats de d.nombrement de Legionella
obtenus par culture et par q-PCR, sur 77 .chantillons d'eaux chaudes sanitaires (46C +/- 9C),
provenant de 3 h?pitaux, sans prendre en compte les .ventuels produits de traitement r.siduels
pr.sents dans ces .chantillons. Les cibles (L. spp., L. pneumophila et L. pneumophila sg1) ont .t.
d.nombr.es par culture (milieu GVPC) et par q-PCR (gne codant pour l'ARNr 16S pour L. spp et mip
pour L. pneumophila). Dans ces conditions, le coefficient de corr.lation observ. entre les r.sultats de
culture et ceux de q-PCR a .t. de 0,57 (Wellinghausen et al. 2001).
Toujours concernant les m.thodes par culture et par q-PCR, Joly et al. ont r.alis. une .tude sur 223
.chantillons d'eaux chaudes sanitaires et 37 .chantillons d'eau de tours a.ror.frig.rantes. L encore,
les .ventuels traitements, appliqu.s ces eaux avant les analyses, n'ont pas .t. pris en compte. L.
spp., L. pneumophila et L. pneumophila sg1 ont .t. d.nombr.es par culture (selon la norme Afnor NF
T90-431) et par q-PCR. Pour les analyses par biologie mol.culaire, la cible .tait le mme gne codant
pour l'ARNr 16S que celui utilis. par Wellinghausen pour L. spp et le gne mip pour L. pneumophila
utilis. par Cloud et al.(2000). La pr.sence d'inhibiteur de PCR a .t. observ.e dans 2,7% des
.chantillons de tours a.ror.frig.rantes et dans 0 et 2,3 % des .chantillons d'eaux chaudes sanitaires
selon les deux laboratoires ayant particip.s l'.tude.
Dans cette .tude, concernant les eaux de tours a.ror.frig.rantes, aucune corr.lation n'a pu tre mise
en .vidence entre les r.sultats de q-PCR et de culture, aussi bien pour les d.nombrements de L. spp
que de L. pneumophila. Dans ce type d'eau, il est fr.quent d'observer aprs l'analyse d'un .chantillon,
un r.sultat de q-PCR trs .lev. et un r.sultat de culture inf.rieur au seuil de d.tection.
Concernant les r.sultats d'analyse des eaux chaudes sanitaires, les coefficients de corr.lation
observ.s entre les r.sultats de culture et ceux de q-PCR pour L. spp et L. pneumophila sont
respectivement :
- de 0,1267 et 0,2369 dans le laboratoire 1 ;
- de 0,5259 et 0,7295 dans le laboratoire 2.
A noter que les eaux chaudes sanitaires analys.es par le laboratoire 1 provenaient de multiples
origines, alors que celles analys.es dans le laboratoire 2 provenaient d'un mme h?pital, ce qui peut
expliquer partiellement les diff.rences observ.es (Joly et al. 2006).
Anses
F.vrier 2011 page 87 / 144
Yaradou et al. (2007) ont r.alis.s une .tude portant sur 136 .chantillons d'eaux chaudes sanitaires
(provenant de 55 sites) et 49 .chantillons d'eau de tour a.ror.frig.rantes (provenant de 20 sites). L
encore, les .ventuels traitements, appliqu.s ces eaux avant les analyses, n'ont pas .t. pris en
compte. L. pneumophila a .t. d.nombr.e par q-PCR (selon la norme XP T 90-471) et par culture
(selon la norme Afnor NF T90-431). Les analyses par biologie mol.culaire ont .t. r.alis.es avec des
kits commerciaux. Les gnes cibles n'.taient donc pas pr.cis.s dans la publication. La pr.sence
d'inhibiteur de PCR a .t. observ.e dans 6,1 % des .chantillons de tours a.ror.frig.rantes et 2,9 %
des .chantillons d'eaux chaudes sanitaires.
Concernant les eaux de tours a.ror.frig.rantes, le coefficient de corr.lation observ. entre les
r.sultats de culture et ceux de q-PCR est de 0,187. Pour ce type d'eau, la valeur pr.dictive positive et
la valeur pr.dictive n.gative de la q-PCR sont respectivement de 53,6 % (53,6 % des r.sultats positifs
en q-PCR le sont aussi en culture) et 100 % (100 % des r.sultats n.gatifs en q-PCR le sont aussi en
culture).
Concernant les r.sultats d'analyse des eaux chaudes sanitaires, le coefficient de corr.lation observ.
entre les r.sultats de culture et ceux de q-PCR est de 0,732. Pour ce type d'eau, la valeur pr.dictive
positive et la valeur pr.dictive n.gative de la q-PCR sont respectivement de 57,5 % et de 80 %. Ces
r.sultats pourraient s'expliquer par une diff.rence de composition des eaux chaudes sanitaires et des
eaux de tours a.ror.frig.rantes (Yaradou et al. 2007).
Toujours concernant les eaux des tours a.ror.frig.rantes, une .tude comparative, men.e pendant 13
mois, sur 104 .chantillons, montre que la corr.lation entre les r.sultats obtenus par q-PCR et par
culture restent faibles, aussi bien pendant que en dehors des p.riodes de traitements de
d.contamination de l'eau r.alis.s avec le biocide HOBr-isothiozalone (Yaradou et al. 2007).
Par ailleurs, quelque soit le type d'.chantillon, un r.sultat de q-PCR non-quantifiable est trs souvent
associ. une concentration en Legionella inf.rieure 250 UFC/L (Joly et al. 2006).
Pour l'eau des tours a.ror.frig.rantes, il semble ne pas y avoir de corr.lation (Joly et al. 2006) ou une
corr.lation trs faible (r
2
= 0,19) (Yaradou et al. 2007) entre les r.sultats obtenus par q-PCR et par
culture.
En revanche, pour certaines eaux chaudes sanitaire, selon diff.rents auteurs, mme si le signal .mis
par q-PCR (en UG/L) est le plus souvent sup.rieur celui .mis par culture (en UFC/L), il semble
exister une relation lin.aire entre les r.sultats de d.nombrement de Legionella en UG/L obtenus par
q-PCR et ceux en UFC/L obtenus par culture (Joly et al. 2006; Wellinghausen et al. 2001; Yaradou et
al. 2007).
D'autres m.thodes de d.nombrement de Legionella ont .galement fait l'objet d'.tudes de
comparaison, men.es avec des eaux environnementales.
La m.thode culture-FSH a .t. r.cemment compar.e la culture classique (NF T90-431), pour
l'analyse d'eaux chaudes sanitaires. La concordance des deux m.thodes est de 82% (pourcentage
des r.sultats positifs avec les deux m.thodes ou n.gatifs avec les deux m.thodes). La sensibilit. du
test a .t. estim.e 91% (Ditommaso et al. 2010).
La m.thode DS a .galement .t. compar.e la m.thode par culture, en analysant plusieurs types
d'eaux environnementales (Delgado-Viscogliosi et al. 2005). Les r.sultats montrent que :
- les .chantillons d'eaux froides du robinet ou d'eaux souterraines ne r.vlent pas la pr.sence de
Legionella, ni par DS, ni par culture ;
- certains .chantillons d'eaux environnementales g.nrent un signal avec la m.thode DS et une
absence de signal par culture. L'inverse n'est jamais observ.. Pour leur grande majorit., ces
r.sultats correspondent des .chantillons d'eau chaude (plus de 45C). Ces r.sultats pourraient
tre le fait de la pr.sence de cellules VBNC dans les .chantillons.
Ainsi les r.sultats des deux m.thodes ne semblent pas pouvoir tre directement compar.s, l'une
mesurant les cellules viables (DS) et l'autre les cellules cultivables (culture). Une analyse plus fine
des r.sultats montre que ceux obtenus avec la m.thode DS (en cellules viables/L) pr.sentent une
relation lin.aire avec ceux obtenus par culture (en UFC/L) quand la concentration en Legionella est
sup.rieure ou .gale 1000 UFC/L (mesur.e par culture). En de de cette concentration, il n'y a pas
de corr.lation entre les r.sultats des deux m.thodes. Cependant, dans tous les cas les r.sultats
obtenus par DS (en cellules viables/L) sont syst.matiquement sup.rieurs ceux obtenus par culture
(UFC/L), parfois de plus de 2 log. Cela semble montrer que la m.thode DS est plus sensible que la
m.thode par culture sur ce type d'eau.
Anses
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De mme, l'immuno-d.tection a .galement .t. compar.e la culture. Aurell et al. (2004), ont r.alis.
une .tude sur 26 .chantillons d'eaux chaudes sanitaires. L. spp. et L. pneumophila ont .t.
d.nombr.es par culture (selon la norme SO 11731 modifi.e
45
Les r.sultats obtenus, par immunofluorescence avec d.tection par cytom.trie en phase solide
(1,4.10
3
et 4,1.10
6
cellules/L de L. pneumophila), sont syst.matiquement sup.rieurs ceux obtenus
par culture (1,2.10
2
et 1,1.10
4
UFC/L). Cependant, une faible corr.lation est mise en .vidence (r
2
=
0,46).
) et par immunofluorescence, coupl.e
une d.tection par cytom.trie en phase solide (cellules/L). Les anticorps utilis.s pour les analyses par
immunofluorescence .taient : un anticorp polyclonal de lapin anti-Lpsg1 (.labor. par l'.quipe l'aide
de diff.rents anticorps conjugu.s), 1 anticorp polyclonal commercial anti-Lpsg1 FTC, 3 anticorp
monoclonaux commerciaux anti-Lpsg(1-14), 1 anticorp monoclonal anti-Lpsg1, 1 anticorp monoclonal
anti-Lpsg(2-6,8-10,12-15) (Helbig et al. 1997) et 1 anticorp monoclonal anti-Lspp (lp inclus) (Helbig,
1997).
Pour certains .chantillons, la pr.sence de Legionella est r.v.l.e par immunofluorescence et non par
culture. Les .chantillons correspondants ayant .t. pr.lev.s des temp.ratures plus .lev.es que la
moyenne (55C), cette diff.rence de r.sultats pourrait s'expliquer par la pr.sence d'une plus grande
proportion de L. pneumophila sous formes viables non cultivables ou non viables (Aurell et al. 2004).
Concernant les traitements susceptibles d'affecter les r.sultats des diff.rentes m.thodes, seul le
traitement au chlore a .t. test. sur des eaux environnementales naturelles.
Actuellement, comme le confirme la circulaire DGS/SD7A n174, du 19 f.vrier 2007, il est pr.conis.,
en France, le maintien d'une concentration en chlore libre de 0,3 mg/L (ou en bioxyde de chlore de
0,15 mg/L) en sortie des r.servoirs et de 0,1 mg/L (ou en bioxyde de chlore de 0,05 mg/L) en tout
point du r.seau de distribution d'eau.
D'aprs une exp.rimentation men.e sur 6 .chantillons d'eaux environnementales (douches,
fontaines, eaux chaudes sanitaires, puits) soumises 10 mg/L de chlore, aprs 24h de traitement,
aucune Legionella viable n'a pu tre mise en .vidence, ni par DS, ni par culture (Delgado-Viscogliosi
et al. 2005). Cela semble indiquer que ce traitement est efficace pour tuer les Legionella dans une eau
environnementale (Kilvington and Price 1990). Delgado et al. estiment par ailleurs que les valeurs
pertinentes prendre en compte, pour .valuer le risque li. aux Legionella, d'un point de vue sanitaire,
doivent se situer entre les valeurs du signal .mis par la m.thode par culture (normalis.e) et celles du
signal .mit par la m.thode DS (Delgado-Viscogliosi et al. 2005).
Sur des eaux environnementales, dont la qualit. est trs variable en termes de charge en particules,
de compos.s chimiques et de microorganismes, les m.thodes de d.nombrement de Legionella, qui
ont fait l'objet de comparaisons, apparaissent rarement .quivalentes. N.anmoins, les corr.lations
observ.es entre les r.sultats des m.thodes compar.es sont sensiblement meilleures lorsque les eaux
sont relativement peu charg.es, comme celles des r.seaux domestiques, par comparaison avec des
eaux charg.es, comme celles des tours a.ror.frig.rantes.
De manire plus d.taill.e, concernant la comparaison des m.thodes par culture et par q-PCR :
- le signal .mis par q-PCR (exprim. en UG/L) est le plus souvent sup.rieur celui .mis par culture
(exprim. en UFC/L) ;
- quelque soit le type d'.chantillon analys., un r.sultat non-quantifiable par la m.thode q-PCR est
trs souvent associ. une concentration en Legionella inf.rieure 250 UFC/L ;
- dans le cas des eaux de tours a.ror.frig.rantes, il n'apparat pas ou peu de corr.lations entre les
r.sultats obtenus des deux m.thodes ;
- en revanche, dans le cas des eaux chaudes sanitaires, des corr.lations sont observ.es entre les
r.sultats des deux m.thodes ;
- les corr.lations observ.es sont meilleures dans le cas de d.nombrement de L. pneumophila
compar. celui de L. spp.
Concernant la comparaison des m.thodes par culture et par v-PCR :
- le signal .mis par la v-PCR (exprim. en UG/L) est le plus souvent compris entre les signaux .mis
par culture (exprim. en UFC/L) et par q-PCR ;
45
Norme SO 11731 modifi.e : 200 VL d'.chantillon ensemenc. en direct sur milieu GVPC ; 1 litre filtr. 0,2 Vm, remis en
suspension dans 5 mL et trait. par sonication (35 kHz), 100 VL ensemenc. sur milieu GVPC ; traitement thermique ou acide
appliqu. sur un bruit de fond est observ..
Anses
F.vrier 2011 page 89 / 144
- des corr.lations sont observ.es entre les r.sultats obtenus avec les deux m.thodes utilis.es sur
des eaux chaudes sanitaires ;
- D'aprs les .l.ments du paragraphe "5.2.2.5.1.", il apparat important de v.rifier si les r.sultats
pr.liminaires obtenus par v-PCR sont confirm.s en conditions r.elles, en particulier lorsque le
circuit a .t. purg. et que la norme NF T90-471 est utilis.e sans aucune modification aprs
l'.tape de concentration.
Concernant la comparaison des m.thodes par culture et par la m.thode FSH, une corr.lation est
observ.e entre les r.sultats des deux m.thodes : 82 % (double positifs ou double n.gatifs.
Concernant la comparaison des m.thodes par culture et par la m.thode DS :
- le signal .mis par l'DS est syst.matiquement plus fort que celui .mis par la culture ;
- la plupart des eaux dont la temp.rature est sup.rieure 45C g.nrent un signal avec la
m.thode DS et une absence de signal par culture. L'inverse n'est jamais observ. ;
- une corr.lation entre les deux m.thodes est observ.e pour les eaux fortement charg.es en
Legionella, alors qu'elle n'est pas observ.e pour les concentrations faibles ;
- la valeur pr.dictive n.gative de l'DS par rapport la culture est faible.
Concernant la comparaison des m.thodes par immuno-d.tection et par culture :
- le signal .mis par immunofluorescence (exprim. en cellules/L) est syst.matiquement plus fort
que celui .mis par culture (en UFC/L) ;
- certains .chantillons d'eau pr.lev.s une temp.rature sup.rieure 55C g.nrent un signal par
immunofluorescence et une absence de signal par culture. L'inverse n'est jamais observ. ;
- une faible corr.lation est observ.e entre les r.sultats obtenus par les deux m.thodes.
Concernant la comparaison des m.thodes par culture et par culture-FSH :
- des corr.lations peuvent tre observ.es entre les r.sultats obtenus sur des eaux chaudes
sanitaires. Les donn.es disponibles ne concernent pas les eaux de tours a.ror.frig.rantes.
Anses
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9 R.fIexion sur Ia signification des r.suItats et des vaIeurs cibIes
9.1 EI.ments prendre en compte dans I'interpr.tation des r.suItats des m.thodes
de d.nombrement de Legionella
9.1.1 Cons.quence de I'existence de Legionella viabIes non cuItivabIes et non viabIes vis--
vis des m.thodes de d.nombrement
Comme indiqu. pr.c.demment, le groupe de travail ne peut .carter le risque associ. la pr.sence
de VBNC dans un .chantillon d'eau. Ainsi, l'interpr.tation des r.sultats des m.thodes de
d.nombrement de Legionella qui ne prennent pas en compte les Legionella VBNC est d.licate,
particulirement quand les r.sultats de telles m.thodes ne mettent pas en .vidence la pr.sence de
bact.ries cultivables.
Par cons.quent, pour tre en mesure d'apporter une information complte d'un point de vue sanitaire,
le groupe de travail estime important qu'une m.thode de d.nombrement de Legionella comptabilise
aussi bien les Legionella viables cultivable que VBNC.
Par ailleurs, pour v.rifier l'efficacit. d'une d.sinfection, l'information int.ressante est la quantit. de
Legionella restant vivantes.
Ainsi, pour v.rifier l'efficacit. d'une d.sinfection, il peut tre int.ressant de disposer d'une m.thode de
d.nombrement de Legionella prenant en compte les seules Legionella viables, qu'elles soient
cultivables ou non.
l peut tre n.cessaire de v.rifier dans quelle mesure le renouvellement de l'eau, affecte le taux des
bact.ries viables par rapport aux non viables.
Or actuellement, aucune des m.thodes utilis.es sur le plan r.glementaire ou pour le suivi
d'installation ne permet de d.nombrer uniquement les Legionella viables. l existe des m.thodes
exp.rimentales susceptibles de pr.senter cette caract.ristique. Cependant elles n'ont pas encore .t.
test.es dans les conditions r.elles, et leur utilit., comme leur applicabilit. en analyse n'ont pas encore
.t. d.montr.es.
l faut noter qu'il peut tre envisag. d'utiliser des m.thodes de d.nombrement de Legionella
diff.rentes en fonction de l'objectif de leur mise en 8uvre et du contexte de leur utilisation.
9.1.2 Cons.quence de I'association de Legionella avec Ies amibes
Comme .voqu. pr.c.demment, la corr.lation entre les r.sultats obtenus par q-PCR et par culture est
souvent faible. L'analyse de certains .chantillons produit des signaux de q-PCR relativement
importants alors que les signaux obtenus par culture partir du mme .chantillon sont relativement
faibles (inf.rieur 1000 UFC/L). Les connaissances actuelles ne permettent pas de savoir si ces
.chantillons sont plus infectieux que ceux pr.sentant des signaux faibles avec les deux m.thodes.
Une incertitude persiste quant la signification sanitaire de tels r.sultats. L'une des hypothses
avanc.es pour les expliquer est la pr.sence dans l'eau d'amibes contenant de grandes quantit.s de
Legionella (qui seraient d.tectables par q-PCR mais pas par culture) et de faibles quantit.s de
Legionella sous formes libres dans l'eau (qui seraient d.tectables aussi bien par q-PCR que par
culture). Dans cette hypothse, ces r.sultats pourraient r.v.ler un plus grand risque sanitaire qu'en
cas de signaux similaires obtenus par q-PCR et par culture (Joly et al. 2006). A noter cependant que
les recherches bibliographiques men.es par le groupe de travail n'ont pas permis de mettre en
.vidence de r.f.rence qui confirme ou infirme la capacit. des diff.rentes m.thodes existantes
d.nombrer les Legionella contenues dans des amibes.
Certaines .tudes remettent en question l'importance que la virulence intrinsque de Legionella joue
dans les processus d'infection chez les protozoaires et les humains. Ces .tudes .voquent par ailleurs
l'hypothse d'une relation pr.alable n.cessaire entre un protozoaire et une Legionella pour le
d.veloppement d'une infection chez l'homme (Berk et al. 1998; Fields et al. 2002; Philippe et al.
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F.vrier 2011 page 91 / 144
2006). Certains pathognes intracellulaires des vert.br.s, seraient susceptibles d'acqu.rir leur
virulence en r.ponse une pr.dation par des protozoaires, pour faciliter leur survie intracellulaire et
l'infection de l'h?te (Abu Kwaik et al. 1998; Fields 1996; Fields et al. 2002).
L'association de L. pneumophila et d'Acanthamoeba polyphaga semble par ailleurs leur procurer
toutes deux un avantage en termes de r.sistance aux traitements de d.sinfection au chlore
(Kilvington and Price 1990). En effet, la concentration en chlore n.cessaire pour rendre L.
pneumophila non cultivable est moins importante pour les bact.ries pr.sentes dans la phase
planctonique que pour celle en endosymbiose avec A. polyphaga. De la mme manire A. polyphaga
r.siste mieux au chlore en pr.sence de L. pneumophila (Garcia et al. 2007). L. pneumophila semble
.galement plus r.sistante des traitements de d.sinfection au cuivre ou l'argent quant la bact.rie
est en endosymbiose avec A. polyphaga (Hwang et al. 2006).
Garcia et al. suggrent, pour disposer de r.sultats plus facilement interpr.tables d'un point de vue
sanitaire, de rechercher les protozoaires dans les eaux risque en parallle de L. pneumophila. ls
estiment que pour tre consid.r. efficace pour la lutte contre les Legionella, un traitement doit
.galement permettre l'.limination des protozoaires. ls suggrent donc de mener cette double
recherche pour v.rifier l'efficacit. des traitements mis en 8uvre en cas de contamination d'eau
av.r.e par L. pneumophila (Garcia et al. 2007).
Les diff.rentes .tudes cit.es ici mettent en .vidence l'importance des interactions entre amibes et
Legionella, dans l'.cologie microbienne de ces dernires. Les amibes sont des r.servoirs av.r.s de
Legionella et les protgeraient des facteurs environnementaux, notamment vis--vis des traitements
de d.sinfection. Le groupe de travail souligne donc l'int.rt de recherches d'amibes en compl.ment
des d.nombrements de Legionella dans l'eau, particulirement dans certains contextes, comme le
suivi de l'efficacit. de traitement. l est cependant important de noter ici la relative complexit. de la
mise en 8uvre, en routine, de m.thodes de recherche d'amibes dans l'eau et les d.veloppements
encore n.cessaires pour en am.liorer et homog.n.iser les performances.
9.1.3 Cons.quence de I'association de Legionella avec Ie biofiIm
Actuellement, dans le cadre du contr?le sanitaire, les Legionella sont recherch.es dans des
pr.lvements d'eau planctonique, que ce soit dans les r.seaux d'eau chaude sanitaire ou dans les
tours a.ror.frig.rantes.
Comme pr.c.demment indiqu. L. pneumophila est capable de survivre dans le biofilm des
canalisations (Fields et al. 2002; Frre 2009; Kuiper et al. 2004), de s'y multiplier en pr.sence
d'amibes comme Hartmannella vermiformis (Abu Kwaik et al. 1998; Kuiper et al. 2004; Murga et al.
