UNIVERSIDAD AUTNOMA DE ZACATECAS

Francisco Garca Salinas

UNIDAD ACADMICA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

Maestra en Produccin Animal en Zonas ridas TESIS EVALUACIN DE HARINA DE SEMILLA DE GUAYABA Y GERMINADO (Psidium guajava L.) COMO UNA ALTERNATIVA EN NUTRICIN DE RUMIANTES Presenta: Q.F.B. Mnica Silva Vega

EL CORDOVEL, ENRIQUE ESTRADA, ZAC. 21 DE JUNIO, 2013

Mnica Silva Vega

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE ZACATECAS Francisco Garca Salinas

UNIDAD ACADMICA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

MAESTRA EN PRODUCCIN ANIMAL EN ZONAS RIDAS

TESIS EVALUACIN DE HARINA DE SEMILLA DE GUAYABA Y GERMINADO (Psidium guajava L.) COMO UNA ALTERNATIVA EN NUTRICIN DE RUMIANTES

Para obtener el grado de: MAESTRO EN CIENCIAS

PRESENTA: Q.F.B. MNICA SILVA VEGA

ASESORES: Dr. en C. Rmulo Bauelos Valenzuela M en C. Edgar Len Esparza Ibarra D. Ph. Alberto Muro Reyes Dr. en C. Francisco Javier Cabral Arellano Dr. en C. Francisco Javier Gutirrez Pia M en C. Luca Delgadillo Ruiz
El Cordovel, Enrique Estrada, Zacatecas. 21 de Junio, 2013

Mnica Silva Vega

DEDICATORIA A DIOS: Por permitirme estar aqu, y darme la fortaleza de culminar este proyecto A MIS PADRES: Jacobo Silva Elicerio () y Beatriz Vega Rubio, gracias por su apoyo incondicional, Gracias pap porque ests donde ests yo te siento conmigo y mam por tus consejos y amor en todo momento. A MIS HERMANOS Y HERMANAS: Isabel, Jess Irene y Jacobo por su cario y apoyo los quiero mucho.

A MIS AMIGOS: Por su amistad y hacerme tener confianza en m misma y creer en m en todo momento, en especial a la M en C Lucia Delgadillo Ruiz por su ayuda incondicional en todo momento su apoyo en el Laboratorio y amistad de todo corazn se lo agradezco.

Mnica Silva Vega

AGRADECIMIENTOS
La presente Tesis se realiz gracias al esfuerzo conjunto de varias personas que en todo momento estuvieron al pendiente del trabajo realizado.

Agradezco de todo corazn y con todo respeto a mis asesores el Dr. Rmulo Bauelos Valenzuela por haber confiado en m y por haber dirigido con toda paciencia este trabajo. Al D Ph. Alberto Muro Reyes por su paciencia, dedicacin y apoyo brindado. Al M. en C. Edgar Esparza Ibarra por su entusiasmo y su nimo siempre confiando en que terminara. Al Dr. Francisco Cabral Arellano por su nimo y apoyo, al Dr. Francisco Javier Gutirrez Pia por sus comentarios y por ultimo al M en C. Alejandro Espinoza por su apoyo brindado en el Laboratorio MUCHAS GRACIAS!

A mis maestros los Doctores Federico de la Colina, Francisco Echavarra y Francisco J. Escobar por haber participado en mi formacin y por todo su apoyo. A la Universidad Autnoma de Zacatecas y a la Unidad Acadmica de Medicina Veterinaria por darme la formacin profesional de Maestro en Ciencias.

Mnica Silva Vega

NDICE
NDICE DE TABLAS ................................................................................................................. i NDICE DE FIGURAS .............................................................................................................. ii RESUMEN ................................................................................................................................iii ABSTRACT .............................................................................................................................. iv I.- INTRODUCCIN ................................................................................................................. 1 JUSTIFICACION ...................................................................................................................... 3 OBJETIVOS ............................................................................................................................... 3 HIPTESIS .............................................................................................................................. 3 II-REVISION DE LITERATURA ............................................................................................. 4 2.1.- LA GUAYABA .......................................................................................................... 4 2.2.- CULTIVO DE LA GUAYABA ................................................................................. 6 2.3.- EMBRIOGNESIS Y FORMACIN DE LA SEMILLA ........................................ 7 2.4.- LA EMBRIOGENESIS REQUIERE DE LA EXPRESION DE GENES ESPECIFICOS .................................................................................................................... 9 2.5.- GERMINACIN ...................................................................................................... 10 2.5.1.-EL ABA INHIBE LA PRODUCCIN DE ENZIMAS POR GA ................... 13 2.6.- BIOSNTESIS DE ABA ........................................................................................... 13 2.7-ASPECTOS DE LA NUTRICION RUMINAL ......................................................... 18 2.8.-FERMENTACIN RUMINAL ................................................................................ 19 2.8.1.-METABOLISMO ENERGTICO DEL RUMEN............................................. 19 2.8.2.-METABOLISMO PROTEICO EN EL RUMEN ............................................... 20 2.9.- MICROORGANISMOS RUMINALES................................................................... 21 2.10.- ADITIVOS MICROBIANOS O PRBIOTICOS .............................................. 22 2.11.-PRODUCCIN DE CIDOS GRASOS VOLTILES (AGV) ............................. 25 2.11.1.-ACIDOS ORGNICOS............................................................... 25 2.11.2.- ABSORCIN DE LOS AGV..27 2.12.-SNTESIS DE PROTENA MICROBIANA Y PRODUCCIN DE AMONIO. ... 28 2.13.-COMPOSICIN DE LA FIBRA ............................................................................ 28 2.14.1.- DEGRADABILIDAD DE LA FIBRA. ........................................................... 29 2.15.- EXTRACTOS DE PLANTAS ................................................................................ 30

Mnica Silva Vega 2.16.- DIGESTIBILIDAD DE NUTRIENTES. ............................................................... 31 2.17.- PRINCIPALES TRANSTORNOS GSTRICOS EN LOS RUMIANTES........... 31 2.17.1.- ALCALOSIS. .................................................................................................. 31 2.17.2.-ACIDOSIS. ....................................................................................................... 32 2.18.-FACTORES FSICOS QUE MODIFICAN EL pH RUMINAL. ............................ 33 2.18.1.-NIVEL Y DINMICA DE LA INGESTIN. ................................................. 33 2.18.2.-NEUTRALIZACIN DE LA ACIDOSIS. ...................................................... 34 2.19.- RESPUESTAS DEL pH EN EL RUMEN A LA COMBINACIN DE LAS CARACTERSTICAS FSICAS Y QUMICAS. ............................................................. 35 III-MATERIALES Y MTODOS ........................................................................................... 37 3.1.- LOCALIZACIN ..................................................................................................... 37 3.2.- MATERIAL BIOLGICO UTILIZADO ................................................................ 37 3.3.- PARAMETROS DETERMINADOS ....................................................................... 37 3.3.1.- CONTEO DE LA SEMILLA .......................................................................... 37 3.3.2.- GERMINACIN DE LA SEMILLA ............................................................. 37 3.4.- ANLISIS PROXIMAL .......................................................................................... 38 3.4.1-DETERMINACIN DE CENIZAS .................................................................... 38 3.4.2-DETERMINACION DE EXTRACTO TEREO .........38 3.4.3.- FIBRA CRUDA ................................................................................................ 39 3.4.4- FDA Y FDN... 39 3.4.5.- DETERMINACIN DE PROTENA ............................................................... 40 3.4.6.- DIGESTIBILIDAD Y DETERMINACIN DE MATERIA SECA ................ 40 3.4.7- MTODO DE DEGRADABILIDAD IN VITRO PRODUCCIN DE GAS .... 41 3.4.8.-DETERMINACIN DE CIDOS GRASOS VOLTILES (AGV)................. 43 3.5.- DISEO Y ANALISIS ESTADSTICO .................................................................. 43 IV.- RESULTADOS ................................................................................................................. 44 4.1.- PORCENTAJE DE GERMINACIN, CONTEO Y PESO DE LAS SEMILLAS DE GUAYABA EN DIFERENTES ESTADOS DE MADURACIN. ...... 44 4.2.-ANLISIS BROMATOLGICO DE GERMINADO Y HARINA DE SEMILLA DE GUAYABA. ............................................................................................. 45

