Aplicaciones - Microarrays1

Aplicaciones de
los Microarrays y Biochips

en Salud Humana
Informe de Vigilancia Tecnolgica
Aplicaciones
de los Microarrays
y Biochips en Salud
Humana
Informe de Vigilancia
Tecnolgica
4
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS
Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
El presente informe de Vigilancia Tecnolgica ha sido
realizado en el marco del convenio de colaboracin
conjunta entre Genoma Espaa y la Fundacin General
de la Universidad Autnoma de Madrid (FGUAM), entidad
que gestiona el Crculo de Innovacin en Biotecnologa
(CIBT), perteneciente al Sistema de Promocin Regional
de la Innovacin MADRID+D.
Genoma Espaa y la Fundacin General de la Universidad
Autnoma de Madrid (FGUAM) agradecen la colaboracin
ofrecida a:
Dr. Carlos Briones (CSIC-CAB-INTA)
Dra. Ana Dopazo (CNIC)
La reproduccin parcial de este informe est autorizada
bajo la premisa de incluir referencia al mismo, indicando:
Aplicaciones de los Microarrays y Biochips en salud
humana. GENOMA ESPAA/CIBT-FGUAM.
Genoma Espaa no se hace responsable del uso que se
realice de la informacin contenida en esta publicacin.
Las opiniones que aparecen en este informe
corresponden a los expertos consultados y a los autores
del mismo.
Copyright: Fundacin Espaola para el Desarrollo
de la Investigacin en Genmica y
Protemica/Fundacin General de la Universidad
Autnoma de Madrid.
Autores: Marta Lpez (CIBT)
Paloma Mallorqun (CIBT)
Miguel Vega (Genoma Espaa)
Edicin: Silvia Enrquez Encinas (Genoma Espaa)
Referencia: GEN-ES06001
Fecha: Noviembre 2005
Depsito Legal: M-10639-2006
ISBN: 84-609-9226-8
Diseo y realizacin: Spainfo, S.A.
ndice de contenido
RESUMEN EJECUTIVO 7
OBJETIVOS DEL INFORME 8
1. INTRODUCCIN 9
2. MICROARRAYS DE ADN 9
2.1. Diseo de un microarray de ADN 9
2.1.1. Tipos de sondas en microarrays de ADN 10
2.1.2. Tecnologas de inmovilizacin de las sondas y tipos de soporte
en microarrays de ADN 10
2.1.3. Tecnologas de fabricacin de microarrays de ADN 12
2.1.4. Tcnicas de deteccin de la hibridacin en microarrays de ADN 15
2.1.5. Sistemas de amplificacin de la seal de hibridacin del ADN 16
2.2. Tipos de microarrays de ADN 19
2.2.1. Resecuenciacin gnica 20
2.2.2. Anlisis de la expresin Gnica 21
2.2.3. Genotipado de SNPs 23
2.2.4. Hibridacin genmica comparada 23
3. MICROARRAYS DE PROTENAS 24
3.1. Diseo de un microarray de protenas 25
3.1.1. Tipos de soporte de microarrays de protenas 26
3.1.2. Tipos de formato de microarrays de protenas 28
3.1.3. Tcnicas de deteccin de la seal en microarrays de protenas 31
3.2. Tipos de microarrays de protenas 33
3.2.1. Microarrays de identificacin y cuantificacin de protenas 33
3.2.2. Microarrays de funcin e interaccin de protenas 36
3.2.3. Microarrays de screening inverso de protenas 37
4. MICROARRAYS DE CARBOHIDRATOS 38
4.1. Diseo de un microarray de carbohidratos 39
4.1.1. Sntesis de oligosacridos 39
4.1.2. Aislamiento de oligosacridos de fuentes naturales 39
4.1.3. Inmovilizacin de los carbohidratos 40
4.2. Aplicaciones de los microarrays de carbohidratos 40
5. MICROARRAYS DE CLULAS 41
5
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
6. MICROARRAYS DE TEJIDOS 43
7. APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS EN SALUD HUMANA 46
7.1. Identificacin de dianas teraputicas 46
7.2. Descubrimiento y desarrollo de frmacos 47
7.3. Diagnstico clnico 48
7.4. Farmacogenmica y farmacogentica 49
7.5. Investigacin bsica 50
8. BARRERAS EXISTENTES PARA LA IMPLANTACIN DE LOS MICROARRAYS 52
9. PERSPECTIVAS DE MERCADO DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS
EN SALUD HUMANA 54
10. SITUACIN DE LA INVESTIGACIN Y DESARROLLO EN ESPAA
EN EL REA DE MICROARRAYS APLICADOS A LA SALUD HUMANA 56
11. CONCLUSIONES 59
GLOSARIO 60
ANEXOS 62
ANEXO I. Principales aplicaciones de los microarrays disponibles comercialmente 62
ANEXO II. Empresas espaolas que operan en el rea de microarrays 72
ANEXO III. Empresas espaolas que desarrollan productos de bioinformtica aplicados
a microarrays 76
ANEXO IV. Proyectos de investigacin espaoles relacionados con tecnologas de microarrays 78
ANEXO V. Patentes recientes en Microarrays 89
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 90
6
Los microarrays de ADN surgen de la necesidad de
analizar la cantidad de informacin procedente de los
grandes proyectos de secuenciacin de genomas
1,2
.
Estas herramientas de estudio de la informacin
gentica vienen emplendose en dos aplicaciones
fundamentales, la secuenciacin o genotipado del
ADN y el anlisis de la expresin gnica.
La determinacin de la variacin en las secuencias
de ADN humano mediante microarrays permite
entre otras cosas identificar la huella gentica de
la predisposicin a padecer diferentes
enfermedades. Por otro lado, el empleo de
microarrays de ADN en estudios de la expresin
gnica est permitiendo la identificacin y
validacin de manera mucho ms rpida de genes
como potenciales dianas teraputicas. Los
patrones o perfiles de expresin gnica se pueden
estudiar desde dos puntos de vista: mediante el
anlisis de la expresin especfica de los genes en
los tejidos, o bien a travs del estudio en las
alteraciones del nivel de expresin en una
determinada situacin fisiolgica o patolgica con
el objetivo de identificar los genes implicados.
La combinacin de los datos obtenidos a travs de
la secuenciacin del ADN junto con la informacin
obtenida del estudio de perfiles de expresin
gnica, permite establecer una correlacin entre
el genotipo y el fenotipo de un determinado
individuo en una situacin concreta. El resultado
de esta combinacin est resultando de enorme
importancia en estudios de farmacogenmica, as
como en el desarrollo de la medicina
personalizada.
A pesar de que los microarrays de ADN se han
convertido en una herramienta esencial para el
anlisis de expresin gnica y la secuenciacin del
ADN, la informacin que arrojan stos no es
suficiente para comprender los procesos
relacionados con los efectores ltimos de una
multitud de mecanismos celulares: las protenas.
La estimacin de la concentracin de protenas a
travs del ARNm traducido no suministra una
informacin precisa sobre las protenas
sintetizadas correctamente ni sobre su
funcionalidad.
Los microarrays de protenas permiten la
deteccin, caracterizacin y cuantificacin de las
protenas as como el estudio de su funcin y sus
interacciones tanto entre diferentes protenas
como con otras molculas como ADN o lpidos. Es
por ello que los microarrays de protenas son una
herramienta fundamental de la Protemica y
poseen un enorme potencial en cuanto a su
aplicacin en diagnstico molecular o desarrollo
de frmacos.
El estudio a gran escala de los carbohidratos y
sus interacciones con protenas juega un papel
destacable en biologa celular y medicina, ya que
los carbohidratos estn involucrados en la
interaccin de los patgenos con su organismo
hospedador, procesos de desarrollo, transduccin
de seales e inflamacin. El empleo de
microarrays en el anlisis de carbohidratos es otra
posible expansin de estas herramientas al
anlisis de alto rendimiento de molculas
diversas.
7
Resumen ejecutivo
1
http://www.sanger.ac.uk/HGP/
2
http://www.tigr.org/tdb/
8
Objetivos del informe
El objetivo del presente informe consiste en
realizar una actualizacin de los ltimos
desarrollos llevados a cabo en las tecnologas
relacionadas con los microarrays y biochips, as
como de sus aplicaciones en salud humana. Este
documento pretende ser una revisin del informe
de Vigilancia Tecnolgica en Microarrays y
Biochips de ADN publicado por Genoma Espaa
en el ao 2002, incluyndose en esta ocasin
microarrays y biochips de otras biomolculas
como protenas y microarrays de clulas y tejidos.
Por otra parte, se ha realizado un estudio acerca
de las perspectivas de las tecnologas clave
relacionadas con microarrays y biochips en
Espaa, para lo cual se ha hecho una revisin de
los grupos de investigacin que en la actualidad
estn trabajando en el desarrollo de estas
herramientas de anlisis. Por ltimo, con el
objetivo de evaluar las limitaciones tecnolgicas y
prcticas del empleo de microarrays y biochips en
salud humana, se ha recurrido a la recopilacin
de informacin por medio de cuestionarios por
parte de diversos expertos en la materia.
9
1. Introduccin
2. Microarrays de ADN
Puntos clave en la fabricacin de un microarray
Eleccin de la sonda.
Eleccin del soporte.
Tecnologa de inmovilizacin de la sonda.
Tcnica de fabricacin del array.
Mtodo de deteccin de la hibridacin.
Sistemas de amplificacin de la seal/sonda.
Sistemas de anlisis e interpretacin de la seal.
Como consecuencia de la disminucin progresiva
del coste de los microarrays en los ltimos aos,
se ha producido una integracin de esta
tecnologa como herramienta fundamental de la
biomedicina y del proceso de desarrollo de
frmacos. El empleo de microarrays en estudios
de genmica funcional tiene numerosas
aplicaciones de entre las que se pueden destacar
la determinacin de perfiles de expresin gnica,
la seleccin de biomarcadores, la
farmacogenmica, la toxicogenmica, la
identificacin de genes marcadores pronstico de
enfermedades y la clasificacin de tumores.
Los microarrays de ADN son colecciones de
molculas de ADN inmovilizadas sobre un soporte
en localizaciones conocidas, empleados para el
estudio de la secuencia de genes conocidos,
o bien para determinar los niveles de expresin
gentica de un tipo celular o tejido.
2.1. Diseo de un microarray
de ADN
A la hora de fabricar un microarray, existen
determinados elementos que tendrn una
importancia crucial en funcin de las aplicaciones
deseadas:
2.1.1. Tipos de sondas empleadas
en los microarrays de ADN
Sonda es el trmino que se emplea comnmente
para definir un fragmento de ADN o ARN de
secuencia conocida, el cual se emplea en ensayos de
hibridacin para identificar secuencias idnticas o
similares en una mezcla compleja de cidos
nucleicos. Las sondas tambin pueden consistir en
anticuerpos que son utilizados en las tcnicas de
deteccin de protenas especficas
3
. En el caso de los
microarrays de ADN, el material biolgico que se
emplea como sonda puede consistir en molculas de
ADN, ARN o PNA, que se inmovilizan sobre el
soporte del array e hibridan con la muestra de ADN
a analizar denominada diana.
Sondas de oligonucletidos
Las sondas comnmente empleadas en los
microarrays de ADN consisten en oligonucletidos
de cadena sencilla de ADN, que pueden
sintetizarse in situ o bien depositarse sobre el
soporte mediante diferentes tcnicas de
inmovilizacin. Estas sondas suelen ser lineales y
con longitud comprendida entre los 11 y 50
nucletidos. Recientemente, el empleo de
horquillas de oligonucletidos est empezando a
tomar relevancia debido a su mayor estabilidad,
mejor ndice de hibridacin y mayor afinidad por
los agentes de captura, que se traduce en una
seal de mayor intensidad.
Sondas de PNAs
Los cidos nuclicos peptdicos (PNAs) son
molculas artificiales con caractersticas hbridas
de cidos nucleicos y peptdicos, donde las bases
nucleotdicas estn unidas a un esqueleto de tipo
peptdico en lugar del tpico esqueleto de
fosforribosas del ADN. Estas sondas son de gran
utilidad en los microarrays de ADN ya que los
hbridos que se forman entre las sondas de PNA y
el ADN que se analiza poseen una estabilidad
trmica superior a los dplex de ADN-ADN,
adems de cierta insensibilidad a la fuerza inica
debido a la carga neutra del PNA. Por otra parte,
los dplex que presentan desapareamientos de
una sola base son menos estables que sus
correspondientes hbridos de ADN-ADN, lo que les
hace particularmente adecuados para detectar
mutaciones en una sola base nucleotdica o SNP
(Single Nucleotide Polymorphism)
4
.
Sondas de ADNc
Adems de oligonucletidos de ADN o PNA,
tambin es posible emplear ARNm de genes
concretos como sonda de hibridacin, aunque
debido a su baja estabilidad es necesario realizar
una transcripcin inversa para obtener un ADN
copia (ADNc) de mayor estabilidad.
2.1.2. Tecnologas de inmovilizacin
de las sondas y tipos
de soporte en microarrays
de ADN
La deposicin de las sondas es un paso
fundamental a la hora de disear un microarray
de ADN, y est directamente relacionado con la
eleccin del soporte y la tcnica de fabricacin del
array. Existen tres factores que han de tenerse en
cuenta en la inmovilizacin de las sondas:
10
3
Glosario de trminos genticos. Universidad de Murcia, Dpto. Bioqumica, Biologa Molecular e Inmunologa
(http://www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes/Glosario/Glosario/index.htm).
4
Campas, M.; Katakis, I. (2004). DNA biochip arraying, detection and amplification strategies. Trends in analytical
Chemistry. Vol. 23(1): 49-62.
Puntos clave en la inmovilizacin de sondas de ADN
La qumica empleada en la inmovilizacin ha de ser estable durante las diferentes etapas del
experimento.
Las sondas han de permanecer funcionales despus de su inmovilizacin.
Las sondas han de ser inmovilizadas con una orientacin y configuracin apropiada de manera que
no se entorpezca el emparejamiento de bases.
Las tecnologas de inmovilizacin de sondas sobre la superficie de microarrays de ADN son muy
diversas, como se muestra en la tabla 1. Las monocapas autoensambladas
5
constituyen una de las tcnicas
que ms aceptacin ha tenido en los ltimos aos debido a su simplicidad, eficiencia y bajo coste. Las
principales tecnologas de inmovilizacin de sondas se recogen en la siguiente tabla:
11
Mtodo
Orientacin
de la sonda
Accesibilidad Ventajas
Retencin en
matriz polimrica
Unin covalente
Al azar
Ordenada
Baja
Alta
Gran cantidad
de sondas
Gran
estabilidad
Desventajas
Requiere tratamiento de
superficie.
Bajos ndices de hibridacin
superficie.
Bajos ndices de
inmovilizacin
Silanizacin-
unin covalente
Ordenada Alta
Posible control
de la densidad
de la sonda
superficie.
Posibles interacciones
inespecficas.
Bajos ndices de
inmovilizacin
Afinidad
(biotina-
estreptavidina)
Ordenada Alta
Gran
estabilidad.
Sencillez
superficie.
Bajos ndices de
inmovilizacin
Adsorcin Al azar Baja Sencillez Bajos ndices de hibridacin
Inclusin en un
composite
6
Al azar Baja
Posible unin
ordenada
Bajos ndices de hibridacin
SAMs directo
7
(la propia sonda
se inmoviliza
formando una
monocapa)
Ordenada Alta
Sencillez.
Posible control
de la densidad
de la muestra
Posibles interacciones
inespecficas
SAMs indirecto (la
sonda se une a
SAM de otro
material
previamente
formado)
Ordenada Alta
Posible control
de la densidad
de la muestra
superficie.
Bajos ndices de
inmovilizacin
Tabla 1. Principales mtodos de inmovilizacin de sondas.
Fuente: Camps, M. & Katakis, I. (2004). DNA biochip arraying, detection and amplification strategies. Trends in analytical
chemistry. Vol. 23(1): 49-62 (SAM: Self-Assembled Monolayer o monocapa autoensambladas).
PRINCIPALES MTODOS DE INMOVILIZACIN DE SONDAS
5
Las monocapas autoensambladas (self-assembled monolayers o SAMs) se forman a partir de la organizacin espontnea
de molculas con ciertos grupos funcionales, principalmente grupos tiol, sobre la superficie de un metal. Estos grupos tiol
se fijan al sustrato que se desea cubrir a travs de un mecanismo de adsorcin qumica y el resto de la molcula establece
uniones electrostticas, de puente de H, o por fuerzas de Van der Waals, etc., con sus molculas vecinas (Fuente:
Gonzlez Rumayor, V., et al. (2005). Informe de vigilancia tecnolgica. Aplicaciones de biosensores en la industria
agroalimentaria. Fundacin para el conocimiento madri+d; CEIM).
6
Composite: compuesto que une dos o ms materiales, normalmente fibras introducidas en una resina polimrica (plsticos).
7
Las sondas de PNAs han demostrado recientemente una capacidad para formar SAMs directos muy superior a la del ADN,
lo que abre una nueva lnea de desarrolllo de biosensores. Fuente: Briones, C., et al. (2004). Ordered self-assembled
monolayers of peptide nucleic acids with Dna recognition capability. Physical Review Letters, vol. 93:208103 (1-4).
El tipo de soporte en el cual se inmovilizan las
sondas puede ser de diferente naturaleza, siendo
las membranas de nylon y los soportes rgidos
como el plstico o el vidrio los ms utilizados. En
la actualidad, debido a su adaptacin al marcaje
fluorescente, alta sensibilidad, posibilidad de
realizar distintas funcionalizaciones qumicas y
fcil manejo y resistencia, el vidrio ha suplantado
a las membranas como soporte para microarray
de ADN
8
.
2.1.3. Tecnologas de fabricacin
de microarrays de ADN
La fabricacin de un microarray consiste en la
disposicin de las sondas sobre la superficie del
mismo en posiciones conocidas y ordenadas.
Existen diferentes tecnologas para la produccin
de microarrays que han de cumplir una serie de
requisitos, lo que ha generado la aparicin de
diversas plataformas comerciales. Estos
requerimientos han motivado que los avances
tecnolgicos relacionados con la fabricacin de
microarrays queden reflejados en los sistemas de
produccin y las plataformas introducidas por
diferentes empresas.
12
Requisitos de las tecnologas de produccin de microarrays
Robustez
Consistencia
Automatizacin
Velocidad de fabricacin
Versatilidad
Principales tecnologas empleadas en la fabricacin de microarrays
Ink Jetting: impresin de sondas sin contacto.
Pin deposition: impresin de sondas por contacto.
Fotolitografa: sntesis in situ mediante mtodos qumicos.
Polipirrolizacin: inmovilizacin electroqumica de sondas modificadas por pirroles.
Electrodeposicin: inmovilizacin de sondas de ADN sobre nanopartculas de biorreconocimiento en
electrodos.
Unin con direccionamiento electrnico.
Reproducibilidad
Uniformidad
Alta precisin
Alta resolucin
Coste-efectividad
Las principales tecnologas empleadas en la fabricacin de microarrays de ADN se pueden clasificar en
funcin de la metodologa empleada para disponer sondas de forma ordenada.
8
Meloni, R., et al. (2004). DNA microarrays and pharmacogenomics. Pharmacological Research. Vol. 49: 303-308.
La tcnica de Ink jetting emplea inyectores
piezoelctricos. Junto al capilar de vidrio que
contiene la muestra se localizan cristales
piezoelctricos que se deforman al aplicar voltaje.
Esta deformacin presiona el capilar y expulsa
una pequea cantidad de fluido por el extremo
del capilar, que se deposita en un punto concreto
de la superficie.
La tcnica Pin deposition emplea agujas o pins que
se empapan en la solucin que contiene la muestra
y se transfiere una pequea cantidad al extremo de
la aguja. Al hacer contacto el extremo con la
superficie del chip, se imprime una gota en una
posicin determinada de la superficie. Una variante
de este mtodo utiliza en vez de agujas, cabezales
similares a la punta de una pluma estilogrfica.
Respecto a la Fotolitografa, la tcnica se basa
en la unin de los nucletidos protegidos por un
agente qumico fotodegradable sobre un soporte
de vidrio que posee determinados grupos
reactivos. Mediante una mscara que se sita
sobre el chip se logra enfocar un haz de luz hacia
unas posiciones determinadas, degradando al
agente qumico protector en dichas zonas y
dejndolo intacto en las zonas protegidas por la
mscara. Posteriormente se aade un medio que
contiene uno de los cuatro nucletidos que se
unir, mediante enlace covalente, al soporte con
los grupos reactivos que hayan quedado
desprotegidos. Cada grupo aadido lleva una
molcula receptora fotodegradable. Este proceso
se va repitiendo con los diferentes nucletidos y
mscaras hasta generar unos oligonucletidos con
las secuencias de inters. La pionera en el empleo
de esta tcnica fue Affymetrix y en el primer chip
que construy alcanz una densidad de 106
sondas por cm
2
. En la actualidad, el Genechip
comercializado por esta compaa consigue una
densidad de ms de 9.000 sondas de una longitud
de 30 bases en 1,6 cm
2
.
La tcnica de Polipirrolizacin est basada en la
copolimerizacin de un grupo pirrol y los
oligonucletidos que portan parte del pirrol en su
extremo 5. Las secuencias de oligonucletidos
modificados con pirrol se inmovilizan
electroqumicamente en lugares especficos
mediante el encendido secuencial de los
diferentes electrodos
9
.
La electrodeposicin selectiva se basa en la
inmovilizacin de sondas de ADN sobre
nanopartculas de biorreconocimiento en
electrodos de resolucin fotolitogrfica. Estas
nanopartculas consisten en pequeas esferas de
oro modificadas con oligonucletidos.
El posicionamiento electrnico, tcnica
desarrollada por Nanogen, est basada en la
concentracin electrofortica de oligonucletidos
biotilinizados sobre un gel de agarosa modificado
con estreptavidina. Este gel puede direccionarse
electrnicamente sobre un array con propiedades
de electrodo. La incorporacin de campos
elctricos permite controlar la deposicin de las
sondas, as como incrementar la concentracin de
las muestras sobre estas ltimas, aumentando
por tanto la efectividad de la hibridacin. Existen
diversos mtodos basados en este tipo de tcnica,
que combinan los avances producidos en la
investigacin con microarrays con los derivados
de la microfludica.
Algunas de las tcnicas anteriormente descritas
estn confinadas para su uso en laboratorio por
diferentes motivos. Tal es el caso de la
polipirrolizacin, que si bien presenta ciertas
ventajas como su bajo coste, existen una serie de
factores que hacen inviable su empleo a escala
industrial, como son su escasa reproducibilidad de
la deposicin de sondas, as como el tiempo
necesario para fabricar un array.
Las tecnologas lderes en el mercado son la
impresin por chorro de tinta o ink-jetting, la
fotolitografa, pin deposition y el posicionamiento
electrnico. Adems, en los ltimos aos se ha
desarrollado toda una serie de variantes de estas
tecnologas orientadas a mejorar el control sobre
el tamao y la morfologa de la muestra de ADN
depositada sobre el array. Este es el caso de la
tecnologa Bubble Jet Printing Technology de
Canon
10
que es capaz de crear un array de alta
densidad con unos puntos de tamao uniforme y
forma regular.
La siguiente tabla recoge las principales
tecnologas lderes en el mercado en fabricacin
de microarrays, sus principales caractersticas,
ventajas y desventajas, as como las aplicaciones
a las que van dirigidas.
13
9
Cmpas, M.; Katakis, I. (2004). DNA biochip arraying, detection and amplification strategies. Trends in analytical
chemistry Vol. 23 (1): 49-62.
10
Bubble Jet Technologies Applied to DNA Chips, Canon (http://www.canon.com/technology/detail/bj/dna_chips).
14
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2.1.4. Tcnicas de deteccin
de la hibridacin
en microarrays de ADN
La deteccin de la hibridacin es un paso clave
para revelar qu sondas se han unido a sus
dianas complementarias procedentes de la
muestra. Determinadas tcnicas de deteccin de
la hibridacin del ADN requieren del marcaje
previo de la sonda a la molcula diana, por lo que
la deteccin de la hibridacin es un proceso que
limita el desarrollo de nuevas plataformas de
biochips. Los mtodos de deteccin en los cuales
no se necesita el marcaje de la diana estn
tomando relevancia en nuevas aplicaciones de los
biochips, ya que permiten una mayor sensibilidad,
reduccin de la muestra necesaria y simplificacin
del proceso de preparacin de la muestra
11
.
La siguiente tabla muestra las diferentes tcnicas de
deteccin de la hibridacin en los microarrays de
ADN con su transductor y marcaje correspondiente:
15
Tcnicas Transductor Marcaje
Fluorescencia
Piezoelctrico
ptico
Piezoelctrico
Fluorforos
No necesario
Cronopotenciometra
Voltametra
Impedancia
Electroqumico
Complejos catinicos
Compuestos redox
Cronoamperometra Electroqumico Enzimas redox
Capacitancia Electroqumico No necesario
Colorimetra ptico Enzimas
Resonancia de plasmones en superficie ptico No necesario
Quimioluminiscencia electroqumica ptico Quelato rutenio
Tabla 3. Tcnicas de deteccin de la hibridacin en microarrays de ADN.
Fuente: Camps, M.; Katakis, I. (2004). DNA biochip arraying, detection and amplification strategies. Trends in analytical
chemistry. Vol. 23(1)1: 49-62.
TCNICAS DE DETECCIN DE LA HIBRIDACIN EN MICROARRAYS DE ADN
11
Lpez, M.; Mallorqun, P.; Vega, M. (2002). Informe de Vigilancia Tecnolgica Microarrays y Biochips de ADN.
Genoma Espaa.
2.1.5. Sistemas de amplificacin
de la seal de hibridacin
del ADN
El anlisis de ADN por medio de microarrays
requiere de la amplificacin de la muestra y/o de la
seal para alcanzar una sensibilidad apropiada, si
bien es cierto que la mayora de los sistemas de
amplificacin realizan ambas tareas. A pesar del
tiempo que requiere, la tcnica de PCR se ha venido
empleando de manera habitual en la amplificacin y
marcaje fluorescente de muestras de ADN, e incluso
se ha integrado en sensores y microarrays para
minimizar el tiempo de ensayo necesario. Adems
de la tcnica de PCR, existe toda una serie de
mtodos de amplificacin de la seal que pueden
ser incorporados en el sistema de deteccin:
La Amplificacin por crculo rodante o Rolling
Circle Amplification es una tcnica de
amplificacin de la seal de hibridacin que
emplea oligonucletidos circularizados. Mediante
dos pasos sucesivos con sondas de hibridacin,
se consigue obtener una secuencia de ADN
inmovilizado en el soporte capaz de hibridar con
un ADN circular. Posteriormente, la accin
conjunta del ADN polimerasa
12
y el molde de
ADN circular desplazndose a lo largo del
fragmento de ADN inmovilizado genera copias del
ADN original unidas entre s por sus extremos.
Para detectar la seal, se procede a aadir
marcadores fluorescentes complementarios para
su hibridacin con los mltiples sitios repetidos
en la secuencia de ADN elongada. Este mtodo
de amplificacin es rpido, tcnicamente sencillo,
y capaz de detectar mutaciones en presencia de
una gran cantidad de ADN original. Esta tcnica
cuenta con la desventaja de requerir una gran
cantidad de muestra de ADN de partida (100
nanogramos).
16
Sonda
Eliminacin diana
Adicin oligos marcados Eliminacin ADN circular
Adicin
ADN circular
ADN polimerasa
Adicin diana Adicin sonda 2 ADN ligasa
Fig. 1. Amplificacin por crculo rodante.
Fuente: Camps, M., Katakis, I. (2004). DNA biochip arraying, detection and amplification strategies. Trends in analytical
chemistry. Vol. 23(1): 49-62.
12
Las ADN polimerasas son las enzimas que realizan la replicacin del ADN.
La amplificacin mediante ADN ramificado es
otro de los mtodos empleados para aumentar
la seal de la hibridacin, que en este caso
emplea ADN ramificado
13
o hiperpolimrico, que
debido a sus ramificaciones puede realizar
hibridaciones simultneas. Este tipo de ADN