2001), voire peut-tre de s'y multiplier en dehors de cellules de protozoaires h?tes (Fields et al. 2002;
Rogers and Keevil 1992).
Ainsi L. pneumophila peut avoir .t. .limin.e de l'eau libre et persister dans les biofilms la surface
des canalisations. L'absence de L. pneumophila dans un pr.lvement d'eau ne signifierait donc pas
n.cessairement que L. pneumophila est totalement absente du r.seau dans lequel le pr.lvement a
.t. effectu..
Fields et al. suggrent de rechercher les Legionella dans les biofilms des r.seaux d'eaux chaudes,
pour une meilleure efficacit. des contr?les sanitaires et pour faciliter l'interpr.tation de leurs r.sultats
(Fields et al. 2002).
Bien qu'.tant la marge du champ de la pr.sente saisine, la recherche de Legionella dans le biofilm
apporterait probablement une information int.ressante aussi bien d'un point de vue sanitaire que pour
la gestion des installations. Toutefois, la complexit. d'un tel d.nombrement, particulirement en ce qui
concerne le pr.lvement, est soulign.e cause du caractre exp.rimental des m.thodes propos.es
jusqu'ici et de la n.cessit. de mener un important travail de d.veloppement de ces m.thodes dans
l'hypothse oM leur mise en 8uvre grande .chelle serait envisag.e. En l'.tat actuel des
connaissances, il n'est envisageable de les utiliser que dans le cadre de recherches ou d'.tudes
sp.cifiques.
Anses
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9.2 SeuiIs de gestion et mesures pr.conis.es par Ia r.gIementation en vigueur
Les .l.ments rassembl.s dans ce chapitre ne concernent que la surveillance de routine des
installations risque, hors cas de l.gionellose d.clar.. Les investigations environnementales men.es
pour tenter d'identifier l'origine des cas de l.gionellose d.clar.s sont r.alis.es au cas par cas.
Certains auteurs (Lee and Joseph 2002) ou groupes d'experts (CSHPF 2005) proposent, des guides
pour mener ces investigations, mais ces derniers ne sont pas d.crits ici.
9.2.1 Cas g.n.raI des eaux chaudes sanitaires
La Direction g.n.rale de la sant. a fix. des "prescriptions techniques applicables aux installations
collectives de production, de stockage et de distribution d'eau chaude sanitaire qui alimentent les
ztablissements de santz, les ztablissements sociaux et mzdico-sociaux, les ztablissements
pznitentiaires, les htels et rzsidences de tourisme, les campings et les autres ztablissements
recevant du public qui possdent des points d'usage [ risque
46
D "Les dznombrements en Legionella pneumophila doivent tre infzrieurs [ 1 000 unitzs
formant colonie par litre (UFC/L) au niveau de tous les points d'usage [ risque.
" (Arrt. du 1er f.vrier 2010) :
D Dans les ztablissements de santz, les dznombrements en Legionella pneumophila doivent
tre infzrieurs au seuil de dztection au niveau de tous les points d'usage [ risque accessibles
[ des patients identifizs par le comitz de lutte contre les infections nosocomiales ou toute
organisation chargze des mmes attributions comme particulirement vulnzrables au risque
de lzgionellose.
D Lorsque ces seuils ne sont pas respectzs, le responsable des installations prend sans dzlai
les mesures correctives nzcessaires au rztablissement de la qualitz de l'eau et [ la protection
des usagers."
9.2.2 Cas des eaux chaudes sanitaires dans Ies .tabIissements de sant.
La Direction g.n.rale de la sant., pr.conise diff.rents types dSactions en fonction des concentrations
en Legionella mesur.es aux points dSusages des installations dSeau chaude des .tablissements de
sant. (Circulaire DGS 2002/243). Ces pr.conisations sont adapt.es la majeure partie de la
population hospitalire. Pour les patients dits " haut risque
47
LSobjectif cible est de maintenir la concentration en Legionella pneumophila un niveau inf.rieur 10
UFC/L dSeau. Cela suppose un "entretien rzgulier des rzseaux et des zquipements", et une
"surveillance rzgulire des paramtres physiques (tempzrature) et microbiologiques de l'eau". Des
actions sont pr.conis.es ds que la concentration en L. pneumophila atteint 10
3
UFC/L dSeau, en
commenant par une alerte des autorit.s et la mise en place de mesures pouvant aller jusqu' des
restrictions d'usages et des actions curatives :
", les mesures de pr.vention particulires
n.cessaires sont pr.cis.es ma fin de ce chapitre.
"Mesures de base :
D sassurer que linformation est adressze sans dzlai [ lensemble des personnels en charge de
la gestion de leau, du Centre de coordination de la lutte contre les infections nosocomiales
(CCLIN), de lzquipe opzrationnelle dhygine et des services concernzs ;
D comprendre lorigine des zcarts avec les rzsultats des analyses antzrieures et rechercher les
causes de la prolifzration ;
D zvaluer lztendue de la contamination du rzseau ;
D mettre en uvre les mesures nzcessaires [ la ma#trise de la concentration en Legionella
(dztartrage, purge, rzglage de la tempzrature, travaux) ;
D renforcer la surveillance des paramtres physiques et microbiologiques.
Selon limportance de la prolifzration :
46
L'arrt. du 1er f.vrier 2010 relatif la surveillance des l.gionelles dans les installations de production, de stockage et de
distribution d'eau chaude sanitaire, d.finit point d'usage risque comme tout point d'usage accessible au public et
pouvant produire des azrosols d'eau chaude sanitaire susceptible d'tre contaminze par les lzgionelles ; il s'agit notamment des
douches, des douchettes, des bains [ remous ou [ jets. L
47
La Circulaire DGS 2002/243 d.finit les patients dits "patients haut risque" sont les immunod.prim.s s.vres, et
particulirement les immunod.prim.s aprs transplantation ou greffe dSorgane et les immunod.prim.s par corticoth.rapie
prolong.e (0,5 mg/kg de prednisone pendant 30 jours ou plus, ou .quivalent) ou r.cente et haute dose (cSest--dire
sup.rieure 5 mg/kg de prednisone pendant plus de 5 jours).
Anses
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D mettre en uvre les actions curatives nzcessaires (nettoyage et dzsinfection, purge, montze
en tempzrature) ;
D assurer une information adaptze des malades accompagnze de conseils ;
D en fonction de lanalyse bznzfice/risque faite au cas par cas, supprimer les usages [ risque
(bains bouillonnants, douches) et mettre en uvre des moyens permettant de limiter
lexposition aux azrosols (lavage au gant, bain) ;
D suivre lefficacitz des mesures mises en uvre."
Les actions doivent tre appliqu.es jusquS un retour des niveaux de contamination inf.rieurs
cette valeur (Circulaire DGS 2002/243). La Circulaire DGS 2005/315 pr.cise que :
D "si le bulletin d'analyse porte un rzsultat chiffrz infzrieur ou zgal [ 10
3
UFC/L de L.
pneumophila ou indique le rzsultat "< 250 UFC/L", quelle que soit la mention complzmentaire
apportze, le przlvement respecte l'objectif cible de qualitz ;
D si le bulletin d'analyse porte la mention "ininterprztable" ou "przsence d'une flore interfzrente
empchant la dztection des L. pneumophila" ou "przsence de L. pneumophila non
quantifiables en raison de la przsence d'une flore interfzrente", la conformitz du rzsultat
d'analyse par rapport [ l'objectif cible ne peut tre estimze et un przlvement de contrle doit
tre reprogrammz."
Pour les patients "[ haut risque", la Circulaire DGS 2002/243 indique que "des mesures de przvention
particulires sont przciszes. Leau soutirze au niveau des points dusage [ risque doit respecter en
permanence une concentration en Legionella pneumophila infzrieure au seuil de dztection (50 UFC/L
mesurzs par culture). Les points dusage [ risque pour les patients [ haut risque correspondent aux
points dusage susceptibles dexposer ces patients [ un azrosol ; il sagit en particulier des douches.
Chaque ztablissement devra dzfinir, en liaison avec le CCLIN, des mesures spzcifiques pour les
patients [ haut risque lorsquil nest pas possible dassurer en permanence une concentration en
Legionella pneumophila infzrieure au seuil de dztection dans leau du rzseau alimentant les points
dusage [ risque". La Circulaire DGS 2005/315 pr.cise que :
D "si le bulletin d'analyse mentionne un rzsultat chiffrz ou porte la mention "przsence de L.
pneumophila non quantifiables" ou la mention "przsence de L. pneumophila non quantifiables
en raison de la przsence d'une flore interfzrente", des restrictions d'usage et des actions
curatives doivent tre mises en uvre par l'ztablissement de santz.
D si le bulletin d'analyse porte la mention "ininterprztable" ou "przsence d'une flore interfzrente
empchant la dztection des L. pneumophila" (quel que soit le rzsultat exprimz < 25 000
UFC/L ou < 2 500 UFC/L, etc.), la conformitz du rzsultat d'analyse ne peut tre estimze et un
przlvement de contrle doit tre reprogrammz. Les modalitzs de gestion du risque devront
tre apprzcizes au cas par cas en fonction des zlzments de contexte."
9.2.3 Cas des tours a.ror.frig.rantes et autres instaIIations risque
Actuellement, des rgles .dict.es par les ministres en charge de l'environnement et de la sant.
existent pour la surveillance et les niveaux d'intervention en fonction des concentrations en Legionella
dans les installations risque.
- article 8 (Arrt. du 13 d.cembre 2004) :
L'arrt. du 13 d.cembre 2004 relatif aux installations de refroidissement par dispersion d'eau dans un
flux d'air soumises autorisation au titre de la rubrique (num.ro 2921) pr.cise :
"La frzquence des przlvements et analyses de Legionella spp selon la norme NF T90-431 est au
minimum mensuelle pendant la pzriode de fonctionnement de linstallation.
Si, pendant une pzriode dau moins 12 mois continus, les rzsultats des analyses mensuelles sont
infzrieurs [ 1 000 unitzs formant colonies par litre deau, la frzquence des przlvements et analyses
des Legionella spp selon la norme NF T90-431 pourra tre au minimum trimestrielle.
Si un rzsultat dune analyse en lzgionelles est supzrieur ou zgal [ 1 000 unitzs formant colonies par
litre deau, ou si la przsence de flore interfzrente rend impossible la quantification de Legionella spp, la
frzquence des przlvements et analyses des Legionella spp selon la norme NF T90-431 devra tre de
nouveau au minimum mensuelle"
- article 9 (Arrt. du 13 d.cembre 2004) :
"1. Les actions [ mener si la concentration mesurze en Legionella spp est supzrieure ou zgale
[ 100 000 unitzs formant colonies par litre d'eau selon la norme NF T90-431 :
a) l'exploitant arrte, dans les meilleurs dzlais, l'installation de refroidissement, (...), et rzalise la
vidange, le nettoyage et la dzsinfection de l'installation de refroidissement. (...)
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Ds rzception des rzsultats selon la norme NF T90-431, l'exploitant en informe
immzdiatement l'inspection des installations classzes (...)
b) Avant la remise en service de l'installation, il procde [ une analyse mzthodique des risques
de dzveloppement des lzgionelles dans l'installation, telle que przvue [ l'article 6.1, ou [
l'actualisation de l'analyse existante, en prenant notamment en compte la conception de
l'installation, sa conduite, son entretien et son suivi. (...)
L'exploitant met en place les mesures d'amzlioration przvues et dzfinit les moyens susceptibles
de rzduire le risque. Les modalitzs de vzrification de l'efficacitz de ces actions avant et aprs
remise en service de l'installation sont dzfinies par des indicateurs tels que des mesures
physico-chimiques ou des analyses microbiologiques.
c) Aprs remise en service de l'installation, l'exploitant vzrifie immzdiatement l'efficacitz du
nettoyage et des autres mesures prises selon les modalitzs dzfinies przczdemment. Quarante-
huit heures aprs cette remise en service, l'exploitant rzalise un przlvement, pour
analyse des lzgionelles selon la norme NF T90-431. (...)
d) Les przlvements et les analyses en Legionella spp selon la norme NF T90-431 sont
ensuite effectuzs tous les quinze jours pendant trois mois. En cas de dzpassement de la
concentration de 10 000 unitzs formant colonies par litre d'eau sur un des przlvements
prescrits ci-dessus, l'installation est [ nouveau arrtze dans les meilleurs dzlais et l'ensemble
des actions prescrites ci-dessus sont renouvelzes.
e) Dans le cas des installations dont l'arrt immzdiat przsenterait des risques importants pour le
maintien de l'outil ou la szcuritz de l'installation et des installations associzes, la mise en uvre
de la proczdure d'arrt sur plusieurs jours pourra tre stoppze, sous rzserve qu'il n'y ait pas
d'opposition du przfet [ la poursuite du fonctionnement de l'installation de refroidissement, si le
rzsultat selon la norme NF T90-431 d'un przlvement effectuz pendant la mise en uvre de la
proczdure d'arrt est infzrieur [ 100 000 unitzs formant colonies par litre d'eau. La remise en
fonctionnement de l'installation de refroidissement ne dispense pas l'exploitant de la rzalisation
de l'analyse de risques, de la mise en uvre d'une proczdure de nettoyage et dzsinfection, et
du suivi de son efficacitz. Les przlvements et les analyses en Legionella spp selon la
norme NF T90-431 sont ensuite effectuzs tous les huit jours pendant trois mois.
En fonction des rzsultats de ces analyses, l'exploitant met en uvre les dispositions suivantes :
en cas de dzpassement de la concentration de 10 000 unitzs formant colonies par litre
d'eau, l'exploitant rzalise ou renouvelle les actions przvues au point 1.b (...);
en cas de dzpassement de la concentration de 100 000 unitzs formant colonies par litre
d'eau, l'installation est arrtze dans les meilleurs dzlais et l'exploitant rzalise l'ensemble des
actions prescrites aux points 1 a [ 1 c du przsent article.
Le przfet pourra autoriser la poursuite du fonctionnement de l'installation, (...)
2. Actions [ mener si la concentration mesurze en Legionella spp est supzrieure ou zgale [ 1
000 unitzs formant colonies par litre d'eau et infzrieure [ 100 000 unitzs formant colonies par
litre d'eau.
(...) l'exploitant prend des dispositions pour nettoyer et dzsinfecter l'installation de faHon [
s'assurer d'une concentration en Legionella spp infzrieure [ 1 000 unitzs formant colonies par
litre d'eau. La vzrification de l'efficacitz du nettoyage et de la dzsinfection est rzalisze par
un przlvement selon la norme NF T90-431 dans les deux semaines conszcutives [
l'action corrective. Le traitement et la vzrification de l'efficacitz du traitement sont
renouvelzs tant que la concentration mesurze en Legionella spp est supzrieure ou zgale
[ 1 000 unitzs formant colonies par litre d'eau et infzrieure [ 100 000 unitzs formant colonies
par litre d'eau.
A partir de trois mesures conszcutives indiquant des concentrations supzrieures [ 1 000
unitzs formant colonies par litre d'eau, l'exploitant devra proczder [ l'actualisation de l'analyse
mzthodique des risques de dzveloppement des lzgionelles dans l'installation, przvue [ l'article
6, en prenant notamment en compte la conception de l'installation, sa conduite, son entretien,
son suivi. (...)
3. Actions [ mener si le rzsultat de l'analyse selon la norme NF T90-431 rend impossible la
quantification de Legionella spp en raison de la przsence d'une flore interfzrente.
(...) l'exploitant prend des dispositions pour nettoyer et dzsinfecter l'installation de faHon [ s'assurer
d'une concentration en Legionella spp infzrieure [ 1 000 unitzs formant colonies par litre d'eau."
- dans son article 9 (Arrt. du 13 d.cembre 2004) :
"Leau dappoint respecte au niveau du piquage les critres microbiologiques et de matires en
suspension suivants
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Legionella spp < seuil de quantification de la technique normalisze utilisze.
Numzration de germes azrobies revivifiables [ 37 C < 1 000 germes/mL.
Matires en suspension : < 10 mg/L.
Lorsque ces qualitzs ne sont pas respectzes, leau dappoint fera lobjet dun traitement permettant
latteinte des objectifs de qualitz ci-dessus. Dans ce cas, le suivi de ces paramtres sera rzalisz au
moins deux fois par an dont une pendant la pzriode estivale."
"7.1. Actions [ mener si la concentration mesurze en Legionella specie est supzrieure ou zgale
[ 100 000 unitzs formant colonies par litre deau selon la norme NF T90-431
L'arrt. du 13 d.cembre 2004 relatif aux prescriptions g.n.rales applicables aux installations
class.es pour la protection de lSenvironnement soumises d.cIaration sous la rubrique n 2921,
pr.cise dans son annexe , Titre , 7. "Actions mener en cas de prolif.ration de l.gionelles" :
a. Si les rzsultats des analyses en lzgionelles selon la norme NF T90-431, rzaliszes en
application de l'ensemble des dispositions qui przcdent, mettent en zvidence une
concentration en Legionella specie supzrieure ou zgale [ 100 000 unitzs formant colonies par
litre deau, lexploitant arrte dans les meilleurs dzlais l'installation de refroidissement, () et
rzalise la vidange, le nettoyage et la dzsinfection de l'installation de refroidissement. ()
Ds rzception des rzsultats selon la norme NF T90-431, l'exploitant en informe immzdiatement
linspection des installations classzes par tzlzcopie avec la mention urgent & important tour
azrorzfrigzrante - dzpassement du seuil de 100 000 unitzs formant colonies par litre d'eau L.
()
b. Avant la remise en service de l'installation, il procde [ une analyse mzthodique des risques
de dzveloppement des lzgionelles dans l'installation, () ou [ l'actualisation de l'analyse
existante, en prenant notamment en compte la conception de l'installation, sa conduite, son
entretien, son suivi. Cette analyse des risques doit permettre de dzfinir les actions correctives
visant [ rzduire les risques de dzveloppement des lzgionelles et de planifier la mise en uvre
des moyens susceptibles de rzduire ces risques. () L'exploitant met en place les mesures
d'amzlioration przvues et dzfinit les moyens susceptibles de rzduire le risque. Les modalitzs de
vzrification de l'efficacitz de ces actions avant et aprs remise en service de l'installation sont
dzfinies par des indicateurs tels que des mesures physico-chimiques ou des analyses
microbiologiques.
c. Aprs remise en service de l'installation, l'exploitant vzrifie immzdiatement l'efficacitz du
nettoyage et des autres mesures prises selon les modalitzs dzfinies przczdemment. Quarante
huit heures aprs cette remise en service, l'exploitant rzalise un przlvement, pour analyse des
lzgionelles selon la norme NF T90-431. Ds rzception des rzsultats de ce przlvement, un
rapport global sur l'incident est transmis [ l'inspection des installations classzes. ()
d. Les przlvements et les analyses en Legionella specie selon la norme NF T90-431 sont
ensuite effectuzs tous les 15 jours pendant trois mois. En cas de dzpassement de la
concentration de 10 000 unitzs formant colonies par litre d'eau sur un des przlvements
prescrits ci-dessus, l'installation est [ nouveau arrtze dans les meilleurs dzlais et l'ensemble
des actions prescrites ci-dessus sont renouvelzes.
e. Dans le cas des installations dont l'arrt immzdiat przsenterait des risques importants pour le
maintien de l'outil ou la szcuritz de l'installation et des installations associzes, la mise en uvre
de la proczdure d'arrt sur plusieurs jours pourra tre stoppze, sous rzserve qu'il n'y ait pas
d'opposition du przfet [ la poursuite du fonctionnement de l'installation de refroidissement, si le
rzsultat selon la norme NF T90-431 d'un przlvement effectuz pendant la mise en uvre de la
proczdure d'arrt est infzrieur [ 100 000 unitzs formant colonies par litre d'eau. La remise en
fonctionnement de l'installation de refroidissement ne dispense pas l'exploitant de la rzalisation
de l'analyse de risques, de la mise en uvre d'une proczdure de nettoyage et dzsinfection, et
du suivi de son efficacitz. Les przlvements et les analyses en Legionella specie selon la norme
NF T90-431 sont ensuite effectuzs tous les 8 jours pendant trois mois. En fonction des rzsultats
de ces analyses, l'exploitant met en uvre les dispositions suivantes :
- En cas de dzpassement de la concentration de 10 000 unitzs formant colonies par litre
d'eau, l'exploitant rzalise ou renouvelle les actions przvues au point 7.1.b du przsent titre
() ;
- En cas de dzpassement de la concentration de 100 000 unitzs formant colonies par litre
d'eau, l'installation est arrtze dans les meilleurs dzlais et l'exploitant rzalise l'ensemble des
actions prescrites aux points 7.1.a [ 7.1.c du przsent titre. Le przfet pourra autoriser la
poursuite du fonctionnement de l'installation, sous rzserve que l'exploitant mette
immzdiatement en uvre des mesures compensatoires ().
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F.vrier 2011 page 96 / 144
7.2. Actions [ mener si la concentration mesurze en Legionella specie est supzrieure ou zgale
[ 1 000 unitzs formant colonies par litre deau et infzrieure [ 100 000 unitzs formant colonies
par litre d'eau selon la norme NF T90-431
Si les rzsultats danalyses rzaliszes en application de l'ensemble des dispositions qui przcdent
mettent en zvidence une concentration en Legionella specie selon la norme NF T90-431
supzrieure ou zgale [ 1 000 unitzs formant colonies par litre d'eau et infzrieure [ 100 000 unitzs
formant colonies par litre d'eau, lexploitant prend des dispositions pour nettoyer et dzsinfecter
l'installation de faHon [ s'assurer d'une concentration en Legionella specie infzrieure [ 1 000
unitzs formant colonies par litre d'eau. La vzrification de l'efficacitz du nettoyage et de la
dzsinfection est rzalisze par un przlvement () dans les deux semaines conszcutives [
laction corrective. Le traitement et la vzrification de l'efficacitz du traitement sont renouvelzs
tant que la concentration mesurze en Legionella specie est supzrieure ou zgale [ 1 000 unitzs
formant colonies par litre deau et infzrieure [ 100 000 unitzs formant colonies par litre d'eau
A partir de trois mesures conszcutives indiquant des concentrations supzrieures [ 1 000 unitzs
formant colonies par litre d'eau, l'exploitant devra proczder [ l'actualisation de l'analyse
mzthodique des risques de dzveloppement des lzgionelles dans l'installation, (). L'exploitant
tient les rzsultats des mesures et des analyses de risques effectuzes [ la disposition de
l'inspection des installations classzes.