Mnica Silva Vega 4.3.-CINTICA DE DEGRADABILIDAD POR PRODUCCIN DE GAS IN VITRO. .............................................................................................................................. 46 V.- DISCUSIN ....................................................................................................................... 51 5.1.-CENIZAS ................................................................................................................... 52 5.2.-EXTRACTO ETREO .............................................................................................. 52 5.3.- FIBRA CRUDA ........................................................................................................ 52 5.4.- FDA Y FDN .............................................................................................................. 53 5.5.- PROTENA CRUDA ................................................................................................ 53 5.6.- MATERIA SECA ..................................................................................................... 54 5.7.-DIGESTIBILIDAD Y PRODUCCIN DE GAS IN VITRO Y

CUANTIFICACIN DE AGV. ........................................................................................ 54 VI.-CONCLUSIONES ............................................................................................................. 56 VII.- LITERATURA CITADA ................................................................................................ 57 ANEXOS..73

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NDICE DE TABLAS
Pag. Tabla 1. Promedio de los pesos y cantidades de semilla de Guayabas en sus estados de maduracin. Tabla 2. Resultado del Anlisis Bromatolgico de la semilla y germinado de Guayaba. Tabla 3. Resultados obtenidos de la digestibilidad de Harina de semilla y Germinado de Guayaba. Tabla 4. Correlacin de parmetros entre harina de semilla y germinado de guayaba 44

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NDICE DE FIGURAS
Pag. Figura 1. Principales Estados Productores de Guayaba (Ha) 2010. Figura 2. Psidium guajava L. en flor Figura 3. Estados de desarrollo desde germinacin de la semilla hasta formacin completa de la plntula de Guayaba (P. guajava L.) Figura 4. Protocolo de regeneracin. A) Segmentos nodales. B) Brotes a los 60 das. C) Plntulas a los 15 das en el medio. D) Plntula regenerada para climatizacin. Figura 5. Estados de maduracin del fruto de guayaba. Figura 6. Germinacin de las semillas de guayaba. Figura 7. Produccin de gas in vitro a las 48 horas de incubacin de harina de Semilla y Germinado de Guayaba. Figura 8. Produccin de AGV en el germinado y harina de semilla de guayaba. 4 6 16

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RESUMEN
Con el objetivo de evaluar los contenidos nutricionales de la Harina de semilla y Germinado de Guayaba para su posible utilizacin como alimento de rumiantes se encontr que la semilla de Guayaba germina 92 % a las 5 semanas alcanzando una altura de 5.7 mm de altura. La composicin bromatolgica de la harina de semilla mostr para cenizas 1.096 %, grasa 40.576 %, fibra cruda (FC) 41.331 %, fibra detergente neutro (FDN) 94.025 %, fibra detergente cido (FDA) 36.7383 %, protena 8.788 % y materia seca (MS) de 35.3901 %. Despus de la digestibilidad in vitro que registr una presin de 5.5 atm a las 48 horas, se cuantificaron los cidos grasos voltiles (AGV) resultando 21.58 mmol/L de cido actico, 7.94 mmol/L de cido propinico y 44.90 mmol/L de cido butrico. En el germinado de guayaba result con cenizas de 1.517 %, grasa 17.300 %, FC 99.463 %, FDN 43.1622 %, FAD 36. 898 %, protena 30.496 % y MS 39.9203 %. En la digestibilidad tenemos una presin de$ 6.8 atm en 48 horas y en la cuantificacin de AGV 25.240 mmol/L de cido actico, 11.26 mmol/L de cido propinico y 55.8 mmol/L de cido butrico. Estadsticamente existieron diferencias significativas en ceniza, FC, grasa, FDN, protena y cido butrico entre Harina de semilla y Germinado de Guayaba. Y correlaciones, entre cenizas y FC positiva, grasa con cenizas y FC negativas, FDN con cenizas y FC negativas, protena con cenizas y FC positiva y negativa con grasa, y cido butrico con cenizas, FC, protena y cido actico correlacin positiva y negativa con grasa y FDN. La Hiptesis planteada en este trabajo se cumple en lo que se refiere a la harina de semilla de Guayaba, la cual tiene posibilidades ser utilizada para la dieta de los rumiantes adems de su bajo costo aproximadamente 50 centavos por Kg y la facilidad de elaboracin. Con respecto al germinado no es una alternativa costeable debido a los esfuerzos en la germinacin y la cantidad obtenida es mnima en peso, aunque su valor nutritivo sea mayor que la harina.

PALABRAS CLAVE: Guayaba, Harina de Semilla, Germinado, Anlisis bromatolgico, digestibilidad.

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ABSTRACT
In order to evaluate the nutritional content in seed flour and guava sprout for ruminants feeding utilization found, that guava seed germinates at 92% in 5 weeks growing until 5.7 mm in tall. The bromatological composition of seed flour shows a relative ashes 1.096%, fat 40.576%, crude fiber (CF) 41.331%, neutral detergent fiber (NDF) 94.025%, acid detergent fiber (ADF) 36.7383%, protein 8.788% and dry matter (DM) 35.3901%. After in vitro digestibility that obtained 5.5 atm of pressure at 48 hours, the volatile fatty acids (VFA) were quantified; the result shows 1.079g/L of acetic acid, 0.397 g/L of propionic acid and 2.245 g/L of butyric acid. In guava sprout the humidity result in 88.494%, ashes 1.517%, Fat 17.300%, CF 99.463%, NDF 43.1622%, ADF 36.898%, protein 30.496% and DM 39.9203%. In vitro digestibility shows 6.8 atm of pressure in 24 hours, when the VFAs were determinate it resulted with 1.2625g/L of acetic acid, 0.563 g/L of propionic acid and 2.7925 of butyric acid. Statistically existed significant differences in ashes, CF, fat, NDF, protein and butyric acid between seed flour and guava germinated. Positive correlations between ashes and CF, negative in case of Fat with ashes and CF, also negative in the correlation between NDF whit ashes and CF, positive between protein whit ashes and CF and negative whit Fat and butyric acid whit ashes. CF, protein and acetic acid had positive correlation and negative whit Fat and NDF. The hypothesis proposed in this work is fulfilled in regards to the guava seed meal, which has the potential to be used for ruminant diets besides its low cost about 50 cents per Kg and ease of preparation. With respect to germinated is not affordable alternative due to efforts in the germination and the amount obtained is minimal weight, although their nutritional value is greater than the flour.

Keywords: Guava, Seed flour, Sprouts, Bromatological test, Digestibility.

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I.- INTRODUCCIN
El consumo de la guayaba principalmente es en fresco, sin embargo en la poca de mayor cosecha se industrializa, sobre todo la de menor calidad para la elaboracin de jugo, nctar, ate, mermelada, licor y diversos dulces. Durante la elaboracin de dichos productos se utiliza la pulpa quedando como desecho una gran cantidad de semillas las cuales no tienen ninguna utilidad al contrario resultan un problema para las empresas dedicadas a los jugos y nctares. Las semillas contienen cantidades variables de nutrientes que las plantas utilizan para su germinacin y establecimiento en suelo, estos pueden ser utilizados por el hombre en lugar de ser desechados sin ninguna utilidad (Lawrence et al., 1990); para conocer su posible utilidad es importante estudiar la composicin y cantidad de estos compuestos tales como protenas, carbohidratos, lpidos, fibra y en base a las cantidades y caractersticas propias que presenten buscarles alguna posibilidad de uso. Existen pocos reportes de estudios diversos a cerca de la semilla de guayaba, en donde proponen que la harina de la molienda de la semilla se utilice en la preparacin de galletas sustituyendo parte de la harina de trigo (El y Yassen 1997). Bourgeois et al., (1998) estudiaron el aceite de la semilla y proponen que puede tener utilidad en la elaboracin de jabones, productos de bao y de belleza. Bernardino-Nicanor et al., (2001) reporta una caracterizacin bioqumica de la protena de la semilla y sus caractersticas funcionales. Por lo que se puede mencionar que el 80 % de la fibra de la semilla de Guayaba no es digerible para el humano, por lo cual se podra emplear en la elaboracin de productos con contenidos variables de fibra. El 70 % de esta es digerible por los rumiantes la cual podra constituir una fuente de fibra en la elaboracin de alimentos para estos. En otro orden de ideas, los rumiantes requieren alimentos que cubran sus necesidades, como mantenimiento, crecimiento, preez y desarrollo corporal. El conocimiento del valor nutritivo de los alimentos es fundamental para la nutricin animal, no siendo suficiente con los anlisis qumicos, hay que considerar los efectos de los procesos de digestin, absorcin y metabolismo animal (Bondi, 1989). Las pruebas de digestibilidad permiten estimar la proporcin de nutrientes presentes en una racin que pueden ser absorbidos por el aparato digestivo (Church y Pond, 1994) quedando disponibles para el animal (Bondi, 1989). 1

Mnica Silva Vega El presente trabajo pretende encontrar alternativas para el aprovechamiento de los desechos industriales y obtener un alimento o complemento en la dieta de los animales de produccin. Esto puede contribuir a una alternativa de alimentacin en tiempo de sequa y representar un ahorro para la industria que no tendra que gastar en combustible y mano de obra para depositar estos desechos en basureros, y ahorro para los ganaderos porque tendran un complemento alimentario para sus animales a bajo costo.

