Las cuatro blastomeras, de un embrin en estadio de 4 clulas son capaces de desarrollarse individualmente en blastocistos con macizo celular interno

y trofoblasto
Resumen
Antiguamente se pensaba que las blastmeros de mamferos eran flexibles y totipotentes, lo que permita al embrin superar complicaciones en la organizacin durante el desarrollo de la pre implantacin. En el pasado, utilizando experimentos simples, desde 2,4 y 8 clulas de mamfero en estado embrionario, han proporcionado evidencia que al menos algunas clulas aisladas puede convertirse en animales frtilmente saludables y por lo tanto totipotentes. Investigamos si blastmeros humanas, en estadio de 4 clulas embrionarias podran convertirse en vitro en blastocitos con trofoectodermo y macizo celular interno. -Mtodos: Seis estadios de cuatro clulas de embriones humanos se dividieron y las cuatro blastmeros se cultivaron en forma individual. La expresin de NANOG, un marcador para clulas del macizo celular interno, fue analizada por la inmunocitoquimica. -Resultados: La mayora de las blastmeros sigui el patrn normal de desarrollo Con compactacin en el da 4 y cavitacin en el da 5 y desarrollados dentro de pequeos blastocitos con trofoectodermo y macizo celular interno en el 6 da. Las cuatro clulas de un embrin eran individualmente capaces de desarrollar blastocitos con trofoectodermo y macizo celular interno, y NANOG fue expresado en el macizo celular interno. -Conclusin: Aunque basado en un pequeo numero de embriones, nosotros concluimos que las blastmeros de 4 clulas de desarrollo embrionario humano son flexibles y capaces de desarrollar blastocitos con macizo celular interno y trofoectodermo.

Introduccin:
Se supone que los primeros blastmeros son totipotentes, esto permite que el embrin pueda regular su desarrollo a fin de superar las perturbaciones en su organizacin como la prdida de clulas. La evidencia directa de totipotencialidad se aprecia cuando un blastmero aislado es capaz de convertirse en una descendiente frtil normal (revisado en Edwards y Beard, 1997). En los ratones, los experimentos de divisin han mostrado que una blastmera de dos clulas (estado embrionario) como totipotente, pero una sola blastmera en estado embrionario de 4 clulas no lo es. Una blastmera de ratn en estado embrionario de cuatro clulas puede convertirse en un blastocito e implantarse, pero morir pronto debido a su pequeo tamao y el nmero insuficiente de clulas y de su carencia de masa celular interna (MCI). Evidencia indirecta de que al menos algunos de los blastmeros de un embrin de ratn de 4 clulas son totipotentes fue incluida en los modelos quimricos utilizando blastmeras portadoras de un genotipo diferente para mantener el tamao y nmero de clulas del embrin normal (Tarkowski et al.,2001). Algunas clulas aisladas de un embrin de raton de 8 clulas, formar slo un pequeo trofoblastp (Edwards y Beard, 1997). Ambas blastmeras en el estado de 2 clulas de un embrin de bovino pueden transformarse en un cordero (Willadsen and Godke, 1984), Y Todas las clulas de un embrin con 4 blastmeras de bovino son totipotenciales El objetivo de nuestro estudio era investigar si blastmeros aislados de embriones humanos fase cuatro clulas podran in vitro transformarse en blastocistos con trofoectodermo (TE) y masa celular interna MCI. Hasta donde sabemos, sta es la primera vez que este experimento es llevado a cabo.