7.3. Actions [ mener si le rzsultat dzfinitif de l'analyse rend impossible la quantification de
Legionella specie en raison de la przsence d'une flore interfzrente
Sans przjudice des dispositions przvues aux points 7.1 et 7.2, si le rzsultat dzfinitif de l'analyse
rend impossible la quantification de Legionella specie en raison de la przsence d'une flore
interfzrente, lexploitant prend des dispositions pour nettoyer et dzsinfecter l'installation de faHon
[ s'assurer d'une concentration en Legionella specie infzrieure [ 1000 unitzs formant colonies
par litre d'eau."
9.3 Signification sanitaire des vaIeurs cibIes actueIIes
9.3.1 Cas g.n.raI
La plupart des m.thodes de d.nombrement de Legionella donnent peu d'information sur le niveau
d'infectiosit. des bact.ries d.nombr.es. Par ailleurs, actuellement les informations sur la dose
infectante et la relation concentration dans l'eau/concentration dans les a.rosols restent parcellaires.
Cela rend les r.sultats de d.nombrement de Legionella difficiles interpr.ter d'un point du vue
sanitaire (Yaradou et al. 2007).
Cependant, des Legionella infectieuses pr.sentes dans un environnement ont une probabilit. d'autant
plus grande de provoquer une infection, qu'elles sont pr.sentes en grand nombre. En effet, plus elles
sont nombreuses, plus leurs chances de r.sister aux conditions environnementales sont .lev.es
(Delgado-Viscogliosi et al. 2005).
Anses
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9.3.2 Cas des eaux chaudes sanitaires
Pour la population g.n.rale, les auteurs admettent que Legionella pneumophila pr.sente un risque
pour la sant. humaine, quand la densit. de cellules est sup.rieure 10
4
ou 10
5
UFC par litre
(mesur.e par culture) d'eau chaude sanitaire, malgr. l'absence de dose-r.ponse connue chez
l'homme. Les donn.es .pid.miologiques montrent que le risque de survenue de l.gionellose est
accru partir de ces concentrations (Bauer et al. 2008; Delgado-Viscogliosi et al. 2009; Meenhorst et
al. 1985; Patterson et al. 1994). Ceci n'est pas valable pour les patients dits "haut risque", lesquels
sont plus sensibles aux infections et susceptibles de contracter une l.gionellose avec des densit.s en
Legionella bien inf.rieures.
Selon les donn.es de la litt.rature, la valeur sanitaire en dessous de laquelle le risque de l.gionellose
est n.gligeable ou acceptable pour la population g.n.rale est comprise entre 10
4
ou 10
5
UFC/L en L.
pneumophila, malgr. l'absence de dose-r.ponse connue chez l'homme.
Pour la population g.n.rale, la r.glementation franaise actuelle relative aux eaux chaudes
sanitaires, est plus exigeante d'un facteur 10 et fixe la concentration ne pas d.passer 10
3
UFC/L
L. pneumophila. Cela permet de conserver une marge de s.curit. par rapport au risque estim..
Compte tenu des connaissances actuelles, le groupe de travail estime qu'il n'est pas justifi. de
proposer une modification des seuils r.glementaires actuellement utilis.s pour exploiter les r.sultats
de d.nombrement obtenus par culture (selon la norme NF T90-431).
En revanche, pour les patients "haut risque" (immunod.prim.s), l'examen de la litt.rature, n'a pas
permis de mettre en .vidence une concentration en Legionella dans une eau chaude sanitaire en
dessous duquel il ne serait plus observ. de cas de l.gionelloses. De surcrot, contrairement la
population g.n.rale, les patients "haut risque" sont susceptibles d'tre infect.s par d'autres
espces de Legionella que L. pneumophila. Pour ces patients, il est pr.f.rable de conserver une
valeur cible inf.rieure au seuil de quantification en L. pneumophila (selon la norme NF T90-431) et
d'analyser le risque vis--vis de Legionella .largie toute espce (Legionella spp.).
9.3.3 Cas des tours a.ror.frig.rantes
La concentration en Legionella (incluant L. pneumophila) dans les tours a.ror.frig.rantes peut varier
consid.rablement en trs peu de temps. Ces oscillations refltent le caractre dynamique de ces
.cosystmes dans lesquels de nombreuses espces de bact.ries ou de protozoaires adh.rent entre
eux pour former des biofilms dans les installations. Comme indiqu. pr.c.demment, cette association
peut contribuer la moindre sensibilit. aux biocides utilis.s pour le nettoyage et la d.sinfection des
installations ou la modification de certaines caract.ristiques de Legionella, comme leur virulence.
Les fluctuations de densit. en Legionella observ.es peuvent compliquer l'.tablissement de valeurs
cibles r.glementaires et de rgles sp.cifiant la fr.quence minimum des mesures n.cessaires pour
maintenir les tours a.ror.frig.rantes sous contr?le et .viter des dispersions importantes de Legionella
dans leur voisinage (Ragull et al. 2007).
A ce jour, aucune .pid.mie li.e une tour a.ror.frig.rante n'a .t. attribu.e une autre espce de
Legionella que L. pneumophila. Pour la population g.n.rale, le risque .tant li. L. pneumophila et
non Legionella spp, il semble plus opportun de d.nombrer L. pneumophila plut?t que L. species, tout
en conservant les mmes valeurs de seuils d'action et d'arrt (respectivement 10
3
et 10
5
UFC/L).
Toutefois, dans le cadre de la gestion des installations, la recherche de L. spp reste un indicateur
pertinent de dysfonctionnement.
9.4 D.termination de vaIeurs cibIes pour Ies m.thodes aIternatives Ia cuIture.
Un examen de la litt.rature a permis de mettre en .vidence quelques tentatives destin.es proposer
des valeurs cibles, pour des m.thodes alternatives, qui correspondent aux valeurs cibles utilis.s pour
l'interpr.tation des r.sultats obtenus par culture (selon la norme Afnor NF T90-431). L'essentiel de
ces tentatives portent sur la q-PCR. Le pr.sent chapitre a pour but d'en faire un bilan.
Anses
F.vrier 2011 page 98 / 144
9.4.1 Cas des eaux chaudes sanitaires
Dans leur .tude portant sur 223 .chantillons d'eaux chaudes sanitaires, d.j .voqu.e dans le
chapitre relatif la comparaison des m.thodes de ce rapport, Joly et al., ont mis en .vidence des
valeurs de corr.lations entre les r.sultats de culture et ceux de q-PCR (r
2
= 0,1267 et 0,2369
respectivement de pour L. spp et L. pneumophila dans le laboratoire 1 de l'.tude ; r
2
= 0,5259 et
0,7295 respectivement pour L. spp et L. pneumophila dans le laboratoire 2 de l'.tude). Sur la base de
cette observation, Joly et al., ont tent. de d.terminer une valeur seuil en q-PCR correspondant des
eaux contenant plus de 10
3
UFC/L Legionella mesur.es par culture (seuil utilis. pour l'interpr.tation
des r.sultats en culture), l'aide d'une courbe de ROC
48
- pour le d.nombrement de L. spp :
pour obtenir un maximum de sensibilit. et de
sp.cificit.. l en ressort que (Joly et al. 2006) :
U une valeur cible en q-PCR de 2,9. 10
4
UG/L permettrait d'obtenir 78,9% de correspondance
entre les actions d.clench.es par q-PCR et par culture (101 .chantillons sur 128), dans le
laboratoire 1 ;
U une valeur cible en q-PCR de 2,5. 10
3
UG/L permettrait d'obtenir 87% de correspondance entre
les actions d.clench.es par PCR et par culture (80 .chantillons sur 91), dans le laboratoire 2;
- pour le d.nombrement de L. pneumophila :
U une valeur cible en q-PCR de 2,6 10
4
UG/L permettrait d'obtenir 86,9% de correspondance
entre les actions d.clench.es par PCR et par culture (106 .chantillons sur 122), dans le
laboratoire 1 ;
U une valeur cible en q-PCR de 5,6 10
3
UG/L permettrait d'obtenir 94,5% de correspondance
entre les actions d.clench.es par q-PCR et par culture (86 .chantillons sur 91), dans le
laboratoire 2.
Les valeurs du signal q-PCR sont significativement diff.rentes (de l'ordre de 1 log) d'un laboratoire
l'autre, malgr. l'utilisation d'une mme m.thode d'extraction et du mme protocole de q-PCR. Les
auteurs de l'.tude en concluent une n.cessit., pour chaque laboratoire, de d.terminer sa propre
valeur cible de signal q-PCR permettant de correspondre 1000 UFC/L (Joly et al. 2006). Toutefois,
les eaux chaudes sanitaires analys.es par le laboratoire 1 proviennent de multiples origines, alors que
celles analys.es dans le laboratoire 2 proviennent d'un mme h?pital. Par ailleurs, les laboratoires ne
disposaient pas d'un .talon commun.
Concernant la d.termination de valeurs cibles pour les m.thodes d'analyse des eaux chaudes
sanitaires alternatives la culture, une seule .tude publi.e a .t. r.pertori.e. Cette .tude fait .tat de
correspondances non homognes entre les seuils de d.clenchement d'actions sp.cifiques de la
culture et ceux de la q-PCR. Ces correspondances apparaissent meilleures pour la cible L.
pneumophila que pour L. spp.
Aucune .tude portant sur la d.termination de valeurs cibles n'a .t. r.pertori.e pour les autres
m.thodes alternatives, hormis la q-PCR.
9.4.2 Cas des tours a.ror.frig.rantes
Dans leur .tude portant sur 37 .chantillons d'eaux de tours a.ror.frig.rantes, Joly et al., n'ont pas mis
en .vidence de corr.lations entre les r.sultats de culture et ceux de q-PCR. ls n'ont donc pas pu
d.terminer de valeur cible en q-PCR correspondant des eaux contenant plus de 10
3
UFC/L
Legionella mesur.es par culture, comme ce qu'ils ont tent. de faire pour les eaux chaudes sanitaires
(Joly et al. 2006).
Compte tenu du peu de r.sultats publi.s sur le sujet, il est difficile de conclure sur la base de la
bibliographie.
48
Courbe de ROC (Receiver Operating Characteristics) : outil graphique, destin. tracer des valeurs de la sensibilit. (Se) en
fonction de 1-Sp (sp.cificit.).
Anses
F.vrier 2011 page 99 / 144
10 Synthse des .I.ments recueiIIis
10.1 Synthse sur Ia base des .I.ments bibIiographiques
10.1.1 EI.ments prendre en compte pour choisir une m.thode de d.nombrement de
Legionella
La saisine portait sur les m.thodes de d.tection de Legionella dans l'eau adapt.es aux contextes
des eaux chaudes sanitaires et des tours a.ror.frig.rantes. En pr.ambule, il est important d'insister
sur I'importance de d.nombrer Ies Legionella. L'information fournie par la simple d.tection parat
insuffisante dans ces contextes.
Le genre Legionella est compos. de multiples espces, elles-mmes subdivis.es en s.rogroupes et
sous-types. l apparat n.cessaire de pr.ciser la cible la plus pertinente des d.nombrements, en
fonction de l'objectif poursuivi : gestion des risques sanitaires ou gestion des installations.
Pour Ia popuIation g.n.raIe, compte tenu de la raret. des cas de l.gionellose attribu.s d'autres
espces de Legionella que L. pneumophila, le d.nombrement de cette espce peut suffire fournir
l'information n.cessaire la gestion du risque sanitaire. Le d.nombrement sp.cifique des L.
pneumophila du s.rogroupe 1, principal responsable des cas de l.gionellose, peut apporter une
information suppl.mentaire. Cependant, il ne peut remplacer le d.nombrement des L. pneumophila.
Pour Ies individus atteints d'une immunod.pression s.vre, .galement dits "patients haut
risque"
49
), qui peuvent tre infect.s par L. pneumophila comme par d'autres espces de Legionella, le
d.nombrement des L. spp apporte une information suppI.mentaire, notamment lorsqu'il est
associ. aux mesures de suivi et de traitement de l'eau sp.cifiques ce contexte, d.j envisag.es
dans la r.glementation en vigueur
50
Pour Ia gestion des instaIIations d'eaux chaudes sanitaires et des tours a.ror.frig.rantes, le
d.nombrement de L. spp apporte des informations relatives l'.cosystme des installations de la
mme importance que celles apport.e par le d.nombrement de L. pneumophila.
;
L'.tat de viabilit. des Legionella d.nombr.es est une information compl.mentaire int.ressante pour
interpr.ter les r.sultats, quel que soit la cadre de leur utilisation. Le risque associ. Ia pr.sence de
bact.ries viabIes non cuItivabIes doit notamment tre pris en consid.ration.
Le biofilm et les protozoaires constituent un r.servoir av.r. de Legionella. ls contribuent leur
protection contre les stress environnementaux (traitement de d.sinfection), favorisent leur
multiplication. Par ailleurs, les protozoaires semblent contribuer la revivification des Legionella et
accrotre leur pathog.nicit. pour l'homme. Compte tenu de ces .l.ments, la pr.sence de biofiIm et
de protozoaires sont des facteurs prendre en consid.ration lors du suivi des installations et
pourraient .galement contribuer la recontamination plus rapide de l'installation, aprs un traitement
de d.sinfection.
10.1.2 Attentes reIatives une m.thode de d.nombrement de Legionella dans I'eau
l apparat important qu'une m.thode analytique destin.e au d.nombrement de Legionella dans l'eau
soit sp.cifique et s.lective de la cible choisie, qu'elle ait .t. .valu.e sur le plan du rendement
51
Par ailleurs, Ie groupe de travaiI a identifi. des critres sp.cifiques I'.vaIuation d'une m.thode
de d.nombrement de Legionella, en routine, dans les eaux chaudes sanitaires et les tours
a.ror.frig.rantes.
,
qu'elle possde une limite de quantification basse et le cas .ch.ant inf.rieure aux seuils
r.glementaires.
49
Les patients dits patients haut risque sont les immunod.prim.s s.vres, et particulirement les immunod.prim.s aprs
transplantation ou greffe dSorgane et les immunod.prim.s par corticoth.rapie prolong.e (0,5 mg/kg de prednisone pendant
30 jours ou plus, ou .quivalent) ou r.cente et haute dose (cSest--dire sup.rieure 5 mg/kg de prednisone pendant plus de
5 jours)
50
Arrt. du 1er f.vrier 2010 relatif la surveillance des l.gionelles dans les installations de production, de stockage et de
distribution d'eau chaude sanitaire et Circulaire DGS/SD7A/SD5C/DHOS/E4 n 2002/243 du 22 avril 2002 relative la
pr.vention du risque li. aux l.gionelles dans les .tablissements de sant.
51
Fraction de la cible d.tect.e par rapport la cible pr.sente dans l'.chantillon.
Anses
F.vrier 2011 page 100 / 144
Des critres identifi.s comme de priorit. .lev.e :
- Quantification de Legionella pneumophila ;
- Quantification de Legionella pneumophila avec distinction du s.rogroupe 1 ;
- Prise en compte des Legionella intra amibiennes ou intra v.siculaires dans la quantification ;
- Non d.tection des Legionella mortes ;
- D.tection de l'ensemble des Legionella viables et potentiellement pathognes ;
- Rapidit. des r.sultats ;
- Applicable sur des .chantillons d'eau trait.e ;
- Critres d'interpr.tation pour le risque sanitaire disponibles.
Des critres identifi.s comme de priorit. mod.r.e :
- Distinction et de quantification des s.rogroupes Lp autre que sg1 ;
- Quantification de l'ensemble des Legionella spp ;
- Applicable sur des .chantillons d'eau charg.e (biologiquement, chimiquement ou
physiquement) ;
- Faisabilit., simplicit. ;
- Equipements n.cessaires faibles ;
- Temps technicien faible ;
- nterpr.tation technique simple des r.sultats bruts ;
- Permet de disposer de souches pour des .tudes compl.mentaires.
Chaque m.thode d.crite dans ce rapport a .t. examin.e au regard de ces critres. Le r.sultat de cet
exercice est pr.sent. dans les chapitres de description des m.thodes, et synth.tis. dans le tableau
10.
II est important de souIigner que Ie choix d'une m.thode de d.nombrement ne peut reposer
que sur ses avantages et ses inconv.nients intrinsques. En effet certains de ces .l.ments
th.oriques positifs doivent tre confront.s aux r.alit.s du terrain oM ils peuvent tre alors pris en
d.faut. II apparat .gaIement essentieI, pour un teI choix, de prendre en compte Ies niveaux de
d.veIoppement des diff.rentes m.thodes : stabilisation d'un protocole pr.cis, validation des
caract.ristiques et performances par diff.rents laboratoires et sur diff.rents types d'.chantillons
environnementaux, robustesse, existence de standards et d'.talons, etc.
Anses
F.vrier 2011 page 101 / 144
TabIeau 10 : Critres identifi.s pour Ie choix des m.thodes de d.nombrement de Legionella
( +) Avantages ; (-) inconv.nients ; ( ?) critres non .valu.s
10.1.3 Tentatives de comparaison des diff.rentes m.thodes de d.nombrement de Legionella
Certaines m.thodes de d.nombrement de Legionella dans l'eau, g.n.ralement les plus utilis.es, ont
fait l'objet de tentatives de comparaison. Les unit.s dans lesquelles sont exprim.s les r.sultats des
m.thodes consid.r.es ne sont souvent pas strictement comparables. Toutefois, l'existence de
corr.lations entre des r.sultats de d.nombrement exprim.s dans diff.rentes unit.s, semble
int.ressante pour alimenter la r.flexion relative l'.laboration de rgles d'interpr.tation pour les
m.thodes alternatives la culture.
Pour I'anaIyse d'eaux pr.par.es en Iaboratoire, dans des conditions id.aIes de croissance
matris.es et sans stress ajout. (d.sinfectant, traitement thermique, etc.), certaines m.thodes
(cuIture, q-PCR, TVC, immuno-d.tection) produisent des r.suItats .quivaIents. Tout .cart par
rapport ces conditions id.ales affecte diff.remment les r.sultats de ces m.thodes et perturbe leur
.quivalence.
Ainsi, sur des eaux environnementaIes, dont Ia quaIit. et Ia charge en particuIes, compos.s
chimiques et microorganismes sont trs variabIes, Ies diff.rentes m.thodes de d.nombrement
de Legionella, apparaissent rarement .quivaIentes. N.anmoins, les corr.lations observ.es entre
les r.sultats des m.thodes compar.es sont sensiblement meilleures, pour l'analyse d'eaux
M.thodes Culture DVC q-PCR v-PCR mmuno-
d.tection
FSH DS Culture-
FSH
Critres priorit. .Iev.e
Quantification de Legionella
pneumophila
+ ? + + + + + +
Quantification de Legionella
pneumophila avec distinction du
s.rogroupe 1
+ ? + + + ? + ?
Prise en compte des Legionella
intra amibiennes ou intra
v.siculaires dans la quantification
- ? + + - ? ? -
Non d.tection des Legionella
mortes
+ + - + - - ? +
D.tection notamment de
l'ensemble des Legionella viables
et potentiellement pathognes
- ? + + + + + -
Rapidit. des r.sultats
- + + + + + + +
Critres d'interpr.tation pour le
risque sanitaire disponibles
+ - - - - - - -
Applicable sur des .chantillons
d'eau trait.e
+ ? + + ? ? ? +
Critres priorit. mod.r.e
Distinction et quantification des
s.rogroupes Lp autre que sg1
+ ? ? ? + - + +
Quantification de l'ensemble des
Legionella spp
+ ? + + + + ? +
Applicable sur des .chantillons
d'eau charg.e
- ? - - - ? - -
Faisabilit., simplicit.
+ ? + + + + ? +
Equipements n.cessaires faibles
+ ? + + - + - +
Temps technicien faible
- ? + + - - - -
nterpr.tation technique simple
des r.sultats bruts
+ ? + + + + + +
Permet de disposer de souches
pour des .tudes
compl.mentaires
+ ? - - ? - ? +
Anses
F.vrier 2011 page 102 / 144
relativement peu charg.es, comme les eaux de r.seaux domestiques, que pour l'analyse d'eaux
charg.es, comme les eaux de tours a.ror.frig.rantes.
Pour envisager la comparaison des limites de d.tection et de quantification relatives diff.rentes
m.thodes il est n.cessaire que celles-ci soient .prouv.es et stabilis.es, par exemple par l'introduction
d'une norme. Ce n'est pas le cas pour la majorit. des m.thodes alternatives r.pertori.es.
10.1.4 R.fIexion sur Ia signification des r.suItats et des vaIeurs cibIes
Pour tre en mesure d'apporter une information complte d'un point de vue sanitaire, il semble
important qu'une m.thode de d.nombrement de Legionella comptabilise aussi bien les Legionella
viables cultivables que VBNC.
Dans Ie cas particuIier d'un suivi de d.sinfection, Ies m.thodes qui sembIent tre Ies pIus
adapt.es sont ceIIes qui prennent en compte Ies seuIes Legionella viabIes, qu'elles soient
cultivables ou non. Dans ce contexte, il peut .galement tre n.cessaire de v.rifier dans quelle mesure
le renouvellement de l'eau, affecte le taux des bact.ries viables par rapport au taux de bact.ries non
viables.
L'.cologie microbienne des Legionella est largement influenc.e par leurs interactions avec les amibes
et les biofilms. Ces derniers peuvent jouer un r?le de r.servoirs de Legionella et les protgeraient des
facteurs environnementaux, notamment des traitements de d.sinfection. Ainsi, dans certaines
situations, Ia recherche d'amibes ou de Legionella dans Ies biofiIms, sembIe pouvoir apporter
des informations int.ressantes, en compl.ment du d.nombrement de Legionella dans l'eau. Ces
recherches restent cependant encore compIexes mettre en 8uvre en routine.
En termes de signification sanitaire des valeurs cibles actuelles, il est important de distinguer le cas
des eaux chaudes sanitaire de celui des tours a.ror.frig.rantes.
Concernant Ies eaux chaudes sanitaires, selon les donn.es de la litt.rature, la valeur sanitaire en
dessous de laquelle le risque de l.gionellose est n.gligeable ou acceptable pour la population
g.n.rale est comprise entre 10
4
ou 10
5
UFC/L en L. pneumophila, malgr. l'absence de dose-r.ponse
connue chez l'homme. La r.glementation actuelle est plus exigeante d'un facteur 10. Ainsi, iI ne
sembIe pas opportun de modifier Ies seuiIs r.gIementaires reIatifs aux L. pneumophila dans les
eaux chaudes sanitaires, pour l'interpr.tation des r.sultats de d.nombrement par culture.
