MARZO 29

Rodrigo Bustos, PhD

martes 29 de marzo de 2011

Estructura de Protenas
- Las protenas llevan a cabo la mayor parte de las funciones biolgicas de las clulas - Gran cantidad de protenas y su complejidad de funciones se desprenden de la estructura primaria

La estructura primaria determina el plegamiento para lograr las estructuras de mayor orden

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La protena se pliega exponiendo las cadenas laterales polares y encubriendo las hidrofbicas

Esto resulta en que cada protena tenga una estructura tridimensional particular
Interacciones entre las cadenas laterales de los aminocidos estabilizan las estructuras de mayor orden de la protena

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Protenas con similar estructura y conformacin tienen funciones similares

Proteasas de la familia serina-proteasa

Si conocemos parte de la estructura primaria de una protena, podemos predecir su funcin

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Las protenas ms complejas estn formadas por uno o mas dominios Protena Src

Los dominios son unidades estructurales y/o funcionales en que se divide una protena

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En una clula, todas las protenas interaccionan con otras molculas

La conformacin tridimensional de la protena es crucial en la formacin del sitio de unin al ligando

La habilidad de unirse selectivamente a un l i gan d o de p e n d e d e u n a s e r i e de interacciones dbiles no-covalentes: enlaces inicos, puentes de hidrgeno, interacciones van der Waals, int. hidrofbicas.

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Protenas con mltiples subunidades

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Las protenas pueden formar estructuras de gran tamao

La actina polimeriza para formar microlamentos

El colgeno se asocia lateral y longitudinalmente para formar lamentos de gran rmeza

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Enzimas
Las enzimas son catalizadores moleculares que facilitan reacciones qumicas en la clula. Se unen a uno o mas ligandos, los substratos, y los convierten en uno o mas productos. Incrementan millones de veces la velocidad de las reacciones qumicas sin sufrir cambios qumicos permanentes: esto es, son catalizadores Casa tipo de enzima cataliza un tipo de reaccin qumica y es relativamente especca para los ligandos a que se unen Se clasican en clases funcionales segn la reaccin que catalizan

Tipos de enzimas - Oxido-reductasas - Kinasas - Hidrolasas (proteasas, nucleasas, etc) - Fosfatasas - ATPasas - Polimerasas - Sintasas
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Cintica de la catlisis enzimtica Para una reaccin del tipo E + S ES E + P

Se puede graficar la velocidad de la reaccin (V) contra la concentracin de S V

[S] Esta curva est descrita por la ecuacin V = Vmax [S] Km + [S]

Ecuacin de Michaelis-Menten

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V =

Vmax [S] Km + [S]

[S] La velocidad (V) de una reaccin enzimtica aumenta con la concentracin de sustrato hasta que se alcanza un valor mximo ( Vmax), en que todos los sitios de unin de sustrato de la enzima estn ocupados. La concentracin de sustrato en que la velocidad es 1/2 de la mxima (0.5 Vmax) es igual a la constante Km (constante de Michaelis) Km tambin describe la anidad de la enzima por el sustrato.

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Inhibicin enzimtica
- Cualquier sustancia que decrece la velocidad de una reaccin catalizada por una enzima es un inhibidor. - Pueden clasicarse en irreversibles y reversibles, segn si modican o no la estructura de la enzima en forma covalente. - Una gran cantidad de frmacos en uso son inhibidores enzimticos Entre los inhibidores reversibles hay dos principales tipos: - Inhibidores competitivos Son aquellos que se unen al mismo sitio que el sustrato normal de la reaccin, de este modo previniendo la unin del sustrato a la enzima. Este inhibidor no modica la Vmax de la reaccin - Inhibidores no-competitivos: Se unen a la enzima en un sitio distinto al del sustrato Puede unirse tanto a la enzima libre como al complejo ES Decrecen la Vmax de la reaccin pero no intereren con la unin del sustrato a la enzima

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Regulacin de actividad enzimtica

Una de las formas mas importantes de regulacin es mediante fosforilacin

La fosforilacin-desfosforilacin regula la actividad de una gran cantidad de protenas en una clula

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MTODOS EN BIOLOGA CELULAR

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Estudios in vitro de funciones celulares requieren de una fuente de clulas, las cuales pueden ser cultivadas en el laboratorio (in vitro) Podemos obtener clulas 1- A partir de un tejido: cultivos primarios - Se disecta el tejido y se usan proteasas para disolver la matriz extracelular - Se obtiene el tipo de clula que se desea - Se cultivan en medios especiales en condiciones controladas (37C, CO2) - Es posible mantener estas clulas por tiempos relativamente cortos en cultivo (dias o semanas). El cultivo primario es de corta duracin

