Tesis 4826 Sigaut

Caracterizacin cuantitativa de seales
intracelulares de calcio
Sigaut, Lorena
2011
Tesis Doctoral
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
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Contacto: digital@bl.fcen.uba.ar
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UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Fsica
Caracterizaci on cuantitativa de se nales
intracelulares de calcio
Trabajo de Tesis para optar por el ttulo de
Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el area Ciencias Fsica
por Lic. Lorena Sigaut
Director de Tesis: Dra. Silvina Ponce Dawson
Lugar de Trabajo: Departamento de Fsica
Febrero 2011
palabra
A mis padres
y a N estor
palabra
I
Resumen
Las se nales de calcio son utilizadas por una enorme variedad de c elulas para
regular procesos tan distintos como la fertilizaci on o la muerte celular, entre mu-
chos otros. La versatilidad del i on calcio como agente se nalizador se basa en la
gran diversidad de comportamientos que su concentraci on puede desplegar dentro
de las c elulas. Desentra nar la compleja trama de mecanismos que determinan dichos
comportamientos es un enorme desafo que requiere la combinaci on de estrategias
m ultiples tanto experimentales como de modelado. En particular, el amplio rango
de escalas espaciales y temporales involucradas no puede ser abarcado con un uni-
co tipo de experimentos y es entonces que la elaboraci on de modelos que permitan
conectar observaciones dispares se vuelve indispensable. Por otro lado, para que los
modelos puedan cumplir este rol es necesario contar con estimaciones conables,
idealmente obtenidas in situ, de algunas de las cantidades que caracterizan a los
fen omenos fsicos y qumicos involucrados en las se nales. El objetivo de esta Tesis
ha sido avanzar en la obtenci on de estas estimaciones realistas realizando experi-
mentos opticos y desarrollando el marco te orico necesario para extraer informaci on
cuantitativa de los mismos.
Una de las propiedades pobremente caracterizadas es la tasa a la que el calcio se
transporta dentro de las c elulas. Existen distintas t ecnicas opticas para estimar coe-
cientes de difusi on, entre las que se encuentran la espectroscopa de correlaci on de
uorescencia (FCS) o la recuperaci on de uorescencia tras fotoblanqueo (FRAP). La
aplicaci on de las mismas al caso del calcio no es totalmente directa, ya que este i on
no s olo difunde al entrar al citosol a trav es de canales especcos, sino que tambi en
reacciona con distintas sustancias (buffers) que poseen las c elulas. Para describir
este tipo de transporte es posible denir coecientes efectivos, que contienen infor-
maci on sobre la difusi on y las reacciones. Estudios preliminares haban mostrado la
existencia de m as de un coeciente de este tipo. Una de las contribuciones de esta
Tesis ha sido estudiar de forma detallada la informaci on que es posible extraer a
partir de experimentos de FCS en donde la sustancia observada difunde y reacciona.
En particular, se demostr o que las t ecnicas de FCS y FRAP brindan informaci on so-
bre coecientes distintos, que puede ser combinada para inferir tasas de reacci on y
de difusi on libre. Se realiz o este estudio te orico para el caso en que la sustancia de
II
inter es est a marcada uorescentemente y cuando existen mol eculas marcadas y no
marcadas en el mismo sistema. Parte de los resultados fueron aplicados para explicar
las diferencias observadas en experimentos de FCS y FRAP, realizados para deter-
minar el coeciente de difusi on del producto del gen bicoid en embriones de moscas
Drosophila melanogaster, una sustancia fundamental para el establecimiento del eje
dorsoventral en este organismo.
La aplicaci on de t ecnicas opticas para estudiar el transporte de calcio en c elulas
presenta dicultades adicionales. En primer lugar, la observaci on de la distribuci on
del calcio se hace de modo indirecto, mediante uor oforos que reaccionan con este
i on y cambian sus propiedades espectrales como por ejemplo, aumentar notablemen-
te la uorescencia al ligar calcio. Es decir, la sustancia observable (indicador ligado
a calcio) est a permanentemente transform andose en otra. Por otro lado, para poder
inferir a partir de ella la distribuci on de calcio libre es necesario conocer propiedades
del indicador que tpicamente no son provistas por quienes lo comercializan, como
por ejemplo, los coecientes de difusi on. Otra de las contribuciones de esta Tesis ha
sido establecer las bases para la determinaci on de los coecientes de difusi on y tasas
de reacci on del calcio y sus uor oforos, en c elulas. Para tal n se hicieron, en pri-
mer lugar, experimentos de FCS en distintos tipos de soluciones conteniendo calcio
e indicador. Se trabaj o simult aneamente en los desarrollos te oricos necesarios para
el an alisis de los mismos. De su aplicaci on se pudieron determinar coecientes de
difusi on y par ametros de reacci on en soluci on. Entre los experimentos se realiz o un
subconjunto conteniendo calcio, indicador y un buffer adicional. A partir del es-
tudio detallado de estos ultimos se elabor o una propuesta de c omo obtener estos
coecientes en c elulas intactas donde las propiedades de los buffers presentes son
desconocidas.
La versatilidad de las se nales intracelulares de calcio depende, entre otras co-
sas, de la distribuci on espacial y de la cin etica de los canales a trav es de los cuales
los iones ingresan al citosol. Entre estos, los receptores de inositol (1,4,5)-trifosfato
(IP
3
R) constituyen una de las vas m as importantes para este ingreso. Estos canales
se encuentran en la membrana del retculo endoplasm atico organizados en c umulos
que se supone son de unos 100 nm de lado y que est an, a su vez, separados por algu-
nos milmetros entre s. Los canales se abren cuando ligan calcio e IP
3
R el que, en
condiciones siol ogicas, es sintetizado a partir de elementos presentes en la mem-
III
brana plasm atica cuando la c elula recibe una se nal. La distribuci on inhomog enea
de los canales junto con el efecto del calcio liberado sobre la probabilidad de aper-
tura se combinan para dar lugar a una jerarqua de se nales que van desde las muy
localizadas hasta las ondas que viajan por toda la c elula. Contar con informaci on
cuantitativa sobre la geometra de los c umulos y sobre la cin etica de los canales in
situ es fundamental para entender la variedad de se nales que pueden evocarse. Expe-
rimentalmente es posible observar las se nales usando los uor oforos antes mencio-
nados e induciendo la apertura de los canales con IP
3
, que es introducido en la c elula
en forma enjaulada y posteriormente fotoliberado con luz ultravioleta. Otra de las
contribuciones del presente trabajo de Tesis ha sido el dise no e implementaci on de
una adaptaci on relativamente barata de un microscopio confocal Olympus FV1000
para realizar este tipo de experimentos. La habilidad del sistema para fotolizar com-
puestos enjaulados fue comprobada en distintas situaciones experimentales. Por otro
lado, la potencia que llega a la muestra y el tama no de la zona iluminada fueron
cuanticados. Finalmente, en el trabajo se ha mostrado tambi en que con esta adapta-
ci on es posible generar un estmulo preciso y controlado de IP
3
simult aneamente a la
obtenci on de im agenes confocales de se nales de calcio, registrando y caracterizando
a las mismas en ovocitos de Xenopus Laevis.
Palabras claves: din amica de calcio, receptores de IP
3
, procesos de difusi on y reacci on, es-
pectroscopa de correlaci on de la uorescencia, microscopa confocal.
IV
Quantitative characterization of intracellular
calcium signaling
Abstract
Calcium signals are used by an enormous variety of cells to regulate processes
as diverse as fertilization or cell death, among others. The versatility of calcium as a
signaling agent is based on the great diversity of behaviors that its concentration can
display inside cells. Unveiling the complex network of mechanisms that determine
these behaviors is an enormous challenge that requires the combination of multiple
strategies which include experiments and modeling. In particular, the wide range of
spatial and temporal scales involved can not be covered with a single type of expe-
riment, so that the development of models that can connect different observations
becomes unavoidable. On the other hand, for models to fulll this role is necessary
to have reliable estimates, ideally obtained in situ, of some of the quantities that cha-
racterize the physical and chemical phenomena involved in the signals. The aim of
this Thesis has been to advance in obtaining these realistic estimates by performing
optical experiments and developing the theoretical framework necessary to extract
quantitative information from them.
One poorly characterized property is the rate of calcium transport inside ce-
lls. There are several optical techniques to estimate diffusion coefcients, among
them, Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) and Fluorescence Recovery Af-
ter Photobleaching (FRAP). Applying these techniques to the case of calcium is not
entirely straightforward, since this ion not only diffuses, when it enters the cytosol
through specic channels, but also reacts with various substances ( buffers) inside
cells. Effective coefcients can be dened to describe this type of transport, which
contain information on the diffusion and reaction parameters. Preliminary studies
had shown the existence of more than one of these coefcients. One contribution
of this Thesis has been a detailed study of the information that can be obtained
from FCS experiments in which the particles observed diffuse and react. In parti-
V
cular, it was proved that FCS and FRAP provide information about different coef-
cients which can be combined to infer reaction and free diffusion rates. A theoretical
study was done for the case in which the molecule of interest is uorescently labe-
led and when there are uorescently labeled and unlabeled molecules in the same
system. Part of the results were applied to explain the differences observed in FCS
and FRAP experiments, performed to determine the diffusion coefcient of bicoid
in Drosophila melanogaster embryos, an essential substance for the formation of the
dorsoventral axis in this organism.
The application of optical techniques to study calcium transport in cells offers
additional difculties. First of all, the observation of the calcium distribution is in-
direct, by means of uorophores that react with this ion and change their spectral
properties upon binding (e.g. increasing their uorescence when they are bound to
calcium). Thus, the observable particle (indicator bound to calcium) is permanently
transforming into another. On the other hand, to infer the distribution of free cal-
cium it is necessary to know indicator properties that are not usually provided by the
vendor, for example, diffusion coefcients. Another contribution of this Thesis has
been to establish the basis for the determination of diffusion coefcients and reaction
rates of calcium and uorophores in cells. To this aim, rstly, FCS experiments in
different types of solutions containing calcium and indicator were performed. At the
same time, the theoretical framework for the analysis of the results was developed.
Applying this theory, diffusion coefcients and reaction parameters could be deter-
mined for the experiments in solution. Among the experiments, a subset containing
calcium indicator and an additional buffer was performed. From a detailed study of
the latter, a proposal was made on how to obtain these coefcients and parameters in
intact cells where the properties of the endogenous buffers are unknown.
The versatility of intracellular calcium signals depends, among other things, on
the spatial distribution and kinetics of the channels through which the ions enter
the cytosol. Among them, the inositol (1,4,5)-triphosphate receptors (IP
3
R) are one
of the most important ways for this entry. These channels are located on the mem-
brane of the endoplasmic reticulum, organized in clusters of about 100 nm in side
which are separated by a few millimeters. These channels become open when they
bind calcium and IP
3
which, under physiological conditions, is synthesized from
elements present in the plasma membrane upon the arrival of a signal. The inho-
VI
mogeneous distribution of the channels together with the effect of the free calcium
on the open probability are combined to give rise to a hierarchy of signals, ranging
from very localized ones to waves that travel throughout the cell. Having quantitati-
ve information on the clusters geometry and channels kinetics it in situ is essential
for understanding the variety of signals that can be evoked. Experimentally, it is
possible to observe these signals using the uorophores mentioned before and indu-
cing the opening of IP
3
receptor/channels by introducing a caged form of IP
3
into
the cell and then fotoreleasing it with ultraviolet light. Another contribution of this
Thesis has been the design and implementation of a relatively inexpensive adapta-
tion of an Olympus FV1000 confocal microscope to perform such experiments. The
systems ability to photolyze caged compounds was tested in different experimental
situations. The power that reaches the sample and the size of the illuminated area
were also quantied. Finally, in this work it has also been demostrated that with the
modied microscope it is possible to generate a precise and controlled IP
3
stimulus,
simultaneously with the confocal imaging of the evoked calcium signals. This has
been proved by recording and characterizing such images in Xenopus laevis oocytes.
Keywords: calcium dynamics, IP
3
receptors, diffusion and reaction processes, uorescence
correlation spectroscopy, confocal microscopy.
Indice general
1. Introducci on 3
1.1. Se nales de calcio mediadas por IP
3
y su relevancia . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.1.1. La maquinaria celular para el control de la concentraci on de calcio . . . . 4
1.1.2. Din amica del Receptor de IP
3
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.1.3. Se nales de calcio en ovocitos de Xenopus laevis . . . . . . . . . . . . . . 7
1.2. Observaci on de se nales de calcio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.2.1. Indicadores de calcio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.2.2. Fot olisis de compuestos enjaulados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.2.3. Microscopa confocal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.3. Din amica del calcio intracelular y procesos de reacci ondifusi on . . . . . . . . . 13
1.3.1. Procesos de reacci on-difusi on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.3.2. Estimaci on de la difusi on efectiva del calcio usando sustancias radioactivas 15
1.3.3. Transporte en presencia de trampas y difusi on efectiva . . . . . . . . . . 16
1.4. Cuanticaci on de la difusi on por m etodos opticos . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1.4.1. Marcaci on de compuestos para su observaci on . . . . . . . . . . . . . . 17
1.4.2. Espectroscopa de Correlaci on de Fluorescencia (FCS) . . . . . . . . . . 18
1.4.3. Recuperaci on de la uorescencia tras fotoblanqueo (FRAP) . . . . . . . 22
1.5. Esquema de la Tesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2. Difusi on en presencia de trampas. Coecientes efectivos y su cuanticaci on median-
te FCS y FRAP 25
2.1. Modelo completo de FCS para partculas uorescentes que difunden y reaccio-
nan con trampas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.1.1. C alculo de autovalores y autovectores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
2.1.2. Expresiones de autocorrelaci on para el modelo completo . . . . . . . . . 28
2.2. Modelo aproximado para tiempos largos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
2.2.1. Coecientes efectivos de difusi on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
2.2.2. Funci on de correlaci on del modelo aproximado . . . . . . . . . . . . . . 30
2.2.3. Lmites de aplicaci on del modelo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
2.3. Comparaci on entre el modelo completo y el modelo aproximado . . . . . . . . . 34
2.3.1. Incorporaci on de ruido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.3.2. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
VII
VIII

INDICE GENERAL
2.4. Informaci on que se puede obtener aplicando el modelo aproximado . . . . . . . 40
2.4.1. Informaci on que se extrae en un experimento de FCS . . . . . . . . . . . 40
2.4.2. Experimentos de FCS a diferentes concentraciones . . . . . . . . . . . . 42
2.5. Combinando la informaci on de experimentos de FRAP y FCS . . . . . . . . . . 43
3. Cuanticaci on de coecientes de difusi on por m etodos opticos en presencia de partcu-
las no marcadas 45
3.1. Caso partculas marcadas y no marcadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
3.1.1. Funci on de correlaci on para partculas marcadas y no marcadas . . . . . 48
3.1.2. Coecientes efectivos de difusi on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
3.1.3. Funci on de correlaci on para tiempos largos . . . . . . . . . . . . . . . . 50
3.2. Aplicaci on del modelo al sistema de Bicoid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
3.2.1. Sistema biol ogico y su relevancia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
3.2.2. Aplicaci on del modelo al sistema de Bicoid . . . . . . . . . . . . . . . . 53
3.2.3. Estimaci on de par ametros de la reacci on del Bicoid con trampas . . . . . 56
4. Cuanticaci on de la difusi on del calcio por m etodos opticos 63
4.1. Teora de FCS para un sistema conteniendo calcio y un indicador . . . . . . . . 64
4.1.1. Funci on de autocorrelaci on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
4.1.2. Modelo aproximado para tiempos largos . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
4.2. Teora de FCS para un sistema conteniendo calcio, indicador y quelante. . . . . . 66
4.2.1. Coecientes de difusi on efectivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
4.2.2. Funci on de autocorrelaci on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
4.3. Experimentos de FCS en soluci on. Materiales y m etodos. . . . . . . . . . . . . . 73
4.3.1. Adquisici on de datos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
4.3.2. C alculo de la autocorrelaci on de la uorescencia experimental . . . . . . 74
4.3.3. Ajuste de las autocorrelaciones experimentales . . . . . . . . . . . . . . 74
4.4. Experimentos de FCS en soluciones con calcio y Fluo 4 . . . . . . . . . . . . . . 75
4.4.1. Obtenci on de par ametros de ajuste y estimaci on de coecientes de difusi on. 78
4.4.2. Estimaci on de par ametros de reacci on y concentraciones. . . . . . . . . . 82
4.5. Experimentos de FCS en soluciones con calcio, Fluo 4 y EGTA. . . . . . . . . . 83
4.5.1. Obtenci on de par ametros de ajuste y estimaci on de coecientes de difusi on. 85
4.5.2. Estimaci on de par ametros de reacci on y concentraciones. . . . . . . . . . 90
4.6. Propuesta de aplicaci on del modelo a mediciones de FCS en ovocitos . . . . . . 91
5. Se nales intracelulares de calcio, modicaci on de un microscopio comercial confocal
para su observaci on 95
5.1. El microscopio confocal Olympus FV1000 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
5.2. Adaptaci on del FV1000 para la fot olisis de compuestos enjaulados . . . . . . . . 97
5.3. Caracterizaci on del sistema de fot olisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
5.3.1. Potencia UV y atenuadores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
5.3.2. Tama no del haz de iluminaci on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
5.4. Prueba de funcionamiento usando calcio enjaulado . . . . . . . . . . . . . . . . 105
INDICE GENERAL 1
6. Observaci on de se nales de calcio en ovocitos de Xenopus laevis 109
6.1. Obtenci on de se nales de calcio en el FV1000 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
6.1.1. Acondicionamiento del laboratorio para tratamiento de ovocitos . . . . . 110
6.1.2. Preparaci on de los ovocitos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
6.1.3. Adquisici on y procesamiento de im agenes . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
6.2. Observaci on y caracterizaci on de se nales usando Fluo 4 Dextran . . . . . . . . . 116
6.3. Observaci on de se nales desde el retculo y perspectivas futuras . . . . . . . . . . 119
7. Conclusiones 125
A. Ap endice 133
Agradecimientos 135
Bibliografa 136
2

INDICE GENERAL
1
Introducci on
El calcio es utilizado como agente se nalizador para regular diferentes procesos en una enor-
me variedad de c elulas. Una completa descripci on de estas se nales requiere un conocimiento
detallado de la magnitud y cin etica del ujo de calcio que ingresa al citosol y de su posterior dis-
tribuci on espacial y temporal. Combinando la realizaci on de experimentos opticos que permitan
caracterizar cuantitativamente el transporte de calcio con el modelado matem atico, se avanza ha-
cia una descripci on abarcadora de las se nales intracelulares de calcio, determinando de qu e modo
la presencia de distintas sustancias modulan las se nales.
1.1. Se nales de calcio mediadas por IP
3
y su relevancia
Las se nales de calcio son utilizadas por muchos tipos celulares para iniciar procesos tan
diversos como la contracci on muscular, la divisi on o la muerte celular, entre otros [Berridge
et al., 1998]. La informaci on transmitida por el calcio est a codicada en la distribuci on espacio-
temporal de su concentraci on dentro de la c elula. Por esta raz on es de inter es estudiar los meca-
4 Introducci on
nismos que determinan y modulan dicha distribuci on. Las se nales se construyen con el paso del
calcio desde el medio extracelular o desde reservorios internos, hacia el citosol a trav es de cana-
les especcos. Entre los canales involucrados los receptores de IP
3
cumplen un rol fundamental
en muchos casos.
1.1.1. La maquinaria celular para el control de la concentraci on de calcio
Las c elulas tienen una gran variedad de mecanismos que act uan en diferentes niveles, que
controlan la concentraci on intracelular de Ca
2+
. Todos ellos dise nados para asegurar la presen-
cia de Ca
2+
en cantidades sucientes como para que pueda llevar a cabo sus funciones, evitando
exposiciones prolongadas de altas concentraciones dado que resultan t oxicas y pueden llevar a la
muerte celular. La concentraci on intracelular tpica de Ca
2+
est a alrededor de 0.1 M, mientras
que la extracelular es de aproximadamente 1 mM. Dentro de la c elula, existen reservorios inter-
nos que acumulan Ca
2+
, como por ejemplo mitocondrias, el retculo sarcoplasm atico (SR) y el
retculo endoplasm atico (ER) que presenta concentraciones del orden de 1 mM.
El inujo de iones de calcio al citoplasma se produce b asicamente por dos vas: a trav es
de la apertura de canales situados en la membrana plasm atica que separa el medio extracelular
del intracelular o mediante la liberaci on desde los reservorios internos. Existen varios tipos de
canales en la membrana plasm atica: en algunos la apertura es controlada por la diferencia de
potencial el ectrico a trav es de la membrana (importantes en la generaci on de oscilaciones r apidas
en c elulas cardacas y en los mecanismos de comunicaci on neuronal en la c elula pre-sin aptica),
en otros por la uni on de un ligando externo (como los receptores de NMDA presentes en sinapsis
de algunas neuronas), y en otros es incluso controlada por estmulos mec anicos. Con respecto
a la liberaci on desde reservorios internos, esta se produce principalmente a trav es de dos tipos
de canales ubicados en la membrana de los retculos sarco y/o endoplasm atico: los receptores
de rianodina y los receptores de inositol (1,4,5)-trifosfato (IP
3
R). Los receptores de rianodina
juegan un papel importante en la contracci on del m usculo cardaco. Los receptores de IP
3
se
encuentran predominantemente en c elulas no musculares y, en particular, son los responsables
de la liberaci on desde el retculo endoplasm atico en ovocitos [Choe and Ehrlich, 2006; Foskett
et al., 2007; Busa et al., 1985; Lechleiter and Clapham, 1992].
Para remover el calcio citos olico existen protenas especializadas que bombean calcio hacia
el exterior de la c elula o reinsert andolo en los reservorios internos. Ambos m etodos requieren un
gasto de energa ya que implican el transporte de una sustancia contra su gradiente de concen-
1.1 Se nales de calcio mediadas por IP
3
y su relevancia 5
Figura 1.1: Diagrama de alguno de los mecanismos involucrados en el control de la concentraci on
de calcio citos olico. Entrada de calcio al citosol: desde los dep ositos intracelulares (RE) mediante
IP
3
o abriendo canales de calcio de la membrana plasm atica, bien por despolarizaci on, por la
uni on de un ligando externo o por estmulos mec anicos. Remoci on de calcio del citosol: mediante
bombas o intercambiadores de la membrana plasm atica (PMCA, Na
+
-Ca
2+
) o mediante bombas
de los dep ositos (SERCA). El rellenado de los dep ositos requiere la presencia de protones (H
+
)
en su interior. Otras organelas como las mitocondrias tambi en pueden captar calcio.
6 Introducci on
traci on. Ejemplos del primer tipo son el intercambiador Na
+
-Ca
2+
, que usa la energa electro-
qumica almacenada en el gradiente de sodio a expensas de la entrada de iones Na
+
o la Ca
2+
ATPasa de la membrana plasm atica (PMCA), que consume energa entregada por la hidr olisis de
mol eculas de ATP. En ovocitos el mecanismo m as importante lo constituye la Ca
2+
ATPasa del
retculo endoplasm atico, o bomba SERCA por sus siglas en ingl es, que recaptura iones de Ca
2+
presentes en el citosol hacia el retculo endoplasm atico [Keener and Sneyd, 1998; Berridge et al.,
1998].
Pero la forma m as r apida de reducir la concentraci on citos olica de Ca
2+
es proporcionada
por sustancias llamadas buffers, que son grandes protenas que ligan Ca
2+
y est an presentes en
la mayora de los tipos de c elulas. Estos buffers de calcio atrapan Ca
2+
con diferentes anidades
y cin eticas, se estima que el 99 % del calcio citoplasm atico total se encuentra ligado a buffers.
Estas sustancias controlan tanto la concentraci on de Ca
2+
como su escala espacial de difusi on.
Protenas de este tipo tambi en est an presentes dentro de los reservorios internos. En la gura 1.1
se esquematizan s olo algunos de los mecanismos involucrados en el control de la concentraci on
de calcio citos olico.
1.1.2. Din amica del Receptor de IP
3
La din amica de los receptores de IP
3
aislados ha sido (y contin ua siendo) estudiada en for-
ma experimental usando distintas t ecnicas. Dado el difcil acceso a la regi on celular en donde
se encuentran estos receptores, muchas observaciones se han realizado en bicapas lipdicas re-
constituidas [Bezprozvanny et al., 1991; Watras et al., 1991]. Se han obtenido tambi en registros
electrosiol ogicos de canal unico usando la t ecnica de patch-clamp en n ucleos aislados de
ovocitos de Xenopus laevis [Mak et al., 2000, 1998].
En todos estos experimentos se estudia la corriente el ectrica que uye a trav es de los canales
cuando se jan las concentraciones de IP
3
y de Ca
2+
. B asicamente se ha observado que la aper-
tura de estos canales es un proceso estoc astico. Se ha estudiado la probabilidad estacionaria de
apertura y se ha visto que tanto el IP
3
como el Ca
2+
funcionan como moduladores de la misma.
Se ha demostrado que es necesaria la presencia de IP
3
para que el canal pueda abrirse. Tambi en
resulta relevante la concentraci on del calcio tanto en el lado citos olico del canal, como del lado
luminal (es decir, la concentraci on de calcio dentro del retculo endoplasm atico). De hecho, se
determin o que la concentraci on de calcio en el citosol juega un papel dual: a bajas concentracio-
nes promueve la apertura del canal, mientras que a altas concentraciones la inhibe [Bezprozvanny
1.1 Se nales de calcio mediadas por IP
3
y su relevancia 7
Figura 1.2: Probabilidad de apertura del receptor de IP
3
en funci on de la concentraci on de calcio
citos olico para diferentes concentraciones de IP
3
, Mak et al, 1999.
et al., 1991; Watras et al., 1991], ver gura 1.2. Este ultimo aspecto juega un papel esencial en
el hecho que el citosol se comporte como un medio excitable ya que, a bajas concentraciones la
presencia de calcio puede inducir la liberaci on de m as calcio, gener andose un ciclo de realimen-
taci on positiva. Este mecanismo no lineal de regulaci on se maniesta en un fen omeno conocido
como liberaci on de calcio inducida por calcio (CICR, por sus iniciales en ingl es).
1.1.3. Se nales de calcio en ovocitos de Xenopus laevis
El estudio de la din amica espacio-temporal del calcio se realiza principalmente en miocitos
y ovocitos. Los ovocitos de Xenopus laevis, una especie de rana originaria de

Africa, adem as
son usados como un sistema ventajoso en varias investigaciones experimentales biol ogicas. Se
caracterizan por poseer un gran tama no, teniendo un di ametro medio del orden del milmetro,
lo cual permite observar un amplio repertorio de se nales macrosc opicas. La variedad de se nales
observadas en ovocitos inmaduros, es consecuencia del hecho de que el calcio involucrado en las
mismas es liberado desde reservorios internos a trav es de canales que est an distribuidos de forma
espacialmente inhomog enea.
En este tipo de c elulas, los receptores de IP
3
son los responsables de la liberaci on desde el
retculo endoplasm atico [Choe and Ehrlich, 2006; Foskett et al., 2007; Busa et al., 1985; Lechlei-
8 Introducci on
ter and Clapham, 1992]. Diversos estudios han permitido concluir que, en algunas regiones del
ovocito inmaduro de Xenopus laevis, los receptores de IP
3
est an organizados en conglomerados
o clusters de aproximadamente 50 nm de lado [Swillens et al., 1999] separados entre s por entre
2 y 3 m. Los mismos est an principalmente concentrados en una regi on delgada (de unos 6 m
de ancho) cercana a la membrana plasm atica [Callamaras and Parker, 1999].
Jerarqua de eventos
El hecho de que la probabilidad de apertura de los receptores de IP
3
es modulada por la
concentraci on de calcio, hace del citosol un medio excitable en lo que se reere a la propagaci on
de las se nales de calcio. El ujo de Ca
2+
desde un canal abierto favorece la apertura de m as
canales, y dependiendo de la cantidad de IP
3
presente en el citosol, se observan distintos tipos
de eventos [Berridge et al., 1998; Parker et al., 1996a; Sun et al., 1998]. Todos estos eventos
se construyen a partir de eventos elementales que involucran la liberaci on desde un solo canal
abierto (blips). Estos eventos elementales son difciles de observar experimentalmente, en ellos
la retroalimentaci on se mantiene restringida a canales dentro de un cluster de modo que los sitios
de liberaci on individuales funcionan aut onomamente.
Frente a concentraciones moderadas de IP
3
, aparecen eventos un poco m as extensos (puffs),
que involucran la apertura coordinada de m ultiples canales que forman un conglomerado o clus-
ter. Estos eventos resultan m as f aciles de visualizar [Parker et al., 1996b]. Para mayores con-
centraciones de IP
3
se observan ondas globales que se propagan de un modo saltatorio mediante
el mecanismo de liberaci on de calcio inducida por calcio (CICR). Esta jerarqua de eventos se
esquematiza en la gura 1.3.
1.2. Observaci on de se nales de calcio
1.2.1. Indicadores de calcio
Para el estudio de se nales de calcio por m etodos opticos, se emplean indicadores de calcio.
Estos indicadores son sustancias que ligan calcio similarmente a como lo hacen los buffers, pero
que poseen la propiedad de modicar su espectro de emisi on de luz dependiendo de si tienen
o no iones de Ca
2+
ligados. Si se introduce una cierta cantidad de indicador en el citosol de la
c elula a estudiar y se ilumina el medio intracelular con luz l aser focalizada de longitud de onda
1.2 Observaci on de se nales de calcio 9
Figura 1.3: Esquema que muestra la actividad de canales y conglomerados o clusters de cana-
les modulados por IP
3
, en presencia de concentraciones crecientes de dicha sustancia. (A) Para
bajas concentraciones, pocos receptores ligan IP
3
, entonces la retroalimentaci on debida al calcio
liberado por un solo canal est a restringida a ese canal, produciendo una se nal de calcio peque na
y localizada (blip). (B) Para concentraciones intermedias de IP
3
, el calcio liberado a trav es de
la apertura espont anea de un canal causa la apertura de muchos otros canales dentro del mismo
cluster y origina un puff, pero no logra activar clusters adyacentes. (C) Altas concentraciones
de IP
3
provocan ondas de propagaci on de calcio mediante el mecanismo de liberaci on de calcio
inducida por calcio (CICR).
10 Introducci on
Figura 1.4: Espectro de excitaci on y emisi on del indicador de calcio Fluo 4 (Invitrogen
Molecular Probes) con calcio ligado. El espectro de emisi on del indicador sin calcio ligado
es pr acticamente nulo. Indicado con una lnea vertical se especica la lnea l aser utilizada. El
sombreado indica el rango de longitudes de onda sugerido para su detecci on.
dentro del espectro de absorci on del indicador, recogiendo la se nal lumnica emitida por esta
sustancia es posible seguir la evoluci on de la cantidad de calcio ligada al indicador dentro del
medio intracelular, con una resoluci on espacial del orden del micr on y temporal de milisegundos.
Esta t ecnica es esencialmente no invasiva, excepto por la presencia del indicador uorescente.
Como ejemplo, se presenta en la gura 1.4, el espectro de absorci on y emisi on del indicador
Fluo 4 (Invitrogen-Molecular Probes), cuando presenta calcio ligado. El Fluo 4 pertenece a la
clase de indicador estudiado en este trabajo: el espectro de emisi on del indicador sin calcio
ligado es pr acticamente nulo; al ligar calcio y ser excitado con fotones de longitudes de onda
dentro de su espectro de absorci on, el indicador uoresce emitiendo fotones dentro del espectro
de emisi on del indicador. La relaci on entre la concentraci on de calcio libre y la ligada al indicador
es no lineal, especialmente en las zonas de altas concentraciones [Nuccitelli, 1994].
Dado que en este tipo de estudios se registra la din amica del indicador ligado a calcio, hay
que tener especial cuidado al extraer informaci on acerca de la din amica espacio-temporal del
calcio libre, ya que se ver an involucrados par ametros fsicos del indicador, como las constantes
de la reacci on y su coeciente de difusi on.
1.2.2. Fot olisis de compuestos enjaulados
La fot olisis de compuestos enjaulados es una t ecnica que usa mol eculas especialmente di-
se nadas para generar cambios r apidos en la concentraci on de sustancias [Adams and Tsien, 1993;
1.2 Observaci on de se nales de calcio 11
Callaway and Yuste, 2002; Kaplan, 1990], y resulta esencial para la observaci on de se nales de
calcio mediadas por IP
3
. Esta t ecnica se basa en el uso de mol eculas biol ogicamente activas que
se sintetizan con un grupo fotosensible (jaula o cage), que los hace inactivos. Al ser expuesta
a luz, por lo general en el rango ultravioleta, se transforma o se corta la uni on con la jaula y la
mol ecula se activa. De esta forma, la fot olisis de compuestos enjaulados, permite generar estmu-
los controlados y reproducibles, ideales para estudiar fen omenos siol ogicos que dependen de
cambios bruscos en la concentraci on. Adem as, se puede utilizar en combinaci on con indicado-
res uorescentes (que en general son excitados por fotones de longitud de onda m as larga) para
observar las consecuencias de los estmulos.
Entre los diversos compuestos enjaulados est a actualmente disponible en el mercado una for-
ma enjaulada de IP
3
que ha demostrado ser muy util para obtener se nales intracelulares de calcio
mediadas por IP
3
en una gran variedad de c elulas [Callamaras and Parker, 1998], en particular, en
ovocitos. En estas ultimas, la forma enjaulada debe introducirse junto con el indicador de calcio.
Mediante un corto pulso de luz ultravioleta, se desenjaula el IP
3
aumentando las probabilidades
de liberaci on de calcio a trav es de los receptores de IP
3
y simult aneamente se registra el calcio
ligado al indicador.
1.2.3. Microscopa confocal
Para la observaci on de las se nales de calcio en ovocitos, se emplea la microscopa l aser
confocal. La microscopa l aser confocal es una nueva t ecnica de observaci on que est a logrando
excelentes resultados en diversas ramas de la ciencia (medicina, biologa, materiales, geologa,
etc.) La observaci on de especmenes ha estado limitada, porque estos tienen grosores variables
y trasmiten y reejan la luz de manera no uniforme. Las areas fuera del plano focal degradan
la imagen haci endola borrosa, disminuyendo el contraste y la resoluci on, dicultando as la ob-
servaci on de las estructuras que componen un esp ecimen. La ventajas que ofrece la microscopa
confocal frente a la microscopa optica tradicional son im agenes de mayor nitidez y contraste,
mayor resoluci on lateral y axial. Esta t ecnica posibilita la obtenci on de secciones opticas de la
muestra, lo que permite su estudio tridimensional.
Aunque el principio de la microscopa confocal fue patentado hace varios a nos (Minsk, 1957)
y los primeros microscopios basados en esta t ecnica que demostraron su validez fueron descritos
por Petran et al. en 1968 , su gran aceptaci on y desarrollo no ha tenido lugar hasta hace unos
pocos a nos con el desarrollo del l aser [Wilson and Sheppard, 1984; Pawley, 2006].
12 Introducci on
Figura 1.5: Esquema del principio de la microscopa confocal. La luz procedente de los puntos
fuera del plano focal es eliminada por el diafragma o pinhole.
La microscopa confocal emplea un l aser enfocado que ilumina un punto o regi on de la mues-
tra a la vez. La se nal emitida por la regi on iluminada vuelve por el mismo camino optico, pasa a
trav es de un espejo dicroico y es enfocada en un detector (en general un fotomultiplicador (PMT)
o fotodiodo de avalancha). Un peque no diafragma o pinhole es colocado delante del detector
para eliminar las se nales procedentes de la zona fuera de foco. La luz recolectada de la muestra,
que proviene del plano focal del objetivo, es reenfocada y transmitida por el pinhole sin ningu-
na p erdida. En cambio, la luz dispersada o emitida por los puntos que se encuentran fuera del
plano de la imagen es atenuada o bloqueada completamente, ver gura1.5. De esta manera, se
obtiene una imagen de alto contraste y denici on de un punto en el plano focal, sin que haya una
contribuci on signicativa de las regiones que se encuentran fuera de foco. Para poder generar
una imagen completa del plano, el microscopio realiza un barrido o escaneo punto a punto en
el plano X-Y moviendo la direcci on del l aser a los distintos puntos de la muestra. En cada uno
de esos puntos el PMT detecta la uorescencia emitida (ltrada por el pinhole) y le asigna una
intensidad de pxel (generalmente de 8 bit = valores de 0 a 255). Utilizando la intensidad de cada
pxel se reconstruye una imagen digital.
Esta t ecnica es ideal para la observaci on de especimenes de gran tama no, como el ovocito. Si
bien la regi on donde se encuentran los receptores es relativamente delgada ( 6 m) comparada
1.3 Din amica del calcio intracelular y procesos de reacci ondifusi on 13
con su tama no, el uso de la microscopa confocal permite tener im agenes denidas de los eventos
de calcio. En el caso de las se nales de calcio, se emplea el modo de barrido de una lnea, que
registra la intensidad de la uorescencia realizando sucesivos barridos sobre una misma lnea
denida en la regi on de inter es del ovocito. Se elige adquirir la uorescencia en una lnea en
lugar de una imagen ya que, si bien se pierde cierta resoluci on espacial, la resoluci on temporal
resulta signicativamente mayor.
1.3. Din amica del calcio intracelular y procesos de reacci on
difusi on
Cuando el calcio ingresa al citosol adem as de difundir reacciona con los buffers end ogenos
presentes. Como se mencion o antes, hay otros mecanismos que tambi en afectan la concentraci on
de calcio citos olico, como las bombas.