Materiales y mtodos.Ovocitos y embriones De acuerdo con la legislacin belga, los embriones pueden ser generados con fines de investigacin, siempre y cuando el estudio se haya presentado al Comit tico Federal de embriones. El Comit de tica de la UZ de Bruselas (Universitair Ziekenhuis Brussel) dio su aprobacin para este proyecto debido a que los embriones no se transfieren a un tero y por lo tanto, seran destruidos por el procedimiento experimental. De esta manera, la clonacin reproductiva, que no est permitida en Blgica, no era un problema aqu. Ovocitos maduros, formados quitando la zona pelcida a partir de ovocitos inmaduros y blastocistos fueron donados para la investigacin por parejas tratadas en nuestro centro de fertilizacin in vitro, que haban dado su consentimiento informado. Los embriones se obtuvieron despus de la microinyeccin con los espermatozoides de un donante de consentimiento. Cultivo In vitro, micromanipulacin y microscopa invertida. Los ovocitos fueron denudados y introducidos con espermatozoides y los cigotos resultantes fueron cultivados (Medicult series, Lucron Bioproducts, Blgica) como se describi anteriormente. La Fertilizacin se evalu 16-22 horas despus de la microinyeccin, la calidad del embrin fue evaluada en el Da 2 antes de la biopsia, embriones con <10% de fragmentacin y con blastmeras de tamao regular fueron partidas. Un orificio fue hecho en la zona pelcida usando pulsos de lser (Fertilase, MTM Medical Technologies Montreux, Suiza) como se describi anteriormente. Basltmeras fueron removidas por aspiracin usando una pipeta con un dimetro interno de 50 um. Todas las blastmeras fueron puestas una por una en una vaca zona pelcida (ZP de ovocitos inmaduros haban sido vaciadas por aspiracin). Cultivando en una zona pelcida en el IVF laboratorio, permiti comparar el tamao entre las pequeas blastmeras derivadas del blastociso y embriones humanos regulares. Ellas fueron cultivadas individualmente durante 6 das en medio secuenciales, tal como se utiliza en el programa IVF. El desarrollo In vitro fue seguido por un embriologista clnico experimentado usando un microscopio invertido (x100 o x200 aumento, Diaphot 300, Nikon, Tokyo, Japn) y fotografas fueron tomadas diariamente (OCTAX Eyeware MX). Inmunocitoqumica indirecta Embriones fueron en un buffer fosfato salino (PBS; Sigma-Aldrich, Bornem, Blgica) complementado con albmina de suero de bovino al 2%(BSA; Sigma-Aldrich), fijadas con formaldehdo al 3,7% (Merck; VWE International, Leuven, Blgica) en PBS por 10 minutos a temperatura ambiente y permeabilizadas con Triton X-100 al 0,1% (Sigma-Aldrich) en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Luego ellos fueron incubados con 2ug/ml de anti-NANOG anticuerpo de conejo policlonado (an21624; Abcam, Cambridge, Reino Unido) en PBS con BSA al 2% a 4C de noche. Siguiente, las muestras fueron incubadas con 10ug/ml de Alexa Fluor 667 inmunoglobulina burro anti-conejo (Ig) G (A-31573, Invitrogen, Merelbeke, Blgica) en PBS con BSA al 2% durante 2 horas a 4C en la oscuridad. Entre cada paso, las muestras fueron lavadas tres veces durante 5 minutos en PBS con BSA al 2% en un plato de agitacin a temperatura ambiente. Experimentos de control, positivos y negativos, en la preimplantacin de embriones normales, los cuales fueron donados para la investigacin despus de un consentimiento informado, se incluyeron en cada experimento (datos no mostrados). En los controles positivos, los embriones normales de fecundacin in vitro se tieron de NANOG. En los controles negativos, el anticuerpo NANOG fue reemplazado con conejo IgG (R-9133, Sigma-Aldrich) a una concentracin de 2 ug / ml. Despus de la tincin, los embriones fueron puestos entre dos hojas de vidrio cubreobjeto (24 x 60 mm) en 2 ul de reactivo SlowFadew Light Antifade (Invitrogen). Para evitar el estrujamiento de los embriones, un cubreobjetos de vidrio redondo (10 mm de dimetro) fijado con acrytol (medio de montaje) (Surgipath,

