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A cromatografia em coluna (CC) comumente citada por diversos livros e artigos acadmicos como o mais antigo procedimento cromatogrfico. Tal procedimento atribudo ao botnico russo Mikhael S. Tswett, em 1906 (BONATO, 2006). No experimento, Tswett utilizou colunas de vidro recheadas com vrios slidos finamente divididos e arrastou os componentes dos extratos de plantas e gema de ovo com ter de petrleo (BONATO, 2006). Com isso, Mikhael exibiu uma tcnica de separao de componentes de uma amostra que, desde ento, foi sendo amplamente reproduzida e difundida. A cromatografia em coluna um mtodo fsico-qumico, ou seja, no altera a natureza qumica dos componentes envolvidos. um mtodo largamente utilizado no isolamento de produtos naturais e purificao de produtos de reaes qumicas, em um volume maior que os utilizados na cromatografia planar (CASS, 1998). A tcnica da CC fundamentada, essencialmente, na polaridade relativa das molculas envolvidas. Adiciona-se coluna de vidro o adsorvente (fase estacionria), geralmente alumina ou slica gel, e a mistura a ser analisada aplicada na parte superior da coluna (CASS, 1998). A coluna cromatogrfica constituda por um tubo de vidro, em posio vertical; a extremidade superior do tubo aberta e a inferior afunilada, terminando numa torneira, onde tem-se o controle da vazo da fase mvel. Abaixo da torneira, colocam-se recipientes ou frascos coletores do eluente, cujas dimenses dependem do volume de cada frao a ser coletada. A fase que fica no interior da coluna (adsorvente) suportada, na parte inferior, por um chumao de l de vidro, ou por uma placa porosa de vidro ou Ptfe (politetrafluoretileno). O tamanho da coluna e suas dimenses dependero da quantidade de material a ser cromatografado(BONATO, 2006).
Os componentes de uma mistura movem-se com solventes pela coluna com velocidades diferentes, dependendo de fatores como a natureza de cada substncia, a natureza do solvente e a atividade do adsorvente. A separao dos constituintes de uma mistura efetuada atravs da passagem do solvente pela coluna e baseia-se na interao dos componentes da amostra e do solvente com a superfcie adsorvente. Se
o composto mais atrado pela fase estacionria do que pelo solvente, ele migrar mais lentamente da coluna. Caso contrrio, se o composto tiver maior afinidade pelo solvente ele migrar mais rapidamente da coluna, gastando menos tempo e solvente. O xito de uma coluna depender ento da escolha de um suporte e solvente adequados para a sua realizao. Em alguns casos possvel visualizar a separao dos componentes de uma mistura observando o desenvolvimento de manchas diferentes na coluna ou acompanhando com uma luz ultravioleta. Entretanto, na maioria das vezes, torna-se necessrio o acompanhamento da separao dos componentes pela tcnica de cromatografia em camada delgada (CCD). Nessa ltima, coleta-se fraes com volume predeterminados, as quais provavelmente contero os componentes da mistura separados e, para confirmao, utiliza-se a CCD.
Muitos dos adsorventes empregados em CC tambm so usados em Cromatografia em camada delgada. A diferena reside no tamanho das partculas, da ordem de 63 a
A escolha do eluente muito importante e feita baseando-se na polaridade e solubilidade entre este e a amostra. A polaridade deve ser, geralmente, menor que a do composto e o ltimo deve ser parcialmente solvel. A cromatografia em coluna tem a vantagem de se poder utilizar vrios solventes, um de cada vez, para separar diferentes componentes. Assim, em separaes simples, utiliza-se apenas um solvente para
todo o processo e em separaes mais complexas utiliza-se uma srie de solventes, em ordem crescente de polaridade.
Alm da escolha do melhor adsorvente, do melhor eluente e da melhor coluna para a anlise, necessrio ter uma ateno especial preparao da coluna adsorvente. No deve ter bolhas de ar aprisionado, j que podem criar rachaduras na coluna, formando caminho preferencial para a amostra, no ocorrendo, ento, a separao efetiva. Deve-se, tambm, deixar a superfcie superior da coluna coberta pelo eluente, j que esta pode secar e contrair, resultando em erros de anlise, ou mesmo ocasionando a perda da coluna e do material a ser analisado.