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JUSTIFICACIN
Este proyecto busca generar una opcin para mejorar la utilizacin integral de la semilla de Guayaba como un recurso de los productores de Guayaba del pas. As el propsito es de beneficiar a los ganaderos del estado aportando una nueva fuente de alimento para el ganado.

OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL

Evaluar el contenido nutricional de la Harina de semilla y el Germinado de Guayaba (Psidium guajava L.) para uso en la alimentacin de rumiantes.

OBJETIVOS PARTICULARES
1.- Determinar los rendimientos y el porciento de germinacin de la semilla de Guayaba (Psidium guajava L.) en distintas etapas de maduracin. 2.- Evaluacin Bromatolgica de la semilla y el germinado de Guayaba (Psidium guajava L.). 3.- Identificacin y cuantificacin de l a digestibilidad in vitro de la harina de semilla y germinado de Guayaba (Psidium guajava L.) as como la produccin de cidos grasos voltiles.

HIPTESIS
El germinado y la harina de semilla de Guayaba (Psidium guajava L.) por sus contenidos nutricionales, protena, grasas y fibra pueden utilizarse en la nutricin ruminal.

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II-REVISION DE LITERATURA
2.1.- LA GUAYABA La guayaba (Psidium guajaba L.) es una especie frutcola originaria de Amrica Ecuatorial que se encuentra ampliamente distribuida en regiones tropicales y subtropicales para su consumo fresco y procesado (Martin, 1984). Es la ms cultivada de las especies del gnero Psidum que pertenecen a la familia de las Mirtceas, por su alto contenido nutricional, propiedades medicinales y su valor agroecolgico. En Mxico los productores de guayaba ocupan el cuarto lugar mundial de la produccin con el 6.1% de la oferta internacional estimada en 277 mil 543 toneladas y solamente son superados por Pakistn, China e India (SAGARPA, 2009). La produccin nacional de guayaba se registra en 22 Estados del pas con un total de 22,576.11 Ha. sembradas y 22,246.86 Ha. cosechadas; incluido Baja California, donde se reporta 1.0 Ha. de superficie sembrada. En 2010, Michoacn reporta un total de 9,346.59 Ha. sembradas y 9,239.09 Ha. cosechadas; siendo el primer productor a nivel nacional con un 41.40% de la superficie sembrada. En segundo lugar aparece Aguascalientes con un total de 6,734 Ha. sembradas de las cuales se cosechan igual nmero, que representan el 29.83% de la produccin nacional, tal y como se muestra en la Figura 1. En conjunto, a nivel nacional los Estados de Michoacn y Aguascalientes tienen el 71.23% de la superficie sembrada con guayaba.

Figura 1. Principales Estados Productores de Guayaba (Ha), 2010.

Fuente: Elaboracin propia en base a datos estadsticos de SAGARPA - SIAP, Marzo 2012

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Zacatecas por su parte tiene el 17.82% de la superficie sembrada con guayaba, ubicndose como el tercer productor a nivel nacional. Michoacn, Aguascalientes y Zacatecas concentran el 89.05% de la produccin nacional; en este rubro, otras entidades federativas que participan con menor escala son: Estado de Mxico con 4.02%, Jalisco con 1.51% y Guerrero con 1.16%. (SAGARPA, SIAP 2012) El cultivo de la guayaba ha adquirido una creciente importancia por el alto valor nutritivo de su fruto el cual posee niveles de vitamina C que alcanzan los 400 mg por cada 100 gramos de pulpa, alto contenido de pectina y minerales. Estas bondades nutricionales acompaadas de alto consumo fresco hacen de esta fruta muy apetecida en los mercados de varios pases por lo que se le considera como la manzana del trpico (Prakash et al., 2002). La composicin de los azcares vara ampliamente en el fruto: sin embargo la fructuosa es el principal azcar y otro como la glucosa y la sacarosa son menos abundantes (Paull y Goo, 1983). La fructuosa es el carbohidrato ms abundante en los frutos maduros, mientras que la sacarosa en frutos muy maduros (Arenas et al., 1995).

Mnica Silva Vega 2.2.- CULTIVO DE LA GUAYABA La produccin de cultivos frutales lleva consigo una importante inversin desde el inicio del cultivo en el semillero o vivero hasta su plantacin al terreno definitivo. Uno de las etapas ms delicadas es precisamente los inicios de la plantacin donde la planta es susceptible a muchos cambios (climticos, fsicos y qumicos) y es donde requiere una mayor atencin y una mayor disponibilidad de nutrimentos para alcanzar un desarrollo ptimo y por consecuencia una mejor capacidad de adaptacin al terreno, permitindole obtener una mayor eficiencia al momento de comenzar su produccin. La guayaba es una de las frutas ms importantes desde el punto de vista diettico, por su contenido de calcio, fsforo y vitaminas C y A. Hay variedades con bastante carotenos, mientras que otras son ricas en cido ascrbico (Hoyos, 1989). La variedad de guayaba ms predominante en nuestro pas es la Media China obtenida de un arbusto frondoso que alcanza de 5 a 6 metros de altura. Su crecimiento y desarrollo se ve favorecido en lugares con temperaturas entre 16C y 34C con un factor de humedad relativa entre 36 y 96%. Se recomienda su cultivo en la franja tropical y en zonas subtropicales que no rebasen los 1,400 metros sobre el nivel del mar con una precipitacin anual de 1,000 a 1,800 milmetros cbicos (SAGARPA, 2009). Las hojas son oblongas o elpticas, apiculadas, de 4-12 cm de largo por 3-4 cm de ancho, con nerviaciones prominentes y numerosas glndulas transparentes. Las flores son grandes, blancas y axilares (Figura 2). Sus frutos son bayas carnosas muy aromticas, con el cliz persistente en el pice, globosas o piriformes, con numerosas semillas muy duras en la pulpa (Hoyos, 1985).

Figura 2. Psidium guajava L. en flor. 6

Mnica Silva Vega 2.3.- EMBRIOGNESIS Y FORMACIN DE LA SEMILLA La semilla es pequea en forma reniforme con una testa sea y dura; el embrin es cilndrico y arqueado y termina en dos minsculos cotiledones (Vindas, 1990). A partir del momento en que se forma el zigoto dentro del ovulo y hasta que este llegue a ser un esporofito embrionario maduro, la planta progenitora transfiere nutrientes a los tejidos del vulo. Las reservas de alimento se acumulan en el endospermo o en los cotiledones. En algn momento el vulo se separa de la pared del ovario y sus integumentos se engruesan y endurecen para formar la cubierta de la semilla. El embrin, las reservas de alimento y la cubierta constituyen un paquete autocontenido. Una semilla, a la cual denominan vulo maduro. A partir de este se pueden realizar cultivos in vitro de embriones zigticos has sido efectivos en el rescate de embriones abortivos derivados a partir de hibridacin inespecfica o intergentica y en el rescate del material de propagacin de frutales con semilla que en algunos casos es debida a inhibidores del desarrollo del embrin, presentes en endospermo o en la cubierta de la semilla, el cultivo de embriones ha ayudado el mejoramiento gentico de las especies arbreas, porque permite acortar el periodo del siembra a floracin (Litz, 1991). Las semillas son resistentes a la desecacin, poseen reservas nutritivas, como lpidos, carbohidratos y protenas, para iniciar el proceso de germinacin en el cual las semillas tienen que cumplir ciertos requisitos, uno de ellos es ser una fuente de precursores de esqueletos de carbono y funcionar como una fuente de energa (Flores-Vindas, 1999). Los materiales de reserva se pueden almacenar en el embrin o en tejidos extraembrionarios como en endospermo (Gispert C. 1999). Las semillas se forman por medio de la embriognesis, el cual inicia el desarrollo vegetal. Normalmente se inicia con la unin de una clula espermtica con una ovoclula transformando una clula nica llamado zigoto. La embriognesis transforma un zigoto unicelular en una planta embrionaria multicelular y microscpica. Un embrin completo posee el cuerpo vegetal bsico de la planta madura, y muchos de los tejidos adultos, aunque estn en forma rudimentaria. La embriognesis se produce en el saco embrionario del primordio seminal mientras que el saco embrionario y estructuras asociadas dan lugar a la semilla. El endospermo es un tejido resultante de la fusin entre una clula epidrmica y los ncleos polares de una clula central perteneciente al saco embrionario, este tejido es 7