Estas act uan en una escala temporal m as lenta que los
buffers por lo que no se considerar an en esta secci on. Ac a nos concentramos en la din amica
del calcio en presencia de buffers exclusivamente. Se cree que pr acticamente el 99 % del calcio
citos olico se encuentra ligado a buffers end ogenos. Los buffers de calcio atrapan y liberan Ca
2+
con diferentes anidades y cin eticas. La caracterizaci on de la capacidad buffer de la c elula es
de suma importancia para entender las se nales de calcio, porque los buffers no s olo reducen la
concentraci on de calcio libre en el citosol, sino que tambi en afectan la distribuci on espacial y el
comportamiento temporal de las se nales. Dado que los buffers difunden m as lentamente que el
calcio, su interacci on con este i on reduce efectivamente su movilidad limitando su rango espacial
de acci on. Se cree que la informaci on se encuentra guardada en la distribuci on espacio temporal
del calcio. Para entender las se nales de calcio libre es necesario caracterizar cuantitativamente la
concentraci on y cin etica de los buffers end ogenos que est an presentes en cada tipo de c elula y la
forma en que su presencia reduce la tasa de transporte del calcio.
1.3.1. Procesos de reacci on-difusi on
La interacci on del Ca
2+
con los buffers puede ser descripta mediante reacciones de la forma:
Ca
2+
+ B
i
k
off,i
k
on,i
CaB
i
, (1.1)
14 Introducci on
donde k
on,i
y k
off,i
son las constantes cin eticas de asociaci on y disociaci on para la reacci on
del buffer B
i
con Ca
2+
y CaB
i
es el buffer B
i
ligado a Ca
2+
. Si se considera que a t = 0 la
concentraci on total de cada buffer, [B
i
](t = 0) + [CaB
i
](t = 0), est a uniformemente distribuida
en el espacio, B
tot,i
[B
i
](t = 0) +[CaB
i
](t = 0); y que las formas libre y ligada del buffer, B
i
y CaB
i
, respectivamente, difunden a la misma tasa, D
B,i
, se puede mostrar que [B
i
] +[CaB
i
] =
B
tot,i
para todo tiempo y posici on del espacio. De esta forma, se pueden considerar las ecuaciones
de evoluci on de [Ca
2+
](x, t) y de una sola variable por buffer, por ejemplo [CaB
i
](x, t). Las
ecuaciones de evoluci on para el sistema pueden escribirse como:
[Ca
2+
]
t
= D
Ca
2
[Ca
2+
] +
i
(k
on,i
[Ca
2+
](B
tot,i
[CaB
i
]) +k
off,i
[CaB
i
]), (1.2)
[CaB
i
]
t
= D
B,i
2
[CaB
i
] (k
on,i
[Ca
2+
](B
tot,i
[CaB
i
]) +k
off,i
[CaB
i
]), (1.3)
donde la sumatoria recorre todos los buffers que afectan la din amica del calcio citos olico y D
Ca
es el coeciente de difusi on libre para Ca
2+
. Para poder resolver el sistema completo dado por
las Ecs. (1.2)-(1.3), se necesita un conocimiento completo de los par ametros cin eticos y las con-
centraciones. Desafortunadamente, esta informaci on est a muy pobremente caracterizada.
Aproximaci on de Buffers R apidos
Las Ecs. (1.2)-(1.3) representan la descripci on del sistema de reacci ondifusi on calcio
buffers. Diferentes reducciones analticas de este modelo matem atico completo han sido deri-
vadas en diferentes regmenes lmite. En particular, la Aproximaci on de Buffers R apidos (RBA)
se basa en la hip otesis de que no todos los procesos ocurren en la misma escala temporal: las
reacciones con los buffers son los procesos m as r apidos durante la evoluci on. De este modo, se
puede considerar que los buffers y el Ca
2+
est an localmente en equilibrio qumico, en cada punto
del espacio:
B
eq,i
=
K
d,i
B
tot,i
K
d,i
+ Ca
eq
(1.4)
donde Ca
eq
y B
eq,i
son las concentraciones de calcio y buffer i libre en el equilibrio, y K
d,i
es la
constante de disociaci on de la reacci on Ca
2+
- buffer i denida como K
d,i
= k
off,i
/k
on,i
.
En presencia de buffers r apidos, las ecuaciones completas de reacci on difusi on que describen
el transporte del Ca
2+
Ecs. (1.2)-(1.3) se pueden reducir a una unica ecuaci on de transporte para
la concentraci on de calcio libre, usando la aproximaci on de buffers r apidos. La ecuaci on redu-
cida puede reescribirse como una ecuaci on de reacci on-difusi on con un coeciente de difusi on
1.3 Din amica del calcio intracelular y procesos de reacci ondifusi on 15
dependiente de la concentraci on [Sneyd et al., 1998]:
D
RBA
=
D
Ca
+
i
B
2
eq,i
B
tot,i
K
d,i
D
B,i
1 +
i
B
2
eq,i
B
tot,i
K
d,i
(1.5)
La validez de esta aproximaci on fue estudiada en muchos trabajos, entre ellos Smith et al. [1996];
Strier et al. [2003]. Sin embargo, a un siendo simplicadas, las ecuaciones reducidas requieren
conocimiento detallado de procesos y par ametros que est an pobremente caracterizados.
1.3.2. Estimaci on de la difusi on efectiva del calcio usando sustancias ra-
dioactivas
En Allbritton et al. [1992] se estudi o el coeciente de difusi on del calcio en extracto citos oli-
co de ovocitos de Xenopus laevis, empleando calcio radioactivo
45
Ca
2+
. El calcio radioactivo
se coloc o en la parte superior de un tubo delgado que contena el extracto citos olico, dej andolo
difundir por varios perodos de tiempo. El tubo fue congelado y cortado en nas rodajas, deter-
min andose la concentraci on de calcio radioactivo en cada secci on, a partir de la cual inrieron el
coeciente de difusi on del calcio. El experimento fue repetido varias veces agregando al extrac-
to citos olico diferentes cantidades de calcio no radioactivo y dej andolo equilibrar con el medio
antes de agregar el calcio radioactivo. En ese trabajo se observ o que el valor del coeciente de
difusi on del calcio medido dependa de la concentraci on de calcio agregado al extracto: a medida
que se agregaba calcio al medio, mayor era el coeciente de difusi on medido. Se determin o que
el coeciente de difusi on para el calcio aumentaba de 13 a 65 m
2
/s cuando la concentraci on de
calcio libre se elevaba de 90 nM a 1 M. En Allbritton et al. [1992] proponen que la disminuci on
del coeciente de difusi on del calcio en condiciones siol ogicas (baja concentraci on de calcio
90 nM) es resultado de su uni on a buffers m oviles e inm oviles presentes en el extracto. La
tasa de transporte neta del calcio es, an alogamente a lo encontrado en la aproximaci on de buf-
fers r apidos (Ec. 1.5), un promedio pesado entre la difusi on libre del i on y la de los buffers que
depende de cuanto calcio se encuentra ligado a estos ultimos. Al aumentar la concentraci on de
calcio, menor resulta la proporci on de concentraci on de calcio ligado a buffers y as aumenta el
coeciente de difusi on efectivo, ya que el calcio libre difunde m as r apidamente que los buffers
y que el calcio ligado a ellos. Como mostramos m as adelante, no existe un unico coeciente
de difusi on efectivo, por lo que es necesario tener sumo cuidado al interpretar los resultados
experimentales que determinan dichos coecientes
16 Introducci on
1.3.3. Transporte en presencia de trampas y difusi on efectiva
Adem as del calcio, las c elulas utilizan el movimiento de mol eculas mensajeras para trans-
mitir informaci on que se utiliza para regular una gran variedad de procesos, mediante diferentes
mecanismos. En muchos casos, tanto en bacterias como en c elulas eucariotas, el movimiento de
las mol eculas no se produce por difusi on, sino por mecanismos de transporte activo con la parti-
cipaci on del citoesqueleto [Alberts et al., 2007]. Sin embargo, incluso en el caso de difusi on, es
poco probable que el movimiento sea puramente difusivo. Adem as de las restricciones de movi-
lidad debido a la aglomeraci on macromolecular [Ellis, 2001], la difusi on de los mensajeros suele
verse afectada por su interacci on con otras sustancias que disminuyen la velocidad de las partcu-
las en el medio. En ese sentido, estas mol eculas act uan como trampas. El transporte que resulta
de la combinaci on de difusi on y las reacciones con las trampas se suele describir en t erminos de
un coeciente de difusi on efectivo que depende de la concentraci on de las especies involucradas.
Los coecientes de difusi on de estos mensajeros imponen restricciones sobre el rango y tiempos
caractersticos de la propagaci on de la se nal, y por lo tanto afectan el rendimiento global de los
procesos biol ogicos que dependen de estos mensajeros.
Coecientes efectivos de difusi on
En Pando et al. [2006] se estudi o el caso de un medio con partculas libres P
f
y trampas S
que difunden y reaccionan entre s de acuerdo a un esquema bi-molecular (como el presentado
en el caso del calcio y el buffer), asumiendo que las partculas ligadas P
b
difunden a la misma
tasa que la trampa. Si en ese medio coexisten partculas que est an marcadas (superndice t) y
que no est an marcadas (superndice u), las poblaciones se dividen en dos grupos: P
t
f
y P
u
f
para
partculas libres, y P
t
b
y P
u
b
para partculas ligadas. Se mostr o en Pando et al. [2006], que hay dos
coecientes de difusi on efectivos diferentes que describen la difusi on de las partculas en esta
situaci on. Uno de ellos, D
t
, regula la dependencia temporal del desplazamiento medio cuadr atico
de una sola partcula marcada que difunde en un medio de trampas en equilibrio con partculas
sin marcar. D
t
tambi en describe la propagaci on de una bola de partculas marcadas en un medio
sin marcar. El otro coeciente, D
u
, regula la evoluci on de una bola de partculas sin marcar en el
mismo medio. Estos coecientes se escriben como:
D
t
=
D
f
+ (S
eq
/K
d
)D
S
1 +S
eq
/K
d
(1.6)
D
u
=
D
f
+ [S
2
eq
/(K
d
S
tot
)]D
S
1 +S
2
eq
/(K
d
S
tot
)
. (1.7)
1.4 Cuanticaci on de la difusi on por m etodos opticos 17
donde D
f
y D
S
son los coecientes de difusi on de la partcula libre y la trampa respectivamente,
K
d
la constante de disociaci on, S
eq
la concentraci on de trampas libres en el equilibrio y S
tot
la
concentraci on total de trampas. N otese que D
u
coincide con el coeciente efectivo obtenido a
partir de la aproximaci on de buffers r apidos, Ec. 1.5.
En la mayora de los casos, las trampas difunden m as lentamente que las partculas libres de
modo que D
t
/D
u
1. Dependiendo de los par ametros de la reacci on entre trampas y partculas,
esta relaci on puede ser arbitrariamente peque na. Los mensajes son transmitidos generalmente por
mol eculas que se han activado por una modicaci on covalente despu es de la traducci on (siendo
la fosforilaci on la m as com un). Dado que en cada tiempo, s olo una fracci on de las mol eculas
se activa, se puede pensar a las mol eculas activas como marcadas, difundiendo en un medio con
partculas sin marcar (mol eculas no activas). Esto indica la necesidad de ser sumamente cuidado-
so al interpretar los resultados de experimentos que usan partculas marcadas para obtener tasas
de transporte. La determinaci on de D
t
y D
u
podra ser clave para comprender la propagaci on de
la se nal cuantitativamente.
1.4. Cuanticaci on de la difusi on por m etodos opticos
1.4.1. Marcaci on de compuestos para su observaci on
Para estudiar mediante m etodos opticos la difusi on de sustancias es necesario poder mar-
carlas uorescentemente. Si la sustancia de inter es es una protena, existen t ecnicas de fusi on
que permiten unir la protena de inter es a una protena uorescente, como por ejemplo GFP o
YFP. Existe una gran variedad de protenas uorescentes disponible en el mercado y, gracias a
los avances en la tecnologa de fusi on, es posible marcar uorescentemente una amplia gama de
protenas biol ogicamente relevantes [Stepanenko et al., 2008; Chudakov et al., 2005]. Otra for-
ma de marcar uorescentemente a una partcula es unir qumicamente un uor oforo a un grupo
especco funcional de la mol ecula de inter es. Este uor oforo puede ser una peque na mol ecula
uorescente o una partcula quantum dot, que son nanocristales semiconductores que emiten
luz en una variedad de colores [Walling et al., 2009; Keppler et al., 2003; Smith, 2007]. A menos
que se trate de una sonda especcamente dise nada, como por ejemplo las sondas de Ca
2+
, en
general, estas partculas o protenas marcadas no cambian su uorescencia al unirse a un sustrato
18 Introducci on
que act ue como trampa; permanecen uorescentes a no ser que se fotoblanqueen
1
.
1.4.2. Espectroscopa de Correlaci on de Fluorescencia (FCS)
La Espectroscopa de Correlaci on de Fluorescencia, o FCS por sus iniciales en ingl es, es
una poderosa herramienta que permite determinar de manera no invasiva concentraciones loca-
les, coecientes de difusi on, cambios conformacionales y reacciones fotoqumicas de mol eculas
uorescentes en condiciones siol ogicas. FCS es una t ecnica basada en la medici on de la au-
tocorrelaci on de las uctuaciones de la intensidad de la uorescencia F(t) en un volumen de
detecci on del orden del femtolitro, generado usualmente por un haz de l aser enfocado y de-
tecci on confocal [Magde et al., 1972; Elson, 2001; Kim and Schwille, 2003; Krichevsky and
Bonnet, 2002; Gr unwald et al., 2005]. La distribuci on de intensidad del sistema de iluminaci on
y detecci on confocal es com unmente aproximado por una gaussiana en tres dimensiones:
I(r) = I(0)e
2r
2
w
2
r
e
2z
2
w
2
z
, (1.8)
donde I(0) es la intensidad de la iluminaci on en r = 0; (r, z) son la coordenadas cilndricas
con z la coordenada espacial a lo largo de la direcci on de propagaci on del haz y r la coordenada
radial en el plano perpendicular a dicha direcci on; w
z
y w
r
son los tama nos de la cintura del
haz a lo largo de z y r respectivamente, en general, w
z
> w
r
. Las uctuaciones estadsticas
de la uorescencia alrededor del equilibrio se analizan calculando la funci on de autocorrelaci on
denida por:
G() =
F(t)F(t + )
F(t)
2
, (1.9)
donde F(t) es el promedio temporal de la uorescencia en el volumen de detecci on y F(t) es
la desviaci on en cada tiempo t, de la uorescencia con respecto a este valor promedio.
Difusi on de partculas libres
En un caso de m especies de partculas marcadas uorescentemente, la amplitud de la uo-
rescencia esta dada por:
F(t) =
_
I(r)
m
i=1
(Q
i
[C
i
](r, t))d
3
r, (1.10)
1
p erdida irreversible de la uorescencia de un uor oforo debido a da nos qumicos producidos por los fotones.
donde [C
i
](r, t) es la concentraci on de partculas de especie i a tiempo t y en el punto r. El
par ametro Q
i
, es el producto de la eciencia de detecci on, eciencia cu antica y la secci on ecaz
de absorci on, caracterstico de cada especie uorescente i.
Si las diferentes especies de partculas difunden libremente con coeciente de difusi on D
i
,
sin interactuar entre s, la funci on de autocorrelaci on dada por la Ec. (1.9) se puede calcular
analticamente:
G() =
m
i=1
Go
i
_
1 +

Di
__
1 +

w
2
Di
, (1.11)
donde w = w
z
/w
r
y
Di
es el tiempo caracterstico de difusi on de la especie i a trav es del
volumen de detecci on, que depende del coeciente de difusi on de las partculas, D
i
, de la forma:
Di
=
w
2
r
4D
i
(1.12)
El valor de los pesos, Go
i
, es inversamente proporcional a la concentraci on total de partculas
uorescentes de especie i, P
tot,i
, y se escribe:
Go
i
=
1
V
ef
P
tot,i
(1.13)
donde V
ef
es el volumen confocal efectivo denido como:
V
ef
=
3/2
w
2
r
w
z
. (1.14)
A modo de ejemplo, se ilustra en la gura 1.6 el caso de difusi on libre de TMR-dextran
(Invitrogen-Molecular Probes) en agua. TMR-dextran est a formada por la uni on de TMR, una
peque na mol ecula uorescente, a un dextrano de peso molecular 10000. En la gura 1.6(a) se
observa un tramo de la serie temporal de la uorescencia adquirida en un experimento de FCS
que se realiz o en el microscopio confocal modelo Fluo View 1000 de la rma Olympus del La-
boratorio de Microscopa y Microespectroscopa. All se pueden apreciar las uctuaciones de
la intensidad alrededor del valor de equilibrio. La curva de autocorrelaci on experimental, gu-
ra 1.6(b), se obtiene restando el valor medio de la uorescencia a la serie temporal y calculando
la autocorrelaci on seg un Ec. (1.9). Para extraer informaci on de los experimentos, la curva de
autocorrelaci on obtenida experimentalmente debe ser ajustada por un modelo adecuado de auto-
correlaci on, en este caso el de difusi on libre de una sola especie, Ec. (1.11) especicando m = 1.
Dos par ametros pueden ser determinados a partir de su ajuste: el valor de la correlaci on a = 0,
Go
1
, y el tiempo caracterstico
D1
, que puede interpretarse como el tiempo de residencia medio
de las partculas uorescentes en el volumen de detecci on. Previamente, se debe realizar una
20 Introducci on
calibraci on para determinar los par ametros geom etricos del volumen de detecci on, que consiste
en realizar un experimento de FCS de difusi on libre con una muestra de coeciente de difusi on
conocido. Una vez conocidos w
r
y w
z
, se pueden estimar los valores de D
1
y P
tot
a partir de
D1
y Go
1
respectivamente.
2 3 4 5 6 7
3.8
4
4.2
4.4
4.6
4.8
x 10
4
t (ms)
F
l
u
o
r
e
s
c
e
n
c
i
a
<F(t)>
t t +
(a) Serie temporal de la uorescencia

10
5
10
4
10
3
10
2
10
1
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
(s)
A
C
F
Go
1
D1
(b) Funci on de autocorrelaci on, datos experimentales (puntos), ajuste (lnea contnua)
Figura 1.6: Datos experimentales obtenidos en soluci on 50 nM TMR-dextran
en agua, emplean-
do la t ecnica FCS en microscopio confocal Fluo View 1000 Olympus.

Invitrogen-Molecular
Probes
FCS en procesos de reacci on- difusi on
En el caso general de un sistema de muchos componentes qumicos que difunden e inter-
act uan qumicamente entre s, las uctuaciones estadsticas alrededor del equilibrio, provienen
no s olo de la difusi on de partculas que entran y salen del volumen de detecci on, sino tambi en
de las uctuaciones qumicas debidas a la asociaci on y disociaci on de mol eculas [Magde et al.,
1972].
Con el n de encontrar una expresi on general para la funci on de correlaci on, se deben plan-
tear las ecuaciones de reacci on-difusi on. La soluci on de estas ecuaciones linealizadas alrededor
del equilibrio, se puede expresar en el espacio de Fourier y puede ser escrita en t ermino de
las ramas de autovalores, (q), y autovectores, (q), donde q es la variable conjugada en el
espacio de Fourier de la coordenada espacial, r. En el caso de un sistema de m componen-
tes qumicos que difunden e interact uan qumicamente entre s, la autocorrelaci on denida en
Ec. (1.9) con la uorescencia dada por la Ec. (1.10) puede ser escrita en t erminos de los auto-
valores y autovectores del problema de reacci on-difusi on linealizado. Si la longitud de corre-
laci on es mucho m as chica que la distancia entre dos partculas uorescentes, es posible asu-
mir que las uctuaciones en las concentraciones de las especies uorescentes C
i
, satisfacen
C
j
(r, 0)C
k
(r
, 0) = C
eq,j
jk
(r r
), 1 j, k m. En ese caso, G() puede ser escrita

como Krichevsky and Bonnet [2002]:
G() =
1
(2)
3
(
m
i=1
Q
i
C
eq,i
)
2

_
d
3
q

I(q)
m
j,k=1
Q
j
Q
k
C
eq,j
m
s=1
ks
e
s
1
sj
(1.15)
donde
I(q) e
w
2
r
q
2
r
4

w
2
z
q
2
z
4
(1.16)
con q
r
y q
z
las variables conjugadas en el espacio de Fourier de r y z, respectivamente, C
eq,i
es
la concentraci on en equilibrio del componente i y
s
y son los autovalores y la matriz con los
autovectores del problema linealizado.
Los coecientes de los procesos de reacci on-difusi on, como los coecientes de difusi on y
constantes de reacci on, determinan la forma de la funci on de correlaci on. En principio, a partir
de expresiones para la funci on de correlaci on, es posible obtener los valores de los coecientes.
Pero a veces la presencia de dos o m as procesos puede resultar confusa y no siempre se pue-
de obtener informaci on dedigna y conable acerca de estos coecientes. Adem as no siempre
22 Introducci on
se cuenta con una expresi on analtica de la funci on de correlaci on, raz on por la cual se usan
aproximaciones validas en diferentes regmenes. Es por eso que cada caso en particular se de-
be analizar cuidadosamente para obtener datos conables acerca de los procesos que causan las
uctuaciones estudiadas en este tipo de t ecnica.
1.4.3. Recuperaci on de la uorescencia tras fotoblanqueo (FRAP)
La recuperaci on de la uorescencia tras fotoblanqueado, o FRAP por sus iniciales en ingl es,
es otra t ecnica optica muy usada para la determinaci on de coecientes de difusi on y el estudio
de interacciones de protenas en c elulas. Existe una extensa lista de bibliografa sobre el tema
entre los cuales se destacan Axelrod et al. [1976]; Jacobson and Wojcieszyn [1984]; Gribbon and
Hardingham [1998]; Braeckmans et al. [2003]; Sprague and McNally [2005]; a continuaci on se
presenta muy brevemente los conceptos de FRAP necesarios para este trabajo.
La t ecnica de FRAP se basa en medir la recuperaci on de la uorescencia en un volumen,
luego de haber fotoblanqueado al marcador uorescente. La forma en que se recupera la uo-
rescencia est a relacionada con los procesos de difusi on y/o reacci on a los que est a sujeto el
marcador. La curva de recuperaci on puede ser descripta de la siguiente forma:
f(t) =
F(t) F
0
F
F
0
(1.17)
donde F(t) es la uorescencia en el volumen de detecci on, F
0
es la uorescencia inmediatamente
despu es de fotoblanquear y F
es la uorescencia a tiempos largos. En la gura 1.7, se muestra

una curva de recuperaci on tpica de FRAP.
Tiempo
F
l
u
o
r
e
s
c
e
n
c
i
a
F
0
Fotoblanqueo
F
Figura 1.7: Curva de recuperaci on caracterstica de la uorescencia en un experimento de FRAP.

1.5 Esquema de la Tesis 23
FRAP en procesos de reacci ondifusion
En FRAP la situaci on inicial de equilibrio es perturbada al fotoblanquear una regi on y se
mide la recuperaci on de la uorescencia, que en denitiva es la difusi on de partculas marcadas
en una regi on de partculas sin marcar. Es de esperar que el coeciente de difusi on que rija su
comportamiento sea D
t
. De hecho, en el caso de partculas marcadas en presencia de trampas,
se demostr o en Sprague et al. [2004], que cuando la reacci on ocurre en una escala temporal m as
r apida que la difusi on libre, los experimentos de FRAP dan informaci on acerca del coeciente
de difusi on efectivo, D
t
.
1.5. Esquema de la Tesis
El objetivo de esta Tesis es avanzar en la obtenci on de estimaciones realistas del transporte
y tasas de reacci on del calcio con su indicador y con buffers, realizando experimentos opticos
y desarrollando el marco te orico necesario para extraer informaci on cuantitativa de los mismos,
con el n de lograr una mayor entendimiento de las se nales de calcio. La organizaci on de la Tesis
se describe a continuaci on.
En el Captulo 2 se estudia en forma detallada la informaci on que es posible extraer a partir
de experimentos de FCS en donde la sustancia de inter es marcada uorescentemente, difunde
y reacciona. En particular, se demuestra que las t ecnicas de FCS y FRAP brindan informaci on
sobre coecientes distintos, que puede ser combinada para inferir tasas de reacci on y de difusi on
libre.
En el Captulo 3 se realiza el estudio te orico para el caso en que coexisten mol eculas mar-
cadas y no marcadas en el mismo sistema. Los resultados son aplicados para explicar las dife-
rencias observadas en experimentos de FCS y FRAP, realizados para determinar el coeciente
de difusi on del producto del gen bicoid en embriones de moscas Drosophila melanogaster, una
sustancia fundamental para el establecimiento del eje dorsoventral en este organismo.
En el Captulo 4 se estudia la aplicaci on de FCS para inferir propiedades de transporte e
interacciones del calcio. Para tal n se investigan los coecientes efectivos de difusi on que se
obtienen en un sistema donde hay partculas que interact uan con dos tipos de trampa, aplic andose
al caso particular del calcio identicando una de las trampas con el indicador y la otra con un
buffer no uorescente. Se presentan datos experimentales en soluci on empleando un indicador de
24 Introducci on
calcio, que corroboran la existencia de dichos coecientes. Se propone un m etodo para estimar
la difusi on del calcio y la capacidad buffer en ovocitos a partir de experimentos de FCS.
En el Captulo 5 se presenta el dise no e implementaci on de una adaptaci on de un microscopio
confocal Olympus FV1000 para realizar la fot olisis de compuestos enjaulados mediante luz ul-
travioleta. Esta adaptaci on resulta esencial para la observaci on de se nales de calcio mediadas por
IP
3
. Se caracteriza el sistema y se comprueba su capacidad para fotolizar compuestos enjaulados.
En el Captulo 6 se muestra la habilidad del sistema presentado en el Captulo 5, para generar
estmulos precisos y controlados de IP
3
simult aneamente a la obtenci on de im agenes confocales
en ovocitos de Xenopus laevis. Se presenta el m etodo de obtenci on de las se nales de calcio y se
muestran diferentes registros de se nales de calcio en ovocitos.
Por ultimo, en el Captulo 7 se sintetizan los resultados de la Tesis, se presentan sus conclusio-
nes generales y se discuten sus aplicaciones y las lneas de investigaci on que quedan planteadas
a partir de la misma.
2
Difusi on en presencia de trampas.
Coecientes efectivos y su cuanticaci on
mediante FCS y FRAP
En este captulo se estudia la funci on de correlaci on que se obtiene mediante FCS cuando
coexisten procesos de difusi on y reacci on. Se describe el caso de partculas uorescentes difun-
diendo en un medio homog eneo con trampas, que presentan cierta probabilidad por unidad de
tiempo de atrapar o liberar a una partcula de acuerdo a un esquema de reacci on bi-molecular.
Se presenta la expresi on integral de la funci on de correlaci on para este caso. Mediante la apro-
ximaci on a tiempo largos se obtiene una expresi on analtica de la funci on de correlaci on, que
es funci on de coecientes efectivos de difusi on. Se estudia la validez de dicha aproximaci on y
se compara con el modelo integral. Este modelo aproximado brinda una expresi on analtica que
puede ser usada para obtener par ametros de reacci on - difusi on, ajustando datos experimenta-
les con el modelo aproximado. Se discute la informaci on que puede ser obtenida empleando el
modelo aproximado en experimentos de FCS y adem as en combinaci on con experimentos de
26
Difusi on en presencia de trampas. Coecientes efectivos y su cuanticaci on mediante FCS y
FRAP
FRAP.
2.1. Modelo completo de FCS para partculas uorescentes
que difunden y reaccionan con trampas
A continuaci on se estudiar a el comportamiento de la funci on de correlaci on cuando coexisten
procesos de difusi on y reacci on. En particular, se describe el caso en que partculas uorescentes
difunden en un medio homog eneo con trampas, que presentan cierta probabilidad por unidad de
tiempo de atrapar o liberar a una partcula. El modelo simple, m as realista, que incorpora trampas
y partculas, es el que reacciona de acuerdo al esquema:
P
f
+ S
k
off
k
on
P
b
(2.1)
donde k
on
y k
off
son las constantes cin eticas de la reacci on. En el esquema (2.1) S representa
las trampas libres, P
f
representa a las partculas libres y P
b
representa a las partculas atrapadas
(ligadas a trampas). El coeciente de difusi on de las trampas es D
S
y el de la partculas libres es
D
f
. Como en general las trampas son mol eculas mucho m as grandes que las partculas, se asume
que el coeciente de difusi on de las partculas ligadas es igual a la de la trampa libre, D
S
.
En el caso en que las partculas marcadas uorescentemente difundan e interact uen con tram-
pas de acuerdo al esquema (2.1), la intensidad de la uorescencia est a dada por:
F(t) =
_
QI(r) ([P
f
](r, t) + [P
b
](r, t)) d
3
r, (2.2)
donde [P
b
] y [P
f
] son la concentraci on de partculas ligadas y libres respectivamente, I(r) es la
distribuci on de intensidades denida en la Ec. 1.8 y Qes el producto de la eciencia de detecci on,
eciencia cu antica y la secci on ecaz de absorci on de la partcula uorescente. Est a implcito en
la Ec. (2.2) que las trampas libres, S, no son uorescentes y que el brillo de las partculas no se
ve afectado al estar ligadas a las trampas, es por eso que el factor Q es com un a ambos t erminos.
Las trampas se consideran macromol eculas que est an distribuidas uniformemente en el espacio
y que son lo suciente grandes como para que su coeciente de difusi on, D
S
, no cambie al
ligar la partcula. Las partculas tambi en se suponen uniformemente distribuidas. Partculas y
trampas est an en equilibrio, de forma que las concentraciones promedio sean las dadas por las
concentraciones en equilibrio, P
feq
, P
beq
y S
eq
:
P
feq
S
eq
= K
d
P
beq
, (2.3)
2.1 Modelo completo de FCS para partculas uorescentes que difunden y reaccionan con
trampas 27
donde K
d
es la constante de disociaci on denida como K
d
= k
off
/k
on
. La concentraci on total
de partculas P
tot
= [P
f
] + [P
b
] = P
feq
+ P
beq
. En FCS se observan las uctuaciones alre-
dedor del equilibrio. Para determinar la dependencia espacio-temporal de estas uctuaciones, las
ecuaciones de evoluci on de las concentraciones [P
f
], [P
b
] y [S]:
[P
f
]
t
= D
f
2
[P
f
] k
on
[P
f
][S] + k
off
[P
b
],
[P
b
]
t
= D
S
2
[P
b
] + k
on
[P
f
][S] k
off
[P
b
],
[S]
t
= D
S
2
[S] k
on
[P
f
][S] + k
off
[P
b
], (2.4)
son linealizadas alrededor de la soluci on de equilibrio Ec. (2.3).
2.1.1. C alculo de autovalores y autovectores
Para calcular la funci on de correlaci on, G(), dada por la Ec. (1.9), se linealizan las Ecs. (2.4)
alrededor del equilibrio Ec. (2.3). Deniendo P P
f
P
feq
, B P
b
P
beq
y S = SS
eq
,
e introduciendo el tiempo adimensional T k
off
t y espacio =
_
k
off
/D
f
r, las ecuaciones
linealizadas resultan:
_
_
_
_
P
T
B
T
S
T
_
_
_
_
=
_
_
_
_
a 1 c
a

D
2
1 c
a 1

D
2
c
_
_
_
_
_
_
_
_
P
B
S
_
_
_
_
+
P S
K
d
_
_
_
_
1
1
1
_
_
_
_
, (2.5)
donde

D = D
S
/D
f
, a = S
eq
/K
d
y c = P
feq
/K
d
. Aplicando la transformada de Fourier a estas
ecuaciones se obtiene:
_
_
_
_

Fq
T

Bq
T

Sq
T
_
_
_
_
=
_
_
_
_
q
2
a 1 c
a
D q
2
1 c
a 1
D q
2
c
_
_
_
_
_
_
_
_
F
q
B
q
S
q
_
_
_
_
(2.6)
donde q es la norma del vector de onda adimensional, q = | q|, y

A
q
(t) =
(2)
3
2
_
+
A(r, t)e
i q
d
3
para A = P, B, S. Las ramas de los autovalores (adimensio-
28
FRAP
nales),

s
( q), de la Ec. (2.6) son:
1
=
D q
2
,
2
=
1
2
_
a + h +
_
D + 1
_
q
2
_
+
1
2
_
_
D 1
_
2
q
4
+ 2 q
2
_
D 1
_
(h a) + (a + h)
2
,
3
=
1
2
_
a + h +
_
D + 1
_
q
2
_
1
2
_
_
D 1
_
2
q
4
+ 2 q
2
_
D 1
_
(h a) + (a + h)
2
,
(2.7)
donde h = 1 +c = S
tot
/S
eq
y la correspondiente matriz de autovectores, (q) es:
=
_
_
_
_
_
0
_
h +

D q
2
+

2
_

_
h +

D q
2
+

3
_
h 1 a a
1 a a
_
_
_
_
_
. (2.8)
2.1.2. Expresiones de autocorrelaci on para el modelo completo
Insertando las Ecs. (2.7) en (2.8) como funci on de q en la Ec. (1.15) se obtiene la funci on de
autocorrelaci on como la suma de tres contribuciones, que corresponde cada una a una rama de
autovalores:
G() = G
S
() +G
1
() +G
2
(), (2.9)
G
S
() =
Go
S
_
1 +

DS
__
1 +

w
2
DS
, (2.10)
G
1
() =
P
feq
4hk
off
P
2
tot
_
d
3
q
(2)
3
I(q)e
2
k
off
_
2 +
. +

2
(D
S
D
f
)
2
q
4
.
_
, (2.11)
G
2
() =
P
feq
4hk
off
P
2
tot
_
d
3
q
(2)
3
I(q)e
3
k
off
_
2
.

