Bibliotecas Apresentadas em

PESQUISA

FAGOS

Marcelo de Macedo Brgido

Prof. Dr., Grupo de Imunologia Molecular UnB Lab. Biologia Molecular / departamento de Biologia Celular brigido@unb.br

Fotos e ilustraes cedidas pelos autores

Andra Queiroz Maranho

Profa. Dra., Grupo de Imunologia Molecular UnB Lab. Biologia Molecular / departamento de Biologia Celular andreaqm@unb.br

Phage Display Libraries

Figura 1 - Organizao estrutural de uma partcula viral do bacterifago M13 (Kischenko et al., 1994, com modificaes). O vrion tem cerca de 9.300 de comprimento e 65 de dimetro. A extremidade do vrus, que montada primeiro (distal), recoberta por cinco cpias de p7 (33 resduos de aminocidos) e cinco molculas de p9 (32 resduos de aminocidos). A extremidade proximal, que montada por ltimo, possui cinco cpias de p6 (113 resduos de aminocidos) e cinco de p3 (406 resduos de aminocidos). Entre as duas extremidades o DNA circular e de fita simples (ssDNA) recoberto por milhares de cpias de p8 (50 resduos de aminocidos)
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urante os ltimos anos, uma nova perspectiva da Biologia Molecular tem atrado diversos grupos de pesquisadores: o desenvolvimento de novas biomolculas com o objetivo de se obter frmacos, vacinas e outras drogas de interesse biotecnolgico. A grande maioria dos processos biolgicos envolve contatos entre superfcies macromoleculares (enzimasubstrato, receptores-efetores, protenas - cidos nuclicos, etc.) que so resultantes das foras fsico-qumicas caractersticas dessas superfcies contactantes. Dessa forma, pode-se afirmar que a evoluo molecular se manifesta pela busca do aprimoramento de tais interaes, seja no intuito de favorec-las ou no, mas procurando sempre a manuteno do equilbrio do sistema vivo. Na natureza, esse fenmeno ocorre como um processo de tentativas e erros, onde subpopulaes de variantes da populao primordial so selecionadas, positiva ou negativamente. Assim, a evoluo molecular natural um processo que demanda longos perodos de tempo, uma vez que a seleo exercida sob um pequeno nmero de variantes (Kenan et al., 1994). Atualmente possvel aplicar, em laboratrio, mtodos que visem a dirigir artificialmente a evoluo molecular em funo de objetivos prdeterminados. Em oposio aos mecanismos naturais, as metodologias realizadas in vitro abreviam o tempo requerido, selecionando populaes moleculares compostas pelo maior nmero possvel de variantes. Uma das metodologias mais empregadas atualmente a construo de bibliotecas conformacionais, que so definidas como

uma populao de ligantes em potencial, composta por (bio)molculas de formas variantes. Cada membro da biblioteca apresenta uma forma distinta, que determinar a capacidade de interao deste com uma molculaalvo. Quanto maior for o nmero de formas representadas na biblioteca, mais facilmente ser encontrado um ligante afim (Posner et al., 1994). Vrios tipos de bibliotecas conformacionais foram descritos, com a utilizao de diversas estratgias; entre essas, destacam-se aquelas sintetizadas quimicamente, como as de oligonucleotdeos e de peptdeos fixos ou em soluo (revisadas por Kenan et al., 1994), e as produzidas em sistemas vivos, como as leveduras, bactrias ou bacterifagos filamentosos (revisadas por Scott,1993). Bacterifagos Filamentosos Os fagos filamentosos (M13, f1, fd, entre outros) pertencem famlia Inoviridae de bacterifagos e possuem como material gentico DNA fita simples (ssDNA). A infeco viral ocorre via pilus sexual de clulas bacterianas gram negativas que apresentam o gene desta fmbria especial codificado pelo plasmdio F. A liberao das partculas virais, que so produzidas a cada ciclo se realiza a partir da extruso do DNA atravs da membrana. Em nenhum destes dois processos ocorre lise celular. A partcula viral esquematizada na figura 1 composta pelo genoma viral e por cinco protenas estruturais. No capsdio do fago esto presentes as protenas p3, p6, p8, p7 e p9. No fago selvagem, encontram-se cerca de 2.800