requiere ciertas caractersticas como son su
homogeneidad, uniformidad, y el control de la
composicin y tamao de la longitud de sus
fragmentos.
17
Fig. 2. Amplificacin por ADN ramificado.
Fuente: Genospectra (http://www.genospectra.com).
La amplificacin de la seal de hibridacin
mediante nanopartculas dendrticas est
basada en el uso de nanopartculas de oro
activadas con nucletidos, como las empleadas
en los mtodos piezoelctricos. Estas
nanopartculas contienen fragmentos de
oligonucletidos que hibridan con la diana una
vez que sta ha hibridado con la sonda
inmovilizada. Empleando el tamao apropiado
de partcula se pueden conseguir sensibilidades
de deteccin muy elevadas.
13
bDNA (branched DNA o ADN ramificado): el ADN ramificado contiene mltiples cadenas ramificadas en forma de rbol y
cada una de estas ramas constituye un sitio de hibridizacin con una sonda marcada con una enzima, que reacciona con
un sustrato que permite la demostracin colorimtrica o quimioluminiscente.
Clula
Sondas
ADN
ramificado
Marcadores
de sondas
Sustrato
quimioluminiscente
Lisado de clula para
obtener ARNm
Adicin de sondas
Hibridacin
Cuantificacin
del ARNm
El mtodo de amplificacin de la Tiramida o
TSA (Tyramide Signal Amplification) consiste en
una combinacin de tres pasos que comienzan
en el marcaje de la molcula diana con un
anticuerpo unido a peroxidasa o estreptavidina.
Tras la hibridacin a la sonda, se aaden
mltiples derivados de tiramida marcados con
biotina o agentes fluorescentes, que son
activados por la enzima peroxidasa, liberando
finalmente radicales de tiramida que emiten
una seal detectable. Este es un mtodo de
marcaje indirecto que consigue una
amplificacin de la seal hasta 100 veces
mayor que las tcnicas directas de marcaje con
fluorescencia, sin incrementar el ruido de
fondo. A pesar de ser una tcnica laboriosa, la
amplificacin con Tiramida compite con las
tecnologas actuales de amplificacin por PCR
14
.
Sin embargo, los anlisis comparativos son
complicados debido a la variabilidad existente
en la eficiencia del marcaje
15
.
18
Fig. 3. Amplificacin mediante nanopartculas dendrticas.
Fuente: Fritzsche, W. & Taton, A. (2003) Metal nanoparticles as labels for heterogeneous, chip-based DNA detection.
Nanotechnology 14, R63-R73.
14
Cmpas, M.; Katakis, I. (2004). DNA biochip arraying, detection and amplification strategies. Trends in analytical
chemistry Vol. 23 (1): 49-62.
15
Tyramide Signal Amplification (TSA) Technology, Molecular Probes, Invitrogen detection technologies
(http://probes.invitrogen.com/handbook/sections/0602.html).
Fig. 4. Amplificacin de la Tiramida.
Fuente: Tyramide Signal Amplification (TSA) Technology, Molecular Probes, Invitrogen detection technologies
(http://probes.invitrogen.com/lit/catalog/2/sections/4021.html).
La amplificacin de la seal por medio de
liposomas funcionalizados se puede emplear
en las tcnicas de deteccin electroqumica de
la hibridacin. Este sistema est basado en la
inhibicin de la transferencia de electrones
entre la sonda y la superficie del electrodo
donde la sonda est inmovilizada. Existen dos
formas de conseguir la transferencia de
electrones, mediante la activacin de los
oligonucletidos cargados negativamente, o
bien mediante la funcionalizacin de los
liposomas con biotina.
ADN diana
Nanopartcula
unida a
oligonucletido
Peroxidasa
H
2
O
2
Estreptavidina
Biotina
ADN
2.2. Tipos de microarrays
de ADN
Los microarrays de ADN surgieron de la necesidad
de analizar la ingente cantidad de informacin
surgida de los grandes proyectos de secuenciacin
de genomas desarrollados en los ltimos aos
16
. Por
tanto, las principales aplicaciones de los microarrays
de ADN se centraron inicialmente en el anlisis de la
expresin gnica y el diagnstico gentico, basados
en la bsqueda de mutaciones o polimorfismos de
un solo nucletido o SNP
17
. Los nuevos desarrollos
tecnolgicos han permitido ampliar estas
aplicaciones hacia nuevas reas de inters como la
farmacogenmica, as como la integracin de los
microarrays de ADN en el proceso de
descubrimiento e identificacin de frmacos.
El rea de diagnstico molecular mediante
microarrays de ADN posee entre sus principales
aplicaciones el cribado gentico de mutaciones
o polimorfismos relacionadas con enfermedades
mediante tcnicas de resecuenciacin del ADN.
Por otra parte, la identificacin de
microorganismos patgenos (virus, bacterias,
hongos o protozoos) mediante microarrays de
oligos que contengan secuencias de ARN
ribosomal de dichos microorganismos es de
utilidad en el diagnstico de patologas
infecciosas. Asimismo, tanto los anlisis de
SNPs como de expresin gnica mediante
microarrays de ADN permitiran identificar los
mecanismos implicados en la resistencia de
patgenos a ciertos agentes antimicrobianos
18
.
Por ltimo, el uso de microarrays de ADN para
el anlisis de los perfiles de expresin gnica en
procesos tumorales, ha posibilitado elaborar
para ciertos tipos de cncer una clasificacin de
los tumores que ha permitido un diagnstico y
pronstico ms preciso que el obtenido
mediante otras tcnicas moleculares.
Las estrategias de farmacogentica y
farmacogenmica
19
constituyen otras de las
reas de aplicacin de los microarrays de ADN.
La combinacin de los datos obtenidos a partir
de la identificacin de SNPs, junto con la
informacin obtenida del estudio de perfiles de
expresin gnica, permite establecer una
correlacin entre el genotipo y el fenotipo de un
determinado individuo. El resultado de esta
combinacin est resultando de enorme
importancia para la identificacin de genes que
puedan constituir nuevas dianas teraputicas.
El proceso de descubrimiento y desarrollo
de frmacos se ha beneficiado del uso de
herramientas genmicas de alto rendimiento
como los microarrays de ADN, que hacen
posible el anlisis de la expresin gnica en
miles de muestras simultneamente. El diseo
y estratificacin de los ensayos clnicos en
funcin del genotipo es otra de las aplicaciones
que los microarrays de ADN han aportado a la
industria farmacutica.
19
16
The Sanger Institute: Human Genome Project (http://www.sanger.ac.uk/HGP).
The Institute for Genomic Research, TIGR (http://www.tigr.org/tdb).
17
SNP: Single Nucleotide Polymorphism.
18
Domnech-Snchez, A. & Vila, J. (2004). Fundamento, tipos y aplicaciones de los arrays de ADN en la microbiologa
mdica. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 22(1):46-54.
Bryant, P. A., et al. (2004). Chips with everything: DNA microarrays in infectious diseases. Lancet Infect. Dis. 4:100-111.
19
Farmacogentica: disciplina que se ocupa de estudiar las diferentes respuestas de los individuos frente a los frmacos
basndose en los patrones de variabilidad gentica de cada paciente.
Farmacogenmica: trmino ms amplio que persigue buscar genes candidatos de respuesta a determinados frmacos o
personalizar medicamentos empleando herramientas genmicas.
20
reas Aplicaciones Tcnicas
Diagnstico
molecular
Cribado gentico
Identificacin de patgenos
Resecuenciacin
Deteccin de secuencias de ADN
procedentes de patgenos
Resistencia a frmacos de
microorganismos infecciosos
Genotipado de SNPs
Anlisis de la expresin gnica
Diagnstico y pronstico oncolgico Anlisis de la expresin gnica
Farmacogentica y
Farmacogenmica
Identificacin de genes
Genotipado de SNPs
Resecuenciacin
Respuesta a frmacos Genotipado de SNPs
Diagnstico predictivo Genotipado de SNPs
Descubrimiento y
desarrollo de frmacos
Cribado de frmacos Anlisis de la expresin gnica
Diseo y estratificacin de ensayos
clnicos
Genotipado de SNPs
Tabla 4. Aplicaciones de los microarrays de ADN en salud humana.
Fuente: Elaboracin propia.
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS DE ADN EN SALUD HUMANA
A continuacin se describen las principales tcnicas genmicas que emplean los diferentes microarrays de ADN
en funcin del objetivo que se persiga:
2.2.1. Resecuenciacin gnica
El descubrimiento de genes o la identificacin
mediante secuenciacin de determinadas
secuencias de ADN, requiere arrays con sondas
que incluyan todas las posibles combinaciones de
nucletidos para una determinada longitud. El
fragmento de ADN a analizar se divide en
fragmentos de entre 200 y 600 nucletidos, y
posteriormente se marca e hibrida con las sondas
inmovilizadas. Al detectar la localizacin de la
hibridacin mediante tcnicas de anlisis y
procesamiento de las seales, se puede identificar
la secuencia total del fragmento de ADN.
La resecuenciacin es una las ltimas
aplicaciones de los microarrays de ADN, que
permite la identificacin de mutaciones y SNPs en
el genoma a partir de una secuencia conocida.
Para cada base nucleotdica de una secuencia se
disean cuatro sondas que difieren entre s en un
nucletido (A,T,G,C) generalmente en su posicin
central. Posteriormente se marca el ADN de la
muestra mediante reactivos fluorescentes, y se
pone en contacto con las sondas inmovilizadas en
el microarray. Los fragmentos de ADN que
contengan una secuencia complementaria
hibridarn nicamente con una de las cuatro
sondas, dando lugar a una seal fluorescente
20
.
La principal ventaja de esta tcnica consiste en
que permite conocer la secuencia de fragmentos
de ADN de hasta 30 Kb de longitud.
21
Fig. 5. Resecuenciacin mediante microarrays de ADN.
Fuente: Cutler, DJ, et al. (2001). High-throughput variation detection and genotyping using microarrays.
Genome Res. 11(11):1913-25.
20
CustomSeq Resequencing Arrays, Affymetrix (http://www.affymetrix.com/products/arrays/specific/custom_seq.affx).
21
Lpez, M.; Mallorqun, P.; Vega, M. (2001). Informe Sectorial de Vigilancia Tecnolgica sobre Microarrays y Biochips de
ADN. Genoma Espaa.
2.2.2. Anlisis de la expresin
gnica
La expresin gnica es el proceso por medio del
cual la informacin codificada en el ADN se
transforma en las protenas necesarias para el
desarrollo y funcionamiento de la clula. Este
proceso tiene lugar por medio de una molcula
intermediaria que transmite la informacin
gentica denominada ARN mensajero (ARNm).
Una de las principales aplicaciones de los
microarrays de ADN es la determinacin del perfil
de expresin, es decir la cuantificacin relativa de
los ARN transcritos, mediante la comparacin de
los ARNm aislados de dos muestras diferentes.
Por tanto, los microarrays de ADN proporcionan
indirectamente informacin de los distintos
niveles de protenas que se producen durante un
estado patolgico o en una determinada situacin
metablica.
El anlisis de la expresin gnica mediante
microarrays de ADN requiere realizar previamente
la copia del ARNm a ADN complementario
mediante un proceso de transcripcin inversa.
Este ADN copia (ADNc) posee una mayor
estabilidad que el ARNm y adems permite la
adicin de marcadores para su deteccin
21
. Las
molculas marcadas de ANDc se hibridan a
microarrays que contienen sondas de ADN
especficas para genes concretos. La seal que
emite el ADNc ser indicativa de la presencia de
expresin gnica, que tambin puede ser
cuantificada.
El perfil de expresin gnica de una clula
proporciona informacin sobre su fenotipo y su
respuesta al medio (estado metablico, ciclo
celular, respuesta a condiciones de estrs,
presencia de toxinas o microorganismos
patgenos). La medida de la expresin gnica es
una importante herramienta para estudiar los
mecanismos de regulacin, rutas bioqumicas y
funciones celulares.
Las aplicaciones de los microarrays de expresin
gnica son diversas, y actualmente el nmero de
productos dirigidos a la industria farmacutica se
ha multiplicado considerablemente (ver Anexo I).
No obstante, una de las aplicaciones ms
atrayentes es el empleo de microarrays de
expresin gnica en clnica. La empresa
holandesa Agendia
22
ha desarrollado microarrays
de expresin gnica que permiten predecir el
riesgo de sufrir metstasis en pacientes con cncer
de mama, as como arrays de expresin que
facilitan la identificacin de tumores primarios. La
empresa californiana Genomic Health
23
posee
entre sus productos un microarray de expresin
gnica que cuantifica la probabilidad de recurrencia
en pacientes con cncer de mama, e incluso
proporciona informacin acerca de las terapias ms
efectivas para el paciente.
22
Fig. 6. Anlisis de la expresin gnica mediante microarrays de ADN.
Fuente: Institute for Mikrobiology and Genetics, Georg-August-University of Gttingen, Functional Genomics Group.
(http://wwwuser.gwdg.de/~aehrenr/arrays/c_arrays.html).
Tejido sano
Muestra A
Tejido enfermo
Muestra B
Interpretacin
A > B
B > A
A = B
Combinacin
de ambas seales
fluorescentes
Emisin
de fluorescencia
Incidencia luz
fluorescente
A B
Extraccin
ARNm
ADNc marcado
con sondas
fluorescentes
Hibridacin con ADN
inmovilizado
22
MammaPrint, CupPrint (Agendia, BV; http://www.agendia.com).
23
Oncotype DX (Genomic Health, Inc.; http://www.genomichealth.com/oncotype/hcphome.aspx).
Aplicaciones de los microarrays de expresin gnica
Identificacin de genes involucrados en procesos patolgicos, fisiolgicos y de desarrollo.
Caracterizacin de tumores.
Estudio de procesos de regulacin gnica.
Diagnstico mediante la identificacin de patrones de expresin relacionados con diferentes
estados patolgicos.
Identificacin de dianas teraputicas en el proceso de desarrollo de frmacos mediante la
comparacin de los genes expresados en tejido normal y tejido enfermo.
2.2.3. Genotipado de SNPs
Menos del 0,1% del genoma humano presenta
variaciones entre los distintos individuos, siendo
las formas ms frecuentes de variacin los SNPs o
polimorfismos de una sola base
24
, que consisten
en sustituciones de una base por otra. La mayora
de los SNPs conocidos hasta hace unos aos
haban sido identificados a partir de proyectos de
secuenciacin como el Proyecto Genoma Humano,
y de experimentos de secuenciacin de
fragmentos concretos de ADN. En la actualidad
varias compaas biotecnolgicas disponen de
tests farmacogenmicos que permiten la
identificacin de polimorfismos relacionados con el
metabolismo de frmacos. Los principales tests
toxicogenmicos se centran en el genotipado de
genes de enzimas de la familia del citocromo
p450, relacionada con la toxicidad de un gran
nmero de frmacos
25
.
23
24
Las diferencias entre las secuencias de ADN de los diferentes individuos y especies se deben primordialmente a
mutaciones que alteran una de las cuatro letras del cdigo ACGT. Tales cambios de una sola letra de posicin variable son
los SNP (Single Nucleotide Polymorphism). Adems, se conocen otros sistemas de reordenamiento gentico, tales como
inserciones o deleciones de fragmentos de ADN.
25
Prometheus Laboratories Inc., PRO-PredictRx TPMT (http://www.prometheuslabs.com).
Roche Diagnostics, con tecnologa de Affymetrix (http://www.roche-diagnostics.com).
GE Healthcare, CodeLink P450 Bioarrays (http://www.gehealthcare.com).
Jurilab, DrugMEtTM Genotyping Test (http://www.jurilab.com).
Roche Group, AmpliChip CYP450 Test (http://www.roche-diagnostics.com).
TM Bioscience Corp., Tag-ItTM Mutation Detection Kits (http://www.tmbioscience.com).
26
Vysis (http://www.vysis.com).
27
CNIO, Investigacin de Transferencia en Cncer: del Laboratorio a la Clnica
(http://www.cnio.es/es/news/transferencia.htm).
Fig. 7. Microarray de anlisis farmacogenmico AmpliChip CYP450. Fuente: Roche Group, AmpliChip CYP450 Test
(http://www.roche-diagnostics.com/products_services/amplichip_cyp450.html).
2.2.4. Hibridacin genmica
comparada
Los microarrays de hibridacin genmica
comparada (CGH Arrays) son herramientas de
anlisis genmico de escaneado global que se
emplean para detectar la presencia de ganancias
(duplicacin o amplificacin) o prdidas (delecin
o nulisoma) de segmentos del genoma. Su
aplicacin en el campo de la oncologa incluye la
deteccin de nuevas amplificaciones genmicas
asociadas a tumores humanos y murinos, la
definicin en detalle de regiones comnmente
amplificadas (amplicones), y la deteccin de
deleciones asociadas a tumores.
Un ejemplo de este tipo de microarrays de
hibridacin genmica comparada es el
Genosensor System de la compaa Vysis
26
que
permite establecer correlaciones entre el nmero
de copias de un gen y una determinada
enfermedad. ste es un sistema que por el
momento slo se emplea en investigacin en
laboratorios y an no se ha empleado con fines
diagnsticos. En la actualidad, el Centro
Nacional de Investigaciones Oncolgicas
(CNIO) est poniendo en marcha una plataforma
para la produccin de microarrays de hibridacin
genmica comparada que posean una cobertura
completa de los genomas humano y murino
27
.
Los microarrays y biochips de ADN se han
consolidado como una herramienta fundamental
para el anlisis de la expresin gnica a nivel
genmico. Sin embargo, la determinacin de la
cantidad de ARNm mediante microarrays de ADN
no proporciona la informacin suficiente sobre las
protenas que se traducen a partir de esta
molcula. Esto es debido a que las protenas
sufren toda una serie de modificaciones post-
traduccionales a lo largo de su proceso de
sntesis, que consisten fundamentalmente en
procesamientos proteolticos, glicosilaciones
28
, y
formacin de complejos proteicos. Por otra parte,
las protenas han de plegarse correctamente con
el fin de ser totalmente funcionales.
Para completar el estudio de las funciones de las
protenas se ha de recurrir a la informacin
contenida en el proteoma. El proteoma es el
conjunto de protenas expresadas por un tejido o
por una clula en un momento determinado. Por
tanto, la protemica es la disciplina que estudia
globalmente la expresin gnica a nivel de las
protenas, aglutinando protemica comparativa,
funcional y estructural.
Los microarrays de protenas son de gran
utilidad en el anlisis protemico funcional, y
consisten en chips de protenas inmovilizadas en
una posicin concreta sobre una superficie slida,
dispuestas de forma similar a como se disponen
las sondas en los microarrays de ADN. A la hora
de construir un microarray de protenas es muy
importante plantearse una serie de cuestiones
previas, al igual que suceda con el diseo del
microarray de ADN:
24
28
Glicosilacin: proceso qumico por el que se aaden cadenas de azcares a una protena.
3. Microarrays de protenas
Factores de relevancia en el diseo de microarray de protenas
Naturaleza de la superficie sobre la cual inmovilizar (soporte).
Protenas a inmovilizar.
Mtodo de inmovilizacin.
Formato del microarray.
Agente de captura (en el caso de microarray de deteccin).
Mtodo de deteccin a emplear.
Cada una de estas cuestiones lleva asociada una tecnologa concreta, que al combinarse permiten la
generacin de microarrays de protenas. En la siguiente figura se muestran las tecnologas asociadas a los
microarrays de protenas:
25
Tecnologa
de produccin
Molculas
de captura
Superficies Deteccin Aplicaciones
Impresin
por contacto
Impresin sin
contacto
Unin
no covalente
Electrosttica
Reconocimiento
molecular
Hidrofbica
Protenas fusin
Fluorescencia
Diagnstico
Protemica
Cribado de
frmacos
Quimio-
luminiscencia
Resonancia
de plasmones
superficiales
Radioactividad
Espectrometra
de masas
Anticuerpos
Receptor/ligando
Enzima/sustrato
Aptmeros
Unin covalente
Litografa
Affibodies
Fig. 8. Tecnologas implicadas en la produccin de microarrays.
Fuente: Ojos, T. & Bachmann, J. (2003). Business Briefing: Future Drug Discovery. 1-4.
de protenas
La complejidad y diversidad estructural de las
protenas ha hecho que el desarrollo de los
microarrays de protenas haya sido tcnicamente
complicado. Al contrario que los cidos nucleicos,
las protenas no tienen una estructura homognea
ni un patrn de unin especfico, sino que cada
protena posee unas caractersticas bioqumicas
particulares. En cuanto a los procesos de
amplificacin de muestra, no existe una tcnica
equivalente a la PCR capaz de amplificar la
cantidad de protena existente en una muestra.
Por lo tanto, la tecnologa de microarrays de
protenas se encuentra ante dificultades tcnicas
en cuanto a la adquisicin y unin estable de
protenas a superficies donde puedan
interaccionar con otras protenas o ligandos y
detectarse tal interaccin
29
.
29
Hardiman, G., et al. (2002). Protein microarrays: challenges and promises. Pharmacogenomics. Vol. 3 N 4: 1-10.
3.1.1. Tipos de soporte de microarrays de protenas
Durante el diseo de un microarray de protenas la eleccin del soporte habr de tenerse en cuenta en
primera instancia ya que condicionar tanto el formato final del array como el mtodo de deteccin
preferible. De la misma forma, la tecnologa de inmovilizacin elegida ha de tener en cuenta tanto la
naturaleza del compuesto que se ha de inmovilizar como la superficie a la cual se acopla, manteniendo
siempre la funcionalidad y accesibilidad de las protenas presentes en el array.
26
Caractersticas de un soporte ideal de protenas
Estabilidad qumica.
Buena morfologa de los puntos o spots.
Mnimas uniones no especficas.
Baja seal de fondo.
Alto ratio superficie/volumen.
Compatibilidad con los distintos sistemas de deteccin.
Baja autofluorescencia.
En el caso del ADN, ste posee una carga
negativa que podra aprovecharse para inmovilizar
la molcula sobre la superficie del array mediante
fuerzas electrostticas. Por el contrario, la carga
de las protenas es muy variable, y por este
motivo se han realizado grandes esfuerzos en la
estandarizacin de materiales de soporte que
sean adecuados para cada tipo de microarray de
protenas. Los soportes porosos como las
membranas de nitrocelulosa, nylon o fluoruro de
polivinilo, son ms adecuados para la
inmovilizacin de protenas que los soportes lisos,
ya que poseen mayor superficie y por tanto
capacidad de unin
30
.
No obstante, la nueva generacin de qumica de
superficies de membrana y de vidrio ha logrado
ofrecer una variedad de superficies de soporte
que no requieren del empleo de agentes
bloqueantes para eliminar el ruido de fondo,
y que a la vez previenen el contacto directo de la
protena con la superficie mediante la introduccin
de grupos funcionales como polietilenglicol (PEG).
Otras estrategias empleadas son capaces de
aumentar la densidad de los grupos funcionales
accesibles mediante el empleo de
dendrmeros
31,32
.
30
Espina, V., et al. (2004). Protein microarray detection strategies: focus on direct detection technologies. Journal of
Immunological methods. Vol. 290: 121-133.
31
Agenendt, P., et al. (2003). Next generation of protein microarray support materials: evaluation for protein and antibody
microarray evaluations. Journal of Chromatography A. Vol. 1009:97-104.
32
Los dendrmeros son agrupaciones esfricas de molculas anidadas, de importante aplicacin en la fabricacin de
dispositivos miniaturizados para el almacenaje de informacin.
33
Biotina (unin a estreptavidina); Protena G (unin a anticuerpo Fc); Protena A (unin a anticuerpo Fc); GST, Glutation
S-transferasa (unin a anti-GST); MBP, protena de unin a la maltosa (unin a anti-MBP); TRX, tiorredoxina reductasa
(unin a anti-TRX), GFP, protena verde fluorescente (unin a anti-GFP).
34
Poli-aminocidos empleados como molculas de afinidad en microarrays de protenas: Poli-Histidina (soporte de resina de
nquel); Poli-Lisina (uniones amida y bases de Schiff); Poli-cisteina (uniones tioter).
35
Hardiman, G., et al. (2002). Protein microarrays: challenges and promises. Pharmacogenomics. Vol. 3 (4): 1-10.
27
Soporte Qumica de superficie Proveedor
Placas de dendrmero
(prototipo)
Capa de dendrmero con grupos
reactivos epoxi
Chimera Biotech GmbH
Placas de epoxi-PEG
(prototipo)
Capa de PEG con grupos reactivos
epoxi
Jen Sobek, Functional Genomics
Center
Placas Maxisorb
Superficie de poliestireno
modificada
Nunc A/S
Placas amino Grupos amino Telechem International
Placas epoxi Grupos epoxi Telechem International
Placas silanizadas Grupos amino Telechem International
Placas FAST Matrices de nitrocelulosa Schleicher and Schuell Biosciences
Placas en cultivo celular en
poliestireno
Poliestireno Nalge Nunc International
Tabla 5. Principales soportes empleados en la inmovilizacin de protenas sobre arrays.
Fuente: Angennendt, P. & Glker, J. (2003). Protein and antibody microarray technology. Journal of Chromatography B
Vol. 797: 229-240.
PRINCIPALES SOPORTES EMPLEADOS EN LA INMOVILIZACIN DE PROTENAS
SOBRE ARRAYS
Placas de aminosilanos Grupos amino Sigma Aldrich Chemie GmbH
HydroGel Gel de poliacrilamida modificado Perkin-Elmer
Microarray reflectivo Trietoxilsilano 3-amino propil Amersham Biosciencies
Placas epoxi QMT Grupos epoxi Quantifoil Micro Tools GMBH
Placas de polilisina Grupos amino Preparadas manualmente
Placas de poliacrilamida Poliacrilamida Preparadas manualmente
Para favorecer la inmovilizacin de las protenas es frecuente recurrir a molculas adaptadoras de afinidad,
que consisten fundamentalmente en protenas
33
, poliaminocidos
34
o polipptidos. Las estrategias ms
habituales se centran en el empleo de molculas de afinidad ancladas en la superficie del array, que a su
vez mantendrn unidas las protenas por medio de una segunda molcula adaptadora
35
.
3.1.2. Tipos de formato de microarrays de protenas
Los formatos que se pueden emplear para construir un microarray de protenas son muy variados, aunque
el ms extendido es el formato de array plano que se comercializa por numerosas empresas:
28
Fig. 9. Estructura de un microarray de protenas.
Fuente: Hardiman, G., et al. (2002) Protein microarrays: challenges and promises. Pharmacogenomics. Vol. 3 (4): 1-10.
Empresa Producto Aplicacin
Schleicher & Schuell
Bioscience
Provisin
TM
HCA Perfil de citoquinas
Zymoyx Inc.
Simios protein profiling biochip
system
Perfil de citoquinas
Pierce Biotechnology Inc. Search Light
TM
Arrays Perfil de citoquinas
RayBiotech Inc.
RayBio
TM
Cytokine Arrays, Custom
Ab Arrays
Perfil de citoquinas
BD Biosciences BD Clontech
TM
Ab Microarray Anlisis comparativo de protenas
Sigma Aldrich Co.
Panorama
TM
Ab Microarray Cell
Signalling Kit
TM
Anlisis comparativo de protenas
Protometrix Inc. The Yeast Protoarray
TM
Estudios de interaccin de protenas
Molecular Staging Inc.
Rolling circle amplification
technology (RCAT
TM
)
Perfil de protenas multiplexado
Tabla 6. Microarrays planos de microarrays de protenas disponibles comercialmente.
Fuente: Joos, T. O. Microarray technology: an increasing variety of screening tools for proteomic research. Drug Discovery
Today (2004). Vol. 3 (1): 24-31.
MICROARRAYS PLANOS DE MICROARRAYS DE PROTENAS DISPONIBLES
COMERCIALMENTE
Zeptosen AG ZeptoMAR
TM
CeLyA Cell Lysate Arrays Screening reverso
Ciphergen Biosystems inc SELDI Protein Chip Technology Screening reverso
Protena
Molcula adaptadora
Molcula de afinidad
Soporte recubierto
de una capa orgnica