En revanche, pour Ies patients "haut risque" (immunod.prim.s), l'examen de la litt.rature, n'a
pas permis de mettre en .vidence une concentration en Legionella dans une eau chaude sanitaire en
dessous de laquelle il ne serait plus observ. de cas de l.gionelloses. Pour ces patients, iI est
pr.f.rabIe de conserver une vaIeur cibIe inf.rieure au seuiI de quantification en L.
pneumophila et d'anaIyser Ie risque vis--vis de Legionella .Iargie toute espce.
Concernant Ies tours a.ror.frig.rantes, pour la population g.n.rale, le risque .tant li. L.
pneumophila et non Legionella spp, iI sembIe pIus opportun de d.nombrer L. pneumophila pIut?t
que L. spp, tout en conservant les mmes valeurs cibles (10
3
et 10
5
UFC/L). Toutefois, dans le cadre
de la gestion des installations, la recherche de L. spp reste un indicateur pertinent de
dysfonctionnement.
10.1.5 D.termination de vaIeurs cibIes pour Ies m.thodes aIternatives Ia cuIture
Dans Ie cas des eaux chaudes sanitaires, bien peu de laboratoires se sont risqu.s d.terminer
des valeurs cibles pour les m.thodes alternatives en tentant de les faire correspondre aux valeurs
cibles utilis.es pour l'interpr.tation de la m.thode par culture. Une seule .tude publi.e a .t.
r.pertori.e sur le sujet. Elle concerne les seules eaux chaudes sanitaires. Elle fait .tat de
correspondances entre des seuiIs de d.cIenchement d'actions sp.cifiquement .tabIies pour Ia
m.thode par cuIture et des vaIeurs cibIes .tabIies pour Ia m.thode par q-PCR. Ces
correspondances apparaissent meilleures pour la cible L. pneumophila que pour L. spp. Aucune
tentative de d.termination de valeurs cibles impliquant une autre m.thode que la q-PCR n'a .t.
r.pertori.e.
Dans Ie cas des tours a.ror.frig.rantes, compte tenu de l'absence de r.sultats d'.tudes
concluantes publi.s sur le sujet, aucune concIusion ne peut tre faite sur la base de la bibliographie.
Anses
F.vrier 2011 page 103 / 144
10.2 Synthse sur Ia base des auditions
Le pr.sent chapitre est une synthse des informations issues des pr.sentations et des discussions
men.es avec les diff.rents acteurs auditionn.s par le groupe de travail. Ces donn.es proviennent
d'observations de terrain ou d'.tudes en cours mais ne sont pas publi.es. Elles ne peuvent tre
consid.r.es au mme titre que des .l.ments bibliographiques cit.s pr.c.demment, dans la mesure
oM elles ne sont pas pass.es au crible d'une proc.dure de validation par les pairs. Leur int.rt r.side
dans leur comparaison avec les tendances et hypothses d.j publi.es dans la litt.rature. La liste des
personnalit.s auditionn.es et la m.thode utilis.e pour mener bien ces auditions sont pr.sent.es
page 4, dans le chapitre Auditions . .
La prise en compte et l'interpr.tation des r.sultats pr.sent.s par les diff.rents acteurs n.cessitent une
remarque pr.liminaire, soulign.e par l'un d'entre eux. Les essais inter-laboratoires ont montr. que
mme sur une technique aussi rod.e et robuste que Ia cuIture, iI pouvait exister une grande
disparit. des performances anaIytiques, li.e pour partie aux rendements des diff.rentes .tapes de
l'analyse, ainsi qu'au mat.riel utilis. (ex : milieu de culture). Les fluctuations pouvaient influencer les
r.sultats hauteur de 20%. l a fallu du temps pour que ces disparit.s soient mieux matris.es. De
fait, il n'est pas .tonnant de trouver entre les diff.rents acteurs des fluctuations des niveaux de fid.lit.
des m.thodes et des avis divergents sur l'efficacit. de techniques non totalement rod.es.
Cette disparit. de performance anaIytique a .t. identifi.e et partieIIement r.duite pour Ia
cuIture (actueIIement de I'ordre de 1 Iog sur Ia moyenne des r.suItats, seIon Ies essais inter-
Iaboratoires), eIIe est en cours de matrise pour Ia q-PCR, et n'est ni connue ni .vaIu.e pour Ies
autres m.thodes. La grande majorit. des acteurs centrent leur activit. sur la culture, avec parfois
une seconde technique en appui, celle-ci .tant la plupart du temps la q-PCR. Les autres techniques
sont peu ou pas utilis.es, sauf dans le cas d'eaux trs charg.es.
Les prises de positions des diff.rents acteurs concernant ces techniques doivent tre consid.r.es au
regard de l'.volution positive tendant diminuer cette disparit. au fil du temps. Des travaux anciens,
pour lesquels cette .volution des pratiques n'a pas encore .t. prise en compte peuvent pr.senter des
diff.rences marqu.es, alors qu'elles seront moindres pour des travaux r.cents. A titre d'exemple, Ia
reproductibiIit. et Ia r.p.tabiIit. de Ia q-PCR sont d.sormais voisines de ceIIes de Ia cuIture. La
mise en place d'un .talon national pour le d.nombrement de Legionella par q-PCR va .galement
dans ce sens, dans l'hypothse d'un raccordement fiable entre .talon primaire et .talons secondaires.
L'utilisation de la q-PCR qui reste relativement faible, du fait de la non reconnaissance de ses
r.sultats d'un point de vue r.glementaire, fait que le nombre de participants des essais inter-
laboratoires pour la q-PCR est trs insuffisant (environ 30 en France) par rapport au nombre de
participants pour la culture (environ 300 en France). Sur la base des .l.ments communiqu.s, on peut
toutefois affirmer que les recherches de Legionella par culture (selon la norme NF T90-431) et par q-
PCR (selon la norme NF T90-471) restent deux m.thodologies distinctes dont la corr.lation n'est pas
formellement .tablie.
Le second facteur consid.r. comme une source de disparit.s entre Ies r.suItats est I'efficacit.
de Ia phase d'extraction. L'existence d'une norme devrait contribuer am.liorer ce point, mais le
contr?le de cette condition n.cessite .galement un standard de r.f.rence, encore d.velopper. La
variabilit. entre la q-PCR et la culture n'est en revanche pas influenc.e par l'.chantillonnage qui est
identique.
Un autre .I.ment I'origine de disparit.s est I'.tat de cuItivabiIit. des bact.ries. La question
des bact.ries viables non cultivables (VBNC) n'a que peu .t. .voqu.e dans les auditions car de l'avis
des acteurs leur .valuation quantitative directe pose encore un problme.
Les acteurs principaux traitent chacun de l'ordre de 25 000 .chantillons par an. Si la culture est
exploit.e par tous pour des raisons r.glementaires .videntes, les autres m.thodes peuvent
repr.senter entre 10 % et moins de 1% de l'activit. globale d'analyse, ce qui incite la prudence lors
des conclusions tir.es des r.sultats produits et des commentaires aff.rents, en particulier lorsqu'il
s'agit de comparer diff.rentes m.thodes.
QueIIes que soient Ia ou Ies m.thodes utiIis.es, tous Ies acteurs font .tat d'objectifs diff.rents
en fonction des types d'instaIIation et des types d'eau qu'iI convient pour eux de distinguer.
Cependant la plupart des acteurs retiennent sensiblement les mmes priorit.s pour une m.thode de
d.nombrement des Legionella :
U m.thode adapt.e la matrice analys.e ;
Anses
F.vrier 2011 page 104 / 144
U obtention rapide des r.sultats : 24 48h ;
U suivi des tendances de colonisation des installations par les bact.ries (.volution
chronologique).
U si possible, quantification .quivalente ou proportionnelle la r.glementation.
La plupart admettent explicitement ou non que la culture ne correspond pas totalement la r.alit. des
besoins industriels et sanitaires puisqu'ils cherchent souvent d.velopper des m.thodes alternatives
pour matriser leurs installations.
10.2.1 Concernant Ies eaux chaudes sanitaires
De l'avis de plusieurs des acteurs consult.s, la probl.matique pos.e par la pr.sence de Legionella
dans les eaux chaudes sanitaires (ECS) est moins complexe que celle des TAR, dans la mesure oM il
s'agit g.n.ralement d'une eau trait.e, peu charg.e biochimiquement et microbiologiquement parlant.
Selon un des acteurs, le taux de contamination des installations par le genre Legionella avoisine les
10% de celles qu'il surveille, la majorit. des contaminations .tant dues Legionella spp et plus
rarement L. pneumophila. Les .chantillons s'av.rant trop charg.s en flore interf.rente pour fournir
un r.sultat par culture repr.sentent seulement 2% des .chantillons trait.s. Par ailleurs, mme si le
traitement de l'eau est susceptible d'affecter certaines m.thodes (ex : par pr.sence de chlore), cette
alt.ration demeure mod.r.e. Ce type d'eau ne comporte que peu d'inhibiteurs. De fait, beaucoup
d'acteurs observent pIut?t une bonne corr.Iation entre Ies diff.rentes m.thodes utiIis.es,
assortie d'une bonne lin.arit. ds que la concentration en Legionella d.passe 10
3
UFC/L (r.sultats de
q-PCR pr.dictifs des r.sultats obtenus pas culture dans plus de 80% des cas). Cette corr.Iation par
rapport Ia m.thode par cuIture, est vaIabIe pour L. pneumophila comme pour Legionella spp.
Dans le cas des eaux chaudes sanitaires, on peut donc envisager sans trop de risque une m.thode
rapide permettant un d.nombrement des Legionella avec des performances analytiques adapt.es la
matrice. L'utilisation d'une telle m.thode repr.sente aux yeux des acteurs une plus value pour la
gestion des r.seaux non encore .tudi.es. La difficult. essentielle concerne la d.termination des
valeurs cibles, car certains r.sultats pr.sent.s font .tat d'un taux de faux n.gatifs qui reste
pr.occupant (sup.rieur 11%).
l est noter que pour certains acteurs, le problme de la pr.sence de Legionella dans les r.seaux
d'eau chaude sanitaire est principalement li. la conception hydrauIique des instaIIations et
pourrait tre partiellement r.solu en modifiant leur conception. Sur ce point, Ie groupe de travaiI
tient pr.ciser qu'iI considre que I'am.Iioration hydrauIique des r.seaux permettrait de
Iimiter Ie probIme, mais que ceIa ne suffirait pas Ia r.soudre totaIement. II souIigne
.gaIement Ia compIexit. de Ia r.aIisation de teIIes am.Iiorations dans Ies instaIIations
existantes.
Afin de prendre une d.cision dans Ie cadre d'une gestion d'instaIIation, certains acteurs
souIignent I'importance de Ia prise en compte du nombre de points d'usage contamin.s en L.
pneumophila, comme le font les nord-am.ricains. Ces derniers pr?nent le d.clenchement
syst.matique d'un traitement de l'installation si plus de 30 % des points d'usage sont contamin.s. En
cas de contamination par Legionella observ.es sur moins de 30 % des points d'usage la mise en
8uvre d'un traitement n'est pas syst.matique.
10.2.2 Concernant Ies tours a.ror.frig.rantes
Le probIme pos. par Ies tours a.ror.frig.rantes (TAR) est, de I'avis g.n.raI, nettement pIus
compIexe que ceIui des eaux chaudes sanitaires. Les Legionella pathognes sont dans ce cas
int.gr.es un .cosystme microbien plus complexe, avec des eaux pouvant tre beaucoup plus
charg.es en particules, en substances chimiques diverses et en microorganismes.
Tous les acteurs soulignent l'importance de d.nombrer Legionella spp. et L. pneumophila pour la
surveillance et la gestion courante de leurs installations. Les auditions font n.anmoins apparatre que
la cible dont le d.nombrement apporte le plus d'informations pertinentes et d.cisives pour la gestion
des installations est L. pneumophila. ls s'accordent pour reconnatre que les analyses qu'ils r.alisent
portent d.j pr.f.rentiellement sur cette espce, plut?t que sur le genre toute entier, dont le
d.nombrement est exig. dans la r.glementation en vigueur. A cet .gard, certains acteurs
pr.conisent d'aiIIeurs que Ies seuiIs r.gIementaires pour Ies TARs soit fix. en L. pneumophila
et non pas en L. spp. En effet, dans un cadre r.glementaire (nombre limit. de pr.lvement), les
r.sultats des recherches de Legionella spp. peuvent s'av.rer difficilement interpr.tables car, selon les
espces qui les composent, elles ne repr.sentent pas n.cessairement un risque sanitaire.
Anses
F.vrier 2011 page 105 / 144
Un acteur rappelle qu' l'heure actuelle seule la France recherche Legionella spp., alors mme que
d'autres pays estiment que cette recherche a peu d'int.rt et .cartent les cas de Legionella spp. des
.tudes comparatives. Toutefois, pour I'ensembIe des acteurs auditionn.s, Ia recherche
syst.matique et paraIIIe de L. pneumophila et Legionella spp. reste int.ressante notamment
du fait de l'existence d'espces non pneumophila pathognes, bien que ces espces soient
marginales dans les TAR.
Pour certains acteurs la colonisation en Legionella spp. peut .galement donner une indication sur
l'.volution de l'.cologie microbienne des TAR. ls notent une positivit. des tours en Legionella spp.
sup.rieure 96% lorsque la recherche est effectu.e en q-PCR, ce qui confirme que les conditions
environnementales l'int.rieur des TARs sont particulirement favorables la prolif.ration de ce type
de bact.rie.
La plupart des acteurs n'ont pu mettre en .vidence de corr.Iation entre Ies r.suItats d'anaIyse
d'eau de TAR obtenus par cuIture et par q-PCR. Un acteur auditionn. a mme .voqu. les r.sultats
d'essais qui montrent une meilleure concordance relative entre les r.sultats de d.nombrement de
Legionella spp par culture et de L. pneumophila par q-PCR, et entre les r.sultats de d.nombrement
de L. pneumophila par culture et de L. pneumophila par q-PCR. Cette correspondance n'est
cependant que relative. En effet, il ne s'agit pas d'une correspondance directe entre les r.sultats de
culture (en UFC/L) et de q-PCR (en UG/L), mais d'une concordance d'actions pr.conis.es en fonction
des valeurs cibles fix.es par les auteurs de l'.tude pour la q-PCR et des seuils r.glementaires pour la
culture. Ce point n'est valable que pour les TAR et n'a pas .t. confirm. par ailleurs. Certains
souIignent que Ies miIieux de cuItures ont .t. initiaIement d.veIopp.s pour d.tecter L.
pneumophila et non L. spp, ce qui pourrait expIiquer ce d.caIage.
La prise en compte d'un indice de Legionella totales (L. spp.) pourrait permettre d'estimer l'instabilit.
ou la stabilit. d'une TAR dans le temps, tout en apportant une information sur les effets des
traitements. Toutefois un acteur fait remarquer que pour interpr.ter correctement un r.sultat de
recherche de L. spp., il est n.cessaire de connatre l'.tat d'approvisionnement en eau de l'installation
et de disposer d'un suivi r.gulier pour connatre l'.volution des r.sultats.
Au cours de l'analyse des donn.es issues des auditions, un membre du groupe de travail a propos.
une alternative lS.tablissement de valeurs cibles de concentration en Legionella dans l'eau, qui sont
forc.ment li.s une m.thode donn.e. l propose de pr.f.rer l'.tablissement de valeurs cibles,
l'.tablissement d'exigences techniques destin.es matriser le risque :
- exigence en eau d'appoint : teneur en Legionella pneumophila inf.rieure la limite de
quantification (LQ), quelle que soit la m.thode ;
- niveau d'alerte ou d'action : d.passement d'1 log par rapport la LQ ;
- niveau d'arrt imm.diat : d.passement de 2 log par rapport la LQ ;
- la mme m.thode devrait tre utilis.e pour toutes les analyses (de l'eau d'appoint ou du circuit
de l'installation) et la LQ devra tre coh.rente.
l pourrait tre envisageable d'accepter des d.passements de LQ en eau d'appoint sous r.serve de
matrise stricte des paramtres de fonctionnement de la TAR : d.bit d'entranement v.siculaire,
rendement du d.v.siculeur sup.rieure 0.01%, etc. Un suivi de la biomasse sur le mme principe,
utilis. en routine par le gestionnaire, pourrait par ailleurs permettre de remplacer partiellement les
contr?les par d.nombrements de Legionella et d'espacer ces derniers.
SeIon certains acteurs, Ia fIore totaIe peut .gaIement tre utiIis.e comme un outiI de gestion
des instaIIations, lorsqu'elle est .valu.e par ATP-m.trie. La m.thode ne semble toutefois pas
adapt.e l'analyse des eaux de TAR aliment.es par des eaux de surface qui contiennent de
nombreux organismes vivants diff.rents, susceptibles de produire de l'ATP. Son int.rt reste
.galement contest. par d'autres acteurs en raison de sa non-sp.cificit. vis--vis du genre Legionella.
Toutefois, les acteurs s'accordent globalement sur sa simplicit. de mise en 8uvre sur le terrain, avec
notamment peu de comp.tences n.cessaires.
En outre, un acteur a rapport. que Ia pr.sence de biofiIms dans Ies TARs sembIe contribuer
une stabiIisation de I'.cosystme bact.rien, en Iimitant notamment Ie d.veIoppement de L.
pneumophila. Cette opinion est bas.e sur l'analyse des r.sultats de surveillance de nombreuses
tours qui r.vle que par rapport aux installations dans lesquelles le biofilm est stable, les tours
a.ror.frig.rantes conues sp.cialement pour limiter la pr.sence de biofilm sont souvent plus difficiles
piloter du point de vue de L. pneumophila. II est noter que Ia pIupart des acteurs d.cIarent ne
pas tenir compte de Ia pr.sence de biofiIm dans Ieurs instaIIations, bien qu'iI soit probabIe
qu'une grande part de Ia muItipIication des Legionella ait Iieu justement dans Ie biofiIm. ls
Anses
F.vrier 2011 page 106 / 144
soulignent que l'analyse du biofilm n'est pas requise dans la r.glementation et jugent les r.sultats de
recherches des Legionella dans celui-ci, trop complexes interpr.ter. D'aprs eux, leur mise au point
n.cessite encore des recherches approfondies, peu compatibles avec les objectifs industriels
imm.diats.
Dans le cadre d'une analyse de routine, I'ATP-m.trie et/ou Ies mesures de fIore cuItivabIe ne
sembIent donc pr.senter qu'un int.rt marginaI pour certains acteurs qui ne basent Ieurs
actions de gestion que sur Ies vaIeurs obtenues pour L. pneumophila et L. spp. ls justifient cette
position par la plus grande sp.cificit. et donc plus grande fiabilit. des d.nombrements de Legionella.
ls admettent toutefois que le d.nombrement de L. spp est une plus-value pour la gestion des
installations.
Dans Ia pIupart des .tudes, Ies Legionella sont recherch.es dans I'eau. Dans Ie cadre de
pr.occupations sanitaires, Ia recherche de Legionella dans Ies a.rosoIs a .t. .voqu.e mais Ies
acteurs ne disposent pas de m.thodes et d'appareiIs de pr.Ivement de r.f.rence
suffisamment fiabIes. l est donc d.licat de conclure sur les r.sultats d'analyse obtenus.
10.2.3 Cas particuIier des eaux trs charg.es
Dans le cas de TAR aliment.es en eaux de rivire les acteurs observent une composition biochimique
(inhibiteurs) et microbiologique (flore interf.rente) complexe et .volutive qui rend les analyses trs
d.licates. La pr.sence d'une fIore interf.rente en grande quantit. (pouvant inhiber jusqu' 10%
des mesures, 2% en moyenne), d'inhibiteurs organiques ou d'.I.ments traces m.taIIiques
(identifi.s dans 80% des eaux brutes de rivire et imposant des dilutions d'.chantillons allant jusqu'
2 log) ou de particuIes auto fIuorescentes, Iimitent Ie choix des m.thodes appIicabIes. Par
ailleurs, tous ces .l.ments interfrent de manire significative sur de nombreux paramtres de la
m.thode utilis.e : sensibilit., justesse, limite de d.tection, concordance avec les r.sultats par d'autres
m.thodes, etc.
Ce constat fait, Ies acteurs confront.s ce type d'eau de manire r.guIire estiment que Ia
m.thode par cuIture ne r.pond pas correctement aux besoins anaIytiques pour Ia gestion de
Ieurs instaIIations. IIs estiment .gaIement que Ia m.thode par q-PCR ne pr.sente pas toutes
Ies garanties n.cessaires. A titre d'exemple, il y a th.oriquement peu de risque d'obtenir des
r.sultats faux n.gatifs li.s la pr.sence d'inhibiteurs. Cependant, de nombreux .chantillons ne sont
plus interpr.tables au regard de la gestion de l'installation, du fait de dilutions importantes qui
repoussent la limite de d.tection au-del des seuils de d.cision.
Les m.thodes faisant appeI des techniques d'hybridation sembIent moins sensibIes aux
effets d'une eau charg.e, avec une bonne coh.rence globale et ce quelle que soit la qualit. d'eau
(avec et sans biocide). Mais ces m.thodes sont encore en cours d'.vaIuation et n.cessitent
d'tre d.veIopp.es et test.es pIus avant. Par ailleurs elles conviennent au d.nombrement de
Legionella spp., mais restent moins adapt.es au d.nombrement de L. pneumophila. En outre, ces
m.thodes intgrent une pr.-.tape de culture de 24 heures et ne d.tectent donc pas les bact.ries
viables non-cultivables.
10.2.4 Suivi de traitement et recoIonisation
Les d.sinfections interviennent par le biais d'un traitement choc aprs un .pisode de contamination
d.passant le seuil de gestion adopt.. Certains acteurs pr.conisent une d.sinfection en cas de
pr.sence de flore interf.rente, avec un traitement choc et des analyses renouvel.es dans les jours
suivants. Le suivi d'installation aprs d.sinfection est actuellement effectu. par la plupart des acteurs
par culture. En effet, lors d'essais en discontinu, Ies r.suItats impIiquant Ia m.thode par q-PCR ont
montr. des variations notabIes en fonction du biocide utiIis., avec une persistance du signaI
de q-PCR aprs d.sinfection par certains biocides, sans que le niveau de cette persistance ait .t.
pr.cis.. Dans Ie cadre du suivi d'instaIIation, iI est donc d.Iicat de d.gager des cI.s
d'interpr.tation en fonction des pratiques op.rationneIIes. En dehors de la q-PCR et de la
culture, aucune autre m.thode sp.cifique n'a .t. test.e grande .chelle par les acteurs dans ce
contexte.
Une autre approche du suivi de traitement pourrait tre obtenue par comparaison q-PCR et v-PCR.