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Figura 2 - Esquematizao do ciclo infectivo de bacterifagos filamentosos. Os fagos filamentosos infectam clulas de bactrias Gram negativas atravs da interao de p3 adesinas do pillus sexual. Aps este contato inicial, o DNA fita simples entra dentro da clula e convertido a DNA fita dupla ou RFDNA. Ao assumir essa conformao, a sntese de protenas virais se d utilizando-se a maquinaria celular. As novas partculas virais so montadas a partir da extruso do DNA fita simples pela membrana celular, onde esto localizadas as protenas virais estruturais (Webster, 2000)
cpias da protena 8 (p8), que formam o corpo do capsdio cilndrco e flexvel. Nas extremidades desse capsdio encontram-se de trs a cinco cpias das demais protenas estruturais. A extremidade distal contm as protenas p7 e p9, enquanto que a proximal composta pelas protenas codificadas pelo gene 3 (p3) e pela protena p6. O dimetro da partcula viral de cerca de 65 e o seu comprimento depende do tamanho do genoma encapsulado, sendo que cada nucleotdeo do ssDNA confere 1,435 de comprimento ao ser envolvido por p8, e as protenas minoritrias contribuem com cerca de 175 . (Makowisk, 1993). A incorporao de protenas exgenas na superfcie dos fagos filamentosos faz-se fusionando-se esses peptdeos com protenas estruturais das partculas virais. As duas principais protenas utilizadas para esse fim so a protena p8 e a p3. O ciclo infectivo dos fagos filamentosos (figura 2) iniciado pela ligao da protena p3 extremidade dos pili da clula bacteriana. Em seguida, ocorre a internalizao do ssDNA viral (denominado fita +), que atua como molde para a sntese da fita complementar (denominada -) dentro da hospedeira, originando um DNA de fita dupla, correspondente forma replicativa (RFDNA). O RFDNA capaz de dirigir a sua replicao, a produo de ssDNA, bem como a sntese de mRNA viral, utilizando-se, para tanto, da maquinaria enzimtica da hospedeira. Os vrions formados so montados pela extruso do ssDNA atravs do envelope bacteriano, sem lisar a clula ou impedir sua diviso. Aps atravessar a membrana, o DNA viral passa a ser revestido pelas protenas estruturais, completando assim a montagem da partcula viral, que ento liberada para o sobrenadante da cultura (Smith & Scott, 1993). A principal protena estrutural utilizada para a apresentao de protenas a protena 3. Responsvel pela adeso da partcula viral ao pilus sexual, o produto do gene III dos fagos filamen-