Otros formatos alternativos estn encaminados a disminuir la cantidad de muestra y reactivos necesarios
por medio de la miniaturizacin y la combinacin con tecnologas de microfludica:
29
CD de centrifugacin como el Gyrolab
Bioaffy comercializado por Gyros
36
. El giro del
CD hace que la fuerza centrfuga dirija la
muestra a travs de microcanales, que permiten
la cuantificacin de protenas a escala
nanomtrica por medio de inmunoensayos tipo
sndwich u otras tcnicas.
Microcanales desarrollados por Biotrove
37
por
medio de la tecnologa Thru-Hole, que
consiste en una plataforma miniaturizada para
el procesamiento en paralelo de alta densidad
de muestras a escala nanomtrica.
3D sobre superficies de silicio como Protein
Profiling Biochip System de Zyomyx
38
que
permite la orientacin de los anticuerpos gracias
a su estructura en pilares. Esta plataforma
permite la cuantificacin de mltiples citoquinas
presentes en suero de plasma humano y
murino.
36
Microarray de protenas sobre CD de centrifugacin (Gyrolab Bioaffy
TM
). Gyros AB (http://www.gyros.com).
37
Microarray de microcanales. Biotrove (http://www.biotrove.com).
38
Protein Profiling Biochip
TM
System de Zyomyx (http://www.zyomyx.com) (en la actualidad est en uso en centros de
Investigacin de GlaxoSmithkline y Partners Healthcare).
Wagner, P.; Raymond, K. (2002). Protein biochips: an emerging tools for proteomic research. Current Drug Discovery.
May: 23-28.
Anticuerpo
marcado
18 mm
CD
Protena
Las partculas en suspensin tambin pueden emplearse como base para el microarray, teniendo en cuenta
que estas partculas pueden codificarse para su posterior identificacin. Existen diferentes sistemas de
codificacin de estas partculas que emplean tecnologas muy diversas:
30
Microesferas sometidas a citometra de
flujo, comercializadas por BD Biosciences bajo
el nombre comercial de BD
TM
Cytometric Bead
Array
39
: la captura de protenas se realiza por
medio de inmunoensayos tipo ELISA, mientras
que la deteccin se basa en fluorescencia y la
cuantificacin se realiza por citometra de flujo.
Microesferas codificadas con colores, como
el sistema Bio-Plex Protein Array System
desarrollado por Luminex
40
y Bio-Rad
41
.
Mediante este sistema, se pueden medir las
reacciones bioqumicas que tienen lugar en la
superficie de las microesferas en funcin de las
intensidades de las fluorescencias.
Nanocristales de semiconductores
codificadas con colores, que reciben el
nombre comercial de Nanocristales Qdot
42
y
han sido desarrollados por Quantum Dots Corp.
Estos nanocristales estn formados por
materiales semiconductores que emiten luz en
el espectro de luz visible, permitiendo el
marcaje de protenas dentro de las clulas.
Microesferas con cdigos de barras como la
tecnologa UltraPlex
TM
desarrollada por
Smartbeads
43
, que permite realizar ensayos
multiplexados para una serie de anticuerpos
identificados con su cdigo de barras
correspondiente.
Micropartculas con cdigos de barras
formadas por metales intercalados, como las
nanopartculas Nanobarcodes
TM
de Nanoplex
Technologies
44
, que permiten identificar con una
gran precisin la molcula para la cual sirve de
marcador.
39
BD
TM
Cytometric Bead Array, BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com).
40
Luminex xMAP technology (http://www.luminexcorp.com).
41
Sistema Bio-Plex Protein Array System, Bio-Rad (http://www.bio-rad.com).
42
Qdot Nanocrystals (http://www.qdots.com).
43
UltraPlex
TM
, Smartbeads (http://www.smartbead.com).
44
Nanopartculas Nanobarcodes
TM
, Nanoplex Technologies (http://www.nanoplextech.com).
Esferas
marcadas
con fluorescencia
Anticuerpos
de captura
Anticuerpos
de deteccin
lser
Nanocristal
Antgenos
Anticuerpos
Micropartculas con
cdigos de barras
Marcador
fluorescente
Anticuerpos
Banda de plata
Banda de oro
Protena
3.1.3. Tcnicas de deteccin de la seal en microarrays de protenas
Los mtodos de deteccin empleados en microarrays de protenas se pueden clasificar en mtodos libres
de marcaje y mtodos que emplean sondas marcadas con diferentes tcnicas. Los mtodos libres de
marcaje presentan la ventaja de no necesitar un marcaje previo de las protenas diana, evitando de esta
forma modificar su actividad. Entre ellas destacan las siguientes:
31
Espectrometra de masas: tcnica en la que
las molculas proteicas se ionizan y
posteriormente se aceleran a travs del vaco
mediante un campo magntico. Las partculas
de distinta relacin masa/carga se separan por
su deflexin (desviacin de la direccin de la
corriente) en un campo magntico. Dentro de la
espectrometra de masas las variantes ms
representativas son la denominada
espectrometra MALDI-TOFF
45
y la
espectrometra de masas en tandem (MS/MS).
Resonancia de Plasmones Superficiales
(SPR): tcnica basada en fenmenos pticos
que tienen lugar sobre la superficie de un
metal, permitiendo la deteccin de cambios de
concentracin de la masa del chip debidos a la
unin de un ligando a la protena inmovilizada.
Campo
magntico
Luz
polarizada
e
Luz
reflejada
Dentro de las estrategias que emplean mtodos de marcaje, se pueden clasificar a su vez en tcnicas de
deteccin directa si utilizan una sonda marcada que sea compatible con el sustrato, y mtodos de
deteccin indirecta, donde se marca directamente la protena de inters
46
. En funcin del marcaje
realizado, la tcnica de deteccin empleada ser diferente:
45
MALDI-TOF: Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (desorcin/ionizacin mediante lser asistida por matriz.
46
Espina, V. (2004). Protein microarray detection strategies: focus on direct detection technologies. Journal of
Immunological Methods. Vol. 290: 121-133.
Deteccin cromognica: los cromgenos son
sustancias que sirven como sustratos para
reacciones enzimticas que generan productos
coloreados. La deteccin cromognica de
microarrays de protenas produce seales
permanentes de fcil visualizacin para su
anlisis. Los cromgenos empleados con mayor
frecuencia en microarrays de protenas son la
peroxidasa y la fosfatasa alcalina.
Deteccin por quimioluminiscencia: la
emisin de la luz se produce por los productos
de una reaccin qumica en la que participa la
enzima luciferasa. La quimioluminiscencia puede
emplearse con cualquiera de los mtodos de
deteccin por marcaje de sonda. La principal
ventaja de la deteccin por quimioluminiscencia
es que crea un registro permanente de los
resultados con alta sensibilidad y rapidez.
Deteccin por fluorescencia: las molculas
fluorescentes (fluorforos) absorben fotones de
luz de una fuente externa, generalmente un
lser monocromtico, que provoca la excitacin
de los electrones de la molcula y la posterior
emisin de luz en una longitud de onda mayor a
la de la luz incidente. La principal limitacin de
esta tcnica de deteccin es su incompatibilidad
con los soportes que poseen autofluorescencia,
ya que esta caracterstica hace muy difcil
distinguir la seal del ruido de fondo. Los
principales fluorforos empleados son
fluorescena, rodamina, ficobiliprotenas,
acridinas y cianinas.
Deteccin por desintegracin radiactiva: la
posibilidad de incorporar
32
P en protenas, ADN
y ARN permite la deteccin de las interacciones
protena-protena, protena-ADN, protena-ARN y
protena-ligando. Sin embargo, el empleo de la
radiactividad como mtodo de deteccin para
microarrays no est muy extendido por
cuestiones de seguridad.
Desafos tecnolgicos a los que se enfrentan
los microarrays de protenas
El anlisis de protenas mediante microarrays se
enfrenta a una serie de limitaciones referidas
principalmente a problemas de deteccin de la
interaccin y de estabilidad de las protenas
inmovilizadas.
Disponibilidad de protenas y anticuerpos
especficos: en el caso de los microarrays de
anticuerpos, una de las principales limitaciones
ante las que se enfrenta su fabricacin no es
nicamente obtener grandes cantidades, sino al
hecho de que es necesario obtener anticuerpos
de gran diversidad. Para solucionar estos
problemas, se est recurriendo a la produccin
de fragmentos de anticuerpos como scFvs o
Fabs mediante libreras de fagos u otras, en
lugar de producir anticuerpos en hibridomas que
suponen un alto coste.
Deteccin especfica de protenas: una
alternativa para la deteccin de protenas es el
empleo de aptmeros. Estas molculas
consisten en cidos nucleicos generalmente
cortos y obtenidos por mtodos de seleccin in
vitro, que son capaces de reconocer y unirse a
una molcula especfica como una protena o un
ligando.
Deshidratacin de las protenas: la miniaturizacin
de los microarrays de protenas es consecuencia
de los problemas de deshidratacin e inactivacin
de las protenas, que se acentan bajo el empleo
de soportes de cristal. Por este motivo, la
nanotecnologa y microfludica son campos que
estn desarrollando nuevas estrategias como son
las estructuras de microcanales, que previenen la
deshidratacin de las protenas debido a su
arquitectura cerrada. Otra de las alternativas que
se est estudiando consiste en el empleo de
sustancias qumicas que estabilicen las protenas.
Fenmenos de reactividad cruzada: dada la
naturaleza de los anticuerpos que en su mayora
se encuentran glicosilados, el fenmeno de
reactividad cruzada sucede a menudo, creando
falsos positivos y falsos negativos al formarse
complejos de cierta estabilidad. Por ello, las
estrategias actuales van encaminadas a la
seleccin de anticuerpos altamente especficos,
o al empleo de otras molculas de afinidad
como los aptmeros o esqueletos proteicos.
Deteccin no uniforme de las interacciones
entre protenas: el empleo de tcnicas de
marcaje en microarrays de protenas supone
una limitacin importante, ya que es imposible
lograr un marcaje homogneo en mezclas de
protenas debido a su diversidad y complejidad.
La deteccin de protenas en un microarray
requiere un rango mucho ms dinmico de
operaciones que el caso de los microarrays de
ADN, ya que la concentracin de protenas en el
interior de las clulas es muy variable. Esta
caracterstica hace que sea necesario el empleo
de anticuerpos con afinidades variables, que
sean capaces de detectar protenas a distintas
concentraciones.
32
3.2. Tipos de microarrays
de protenas
En funcin de la aplicacin que se persiga con el
uso de microarrays de protenas, se pueden
clasificar en microarrays de deteccin de
protenas y microarrays de funcin o interaccin
de protenas.
3.2.1. Microarrays de identificacin
y cuantificacin de protenas
Los microarrays de identificacin de protenas
constituyen herramientas muy tiles de
diagnstico. Se basan en la captura de protenas
por medio de molculas de diversa naturaleza que
permanecen ancladas a la superficie del
microarray.
Los microarrays de captura de protenas se pueden
construir mediante el empleo de diferentes agentes
de captura, dando lugar a los microarrays de
identificacin de protenas comerciales que se
recogen en la tabla 7. Los agentes de captura
empleados de manera ms frecuente son:
a. Anticuerpos: protenas altamente especficas
producidas por el sistema inmune que
reconocen a los agentes infecciosos y otras
sustancias extraas que invaden el organismo.
b. Affibodies: molculas que mimetizan las
funciones de los anticuerpos y que se pueden
sintentizar de manera sencilla con una
determinada especificidad y afinidad de manera
que se dirijan a una diana especfica.
c. Aptmeros: molculas de ADN o ARN capaces
de reconocer y unirse a una molcula especfica
(protena u otro ligando).
33
Affibodies
Aptmeros
Anticuerpos
Fig. 10. Modo de interaccin de los affibodies, aptmeros y anticuerpos como agentes de captura.
Fuente: Joos, T. O. (2004). Microarray technology: an increasing variety of screening tools for proteomic research. Drug
Discovery Today. Vol. 3 (1):24-31.
En el caso de los microarrays basados en anticuerpos como agentes de captura, se emplean dos
estrategias de deteccin basadas en las tcnicas de inmunoensayos. La primera consiste en un
inmunoensayo tipo sndwich, donde los anticuerpos se inmovilizan sobre la superficie del array, y las
protenas que se unen a ellos sern detectadas por un segundo anticuerpo marcado. En el segundo tipo de
inmunoensayo, las protenas interaccionan de manera similar con los anticuerpos inmovilizados, pero en
este caso las protenas se marcan qumica o fluorescentemente antes de incorporarlas sobre el microarray,
sin necesidad de utilizar un anticuerpo adicional.
Sandwich Captura de antgenos
Fig. 11. Estrategias de deteccin empleadas en los microarrays de protenas.
Fuente: MacBeath, G. (2002). Protein microarrays and proteomics. Nature Genetics Suppl. Vol. 32:526-532.
La ventaja de los microarrays de identificacin de
protenas es que permiten la amplificacin de la
seal, si bien en contrapartida la deteccin de
protenas en bajas concentraciones es complicada
ya que para su unin deben competir con otras
protenas presentes en mayores concentraciones.
La principal limitacin de estos microarrays radica
en la necesidad de conseguir una elevada
especificidad de los anticuerpos inmovilizados y
en la precisin de la deteccin, que se encuentra
limitada por la reproducibilidad del experimento,
tanto de la preparacin de la muestra como de su
deposicin.
Los microarrays de protenas han alcanzado el
mercado con una gran variedad tanto de superficies,
de sistemas de inmovilizacin de los agentes de
captura, y de agentes de captura en s mismos. Por
el contrario, la tecnologa de deteccin de la seal
empleada en estos ensayos es fundamentalmente la
fluorescencia. Esta variedad de productos
comerciales se muestra en la tabla 7 del presente
informe. Un ejemplo de los microarrays de deteccin
de protenas que emplean anticuerpos es el
desarrollado por la empresa Chemicon, que ha
introducido en el mercado microarrays para la
deteccin de los perfiles de expresin de citoquinas
en muestras biolgicas
47
.
34
47
Chemiarray
TM
, Chemicon International Inc. (http://www.chemicon.com/Product/Research.asp).
35
Empresa Material del chip
Ciphergen Biosystems
Slice recubierto de
aluminio
Lumicyte Slice
Agente de captura
Afinidad de metales,
cromatografa cargada o
hidrofbica, anticuerpos
Afinidad de superficie
qumica, bioqumica o
biolgica
Deteccin de la seal
SELDI y MS
SELDI y MS
Biacore
Vidrio recubierto con
capa de oro, superficie
de hidrogel de dextrano
NHS/EDC superficie
activada, superficie de Ni
2+
,
anticuerpos, estreptavidina
SPR
HTS Biosystems
Plstico con fina
retcula en la
superficie, recubierto
por fina capa de oro
Anticuerpos y fragmentos
de anticuerpos
SPR
Large Scale Biology Plstico Anticuerpos Fluorescencia
Biosite Diagnostics Plstico Anticuerpos Fluorescencia
Zyomyx Slice
Anticuerpos y fragmentos
de anticuerpos
Fluorescencia
Phylos N/A
Estructuras de polipptidos
basadas en fibronectina
Florescencia
Somalogic N/A Aptmeros Fluorescencia
Akceli Vidrio
CADN expresado por
clulas humanas
embrionarias de rin
Fluorescencia
Packard Bioscience
Hidrogel de
poliacrilamida
Anticuerpos Fluorescencia
BD Biosciences Vidrio Anticuerpos Fluorescencia
Molecular Staging Inc. Vidrio
Anticuerpos y amplificacin
por crculo rodante
Amplificacin del ADN
marcado asociado
Interactiva
Biotechnology
Alquiltioles de cadena
larga en superficie de
oro biotinilada
Captura de las molculas
biotiniladas por
estreptavidina
Fluorescencia
Tabla 7. Principales tecnologas empleadas en microarrays de protenas.
Fuente: Hardiman, G., et al. (2002). Protein microarrays: challenges and promises. Pharmacogenomics. Vol. 3 (4): 1-10.
MS: Mass Spectrometry; NHS: N-hydroxysuccinimide; SELDI: Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization; SPR: Surface
Plasmon Resonance.
PRINCIPALES TECNOLOGAS EMPLEADAS EN MICROARRAYS DE PROTENAS
Protometrix Vidrio
Superficie recubierta de
Ni
2+
para la captura de
protenas marcadas con
Histidina
Fluorescencia
3.2.2. Microarrays de funcin e
interaccin de protenas
Mediante los arrays de protenas de funcin e
interaccin se puede estudiar de manera
simultnea diferentes interacciones existentes
entre protenas, protena-oligosacrido, protena-
ADN, y protena-frmaco. Adems estos
microarrays pueden emplearse en la verificacin
de la diana de un determinado anticuerpo o bien
en la identificacin del sustrato de una enzima, tal
y como se ha representado en la siguiente figura:
36
Receptor-ligando
Enzima-sustrato
Protena-protena
Protena-oligosacrido
Protena-ADN
Fig. 12. Microarrays de funcin e interaccin de protenas.
Fuente: Joos, T. O. (2004). Microarray technology: an increasing variety of screening tools for proteomic research.
Drug Discovery Today. Vol. 3 (1):24-31.
Las aplicaciones comerciales de los microarrays
de funcin e interaccin se centran en los arrays
de interaccin enzima-sustrato y protena-
protena:
Arrays de interaccin enzima-sustrato: la
bsqueda de sustratos para enzimas se ha
centrado en gran medida en el desarrollo de
nuevas aplicaciones orientadas a la
identificacin de sustratos para protenas
kinasas. Esta aplicacin de los microarrays de
protenas es de gran relevancia, ya que la
identificacin de los sustratos de este tipo de
protenas es un paso clave en la comprensin
de su funcin. Hasta ahora, este tipo de
identificacin resultaba muy lenta y costosa,
adems de carecer de la sensibilidad
necesaria
48
.
Entre las empresas que desarrollan microarrays
de protenas para estudiar la funcin de kinasas
se encuentra PepScan
49
. Esta empresa ha
lanzado al mercado el PepChip Kinase
microarray que permite la seleccin del
sustrato ptimo para ensayos de alto
rendimiento, de manera que se pueda generar
una huella de la actividad celular de la kinasa,
analizar los efectos y especificidad de sus
inhibidores, y determinar la actividad kinasa en
una mezcla compleja de enzimas. Otra de las
empresas que desarrollan microarrays enzima-
sustrato es Jerini AG
50
, que ha lanzado el
Pepstar
TM
peptide microarray, con diferentes
aplicaciones como el screening de sustratos
especficos de enzimas y de proteasas, la
optimizacin de los sustratos enzimticos ya
conocidos, el estudio de las rutas de
transduccin de la seal, la deteccin de las
actividades enzimticas contaminantes, o el
mapeado de las regiones inmunodominantes de
los antgenos.
Arrays de interaccin protena-protena:
esta estrategia est siendo comercializada por
la compaa Protometrix Inc. y ofrece un amplio
abanico de posibilidades para el estudio de la
interaccin entre frmacos y protenas, o bien
el efecto de un determinado frmaco sobre las
interacciones protena-protena con productos
como el array que comercializa bajo el nombre
de Yeast Protoarray
TM
PPI Proteome
Microarray.
48
Invitrogen (http://www.invitrogen.com).
49
PepScan (http://www.pepscan.nl).
50
Jerini AG (http://www.jerini.com).
3.2.3. Microarrays de screening
inverso de protenas
Mediante el screening inverso se inmovilizan
lisados celulares que representan todo el
repertorio de protenas celulares en un
determinado estado celular. La interaccin
inespecfica de las protenas con el soporte del
microarray tiene lugar mediante interacciones
electrostticas, fuerzas inicas o de Van der
Waals. Las protenas capturadas en estos tipos de
arrays pueden ser identificadas mediante
espectrometra de masas o bien mediante
anticuerpos especficos.
Gracias a estos microarrays es posible realizar un
screening de todos los anticuerpos presentes en
el suero de un paciente en busca de una
determinada protena diana. Las muestras de
tejido inmovilizado o de clulas pueden ser
empleadas para este tipo de ensayos. Estas
tcnicas tienen un enorme potencial en la
deteccin de biomarcadores en anlisis
protemicos.
37
Lisado de protenas
(deteccin por EM)
Lisado de protenas
(deteccin por anticuerpos)
Clulas
Tejidos
Fig. 13. Microarrays de protenas de screening inverso.
Fuente: Joos, T. O. (2004). Microarray technology: an increasing variety of screening tools for proteomic research.
Drug Discovery Today. Vol. 3 (1):24-31.
La principal ventaja de este tipo de microarray
reside en que las muestras inmovilizadas no
requieren un paso previo de desnaturalizacin ni
marcaje. Los microarrays de protenas de
screening inverso permiten la identificacin de
nuevos biomarcadores, el anlisis de perfiles de
expresin de protenas y el perfilado temprano de
la toxicidad y eficacia de frmacos potenciales.
Empresas como Zeptosens AG
51
ofrecen este tipo
de plataformas de screening inverso, que en este
caso emplea el nombre comercial de
ZeptoMARK
TM
.
La empresa Ciphergen Biosystems Inc.
52
tambin
ha desarrollado tecnologas de screening inverso
como SELDI
53
, que emplea espectrometra de
masas como mtodo de lectura. Mediante la
comparacin de los espectros de dos muestras
diferentes se pueden identificar las protenas que
se expresan de manera diferencial a travs de su
masa molecular. La tecnologa SELDI es muy
apropiada para la deteccin rpida de las
diferentes cantidades de protena total en
muestras diferentes, as como para la deteccin
de protenas pequeas y pptidos, si bien su uso
es limitado en protenas de alto peso molecular o
protenas de membrana
54
.
51
Zeptosens (http://www.zeptosens.com).
52
Ciphergen (http://www.ciphergen.com).
53
SELDI: desorcin/ionizacin mediante lser asistida por matriz (Surface Enhanced Laser Desorption Ionization).
54
Joos, T.O. (2004) Microarray technology: an increasing variety of screening tools for proteomic research. Drug Discovery
Today. Vol. 3 (1):24-31.
Los arrays de protenas suministran una gran
cantidad de informacin acerca de la funcin e
interacciones de las protenas que los arrays de
ADN no pueden proporcionar. No obstante, los
microarrays de protenas no son suficientes para
analizar las modificaciones post-traduccionales
que sufren las protenas, generalmente debidas a
la unin covalente de azcares en un proceso
llamado glicosilacin. Por otro lado, existe un
amplio nmero de procesos celulares en los que
estn involucrados receptores de unin a
azcares, por lo que los microarrays de
carbohidratos son una herramienta fundamental
en el estudio de los procesos biolgicos en los que
estn implicadas las protenas de inters.
Los carbohidratos o azcares complejos estn
constituidos por mocosacridos que pueden unirse
de formas muy diversas, dando lugar a distintos
tipos de oligosacridos y polisacridos con
diferentes configuraciones y ramificaciones. Las
interacciones entre protenas y carbohidratos
estn implicadas en numerosos procesos
biolgicos de relevancia, que tienen lugar tanto
en el interior como en el exterior de la clula. En
los ltimos aos ha tenido lugar un desarrollo
continuo de herramientas moleculares que
permiten identificar estos oligosacridos y las
protenas con las que interactan, aumentando en
gran medida la sensibilidad de los ensayos,
principalmente gracias a la espectrometra de
masas. Sin embargo, el progreso que han sufrido
las tcnicas relacionadas con la identificacin de
protenas y ADN ha sido mucho mayor, por lo que
el anlisis de oligosacridos clave es una
asignatura pendiente. Una de las razones
principales radica en el hecho de que los
oligosacridos no pueden ser clonados ni
amplificados, ya que son sintetizados por la
accin conjunta de mltiples glicotransferasas y
otras enzimas. Por otra parte, la cantidad de
oligosacridos que pueden ser aislados es
generalmente muy limitada
55
.
Existen dos categoras de microarrays de
oligosacridos en funcin del tipo de carbohidrato
inmovilizado. Los primeros estn compuestos por
macromolculas de tipo glicoprotenas y
polisacridos, inmovilizados sobre soportes como
cristales cubiertos de nitrocelulosa o poliestireno.
Estos microarrays tienen una aplicacin directa en
estudios serolgicos con el fin de identificar
interacciones con anticuerpos y otras protenas.
Este es el caso de microarrays de polisacridos
como el dextrano e inulina, empleados en anlisis
antignicos de polisacridos bacterianos. La
principal desventaja de este tipo de microarrays
de oligosacridos radica en la imposibilidad de
identificar la secuencia del oligosacrido una vez
se ha producido la interaccin. El segundo tipo de
microarrays de carbohidratos est formado por
monosacridos como la N-acetilglucosamina, o
disacridos como la lactosa, celobiosa o manosa
en forma de glucosaminas
56
. En este ltimo tipo
de microarrays, la inmovilizacin al soporte se
consigue por medio de lectinas procedentes de
plantas o anticuerpos modificados por medio de la
enzima glicosiltransferasa. Una estrategia
alternativa que sigue el Consorcio de Glicmica
Funcional
57
consiste en la biotinilizacin de
oligosacridos y su posterior anclaje a una
superficie cubierta con estreptavidina.
38
4. Microarrays de carbohidratos
55
Fukui, S., et al. (2002). Oligosaccharide microarrays for high-throughput detection and specificity assignments of
carbohydrate-protein interactions. Nature Biotechnology. Vol. 20: 1011-1017.
56
Feizi, T., et al. (2003). Carbohydrate microarrays- a new set of technologies at the frontiers of glycomics. Current Opinion
in Structural Biology. Vol. 13: 637-645.
57
Consortium for Functional Glycomics, CFG, NIH (http://www.functionalglycomics.org/static/consortium).
Los neoglicolpidos
58
son uno de los ejemplos de
estos microarrays de carbohidratos. Los
neoglicolpidos inmovilizados en nitrocelulosa se
han utilizado con protenas especficas de unin a
carbohidratos para confirmar la prediccin de las
interacciones entre las protenas y los
oligosacridos
59
.
de carbohidratos
El elemento ms importante a tener en cuenta a
la hora de construir un microarray de
carbohidratos reside en la obtencin de
monosacridos u oligosacridos puros. Los
principales mtodos de obtencin de estos
carbohidratos son la sntesis qumica o enzimtica
y la extraccin de oligosacridos a partir de
fuentes naturales. La inmovilizacin de los
oligosacridos es el siguiente paso clave en el
diseo de un microarray, y existen diversos
procedimientos y soportes.
4.1.1. Sntesis de oligosacridos
A pesar de la dificultad de la sntesis qumica de
oligosacridos debido a su complejidad estructural,
se ha conseguido sintetizar un nmero
considerable de ellos con el objeto de estudiar la
especificidad de anticuerpos y otras protenas de
unin a carbohidratos. Una alternativa a la sntesis
qumica consiste en la sntesis enzimtica mediante
reacciones catalizadas por enzimas como las
glicosiltransferasas o glicosidasas. La ventaja de
esta tcnica radica en que los sustratos que se
utilizan en estas reacciones son naturales, mientras
que su principal desventaja reside en la escasa
disponibilidad de enzimas y su elevado coste
60
.
4.1.2. Aislamiento de oligosacridos
de fuentes naturales