Peterborough, Reino Unido) fue utilizado como separador. Para grabar las imgenes fluorescentes se realiz microscopa confocal de barrida con un laser de He-Ne (633 nm) (IX71 Fluoview 300; Olimpo, Aartselaar, Blgica)

Resultados
Veinticuatro blastmeros de seis embriones humanos (tabla I) fueron, uno por uno, aspirados despus de perforar la zona pelcida, igual que en el caso de la biopsia del embrin para diagnstico gentico preimplantatorio (sigla en ingls: PGD) (Van de Velde et al., 2000) y estos blastmeros fueron puestos por separado dentro de una zona pelcida vaca (Fig. 1). En consecuencia, sus tamaos pueden ser comparados con los de embriones humanos in vitro con desarrollo normal. Un blastmero no sobrevivi la aspiracin; veintitrs blastmeros dentro de sus respectivas zonas pelcidas fueron individualmente cultivados in vitro. Los cultivos fueron evaluados diariamente hasta el da 6 de desarrollo preimplatacional. Cuatro blastmeros degeneraron durante el cultivo in vitro; la mayora de los blastmeros siguieron el patrn normal de desarrollo preimplantacional, de acuerdo al reloj biolgico de compactacin en el da 4 y cavitacin en el da 5. En el momento de la evaluacin del da 3 (72 horas despus de la inyeccin), 19 blastmeros estaban divididos en dos (tabla I). Un da despus, 19 embriones estaban haciendo compactacin o estaban ya compactados (formados por 2-4-8 clulas). En el da 5, estos 19 embriones derivados de blastmeros se desarrollaron en blastocistos, con una cavidad, formada por un pequeo nmero de clulas de trofoectodermo. Finalmente, 16 blastmeros se desarrollaron en blastocistos completos el da 6, de los cuales 12 tenan masa celular interna. Algunos blastocistos fueron artificialmente eclosionados a travs del agujero hecho previamente en la zona pelcida. Con el fin de apoyar la observacin microscpica de las clulas con Macizo celular interno, se busc la presencia de marcadores troncales NANOG, un factor de transcripcin exclusivamenteexpresados por las clulas con Macizo celular interno en embriones humanos (Hyslop et. Al. 2005). Despus de la inmunicitoqumica y microscopa confocal, encontramos que en 9 de 11 blastocistos (uno lo perdimos durante la fijacin) con Macizo celular interno y Trofoectodermo testeado, algunas clulas del macizo celular interno expresaron NANOG. En cinco de seis embriones, tres de las cuatro blastmeras se convirtieron en blastocistos en el da 5 (en total 15). En 12 de esos blastocistos, el macizo celular interno fue visible. En el sexto embrin, las cuatro blastomeras fueron capaces de desarrollarse cada una en un blastocisto expandido de buena calidad con Trofoectodermo cohesivo y macizo celular interno fuertemente empaquetado (dos de tipo B14AA con muchas clulas del Macizo celular interno y dos tipos B14BA con menor cantidad clulas, de acuerdo con el sistema de puntuacin de Gardner y Schoolcraft, 1999) (Fig. 2 a). En el macizo celular interno de dos blastocistos B14AA y dos B14BA, 6, 6, 3 y 2 clulas, respectivamente fueron encontradas expresando NANOG (Fig. 2b). Por lo tanto concluimos que las clulas de embrioncitos de 4 blstomeras son capaces individualmente de desarrollarse en pequeos blastocistos con macizo celular interno y clulas de trofoectodermo. *TE: Trofoectodermo *ICM: Macizo celular interno

Tabla I. Resultado de segmentacin de 6 embriones humanos en estadio de 4 clulas. Embrin 1 2 3 4 5 6 Da 2 Sobrevivencia 4 4 3 4 4 4 23 Da 3 2 clulas 4 4 3 4 3 1 19 Da 4 Compactacin 3 3 3 4 3 3 19 Da 5 Cavitacin 3 3 3 4 3 3 19 Da 6 Blastocitos Expandidos (ICM/NANOG) 2 (1/ND) 3(2/2) 3(1/1) 4(4/4) 3(3/2) 1(1/0) 16(12/9)