tosos corresponde maior das protenas estruturais, com uma massa molecular de cerca de 42 kDa na sua forma madura. Essa protena sintetitizada sob a forma de um precursor contendo peptdeo sinal, que clivado durante a passagem atravs da membrana. A protena 3 (p3) associa-se ao capsdio viral atravs de 23 resduos de aminocidos hidrofbicos prximos extremidade C-terminal. O produto do gene III contm ainda dois arranjos repetitivos do motivo Ser-Gly-Gly-Gly ou SerGlu-Gly-Gly-Gly, localizados a 70 e a 215 resduos de aminocidos da extremidade N-terminal. Esses arranjos so responsveis pela aparente flexibilidade da molcula (Makowski, 1993) Em 1984, Crissman e Smith estabeleceram o papel funcional dos domnios amino e carboxi de p3, sendo a poro N-terminal requerida para a infectividade viral, enquanto que a Cterminal desempenha papel na morfognese das partculas. Em 1985, Smith mostrou que era possvel inserir um gene inteiro entre os dois domnios de p3 e que esta ainda era capaz de manter ambas as funes. Mais surpreendente ainda era o fato de que a seqncia exgena era incorporada partcula viral e apresentada de forma acessvel ao reconhecimento molecular. Isso demonstrava que determinantes antignicos, presentes na protena exgena fusionada p3 eram apresentados na superfcie da partcula viral. Esses trabalhos levaram proposio de que bibliotecas conformacionais de peptdeos ou mesmo de protenas poderiam ser construdas por meio da manipulao do gene III, assim como do gene VIII de bacterifagos filamentosos (Smith, 1993). Outra possibilidade de apresentao utilizar-se do principal constituinte do capsdio de fagos filamentosos, a protena p8. Essa protena tem uma forma cilndridica e composta por 50 resduos de aminocidos. Tambm sintetizada como uma pr-protena a partir da expresso do gene VIII. Quando ancorada membrana celular pelo peptdeo sinal, expe o seu domnio C-terminal para o periplasma. medida que ocorre a extruso do DNA viral, p8 vai sendo incorporada no vrion emergente. No vrus, a poro C-terminal aparece prxima ao ssDNA, enquanto a N-terminal, dotada de grande
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tam duas cpias do gene viii, uma selvagem e uma de fuso (Webster, 2000). Apresentando Peptdeos na Superfcie dos Fagos A possibilidade de expresso de uma protena de fuso no capsdio de fagos, de maneira acessvel ao reconhecimento por um ligante, abriu o caminho para a construo de bibliotecas conformacionais apresentadas na superfcie dessas partculas virais. Os vrus, cujos genomas so manipulados de forma a apresentarem em seus capsdios o polipeptdeo exgeno fusionado com uma de suas protenas estruturais, so denominados fagos de fuso. Nas bibliotecas construdas em fagos filamentosos, a seleo de formas, com maior ou menor afinidade, por um ligante alvo feita misturando-se fagos de fuso, produzidos e liberados para o sobrenadante de cultura de clulas infectadas, com a molcula reconhecida pelo peptdeo recombinante fixa em um suporte. A figura 3 mostra um esquema onde uma placa de microtitulao foi recoberta com um ligante; em seguida, incubaram-se fagos de fuso apresentando uma biblioteca de formas de peptdeo exgeno fusionadas protena 3. Durante os procedimentos de lavagem, os fagos capazes de reconhecer o ligante com o qual a placa foi sensibilizada, so retidos. Os fagos selecionados podem ser obtidos atravs de condies de eluio que desfavoream a ligao desses com a molcula presa ao suporte, e aps a sua amplificao por meio de infeco de clulas de E. coli, os fagos selecionados podem ser utilizados em novos ciclos de seleo. A cada procedimento de seleo, formas mais afins do peptdeo exgeno so obtidas, ocorrendo o processo de maturao da afinidade (Lowman & Wells, 1993). Devido s diferenas nas quantidades de p3 e p8 presentes nas partculas virais de fuso, as bibliotecas apresentadas no contexto da protena 8 so ditas multi ou polivalentes, uma vez que vrias cpias da protena de interesse so incorporadas ao capsdio dos fagos, e aquelas que se utilizam de p3 so denominadas monovalentes, em virtude da presena de, no mximo,

Figura 3 - Seleo de ligantes de uma biblioteca utilizando-se o antgeno adsorvido em placa de microtitulao. Bibliotecas de formas variantes do gene de interesse so obtidas e clonadas em fagomdios para incorporao do peptdeo ao capsdio viral. As partculas virais de fuso apresentando a biblioteca so produzidas e colocadas em contato com ao antgeno fixado a um suporte. Sucessivas lavagens so realizadas e os fagos remanescentes so eludos da placa e amplificados por meio de infeco de clulas bacterianas

