Tcnicas de citogentica molecular y sus aplicaciones

Dra. Blanca Espinet, Dr. Marta Salido, Dr. Francesc Sol. Laboratori de Citogentica i Biologia Molecular Servei de Patologia Hospital de Mar de Barcelona
UTILIDAD DE LA CITOGENTICA EN EL ESTUDIO DE LAS NEOPLASIAS

En los ltimos aos los anlisis citogenticos han ido adquiriendo mayor importancia tanto en el estudio de las neoplasias, como en las hemopatas malignas. Los recientes avances registrados en este campo, entre los que destacan la calidad de las bandas cromosmicas, han permitido identificar subgrupos clnicos asociados a cambios cromosmicos especficos.

Es importante subrayar que la interpretacin de los resultados citogenticos se debe realizar teniendo en cuenta tanto la historia clnica del paciente, como los hallazgos de laboratorio. Por ello es necesario una estrecha colaboracin entre los citogenetistas, hematlogos y onclogos, colaboracin que permitir interpretar el significado y el valor del cambio cromosmico hallado en un paciente determinado.

Es asimismo importante tener en cuenta el tipo de material que debe utilizarse para la realizacin de un estudio citogentico, que necesariamente corresponder a las clulas implicadas en la enfermedad. As, en el caso de las leucemias, la valoracin se debe realizar en la medula sea. En los linfomas, hay que analizar los ganglios linfticos o los tejidos tambin implicados; en la leucemia linftica crnica y en algunas otras enfermedades, puede efectuarse en sangre perifrica al hallarse en ella una gran proporcin de clulas leucmicas. En el caso de los tumores slidos el tejido de eleccin debe ser una muestra representativa del propio tumor. No obstante, en general, y a pesar de la invasin perifrica, tanto para la leucemia mieloide crnica como para sndromes mielodisplsicos y leucemias agudas se requiere el estudio de medula sea para obtener la debida

informacin citogentica. En aquellos casos en que debe descartarse que la alteracin cromosmica hallada en medula sea es constitucional, se requerir asimismo un estudio de sangre perifrica estimulada con Fitohemaglutinina (PHA).

Por lo dems, los resultados citogenticos adems de ser importantes para la precisa caracterizacin de las leucemias, tambin aportan informacin de valor pronstico. As por ejemplo, existen alteraciones que implican un pronstico favorable, tales como la t(8;21)(q22;q22) en la leucemia aguda no linfoblstica (LANL) M2 o la inv(16)(p13q22) en la LANL M4 con eosinofilia medular (M4Eo), mientras que la monosoma del cromosoma 7 (-7) o la deteccin de cariotipos complejos (con ms de tres alteraciones cromosmicas distintas) se relacionan con un pronstico desfavorable. En estos casos concretos y en otros varios, son los cambios cromosmicos los que por s solos tienen valor pronstico. Por otro lado, la caracterizacin y el mapado de los genes localizados en los puntos de rotura implicados en alteraciones cromosmicas, est permitiendo conocer el mecanismo por el cual se origina una neoplasia. Los recientes avances en el campo de la gentica molecular constituyen un complemento importante para los citogenetistas, ya que enriquecen la informacin que aporta el estudio citogentico. Valor pronostico de los hallazgos citogeneticos

Seguidamente se detallan los cambios cromosmicos que tienen un valor pronstico, por orden de importancia: - Cambio cromosmico primario: Se acepta que es el que est relacionado con el proceso de transformacin maligna y est estrechamente asociado a mecanismos moleculares, los cuales seran los responsables de la neoplasia. - Cambio cromosmico secundario: Cuando ocurren cambios cromosmicos secundarios la enfermedad sigue un curso ms agresivo, hacindose ms resistente a la terapia y siendo ms difcil obtener una remisin completa o de larga duracin.

Cuando existen alteraciones secundarias el valor pronstico parece estar relacionado con el nmero de anomalas. Por ello, la presencia de muchos cambios cromosmicos (MAKA, "major karyotypic abnormalities") conlleva peor pronstico que la presencia de pocos cambios (MIKA, "minor karyotypic abnormalities"). - Presencia o ausencia de clulas citogenticamente normales en mdula sea: Los pacientes que slo presentan clulas con un cariotipo anormal (AA) tienen un peor pronstico que los que tienen clulas normales (AN o NN). - Presencia de dobles diminutos (DMS, "double minutes") o de regiones de tincin uniforme (HSR, "homogeneously staining regions"): La presencia en las clulas leucmicas de DMS y de HSR se asocia a un mal pronstico. Los DMS y las HSR estn relacionados con una amplificacin gnica, y sta confiere una mayor resistencia a la terapia. Cambios cromosmicos numricos (sin anomalas estructurales): Algunas leucemias (particularmente la leucemia linfoblstica aguda) estn relacionadas con una alteracin cromosmica numrica. Cuando estas anomalas representan el nico cambio cromosmico, probablemente tienen el mismo valor pronstico que los cambios primarios, tales como translocaciones, deleciones, inserciones o inversiones.