2
(D
S
D
f
)
2
q
4
.
_
, (2.12)
donde los t erminos G
1
y G
2
est an escritos funci on del vector de onda con dimensiones, q =
q
_
k
off
/D
f
, = k
off
(a + h) y

. =
_
(D
S
D
f
)
2
q
4
+ 2q
2
(D
S
D
f
) k
off
(h a) +
2
.
I(q) es la transformada de Fourier de la distribuci on de intensidad del sistema, Ec. 1.16.

2.2 Modelo aproximado para tiempos largos 29
2.2. Modelo aproximado para tiempos largos
La autocorrelaci on dada por las Ecs. (2.92.12) se debe comparar con la obtenida experi-
mentalmente para determinar los par ametros que rigen el transporte de las partculas de inter es,
en particular el coeciente de difusi on. Con este n es necesario tener una expresi on m as sim-
ple, es decir analtica de las integrales involucradas en las Ecs. (2.92.12). Notar que el t ermino
correspondiente al primer autovalor, G
S
, puede ser integrado analticamente. Sin embargo, en
general, no es posible encontrar una expresi on analtica para G
1
y G
2
aunque se puede obtener
una expresi on analtica bajo ciertas aproximaciones [Bismuto et al., 2001; Lamb et al., 2000].
2.2.1. Coecientes efectivos de difusi on
La principal cantidad de inter es en los experimentos de FCS es la funci on de autocorrelaci on,
G(), la dependencia temporal de la misma est a determinada por los autovalores del problema
lineal. Estos autovalores (Ec. 2.7) son negativos y su norma son funciones crecientes del vector
de onda al cuadrado, q
2
. Las componentes de mayores longitudes de onda, son las que decaen
m as lentamente. Inspeccionando las ramas de autovalores (Ec. (2.7)) se observa al recuperar
dimensiones, que el primer autovalor
1
= D
S
q
2
est a directamente relacionado con el coeciente
de difusi on de las trampas. Los otros dos autovalores no son directamente proporcionales a q
2
.
Pero, en el lmite de q peque no, que corresponde a los modos m as relevantes en el lmite de
tiempos largos, pueden ser aproximados como:
2

hD
f
+ aD
S
a + h
q
2
, (2.13)
3
(a + h)k
off

aD
f
+ hD
S
a + h
q
2
,
donde a = S
eq
/K
d
y h = S
tot
/S
eq
, se dan las expresiones de los autovalores recuperando las
dimensiones. Mientras que
2
describe un comportamiento puramente difusivo a q peque no,
3
incluye un decaimiento exponencial, proporcional a k
off
, superpuesto a la difusi on. Los corres-
pondientes coecientes de difusi on asociados son:
D
ef1
=
D
f
+ (a/h)D
S
1 + (a/h)
, (2.14)
D
ef2
=
(a/h)D
f
+ D
S
1 + (a/h)
. (2.15)
D
ef1
coincide con el coeciente de difusi on, D
u
, dado por la Ec. (1.7).
30
FRAP
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
1
a/h
D
e
f
i

/

D
f
D
S
/ D
f
Figura 2.1: Cociente entre D
ef1
y D
f
(lnea continua) y cociente entre D
ef2
y D
f
(lnea punteada)
en funci on de a/h.
En la gura 2.1 se muestra el gr aco de los coecientes adimensionales D
ef1
/D
f
y D
ef2
/D
f
en funci on de a/h = S
2
eq
/(S
tot
K
d
). Como se puede observar, los coecientes efectivos de difu-
si on son iguales para a/h = 1, es decir, para S
2
eq
= (S
tot
K
d
), y D
ef2
> D
ef1
cuando a/h > 1.
Los valores que pueden tomar los coecientes de difusi on efectivos se encuentran entre el coe-
ciente de difusi on de la trampa y el de la partcula libre (D
S
D
efi
D
f
), y la suma de ambos
coecientes efectivos siempre es D
f
+ D
S
.
2.2.2. Funci on de correlaci on del modelo aproximado
En el caso general no es posible encontrar una expresi on analtica para G
1
y G
2
. Sin embar-
go, es posible hacerlo en el lmite de q peque no. Introduciendo una expansi on en t erminos de
potencias de q
2
y qued andose a orden O(q
2
) en los exponentes, se obtiene:
G
1
() = v
o
_
d
3
q
(2)
3
I(q)e
D
ef1
q
2
_
1 +O(q
4
)
_
, (2.16)
G
2
() = e
_
d
3
q
(2)
3
I(q)e
D
ef2
q
2
O(q
4
), (2.17)
donde v
o
=
P
feq
P
2
tot
(a + h)
h
. La Ec. (2.16) puede ser integrada exactamente si se desprecian t ermi-
nos de orden O(q
4
) o mayores, si se combina con la Ec. (2.10) lleva a la ecuaci on Ec. (2.18).
N otese en la Ec. (2.17) que el termino principal en G
2
es O(q
4
).
Integrando las Ecs. 2.17 a orden q
2
,se obtiene:
G() =
Go
S
_
1 +

DS
__
1 +

w
2
DS
+
Go
u
_
1 +

Du
__
1 +

w
2
Du
, (2.18)
donde
DS
= w
2
r
/(4D
S
),
Du
= w
2
r
/(4D
u
) y Go
S
y Go
u
estan dados por:
Go
S
=
P
2
beq
V
ef
P
2
tot
S
tot
, (2.19)
Go
u
=
1
V
ef
P
tot
P
2
beq
V
ef
P
2
tot
S
tot
, (2.20)
donde V
ef
es el volumen efectivo y dado que D
ef1
= D
u
a partir de ahora se mantendr a esta
ultima notaci on. Este modelo aproximado tiene dos t erminos en la funci on de autocorrelaci on,
se observa en la Ec. (2.18) que se pierde la informaci on de D
ef2
a este nivel de aproximaci on.
Los dos t erminos que quedan tienen la misma dependencia temporal que la funci on de autoco-
rrelaci on en el caso de difusi on pura Ec. (1.11) para m = 2 componentes. El primer t ermino
tiene el tiempo caracterstico
DS
= w
2
r
/(4D
S
) que corresponde al tiempo caracterstico de difu-
si on de la trampa en el volumen de detecci on. El segundo t ermino tiene el tiempo caracterstico
Du
= w
2
r
/(4D
u
) asociado al coeciente de difusi on efectivo colectivo, D
u
, the Ec. (1.7) que
depende de los coecientes de difusi on de las partculas y trampas y de los par ametros de la
reacci on. Si no hubiera trampas, D
u
= D
f
, y el primer t ermino de la Ec. (2.18) fuese cero, se
recuperara la funci on de autocorrelaci on de partculas difundiendo libremente, Ec. (1.11) y su
valor a = 0 sera proporcional al n umero de partculas. En el lmite en donde todas las partcu-
las se encuentran atrapadas por las trampas, la funci on de correlaci on tambi en tendra la forma
de la Ec. (1.11) pero con el coeciente D
u
D
S
.
Estos c alculos muestran que, mientras valga la aproximaci on de q peque no, la funci on de
autocorrelaci on presenta dos componentes: uno que depende del coeciente de difusi on de la
trampa D
S
y el otro que depende del coeciente efectivo de difusi on colectivo D
u
de la Ec. (1.7).
Dada la funci on de autocorrelaci on obtenida de los experimentos, la contribuci on de los dos
componentes podr a ser separada siempre y cuando D
S
y D
u
sean sucientemente diferentes (que
dieran en por lo menos un factor 2 [Meseth et al., 1999]). Esto es v alido, en particular, para el
caso de trampas inm oviles, D
S
= 0, en donde la primer componente desaparece. Si las dos
componentes pueden ser separadas, ajustando la funci on de autocorrelaci on experimental con la
Ec. (2.18) se obtienen cuatro par ametros: Go
S
, Go
u
,
DS
y
Du
. De los tiempos caractersticos
se pueden estimar los coecientes de difusi on D
S
y D
u
, previa calibraci on de los par ametros
geom etricos del volumen de detecci on.
32
FRAP
2.2.3. Lmites de aplicaci on del modelo
A continuaci on se analizar an los lmites de aplicaci on de la aproximaci on de q peque no dada
por la Ec. (2.18). Como se vio en la secci on anterior, la funci on de correlaci on sin aproxima-
ciones es la suma de tres componentes, G
S
, G
1
y G
2
, cada una correspondiente a una rama
de autovalores,
1
,
2
y
3
, del problema linealizado. La primer componente, G
S
, asociada a
1
= D
S
q
2
o equivalentemente, al coeciente de difusi on de las trampas, D
S
, puede ser inte-
grada analticamente. Como ambos integrandos en las expresiones de G
1
y G
2
contienen funcio-
nes exponenciales decrecientes de q
2
, es posible denir un valor de corte, q
2
c
, de forma tal que la
diferencia entre calcular la integral sobre todos los valores de q y para q
2
q
2
c
, sea despreciable.
Este valor de corte es una funci on decreciente de , existe un valor
min
para el cual q
2
c
(
min
) es
lo sucientemente chico como para que la aproximaci on que conduce a la Ec. (2.18) sea v alida
para todo
min
.
Como uno de los prop ositos de los experimentos de FCS es extraer tiempos caractersticos de
los cuales se puedan derivar propiedades de transporte, se quiere establecer el rango de valores de
los par ametros para los cuales
min
<
DS
,
Du
de forma tal que
DS
y
Du
puedan ser estimados
conablemente del ajuste de la funci on de autocorrelaci on experimental con el modelo Ec. (2.18).
Para estudiar bajo qu e condiciones es v alida la aproximaci on, se analiza el siguiente orden en
la expansi on de q, es decir, se estudia hasta orden O(q
4
) tanto en el exponente, que corresponde
a
2
, como en los t erminos multiplicativos. En esta expansi on, G
1
y G
2
resultan:
G
1
() =
_
d
3
q
(2)
3
I(q)
_
v
o
e
Duq
2
+q
4
v
1
q
4
e
Duq
2
_
, (2.21)
G
2
() = e
_
d
3
q
(2)
3
I(q)v
1
q
4
e
D
ef2
q
2
, (2.22)
donde D
u
y D
ef2
est an dados por las Ecs. 2.14y 2.15, v
1
= v
o
y =
ah
(a + h)
2
(D
f
D
S
)
2
2
.
Para despreciar el O(q
4
) en el exponente y en el factor multiplicativo en G
1
se debe cumplir:
q
2
D
u
(2.23)
q
2
_
v
o
v
1
(2.24)
y para despreciar el O(q
4
) en G
2
se requiere que:
q
4
v
o
v
1
e
e
(D
ef2
Du)q
2
. (2.25)
N otese que si los O(q
4
) se pueden despreciar para G
1
, entonces solamente es necesario pedir que
+ (D
ef2
D
u
)q
2
> 0 para garantizar que el O(q
4
) pueda ser despreciado en G
2
. Se observa
que esta ultima condici on sobre q se cumple autom aticamente si D
ef2
D
u
pero si D
ef2
< D
u
,
adem as de satisfacer las condiciones en la Eq 2.23, q debe satisfacer la relaci on:
q
2

(D
u
D
ef2
)
. (2.26)
Como se puede observar, en la gura 2.1 los coecientes efectivos de difusi on son iguales para
a/h = 1, es decir, para S
2
eq
= S
tot
K
d
, y D
ef2
> D
u
cuando a/h > 1.
Como se mencion o con anterioridad, existe un valor de corte, q
2
c
, que depende de . Si el valor
de corte, q
2
c
, satisface las relaciones (2.23) (2.25), la aproximaci on de q peque no ser a valida.
Este valor de corte depende adem as de par ametros geom etricos del volumen de detecci on y de
par ametros de reacci on difusi on. Debido a la simetra del volumen confocal, es posible denir
dos valores de corte, uno en la direcci on de z, q
2
cz
, y otro en la direcci on perpendicular, q
2
cr
.
q
2
cr
=
10
w
2
r
4
+ D
ef,i
, q
2
cz
=
10
w
2
z
4
+ D
ef,i
, (2.27)
donde D
ef,i
= min(D
u
, D
ef2
). Dado que w
z
> w
r
, entonces q
2
cz
< q
2
cr
, basta pedir que q
2
c
= q
2
cr
satisfaga las condiciones conditions (2.23) (2.26). Como q
2
c
decrece con , siempre existe un
valor mnimo,
min
, tal que si >
min
, las relaciones (2.23) (2.26) se mantengan. En particular,
es conveniente establecer las condiciones sobre los par ametros de forma tal que
min
sea lo su-
cientemente chico como para que el modelo aproximado (Ec. (2.18)) sea v alido para casi todos
los . Reemplazando q
2
c
() en las Ecs. (2.23) (2.26) y deniendo =
_
a/h
(1 +a/h)
(D
f
D
S
)
D
u
se
obtiene que las condiciones (2.23) y (2.24) son equivalentes a:
10
reac

Du
to
1
, (2.28)
10
reac
Du
to
2
, (2.29)
donde se dene el tiempo caracterstico de la reacci on como:
reac
=
1
=
1
k
off
(a + h)
(2.30)
Si a/h 1 (i.e. D
ef2
D
u
) la condici on (2.25) se satisface autom aticamente bajo las condi-
ciones (2.29), pero si a/h < 1 (i.e. D
ef2
< D
u
), la condici on (2.26) se debe satisfacer, esto es
equivalente a:
> 10
reac
(1 a/h)
(1 +a/h)
(D
f
D
S
)
D
ef2
Def2
to
3
(2.31)
34
FRAP
donde
Def2
= w
2
r
/(4D
ef2
) es el tiempo caracterstico medio de residencia de las partculas con
D
ef2
en el volumen confocal.
Por lo tanto, la aproximaci on Ec. (2.18) se mantiene para
min
max(to
1
, to
2
, to
3
).
Como D
S
< D
u
, los dos tiempos caractersticos del modelo satisfacen
DS
>
Du
. Entonces
el modelo aproximado puede ser utilizado para ajustar curvas experimentales y obtener tiempos
caractersticos conables si
min

Du
. Estas inegualdades se escriben como:
5
reac
Df
(1 + )
( 1)
1, if
min
= to
1
5
reac
Df
(1 + )
( 1)
2
( + )
1 if
min
= to
2
5
reac
Df
(1 )
(1 + )
( 1)
1 if
min
= to
3
(2.32)
donde = a/h, = D
f
/D
S
y
Df
=
w
2
r
4D
f
. Como 0 y > 1, todos los factores que
multiplican 5
reac
/
Df
en las Ecs. (2.32) son menores o iguales a uno. Entonces, sin importar
cu al to
i
sea el mayor, se puede concluir que la expresi on aproximada de la funci on de autocorre-
laci on Ec. (2.18) es v alida cuando la reacci on se produce m as r apidamente que la difusi on de las
partculas libres en el volumen de detecci on, es decir cuando se cumple:
reac
=
1
k
off
+ k
on
(P
feq
+ S
eq
)

Df
=
w
2
r
4D
f
, (2.33)
N otese que a un cuando
reac

Df
, las Ecs. (2.32) pueden ser satisfechas por diferentes combi-
naciones de par ametros, tales como 1, 1 o 1.
2.3. Comparaci on entre el modelo completo y el modelo apro-
ximado
A n de comprobar que estas estimaciones son correctas y comprobar qu e tan bien se pueden
inferir otros par ametros adem as de los tiempos caractersticos usando la Ec. (2.18), se analizaron
alrededor de 330 casos que se encuentran dentro del rango de validez del modelo. Se descarta-
ron casos donde D
f
/D
S
2, con el n de poder asumir que el coeciente de difusi on de la
partcula ligada a la trampa, D
Pb
, es el mismo que el de la trampa, D
S
, con un error menor al
4 %. El rango de valores de par ametros explorados se listan en la tabla 2.1. Para cada conjunto
de valores de los par ametros, se comput o la funci on de correlaci on dada por el modelo completo
2.3 Comparaci on entre el modelo completo y el modelo aproximado 35
Tabla 2.1: Tabla con el rango de valores explorado
Parametro Rango Unidad
P
tot
[ 50 200 ] nM
S
tot
[ 500 100000]nM
k
off
[1000 5000 ] s
1
K
d
[ 57 400000] nM
D
f
[ 10 100 ] m
2
/s
D
S
[ 0.1 25 ] m
2
/s
(Ecs. (2.9) (2.12)) que se expresa en t erminos de integrales. Para hacer esto, se us o la funci on
de Matlab dblquad que emplea el m etodo de cuadratura adaptativo de Simpson para evaluar las
dobles integrales. Las funciones de correlaci on calculadas con el modelo completo fueron tra-
tadas como si fuesen curvas experimentales y ajustadas con el modelo aproximado, Ec. (2.18),
para determinar qu e tan bien se recuperan los par ametros de reacci on - difusi on empleando este
modelo. El ajuste de mnimos cuadrados no lineal se realiz o con la funci on de Matlab nlint.
Cuatro par ametros se obtiene del ajuste, D
S
, Go
S
, D
u
y Go
u
, que luego son comparados con los
valores esperados. Se calcularon lo errores relativos promedio para cada par ametro.
2.3.1. Incorporaci on de ruido
Para corroborar que el modelo presentado permite recuperar valores de par ametros conables
a un en condiciones experimentales, se realizaron pruebas incorporando ruido a la funci on de
correlaci on del modelo completo. Para simular el ruido experimental, se agrega a la funci on de
correlaci on del modelo completo ruido al azar con distribuci on gaussiana de valor medio cero y
desviaci on est andar igual a 0.025. Luego se realiza el promedio de 234 curvas calculadas con
este ruido incorporado.
Esta forma de a nadir ruido proviene del an alisis de experimentos tpicos de FCS. Con el n
de estimar la magnitud del ruido, se realizaron experimentos de FCS en una soluci on acuosa
50 nM de TMR-dextran (Invitrogen-Molecular Probes), empleando una frecuencia de muestreo
de 50 kHz. Los experimentos fueron realizados en un microscopio confocal FV1000 de Olym-
pus. La serie temporal de la uorescencia se dividi o en 234 segmentos, cada uno de ellos con
2 10
15
puntos experimentales. Para cada segmento se calcul o la autocorrelaci on y el residuo,
36
FRAP
0
0.03
0.06
A
C
F
10
4
10
3
10
2
0.02
0
0.02
R
e
s
i
d
u
o
(s)
(a)
0.06 0.04 0.02 0 0.02 0.04 0.06
0
10
20
30
40
50
60
Residuo
(b)
Figura 2.2: Mediciones de FCS en soluci on acuosa 50 nM de TMR-dextran (a) arriba Funci on
de autocorrelaci on experimental obtenida para uno de los 234 segmentos de 2 10
15
puntos
analizados (lnea de puntos) y funci on de autocorrelaci on promedio de las 234 curvas (lnea con-
tinua), abajo Residuo, denido como la resta entre la funci on de autocorrelaci on de un segmento
y la curva promedio. (b) Histograma de los residuos para el tiempo de correlaci on = 20 s y en
lnea continua el ajuste Gaussiano con 0.019.
denido como la resta de la ACF de cada segmento y la curva promedio de las 234 ACF. A modo
de ejemplo, en la gura 2.2(a) se graca la funci on de correlaci on promedio y una de las 234 fun-
ciones de autocorrelaci on, junto con su correspondiente residuo. Para cada tiempo de correlaci on
se graca el histograma de los residuos y se ajusta por una gaussiana obteni endose la desviaci on
est andar para cada histograma. El valor de fue menor a 0.02 en todos los casos analizados.
En la gura 2.2(b) se presenta un histograma representativo, con 0.019.
2.3.2. Resultados
En algunos casos, la contribuci on del primer autovalor (primer t ermino de la Ec. (2.18)) a la
funci on de correlaci on era despreciable frente a la contribuci on del segundo autovalor (segundo
t ermino de la Ec. (2.18)). Estos casos eran mejor ajustados por el modelo de una componente,
en este caso, la Ec. (2.18) sin el primer t ermino. El criterio para decidir si se debe incluir uno o
dos t erminos en el modelo aproximado fue el siguiente: si los valores de D
S
y D
u
obtenidos del
ajuste por dos componentes era tal que diferan en menos de un 10 % o si D
S
0.01 m
2
/s o
D
u
200 m
2
/s, entonces se usaba el modelo de una componente correspondiente al t ermino
del coeciente de difusi on efectivo. Tambi en se emple o una componente, en lugar de dos, si la
bondad del ajuste (dada por el chi-cuadrado) con una componente era similar o mejor que con
dos componentes.
Como ejemplo, en la gura 2.3 se muestra un caso representativo obtenido para
D
f
= 10 m
2
/s, D
S
= 0,1 m
2
/s, P
tot
= 200 nM, P
tot
= 200 nM, S
tot
= 500 nM,
P
beq
= 160 nM y k
off
= 1000 s
1
. En la gura 2.3(a) se comparan las funciones de autoco-
rrelaci on te orica (obtenida con el modelo integral completo Ec. (2.9)) y el ajuste obtenido con
el modelo aproximado considerando en la Ec. (2.18) los dos t ermino o solamente el t ermino que
corresponde al coeciente de difusi on efectivo. Los residuos, denidos como la diferencia entre
entre la curva te orica y el ajuste, se muestran en la gura 2.3(c). Como se puede apreciar, en
este caso es necesario incluir ambas componentes en el modelo aproximado. En la gura 2.3(b)
se gracan cada uno de los tres t erminos del modelo completo, Ecs. (2.10) (2.12), como se
puede observar, la componente correspondiente al tercer autovalor es pr acticamente nula. En el
mismo gr aco se muestran las contribuciones de los dos t erminos del modelo aproximado. Los
par ametros obtenidos del ajuste y sus respectivos valores te oricos se listan en la tabla 2.2. En este
ejemplo, el criterio de selecci on indica que se requiere usar el modelo de dos componentes. Los
diferentes par ametros se recuperaron con errores relativos menores al 20 %. El mismo ejemplo
38
FRAP
10
4
10
2
10
0
0
0.01
0.02
A
C
F
(s)
(a)
10
4
10
2
10
0
0
0.01
0.02
A
C
F
(s)
(b)
10
4
10
2
10
0
0.002
0
0.002
R
e
s
i
d
u
o
(s)
(c)
10
4
10
2
10
0
0
0.01
0.02
0.03
A
C
F
(s)
(d)
Figura 2.3: (a) Funci on de autocorrelaci on del modelo completo (lnea continua negra), modelo
aproximado de dos componentes (lnea de rayas roja)y modelo aproximado de una componen-
te (lnea de puntos azul), en funci on del tiempo de correlaci on . (c) Residuos entre el modelo
completo y el modelo aproximado de dos componentes (lnea de rayas roja) y de un componente
(lnea de puntos azul). (b) Funci on de autocorrelaci on del modelo completo, contribuciones del
primer, segundo y tercer autovalor (lnea continua negra, roja y azul, respectivamente). T ermi-
nos correspondientes al primer y segundo autovalor en el modelo aproximado (lnea de rayas
negra y roja, respectivamente). (d) Funci on de autocorrelaci on del modelo completo con ruido
incorporado (lnea de puntos roja) y ajuste por el modelo de dos componentes (lnea continua
negra). Curvas obtenidas en un caso representativo con D
f
= 10 m
2
/s, D
S
= 0,1 m
2
/s,
P
tot
= 200 nM, P
tot
= 200 nM, S
tot
= 500 nM, P
beq
= 160 nM y k
off
= 1000 s
1
.
Tabla 2.2: Par ametros obtenidos del ajuste de los datos del modelo completo por el modelo
aproximado de una o dos componentes, correspondiente al ejemplo mostrado en la gura 2.3. Se
muestran los valores te oricos exactos, los valores recuperados con el ajuste y el error relativo, en
el caso sin agregarle error a la curva ajustada e incorpor andole ruido. En cada caso se presenta el
valor de Chi-cuadrado del ajuste.
Modelo aproximado 2 componentes
Sin ruido Con ruido
Valor Valor del Error Valor del Error
exacto ajuste relativo ajuste relativo
D
S
(m
2
/s) 0.100 0.087 13 % 0.089 11 %
Go
S
0.00575 0.00512 11 % 0.00498 13 %
D
u
(m
2
/s) 2.76 2.34 15 % 2.42 12 %
Go
u
0.0167 0.0173 -4 % 0.0175 -5 %
Chi-cuadrado 0.00011 0.00012
Modelo aproximado 1 componente
Sin ruido Con ruido
Valor Valor del Error Valor del Error
exacto ajuste relativo ajuste relativo
D
u
(m
2
/s) 2.76 1.17 58 % 1.25 55 %
Go
u
0.0167 0.0221 -32 % 0.0221 -32 %
Chi-cuadrado 0.34 0.40
presentado en la gura 2.3 se analiza a nadiendo ruido, en la gura 2.3(d) se graca la funci on
de autocorrelaci on del modelo completo con ruido incorporado y el ajuste por el modelo aproxi-
mado de dos componentes. Los par ametros de este ajuste se presentan en la tabla 2.2. Como se
puede apreciar, inclusive cuando se agrega ruido a la curva, se pueden recuperar los par ametros
del modelo con niveles de error similar.
La Fig 2.4 muestra los histogramas de los errores relativos absolutos para los diferentes
par ametros obtenidos del ajuste de los 330 casos, empleando el modelo aproximado de una o
dos componentes seg un el criterio explicado anteriormente. La Fig 2.4(a) muestra los histogra-
mas para los casos ajustados con el modelo de una componente, de los 284 casos analizados,
40
FRAP
solamente el 6 % y el 7 % presenta errores relativos mayores que el 15 % en la determinaci on
de D
u
y Go
u
, y sus errores relativos promedio son 7 % y 4 %, respectivamente. En los 46 casos
analizados con el modelo de dos componentes, gura 2.4(b), el coeciente de difusi on efectivo,
D
u
, fue recuperado con errores relativos menores a 15 % y Go
u
, con errores menores a 7 % . Sus
errores relativos promedio son 8 % y 2 %, respectivamente. En general, el error en determinar
D
S
y Go
S
es mayor que el error en determinar D
u
y Go
u
. De hecho, el error relativo promedio
para D
S
y Go
S
es 27 % y 22 %, respectivamente, y el m aximo error relativo encontrado en los
casos analizados fue de 68 % y 53 %, pero solamente el 17 % y 7 % de los casos presentan
errores relativos mayores que 50 % en determinar D
S
y Go
S
, respectivamente.
En todos los casos, todos los par ametros obtenidos al ajustar con el modelo aproximado (una
o dos componentes) tienen error relativo promedio menor que 30 %. En los casos analizados,
el tiempo caracterstico de difusi on
Df
era entre 4 y 40 veces m as grande que el tiempo carac-
terstico de reacci on
reac
. Inclusive cuando
reac

Df
el modelo aproximado puede ser usado
siempre y cuando se satisfagan las Ecs. (2.32).
2.4. Informaci on que se puede obtener aplicando el modelo
aproximado
2.4.1. Informaci on que se extrae en un experimento de FCS
Si la funci on de correlaci on experimental se puede ajustar usando las dos componentes en
el modelo aproximado Ec. (2.18), en un experimento de FCS se obtienen los valores estimados
de D
S
, D
u
, Go
S
y Go
u
. Dado que G( = 0) es inversamente proporcional al n umero total de
partculas uorescentes en el volumen de detecci on, la concentraci on total de partculas uores-
centes se puede estimar como P
tot
= 1/(V
ef
Go
tot
) con Go
tot
= G( = 0) = Go
S
+ Go
u
. Si
el coeciente de difusi on de las partculas libres D
f
es conocido a priori, el n umero total de
trampas, la fracci on de partculas ligadas y libres y la constante de disociaci on de las trampas
pueden ser inferidas a partir de los par ametros de ajuste:
S
tot
=
1
V
ef
Go
2
tot
1
Go
S
_
Go
S
+ Go
u
(D
f
D
u
)
(D
f
D
S
)
_
2
,
K
d
=
1
V
ef
Go
2
tot
Go
2
u
Go
S
(D
f
D
u
)(D
u
D
S
)
(D
f
D
S
)
2
.
(2.34)
2.4 Informaci on que se puede obtener aplicando el modelo aproximado 41
0 10 20 30
0
20
40
60
80
100
Error relativo (%)

0 10 20 30 40
0
50
100
150
200
Error relativo (%)

Go
u
D
u
(a) Par ametros de ajuste del modelo de una componente
0 20 40 60
0
4
8
Error relativo (%)

0 5 10 15
0
5
10
Error relativo (%)

0 20 40 60
0
4
8
Error relativo (%)

0 2 4 6 8
0
12
24
Error relativo (%)

D
S
Go
S
D
u
Go
u
(b) Par ametros de ajuste del modelo de dos componentes
Figura 2.4: Histogramas de los errores relativos absolutos para los par ametros de ajuste del mo-
delo aproximado con una (a) o dos (b) componentes.
42
FRAP
Si en cambio se conoce de antemano K
d
o la concentraci on total de trampas, S
tot
, el coeciente
de difusi on de partculas libres puede ser estimado. Por ejemplo, si K
d
es conocido, se puede
reescribir la Ec. (2.19) en t erminos de P
feq
, P
beq
y K
d
, y:
P
feq
=
Go
u
2V
ef
Go
2
tot
+
_
Go
u
2V
ef
Go
2
tot
_
2
K
d
Go
S
V
ef
Go
2
tot
,
P
beq
= P
tot
P
feq
. (2.35)
Usando estas concentraciones, D
f
es estimado como:
D
f
= D
u
+
P
beq
P
feq
K
d
(P
feq
+ K
d
)
(D
u
D
S
). (2.36)
Por lo tanto, es necesario conocer a priori el valor de un par ametro de reacci on o de transporte a
n de estimar los cinco par ametros de inter es de un unico experimento de FCS.
2.4.2. Experimentos de FCS a diferentes concentraciones
Si los experimentos de FCS se pudiesen repetir variando el n umero de partculas marcadas
uorescentemente y manteniendo el resto de las condiciones sin modicar, entonces sera posible
inferir el coeciente de difusi on D
f
y las variables de reacci on de la serie de experimentos, sin
tener conocimiento de alguno de los valores de los par ametros de reacci on-difusi on. En principio,
variar el n umero de partculas uorescentes en un sistema, no afectara a la concentraci on de
las trampas, la constante de disociaci on o a los valores de los coecientes de difusi on de las
trampas ni de las partculas libres. El n umero mnimo de condiciones diferentes en las que se
debera realizar el experimento de FCS seran dos, en cuyo caso el coeciente de difusi on D
f
,
por ejemplo, podra calcularse como:
D
f
=
_
Go
(2)
S
_
_
Go
(2)
S

_
Go
(1)
S
_
_
Go
(1)
S
D
S
+ Go
(1)
u
D
(1)
u
_
Go
(1)
tot
_
Go
(1)
S
_
_
Go
(2)
S