Cette dernire d.nombre th.oriquement sp.cifiquement Legionella viables. l est g.n.ralement
observ. in vitro un abattement de 1 3 log de la d.tection des bact.ries mortes, entre les r.sultats
obtenus par q-PCR et ceux obtenus par v-PCR. Toutefois, les essais de v-PCR ont .t. men.s sur des
systmes ferm.s (sans renouvellement de l'eau du systme), alors que les TAR sont des systmes
Anses
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ouverts. Le risque de d.tecter des Legionella mortes par q-PCR est minimis. dans les TAR par le fort
renouvellement de l'eau dans ces installations. Les premiers r.sultats obtenus par quelques acteurs
lors d'essais de v-PCR en conditions r.elles semblent montrer que les r.sultats de d.tection sont
assez comparables ceux obtenus par q-PCR. La justesse de la q-PCR n'a par ailleurs pas .t.
totalement .valu.e.
La v-PCR apparat pIusieurs acteurs comme potentieIIement utiIe pour d.tecter rapidement
un traitement non signaI. ou .vaIuer I'efficacit. imm.diate d'un traitement. Toutefois elle reste
ce jour quasi-inutilis.e.
l est rappel. par un acteur que le pr.traitement par l'EMA et le PMA n'a pas le mme impact selon le
mat.riel d'amplification utilis., ce que confirme une publication (Chang et al. 2010).
Mme si Ie Iien entre Ia pr.sence d'amibes et de Legionella dans I'eau n'est pas toujours
.vident, Ia pr.sence av.r.e d'amibes Iibres dans une TAR sembIe tre pour pIusieurs acteurs
un indicateur fiabIe d'une pr.sence potentieIIement importante de Legionella. Cependant Ia
m.thode de d.tection des amibes Ia pIus r.pandue est co`teuse, demande du temps et
l'ensemble des laboratoires n'est pas en mesure de la mettre en 8uvre. l est donc difficile
d'envisager de l'utiliser en routine. De surcrot, la recherche d'amibes dans les TAR n'est pas
forc.ment utile si la pr.sence de L. pneumophila est matris.e. (opinion bas.e sur des essais de
recherche d'amibes et de L. pneumophila en parallle dans environ 200 TARs.). Elle peut en
revanche se r.v.ler int.ressante en cas de sur-contamination post-traitement.
Certains acteurs notent en effet un regain de viabiIit. des L. pneumophila 7 10 jours aprs Ie
traitement d'une instaIIation, mettant en doute I'int.rt sanitaire des traitements choc sur le
long terme. L'hypothse avanc.e pour expliquer ce ph.nomne est la destruction des Legionella spp.
et/ou des flores interf.rentes qui sont susceptibles de limiter le d.veloppement de L. pneumophila par
un ph.nomne de concurrence. La r.tention des L. pneumophila dans le biofilm et dans les amibes
oM elles sont prot.g.es des traitements et l'.radication de la flore libre permet leur avis une
recolonisation sp.cifique et accrue par L. pneumophila. Ainsi, Ia pr.sence de concentrations
reIativement .Iev.es en Legionella spp. pourrait permettre de Iimiter Ia proIif.ration de L.
pneumophila et ainsi Iimiter Ie risque sanitaire qui y est associ.. l est indiqu. que les m.thodes
destructives qui comptabilisent de fait .galement les Legionella contenues dans les protozoaires
permettent de mieux appr.hender ce risque
10.2.5 Comparaison des m.thodes (corr.Iations, pr.dictivit. et seuiIs de d.cision)
La position des acteurs quand Ia comparabiIit. des m.thodes et des .I.ments que I'on peut
tirer de cette comparaison diverge fortement. Certains considrent que Ia chose n'est
simpIement pas possibIe et s'en tiennent Ia m.thode r.gIementaire. Le fait qu'il n'existe aucun
seuil r.glementaire disponible pour les autres m.thodes est un frein d.clar. leur utilisation.
A I'inverse, Ies auditions font .tat de deux tentatives de comparaison de m.thodes cherchant
tre pr.dictive et fixer des seuiIs de d.cisions. Dans Ies deux cas, Ia comparaison ne
concerne que Ia cuIture et Ia PCR. De fait, iI sera difficiIe pour Ie groupe de travaiI de formuIer
un avis concernant ces points pour Ies autres m.thodes envisageabIes partir des auditions.
l apparat clairement tous les acteurs concern.s que les UG et les UFC sont deux unit.s
diff.rentes, ne correspondant l'.vidence pas la mme chose. Toutefois, les r.sultats de recherche
de L. pneumophila par culture (UFC) et par PCR (UG) peuvent souvent tre li.s.
Pour un des acteurs auditionn.s, une Iecture anticip.e des r.suItats de cuIture (avant Ie d.Iai
d'obtention d'un r.suItat finaI pr.conis. par Ia norme NF T90-431, 14 jours aprs
I'ensemencement) est reIativement pr.dictive des r.suItats finaux : Ie r.suItat est identique au
r.suItat finaI dans 96 % des cas ds Ie 5
me
ou 6
me
jour et dans 85% des cas entre Ie 3me et Ie
4me jour. Les r.sultats d'analyse obtenus par PCR seraient quant eux pr.dictifs de ceux obtenus
par culture dans tous les cas pour le d.nombrement de L. pneumophila. A titre d'exemple, pour l'un
des acteurs auditionn.s, des r.sultats obtenus par culture en UFC/L plus importants que ceux
obtenus en q-PCR en UG/L ne repr.sentent que moins d'1% des cas. En outre, il a .t. rapport. que
lorsque le d.nombrement de L. pneumophila d.passe 100 000 UFC/L, les r.sultats par q-PCR et
culture sont identiques.
Pour deux autres acteurs, Ies r.suItats pr.sent.s pour Ies TAR ne montrent pas une
corr.Iation directe entre Ia cuIture et Ia q-PCR, mais montrent que Ia q-PCR est pr.dictive
97% des r.suItats n.gatifs obtenus par cuIture. En revanche Ia pr.dictivit. positive est pIus
Anses
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faibIe. Ceci est interpr.t. par les acteurs comme le fait que les Legionella d.tect.es par q-PCR dans
les .chantillons des TAR sont vivantes mais cultivent difficilement sur les milieux de culture g.los.s
utilis.s dans le cadre de la m.thode normalis.e par culture. ParadoxaIement, pour I'un des deux
acteurs, ceci est moins vrai pour I'ECS avec seuIement 89 % de vaIeur pr.dictive n.gative. De
fait, par rapport Ia cuIture, Ia vaIeur pr.dictive n.gative de Ia q-PCR sembIe moindre pour Ies
ECS, mais Ia majorit. des faux n.gatifs mesur.s par q-PCR et mis en .vidence par cuIture,
sont en dessous du seuiI d'aIerte de Ia cuIture, ce qui de I'avis de I'acteur, enIve du poids
cet .cart. L'auteur d'une autre .tude rapporte n.anmoins que 14 % des .chantiIIons donnent des
r.suItats en dessous du seuiI d'aIerte en PCR, aIors qu'iIs sont au dessus du seuiI d'aIerte en
cuIture (au dessus du seuiI d'action en cuIture pour 2% d'entres eux). La concordance troublante
des deux r.sultats a .t. remarqu.e par le groupe de travail. Cela peut tre interpr.t. aussi bien
comme un point de d.saccord entre les m.thodes que comme un positionnement erron. des seuils
de d.cisions actuels. En effet, toutes Ies .tudes reposent sur Ia cuIture comme r.f.rence, aIors
mme que Ia m.thode par cuIture est critiquabIe dans certains de ses aspects et peut tout au
moins susciter des questions en termes de positionnement des seuils de d.cisions.
Selon les r.sultats d'une .tude europ.enne (.tude Emile) pr.sent.e au groupe de travail, 10 UG/L
(ou 1 log UG/L) seraient environ .quivalentes 1 UFC/L. Dans cette .tude, les seuils d'alerte (10
3
UFC/L) et d'action (10
4
UFC/L) pris en compte pour la culture sont ceux recommand.s par les
documents guides europ.ens pour les ECS et TAR et ne sont pas ceux de la r.glementation
franaise. Cette .tude propose Ia mise en pIace d'un aIgorithme de d.cision. Cette proposition
est consid.r.e par Ie groupe de travaiI comme reIativement novatrice par rapport ce qui a .t.
vu jusqu'ici.
Les auteurs de I'.tude pr.conisent pour Ies TAR un seuiI d'aIerte pour L. pneumophila 10
4
UG/L et un seuiI d'action 10
5
UG/L. Concernant Legionella spp. Ies auteurs pr.conisent des
seuiIs d'aIerte et d'action respectivement de 10
6
UG/L et 10
7
UG/L. Pour Ies ECS, Ia
correspondance des seuiIs d'action et d'aIerte des deux m.thodes est trs bonne aussi bien en
recherchant Legionella spp (67 %) que L. pneumophila (74 %). Dans Ies deux cas Ies seuiIs
d'aIerte et d'action propos.s sont respectivement pour L. pneumophila de 10
4
UG/L et 10
5
UG/L
et pour Legionella spp. de 5 10
4
UG/L et 5 10
5
UG/L. L'aIgorithme de d.cision pr.sent. n'avait
pas encore .t. pubIi. au moment de I'audition et sa vaIidit. n'.tait pas confirm.e
52
Un autre acteur indique que Ia correspondance mise en .vidence par I'.tude europ.enne EmiIe
.voqu.e ne tient pas compte du fait que Ia m.thode par cuIture n'est pas Iin.aire. Le seuiI
d'action propos. dans cette .tude serait, d'aprs Iui, justement pIac. une concentration
correspondant au d.crochement de Iin.arit. de Ia m.thode, ce qui en affecterait Ia vaIidit.. Ce
point demande donc tre v.rifi..
.
Les rendements respectifs des m.thodes compar.es semblent .galement poser question. Le
rendement minimum exig. par la m.thode PCR telle que d.crite dans la norme est de 0,6 log
(25%). En pratique, il atteint en moyenne des valeurs proches de 100 % avec des kits commerciaux
certifi.s par "Afnor validation" et les r.sultats minimums ne sont jamais inf.rieurs 50%. Le
rendement de la culture est de l'ordre de 10% en cas de filtration de l'.chantillon et de moins de 1%
en cas de traitement acide (En l'absence d'autre r.f.rence, la r.f.rence prise en compte pour calculer
le rendement est la culture sans filtration, dont le rendement est consid.r. tre de 100%, mme si
cette hypothse n'est pas r.aliste).
SeIon I'un des acteurs, Ia cuIture est Iin.aire entre 250 et 5000 et au dessus de 25000. La q-
PCR quant eIIe est Iin.aire au dessus de 1000 Legionella par Iitre. Avec un rendement de
100% de Ia q-PCR, compte tenu des Iin.arit.s des deux m.thodes, Ies r.suItats de Ia q-PCR et
de Ia cuIture ne seront comparabIes qu'au dessus de 25 000 Legionella par Iitre. Si Ie
rendement n'est que de 25% pour Ia q-PCR, q-PCR et cuIture donnent des r.suItats
comparabIes entre 1000 et 10000 Legionella par Iitre (concentration initiaIement mesur.e pour
Ia cuIture).
Les lin.arit.s et les rendements respectifs des m.thodes permettent de situer des valeurs cibles
.quivalentes pour l'analyse par PCR et culture.
52
l faut signaler ici que les r.sultats de l'.tude Emile ont .t. publi.s trs peu de temps avant la publication du pr.sent rapport
avec des seuils d'alerte et d'action l.grement diff.rents de ceux qui avaient .t. .voqu.s pendant les auditions. Dans cette
publication, les auteurs proposent un seuil d'alerte en L. pneumophila 5.10
3
UG/L et un seuil d'action 5.10
4
UG/L (Lee et al.
2011). Cette publication a .t. soumise au groupe de travail M.thode de d.nombrement de L.gionelles dans l'eau , le 24
f.vrier 2011. Ce dernier estime qu'elle ne remet pas en cause le raisonnement conduisant lS.tablissement de valeurs cibles
dans le pr.sent rapport.
Anses
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- 1 000 UFC / 2500 UG
- 10 000 UFC / 25 000 UG
- 100 000 UFC et 250 000 UG
A partir de ces donn.es, cet acteur pr.conise Ies niveaux de d.cision suivants pour Ies
Legionella pneumophila d.nombr.es par q-PCR seIon Ia norme XP T 90-471:
- ECS
U < 2 500 UG/L : CibIe
U 2 500 UG/L : AIerte
U 25 000 UG/L : Action
- TAR
U < 2 500 UG/L : CibIe
U 2 500 UG/L : AIerte
U 25 000 UG/L : Action
U 250 000 UG/L : Arrt de I'instaIIation
Le groupe de travail estime que l'introduction de l'.talon national de q-PCR amnera probablement
cet acteur reconsid.rer les valeurs cibles et les niveaux de d.cisions pr.conis.s. Selon cet acteur,
la sensibilit. de la q-PCR est sup.rieure celle de la culture (d.tection de L. pneumophila dans 20%
des installations versus 5% par culture) et sa valeur pr.dictive n.gative est excellente (98%). En
outre, elle fournit un indicateur de risque pr.cieux, car une valeur de q-PCR positive correspond un
risque de culture positive dans un cas sur 4. Cet acteur signale que ces valeurs ne sont pas
seulement un modle, mais qu'elles sont d.j appliqu.es de longue date au pilotage d'installations,
en faisant uniquement appel aux r.sultats de q-PCR. l faut signaler ici que l'acteur en question
continue, en parallle, de r.aliser des d.nombrements par culture, selon la pr.conisation de la
r.glementation. SeIon Iui, ce jour, Ies instaIIations (TAR ou ECS) g.r.es de cette manire n'ont
jamais rencontr. de probIme mis en .vidence par Ies r.suItats de d.nombrements par
cuIture, qui n'aient pas .t. d.tect.s et g.r.s pr.aIabIement grce aux r.suItats de q-PCR. Pour
Ie groupe de travaiI, cette pr.cision est susceptibIe de renforcer Ia vaIeur de Ia proposition de
cet acteur.
Anses
F.vrier 2011 page 110 / 144
11 ConcIusions et recommandations
L'analyse men.e par le groupe de travail dans le cadre de cette expertise, notamment concernant les
valeurs cibles, l'a amen. prendre en compte certains .l.ments du risque sanitaire sans pour autant
r.aliser une .valuation des risques. Ainsi, le groupe de travail s'est notamment int.ress., la
virulence de L. pneumophila versus L. spp, [ la signification sanitaire de la pr.sence de Legionella
viables non cultivables ou la signification sanitaire des seuils de gestion r.glementaires existants.
De la mme manire, il a .galement .t. pris en consid.ration les proc.dures de gestion, notamment
de d.sinfection, qui peuvent avoir un impact sur les r.sultats de d.nombrement de Legionella
examin.es.
11.1 ConcIusions et recommandations g.n.raIes court terme
11.1.1 Les m.thodes pertinentes pour une utiIisation en routine court terme
nd.pendamment des caract.ristiques et performances d'une m.thode analytique, pour une
application en routine court terme dans un cadre r.glementaire, il importe de disposer d'une
m.thode dont le protocole est pr.cis.ment d.crit et valid. par de nombreux laboratoires, sur un grand
nombre d'.chantillons. Actuellement, seules les m.thodes normalis.es offrent cette garantie. Les
deux m.thodes de d.nombrement de Legionella dans l'eau normalis.es ce jour sont la culture (NF
T90-431 et NF EN SO 11731-2
53
Cela ne signifie pas que ces deux m.thodes sont consid.r.es sup.rieures aux autres en termes de
richesse d'informations apport.es ou de performances, mais seulement qu'elles ne n.cessitent pas
d'.tudes compl.mentaires pour tre applicables. D'autres m.thodes ont .t. identifi.es comme
potentiellement int.ressantes pour le d.nombrement de Legionella dans l'eau, mais demandent tre
d.velopp.es, stabilis.es et test.es sur de multiples .chantillons, avant qu'il soit possible d'envisager
leur application en routine, laquelle ne pourra se faire qu' moyen ou long terme.
) et la q-PCR (NF T90-471). Les recommandations en vue d'une
mise en 8uvre court terme dans un cadre r.glementaire ne peuvent donc raisonnablement porter
que sur ces deux m.thodes.
11.1.2 Choix d'une m.thode appIicabIe aux eaux chaudes sanitaires et aux eaux des tours
a.ror.frig.rantes
En situation de suivi de routine, dans lequel les d.lais de r.ponse ne constituent pas un critre
prioritaire, il est pr.conis. de laisser la possibilit. d'utiliser la m.thode par cuIture ou Ia m.thode
par q-PCR. La m.thode pourra tre choisie en fonction du contexte local : pr.sence d'inhibiteurs, flore
interf.rente, accessibilit. aux techniques, etc. Lorsque l'analyse sera r.alis.e par q-PCR, il est
cependant pr.conis., en cas de d.passement de la valeur cible, une mise en culture d'un .chantillon
afin de disposer de la souche d.nombr.e, en vue d'.ventuelles analyses compl.mentaires. Les
souches mises en culture seront conserv.es pendant les d.lais d.j pr.vus par la r.glementation en
fonction des diff.rents cas de figure.
Si des cas group.s ou un cas nosocomiaI de l.gionellose sont av.r.s, compte tenu de l'importance
d'identifier le r.servoir infectieux le plus rapidement possible, le groupe de travail recommande la
m.thode dont Ia mise disposition des r.suItats est Ia pIus rapide. Ainsi, il est pr.conis. de
privil.gier, selon le diagnostic biologique, le d.nombrement de L. pneumophila ou L. spp par q-PCR,
suivie dSune mise en culture pour une comparaison des souches environnementales et cliniques (si
elles ont .t. isol.es). Dans le cas oM la m.thode de d.nombrement par q-PCR ne serait pas
disponible, il est pr.conis. d'utiliser la m.thode de d.nombrement par culture, en conservant l aussi
les souches d.nombr.es pour d'.ventuelles .tudes compl.mentaires. En cas de l.gionellose L.
pneumophila, la recherche dans l'environnement inclura l'identification du s.rogroupe correspondant
au cas clinique. En cas de l.gionellose due une autre espce que L. pneumophila, la recherche de
Legionella spp sera entreprise.
11.1.3 Choix des critres d'interpr.tation des r.suItats seIon Ies m.thodes
L'utilisation d'une m.thode analytique va de pair avec la d.finition de critres d'interpr.tation de ses
r.sultats. Aussi, avant d'envisager l'utilisation d'une m.thode de d.nombrement de Legionella, dans
53
Etant donn. le peu d'exemples d'application de la norme NF EN SO 11731-2 en France, les pr.sentes recommandations
sont essentiellement bas.es sur la norme NF T90-431.
Anses
F.vrier 2011 page 111 / 144
le cadre de la surveillance sanitaire des eaux chaudes sanitaires et des tours a.ror.frig.rantes, il
apparat n.cessaire de fixer des valeurs cibles au-del desquelles des actions de gestion pourraient
tre envisag.es.
A l'heure actuelle, ces valeurs cibles ne peuvent pas tre bas.es sur les seules donn.es
.pid.miologiques du fait :
D du peu de publications disponibles sur le sujet et des fortes incertitudes qu'elles mettent en
.vidence ;
D de la difficult. d'identification de l'origine environnementale des cas de l.gionellose (possible
dans 20% des cas d.clar.s) ;
D du grand nombre de facteurs autres que la concentration en Legionella pneumophila dans l'eau
des installations intervenant dans la survenue des l.gionelloses (m.t.orologie, taille des
gouttelettes produites par les installations, .tat de viabilit. et de virulence des souches de
Legionella pr.sentes dans l'eau, etc.).
Aussi, la d.termination des valeurs cibles doit se fonder sur une approche pragmatique, en exploitant
les .l.ments disponibles.
11.1.3.1 Valeurs cibles pour la m.thode par culture
En 2001, le Conseil sup.rieur d'hygine publique de France (CSHPF) a propos. des valeurs cibles,
sur la base des connaissances scientifiques et des observations de terrain disponibles la date de
cette proposition (Dubrou et al. 2002). Les valeurs cibles propos.es n'.taient pas fond.es sur une
dose-r.ponse
54
Ces valeurs cibles ont .t. reprises dans la r.glementation franaise.
chez l'homme.
D Dans le cas des eaux chaudes sanitaires
Pour la population g.n.rale, la r.glementation franaise en vigueur, fixe la vaIeur cibIe en L.
pneumophila 10
3
UFC/L.
Pour les patients haut risque (immunod.prim.s), la r.glementation pr.conise de ne pas
d.passer le seuil de d.tection de la m.thode par culture (selon la norme NF T90-431).
Selon les donn.es de la litt.rature, la concentration en L. pneumophila en dessous de laquelle le
risque de l.gionellose est n.gligeable ou acceptable pour la population g.n.rale est comprise
entre 10
4
ou 10
5
UFC/L dans les eaux chaudes sanitaires, malgr. l'absence de dose-r.ponse
connue chez l'homme.
L'examen de la bibliographie et les auditions d'acteurs du systme de surveillance des Legionella
dans les eaux chaudes sanitaires n'ont pas mis en .vidence d'argument justifiant, d'un point de
vue sanitaire, une modification de ces valeurs cibles.
D Dans le cas des tours a.ror.frig.rantes
La r.glementation franaise en vigueur, concernant les tours a.ror.frig.rantes, fixe des
vaIeurs cibIes en Legionella spp. :
- seuil d'acceptabilit. de l'eau d'appoint : limite de quantification de la m.thode normalis.e
utilis.e ;
- seuil d'action pour l'eau de l'installation : 10
3
UFC/L ;
- seuil d'arrt pour l'eau de l'installation : 10
5
UFC/L.
La litt.rature et les auditions d'acteurs du systme de surveillance des tours a.ror.frig.rantes
mettent en .vidence une difficult. d'interpr.tation des r.sultats li.e au choix de la cible du
d.nombrement. En effet, l'espce responsable de la plupart des cas de l.gionelloses d.clar.s
.tant Legionella pneumophila, il est difficile d'interpr.ter un d.passement de seuil en Legionella.
spp. d'un point de vue sanitaire. Ces valeurs doivent avant tout tre consid.r.es comme des
valeurs de gestion.
11.1.3.2 Valeurs cibles pour la m.thode par q-PCR
Le niveau actuel des connaissances ne permet pas d'.tablir une valeur cible de L. pneumophila la
q-PCR (en UG/L) sur les bases d'une dose r.ponse chez l'homme.
54
Relation sp.cifique d'une voie entre des niveaux d'exposition un agent dangereux et l'indice observ. d'un effet donn..