Nmero de blastmeros que sobrevivieron a la biopsia en el da 2, divididas en el da 3, el da 4 mostraron signos de compactacin, a los 5 das poseen una cavidad y el da 6 forman un blastocito expandido ,los cuales son representados en la respectivas columnas. En la ultima columna esta presente el numero de blastocito con ICM/el numero de la IMC que expresa NANOG. ND, no se hace porque se perdi durante la fijacin

Figure 1: Biopsia de un embrin humano en estadio de 4 clulas. (A) las clulas son aspiradas un a por una y (B) suavemente poner en el vaco de la zona pelcida (ZP) y (C) los cuatro blastmeros son puestos en cuatro ZP aparte.

Discusin
Los resultados de los experimentos realizados en este estudio, proporcionan evidencia de que las blastmeras aisladas de un embrin humano de cuatro blastmeras (o de cuatro clulas), puede desarrollarse individualmente en vitro, en blastocistos con TE y ICM. Concluimos que las clulas son flexibles y pueden aun no estar destinadas irreversiblemente a un tipo celular (linaje). La polaridad y pre-patterning (territorios presuntivos? patrones previos?) en el embrin de mamfero estn actualmente en debate. (Vogel, 2005; Hiiragi et al., 2006). Tener un eje cfalo-caudal o izquierdo-derecho, parece estar claramente definido en ovocitos de rana y mosca, donde los morfgenos en concentraciones variables, regulan la diferenciacin posterior a la fecundacin. En especies no mamferas, las gradientes de ARNm y morfgenos estn establecidos por el citoesqueleto; estos cruzan al cigoto y embrin temprano e inducen a las clulas vecinas a diferenciarse. En mamferos, se crea que las blastmeras son totipotenciales, al menos hasta el estado de 8 blastmeras, aunque la evidencia ( DATA), demuestra que algunos pre modelos (pre-patterning) han sido reportados. La formacin de clulas externas e internas durante el cuarto clivaje es el resultado de una divisin diferencial en: clulas polares/externas y clulas apolares/internas (Hipotesis dentro-fuera) (Tarkowski and Wroblewska, 1967).

