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Nature & Technologie

Etude de lactivit antimicrobienne des souches de lactobacilles thermophiles utilises dans lindustrie laitire.
Fella Naouel ALLOUCHEa*, Amina HELLALb., Abdenour LARABAc.
a

Division Bionergie et Environnement. Centre de Dveloppement des Energies Renouvelables.B.P.62, route de lobservatoire. Bouzareah Algrie. *Ecole Nationale Suprieure Agronomique. EL Harrach. Algrie
b

Ecole Nationale Polytechnique El Harrach. Dpartement de Gnie de lEnvironnement. Algrie c Hpital universitaire de Bab el Oued. Service pdiatrie. Algrie

Rsum Cette tude a t inspire des problmes rencontrs dans lindustrie laitire et illustre limportance antimicrobienne des lactobacilles vis-vis des germes daltration. Dix souches de lactobacilles thermophiles appartenant aux espces: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus lactis, Lactobacillus bulgaricus) ont t isoles sur milieu MRS partir du lait cru et d'un ferment lactique commercial pour l'tude de leur activit antimicrobienne contre des germes Gram positifs et Gram ngatifs. Les rsultats de lactivit antimicrobienne ont rvl que toutes les souches de Lactobacillus isoles produisent et excrtent dans le milieu de culture des substances inhibitrices capables d'inhiber la croissance de Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa. Ltude des cintiques de croissance et dexcrtion, nous a permis de choisir une souche de Lactobacillus acidophilus comme souche modle pour la production et la purification de bactriocine. Une caractrisation physico-chimique nous a permis dobserver que la bactriocine prsente une faible thermorsistance et un pH optimum de 5. L'activit bactriocinognique est dtruite par 121C pendant 20 mn. La stabilit de la bactriocine a t dtecte une temprature de 45 C et une gamme de pH comprise entre 5 6. La bactriocine conserve toute son activit pendant 7 jours une temprature + 4C et 20C. Lactivit est entirement dtruite sous laction des enzymes protolytiques, ce qui indique que la partie biologiquement active est de nature protique. Ces proprits suggrent que cette substance inhibitrice est considre comme substance de type Bactriocine . Lensemble de ces rsultats souligne limportance de lactivit antimicrobienne des lactobacilles dans lindustrie laitire.
Mots cls : Lactobacillus; Bactriocine; Substances antimicrobiennes; inhibition des germes pathognes.

1. Introduction Les bactries lactiques sont connues pour leur capacit produire lors de leur croissance des composs actifs savoir les acides organiques qui acidifient le milieu, des drivs du mtabolisme de loxygne (H2O2) et des substances naturelles de nature protique doues dune activit antagoniste lencontre dun grand nombre de germes daltration, leur permettant de se dvelopper prfrentiellement dans divers cosystmes [1] [2] [3]. Parmi ces substances synthtises, des peptides dnomms bactriocines, sont produits puis excrts lextrieur des cellules productrices. Ils prsentent une activit bactricide ou bactriostatique. Leur spectre dactivit peut tre plus ou moins large, quelquefois limit aux espces proches phylogntiquement des

bactries productrices [2] [4]. De nombreuses possibilits dutilisation ont t envisages, pour rpondre aux besoins de lindustrie alimentaire, cosmtique et de la mdecine. Ces nouvelles substances naturelles produites par des souches bactriennes universellement reconnues dusage alimentaire diriges contre des germes pathognes pourraient tre utilises comme agent de conservation sous forme dadditif, soit dinoculum bactrien producteur de bactriocines au cours du processus de fabrication, permettant ainsi de diminuer le nombre dintoxications alimentaires et daugmenter la dure de conservation et de commercialisation. Par exemple, la nisine produite par la souche Lactococcus lactis, est autorise et utilise cet effet dans certains aliments [5]. Lobjectif de notre travail consiste isoler des souches de lactobacilles thermophiles partir du lait cru et dun ferment lactique thermophile commercial; la mise en