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F.vrier 2011 page 112 / 144
Cependant, les b.n.fices sanitaires potentiels de l'utilisation de la q-PCR, du simple fait de la rapidit.
de sa mise en 8uvre et de l'obtention de r.sultats sp.cifiques de L. pneumophila, incitent mettre en
place les outils permettant l'utilisation de cette technique en routine. En effet, dans de nombreux cas,
elle permettrait de d.tecter et donc de g.rer la contamination d'une installation beaucoup plus
rapidement qu'avec la culture. Dans ce contexte, l'.tablissement de valeurs cibles est primordial.
Les seuls r.f.rentiels actuels sont les valeurs cibles d.j pr.sentes dans la r.glementation pour la
m.thode par culture. Les retours d'exp.rience li.s leur utilisation pour la surveillance des l.gionelles
dans l'eau ne mettent pas en .vidence la n.cessit. de les modifier. l apparat donc raisonnable de
d.finir les valeurs cibles applicables la q-PCR de manire ce que le taux de r.sultats sup.rieurs
ces valeurs cibles, obtenus avec une mme s.rie de pr.lvements, soit .quivalent pour la culture et
pour la q-PCR.
Cependant les unit.s des diff.rentes m.thodes de d.nombrement de Legionella apparaissent
h.t.rognes et difficilement comparables : unit.s g.nomes/L (UG/L) pour les m.thodes par biologie
mol.culaire et unit.s formant colonies/L (UFC/L) pour les m.thodes par culture. En l'absence de
donn.e publi.e, les valeurs propos.es sont principalement bas.es sur les r.sultats de la surveillance
des l.gionelles dans l'environnement, pr.sent.s par deux acteurs auditionn.s.
D Dans le cas des eaux chaudes sanitaires
Sur la base de ce raisonnement des valeurs cibles peuvent tre .labor.es pour les points
d'usage risque
55
En ce qui concerne les points d'usage risque utilis.s par des patients haut risque dans les
.tablissements de sant., pour assurer une protection sanitaire maximale, il semble raisonnable
de proposer des valeurs cibles .gales au seuil de d.tection de la m.thode.
dans les .tablissements recevant du public, l'exclusion de ceux utilis.s par
des patients haut risque.
D Dans le cas des tours a.ror.frig.rantes
L'.tablissement de valeurs cibles en Legionella. spp., adapt.es la q-PCR, pourrait tre
envisag. sur la base du raisonnement d.velopp. ci-dessus.
Cependant, certains essais montrent une bien meilleure concordance relative entre les r.sultats
obtenus par culture et par q-PCR pour le d.nombrement de L. pneumophila que pour celui de
Legionella. spp. D'un point de vue analytique, il semble donc plus adapt. de d.terminer une
valeur cible en L. pneumophila pour la q-PCR.
D'un point de vue sanitaire, l'.tablissement de valeurs cibles en L. pneumophila apparat
.galement plus pertinent.
Les valeurs r.glementaires actuelles en Legionella. spp. pourraient tre consid.r.es plus
protectrices d'un point de vue sanitaire que les mmes valeurs appliqu.es L. pneumophila,
dans la mesure oM ces dernires font partie des Legionella spp. On rappellera n.anmoins que :
U ce jour, aucune autre espce que L. pneumophila n'a pu tre identifi.e chez un patient
atteint de l.gionellose, dont l'origine de la contamination ait .t. attribu.e une tour
a.ror.frig.rante ;
U la proportion de L. pneumophila parmi les Legionella spp. varie fortement dans le temps
et il n'existe pas d'outil fiable permettant de la pr.voir.
Aussi, il parat fond. de proposer aujourd'hui des valeurs cibles en L. pneumophila, pour la
surveillance sanitaire des tours a.ror.frig.rantes, aussi bien pour la m.thode par culture que
pour la m.thode par q-PCR.
Ce dispositif pr.sente quatre avantages importants :
D d'un point de vue sanitaire :
U faciliter l'interpr.tation des r.sultats de surveillance ;
U ouvrir la possibilit. d'utiliser la q-PCR pour la surveillance des tours a.ror.frig.rantes,
pour b.n.ficier de la grande r.activit. de cette technique, avec la possibilit. de d.tecter
une contamination beaucoup plus rapidement que ce n'est le cas actuellement ;
55
L'arrt. du 1er f.vrier 2010 relatif la surveillance des l.gionelles dans les installations de production, de stockage et de
distribution d'eau chaude sanitaire, d.finit point d'usage risque comme tout point d'usage accessible au public et
pouvant produire des azrosols d'eau chaude sanitaire susceptible d'tre contaminze par les lzgionelles ; il s'agit notamment des
douches, des douchettes, des bains [ remous ou [ jets. L
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D du point de vue de la gestion des installations : le choix de d.nombrer L. pneumophila dans les
tours a.ror.frig.rantes la place de Legionella spp. permettrait :
U d'arrter les installations uniquement pour une raison sanitaire. Le nombre d'arrts de
fonctionnement des tours a.ror.frig.rantes sans fondement sanitaire s'en verrait
significativement r.duit ;
U de v.rifier plus rapidement l'efficacit. des actions correctives men.es en cas d'arrt
d'une installation.
11.1.4 Propositions de vaIeurs cibIes
Les valeurs cibles propos.es ici reposent sur un avis d'expert en l'.tat actuel des connaissances.
Elles sont propos.es dans l'objectif d'am.liorer le niveau de s.curit. sanitaire.
Les valeurs cibles propos.es pour la q-PCR n.cessitent d'tre consolid.es durant une p.riode
probatoire, pendant laquelle une .tude m.trologique serait men.e afin de comparer les r.sultats
d'analyse obtenus avec les deux m.thodes utilis.es en parallle sur un nombre suffisant
d'.chantillons.
Les valeurs propos.es ici sont propres chaque m.thode. Elles visent cependant atteindre les
mmes objectifs en termes de gestion des risques.
11.1.4.1 Pour les eaux chaudes sanitaires :
En situation de surveillance de routine
' Dans le cas des eaux destin.es la consommation humaine fournies au niveau de points
d'usage risque
56
dans des .tablissements recevant du public, l'exclusion de ceux utilis.s par
des patients haut risque
57
Pour les r.sultats d'analyses obtenus par cuIture, aucune des donn.es r.pertori.es ne permet de
justifier une modification de la r.glementation en vigueur en France concernant l'objectif cible
pr.conis. de concentration en L. pneumophila ne pas d.passer, soit 10
3
UFC /L.
dans les .tablissements de sant. :
Pour les r.sultats obtenus par q-PCR, la concentration seuil en L. pneumophila ne pas d.passer est
de 5.10
3
UG /L. En suivant la logique d.crite dans le chapitre 11.1.3., cette recommandation de valeur
cible pour la q-PCR est bas.e sur les donn.es suivantes :
- deux .tudes non publi.es, pr.c.demment .voqu.es au chapitre 10.2., proposent des seuils en L.
pneumophila de 2,5.10
3
UG /L et de 10. 10
3
UG /L dans les eaux chaudes sanitaires ;
- compte tenu des incertitudes de l'.tape de q-PCR (+/- 0,15 log selon la norme NF T90-471), un
r.sultat .gal 5.10
3
UG /L, implique que l'.chantillon contient entre 3,5.10
3
et 7.10
3
UG /L.
- Les limites de quantification des kits commercialis.s pour le d.nombrement de Legionella par q-
PCR sont comprises entre 0,5.10
3
et 0,9.10
3
UG /L pour un .chantillon de 1 litre d'eau analyser
et entre10
3
et 1,8.10
3
UG /L pour un .chantillon de 0,5 litre, ce qui est proche de 3,5.10
3
UG /L.
Ainsi, compte tenu de l'incertitude, de l'.tape de q-PCR .voqu.e ci-dessus, un r.sultat inf.rieur
5.10
3
UG /L n'est pas loin de correspondre un .chantillon qui peut en r.alit. contenir une
concentration en L. pneumophila .gale ou inf.rieure la limite de quantification de la m.thode.
Compte tenu de ces limites analytiques, en gardant des volumes d'.chantillon du mme ordre de
grandeur, il semble donc difficilement envisageable d'exiger une concentration en L. pneumophila
plus basse.
Ces deux vaIeurs cibIes ne sont pas sensu stricto .quivaIentes.
En cas de d.passement des valeurs cibles propos.es et en fonction de la m.thode de d.nombrement
choisie, des actions de gestion doivent tre envisag.es par le responsable de l'installation. Au cas oM
des r.sultats non satisfaisants
58
56
L'arrt. du 1er f.vrier 2010 relatif la surveillance des l.gionelles dans les installations de production, de stockage et de
distribution d'eau chaude sanitaire, d.finit point d'usage risque comme tout point d'usage accessible au public et
pouvant produire des azrosols d'eau chaude sanitaire susceptible d'tre contaminze par les lzgionelles ; il s'agit notamment des
douches, des douchettes, des bains [ remous ou [ jets. L
sont obtenus, il convient de rechercher l'origine de la contamination
en confrontant les r.sultats d'analyse d'eau pr.lev.e en diff.rents points du r.seau de distribution
57
Circulaire DGS 2002 243, du 22 avril 2002 : les patients dits patients haut risque sont les immunod.prim.s s.vres,
et particulirement les immunod.prim.s aprs transplantation ou greffe dSorgane et les immunod.prim.s par corticoth.rapie
prolong.e (0,5 mg/kg de prednisone pendant 30 jours ou plus, ou .quivalent) ou r.cente et haute dose (cSest--dire
sup.rieure 5 mg/kg de prednisone pendant plus de 5 jours)
58
D.passement des seuils de gestion fix.s
Anses
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d'eau chaude. l importe aussi de v.rifier la concentration en L. pneumophila dans l'eau du r.seau
d'eau froide. Le taux de points conformes et la localisation des points non-conformes peuvent
.galement apporter des informations utiles au gestionnaire de l'installation. Les mesures de gestion
de la qualit. des eaux incluent outre la d.sinfection, des am.liorations envisager telles que la
suppression de bras morts, et de points de soutirage non utilis.s ou l'.quilibrage du d.bit. Dans tous
les cas, une v.rification de l'efficacit. des mesures de gestion choisies sera indispensable.
La gestion technique des installations d'eau chaude sanitaire peut permettre de d.tecter, voire
d'anticiper des dysfonctionnements. Elle peut tre r.alis.e par le d.nombrement de Legionella spp
comme par des indicateurs beaucoup plus simples, tels qu'un suivi rigoureux de temp.rature bas. sur
un nombre suffisant de points de mesure.
' Dans le cas des eaux destin.es la consommation humaine fournies au niveau de points
d'usage risque utilis.s par des patients haut risque dans les .tablissements de sant. :
Selon la r.glementation en vigueur en France, (Arrt. du 1er f.vrier 2010) l'objectif cible pr.conis. de
concentration en L. pneumophila ne pas d.passer est le seuil de d.tection de la m.thode par
culture
59
. Le groupe de travail pr.conise de conserver cet objectif pour les r.sultats de surveillance
obtenus par culture et recommande d'appliquer ce mme objectif de non d.passement du seuil de
d.tection de la m.thode utilis.e, aux r.sultats obtenus par q-PCR
60
Concernant les points d'usage risque utilis.s par des patients haut risque, il convient, en plus de la
surveillance vis--vis de Legionella pneumophila, de proc.der une analyse de risque .tendue au
genre Legionella et toutes autres bact.ries pathognes. Celle-ci sera r.alis.e, par le Comit. de lutte
contre les infections nosocomiales ou toute organisation charg.e des mmes attributions .voqu.es
dans l'arrt. du 1
er
f.vrier 2010, relatif la surveillance des l.gionelles dans les installations de
production, de stockage et de distribution d'eau chaude sanitaire.
.
En situation de surveillance aprs une dzcontamination
Aprs une d.contamination chimique ou thermique, il est n.cessaire de v.rifier son efficacit. en
d.nombrant L. pneumophila dans un .chantillon pr.lev. quelques jours aprs le traitement (circulaire
DGS 2002 / 243 du 22 avril 2002). Le fascicule de documentation FD T90-522, "Guide technique de
pr.lvement pour la recherche de Legionella dans les eaux" (2006), pr.conise de r.aliser le
pr.lvement au minimum 48 heures aprs un traitement de d.contamination choc. Ce d.lai est
notamment pr.vu pour permettre le renouvellement de l'eau dans le r.seau et l'.limination des
.ventuelles bact.ries mortes. En termes d'impact sur les r.sultats des m.thodes, la probabilit. de
d.nombrer de fortes proportions de bact.ries mortes, par q-PCR, ou de ne pas d.nombrer de fortes
proportions de bact.ries VBNC par culture sont limit.s. De surcrot, dans le cas d'un traitement de
l'eau par un d.sinfectant chlor., il est n.cessaire de traiter lS.chantillon dSeau par du thiosulfate de
sodium pour neutraliser le chlore. Dans ce cas, le risque d'inhibition par le chlore de la croissance des
bact.ries sur les milieux de culture et donc le risque de faux n.gatifs, sont limit.s.
Le choix de la m.thode la plus appropri.e (culture ou q-PCR) peut tre laiss. la discr.tion du
gestionnaire de l'installation. Dans le cas de la culture, comme dans celui de la q-PCR, la
d.contamination peut tre consid.r.e suffisante si le r.sultat de l'analyse met en .vidence un nombre
de L. pneumophila inf.rieur ou .gal la valeur cible pr.c.demment propos.e. Dans le cas contraire,
une nouvelle action de gestion doit tre envisag.e jusqu' ce que les analyses fassent .tat de
r.sultats inf.rieurs ou .gal cette valeur cible.
11.1.4.2 Pour les eaux de tour a.ror.frig.rante :
En situation de surveillance de routine
Actuellement, dans un contexte sanitaire, les seuils relatifs aux tours a.ror.frig.rantes fix.s par la
r.glementation franaise concernent Legionella spp. Le groupe de travaiI propose de ne pIus
rechercher Legionella spp, mais seuIement L. pneumophila. Les valeurs cibles de concentration
en L. pneumophila pr.conis.es sont les suivantes :
R.sultats obtenus par culture :
- vaIeur ne pas d.passer pour I'eau d'appoint : limite de quantification de la m.thode (250
UFC/L) ;
59
50 UFC /L
60
Selon la norme NF T90-471, le seuil de d.tection de la m.thode par q-PCR est variable en fonction des .ventuelles dilutions
appliqu.es l'.chantillon en pr.sence d'inhibiteurs. l est important que les dilutions .ventuelles n'impactent pas la valeur cible.
Anses
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- vaIeur cibIe d'action pour l'eau de l'installation : 10
3
UFC /L ;
- vaIeur cibIe d'arrt pour l'eau de l'installation : 10
5
UFC /L.
R.sultats obtenus par q-PCR :
- vaIeur ne pas d.passer pour I'eau d'appoint : Iimite de quantification de la m.thode (limite
variable) ;
- vaIeur cibIe d'action pour l'eau de l'installation : 5.10
3
UG /L ;
- vaIeur cibIe d'arrt pour l'eau de l'installation : 5.10
5
UG /L.
En suivant la logique d.crite dans le chapitre 11.1.3., ces recommandations de valeurs cibles pour la
q-PCR sont bas.es sur les donn.es suivantes :
- deux .tudes non publi.es pr.c.demment .voqu.es proposent des valeurs cibles en L.
pneumophila, dans les tours a.ror.frig.rantes : l'une 2,5.10
3
UG /L pour le seuil d'action (10
3
UFC /L) et 2,5.10
5
UG/L pour le seuil d'arrt (10
5
UFC /L) ; l'autre 10
4
UG /L pour le seuil
d'alerte (10
3
UFC /L) et 10
5
UG /L pour le seuil d'action (10
4
UFC /L) ;
- les incertitudes de la q-PCR qui impliquent qu'un r.sultat .gal 5.10
3
UG /L, signifie que
l'.chantillon contient entre 3,5.10
3
et 7.10
3
UG /L et un r.sultat .gal 5.10
5
UG /L, entre 3,5.10
5
et 7.10
5
UG /L ;
- le fait qu'un r.sultat inf.rieur 5.10
3
UG /L n'est pas loin de correspondre un .chantillon qui
peut en r.alit. contenir une concentration en L. pneumophila .gale ou inf.rieure la limite de
quantification de la m.thode.
Les vaIeurs cibIes propos.es pour Ia cuIture et pour Ia q-PCR ne sont pas sensu stricto
.quivaIentes.
Par ailleurs, une augmentation relative significative (2 log ou plus) de la teneur en Legionella spp. par
rapport la teneur en Legionella dans l'eau d'appoint pourrait constituer un indicateur de
dysfonctionnement de la tour a.ror.frig.rante. Le mme principe pourrait par ailleurs s'appliquer
d'autres indicateurs bact.riens, tels que l'ATP-m.trie.
En situation de surveillance aprs une dzcontamination
En cas de traitement de d.contamination dSune installation lSarrt, par suite d'une contamination
excessive ou d'un cas de l.gionellose, il est n.cessaire de rincer les circuits afin dS.vacuer les
bact.ries pr.sentes dans l'eau et le cas .ch.ant les r.sidus de produits chimiques. Les proc.dures de
d.sinfection sp.cifient que l'absence de r.sidus de d.sinfection doit tre v.rifi.e aprs le rinage.
Ainsi, le risque de voir un d.nombrement perturb. par la pr.sence de d.sinfectant (pour la m.thode
par culture) ou la pr.sence de bact.ries mortes (pour la m.thode par q-PCR), est diminu.. l est donc
recommand. de laisser la possibilit. d'utiliser la m.thode par culture ou la m.thode par q-PCR. l
convient cependant de mettre les r.sultats disposition du gestionnaire le plus rapidement possible
(q-PCR ou culture selon les contextes locaux). L'interpr.tation des r.sultats devra prendre en compte
les performances analytiques et la particularit. des m.thodes utilis.es.
Selon la r.glementation en vigueur, dans le cadre du suivi de d.contamination, en cas de
d.passement du seuil d'action, il est n.cessaire de d.nombrer L. pneumophila dans un .chantillon
pr.lev. au maximum deux semaines aprs le traitement. En cas de d.passement du seuil d'arrt, la
r.glementation demande un pr.lvement de contr?le 48h aprs la remise en service (Arrt. du 13
d.cembre 2004). La d.contamination est suffisante si le r.sultat de l'analyse met en .vidence un
nombre de L. pneumophila inf.rieur aux seuils d'action.
En cas de contaminations r.currentes d'un mme site, il convient de r.aliser des investigations
compl.mentaires incluant la conception hydraulique des installations, la pr.sence de biofilms ainsi
que celle de protozoaires.
11.1.5 Besoins d'.tudes et de recherches
En ce qui concerne la q-PCR et la culture, il est n.cessaire de mener une .tude comparative sur
diff.rentes qualit.s d'eaux (Eaux chaudes sanitaires et tours a.ror.frig.rantes), avec un grand
nombre d'.chantillons, afin de tester et le cas .ch.ant d'affiner les valeurs cibles propos.es dans le
cadre de cette expertise.
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11.2 ConcIusions et recommandations moyen et Iong termes
Des critres de choix des m.thodes ont .t. d.finis, discut.s et hi.rarchis.s dans le tableau 1
"Pertinence des critres de s.lection d'une m.thode de d.nombrement de Legionella dans l'eau dans
les contextes des ECS, des TAR et des suivis de d.contamination" (page 25).
Cela constitue une base de travail, permettant de faciliter le d.veloppement de m.thodes alternatives
de d.nombrement de Legionella dans l'eau, adapt.es aux contextes particuliers des eaux chaudes
sanitaires et des tours a.ror.frig.rantes.
Les m.thodes actueIIes ne r.pondent pas tous Ies besoins exprim.s
Les deux m.thodes normalis.es qui font l'objet des recommandations court terme apportent un
certain nombre d'informations et ont le m.rite d'tre largement d.velopp.es et utilis.es. Cependant
elles pr.sentent des limites d.j largement .voqu.es, notamment concernant leurs caract.ristiques
intrinsques.
V La m.thode par culture n'apporte pas de garantie sur sa capacit. prendre en compte
correctement des Legionella intra amibiennes ou intra v.siculaires dans la quantification ; elle ne
permet pas de d.tecter l'ensemble des Legionella viables et potentiellement pathognes ; elle est
relativement lente et fastidieuse ; elle n.cessite une bonne comp.tence technique ; elle peut tre
influenc.e par la pr.sence d'une flore autre que Legionella.
V La m.thode par q-PCR d.nombre aussi bien les Legionella mortes que vivantes ; elle ne permet
pas de disposer de souches pour des .tudes compl.mentaires ; elle est sensible la pr.sence
d'inhibiteurs.
Des r.ponses aux besoins sont potentieIIement apport.es par certaines m.thodes aIternatives,
sous r.serve de d.veIoppements et d'.vaIuations in situ
V Aucune des m.thodes alternatives de d.nombrement de Legionella d.crites dans le rapport ne
semble pouvoir satisfaire l'ensemble des attentes identifi.es par les experts. Cependant, les
principes et objectifs de certaines m.thodes d.crites permettent d'envisager de repousser
certaines des limites. l est donc important d'encourager leur d.veloppement.
V Les m.thodes de d.nombrement par q-PCR, v-PCR, culture (pour cette dernire sous r.serve de
l'introduction d'un protocole exp.rimental permettant la rupture des v.sicules amibiennes sans
rupture de la membrane bact.rienne), FSH et DS (sous r.serve de l'introduction d'un protocole
exp.rimental permettant que la sonde ou l'anticorps puisse p.n.trer les cellules amibiennes),
semblent pouvoir permettre une prise en compte des Legionella intra amibiennes ou intra
v.siculaires dans la quantification.
V Les m.thodes de d.nombrement par DVC, v-PCR, DS, DVC-FSH ou culture-FSH semblent
permettre de d.tecter uniquement les bact.ries viables ou de distinguer les bact.ries viables et
non viables. L'une des pistes .galement .voqu.es est le marquage sp.cifique des bact.ries
viables et non viables l'aide de fluorochromes marquant les cellules dont la membrane est
intgre, ou l'inverse celles dont la membrane est perm.abilis.e.
V Les m.thodes de d.nombrement par q-PCR, v-PCR, immuno-d.tection, FSH, et DS permettent
th.oriquement de d.tecter l'ensemble des Legionella viables et potentiellement pathognes.
V Les m.thodes de d.nombrement par DVC, q-PCR, v-PCR, immuno-d.tection, FSH, et DS
permettent une obtention relativement rapide des r.sultats d'analyse.
V Des am.liorations des milieux utilis.s pour les m.thodes de d.nombrement par culture
pourraient .galement permettre une r.duction du temps d'obtention des r.sultats de ces
m.thodes.