_
Go
(1)
S
_
_
Go
(2)
S
D
S
+ Go
(2)
u
D
(2)
u
_
Go
(2)
tot
,
(2.37)
donde los superndices identican el experimento realizado con concentraci on total de partcu-
las uorescentes P
(i)
tot
. Por supuesto que si se pudiese realizar una serie de experimentos para
varios valores de P
tot
, resultara mejor para extraer la informaci on acerca de D
f
, junto con los
par ametros de la reacci on.
2.5 Combinando la informaci on de experimentos de FRAP y FCS 43
2.5. Combinando la informaci on de experimentos de FRAP y
FCS
Hasta ahora se han mostrado las propiedades de transporte que pueden inferirse a partir de
experimentos FCS. M as concretamente, se ha demostrado que, para un sistema en el cual las
partculas uorescentes difunden y reaccionan con trampas de acuerdo al esquema (2.1), FCS da
el valor del coeciente de difusi on D
u
, que se dene en la Ec. (1.7). A un as, este es un coecien-
te efectivo que combina par ametros que caracterizan el transporte con par ametros asociados a la
reacci on. Sera conveniente extraer informaci on sobre cada uno de estos procesos por separado.
Como se ha mencionado en Pando et al. [2006], en el lmite de reacciones r apidas, los experi-
mentos de FRAP dan el coeciente de difusi on efectivo de partculas marcadas, es decir, D
t
, tal
como se dene en la Ec. (1.6). Por lo tanto, realizando experimentos de FCS y FRAP se puede
esperar obtener informaci on m as all a de los coecientes de difusi on efectiva, m as concretamente
sobre algunas de las cinco inc ognitas que caracterizan el sistema en estudio: D
f
, D
S
, P
tot
, S
tot
y
K
d
, a partir de los cuales el resto de los par ametros, con la excepci on de k
off
, se pueden derivar.
Combinando la informaci on de experimentos de FRAP y FCS
Los experimentos de FCS y FRAP se realizan empleando concentraciones de partculas uo-
rescentes muy diferentes. Mientras FCS requiere concentraciones muy bajas ( nM) con el n
de detectar las uctuaciones de uorescencia, FRAP necesita concentraciones mucho m as altas
( M), de modo que la curva de recuperaci on de la uorescencia se pueda construir ade-
cuadamente. Si se tiene un sistema de partculas uorescentes y trampas que difunden y reac-
cionan de acuerdo al esquema (2.1), en el cual la concentraci on de partculas marcadas uo-
rescentemente P
tot
puede modicarse, se podran llevar a cabo: un experimento de FCS a una
concentraci on de partculas P
tot
= P
FCS
tot
y un experimento de FRAP a P
tot
= P
FRAP
tot
. En
principio, la constante de disociaci on de la reacci on partculas-trampa y la concentraci on de
las trampas no cambian al variar la concentraci on de partculas uorescentes P
tot
. Suponien-
do que los tiempos de reacci on son mucho m as cortos que la difusi on Ec. (2.33), la funci on
de correlaci on para FCS se puede aproximar por la Ec. (2.18) y el experimento de FRAP da
el coeciente efectivo de difusi on, D
t
, de la Ec. (1.6). Como resultado se tendr an los valores
de D
S
, D
u
(P
FCS
tot
), P
FCS
tot
y D
t
(P
FRAP
tot
). La relaci on entre la uorescencia medida y el n ume-
ro de partculas uorescentes se puede estimar en experimentos de FCS mediante la Ec. (2.2):
44
FRAP
F
FCS
=
_
QI(r)[P
f
](r, t) + [P
b
](r, t)d
3
r = P
tot
_
QI(r)d
3
r P
tot
, donde F
FCS
es
la amplitud de uorescencia media en el volumen de detecci on del experimento de FCS. Si el
experimento de FRAP se puede realizar empleando el mismo volumen de detecci on, entonces
podemos estimar P
FRAP
tot
como P
FRAP
tot
= F
FRAP
. De esta forma, combinando la informa-
ci on de FRAP y FCS obtenemos D
S
, P
FCS
tot
y P
FRAP
tot
. Tambi en se cuenta con expresiones para
Go
S
(P
FCS
tot
), Go
u
(P
FCS
tot
) (Ecs. (2.19) y (2.20)), D
u
(P
FCS
tot
) (Ec. (1.7)) y D
t
(P
FRAP
tot
) (Ec. (1.6))
de las cuales es posible inferir todas las variables de reacci on (es decir, S
tot
, K
d
, fracci on de
partculas libres y atrapadas) y el coeciente de difusi on libre D
f
.
Por otra parte, si el experimento de FRAP pudiese llevarse a cabo a la misma concentraci on
de partculas uorescentes que en FCS, no habra informaci on suciente para extraer todos los
par ametros de reacci on y de transporte. De hecho, el coeciente de difusi on efectivo medido por
FRAP en las mismas condiciones que en el FCS, proporciona la misma informaci on que se puede
obtener utilizando Go
S
y D
u
, de forma que D
f
, S
tot
y K
d
no se podran estimar sin conocer de
antemano el valor de alguno de ellos.
3
Cuanticaci on de coecientes de difusi on por
m etodos opticos en presencia de partculas no
marcadas
Al marcar uorescentemente partculas o compuestos, es muy com un que una parte de estas
partculas no resulten marcadas. Esto sucede, tanto al marcar el compuesto de inter es unien-
do qumicamente una mol ecula uorescente [Walling et al., 2009; Keppler et al., 2003; Smith,
2007], como en la t ecnica de fusi on de protenas a protenas uorescentes [Stepanenko et al.,
2008; Chudakov et al., 2005], en donde no s olo est a presente la protena de inter es marcada uo-
rescentemente sino tambi en la protena end ogena (que produce el sistema biol ogico) sin marcar.
Hay que tener especial cuidado en la interpretaci on de los resultados al estudiar procesos de di-
fusi on y reacci on por m etodos opticos en un sistema donde coexisten mol eculas end ogenas sin
marcar y las mol ecula modicadas. En este captulo, se estudia la aplicaci on de FCS a un sistema
de partculas marcadas y no marcadas que presentan la misma funcionalidad, y reaccionan con
trampas de la misma forma. El modelo se aplica al sistema del bicoid, donde se reinterpretar an
46
Cuanticaci on de coecientes de difusi on por m etodos opticos en presencia de partculas no
marcadas
los resultados obtenidos por diversos grupos que investigan su din amica.
3.1. Caso partculas marcadas y no marcadas
En este caso hay un solo tipo de trampa, S, no uorescente y un solo tipo de partcula, que
puede estar marcada uorescentemente, P
t
, o no marcada, P
u
. Las partculas, tanto marcadas
como no marcadas, tienen el mismo coeciente de difusi on libre, D
f
y reaccionan con las tram-
pas de la misma forma. O sea, las constantes cin eticas de la reacci on (k
on
y k
off
) son las mismas
para ambas clases de partculas. Suponemos que el estado de uorescencia no se modica a lo
largo del tiempo y que la uorescencia de las partculas no cambia al ligarse a las trampas, si
una partcula marcada se liga a una trampa, permanece marcada. Nuevamente consideramos que
el peso molecular de las trampas es mucho mayor al de las partculas marcadas y no marcadas,
considerando al coeciente de difusi on de las partculas ligadas igual a D
S
, el coeciente de
difusi on de las trampas libres. El esquema de la reacci on en este caso ser a:
P
t
f
+ S
k
off
k
on
P
t
b
(3.1)
P
u
f
+ S
k
off
k
on
P
u
b
(3.2)
En la notaci on usada, el subndice indica si la partcula est a libre (f) o ligada (b) y el su-
prandice, si est a marcada (t) o no marcada (u). Las ecuaciones de evoluci on de las concentra-
ciones ser an:
[P
t
f
]
t
= D
f
2
[P
t
f
] k
on
[P
t
f
] [S] + k
off
[P
t
b
]
[P
t
b
]
t
= D
S
2
[P
t
b
] + k
on
[P
t
f
] [S] k
off
[P
t
b
]
[S]
t
= D
S
2
[S] k
on
[P
t
f
] [S] + k
off
[P
t
b
] k
on
[P
u
f
] [S] + k
off
[P
u
b
]
[P
u
f
]
t
= D
f
2
[P
u
f
] k
on
[P
u
f
] [S] + k
off
[P
u
b
]
[P
u
b
]
t
= D
S
2
[P
u
b
] + k
on
[P
u
f
] [S] k
off
[P
u
b
]
Siguiendo con el procedimiento de captulos anteriores, se realiza un cambio de variables
3.1 Caso partculas marcadas y no marcadas 47
alrededor del equilibrio y se adimensionalizan empleando:
T = k
off
t
=
k
off
D
f
x.
Las concentraciones en el equilibrio est an dadas por:
P
t
feq
S
eq
= K
d
P
t
beq
P
u
feq
S
eq
= K
d
P
u
beq
. (3.3)
Las concentraciones totales de trampas S
tot
y de partculas marcadas P
t
tot
, sin marcar P
u
tot
, y
totales P
tot
est an dadas por:
S
tot
= S + P
t
b
+ P
u
b
P
t
tot
= P
t
f
+ P
t
b
P
u
tot
= P
u
f
+ P
u
b
P
tot
= P
t
f
+ P
t
b
+ P
u
f
+ P
u
b
(3.4)
respectivamente, y en este caso importar a la fracci on de partculas marcadas denida como f =
P
t
tot
/P
tot
.
Aplicando la transformada de Fourier al sistema linealizado alrededor del equilibrio, se ob-
tiene:
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
q
2
a 1 c
t
0 0
a
D q
2
1 c
t
0 0
a 1
D q
2
c
t
c
u
a 1
0 0 c
u
q
2
a 1
0 0 c
u
a
D q
2
1
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
(3.5)
donde q es la norma del vector de onda adimensional, q = | q| y se denieron las constantes
D =
D
S
D
f
, a =
S
eq
K
d
, c
t
=
P
t
feq
K
d
y c
u
=
P
u
feq
K
d
. Notar que considerando h = 1 + c
t
+ c
u
=
S
tot
S
eq
,
entonces a y h quedan denidos como en el caso de todas las partculas marcadas presentado en
el Captulo 2.
48
marcadas
Los autovalores de la matriz denida en Ec. 3.5 resultan:
1
=
D q
2
2
=
1
2
(a + h + (1 +

D) q
2
) +
1
2
_
(

D 1)
2
q
4
+ 2(

D1)(h a) q
2
+ (a + h)
2
3
=
1
2
(a + h + (1 +

D) q
2
)
1
2
_
(

D 1)
2
q
4
+ 2(

D 1)(h a) q
2
+ (a + h)
2
4
=
1
2
(a + 1 + (1 +

D) q
2
) +
1
2
_
(

D 1)
2
q
4
+ 2(

D 1)(1 a) q
2
+ (a + 1)
2
5
=
1
2
(a + 1 + (1 +

D) q
2
)
1
2
_
(

D 1)
2
q
4
+ 2(

D 1)(1 a) q
2
+ (a + 1)
2
Para calcular la funci on de correlaci on es necesario conocer la matriz de autovectores asocia-
da a la matriz de la Ec. 3.5. es la matriz de los autovectores en columnas:
=
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
0 (c
t
/c
u
) (c
t
/c
u
) 1 1
c
t
(c
t
/c
u
)
2
(c
t
/c
u
)
3

4

5
1 (c
t
+ c
u
)/c
t
2
(c
t
+ c
u
)/c
t
3
0 0
0 1 1 1 1
c
u
2

3

4

5
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
donde
2
= (a + q
2
+
2
)/h
3
= (a + q
2
+
3
)/h
4
= (a + q
2
+
4
)
5
= (a + q
2
+
5
)
3.1.1. Funci on de correlaci on para partculas marcadas y no marcadas
Para calcular la correlaci on se emplea la expresi on de la Ec. 1.15, en donde se considera el
brillo de cada especie, en este caso las unicas que poseen uorescencia son P
t
f
y P
t
b
. Asignando:
C
1
= P
t
feq
y Q
1
= Q
C
2
= P
t
beq
y Q
2
= Q
C
3
= S
eq
y Q
3
= 0
C
4
= P
u
feq
y Q
4
= 0
C
5
= P
u
beq
y Q
5
= 0
y usando los autovalores y autovectores con dimensiones, la funci on de correlaci on se escri-
bir a como suma de 5 t erminos, cada uno de ellos expresado como:
G
i
() =
1
(2)
3
_
d
3
q
I(q)g
i
(q, )
donde

I(q) es la transformada de Fourier de la distribuci on de intensidad del sistema, Ec. 1.16.
Sin ninguna otra aproximaci on, los integrandos de la funci on de correlaci on g
i
son:
g
1
(q, ) =
P
t
beq
c
t
h(P
t
tot
)
2
e
g
2
(q, ) =
P
t
feq
4k
off
h(P
t
tot
)
2
c
t
(h 1)
_
2 +
1 +
( (D
f
D
S
)
2
q
4
1
_
e
g
3
(q, ) =
P
t
feq
4k
off
h(P
t
tot
)
2
c
t
(h 1)
_
2
1
( (D
f
D
S
)
2
q
4
1
_
e
g
4
(q, ) =
P
t
feq
4k
off
(P
t
tot
)
2
c
u
(h 1)
_
2
1
+
2 +
(
1
(D
f
D
S
)
2
q
4
2
_
e
g
5
(q, ) =
P
t
feq
4k
off
(P
t
tot
)
2
c
u
(h 1)
_
2
1
2
(
1
(D
f
D
S
)
2
q
4
2
_
e
Con q la norma del vector de onda q con dimensiones y

= k
off
(a + h)
1
= k
off
(a + 1)
1 =
_
(D
f
D
S
)
2
q
4
+ 2(D
f
D
S
)(a h)/(a + h)q
2
+
2
2 =
_
(D
f
D
S
)
2
q
4
+ 2(D
f
D
S
)(a 1)/(a + 1)
1
q
2
+
2
1
.
3.1.2. Coecientes efectivos de difusi on
Recuperando dimensiones y aproximando a orden q
2
los autovalores resultan:
1
= D
S
q
2
2
D
ef1
q
2
3
D
ef2
q
2
4
D
ef3
q
2
5

1
D
ef4
q
2
50
marcadas
donde denimos los coecientes efectivos de difusi on:
D
ef1
=
D
f
+ (a/h)D
S
1 + (a/h)
(3.6)
D
ef2
=
(a/h)D
f
+ D
S
1 + (a/h)
(3.7)
D
ef3
=
D
f
+ aD
S
1 +a
(3.8)
D
ef4
=
aD
f
+ D
S
1 +a
(3.9)
Al igual que en el caso de todas las partculas marcadas, uno de los autovalores est a asociado
con la difusi on de la trampa y es exacto; tambi en se recuperan en la aproximaci on a orden q
2
los
dos coecientes de difusi on efectivos D
ef1
y D
ef2
del Captulo 2 (Ecs. 2.14 y 2.15). Al haber
partculas no marcadas, aparecen dos nuevos coecientes de difusi on efectivos D
ef3
y D
ef4
.
D
ef3
tiene la misma expresi on que el coeciente de difusi on efectivo encontrado en el caso de
un experimento de FRAP con partculas todas marcadas D
t
, Ec. 1.6. D
ef4
presenta el mismo
factor que D
ef3
pero en lugar de estar multiplicando a D
S
, est a multiplicando a D
f
.
3.1.3. Funci on de correlaci on para tiempos largos
En este caso, la funci on de correlaci on aproximada a orden q
2
tiene tres t erminos:
G() =
Go
S
_
1 +

DS
_
_
1 +

w
2
DS
+
Go
u
_
1 +

Du
_
_
1 +

w
2
Du
+
Go
t
_
1 +

Dt
_
_
1 +

w
2
Dt
(3.10)
deniendo el peso correspondiente a cada t ermino como:
Go
S
=
(P
t
beq
)
2
V
ef
S
tot
(P
t
tot
)
2
Go
u
=
P
t
feq
V
ef
(P
t
tot
)
2
f
(a + h)
h
Go
t
=
(1 f)
V
ef
(P
t
tot
)
(3.11)
donde P
t
tot
es la cantidad total de partculas marcadas y f la fracci on de partculas uorescentes.
Los tiempos caractersticos asociados a cada coeciente de difusi on son:
DS
=
w
2
r
4D
S
(3.12)
Du
=
w
2
r
4D
u
D
u
=
D
f
+ (a/h)D
S
1 + (a/h)
(3.13)
Dt
=
w
2
r
4D
t
D
t
=
D
f
+ aD
S
1 +a
(3.14)
(3.15)
En la aproximaci on a orden q
2
no hay contribuci on de los autovalores
3
y
5
. Solamente
las ramas de autovalores que se aproximan a cero cuando q 0 contribuyen a G(), esto ha-
ce que no haya ning un factor exponencial en la funci on de correlaci on. El primer t ermino en
la Ec. 3.10, se resuelve exactamente y es el asociado al coeciente de difusi on de la trampa; el
segundo t ermino est a asociado al coeciente de difusi on encontrado en el caso con partculas
todas marcadas, y el tercero corresponde al asociado al coeciente de difusi on efectivo de FRAP
en el caso de todas las partculas marcadas. N otese que si no hay partculas sin marcar, f = 1,
este ultimo t ermino se anula y se recupera la soluci on para partculas siempre uorescentes en-
contrada en el Captulo 2. El valor del coeciente D
t
ser a siempre menor o igual al valor de D
u
,
de hecho la relaci on que cumplen es D
S
D
t
D
u
D
f
.
En total, el sistema de partculas descripto en este captulo tiene 12 inc ognitas: los coecien-
tes de difusi on D
S
, D
f
, la constante de disociaci on K
d
, y las concentraciones de las diferentes
especies P
tot
, P
t
tot
, P
u
tot
, S
tot
, S
eq
, P
t
feq
, P
t
beq
, P
u
feq
, P
u
beq
. En cuanto a las ecuaciones, hay 4 ecua-
ciones de conservaci on de trampas y partculas totales (Ec. 3.4), dos ecuaciones de equilibrio de
las reacciones (Ec. 3.3) y 6 ecuaciones que provienen de la denici on de los par ametros de ajuste
del modelo, D
S
, D
t
,D
u
y sus respectivos pesos Go
S
, Go
t
y Go
u
. Esto da un total de 12 ecuacio-
nes con 12 inc ognitas, por lo que uno podra esperar, idealmente, recuperarlas todas a partir de un
experimento de FCS de este tipo. Sin embargo no todas las ecuaciones son independientes entre
s por lo que es necesario contar con datos adicionales para obtener todas las cantidades desco-
nocidas. Se puede elegir usar la informaci on de D
t
, D
u
o Go
u
, y suponer conocido el D
f
, S
tot
o K
d
para poder estimar todas las inc ognitas, a menos que se repita el experimento a diferentes
concentraciones de partculas marcadas, por ejemplo.
En la secci on siguiente presentamos una aplicaci on particular de esta forma de proceder
para extraer informaci on sobre algunos de los par ametros involucrados en un problema de gran
relevancia biol o gica, la embriog enesis.
52
marcadas
3.2. Aplicaci on del modelo al sistema de Bicoid
3.2.1. Sistema biol ogico y su relevancia
Uno de los mayores enigmas en la biologa del desarrollo es c omo las c elulas embrionarias
indiferenciadas son capaces de adoptar diferentes destinos celulares dependiendo de su posici on
en el embri on. Se conoce la existencia de mol eculas capaces de dictar a estas c elulas un destino,
mediante gradientes de su concentraci on. A este tipo de mol eculas se lo denomina morf ogeno.
Uno de los m as conocidos es el factor de transcripci on Bicoid (Bcd), estudiado especialmente
en moscas Drosophila melanogaster. Sabiendo ya la causa por la que las c elulas embrionarias
son capaces de adoptar destinos diferentes el inter es se ha volcado en descubrir c omo se forma
el gradiente que hace posible este fen omeno.
Uno de los mecanismos propuestos para explicar la formaci on del gradiente Bcd es un mode-
lo basado en la difusi on de este producto, que se conoce con el nombre de SDD (sntesis, difusi on
y degradaci on de Bcd). Este modelo supone que el mRNA Bcd no cursa ning un tipo de transporte
y queda connado en el polo anterior del embri on de D. melanogaster. Es la traducci on de ese
mRNA y la posterior difusi on del producto lo que formara el gradiente Bcd, permaneciendo m as
concentrado en el polo anterior que en el posterior. Este modelo, as como otros modelos pro-
puestos, depende fuertemente de la velocidad de difusi on del Bcd en el embri on. Es por eso que
han surgido en los ultimos a nos, muchos trabajos basados en m etodos opticos para determinar la
difusi on del Bcd en el embri on.
Diversos experimentos de FRAP realizados con Bcd marcado uorescentemente han dado
como resultado valores del coeciente de difusi on menores a 1 m
2
/s. La velocidad de difu-
si on estimada de esta forma no es lo sucientemente alta como para establecer el gradiente tan
r apidamente como de hecho se establece, entrando en conicto con el modelo SDD. Recientes
experimentos de FCS en el embri on, han dado como resultado coecientes de difusi on mayores,
que sostienen el modelo SDD. Ha surgido una gran controversia debido a estas diferencias en la
estimaci on del coeciente de difusi on del Bcd y su repercusi on en la validez de modelos.
En este trabajo no se busca validar o refutar el modelo SDD, pero s entender y explicar la
diferencia en las estimaciones del coeciente de difusi on del Bcd. La explicaci on que aqu pro-
ponemos est a basada en nuestro modelo que determina, entre otras cosas, c omo los coecientes
que se obtienen por FCS dependen de los par ametros biofsicos del problema. Esto nos permite
no s olo explicar las diferencias observadas sino tambi en inferir varios par ametros de inter es en
3.2 Aplicaci on del modelo al sistema de Bicoid 53
el caso de Bicoid.
3.2.2. Aplicaci on del modelo al sistema de Bicoid
Los resultados experimentales de FCS que vamos a analizar corresponden a los presentados
en Abu-Arish et al. [2010] obtenidos en embriones de Drosophila melanogaster. En estos expe-
rimentos se usan embriones que expresan Bcd fusionado con la protena uorescente egfp. Los
autores muestran que la protena marcada es funcional, es decir, se comporta dentro del embri on
como el Bcd sin marcar. Teniendo en cuenta que la egfp necesita un tiempo de maduraci on an-
tes de poder emitir luz, suponemos que los experimentos pueden ser interpretados utilizando el
modelo de partculas marcadas y no marcadas introducido en este captulo.
El embri on de Drosophila melanogaster sufre sucesivos ciclos de mitosis e interfase en don-
de los n ucleos se dividen. En la interfase los n ucleos est an bien diferenciados del citoplasma y
el Bcd se encuentra en mayor concentraci on dentro de los n ucleos. Durante la fase de mitosis
del ciclo celular la membrana que rodea al n ucleo se desensambla y no queda determinada la
separaci on entre citoplasma y n ucleos, mezcl andose los contenidos de los mismo. La concentra-
ci on de Bcd en el citoplasma durante la interfase aumenta levemente con respecto a la mitosis.
Los experimentos de Abu-Arish et al. [2010] fueron realizados empleando la t ecnica FCS en el
citoplasma cortical del embri on durante la interfase. Los autores buscan ajustar la funci on de
autocorrelaci on obtenida mediante expresiones de la forma:
G() =
1
N
_
1 +
B
1 B
e
/
B
_

n
j=1
F
j
_
1 +
_
j
_
j
_
_
1 +
_

w
2
j
_
j
, (3.16)
con n, el n umero de componentes consideradas, (n = 1, 2, 3), w
r
y w
z
par ametros que caracteri-
zan el tama no del volumen de detecci on y que se obtienen a partir de calibraciones (w
r
= (0.40
0.03) m, w
z
= (2 0.5) m en los experimentos ac a analizados) y el resto de los par ametros a
ser ajustados a partir de las observaciones o jados en base a otras consideraciones. En particular,
B y
B
caracterizan propiedades del uor oforo que los autores suponen conocidas de antemano,
siendo sus valores B = 0.2 y
B
= 0.22 ms para el subconjunto de ajustes que se considera en
esta Tesis. Los par ametros
j
, por otro lado, son o bien considerados jos (
j
= 1) o ajustados
para abarcar tambi en casos de difusi on an omala, los que corresponden a
j
= 1. Sin embargo,
los ajustes de Abu-Arish et al. [2010] dan
j
1. Por lo tanto, s olo se consideran los resultados
54
marcadas
de Abu-Arish et al. [2010] en los que se ja a priori
j
= 1 para todos los j. En la Ec. (3.16)
N es el n umero medio de partculas uorescentes en el volumen de detecci on y los varios
j
son
los tiempos de residencia promedio en dicho volumen de las componentes consideradas. Estos
ultimos siempre son determinados a partir del ajuste de la funci on de autocorrelaci on experimen-
tal y permiten estimar coecientes de difusi on mediante la relaci on D
j
= w
2
r
/(4
j
). Debido a
limitaciones experimentales, el valor de N es estimado en experimentos separados (hechos en el
n ucleo) por lo que la incerteza en esta cantidad es bastante grande. En la tabla 3.1 se presentan
los datos obtenidos en Abu-Arish et al. [2010] a partir de los ajustes. En la misma tabla, se pre-
senta el coeciente de difusi on estimado a partir de experimentos de FRAP realizados en Gregor
et al. [2007], empleando la protena fusionada Bcd-egfp durante la fase de mitosis.
Todos los tiempos de residencia obtenidos en Abu-Arish et al. [2010] son mucho mayores
que el caracterstico del uor oforo,
B
. Esto implica que el factor que multiplica a la sumatoria
en (3.16) es aproximadamente igual a 1/N para
j
. Por lo tanto, es de esperar que un ajuste
hecho con la funci on (3.16) donde el prefactor fuera reemplazado por 1/N dara aproximada-
mente los mismos valores de tiempos de residencia. Ahora bien, una expresi on de este tipo para
la funci on de autocorrelaci on tiene la misma forma que las aproximaciones obtenidas en esta
Tesis Ec. 3.10. La mayor diferencia radica en que las aproximaciones obtenidas en esta Tesis
permiten relacionar las cantidades inferidas a partir del ajuste de los experimentos con par ame-
tros biofsicos de un modelo del proceso en estudio. A continuaci on se interpretar an los valores
de la tabla 3.1 en funci on de las expresiones obtenidas en el marco del modelo propuesto en
este captulo para inferir varias cantidades de inter es. Debe notarse que en esta tabla se dan las
fracciones, F
i
, con la que cada componente contribuye a la funci on de autocorrelaci on, en lugar
de los pesos, Go
i
, de la Ec. 3.10, debido a las incertezas en la determinaci on de N. La relaci on
entre estas cantidades es:
F
i
=
Go
i
Go
tot
100 % (3.17)
donde Go
tot
= Go
i
.
Para analizar los resultados de los experimentos de Abu-Arish et al. [2010] se supone que
en el embri on hay Bcd marcado y sin marcar y que puede estar reaccionando con sustancias
que act uan como trampas. Por lo tanto, se utilizar a la expresi on analtica de la Ec. 3.10 para
interpretar los datos de la tabla 3.1. En esta tabla se listan los resultados obtenidos en Abu-Arish
et al. [2010] a partir de ajustes usando n = 2 y n = 3 componentes. En el caso n = 3 se identica
al menor coeciente de difusi on (D
1
) con el de la trampa, D
S
, al mayor (D
3
) con D
u
y al restante
(D
2
) con D
t
(dado que D
S
< D
t
< D
u
). En el caso de 2 componentes, se supone que D
S
0
Tabla 3.1: Datos de experimentos de FCS y FRAP realizados en el embri on de Drosophila me-
lanogaster empleando Bcd fusionado con la protena uorescente egfp y NLS-egfp.
Mediciones de FCS en citoplasma durante la interfase Abu-Arish et al. [2010]
Bcd-egfp
Par ametros de ajuste con n =3 componentes
Coeciente de difusi on Peso
D
1
= (0.095 0.037) m
2
/s F
1
= (5 2) %
D
2
= (1.6 0.5) m
2
/s F
2
= (32 6) %
D
3
= (14 2) m
2
/s F
3
= (63 8) %
D
1
= (0.38 0.03) m
2
/s F
1
= (18 1) %
D
2
= (8.9 0.4) m
2
/s F
2
= (82 1) %
NLS-egfp
D
1
= (1.0 0.1) m
2
/s F
1
= (11 1) %
D
2
= (26.5 0.9) m
2
/s F
2
= (89 1) %
Medici on de FRAP durante mitosis
Bcd-egfp
D
FRAP
= [0.37 - 1] m
2
/s Abu-Arish et al. [2010]
D
FRAP
= (0.30 0.09) m
2
/s Gregor et al. [2007]
56
marcadas
y que los coecientes, D
1
y D
2
, corresponden a D
t
y D
u
, respectivamente. Como se aprecia en
el ajuste de 3 componentes, D
S
D
t
, D
u
( 0.1 m
2
/s) y contribuye tan s olo en un 5 % a la
correlaci on total. Por lo tanto es razonable pensar que el ajuste de dos componentes corresponde
al lmite del ajuste con n = 3 en un caso en que es posible despreciar la contribuci on del t ermino
asociado a D
S
frente a la de los t erminos asociados a D
t
y D
u
. En la tabla 3.1 se incluyen tambi en
los valores del coeciente de difusi on obtenidos por FRAP en el citoplasma durante mitosis.
Como se discuti o en el Captulo 1, el coeciente que se estima con esta t ecnica FRAP es D
t
.
Teniendo en cuenta que la variaci on en la concentraci on citoplasm atica de Bcd-egfp observada
en mitosis y en interfase es de alrededor del 20 % Gregor et al. [2007], es de esperar que el
valor de D
t
no vare demasiado entre ambas situaciones si suponemos que el tipo de trampas
presentes no vara. El rango de valores de D
t
obtenidos en las mediciones de FRAP (realizadas
durante la mitosis), D
FRAP
t
= [0.21 1] m
2
/s, concuerda con los valores obtenidos por FCS
(en experimentos hechos durante interfase) que mediante el modelo propuesto se interpretan
como correspondientes a D
t
, D
FCS
t
= [0.38 1.6] m
2
/s. Esto muestra la plausibilidad del
modelo desarrollado en este captulo. De acuerdo a este, se puede decir que la diferencia de
estimaciones del coeciente de difusi on del Bcd medidas en FCS, Abu-Arish et al. [2010], y
FRAP, Gregor et al. [2007], es totalmente compatible con el hecho de que ambas t ecnicas dan
informaci on sobre distintos tipos de coecientes de difusi on efectivos.
3.2.3. Estimaci on de par ametros de la reacci on del Bicoid con trampas
Empleando el modelo propuesto en este captulo, no solamente se pueden explicar satisfac-
toriamente las diferencias en los coecientes de difusi on medidos, sino que tambi en se pueden
estimar par ametros referidos a la reacci on de Bcd con las posibles trampas. Para determinar todos
los par ametros de inter es es necesario contar con informaci on adicional. En particular, es posible
hacerlo si se conoce el coeciente de difusi on libre de Bcd-egfp, D
Bcd
(al que identicamos con
D
f
en nuestro modelo). En Abu-Arish et al. [2010] se presentan resultados de experimentos de
FCS realizados con la protena NLS-egfp, los que se han incluido en la tabla 3.1. Como se men-
ciona en el trabajo de Abu-Arish et al, la NLS-egfp debera moverse principalmente de forma
libre dentro del citoplasma, aun cuando pudiera interactuar con factores de transporte nuclear.
Por lo tanto, se espera que los experimentos hechos con NLS-egfp dan informaci on sobre el
coeciente de difusi on libre de Bcd-egfp, D
Bcd
. Pero antes de utilizar estos nuevos resultados
es necesario hacer ciertas consideraciones sobre los coecientes de difusi on. En primer lugar,
tenemos en cuenta la ecuaci on de Stokes-Einstein que relaciona el coeciente de difusi on, D, de
una mol ecula con su radio hidrodin amico, R
H
:
D =
kT
6R
H
, (3.18)
donde k es la constante de Boltzman, T la temperatura y la viscosidad del medio. En el caso
de protenas globulares, el radio hidrodin amico se puede expresar en t erminos de la densidad
molecular y el peso molecular de la protena (MW):
R
H
=
_
3
4
MW
_
1/3
. (3.19)
Como la densidad de las protenas globulares no vara demasiado y es del orden de 0.7 g ml
1
[Ja-
ckson, 2006], se puede estimar el cociente de los coecientes de difusi on para dos protenas en
un mismo medio y a la misma temperatura empleando las Ecs. 3.18 y 3.19:
D
Bcdegfp
D
NLSegfp
=
_
MW
NLSegfp
MW
Bcdegfp
_
1/3
. (3.20)
De los experimentos de Abu-Arish et al. [2010] realizados con NLS-egfp (tabla 3.1), se obtiene
D
NLSegfp
= (26.5 0.9) m
2
/s, y como MW
Bcdegfp
= 80 kDa y MW
NLSegfp
= 30 kDa,
una estimaci on del coeciente de difusi on libre del Bcd es: D
Bcd
18.7 m
2
/s. Los valores de
coecientes efectivos de difusi on deben ser menores o iguales a D
Bcd
, lo que se cumple en el
caso de estudio.
Usando la estimaci on de D
Bcd
y los coecientes efectivos de difusi on del ajuste de los datos
experimentales del Bcd, se pueden obtener las cantidades adimensionales S
eq
/K
d
y S
eq
/S
tot
. En
el caso del ajuste por 2 componentes, S
eq
/K
d
= 49 y para 3 componentes S
eq
/K
d
= 12. Las
diferencias entre estos valores se deben a que para el ajuste de 3 componentes D
t
1.6 m
2
/s,
mientras que para el ajuste de dos componentes es D
t
0.38 m
2
/s. El factor 4 en la estimaci on
de D
t
es el que se traslada al cociente S
eq
/K
d
. A partir del valor de S
eq
/K
d
se puede calcular la
fracci on de partculas (Bcd) libres, que resulta ser 2 % y 8 %, para 2 y 3 componentes, respecti-
vamente. Esto indica que la cantidad de Bcd libre es muy chica. La fracci on de trampas libres,
S
eq
/S
tot
, estimada usando el ajuste de 2 y 3 componentes es 2.3 % y 3.1 %, respectivamente. En
ambos casos esto indica que, de acuerdo al modelo desarrollado en este captulo, pr acticamente
todo lo que est a actuando como trampa tiene ligado Bcd.
Por otro lado, a partir del peso relativo de la componente correspondiente a D
t
, (F
1
para
n = 2 y F
2
= 2 para n = 3), se puede estimar la fracci on de partculas uorescentes, f, sin
58
marcadas
Tabla 3.2: Estimaciones de par ametros de las posibles trampas del Bcd inferidos a partir del
modelo propuesto.
Ajuste 2 componentes Ajuste 3 componentes
S
eq
/[Bcd-egfp] 0.028 0.043
K
d
/[Bcd-egfp] 5.8 10
4
0.0038
S
tot
/[Bcd-egfp] 1.2 1.4
S
eq
/[Bcd]
tot
0.023 0.030
K
d
/[Bcd]
tot
4.7 10
4
0.0026
S
tot
/[Bcd]
tot
1.00 0.95
necesidad de hacer uso del valor, D
f
= D
Bcd
. En el caso n = 2 la fracci on es 82 % y para 3
componentes es 68 %.
La informaci on obtenida hasta este punto se puede reescribir y obtener a partir de ella el
cociente entre los par ametros de la trampa, S
eq
, K
d
y S
tot
, y la concentraci on total de partculas
uorescentes [Bcd-egfp] (al que se identica con P
t
tot
= fP
tot
en el modelo desarrollado en este
captulo). Tambi en es posible obtener los cocientes con la concentraci on total de Bcd, [Bcd]
tot
=
[Bcd]+[Bcd-egfp] (al que se identica con P
tot
). Los resultados se presentan en la tabla 3.2.
Si se estima la concentraci on de Bcd en el embri on, es posible inferir S
eq
, K
d
y S
tot
a partir de
los cocientes. En Abu-Arish et al. [2010] ineren un rango de concentraciones de Bcd-egfp en el
n ucleo, [Bcd-egfp]
nuc
= [19 140] nM mientras que los experimentos de FCS fueron realizados
en el citoplasma durante la interfase. En Gregor et al. [2007] se estima que las concentraciones
de Bcd en citoplasma, n ucleo y durante la mitosis est an relacionadas de acuerdo a:
[Bcd egfp]
nuc
[Bcd egfp]
cito
4
[Bcd egfp]
mito
[Bcd egfp]
cito
1,2
Usando la relaci on de concentraci on de Bcd-egfp entre el n ucleo y el citoplasma se obtiene el
rango de concentraciones en el citoplasma: [Bcd-egfp]
cito
= [5 35] nM. Empleando este rango
se inere un rango de par ametros de las posibles trampas, los mismo se presentan en la tabla 3.3.
Tabla 3.3: Estimaciones de par ametros de las posibles trampas del Bcd inferidos a partir del
modelo propuesto y la estimaci on de la concentraci on de Bcd-egfp en el embri on.
Ajuste 2 componentes Ajuste 3 componentes
S
eq
[0.14 0.99] nM [0.22 1.5] nM
K
d
[0.003 0.02] nM [0.02- 0.13] nM
S
tot
[6 43] nM [7 49] nM
Diferencias entre mediciones de FRAP y FCS e implicancias para la formaci on del gradien-
te de Bicoid.
Considerando que los experimentos de FCS fueron realizados en el citoplasma durante la
interfase, mientras que los experimentos de FRAP fueron realizados durante la fase de mito-
sis, existe una leve diferencia en concentraciones del Bcd-egfp que fue medida en Gregor et al.
[2007]. Es de esperar que haya otras diferencias, como por ejemplo la concentraci on de tram-
pas. Durante la interfase, perodo en donde el citoplasma est a diferenciado de los n ucleos, estos
ultimos presentan una mayor concentraci on de Bcd. Es probable que algo an alogo suceda con la
concentraci on total de trampas. Durante la mitosis, la membrana que rodea los n ucleos se des-
ensambla y el contenido de estos se mezcla con el citoplasma, resultando en una concentraci on
de Bcd-egfp un poco mayor que en el citoplasma durante la mitosis. Si bien inobservable ex-
perimentalmente, es de esperar que la variaci on de la concentraci on total de Bcd sea igual a la
de Bcd-egfp. Teniendo en cuenta que las concentraciones observadas son bastante homog eneas
dentro de cada compartimiento (n ucleo o citoplasma), es razonable suponer que la variaci on en
[Bcd]
tot
sea debida unicamente a un cambio en el volumen accesible al pasar de medir en cito-
plasma durante la interfase a medir durante la mitosis. Si se supone adem as que hay un mismo
tipo de trampas en el n ucleo y en el citoplasma (caracterizadas por un mismo valor de K
d
en
el modelo aqu propuesto), la concentraci on total de trampas debera modicarse de la misma
forma que la concentraci on total de Bcd. Para investigar esta posibilidad, se estima el cociente
S
mito
tot
/S
cito
tot
a partir de la informaci on que se obtiene de los experimentos de FCS y FRAP, apli-
cando el modelo propuesto en este captulo. Para tal n, se reescribe el cociente en funci on de
60
marcadas
par ametros del modelo:
S
mito
tot
S
cito
tot
=
a
cito
a
mito
[Bcd]
mito
tot
[Bcd]
cito
tot
Kd
[Bcd]
mito
tot
+
1
(1 +a
mito
)
Kd
[Bcd]
cito
tot
+
1
(1 +a
cito
)
(3.21)
en donde a
cito
y a
mito
se estiman a partir del valor de D
t
obtenido en FCS y FRAP respectiva-
mente. Utilizando el valor Kd/[Bcd]
cito
tot
de la tabla 3.2 se calcula:
Kd
[Bcd]
mito
tot
=
Kd
[Bcd]
cito
tot
[Bcd]
cito
tot
[Bcd]
mito
tot
(3.22)
en donde el cociente [Bcd]
mito
tot
/[Bcd]
cito
tot
se considera igual al cociente [Bcd-egfp]
mito
/[Bcd-
egfp]
cito
1.2 (Ec. 3.21). Usando D
FRAP
t
dentro del rango [0.21 -1] m
2
/s y los datos del ajuste
de 2 y 3 componentes de FCS, el rango de valores que el cociente S
mito
tot
/S
cito
tot
puede tomar es [1.23
- 1.14] y [1.7 - 1.26], respectivamente. Estos valores son similares a los de [Bcd-egfp] estimados
en Gregor et al. [2007]. Esto es una muestra m as de la plausibilidad del modelo ac a propuesto
para interpretar los resultados sobre la difusi on de Bcd medidos por FRAP y FCS.
En resumen, los experimentos de FCS muestran de forma inequvoca que el Bcd no difunde
libremente dentro del citoplasma. Los experimentos de FCS y de FRAP dan entonces informa-
ci on sobre coecientes efectivos de difusi on que pueden resultar muy distintos entre s depen-
diendo de las propiedades de la interacci on entre Bcd y sus trampas y de sus concentraciones.
En esta secci on se ha presentado un modelo biofsico minimal que tiene en cuenta los procesos
involucrados en el transporte de Bcd en el citoplasma. Utilizando los resultados experimentales
de FCS y FRAP se estimaron los par ametros caractersticos de este modelo. De acuerdo a estos,
los coecientes efectivos, D
u
y D
t
, pueden ser muy distintos entre s lo que explica las diver-
gencias en las estimaciones del transporte citoplasm atico de Bcd obtenidas con FRAP y FCS.
Es necesario remarcar que los coecientes efectivos dependen, entre otras cosas, de la concen-
traci on de Bcd. Dado que la misma presenta un gradiente espacial, la tasa de transporte efectiva
de Bcd depende de la regi on dentro del embri on y del tiempo transcurrido desde el momento
en que el gradiente empieza a formarse. La estimaci on del tiempo que debe transcurrir hasta el
establecimiento de dicho gradiente no puede hacerse entonces en base a un unico coeciente de
difusi on. Lo m as correcto es hacerlo en base al modelo biofsico minimal ac a presentado don-
de Bcd difunde y reacciona. De todos modos, teniendo en cuenta que de acuerdo a los c alculos
presentados la constante de disociaci on de las trampas es peque na, es de esperar que las mismas
pronto saturen al irse produciendo Bcd en el polo anterior y que, una vez saturadas, las nuevas
mol eculas de Bcd difundan casi libremente estableciendo r apidamente el gradiente en la zona
anterior.
62
marcadas
4
Cuanticaci on de la difusi on del calcio por
m etodos opticos
En el estudio de las se nales intracelulares de calcio por m etodos opticos usualmente se em-
plean indicadores que aumentan la intensidad de su uorescencia al ligar iones de calcio. Dado
que en este tipo de estudios se registra la din amica del indicador ligado a calcio, para extraer
informaci on acerca de la din amica espacio-temporal del calcio libre es necesario contar con es-
timaciones realistas de los par ametros fsicos del indicador, en particular, de las constantes de
la reacci on y de su coeciente de difusi on. Por otro lado, en las c elulas el calcio no difunde
libremente, sino que reacciona tambi en con diversas sustancias (buffers) que modican su
concentraci on y su transporte. Estos buffers compiten con el indicador por el calcio y es de in-
ter es tambi en determinar sus propiedades. Un conocimiento de la capacidad buffer de la c elula
permitir a estimar la corriente de calcio que subyace a la imagen de una se nal usando un indicador
como los antes mencionados. En este captulo se estudia la aplicaci on de FCS para obtener algu-
nas de estas cantidades y se la implementa experimentalmente en soluciones de calcio, indicador
y buffer.
64 Cuanticaci on de la difusi on del calcio por m etodos opticos
Con este objetivo se hace primero un estudio te orico de los coecientes efectivos de difusi on
y de la funci on de autocorrelaci on que se obtendra en experimentos de FCS en un sistema con
calcio y un indicador y en otro donde hay adem as una trampa adicional (buffer) de calcio. Se
presentan a continuaci on datos experimentales en soluci on empleando un indicador de calcio,
que corroboran la existencia de dichos coecientes y que permiten inferir par ametros biofsicos
de inter es tanto en el caso en que no hay presente una trampa adicional como cuando s la hay.
Basado en el an alisis de este ultimo caso se propone un m etodo para estimar coecientes de
difusi on y capacidad buffer en ovocitos a partir de experimentos de FCS.
4.1. Teora de FCS para un sistema conteniendo calcio y un
indicador
4.1.1. Funci on de autocorrelaci on
El calcio y sus indicadores cumplen con un esquema de reacci on bi-molecular como el
presentado en la Ec. 2.1. Por otro lado, dado que el peso molecular de los indicadores es mucho
mayor que el de los iones es posible suponer que la difusi on del indicador no se ve modicada
al ligar al i on. Por lo tanto, las ecuaciones que rigen la evoluci on de las concentraciones en
este caso son las mismas que las planteadas en el Captulo 2 y se pueden usar los autovalores y
autovectores ya encontrados, identicando al calcio (Ca) con las partculas y a su indicador con
la trampa (F4). Para calcular la correlaci on se emplea la expresi on de la Ec. 1.15, en donde se
considera el brillo de cada especie. En este caso suponemos que la unica sustancia uorescente
es el indicador ligado a calcio, CaF4:
C
1
= Ca
eq
y Q
1
= 0
C
2
= CaF4
eq
y Q
2
= Q
C
3
= F4
eq
y Q
3
= 0
donde Ca
eq
, CaF4
eq
y F4
eq
son las concentraciones en equilibrio que cumplen:
Ca
eq
F4
eq
= K
dF4
CaF4
eq
, (4.1)
donde K
dF4
es la constante de disociaci on, denida como el cociente de las tasas de disociaci on
y asociaci on de la reacci on k
offF4
/k
onF4
. La funci on de correlaci on se escribe como suma de 3
4.1 Teora de FCS para un sistema conteniendo calcio y un indicador 65
t erminos G() = G
1
() +G
2
() +G
3
(), cada uno de la forma:
G
i
() =
1
(2)
3
_
d
3
q
I(q)g
i
(q, )
donde los integrandos, g
i
, se escriben en funci on de la norma del vector de onda q y como:
g
1
(, q) =
1
CaF4
eq
(1 +h)
h
e
g
2
(, q) =
1
2hCaF4
eq
_
1 +
(a h)
(a + h)
F4
.
+
(D
Ca
D
F4
)q
2
.
_
e
g
3
(, q) =
1
2hCaF4
eq
_
1
(a h)
(a + h)
F4
.
+
(D
Ca
D
F4
)q
2
.
_
e
con
. =
(D
Ca
D
F4
)
2
q
4
+ 2
(a h)
(a + h)
(D
Ca
D
F4
)
F4
q
2
+
2
F4
, D
Ca
y D
F4
los coecien-
tes de difusi on libres del calcio y de su indicador, respectivamente, y
F4
denido como:
F4
= k
offF4
(a + h). (4.2)
En este caso a =
F4
eq
K
dF4
y h =
F4
tot
F4
eq
. N otese que si bien los autovalores y autovectores son
los mismos que en el caso de partculas siempre uorescentes del Captulo 2, los pesos de cada
t ermino en la funci on de correlaci on son diferentes debido al cambio en el brillo de las diferentes
especies.
4.1.2. Modelo aproximado para tiempos largos
Si se aplica la aproximaci on a orden q
2
en la expansi on, la correlaci on se escribe como:
G() =
Go
F4
_
1 +