Mnica Silva Vega el responsable de otorgar el crecimiento y por lo tanto la germinacin del embrin en la planta, el endospermo posee una presencia cromosmica materna y paterna bien definida, el control de la reproduccin sexual de la planta radican en el endospermo, es importante mencionar que en el endospermo se expande durante el crecimiento a expensas del tejido nuclear (Flores-Viendas E. 1999). El hecho de que lo zigotos den lugar a un embrin organizado con una estructura predecible y especfica para cada especie nos indica que el zigoto esta genticamente programado para desarrollarse en una forma determinada, y que la divisin, la expansin y la diferenciacin celular est fuertemente controladas durante la embriognesis. Si estos procesos se produjeran al azar en el embrin, dara como resultado un grupo de clulas desorganizadas sin forma ni funcin determinada (Teijn et al; 2006). Es muy probable que las angiospermas usen mecanismos similares de desarrollo, que aparecieron tempranamente en la evolucin de las angiospermas y que la diversidad de la formas vegetales se haya producido por cambios sutiles en el tiempo y lugar a la expresin de los reguladores moleculares del desarrollo, ms que efectos de mecanismos diferentes (Doebley y Luckens, 1998). La embriognesis tambin establece los meristemos primarios. La mayora de las estructuras que forma la planta adulta se genera por la embriognesis por actividad de meristemos. Aunque estos meristemos estn bien establecidos durante la embriognesis, solo llegaran a ser activos durante la germinacin y empezaran a generar los rganos y tejidos de la planta adulta. PATRON AXIAL: Casi todas las plantas muestran una polaridad axial en las que los tejidos y los rganos se organizan en un orden preciso a lo largo del eje lineal polarizado. El meristemo apical del brote o caulinar se encuentra en uno de los extremos de eje, y el meristemo apical de la raz est en el otro. La primera divisin del zigoto es asimtrica y se produce en una ngulo recto al eje longitudinal. Esta divisin crea dos clulas, una apical y otra basal con destinos muy diferentes. La clula hija ms pequea, recibe ms citoplasma que la clula ms grande, la basal, que hereda la gran vacuola del zigoto. Casi todas las estructuras del embrin, y en ltima instancia la planta madura derivan de una pequea clula apical.

Mnica Silva Vega La clula basal tambin se divide, pero todas las divisiones son horizontales, en ngulo recto al eje longitudinal. El resultado es un filamento de seis a nueve clulas conocido como el suspensor que ancla el embrin al sistema vascular de la planta. Solo una de las clulas derivadas de la clula basal contribuye al embrin. La clula derivada ms prxima al embrin se conoce como hipfisis, y forma la columela, o parte central de la cofia apical, y una de la parte esencial del meristemo radical apical conocido como centro quiescente. El patrn radial en la diferenciacin de los tejidos que se observa por primera vez en un embrin octante. A medida que continan las divisiones celulares en el embrin globular, las divisiones transversales dividen la capa inferior de las clulas radialmente en tres regiones. Estas tres regiones formaran los tejidos ordenados radialmente en los ejes del tallo y la raz. Las clulas ms externas forman una capa unicelular superficial, conocida como protodermis. La protodermis cubre ambas mitades del embrin y genera la epidermis. Las clulas que formaran el meristemo fundamental se sitan por debajo de la protodermis. El meristemo fundamental dar lugar al crtex, y en la raz e hipocotilo, tambin la endodermis. El procambium es la capa ms interna, de las clulas alargadas que generan los tejidos vasculares y en la raz, el periciclo (Teijn et al; 2006).

2.4.- LA EMBRIOGENESIS REQUIERE DE LA EXPRESION DE GENES ESPECIFICOS El gen GNOM: El patrn axial. Las plntulas homocigotas para las mutaciones del gen GNOM carecen de races y cotiledones (Mayer et al., 1993). En los mutantes extremos los embriones gnom, son esfricos y carecen de polaridad axial. Los genes MONOPTEROS: Raz principal y tejido vascular. Dan lugar a las plntulas que carecen de hipocotilo y de raz, aunque producen una regin apical. En los embriones mutantes mp las estructuras apicales no son estructuras normales y los tejidos de los cotiledones estn desorganizados (Berleth y Jrgens, 1993) los embriones mutantes mp muestran anormalidades por primera vez en el estado octante y no forman el procambium en la parte inferior del embrin globular, la parte que dara lugar al hipocotilo y la raz. 9

Mnica Silva Vega Los mutantes del gen HOBBIT (HBT) son deficientes en la formacin de una raz embrionaria funcional, al igual que las plantas mutantes mp. Sin embargo ambas mutaciones actan de modo diferente. Las mutantes htb empiezan a mostrar anormalidades en la etapa celular de dos a cuatro clulas antes de la formacin del embrin globular. El principal defecto de los mutantes hbt se encuentran en el precursor de la hipfisis y el meristemo radical que se forma a continuacin carece de centro quiescente de la columela. Los embriones de los mutantes htb parecen tener un meristemo radical, pero no es funcional cuando las plntulas germinan. Adems las plantas crecidas a partir de embriones mutantes htb son incapaces de formar races laterales. El gen SHOOTMERISTEMLESS: El promeristemo del brote: las divisiones orientadas de algunas de las clulas que hay entre los coltiledones dan lugar a una estructura en las capas de esta regin, caracterstica de meristemo apical del brote. El producto del gen STM silvestre parece suprimir la diferenciacin celular, asegurando que las clulas del meristemo permanezcan indiferenciadas. En el estado de corazn la expresin de STM pueda restringida a unas pocas clulas de los cotiledones (Long et al., 1996). El gen STM es necesario no solo en la formacin del meristemo apical del brote embrionario, si no para el mantenimiento de la identidad del meristemo apical caulinar en la planta adulta. El gen LEAFY COTYLEDONY (LECI, del ingls leafy cotyledon 1, cotiledn frondoso). Tambin es activo en las etapas de la embriognesis: como los mutantes de la lec1 no pueden sobrevivir a la desecacin y no entran en etapa de latencia. Los embriones mueren a menos que se aslen antes de la desecacin.

2.5.- GERMINACIN La germinacin es el proceso de iniciacin del crecimiento del embrin, se inicia con la absorcin de agua, (imbibicin) y finaliza con la emergencia del embrin (radcula o hipocotilo) a travs de la cubierta o testa de la semilla. La imbibicin da lugar a una prdida de solutos y reanuda la actividad metablica (respiracin, sntesis de protena y cidos nucleicos). Considerando que la germinacin finaliza al iniciarse el crecimiento del 10

Mnica Silva Vega embrin los cambios en el contenido hdrico son de gran inters en la regulacin del proceso. As muchos inhibidores (cido abscsico, dficit hdrico y temperaturas extremas) y promotores (KNO) de la germinacin actan alargando o acortando esta fase. En muchos casos, una semilla viable (y por tanto viva) no germinar incluso aunque se den todas las condiciones ambientales necesarias para el crecimiento. Este fenmeno se denomina dormicin de la semilla o estado de latencia (Bewley, 1997 y Azcon-Bieto, 1993). Este estado se manifiesta en grados diversos en diferentes especies incluso en una poblacin de semillas de la misma especie. Para una planta puede representar cierta ventaja adaptativa que contribuye a su mejor distribucin espacio-temporal y consecuentemente a su comunidad como especie. (Bewley, 1997). Se puede definir 2 tipos de dormicin, la que induce la cubierta y la del embrin. La dormicin del embrin impuesto por la cubierta de la semilla y otros tejidos que la encierran, como el endospermo, el pericarpo u rganos extraflorales, se conoce como dormicin impuesta por la cubierta. Los embriones de tales semillas germinaran rpidamente en presencia de agua y oxgeno, una vez que la cubierta de la semilla y los tejidos que la rodean hayan sido eliminados o daados. Hay cinco mecanismos bsicos de la dormicin impuesta por la cubierta. 1.- Prevencin de la incorporacin de agua. 2.- Constriccin mecnica: el primer signo de la germinacin normal es la ruptura de la radcula atreves de la cubierta de la semilla. Para que las semillas germinen las paredes del endospermo deben debilitarse por la produccin de enzimas que degradan la pared celular. 3.- Interferencia para el intercambio gaseoso: la reducida permeabilidad de las cubiertas de las semillas al oxigeno sugiere que dicha cubierta inhibe la germinacin al limitar el porte de oxgeno al embrin. 4.- Retencin de inhibidores: las cubiertas de las semillas puede evitar la prdida de inhibidores de esta. 5.- Produccin de inhibidores: las cubiertas de las semillas y los pericarpos pueden contener concentraciones relativamente altas de los inhibidores del crecimiento, el principal factor reportado que controla la dormicin de la semilla es el cido abscsico (ABA). (Bewley, 1997; Steinbach et al., 1997)