Los oligosacridos con extremos reductores
61
son
ideales para la derivatizacin o modificacin de
sus grupos funcionales, necesaria en los procesos
de inmovilizacin de carbohidratos. Estos
oligosacridos reductores pueden aislarse a partir
de leche y orina tanto animal como humana, o
bien pueden ser liberados de oligosacridos
mediante enzimas hidrolticas especficas. La
obtencin de fragmentos de oligosacridos a
partir de los polisacridos de plantas y bacterias
tambin es posible mediante mtodos qumicos
como la hidrlisis, acetolisis o degradacin de
Smith
62
. El aislamiento y purificacin de
oligosacridos es un proceso muy laborioso que
implica la realizacin mltiples ensayos
cromatogrficos mediante HPLC
63
.
39
Fig. 14. Espectrometra de masas para la identificacin de los oligosacridos
Fuente: Consortium for Functional Glycomics, CFG, NIH. (http://www.functionalglycomics.org/static/consortium).
58
Los neoglicolpidos son oligosacridos unidos a lpidos.
59
Fukui, S., et al. (2002). Oligosaccharide microarrays for high-throughput detection and specificity assignments of
carbohydrate-protein interactions. Nature Biotechnology. Vol. 20: 1011-1017.
60
61
Extremo reductor o libre (R): grupo funcional que en presencia de O
2
tiene mucha tendencia a oxidarse (-OH, -NH, -SH),
posibilitando la formacin de nuevos compuestos y macromolculas.
62
63
HPLC, High Performance Liquid Chromatography (Cromatografa lquida de alta resolucin).
4.1.3. Inmovilizacin
de los carbohidratos
La inmovilizacin de carbohidratos se puede llevar a
cabo mediante dos estrategias, la inmovilizacin
covalente y no covalente. La inmovilizacin no
covalente inespecfica sobre placas de vidrio
cubiertas de nitrocelulosa puede ser empleada con
carbohidratos no modificados. Sin embargo, la
inmovilizacin de oligosacridos mediante esta
tcnica es dependiente de la longitud de las cadenas
de carbohidratos, siendo mayor la afinidad de
oligonucletidos de alto peso molecular por los
soportes de nitrocelulosa. Ejemplos de carbohidratos
inmovilizados no covalentemente son polisacridos
diversos, glicosaminoglicanos, glicoprotenas, o
neoglicolpidos. La inmovilizacin covalente de
carbohidratos se puede realizar tanto en soportes de
cristal como de oro, que previamente han de ser
funcionalizados mediante grupos tiol, maleimida o
benzoquinona. La unin covalente entre estos grupos
y los carbohidratos se realiza por medio de molculas
de enlace unidas a los extremos de los carbohidratos
como los ciclopentanos y maleimidas
64
.
4.2. Aplicaciones de los
microarrays de
carbohidratos
La principal aplicacin de los microarrays de
carbohidratos es el descubrimiento de compuestos
teraputicos implicados en diversos procesos
fisiolgicos, desde la aparicin de una respuesta
inmune hasta procesos inflamatorios o infecciosos
desencadenados por bacterias o virus. La mayora
de los microarrays de carbohidratos han sido
empleados como sistemas modelo para la
investigacin de interacciones entre carbohidratos
y lectinas. Las lectinas son grupo de protenas de
origen no inmune presentes en la mayora de los
seres vivos, que comparten en comn la
propiedad de unirse de forma especfica y
reversible a carbohidratos. Esta propiedad hace
que las lectinas constituyan una herramienta muy
valiosa para el estudio de la estructura de
membranas celulares, determinacin de la
patogenicidad de los microorganismos, tipaje de
grupos sanguneos, y estudio de otros procesos
de reconocimiento mediados por interacciones
especificas de carbohidratos con receptores.
Los principales ejemplos de microarrays de
carbohidratos son los microarrays de antibiticos
aminoglicsidos y los microarrays de manosa:
Los microarrays de antibiticos
aminoglicsidos se han empleado en la
determinacin de las interacciones de los
antibiticos con dianas teraputicas y enzimas
asociadas a resistencia frente a antibiticos. Esta
herramienta es de gran utilidad, ya que permite
acelerar el descubrimiento de nuevos antibiticos.
Los microarrays del monosacrido manosa
han sido empleados en la caracterizacin de los
carbohidratos que especficamente se unen a las
protenas neutralizantes del virus de la
inmunodeficiencia humana (HIV). Estos estudios
podran ser de gran relevancia para el desarrollo
de vacunas anti-VIH basadas en carbohidratos
65
.
Un ejemplo de las diversas aplicaciones que un
microarray de carbohidratos puede ofrecer se
encuentra en el producto comercial GlycoChip,
desarrollado por la compaa israel Glycominds.
Las aplicaciones de este microarray consisten en
la identificacin de nuevas protenas con dominios
de unin a carbohidratos, y el cribado de
anticuerpos frente a determinados glicanos.
40
64
Disney, M. & Seeberger, P. (2004). Carbohydrate arrays as tools for the glycomics revolution. Drug Targets Today:
Targets. Vol. 3(4): 151-158.
65
Seeberger, P. H., et al. (2004). Carbohydrate arrays as tools for the glycomics revolution. Drug Discovery Targets. Vol. 3
(4): 151-158.
Fig. 15. GlycoChip empleado en la identificacin de las interacciones
de glicanos con clulas T CD4.
Fuente: Glycominds Ltd (http://www.glycominds.com).
Hasta la fecha, el anlisis in vivo de la expresin
gnica se realizaba nicamente gen a gen, por
medio de la introduccin de un gen en un clula,
y la posterior observacin de su efecto fisiolgico
o fenotipo. Los microarrays de clulas permiten el
anlisis de la expresin gnica in vivo a gran
escala en clulas humanas y animales.
La estrategia empleada para su diseo consiste en
el cultivo de clulas sobre fragmentos de ADN
inmovilizados en un microarray. Estos fragmentos
de ADN se transfectan o introducen en las clulas,
que posteriormente expresan las protenas
codificadas por su secuencia. Una estrategia
alternativa consiste en transfectar las clulas
inmovilizadas en el array con ARN interferente, de
modo que en vez de activarse la expresin de un
gen, se produzca el silenciamiento del mismo. Este
bloqueo de la expresin gnica define un conjunto
de puntos en el array que se correspondern con la
expresin del fenotipo esperado. Las principales
tcnicas de deteccin empleadas en los
microarrays de clulas son la hibridacin in situ,
inmunofluorescencia y autorradiografa.
41
5. Microarrays de clulas
ADNc depositado en placa
1 3
2
Incubacin de ADN con clulas
de mamfero para su transfeccin
Deteccin de las clulas transfectadas
a partir del fenotipo
Fig. 16. Diseo de un Microarray de clulas.
Fuente: Howbrook, D. N., et al. (2003). Developments in microarray technologies. Drug Discovery Today Vol. 8
N 14:642-651.
Aplicaciones de los microarrays de clulas
Identificacin de dianas teraputicas mediante la caracterizacin funcional a gran escala de
productos gnicos.
Evaluacin de la especificidad de frmacos candidatos.
Identificacin de las protenas de unin en aquellos frmacos con mecanismos de accin
desconocidos o bien identificados mediante anlisis basados en fenotipo.
Anlisis de prdida de funcin mediante ARN interferente
66
.
66
El ARN de interferencia (ARNi) es una tecnologa que se basa en el empleo de molculas cortas de ARN de cadena
sencilla o doble para bloquear la expresin de genes especficos. El mecanismo del ARNi est presente en la naturaleza
como una respuesta celular innata que permite combatir las infecciones virales regulando la expresin del ARN.
Los microarrays de clulas ofrecen varias ventajas
frente a los microarrays de protenas, debido a la
heterogeneidad de estas ltimas y a la dificultad
para mantener su estabilidad. El empleo de
microarrays de clulas evita estos problemas,
adems de permitir que tengan lugar los procesos
de modificacin transcripcional necesarios para el
correcto funcionamiento de las protenas, como
por ejemplo protenas de membrana, un tipo de
diana muy comn. Los microarrays de clulas
transfectadas tienen una serie de ventajas sobre
otros mtodos convencionales de expresin
67
:
42
Principales ventajas de los microarrays de clulas
Miniaturizacin, automatizacin y multiplexado del ensayo.
Permite el empleo de diversos mtodos de deteccin.
Emplean los mismos arrayers robticos que los microarrays de ADN y por ello pueden llegar a
densidades de hasta 6.000-10.000 clusters de clulas por soporte.
Posibilidad de inmovilizar clulas en el array, permitiendo la deteccin de fenotipos transitorios
tales como cambios en la concentracin de una determinada sustancia.
Las protenas son sintetizadas por las clulas inmovilizadas en el array, aumentando la probabilidad
de adquirir las necesarias modificaciones post-traduccionales.
Principales limitaciones de los microarrays de clulas
El fenotipo observado debido a la transfeccin transitoria de las clulas puede no corresponderse
con la funcin celular del gen in vivo.
Slo es posible realizar esta tcnica en clulas con eficiencias de transfeccin mayores del 1%.
Requiere el diseo previo de colecciones de ADNc.
Cabe destacar el diseo de colecciones de ADNc como una limitacin importante a la hora de elaborar
arrays de clulas de alta densidad. Actualmente existen distintas iniciativas en marcha para la creacin de
colecciones de ADNc a partir del genoma humano
68
.
67
Sabatini, D. M. and Ziauddin, J. (2001). Microarrays of cells expressing defined cDNAs. Nature. Vol. 411: 107-110.
Bailey, S. N., et al. (2002). Applications of transfected cell microarrays in high-throughput drug discovery. DDT Vol. 7,
N 18 (Suppl.): 1-6.
68
Harvard Institute of Proteomics, Boston, MA, USA (http://www.hip.harvard.edu/research.html).
Mammalian Gene Collection, MGC (http://mgc.nci.nih.gov/).
Los microarrays de tejidos (TMAs, Tissue
Microarrays) constituyen una de las ms recientes
novedades en el campo de los biochips. Consisten
en colecciones miniaturizadas de hasta 1.000
muestras de tejidos inmovilizadas sobre un
soporte, que permiten el screening de ADN, ARN
y protenas. Prcticamente la mayora de los
artculos publicados sobre microarrays de tejidos
estn relacionados con el anlisis de tumores,
aunque se ha demostrado su valor en otro tipo de
patologas relacionadas con el sistema nervioso
69
.
El proceso de desarrollo de frmacos est
compuesto por una serie de etapas que requieren
del anlisis de tejidos de los pacientes
participantes en ensayos clnicos. Los mtodos
empleados hasta el momento en el anlisis y
caracterizacin de tal cantidad de muestras de
tejidos hacan que el proceso de descubrimiento y
desarrollo de frmacos fuera largo, de alto coste y
con una difcil estandarizacin. La tecnologa de
microarrays de tejidos permite el anlisis in situ a
gran escala de muestras de tejidos
70
y aunque
bsicamente se emplea en estudios relacionados
con el cncer, son de gran utilidad en cualquier
tipo de patologas en los que se necesitan
muestras de tejidos como es el caso de estudios
con tejido nervioso.
43
6. Microarrays de tejidos
Ventajas derivadas del empleo de microarrays de tejidos
Estandarizacin de los ensayos clnicos y moleculares en tejidos.
Pueden someterse a un amplio rango de tcnicas (tincin histoqumica e inmunolgica, hibridacin
in situ).
Requerimiento de pequeas cantidades de reactivos.
Limitaciones derivadas del empleo de microarrays de tejidos
La cantidad de tejido empleada podra no ser representativa del tejido del que deriva (ej. Displasias y
carcinomas in situ).
Requiere material de partida fijado en formol e incluido en parafina.
Segn se muestra en la figura 17, la construccin de un microarray de tejidos requiere la extraccin previa
de muestras de tumor en forma de pequeos cilindros de 0,6 mm de dimetro que posteriormente se
insertan en las cavidades a medida de un bloque de parafina. La transferencia de estas secciones de tejido
a una placa se facilita mediante el empleo de lminas adhesivas.
69
Sauter, G., et al. (2003).Tissue microarrays in drug discovery. Nature Review: Drug discovery 2: 962-972.
70
Hillan, K., et al. (2003). Tissue microarrays in drug discovery. Nature Reviews in Drug Discovery. Vol. 2 (962-972).
Una de las posibilidades que ofrecen los
microarrays de tejidos es su combinacin con
microarrays de ADNc para la validacin de los
resultados obtenidos con estos ltimos. De esta
manera, se pueden obtener perfiles de expresin
mediante microarrays de tejidos para aquellos
genes que se expresen de manera diferencial en
tejidos sanos y enfermos.
44
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Fig. 17. Diseo de un microarray de tejidos.
Fuente: Hillan, K., et al. (2003). Tissue microarrays in drug discovery. Nature Reviews in Drug Discovery. Vol. 2 (962-972).
Aplicaciones de los microarrays de tejidos en combinacin con microarrays de ADNc:
Determinacin de la distribucin celular y subcelular de las dianas moleculares.
Integracin de la informacin obtenida a nivel de ADN, ARN y protena sobre una misma diana
molecular.
Validacin in vivo de los resultados obtenidos del anlisis de lneas celulares o de modelos
animales de enfermedades en muestras de tejidos de pacientes.
Extensin de los resultados obtenidos del anlisis de un nmero limitado de arrays de ADNc a una
cohorte epidemiolgicamente representativa mediante arrays de tejidos.
Exploracin de la prevalencia de las potenciales dianas en diferentes estados de progresin del
tumor.
Correlacin de los datos moleculares con evidencias clinicopatolgicas de los pacientes.
45
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Las principales aplicaciones de las tecnologas de
microarrays en salud humana son muy diversas y
estn interrelacionadas entre si, pudindose
emplear clasificaciones que hacen referencia a los
usuarios de la tecnologa (industria farmacutica,
clnica o acadmica), o bien al tipo de estudio que
se puede llevar a cabo (genotipado o expresin
gnica). Para los propsitos del presente informe,
las aplicaciones de los microarrays se han dividido
en cinco sectores que se corresponden con la
identificacin de dianas teraputicas,
descubrimiento y desarrollo de frmacos,
diagnstico clnico, farmacogenmica y
farmacogentica, e investigacin bsica.
7.1. Identificacin de dianas
teraputicas
La comparacin de los niveles de expresin de
genes en tejidos enfermos y sanos permite la
identificacin de genes implicados en
enfermedades de inters, as como la asociacin
con las protenas que forman parte del proceso
patolgico. Esta informacin es imprescindible
para el desarrollo de frmacos que acten
bloqueando o modulando los mecanismos
moleculares de la enfermedad.
Las tcnicas de anlisis de la expresin gnica
mediante microarrays de ADN se emplean en la
identificacin de nuevas dianas teraputicas, como
parte de las primera etapas del proceso de
investigacin en la industria farmacutica. El estudio
de interacciones protena-protena es tambin otra
de las estrategias tenidas en cuenta, para la cual los
microarrays de protenas son de gran utilidad.
46
7. Aplicaciones de los microarrays
en salud humana
Descubrimiento
de dianas
Descubrimiento
de frmacos
Desarrollo
de frmacos
Identificacin
de dianas
Validacin
de dianas
Seleccin
de compuestos
Optimizacin
de compuestos
Fase
Preclnica
Fase
Clnica
Fig. 18. Fases principales del desarrollo farmacolgico.
Fuente: Whittaker P. A. (2003). What is the relevance of bioinformatics to pharmacology? Trends In Pharmacological
Sciences, 24 (8):434-439.
7.2. Descubrimiento
y desarrollo de frmacos
El proceso de descubrimiento y desarrollo de
frmacos se ha beneficiado del uso de
herramientas genmicas de alto rendimiento
como los microarrays de ADN, que hacen posible
el anlisis de la expresin gnica en miles de
muestras simultneamente. El empleo de biochips
permite analizar de forma rpida los cambios de
expresin gnica que tienen lugar durante la
administracin de un frmaco, as como la
localizacin de nuevas posibles dianas
teraputicas y efectos toxicolgicos asociados. Por
otra parte, los microarrays de carbohidratos
poseen un papel fundamental en el
descubrimiento de compuestos teraputicos
implicados en diversos procesos fisiolgicos,
desde la aparicin de una respuesta inmune hasta
procesos inflamatorios o infecciosos
desencadenados por bacterias o virus.
El objetivo principal de la toxicogenmica radica
en el estudio de los cambios que se producen en
el perfil de expresin gnica como respuesta a
sustancias txicas para el organismo. Los
microarrays pueden ser utilizados por tanto en
ensayos de toxicidad, seguridad y efectividad del
frmaco candidato como parte integral de los
estudios clnicos. Las principales ventajas del
empleo de microarrays durante los estudios de
toxicidad radica en que permiten reducir el
empleo de animales en los ensayos clnicos y
proporcionan una herramienta de gran utilidad en
enfermedades complejas para los cuales no
existen modelos animales disponibles.
La determinacin de la toxicidad de un frmaco
durante las primeras fases del desarrollo
farmacutico permite ahorrar tiempo y dinero, de
forma que slo superen estas etapas preliminares
los candidatos ms adecuados.
47
Test de seguridad
en individuos sanos
(30-100 indiv.)
Fase I
Fase II
Fase III
Fase IV
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Test de seguridad e
impacto en el estado
patolgico (cientos de
pacientes)
Test de seguridad,
impacto, dosificacin y
estudios comparativos
(miles de pacientes)
Monitorizacin del
frmaco (estudios
post-marketing)
ETAPAS DEL DESARROLLO DE UN FRMACO
Fig. 19. Situacin de los estudios toxicolgicos en las distintas fases de ensayos clnicos que forman parte del proceso de
desarrollo de frmacos.
7.3. Diagnstico clnico
El diagnstico molecular de enfermedades se
realiza principalmente mediante microarrays de
ADN, que permiten el estudio de los posibles
polimorfismos y la deteccin de mutaciones en
genes complejos asociados a una enfermedad
concreta. Por otro lado, los microarrays tambin
se pueden emplear en el mbito clnico para la
diagnosis de diferentes tipos de tumores gracias a
sus perfiles de expresin gnica o patrones
moleculares. El anlisis de la expresin gnica de
los pacientes y la consiguiente identificacin de
patrones de expresin posee un impacto directo
en el diagnstico molecular del cncer. De esta
forma, cuanto mayor sea la capacidad para
clasificar un tumor determinado, se dispondr de
mayor informacin acerca de la biologa y el
pronstico del tumor.
Por otra parte, la identificacin de microorganismos
patgenos (virus, bacterias, hongos o protozoos)
mediante microarrays de ADN es de gran utilidad en
el diagnstico de patologas infecciosas y otra serie
de aplicaciones relacionadas con la microbiologa
clnica
71
. Los microarrays de ADN pueden emplearse
en la deteccin simultnea de un amplio nmero de
microorganismos, incluyendo bacterias, virus,
parsitos y hongos. La finalidad del empleo de
microarrays en microbiologa abarca mltiples
aplicaciones, que van desde la comprensin de la
biologa de los microorganismos, el estudio de los
mecanismos de resistencia frente a antibiticos, la
identificacin de las cepas o serotipos, a la
caracterizacin de nuevas dianas gnicas con valor
teraputico. Tanto los anlisis de SNPs como de
expresin gnica mediante microarrays de ADN
permitiran identificar los mecanismos implicados en
la resistencia de patgenos a ciertos agentes
antimicrobianos
72
.
48
71, 72
Domnech-Snchez, A. & Vila, J. (2004). Fundamento, tipos y aplicaciones de los arrays de ADN en la microbiologa
mdica. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 22(1):46-54.
Bryant, P. A., et al. (2004). Chips with everything: DNA microarrays in infectious diseases. Lancet Infect. Dis. 4:100-111.
Amplificacin
por PCR
Fabricacin
del chip
Hibridacin
Deteccin de la
seal y anlisis
Marcaje
fluorescente
Aislamiento
de ADN
Deteccin de secuencias virales y subtipos
HIV-1
EBV
HHV-6
KSHV
HTLV-1
HTLV-2
HCV
Infection
Fig. 20. Aplicacin de los microarrays en el diagnstico de VIH.
Fuente: Shieh, B. & Li, C. (2004). Multi-faceted, multi-versatile microarray: simultaneous detection of many viruses and
their expression profiles. Retrovirology 26 May, 1:11.
Es interesante sealar que no slo los microarrays
de ADN se emplean en las aplicaciones
relacionadas con el diagnstico, ya que los
microarrays de protenas muestran un gran
potencial como herramientas de diagnstico
clnico en alergias humanas de distinta ndole.
Otra posible aplicacin de este tipo de
microarrays de protenas es la posibilidad de
desarrollar estudios de inmunogenicidad para su
potencial aplicacin en el desarrollo de vacunas.
En este tipo de estudios se podran inmovilizar
diferentes eptopos
73
y analizar que anticuerpos
presentan una mayor respuesta, o bien analizar
simultneamente una gran cantidad de
anticuerpos frente a un mismo antgeno.
49
73
Eptopo: regin de la superficie de un antgeno que las molculas de anticuerpos pueden identificar y a la cual se pueden
fijar. Antgeno: Sustancia que el organismo reconoce como extraa y posiblemente perjudicial.
Principales aplicaciones de los microarrays en microbiologa clnica:
Estudio epidemiolgico molecular de microorganismos: identificacin de los genes responsables de
una menor patogenicidad en determinadas cepas de microorganismos. Ejemplo: Microarray de ADN
con genes de 19 cepas diferentes de M. tuberculosis.
Diagnstico microbiolgico: la mayora de los arrays empleados hasta le fecha en diagnstico
clnico consisten en arrays de baja densidad. Ejemplos: estos arrays se centran fundamentalmente
en la deteccin de varias especies de un mismo gnero de bacterias (Staphylococcus sp.
Pseudomonas sp.), presencia de parsitos infecciosos (Cryptosporidium sp.), o en el mbito de la
virologa clnica, bsicamente en su utilizacin en el genotipado del virus VIH.
Estudio de los mecanismos de accin y de resistencia a los agentes antimicrobianos: los
microarrays de ADN se han empleado para el estudio del mecanismo de accin de ciertos
compuestos frente a determinados microorganismos, as como en el anlisis de la resistencia a
antibiticos mediante deteccin de genes especficos o mutaciones. Ejemplo: Microarrays de ADN
para la deteccin de resistencia a rifampicina en M. tuberculosis.
7.4. Farmacogenmica
y farmacogentica
Las estrategias de farmacogentica y
farmacogenmica constituyen otras de las reas de
aplicacin de los microarrays de ADN. La
farmacogentica consiste en el estudio de las bases
genticas que influencian la respuesta individual a
los frmacos, mientras que el trmino
farmacogenmica es ms amplio y se suele referir a
las aplicaciones comerciales de la tecnologa
genmica en el desarrollo de frmacos y terapia. La
combinacin de los datos obtenidos a partir de la
identificacin de SNPs, junto con la informacin
recopilada del estudio de perfiles de expresin
gnica, permite establecer una correlacin entre el
genotipo y el fenotipo de un determinado individuo.
El ltimo objetivo de la farmacogenmica consiste
en definir una enfermedad a nivel molecular de
tal manera que las herramientas preventivas y
teraputicas de las que se disponga puedan
frenar o mitigar los efectos de la enfermedad. Las
aplicaciones clnicas de la farmacogenmica se
encuentran dirigidas al empleo de estrategias
teraputicas ms efectivas en funcin del perfil
genmico del paciente, permitiendo identificar
aquellos frmacos y dosificaciones de los mismos
para los cuales el paciente ofrece una respuesta
ptima. De la misma forma, es posible identificar
los medicamentos o concentraciones de los
mismos que desencadenan reacciones de
toxicidad en algunos pacientes. Esta
estratificacin de la enfermedad en funcin del
genotipo del paciente, hara posible adems la
7.5. Investigacin bsica
El estudio de la regulacin de genes por medio de
microarrays de ADN ha proporcionado ingentes
cantidades de datos de gran valor para la
identificacin de genes involucrados en procesos
patolgicos, fisiolgicos y de desarrollo, adems
de servir como paso previo en el proceso de
desarrollo de frmacos. Los microarrays de ADN
permiten estudiar la funcin de los genes
facilitando la identificacin de aquellos que estn
activados de forma diferencial cuando se
comparan dos condiciones diferentes, como por
ejemplo un tejido sano y otro afectado por algn
tipo de patologa.
salida al mercado de nuevos frmacos, dirigidos a
segmentos de la poblacin para los cuales los
medicamentos actuales no resultan eficaces. Por
ltimo, el conocimiento del perfil gentico de las
poblaciones permitir conocer la predisposicin
individual de cada persona a sufrir algn tipo de
enfermedad, antes incluso de que aparezcan los
sntomas, permitiendo as la realizacin de una
mejor y autntica medicina preventiva. Esto se
llevar a cabo a travs de estudios de
epidemiologa gentica.
Otro de los usos ms prometedores de los
microarrays consiste en el empleo de los patrones
de expresin como predictores de la respuesta al
tratamiento. Se conocen datos confirmatorios en
relacin con el tratamiento de linfomas, leucemias
agudas y cncer de mama
74
.
50
74
Cigudosa, J. C. (2004).The microarray revolution in biomedical research: types of platforms, uses and perspectives in
oncology .An. Sist. Sanit. Navar. 27 (1): 11-20.
ARNm
Microarrays
Subgrupo 1:
gen inactivo
Subgrupo 2:
gen activo
Distinto Genotipo
Respuesta a frmacos, toxicidad, predisposicin a desarrollar determinadas enfermedades, etc.
Fig. 21. Tecnologas de microarrays de ADN aplicadas a la farmacogenmica.
{
51
Distinta expresin gnica
Identificacin de genes implicados en procesos biolgicos de inters
Cultivos
celulares
ARNm
Microarrays
Tejido
sano
Tejido
enfermo
Fig. 22. Tecnologas de microarrays de ADN aplicadas a la investigacin bsica.
Este tipo de estudios se pueden complementar con
anlisis realizados mediante otros tipos de
microarrays, como por ejemplo microarrays de
protenas, anticuerpos, clulas o tejidos. Por otra
parte, los microarrays de carbohidratos ofrecen
grandes ventajas como sistemas modelo para la
investigacin de interacciones entre carbohidratos y
lectinas. stas constituyen un grupo de molculas
muy valiosas para el estudio de la estructura de
membranas celulares, patogenicidad de
microorganismos, tipaje de grupos sanguneos, y
otros procesos de reconocimiento mediados por
interacciones especificas de carbohidratos con
receptores. Los microarrays de ADN tambin se han
empleado en la investigacin de patgenos
bacterianos, tanto de los factores de patogenicidad
del organismo, como de la respuesta de la clula
hospedadora frente a la accin del microorganismo
(Ejemplo: Microarrays de ADN que contienen genes
constituyentes del genoma de H. pylori
75
).
Tipos de microarrays ADN Protenas Carbohidratos Clulas Tejidos
Identificacin de dianas
teraputicas