D
F4
_
_
1 +

w
2
D
F4
+
Go
CaF4
ef1
_
1 +

D
CaF4
ef1
_
1 +

w
2
D
CaF4
ef1
+
+
Go
CaF4
ef2
e
F4
_
1 +

D
CaF4
ef2
_
1 +

w
2
D
CaF4
ef2
(4.3)
con los pesos:
Go
F4
=
1
V
ef
F4
tot
(4.4)
Go
CaF4
ef1
=
1
V
ef
CaF4
eq
a
h(a + h)
(4.5)
Go
CaF4
ef2
=
1
V
ef
CaF4
eq
1
(a + h)
(4.6)
y los tiempos caractersticos y coecientes de difusi on efectivos denidos como:
D
F4
=
w
2
r
4D
F4
(4.7)
D
CaF4
ef1
=
w
2
r
4D
CaF4
ef1
, D
CaF4
ef1
=
D
Ca
+ x
F
D
F4
1 +x
F
(4.8)
D
CaF4
ef2
=
w
2
r
4D
CaF4
ef2
, D
CaF4
ef2
=
x
F
D
Ca
+ D
F4
1 +x
F
(4.9)
con x
F
a/h = F4
2
eq
/(K
dF4
F4
tot
).
A diferencia del caso de partculas siempre uorescentes estudiado en el Captulo 2, en este
caso no se anula el tercer t ermino correspondiente al autovalor que no tiende a cero cuando q
tiende a cero. Es por eso que aparece el factor exponencial en el ultimo t ermino de la funci on de
autocorrelaci on. N otese que al igual que en el caso de partculas siempre uorescentes, la suma
de los pesos Go, es inversamente proporcional a la concentraci on de partculas uorescentes, que
en este caso corresponde a:
Go
tot
=
1
V
ef
CaF4
eq
. (4.10)
En total, el sistema analizado en esta secci on tiene 9 inc ognitas: los coecientes de difusi on
libres, D
Ca
, D
F4
, las constantes de la reacci on K
dF4
, k
offF4
y las concentraciones de las dife-
rentes especies Ca
tot
, F4
tot
, Ca
eq
, F4
eq
, CaF4
eq
. En cuanto a las ecuaciones, hay 2 ecuaciones
de conservaci on (una para el indicador y otra para el calcio), la ecuaci on de equilibrio de la reac-
ci on (4.1) y 7 ecuaciones que provienen de la denici on de los par ametros de ajuste del modelo,
D
F4
, D
CaF4
ef1
,D
CaF4
ef2
y sus respectivos pesos Go
F4
, Go
CaF4
ef1
, Go
CaF4
ef2
y
F4
. En total seran
10 ecuaciones y 9 inc ognitas. Sin embargo se puede mostrar que una de las ecuaciones del ajus-
te del modelo, D
CaF4
ef1
, D
CaF4
ef2
o Go
CaF4
ef1
, es dependiente de las otras. A diferencia del caso
de partculas siempre uorescentes, no es necesario suponer conocido a priori el valor de D
Ca
,
F4
tot
o K
dF4
para, idealmente, poder estimar el resto de las inc ognitas a partir de la funci on
de autocorrelaci on. Adem as el ajuste permitira obtener informaci on acerca de k
offF4
que es un
par ametro de reacci on pobremente caracterizado.
4.2. Teora de FCS para un sistema conteniendo calcio, indi-
cador y quelante.
Hasta ahora se estudiaron diferentes casos de interacciones, pero siempre con un solo tipo
de trampa. En general, y en particular en el caso del calcio, es de esperar la presencia de m as
4.2 Teora de FCS para un sistema conteniendo calcio, indicador y quelante. 67
de un compuesto que act ue como trampa. Se estudiar a en esta secci on c omo se modican los
coecientes de difusi on efectivos ante la presencia de dos tipos de trampas diferentes. Se con-
sidera, en particular, el caso del calcio, su indicador uorescente, Fluo 4 y un buffer llamado
EGTA. El EGTA es un quelante de calcio que reacciona con este de acuerdo a un esquema de
reacci on bimolecular como el de la Ec. 2.1 con tasas de asociaci on y disociaci on, k
onE
y k
offE
,
respectivamente. Llamaremos K
dE
= k
offE
/k
onE
a la constante de disociaci on. En el caso de los
buffers de calcio en general, y en el del EGTA, en particular, es posible suponer que la difusi on
libre no se ve modicada al ligar calcio. En esta secci on trabajaremos entonces con los siguientes
esquemas de reacci on
Ca + F4
k
offF4
k
onF4
CaF4 (4.11)
Ca + E
k
offE
k
onE
CaE (4.12)
donde con E y CaE denotamos al quelante en su forma libre y en su forma con calcio ligado res-
pectivamente, y consideraremos las siguientes ecuaciones de evoluci on para las concentraciones
de los compuestos intervinientes:
[Ca]
t
= D
Ca
2
[Ca] k
onF4
[Ca] [F4] +k
offF4
[CaF4] k
onE
[Ca] [E] + k
offE
[CaE]
[F4]
t
= D
F4
2
[F4] k
onF4
[Ca] [F4] +k
offF4
[CaF4]
[CaF4]
t
= D
F4
2
[CaF4] +k
onF4
[Ca] [F4] k
offF4
[CaF4]
[E]
t
= D
E
2
[E] k
onE
[Ca] [E] + k
offE
[CaE]
[CaE]
t
= D
E
2
[CaE] + k
onE
[Ca] [E] k
offE
[CaE]
donde D
E
es el coeciente de difusi on libre del EGTA.
Siguiendo el mismo procedimiento que en captulos anteriores, se linealizan las ecuaciones
de evoluci on alrededor del equilibrio. En el caso del EGTA, las concentraciones en el equilibrio
satisfacen: Ca
eq
E
eq
= K
dE
CaE
eq
. Utilizando las constantes referentes al indicador de calcio
para adimensionalizar las ecuaciones:
T = k
offF4
t
=
_
k
offF4
D
Ca
x
y pasando al espacio de Fourier, la matriz que caracteriza la evoluci on del problema linealizado
en funci on de la norma del vector de onda adimensional q resulta:
A =
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
q
2
a a
E
1 c k
E
c
E
a
D
F4
D
Ca
q
2
1 c 0 0
a 1
D
F4
D
Ca
q
2
c 0 0
a
E
0 0
D
E
D
Ca
q
2
k
E
c
E
a
E
0 0 k
e

D
E
D
Ca
q
2
c
E
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
(4.13)
donde a =
F4
eq
K
dF4
y c =
Ca
eq
K
dF4
, k
E
=
k
offE
k
offF
, a
E
=
E
eq
K
dE
k
E
y c
E
=
Ca
eq
K
dE
k
E
.
4.2.1. Coecientes de difusi on efectivos
En este caso hay 5 autovalores. Dos de ellos corresponden a la difusi on libre del Fluo 4 y del
EGTA y se escriben, sin realizar otras aproximaciones, como:
1
= D
F4
q
2
2
= D
E
q
2
Los restantes autovalores, en la expansi on a orden q
2
, se escriben de la forma:
3
= D
ef1
q
2
(4.14)
4
=
ef2
D
ef2
q
2
(4.15)
5
=
ef3
D
ef3
q
2
(4.16)
donde D
ef1
, D
ef2
y D
ef3
son n umeros positivos a los que llamamos coecientes efectivos de
difusi on y q es la norma del vector de onda con dimensiones. En particular, es posible obtener
una expresi on analtica sencilla para el primero de ellos:
D
ef1
=
D
Ca
+ x
F
D
F4
+ x
E
D
E
1 +x
F
+ x
E
, (4.17)
con x
F
= F4
2
eq
/(K
dF4
F4
tot
) y x
E
= E
2
eq
/(K
dE
E
tot
). Este coeciente es el mismo que el coe-
ciente efectivo de la aproximaci on de buffers r apidos (RBA) presentada en la Eq 1.5 y corres-
ponde al coeciente efectivo 2.14 en el caso de m as de una trampa. Las expresiones analticas
de D
ef2
, D
ef3
,
ef2
y
ef3
, son realmente largas, el procedimiento para obtenerlas se presen-
ta en el Ap endice. Cabe mencionar que los coecientes efectivos D
ef2
y D
ef3
, a diferencia de
D
ef1
, dependen del cociente k
E
= k
offE
/k
offF4
. Adem as, se cumplen las siguientes relaciones:
D
ef1
+ D
ef2
+ D
ef3
= D
Ca
+ D
F4
+ D
E
y
ef2
+
ef3
=
F4
+
E
donde
F4
y
E
son los
argumentos de las exponenciales en el caso de la difusi on de calcio en presencia de Fluo 4 y de
EGTA separadamente,
F4
denida en (4.2) y
E
= k
offE
(E
eq
/Kd
E
+ E
tot
/E
eq
).
A modo de ilustraci on se muestran en la gura 4.1 los gr acos de los cocientes con D
Ca
de
los coecientes de difusi on efectivos denidos en (4.14)(4.16) en funci on de la concentraci on
total de calcio, para un caso particular. Los par ametros elegidos son cercanos a valores esperados
de la reacci on CaFluo 4EGTA, en los casos en los que hay estimaciones previas de los mismos
(ver tabla 4.5). Se gracan los cocientes porque el comportamiento de los coecientes efectivos
no cambia cualitativamente al cambiar el valor de D
Ca
. En la mencionada gura se vara el
valor del cociente de tasas de disociaci on, k
E
, modicando los valores de k
offF4
y k
offE
. Cabe
aclarar que D
ef2
y D
ef3
, dependen de k
E
y no de los valores de las tasas de disociaci on de
cada trampa por separado. Como se observa en los gr acos de la gura 4.1, D
ef1
es la misma
funci on de Ca
tot
en todos los casos, mientras que D
ef2
y D
ef3
presentan cambios cualitativos con
k
E
. Tambi en se gracan en esa gura el cociente de los coecientes efectivos provenientes del
modelo de una sola trampa, considerando la reacci on CaFluo 4 (D
CaF4
ef1
y D
CaF4
ef2
denidos
en (4.8)(4.9)) y la reacci on CaEGTA (D
CaE
ef1
y D
CaE
ef2
como en (4.8)(4.9) pero teniendo en
cuenta los par ametros de reacci on y concentraciones del EGTA). Es conveniente comparar los
coecientes efectivos de la reacci on de dos trampas con el caso de una trampa para poder saber
en qu e condiciones el an alisis de la reacci on de tres compuestos se puede reducir al de dos. En
la gura 4.1 se observa que para k
E
1, D
ef2
es indistinguible de D
CaF4
ef2
para todo el rango
de concentraciones, Ca
tot
, considerado, mientras que es indistinguible de D
CaE
ef2
para k
E
1.
Por otro lado, la posibilidad de describir los coecientes en el caso de 2 trampas en t erminos
de los obtenidos para una sola de ellas tambi en depende de las concentraciones relativas de los
compuestos involucrados. En particular, si las concentraciones totales de quelante y de calcio se
encuentran en exceso en comparaci on al indicador Fluo 4 (como es de esperar que suceda en una
c elula intacta al inyectar peque nas cantidades de indicador) resulta:
x
F
=
F4
2
eq
K
dF4
F4
tot
E
2
eq
K
dE
E
tot
(4.18)
de donde se desprende que:
D
ef1
=
D
Ca
+ x
E
D
E
+ x
F
D
F4
1 +x
E
+ x
F
D
Ca
+ x
E
D
E
1 +x
E
= D
CaE
ef1
. (4.19)
Esto se puede observar en la gura 4.2 donde se presentan gr acos similares a los de la -
gura 4.1 pero para un caso donde el calcio y el EGTA est an en exceso respecto del Fluo 4
0 1 2 3 4 5 6 7
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
Ca
tot
(M)
D

/

D
C
a

D
ef1
D
ef2
D
ef3
D
ef1
CaF4
D
ef2
CaF4
D
ef1
CaE
D
ef2
CaE
D
F4
/D
Ca
D
E
/ D
Ca
(a) k
E
= 0.001, k
offF4
= 1000 s
1
, k
offE
= 1 s
1
0 1 2 3 4 5 6 7
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
Ca
tot
(M)
D

/

D
C
a

D
ef1
D
ef2
D
ef3
D
ef1
CaF4
D
ef2
CaF4
D
ef1
CaE
D
ef2
CaE
D
F4
/D
Ca
D
E
/D
Ca
(b) k
E
= 0.1, k
offF4
= 10 s
1
, k
offE
= 1 s
1
0 1 2 3 4 5 6 7
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
Ca
tot
(M)
D

/

D
C
a

D
ef1
D
ef2
D
ef3
D
ef1
CaF4
D
ef2
CaF4
D
ef1
CaE
D
ef2
CaE
D
F4
/D
Ca
D
E
/D
Ca
(c) k
E
= 100, k
offF4
= 1 s
1
, k
offE
= 100 s
1
Figura 4.1: Gr aco de los cocientes adimensionales de los coecientes efectivos te oricos de
la reacci on CaFluo 4EGTA: D
ef1
, D
ef2
y D
ef3
, y de las reacciones CaFluo 4, D
CaF4
ef1
,
D
CaF4
ef2
y CaEGTA, D
CaE
ef1
, D
CaE
ef2
en funci on de la concentraci on total de calcio. Con
D
Ca
= 1000 m
2
/s, D
F4
= 100 m
2
/s, D
E
= 300 m
2
/s, F4
tot
= 1000 nM, E
tot
= 1000 nM,
K
dF4
= 500 nM y K
dE
= 100 nM.
9.2 9.4 9.6 9.8 10 10.2
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Ca
tot
(mM)
D

(
m
2
/
s
)

D
ef1
D
ef2
D
ef3
D
ef1
CaF4
D
ef2
CaF4
D
ef1
CaE
D
ef2
CaE
D
F
D
E
D
Ca
Figura 4.2: Gr aco de los coecientes efectivos te oricos de la reacci on CaFluo 4EGTA,
D
ef1
, D
ef2
y D
ef3
y de las reacciones CaFluo 4, D
CaF4
ef1
, D
CaF4
ef2
y CaEGTA, D
CaE
ef1
,
D
CaE
ef2
en funci on de la concentraci on total de calcio. Con F4
tot
= 676 nM, E
tot
= 9.66 mM,
D
Ca
= 760 m
2
/s, D
F4
= 85 m
2
/s, D
E
= 300 m
2
/s, K
dF4
= 2600 nM, K
dE
= 150 nM,
k
offF4
= 300 s
1
y k
offE
= 0.75 s
1
.
(F4
tot
= 676 nM mientras que E
tot
= 9.66 mM y Ca
tot
= [9.2 10.4] mM). Como se puede ob-
servar, D
ef1
= D
CaE
ef1
para cualquier concentraci on de calcio en este caso. Se observa tambi en
que D
ef3
D
CaE
ef2
para Ca
tot
> 9.6 mM, valores de concentraci on para los que D
ef2
D
F4
.
Bajo esta ultima condici on, el comportamiento observado de D
ef3
puede deducirse a partir de
las expresiones de los coecientes efectivos. Teniendo en cuenta que D
ef1
+ D
ef2
+ D
ef3
=
D
Ca
+D
F4
+D
E
, si D
ef2
D
F4
se puede concluir que D
ef3
D
Ca
+D
E
D
ef1
. Insertando
en esta ultima igualdad la expresi on aproximada de D
ef1
dada por (4.19), se obtiene:
D
ef3

x
E
D
Ca
+ D
E
1 +x
E
= D
CaE
ef2
(4.20)
Este comportamiento es interesante ya que, en principio, permitira determinar propiedades de las
trampas no uorescentes a partir de mediciones realizadas con peque nas cantidades de uor ofo-
ro. En otras secciones de este Captulo se muestran resultados experimentales que hacen uso
de esta propiedad y, basada en ella, se presenta tambi en una propuesta para determinar las pro-
piedades de buffers end ogenos en ovocitos usando FCS. Se aprecia a su vez en la gura que
los coecientes efectivos D
CaF4
ef
permanecen pr acticamente constantes alrededor de los valores
extremos que pueden tomar para todas las concentraciones, Ca
tot
.
4.2.2. Funci on de autocorrelaci on
Para calcular la funci on de correlaci on hay que conocer la matriz de autovectores:
=
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
0 0
(1 +c + D
F4
q
2
+
3
)
a

(1 +c + D
F4
q
2
+
4
)
a

(1 +c + D
F4
q
2
+
5
)
a
c 0 1 1 1
1 0 1 1 1
0
c
E
k
E
3

4

5
0 1
3

4

5
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
(4.21)
donde
i
son funciones de q y de los par ametros de reacci on - difusi on. No se tiene una expresi on
compacta analtica de los
i
. Como el calcio y el EGTA no son uorescentes y considerando que
la unica especie uorescente es el indicador ligado a calcio (CaF4), se emplea la expresi on de
la Ec. 1.15 para calcular la funci on de correlaci on, en donde se asigna:
C
1
= Ca
eq
y Q
1
= 0,
C
2
= CaF4
eq
y Q
2
= Q,
C
3
= F4
eq
y Q
3
= 0,
C
4
= CaE
eq
y Q
4
= 0,
C
5
= E
eq
y Q
5
= 0.
La funci on de correlaci on resulta:
G() =
Go
F4
_
1 +

D
F4
_
_
1 +

w
2
D
F4
+
Go
ef1
_
1 +

D
ef1
_
_
1 +

w
2
D
ef1
+
+
Go
ef2
e
ef2

_
1 +

D
ef2
_
_
1 +

w
2
D
ef2
+
Go
ef3
e
ef3

_
1 +

D
ef3
_
_
1 +

w
2
D
ef3
(4.22)
donde
D
efi
=
w
2
r
4D
efi
. Se obtiene un modelo de 4 componentes, dos de ellos con factores expo-
nenciales. El primer t ermino de la Ec. 4.22 corresponde (como en el caso de una sola trampa) al
coeciente de difusi on del indicador, del cual se conoce la expresi on analtica de su peso:
Go
F4
=
1
V
ef
F4
tot
. (4.23)
Dado que no se tiene una expresi on analtica cerrada de todos los autovectores, tampoco se tiene
una expresi on analtica de los pesos (Go) de las otras componentes. De todos modos, se puede
4.3 Experimentos de FCS en soluci on. Materiales y m etodos. 73
suponer que la suma de todos los pesos es inversamente proporcional a la concentraci on de
partculas uorescentes que, al igual que en el caso de un sistema con calcio y un indicador, es
CaF4
eq
cumpli endose la Ec. 4.10. En cuanto a los coecientes de difusi on efectivos, se tiene una
expresi on compacta en el caso de D
ef1
. Para D
ef2
y D
ef3
las expresiones analticas son bastante
extensas, en el ap endice se muestra el procedimiento para obtenerlas.
4.3. Experimentos de FCS en soluci on. Materiales y m etodos.
Para comprobar y corroborar el desarrollo te orico propuesto para el caso de indicadores de
calcio se realizaron experimentos de FCS en condiciones controladas. Para el caso de un solo
tipo de trampa se emplearon soluciones con diferentes concentraciones del indicador de calcio
Fluo 4-dextran high afnity y una concentraci on de calcio total constante. Para el caso de dos
tipos de trampa se emple o el quelante EGTA, que liga y desliga iones de calcio y la versi on de
baja anidad del Fluo 4-dextran. Para este ultimo tipo de experimentos, se dejaron constantes
las concentraciones totales de Fluo 4-dextran low afnity y EGTA, variando la concentraci on de
calcio total. Los experimentos fueron realizados en el microscopio confocal de la rma Olympus,
modelo Fluo View 1000 del Laboratorio de Microscopa y Microespectroscopa.
4.3.1. Adquisici on de datos
Para la realizaci on de los experimentos en soluci on se depositaba una gota de aproxima-
damente 30 l de la soluci on elegida sobre un cubreobjeto y se colocaba en el microscopio
empleando un objetivo 60 x de inmersi on en aceite (UPlasSapo). Al tratarse del indicador de
calcio Fluo 4 se emple o la lnea 488 nm del l aser de Arg on para excitar la muestra y se reco-
lect o la uorescencia en el rango de [500600] nm. Se emple o un tama no de abertura confocal o
pinhole de 115 m. Se realizaron experimentos de FCS, es decir, se recolect o la uorescencia
en un punto sin escanear la regi on. Se preri o hacer este tipo de experimento que prioriza la
resoluci on temporal sobre la espacial, ya que al tratarse de una soluci on acuosa, la parte espacial
es homog enea. Para ello se enfocaba el microscopio en un punto aproximadamente a 20 m del
cubreobjeto y se adquira la uorescencia en un punto jo a una frecuencia de 50 kHz durante
aproximadamente 160 s. El tama no de pixel es de 0.175 x 0.175 m
2
.
4.3.2. C alculo de la autocorrelaci on de la uorescencia experimental
Se veric o que la serie temporal de la uorescencia uctuara alrededor de un valor constante
a lo largo de toda la medici on y se descartaron series que presentaran alteraciones abruptas con
respecto a su valor medio. La serie temporal de la uorescencia fue dividida en N segmentos de
largo FTL. Cada uno de ellos fue extendido al doble de su longitud con ceros para evitar el alia-
sing. Luego se calcul o la autocorrelaci on a partir del teorema de Wiener-Khinchin, empleando
la transformada de Fourier discreta (FTL debe ser una potencia de 2). Finalmente se calcul o el
promedio de las autocorrelaciones. La longitud del segmento, FTL, determina el mayor tiempo
de correlaci on estudiado, por lo tanto es necesario elegirlo de forma tal que los tiempos carac-
tersticos estudiados sean mucho menores a el. En este caso se tom o una longitud de FTL = 2
13
datos obteniendo N = 1021 segmentos de 164 ms de duraci on, mientras que el mayor tiempo
caracterstico de correlaci on obtenido fue de 1 ms.
4.3.3. Ajuste de las autocorrelaciones experimentales
La correlaci on promedio obtenida experimentalmente fue ajustada por el modelo indicado en
cada caso. En particular, se us o una funci on de la forma (4.3) para los experimentos con calcio e
indicador a partir de los cuales se obtuvieron 3 pesos y 3 tiempos de difusi on caractersticos, Go
i
,
D
i
, 0 i 2, junto con la tasa de decaimiento exponencial
2
,asociada al t ermino de D
2
, que
corresponde respectivamente, a las cantidades Go
F
, Go
CaF4
ef1
, Go
CaF4
ef2
,
D
F4
,
D
CaF4
ef1
,
D
CaF4
ef2
y
F4
del modelo. En el caso de los experimentos conteniendo tambi en EGTA, se intent o el
ajuste con funciones de la forma (4.22) con diferentes n umeros de componentes y con y sin
factores exponenciales. Sin embargo, el mejor ajuste se logr o usando una funci on de la forma
Ec. 1.11 con s olo dos componentes (m = 2), por lo que se obtuvieron s olo 2 pesos y 2 tiempos
caractersticos de difusi on, Go
i
,
D
i
, 0 i 1 para cada tipo de soluci on analizada. Parte
del an alisis de estos datos presentado en esta Secci on radica en determinar que informaci on
proveen estos par ametros en t erminos de los de la funci on de autocorrelaci on te orica (4.22). Para
la realizaci on de los ajustes se emple o la funci on nlint de la plataforma Matlab, que estima por
cuadrados mnimos los par ametros de modelos no lineales, utilizando el algoritmo de Gauss-
Newton con modicaciones Levenberg-Marquardt para la convergencia global. Para este m etodo
es necesario dar una propuesta inicial de los par ametros a ajustar. El resultado de la minimizaci on
puede llegar a depender de estos valores. En muchos casos, dar propuestas muy lejanas a los
valores reales de los par ametros puede llevar a encontrar valores no fsicamente posibles. Por esta
4.4 Experimentos de FCS en soluciones con calcio y Fluo 4 75
raz on se implement o una rutina en donde se varan las propuestas iniciales de los par ametros, y se
descartan los resultados con valores no razonables. En el caso de los experimentos realizados, las
restricciones impuestas a los coecientes de difusi on, D, y a los pesos, Go fueron: 10 m
2
/s <
D < 2500 m
2
/s y 0 < Go <10. Si, habiendo descartado las soluciones no fsicamente posibles
se encuentran m as de un conjunto de par ametros razonables, se elige el que presenta un menor
valor de
2
:
2
=
1
N
p
N
v
Np
i
(G
teo
(
i
) G
exp
(
i
))
2
G
teo
(
i
)
(4.24)
donde N
p
es el n umero total de puntos de la correlaci on experimental G
exp
, N
v
el n umero de
variables del modelo y G
teo
la correlaci on calculada por el modelo.
2
resulta muy util para
comparar ajustes de modelos con diferente n umero de par ametros.
Como se explic o en el Captulo 1, para recuperar los coecientes de difusi on en experi-
mentos de FCS para cada tanda de experimentos, se realiz o una calibraci on del volumen con-
focal empleando una soluci on 50 nM de Fluorescena
1
, considerando su coeciente de difusi on
300 m
2
/s. Los valores de w
r
obtenidos variaron entre 220 y 245 m con w = w
z
/w
r
= 5. El
volumen efectivo estimado fue V
ef
= (0.35 0.06) m
3
.
4.4. Experimentos de FCS en soluciones con calcio y Fluo 4
Se realizaron experimentos empleando soluciones acuosas con diferentes concentraciones
de Fluo 4-dextran high afnity (Invitrogen-Molecular Probes). En la tabla 4.1 se presentan las
concentraciones de los diferentes reactivos empleadas. Usando las estimaciones previas listadas
en la tabla 4.2, se calcularon las correlaciones te oricas esperadas para cada soluci on a partir de
las Ecs. (4.3)(4.9). En la gura 4.3 se gracan estas correlaciones y la contribuci on de cada
componente a la correlaci on total. Estas ultimas varan seg un la composici on de la soluci on.
Para concentraciones menores de Fluo 4, predomina la componente asociada al coeciente D
F4
y a mayores concentraciones predomina la asociada a D
CaF4
ef1
.
1
La Fluorescena es un uor oforo con espectro de absorci on y emisi on similar al de Fluo 4.
Tabla 4.1: Concentraciones de los distintos reactivos usados en experimentos de FCS en soluci on
Soluci on F4
tot
Ca
tot
S1 429 nM 4286 nM
S2 857 nM 4286 nM
S3 1371 nM 4286 nM
S4 1886 nM 4286 nM
S5 2571 nM 4286 nM
S6 4286 nM 4286 nM
S7 9000 nM 4286 nM
S8 15000 nM 4286 nM
S9 19286 nM 4286 nM
Todas las soluciones contienen adem as:
100 mM KCl,30 mM MOPS, pH 7.2
Tabla 4.2: Par ametros de reacci on - difusi on
Coecientes de difusi on y constantes de reacci on estimados previamente
D
Ca
760 m
2
/s Qin et al. [1991]
D
F4
85 m
2
/s Gennerich and Schild [2002]
K
dF4
772 nM Invitrogen-Molecular Probes
k
offF4
80 s
1
no se encontraron estimaciones
Figura 4.3: Gr aco de las correlaciones te oricas y las diferentes componentes, para cada una de
las soluciones analizadas. En lnea continua negra, roja y verde, se gracan respectivamente, el
primer, segundo y tercer t ermino de la funci on de autocorrelaci on del modelo de la Ec. 4.3, que
corresponden a los t erminos asociados a los coecientes de difusi on D
F4
, D
CaF4
ef1
y D
CaF4
ef2
respectivamente. En lnea punteada se graca la autocorrelaci on total.
4.4.1. Obtenci on de par ametros de ajuste y estimaci on de coecientes de
difusi on.
Para cada una de las soluciones presentadas en la tabla 4.1 se realizaron experimentos de
FCS que fueron ajustados con funciones de la forma eq 4.3 a partir de los cuales se obtuvieron
los pesos y coecientes de cada componente, Go
0
, Go
1
, Go
2
, D
0
, D
1
y D
2
y la tasa del factor
exponencial,
2
. En la gura 4.4 se presentan los coecientes de difusi on del ajuste encontra-
dos para cada soluci on en funci on del F4
tot
y los resultados te oricos esperados, D
F4
, D
CaF4
ef1
y
D
CaF4
ef2
calculados a partir de las Ecs. 4.8 y 4.9 usando los par ametros de las tablas 4.2 y 4.1.
Como se puede observar en dicha gura, el coeciente, D
0
, obtenido del ajuste permanece apro-
ximadamente constante a lo largo de todas las soluciones analizadas y es f acilmente atribuible
al coeciente de difusi on del Fluo 4, D
F4
. El valor de D
F4
obtenido del promedio de D
0
es de
(47 4) m
2
/s, si bien es un poco menor que el esperado 85 m
2
/s, no se tiene con cer-
teza el valor de su difusi on. El valor dado en la referencia de la tabla 4.2 es el estimado para
la TMR dextran, que es un dextrano de 10 kDa como el Fluo 4-dextran pero en lugar de tener
asociado el Fluo 4, tiene asociada una mol ecula de TMR (Tetramethyl Rhodamine) que no re-
quiere calcio ni ning un otro ligando para uorescer. Con respecto a los otros dos coecientes de
difusi on mostrados en la gura 4.4, se puede ver que ambos siguen las tendencias esperadas para
los coecientes te oricos: D
1
decrece con F4
tot
aproxim andose a D
F4
para F4
tot
grande como lo
hace D
CaF4
ef1
, mientras que D
2
, como D
CaF4
ef2
, presenta el comportamiento contrario. Por otro
lado, el valor al que se aproximan D
1
y D
CaF4
ef1
para bajo F4
tot
es del orden del valor esperado
del coeciente de difusi on libre de calcio, D
Ca
[Qin et al., 1991].
En la gura 4.5, se presentan los valores de ajuste del par ametro
2
. Hay que destacar que este
par ametro, a diferencia de los coecientes de difusi on efectivos y los pesos Go, depende de la
constante de disociaci on k
offF4
de la reacci on calcioindicador, un par ametro pobremente cono-
cido (no se encontr o una referencia para este). Los experimentos que presentamos ac a permiten
entonces estimar este valor. Se observa, en particular, que k
offF4
parece estar aproximadamente
entre 20 y 80 s
1
.
Con respecto a los pesos de los diferentes t erminos de la correlaci on, en la gura 4.6 se
gracan los obtenidos a partir del ajuste en funci on del F4
tot
, junto con los valores te oricos
determinados usando las Ecs. 4.44.6 y los par ametros de las tablas 4.2 y 4.1. Como se observa
en los gr acos de dicha gura, que el valor de Go
0
, identicado con Go
F4
, responde a lo esperado
en casi todos los casos, mientras que las contribuciones de Go
1
y Go
2
son mayores a las esperadas
para los experimentos realizados en soluciones con concentraci on de Fluo 4 por debajo de 5 M.
Para concentraciones de F4
tot
entre 1 y 5 M, los pesos esperados te oricamente, Go
CaF4
ef1
y
0 5 10 15 20
0
200
400
600
800
1000
1200
F4
tot
(M)
D