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Mnica Silva Vega El segundo tipo de dormicin de la semilla es la dormicin del embrin, una dormicin que es intrnseca al embrin y no se debe a ninguna influencia de la cubierta de la semilla o de los tejidos que la rodean en algunos casos, la dormicin del embrin se puede eliminar por la amputacin de los cotiledones. Se cree que la dormicin del embrin es debida a la presencia de inhibidores, especialmente ABA, as como ausencia de promotores de crecimiento, como GA (cido giberlico). La prdida de la dormicin del embrin suele estar asociada al brusco descenso de la relacin entre ABA y GA. ABA inhibe la germinacin precoz y la vivipariedad. Si durante el desarrollo, antes del inicio de la dormicin, se separan los embriones maduros de las semillas y se colocan en medios de cultivo, estos germinan precozmente. El ABA aadido en medio de cultivo inhibe la germinacin precoz, este resultado junto con el hecho de que el nivel de ABA endgeno es alto durante la mitad y el final del desarrollo de la semilla, sugiere que ABA es el constructor natural que mantiene el desarrollo del embrin en su estado estacionario (Teijn et al; 2006).

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Mnica Silva Vega 2.5.1.-EL ABA INHIBE LA PRODUCCIN DE ENZIMAS POR GA El ABA inhibe la sntesis de las enzimas hidrolticas que son esenciales para la ruptura de reservas almacenadas en la semilla. Por ejemplo, el GA estimula la capa de la aleurona de los cereales para producir alfa-amilasa y otros enzimas hidrolticos que catalizan la ruptura de compuestos de reserva en el endospermo durante la germinacin. La influencia de la luz sobre la germinacin se conoce desde el siglo XIX, la investigacin del fotocontrol de la germinacin de las semillas de Lactuca sativa condujo al descubrimiento del fitocromo (Borthwick et al,. 1952). El efecto de la luz puede ser promotor e inhibidor segn la composicin espectral, la irradiancia y duracin de la radiacin, la temperatura y el estado fisiolgico de la semilla.

2.6.- BIOSNTESIS DE ABA Como con otras hormonas vegetales, los efectos reguladores de ABA dependen de su concentracin en el tejido y de la sensibilidad del tejido a la hormona: la ruta biosinttica de ABA se ha determinado con ayuda de los mutantes deficientes en ABA que tienen bloqueada la ruta en espacios especficos. La biosntesis de ABA tiene lugar en los cloroplastos y en otros plastos. La ruta empieza en el Isopentenildifosfato (IPP) la estructura biolgicamente activa del isopropeno que da lugar a la sntesis de una xantofila C40 (es decir un carotenoide oxigenado) la violaxantina. La sntesis de la violaxantina est caracterizada por una zeaxantina epoxidasa (ZEP). Este descubrimiento aporto la evidencia concluyente de que la sntesis de aba se produce por la ruta indirecta o de los carotenoides, ms que a partir de una molcula pequea: los mutantes de maz que tienen bloqueada la ruta de los carotenoides en otras etapas tienen niveles reducidos de ABA y muestran vivipariedad (la germinacin precoz de las semillas del fruto cuando todava estn unidas a la planta). La violaxantina es convertida en un compuesto C 40 la 9-cis-neoxantina, que se rompe para formar el compuesto de 15 carbonos xantoxal, anteriormente conocido como xantoxina, un inhibidor del crecimiento neutro que tiene propiedades fisiolgicas similares a las de ABA. La ruptura esta catalizada por la 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenasa

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Mnica Silva Vega (NECD) llamada as porque puede romper la 9-cis-violaxantina como la 9-cisneoxantina. La sntesis de NCED se induce rpidamente por estrs hdrico, lo que sugiere que la reaccin catalizada es un paso regulador clave en la sntesis de ABA. El enzima est localizada en los tilacoides, donde se encuentra el sustrato carotenoide. Finalmente el xantoxal es convertido en ABA a travs de etapas oxidativas que implican el (los) intermediario (s) ABA-aldhido y/o posiblemente el cido xantoxico. La etapa final esta catalizada por una familia de aldehdo-oxidasa que necesita molibdeno como factor. La biosntesis y las concentraciones de ABA pueden variar drsticamente en tejidos especficos durante el desarrollo o en respuesta a condiciones ambientales cambiantes. Las semillas en desarrollo pueden aumentar hasta 100 veces en unos pocos das y reducirse a niveles mnimos a medida que avanza la maduracin. En condiciones de estrs hdrico, el ABA en las hojas puede aumentar 50 veces en un periodo de 4 a 8 horas. Tras la rehidratacin el ABA se reduce a niveles normales en el mismo tiempo (Pozo, 2001) La biosntesis no es el nico factor que regula las concentraciones en el tejido. Como otras hormonas vegetales, la concentracin de ABA libre en el citosol est tambin regulada por la degradacin, compartimentalizacin, conjugacin y transporte. Por ejemplo el ABA citosolico aumenta durante el estrs hidroltico resultado de la sntesis de la hoja, la redistribucin en la clula del mesofilo, la importacin de las races y la recirculacin de las hojas. La concentracin de ABA tras la rehidratacin debido a la degradacin y exportacin de la hoja y a un descenso de la velocidad de la sntesis. Una de las principales causas de la inactivacin de ABA es la oxidacin, que da lugar a la formacin de un intermedio inestable, el 6-hidroximetil-aba, que se convierte rpidamente en cido faseico (PA) y cido dihidroxifaseico (DPA). El PA normalmente es inactivo o muestra una actividad muy reducida. No obstante en PA puede inducir el cierre estomtico en algunas especies y es tan activo como el ABA. El ABA libre tambin es inactivado por la conjugacin, covalente a otras molculas, como los monosacridos. Un ejemplo comn de ABA conjugado es el ster -D-glucosil-ABA (ABA-GE). La conjugacin no solo inactiva la actividad hormonal de ABA, sino que, adems, altera su polaridad y su distribucin celular. Mientras que el ABA libre se

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Mnica Silva Vega localiza en el citosol, el ABA-GE se localiza en las vacuolas y podra ser, por tanto una forma de reserva de la hormona. (Rachmilericht et al., 2004) ABA es trasportado por el xilema y por el floema, pero es mucho ms abundante e la savia del floema. El principal punto de control de distribucin de ABA entre los compartimentos de la clula vegetal se basa en el concepto de trampa aninica. La forma disociada (anin) de este cido dbil se acumula en los compartimientos alcalinos y puede ser distribuido de acuerdo a lo pronunciado que sean los gradientes de PH a travs de las membranas. El cido abscsico acta principalmente regulando el inicio y el mantenimiento de la dormicin de la semilla y yemas en la respuesta del estrs, sobre todo al estrs hdrico. Adems ABA influye en otros aspectos del desarrollo, interactuando, normalmente como antagonista de auxinas, citoquininas, giberelinas, etileno y brasinosteroides. La propagacin de la guayaba se realiza especialmente por medio de semilla sexual y en menor escala a travs de acodos y estacas (Jaiswal y Amin, 1992). La propagacin masiva por semilla, aunque es fcil, genera alta variabilidad y baja produccin comercial (Ali et al., 2003). Por su parte, la propagacin asexual convencional por lo general es poco eficiente y difcil de masificar en niveles deseables. A pesar del avance considerable en el desarrollo de tcnicas que mejoran el potencial germinativo de especies cultivadas, la mayora de las especies nativas necesita de informaciones silviculturales, principalmente las relacionadas con las condiciones apropiadas para que sus semillas germinen (Abreu et al., 2005). La germinacin de la semillas del guayabo es epigea y la plntula criptocotilar (Meza., et al 2007). La consideracin del tamao del fruto se fundamenta en el principio de que la semilla alcanza la madurez fisiolgica cuando alcanza su mximo tamao (Popinigis, 1985) y en ese momento presenta la mxima calidad en trminos de materia seca, germinacin y vigor y a partir de entonces se inicia el proceso de deterioro. La longevidad de las semillas est determinada por su constitucin gentica y sus caractersticas fisiolgicas como as tambin por daos previos o durante el almacenamiento (Willan, 1991). Con relacin a la germinacin, la especie ms estudiada del gnero Psidium es P. guajava y al respecto (Pereira y Andrade et al. 1994) sealan que no existen diferencias en los porcentajes de germinacin cuando se siembran en vermiculita, papel de filtro o toallas de 15