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Etude de lactivit antimicrobienne des souches lactobacilles utilises dans lindustrie laitire (Schillinger et Lucke ; Ten brink et al. ; Jin et al.) [10] [11] [12]. 20 ml de milieu glos, sont recouvertes avec 5 ml de milieu semi-solide (0,7 % dagar) pralablement ensemenc avec 0,05 ml de la suspension de souche cible dilution 10-1. Sur les boites de Ptri inocules par les germes cibles prpares pralablement, on ralise des puits (diamtre de 4,5 mm) qui sont remplis par la suite par 50 l de lextrait bactriocinique brut. Les boites de Ptri ainsi prpares sont pr-incubes pendant 2 4 heures + 4 C, afin de permettre la diffusion radiale de lagent inhibiteur ensuite suivit par une incubation 18 24 heures, 37 C en anarobiose, afin dviter la prsence de lair ncessaire la production de peroxyde dhydrogne [13]. En fin dincubation, on observe les zones dinhibition autour des puits, pour les diffrentes souches slectionnes vis--vis des germes cibles tests. La lecture de lactivit bactriocinognique se fait par la mesure du diamtre dinhibition autour du puits, exprime en mm [14]. 2.4. Etude de lvolution de la cintique de croissance et de production Ltude de lvolution de la croissance des lactobacilles thermophiles slectionns est effectue dans le milieu MRS pH 6,8, incubation 37 C, en anarobiose. Des prlvements striles sont effectus priodiquement afin dvaluer la croissance (DO) 560 nm, le pH ainsi que la dtermination de lactivit bactriocinognique vis vis des germes cibles. 2.5. Purification de la bactriocine Afin dextraire et de purifier la fraction bactriocinique, une mthode dextraction simple, fonde sur lemploi de (NaCl) a t dveloppe. La mthode dextraction acide a pour principe ladsorption et la dsorption des molcules sur les cellules productrices de bactriocines prconise par Yang et al. [15]. 2.5.1. Dtermination du pH optimum daction, de la thermorsistance Le pH optimum daction de la bactriocine purifie est mis en vidence par la variation du pH, lextrait bactriocinique est ajust des valeurs de pH variant de 2 10 avec HCl, 1 mole L-1 ou du NaOH 1 mole L-1. Aprs incubation pendant 1 heure 30 mn 37 C, lactivit bactriocinognique est ensuite teste vis--vis de Bacillus subtilis et Staphylococcus aureus par la mthode de diffusion des puits [16] [17]. Pour la dtermination de la thermorsistance de la bactriocine, diffrentes fractions dextraits bactriociniques purifis sont soumises un traitement thermique 40 C, 45 C, 50 C, 60 C, 80 C et 100 C pendant 1 mn et enfin un cycle dautoclavage 121 C pendant 20 minutes pH optimum (pH 5) [11] [17]. Aprs refroidissement, lactivit de la bactriocine est vrifie vis--vis de Bacillus subtilis et Staphylococcus aureus.

vidence de lactivit antimicrobienne des souches Lactobacillus slectionnes; tudier par la suite la cintique de croissance des souches Lactobacillus slectionnes; extraire et purifier la bactriocine partir de la souche Lactobacillus la plus performante et dterminer les proprits physico-chimiques de la bactriocine purifie. Enfin, cest sur cette base de donnes, que nous essayerons dtudier au laboratoire, lactivit antimicrobienne des souches de lactobacilles thermophiles vis vis des germes cibles. 2. Matriel et mthodes 2.1. Bactries et conditions de culture Lisolement des lactobacilles a t effectu partir du lait cru et lben traditionnel prpar partir de diffrents chantillons de lait cru rcolt la ferme exprimentale de lINA El Harrach et dun ferment lactique commercial (Danimax-food , ORLAC Birkhadem). Lisolement des lactobacilles a t effectu sur le milieu MRS pH 6,2, incub 42C pendant 72 heures, en anarobiose [6]. Les souches ont subi par la suite des tests didentification spcifiques. Le milieu de production de bactriocine utilis est le milieu MRS pH 6,8 prconis par Barefoot et Klaenhammer ; Barefoot et al. [7] [8]. Afin de dtecter le spectre dactivit des espces lactobacilles slectionnes, nous avons test les souches contre un certain nombre de germes indsirables. Les souches cibles utilises pour ltude de lactivit bactriocinognique proviennent des collections (ATCC, IPA) fournies par lInstitut Pasteur dAlgrie (IPA) (tableau1). Des tests de caractrisation culturaux et morphologiques (Gram, catalase et oxydase) sont effectus au pralable. Les rsultats des tests de caractrisation ont t compars avec ceux obtenus par Holt (1994) dans Bergeys Manuel of Determinative Bactriology 9 th Edition. 2.2. Prparation de lextrait bactriocinique Une culture de lactobacilles thermophiles a t effectue dans le milieu MRS pH 6,8, incubation 37C, dans une jarre danarobiose. Le surnageant contenant lextrait brut bactriocinique est rcupr par centrifugation est ajust pH neutre 6,5 7 avec du NaOH 10 M. La neutralisation de lextrait bactriocinique permet dliminer leffet des acides organiques. Lextrait est ensuite filtr sur filtres Millipore striles de diamtre 0,22 m, lactivit antimicrobienne est dtermine pour chaque souche de lactobacille slectionne. 2.3. Essai de lactivit bactriocinognique Afin de minimiser linfluence de leffet inhibiteur du peroxyde dhydrogne; les boites de Ptri sont ensemences avec le germe cible en profondeur et en double couche dans la glose nutritive selon la technique de diffusion des puits prconise par Tagg et Mc Given [9] puis reprit et modifie par plusieurs auteurs

