Universidad Nacional Andrs Bello Laboratorio Qumica Analtica e Instrumental QUI-141 Profesora: Karina Gonzlez

LABORATORIO 10:

Separacin de aminocidos por

cromatografa en capa fina

Integrante: Eduardo Valderrama Curso: QUI141 Seccin 03 Fecha de entrega: sbado 9 de Noviembre del 2013

Introduccin
En la cromatografa en capa fina es un mtodo de separacin que emplea una placa de vidrio o una lamina metlica, que se cubre con una pelcula de unos 250 um de espesor de un adsorbente (gel de slice u oxido de aluminio, entre otros). A continuacin, de forma anloga a la cromatografa de papel, se sita en un extremo inferior la disolucin de las sustancias que se van a separar. Esta separacin se lleva a cabo en una cubeta, que contiene un agente eluyente hasta una altura de 0,5cm; las sustancias que se separen se detectan posteriormente de forma apropiada. Por variacin y preparacin adecuada de la capa de adsorcin se consigue el anlisis de mezclas de sustancias tanto hidrfilas como lipfilas. La mayor ventaja de este mtodo es, junto a su gran capacidad de separacin, la rapidez del proceso que, en general, requiere solamente 10-30 minutos. La cromatografa en capa fina resulta adecuada tanto para la separacin de vitaminas, terpenos, esteroides y pigmentos como para la de aminocidos, azcares, nucletidos, cidos nucleicos, alcaloides, medicamentos e incluso para la de aniones y cationes inorgnicos. El proceso de separacin tambin se puede llevar a cabo por medio de la electroforesis o una combinacin electroforesis-cromatografa, cuando se trata de identificacin de sustancias de alto peso molecular. El uso de la cromatografa en capa fina o de la electroforesis son adecuados para averiguar el nmero y la cantidad relativa de los diferentes aminocidos presentes en una muestra (anlisis cualitativo), aunque para los anlisis cuantitativos es necesario la cromatografa de gases o un analizador de aminocidos. Una importante aplicacin de la cromatografa en capa fina es la de servir como gua para el desarrollo de las condiciones ptimas para realizar separaciones por cromatografa de lquidos de columna. Proporciona una idea rpida de los aminocidos mayoritarios existentes en la muestras. Las ventajas de este procedimiento son la rapidez y el bajo costo de los ensayos experimentales. De hecho, algunos cromatografstas son de la opinin de que los ensayos en capa fina deberan preceder siempre al uso de la columna. Antes de realizar la cromatografa, es necesario eliminar las sustancias que interfieren, tales como protenas, carbohidratos y sales, lo que puede hacerse con una resina de intercambio inico. Los aminocidos retenidos pueden eluirse a continuacin aadiendo a la columna un pequeo volumen de aminocido y lavando despus con agua destilada. La separacin de los aminocidos se basa en que estos se reparten de modo diferencial entre la fase mvil y la fase estacionaria. Generalmente se realizan por el procedimiento ascendente: introduciendo el borde inferior de la placa cromatografa en el eluyente que ser succionado por accin de las fuerzas capilares del recubrimiento de la superficie de la placa. La identificacin de un aminocido se realiza comparando los valores de Rf (factor de retaso: cociente entre la distancia recorrida por el compuesto desde el origen y la distancia recorrida por el solvente desde el origen), con otros tomados como referencia para establecer su identidad con un cierto grado de seguridad. La naturaleza de los aminocidos es un factor importante a la hora de elegir un disolvente, ya que los diferentes solventes pueden permitir una mejor resolucin de los componentes cidos, bsicos o neutros. En general, aumentando la proporcin de agua en el disolvente se incrementan los valores de Rf e introduciendo pequeas cantidades de amoniaco aumentan los valores del factor de retraso de los aminocidos bsicos. Algunos disolventes contienen compuestos nocivos, por ejemplo el fenol, lo que restringe su uso rutinario. La composicin qumica del disolvente puede tambin limitar el rango de reactivos de localizacin que pueden aplicarse satisfactoriamente. Por ejemplo, al acido sulfanlico no puede utilizarse con disolventes fenlicos.