El primer signo morfolgico de polaridad aparece en el blastocisto cuando al menos dos tipos de clula pueden ser distinguidas: macizo celular interno (ICM), que dar origen al feto como tambin a los tejidos extraembrionarios; y las clulas externas (TE), que se desarrollarn como parte de la placenta. En este modelo regulatorio o de segmentacin dirigida, las clulas estn localizadas basndose en orden y /u orientacin de las divisiones del clivaje. Recientemente, sin embargo, varios grupos de investigacin encontraron evidencia en ratones, que el ovocito fecundado ya esta polarizado (Asimetra morfolgica y/o molecular) y que las blastmeras tempranas, estn predestinadas a convertirse en ICM o TE (prepatterning model). El grupo de Garner inicialmente encontr que el eje embrionario y abembrionario en el blastocisto es aproximadamente perpendicular al plano del primer clivaje, indicando que la polaridad en el blastocisto de ratn puede encontrar su origen ya en el huevo fecundado. La idea es apoyada por el grupo de Zernicka-Goetz, quienes reportaron que es posible en el estado de dos blastmeras, predecir el destino de las clulas hermanas: la clula de divisin temprana, tiende a formar la regin embrionaria, mientras que la clula de divisin tarda tiende a formar la regin abembrionaria. Al crear un embrin quimrico de las clulas individuales de un embrin de ratn de 4 blastmeras, ellos mostraron que las clulas tienen distintos destinos. Otros argumentan que este model pre-patterning slo fue establecido en sepas particulares de ratn, bajo ciertas condiciones experimentales (manipulacin, tcnicas invasivas y presin mecnica) que pueden haber inducido tendencias/patrones que son biolgicamente irrelevantes. Sin embrago, en ratones un embrin aislado de dos blastomeras es totipotencial. Edwards, quien apoya el modelo pre-patterning, ha introducido un modelo extrapolado de la situacin de especies no mamferas donde en el estado de 4 blastmeras, dos clulas estn predeterminadas a convertirse en ICM; una clula se convertir en TE y una clula va a contribuir con la lnea germinativa. La evidencia (DATA) que apoya este modelo fue proporcionada por Hansis et. Al (2004), luego de analizar la expresin de b-HCG (potencial marcador de TE), POU5F1 (potencial marcador de clulas totipotenciales, antiguamente llamadas OCT-4) y B-ACTINA (control positivo) en blastmeras individuales de cinco embriones humanos en etapa de 2 a 5 clulas. La expresin de B-HCG y POU5F1 fue negativamente correlacionada en estos embriones; sin embargo, se debe tomar precaucin al interpretar estos resultados, ya que el resultado en un nmero de blastmeras no fue considerado porque no se encontraron transcripciones de B-actin. El genoma embrionario humano es encendido en el estado de 4 a 8 clulas, pero la expresin embrionaria no est necesariamente sincronizada y por lo tanto la variabilidad en la expresin debe ser considerada al trazar conclusiones en el estado de clivaje temprano. Por otra parte, experimentos con POU5F1 deben ser reinterpretados porque las isoformas POU5F1_iA y POU5F1_iB suelen ser ignoradas, y slo la primera juega un papel en la totipotencialidad. El anlisis de la expresin de POU5F1_iA a travs del desarrollo humano preimplantacional mostr que POU5F1_iA se expresa en clulas del TE y ICM del blastocisto humano y no induce una asignacin especifica de las blastmeras en divisin hacia un linaje determinado. Nuestros resultados divididos contradicen el modelo pre-patterning de Edward, porque en el estado de 4 blastmeras todas las clulas siguen teniendo capacidad individual de desarrollarse en dos linajes, ICM y TE. No podemos excluir que dentro de la estructura del embrin, las blastmeras se comunican y comportan de manera diferente, pero individualmente son equivalentes y pueden no estar irreversiblemente asignadas aun. El momento de activacin del genoma humano embrionario entre el estado de 4 y 8 blastmeras, explican la flexibilidad de las clulas, en el estado de 4 blastmeras. Nosotros proponemos, que la asignacin a ICM y TE ocurre despus del cambio de genoma materno a embrionario en el da 3. El genoma embrionario se activa ms temprano en el ratn, lo que podra explicar las diferencias entre dos especies. El tamao de los blastocistos derivados de blastmeras cultivadas individualmente era menor en comparacin con el tamao de un embriones humanos normales cultivados in vitro (de hecho cuatro veces ms pequeos del da 3 al 5). Sin embargo, siguieron el reloj biolgico de compactacin el da 4 y cavitacin el da 5. El da 6, la mayora se desarroll como blastocistos completos/expandidos, con ICM y TE claramente visibles. El paso crtico pareci ser la produccin de la masa celular en expansin, entre los

das 5 y 6. Por razones ticas y legales, no podemos transferir el blastocisto a un tero para determinar su capacidad de implantacin y proporcionar evidencia de que son totipotenciales. La presencia de clulas trofoblsticas era evidente bajo el microscopio invertido. Para confirmar la presencia de clulas del ICM dentro de los blastocistos derivados de blastmeras, investigamos la expresin de NANOG. NANOG fue elegido porque, segn lo que sabemos, es el nico marcador que es especficamente expresado en clulas del ICM, de un blastocisto humano expandido. Por otra parte, NANOG se considera uno de los marcadores clave de la potencialidad/troncalidad. La expresin de POU5F1_iA no fue investigada porque no est restringida a cellas del ICM en blastocistos humanos. Ratones modificados genticamente que no expresan NANOG han mostrado tener ICM normal, pero fallan en la produccin del epiblasto y mueren pronto despus de la implantacin. Por lo tanto, concluimos que los blastocisctos derivados de blastmeras son potencialmente totipotenciales.