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Tableau 1 Rfrence des souches cibles.

Germes cibles

Milieu dincubation

Temps dincubation

Origine

Bactries Gram positives Bacillus subtilis Bacillus subtilis SL 12 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus 209 P Streptocoque D : Enterococcus fcalis Listeria monocytogenes Bactries Gram ngatives Escherichia coli 54127 Escherichia coli 10531 Pseudomonas aeruginosa 165 Salmonella seftenberg 67 ATCC: American Type Culture Collection; IPA: Institut Pasteur dAlger.

glose nutritif (liquide et solide)

30 C ,18-24 heures 30 C ,18-24 heures 37 C,18-24 heures 37 C,18-24 heures

IPA ATCC IPA ATCC IPA ATCC

30 C ,18-24 heures 30 C ,18-24 heures 30 C ,18-24 heures 37 C, 18-24 heures

ATCC ATCC ATCC IPA

2.5.2. Dtermination de la stabilit thermique de la bactriocine au cours du stockage Afin dexaminer la stabilit thermique de la bactriocine au cours du stockage, diffrentes fractions dextraits bactriociniques purifies sont conserves pH optimum des tempratures diffrentes: 37 C et + 4 C pendant 7 jours et 20 C pendant 7 jours et au moins une anne [11] [17]. Lactivit de la bactriocine est teste vis--vis de Bacillus subtilis et Staphylococcus aureus. 2.5.3. Effet des enzymes protolytiques Leffet des enzymes protolytiques suivantes: Trypsine (Merck from Bovine pancras 40 UI/mg), chymotrypsine (Merck 60 UI /mg), Pronase (Merck 4.000.000 UI/g) a t tudi afin de dterminer la nature de la bactriocine.
Tableau 2 Observations culturales et morphologiques des lactobacilles thermophiles. Souches Examen Macroscopique

Le surnageant dot dune activit inhibitrice est addition aux enzymes une concentration finale de 1mg/ml dans du tampon phosphate de potassium 10 mmole/L ajust pH 7,0 avec du HCl ou du NaOH 1 mole L-1. Aprs incubation 37 C pendant 1 heure, lactivit rsiduelle est dtermine par comparaison avec le tmoin [11] [17]. Lactivit bactriocinognique a t teste par la suite en utilisant Bacillus subtilis et Staphylococcus aureus comme germes cibles. 3. Rsultats La dtermination des caractres morphologiques et biochimiques des souches isoles nous a permis didentifier 10 souches, dont quatre espces appartiennent au genre Lactobacillus (tableau 2 et 3).