Descubrimiento y
desarrollo de frmacos

Frmacogenmica
Diagnstico clnico
Investigacin bsica
Tabla 9. Aplicaciones de las tecnologas de microarrays en salud humana.
APLICACIONES DE LAS TECNOLOGAS DE MICROARRAYS EN SALUD HUMANA
75
Domnech-Snchez, A.; Vila, J. (2004). Fundamentos, tipos y aplicaciones de los arrays de ADN en la microbiologa
mdica. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. Vol. 22 (1):46-54.
La tcnica de microarrays cuenta con una serie de
barreras a su desarrollo que, si bien durante los
ltimos aos se est trabajando de manera activa
en solventarlas, no dejan de seguir siendo
importantes.
Entre las principales limitaciones de los
microarrays est su precio, ya que pese al
descenso paulatino de su coste, sigue siendo
una tcnica cara que en muchos casos no
permite incorporarla como un anlisis rutinario.
En cuanto a las limitaciones tcnicas, la
reproducibilidad de los arrays de expresin es
la que ms se cita entre los usuarios de esta
tecnologa. Hay que tener en cuenta que la
variabilidad de los parmetros implicados en
estos anlisis ha de ser mnima y la deteccin
de pequeos cambios en la expresin de genes
nicamente deberan ser atribuidos a la biologa
de la muestra en s. En la actualidad existe la
posibilidad de cuantificar la integridad del ADN,
favoreciendo la fiabilidad y robustez de los
microarrays. Varios estudios publicados en el
ltimo ao destacan el descenso de la
variabilidad tcnica entre las principales
plataformas tecnolgicas de microarrays de
ADN, lo que indica un mejor conocimiento de
esta tecnologa y mayor experiencia en el
correcto uso de dichas herramientas
76
.
Dado que es una tecnologa que an se
encuentra en desarrollo, resulta difcil su
estandarizacin, una necesidad que est
favoreciendo el uso de microarrays de oligos
frente al ADNc por su mejor estandarizacin y
portabilidad. Algunos estudios recientes ya
sealan la relevancia de la estandarizacin en la
utilizacin correcta de microarrays
77
. La FDA
78
ha puesto en marcha en el ao 2005 un
proyecto denominado MAQC (MicroArray Quality
Control Project)
79
, que pretende proporcionar a
la comunidad cientfica herramientas de control
de calidad en microarrays. El objetivo ltimo de
este proyecto consiste en la elaboracin de una
gua de referencia que facilite la estandarizacin
del uso de microarrays, como complemento a la
gua sobre farmacogenmica publicada a
comienzos del ao 2005 por la misma agencia
80
.
Hasta ahora, la cantidad de muestra
necesaria para ser analizada era un factor
limitante, pero gracias a la aportacin de
diferentes tecnologas de miniaturizacin como
la microfludica y la nanotecnologa, el problema
de la cantidad de muestra est reduciendo
progresivamente su impacto.
El Proyecto Genoma Humano ha permitido la
construccin de mapas genticos y fsicos
detallados del genoma humano, as como
determinar su secuencia y localizar la posicin de
los genes que lo componen. Esta informacin ha
sido de gran valor a la hora de desarrollar
microarrays de ADN, a pesar de que la anotacin
incorrecta o incompleta de secuencias del
genoma puede dar lugar a errores que pueden
pasar desapercibidos. La anotacin de secuencias
va paulatinamente ganando en exactitud a medida
que se dispone de ms informacin, lo que
permite no slo identificar la secuencia, sino
adems describir su funcin.
52
8. Barreras existentes para la implantacin
de los microarrays
76
Sherlock, G. (2005). Of fish and chips. Nature Methods 2:329-30; Irizarry, et al. (2005). Multiple-laboratory comparison
of microarray platforms. Nature Methods 2: 345-50; Larkin et al. (2005). Independence and reproducibility across
microarray platforms. Nature Methods 2: 337-44; Weis, B. K. (2005). Standardizing global gene expression analysis
between laboratories and across platforms. Nature Methods 2:351-356.
77
Michiels, S., et al. (2005). Prediction of cancer outcome with microarrays: a multiple random validation strategy. Lancet.
5-11;365(9458):488-92.
78
FDA, Food & Drug Administration, USA (http://www.fda.gov/default.htm).
79
MicroArray Quality Control (MAQC) Project (http://www.fda.gov/nctr/science/centers/toxicoinformatics/maqc).
80
Guidance for Industry: Pharmacogenomic Data Submissions (2005). FDA, March.
(http://www.fda.gov/cder/guidance/6400fnl.pdf).
Por ltimo, una caracterstica inherente a las
tecnologas basadas en microarrays es la gran
cantidad de informacin que se genera a partir
de ellas. El manejo de los datos obtenidos a
partir de estos experimentos y su anlisis
posterior es uno de los mayores retos ante los
que se enfrenta esta tecnologa
81
. Para lograr
superar esta barrera, se est avanzando
considerablemente en el desarrollo de
herramientas bioinformticas entre las que
podemos mencionar las tcnicas de minera de
datos como el clustering, el anlisis estadstico,
los algoritmos genticos, las redes neuronales,
las herramientas de preprocesamiento de datos,
la representacin de modelos biolgicos, la
biologa computacional o la minera de textos.
Actualmente se est avanzando
considerablemente en el desarrollo de
herramientas bioinformticas en el contexto de
la genmica funcional, que permiten el
almacenaje de informacin, agrupacin de
genes en base a una determinada caracterstica,
seleccin de caractersticas relevantes y su
correlacin.
53
81
The ABRF MARG Survey 2005: Taking the Pulse of the Microarray Field.
(http://www.abrf.org/index.cfm/group.show/Microarray.30.htm).
Hace unos aos las perspectivas de las
tecnologas de microarrays y biochips auguraban
un futuro prometedor en este campo, aunque
todava no se observaba una implantacin
generalizada de la tcnica. La situacin actual
confirma estas previsiones al revelar un aumento
exponencial en cuanto a las publicaciones
relacionadas con microarrays y biochips, as como
un crecimiento en las patentes concedidas en los
ltimos aos, lo que demuestra alto inters
comercial por las tecnologas de microarrays y
biochips.
54
9. Perspectivas de mercado de los
microarrays y biochips en salud humana
N

d
e

p
u
b
l
i
c
a
c
i
o
n
e
s
Ao
0
4.000
8.000
12.000
2005 2004 2003 2002 2001 2000 1999 1998 1997 1996 1995 1994 1993 1992 1991 1990
N