(

m
2
/
s
)

D
0
D
1
D
2
D
F4
D
ef1
CaF4
D
ef2
CaF4
Figura 4.4: Gr aco de los coecientes de difusi on D
0
, D
1
y D
2
obtenidos del ajuste del modelo
a las curvas de correlaci on experimentales de las diferentes soluciones. En lnea continua negra,
azul y verde, los valores te oricos esperados de D
F4
, D
CaF4
ef1
y D
CaF4
ef2
(Ecs. 4.8 y 4.9) calculados
usando los par ametros de las tablas 4.2 y 4.1. Valores de F4
tot
usados en la confecci on de las
soluciones, tabla 4.1.
0 5 10 15 20
0
500
1000
1500
2000
F4
tot
(M)

(
s
1
)

F4
( k
offF4
= 20 s
1
)
F4
( k
offF4
= 80 s
1
)
Figura 4.5: Gr aco del valor de
2
obtenido del ajuste del modelo a las curvas de correlaci on
experimentales de las diferentes soluciones. En lnea continua los valores te oricos esperados de
F4
(Ec. 4.2) calculados con k
offF4
= 80s
1
(verde) y considerando k
offF4
= 20s
1
(rojo), el
resto de los par ametros necesarios para estimar
F4
obtenidos de las tablas 4.2 y 4.1. Valores de
F4
tot
usados en la confecci on de las soluciones, tabla 4.1.
0 5 10 15 20
0
5
10
15
20
x 10
3
F4
tot
(M)
G
o

(

n
M
3
)

Go
0
Go
1
Go
2
Go
F4
Go
ef1
CaF4
Go
ef2
CaF4
Figura 4.6: Valores de Go
0
, Go
1
y Go
2
obtenidos del ajuste del modelo a las curvas de corre-
laci on experimentales de las diferentes soluciones. En lnea continua negra, azul y verde, los
valores te oricos esperados de Go
F4
, Go
CaF4
1
y Go
CaF4
2
(Ecs. 4.44.6)calculados usando los
par ametros de las tablas 4.2 y 4.1. Valores de F4
tot
usados en la confecci on de las soluciones,
tabla 4.1. Valores de F4
tot
Go
CaF4
ef2
, resultan mucho menores que Go
F4
, por lo que es de esperar que no se los pueda
determinar correctamente a partir de los experimentos. En la regi on donde Go
CaF4
ef1
, Go
CaF4
ef2
y
Go
F4
son m as comparables los valores obtenidos, Go
1
y Go
2
, en cambio, resultan m as cercanos
a los esperados, Go
CaF4
ef1
y Go
CaF4
ef2
.
Dado que Go
F4
es inversamente proporcional a la concentraci on de F4
tot
, si se graca Go
0
en funci on de F4
1
tot
, la pendiente debera ser igual a la inversa del valor de V
ef
(Ec. 4.4). En
el gr aco de la gura 4.7(a) se presenta dicho ajuste. El valor de V
ef
estimado a partir de la
pendiente es igual a (0.28 0.02) m
3
, consistente con el obtenido a partir de la calibraci on
con Fluorescena V
ef
= (0.35 0.06) m
3
. Adem as, la suma de todos los pesos, Go
tot
, es
inversamente proporcional a la concentraci on de CaF4
eq
, Ec. 4.10. En la gura 4.7(b) se presenta
la suma de los Go obtenidos del ajuste de los datos experimentales en funci on del valor de
CaF4
eq
calculado te oricamente a partir de los datos de las tablas 4.1 y 4.2, junto con el ajuste
lineal de los mismos. En este caso, la pendiente tambi en debera ser la inversa de V
ef
. Estimado
de esta forma, se obtiene (0.083 0.004) m
3
que no se ajusta al valor esperado, probablemente
debido a las diferencias observadas en los valores de Go
1
y Go
2
. De todos modos, se observa que
hay una buena correlaci on lineal de los datos.
0 0.5 1 1.5 2 2.5
x 10
3
0
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
F4
1
tot
(nM
1
)
G
o
F
4

(
3

n
M
1
)
(a)
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
x 10
3
0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025
0.03
0.035
CaF4
eq
1
(nM
1
)
G
o
t
o
t

(
3

n
M
1
)
(b)
Figura 4.7: (a) Gr aco de Go
0
(identicado con Go
F4
) en funci on de la inversa de F4
tot
, en lnea
continua el ajuste lineal. Valores de F4
tot
(b) Gr aco de la suma de todos los Go provenientes de ajuste (Go
tot
) en funci on de la inversa de
CaF4, en lnea continua el ajuste lineal. CaF4
eq
se calcul o te oricamente a partir de los datos de
las tablas 4.1 y 4.2.
4.4.2. Estimaci on de par ametros de reacci on y concentraciones.
A partir de los datos del ajuste del modelo es posible inferir todos los par ametros de la
reacci on de Ca
2+
con su indicador, Fluo 4, adem as de sus coecientes de difusi on libre. Para
cada soluci on empleada se estiman estos par ametros. Los coecientes de difusi on libres D
Ca
,
D
F4
, las constantes de reacci on K
dF4
, k
offF4
y la concentraci on total de calcio Ca
tot
son iguales
para todas las soluciones estudiadas, por lo tanto para estimar su valor se realiza el promedio
pesado de los valores obtenidos con cada soluci on. Los resultados de cada soluci on se presentan
en el gr aco de la gura 4.8, donde tambi en se presenta el promedio pesado de los datos. Los
valores estimados de la reacci on y difusi on se presentan en la tabla 4.3.
En cuanto a los coecientes de difusi on del calcio y el indicador, est an dentro de lo razonable.
En la subsecci on anterior se coment o acerca del valor de D
F4
y el valor de D
Ca
en soluci on
acuosa es consistente con estimaciones previas de la literatura Qin et al. [1991]. Con respecto a
la constante de disociaci on K
dF4
, si bien presenta un error apreciable, su valor es consistente con
el informado por el fabricante. Cabe aclarar que el fabricante determina esta constante en ciertas
condiciones (composici on i onica, pH, temperatura), no necesariamente iguales a las empleadas
en este trabajo, el modelo propuesto permite inferir el medio el valor de K
d
in situ. Se estim o el
valor de k
offF4
en (90 20) 1/s, no se encontr o en la literatura una estimaci on del mismo.
Conocer este par ametro es sumamente importante a la hora de modelar la cin etica de los procesos
de reacci ondifusi on. Si bien las concentraciones en el equilibrio no dependen de k
off
sino del
cociente K
d
= k
off
/k
on
, la evoluci on de la concentraci on de las especies involucradas dependen
de los valores de k
off
y K
d
.
La concentraci on de calcio total estimada a partir de los experimentos resulta menor a la
Tabla 4.3: Parametros de reacci ondifusi on obtenidos empleando el modelo propuesto para el
calcio y su indicador.
Par ametro Valor del ajuste Estimaciones previas
D
F4
(47 4) m
2
/s 85 m
2
D
Ca
(790 110) m
2
/s 760 m
2
Ca
tot
(2100 380) nM 4285 nM
K
dF4
(1590 840) nM 772 nM Invitrogen-Molecular Probes
k
offF4
(90 20) 1/s
4.5 Experimentos de FCS en soluciones con calcio, Fluo 4 y EGTA. 83
esperada en casi todas las tandas de experimentos salvo en las dos con mayor concentraci on
de Fluo 4. Esto es consecuencia de la mayor divergencia encontrada entre los valores de los
pesos determinados experimentalmente y los esperados para las tandas con menor concentraci on
total de Fluo 4. Esta ultima concentraci on puede ser determinada tambi en a partir de los datos
experimentales usando exclusivamente informaci on sobre el peso, Go
F4
, que presenta menos
error. En la gura 4.8(f) se muestra el gr aco de la concentraci on F4
tot
determinada del ajuste
del modelo en funci on de la concentraci on F4
tot
esperada, donde se puede apreciar que esta
concentraci on puede ser determinada correctamente en todos los experimentos. Al trabajar en
soluciones acuosas, se conoce la concentraci on de todos los reactivos. Aqu se muestra que estas
concentraciones, en particular, la del indicador, pueden ser obtenidas a partir de los experimentos.
Esto es de especial importancia en caso de querer aplicar la t ecnica ac a analizada en c elulas
intactas, ya que es difcil estimar la cantidad de indicador que se introduce en ellas. El abordaje
propuesto en este trabajo muestra c omo es posible inferir concentraciones de inter es in situ.
4.5. Experimentos de FCS en soluciones con calcio, Fluo 4 y
EGTA.
Se realizaron experimentos empleando soluciones acuosas conteniendo adem as del calcio
y su indicador, el quelante EGTA que tambi en liga y desliga iones de calcio. En este caso se
utiliz o el indicador Fluo 4-dextran low afnity, que es el an alogo de baja anidad del Fluo 4-
dextran utilizado en los experimentos de la Secci on anterior. En la tabla 4.4 se presentan las
concentraciones de los diferentes reactivos empleados en esta nueva serie de experimentos. En
este caso, vara la concentraci on de calcio total, dej andose constante la concentraci on de Fluo 4-
dextran low afnity y EGTA.
Usando los valores de coecientes de difusi on y constantes de reacci on de los diferentes
reactivos presentados en la tabla 4.5 y las concentraciones de la tabla 4.4, se calcularon los
valores te oricos de los coecientes de difusi on efectivos (D
ef1
, D
ef2
y D
ef3
) y de
ef2
y
ef3
empleando las expresiones analticas (Ec. 4.17 y Ap endice), con el n de compararlas con los
valores obtenidos experimentalmente.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
500
1000
1500
2000
Solucin
D
C
a

(
m
2
/
s
)
(a) D
Ca
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
20
40
60
80
100
Solucin
D
F
4

(
m
2
/
s
)
(b) D
F4
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
Solucin
K
d
F
4

(
n
M
)
(c) K
dF4
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
50
100
150
200
250
300
Solucin
k
o
f
f
F
4

(
1
/
s
)
(d) k
offF4
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
1
2
3
4
5
6
7
Solucin
C
a
t
o
t

(
M
)

(e) Ca
tot
0 5 10 15 20
0
10
20
30
40
F4
tot
teorico (M)
F
4
t
o
t

a
j
u
s
t
e

(
M
)
(f) F4
tot
Figura 4.8: (a) - (e) Gr acos de los par ametros de reacci on - difusi on obtenidos de los datos del
modelo para cada soluci on estudiada. En lnea punteada el promedio pesado de las diferentes
estimaciones y en lnea roja continua el valor esperado. (f) Gr aco de la concentraci on F4
tot
de-
terminada del ajuste del modelo en funci on de la concentraci on F4
tot
empleada en la confecci on
de las soluciones, tabla 4.1. En lnea continua la recta identidad.
Tabla 4.4: Concentraciones de los distintos reactivos usados en experimentos de FCS en soluci on
Soluci on Ca
tot
F4
tot
EGTA
tot
A01 9.37 mM 676 nM 9.66 mM
A02 9.42 mM 676 nM 9.66 mM
A03 9.47 mM 676 nM 9.66 mM
A04 9.52 mM 676 nM 9.66 mM
A05 9.57 mM 676 nM 9.66 mM
A06 9.61 mM 676 nM 9.66 mM
A07 9.66 mM 676 nM 9.66 mM
A08 9.69 mM 676 nM 9.66 mM
A09 9.90 mM 676 nM 9.66 mM
A10 10.63 mM 676 nM 9.66 mM
Todas las soluciones contienen:
100 mM KCl,30 mM MOPS, pH 7.2
Tabla 4.5: Par ametros de reacci on - difusi on
Coecientes de difusi on y constantes de reacci on
D
Ca
760 m
2
D
F4
85 m
2
K
dF4
k
offF4
300 s
1
Shuai et al. [2006]
D
E
300 m
2
K
dE
k
offE
0.75 s
1
Shuai et al. [2006]
4.5.1. Obtenci on de par ametros de ajuste y estimaci on de coecientes de
difusi on.
Los experimentos se realizaron de la misma manera que los experimentos en soluci on con
una sola trampa. El ajuste de las funciones de autocorrelaci on experimentales se realiz o en una
primera instancia, con un modelo de 3 componentes, una de ellas con factor exponencial. Como
no se encontraron conjuntos de par ametros de ajuste de este modelo dentro de los lmites razo-
nables, se probaron modelos de 3, 2 y 1 componente, con o sin factor exponencial, y el mejor
ajuste fue obtenido por el modelo de 2 componentes sin ning un t ermino con factor exponencial
(es decir, usando una expresi on de la forma Ec. 1.11 con m = 2). Los resultados del ajuste para
cada soluci on, se presentan en los gr acos de la gura 4.9. Se muestran tambi en en esta gura
los coecientes efectivos esperados, D
ef1
, D
ef2
y D
ef3
, calculados utilizando los datos de las
tablas 4.4 y 4.5.
Se puede observar en la gura 4.9(a) que el coeciente de difusi on de menor valor determina-
do experimentalmente, D
0
, se mantiene aproximadamente constante para las diferentes solucio-
nes. Como discutimos m as adelante, el peso correspondiente, Go
0
, tambi en permanece constante
con Ca
tot
por lo que identicamos a D
0
con el del Fluo 4-dextran low afnity, D
F4
. El valor
promedio obtenido con los ajustes, por otro lado, es D
0
= (42 6) m
2
/s, compatible con
el coeciente de difusi on, D
F4
, encontrado para las soluciones de calcio y Fluo 4-dextran high
afnity. Comparando el otro coeciente obtenido, D
1
, con los valores te oricos esperados, D
ef1
,
D
ef2
y D
ef3
, vemos que D
1
D
ef1
en los experimentos con menor concentraci on total de calcio
(Ca
tot
< 9.5 mM) y que D
2
D
ef3
para concentraciones mayores. Vemos adem as que D
1
per-
manece aproximadamente constante para las primeras tres soluciones analizadas. En base a los
estudios te oricos discutidos anteriormente, sabemos que los coecientes efectivos no varan con
las concentraciones de los reactivos cuando se aproximan a los coecientes de difusi on libre de
alguno de los compuestos que intervienen: calcio, indicador o segunda trampa, EGTA. En este
caso, suponemos que D
1
D
E
en los experimentos con baja concentraci on total de calcio don-
de D
1
es pr acticamente constante. Sabemos que no puede estar aproxim andose al coeciente de
difusi on del indicador porque, como se muestra m as adelante, el valor del peso asociado, Go
1
, no
permanece constante con Ca
tot
. Tampoco puede tratarse de D
Ca
, porque D
1
crece para valores
mayores de Ca
tot
y, teniendo en cuenta las masas de los reactivos involucrados, D
Ca
constituye
una cota m axima para todos los coecientes efectivos. El valor de D
E
estimado de esta forma
resulta (319 6) m
2
/s.
Con respecto a los Go experimentales presentados en la gura 4.9(b), se observa que Go
0
(asociado al coeciente D
0
que identicamos con D
F4
) permanece aproximadamente constante y
su valor promedio es Go
0
= (0.0035 0.0010) m
3
nM
1
. Esto ratica el hecho de que la com-
ponente asociada al coeciente D
0
corresponde al Fluo 4-dextran ya que al ser F4
tot
la misma
en todas las soluciones, el valor te orico esperado, Go
F4
, es constante e igual a
1
V
ef
F4
tot
. Usando
el valor determinado de V
ef
y el de Go
0
obtenido del ajuste se estima F4
tot
= (847 253) nM,
9.2 9.4 9.6 9.8 10 10.2 10.4 10.6 10.8
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Ca
tot
(mM)
D

(
m
2

/
s
)

D
ef1
D
ef2
D
ef3
D
0
D
1
(a)
9.2 9.4 9.6 9.8 10 10.2 10.4 10.6 10.8
0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025
Ca
tot
(mM)
G
o
t
o
t

(
n
M
3
)

Go
0
Go
1
(b)
Figura 4.9: Par ametros obtenidos del ajuste de las correlaciones experimentales por el modelo de
dos componentes, en funci on del Ca
tot
empleado en la confecci on de las soluciones, tabla 4.4.
(a) Coecientes de difusi on experimentales D
0
y D
1
, en lnea continua los valores esperados
de D
ef1
, D
ef2
y D
ef3
calculados a partir de sus expresiones analticas y los datos de las ta-
blas 4.4 y 4.5 (b) Valores de Go experimentales Go
0
y Go
1
. En lnea continua el valor esperado
de Go
F4
calculado a partir de la Ec. 4.23 usando los datos de la tabla 4.4.
consistente con la concentraci on empleada en la confecci on de las soluciones, F
tot
= 676 nM.
Para corroborar la correcta tendencia de los pesos con las concentraciones, en la gura 4.10 se
muestran los gr acos de las inversas de Go
0
y Go
tot
= Go
0
+Go
1
en funci on de la concentraci on
de CaF4
eq
calculada te oricamente usando los datos de las tablas 4.4 y 4.5. En el primer gr aco
se superpone el promedio y en el segundo el ajuste lineal de los datos. Se observa que Go
1
0
permanece aproximadamente constante para casi todas las concentraciones de CaF4 mientras
que Go
1
tot
crece con ellas de forma pr acticamente lineal. Recordando que el Go
tot
es inversamente
proporcional a la concentraci on de partculas uorescentes (en este caso CaF4
eq
) y a V
ef
, del
valor de la pendiente se obtiene el valor de V
ef
= (0.32 0.14) m
3
, consistente con el valor
450 500 550 600 650 700
0
500
1000
1500
2000
CaF4
eq
(nM)
G
o
1
F
4

(
n
M

m
3
)
(a)
400 450 500 550 600 650 700
0
50
100
150
200
CaF4
eq
(nM)
G
o
1
t
o
t

(
n
M

m
3
)
(b)
Figura 4.10: Inversa de los Go obtenidos del ajuste de las correlaciones experimentales por el mo-
delo de dos componentes en funci on de la concentraci on de calcio ligado al indicador, CaF4
eq
.
(a) Inversa de Go
F4
, en lnea continua el promedio de los valores. (b) Inversa de Go
tot
, en lnea
continua el ajuste lineal de los datos. CaF4
eq
se calcul o te oricamente a partir de los datos de las
tablas 4.4 y 4.5.
obtenido en la calibraci on (V
ef
= (0.35 0.06) m
3
).
Para interpretar el signicado del coeciente obtenido del ajuste, D
1
, hay que considerar que
tanto el buffer EGTA como el calcio total se encuentran en exceso en comparaci on al indicador
Fluo 4 en estos experimentos, por lo que valen las consideraciones que dieron lugar a las relacio-
nes (4.18)(4.19) reejadas en la gura 4.1. Esta gura fue hecha utilizando los valores de los
par ametros de los experimentos presentados en esta Secci on. Comparando las guras 4.1 y 4.9
vemos que el coeciente de difusi on, D
1
, es D
1
D
ef3
para valores de concentraci on para los
cuales se espera que D
ef3
D
CaE
ef2
. Teniendo en cuenta esto se gracaron en la gura 4.11 los
coecientes experimentales asociados a D
ef3
en funci on del cociente E
2
eq
/E
tot
calculado te ori-
camente a partir de los datos de las tablas 4.4 y 4.5. Ajustando los datos de esta gura mediante
la funci on:
f(x) = (a + bx)/(1 +cx) (4.25)
y haciendo la identicaci on a = D
E
, b = D
Ca
/K
dE
y c = 1/K
dE
se recuperan los coecientes
de difusi on y par ametros de reacci on asociados al EGTA. Obtenemos, en particular: D
E
= (304
57) m
2
/s, D
Ca
= (551 803) m
2
/s y K
dE
= (154 163) nM, que si bien presentan
errores importantes, los valores concuerdan con los esperados corroborando la interpretaci on
ac a presentada del signicado del coeciente, D
1
, obtenido a partir del ajuste de los datos expe-
rimentales.
0 500 1000 1500 2000 2500
250
300
350
400
450
500
550
600
650
E
eq
2
/E
tot
(nM)
D
e
f
3

(
m
2
/
s
)
Figura 4.11: Gr aco de datos experimentales del coeciente de difusi on D
ef3
obtenidos del ajuste
del modelo aproximado en funci on de E
2
eq
/E
tot
. En lnea continua, el ajuste de los mismos por
la funci on de la Ec. 4.25. El cociente E
2
eq
/E
tot
se calcul o te oricamente usando los datos de las
tablas 4.4 y 4.5.
Finalmente, cabe notar que el t ermino de la funci on de autocorrelaci on Ec. 4.22 asociado a
D
ef3
presenta un factor exponencial de la forma e
3
t
que no se vio reejado en el ajuste de los
datos experimentales. Esto puede ser debido a que el valor del factor sea pr acticamente uno en
los tiempos en donde la correlaci on vara m as, es decir, tiempos cercanos al tiempo caracterstico
asociado al coeciente D
ef3
,
D3
= w
2
r
/(4D
ef3
), que en este caso toma valores entre [0.015
0.044] ms. De hecho, si se calcula el valor del factor en el tiempo caracterstico asociado
al termino D
ef3
empleando los valores te oricos de
3
para cada soluci on, se comprueba que
resulta ser mayor a 0.99 en todos los casos, salvo para la ultima soluci on (A10) donde toma el
valor de 0.81. Si se analiza en un tiempo 10 veces mayor al tiempo caracterstico, el factor es
mayor a 0.9 en todos los casos salvo el ultimo punto que es 0.12. El valor de
3
para la ultima
soluci on es aproximadamente 5000 s
1
mientras que para el resto de las soluciones vara entre
[380 1250] s
1
.
4.5.2. Estimaci on de par ametros de reacci on y concentraciones.
Hasta ahora se ha mostrado c omo los coecientes de difusi on que pueden extraerse de los
ajustes de los datos experimentales con dos componentes pueden identicarse con los obtenidos
a partir del an alisis te orico y de qu e manera pueden ser usados entonces para estimar los coe-
cientes de difusi on libre, D
F4
y D
E
. Para raticar la validez de la identicaci on entre valores
ajustados y cantidades te oricas aqu propuesta, se mostr o c omo los primeros seguan la tendencia
esperada de acuerdo a esta identicaci on con las concentraciones te oricas de las diferentes espe-
cies. Se analiza ahora qu e datos (en especial, referentes al EGTA) se pueden extraer a partir de
las observaciones suponiendo que s olo se conocen las concentraciones totales de calcio y Fluo 4.
Con este objetivo se vuelve sobre el an alisis de D
1
.
Como ya se argument o, se asociaron los valores donde D
1
es decreciente con D
ef3
D
CaE
ef2
:
D
CaE
ef2
=
x
E
D
Ca
+ D
E
1 +x
E
=
Kd
E
E
tot
D
Ca
+ (Ca + Kd
E
)
2
D
E
Kd
E
E
tot
+ (Ca + Kd
E
)
2
(4.26)
donde x
E
se reescribi o en t erminos del calcio libre como x
E
= K
dE
E
tot
/(Ca + K
dE
). Para
las distintas soluciones empleadas en los experimentos, la concentraci on de EGTA permanece
constante. Por lo tanto, si se pudiera estimar el calcio libre en cada soluci on, a partir de los
diferentes valores que toma D
CaE
ef2
se podran inferir los par ametros de la trampa, K
dE
, D
E
y E
tot
, adem as del coeciente de difusi on del calcio utilizando la ec. (4.26). Para estimar la
concentraci on de calcio libre se procede del siguiente modo. A partir del valor Go
tot
se estima
4.6 Propuesta de aplicaci on del modelo a mediciones de FCS en ovocitos 91
CaF4
eq
= 1/(V
ef
Go
tot
) para cada soluci on, y del valor de Go
F4
se obtiene F4
tot
= 1/(V
ef
Go
F4
a partir de los cuales se determina F4
eq
= F4
tot
CaF4
eq
. Usando el valor de K
dF4
del indicador
dada por el fabricante, se puede inferir el calcio libre en cada soluci on, Ca
eq
de la forma:
Ca
eq
=
K
dF4
CaF4
eq
F4
eq
= K
dF4
Go
F4
(Go
tot
Go
F4
)
(4.27)
A partir de 3 valores diferentes obtenidos de D
1
(y distintos a D
E
) y estimando en cada
caso el valor de Ca
eq
mediante la Ec. 4.27, se pueden despejar los valores de E
tot
, K
dE
y D
Ca
empleando, a su vez, el valor D
E
determinado a partir de D
1
donde este no vara con Ca
tot
. Se
sigui o este procedimiento usando los valores experimentales de las soluciones A4, A7 y A8 (D
2
igual a 491 m
2
/s, 441 m
2
/s y 331 m
2
/s, respectivamente) obteniendo D
Ca
= 580 m
2
/s,
K
dE
= 135 nM y E
tot
= 2490 nM. El coeciente de difusi on de calcio se encuentra dentro de lo
esperado. La concentraci on de EGTA resulta mucho menor que la utilizada en la confecci on de
las soluciones, sin embargo se obtiene una buena estimaci on de la constante, K
dE
, que seg un el
fabricante debera ser 150 nM a la temperatura y pH empleados en los experimentos.
En resumen, se han podido determinar los coecientes de difusi on libres tanto del indicador
como de la segunda trampa, sin suponer como conocido ninguna constante de reacci on. Adem as
se pudieron estimar las concentraciones del indicador en todas sus formas: F4
eq
, CaF4
eq
y
F4
tot
. Por otro lado, usando la constante de disociaci on de la sonda de calcio indicada por el
fabricante, se pudo estimar satisfactoriamente el coeciente de difusi on del calcio y la constante
de disociaci on de la segunda trampa, el EGTA.
4.6. Propuesta de aplicaci on del modelo a mediciones de FCS
en ovocitos
El an alisis te orico y los resultados experimentales de FCS en soluciones con calcio, indicador
y un buffer adicional dan ideas de c omo obtener informaci on sobre el transporte de calcio y la
capacidad buffering en c elulas intactas mediante experimentos opticos. En particular, estamos
interesados en determinar estas propiedades en ovocitos. En todas las c elulas, en condiciones
basales, los iones de calcio est an en su mayora atrapados por buffers o trampas (el calcio basal
libre es del orden de 40 nM). No se conoce mucho acerca de estos buffers en ovocitos. Se cree
que est an en concentraciones altas y que tienen baja movilidad. Comparada con la concentraci on
de indicador de calcio que se usa en los experimentos, se puede considerar que, en el ovocito, las
concentraciones totales de buffer y calcio E
tot
y Ca
tot
, son mucho mayores que la de la sonda,
F4
tot
. Es decir, se est a en una situaci on an aloga a la de los experimentos de la ultima secci on.
Sin embargo, hay una diferencia y es que muy probablemente el cociente de difusi on libre de
los buffers end ogenos sea menor que el del indicador de calcio. Este hecho no cambia signi-
cativamente el comportamiento de los coecientes de difusi on efectivos. Es m as, si en el caso
expuesto de CaFluo 4EGTA, el EGTA tuviese coeciente nulo de difusi on, los coecientes
efectivos se comportaran de la misma forma, es decir, D
ef1
sera igual a D
CaE
ef1
; D
ef3
se apro-
ximara a D
CaE
ef2
luego de alcanzar su valor m aximo y D
ef2
sera aproximadamente igual a D
F4
.
En la gura 4.12 se pueden observar los diferentes coecientes efectivos suponiendo mantenien-
do los mismos par ametros que en el caso de las reacciones con Fluo 4 y EGTA pero considerando
D
E
= 0.
Para estimar par ametros de las trampas en el ovocito, habra que realizar experimentos de
FCS en diferentes condiciones, de forma tal que los coecientes efectivos variaran su valor. Da-
do que las trampas son desconocidas, no es posible variar su concentraci on, habra que variar
la concentraci on de indicador o de calcio. Como experimentos de FCS requieren bajas con-
centraciones de partculas uorescentes, de forma de obtener uctuaciones m as grandes en la
uorescencia, la concentraci on del indicador no se puede variar en forma signicativa, y como
9.2 9.4 9.6 9.8 10 10.2
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Ca
tot
(mM)
D

(
m
2
/
s
)