Croissance sur Milieu MRS Liquide 42C / 24 H Mobilit Trouble + Culot +

Examen Microscopique

Dimensions Forme Lba1, Lba2, Lba3, Lba4, Lba5 Lba6, Lbl1, Lbb1, . 0,8< < 1 ronde

Couleur Crme (blanc crme)

Consistance Contour Surface Pteuse Rgulier Lisse

Forme Btonnet

Gram +

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Etude de lactivit antimicrobienne des souches lactobacilles utilises dans lindustrie laitire

Tableau 3 Tests didentification des souches lactobacilles thermophiles. Souches Lactobacillus thermophiles Caractres Biochimiques Catalase Croissance sur MRS milieu liquide: 45 C 15 C Lba1 + + + + + + + + + + Lba2 + + + + + + + + + + Lba3 + + + + + + + + + + Lba4 + + + + + + + + + + Lba5 + + + + + + + + + + Lba6 + + + + + .+ + + + + Lbh1 + + + + + + Lbh2 + + + + + + Lbl1 + + + + + + + + Lbb1 + + + + + -

Thermoresistance:

60 C / 90 mn

65 C / 30 mn Hydrolyse de larginine Hydrolyse de lesculine Croissance en prsence de NaCl :

NaCl 2 % NaCl 4 %
type fermentaire : Homofermentaire Coagulation du lait crm Fermentation des sucres : Arabinose Lactose Saccharose Maltose Sorbitol Galactose

Glucose Xylose

3.1. Spectre dactivit Les diffrentes souches de Lactobacillus slectionnes, prsentent un spectre dactivit trs proche vis--vis des germes cibles tests. Il a t not que seule la souche (Lba1) est active contre Escherichia coli. Les zones dinhibition sont claires avec des bordures bien distinctes, le diamtre dinhibition variable entre 12 et 22 mm suivant la souche teste (tableau 4). Linhibition est note positive lorsquelle est suprieure 1 mm Schillinger et Lucke, [10].

1,5
Do (560 nm)

1 0,5 0 0 2
Lba3 Lb b1

4
Lb a4 Lb h2

6 8 10 Tem ps (heures )
Lb l1 Lb a2 Lb a1

(a)

(b)

Fig. 2. Cintique de croissance des souches Lactobacillus thermophiles, au cours de la fermentation en bouillon MRS (inocul raison de 1%, pH initial 6,8 incub 37C, sans agitation).

3.2. Cintique de production A partir de lanalyse des cintiques de croissance, il est intressant de relever que les sept souches de Lactobacillus slectionnes prsentent le mme profil cintique au dbut de la phase exponentielle, et elles atteignent respectivement leur phase stationnaire au bout de 6-7 heures dincubation avec des densits optiques variables selon lespce (fig.2).

(c)

(d)

Figure. 1. Activit antimicrobienne des souches de Lactobacilles thermophiles slectionnes vis--vis de Staphylococcus aureus 209 P (a et b) et Bacillus subtilus (c et d) par la mthode de diffusion des puits.

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Tableau 4 Spectre dactivit antimicrobienne des souches de Lactobacillus thermophiles par la mthode de diffusion des puits. Zone dinhibition exprime en mm.

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Souche Tests Lba1 Souches cibles Lba2 Lba3 Lba4 Lba5 Lba6 Lbh1 Lbh2 Lbl1 Lbb1

Bactries Gram positives Bacillus subtilis

20

20

20

15

18

19

17,5

19

17

22

Bacillus subtilis SL12 Staphylococcus aureus 209p

22,5

19

19

14

17

18

17

18

14,75

14,5

14,5 Staphylococcus aureus 12 Enterococcus faecalis Listeria monocytogenes 0 0

19 0

19 0

18 0

22 21,5

21 0

18 18

17 0

17 0

21 16,5

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

Bactries Gram ngatives Escherichia coli 54127 Escherichia coli 105331 Pseudomonas aeruginosa 165

19

18

18 18

0 18,5

0 19

0 20

0 22

0 17

0 19

0 0

0 17

0 15

Salmonella seftenberg 67

Lactivit inhibitrice atteint son niveau maximal aprs 6 7 heures dincubation et reste stable jusqu' la fin de fermentation. La figure 3, permet dapprcier la cintique de croissance de la souche Lactobacillus acidophilus (Lba1), lactivit inhibitrice augmente progressivement au dbut de la phase exponentielle et se stabilise au cours de la phase stationnaire, qui correspond la phase de synthse des substances inhibitrices par les cellules productrices dans le milieu extracellulaire. Selon Ten Brink et al. [11] cette stabilit dactivit est attribue dune part au fait que la lyse cellulaire est incomplte au dbut de la fermentation et dautre part, pour la souche Lactobacillus acidophilus M46, la scrtion de la bactriocine acidocine B a t observe au cours de la croissance pour atteindre le maximum de scrtion en phase stationnaire. Dans le cas des espces appartenant au genre Lactobacillus, les travaux entrepris par Vaughan et al. [18] ; Barefoot et Klaenhammer, [19]; Garriga et al. [20]; Barefoot et al. [8]; Ten Brink et al. [11] et Thompson et al. [21], ont rapport que la production de bactriocine varie selon lespce bactrienne productrice.