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Distintos tipos de clulas pueden cultivarse in vitro

Fibroblastos Clulas musculares Neuronas

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II- Lneas celulares Son clulas transformadas que pueden cultivarse indenidamente en el laboratorio (inmortales)
Algunas lneas celulares comunes: HeLa 3t3 MDCK HEK 293 Pc12 Cos CHO

Ventajas: - Se propagan indenidamente - Constituyen poblaciones homogneas - Se obtienen grandes cantidades en poco tiempo - Conservan algunas propiedades de los tejidos originales - Se evita el uso de animales vivos - Son fcilmente manipulables por mtodos de DNA recombinante para sobreexpresar o silenciar genes de inters

Originalmente se obtienen de tumores o han sido transformadas in vitro (virus)

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Mtodos de DNA recombinante

- Las tcnicas de clonacin, amplicacin por PCR y expresin de DNA han revolucionado la biologa celular - Permiten sobre-expresar o silenciar genes de inters y estudiar los procesos biolgicos en que estos participan Flujo de la informacin gentica:

DNA

mRNA

protena

1) PCR: Permite amplicar millones de veces una secuencia de DNA especca, que luego es clonada en un vector o plsmido 2) RT-PCR: Permite amplicar un DNA especco (cDNA) a partir de un mRNA 3) Transfeccin de cDNA: Permite introducir en una clula un cDNA de inters para estudiar la expresin y funcin de la protena que codica 4) Silenciamiento: Es posible expresar en clulas un RNA especial, siRNA, que interere con la expresin normal de una protena endgena, de este modo obteniendo clulas que carecen de tal protena

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Fraccionamiento celular - Necesitamos estudiar componentes subcelulares - Podemos obtener organelos puricados, protenas, complejos macromoleculares La centrifugacin nos permite separar componentes celulares segn tamao y densidad - En primer lugar debemos romper las clulas y liberar los coponentes subcelulares: el homogenizado - Esto se logra por varios mtodos, el mas comn es mediante un homogenizador de vidrio tipo Dounce
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Centrifugacin diferenciada Componentes de distintos tamaos se separan en etapas sucesivas de centrifugacin a velocidades crecientes

A bajas velocidades sedimentan nucleos y clulas no rupturadas

Mayores velocidades permiten sedimentar organelos de menor tamao: mitocondrias, Golgi, ER, lisosomas

Muy altas velocidades permiten sedimentar ribosomas y complejos macromoleculares

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Centrifugacin a equilibrio

La sedimentacin a travs de un gradiente permite separar componentes subcelulares con gran resolucin en un solo paso

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Anlisis de Protenas Cromatografa - Permite separar molculas por carga, anidad o tamao
Se utilizan columnas conteniendo resinas con propiedades especcas

Intercambio inico

Filtracin en gel

Anidad

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Electroforesis Es la separacin de molculas en un campo elctrico

SDS-PAGE: Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS - Las protenas son denaturadas mediante el detergente SDS (dodecilsulfato de sodio), y se les conere carga negativa, lo cual permite separarlas principalmente por tamao. El agente reductor 2mercaptoetanol es usado para romper puentes disulfuro entre cadenas polipeptdicas. - El gel de poliacrilamida acta como ltro/tamiz permitiendo la separacin por tamao

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La electroforesis bidimensional permite resolver miles de protenas en un gel

Migracin por carga Migracin por tamao

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Inmunoblot: - Permite detectar protenas especcas mediante el uso de anticuerpos

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Microscopa Microscopa ptica - Se utiliza la luz visible para iluminar el especimen - Se logra resolucin hasta unos 0,2 m - Permite visualizar especmenes vivos y procesos biolgicos
Campo claro Contraste de fases Nomarski (DIC)

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Microscopa de Fluorescencia - Es un tipo de microscopa ptica - Se tien las clulas con molculas uorescentes para visualizar estructuras especcas. - Permite visualizar la localizacin intracelular de macromolculas y estructuras subcelulares

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microlamentos y mitocondrias

microtbulos y mitocondrias

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Microscopa Electrnica

Permite alcanzar resoluciones menores a 0,2 m No permite analizar clulas vivas ni procesos biolgicos
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FIN

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