D
ef1
D
ef2
D
ef3
D
ef1
CaF4
D
ef2
CaF4
D
ef1
CaE
D
ef2
CaE
D
E
= 0
D
F4
D
Ca
Figura 4.12: Gr aco de los coecientes efectivos te oricos de la reacci on CaFluo 4EGTA, D
ef1
,
D
ef2
y D
ef3
y de las reacciones CaFluo 4, D
CaF4
ef1
, D
CaF4
ef2
y CaEGTA, D
CaE
ef1
, D
CaE
ef2
en
funci on de la concentraci on total de calcio. Con D
Ca
= 760 m
2
/s, D
F4
= 85 m
2
/s, D
E
= 0,
F4
tot
= 676 nM, E
tot
= 9.66 mM, K
dF4
= 2600 nM, K
dE
= 150 nM, k
offF4
= 300 s
1
y
k
offE
= 0.75 s
1
.
4.6 Propuesta de aplicaci on del modelo a mediciones de FCS en ovocitos 93
la trampa est a en exceso, una variaci on en la concentraci on de la sonda pr acticamente no mo-
dicara los valores de coecientes efectivos que se obtendran. Sera necesario entonces variar
la concentraci on de calcio total en el citosol. Una de las posibilidades para lograrlo es interferir
farmacol ogicamente con el funcionamiento de las bombas que retiran parte del calcio del citosol,
por ejemplo empleando tapsigargina, que es un inhibidor de la bomba del retculo endopl asmico.
Se propone entonces realizar experimentos de FCS en ovocitos de rana Xenopus laevis, va-
riando la concentraci on de calcio citos olico mediante el uso de tapsigargina. Aplicando a los
datos obtenidos el an alisis utilizado ac a en el caso de soluciones con calcio, EGTA y Fluo 4,
esperamos estimar coecientes de difusi on de calcio, indicador y buffers end ogenos in situ. Se
espera, a su vez, extraer informaci on sobre algunos par ametros de reacci on y la capacidad buf-
fering de la c elula.
5
Se nales intracelulares de calcio, modicaci on
de un microscopio comercial confocal para su
observaci on
En este captulo se describe la modicaci on introducida en el microscopio confocal multi-
espectral Olympus Fluo View 1000 para realizar experimentos en los que es necesario fotolizar
compuestos enjaulados. Esta modicaci on resulta esencial e imprescindible para el estudio de
se nales de calcio evocadas por IP
3
mediante m etodos opticos, ya que permite generar un estmulo
preciso y controlado de IP
3
, simult aneamente a la obtenci on de im agenes confocales. Se presenta
una caracterizaci on de las propiedades principales del sistema y se corrobora la efectividad del
sistema propuesto, empleando un compuesto enjaulado de calcio junto con un indicador uores-
cente de calcio.
96
Se nales intracelulares de calcio, modicaci on de un microscopio comercial confocal para su
observaci on
5.1. El microscopio confocal Olympus FV1000
El microscopio confocal espectral de la rma Olympus, modelo Fluo View 1000 (FV1000),
con el que se realizaron los experimentos presentados en este trabajo de Tesis, fue adquirido
a mediados del a no 2007 y se encuentra instalado en el laboratorio de Microscopa y Micro-
espectroscopas (LMM) del departamento de Fsica. El LMM forma parte de un proyecto in-
terdisciplinario y est a compuesto por investigadores del departamento de Fsica, del Centro de
Microscopas Avanzadas y de Biologa.
El microscopio est a formado por un m odulo confocal espectral, unido a un microscopio in-
vertido IX81. Posee dos modos para adquirir im agenes, vinculados a dos sistemas de iluminaci on
diferentes: por una parte el modo confocal, que tiene l aseres como fuente de iluminaci on por el
que se obtienen im agenes con alta resoluci on axial, y por otra parte la adquisici on de im agenes
convencionales de uorescencia ( wide eld), que utiliza la luz de una l ampara de mercurio.
Modo confocal El microscopio tiene tres l aseres que proveen en total cinco longitudes de
Figura 5.1: Esquema de la unidad confocal espectral del microscopio FV1000.
5.2 Adaptaci on del FV1000 para la fot olisis de compuestos enjaulados 97
onda: l aser multilnea de Arg on (457 nm, 488 nm, 515 nm), l aser de Helio-Ne on (543 nm) y un
l aser diodo de estado s olido (635 nm). Una unidad combinadora de l aseres permite iluminar a la
muestra simult aneamente con tres longitudes de onda. Consta de tres canales de detecci on, dos
de ellos espectrales. Los detectores son fotomultiplicadores de alta sensibilidad con eciencia
cu antica 100 % para 500 nm (Hamamatsu). El sistema de detecci on, que se encuentra dentro
de la unidad confocal, tiene dos sistemas de red de difracci on (para los dos primeros canales) con
una resoluci on de 2 nm que trabajan en todo el espectro visible 400 nm a 700 nm. El tercer canal
posee ltros barrera. Un par de espejos galvan ometros permiten generar im agenes por barrido,
con una velocidad m axima de 16 cuadros por segundo, para una imagen de 256 x 256 pxeles.
La m axima resoluci on es de 4096 x 4096 pxeles y el mnimo intervalo de detecci on es de 2 s.
En la gura 5.1 se presenta un esquema de la unidad confocal con los elementos mencionados.
Modo Fluorescencia Como fuente de iluminaci on para uorescencia, el microscopio tiene
una l ampara de mercurio externa de 100 Watts, conectada va bra optica al microscopio a trav es
del puerto de uorescencia. Se tienen diversos cubos de ltros de uorescencia para ser emplea-
dos con distintas sondas uorescentes. Como sistema de detecci on se emplea una c amara CCD
Proscan 128+.
El microscopio cuenta con diversos objetivos, el empleado en los experimentos mostrados en
este trabajo es el objetivo 60 x (UPlanSAPO, Olympus), apocrom atico de inmersi on en aceite,
apertura num erica 1.35 y distancia de trabajo 0.15 mm. Adem as, se incorpor o al microscopio una
platina motorizada (Scientic Roper) y una c amara ambientadora para mantener la temperatura
constante. En la gura 5.2 se presentan dos fotografas donde se pueden observar los diferentes
componentes del sistema.
5.2. Adaptaci on del FV1000 para la fot olisis de compuestos
enjaulados
La luz ultravioleta (UV) es proporcionada por la l ampara de mercurio externa que se utiliza
para la observaci on de uorescencia convencional. Como se observa en la gura 5.3, el espectro
de emisi on de la l ampara de mercurio es continuo y presenta un importante pico a 365/366 nm
que se aprovecha para la fot olisis. La luz de la l ampara se conecta al microscopio a trav es de
una bra optica pero, en lugar de utilizar el puerto convencional de uorescencia, en el modo de
fot olisis la luz de la l ampara de mercurio se introduce a trav es del puerto SIM. En la gura 5.4(a)
98
observaci on
(a)
(b)
Figura 5.2: Fotografas del microscopio confocal espectral de Olympus, FV1000.
Figura 5.3: Espectro de la l ampara de mercurio.
se muestra una fotografa de la vista lateral de la unidad confocal, donde se puede observar
que los diferentes sistemas de iluminaci on entran al microscopio a trav es de esta unidad. En la
fotografa se identicaron el puerto para el combinador l aser, el puerto de uorescencia, que es
el empleado para la l ampara de mercurio en su uso convencional, y el puerto SIM modicado
para la fot olisis. Tradicionalmente el puerto SIM se utiliza para incorporar una segunda unidad
de escaneo, dedicada a la estimulaci on con luz l aser, independiente de la unidad primaria.
A la salida de la bra optica del puerto SIM se coloc o un sistema de lentes que permite
enfocar la luz proveniente de la bra en el microscopio. En este caso se replic o el sistema de
lentes usado en el puerto convencional de uorescencia. Adem as se incorpor o un ltro 377/50
(Brightlines) para seleccionar las longitudes de onda cortas usadas en la fot olisis. El sistema de
lentes y el ltro UV se colocaron en un tubo negro que puede desplazarse verticalmente, ver
la fotografa de la gura 5.4(b). El desplazamiento vertical del tubo que contiene el sistema de
lentes, permite variar el plano imagen de la luz UVcon respecto al plano imagen del microscopio.
El cable que transmite la luz de la l ampara est a compuesto por varias bras opticas. Si se enfoca
la salida del cable en el plano imagen del microscopio, la iluminaci on UV no resulta homog enea,
dado que se pueden observar las im agenes circulares de cada bra individual que componen el
cable. Con el n de priorizar la homogeneidad de la iluminaci on UV en el plano confocal, se
desenfoca ligeramente la iluminaci on UV modicando la altura del posicionador vertical.
Como se mostr o, las diferentes formas de iluminaci on entran al microscopio IX81 a trav es
100
observaci on
(a) (b)
Figura 5.4: Fotografa de la unidad confocal modicada. (a) Vista lateral mostrando los tres puer-
tos de iluminaci on: el puerto de uorescencia para la luz de la l ampara de mercurio, el puerto del
combinador l aser para la obtenci on de im agenes confocales, y el puerto SIMmodicado, que per-
mite obtener im agenes confocales simult aneamente a la fot olisis de compuestos enjaulados.(b)
vista detallada del puerto SIM modicado donde se observa el posicionador vertical que permite
cambiar la localizaci on relativa de la iluminaci on UV con respecto al plano focal del microsco-
pio.
(a) Esquema de la unidad confocal vista desde arriba (b) Esquema de la unidad confocal vista desde arriba
(c) Esquema de la unidad confocal
Figura 5.5: Esquema de los caminos opticos de los diferentes sistemas de iluminaci on que se
consiguen moviendo la posici on del riel: (a) Posici on 1 tiene un espejo que re-dirige la luz de la
l ampara de mercurio para la observaci on convencional de uorescencia (b) Posici on 2 est a vaca,
de este modo la luz del combinador de l aseres puede llegar al microscopio para la adquisici on
de im agenes confocales (c) Posici on 3 tiene un espejo dicroico que reeja las longitudes de onda
cortas (<450 nm) usadas en la fot olisis, y permite la transmisi on de los l aseres para el modo
confocal.
102
observaci on
de la unidad confocal. Esta unidad cuenta con un riel motorizado que posee tres posiciones: en
la primera hay un espejo que reeja la luz de la l ampara de mercurio en el camino convencional
para uorescencia (en este caso la luz que proviene del combinador l aser no puede pasar); la
segunda se encuentra libre, de forma que permite el paso de la luz l aser para la obtenci on de
im agenes confocales (pero no pasa la luz de la l ampara de mercurio); y la tercera se utiliz o para
la fot olisis. En esta tercera posici on se coloc o un espejo dicroico que reeja luz de longitudes
de onda menores a 450 nm y transmite mayores longitudes de onda. De esta forma, se logra
iluminar simult aneamente con los l aseres disponibles y la luz UV de la fot olisis. Adem as, el
espejo dicroico permite la transmisi on de la luz proveniente de la muestra hacia el sistema de
detecci on confocal y as obtener im agenes confocales. En la gura 5.5 se muestra un esquema
de los distintos caminos para la iluminaci on.
Con el n de controlar el tiempo de exposici on a la luz UV, se coloc o un obturador ultra r apido
(Uniblitz) entre la l ampara de mercurio y la bra optica. El obturador posee su propio controlador
(VCM-D1, Uniblitz). Para controlar la duraci on del ash un generador de pulsos construido en
el departamento de Fsica se conecta al controlador del obturador, mandando se nales TTL de
5 volts de la duraci on deseada, a partir de 10 ms y de a pasos de 10 ms. El FV1000 tiene una
se nal de salida TTL que es comandada por el software del microscopio FW10-ASW (version
01.07.03) a trav es de la ventana time controller. Esta ventana permite al usuario programar la
rutina de adquisici on, por ejemplo: seleccionar los l aseres y sus intensidades; elegir la forma de
barrido; el tiempo de adquisici on, etc.; adem as de controlar el envo de la se nal de salida TTL.
Para sincronizar el ash de UVcon la adquisici on de la imagen, la se nal de salida del microscopio
se conecta al generador de pulsos y usando el time controller es posible elegir el tiempo en el
cual se enva la se nal de salida y se genera el ash UV.
La potencia de la luz UV empleada en la fot olisis se controla agregando una rueda de ltros
motorizada con 6 sitios donde se colocaron 5 ltros neutros de diferentes densidades opticas
(New Focus), ver tabla 5.1. Seg un el fabricante, los ltros aten uan todas las longitudes de onda
en el rango de [400 700] nm por igual. Un lugar se dejo vaco para obtener la mayor potencia
UV. La rueda motorizada es comandada desde el software del microscopio. En la gura 5.6 se
presenta una fotografa del sistema de iluminaci on externo de la l ampara de mercurio, mostrando
los diferentes elementos mencionados.
Figura 5.6: Fotografa del sistema de iluminaci on externo. Se obseva la l ampara de mercurio, el
obturador r apido y la rueda de ltros motorizada.
Tabla 5.1: Densidad optica y transmisi on de los ltros neutros (New Focus)
Densidad optica Transmisi on ( %)
0 100
0.3 50
0.5 32
1 10
1.5 3
2 1
104
observaci on
5.3. Caracterizaci on del sistema de fot olisis
5.3.1. Potencia UV y atenuadores
La l ampara de mercurio es de 100 W, distribuidos en un espectro continuo de emisi on con un
pico importante a 365/366 nm. Los componentes opticos del sistema de fot olisis y del microsco-
pio aten uan la potencia de la luz especialmente en el rango ultravioleta. Se midi o la potencia de
la luz empleada en la fot olisis a la salida del objetivo 60 x, despu es de haber pasado a trav es de
los ltros neutros indicados en la tabla 5.1. En la gura 5.7 se muestra el gr aco de la potencia
en funci on de la transmisi on de cada ltro neutro. Las mediciones se realizaron empleando un
medidor de potencia de la luz Advantest TQ8210 registrando a 364 nm. La m axima potencia
obtenida fue de 400 W. En la gura 5.7 se presenta el gr aco de la potencia en funci on de la
transmisi on de los ltros empleados. Recordando que la densidad optica (OD) y la transmisi on
(T) cumplen la relaci on T = 10
OD
se puede inferir, del ajuste lineal de los datos en la gura 5.7,
que los ltros pueden considerarse neutros, inclusive en el rango de [350 400] nm, hecho que
no fue informado por el fabricante (que aseguraba el buen comportamiento de los ltros en el
rango visible [400 700] nm).
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Transmisin (%)
P
o
t
e
n
c
i
a

(
W
)
Figura 5.7: Gr aco de la potencia de la luz de fot olisis en funci on de la transmisi on de los ltros
neutros.
5.4 Prueba de funcionamiento usando calcio enjaulado 105
5.3.2. Tama no del haz de iluminaci on
Una de las t ecnicas m as comunes para determinar el ancho de un haz es generar el perl de
intensidades, midiendo la intensidad de la luz transmitida a trav es de una peque na ranura que se
va deslizando a lo largo del haz [Wright et al., 1992]. La intensidad del haz es integrada sobre el
ancho de la ranura, el resultado de la medici on es equivalente a la convoluci on de la intensidad
original con el perl de la ranura. Para estimar el tama no del area iluminada por UV, en vez de
medir la luz transmitida por una rendija, se midi o la luz reejada por un delgado hilo que se
hace pasar a lo largo del haz. De esta forma se obtiene el perl de intensidades en funci on de
la posici on del hilo. Asumiendo que el haz presenta una distribuci on gaussiana, el ancho de la
cintura puede ser estimado ajustando el perl por:
E(x, y, 0) = E
0
e
(x
2
+y
2
)/
2
0
, (5.1)
donde E
0
es un vector constante en el plano transversal (x, y), z = 0 en la cintura del haz y
0
es el radio de la cintura.
Un delgado hilo ( 60m) se mont o sobre un cubreobjeto, solamente se permita el paso de
luz UV del sistema de fot olisis. Usando una platina motorizada (Scientic Roper) se movi o la
posici on del hilo de a pasos de 10 m mientras la intensidad reejada se registraba usando los
detectores del sistema confocal. En la gura 5.8 se muestra el gr aco de la intensidad reejada
en funci on de la posici on del hilo, junto con el ajuste de los datos experimentales por la Ec. 5.1.
El tama no de la imagen UV depende del di ametro de la bra optica y de la magnicaci on del
objetivo. El experimento se realiz o utilizando el objetivo de inmersi on en aceite 60 x y una
apertura del diafragma confocal de 105 m. Este objetivo produce un crculo de iluminaci on UV
de di ametro (212 7) m. Se hicieron pruebas (que no se muestran) corroborando que el tama no
del area de iluminaci on UV estimada de la forma aqu presentada, no depende del tama no de la
apertura confocal.
5.4. Prueba de funcionamiento usando calcio enjaulado
A n de comprobar la efectividad del sistema de fot olisis, se utiliz o NP-caged EGTA
(Invitrogen-Molecular Probes), que es un quelante fotol abil que presenta una alta selectividad
por el Ca
2+
. Este quelante, aumenta su constante de disociaci on K
d
por el Ca
2+
, desde 80 nM
a m as de 1 mM, al ser expuesto a luz UV [Graham and Davies, 1994; Graham et al., 1996].
106
observaci on
400 300 200 100 0 100 200 300 400
0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
Posicin (m)
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d

n
o
r
m
a
l
i
z
a
d
a

Figura 5.8: Gr aco del perl de intensidad reejada en funci on de la posici on del hilo. En lnea
continua el ajuste de los datos experimentales por la Ec. 5.1.
Este compuesto enjaulado r apidamente liberar a Ca
2+
despu es de su fot olisis. Empleando un in-
dicador de calcio junto con el NP-caged EGTA es posible vericar la ecacia del sistema de
fot olisis.
Con este n se confeccionaron soluciones que contenan NP-caged EGTA, calcio y el indi-
cador de calcio Fluo 4-dextran high afnity (Invitrogen-Molecular Probes). Empleando el mi-
croscopio confocal FV1000 modicado, se realizaron mediciones en gotas de aproximadamente
30 l de la soluci on, y se emple o el sistema de fot olisis para liberar en cierto momento el calcio
enjaulado. Para ello se registr o la uorescencia proveniente de la muestra para longitudes de on-
da dentro del rango [500 600] nm, en un punto a aproximadamente 10 m del cubreobjeto, a
una frecuencia de 100 kHz, empleando la lnea 488 nm del l aser de arg on y el objetivo 60x. No
se utiliz o ning un ltro neutro para atenuar la intensidad de la iluminaci on UV.
En la gura 5.9(a) se presentan las series temporales de la uorescencia (F) a la que se le
resta el promedio de la uorescencia antes del pulso UV (F
o
), obtenidas a partir de experimentos
realizados con distinta duraci on del pulso de UV (t
UV
), que van desde los 250 ms hasta 1 s. En
esta gura se puede observar el aumento de la uorescencia despu es del pulso UV, en respuesta
a la liberaci on de calcio debida a la fot olisis del NP-caged EGTA. Se observa que cuanto m as
larga sea la duraci on del pulso de UV, mayor ser a la cantidad de calcio puesto en libertad y
disponible a ser ligado por el indicador de calcio. Se espera que la cantidad de calcio liberado
sea linealmente proporcional no s olo a la concentraci on del compuesto enjaulado, sino tambi en a
la intensidad del pulso de UV y a su duraci on. Para corroborar esto, en la gura 5.9(b) se graca
la diferencia de uorescencia (F), calculada como la diferencia entre la m axima uorescencia
5.4 Prueba de funcionamiento usando calcio enjaulado 107
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
t (ms)
F

F
o

t
UV
= 1000ms
t
UV
= 750ms
t
UV
= 500ms
t
UV
= 250ms
(a)
100 150 200 250 300 350 400
500
1000
1500
2000
2500
3000
t
UV
(ms)
F
(b)
Figura 5.9: (a) Serie temporal de la uorescencia (F) menos la uorescencia basal (F
o
), para
distintas duraciones del pulso de UV (t
UV
). Mediciones realizadas en soluci on con concen-
traciones [NP-caged EGTA] = 1 mM, [Ca] = 0.8 mM y [Fluo 4] = 30 M. (b) Gr aco de F
(diferencia entre la uorescencia m axima y la uorescencia basal) en funci on de la duraci on del
pulso de UV (t
UV
), en lnea continua la regresi on lineal de los datos. Mediciones realizadas en
soluci on con concentraciones [NP-caged EGTA] = 1.5 mM, [Ca] = 8.5 M y [Fluo 4] = 100 M.
y la uorescencia basal antes de dar el pulso de UV, en funci on de la duraci on del pulso de
UV (en este caso desde 100 ms a 400 ms). Como se observa en esta gura, la relaci on lineal es
seguida casi exactamente.
108
observaci on
6
Observaci on de se nales de calcio en ovocitos
de Xenopus laevis
En este captulo se presenta el m etodo de obtenci on de las se nales de calcio y se mues-
tran diferentes registros de se nales de calcio en ovocitos de Xenopus laevis. En estas c elulas el
calcio es liberado desde el retculo endoplasm atico a trav es de canales receptores de IP
3
, que
necesitan ligar calcio e IP
3
para poder abrirse. Este ultimo es introducido en la c elula en forma
enjaulada junto con el indicador de calcio y liberado posteriormente con un pulso de luz ultravio-
leta [Callamaras and Parker, 1998]. Las im agenes son tomadas con el microscopio modicado
FV1000 descripto en el captulo anterior. Con el n de caracterizar la regi on del ovocito donde
se encuentran los receptores de IP
3
, se muestra la estructura del retculo endoplasm atico em-
pleando un marcador uorescente especco. Esto ultimo permite conocer la geometra desde
donde el calcio es liberado e inferir c omo la misma afecta las se nales. Se observan se nales de
calcio localizadas puffs y eventos m as globales, ondas. Se calcularon los perles temporales
de intensidad que permiten analizar y extraer m as f acilmente informaci on acerca de los eventos
observados.
110 Observaci on de se nales de calcio en ovocitos de Xenopus laevis
6.1. Obtenci on de se nales de calcio en el FV1000
6.1.1. Acondicionamiento del laboratorio para tratamiento de ovocitos
Dado que se trata de una nueva lnea experimental de investigaci on en el departamento de
Fsica, form o parte de mi trabajo doctoral acondicionar el laboratorio para el tratamiento de los
ovocitos y posibilitar el estudio de se nales de calcio. No s olo se modic o el microscopio FV1000
para adaptarlo a la fot olisis de compuestos enjaulados, sino que tambi en se seleccionaron y
adquirieron los diferentes dispositivos relacionados a la t ecnica aqu descripta.
Incubadora La temperatura corporal de las ranas es de 17
o
C, para preservar a los ovocitos
se adquiri o una incubadora que mantiene la temperatura constante, j andose la misma en 17
o
C.
Lupa estereosc opica Se compr o una lupa estereosc opica Olympus SZ51, junto con un ilu-
minador por bra optica marca Arcano, para observar a los ovocitos durante el tratamiento previo
a las mediciones. La lupa posee ocular 10 x con una distancia de trabajo de 110 mm.
Tubos capilares Las micropipetas son formadas a partir de tubos capilares de vidrio boro
silicato, con un punto de ablandamiento est andar de 780
o
C.
Estirador de micropipetas Para dar forma a las micropipetas, se compr o un Puller PC-
10, Narishigue, que utiliza un m etodo de calor y estiramiento vertical del capilar de vidrio por
fuerza de la gravedad. Dispone de dos modos de estiramiento: simple y doble (donde cambian
las condiciones del estiramiento a mitad del proceso). El sistema puede producir micropipetas
largas y nas para inyecci on a partir de 0.3 m de di ametro en la punta, facilitando la producci on
de grandes cantidades de micropipetas id enticas y de calidad uniforme.
Microinyector Para realizar la microinyecci on, se opt o por adquirir un microinyector au-
tom atico Drummond, Nanoject II, que est a especialmente dise nado para realizar de forma deli-
cada, inyecciones de vol umenes de nanolitros en ovocitos, embriones y tejidos. Posee un micro-
procesador que controla autom aticamente una pipeta de microinyecci on, permitiendo inyectar
peque nos vol umenes (nanolitros) en forma precisa. El volumen a inyectar se puede elegir entre
16 valores en un rango de 2.3 nl a 69.0 nl. Adem as tiene un sistema de control remoto y un
embolo no-rotacional que elimina vibraciones, permitiendo una microinyecci on m as precisa y
minimizando el da no ocasionado a las c elulas al microinyectar.
Micromanipulador El microinyector debe ser montado sobre un micromanipulador que per-
mita posicionar la micropipeta para la microinyecci on. El micromanipulador es manual, de tipo
6.1 Obtenci on de se nales de calcio en el FV1000 111
mec anico y mediante un juego de tornillos permite el movimiento en todas direcciones.
6.1.2. Preparaci on de los ovocitos
Aislamiento del ovocito
Los ovocitos empleados en este trabajo provienen de una especie de rana acu atica africana
llamada Xenopus laevis. Los ovocitos son ovulos inmaduros de rana sin fecundar; se encuen-
tran en sacos o l obulos que conforman el ovario de la rana. Los sacos del ovario se extirpan
quir urgicamente. Una vez extirpados, los sacos junto con los ovocitos se deben mantener inmer-
sos en una soluci on salina con antibi otico llamada Barth
1
. En la fotografa de la gura 6.1(b)
se observa parte de un saco, en donde se puede apreciar el tejido conectivo que rodea al saco y
contiene vasos sanguneos. Cada saco contiene ovocitos en diferentes estadios. La membrana del
saco se rompe para acceder a los ovocitos, y se separan los ovocitos en los estadios V y VI, que
corresponde a las ultimas dos etapas previas a la maduraci on. En esos estadios el ovocito mide
alrededor de 1 mm de di ametro y posee bien distinguidos dos hemisferios denominados hemis-
ferio vegetal (claro) y animal (oscuro), ver fotografa de la gura 6.1(d). A su vez, los ovocitos
est an envueltos en una capa de c elulas foliculares que contiene peque nos capilares sanguneos,
ver gura 6.1(c). Esta capa puede ser removida mec anicamente mediante el uso de peque nos
f orceps o qumicamente mediante un tratamiento de colagenasa
2
.
Los ovocitos son provistos generosamente por el grupo del Dr. Daniel J. Calvo, del Instituto
de Investigaciones en Ingeniera Gen etica y Biologa Molecular (INGEBI), CONICET-UBA, en
dos formas diferentes: ovocitos aislados mediante un tratamiento de colagenasa o sacos que luego
son tratados en el laboratorio de la forma descripta anteriormente.
Soluci on de microinyecci on
La soluci on con que se microinyecta al ovocito para la observaci on de se nales de calcio es
una mezcla del indicador de calcio (que puede ser por ejemplo Fluo 4 dextran) y el IP
3
enjaulado
en concentraciones tales que las concentraciones nales en el ovocito son aproximadamente
1
Composici on de la soluci on Barth: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.82 mM MgSO4, 0.33 mM
Ca(NO3)2, 0.14 mM CaCl2, 5 mM HEPES, 0.5 mg/mL gentamicina, pH 7.4.
2
La colagenasa es una enzima que digiere las c elulas foliculares que rodean al ovocito.
(a) (b)
(c) (d)
Figura 6.1: (a) Rana africana Xenopus laevis. (b) Detalle se un saco que contiene ovocitos en dife-
rente estadio. Envolviendo al saco se observa el tejido conectivo que contiene vasos sanguneos.
(c) Ovocitos aislados. (d) Ovocitos de 1-1.2 mm de di ametro en estadio VI, se distinguen los
hemisferio animal (oscuro) y vegetal (claro). Fotografas de Erwin Sigel, 1987. Institute for Bio-
chemistry and Molecular Medicine, University of Bern.
40 M y 9 M respectivamente
3
.
Si se quieren observar eventos localizados de calcio, puffs, se agrega a la soluci on de micro-
inyecci on EGTA, que inhibe el acople entre los sitios de liberaci on. Gracias a su lenta capacidad
de ligar calcio (k
on
20 M
1
s
1
) el EGTA evita que el Ca
2+
difunda en distancias del or-
den de micr ometros. Dado que la distancia entre sitios de liberaci on es de este mismo orden, el
EGTA tiene la acci on de desacoplar los sitios de liberaci on, dejando pr acticamente sin alterar
las caractersticas del puff. De esta forma, los diferentes sitios operan aut onomamente y no se
propagan ondas de Ca
2+
[Callamaras and Parker, 2000; Marchant and Parker, 2001].
Todos los indicadores de calcio y compuestos enjaulados empleados en este trabajo son de
Invitrogen-Molecular Probes. Los dem as compuestos utilizados son de Sigma.
Microinyecci on
Para la microinyecci on de los ovocitos se prepara la micropipeta estirando un capilar de
vidrio. La punta de la pipeta es de aproximadamente 15 m. Empleando una jeringa y aguja
met alica, el capilar estirado se rellena con aceite mineral y se monta en el microinyector au-
tom atico. Se carga la micropipeta con la soluci on deseada y los ovocitos aislados se alinean en
una grilla pl astica. Con el micromanipulador se introduce la punta de la micropipeta en el ecua-
dor del ovocito, se elige microinyectar en el ecuador para evitar el n ucleo del ovocito que se
encuentra en el polo animal, ver gura 6.2. Accionando el microinyector autom atico, un volu-
men de aproximadamente 40 nl de la soluci on empleada se inyecta en el citoplasma del ovocito.
Los ovocitos microinyectados se incuban a 17
o
C por al menos 30 minutos para permitir que los
compuestos introducidos alcancen una distribuci on uniforme a lo largo del citoplasma.
6.1.3. Adquisici on y procesamiento de im agenes
Adquisici on de im agenes
Para adquirir las se nales de calcio se emplea el microscopio FV1000 modicado, descripto
en el captulo anterior. El ovocito microinyectado se coloca sobre un cubreobjetos en un peque no
contenedor, inmerso en soluci on salina Ringer
4
, con el hemisferio animal hacia abajo. Se em-
plea un objetivo 60 x (UPlanSAPO, Olympus), apocrom atico de inmersi on en aceite, apertura
3
Para estimar las concentraciones nales en la c elula, se supone un volumen del ovocito de 1 l
4
Composici on de la soluci on Ringer: 120 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7.2.
(a) (b)
Figura 6.2: (a) Esquema ilustrando la microinyecci on de los ovocitos (b) Ovocitos alineados en
una grilla pl astica durante la microinyecci on con capilar de vidrio de aproximadamente 15 m.
Fotografa de Erwin Sigel, 1987. Institute for Biochemistry and Molecular Medicine, University
of Bern.
num erica 1.35. Si se trata del indicador de calcio Fluo 4-dextran o Fluo 5N, se excita la muestra
con la lnea 488 nm del l aser de Arg on y se detecta la uorescencia en el rango de [500 600] nm.
Sea cual fuere el indicador de calcio, en primer lugar se toman im agenes de barrido en el modo
confocal del lado animal del ovocito de forma de ubicar la zona de los gr anulos corticales, que
se encuentra aproximadamente a [3 10] m de la supercie de la c elula. Una vez identicada la
zona de inter es, se emplea el modo confocal de barrido de una lnea de aproximadamente 45 m,
centrada en el area de iluminaci on UV. Se elige adquirir la uorescencia en una lnea en lugar de
una imagen ya que, si bien se pierde cierta resoluci on espacial, la resoluci on temporal es signi-
cativamente mayor. El tiempo de adquisici on en cada punto es de 10 s, y el tiempo que tarda en
barrer una lnea es de aproximadamente 3.7 ms. El tama no de un pxel es de 0.175 x 0.175 m
2
.
Con respecto al ash de UV, se especica el ltro de atenuaci on deseado y se determina la dura-
ci on y el momento en el cual se da el pulso de UV. En general el pulso se da despu es de 0.5 s,
para tener registro de la uorescencia antes de la estimulaci on. La longitud total del experimento
suele ser de 10 s aproximadamente. Para permitir que los receptores de IP
3
se recuperen de una
eventual desensibilizaci on, se deja pasar alrededor de un minuto entre registros sucesivos en una
misma zona de un ovocito.
El registro de se nales de calcio se realiza en el hemisferio animal del ovocito porque este
presenta una mayor probabilidad de aparici on de eventos, los sitios de liberaci on de calcio pare-
ceran est ar m as concentrados en ese hemisferio Callamaras and Parker [1994, 1999].
Procesamiento de im agenes
Los datos se guardan en im agenes TIFF de tama no n x m, en donde n es la cantidad de
pxeles de la lnea barrida y mequivale a la cantidad de veces que se barri o la lnea. El eje vertical
corresponde al espacio y el horizontal al tiempo. Las im agenes adquiridas son analizadas en la
forma que se detalla a continuaci on. Para cada posici on j de la lnea de barrido digitalizada se
deni o el nivel de uorescencia basal F
j
0
como el promedio de los registros obtenidos en esa
posici on hasta el momento previo al pulso UV (equivaldra al promedio de la uorescencia basal
para cada posici on de la lnea barrida). Una vez calculada esta cantidad para cada posici on de la
lnea de barrido, la serie temporal de uorescencia proveniente de cada punto fue procesada de
la siguiente manera: al i- esimo punto registrado en la j- esima posici on de la lnea de barrido se
le asign o la cantidad
F
i

Fi
j
F
j
0
F
j
0
. (6.1)
La cantidad denida de esta manera es entonces, para cada punto de la lnea de barrido, una
medici on de la evoluci on de los cambios relativos de la uorescencia detectada. Cambios en esta
magnitud dan cuenta de cambios en la concentraci on de calcio citos olico.
Para apreciar con m as detalle la din amica de un evento, se realizaron perles temporales de
la intensidad F a lo largo de una posici on dada. Con el n de reducir el ruido presente en los
registros se realiz o un promedio de 7 pxeles consecutivos en la direcci on espacial, o sea a lo
largo de la direcci on de barrido.
Separaci on de canales
En el caso de trabajar simult aneamente con dos indicadores uorescentes cuyos espectros de
emisi on se superpongan, es necesario separar las contribuciones de cada uor oforo. En la gu-
ra 6.3 se muestran en el mismo gr aco los espectros de dos indicadores de calcio, el Fluo 4 y
Rhod 2, como se observa, los espectros de emisi on (lnea continua) se superponen. En esa gura,
el sombreado verde y rojo representa el rango de longitudes de onda registradas por el canal 1
y 2, respectivamente. Se puede apreciar, que el canal 1, registra unicamente la se nal proveniente
del Fluo 4, pero el canal 2 registra contribuciones de ambos uor oforos. Para obtener la se nal
limpia del Rhod 2 es necesario conocer el porcentaje de se nal del Fluo 4 que se introduce
Figura 6.3: Espectros de absorci on (lnea punteada) y emisi on (lnea continua) de los indicadores
uorescentes de calcio Fluo 4, en verde, y Rhod 2, en rojo. El sombreado verde y rojo indican
los rangos de longitudes de onda registradas por los canales 1 y 2 respectivamente.
en el canal 2. Para ello se debe realizar una calibraci on, tomando im agenes de referencia de las
muestras empleando solamente el indicador cuya se nal se introduce en ambos canales, en este
caso el Fluo 4. Estas im agenes deben ser adquiridas en las mismas condiciones que se adquieren
las im agenes con dos uor oforos. Una vez adquirida las im agenes de referencia, se realiza el
cociente de la se nal del canal 2 y el canal 1. Este cociente (R) es una magnitud aproximadamente
constante, que depende exclusivamente del uor oforo empleado y las condiciones de adquisi-
ci on. Al obtener im agenes con ambos uor oforos simult aneamente, la se nal del Fluo 4 ser a la
proveniente al canal 1 y para obtener la se nal proveniente del Rhod 2, al canal 2 se le resta el
producto del canal 1 por R [Zimmermann, 2005].
6.2. Observaci on y caracterizaci on de se nales usando
Fluo 4 Dextran
Empleando el microscopio modicado FV1000 presentado en el captulo anterior y siguiendo
los protocolos descriptos en este captulo, se realizaron diversos experimentos en ovocitos de
Xenopus laevis empleando IP
3
enjaulado y un indicador de calcio. A continuaci on se presentan
im agenes representativas de cada tipo de evento evocado. Se incluye tambi en un an alisis de los
mismos que permite concluir que se trata de eventos mediados por receptores de IP
3
y que el
sistema de fot olisis est a funcionando del modo esperado para evocar las se nales.
En los paneles de la gura 6.4 se muestran im agenes representativas de distintos tipos de
6.2 Observaci on y caracterizaci on de se nales usando Fluo 4 Dextran 117
se nales obtenidas, despu es de un pulso UV de 10 ms, en ovocitos previamente microinyectados
con una mezcla de Fluo 4-dextran (de alta anidad) e IP
3
enjaulado. Se trata de tpicas im agenes
confocales de barrido de una lnea, en donde se graca F (Eq. 6.1) usando un c odigo de colores
ilustrado en la misma gura. En este tipo de gr acos, el eje vertical corresponde a la posici on a
lo largo de la lnea barrida y el eje horizontal al tiempo de barrido de la lnea. En lnea blanca
vertical se indica el momento en el cual se dio el pulso UV. En ambos paneles presentados en la
gura 6.4 se puede apreciar un aumento en el cociente de uorescencia F luego del pulso UV,
indicando un aumento en el calcio libre, pero las escalas temporales y espaciales de los aumentos
dieren notablemente entre s.
En el caso de la gura (a), al microinyectar se agreg o EGTA para prevenir la propagaci on
de ondas de Ca
2+
y aumentar la probabilidad de observar se nales localizadas tales como puffs.
En esta gura se pueden distinguir dos sitios diferentes de liberaci on indicados con las letras A
y B. Los perles temporales de intensidad se muestran en la misma gura. Es evidente que en
este registro los dos sitios act uan en forma independiente inici andose la liberaci on de Ca
2+
en
momentos no correlacionados. Por otra parte, en el sitio B, se observa el suceso de tres puffs
consecutivos. Se puede observar claramente, especialmente en el perl temporal de la intensi-
dad, que el primer evento presenta mayor amplitud que los otros. El tiempo entre eventos es
de aproximadamente 3.5 s, consistente con las estimaciones del intervalo de tiempo entre puffs
consecutivos presentadas en Daniel Fraiman et al. [2006]; Marchant et al. [1999].
Se presenta en la gura 6.4(b), un evento m as global, en este caso no se agreg o EGTA al
microinyectar las c elulas. Se observa que todos los sitios de liberaci on fueron activados pr acti-
camente al mismo tiempo y liberan Ca
2+
durante m as tiempo. El perl de intensidad se presenta
en la misma gura, en este caso mostrando que la concentraci on de Ca
2+
decae en una escala
temporal consistente con observaciones previas [Dargan and Parker, 2003].
En la gura 6.5 se presenta una tpica onda de calcio. Como se puede apreciar, luego de que
un sitio se activa, el Ca
2+
entra al citosol, difunde e induce la apertura de receptores de IP
3
en
sitios vecinos, generando una onda. Se sabe que la velocidad de las ondas de Ca
2+
vara con
la concentraci on de IP
3
, tomando valores desde 10 m/s a baja concentraci on de IP
3
hasta
50 m/s a mayores [Marchant et al., 1999]. Con el n de estimar la velocidad de la onda a
partir del experimento de la gura 6.5, se aline o una recta con el frente de onda aparente como
se muestra en la misma gura. La velocidad promedio de la onda obtenida de las pendientes es
de (18 2) m/s, valor que se encuentra dentro del rango de valores esperados.
E
s
p
a
c
i
o

(
m
)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 0
2
4
6
8
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
0
5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
0
3
Tiempo (s)

20
40
60
A
B
A
B
(a)

E
s
p
a
c
i
o

(
m
)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 0
4
6
8
10
12
14
16
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
0
10
20
Tiempo (s)
10
20
30
40
50
60
(b)
Figura 6.4: Im agenes confocales representativas mostrando diferentes eventos de Ca
2+
despu es
de un ash UV de 10 ms de duraci on, empleando el indicador Fluo 4-dextran e IP
3
enjaulado. En
los paneles se graca F (Eq. 6.1) usando un c odigo de colores, con la distancia a lo largo del eje
vertical y el tiempo a lo largo del eje horizontal. Un aumento en el cociente de uorescencia F
(aumento en el Ca
2+
libre) se denota con colores cada vez m as c alidos como se indica en la
barra de color. La lnea blanca vertical indica el momento en el cual se dio el pulso UV. (a) arriba
Imagen tpica de eventos localizados de Ca
2+
, (puffs). Los sitios de liberaci on est an indicados
con las letras A y B. En este caso tambi en se microinyect o EGTA. abajo perles temporales de
los puffs que ocurrieron en los sitios A y B. (b) arriba Evento m as global de Ca
2+
(onda de
Ca
2+
) abajo perl temporal de la onda.
6.3 Observaci on de se nales desde el retculo y perspectivas futuras 119
Tiempo (s)
E
s
p
a
c
i
o