d
e

p
a
t
e
n
t
e
s
Ao
0
100
200
300
400
500
600
2004 2003 2002 2001 2000 1999 1998 1997 1996 1995 1994 1993 1992 1991 1990
Fig. 23. Crecimiento del nmero de publicaciones y patentes relacionadas con microarrays y biochips.
Fuente: Elaboracin propia (datos obtenidos de PubMed, USPTO, esp@cenet).
Segn datos publicados en octubre de 2004 por la
empresa consultora estadounidense Freedonia
Group
82
, la demanda de productos y servicios
relacionados con biochips est sufriendo
aumentos progresivos anuales desde el ao 2003,
que alcanzarn la cifra de 2.100 millones de
dlares en el ao 2008. La demanda de
microarrays o biochips por separado tendr un
valor de 875 millones de dlares para esta fecha,
mientras que la demanda de productos
relacionados y servicios, tales como reactivos,
instrumentacin, software, soporte tcnico y
contratacin de servicios, completarn el total de
los 2.100 millones de dlares. Las tendencias
detectadas por este estudio se resumen en el
siguiente cuadro.
55
82
Freedonia Group, Inc. Freedonia Study Biochips (http://www.freedoniagroup.com/pdf/1854smwe.pdf).
Perspectivas de demanda de productos y servicios relacionados con biochips en el ao
2008 (Freedonia Group, Inc.):
Los microarrays de ADN continuarn siendo los principales productos que generan la mayor
demanda, aunque los microarrays de protenas sufrirn una expansin mucho ms rpida debido al
crecimiento del campo de la Protemica en los ltimos aos.
Los microarrays de alta sensibilidad y kits de procesamiento de muestras proporcionarn un
valor aadido y oportunidades de crecimiento.
La demanda total para instrumentacin de biochips se espera que alcance los 263 millones de
dlares en el ao 2008, con un crecimiento anual del 13% a partir del 2003.
Las oportunidades de crecimiento para la deteccin, preparacin de muestras y equipamiento
en hibridacin continuarn expandindose debido a la diversificacin de las investigaciones
protemicas.
La demanda de software especializado aumentar considerablemente ya que cada vez es ms
frecuente el empleo de programas sofisticados por parte de los investigadores. Estos programas
son capaces de almacenar inmensas cantidades de datos procedentes de los microarrays, as como
descifrar la complejidad de los perfiles de expresin de genes y protenas.
Se prev que el mercado relativo a los servicios relacionados con biochips crecer a un ritmo del
19% anual a partir del 2003, alcanzando los 600 millones de dlares para el ao 2008.
En cuanto a las labores de consultora y contratos de investigacin el crecimiento del 23%
contina situndolos en cabeza, debido principalmente a que las grandes compaas farmacuticas
contratan estas labores a terceros con mayor frecuencia.
Por ltimo, las oportunidades de crecimiento de la demanda en soporte tcnico y
mantenimiento de instalaciones en microarrays se mantendrn en alza, como consecuencia de la
renovacin de instalaciones antiguas por otras ms modernas.
El crecimiento de la demanda de productos y
servicios relacionados con biochips estar dirigido
principalmente por las aplicaciones en
descubrimiento de frmacos e investigacin
epidemiolgica, siendo el anlisis de protenas y
del perfil de expresin gnica las tcnicas que se
expanden con mayor velocidad.
Debido a que el descubrimiento de frmacos sigue
siendo la principal aplicacin de los biochips, el
mercado de la industria de los biochips est
compuesto fundamentalmente por empresas
farmacuticas, biotecnolgicas y grandes centros
de investigacin. Otros mercados secundarios
como proveedores mdicos, agencias
gubernamentales de salud, medicina forense y
agroalimentacin, no sern tan relevantes,
limitndose a aprovechar nichos de mercado en
productos concretos.
Una de las principales aplicaciones de los
microarrays de ADNc es el estudio de los niveles
de expresin de genes orientado a la
caracterizacin de tumores. Cabe destacar dentro
de esta aplicacin el esfuerzo llevado a cabo por
el Centro Nacional de Investigaciones
Oncolgicas (CNIO) para el desarrollo del
OncoChip
83
, que constituye la nica plataforma
de anlisis de expresin gnica mltiple
especficamente dedicada a cncer que se fabrica
en Espaa. El Oncochip representa alrededor
de 9.300 genes de las formas de cncer ms
frecuentes y relevantes como el cncer de mama,
colorrectal, pulmn, linfomas, leucemia y tumores
urinarios como el de rin, vejiga o prstata. El
80% de los genes representados en el Oncochip
han sido seleccionados por su funcin biolgica
directamente relacionada con procesos tumorales
como angiognesis, adhesin celular, apoptosis y
metstasis, o por su expresin anmala en tejidos
tumorales. El 20% restante son genes de inters
por su localizacin en regiones cromosmicas
donde se detectan frecuentes alteraciones. El
empleo de este microarray en la caracterizacin
de tumores permitir establecer la relacin de los
patrones de expresin gnica de los distintos
tipos de tumor con el comportamiento clnico de
los mismos, y definir criterios de tratamiento
diferenciado para cada tipo de tumor basados en
su perfil de expresin gnica.
En cuanto a la utilizacin de los microarrays de
ADNc en el diagnstico, tratamiento y
seguimiento de enfermedades, el Lipochip
84
comercializado por Laboratorios Lcer, S.A. es
uno de los ejemplos a resaltar. Este microarray ha
sido desarrollado a partir de la actividad
investigadora de la Fundacin de
Hipercolesterolemia Familiar con la
colaboracin del Departamento de Bioqumica y
Biologa Molecular de la Universidad de
Zaragoza, y con el soporte tecnolgico de
Progenika-MedPlant. El Lipochip constituye el
primer test gentico para el diagnstico de la
Hipercolesterolemia Familiar y recoge 224
mutaciones del gen que codifica el Receptor LDL,
cuyo mal funcionamiento es el responsable de
esta enfermedad. Gracias a la deteccin precoz de
este tipo de enfermedad, se puede establecer un
tratamiento adecuado que reduce
considerablemente los riesgos cardiovasculares
asociados a esta enfermedad.
En la misma lnea de diagnstico, la empresa
Progenika en colaboracin con el Servicio de
Gastroenterologa del Hospital Clnico de
Barcelona ha desarrollado un chip de ADN capaz
de analizar el diagnstico y pronstico de la
Enfermedad Inflamatoria Intestinal (EII) a
travs del anlisis de un panel de polimorfismos
de nucletidos (SNPs). En el caso del biochip para
la EII, la informacin obtenida del anlisis de
cada SNP aporta informacin sobre factores de
riesgo distintos, como la agresividad de la
dolencia, la necesidad de ciruga o la localizacin
de la patologa a lo largo de todo el tracto
digestivo. Esta nueva herramienta gentica
dirigida al diagnstico de la colitis ulcerosa y la
enfermedad de Crohn, cuenta hasta el momento
con 46 genes relacionados con esta enfermedad.
56
10. Situacin de la investigacin y desarrollo
en Espaa en el rea de microarrays
aplicados a la salud humana
83
CNIO OncoChip (http://bioinfo.cnio.es/data/oncochip).
84
Lipochip (http://www.meiga.info/documentos/lipochip.pdf).
Adems de los genes de mayor importancia en la
EII, como el PAI-1 (inhibidor de la activacin del
plasmingeno), el CRAD-15 o el HLA de clase 2,
tambin se han incluido otros relacionados con la
respuesta del organismo del paciente a los
frmacos con los que se trata la patologa
gstrica, con el fin de valorar cmo reaccionan
ante determinados tratamientos.
En el anexo II y III se recogen las empresas
espaolas con productos y servicios de
microarrays as como las empresas con
desarrollos bioinformticos aplicados a
microarrays. Por otra parte, los principales
proyectos de investigacin llevados a cabo por
grupos espaoles se encuentran recogidos en el
anexo IV del presente informe.
El empleo de microarrays de ADN por parte de
grupos de investigacin espaoles se ha visto
potenciado por medio de iniciativas para el
fomento del uso de estas tecnologas como la de
Genoma Espaa. Con esta convocatoria, se
pretende incentivar el empleo de microarrays de
ADN para medir la expresin de los genes gracias
a la cofinanciacin de Genoma Espaa, que
permite por tanto rebajar el precio final de las
casas comerciales. De momento existen ya cuatro
agrupaciones (Genochip, Aginet, AEMCES y
CEMAB), que ofrecern distintos servicios, aunque
la convocatoria sigue abierta hasta noviembre del
2006.
57
58
El objetivo de esta convocatoria de Genoma Espaa es aumentar la competitividad de la investigacin
pblica espaola en genmica, biomedicina y biotecnologa mediante el incremento del consumo de
microarrays para el anlisis de expresin gnica. Esta iniciativa ha supuesto un ahorro en los costes de
un 40%. El plazo de presentacin de solicitudes comienza el 15 de noviembre de 2004 y la convocatoria
se mantiene abierta hasta el 14 de noviembre de 2006.
Objetivo y duracin
Genoma Espaa dispone de 1.000.000 de euros para el presente ao. Entre las cuatro agrupaciones se
han requerido un total de 1.490.878 euros y a cada una se le ha concedido la cantidad que ha solicitado
contra justificacin de los servicios prestados. El reparto de la cantidad total es el siguiente:
Agrupacin Primeros seis meses Total anual
GENECHIP 386.900,00 (1.250 servicios) 773.800,00
AGINET 139.860,00 (600 servicios) 279.720,00
AEMCES 120.000,00 (400 servicios) 240.000,00
CEMAB 98.679,00 (378 servicios) 197.358,68
Situacin econmica
Convocatoria de ayudas para el fomento del uso de tecnologas microarrays de ADN para el
anlisis de expresin gnica (20 de diciembre de 2005)
Agrupacin Genechip (empresa proveedora: Affymetrix Co.)
Centro de Investigacin del Cncer de Salamanca (CIC).
Institut dInvestigacions Biomdiques August Pi i Sunyer, Hospital Clinic de Barcelona (IDIBAPS).
Centro Nacional de Biotecnologa de Madrid (CNB-CSIC).
Facultad de Medicina de Valencia. Universidad de Valencia (UVEG).
Asociacin Genika de Bilbao (GENIKA)
Parque Cientfico de Madrid. Universidad Complutense de Madrid (PCM-UCM)
Institut de Recerca. Hospital de la Santa Creu i Sant Pau de Barcelona (IR- HSCSP).
Institut de Recerca del Vall dHebron de Barcelona (IR-HUVH).
Agrupacin Aginet (empresa proveedora: Agilent Technologies)
Centro Nacional de Investigaciones Oncolgicas de Madrid (CNIO).
Centro de Regulacin Genmica de Barcelona (CRG).
Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares de Madrid (CNIC).
Hospital Clnico San Carlos de Madrid (HCSC).
Oryzon Genomics de Barcelona (ORYZON).
Fundacin Gaiker de Vizcaya (GAIKER).
Dominion Pharmakine, SL de Vizcaya (DPK).
Parque Cientfico de Barcelona (PCB).
Agrupacin Aemces (empresa proveedora: Amersham Biosciences, ahora parte de General Electric
Healthcare)
Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares de Madrid (CNIC).
Instituto de Investigaciones Biomdicas de Madrid (IIB-CSIC).
Centro de Investigaciones Biolgicas de Madrid (CIB-CSIC).
Centro de Biologa Molecular Severo Ochoa, Universidad Autnoma de Madrid (CBM-CSIC).
Agrupacin Cemab (empresa proveedora: Applied Biosystems, en Espaa, Applera Hispania)
Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares de Madrid (CNIC)
Centro Nacional de Investigaciones Oncolgicas (CNIO)
Institut de Recerca Biomdica- Parc Cientific de Barcelona (IRB-PCB).
Coordinadores:
Dr. Xos Ramn Garca Bustelo del Centro de Investigacin del Cncer de Salamanca (CIC) coordina la
agrupacin Genechip que utiliza la tecnologa de Affymetrix.
Dr. Miguel ngel Piris del Centro Nacional de Investigaciones Oncolgicas (CNIO) coordina la
agrupacin Aginet que utiliza la tecnologa de Agilent Technologies.
Dra. Ana Dopazo del Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) que
coordina las agrupaciones Aemces y Cemab bajo las tecnologas Amersham Biosciences y Applera
Hispania respectivamente.
Participantes
La situacin actual de las tecnologas de
microarrays y biochips con aplicaciones en salud
humana ha cambiado considerablemente en
Espaa y resto del mundo respecto a los ltimos
aos, tanto en el entorno investigador como en el
empresarial. Las promesas que surgieron hace
unos aos respecto a esta tecnologa se han
cumplido con creces, y hoy por hoy supone una
herramienta imprescindible en cualquier proyecto
de genmica y protemica.
Resulta de especial importancia no slo el mayor
nmero de proyectos de investigacin que
emplean estas tecnologas en Espaa, sino las
diferentes aplicaciones que han surgido de ella.
Las tres grandes reas donde los microarrays
estn cobrando cada vez mayor relevancia son el
diagnstico molecular, farmacogentica, y el
desarrollo de frmacos. En el caso del diagnstico
molecular, los microarrays se emplean en la
clasificacin de enfermedades, mejorando el
pronstico en patologas como el cncer. En las
aplicaciones dirigidas a farmacogenmica y
desarrollo de frmacos, los microarrays ofrecen la
posibilidad de disear tratamientos personalizados
con frmacos dirigidos a grupos especficos de
pacientes, ya que mediante el anlisis del perfil
de expresin de cada tumor individual se puede
anticipar la respuesta a un determinado
tratamiento. Gracias a las posibilidades que
ofrecen estas aplicaciones han surgido grandes
proyectos de genotipado en Espaa para el
estudio de patologas como el cncer,
enfermedades psiquitricas y cardiovasculares.
El panorama actual en cuanto al acceso de la
tecnologa es muy diferente, y la mayora de
centros de investigacin espaoles disponen de
infraestructuras de apoyo que permiten el
empleo de los microarrays. Adems, existen
iniciativas pblicas como la convocada por
Genoma Espaa para aumentar la competitividad
de la investigacin pblica en genmica,
biomedicina y biotecnologa gracias al aumento
del consumo de este tipo de herramientas. Esta
iniciativa ha dado como resultado la creacin de
cuatro agrupaciones para el fomento del uso de
tecnologas microarrays de ADN para el anlisis
de expresin gnica (GeneChip, Aginet, Aemces y
Cemab) con diferentes empresas lder en este
campo como proveedoras de la tecnologa.
En cuanto al entorno empresarial, el gran
inters de las industrias farmacuticas por los
microarrays reside en la posibilidad que ofrecen
para agilizar el proceso de descubrimiento de
frmacos, desde su contribucin a la identificacin
y validacin de potenciales dianas teraputicas,
hasta la validacin de nuevos frmacos facilitando
los ensayos de toxicidad. A este hecho se suma la
posibilidad de realizar estudios a gran escala de
genes en mucho menor tiempo maximizando los
recursos disponibles.
Existe actualmente una autntica carrera
tecnolgica entre las empresas por posicionarse
como lderes de esta tecnologa, y las empresas
que en Espaa surgen en este entorno tienden a
ser proveedoras de servicios o buscan nichos de
mercado a los que dirigirse con productos muy
especficos como el Hepatochip, Onchochip o
Lipochip entre otros.
En cuanto al almacenamiento y procesado de
informacin por medio de herramientas
bioinformticas, todava no se ha superado este
cuello de botella, que por otro lado es el campo
que muestra mayor produccin de I+D a nivel
mundial. Iniciativas nacionales ya en marcha
como el Instituto Nacional de Bioinformtica
(INB), deben contribuir a generar y aplicar
soluciones bioinformticas de proyectos de
investigacin con un enfoque genmico y
protemico.
Por ltimo, es preciso que se haga un esfuerzo
global para propiciar la puesta en marcha de
proyectos multidisciplinares, que no consistan
meramente en la adquisicin de tecnologas de
microarrays a gran escala, sino en proyectos
enfocados hacia intereses estratgicos para la
industria y la comunidad cientfica.
59
11. Conclusiones
ADNc: ADN complementario que ha sido
sintetizado a partir de un ARN-mensajero.
Anlisis de expresin gnica: identificacin
de los genes que se expresan de manera
diferente en la clula y cuantificacin de los
niveles de expresin de aquellos genes de
especial relevancia en funciones celulares como
metabolismo, transporte o desarrollo entre
otros. Los anlisis de expresin permiten
establecer relaciones entre los perfiles genticos
de pacientes y respuestas a frmacos o agentes
txicos que actan, alterando la funcin celular.
Aptmero: molculas de ADN o ARN capaces de
reconocer y unirse a una molcula especfica
(protena u otro ligando).
ARN de interferencia: tecnologa que se basa
en el empleo de molculas cortas de ARN de
cadena sencilla o doble para bloquear la
expresin de genes especficos.
ARN mensajero: molcula de ARN que
proviene de la transcripcin de un gen que
codifica una protena, despus de experimentar
un proceso de corte y empalme. La informacin
codificada en la molcula de ARNm se traduce a
un producto gnico en los ribosomas.
bDNA (branched DNA o ADN ramificado): el
ADN ramificado contiene mltiples cadenas
ramificadas a manera de rbol y cada una de
estas ramas es un sitio de hibridizacin con una
sonda marcada con una enzima, que reacciona
con un sustrato que permite la demostracin
colorimtrica o quimioluminiscente.
Carbohidrato: trmino general utilizado para
denominar a los azcares y compuestos
relacionados que contienen carbono, hidrgeno y
oxgeno, habitualmente con la frmula emprica
(CH
2
0)n.
Expresin gnica: fenmeno que incluye la
transcripcin de un gen en ARN mensajero y su
posterior traduccin a protena.
Farmacogentica: estudio de la respuesta a un
determinado frmaco como consecuencia de la
herencia gentica del paciente.
Farmacogenmica: estudio de la importancia
que presentan las variaciones genticas en la
eficacia y toxicidad de los frmacos.
Fotolitografa: tcnica de fabricacin de un
microarray de ADN que se basa en la unin de
nucletidos protegidos por un agente qumico
fotodegradable sobre un soporte de vidrio que
posee determinados grupos reactivos.
Genmica funcional: disciplina que estudia la
relacin existente entre un gen y su funcin, de
manera que permita comprender el
funcionamiento de los sistemas biolgicos.
Glicosilacin: proceso qumico por el que se
aaden cadenas de azcares a una protena.
Hibridacin: proceso por el cual dos hebras
sencillas complementarias de polinucletidos se
asocian para formar una doble hlice.
Microarray: conjunto de molculas de ADN,
protenas, hidratos de carbono, muestras de
tejidos o clulas, inmovilizadas sobre una
superficie slida que nos permite el estudio de
niveles de expresin gnica a nivel genmica,
funcin, modificaciones post-traduccionales de
protenas o de los niveles de expresin gnica in
vivo, respectivamente.
Oligosacridos: grupo de hidratos de carbono
de cadena corta (de 2 a 8 unidades de Carbono).
60
Glosario
PCR (polymerase chain reaction o reaccin en
cadena de la polimerasa): sistema de
amplificacin gentica que permite obtener
millones de copias de un determinado fragmento
de ADN o ARN mensajero, incluso a partir de
muestras muy reducidas.
PNA (Peptide Nucleic Acid o cido Nuclico
Peptdico): anlogo artificial del ADN en el que
el esqueleto no es azcar y fosfato, sino
entidades similares a pptidos o protenas.
Proteoma: conjunto de protenas que se
expresan en un momento concreto en un
determinado tejido u organismo.
Screening: trmino ingls derivado de la
palabra screen o pantalla cuyo significado,
dentro del campo de la biologa molecular o la
biotecnologa se refiere al seguimiento o la
monitorizacin de un proceso.
Sonda: segmento de material biolgico marcado
radioactivamente (o con algn grupo qumico
fcilmente visualizable), utilizado para detectar
secuencias de cidos nucleicos o protenas
complementarios mediante hibridacin.
Toxicogenmica: disciplina que estudia las
bases genticas que permiten explicar los
mecanismos de toxicidad en respuesta a
frmacos o compuestos txicos.
Transcriptoma: conjunto de mRNAs que a
partir de un genoma se pueden sintetizar en un
momento concreto en un determinado tejido.
Validacin de dianas: proceso que tiene por
objeto demostrar que una determinada diana
molecular est implicada en la aparicin y
progresin de una enfermedad. La validacin de
una diana permite establecer una relacin entre
la modificacin de la diana y su potencial
teraputico.
61
62
Anexos
Anexo I: Principales aplicaciones de los microarrays
disponibles comercialmente
Advanced Array
Technology SA
StaphyChips
Microarray para la deteccin de las secuencias
de ADN de las 5 especies ms importantes de
Staphylococcus, as como para la deteccin de
resistencia a antibiticos beta-lactmicos
Rat HepatoChips
Determinacin del patrn de genes expresados
en cultivos de hepatocitos incubados en
presencia de compuestos qumicos o
contaminantes ambientales
Affymetrix, Inc.
Lymphochip Clasificacin molecular de linfomas
GeneChip Porcine Genome
Array
Anlisis del transcriptoma completo del cerdo
domstico
GeneChip Maize Genome
Array
Anlisis del transcriptoma completo del maz
Zea mays
CupPrint
Anlisis del perfil gentico para localizacin del
tumor primario en pacientes diagnosticados con
cncer de localizacin primaria desconocida
Agendia
MammaPrint
Anlisis del riesgo de metstasis en cncer de
mama
Agilent Technologies,
Inc.
Agilent G4130A
Microarray para el screening del genoma de
rata y estudios toxicogenmicos para la
determinacin de los efectos en el organismo
de una sustancia txica, frmaco o pesticida
BioDoor Gene
Technology Ltd.
BioDoor4000
Anlisis de expresin de 4.000 genes humanos
completos
ViriChip Perfil de expresin de ARN y deteccin de virus
BiodoorHCV Diagnstico de Hepatitis C
BioForce
Nanosciences, Inc.
Rice Oligo Microarray Kit
60-meR
Determinacin de la actividad de genes en arroz y
cereales. Identificacin de variedades con alta
tolerancia a sequa, salinidad, fro o pestes para
sembrar en terrenos poco cultivables
Empresa Producto Caractersticas
PRINCIPALES APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS DE CIDOS NUCLEICOS
DISPONIBLES COMERCIALMENTE
Human 1B Oligo Microarray
Anlisis de expresin gnica en desarrollo de
frmacos y estudio de enfermedades
Canberra LLC IntelliGene
Anlisis de Arabidopsis, cncer humano,
citoquinas humanas, disrupcin endocrina, ORF,
ratn y E. coli
63
DR. Chip
Biotechnology Inc.
DR. EV chip Diagnstico de enterovirus
DR. BLAD Chip
Deteccin de las mutaciones del gen
responsable de la Deficiencia de Adhesin
Leucocitaria Bovina
DR. Mastitis Chip
Deteccin de S. agalactiae, S. aureus,
S. bovis, S. uberis, S. dysgalactiae, y E. coli
DR. Food Pathogen Chip
Deteccin de Salmonella spp., E. coli, y
Staphylococcus aureus
DR. HBV Chip
Deteccin de hepatitis B virus en suero e identifica
genotipos de HBV A, B, C, D, E, F y dos variantes
resistentes a amivudina: YIDD y YVDD
DR. RV IVD Kit Deteccin de infeccin por coronavirus (SARS)
DR. Milk Kit18
Deteccin de siete agentes causantes de
mastitis Streptococcus spp., S. agalactiae,
S. bovis, S. ysgalactiae, S. uberis, Escherichia
coli, and S. aureus
DR. EV IVD Kit
Detecta infeccin por enterovirus sin reactividad
cruzada entre adenovirus, herpes simplex virus
tipo I y tipo II, citomegalovirus humano
Detecta gnero enterovirus y dos serotipos:
enterovirus 71 y coxsackie A16
DR. Food Kit
Detecta nueve de los patgenos ms comunes
en alimentos: Staphylococcus aureus,
Escherichia coli, Yersinia enterocolitica, Bacillus
cereus, Clostridium perfringens, Listeria
EcoArray, L.L.C.
BassChip
Anlisis de la expresin de genes de
importancia toxicolgica
Fathead MinnowChip
Eppendorf AG
DualChip human general
Anlisis de expresin gnica diferencial en
humanos
DualChip human aging
Anlisis de expresin gnica diferencial en
genes humanos relacionados con el estrs y el
envejecimiento
DualChip rat GPCR
Anlisis de expresin gnica diferencial de los
genes GPCR de rata
DualChip hepato
microarray series
Patrones de expresin gnica de genes
importantes toxicolgicos en clulas de hgado
de rata
Eurogentec GEArray
Anlisis de expresin de genes involucrados en
rutas de sealizacin
Genomic Health Oncotype DX
Anlisis de probabilidad de recurrencia de
cncer de mama tras tratamiento con
tamoxifeno
64
GeneMaster
Lifesciences Co. Ltd.
GeneMaster MegiC Diagnstico de meningitis
GeneScan
Europe AG
GMOChip
Deteccin de organismos modificados
genticamente en alimentos
NUTRIChip Presencia de bacterias patognicas en alimentos
Greiner Bio-One
GmbH/Lambda
GmbH
ParoCheck I
Identificacin y deteccin cualitativa de ADN de
patgenos periodontales
CarnoCheck
Identificacin y deteccin cualitativa de 8
especies animales en alimentos y piensos
PapilloCheck
Tipaje de 17 papilomavirus humanos (HPV)
involucrados en cncer cervical
ParoCheck I
Deteccin cualitativa e identificacin de ADN de
patgenos periodontales
PapilloCheck
Tipaje de 17 tipos de papilomavirus humanos
involucrados en cncer cervical
CarnoCheck Food and feed
DNA-C
Identificacin y deteccin cualitativa de 8
especies animales en alimentos y piensos
Icoria, Inc.
Magnaporthe grisea
microarray
Deteccin del patgeno del arroz Magnaporthe
grisea
IntegriDerm
DermArray GeneFilters
enfermedades epiteliales y dermatolgicas
PharmArray
Ipsogen, Luminy
Biotech Entreprises
MLL Fusionchip
Deteccin de reordenamientos de MLL en leucemia
aguda y la determinacin del gen asociado
ProfileChip Biochip para el estudio de cncer
Iris BioTechnologies,
Inc.
Genetic Profiling
Microarray
BioPharma GPM System
Detecta deleciones y amplificaciones del
nmero de copias y mutaciones puntuales
Descubrimiento y desarrollo de frmacos
Lcer LipoChip
Deteccin de mutaciones del receptor LDL
asociadas a Hipercolesterolemia Familiar
Memorec Biotec
GmbH
PIQOR Immuno/Onco,
human and mouse
Anlisis de expresin de 1.076 genes relacionados
con respuesta inmune, matriz extracelular, muerte
celular, y transduccin de seales
PIQOR Cytokines &
Receptors, human and mouse
Anlisis de expresin de 288/274 genes de
citoquinas y receptores
PIQOR Cell death, human
and mouse
Anlisis de expresin de 500/509 genes
involucrados en muerte celular
PIQOR Kinase, human and
mouse
Anlisis de expresin de 498/481 genes de
kinasas
PIQOR Toxicology, human
and rat
Anlisis de expresin de 1.252/1.107 genes
involucrados en citotoxicidad
65
Mergen Ltd. ExpressChip
Perfiles de expresin de diferentes categoras
de genes: apoptosis, ATPasa, GTPasa o ATP,
protenas de unin a GTP, canales,
citoesqueleto, asociados a enfermedades,
transduccin de seales, factores de
transcripcin, supresores de tumores
NEN Life Science
Products Inc.
Operon GmbH
MICROMAX Human
Oncogenes and Tumor
Suppressor Genes Array
Anlisis de la expresin de oncogenes y genes
supresores de tumores
MICROMAX Human Kinase
& Phosphatase Array
Anlisis de la expresin de genes de quinasas y
fosfatasas
MICROMAX Human
transcription factor array
Anlisis de expresin de genes de factores de
transcripcin
MICROMAX Human Ion
Channel, Transporter &
Receptor Array
Anlisis de expresin de genes de canales de
iones, transportadores y receptores
OpArray Human collagen
Array
Anlisis de expresin de genes de colgeno
OpArray Human Apoptosis
Array
apoptosis
OpArray Human Stress y
Aging Array
estrs y envejecimiento
OpArray Yeast collage Array Anlisis de expresin de genes de levadura
SensiChip Human Kinase Anlisis de expresin de genes de quinasas
Origene
Technologies, Inc.
Smart set 1
Anlisis de expresin de genes receptores
nucleares de hormonas y correguladores
Smart set 2
Anlisis de expresin de genes factores de
transcripcin Homeobox/bZIP/bHLH
Smart set 3
Anlisis de expresin de genes factores de
transcripcin inducibles/especficos de tejido
Smart set 5
Anlisis de expresin de genes protenas G y
receptores acoplados a protena G
Smart set 7
Anlisis de expresin de genes de protenas de
transportadores
Smart set 8 Anlisis de expresin de genes de proteinasas
Smart set 9
Anlisis de expresin de genes de citoquinas,
quimioquinas y receptores
Smart set 10
Anlisis de expresin de genes de molculas de
adhesin
Smart set 4
Anlisis de expresin de genes tirosinquinasas y
fosfatasas
Smart set 6 Anlisis de expresin de genes de canales de iones
66
PamGene
International B.V.
PamChip Genotipado, perfiles de expresin y protemica
PicoRapid
Technologie GmbH
Qiagen N.V.
PicoArrays Rheumatism
Rheumatoid Arthritis and
Inflammation
Estudio de las bases patognicas de
enfermedades inflamatorias
PicoArrays Apoptosis
Anlisis de la expresin de los principales genes
involucrados en muerte celular, diferenciacin y
proliferacin celular
SensiChip Human Kinase
DNA Array Bar
Anlisis de la expresin gnica de todas las
quinasas y fosfatasas conocidas
AmpliChip CYP450
Identificacin de polimorfismos en dos genes,
CYP2D6 y CYP2C19 implicados en el
metabolismo de medicamentos
ImmunoChip RZPD1.2
Human cDNA microarray
Anlisis de la expresin gnica de 1.137 genes
involucrados en procesos inmunolgicos
Oncochip RZPD1
Anlisis de la expresin gnica de 1.544 genes
de importancia en procesos cancergenos
sciTRACER Inflammation 170
Estudio de la expresin diferencial de genes
relacionados con enfermedades inflamatorias
sciTRACER CardioVascular
350
Estudio de genes humanos involucrados en
enfermedades cardiovasculares
Panorama Gene E. coli
Gene Arrays E. Coli
Anlisis de todos los genes codificantes para
protenas de E.coli
F. Hoffmann-
La Roche Ltd.
RZPD Deutsches
Ressourcenzentrum
fr Genomforschung
GmbH
Sigma-Genosys
Spectral Genomic,
Inc.
STEAG microParts
GmbH
Scienion AG
Panorama Gene
Helicobacter pylori Gene
Arrays Helicobacter pylori
Anlisis de todos los posibles genes codificantes
para protenas de H. pylori
Panorama Gene B. subtilis
Gene Arrays B. Subtilis
Anlisis de todos los genes codificantes para
protenas de B. subtilis
Panorama Gene Human
Cytokine Gene Arrays
Human Cancer OligoArray