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7
Do ( 560 nm )

( mm)

20 15 0,5 10 5 0 0 2 4 Activit Bs Activit Pa 6 7 8 Temps ( heures ) 10 0

Activit

pH

Activit St a Do 560 nm

Fig. 3. Cintique de croissance de Lactobacillus acidophilus Lb a 1, activit antibactrienne et volution du pH au cours de la fermentation en bouillon MRS (inocul raison de 1%, pH initial 6,8, incub 37C, sans agitation).

En revanche, on a constat galement que la scrtion des molcules inhibitrices (bactriocine) augmente au fur et mesure au cours de la croissance et natteint son niveau maximum de production quaprs acidification plus ou moins complte du milieu de culture, vers la fin de la

pH

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Etude de lactivit antimicrobienne des souches lactobacilles utilises dans lindustrie laitire Ltude de la cintique de croissance et dexcrtion des bactriocines a montr que leur scrtion dans le milieu de culture MRS liquide se fait au fur et mesure de la croissance de la souche. Dune manire gnrale, lactivit antimicrobienne des sept souches slectionnes est dtecte au dbut de la phase exponentielle et natteint son niveau maximal de scrtion quaprs acidification quasiment complte du milieu de culture. En effet, ltude entreprise par Yang et Ray [15], a montr que la production de bactriocine par les bactries lactiques est fortement dpendante : des souches, de la composition du milieu de culture, du pH final du milieu, du temps dincubation, de la temprature optimale de croissance et surtout elle ncessite lutilisation des milieux simples et conomiques. Sur la base des rsultats obtenus sur lactivit antimicrobienne des souches slectionnes, la souche Lactobacillus acidophilus (Lba1), est considre comme tant la souche la plus performante pour son activit antagoniste vis--vis des souches cibles testes. La souche (Lba1) t retenue pour sa forte activit comme modle pour lisolement et la purification de la bactriocine partir de lextrait brut (surnageant de culture).Toutefois, les tests de caractrisation prliminaires rvlent que la bactriocine prsente une faible thermorsistance (tableau 5). Son activit est totalement dtruite aprs un cycle dautoclavage 120 C pendant 20 mn. La bactriocine conserve toute son activit pendant 7 jours une temprature de + 4 C et 20 C et au moins une anne 20 C selon nos conditions exprimentales (tableau 5). Sa stabilit a t dtecte une gamme de pH comprise entre 5 6, son pH optimum est estim 5.
Tableau 5 Dtermination de la thermorsistance de la bactriocine issue de la souche Lactobacillus acidophilus (Lba1).

