Gua de laboratorio 1 Ingeniera de Enzimas Determinacin de actividad Enzimtica Celulasas

Objetivos Determinar la velocidad de hidrolisis de papel filtro catalizado por una mezcla de celulasas y hemicelulasas bajo condiciones controladas. Introduccin La enorme variedad de reacciones bioqumicas que comprende la vida son mediadas, casi todas ellas, por una serie de catalizadores biolgicos conocidos como enzimas. Las enzimas son protenas con actividad cataltica, es decir aumentan la velocidad de una reaccin qumica, permitiendo as que el sustrato se transforme en producto de manera ms rpida. La enzima se une al sustrato formando el complejo Enzima Sustrato, una vez que se ha formado el nuevo producto, la enzima se separa de este quedando libre para recibir a otro sustrato.

La velocidad de las reacciones se determina de acuerdo al aumento de la concentracin del producto o la disminucin de la concentracin del sustrato de la reaccin en el tiempo. Existen diferentes mtodos que permiten cuantificar la concentracin de reactantes y/o productos. Entre los mtodos analticos fsicos destacan los pticos, que se basan en la absorcin de radiacin electromagntica en la regin visible y ultravioleta. Determinando el coeficiente de extincin de un compuesto se estima la velocidad sobre la base de las medidas experimentales de absorbancia a un tiempo dado. Hay diferentes factores que afectan la actividad de las enzimas. Los factores ms importantes son: concentracin de enzima, concentracin de ligandos (sustratos, productos, inhibidores y activadores), pH, fuerza inica y temperatura. ( La actividad de las enzimas se ve notablemente afectada por el pH del medio. En general, son slo activas en un rango limitado de ste, observndose en la mayora de los casos una zona de pH ptimo y una disminucin de la actividad a ambos lados del pH ptimo. El efecto del pH en la actividad enzimtica se debe

fundamentalmente a cambios en el estado de ionizacin de los componentes del sistema; esto puede darse en la enzima libre, en el complejo E-S o en el sustrato. En la zona de pH ptimo predomina la forma inica activa, a valores de pH menores y mayores su proporcin disminuye, aumentando la proporcin de formas inicas no activas; a causa de ello la curva de velocidad versus pH tiene aproximadamente la forma de una campana. El pH no slo afecta la actividad de las enzimas, sino que tambin la estabilidad, lo que contribuye a la disminucin de la actividad generalmente a valores extremos de pH. Las reacciones enzimticas estn fuertemente afectadas por la temperatura. Hay dos factores determinantes, el efecto de la temperatura en las constantes de velocidad de la reaccin y el efecto de la temperatura en la estabilidad de la enzima. Como es de esperar, un aumento de la temperatura aumenta la velocidad de la reaccin; sin embargo, sobre cierta temperatura hay inactivacin de la enzima que lleva a una disminucin en la velocidad. La zona de temperatura en la cual se observa mayor actividad se conoce como temperatura ptima, sta tiene slo valor operativo, ya que depende de una serie de factores, como el pH y el tiempo de reaccin. Unidades de la actividad Enzimtica Las cantidades de enzima pueden ser expresadas en moles, como las de cualquier otro compuesto qumico, o pueden ser cuantificadas en trminos de actividad enzimtica. La actividad enzimtica es una medida de la cantidad de enzima activa presente y del nivel de actividad de la misma, por lo que la medida de la actividad es dependiente de las condiciones, que deben ser especificadas cuando se dan valores de actividad. La actividad expresa la cantidad de sustrato convertido por unidad de tiempo, teniendo en cuenta el volumen de reaccin. (Jens Nielsen, 2003) En el Sistema Internacional de Unidades la unidad para la actividad cataltica es el katal (kat), pero es una unidad demasiado grande y suele usarse la unidad de actividad enzimtica (UI).