Objetivos
Conocer y aplicar la tcnica de cromatografa en capa fina, sus caractersticas y factores que en ella intervienen. Calcular los valores de Rf de varias sustancias (aminocidos). Deducir, mediante los valores de Rf calculados, la relacin que existe entre la polaridad de las sustancias que se analizan y la de los eluyentes utilizados. Aplicar la tcnica de cromatografa de capa fina como criterio de pureza de las sustancias. Aplicar la tcnica de cromatografa de capa fina (TLC) como criterio parcial de identificacin de sustancias. Adquirir la destreza en la aplicacin de muestras sobre cromatofolios. Utilizar mtodos fsicos y qumicos de localizacin de manchas. Determinar la composicin cualitativa de una muestra problema.

Parte experimental
1. Materiales y reactivos:

Tubos de ensayo Gradilla 7 capilares de vidrio Regla de 40 cm Gafas de seguridad Guantes Muestra problema (aminocidos) 6 Soluciones estndares de aminocidos (AA) Lpiz grafito

4 Placas para cromatografa de 10x10 cm (cromatofolios) Cmara cromatogrfica Aspersor Estufa de secado a 105C Solucin de ninhidrina (0.2% en etanol) Fase mvil A: Solucin n-propanol: NH3 (7:3) Fase mvil B: Solucin n-butanol: CH3COOH:H2O (6:2:2)

2. Mtodos y Condiciones Experimentales: Sembrado de muestras y patrones de caracterizacin: En el inicio del presente prctico se realiz el sembrado de muestras y patrones de caracterizacin en cuatro placas cromatogrficas de slice de 10 x 10 cm (cromatofolios) entregadas previamente. Para esto, en cada placa se marc suavemente con un lpiz grafito la lnea de origen a una distancia de 1 cm desde el borde inferior del cromatofolio, procurando de no levantar la slice. Adems de marcar esta lnea, se marc tambin con el lpiz grafito una lnea superior (frente de disolvente) a una distancia de 1 cm desde el borde superior del cromatofolio. Una vez marcadas ambas lneas, se marc nuevamente con el lpiz grafito las posiciones del sembrado a realizar sobre la lnea de origen, de modo que la distancia entre las posiciones de cada patrn de aminocido sea la misma siempre (1 cm aproximadamente).

Posteriormente se realiz el sembrado propiamente tal. Para esto se dispuso de una gradilla con siete tubos de ensayos rotulados, seis de ellos con distintos aminocidos en su interior, y un tubo correspondiente a la muestra problema de aminocidos: Identificacin AA1 AA2 AA3 AA4 AA5 AA6 MP Nombre de Aminocido Triptfano Histidina cido Glutmico Glicina Leucina Arginina Muestra Problema

Luego, para el sembrado se introdujo un capilar de vidrio en la respectiva solucin a sembrar y se esper a que el nivel del lquido fuera suficiente. Posteriormente, el lquido se deposit en su posicin correspondiente sobre la lnea de origen, tocando la misma, manteniendo el capilar en posicin perpendicular. Esto se realiz quince veces con cada solucin y la muestra problema, en sus respectivas posiciones, esperando siempre que las manchas estuvieran secas entre aplicacin y aplicacin, para as evitar la difusin en el origen. Las posiciones (P) de cada aminocido y muestra problema en todas las placas fue la siguiente:

P.1

P.2

P.3

P.4

P.5

P.6

P.7

AA1 AA2 AA3 AA4 AA5 AA6 MP

Preparacin de la cmara cromatogrfica: Las cmaras cromatogrficas para las placas ya se encontraba previamente preparada, con los disolventes correspondientes: n-propanol: NH3 (7:3) para la placa A y B; n-butanol: CH3COOH:H2O (6:2:2), para la placas C y D. Se procedi a colocar las placas anteriormente preparadas, cuidando que el nivel de lquido no superase los 0,8 cm de altura. Desarrollo del cromatograma: Una vez colocadas las placas cromatogrficas en las respectivas cmaras, stas se taparon rpidamente, y se esper el tiempo suficiente para que el frente del solvente alcance su lnea correspondiente dibujada anteriormente, a 1 cm del borde superior de la placa. Una vez alcanzada dicha lnea, se retiraron las placas y se secaron en campana, para as acelerar el proceso.