Blastmero 1

Blastmero 2

Blastmero 3

Blastmero 4
Da 3

Da 4

Da 5

Da 6

B
Da 6

Figura 2. En el desarrollo in vitro de cuatro blastmeros independientes, derivados de un embrin humano de 4 clulas (a) en el da tres, blastmeros independientes, en el da 4 se encuentran compactados, cavitados en el da 5 y convertidos en blastocito en el da 6 (se utiliza la misma escala en todas las fotografas); (b) Inmunocitoquimica y microscopia confocal mostraron expresin en las clulas de NANOG la masa celular interna al sexto da.
Totipotencia o ms bien pluripotencia podra haber sido probado por la obtencin de clulas madre embrionarias a partir de la ICM, pero la posibilidad de tener xito era, a priori, baja. Las lneas CES se han derivado de blastmeros independientes de la etapa de 8 clulas de ratn y embriones humanos con una baja tasa de xito (4 y 2% respectivamente.), indicando que algunos de estos blastmeros son pluripotenciales. Sin embargo, para proporcionar evidencia de que las cuatro clulas son pluripotenciales, una lnea de CES debera haber sido derivada de cada una de las cuatro blastmeros, lo que es prcticamente imposible. El hallazgo de que en un embrin de cuatro clulas iguales puede convertirse en blastocisto tiene implicaciones en el conocimiento actual sobre el desarrollo de preimplantacin y la prdida de clulas por fragmentacin, biopsia de PGD o deterioracin criognica. De los seis embriones divididos, in vitro las cuatro clulas hermanas no se desarrollaron en blastocistos. Esto podra ser debido a: (i) los daos despus de la manipulacin, (ii) la falta de potencial de desarrollo o (iii) in vitro sigue con el desarrollo normal preimpantacin. Aunque la falta de totipotencialidad no puede ser excluida, creemos que nuestras observaciones reflejan las observaciones diarias en el laboratorio FIV: no todos los embriones son de excelente calidad y se desarrollan en blastocisto. Slo el 15% de los embriones son de primera calidad en el da 5, pero los blastocisto de baja calidad (con retraso / o fragmentados) tienen la capacidad de implantarse. La fragmentacin en el da 3 es asociada con una tasa baja de desarrollo del blastocisto en el da 5 y una menor tasa de implantacin, en particular, fragmentos grandes parecidos a blastmeros completos estn asociados con un resultado bajo de embarazo. Curiosamente, los fragmentos pequeos pueden ser reabsorbidos por las blastmeros en el perodo de preimplantacin. (Hardarson et al., 2002). Remover fragmentos pequeos (localizados o distribuidos) podra mejorar la capacidad de implantacin, aunque esto permanezca a prueba en distintas perspectivas de estudios controlados. Embarazos con embriones parcialmente congelados en estado de clivaje fueron reportados. La eliminacin de clulas disueltas por lisina podra mejorar la capacidad de implantacin del embrin congelado, pero esto necesita ser probado de forma apropiada. Clulas perdidas despus de una biopsia por PGD parecen ser menos perjudiciales para el embrin por el aceptable rango de embriones biopsiados. Recientemente, ha sido mostrada en una prospectiva de control incierta que no hay diferencias en la capacidad de implantacin despus de la eliminacin de un blastmero frente a la eliminacin de dos para el diagnstico; sin embargo, la prdida de un gran volumen pareciera ser perjudicial para la vitalidad del embrin. Embriones biopsiados parecen implantar mejor que fragmentos de embriones o que embriones daados; por lo tanto la posibilidad que fragmentos o clulas disueltas puedan obstruir el desarrollo normal de la implantacin (compactacin, cavitacin y fijacin) necesita ser investigada.

-Fin-