TCNICAS

DE

HIBRIDACIN

IN

SITU

(HIS).

FUNDAMENTO Y APLICACIONES EN NEOPLASIAS

La tcnica de hibridacin in situ (HIS) permite detectar y localizar secuencias especficas de cidos nucleicos (ADN o ARN) sobre preparaciones

cromosmicas, extensiones celulares, cortes de tejido y cortes ultrafinos utilizados para el estudio al microscopio. La utilizacin de las tcnicas de HIS ha aumentado en los ltimos aos como complemento de las tcnicas de citogentica convencional (Tabla 1) . La ventaja de la citogentica convencional radica en la visualizacin de todos los cromosomas, pero presenta varias limitaciones: es necesario que existan clulas en divisin y en ocasiones se pueden valorar pocas metafases (menos de 20). Por otra parte, los cromosomas pueden presentar unas bandas cromosmicas poco definidas

siendo imposible determinar el cariotipo debido a una calidad morfolgica deficiente. En este caso, no ser factible la deteccin de alteraciones cromosmicas que afecten a regiones genticas muy pequeas. Para complementar las tcnicas citogenticas convencionales, actualmente

disponemos de las tcnicas de HIS.

La base metodolgica para la realizacin de dichas tcnicas requiere de una desnaturalizacin (rotura de los enlaces que unen la doble hlice del ADN) tanto del ADN de la muestra como del ADN de la sonda utilizada (que deber ser complementario al fragmento de ADN que se desee estudiar).

Posteriormente se procede a hibridar los ADNs de la muestra y de la sonda de modo que se produzca la unin entre ambos por complementariedad de bases. El resultado de la hibridacin se interpretar microscpicamente y teniendo en cuenta el tipo de sonda utilizada. A principios de los aos 90, se introdujeron las tcnicas de HIS en el laboratorio de hematologa aplicadas al diagnstico, pronstico y seguimiento de las neoplasias hematolgicas. Los tipos de sondas aplicadas de forma rutinaria fueron las sondas centromricas (que marcan toda la regin centromrica), las sondas de pintado cromosmico (constituidas por una librera de sondas que abarcan todo el cromosoma) y las sondas de secuencia nica (locus especfico), que marcan regiones cromosmicas muy concretas. A estas sondas nos referimos como sondas de HIS convencionales por ser de uso generalizado. Recientemente, han aparecido nuevas tecnologas de HIS con el mismo fundamento con la intencin de resolver las carencias de las sondas convencionales y aportar una mayor informacin en el conocimiento del cariotipo. Dichas metodologas comprenden la tcnica de Hibridacin Genmica Comparada (HGC), de Multicolor-FISH (M-FISH) y Spectral Karyotyping (SKY) y la tcnica de Multibanding-FISH. Hibridacin in situ convencional

La HIS convencional, de aplicacin ms generalizada en el estudio de las neoplasias, se basa en la utilizacin de tres tipos principales de sondas: sondas

centromricas, sondas de pintado cromosmico y sondas de secuencia nica o tambin llamadas de locus especfico (Tabla 2). Las sondas centromricas estn formadas por una secuencia repetitiva de ADN que hibrida con el ADN de la regin centromrica del cromosoma. stas permiten detectar alteraciones cromosmicas numricas tanto sobre metafases como sobre ncleos en interfase (citogentica interfsica). Mediante esta tcnica se puede valorar la presencia o ausencia de alteraciones numricas (monosomas o trisomas) sin la necesidad de tener clulas en divisin. Las sondas de pintado cromosmico estn formadas por una batera de sondas que en su conjunto hibridan con todo el cromosoma. Dichas sondas permiten visualizar alteraciones citogenticas numricas y estructurales sobre metafases y confirmar de forma inequvoca cariotipos con translocaciones complejas o con cromosomas marcadores. El pintado cromosmico es de gran utilidad cuando los cromosomas son de mala calidad y la citogentica convencional, por si sola, no puede resolver el cariotipo. Las sondas de secuencia nica o locus especifico hibridan con el ADN de una regin genmica concreta, correspondiente a un gen o a una banda cromosmica. Con ellas es posible detectar alteraciones numricas y estructurales tanto en metafases como en ncleos interfsicos. Estas sondas son de gran utilidad para descartar alteraciones cromosmicas difciles de identificar con las tcnicas de bandeo convencionales, como translocaciones crpticas o microdeleciones.