(
m
)
0.5 0.75 1 1.25 1.5
12
14
16
18
20
22
24
26
Figura 6.5: Imagen confocal mostrando una onda de Ca
2+
despu es de un ash UV de 10 ms. Las
lneas blancas est an alineadas con los frentes de la onda con el n de estimar la velocidad de la
onda a partir de su pendiente. Concentraciones nales en ovocito: 37 M Fluo 4-dextran, 9.2 M
IP
3
enjaulado y sin EGTA.
Los comportamientos observados en las guras 6.4 y 6.5 y las estimaciones cuantitativas que
se pueden derivar de ellas est an en total acuerdo con observaciones previas de se nales de Ca
2+
mediadas por IP
3
. Estos resultados indican que el sistema efectivamente fotoliza el IP
3
enjau-
lado previamente microinyectado en las c elulas y permite adquirir simult aneamente im agenes
confocales de las se nales evocadas. No hay duda de que, tanto la modicaci on introducida en el
microscopio FV1000 como el tratamiento de los ovocitos, han sido implementados exitosamente.
6.3. Observaci on de se nales desde el retculo y perspectivas
futuras
Las observaciones presentadas en la secci on anterior, si bien han signicado un gran desafo
para nuestro proyecto, no aportan nueva informaci on sino que conrman resultados previos. La
modicaci on del microscopio confocal FV1000 presentada en el captulo anterior, sin embargo,
abre enormes perspectivas para la realizaci on de estudios originales sobre se nales de calcio en
ovocitos. Ac a describimos algunos de los caminos que planeamos seguir mostrando resultados
preliminares.
Una de las propiedades del microscopio que puede ser explotada para avanzar hacia una
comprensi on m as acabada de las se nales intracelulares de calcio es su multi-espectralidad. Esto
abre la posibilidad de observar el comportamiento espacio-temporal del calcio en distintas re-
giones simult aneamente utilizando marcadores que emiten en distintas longitudes de onda. Dado
que el rol del calcio contenido en el lumen del retculo endoplasm atico (calcio luminal) sobre
las se nales mediadas por receptores de IP
3
no ha sido pr acticamente estudiado y teniendo en
cuenta que cumple un papel fundamental en las se nales en m usculos (mediadas por receptores
de rianodina) decidimos hacer experimentos para observar eventos en el lumen y en el citosol
simult aneamente. Para tal n decidimos utilizar los indicadores Fluo 5N y Rhod 2.
El Fluo 5N es un an alogo al Fluo 4 con una anidad por el Ca
2+
mucho m as baja. La constan-
te de disociaci on (K
d
) del Fluo 5N es 90 M mientras que la del Fluo 4-dextran es 800 nM.
Esto quiere decir que a una misma concentraci on de calcio, en equilibro, el Fluo 5N ligara
mucho menos calcio que el Fluo 4-dextran. Este tipo de indicador de baja anidad se emplea
para registrar niveles de calcio del orden del mM, como es la concentraci on de calcio dentro del
retculo endoplasm atico (ER). El Rhod 2, por otro lado, es un indicador de calcio con constante,
K
d
, similar a la del Fluo 4-dextran pero con espectro de emisi on claramente separable de la de
los indicadores tipo Fluo, como se mostr o en la gura 6.3. La utilizaci on simult anea de ambos
indicadores permitira, por lo tanto, registrar se nales en el lumen y en el citosol simult aneamente.
Para poder registrar el calcio luminal, se emple o una versi on de Fluo 5N AM que es capaz
de atravesar membranas. El Fluo 5N se microinyecta en el citoplasma del ovocito y se deja
incubar entre 3 a 6 horas. No existe un protocolo para el uso de este indicador en ovocitos de
Xenopus laevis, no se han encontrado trabajos que lo empleen en este tipo de c elula. De hecho,
que nosotros sepamos, no hay registros del calcio luminal en ovocitos de Xenopus laevis. Una
vez microinyectado el Fluo 5N difunde y es capaz de atravesar la membrana del ER. Es posible
que parte del Fluo 5N quede en el citoplasma, pero debido a su bajsima anidad por el calcio, la
se nal proveniente del citoplasma debera ser despreciable frente a la se nal proveniente del lumen.
Por lo tanto consideramos que la se nal del Fluo 5N debera brindar informaci on sobre el calcio
en el interior del retculo.
Como paso previo a la observaci on de se nales en ovocitos desde el retculo estudiamos si
con el protocolo dise nado el Fluo 5N reporta informaci on sobre el calcio luminal. Para tal n se
utiliz o un marcador uorescente de retculo llamado DiI y se adquirieron im agenes confocales de
barrido xy de algunas regiones del ovocito utilizando DiI y Fluo 5N. Las se nales provenientes
de ambos uor oforos pudieron ser separadas dado que el espectro de emisi on del DiI es similar
al del Rhod 2 y el del Fluo 5N al del Fluo 4-dextran, por lo que estamos en la situaci on de la
gura 6.3. El marcador DiI emite muy poca luz al estar disuelto en agua pero es muy uorescente
al incorporarse a las membranas. Al ser microinyectado en el ovocito, se incorpora a la membrana
del retculo y difunde por la misma. Para permitir que se distribuya por toda la c elula, una vez
microinyectados con DiI, los ovocitos son incubados por aproximadamente 12 hs. Cabe recordar
que el DiI marca la membrana del retculo y no su interior, siendo la informaci on que brinda el
DiI complementaria a la del Fluo 5N.
El retculo endoplasm atico es un sistema formado por una red de cisternas y t ubulos. Est a or-
ganizado en forma de una red laberntica de t ubulos ramicados que se extiende por todo el
citoplasma. La membrana del ER constituye pr acticamente la mitad del total de la membrana de
la c elula. Se cree que los t ubulos est an interconectados, de modo que la membrana del ER forma
una l amina continua que dene un unico espacio interno (espacio luminal) [Alberts et al., 2007].
En el citoplasma del ovocito, pr oximo a la membrana plasm atica, se localizan los gr anulos cor-
ticales (vesculas usadas en la fertilizacion) que poseen un tama no de 1 2 m. Estos gr anulos
se encuentran distribuidos en una capa que se encuentra aproximadamente a [3 10] m de la
supercie de la c elula. Adentr andose ( 10 m) aparecen unas plaquetas de aproximadamente
5 m. En el hemisferio animal, se pueden encontrar gr anulos de pigmento de aproximadamente
0.5 m, que le coneren el color oscuro [Terasaki et al., 2001; Callamaras and Parker, 1999; Du-
mont, 1972]. Esta estructura es identicable en las im agenes confocales de barrido xy obtenidas
en la capa de los gr anulos corticales de ovocitos previamente microinyectados con DiI y Fluo 5N
como se muestra en la gura 6.6.
Los espectros de emisi on del DiI y el Fluo 5N se solapan. Para separar las contribuciones
de cada uor oforo y obtener las im agenes de la gura 6.6 se us o el m etodo descripto en la Sub-
secci on 6.1.3. Como ya mencionamos, el espectro de emisi on del DiI es similar al del Rhod 2 y
el del Fluo 5N al del Fluo 4-dextran, as que se emple o la misma conguraci on de adquisici on
detallada en dicha subsecci on. En la se nal correspondiente al DiI se observa una estructura con
dimensiones comparables a las reportadas para el ER en Xenopus laevis[Charbonneau and Grey,
1984; Terasaki et al., 2001] donde los espacios oscuros podran corresponder a gr anulos cortica-
les o a otras organelas presentes en el ovocito. La se nal correspondiente al Fluo 5N, es bastante
m as d ebil. Al observar la superposici on de ambas se nales se puede apreciar, en la gura 6.6, que
algunas zonas oscuras de la se nal de DiI se corresponden con zonas que presentan un aumento
en la se nal del Fluo 5N. Es de esperar que estas regiones correspondan al interior del ER. Esto
se hace m as evidente en la gura 6.7(b) donde se muestran los perles normalizados de la uo-
rescencia correspondiente al Fluo 5N y DiI, a lo largo de la recta indicada en la gura 6.7(a).
Figura 6.6: Im agenes confocales en xy obtenidas en dos canales simult aneamente, en la zona de
los gr anulos corticales (z = 0) del hemisferio animal. Ovocito microinyectado con el marcador
de retculo DiI y el indicador de calcio permeable a membrana Fluo 5N. Se muestran im agenes
de las contribuciones de cada indicador y la superposici on de ambas.
Tanto en la regi on I como en la II indicadas en las guras, la se nal del DiI presenta una zona
oscura de di ametro aproximadamente 2 m. Si se observa el perl de la se nal del Fluo 5N, en la
regi on I es nulo, consistente con la presencia de un gr anulo cortical, pero en el caso de la regi on
II, se observa un claro aumento de la se nal, indicando que se trata del interior del ER. Esto es
una indicaci on de que el Fluo 5N est a ingresando al lumen. Para corroborarlo y para determinar
tambi en que la se nal del Fluo 5N no reporta informaci on sobre el calcio citos olico repetimos
los experimentos utilizando DiI y Fluo 4-dextran, un indicador de calcio que permanece en el
citosol. Las im agenes correspondientes se muestran en la gura 6.8.
No se ve en la gura 6.8 ning un comportamiento como el descripto a partir de las gu-
ras 6.7(b) y 6.7(a). En la imagen que corresponde a la se nal de DiI se observa la ya presentada
estructura de red que conforma la membrana del retculo. La se nal del Fluo 4-dextran es m as
d ebil, si bien se trata de un indicador de alta anidad por el calcio, hay que considerar que el ni-
vel de calcio libre basal en el citoplasma es muy bajo ( 40 nM). En la superposici on de ambos
canales se distinguen claramente regiones de tama no entre 1 y 2 m consistentes con el tama no
caracterstico de los gr anulos corticales. Por otro lado, las regiones en donde la se nal del Fluo 4-
dextran es mucho m as intensa que la del DiI, tienen una estructura diferente a aqu ellas donde
la del Fluo 5N lo era. Todas estas observaciones sirven para concluir que el protocolo dise nado
para utilizar el Fluo 5N ha sido exitoso y que este uor oforo reporta exclusivamente informaci on
sobre el calcio luminal. Estos estudios previos permiten concluir que estamos en condiciones de
(a)
0
0.5
1

Fluo 5N
0 5 10 15 20
0
0.5
1
x (m)

DiI
I
I
II
II
(b)
Figura 6.7: (a) Detalle de la imagen confocal xy presentada en la gura 6.6, se indica mediante
una linea blanca la recta donde se realiza el perl de la uorescencia (b) Perles normalizados
de la uorescencia correspondiente al Fluo 5N y DiI, a lo largo de la recta indicada en la imagen
(a).
Figura 6.8: Im agenes confocales en xy obtenidas en dos canales simult aneamente, en la zona de
los gr anulos corticales (z = 0) del hemisferio animal. Ovocito microinyectado con el marcador
de retculo DiI y el indicador de calcio citos olico Fluo 4-dextran. Se muestran im agenes de la
contribuci on de cada indicador por separado y la superposici on de ambas.
observar se nales de calcio simult aneamente en el ER y en el citosol y ayudar as a dilucidar el
papel del calcio luminal sobre las se nales mediadas por receptores de IP
3
.
7
Conclusiones
Las se nales de calcio son utilizadas por una enorme variedad de c elulas para regular proce-
sos tan distintos como la fertilizaci on, la contracci on muscular, la comunicaci on neuronal y la
muerte celular, entre muchos otros. La versatilidad de las se nales se basa en la gran diversidad
de comportamientos que la concentraci on de este i on puede desplegar dentro de las c elulas que
involucran escalas temporales y espaciales muy diversas, imposibles de abarcar por una unica
t ecnica experimental. El modelado se hace entonces indispensable para lograr una descripci on
abarcadora de las se nales. Los modelos realistas, por otro lado, requieren contar con estimacio-
nes conables, idealmente obtenidas in situ, de algunos de los par ametros que caracterizan a los
procesos involucrados. En esta Tesis se ha avanzado hacia la cuanticaci on de estos procesos en
c elulas vivas, realizando experimentos opticos y desarrollando el marco te orico para extraer la
informaci on necesaria a partir de los mismos.
La primera parte del trabajo estuvo dirigida a la determinaci on en c elulas intactas de la ta-
sa de transporte del calcio y de las sondas uorescentes usadas para visualizarlo. Teniendo en
cuenta que el calcio no difunde libremente dentro del citosol sino que reacciona con numerosas
126 Conclusiones
sustancias (buffers) se estudi o, en primer lugar, la informaci on que es posible extraer usando
t ecnicas opticas, tales como FRAP o FCS, cuando se usan partculas marcadas uorescentemen-
te que interact uan con trampas que reaccionan con ellas. En FCS, se miden las uctuaciones
de la uorescencia en un peque no volumen y se calcula su autocorrelaci on. En el caso en que
todas las partculas son uorescentes y difunden sin interactuar, la funci on de autocorrelaci on
tiene una expresi on analtica en t erminos del coeciente de difusi on libre y de la concentraci on
de partculas, que puede ser usada para ajustar las mediciones experimentales y extraer informa-
ci on. Cuando las partculas uorescentes difunden y reaccionan, la funci on de autocorrelaci on no
puede ser integrada analticamente. En el presente trabajo se estudi o el comportamiento de esta
funci on de correlaci on obteniendo aproximaciones analticas que permiten usarla para ajustar
datos experimentales en distintas situaciones.
En una primera instancia, se analiz o el caso en que partculas uorescentes difunden en un
medio homog eneo con trampas, que presentan cierta probabilidad por unidad de tiempo de atra-
par o liberar a una partcula de acuerdo a un esquema de reacci on bi-molecular. De acuerdo a
los estudios de Pando et al. [2006], hay dos coecientes de difusi on efectivos que caracterizan
el transporte en este caso: el llamado colectivo, D
u
y el de un sola partcula, D
t
. En este tra-
bajo de Tesis se present o una aproximaci on analtica a longitudes de onda larga de la funci on
de autocorrelaci on que caracteriza a los experimentos de FCS, que puede ser usada para ajustar
los datos experimentales y extraer informaci on a partir de ellos. La funci on de autocorrelaci on
aproximada es la suma de dos contribuciones (dos componentes) cada una caracterizada por un
tiempo distinto: uno asociado al coeciente de difusi on de la trampa, D
S
, y el otro al coeciente
de difusi on efectivo, D
u
, que depende no s olo de los coecientes de difusi on de las especies
involucradas, sino tambi en de par ametros de la reacci on. Esto permite concluir que a partir del
ajuste de los experimentos es posible obtener D
u
. Se estudi o el lmite de aplicaci on de la aproxi-
maci on a longitudes de onda largas y se determin o que es v alido para reacciones que ocurren en
escalas temporales m as r apidas que la difusi on libre de la partcula,
reac

f
. Se haba mos-
trado en Sprague et al. [2004] que bajo la misma aproximaci on,
reac

f
, los experimentos
de FRAP dan los valores del coeciente efectivo de difusi on de una sola partcula, D
t
. A partir
del trabajo presentado en esta Tesis se puede concluir que FCS y FRAP dan informaci on sobre
diferentes coecientes efectivos de difusi on por lo que, combinando la informaci on proveniente
de ambas t ecnicas, es posible inferir par ametros de reacci on y coecientes de difusi on libre de las
partculas y de las trampas. Con el n de corroborar la aproximaci on a la funci on de autocorrela-
ci on propuesta y comprobar qu e tan bien se pueden inferir los par ametros de ajuste, se emple o el
127
modelo integral, sin aproximaciones, para confeccionar curvas de correlaci on te oricas que luego
fueron ajustadas por el modelo aproximado propuesto. Se analizaron alrededor de 330 casos con
diferentes par ametros de reacci ondifusi on, que se encuentran dentro del rango de validez del
modelo. Del an alisis de los diferentes casos se encontr o que todos los par ametros recuperados
del ajuste de modelo completo con el modelo aproximado, presentan errores relativos promedio
menores al 30 % con respecto al valor te orico, inclusive cuando el tiempo de reacci on
reac
es
similar al tiempo de difusi on,
f
. En todos los casos analizados, D
u
y el peso de la componente
correspondiente, Go
ef
, fueron determinados con errores relativos menores a 15 % y 7 % respec-
tivamente, mientras que D
S
y su peso, Go
S
, fueron estimados con errores relativos promedio
de 27 % y 22 %. Se investig o tambi en qu e experimentos pueden ser combinados para obtener
informaci on acerca de los par ametros de la reacci on y de los coecientes de difusi on libre (en
lugar de los efectivos) de las diferentes especies involucradas. En particular, se mostr o que si el
n umero de partculas uorescentes puede ser cambiado, al realizar experimentos de FCS en por
lo menos dos concentraciones diferentes, entonces se puede estimar el coeciente de difusi on
de partculas libres y par ametros de la reacci on, tales como la concentraci on total de trampas, la
constante de anidad y la fracci on de partculas ligadas y libres.
Se estudi o a continuaci on la aplicaci on de FCS a un sistema de partculas marcadas y no mar-
cadas que presentan la misma funcionalidad, y reaccionan con trampas de la misma forma. Este
modelo resulta muy util dado que en las t ecnicas de marcaci on es com un que algunas mol ecu-
las no sean marcadas exitosamente. En este caso la funci on de autocorrelaci on aproximada bajo
la condici on
reac

f
presenta una componente adicional: adem as de las asociadas al coe-
ciente de difusi on de la trampa, D
S
, y al coeciente efectivo D
u
, aparece una nueva asociada
al coeciente de difusi on efectivo obtenido en FRAP, D
t
. Este c alculo fue utilizado para anali-
zar resultados publicados recientemente sobre experimentos de FCS realizados en embriones de
Drosophila melanogaster empleando la protena fusionada Bcd egfp. En este sistema es po-
sible suponer que no s olo est a presente la protena marcada uorescentemente, sino que tambi en
hay protena sin marcar, Bcd. Experimentos de FCS y FRAP realizados por diversos grupos para
estudiar la tasa de transporte de Bcd dan coecientes de difusi on de esta sustancia muy diferen-
tes entre s, suscitando controversias alrededor de qu e grupo y/o t ecnica es la correcta. Conocer
la tasa a la que difunde Bcd es fundamental para determinar la forma en que se genera el gra-
diente de esta sustancia en los embriones y que constituye la base para el establecimiento del eje
dorsoventral en este organismo. Utilizando la expresi on analtica aproximada de la funci on de
autocorrelaci on obtenida para el caso con partculas marcadas y no marcadas, se determin o que
128 Conclusiones
la diferencia de estimaciones del coeciente de difusi on del Bcd medidas en FCS, Abu-Arish
et al. [2010], y FRAP, Gregor et al. [2007], es totalmente compatible con el hecho de que ambas
t ecnicas dan informaci on sobre distintos tipos de coecientes de difusi on efectivos. M as a un, em-
pleando el modelo propuesto en esta tesis, no solamente se lograron explicar satisfactoriamente
las diferencias, sino que tambi en se estimaron par ametros referidos a la reacci on de Bcd con las
posibles trampas.
Subsiguientemente, dentro del marco del uso de m etodos opticos para estimar tasas de trans-
porte, se estudi o el caso de la reacci on entre el calcio y algunas de sus sondas, en donde no s olo
coexisten procesos de difusi on y reacci on, sino que hay tambi en uctuaciones debidas al cambio
en la intensidad de la uorescencia si el uor oforo est a o no ligado a calcio. A diferencia del caso
de partculas siempre uorescentes estudiado en el captulo 2, en este caso la funci on de auto-
correlaci on en la aproximaci on de longitudes de onda larga es la suma de tres componentes. La
primera es la asociada a la difusi on libre del indicador de calcio, la segunda al coeciente efectivo
D
ef1
(equivalente al D
u
del caso de partculas siempre uorescentes) y la tercera asociada a un
comportamiento no exclusivamente difusivo, con un factor exponencial decreciente, dependiente
de un nuevo coeciente efectivo, D
ef2
. Se analiz o tambi en el caso en que adem as del indicador
hay otra sustancia (buffer) que reacciona con el calcio. Se estudi o el comportamiento de los
coecientes efectivos de difusi on en este caso y se mostr o c omo variando las concentraciones de
las sustancias involucradas es posible inferir coecientes libres y tasas de reacci on. Se presen-
taron luego experimentos de FCS realizados en soluciones conteniendo distintas cantidades de
calcio, del indicador Fluo 4-dextran y de un quelante (o buffer) de calcio llamado EGTA. El
an alisis de estos datos corrobor o la existencia de los varios coecientes efectivos y su variaci on
con algunas de las concentraciones tanto en los casos con uor oforo y calcio exclusivamente (ca-
so con una trampa) y en aqu ellos que adem as tenan EGTA (caso con dos trampas). A partir
de los experimentos en soluci on y del marco te orico de an alisis de los mismos hemos elaborado
una propuesta experimental para estimar coecientes de difusi on de calcio, sondas y buffers
end ogenos en ovocitos obteniendo, a su vez, informaci on sobre algunos par ametros de reacci on.
La segunda parte del trabajo estuvo dirigida a dar los pasos necesarios para la realizaci on de
experimentos propios de observaci on de se nales de calcio intracelular mediadas por receptores
de IP
3
. Para tal n, se dise n o una modicaci on del microscopio confocal comercial FV1000 de
Olympus para permitir la fot olisis de compuestos enjaulados, la que fue implementada exito-
samente. La modicaci on es simple y econ omica y permite obtener simult aneamente im agenes
confocales y fotolizar compuestos enjaulados. Se determin o que la iluminaci on UV obtenida en
129
la muestra es relativamente uniforme en un crculo de di ametro 200 m para longitudes de
onda en el rango de [350400] nm. La m axima potencia dentro de ese rango es de 0.4 mW. El
sistema permite controlar la intensidad de la luz por medio de ltros neutros que producen la
atenuaci on esperada en el rango de longitudes de onda usadas. El tiempo de exposici on tambi en
puede ser controlado de a pasos de 10 ms y sincronizado con el proceso de adquisici on confocal.
Se demostr o la capacidad del sistema en experimentos realizados en soluciones acuosas en donde
el Ca
2+
enjaulado por el NP-EGTA fue fotoliberado al ser expuesto a pulsos UV de diferente
duraci on y, empleando un indicador de calcio, se mostr o que la cantidad de Ca
2+
liberado es
proporcional al tiempo de duraci on del pulso UV.
La modicaci on introducida al microscopio resulta esencial e imprescindible para el estudio
de se nales de calcio evocadas por IP
3
mediante m etodos opticos, ya que permite generar un
estmulo preciso y controlado de IP
3
, simult aneamente a la obtenci on de im agenes confocales.
El sistema fue usado exitosamente en experimentos en ovocitos de Xenopus laevis en donde el
IP
3
enjaulado fue liberado para evocar se nales intracelulares de Ca
2+
. Para la realizaci on de
estos experimentos fue necesario acondicionar el laboratorio para el tratamiento de los ovocitos,
incorporando nuevas t ecnicas que hacen posible el estudio de se nales intracelulares de calcio in
vivo. Esto permiti o extender la lnea de investigaci on te orica preexistente sobre el tema a una
nueva lnea experimental de investigaci on en el departamento de Fsica, teniendo la ventaja de
que conjuga el desarrollo de modelos te oricos con la elaboraci on de experimentos.
La parte nal de la Tesis estuvo dedicada a mostrar la habilidad de la modicaci on intro-
ducida en el microscopio para permitir la observaci on de se nales de calcio evocadas por IP
3
simult aneamente a la fot olisis de IP
3
enjaulado.
Para tal n, se mostraron, en primer lugar, im agenes confocales de barrido obtenidas en ovo-
citos previamente microinyectados con una mezcla de Fluo 4-dextran (de alta anidad) e IP
3
enjaulado. Se repitieron los experimentos con y sin EGTA para variar la probabilidad de ob-
servar se nales localizadas llamadas puffs. Las observaciones mostraron sitios de liberaci on que
presentaban varios eventos de puff consecutivos, donde el primero era de mayor amplitud que los
siguientes. Se calcularon los perles temporales de intensidad a partir de los cuales se estim o el
tiempo entre eventos en aproximadamente 3.5 s, valor consistente con estimaciones previas de
la literatura [Daniel Fraiman et al., 2006; Marchant et al., 1999]. Tambi en se observaron en un
mismo registro, sitios de liberaci on que ante el mismo estmulo UV se comportaban en for-
ma independiente entre s, activ andose en momentos no correlacionados. Se mostraron tambi en
ejemplos de eventos de liberaci on de Ca
2+
m as globales, en donde varios sitios se encuentran
130 Conclusiones
involucrados, activ andose pr acticamente al mismo tiempo y liberando Ca
2+
durante m as tiem-
po. La escala temporal del decaimiento de la concentraci on de Ca
2+
observada es consistente
con lo reportado previamente en la literatura [Dargan and Parker, 2003]. Se mostr o tambi en la
generaci on de una tpica onda de Ca
2+
en donde se observa que al activarse un sitio, entra Ca
2+
al citosol y al difundir va induciendo la activaci on de sitios de liberaci on vecinos. Se midi o la
velocidad de la onda, dando como resultado (18 2) m/s, valor que se encuentra dentro del
rango de valores esperados [Marchant et al., 1999]. Los diferentes eventos de liberaci on de Ca
2+
observados y las estimaciones cuantitativas inferidas a partir de ellos est an en total acuerdo con
observaciones previas de se nales de Ca
2+
mediadas por IP
3
. Estos resultados indican que el sis-
tema fotoliza ecazmente el IP
3
enjaulado, previamente microinyectado en las c elulas, y permite
adquirir simult aneamente im agenes confocales de las se nales evocadas.
Los primeros experimentos de se nales ac a descriptos no aportan nueva informaci on sino que
sirven para comprobar que tanto la modicaci on introducida en el microscopio como el trata-
miento de los ovocitos han sido implementados exitosamente. El FV1000 posee una serie de
caractersticas que permiten imaginar una enorme variedad de nuevos experimentos. En particu-
lar, basado en su multi-espectralidad propusimos observar simult aneamente la din amica espacio-
temporal del calcio luminal y la del citos olico durante se nales mediadas por receptores de IP
3
utilizando Fluo 5N y Rhod 2. El calcio luminal cumple un papel fundamental en las se nales en
m usculos mediadas por receptores de rianodina, por lo que es esperable que algo similar ocurra
en aqu ellas en las que intervienen los receptores de IP
3
. Si bien el Fluo 5N ha sido utilizado en
diversos tipos celulares para observar el calcio en el interior del retculo, que nosotros sepamos,
no existen antecedentes de su uso en ovocitos. Es por eso que debimos desarrollar un protocolo
para poder utilizarlo en este tipo de c elulas. Los resultados preliminares descriptos en esta Tesis
muestran que el Fluo 5N ingresa al lumen y da informaci on exclusivamente sobre el calcio lumi-
nal. Las im agenes obtenidas usando Fluo 5N y el marcador de retculo, DiI, son un ejemplo, por
otro lado, del uso de las propiedades multi-espectrales del FV1000. Estos resultados preliminares
muestran que estamos en condiciones de observar se nales de calcio simult aneamente en el lumen
del retculo y en el citosol y ayudar as a dilucidar el papel del calcio luminal sobre las se nales
mediadas por receptores de IP
3
.
PERSPECTIVAS
Los resultados de los experimentos de FCS en soluciones acuosas, empleando indicadores de
calcio, muestran la posibilidad de aplicar el modelo aproximado de FCS aqu propuesto para el
estudio de la difusi on del calcio en c elulas vivas permitiendo inferir, entre otras cosas, el coe-
131
ciente de difusi on del calcio libre y par ametros de interacci on con otras sustancias. Con este n
se planea en el futuro pr oximo realizar experimentos en ovocitos de Xenopus laevis microinyec-
tando diferentes concentraciones del indicador de calcio y/o alterando la concentraci on de calcio
basal mediante el uso de inhibidores de las bombas que remueven el calcio citos olico (como por
ejemplo la tapsigargina). De este modo se espera poder cuanticar los coecientes de transporte
in situ del calcio y de los indicadores uorescentes que se suelen utilizar para observar se nales
de calcio.
La exitosa modicaci on del microscopio FV1000 y la implementaci on de nuevas t ecnicas
abre un gran abanico de posibilidades en el estudio de se nales intracelulares de calcio in vivo.
Uno de los temas que la nueva t ecnica posibilita, es el estudio del efecto del calcio presente
en el lumen del retculo sobre las se nales. Con este n se planea realizar en el futuro pr oximo
observaciones de se nales en ovocitos de Xenopus laevis previamente microinyectados con IP
3
enjaulado, el indicador de calcio y quelantes de calcio ani onicos de baja anidad (como el citrato
o el maleato). Estos quelantes ani onicos deberan ser transportados hacia el interior del retculo
actuando como quelantes en el lumen de este reservorio. De este modo esperamos poder estudiar
c omo el calcio luminal inuye sobre la probabilidad de apertura de los receptores y sobre el
desarrollo de las se nales, en particular sobre la nalizaci on de las que permanecen localizadas.
132 Conclusiones
A
Ap endice
Coecientes efectivos de difusi on para la reacci on CaFluo 4EGTA
Como se mostr o en el Captulo 4, el sistema de reacci on-difusi on que describe la din amica,
cerca del equilibrio, del calcio en presencia de Fluo 4 y el EGTAest a caracterizado por 5 ramas de
auto-valores, dos de ellas asociadas a la difusi on libre del Fluo 4 y el EGTA. El tercer autovalor,
desarrollado a orden O(q
2
), en el n umero de onda, q, tambi en describe un comportamiento difu-
sivo con coeciente efectivo, D
ef1
dado por 4.17. Asociados a los otros 2 autovalores denimos
los coecientes efectivos, D
ef2
y D
ef3
, como los factores que multiplican a q
2
en su expansi on
(ver Ecs. (4.15)(4.16)). Usando programas de manipulaci on algebraica es relativamente sencillo
obtener expresiones analticas de D
ef2
y D
ef3
. Sin embargo, son demasiado largas y por eso no
fueron incluidas explcitamente en el Captulo 4. Describimos brevemente en este Ap endice los
pasos seguidos para obtenerlas.
Los autovalores de la matriz de la Ec. 4.13, que caracteriza la evoluci on del problema linea-
134 Ap endice
lizado en el espacio de Fourier, son:
1
= D
F
q
2
(A.1)
2
= D
E
q
2
(A.2)
3
=
3
+
2
1/3
3
_
m+
_
m
2
+ 4(
2
+ 3u)
3
_
1/3
(A.3)
1
3
2
1/3
(
2
+ 3u)
_
m+
_
m
2
+ 4(
2
+ 3u)
3
_
1/3
(A.4)
4
=
3

1
6
(1 i
3)2
1/3
_
m+
_
m
2
+ 4(
2
+ 3u)
3
_
1/3
+ (A.5)
+
1
6
(1 +i
3)2
1/3
(
2
+ 3u)
_
m +
_
m
2
+ 4(
2
+ 3u)
3
_
1/3
(A.6)
5
=

4
(A.7)
(A.8)
donde:
= a + a
E
+ 1 +c + c
E
+ k
E
+ q
2
(1 +D
F4
+ D
E
)
u = q
4
(D
E
+ D
F4
+ D
E
D
F4
) +
q
2
[(D
F4
+ 1)(c
E
+ k
E
) + (D
E
+ 1)(1 +c) + (D
F4
+ D
E
)(a + a
E
)] +
+a(c
E
+ k
E
) + (1 +c)(a
E
+ c
E
+ k
E
)
m = a
1
+ b
1
q
2
+ c
1
q
4
+ d
1
q
6
a
1
= 2 (1 +a + c)
3
2 k
E
(1 +a + c
E
)
3
+ 3 k
E
(1 +a
E
+ c
E
)(1 +a + c)
2
+
+3 k
2
E
(1 +a + c)(1 +a
E
+ c
E
)
2
9 a a
E
k
E
[(1 +a + c) +k
E
(1 +a
E
+ c
E
)]
e i es la unidad imaginaria. Si bien la notaci on es compleja, se puede probar que todos los auto-
valores son funciones reales de q
2
. No se dan las expresiones de b
1
, c
1
y d
1
porque no intervienen
en la denici on de los coecientes efectivos. Expandiendo los autovalores
3
,
4
y
5
a orden
O(q
2
) y haciendo la identicaci on introducida en (4.14)(4.16) se llega a la expresi on (4.17)
para D
ef1
. Para calcular num ericamente los valores de
ef2
y
ef3
se especializan en q
2
= 0
las expansiones de
4
y
5
obtenidas. Para determinar los valores D
ef2
y D
ef3
se calculan las
diferencias
4

ef2
y
5

ef3
usando las expansiones a orden O(q
2
) de los autovalores y se
las especializa en q
2
= 1.
Agradecimientos
En primer lugar quiero agradecerle muy especialmente a Silvina, por guiarme durante estos
a nos e introducirme en el mundo de la Biofsica y la Investigaci on. Por darme la oportunidad
de participar de la formaci on de un nuevo laboratorio y de enfrentar el desafo que representa
comenzar una nueva lnea experimental.
A Mara Laura, Emiliano y a los chicos del laboratorio, Luca, Estefana, Roco y Mariano,
por su empuje y buena predisposici on, con quienes siempre resulta un placer trabajar!
A La y todo el grupo del CMA y a Oscar y la gente del LEC, que siempre estuvieron dis-
puestos a contestar dudas y prestar cualquier tipo de reactivo/dispositivo que fuese necesario.
A Valeria y Alejandro por atender las dudas qumica-biol ogicas que surgieron en el camino.
A Ian Parker y todo su grupo de la Universidad de California, Irvine, por recibirme en su
laboratorio y guiarme en los primeros pasos hacia la investigaci on experimental en c elulas vivas.
A Daniel Calvo y su grupo por brindarnos generosamente los ovocitos y estar siempre dis-
puesto a disipar cualquier duda que surgiera con su manejo.
A mis amigos, a los que est an cerca y a los que est an distribuidos por el mundo, gracias por su
cari no y apoyo incondicional! Especialmente a Luz, Flor, Carla y Ceci gracias por escucharme! A
los viejos amigos de plasma, Vero, Pablo, Fran y C esar, que siempre est an presentes. A Gustavo,
Fede F., Fede W. y Gabriel, los amigos que amenizaron los almuerzos.
A la familia! A mam a y a pap a, a mis hermanos: Lolo, Leo y Titen y a mi hermana Jackie!
A Fede y a ta Vicky, no pueden faltar! gracias a cada uno de ellos, porque desde que empec e la
carrera de Fsica cada uno contribuy o a que haya podido llegar a este da. Gracias por todo su
amor y por estar siempre!! Y por supuesto a la nueva familia que me adopt o como propia!
A N estor, mi invalorable compa nero de aventuras y (aunque suene trillado) el amor de mi
vida, gracias por su innita paciencia durante la elaboraci on de este trabajo! Y especialmente
por el amor que me brinda cada da.
136 Ap endice
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Caracterizacin cuantitativa de seales

(a) Serie temporal de la uorescencia

), 1 j, k m. En ese caso, G() puede ser escrita

es la uorescencia a tiempos largos. En la gura 1.7, se muestra

Figura 1.7: Curva de recuperaci on caracterstica de la uorescencia en un experimento de FRAP.

I(q) es la transformada de Fourier de la distribuci on de intensidad del sistema, Ec. 1.16.

Con q la norma del vector de onda q con dimensiones y

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