flexibilidade, fica exposta ao solvente, sendo essa ltima aquela que manipulada para apresentar peptdeos exgenos (Smith & Scott, 1993). Inicialmente acreditava-se que apenas bibliotecas de peptdeos (de, no mximo, 6 a 8 resduos de aminocidos) podiam ser apresentadas pela protena VIII. Isso vlido nos sistemas de apresentao onde todas as protenas 8 so de fuso, no existindo
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misturas com protenas selvagens. Polipeptdeos de maior massa molecular podem ser apresentados ao longo do capsdio do bacterifago, fusionados a p8, desde que p8 selvagem (em torno de 80%) seja fornecida ao sistema. Esse tipo de construo pode ser alcanado quando fagomdios so utilizados (a protena selvagem sintetizada a partir do genoma do fago auxiliar), ou quando os vetores virais apresen-

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Figura 4 - Representao esquemtica de um fagomdeo hipottico para a construo de bibliotecas conformacionais na superfcie de partculas virais
trs cpias das protenas de fuso. Essas diferenas nas quantidades podem ser exploradas em momentos distintos da seleo de bibliotecas: pode-se assegurar seleo de formas de menor afinidade, utilizando-se bibliotecas multivalentes e, em seguida, submet-las a um refinamento da afinidade em sistemas monovalentes (Wells, 1996). Vetores Tanto o gene VIII quanto o gene III vm sendo utilizados para a expresso de bibliotecas conformacionais em bacterifagos filamentosos. Diversas estratgias tm sido descritas para a manipulao desses genes com vistas obteno de sistemas eficientes para a expresso das bibliotecas (Smith, 1993). Uma das formas encontradas para se superar os problemas de manipulao do DNA viral foi a utilizao de fagomdios, que so plasmdios que possuem, alm da origem de replicao ativa em E. coli, a origem de replicao fagos filamentosos, que contm todos os elementos para a sntese da fita complementar e replicao viral, bem como o sinal de empacotamento do DNA fita simples. Nesses sistemas, clulas transformadas com o fagomdio so infectadas por um fago auxiliar (helper), que contm todos os genes do bacterifago filamentoso, permitindo o resgate do fagomdio sob a forma de partcula viral. Durante a infeco viral, o ssDNA proveniente dos fagomdios revestido por protenas estruturais preferencialmente ao ssDNA originado pelo helper. Isso ocorre porque os fagos helper apresentam mutaes na seqncia que forma o grampo, as quais dificultam o empacotamento de seu prprio material gentico (Webster, 2000). O fagomdio construdo para apresentao de bibliotecas conformacionais na superfcie de fagos filamentosos manipulado de forma a expressar os diversos peptdeos quimricos, fusionados a um dos genes III ou VIII. Quando ocorre a infeco com o fago auxiliar, os capsdios so montados contendo misturas de p3 ou p8 selvagem (codificadas pelo auxiliar), e protenas quimricas (expressas a partir de um dos genes III ou VIII fusionados, contidos no fagomdio), gerando uma prognie de fagos de fuso. Nas clulas reinfectadas por esses fagos de fuso, os fagomdios podem ser obtidos sob a forma de plasmdios bacterianos (fita dupla - RFDNA) podendo assim ser amplificados, purificados e novamente manipulados (Breitling et al., 1991). A utilizao de fagomdios, como vetores para a construo de bibliotecas tem sido bastante difundida (Dbel et al., 1993). A maior vantagem desse sistema a possibilidade do gene da protena de fuso se propagar na forma de um plasmdio. Dependendo do promotor utlilizado, esse gene pode ser amplificado de forma regulada at o momento da infeco com o fago auxiliar, reduzindo o nmero de mutantes selecionados negativamente. Os fagomdios transformam E. coli de forma mais eficiente que o RFDNA e a partcula viral formada a partir de seu ssDNA, de menor tamanho que a originada pelos vetores do tipo fago, mais estvel, dissociando-se menos facilmente dos ligantes imobilizados (Breitling et al., 1991). O esquema geral de um fagomdio utilizado para a produo de bibliotecas na superfcie de bacterifagos filamentosos est representado na figura 4. Dentre os elementos constituintes mais importantes, destacam-se: as origens de replicao de E. coli e de fagos, o gene que confere resistncia a antibitico, o promotor que dirige a transcrio do gene de fuso e a seqncia lder responsvel pela citolo47