Mnica Silva Vega papel a temperaturas alternas de 15-35C 20-30C. Por su parte Maeda et al., (1999), determinaron que los mejores resultados de germinacin se consiguen con semillas sembradas sobre papel en un rango de temperatura de 20-30C. A las semillas se les puede aplicar diversos mtodos para estimular la germinacin, (Figura 3) entre estos esta la escarificacin que consiste en el ablandamiento de las capas mas externas de las semillas denominada episperma, esta puede ser mecnica utilizando lijas abrasivas, imbibicin en agua, cidos, remojo en agua en altas temperaturas entre otras (Faria et al., 1996). El remojo durante 24 horas favorece los procesos de germinacin y emergencia de la semilla de guayabo (Meza et al., 2007).

Figura 3. Estados de desarrollo desde germinacin de la semilla hasta formacin completa de la plntula de Guayaba (P. guajava L.) El rendimiento despus de una semana de cultivo es 10 20 veces el peso de la semilla en una fbrica, en condiciones rsticas de 2 a 7 veces, en dependencia del tipo de semilla, tiempo de germinado con o sin sustrato y otros (Cisneros, 1996). Por lo que en una granja 16

Mnica Silva Vega agroecolgica sera una alternativa para agregarle valor a las semillas que se obtienen y dedicarlas a la alimentacin animal e incluso humana. Se ha demostrado la posibilidad de propagar in vitro la guayaba en varios estudios utilizando pices (Papadadatou y Pontikis, 1990), segmentos nodales (Amin y Jaiswal, 1988; Mohamed-Yasseen et al., 1995), hojas jvenes, hipocotilos (Loh y Rao, 1989; Singh et al., (2002) y embriognesis somtica (Manoj et al., 2007). Kaundal y Deol (1990), compararon el desarrollo de grupos de yemas con un anillo modificado de yemas durante dos aos, con xito muy bajo. Prasad, Rabbani y Ram (1988) lograron un 80% de prendimiento aplicando calor y auxinas a la base de los cortes. Mohamed-Yessen et al. (1995), cultivaron nudos de plntulas de semillas germinadas en medio MS suplementado con bencilaminopurina (BAP) y lograron producir brotes con enraizamiento. Singh et al. (2002) informaron sobre la obtencin de plantas a partir de hipoctilos con una frecuencia muy baja. Recientemente, Manoj et al., (2007) sealan que obtuvieron exitosamente plantas completas mediante embriognesis somtica. En la actualidad, el establecimiento y estandarizacin de protocolos in vitro con tejidos de alta respuesta de regeneracin en especies leosas se considera fundamental para procesos de micropropagacin masiva y para facilitar la tecnologa de transformacin gentica. En varias especies frutales y forestales se han hecho estudios para obtener plantas in vitro por medio de organognesis indirecta (Prez-Tornero et al., 2000) y por embriognesis somtica (Toribio et al., 2004). Investigaciones efectuadas por Loh y Rao, (1989); Amin y Jaiswal (1988); Ramrez y Salazar (1997); Prez-Tornero et al., (2000) indican que la propagacin in vitro de guayaba por brotes adventicios es posible. Como la micropropagacin de Psidium guajava L., a partir de segmentos nodales la cual es una buena opcin para la multiplicacin clonal de plantas sobresalientes (Figura 4).

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Figura 4. Protocolo de regeneracin. A) Segmentos nodales. B) Brotes a los 60 das. C) Plntulas a los 15 das en el medio. D) Plntula regenerada para climatizacin.

2.7-ASPECTOS DE LA NUTRICION RUMINAL El estmago de los rumiantes comprende el retculo, rumen, omaso y abomaso. El contenido del retculo-rumen vara dependiendo del tamao del animal, la naturaleza de la dieta, la tasa de fermentacin y la velocidad de transito de alimento por el rumen (Ranjhan, 1992). Un proceso importante para el mantenimiento del ecosistema ruminal es la rumia, fenmeno que envuelve la regurgitacin del alimento del retculo-rumen, remasticacin, insalivacin y mezclado del bolo (Ruckebush, 1993). Entre los factores que determinan la tasa de pasaje del alimento por el tracto digestivo de los rumiantes se pueden mencionar, la especie animal, calidad y tipo de dieta, gravedad especfica y tamao de las partculas, la concentracin de fibra en detergente neutro (FDN) y la temperatura ambiental (Bartocci et al., 1997).

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Mnica Silva Vega 2.8.-FERMENTACIN RUMINAL El medio ruminal es un ecosistema con caractersticas bien definidas y poco variables, en l habitan numerosas especies microbianas, siendo las bacterias y los protozoos los ms numerosos, los valores de pH fluctan en el rumen, influenciados por distintos factores (por ejemplo la naturaleza de la dieta suministrada); aunque los rumiantes poseen un sistema altamente desarrollado para mantener el pH dentro de los lmites fisiolgicos cuyos valores normales se encuentran entre 5.5 a 7 (Krause y Oetzel, 2006). La optimizacin de la fermentacin ruminal debe centrarse en la formulacin correcta de raciones y en un manejo adecuado de los programas de alimentacin. Sin embargo, cuando estas estrategias ya estn implementadas, es posible obtener beneficios adicionales mediante el uso de aditivos que modulen la fermentacin ruminal.

2.8.1.-METABOLISMO ENERGTICO DEL RUMEN Los hidratos de carbono fermentan en el rumen a glucosa, y la glucosa a piruvato, resultando en la produccin de energa para los microorganismos. Este proceso requiere la cesin de un protn al NAD que se transforma en NADH2. En condiciones normales de funcionamiento, es importante mantener una velocidad de formacin y utilizacin de hidrgenos metablicos equilibrada, reciclando constantemente el NADH2 produciendo NAD para garantizar el funcionamiento constante de la gliclisis. En condiciones fisiolgicas normales, el metano y el propionato, y en menor proporcin el butirato, son utilizadores netos de hidrgenos que permiten el mantenimiento de dicho equilibrio. La retencin de hidrgenos metablicos en los cidos grasos voltiles (AGV) es esencial para la obtencin de energa por parte del animal. En este contexto, la liberacin de hidrgenos al medio o su transferencia al metano son procesos energticamente poco eficientes para el animal, ya que estos gases se pierden a travs de la eruccin. Se ha estimado que las prdidas de metano oscilan entre el 3 y el 15% de la energa ingerida (Van Nevel y Demeyer, 1988). Para optimizar la utilizacin de energa en el rumen es necesario incrementar la retencin de hidrgenos metablicos en los AGV. La eficacia de retencin de energa es mxima para el propionato (109%), intermedia para el butrico (78%) y menor para el acetato (62,5%) (Richardson et al., 1976). Finalmente, el buen funcionamiento de este ecosistema debe controlarse cuidadosamente. Los sistemas 19

Mnica Silva Vega intensivos de alimentacin tienen el riesgo de provocar fermentaciones inestables que conducen a acidosis y meteorismo (Nocek, 1997), lo que se traduce en una reduccin en la ingestin de alimentos y en la produccin. En consecuencia, los aspectos fundamentales que debemos considerar como objetivos de modulacin en la fermentacin microbiana ruminal deberan ser: a. Aumentar la degradacin de la fibra y el almidn, y la produccin de AGV. b. Estimular la produccin de propionato. c. Inhibir la produccin de metano. d. Controlar la concentracin de lactato y el pH ruminal.