1 kat = 1 mol sustrato convertido x s-1 = 6 x 107 UI 1 UI = 1 mol sustrato convertido x min-1 = 16,67 nkat

Otra unidad comnmente usada es la actividad especfica. sta se refiere a la actividad de una enzima por miligramo (mg) de protena, y se suele expresar en: mol x min-1 x mg-1). La actividad especfica da una idea de la pureza de la enzima. (Doan, Turan, & Doan, 2006)

Ensayos enzimticos Todos los ensayos enzimticos miden el sustrato consumido o el producto generado en la reaccin durante un tiempo. Existe un gran nmero de mtodos diferentes para medir la concentracin de sustratos y productos, y muchas enzimas pueden ser ensayadas de diferentes maneras. Habitualmente en bioqumica se estudian las reacciones catalizadas por enzima usando cuatro tipos de experimentos: Medida de la velocidad inicial. Cuando una enzima se mezcla con un gran exceso de sustrato (a concentracin saturante), el complejo intermedio enzima-sustrato se genera en una rpida fase inicial transitoria. Despus, la reaccin llega a una cintica constante durante la cual el complejo enzima-sustrato se mantiene prcticamente en cantidades invariables en el tiempo y la velocidad de reaccin es constante. La velocidad se mide en un corto periodo despus de lograr un estado cuasi-constante, que se detecta tpicamente monitorizando la acumulacin de producto durante el tiempo. Como las mediciones se efectan en un periodo muy corto y por la concentracin saturante de sustrato, puede considerarse que el sustrato libre es igual al sustrato inicial y que la velocidad medida es la mxima que la enzima puede alcanzar en las condiciones de reaccin dadas, porque no se estn dando reacciones inversas o degradacin enzimtica. Estas mediciones son las ms simples de realizar y analizar al estar relativamente libres de complicaciones, y por tanto ste el tipo de ensayo ms usado en cintica enzimtica. (Illanes, 2008) Medida del progreso de la curva. En estos experimentos los parmetros cinticos se determinan a partir de expresiones de las concentraciones de las diferentes especies como funciones del tiempo. La concentracin del sustrato o del producto se mide en momentos posteriores a la rpida fase inicial y durante un tiempo lo suficientemente largo que permita a la reaccin acercarse al equilibrio. Este tipo de ensayos se intenta evitar por el error matemtico que se puede introducir y es cada vez menos practicado, pero fue muy ampliamente utilizado en los primeros periodos del estudio de la cintica enzimtica. Medida de la fase transitoria. En estos experimentos se observa el comportamiento de la reaccin durante la rpida fase inicial transitoria en la que el complejo molecular intermedio llega a un periodo cintico constante. stos son los ensayos ms difciles de realizar porque requieren el uso de tcnicas de mezclado y medicin realmente rpidas. Experimentos en la fase de equilibrio. En estos experimentos se perturba una mezcla de enzima, sustrato y producto que ha alcanzado el equilibrio qumico, por ejemplo cambiando la temperatura, la presin o el pH, y se estudia cmo regresa la mezcla al

equilibrio. El anlisis de estos experimentos requiere que la reaccin sea reversible. Adems, estos experimentos son relativamente insensibles a detalles mecansticos y por lo tanto no suelen usarse para la identificacin de mecanismos de reaccin. La medicin de la actividad enzimtica se baja justamente en la medicin de la velocidad de reaccin. De este modo, en la reaccin: Se tendr que:

Si se observa la curva de aparicin de producto a travs del tiempo, se aprecia que la velocidad de reaccin (pendiente de la curva) disminuye continuamente a partir de un valor mximo inicial. Esta disminucin puede deberse a diversos factores, como la inactivacin enzimtica, la reversin de la reaccin, la desaturacin respecto al sustrato, y la inhibicin por productos. Al fin de normalizar su medicin y dado que para lapsos cortos, estos factores no inciden, se acostumbra a identificar el valor de la actividad enzimtica con el de la velocidad inicial de reaccin. Es precisamente a travs de esta medicin de esta velocidad inicial que se cuantifica la actividad enzimtica. La actividad enzimtica representa en consecuencia el mximo potencial cataltico de la enzima para un conjunto de condiciones ambientales dadas. Es preciso sealar que estos valores iniciales de velocidad de reaccin no representan aquellos que se obtendrn en un proceso enzimtico, donde, dados los tiempos de operacin prolongados, es razonable suponer que los factores descritos estarn presentes. En el caso de reacciones sobre sustratos heterogneos, como las celulosas, donde las porciones de celulosa con menor grado de ordenacin, son ms fcilmente atacadas por la enzima, por lo que una medicin de la velocidad inicial puede sobredimensionar el poder cataltico real de la enzima en el sustrato heterogneo. En el caso de enzimas con requerimiento de cofactores estequiomtricos, su carcter de tal permite medir la actividad enzimtica en base a la cuantificacin del cofactor Cuando no el sustrato ni el producto son fciles de cuantificar, se puede recurrir a reacciones acopladas donde se cuantifica el producto final de la reaccin encadenada, siempre y cuando, el paso limitante de la reaccin sea el de la actividad enzimtica que se quiere medir. (Illanes, 2008) (Fernando Acevedo, 2002)