Genes involucrados en apoptosis, angiognesis,
ciclo celular, metstasis, oncogenes,
transduccin de la seal, factores de
transcripcin y supresores de tumores
Lilliput Chip
Empleados en microbiologa clnica para la
automatizacin de los test de susceptibilidad a
antibiticos e identificacin de bacterias
Panorama Gene Human
Apoptosis Gene Arrays
Amplicones de las regiones codificantes para
protenas de genes involucrados en procesos
apoptticos
Spectral Chip 2600 DNA
Array
Hibridacin genmica comparativa con aplicacin
a citogentica e investigacin del cncer
67
Stratagene
GeneConnection Discovery
Microarray
Genes de 29 tejidos humanos
GeneConnection Control
Microarray
Genes Housekeeping y de control exgeno
Takara Bio Inc.
IntelliGene
Functional DNA Chip Human
Brain ver 1
human ChoiceGEArray
mouse GEArray
mouse ChoiceGEArray
Contiene 1.700 genes (fragmentos de ADNc)
con cambios especficos en la expresin en el
cerebelo, hipocampo y amgdala
Functional DNA Chip Rat
Toxicology Ver.1.0
Anlisis de la expresin de genes involucrados
en el metabolismo de frmacos
9801A ICAN DNA
Fragmentos de unos 1.800 genes humanos
(incluyendo 356 citoquinas )
X001 IntelliGene Cyano
CHIP Ver. 2.0
Fragmentos de ORF de especies de
Synechocystis PCC6803
IntelliGene Cyano CHIP Ver.
2.0
Fragmentos de ORF (Open Reading Frame) de
la bacteria Synechocystis
Virginia
Commonwealth
Center
Brain Tumour Biochip Oligo
DNA microarrays
Anlisis de expresin gnica de tumores
cerebrales
Vysis, Inc.
GenoSensor Microarray
System
Deteccin del nmero de copias de genes.
Asesoramiento sobre las anormalidades
cromosmicas, de genes individuales en
cromosomas y secuencias especficas en los genes
Xeotron Corp.
XeoExp Human Cancer chip
Anlisis de expresin de genes humanos de
importancia en cncer
XeoEX SARS chip
Anlisis de los genes de coronavirus para la
deteccin de SARS
Xenopus Xeochip
Anlisis de genes de Xenopus para estudios de
desarrollo neuronal
Superarray, Inc.
human GEArray
Fragmentos de ADNc de genes involucrados en
una determinada ruta de transduccin de
seales
68
PRINCIPALES APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS DE PROTENAS
COMERCIALIZADOS
Advanced Gene
Technology, Corp.
HerboChip
Bsqueda de compuestos activos en plantas.
HerboLink(AGTChip)
Axcell Biosciences
TranSignal WW domain
arrays
Determinacin de interaccin entre
protenas
TranSignal PDZ domain
arrays
Determinacin de la funcin de protenas
TranSignal SH3 domain
arrays
Azign Bioscience A/S
Designarray Anlisis de enfermedades concretas
Specifictargetarray Anlisis de dianas teraputicas
BD Biosciences -
Clontech
Ab Microarrays
Anlisis completo de perfiles de expresin
de protenas
BioForce Nanosciences,
Inc.
NanoArray
Ciphergen
Preactivated ProteinChip
Arrays
Hydrophobic ProteinChip
Arrays
Hydrophilic ProteinChip
Arrays
Cation Exchange
ProteinChip Arrays
Immobilized Metal affinity
ProteinChip Arrays
Chromatographic surface
ProteinChip Arrays
Determinacin de la interaccin entre
protenas y distintos ligandos.
Echelon Biosciences Inc Microarray PIP Array
Determinacin de la selectividad y
sensibilidad relativa fosfoinostidos
GeneMaster Lifesciences
Co., Ltd.
GeneMaster MegiC Diagnstico de meningitis
GeneMaster NICE-Tha Diagnstico de alfa-talasemia
GeneMaster HLA Typing
Chip
Bsqueda de compatibilidad en transplante
de rganos
69
Hypromatrix, Inc.
AntibodyArray Signal
Transduction Antibody
400 anticuerpos contra protenas de
sealizacin bien caracterizadas
Apoptosis AntibodyArray
150 anticuerpos contra protenas que
regulan la apoptosis
CellCycle AntibodyArray
60 anticuerpos contra protenas involucradas
en ciclo celular
Pepscan Systems Pep-Chip Kinase
Bsqueda de sustratos para kinasas y
bsqueda de la especificidad de inhibidores
de kinasas
Phylos, Inc. TRINECTIN Proteome Chip
Deteccin de protenas en tejidos
expresadas en respuesta a frmacos o a
una enfermedad
Pierce Biotechnology
Inc.
Discover Light
Proteome Arrays
SearchLight Proteome
Arrays
SearchLight Cytokine
Arrays
SearchLight Chemokine
Arrays
SearchLight Human
Phosphorylated Kinase Array
SearchLight Human
Angiogenisis Array2
Anlisis de protenas, lisados celulares o
anticuerpos en formatos de baja densidad
Procognia
Gen p53 y principales
variantes SNP
Anlisis de la funcin del gen p53
RayBiotech, Inc.
RayBio human
angiogenesis antibody
arrays
RayBio human
atherosclerosis antibody
arrays
Arrays de anticuerpos de citoquinas para
humanos, ratas y ratones
RayBio human
inflammation antibody
arrays
Schleicher & Schuell
Bioscience
ProVision Human Cytokine
Array
Determinacin simultnea de la presencia
de 16 citoquinas diferentes
Sigma-Genosys
Panorama Ab Microarray -
Cell Signaling Kit
Anlisis de 224 anticuerpos de protenas
implicadas en sealizacin celular
Invitrogen
Protoarray Human Protein
Microarray
Screening de 1.800 protenas de diferentes
familias gnicas como quinasas, protenas
asociadas a membrana, protenas de
sealizacin celular y protenas implicadas
en metabolismo
70
SomaLogic Inc. Aptamer Arrays
Determinacin simultnea de la concentracin
de las protenas correspondientes a los
fotoaptmeros empleados
VBC-Genomics
Bioscience Research
GmbH
ISAC Anlisis de alergenos
PRINCIPALES APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS DE CARBOHIDRATOS
DISPONIBLES COMERCIALMENTE
Producto Empresa Caracteristicas
Glycominds Ltd. GlycoChip
Microarray de alto rendimiento de
carbohidratos complejos para el anlisis de
las interacciones protena-glicano.
Aplicaciones a genmica funcional,
desarrollo de frmacos, prebiticos, ensayos
enzimticos, screening de anticuerpos e
infecciones bacterianas
PicoRapid Technologie
GmbH
PicoArrays GlycoProfiler
Microarray para el estudio de los genes que
controlan la glicosilacin de lpidos y
protenas
PRINCIPALES APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS DE CLULAS DISPONIBLES
COMERCIALMENTE
Producto Empresa Caracteristicas
Biolog, Inc. Phenotype MicroArrays
Identificacin y validacin de cabezas de
serie y dianas respectivamente, biologa
funcional y toxicogenmica. Disponibles
para clulas bacterianas y fngicas
Cellomics, Inc. CellChip Anlisis mltiple de pptidos y protenas
Zeptosens AG ZeptoMARKTM Cell Lysate
Arrays de densidad media/alta para anlisis
multiple de pptidos y protenas
71
Chemicon Inc. Chemicon's TMAs
Perfil de expresin de protenas en
diferentes tipos de tumor
Clinomics Biosciences,
Inc
HER-2neu response array, c-
kit response array
Caracterizacin de alteraciones genticas y
patrones de expresin
Expression Pathology,
Inc
HistoChip
Liquid Tissue
Determinacin de cambios cuantitativos en
la expresin de protenas en un gran
nmero de muestras de tejido enfermo y
sano.
Identificacin y validacin de marcadores
proteicos
Imgenex Corp.
Tissue Array/Histo-Array
human
Perfil de expresin de protenas en
diferentes tipos de tumor
Invitrogen Corp VastArray
Perfil de expresin de protenas, screening
de anticuerpos, estudios de especificidad de
tejido y anlisis de modelos de ratn
Oligene GmbH Tissue Arrays
Microarrays construidos a partir de sus
bancos de tejidos para estudios de
expresin y screening in situ de ARNm
Research Genetics, Inc. VastArray Tissue Arrays
Estudios de expresin de protenas,
screening de anticuerpos, especificidad de
tejidos y determinacin patolgica
Zymed Laboratories,
Inc.
MaxArray
Screening de anticuerpos, anlisis de
expresin, especificidad de tejido, anlisis
de fenotipo frente a genotipo, hibridacin in
situ de ARN o ADN (FISH o CISH)
Zyomyx Inc. Human Cytokine Biochip
Desarrollo de frmacos empleando anlisis
paralelo de protenas
PRINCIPALES APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS DE TEJIDOS DISPONIBLES
COMERCIALMENTE
Ambion, Inc
LandMark Tissue
MicroArrays
Anlisis del perfil de expresin diferencial de
dianas especficas
Ardais Corp. Ardais Tissue Arrays (ATAs) Validacin de dianas de alto rendimiento
BD Biosciences -
Clontech
BD Clontech Cancer Cell
Line Profiling Array
Perfil de expresin gnica de 26 lneas
celulares representadas en 11 tejidos
Tabla 10. Principales aplicaciones de los microarrays disponibles comercialmente.
Fuente BioChipNet (http://www.biochipnet.com)
72
Anexo II. Empresas espaolas que operan
en el rea de microarrays
rea de aplicacin Salud humana
Misin
Desarrollo de tecnologas innovadoras para el progreso de la investigacin
post-genmica y la produccin industrial eficiente de nuevas biomleculas
tiles para la sociedad
Servicios relacionados
con microarrays
Lectura y procesamiento de ADN arrays
Asesoramiento y gestin de proyectos de I+D en biomedicina (estudios de
expresin semi-cuantitativa empleando tecnologas de DNA arrays)
I+D
Desarrollo de vectores para genmica funcional en un amplio rango de
organismos
Desarrollo de herramientas para mejorar la eficiencia en la expresin y
purificacin de protenas
Desarrollo de herramientas para diagnstico molecular
Acuerdos y
colaboraciones
cientficas
Universidad de Sevilla, Universit Clermont-Ferrand, Universidad Miguel
Hernndez, Universidad Pablo de Olavide, Centro de Investigaciones
Biolgicas (CSIC), Instituto de Biomedicina Lpez Neyra (CSIC)
Contacto
Direccin: Avenida Amrico Vespucio n 5, Bloque E - Planta 1 Mdulo 12,
Isla de la Cartuja, 41092, Sevilla
Web: http://www.biomedal.es/espanol/index.htm
Biomedal, S.L.
Misin
Compaa biofarmacutica enfocada al desarrollo de productos y servicios
que permitan avanzar en la investigacin, el diagnstico y tratamiento del
cncer
Productos relacionados
con microarrays
Arrays de tejidos:
Human Hepatic Colon-Carcinoma Metastasis Tissue Array
Organ-Specific Metastasis Melanoma Tissue Array
Multi-Organ Animal Tissue-Arrays
Arrays de tejido personalizados
Arrays de clulas:
Array especfico de clulas hepticas (humano, rata, ratn)
Array de lneas celulares de melanoma humano
Arrays de clulas personalizados
con microarrays
Genmica funcional:
Diseo de microarrays de ADN personalizados
Construccin de libreras de ADNc
Anlisis de sistemas de expresin modificados
Contacto
Direccin: Parque Tecnolgico de Bizkaia, Edificio 801, 1 planta
Web: http://www.pharmakine.com
Dominion Pharmakine, S.L.
73
Misin
Empresa dedicada a la investigacin y desarrollo en biomedicina y al
diagnstico molecular de enfermedades humanas
con microarrays
Expresin gnica mediante microarrays de ADN
I+D Trazado de marcadores de susceptibilidad gentica en la poblacin espaola.
Acuerdos y
colaboraciones
cientficas
Centro Nacional de Investigaciones Oncolgicas de Madrid (CNIO), Centro de
Investigaciones Biolgicas de Madrid (CIB/CSIC), Hospital Clnico San Carlos,
Hospital Doce de Octubre (Madrid), Hospital Virgen del Roco y Valme
(Sevilla) Genetix (UK), Universidad de Utrech (Holanda), Universidad Tor
Vergata (Roma)
Contacto
Direccin: Avda. Averroes n8 Ed. Acrpolis, Mod. 110-111, Sevilla
Web: http://www.neocodex.es
Neocodex, S.L.
rea de aplicacin Salud humana, Agroalimentacin
Misin
Construccin de una plataforma tecnolgica verstil que nos permita
identificar de forma muy procesiva las relaciones entre los genes y sus
funciones
con microarrays
Tethys: sistema de alto rendimiento para disear un conjunto ptimo de
oligonucletidos con el objetivo de construir un chip de DNA para un cierto
organismo
con microarrays
Anlisis de la expresin gnica mediantes chips de ADN:
Toxicogenmica, Cardiovascular, Enfermedades Neurodegenerativas,
Inflamacin, Enfermedades Humanas, Genes de Cncer, Variantes de Splice
en tumores
Genotipaje: chips de ADN humano SNPs-INDELs
I+D Bioinformtica
Contacto
Direccin: C/Josep Samitier 1-5, 08028 Barcelona
Web: http://www.oryzon.com
Oryzon Genomics, S. A.
74
Misin
Identificacin de marcadores moleculares y agentes teraputicos para el
diagnstico temprano y tratamiento de enfermedades hepticas
con microarrays
Hepatochip: chip de ADN que permite conocer la presencia de
esteatohepatitis no alcohlica (NASH) a partir de la coexpresin de 85 genes
I+D
Diagnstico temprano de esteatosis heptica (EH) y esteatohepatitis no
alcohlica (NASH)
Acuerdos y
colaboraciones
cientficas
Universidad de Navarrra, Centro de Estudios e Investigaciones Tcnicas de
Guipzcoa, Hospital Clnico de Barcelona, Hospital Gregorio Maran,
Hospital Universitario Prncipe de Asturias, Hospital Italiano de Buenos Aires,
Noray Bioinformatics, Progenika, Protemica
Contacto
Direccin: Parque Tecnolgico de Bizkaia, Edificio 801, planta 2, 48160 Derio
Web: http://www.owlgenomics.com
Owl Genomics, S.L.
Misin
Identificacin y validacin de genes y protenas implicadas en procesos
patolgicos, y su empleo en el desarrollo de nuevos frmacos y mtodos de
diagnstico
con microarrays
Affymetrix genechip probe arrays
Microarrays de Genotipado:
Human Familiar Hypercholesterolemia DNA Array (Lipochip,
comercializado)
Human Blood genotyping DNA Array (Bloodchip)
Inflammatory Bowel Disease DNA Array (IBDchip)
Arrays de anlisis de la expresin gnica:
Human Blood Neoplasias Classification Array (hematochip)
Rat Genome 5K Microarray
Pseudomonas putida Genome Array
Pseudomonas aeruginosa Genome Array
Medplant Small Cell Lung Cancer Chemotherapy Resistance microarray
(en fase de validacin clnica)
I+D
Identificacin y validacin de genes y protenas relacionadas con
enfermedades psiquitricas, neurolgicas y cncer
Acuerdos y
colaboraciones cientficas
Owl Genomics
Contacto
Direccin: Parque Tecnolgico de Zamudio, Edificio 801 -A- 48160 Derio
Web: http://www.progenika.com
Progenika Biopharma, S.A.
75
rea de aplicacin Salud humana y agroalimentacin
Misin
En el rea de la Biomedicina, crear y proveer a la sociedad de mtodos de
diagnstico que mejoren la salud y la calidad de vida. En el rea de la
Agroalimentacin, satisfacer aquellas necesidades analticas de las empresas
del sector que nicamente pueden cubrirse mediante el anlisis de ADN de
los alimentos
con microarrays
Aplicaciones en el desarrollo de chips de ADN
I+D
Prediccin de Riesgo: Diagnstico Molecular
Medicina personalizada: Farmacogenmica
Contacto
Direccin: Parque Tecnolgico de Valencia, Avda. Benjamn Franklin, 12,
46980 Paterna (Valencia)
Web: http://www.sistemasgenomicos.com
Sistemas Genmicos, S.L.
76
Anexo III. Empresas espaolas que desarrollan productos
de bioinformtica aplicados a microarrays
Misin Bioinformtica
con identificacin y
validacin de dianas
Consultora, formacin y desarrollo de software aplicado a los microarrays
de ADN
I+D
Bioinformtica aplicada a microarrays de ADN
Sistemas de extraccin de informacin
Acuerdos y
colaboraciones
cientficas
CNIO, Genetrix
Contacto
Direccin: Centro Empresarial Euronova, Ronda de Poniente, 4 2 planta,
Unidad C-D, 28760 Tres Cantos, Madrid
Web: http://www.almabioinfo.com
Bioalma, S.L.
Misin
Desarrollo de plataformas bioinformticas para el anlisis de secuencias, de
la diversidad gentica y de datos gnomicos en general, con el objetivo de
simplificar y acelerar la investigacin biomdica.
con identificacin y
validacin de dianas
EbioSNP: plataforma para la representacin y anlisis de la diversidad
gentica
Servicio de anlisis experto en los siguientes campos: asociacin de factores
genticos y rasgos fenotpicos, bsqueda de dianas farmacolgicas, anlisis
epidemiolgicos y filogenticos
I+D Diseo de plataformas bioinformticas
Acuerdos y
colaboraciones
cientficas
Noray Bioinformatics
Contacto
Direccin: Edifici M - Campus de la UAB, Vivero de Empresas de
Biotecnologia y Biomedicina (VE3B), 08193, Bellaterra, Barcelona
Web: http://www.ebiointel.com
Ebiointel, S.L.
77
Misin
Proporcionar soluciones tecnolgicas que faciliten la adquisicin, manejo,
procesamiento y anlisis de grandes volmenes de datos en la era post-
genmica
con identificacin y
validacin de dianas
ArrayHub (gestin de datos de anlisis de la expresin gnica)
Formacin en bioinformtica
Acuerdos y
colaboraciones
cientficas
Applied Biosystems, Spotfire
Contacto
Direccin: Parque Cientfico de Madrid, Ciudad Universitaria Cantoblanco,
C/ Einstein n 13, Pabelln C, 1 planta. 28049 Madrid
Web: http://www.integromics.com
Integromics, S.L.
Misin
Diseo, desarrollo e implantacin de software a medida, con el objeto de
servir como soporte al sector de la biotecnologa en tecnologas de la
informacin
con identificacin y
validacin de dianas
Genmica funcional: software para el anlisis correlacional de datos clnico-
patolgicos con datos genmicos en estudios de cncer (BITIATM)
Servicios: consultora bioinformtica, herramientas de gestin y explotacin
de resultados de laboratorio, proyectos de outsourcing en bioinformtica.
I+D Bioinformtica
Acuerdos y
colaboraciones cientficas
Azeretia, H.U. La Paz, Dominion Pharmakine, Advancell, Owl Genomics,
Aethia Universidad de Barcelona, Biolex, Judo, PharmaDatum, eBiointel.
Contacto
Direccin: Parque Tecnolgico, 801 A, 48160 Derio, Bizkaia
Web: http://www.noraybio.com
Noray Bioinformatics, S.L.
78
ANEXO IV. Proyectos de investigacin espaoles relacionados
con tecnologas de microarrays
Centro de
Investigaciones
Biolgicas, CIB
(CSIC)
Instituto de
Qumica Orgnica
General, IQOG
(CSIC)
PROYECTOS DE INVESTIGACIN ESPAOLES RELACIONADOS CON TECNOLOGAS
DE MICROARRAYS
Centros de investigacin pertenecientes al CSIC
Centro
Microbiologa
Molecular
Anlisis
Estructural y
Qumica
Ambiental
Departamento
Genmica funcional para la
resolucin de problemas
medioambientales y biotecnolgicos
Diseo y construccin de micro-chips
para anlisis rpido y sensible de
protenas marcadoras de tumores
cerebrales
Ttulo del proyecto
MCyT
MCyT
Financiacin
2002-2005
2003-2006
Duracin
Centro de Biologa Molecular Severo
Ochoa, CBM (UAM-CSIC)
Anlisis bioinformtico de
microarrays para la deteccin de
rutas determinantes de la malignidad
asociada a mutaciones del receptor
de andrgenos en cncer de prstata
MCyT 2001-2003
Instituto de
Ciencias de los
Materiales de
Madrid, ICMM
(CSIC)
Materiales
Particulados
Inmovilizacin de anticuerpos y
oligonucletidos en partculas
magnticas para el diseo de
sistemas de deteccin precoz de
marcadores tumorales
MCyT 2000-2003
Centro Nacional
de Biotecnologa,
CNB (CSIC)
Inmunologa y
Oncologa
Desarrollo de un microarray de ADN
basado en transporte e
inmovilizacin por campo elctrico
MCyT 2001
A core DNA microarray facility
serving the fudged integrated project
MCyT
Desarrollo de un microarray de ADN
basado en transporte e
inmovilizacin por campo elctrico
CICYT 2001-2004
Instalacin de microarrays de cDNA
al servicio del proyecto integrado
FUGEDAD
MCyT 2002-2005
Biotecnologa
Microbiana
Modelos de evolucin de la resistencia
a los antibiticos. Protemica y
genmica de Pseudomonas aeruginosa
MCyT 2001-2004
Biologa
Molecular y
Celular
Genmica funcional para la
resolucin de problemas
medioambientales y de salud
MCyT 2002-2005
Anlisis de la conexin entre la