Localizacin de las manchas y revelado: Estando secas ambas placas, stas fueron reveladas bajo campana, asperjando las placas con una solucin de ninhidrina cuidadosamente. Luego de ser pulverizadas ambas placas, se dejaron secar al aire (temperatura ambiente) bajo campana tambin, y posteriormente se trasladaron a una estufa a 105C, dejando las placas ah durante 5 minutos. Al cabo de ese tiempo, se retiraron las placas, en las que ya se podan observar las manchas de colores de cada aminocido. En estas manchas se analizaron sus caractersticas tales como color, forma y tamao. Posteriormente se procedi a medir con una regla las distancias de cada mancha respecto del origen as como la distancia del frente de solvente con respecto de la lnea de origen, para de esta manera calcular los Rf para los patrones y los diferentes componentes contenidos en la muestra problema, lo que permitir finalmente poder determinar cualitativamente la composicin de la muestra problema entregada, y de esta manera poder realizar la identificacin y conclusiones correspondientes. 3. Descripcin de la tcnica: Entre los mtodos de cromatografa en plano est la cromatografa en capa fina (TLC), que es rpida, presenta una buena resolucin y es bastante sensible. En la cromatografa en capa fina se emplea una capa plana y relativamente delgada de un material que a la vez es el soporte, o bien, cubre una superficie metal. La fase mvil se desplaza por la fase estacionaria por accin capilar. La aplicacin de la muestra es tal vez el aspecto ms decisivo de la cromatografa en capa fina. Por lo general se aplica una solucin de la muestra de 0.01% a 0.1% como un punto a 1 o 2 cm del extremo de la placa. Para la separacin ms eficaz, este punto o mancha debe tener un dimetro mnimo, alrededor de 5 mm para un trabajo cualitativo y menor para el anlisis cuantitativo. En el caso de soluciones diluidas, se realizan tres o cuatro aplicaciones superpuestas secando la zona entre aplicacin y aplicacin. La aplicacin manual de las muestras se efecta por contacto entre la placa y un capilar que contiene la muestra. Se pueden aplicar una diversidad de procedimientos para localizar los componentes de la muestra despus de la separacin. Para la separacin de aminocidos se utiliza un reactivo especfico, la ninhidrina, que sirve para localizar las especies separadas. La identificacin de un aminocido se realiza comparando los valores de Rf (factor de retardo) con otros tomados como referencia para establecer su identidad con un cierto grado de seguridad. El factor de retardo para un soluto es: Rf = distancia recorrida por el compuesto desde el origen Distancia recorrida por el solvente desde el origen Ambas distancias lineales medidas desde la lnea de aplicacin. Los valores de Rf tienen la capacidad de variar desde 1, para los solutos que no se retrasan, hasta valores que se aproximan a cero.

Resultados
Tabla N1: Placa A, medida en la fase mvil A (n-propanol:NH3 (7:3)): Nmero Estndar o MP 1 Triptfano 2 Histidina 3 Acido glutmico 4 Glicina 5 Leucina |6 Arginina 7 MP DM(cm) 3,7 2,1 1,0 1,7 3,5 0,5 3,5 y 1,7 DS(cm) 8 8 8 8 8 8 8y8 Rf 0,4625 0,2625 0,1875 0,2125 0,4375 0,0625 0,4375 y 0,2125