2.8.2.-METABOLISMO PROTEICO EN EL RUMEN La degradacin proteica en el rumen es necesaria para aportar N a los microorganismos para su crecimiento y desarrollo (Wallace y Cotta, 1988). Sin embargo, el exceso de degradacin conduce a la acumulacin de N amoniacal que se absorbe, se transforma en urea en el hgado y se pierde por la orina. Esta prdida de N resulta en un aumento en los costos de produccin y en la contaminacin del medio (Tamminga, 1996; Weimer, 1998). La utilizacin ptima del N depende de la velocidad y cantidad de N producido y utilizado por los microorganismos. Los trabajos de investigacin sobre el control de la disponibilidad de N en el rumen se han centrado tradicionalmente en el procesado de los alimentos para reducir su degradacin, en parte porque la manipulacin de la actividad proteoltica del rumen es difcil (Broderick et al., 1991). Sin embargo, la modificacin de la peptidolisis y la desaminacin pueden ser puntos de control igualmente efectivos. Aunque algunas bacterias (Megaesphera elsdenii, Prevotella ruminicola, Selenomonas ruminatum y Bacteroides fibrisolvens) se encuentran en una proporcin elevada en el rumen y tienen una capacidad desaminadora importante (Bladen et al., 1961; Wallace y Cotta, 1988). Russell et al., (1988) identificaron a un pequeo grupo de bacterias que tienen una actividad desaminadora inusualmente elevada (20 veces mayor que las otras bacterias; i.e., Peptostreptococcus y Clostridium spp.), y que aparentemente contribuyen de forma sustancial a la produccin de N amoniacal en el rumen. Estas bacterias utilizan los aminocidos como fuente principal de energa, y liberan el N al medio ruminal. La 20

Mnica Silva Vega inhibicin de este pequeo grupo de bacterias puede permitir controlar la produccin de N amoniacal (Wallace, 1996; Weimer, 1998). De hecho, la monensina tiene la capacidad de inhibir especficamente a este tipo de bacterias. Estas estrategias tienen la ventaja, respecto a la inhibicin de la protelisis, de reducir la produccin de N amoniacal manteniendo la disponibilidad de aminocidos y pptidos para el crecimiento bacteriano, e incrementando el flujo de aminocidos totales al intestino delgado. Los microorganismos, principalmente los amilolticos, no solo tienen la capacidad de utilizar los aminocidos y pptidos cortos, sino que en su presencia dicho crecimiento ocurre con una eficacia mayor (Russell y Sniffen, 1984). Los protozoos tambin juegan un papel importante en la produccin de amonaco, ya que las bacterias son su principal fuente de protena. Por ello, la defaunacin reduce el reciclado de N dentro del rumen y mejora la eficacia de sntesis de protena bacteriana (Williams y Coleman, 1988). Sin embargo, debe considerarse que la reduccin excesiva de la degradacin de la protena puede limitar la disponibilidad de N amoniacal para el crecimiento bacteriano (Broderick et al., 1991).

2.9.- MICROORGANISMOS RUMINALES. El rumen contiene una de las ms densas y variadas poblaciones de microorganismos conocida, la cual mantiene una relacin simbitica con el hospedero. La mayora est compuesta por microorganismos anaerobios estrictos, pero hay una pequea poblacin de bacterias anaerobias facultativas, que toleran pequeas concentraciones de O 2 que pueden utilizar en su metabolismo. La poblacin microbiana del rumen, est constituida por bacterias, hongos y protozoos. El tipo y la proporcin de microorganismos varan en funcin del tipo de alimento (Dor y Gouet, 1991). Las bacterias son los principales agentes que actan en la fermentacin de los carbohidratos estructurales y la protena de las plantas (Stewart, 1991). Los protozoos ciliados son importantes en la digestin de carbohidratos no estructurales, intervienen en el fraccionamiento fsico del alimento y juegan un importante papel como reguladores del pH ruminal (Prins, 1991). Los hongos son los primeros organismos en invadir y digerir el componente estructural de las plantas y tienen una relacin estrecha con las bacterias permitiendo as que estas penetren al

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Mnica Silva Vega compartimiento intracelular y colonicen el material vegetal, iniciando el proceso de degradacin de las fracciones insolubles del alimento (Akin y Borneman, 1990). Estudios realizados en Vietnam por Nguyen van Thu (1999) han mostrado que con adicin de urea y melaza en la dieta se incrementa la poblacin total de protozoos y bacterias ya que estos nutrientes favorecen la sntesis de protena para crecimiento microbiano.

2.10.- ADITIVOS MICROBIANOS O PRBIOTICOS El concepto de probiticos tiene ya ms de un siglo de antigedad y la introduccin del trmino se atribuye a Fuller (1989), aunque se ha visto sometido a mltiples definiciones, ms o menos completas. Tal vez la definicin ms adecuada sea la propuesta por Havenaar y Huisin t Veld (1992), segn la cual los probiticos son: cultivos simples o mezclados de microorganismos vivos que, aplicados a los animales o al hombre, benefician al hospedador mejorando las propiedades de la microflora intestinal original. Van Eyst y Pen Hartog (2003) aaden que deben estar en una dosis suficiente para modificar (por implantacin o colonizacin) la microflora de algn compartimiento del digestivo del hospedador. Existen, de forma genrica, tres tipos principales de aditivos microbianos para rumiantes: Levaduras vivas (Saccharomyces cerevisiae). Cultivos de levaduras (Saccharomyces cerevisiae) sin garanta de su viabilidad: contienen la levadura, el medio de cultivo y sus productos de fermentacin. Extractos del hongo Aspergillus oryzae, que contiene el medio de cultivo y sus productos de fermentacin, pero sin garanta de que las clulas estn vivas. La comparacin de los resultados publicados en revistas cientficas es compleja porque los productos utilizados no son iguales ni tienen los mismos efectos en el metabolismo ruminal. Adems, las dosis se expresan indistintamente en g/da o CFU/da. Por esta razn, no es extrao que los resultados sean variables. Saccharomyces cerevisiae: La adicin de S. cerevisiae resulta frecuentemente en un incremento en el nmero total de bacterias, particularmente las fibrolticas ( F. succinogenes, R. albus), tanto in vitro como in vivo (Dawson et al.., 1990; Carro et al., 1992; Callaway y Martin, 1997; Lila et al., 2004). Tambin se ha observado la estimulacin del crecimiento del hongo Neocallimastix frontalis (Chaucheyras et al., 22

Mnica Silva Vega 1995). Adems, S. cerevisiae parece estimular la utilizacin de lactato por M. elsdenii (Chaucheyras et al., 1996) y S. ruminantium (Callaway y Martin, 1997), resultando en una mayor sntesis de propionato (Plata et al., 1994; Calaway y Martin, 1997; Lila et al., 2004). La reduccin de la concentracin de cido lctico resulta en un incremento en el pH ruminal que favorece el crecimiento de las bacterias fibrolticas, y resulta en un incremento en la digestin de la fibra y en la produccin de AGV (Dawson et al., 1990; Lila et al., 2004; Carro et al., 1992; Doreau y Jouany, 1998; Chaucheyras-Durand y Fonty, 2001). El efecto de S. cerevisiae sobre la concentracin de N amoniacal es muy variable, y se ha observado tanto una reduccin (Carro et al., 1992; Chaucheyras-Durand y Fonty, 2001) como un aumento (Kung et al., 1997). Los efectos de las levaduras sobre la fermentacin ruminal se han explicado mediante dos mecanismos de accin. Las levaduras y sus medios de cultivos pueden contener nutrientes (cidos orgnicos, vitaminas del grupo B, enzimas y aminocidos) que estimulan el crecimiento de bacterias que digieren la celulosa y utilizan el cido lctico (Callaway y Martin, 1997; Nisbet y Martin, 1991). Nisbet y Martin, (1991) sugirieron que el

crecimiento de S. ruminantium aumenta con la suplementacin de un filtrado de cultivo de levaduras, y sugirieron que la presencia de cidos orgnicos podra ser responsable de dichos efectos. Callaway y Martin (1997) tambin justificaron los efectos de S. cerevisiae por la presencia de factores solubles de crecimiento. Este modo de accin sera comn a los cultivos que contienen levaduras vivas y muertas. Sin embargo, tambin hay evidencia de que las levaduras vivas, mediante su actividad de respiracin, consumen el oxgeno residual disponible en el medio ruminal, protegiendo a las bacterias anaerbicas ms estrictas. Newbold et al., (1996) compararon varias cepas de S. cerevisiae y observaron una fuerte correlacin entre la capacidad de las levaduras de consumir oxgeno y el crecimiento bacteriano, lo que les permiti concluir que el efecto de estimulacin de S. cerevisiae sobre las bacterias ruminales poda atribuirse, al menos parcialmente, a su actividad respiratoria. Dawson et al., (1990) tambin observaron que el crecimiento de F. succinogenes in vitro mejoraba en presencia de cepas vivas de S. cerevisiae, mientras que el extracto con clulas muertas no tuvo efectos. Parece ser, adems, que las clulas vivas de S. cerevisiae compiten por la glucosa con S. bovis, reduciendo su disponibilidad y la consecuente 23