phase exponentielle et au dbut de la phase stationnaire (fig.3). Sur la base des rsultats obtenus, il savre que le dveloppement des diffrentes souches Lactobacillus tudies sur le milieu MRS pH initial voisin de la neutralit ne dmarre que tardivement et atteint sa densit maximale aprs 10 heures dincubation. Il apparat galement que lacidit dveloppe par les bactries elles mmes contribue au ralentissement et larrt de la croissance (fig.3). A ce titre les travaux de Barefoot et Klaenhammer [7], rvlent que la scrtion de bactriocines est fortement dpendante du pH initial, du milieu de production; ceci suggre que le pH du milieu facilite la fois la scrtion et la solubilit de la bactriocine dans le milieu de production. 4. DISCUSSION Dans la prsente tude, afin de vrifier les proprits antimicrobiennes des bactries lactiques, nous avons isol et identifi des souches de lactobacilles thermophiles partir du lait cru et dun ferment lactique thermophile. Les rsultats danalyses ont permis didentifier dix souches de Lactobacillus appartenant aux espces suivantes: Lactobacillus acidophilus (Lba1, Lba2, Lba3, Lba4, Lba5, Lba6), Lactobacillus helveticus (Lbh1, Lbh2), Lactobacillus lactis (Lbl1), Lactobacillus bulgaricus (Lbb1). De lensemble des rsultats obtenus, on a constat que sur le nombre total des espces Lactobacillus thermophiles identifies, la frquence de lespce Lactobacillus acidophilus est la plus dominante. En travaillant dans des conditions exprimentales liminant linfluence de lacide lactique et le peroxyde dhydrogne, lactivit antimicrobienne due laction de la bactriocine pour les diffrentes souches de Lactobacillus thermophiles tudies a rvl un spectre dinhibition troit, dirig notamment vis--vis des germes cibles: Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli. Il est important de relever que les rsultats obtenus dans notre tude sur les souches Lactobacillus acidophilus (Lba1, lba2, lba3, lba4, lba5, lba6) testes vis--vis de Bacillus subtilis et Staphylococcus aureus se rapprochent de ceux cits dans la littrature, [22] [8] [11] [23] [24]. Dans une tude similaire, les travaux de Lin et al. [24] et KarskaWysocki et al. [26] ont rapports que les bactriocines produites par Lactobacillus acidophilus dveloppent une activit positive vis--vis de Salmonella choleraesuis, respectivement Lactobacillus acidophilus et Lactobacillus casei vis--vis de Staphylococcus aureus (MRSA). Enfin, Itoh et al [27] Tahara et Kanatani [28] ont montr quil est galement possible que la souche Lactobacillus acidophilus exerce uniquement une activit inhibitrice vis--vis des bactries taxonomiquement proches de la souche productrice.

Traitement

diamtre dinhibition (mm) Bacillus subtilis Staphylococcus aureus 209 p 20

Temprature Tmoin 23

45 C/ 10 mn 22.75 19 50 C/10 mn 15 11 60 C/ 10 mn 0 0 80C/ 10 mn 0 0 100 C/ 1 mn 10 8.5 121 C/ 20 mn 0 0 Conditions de raction: Bactriocine purifie, tampon phosphate de sodium pH 6.5, incubation 37 C pendant 1 heure 30 mn.

Lactivit antimicrobienne est entirement dtruite sous laction des enzymes protolytiques, ceci suggre que la partie biologiquement active de la bactriocine est de nature protique (tableau 6). Ces proprits de la

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bactriocine sont trs importantes dterminer, mais il serait intressant de confirmer ces rsultats in
Tableau 6

vitro [29] [30].

Action des enzymes protolytiques sur lactivit de la bactriocine issue de la souche Lactobacillus acidophilus (Lba1)

Traitement Enzymes protolytiques Trypsine -Chymotrypsine Pronase (-) aucune activit nest note.

diamtre dinhibition (mm) Bacillus subtilis Staphylococcus aureus 209 p [2] R.W. JACK, J.R. TAGG et B. RAY, Bacteriocins of Gram positive bacteria. Microbiol Rev, 59 (1995) 171200.

5. Conclusion Les rsultats prsents dans cet article permettent tout le moins de fournir un ordre dide plus clair sur le potentiel antimicrobien des souches Lactobacillus slectionnes qui reprsentent une voie davenir pour la production des substances antimicrobiennes utilises dans la fermentation et la bioconservation des aliments. Lanalyse des proprits physico-chimiques de cette substance activit inhibitrice de type bactriocine est ncessaire et peut servir de base pour orienter les futurs travaux de recherches sur la production de bactriocines diffrentes chelles destines des applications potentielles dans les produits laitiers, carns et marins, sous forme dadditif, soit dinoculum bactrien producteur de bactriocines au cours du processus de fabrication et en tant que conservateur naturel pour inhiber la croissance des microorganismes indsirables dans les aliments. Sur le plan industriel, lutilisation des bactriocines comme alternative aux additifs chimiques, ne pourra tre obtenue que par la slection judicieuse des souches utilises pour leur synthse associe des procds technologiques respectant lenvironnement. Remerciements Je remercie vivement le Professeur Laraba. A. pour ses encouragements et son aide et le Professeur Mansouri. M. pour avoir accept de maccueillir dans le Laboratoire National de Contrle des Produits Pharmaceutiques (LNCPP) ainsi que tout le personnel pour mavoir permis de raliser mes expriences. Rfrences
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Etude de lactivit antimicrobienne des souches lactobacilles utilises dans lindustrie laitire
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