Tabla N2: Placa B, medida en la fase mvil A (n-propanol:NH3 (7:3)): Nmero Estndar o MP 1 Triptfano 2 Histidina 3 Acido glutmico 4 Glicina 5 Leucina |6 Arginina 7 MP DM(cm) 3,7 2,1 1,0 1,7 3,5 0,5 3,5 y 1,7 DS(cm) 8 8 8 8 8 8 8y8 Rf 0,4625 0,2625 0,1875 0,2125 0,4375 0,0625 0,4375 y 0,2125

Tabla N3: Placa C, medida en la Fase mvil B: Solucin n-butanol (CH3COOH:H2O (6:2:2)): Nmero Estndar o MP 1 Triptfano 2 Histidina 3 Acido glutmico 4 Glicina 5 Leucina |6 Arginina 7 MP DM(cm) 4,2 0,7 2,0 1,7 3,8 0,9 3,8 y 1,7 DS(cm) 8 8 8 8 8 8 8y8 Rf 0,5250 0,0875 0,2500 0,2125 0,4750 0,1125 0,4750 y 0,2125

Tabla N4: Placa D, medida en la Fase mvil B: Solucin n-butanol (CH3COOH:H2O (6:2:2)): Nmero Estndar o MP 1 Triptfano 2 Histidina 3 Acido glutmico 4 Glicina 5 Leucina |6 Arginina 7 MP DM(cm) 4,2 0,7 2,0 1,7 3,8 0,9 3,8 y 1,7 DS(cm) 8 8 8 8 8 8 8y8 Rf 0,5250 0,0875 0,2500 0,2125 0,4750 0,1125 0,4750 y 0,2125

Discusin
Caractersticas de las manchas: Tras analizar las manchas obtenidas en todas las placas cromatogrficas, se puede observar que en cada placa las manchas de los distintos aminocidos difieren levemente en color, pese a ser similares. Aqu cabe destacar que en el desarrollo de color de cada mancha cumple un rol muy importante la solucin de ninhidrina con la cual se asperj cada placa cromatogrfica. La ninhidrina decarboxila y desamina al aminocido gracias a su fuerte poder oxidante. La ninhidrina reducida formada reacciona con una molcula de ninhidrina no reducida y con el amoniaco resultante de la desaminacin para formar as un compuesto complejo capaz de absorber luz visible, presentando as una coloracin que generalmente vara entre rosa y violeta, dependiendo del aminocido. Los colores de cada aminocido varan en las placas, lo que se debe a los distintos solventes utilizados. Respecto a la forma, se pueden observar manchas de distintas formas: circulares, ovaladas e irregulares; as como tambin se pueden observar manchas ms pequeas y otras ms grandes. Todas estas caractersticas permiten determinar, por observacin de las manchas, la composicin cualitativa de la muestra problema. En la placa A se pueden observar dos manchas de la muestra problema: la superior, aplanada color violeta claro y otra inferior, circular de color rosado claro, ambas de tamao mediano, siendo la primera relativamente ms pequea. La primera mancha, por todas las caractersticas descritas anteriormente, se asemeja a la mancha del aminocido 5. La segunda mancha, tambin por sus caractersticas descritas, se asemeja a la mancha del aminocido 4. En la placa B se puede apreciar las mismas observaciones de la placa A. En la placa C se pueden observar tambin dos manchas de la muestra problema, ambas aplanadas y de tamaos similares, siendo la mancha superior de color violeta claro y la inferior de color beige. La primera mancha descrita se asemeja fsicamente a la mancha del aminocido 5, y la segunda mancha descrita se asemeja a la mancha del aminocido 4. En la placa D se puede aprecian las mismas observaciones que la placa C. Puesto que el anlisis en base a la caracterizacin de las manchas coincide para todas las placas cromatogrficas, se deduce que la muestra problema se compone de los aminocidos 4 y 5 (glicina y leucina, respectivamente). Esto se puede corroborar mediante los valores de Rf calculados para cada aminocido y muestra problema en ambas placas. Valores de Rf calculados: En las placa A y B, los valores de Rf calculados de la muestra problema, para la mancha superior y la inferior, dentro de la lnea de origen son 0,4375 y 0,2125, lo que demuestra una precisin perfecta de las medidas, al obtener los mismos Rf en ambas placas. Los valores de Rf de los patrones de aminocidos que ms se asemejan a los Rf de la muestra problema son los calculados para los aminocidos 4 y 5, siendo estos valores 0,4375 y 0,2125, respectivamente. En la placa C y D, lo valores de Rf calculados de la muestra problema, para la mancha superior y la inferior, dentro de la lnea de origen son 0,4750 y 0,2125, lo que demuestra una precisin perfecta de las medidas, en ambas placas. Estos valores son idnticos a los valores de Rf de los patrones de aminocidos calculados para los aminocidos 4 y 5.