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Tabela 1 - Exemplos de Utilizao de Bibliotecas Apresentadas em Fagos Biblioteca Pequenos Peptdeos Randmicos (at 20 resduos de aminocidos, sendo de 6 a 8 randmicos) Finalidade / Espcie Molecular Mapeamento de stios enzimticos Mapeamento de Epitopos Agonistas e antagonistas de biomolculas Identificao de mimotopos Peptdeos ligantes a cidos nuclicos Peptdeos com potencial para vacinao Endereamento endotelial Receptores celulares Enzimas: -lactamase tripsina Inibidores de Proteases Inibidores da coagulao sangnea Domnio de ligao ao HIV do CD4 humano Hormnios Anticorpos: Fab scFv Humanizao de Anticorpos Protenas obtidas a partir de bibliotecas de cDNA Construo de fatores transcricionais Estabilizao de Protenas
apresentadora de protenas exgenas (Posner et al., 1994). Dessa forma, a utilizao de promotores muito fortes, como os virais, deve ser evitada a menos que esses possam ser mantidos sob represso at o momento da produo da partcula viral recombinante. As seqncias codificadoras para o peptdeo sinal so responsveis pelo encaminhamento da protena de fuso para a membrana celular. Deve-se ressaltar que a translocao total atravs da membrana celular no ocorre, uma vez que o domnio C-terminal de p3 permanece inserido nesse compartimento celular at que o produto de fuso seja incorporado ao capsdio do vrion emergente (Breitling et al. 1991). Entre as seqncias lderes descritas, a mais usada a pel B (Hoogenboom et al., 1991). Vantagens sobre outros sistemas de seleo. Quando comparadas s bibliotecas de expresso construdas em sistemas como gt11, os sistemas utilizando fagos filamentosos apresentam vrias vantagens. A primeira delas que fagos filamentosos no lisam as clulas infectadas, o que possibilita a separao de partculas virais do contedo intracelular, eliminando-se assim mui-

Referncia Cheadle et al., 1994 Hoess et al., 1995; Wang et al., 1995 Smith et al., 1993; South et al., 1995 Folgori et al.,1994 Wu et al., 1995 Stoute et al., 1995 Pasqualini & Rouslahti, 1996 Scarseli et al., 1993; Robertson, 1993 Soumillion et al., 1994 Corey et al., 1993 Roberts et al., 1992 Pannekoek et al., 1993 Abrol et al., 1994 Lowan & Wells, 1993 Zebedee et al., 1992; Maranho & Brgido, 2000; Ward,1993 Wang et al., 2000 Barth et al., 2000 Beerli et al.,2000 Chakravarty et al., 2000
to da reatividade cruzada com protenas celulares. Assim, enquanto a varredura de clones em sistemas tradicionais (que lisam as clulas) requer o ligante puro (Rapoport et al., 1995), tal no exigido quando so utilizadas bibliotecas apresentadas na superfcie de partculas virais. Bibliotecas construdas na superfcie de fagos j foram capazes de ser selecionadas at pela interao do fago de fuso com superfcies de clulas em cultura, e mesmo diante da complexidade de formas presentes nesse tipo de superfciealvo, as partculas foram capazes de interagir com o ligante especfico (Meulemans et al. 1994; Edwards, et al., 2000). Outra caracterstica importante que essa nova metodologia utiliza os mais rpidos protocolos de seleo j descritos, e possibilita a varredura de at 108 clones por ciclo de seleo. Esse mtodo mais rpido porque o sobrenadante das culturas infectadas, contendo de 1010 a 1013 clones por mL, pode ser utilizado diretamente para a seleo. Essa utilizao prescinde da transferncia para membranas, que, alm de limitar o nmero de clones (limitao de rea) do filtro, um processo extremamente trabalhoso. O alto nmero de variantes gerados nas bibliotecas apresentadas na super-