regulacin global del metabolismo, la
resistencia de los antibiticos y la
virulencia de Pseudomonas utilizando
microarrays de ADN
CAM 2005
79
Instituto de
Catlisis y
Petroleoqumica,
ICP (CSIC)
Centros de investigacin pertenecientes al CSIC (Continuacin)
Centro
Biocatlisis
Departamento
Desarrollo de una plataforma
tecnolgica de farmacogenmica
funcional basada en DNA microarrays
Ttulo del proyecto
MCyT
Financiacin
2001-2001
Instituto de
Investigaciones
Biomdicas
Alberto Sols,
IIB (UAM-CSIC)
Laboratorio de
Biologa
Molecular y
Celular del
Cncer
Laboratorio de
Regulacin de la
Expresin Gnica
Diseo de un microchip de cDNA
para la deteccin de resistencia a la
quimioterapia en pacientes con
cncer de pulmn
Estudio de los factores moleculares
predictivos de respuesta al
tratamiento de cncer no microctico
de pulmn (NSCLC) mediante
anlisis del transcriptoma a travs de
microarrays
MCyT
FIS
2001
2002-2004
Aplicacin de la tecnologa de los
microarrays de cDNA para analizar la
expresin diferencial de genes entre
mujeres afectadas de sndrome de
ovario poliqustico y normales
CAM 2002-2004
Estudio del perfil de expresin gnica
mltiple en tumores de Ewing como
base para la bsqueda de nuevos
marcadores y dianas teraputicas
MCyT 2001-2003
Desarrollo de un microarray
especfico para la identificacin de
alteraciones genticas con valor
diagnstico y pronstico en tumores
slidos infantiles
MCyT 2003
Gentica molecular del retinoblastoma:
nuevas metodologas para deteccin
de portadores, relaciones
fenotipo/genotipo en pacientes de baja
penetrancia y clasificacin molecular
de los tumores con tcnicas de
expresin en matrices de ADN
Comunidad
Autnoma de
Madrid
2005
Estudio genmico mediante arrays de
oligonucletidos de un modelo humano
de resistencia insulnica: Sndrome de
ovario poliqustico y obesidad
CAM 2003-2004
Aplicacin de la tecnologa de los
microarrays de cDNA para analizar la
expresin diferencial de genes entre
mujeres afectadas de sndrome de
ovario poliqustico y normales
CAM 2002-2003
Duracin
Laboratorio de
Endocrinologa
Molecular
Implementacin y aplicacin de una
tcnica de cDNA microarrays para
el estudio simultneo de la expresin
de miles de genes
MCyT 2000-2002
80
Instituto de
Investigaciones
Biomdicas
Alberto Sols,
IIB (UAM-CSIC)
Centro Departamento Ttulo del proyecto Financiacin Duracin
Implementacin y aplicacin de una
tcnica de cDNA microarrays para
el estudio simultneo de la expresin
de miles de genes
PN 2002
Instituto de
Microelectrnica
de Madrid, IMM
(CNM-CSIC)
Dispositivos,
Sensores y
Biosensores
Laboratorio de
Endocrinologa
Molecular
Desarrollo de nanobiochips de ADN
con tecnologa micro/nanoelectrnica
MCyT 2002
Integrated Opto-Nanomechanical
biosensor for functional genomic
analysis (OPTONANOGEN)
UE 2002-2005
The application of functional genomic
and proteomic technologies to the
study of development and dissease
MCyT 2002-2005
Prototipo de un nanobiodispositivo
para la deteccin de alteraciones en
genes humanos (NANOBIOGEN)
MCyT 2002-2003
Microsistema Biosensor Opto-
nanomecnico para anlisis en
genmica funcional
MCyT 2003-2006
Centro de
Investigacin del
Cncer (USAL-
CSIC)
Investigacin
bsica
Anlisis de alteraciones moleculares
de los activadores de Ras en tumores
usando la tecnologa convencional de
RT-PCR y ampliada con la tecnologa
de los chips microarrays
MCyT 2001
Bioinformtica y
genmica
funcional
Anlisis estadstico y biolgico por
mtodos informticos de resultados
de chips genmicos de hemopatas
malignas
FIS 2003-2005
Investigacin
aplicada
Perfil genmico y de expresin
gnica en gliomas humanos. Relacin
con las caractersticas
histopatolgicas y el pronstico
FIS 2002-2005
Instituto de Biologa y Gentica
Molecular, IBGM (CSIC-Universidad de
Valladolid)
Utilizacin de la tcnica de arrays
para determinar perfiles de expresin
relativa de molculas efectoras de la
lesin intestinal en la enfermedad
celaca
ACM 2004-2005
Centro de
Astrobiologa,
CAB (CSIC-INTA)
Laboratorio de
Evolucin
Molecular
Anlisis gentico de cuasiespecies
virales mediante chips de DNA para
la planificacin de tratamientos
antivirales (Proyecto VIROCHIP)
Deteccin de genomas minoritarios en
cuasiespecies. Aplicacin al desarrollo
de un nuevo mtodo de diagnstico de
virus patgenos basado en memoria
molecular
MCyT
CAM
2002-2005
2001-2003
81
Centro de
Astrobiologa,
CAB (CSIC-INTA)
Centro
Laboratorio de
Evolucin
Molecular (cont.)
Departamento
Hacia un nuevo tipo de biosensor
basado en el uso de cidos nucleicos
peptdicos (PNAs) y nanopartculas
magnticas
Ttulo del proyecto
CSIC
Financiacin
2004-2005
Laboratorio de
Ecologa
Molecular
Microarrays de ADN para estudios de
biodiversidad
FIS 2003-2005
Desarrollo de tecnologas basadas en
microarrays para la deteccin de
biomarcadores de inters
astrobiolgico y medioambiental
MCyT 2004-2006
Instituto de
Biomedicina de
Valencia, IBV
(CSIC)
Unidad de
Gentica
Molecular
Identificacin de genes relacionados
con el sndrome de Parkinson
MCyT 2002-2005
Universidad de
Navarra
Lab. Investigacin
Metablica, Lab.
Biotecnologa,
Dpto. Ciruga,
Dpto.
Endocrinologa.
Clnica
Universitaria de
Navarra
Estudio del patrn diferencial de
expresin gnica en tejido adiposo
de pacientes obesos e individuos con
normopeso mediante la tcnica de
microarrays
Gobierno de
Navarra
2001-2002
Fisiologa y
nutricin
Susceptibilidad o resistencia al
desarrollo de obesidad inducida por
la grasa de la dieta en humanos:
identificacin de genes de tejido
adiposo implicados mediante
tecnologa de microarray
Gobierno de
Navarra
2002-2004
Centro de
Investigacin
Mdica Aplicada,
Universidad de
Navarra
Grupo de
Farmacogenmica
del Cncer
Farmacogenmica en cncer de colon
metastsico mediante tecnologa
microarray
Fundacin de
Investigacin
Mdica Mutua
Madrilea
Automovilista
2004-2007
Universidade
da Corua
Bioloxa Celular e
Molecular
Sistema de determinacin de niveles
de expresin gnica por microarray

Universidad
Complutense de
Madrid
Anatoma
Patolgica
Estudio de microarrays de cDNA para la
identificacin de genes de expresin
diferenciada como potenciales
marcadores de riesgo de transformacin
maligna en clulas bronquiales
FIS 2002
Biologa
Molecular y
Bioqumica I
Accin antitumoral de los
cannabinoides: anlisis de la
expresin gnica en gliomas
mediante arrays de DNA
CAM 2005
Duracin
Universidades
82
Universidad de
Oviedo
Instituto
Universitario de
Oncologa
Anlisis del Fracaso Primario y del
rechazo usando chips de ADN en
injertos de islotes
FIS 2004-2006
Universidad de
Salamanca
Facultad de
Medicina
Valor pronstico de variables
biolgicas definidas mediante tissue
microarrays (TMA) en cncer de
prstata. Influencia del tratamiento
hormonal sobre el perfil de expresin
FIS 2002
Estudio, mediante microarrays, de la

inhibicin de la maduracin de las
clulas presentadoras de antgenos
como mecanismo de induccin de
tolerancia inmunolgica postrasplante
Junta de Castilla
y Len
2005
Universidad de
Valladolid
Bioqumica,
Biologa Molecular
y Fisiologa
Analisis de la respuesta a hipoxia de
las clulas quimiorreceptoras del
cuerpo carotideo de raton mediante
microarrays de oligonucleotidos
2003-2004
Universitat
Autnoma de
Barcelona
Bioqumica y
Biologa
molecular
Creacin y distribucin de microchips
de la levadura S. cerevisiae
MCyT 2002
Universidad
Politcnica de
Valencia
Grupo de
Sistemas Radio-
Fibra ptica
Sensores biofotnicos: estudio de la
deteccin de ADN usando
dispositivos basados en cristales
fotnicos 2D
2003-2005
Universidad de
Huelva
Ingeniera
Electrnica, de
Sistemas
Informticos y
Automtica
Extraccin de conocimiento de los
microarrays de ADN usando
tecnologa difusa
MEC 2003
Universidad de
Granada
Ciencias de la
computacin e
inteligencia
artificial
microarrays de ADN usando
tecnologa difusa
MCyT 2003-2006
Ciencias
Computacionales
Procesos de regulacin gentica
sobre microarrays usando extraccin
de conocimiento
PN 2004
Universidades (Continuacin)
Universidad de
Castilla la
Mancha
Ingeniera
elctrica,
electrnica y
automtica, rea
de Tecnologa
Electrnica
Biochips de ADN con control
electrnico
MCyT 2003-2004
83
Universidad de
Sevilla
Grupo de
Expresin Gnica
en Eucariontes
Nuevas tcnicas de genmica
funcional: anlisis mediante DNA-
arrays de potenciales genes blanco
de los immunosupresores en clulas
linfoides y granulocticas
FIS 2003-2005
Grupo de
Tecnologa
Electrnica
Sistema de produccin masiva de
biochips matriciales (microarrays)
ultradensos
MCyT 2001-2004
Universidad de
Las Palmas de
Gran Canaria
Ciencias Clnicas
Identificacin de perfiles de
expresin gnica
hormonodependientes: aplicacin de
biochips al estudio de los
mecanismos moleculares de la
hormona de crecimiento humana
Pharmacia
Spain S.A.
2002-2003
Universidad de
Santiago de
Compostela
Microbiologa y
Parasitologa
Deteccin de genes de virulencia de
Escherichia coli patgenos para seres
humanos y animales por nuevas
tecnologas de biologa molecular: PCR
clsica, PCR cuantitativa en tiempo
real y chips de DNA/RNA microarrays
Plan Gallego de
Investigacin y
Desarrollo
Tecnolgico
(2002-2005)
2002
Instituto de
Medicina Legal
Desenvolvemento dun mtodo de
deteccin de mutacins en xenoma
mitocondrial mediante arrays de
oligonucletidos e anlises de
fluorescencia
Xunta de Galicia 2002-2005
Anlisis de bajo nmero de copias
ADN en problemas forenses usando
polimorfismos nucleotdos simples y
miocroarrays de ADN
PN 2003-2005
Universidad de
Barcelona
Gentica
Microarrays y anlisis computacional
de genes del desarrollo y la
regeneracin en Drosophila
MCyT 2002-2004
Divisin de
Ciencias
Experimentales
Funcion de las proteinas asociadas al
nucleoide h-ns y hha en la regulacion
de la expresion genica global en
salmonella. Estudio por dna array
DGI 2001-2007
Universidades (Continuacin)
Desarrollo de Microarrays de ADN
para diagnstico de paternidad
mediante el anlisis de SNPs
PN 2001-2003
84
Hospital Ramn
y Cajal
Red temtica de
investigacin
cooperativa
Estudio gentico,
metablico,
clnico,
teraputico y
epidemiolgico de
las hiperlipemias
hereditarias
genticas en
Espaa
Patrn de expresin gnica mediante
microarrays en las hiperlipemias
genticas
FIS 2003-2005
Hospital Vall
d'Hebron
(Universitat
Autnoma de
Barcelona)
Grupo de
Investigacin en
Endocrinologa
Molecular
Identificacin de marcadores
tumorales del adenocarcinoma
endometrial a partir de un panel de
297 secuencias diferencialmente
expresadas aisladas por hibridacin
de microarrays
FIS 2002
Hormonodepend
encia y tumores
slidos
Identificacin de marcadores tumorales
del adenocarcinoma endometrial a
partir de un panel de 297 secuencias
diferencialmente expresadas halladas
por hibridacin de microarrays
FIS 2003-2005
Anatoma
Patolgica
Perfiles de expresin
inmunohistoqumica y de amplificacin
gentica en cncer de endometrio
estudiados mediante matrices de
tejidos (tissue microarrays)
FIS 2003-2005
Hospital
Universitario La
Paz (UAM)
Hospital
Universitario de
La Princesa (UAM)
Hospital
Materno-Infantil
de Las Palmas de
Gran Canaria
Oncologa
Peditrica
Identificacin de marcadores
moleculares de diagnstico y
pronstico en sarcomas de Ewing
mediante el empleo de microarrays
Investigacin en
Oncologa
Peditrica
Fundacin
Enriqueta
Villavecchia
2004-2005
Anatoma
Patolgica
Diferenciacin celular en linfomas B
de clula pequea. Anlisis de
expresin con microarrays de cDNA
CAM 2000-2003
Hospitales
Hospital Las
Cruces - Centro
Vasco de
Investigacin en
Cncer, CVIC
Oncologa Mdica
Estudio farmacogenmico mediante
microarrays y tcnicas de Biologa
Molecular Clsica de resistencia a
quimioterapia en pacientes con cncer
colorectal metastsico tratados en
primera lnea con una combinacin de
oxaliplatino y una fluopirimidina
Gobierno Vasco 2003-2005
Hospital Clnic Barcelona
Expresin gnica del componente
infiltrante de los gliomas: investigacin
de nuevos marcadores y dianas
AECC 2004-2006
Hospital Doce de
Octubre
Servicio de
Oncologa
Anlisis del valor pronstico y
predictivo del perfil de expresin
gnica tumoral, mediante arrays de
oligonucletidos, en la evolucin de
los pacientes con cncer de pulmn
FIFO
85
Centro de
Regulacin
Genmica, Parc
de Recerca
Biomdica de
Barcelona
Laboratorio de
Microarrays
Estudio genmico funcional del gen
LRRN6A en la diferenciacin neuronal.
Optimizacin de metodologas
experimentales y bioinformticas para
la aplicacin de los microarrays a
estudios de expresin
MCyT 2004
Funcin del gen neuronal lern1.

Optimizacin de microarrays para
deteccin de aneuploidas en
poblaciones celulares heterogneas
MCyT 2003
Accin especial de ayudas para el

fomento de tecnologas microarrays
de DNA para el anlisis de expresin
gnica
Fundacin
Genoma Espaa-
Agilent
Instituto Canario
contra el Cncer,
ICIC
Ciencias Clnicas
Aplicacin de la tecnologa de biochips
al estudio de los mecanismos
moleculares de la hormona de
crecimiento - Identificacin de perfiles
de expresin gnica inducidos por
hormonas
Fundacin
Universitaria de
Las Palmas
2003
Tecnologia de microarrays aplicada a
l'anlisi genmic de tumors de bufeta i
a la validaci de marcadors tumorals
2002-2005
Institut de
Biotecnologia i
de Biomedicina
(IIB-UAB)
Institut de Biotecnologia i Biomedicina
"Vicent Villar Palasi"
Unitat de
Citogentica
Lnea de investigacin: citogentica
molecular de tumors slids:
Hibridaci Genmica Comparada en
microarrays de DNA.

Fundacin para la Investigacin Hospital
Universitario la Fe
Aplicacin de la CGH array para la
deteccin de reordenamientos
genmicos responsables de retraso
mental de causa desconocida
MCyT 2004
Centro Nacional
de
Investigaciones
Oncolgicas,
CNIO
Programa de
Oncologa
molecular
Genmica funcional del ratn:
biochips y modelos genticos en
cncer
MCyT 2002-2005
Genmica funcional del ratn:
biochips y modelos genticos
Fundacin
Ramn Areces
2002-2005
Diseo de una estirpe de ratn por
reemplazamiento gnico necesaria
para la generacin de mutantes
condicionales: un til de uso
universal para el desarrollo de la
genmica funcional
MCyT 2001-2004
Otros centros de investigacin
86
Centro Nacional
de
Investigaciones
Oncolgicas,
CNIO
Programa de
Patologa
molecular
Identificacin de nuevas dianas de
inactivacin epigentica (metilacin
aberrante del DNA y alteraciones de
la cromatina) en cncer humano
usando microarrays y otras tcnicas
genmicas
FIS 2002-2004
Perfil de expresin gnica en
linfomas no Hodgkin a partir de un
biochip de 400 cDNA procedentes de
genes relacionados con el proceso
tumoral
CAM 2001
Diferenciacin celular en linfomas B
de clula pequea. Anlisis de
expresin con microarrays de cDNA
CAM 2002-2004
Patrones de expresin gentica en
cncer de endometrio: estudio
mediante micro-arrays de cDNA
FIS 2002-2004
Aproximacin multidisciplinaria al
cncer de mama hereditario no
asociado a mutaciones en los genes
BRCAs. Desarrollo de un biochip de
expresin de cDNAs
MCyT 2002-2004
microarrays de ADN usando mtodos
estadsticos
MCyT 2003-2006
Estudio mediante arrays de cDNA de
los genes implicados en la
sensibilidad y resistencia a paclitaxel
en cncer de mama y ovario
MCyT 2002-2004
Aplicacin de nuevas tecnologas al
estudio del linfoma de Hodgkin: tissue
arrays (matrices de multitejidos),
microdiseccin y anlisis de expresin
con microarrays de cDNA
FIS 2002-2004
Perfiles de expresin
inmunohistoqumica y de amplificacin
gentica en cncer de endometrio
estudiados mediante matrices de
tejidos (tissue microarrays)
FIS 2003-2005
Diseo y fabricacin de un biochip de
expresin para la prediccin de la
respuesta a gemtabicina en pacientes
con cncer de mama: GEMZACHIP
MCyT 2004-2007
Programa de
Biotecnologa
Cncer colorrectal: estudio
protemico de expresin diferencial
mediante microarrays de protenas
encaminado a mejorar la deteccin
precoz y el diagnstico molecular
CAM 2005
Otros centros de investigacin (Continuacin)
87
Centro Nacional
de
Investigaciones
Oncolgicas,
CNIO
Programa de
Biotecnologa
Diseo y fabricacin de un biochip de
DNA de baja complejidad para la
evaluacin pronstica del cncer de
mama
MCyT 2003
Desarrollo de metodologas de matrices
de DNA en soportes interactivos (CD-
ROM) para anlisis de polimorfismos y
expresin gnica (CD-DNA)
MCyT 2001-2003
Genomic approaches to microarray
data analysis
European
Science
Foundation
2003
Desarrollo de nuevos mtodos de
seleccin de genes y construccin de
predictores para el pronstico de
parmetros clnicos usando
microarrays de ADN
CAM 2005
Marcadores genticos del mal
pronstico en leucemias mieloides
agudas y mielodisplasias: anlisis
por citogentica molecular y perfiles
de expresin con cDNA arrays
MCyT 2002-2004
Programa de
Gentica del
Cncer Humano
Diseo y produccin de biochips de
ADN (CGH-arrays) con cobertura
completa de los genomas humano y
de ratn
CAM 2005
Caracterizacin mediante CGH-arrays
de reordenamientos genmicos de
cambios de dosis gnica en procesos
neoplsicos
FIS 2005-2007
Bsqueda de genes implicados en
patognesis de
Feocromocitomas/Paragangliomas, y
de marcadores asociados a curso
clnico usando 3 aproximaciones: cDNA
arrays, CGH e inmunohistoqumica
sobre arrays de tejido
FIS 2005-2007
Caracterizacin molecular e
inmunohistoqumica mediante matrices
de tejido, y bsqueda de alelos de baja
penetrancia en el cncer colorrectal no
polipsico familiar
FIS 2005-2008
Caracterizacin de la heterogeneidad
molecular de los linfomas T humanos
mediante microarrays: implicacin de
la ruta de activacin de NFKB
CAM 2005
Desarrollo de los modelos estadsticos
para el anlisis conjunto de arrays de
CGH y de expresin gnica para el
estudio de neoplasias humanas
Mutua Madrilea
Automovilista
88
Genetrix, S.L.
Genmica, S.A.
Medplant
genetics, S.L.
Neocodex, S.L.
Bioalma
Anlisis gentico de cuasiespecies virales mediante chips
de ADN para la planificacin de tratamientos antivirales
PROFIT 2003
Desarrollo de un microarray especfico para la
identificacin de alteraciones genticas con valor
diagnstico y pronstico en tumores slidos infantiles
PROFIT 2003
Desarrollo de sistemas de diagnstico molecular basados
en microarrays de baja densidad
PROFIT 2003
Diseo de un microchip de ADNc para la deteccin de
resistencia a la quimioterapia en pacientes con cncer de
pulmn
PROFIT 2003
Proyecto Iberoeka Medchip - desarrollo de sistemas de
diagnstico precoz e identificacin de dianas teraputicas,
mediante tecnologa ADN-chip
PROFIT 2003
Desarrollo de SNPs y Biochips aplicables al diagnstico
molecular de la esterilidad humana
PROFIT 2003
Desarrollo e implementacin de sistemas de clasificacin
de muestras para datos de microarrays de expresin
gnica o de tejidos
PROFIT 2003
Empresas
Centro Ttulo del proyecto Financiacin Duracin
Proyecto linfo-chip: desarrollo de un ADN-chip para el
diagnstico diferencial de neoplasias hematolgicas
PROFIT 2003
Tabla 11. Proyectos de investigacin espaoles relacionados con tecnologas de microarrays
Fuente: Elaboracin propia
Acrnimos:
PN, Plan Nacional; FIS, Fondo de Investigaciones Sanitarias; MCyT, Ministerio de Ciencia y Tecnologa;
CAM, Comunidad de Madrid; DGESI, MEyC, Ministerio de Educacin y Cultura; FRA, fundacin Ramn Areces;
CICYT, Comisin Interministerial de Ciencia y Tecnologa; UAB, Universidad Autnoma de Barcelona; UE, Unin europea;
PGI y DT, Plan Gallego de Investigacin y Desarrollo Tecnolgico; DGES, Direccin General de Enseanza Superior;
FCRG, Fundacin Centro de Regulacin Genmic; NIH, National Institutes of Health, USA; NIH/ NHLBI, National Institutes
of Health, National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI); CSIC, Consejo Superior de Investigaciones Cientficas;
Asociacin Espaola Contra El Cncer (AECC); Fundacin para la Investigacin y Formacin en Oncologa (FIFO).
Instituto de
Salud Carlos III
Bioinformtica y
salud pblica
Sistemas de Identificacin Rpida de
Agentes Biolgicos Agresivos
SIRABAD
Ministerio de
Defensa
2003-2005
89
ANEXO V. Patentes recientes en Microarrays
WO2005018796
US20050048580
US20050048554
US20050046758
US20050048648
US20050048531
WO2005016869
Microarray support for bioprobe synthesis 03/03/2005
PamGene
(Hertogenbosch,
Pases Bajos)
Nucleic-acid programmable protein arrays 03/03/2005
Harvard Collage
(Cambridge, MA,
USA)
Method of making and using hybrid polymeric thin films for
bio-microarray applications
03/03/2005 Zhou J; Zhou X
Method of transcribing biomolecular patterns, method of
manufacturing chip boards, and method of manufacturing
biochips
03/03/2005
Omron KK
(Tokyo); Aoyama
S; Matsushita T;
Nisjikawa T;
Norioka S; Tsuda
Y; Wazawa T
Methods for genetic analysis 03/03/2005
Affymetrix
(Santa Clara,
CA, USA)
Novel dendrimer compound, a biochip using the same and
a fabricating method thereof
24/02/2005
Pohang Iron and
Steel Co.;
Pohang
University of
Science and
Technology
Foundation
(Pohang, Korea)
US20050042363
Method for fabrication of biochips with a macroporous
polymer substrate
24/02/2005
Chernov BK;
Gemmell MA;
Golovaj B;
Kukhtin AV;
Yershov GM
WO2005014852
Microarrays of immobilized biomolecules, production
thereof, and use thereof
17/02/2005
SusTech GmbH
& Co.
(Darmstadt,
Germany)
KR2004094982
A method for highly concentrating a target material in a
sample using a scanning probe microscope to manufacture
a highly integrated nano-bioarray
12/11/2005
Sogang
University
(Seoul, Korea)
Patentes recientes en Microarrays
N de Patente Ttulo
Fecha de
Publicacin
Solicitante
Compositions & methods for reformulating biological
membranes for arrays
03/03/2005
Fang Y; Ferrie
AM
Tabla 12: Patentes recientes en Microarrays.
Fuente: Recent patent applications in microarrays. Patents. (2005). Nature Biotechnology 23:550.
90
Angenendt, P,. et al. (2003). Next generation of
protein microarray support materials: evaluation
for protein and antibody microarray evaluations.
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Angenendt, P.; Glkerm, J. (2003). Protein and
antibody microarray technology. Journal of
Chromatography B. Vol. 797:229-240.
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applications of microarrays. Drug Discovery
Today. Vol. 9(2):61-63.
Bailey, S. N., et al. (2002). Applications of
transfected cells microarrays in high-throughput
drug discovery. DDT Vol. 7 (18) (Suppl.): 1-6.
Briones, C., et al. (2004). Ordered self-
assembled monolayers of peptide nucleic acids
with DNA recognition capability. Physical Review
Letters, Vol. 93:208103 (1-4).
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Medicine. Vol. 13:483-495.
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Infecc. Microbiol. Clin. Vol. 22 (1) :46-54.
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frontiers of glycomics. Current Opinion in
Structural Biology. Vol. 13:637-645.
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Hardiman, G., et al. (2002). Protein microarrays:
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Methods 2: 345-50
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microarrays. Proteomics and Genomics Current
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Orense, 69, planta 2
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