Puesto que el anlisis en base a los valores calculados de Rf de las manchas coincide en todas las placas cromatogrficas, se deduce que la muestra problema se compone de los aminocidos 4 y 5 (glicina y leucina, respectivamente), corroborando as lo que se concluy con respecto al anlisis en base a la caracterizacin de las manchas. Cuanto ms polar sea el aminocido, ms retenido estar en el absorbente, y por lo tanto ir ms lento y el Rf ser tambin menor. Por otra parte, los aminocidos menos polares, se consiguen desplazar a ms distancia desde el origen. La polaridad del disolvente tambin influye en el valor del Rf, por lo que se debe tener en cuenta. As, para un mismo tipo de aminocido, un aumento de la polaridad del disolvente har aumentar su desplazamiento en la placa y por lo tanto tambin aumentar su Rf. En este caso, los solventes utilizados (n-propanol y n-butanol) ambos son alcoholes, compuestos polares, y son de una serie homloga, es por esto que se obtiene una buena resolucin de la muestra problema utilizando ambos solventes, obtenindose valores similares de Rf con ambos. Sin embargo, se pudo observar en la realizacin del prctico que en la cromatografa realizada con n-propanol, el ascenso del disolvente fue levemente ms rpido, por lo que se considera que dicho disolvente es ms polar. Pese a esto, los valores de Rf de cada aminocido y muestra problema obtenidos con cada disolvente son tan similares, que la diferencia de polaridad de disolventes se considera mnima.

Conclusin
Se conoci y aplic la tcnica de cromatografa en capa fina, sus caractersticas y los factores que en ella intervienen, como por ejemplo la polaridad tanto de los aminocidos como del disolvente utilizado. Se logr adquirir la destreza necesaria en la aplicacin de muestras de diferentes aminocidos sobre cromatofolios de slice de 10 x 10 cm. Mediante la utilizacin de mtodos fsicos y qumicos, se logr la localizacin y caracterizacin de las manchas obtenidas para cada aminocido y muestra problema. Tras el desarrollo de la cromatografa y posterior revelado de las manchas con ninhidrina, se pudo calcular los valores de Rf de los distintos aminocidos sembrados, as como de la muestra problema entregada previamente. A partir de los valores de Rf calculados, se pudo estudiar y analizar la relacin que existe entre la polaridad de los aminocidos y la de los eluyentes utilizados. Se logr aplicar la tcnica de cromatografa de capa fina como criterio de pureza de los aminocidos, as tambin como criterio parcial de identificacin de aminocidos presentes en la muestra problema, cuyo anlisis cuantitativo arroj que la composicin era de dos aminocidos, glicina y leucina.

Bibliografa
Hans Beber, Wolfgang Walter. Manual de Qumica Orgnica. Editorial Revert S.A. Ao 1987. Captulo: Anlisis elemental orgnico cualitativo. Pgina 11. Douglas A. Skoog, Stanley R. Crouch, F. James Holler. Principios de Anlisis Instrumental; 6 Edicin, Editorial Cengage Learning Editores, Ao 2008, Captulo: Cromatografa por afinidad. Pginas: 848 - 850. J.M.Teijn Rivera, A.Garrido Pertierra. Fundamentos de Bioqumica Estructural; 2 Edicin, Editorial Tbar, Ao 2006, Captulo 4: Aminocidos: propiedades generales. Pginas: 67 68.