Grandes Polipeptdeos

calizao do produto de fuso. As origens de replicao so seqncias gnicas que so reconhecidas pela maquinaria celular ou viral para produzir cpias do fagomdio. A origem de E. coli mais usada nos vetores j construdos a col E1, derivada dos plasmdios tipo pUC, responsvel pelo alto nmero de cpias do fagomdio na clula, em sua forma plasmidial (dupla fita). A origem de fago corresponde regio intergnica encontrada no genoma dos vrus. Essa seqncia capaz de, com o auxlio das enzimas celulares, transformar o fagomdio de ssDNA (forma infectante, empacotada no capsdio viral) em forma replicativa e vice-e-versa (Allen Jr. et al.,1993). Assim, quando a clula contendo o fagomdio infectada pelo fago auxiliar para a produo de partculas virais, ocorre a replicao do DNA plasmidial pelo mecanismo de crculo rolante, dando origem ao DNA fita simples, que migra para a membrana celular para ser revestido por protenas do capsdio. As seqncias promotoras utilizadas para dirigir a sntese do produto de fuso nos vetores tm sido as mais diversas. Acredita-se que a estequiometria entre protenas de fuso e protenas selvagens seja um importante fator na estabilidade da partcula viral
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fcie do capsdio de fagos permite a mutao randmica simultnea de at 6 cdons de aminocidos, possibilitando que as (~2x106) formas possam ser submetidas a ciclos de seleo de uma s vez (Lowman & Wells, 1993). Vale a pena ressaltar que, ao se isolar o fago atravs do fentipo (capacidade de ligao a uma molcula-alvo) apresentado em seu capsdio, isola-se tambm o gentipo codificador dessa caracterstica. Isso ocorre uma vez que o ssDNA do fagomdio ou fago de fuso empacotado no capsdio da partcula que apresenta o peptdeo exgeno. Apesar das vantagens aqui apresentadas, existem alguns relatos que apontam problemas na utilizao desses sistemas de expresso/seleo. O primeiro problema diz respeito instabilidade observada em bibliotecas que apresentam alguns tipos de anticorpos, e, alm disso, h autores que consideram que o passo de amplificao, que envolve uma transfeco viral, possa ser um empecilho (Rapoport et al., 1995). Outros relatam tambm problemas de crescimento celular nas culturas que expressam a protena de fuso, o que poderia ocasionar uma relativa tendenciosidade da biblioteca, que passaria a expressar, preferencialmente, as formas mais toleradas pela bactria (Kenan et al., 1994). A despeito desses problemas as bibliotecas apresentadas em fagos (phage display libraries), em conjunto com o procedimento de seleo (biopanning), so uma metodologia consagrada na literatura. Diversos exemplos delas e seus principais resultados esto listados na Tabela I. Outros fagos tambm j foram utilizados para apresentao de protenas exgenas em seus capsdios: baculovrus (Lindley etal., 2000), bacterifago (Zhang et al., 2000) e vrus da hepatite B (Kratz et al., 1999). Alguns ajustes tambm foram propostos. Entre esses, destaca-se a utilizao de bibliotecas fusionadas poro infectiva da protena III, acoplando-se assim a seleo de ligantes com capacidade infectante da partcula selecionada (Krebber et al., 1997), a regulao da expresso com a utilizao de diferentes promotores (Huang et al., 2000), a obteno de mutantes de pVIII para melhorar a expresso de grandes polipeptdeos (acima de 100 kdA) de forma multivalente (Sidhu et al., 2000) alm da otimizao