Cintica Enzimtica en fase Homognea En las reacciones enzimticas se da un efecto ausente en las no enzimticas: la saturacin con el sustrato.

FIGURA 1 - EFECTO

DE LA CONCENTRACIN DEL SUSTRATO SOBRE LA VELOCIDAD DE UNA REACCIN

CATALIZADA ENZIMTICAMENTE

A partir de la saturacin la reaccin es esencialmente de orden cero respecto al sustrato (es decir, se mantiene con un v constante).

Ensayos de enzimas que participan en la degradacin de celulosa

Una gran variedad de sustratos han sido utilizados para ensayar actividad de celulasas. Para los ensayos de actividad de celulasa es deseable que puedan ser determinados directamente la concentracin de la enzima, normalmente dada en unidades /ml y la actividad especfica definida como unidades/mg de protena. Los ensayos ms comunes para la determinacin de la actividad de celulasas estn basados en la sacarificacin del papel filtro y en la determinacin de la actividad sobre carboximetilcelulosa. La actividad sobre papel filtro fue originalmente definida por Mandels et al, 1974 como la cantidad de azcares reducidos liberados en 1 hora cuando se usan 50 mg de papel filtro Whatman n 1 bajo condiciones estandarizadas (pH 4.8 50C). Los

azcares reductores libres son cuantificados por el mtodo del cido dinitrosaliclico (DNS) propuesto por Miller en 1959 y los resultados son expresados como equivalentes de glucosa. Es importante realizar la determinacin a distintos niveles de concentracin de preparados enzimticos hasta obtener actividad constante. La actividad sobre papel filtro mide actividades endo y exocelulasa, mientras que la determinacin en Carboximetilcelulosa (CMC) expresa principalmente actividad endocelulasa. Para la determinacin de la actividad en CMC existen variados ensayos, los que difieren esencialmente en el grado de sustiucin del sustrato, el pH, la temperatura y el tiempo de anlisis. Determinacin de la Actividad en Papel filtro (Mandels et al, 1974) Se toma una alcuota de 0.5 ml del preparado enzimtico convenientemente diludo Se adiciona 1.0 ml de Tampn citrato pH 4.8 Se incorpora a esta muestra 50 mg de papel filtro Whatman humedecido previamente con agua destilada. Se incuba a 50C por una hora y se retira el papel filtro. Se adicionan 1.5 ml de reactivo DNS. Se calienta a Ebullicin por 5 minutos Se enfra y se adicionan 10 ml de agua destilada Se lee la Absorbancia a 540 nm y se intercepta en la curva de calibrado de azucares reductores n 1 ,

Determinacin de la concentracin de azcares reductores totales por el mtodo del dinitrosalicilato (DNS) (Miller, 1959) Curva de calibrado de azucares reductores A partir de una concentracin Stock de glucosa (1 mg/ml) se prepara un set de 10 tubos a distintas concentraciones de glucosa, llevando a un volumen final de 1.0 ml con agua destilada. Se adiciona a cada tubo 1.0 ml de reactivo DNS Se calienta a Ebullicin por 5 minutos Se enfra y se adicionan 10 ml de agua destilada Se lee la Absorbancia a 540 nm.

Determinar la velocidad de reaccin al expresar grficamente la concentracin de azucares reductores versus el tiempo. Exprese estos resultados en las diferentes unidades vistas en clases.