V Les m.thodes de d.nombrement par immuno-d.tection, FSH, DS, q-PCR et culture-FSH
permettent th.oriquement d'am.liorer la distinction et la quantification des s.rogroupes de L.
pneumophila autres que le s.rogroupe 1.
Besoins d'.tudes et de recherches
Les travaux du groupe de travail ont mis en .vidence des manques de connaissances qui
pourraient justifier Ia r.aIisation d'.tudes ou d'essais exp.rimentaux. A titre indicatif et sans
revendiquer l'exhaustivit., quelques pistes d'.tudes et de recherches sont propos.es.
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Pathogznicitz et gznomique
l semble opportun de mener des recherches pour am.liorer les connaissances sur les Legionella
pathognes, notamment des diff.rents clones de L. pneumophila sg1 d.j identifi.s en pathologie
humaine et leur d.tection. Cette approche n.cessiterait une .tude compl.mentaire de la composition
des g.nomes, et le d.veloppement de sondes sp.cifiques, afin de distinguer les s.quences les plus
int.ressantes dans la discrimination des espces et s.rogroupes pathognes. De mme, des
recherches pourraient tre men.es pour am.liorer les connaissances sur la notion de dose
infectieuse ainsi que sur la pathog.nicit. des Legionella viables non cultivables.
Echantillonnage
Le pr.lvement et l'.chantillonnage constituent un enjeu fort des futurs travaux de d.veloppements.
En effet, dans ces deux cas, les m.thodes analytiques applicables l'eau sont utilisables en l'.tat,
condition d'arriver disposer d'un .chantillon repr.sentatif. Aussi, il convient d'encourager le
d.veIoppement de m.thodes de pr.Ivement et d'.chantiIIonnage appIicabIes aux a.rosoIs et
biofiIms.
Prztraitement des zchantillons
Les m.thodes de pr.lvement et d'.chantillonnage utilis.es en amont des m.thodes de
d.nombrement de Legionella dans l'eau, peuvent avoir une importante influence sur la qualit. des
r.sultats obtenus.
Le d.veIoppement et I'optimisation des pr.traitements des .chantiIIons, pour adapter leurs
caract.ristiques aux m.thodes de d.tection d.j utilis.es ou en cours de d.veloppement, pourraient
permettre d'am.liorer les rendements globaux des d.nombrements de Legionella.
L'analyse des eaux trs charg.es, reste probl.matique pour l'ensemble des m.thodes utilis.es. La
capture des bact.ries par Ie biais d'anticorps sp.cifiques (s.paration immuno-magn.tique, etc.)
est, dans ce domaine, une piste int.ressante qui demande tre d.velopp.e. Elle est envisageable
en amont de la quasi-totalit. des m.thodes de d.nombrement .voqu.es. Elle peut notamment
permettre de contourner efficacement le problme de la flore interf.rente (lequel affecte la culture)
mais .galement celui des inhibiteurs (lequel handicape l'amplification g.nique par PCR). Toutefois,
une capture sp.cifique n.cessite un large panel d'anticorps recouvrant la gamme des espces et
s.rogroupes actuellement identifi.s. Ces anticorps ne sont pas tous encore disponibles ou leur qualit.
sur le plan de l'affinit. est encore perfectible. Les efforts consentis pour le d.veloppement de
nouveaux anticorps devraient s'av.rer terme un atout pr.cieux dans l'efficacit. de l'.valuation du
risque aussi bien que dans la progression de la qualit. du diagnostic m.dical.
Techniques analytiques
Chaque m.thode .tudi.e possde ses points faibles, que les d.veloppements ult.rieurs devront
s'attacher att.nuer.
Ainsi, il s'agit de s'assurer que les milieux s.lectifs utilis.s en culture pr.sentent une s.lectivit.
.quivalente en termes de d.nombrement pour les diff.rentes espces et sous-types de Legionella.
Par ailleurs, les difficult.s de la m.thode par culture d.nombrer les VBNC, alors que ces mmes
bact.ries semblent pouvoir tre revitalis.es par les protozoaires indiquent que les milieux
actuellement utilis.s pour la caract.risation des Legionella sont encore perfectibles. La mise au point
de nouveaux miIieux de cuItures pIus adapt.s, en particulier permettant la croissance de la fraction
actuellement non cultivable, est sans nul doute une voie d'am.lioration de la m.thode par culture. l
convient .galement d'.valuer l'efficacit. de nouveaux antibiotiques, diff.rents de ceux actuellement
utilis.s dans le milieu GVPC, afin de rendre plus efficace la discrimination entre Legionella et flore
interf.rente.
Comme cela a .t. .voqu., la q-PCR pourrait .galement faire l'objet d'am.liorations. Actuellement,
ses performances peuvent notamment tre affect.es par la pr.sence d'inhibiteurs. Des
d.veloppements visant limiter l'impact des inhibiteurs et optimiser l'.tape d'extraction de l'ADN
semblent une voie d'am.lioration int.ressante.
Le q-PCR ne donne pas d'indication sur l'.tat de viabilit. des bact.ries. La v-PCR semble fournir une
information sur l'.tat de viabilit. des bact.ries. Des .tudes visant tester cette m.thode sur des eaux
environnementales sont cependant encore n.cessaires pour v.rifier son potentiel.
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L'hybridation mol.culaire peut .galement contribuer r.pondre au problme du d.nombrement de
Legionella dans des eaux trs charg.es. Elle est moins sensible aux inhibiteurs que l'amplification
g.nique car elle ne fait intervenir aucune enzyme et est par ailleurs capable de d.tecter aussi bien les
cellules cultivables que les VBNC. La mise en 8uvre de ce type d'analyse pourrait passer par le
d.veloppement de biocapteurs (puces ADN, etc.) adapt.s ce type d'eau.
Le d.veloppement de kits prts l'emploi, bas.s sur les diff.rents principes d.j .voqu.s semble
.galement une voie d'am.lioration prometteuse.
Outils utilisables sur site
Une demande a .t. fortement exprim.e lors des auditions par diff.rents acteurs. Elle concerne un
besoin de d.veIoppement d'outiIs utiIisabIes sur site afin de g.n.rer le plus rapidement possible,
directement sur les lieux d'installation, des r.ponses non ambigus permettant d'am.liorer l'efficacit.
de la surveillance de la qualit. des eaux. l n'existe, l'heure actuelle, aucun systme portable
susceptible de r.aliser le d.nombrement de Legionella. De tels outils pourraient tre d.velopp.s pour
tre mis disposition des gestionnaires d'installations et des industriels.
Matrices et zcosystmes
Les .cosystmes des l.gionelles sont encore mal caract.ris.s. Des .tudes compl.mentaires sur
l'influence des conditions environnementales sur la composition physicochimique de l'eau, le biofilm,
les traitements biocides et les interactions entre les microorganismes permettrait de faire progresser
les connaissances dans ce domaine.
Bien que l'eau soit la source principale de contamination, les a.rosols sont la source principale de
diffusion leur comportement et constitution sont encore trop m.connus. Des .tudes suppl.mentaires
dans ce domaine sont n.cessaires.
Le contr?le efficace des installations passe par la maitrise des systmes biologiques qui s'y trouvent.
L'.tat des connaissances des .cosystmes microbiens complexes, en particulier des biofiIms et de
leur capacit. servir de r.servoir aux Legionella est lacunaire. Cette lacune devrait tre combl.e par
des .tudes car, actuellement, elle entrave les possibilit.s de contr?le.
Le suivi des protozoaires (amibes et cili.s) dans les installations et leur contribution la dangerosit.
des installations risque est trop largement n.glig.. Une maitrise complte du risque ne pourra tre
envisag.e sur le long terme que si ces deux paramtres sont pris en compte. Un effort sensibIe de
Ia recherche dans ces deux domaines est pr.conis..
Des .tudes comparant Ies strat.gies de suivi des instaIIations mettant en 8uvre Ies diff.rentes
m.thodes de d.nombrement disponibles, en commenant par la culture et la q-PCR, pourraient tre
propos.es, notamment en cas de d.contamination, pour optimiser les d.lais entre traitements et
pr.lvements en fonction des m.thodes.
Enfin, il semble important que le d.veloppement des futurs r.seaux intgre la probl.matique des
Legionella et anticipe autant que possible les problmes hydrauliques l'origine de d.veloppement
bact.rien.
Interprztation des rzsultats
L'absence de critres d'interpr.tation des r.suItats du point de vue sanitaire, quelles que soient les
m.thodes alternatives la culture, tient principalement au manque de donn.es analytiques obtenues
par ces diff.rentes m.thodes. A court terme, il convient d'affiner les critres d'interpr.tation des
r.sultats retenus pour la q-PCR. A moyen ou long terme, il convient d'.laborer des critres pour les
autres m.thodes qui atteindront un niveau de d.veloppement suffisant.
S'agissant des m.thodes non encore rod.es, le manque de coh.rence des essais comparatifs
mettant en 8uvre les diff.rentes technologies justifie de mettre en 8uvre des essais grande
.cheIIe. Ces essais permettront d'aboutir terme une standardisation des protocoIes, voire
leur normalisation et de disposer de donn.es suffisantes pour pouvoir les comparer.
l semble probable que l'.mergence d'une solution efficace susceptible de r.pondre au problme des
Legionella passera terme par l'.laboration d'une technique composite mettant en 8uvre plusieurs
des principes d.crits dans le pr.sent rapport. Pour autant, certaines m.thodes se situant encore des
stades trs pr.liminaires de d.veloppement, demandent tre encourag.es.
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Anses
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Annexes
Annexe 1 : Courrier de saisine de I'Afsset par Ia DGS et Ia DGPR sur Ies m.thodes de
d.tection des I.gioneIIes dans I'eau
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F.vrier 2011 page 131 / 144
Anses
F.vrier 2011 page 132 / 144
Annexe 2 : Textes r.gIementaires et I.gisIatifs reIatifs aux Legionella,
en Iigne sur Ie RESE (http://rese.sante.gouv.fr/), Ie 5 mars 2010.
ArticIes L. 1335-2-1 L. 1335-2-3
Code de la sant. publique
ArticIe R. 1321-23
D.cret n 2004-1331 du 1er d.cembre 2004 modifiant la nomenclature des installations class.es
(ndlr : crzation de la rubrique 2921)
D.crets
Arrt. du 1er f.vrier 2010 relatif la surveillance des l.gionelles dans les installations de production,
de stockage et de distribution dSeau chaude sanitaire
Arrt.s
Arrt. du 21 janvier 2010 modifiant lSarrt. du 11 janvier 2007 relatif au programme de pr.lvements
et dSanalyses du contr?le sanitaire pour les eaux fournies par un r.seau de distribution, pris en
application des articles R. 1321-10, R. 1321-15 et R. 1321-16 du code de la sant. publique
Arrt. du 22 juin 2006 modifiant lSarrt. du 2 f.vrier 1998 relatif aux pr.lvements et la
consommation dSeau ainsi quSaux .missions de toute nature des installations class.es pour la
protection de lSenvironnement soumises autorisation (ndlr : concerne les TAR)
Arrt. du 30 novembre 2005 modifiant lSarrt. du 23 juin 1978 relatif aux installations fixes destin.es
au chauffage et lSalimentation en eau chaude sanitaire des btiments dShabitation, de bureaux ou
locaux recevant du public
Arrt. du 13 d.cembre 2004 relatif aux prescriptions g.n.rales applicables aux installations
class.es pour la protection de lSenvironnement soumises d.claration sous la rubrique n 2921
nstallations de refroidissement par dispersion dSeau dans un flux dSair
Arrt. du 13 d.cembre 2004 relatif aux installations de refroidissement par dispersion dSeau dans un
flux dSair soumises autorisation au titre de la rubrique n 2921
Arrt. du 19 juin 2000 modifiant lSarrt. du 14 octobre 1937 modifi. relatif au contr?le des sources
dSeaux min.rales
Arrt. du 28 octobre 1993 modifiant lSarrt. du 2 ao`t 1977 relatif aux rgles techniques et de
s.curit. applicables aux installations de gaz combustible et dShydrocarbures liqu.fi.s situ.es
lSint.rieur des btiments dShabitation ou de leurs d.pendances
Arrt. du 23 juin 1978 relatif aux installations fixes destin.es au chauffage et lSalimentation en
chaude sanitaire des btiments dShabitation, de bureaux ou locaux recevant du public (modifiz par
larrtz du 30 novembre 2005)
Note de service DGS/EA4/2009/281 du 9 septembre 2009 relative aux investigations mener lors
de la survenue dSun ou plusieurs cas de l.gionellose proximit. de certains centres nucl.aires de
production dS.lectricit.
Circulaires, notes, ...
Note de service DGS/EA4/2009/167 du 19 juin 2009 relative la d.sinfection des r.seaux dSeau
chaude sanitaire par injection de produits base de peroxyde dShydrogne et de sels dSargent
CircuIaire DGS/EA4/2010/448 du 21 d.cembre 2010 relative aux missions des Agences r.gionales
de sant. dans la mise en 8uvre de l'arrt. du 1er f.vrier 2010 relatif la surveillance des l.gionelles
dans les installations de production, de stockage et de distribution d'eau chaude sanitaire.
CircuIaire DGS/EA4/2010/289 du 27 juiIIet 2010 relative la pr.vention des risques infectieux et
notamment de la l.gionellose dans les bains remous (spas) usage collectif et recevant du public
CircuIaire MEDAD/DPPR du 28 juin 2007 relative la vigilance accrue en p.riode dS.t.
Anses
F.vrier 2011 page 133 / 144
CircuIaire DGS/DEUS/2007/229 du 11 juin 2007 relative la diffusion du questionnaire d'.valuation
de lSutilisation du document "Le risque li. aux l.gionelles, Guide d'investigation et d'aide la gestion",
dans les services d.concentr.s (DDASS, CRE)
CircuIaire interminist.rieIIe DGS/SD7A/DSC/DGUHC/DGE/DPPR/126 du 3 avriI 2007 relative la
mise en 8uvre de lSarrt. du 30 novembre 2005 modifiant lSarrt. du 23 juin 1978 relatif aux
installations fixes destin.es au chauffage et lSalimentation en eau chaude sanitaire des btiments
dShabitation, des locaux de travail ou des locaux recevant du public
CircuIaire du 28 septembre 2006 relative aux mesures compensatoires en cas dSimpossibilit.
technique ou .conomique de r.aliser lSarrt annuel de lSinstallation pour nettoyage et d.sinfection
CircuIaire DGS/SD7A/398 du 12 septembre 2006 relative la saisie dans la base de donn.es
informatique SSE-Eaux des analyses microbiologiques r.alis.es dans le cadre du contr?le sanitaire
des eaux des .tablissements thermaux (Version : annexe 3 modifize le 15 septembre 2006)
CircuIaire DGS/DPPR/DGSNR/DRT n 2006/213 du 15 mai 2006 relative aux modalit.s
d'organisation des services de l'Etat en cas de survenue de cas group.s de l.gionellose
Note dSinformation DGS/SD7A n 2005/1628 du 15 d.cembre 2005 relative lSabrogation de la
circulaire DGS n 97/311 du 24 avril 1997 relative la surveillance et la pr.vention de la l.gionellose
et actualisation de ses annexes
CircuIaire du 8 d.cembre 2005 relative l'application des arrt.s minist.riels du 13 d.cembre 2004
relatifs aux installations de refroidissement par dispersion d'eau dans un flux d'air (rubrique 2921)
CircuIaire DGS/SD7A/DHOS/E4/DGAS/SD2/2005/493 du 28 octobre 2005 relative la pr.vention
du risque li. aux l.gionelles dans les .tablissements sociaux et m.dico-sociaux dSh.bergement pour
personnes g.es
CircuIaire DHOS/E4/DGS/SD7A/2005/417 du 9 septembre 2005 relative au guide technique sur
lSeau dans les .tablissements de sant.
CircuIaire DGS/SD5C/SD7A/DESUS/2005/323 du 11 juiIIet 2005 relative la diffusion du guide
dSinvestigation et dSaide la gestion dSun ou plusieurs cas de l.gionellose
CircuIaire DGS/SD7A/DHOS/E4/2005/286 du 20 juin 2005 relative au r.f.rentiel d'inspection des
mesures de pr.vention des risques li.s aux l.gionelles dans les .tablissements de sant.
Note dSinformation DGS/SD7A n 2005/315 du 3 mars 2005 relative aux .volutions en matire de
m.thodes dSanalyse de l.gionelles dans les .chantillons dSeau et lSinterpr.tation de leurs r.sultats
CircuIaire interminist.rieIIe DGS/DPPR/2004/413 du 6 ao`t 2004 relative la pr.vention du risque
sanitaire li. aux l.gionelles d` aux tours a.ror.frig.rantes humides
CircuIaire du 24 f.vrier 2004 relative au recensement des tours a.ror.frig.rantes humides dans le
cadre de la pr.vention du risque sanitaire li. aux l.gionelles
CircuIaire DHOS/E2/DGS/SD5C/2004/21 du 22 janvier 2004 relative au signalement des infections
nosocomiales et l'information des patients dans les .tablissements de sant.
CircuIaire DGS/SD7A n 633 du 30 d.cembre 2003 relative l'application des articles R. 1321-1 et
suivants du code de la sant. publique concernant les eaux destin.es la consommation humaine,
l'exclusion des eaux min.rales naturelles
CircuIaire MEDD du 16 d.cembre 2003 relative aux installations class.es - vigilance vis--vis du
risque de l.gionellose
CircuIaire DGS/SD7A - DHOS/E4 - DPPR/SEI n 2003/306 du 26 juin 2003 relative la pr.vention
du risque li. aux l.gionelles dans les tours a.ror.frig.rantes des .tablissements de sant.
CircuIaire DGS/SD7A - DHOS/E4 n 03/296 du 24 juin 2003 relative lSenqute visant .valuer
lSapplication par les .tablissements de sant. des mesures pr.conis.es par la circulaire du 22 avril
2002, relative la pr.vention du risque li. aux l.gionelles dans les .tablissements de sant.
CircuIaire DPPR du 24 avriI 2003 relative aux installations class.es - Tours a.ror.frig.rantes -
Pr.vention de la l.gionellose
Lettre circuIaire DGS/SD5B-n 03/58 du 21 f.vrier 2003 relative la proc.dure de gestion des
alertes sanitaires associant les services d.concentr.s, les CRE(s), l'nVS et la DGS
Anses
F.vrier 2011 page 134 / 144
CircuIaire DGS n 2002/273 du 2 mai 2002 relative la diffusion du rapport du Conseil sup.rieur
dShygine publique de France relatif la gestion du risque li. aux l.gionelles
CircuIaire DGS/SD7A/SD5C-DHOS/E4 n 2002/243 du 22 avriI 2002 relative la pr.vention du
risque li. aux l.gionelles dans les .tablissements de sant.
CircuIaire DGS/SD7A/2001/575 du 29 novembre 2001 relative l'enqute sur le bilan de la mise en
8uvre de l'arrt. du 19 juin 2000 modifiant l'arrt. du 14 octobre 1937 modifi. relatif au contr?le des
sources d'eaux min.rales
CircuIaire DGS/VS4/2000/336 du 19 juin 2000 relative la gestion du risque microbien li. lSeau
min.rale dans les .tablissements thermaux (modifize par circulaire du 29 novembre 2001)
CircuIaire DPPR/SEI/BAMET/PG/NA du 23 avriI 1999 relative aux installations class.es sous la
rubrique 2920, comprenant des tours a.ror.frig.rantes
CircuIaire DGS n 98/771 du 31 d.cembre 1998 relative la mise en 8uvre de bonnes pratiques
dSentretien des r.seaux dSeau dans les .tablissements de sant. et aux moyens de pr.vention du
risque li. aux l.gionelles dans les .tablissements risque et dans celles des btiments recevant du
public (modifize par les circulaires du 22 avril 2002 et du 28 octobre 2005)
CircuIaire DGS/VS2 n 97/311 du 24 avriI 1997 relative la surveillance et la pr.vention de la
l.gionellose (abrogze par la circulaire du 11 juillet 2005)
Guide d'investigation d'un ou plusieurs cas de l.gionellose annex. la circulaire DGS 97/311 et .dit.
dans le cadre du BEH 20-22 / 1997
Annexe V : Mesure de lutte et de pr.vention au niveau des bains remous ou des bains jets
(version corrigze) (ndlr : erreur de titre sur le document en ligne sur le site de lInVS)
CircuIaire DGS/PGE/IC n 238 du 28 mars 1989 relative la list.riose et la l.gionellose (abrogze
par circulaire du 24 avril 1997)
CircuIaire n 538 TG 3 du 3 juiIIet 1974 relative la pr.vention des accidents de br`lures par lSeau
chaude sanitaire (abrogze par circulaire du 22 avril 2002)
Anses
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Annexe 3 : Normes r.f.renc.es dans Ie rapport
NF T90-431 (septembre 2003) - Qualit. de lSeau - Recherche et d.nombrement de Legionella spp et
de Legionella pneumophila - M.thode par ensemencement direct et aprs concentration par filtration
sur membrane ou centrifugation
XP T 90-471 (AvriI 2006) - Qualit. de lSeau - D.tection et quantification des Legionella et/ou
Legionella pneumophila par concentration et amplification g.nique par r.action de polym.risation en
chane en temps r.el (RT A PCR)
NF T 90-471 (AvriI 2010) - Qualit. de lSeau - D.tection et quantification des Legionella et/ou
Legionella pneumophila par concentration et amplification g.nique par r.action de polym.risation en
chane en temps r.el (RT A PCR)
NF T90-210 (juin 2009) - Qualit. de lSeau - Protocole dS.valuation initiale des performances dSune
m.thode dans un laboratoire
XP T90-465-1 (projet de norme exp.rimentaIe du 15 f.vrier 2010) - Protocole dSestimation de
lSincertitude de mesure associ.e un r.sultat dSanalyse pour les m.thodes de d.nombrement
microbiologiques
XP T90-465-2 (projet de norme exp.rimentaIe du 15 f.vrier 2010) - Protocole dSestimation de
lSincertitude de mesure associ.e un r.sultat dSanalyse pour les m.thodes de d.nombrement
microbiologiques - Partie 1 : Les techniques .num.ratives
NF ISO 8199 (2005) - Qualit. de lSeau -- Lignes directrices g.n.rales pour le d.nombrement des
micro-organismes sur milieu de culture
NF EN ISO 11731-2 (JuiIIet 2008) - Qualit. de lSeau - Recherche et d.nombrement des Legionella -
Partie 2 : M.thode par filtration directe sur membrane pour les eaux faible teneur en bact.ries
NF EN ISO 16140 (Octobre 2003) - Microbiologie des aliments - Protocole pour la validation des
m.thodes alternatives
NF EN ISO 17994 (d.cembre 2004) - Qualit. de lSeau - Critres pour .tablir lS.quivalence entre les
m.thodes microbiologiques
ISO 19458:2006 (aout 2006) Qualit. de l'eau Echantillonnage pour analyse microbiologique
ISO/TR 13843 : 2000 (juin 2000) - Qualit. de lSeau -- Lignes directrices pour la validation des
m.thodes microbiologiques
FD ENV ISO 13843 (T90-460) (Octobre 2001) - Qualit. de lSeau - Lignes directrices pour la validation
des m.thodes microbiologiques
FD T90-522 (fascicuIe de documentation du JuiIIet 2006) Qualit. de l'eau Guide technique de
pr.lvement pour la recherche de Legionella dans les eaux
Version 0 (26 septembre 2006) du ProtocoIe de vaIidation pour les kits de d.tection et de
d.nombrement de Legionella et Legionella pneumophila par concentration et amplification g.nique
par r.action en chane de polym.risation (PCR) - Application lSanalyse microbiologique de lSeau
Version 0 (28 juiIIet 2008) du ProtocoIe de vaIidation dSune m.thode alternative commerciale par
rapport une m.thode de r.f.rence - Application lSanalyse microbiologique de lSeau
Anses
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Annexe 4 : R.gIementation et guides internationaux
Les .l.ments pr.sent.s dans cette annexe ont pour but de donner une image repr.sentative des
valeurs cibles pr.conis.es dans les r.glementations et guides internationaux pur la surveillance des
tours a.ror.frig.rantes. Cependant, la liste pr.sent.e n'est pas n.cessairement exhaustive.