de mtodos de seleo utilizando-se a superfcie de clulas em cultura como alvo da seleo (Watters et al., 1997; Edwards, et al., 2000). Entre os trabalhos que se utilizam dessa tcnica com aplicabilidade e potencial teraputico, destaca-se o estudo de endereameto de tumores. Esse estudo vem sendo explorado por experimentos de seleo in vivo, utilizando-se bibliotecas de peptdeos expressas na superfcie de bacterifagos filamentosos (Pasqualini & Ruoslahti, 1996; Johns et al., 2000). As bibliotecas so injetadas por via intravenosa na cauda de camundongos e, aps a sua circulao na corrente sangnea, o animal sacrificado e os seus rgos so retirados. Os fagos que conseguiram romper a barreira endotelial so obtidos desses rgos e caracterizados. A partir desses estudos, vrias aplicaes envolvendo qumio e radioterapia especficas tm sido propostas. Alm disso, busca-se a associao entre os peptdeos expressos em fagos e aqueles presentes na superfcie de clulas tumorais metastsicas visando ao desenho de drogas capazes de impedir a migrao e, conseqentemente, a metstase. Outro campo importante que se abriu nos ltimos anos foi a possibilidade de se desenharem fatores transcricionais totalmente in vitro a partir de bibliotecas de zinc fingers e de seleo com diferentes oligonucleotdeos. Esses experimentos resultaram no isolamento de domnios proticos capazes de reconhecer seqncias especficas de DNA. Utilizando-se essas protenas artificiais, selecionadas por Phage Display, j foi possvel ligar e desligar genes in vivo de plantas (Beerli et al., 2000). Resumidamente, pode-se dizer que as bibliotecas conformacionais - apresentadas no capsdio de fagos filamentosos - tm emergido como poderoso instrumento em diversas reas de pesquisa, desde as mais bsicas, como o estudo de estruturas biomolculas, at obteno e o desenho de novos frmacos e vacinas contra diferentes doenas (Medynski, 1994). Bibliotecas combinatrias de anticorpos Uma das molculas mais utilizadas