En la Tabla 2 se muestran los tipos de sondas convencionales ms utilizadas en el estudio de neoplasias hematolgicas. En la Tabla 3 se comparan las tcnicas de HIS convencional con las nuevas tcnicas de HIS. En la Tabla 4 se resumen las recomendaciones respecto al nmero de clulas a analizar, los individuos controles a realizar y los niveles de corte para las sondas centromricas, de locus especfico y de pintado cromosmico. Nuevas tcnicas de HIS

Las tcnicas de Multicolor-FISH (M-FISH) o Spectral Karyotyping (SKY), Multibanding-FISH e Hibridacin Genmica Comparada (HGC) han aparecido

con la intencin de resolver las carencias de la HIS convencional y aportar una mayor informacin en el conocimiento del cariotipo (Tabla 3). Las tcnicas M -FISH o SKY se basan en la cohibridacin de 24 sondas de pintado cromosmico marcadas con fluorescencia sobre metafases. El resultado de la hibridacin permite visualizar simultneamente cada par cromosmico de un color diferente. Estas tcnicas son muy tiles para determinar de forma inequvoca cariotipos complejos y cromosomas no identificables con las tcnicas de bandeo (cromosomas marcadores). Esta tcnica presenta una limitacin en aquellas patologas con un ndice proliferativo bajo debido a la necesidad de obtener clulas en divisin. As mismo, estas tecnologas no permiten el reconocimiento de algunos puntos de rotura como aquellos asociados a deleciones, inserciones, adiciones y translocaciones de pequeo tamao (inferiores a 500-1500 Kb), para los cuales es necesario utilizar sondas especficas de locus. Recientemente, se ha descrito la tcnica de multibanding-FISH (RxFISH), tcnica similar a las de M-FISH o SKY, que permite la generacin de un patrn de bandas de distintos colores para cada cromosoma. Dicha metodologa se basa en las homologas genmicas que existen entre la especie humana y diferentes especies de mono. Las ventajas que ofrece respecto a las de MFISH o SKY radica en que la de Rx-FISH permite la identificacin de alteraciones estructurales dentro de un mismo cromosoma (inversiones y translocaciones) y en que los puntos de rotura de los posibles reordenamientos pueden ser localizados con mayor exactitud. As mismo, permite determinar cariotipos complejos y cromosomas no identificables con las tcnicas de bandeo (cromosomas marcadores) pero tiene la limitacin, como M-FISH y SKY, de necesitar clulas en divisin. Esta tcnica an est en fase de desarrollo y experimentacin por lo cual no existen demasiadas referencias en la literatura . La hibridacin genmica comparada (HGC), tambin llamada CGH (del ingls, comparative genomic hybridization), es una tcnica citogentica-molecular que permite detectar cambios numricos de secuencias de ADN (prdidas, deleciones, ganancias y amplificaciones) en un tejido tumoral. Dicha tcnica se basa en la hibridacin in situ del ADN tumoral y de un ADN control marcados con fluorocromos de distinto color sobre metafases normales. Despus de la

hibridacin, las variaciones numricas del ADN tumoral se cuantifican mediante el coeficiente de intensidad de fluorescencia entre el ADN tumoral y el ADN normal. La HGC tiene particular inters en el anlisis de cambios numricos de secuencias de ADN en tumores slidos y en neoplasias hematolgicas de ndice proliferativo bajo ya que para la realizacin de la tcnica no es necesaria la obtencin de metafases. As mismo, es de gran utilidad en aquellos casos que presentan cariotipos complejos con numerosos cromosomas marcadores, dobles diminutos y regiones de tincin homognea. Esta tcnica nicamente detecta cambios presentes en una proporcin elevada de clulas tumorales (50%). Por otra parte, no permite detectar translocaciones, inversiones y otras alteraciones de tipo equilibrado que no comportan ganancias o prdidas de material gentico. La realizacin de estas tcnicas requiere de un sofisticado y caro soporte informtico, por lo que su realizacin de forma rutinaria supone un gasto importante. En el momento actual, su uso debera regirse por una estrategia razonada, y aplicarse nicamente en casos muy concretos (Tabla 3).