TabIeau 11 : valeurs cibles de surveillance des tours a.ror.frig.rantes pr.conis.es par les r.glementations ou
les guides internationaux
Pays R.gIementation/Guide CibIes
d.nombrement
VaIeurs cibIes
Allemagne Guide 6022-3 de 2002 concernant les
exigences en termes d'hygine pour les
systmes d'air conditionn. (section 4.3.10)
Legionella Objectif / seuil
d'action : 10 UFC/L
Australie Norme int.gr.e dans la r.glementation : "Air-
handing and water systems of buildings,
microbial control, AS/NZS 3666 Australian /
New Zealand standards, Sydney (2000)
Legionella spp Objectif : LD
SeuiI d'action : 10
10
6
UFC/l
Pas de seuil d'arrt
Espagne D.cret royal 865/2003 du 4 juillet .tablit les
critres de sant. et d'hygine pour la
pr.vention et le contr?le de la l.gionellose.
annexe 4
Legionella ,
sous-entendu
spp (SO 11731
partie 1, 1998)
SeuiI d'action 1 :
10
2
UFC/l
SeuiI d'action 2 :
10
3
UFC/l
SeuiI d'arrt : 10
4
UFC/l
Finlande Pas de r.glementation nationale
Application de l'European Guidelines for
Control and Prevention of Travel Associated
Legionnaires Disease (janvier 2005)
Legionella spp SeuiI d'action : 10
3
UFC/l
Pas de seuil d'arrt
Norvge R.glementation nationale associ.
l'application de l'European Guidelines for
Control and Prevention of Travel Associated
Legionnaires Disease (janvier 2005)
Legionella spp SeuiI d'action : 10
3
UFC/l
Pas de seuil d'arrt
Pays Bas D.cret (11/09/2003) modifiant la
r.glementation sur les conditions de travail
(acte 1998, section 5 ; d.cret section 4.87)
Legionella spp Aussi faible que
possible
Royaume
Uni
Guide de r.f.rence publi. par le Health Safety
Executive (HSE) intitul. : Approved code of
practice and guidance Legionaires disease,
the control of legionella bacteria in water
system (2004)
L. pneumophila Objectif : < 10
2
UFC/l
SeuiI d'action :
10
3
UFC/l
Sude Pas de r.glementation nationale
Application de l'European Guidelines for
Control and Prevention of Travel Associated
Legionnaires Disease (janvier 2005)
Legionella spp SeuiI d'action : 10
3
UFC/l
Pas de seuil d'arrt
Suisse Le document Legionella et l.gionellose
(2005), de l'Office f.d.ral de la sant. publique
(rubrique maladies transmissibles)
Legionella spp SeuiI d'action : 10
3
UFC/l
SeuiI d'arrt : 10
4
UFC/l
USA Guide .dit. par l'Occupational Safety & Health
Administration (OSHA, 1999)
L. pneumophila SeuiIs d'action : 10
5
et 10
6
UFC/l
Pas de seuil d'arrt
Anses
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Annexe 5 : ExempIes de courriers de soIIicitation utiIis.s pour pr.parer Ies auditions
men.es par Ie groupe de travaiI "D.tection des I.gioneIIes dans I'eau".
Courrier 1
Objet : SoIIicitation pour une audition concernant Ies m.thodes de d.nombrement des
I.gioneIIes dans I'eau
Monsieur,
A la demande des Ministres en charge de la sant. et de l'environnement, l'Agence franaise de
s.curit. sanitaire de l'environnement et du travail (Afsset), .tudie actuellement la pertinence de
diff.rentes m.thodes de d.tection des l.gionelles dans les eaux chaudes sanitaires et dans les tours
a.ror.frig.rantes.
Vous avez d.pos. votre candidature pour participer au groupe de travail constitu. par l'Afsset pour
r.pondre cette demande et nous vous en remercions. Bien que vous n'ayez pas .t. retenu en tant
que membre de ce groupe de travail, la prise en compte de votre exp.rience et de vos comp.tences
nous semble essentielle pour mener bien notre r.flexion.
Dans ce contexte, nous vous sollicitons donc pour une audition avec Messieurs . et .. Cette
auditions sera conduite par le groupe de travail D.tection des l.gionelles dans l'eau et se d.roulera
le : partir de .
Compte tenu d'un temps d'audition limit., nous souhaiterions nous concentrer plus particulirement
sur les points suivants :
1 la liste des m.thodes de d.tection des l.gionelles que vous utilisez ;
1 les contextes dans lesquels ces m.thodes sont utilis.es (contextes r.glementaires, gestion
technique, types d'eau, ) ;
1 les informations que vous attendez de chacune de ces m.thodes ;
1 comment vous interpr.tez leurs r.sultats (m.thodes, seuils,) ;
1 quels types de mesures peuvent d.couler de ces r.sultats (mesures de gestion techniques,
sanitaires, ).
Nous vous proposons de pr.parer une pr.sentation trs synth.tique de 10 15 minutes
sp.cifiquement sur les points que nous souhaitons aborder, suivie d'une discussion de 30 40
minutes.
Nous souhaiterions par ailleurs, une contribution .crite de votre part, qui regroupe les diff.rents
.l.ments que vous voudrez bien nous communiquer sur les points pr.cit.s, en y pr.cisant autant que
possible des .l.ments sur lesquels nous ne passerons pas n.cessairement beaucoup de temps
pendant l'audition :
, performances des m.thodes que vous .voquerez (performances th.oriques et surtout
performances observ.es) :
A justesse (faux positifs, faux nzgatifs),
A fidzlitz (Reproductibilitz : coefficient de variance),
A sensibilitz (rendement, limites de dztection, limites de quantification en przcisant les volumes
d'zchantillons),
A spzcificitz (par rapport [ Legionella et par rapport [ L. pneumophila),
A temps d'analyse (przlvement, analyse et mise forme des rzsultats),
A zventuels autres paramtres de performance que vous utilisez pour caractzriser ces
mzthodes danalyse,
, robustesse des m.thodes utilis.es (niveaux de comp.tence n.cessaires leur mise en 8uvre,
sensibilit.s aux conditions de mise en 8uvre, ) ;
, co`t par analyse, en fonction du nombre d'analyses r.alis.es, en pr.cisant les .l.ments pris en
compte (mat.riel, r.actifs, personnel) ;
Anses
F.vrier 2011 page 138 / 144
, r.sultats d'.ventuelles comparaisons ou .valuations d'.quivalence de diff.rentes m.thodes de
d.tection des l.gionelles dans l'eau que vous auriez men.es.
Nous n'attendons pas n.cessairement cette contribution .crite avant l'audition, mais dans la mesure
du possible, nous souhaiterions en disposer d'ici ... 2010.
Je vous prie de croire, Monsieur, l'expression de mes salutations distingu.es.
Courrier 2
Objet : SoIIicitation pour une audition concernant Ies m.thodes de d.nombrement des
I.gioneIIes dans I'eau
Monsieur,
A la demande des Ministres en charge de la sant. et de l'environnement, l'Agence franaise de
s.curit. sanitaire de l'environnement et du travail (Afsset), .tudie actuellement la pertinence de
diff.rentes m.thodes de d.tection des l.gionelles dans les eaux chaudes sanitaires et dans les tours
a.ror.frig.rantes.
Vous avez d.pos. votre candidature pour participer au groupe de travail constitu. par l'Afsset pour
r.pondre cette demande et nous vous en remercions. Bien que vous n'ayez pas .t. retenu en tant
que membre de ce groupe de travail, la prise en compte de votre exp.rience et de vos comp.tences
nous semble essentielle pour mener bien notre r.flexion.
Dans ce contexte, nous vous sollicitons donc pour une audition avec Messieurs . et .. Cette
auditions sera conduite par le groupe de travail D.tection des l.gionelles dans l'eau et se d.roulera
le : partir de .
Compte tenu d'un temps d'audition limit., nous souhaiterions nous concentrer plus particulirement
sur les points suivants :
1 les m.thodes de d.nombrement des l.gionelles sur lesquelles portent les essais de
comparaison inter laboratoire ;
1 les contextes dans lesquels ces m.thodes sont utilis.es (contextes r.glementaires, gestion
technique, types d'eau, ) ;
1 les r.sultats de comparaison inter laboratoire men.s sur ces m.thodes ;
1 l'interpr.tation et la signification de ces r.sultats.
Nous vous proposons de pr.parer une pr.sentation trs synth.tique de 10 15 minutes
sp.cifiquement sur les points que nous souhaitons aborder, suivie d'une discussion de 30 40
minutes.
Nous souhaiterions par ailleurs, une contribution .crite de votre part, qui regroupe les diff.rents
.l.ments que vous voudrez bien nous communiquer sur les points pr.cit.s, en y pr.cisant autant que
possible des .l.ments sur lesquels nous ne passerons pas n.cessairement beaucoup de temps
pendant l'audition :
, performances des m.thodes que vous .voquerez (performances th.oriques et surtout
performances observ.es) :
A justesse (faux positifs, faux nzgatifs),
A fidzlitz (Reproductibilitz : coefficient de variance),
A sensibilitz (rendement, limites de dztection, limites de quantification en przcisant les volumes
d'zchantillons),
A spzcificitz (par rapport [ Legionella et par rapport [ L. pneumophila),
A temps d'analyse (przlvement, analyse et mise forme des rzsultats),
A zventuels autres paramtres de performance que vous utilisez pour caractzriser ces
mzthodes danalyse,
Anses
F.vrier 2011 page 139 / 144
, robustesse des m.thodes utilis.es (niveaux de comp.tence n.cessaires leur mise en 8uvre,
sensibilit.s aux conditions de mise en 8uvre, ) ;
, co`t par analyse, en fonction du nombre d'analyses r.alis.es, en pr.cisant les .l.ments pris en
compte (mat.riel, r.actifs, personnel) ;
, r.sultats d'.ventuelles comparaisons ou .valuations d'.quivalence de diff.rentes m.thodes de
d.tection des l.gionelles dans l'eau que vous auriez men.es.
Nous n'attendons pas n.cessairement cette contribution .crite avant l'audition, mais dans la mesure
du possible, nous souhaiterions en disposer d'ici ... 2010.
Je vous prie de croire, Monsieur, l'expression de mes salutations distingu.es.
Anses
F.vrier 2011 page 140 / 144
Annexe 6 : Synthse des d.cIarations pubIiques d'int.rts des experts par rapport au
champ de Ia saisine.
RAPPEL DES RUBRIQUES DE LA DECLARATION PUBLIQUE D'INTERETS
IP-A nterventions ponctuelles : autres
IP-AC nterventions ponctuelles : activit.s de conseil
IP-CC nterventions ponctuelles : conf.rences, colloques, actions de formation
IP-RE nterventions ponctuelles : rapports d'expertise
IP-SC nterventions ponctuelles : travaux scientifiques, essais, etc.
LD Liens durables ou permanents (Contrat de travail, r.mun.ration r.gulire )
PF Participation financire dans le capital d'une entreprise
SR Autres liens sans r.mun.ration ponctuelle (Parents salari.s dans des entreprises
vis.es pr.c.demment)
SR-A Autres liens sans r.mun.ration ponctuelle (Participation conseils d'administration,
scientifiques d'une firme, soci.t. ou organisme professionnel)
VB Activit.s donnant lieu un versement au budget d'un organisme
SYNTHESE DES DECLARATIONS PUBLIQUES D'INTERETS DES MEMBRES DU CES EAUX ET
AGENTS BIOLOGIQUES PAR RAPPORT AU CHAMP DE LA SAISINE
NOM
AnaIyse Anses :
Pr.nom
Rubrique de la DPI
Description de l'int.rt
en cas de lien dzclarz
Date de d.cIaration
des int.rts*
ABSI
Rafik 8 septembre 2010
Aucun lien d.clar. en rapport avec la saisine.
BALLET Jean-Jacques (n'a pas particip. aux travaux)
20 juin 2007
Aucun lien d.clar. en rapport avec la saisine.
BERJEAUD Jean-Marc
7 juillet 2010
VB : Co-directeur de thse sur une bact.riocine
anti-l.gionelle (bourse CFRE/Veolia)
AnaIyse Anses :
Pas de risque de conflit d'int.rt par rapport la
saisine.
BOUDENNE Jean-Luc
7 f.vrier 2011
Aucun lien d.clar. en rapport avec la saisine.
BRUGERE-PICOUX Jeanne
3 septembre 2010
Aucun lien d.clar. en rapport avec la saisine.
Anses
F.vrier 2011 page 141 / 144
CABILLIC Pierre-Jean
5 septembre 2010
Aucun lien d.clar. en rapport avec la saisine.
CAMUS Patrick
1
er
septembre 2010
Aucun lien d.clar. en rapport avec la saisine.
CREPPY Edmond
10 septembre 2010
Aucun lien d.clar. en rapport avec la saisine.
CUDENNEC Christophe
30 aout 2010
Aucun lien d.clar. en rapport avec la saisine.
DAGOT Christophe
24 octobre 2010
Aucun lien d.clar. en rapport avec la saisine.
DUKAN Sam (n'a pas particip. aux travaux)
25 novembre 2009
Aucun lien d.clar. en rapport avec la saisine.
GEHANNO Jean-Franois
13 juin 2010
Aucun lien d.clar. en rapport avec la saisine.
GUT Jean-Pierre
27 octobre 2009
AnaIyse Anses :
IP-SC : Evaluation dSune trousse pour le d.pistage
de lSinfection par le virus de lSh.patite C, pour le
Laboratoire BORAD, avec une r.mun.ration de
son organisme dSappartenance (CHU Strasbourg),
2003.
Pas de risque de conflit d'int.rt par rapport la
saisine.
HILAIRE Didier
3 septembre 2010
SR-A : Membre du groupe d.contamination
de l'OTAN depuis 1995.
AnaIyse Anses :
Pas de risque de conflit d'int.rt par rapport la
saisine.
HUMBERT Jean-Franois
17 juillet 2010
Aucun lien d.clar. en rapport avec la saisine.
LAKEL AbdeI
26 septembre 2010
Aucun lien d.clar. en rapport avec la saisine.
LE BACLE CoIette
23 septembre 2010
Aucun lien d.clar. en rapport avec la saisine.
MARCHANDISE Patrick
10 septembre 2010
Aucun lien d.clar. en rapport avec la saisine.
Anses
F.vrier 2011 page 142 / 144
MATHIEU Laurence
8 janvier 2011
VB : Participation au programme de recherche
Caract.risation de l'exposition aux a.rosols de
l.gionnelles financ. par l'Ademe, l'Ansest,
Veolia, la DGS et EDF.
AnaIyse Anses :
Pas de risque de conflit d'int.rt par rapport la
saisine.
MOGUEDET G.rard
1
er
octobre 2007
Aucun lien d.clar. en rapport avec la saisine.
MOUNEYRAC Catherine
24 novembre 2010
Aucun lien d.clar. en rapport avec la saisine.
POURCHER Anne-Marie
9 f.vrier 2011
Aucun lien d.clar. en rapport avec la saisine.
RAUZY SyIvie
30 aout 2010
Aucun lien d.clar. en rapport avec la saisine.
RUNIGO-MAGIS Ren.e
9 d.cembre 2009
Aucun lien d.clar. en rapport avec la saisine.
SAUVANT-ROCHAT Marie-Pierre
6 septembre 2010
Aucun lien d.clar. en rapport avec la saisine.
TANDEAU DE
MARSAC
NicoIe
9 septembre 2010
Aucun lien d.clar. en rapport avec la saisine.
TREMBLAY MichIe
9 f.vrier 2011
Aucun lien d.clar. en rapport avec la saisine.
TRIBOLLET Bernard
27 juillet 2010
AnaIyse Anses :
IP : Participation au groupe de travail Afsset relatif
aux risques sanitaires li.s aux prolif.rations
de Legionella dans l'eau (2005 2007)
Pas de risque de conflit d'int.rt par rapport la
saisine.
VILLENA IsabeIIe
3 septembre 2010
AnaIyse Anses :
IP : Pr.sidence CES Microbiologie de l'Anses
(2009 2012)
Pas de risque de conflit d'int.rt par rapport la
saisine.
Anses
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SYNTHESE DES DECLARATIONS PUBLIQUES D'INTERETS DES MEMBRES DU GT PAR RAPPORT AU
CHAMP DE LA SAISINE
NOM
AnaIyse Anses :
Pr.nom
Rubrique de la DPI
Description de l'int.rt
Date de d.cIaration
des int.rts*
ABASQ Pierre 11 d.cembre 2009
Aucun lien d.clar. en rapport avec la saisine.
ALLEGRA S.verine 24 aout 2010
Aucun lien d.clar. en rapport avec la saisine.
CHANTELOUP PhiIippe 27 septembre 2010
Aucun lien d.clar.
HILAIRE Didier (membre du CES valuation des risques
li.s aux eaux et aux agents biologiques )
03 d.cembre 2009
Aucun lien d.clar. en rapport avec la saisine.
JARRAUD Sophie 24 f.vrier 2011
IP-AC : intervention pour l'Afssaps en mars 2010.
IP-CC : Organisation du Colloque National
Legionella et l.gionelloses, Lyon, les 18 et 19
Octobre 2007, avec la participation de
Genesystems, BO-RAD, Disruptive Technologies,
OXOD, Sanofi Aventis, AES Chemunex, Applied
Biosystems, BioMerieux, GRP, Sanichem, Thetis
environnement, Eurobio, Pall Medical, Trinity
Biotech France, PFZER, Biololab, ELYO Cylergie,
Euromedex, GATC Biotech, GSK GlaxoSmithKline
France, ROCHE DAGNOSTCS, Wyett Lederle.
VB :
Responsable d'un projet d'Evaluation d'une
technique de PCR en temps r.el pour la d.tection
de l.gionelles dans l'environnement (participation
de GeneSystems au financement de l'.quipe
recherche)
Responsable d'un projet de diff.rentiation des
Legionella vivantes et mortes par biologie
mol.culaire (participation de BioRad au
financement de l'.quipe recherche)
Participe un projet de recherche financ. par
l'Anses sur le typage des l.gionelles par la
m.thode MLVA (novembre 2010 novembre
2012)
Appel recherch. Afsset cibl.e L.gionelles 2007 :
R?le des amibes de l'environnement sur la
colonisation, la prolif.ration et la virulence des
bact.ries du genre Legionella (principal
investigateur : Michel Pelandakis)
Anses
F.vrier 2011 page 144 / 144
SR-A :
D.claration d'invention dans le cadre d'un projet
pilot. par l'nstitut Pasteur concernant le typage
mol.culaire de Legionella pneumophila et
Legionella longbeachae, avec identification
simultan.e de l'espce et du s.rogroupe (d.p?t le
13/10/2010, aucune firme n'a achet. les droits
d'exploitation de l'invention au 10/02/2011, pas de
r.mun.ration cette date).
AnaIyse Anses : Pas de risque de conflit d'int.rt par rapport la
saisine.
LAWRENCE Christine 21 f.vrier 2011
AnaIyse Anses :
IP : Formation de 2h pour Biorad en 2007
VB : Projet de contrat de collaboration de
recherche entre l'APHP et Genesystems (non
sign. au 10/02/2011)
SR-A : D.claration d'invention dans le cadre d'un
projet pilot. par l'nstitut Pasteur concernant le
typage mol.culaire de Legionella pneumophila et
Legionella longbeachae, avec identification
simultan.e de l'espce et du s.rogroupe (d.p?t le
13/10/2010, aucune firme n'a achet. les droits
d'exploitation de l'invention au 10/02/2011, pas de
r.mun.ration cette date).
Pas de risque de conflit d'int.rt par rapport la
saisine.
LE CANN Pierre
8 septembre 2010
AnaIyse Anses :
VB : Pilotage d'un projet de recherche financ. par
l'Anses sur le typage des l.gionelles par la m.thode
MLVA (novembre 2010 novembre 2012)
Pas de risque de conflit d'int.rt par rapport la
saisine.
LECSO MaryIin
14 d.cembre 2009
Aucun lien d.clar. en rapport avec la saisine.
SARDE CIaude-OIivier 13 septembre 2010
AnaIyse Anses :
IP : travaux scientifique dans le cadre du
Programme Europ.en Marie Curie "Vesicount", en
collaboration avec Ascal
Pas de risque de conflit d'int.rt par rapport la
saisine.
SQUINAZI Fabien
27 janvier 2010
Aucun lien d.clar. en rapport avec la saisine.
* : chaque d.but de r.union, il est demand. aux experts s'ils ont de nouveaux liens d.clarer
depuis la dernire mise jour de leur d.claration publique d'int.rt.
Impression daprs documents fournis
bialec, nancy (France)
Dpt lgal n 76046 - mai 2011
Imprim sur papiers issus de forts gres durablement
I
S
B
N

9
7
8
-
2
-
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1
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1
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C
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Agence nationale de scurit sanitaire
de lalimentation, de lenvironnement et du travail
27-31 avenue du gnral Leclerc
94701 Maisons-Alfort Cedex
www.anses.fr