para a construo de bibliotecas em fagos filamentosos so as imunoglobulinas. Os anticorpos so protenas envolvidas na resposta imune a agentes infecciosos e so investigados sistematicamente por seu envolvimento na homeostase do organismo vertebrado e por seu potencial biotecnolgico. A utilizao de anticorpos na medicina teraputica e na propedutica vem crescendo nos ltimos anos e certamente tero um grande impacto na medicina deste novo sculo. Os anticorpos so obtidos in vivo por um processo de seleo natural induzida pela presena do imungeno acompanhado por linfcitos, gerando anticorpos de alta afinidade a um dado antgeno. exatamente esse mecanismo de seleo in vitro que chamou a ateno dos pesquisadores no sentido de adaptar anticorpos s bibliotecas combinatrias em fago. Assim como os anticorpos, que so selecionados in vivo por um imungeno externo, os fagos so selecionados in vitro por um ligante. Essa analogia entre os dois processos foi inicialmente comentada por Winter e seus colegas, em 1992 (Hoogenboom & Winter, 1992) e, desde l, a obteno de anticorpos recombinantes nos sistemas apresentados em fagos tem sido cada fez mais freqente. Neste sentido admite-se que os anticorpos recombinantes obtidos por apresentao em fago seriam representativos da resposta imune. Esse conceito , no entanto, falho, pois no considera que o processo de seleo em fago seja influenciado por outros parmetros muito distintos daqueles encontrados no organismo. Por outro lado, com um sentido pragmtico, a obteno de anticorpos com especificidade e afinidade compatveis queles obtidos in vivo possvel. O desempenho do reagente obtido quanto a sua capacidade de reconhecimento do antgeno depende de dois fatores fundamentais: o tamanho da biblioteca inicial, isto , a capacidade de representar o repertrio do animal imunizado; e o procedimento de seleo utilizado. Vrias estratgias tm sido utilizadas para se alcanar esse xito e elas se baseiam em obter uma biblioteca inicial de tamanho igual ou superior ao repertrio imune (em torno de 107), buscando melhor eficincia de transformao e de amplificao
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dos genes variveis dos anticorpos. Os anticorpos maduros so o resultado da combinao de genes variveis que so associados em um processo,do qual resulta uma alta variabilidade. Essa combinao de genes associada maturao de afinidade permite aos anticorpos uma capacidade de ligao a um nmero ilimitado de formas. Sendo assim, uma biblioteca de anticorpos representativa contm formas ligantes a um nmero virtualmente ilimitado de antgenos. Em nosso grupo de trabalho, adaptamos bibliotecas de anticorpos em fago para explorar questes bsicas (Maranho & Brgido, 2000) e para obteno de reagentes com aplicao biotecnolgica. Com um vis acadmico, utilizamos essa tcnica para comparar a seleo de famlias de genes variveis por determinado antgeno, com a resposta imune in vivo. Tentamos, com isso, observar se, fora do contexto in vivo, conseguiramos observar uma tendncia na associao de certos antgenos com anticorpos derivados de determinadas famlias de genes variveis. Caso haja alguma associao, teremos uma forte evidncia de como o antgeno seleciona o repertrio observado in vivo. Por outro lado, bibliotecas combinatrias esto sendo utilizadas para selecionar anticorpos de alta afinidade especficos para detectar antgenos de tumor sseo. A partir do repertrio natural de pacientes com osteosarcoma, procuramos encontrar anticorpos que auxiliem o diagnstico dessa doena e que possam ser eventualmente utilizados na teraputica como agentes anti-tumorais. Estamos tambm atuando na rea de biotecnologia agronmica, onde procuramos desenvolver anticorpos eficientes na neutralizao de enzimas de nematides envolvidas na infestao de determinados tipos de cultivos. A idia introduzir genes sintticos, codificadores desses anticorpos, no genoma de hortalias no intuito de se obterem plantas transgnicas, que, produzindo o anticorpo neutralizante, tornem-se resistentes aos parasitas. Perspectivas O estudo da tecnologia de apresentao de bibliotecas combinatrias na superfcie de bacterifagos, que data
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de 17 anos, j mostrou o seu potencial na produo de novas formas com capacidade ligante a um grande nmero de molculas. Espera-se que nos prximos anos essa tcnica venha a representar uma tcnica corriqueira de ampla divulgao entre os pesquisadores. Nesse contexto, torna-se importante ressaltar que essa tcnica complementa a atual onda de projetos genmicos, onde se gera um grande volume de informao, mas com pouca interpretao em nvel fenotpico. Com a tcnica de apresentao em fago, podemos agora testar genes de interesse em grande escala, na busca de um conjunto de protenas que interagem, e que vem sendo chamado de interatoma. A busca desses interatomas promete expandir os limites criados com os projetos genmicos e permitem agora inferir acerca de como esses genes se relacionam, explicando o indivduo fenotipicamente. Nesse contexto, a tcnica de apresentao em fago poder ser amplamente utilizada. Portanto, espera-se, que nos prximos anos, venhamos a considerar um papel corriqueiro a tcnica de apresentao em fago. Referncias Bibliogrficas Abrol, S., Sampath, A., Arora, K. & Chaudhary, V. K. (1994). Construction and characterization of M13 bacteriophages displaying gp 120 binding domains of human CD4. Indian J. Biochem. & Biophys., 31: 302-309 Allen Jr., G. C., Dixon, N. E. & Kornberg, A. (1993). Strand switching of replicative DNA helicase promoted by the E. coli primossome. Cell, 74: 713-722. Barth, S., Weidenmller, M.K., Schimidt, M.F.G. & Engert, A. (2000). Combining phage display and screening of cDNA expression libraries: a new approach for identifying the target antigen of an scFv preselected by phage display. J. Nol. Biol, 301:751-757 Beerli, R.R., Dreier, B. & Barbas III, C.F. (2000). Positive and negative regulation of endogenous genes by designed transcription factors. Proc. Natl, Acad. Sci. 97:1495-1500. Breitling, F., Dbel, S., Seehaus, T., Fuchs, P., Braunagel, M., Klewin-

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