Conclusin Los resultados citogenticos son importantes porque no slo son indispensables para el diagnostico de una enfermedad neoplsica hematolgica o tumor slido, sino tambin por su informacin de cara al valor pronstico. An existen muchas alteraciones cromosmicas que no se correlacionan con unas caractersticas clnicas determinadas. Por ello, es indispensable una completa historia clnica con el fin de determinar la correlacin entre el cambio cromosmico y el curso de la enfermedad. En los ltimos aos, la introduccin de las tcnicas de hibridacin in situ , ha representado un complemento importante para las tcnicas citogenticas convencionales. En aquellos casos en los que el ndice mittico de las clulas leucmicas es bajo (por ejemplo, en la LLC), y se quiere descartar una alteracin numrica (por ejemplo, la trisoma 12), se puede utilizar una sonda centromrica del cromosoma que se quiere estudiar, y as se puede determinar, sin la necesidad de realizar un cultivo celular ni obtener clulas en metafase, las copias que existen de un determinado cromosomas mediante el recuento de las

seales de hibridacin en los ncleos. En otros casos, si la calidad de los

cromosomas y de las bandas no es satisfactoria, se pueden aplicar sondas de secuencia nica o un conjunto de sondas para el "pintado" de un cromosoma en concreto, y determinar la existencia de una alteracin cromosmica que mediante la citogentica convencional no se puede asegurar. Por otro lado, el desarrollo de tcnicas moleculares ha introducido una nueva dimensin en el estudio y comprensin del papel de los cambios cromosmicos en la gnesis del tumor, por lo que en un futuro prximo los citogenetistas y los genetistas moleculares debern trabajar coordinados para aportar una mayor informacin sobre el origen y desarrollo del cncer. En estos momentos es muy importante la colaboracin entre la citogentica y la biologa molecular, con el fin de encontrar un mayor nmero de regiones genmicas que puedan ser

candidatas de tener actividad oncognica .

Tabla

1.

Ventajas

limitaciones

de

la

tcnica

de

citogentica

convencional y de hibridacin in situ

TCNICA

VENTAJAS

LIMITACIONES

Citogentica Aporta informacin de todos los Requiere clulas en divisin convencional cromosomas del clon neoplsico Interpretacin dificultosa en caso de obtener cromosomas de mala calidad Permite el anlisis de pocas clulas Baja sensibilidad Hibridacin in Aplicable tanto sobre Aporta informacin concreta situ metafases como sobre ncleos dependiendo del tipo de en interfase sonda utilizada Permite el anlisis de un mayor Alto coste econmico nmero de clulas Mayor sensibilidad

Bajo coste econmico

Tabla 2. Tipos de sondas utilizadas en HIS convencional. Visualizacin en metafase e interfase.

METAFASE

INTERFASE

SONDAS CENTROMRICAS

SONDAS DE PINTADO CROMOSMICO

SONDAS DE SECUENCIA NICA O DE LOCUS ESPECFICO

Tabla 3. Ventajas e inconvenientes de las tcnicas de hibridacin in situ convencionales y de las nuevas tcnicas de hibridacin in situ. VENTAJAS INCONVENIENTES . No requiere clulas en . Solo informa de alteraciones divisin numricas
HIS CENTROMRICA

HIS DE LOCUS . No requiere clulas en ESPECFICO divisin .Muy til para descifrar HIS DE PINTADO cariotipos complejos CROMOSMICO . Requiere una pequea cantidad de ADN. No requiere clulas en divisin HIBRIDACIN .Permite estudiar material GENMICA archivado (congelado, en COMPARADA parafina) .Permite detectar ganancias y prdidas de ADN en todo el genoma .Permite obtener informacin de todos los cromosomas .Muy til para descifrar cariotipos complejos

MULTICOLOR FISH-SKY

.Permite obtener informacin de todos los cromosomas MULTIBANDING .Muy til para descifrar FISH cariotipos complejos .Detecta alteraciones estructurales dentro de un mismo par cromosmico

. Solo informa del locus que se estudia .Requiere clulas en divisin .Solo informa del cromosoma concreto que se analiza .Solo se detectan alteraciones citogenticas que impliquen ganancias y prdidas de ADN .Requiere una infiltracin tumoral mnima del 50% .No permite cuantificacin de las ganancias o prdidas .No detecta ganancias de ADN menores de 4-5 Mb ni prdidas de 10-20 Mb .Requiere clulas en divisin .No detecta alteraciones estructurales dentro de un mismo par cromosmico .No detecta alteraciones estructurales de ADN menores de 500-1500 Kb .Requiere clulas en divisin .No detecta alteraciones estructurales de ADN menores de 500-1500 Kb

Tabla 4. Recomendaciones respecto al nmero de clulas a analizar, los individuos controles a realizar y los niveles de corte para las sondas centromricas, de locus especfico y de pintado cromosmico. NMERO DE CLULAS CONTROLES ANALIZADAS SONDAS CENTROMRICAS 500 10 NIVELES DE CORTE (x 3SD)* Monosomas >10% Trisomas >5% Deleciones >10% Ganancias >5% Alteraciones Estructurales>5-10% Mnimo dos metafases con la misma alteracin

SONDAS DE LOCUS ESPECFICO SONDAS DE PINTADO CROMOSMICO

100

10

10

No requiere

*A considerar por cada Laboratorio