Mnica Silva Vega produccin de cido lctico (Chaucheyras-Durand et al., 1996). El impacto de cada uno de estos mecanismos sobre el efecto final de las levaduras y sus cultivos es difcil de evaluar, pero es probable que los diferentes productos disponibles en el mercado hayan seleccionado cepas que manifiestan mayoritariamente uno de estos mecanismos de accin. Yoon y Stern (1995) propusieron un mecanismo de accin para las levaduras y hongos mediante el cual el aumento del pH ruminal y/o la disminucin de la disponibilidad de oxgeno estimulan el aumento del crecimiento de las bacterias celulolticas. Como consecuencia, aumenta la degradabilidad de la fibra, disminuye el llenado ruminal, y aumenta la ingestin de materia seca y la produccin, sin que mejore necesariamente la eficacia de utilizacin de nutrientes. Aspergillus oryzae: Se utiliza comercialmente como un extracto de la fermentacin de este hongo, e incluye el medio y los productos de su fermentacin sin garanta de la viabilidad de las clulas. El mecanismo principal de accin parece relacionarse con su capacidad de estimular la degradabilidad de la fibra en el rumen mediante el estmulo directo del hongo fibroltico Neocalimastix frontalis. Welch et al., (1996) observaron que la suplementacin con A. oryzae in vitro result en un incremento del 27% en la masa celular de N. frontalis. Los hongos ruminales tienen una elevada actividad celuloltica, y su papel en la digestin de la fibra es probablemente estratgica, abriendo vas de degradacin en las paredes celulares, permitiendo el acceso a otras bacterias celulolticas que son las que realizan la mayor parte de la digestin cuantitativa de la fibra. En cualquier caso, el resultado es un incremento en el nmero de bacterias celulolticas y de la digestibilidad de la fibra tanto in vitro como in vivo (Beharka et al., 1991; Beharka y Nagaraja, 1993; Beharka et al., 1998). El aumento en la degradabilidad de la fibra resulta en el aumento en la concentracin de AGV y cambios en el perfil de AGV individuales (Martin y Nisbet, 1990 y 1992; Nisbet y Martin, 1990; Beharka et al., 1991, Beharka y Nagaraja, 1998). Sin embargo, algunos estudios no han observado efectos de la suplementacin de A. oryzae sobre la degradacin ruminal de la fibra y/o la produccin de AGV (Oellermann et al., 1990). Otros estudios han demostrado que A. oryzae estimula la produccin de amoniaco en ms de un 20% (Martin y Nisbet, 1990) e incrementa la degradabilidad de la protena, lo que sugiere que A. oryzae estimula la proteolisis debido al aporte de nutrientes especficos para este tipo de bacterias, a la presencia de enzimas proteolticos en el extracto, o a la mejora del acceso a 24

Mnica Silva Vega las protenas una vez las paredes celulares se han digerido. A. oryzae tambin estimula el crecimiento de las bacterias utilizadoras de cido lctico como Selenomonas ruminantium (Nisbet y Martin, 1990; Beharka y Nagaraja, 1993; Beharka et al., 1998) y Megasphaera elsdenii (Waldrip y Martin, 1993). El mecanismo a travs del cual se produce este estmulo no se conoce bien, pero (Nisbet y Martin 1990) sugirieron que el aporte de cido mlico en los extractos de A. oryzae podran jugar un papel importante. El incremento en el consumo de cido lctico reduce su concentracin e incrementa el pH ruminal, lo que podra explicar, al menos parcialmente, el aumento en el nmero de bacterias celulolticas y la mejora en la degradacin de la fibra (Beharka et al., 1998). Sin embargo, pocos estudios han confirmado un incremento en el pH ruminal como consecuencia de la suplementacin con A. oryzae.

2.11.-PRODUCCIN DE CIDOS GRASOS VOLTILES (AGV) Los cidos Grasos Voltiles (AGV), actico, propinico y butrico, son los productos finales de la fermentacin de la materia orgnica (MO) del alimento que ocurre en el rumen y representan la mayor fuente de energa para los rumiantes, la cual se estima que representa entre un 50 a un 70% de la energa digestible total (Sutton, 1980). La produccin de AGV determina en gran medida la eficiencia en la utilizacin de los alimentos por los rumiantes, ya que est estrechamente relacionada con su digestibilidad (France et al., 1991). Sin embargo es necesario recordar que la produccin y la proporcin de AGV varan en funcin de la dieta, proporcin de carbohidratos solubles y estructurales, relacin forraje concentrado y el tipo de procesamiento fsico al que ha sido sometido el alimento. Kauffman (1976) reporta que altos contenidos de fibra en la racin afectan la relacin de actico: propinico (C2:C3), lo que en trminos prcticos se traduce en una disminucin en el desempeo productivo del animal.

2.11.1.-ACIDOS ORGNICOS Algunos cidos orgnicos (como el asprtico, mlico o fumrico) parecen inducir cambios en el pH ruminal y la produccin de metano y/o AGV de una forma similar a la monensina. Sin embargo, su modo de accin parece ser completamente diferente ya que, 25

Mnica Silva Vega en contraposicin a los antibiticos, parecen estimular, y no inhibir, actividades especficas dentro del metabolismo ruminal (Nisbet y Martin, 1993). Por ejemplo, el crecimiento de S. ruminantium se increment a ms del doble en presencia de 10 mm de L-asprtico, fumrico o L-mlico (Nisbet y Martin, 1990). La utilizacin de lctico increment ms de 4 veces con asprtico y fumrico, y ms de 10 veces con mlico (Nisbet y Martin, 1990). Estas bacterias utilizan el cido lctico como una fuente de energa (Stewart y Bryant, 1988) produciendo propinico como producto final de la fermentacin (Wolin y Miller, 1988). Linehan et al., (1978) sugirieron que el aspartato, el fumrico y el malato estimulaban el crecimiento de S. ruminantium en presencia de lactato debido a que permitan subsanar un dficit de oxalacetato asociado a la neoglucognesis. Adems, los cidos orgnicos pueden actuar como aceptores finales de hidrgeno metablico, reduciendo su disponibilidad para otras funciones metablicas, particularmente la metanognesis. Sin embargo, aunque algunos estudios in vitro han observado una reduccin en la produccin de metano al aadir cidos orgnicos (Asanuma et al., 1999; Lpez et al., 1999; Carro et al., 1999), dicha reduccin ha sido generalmente pequea (317%). La reduccin de la concentracin de cido lctico estabiliza el pH ruminal y la fermentacin ruminal (Martin y Streeter, 1995; Callaway y Martin, 1996; Martin et al., 1999, Montao et al., 1999; Lpez et al., 1999; Carro et al., 1999). Sin embargo, la reduccin en la concentracin de lactato no explica completamente el aumento del pH. Callaway y Martin (1996) y Martin et al., (1999) sugirieron que los cidos orgnicos aumentaban el pH ruminal por un doble mecanismo: la reduccin de la concentracin de lactato, y la produccin de CO2 que tampona el lquido ruminal. La produccin de gas en cultivos in vitro demuestran que en la mayor parte de los casos la adicin de mlico aumenta la produccin total de gas y la degradabilidad de la MS (Martin y Streeter, 1995; Callaway y Martin, (1996), indicando que la fermentabilidad de la racin mejor como resultado del incremento de la poblacin bacteriana o de su actividad. (Newbold et al., 1996) demostraron que la suplementacin con 100 mg/d de mlico en ovejas increment el nmero total de bacterias y la poblacin de celulolticos. (Lpez et

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Mnica Silva Vega al., 1999) observaron que el fumrico aument el nmero de bacterias celulolticas en un sistema RUSITEC. Los datos productivos sobre los efectos de los cidos orgnicos son muy limitados. Cuando la racin es rica en cereales se produce una acumulacin de lactato que pueden alcanzar hasta los 29 mM, y una reduccin del pH ruminal (Nocek, 1997; Counotte et al., 1981). El resultado conduce a la aparicin de problemas ruminales que incluyen la reduccin de la degradabilidad de la fibra, reduccin del trnsito, disminucin de la rumia y salivacin, aparicin de ulceraciones ruminales, acidosis, timpanismo y muerte (Russell y Hino, 1985).

2.11.2.- ABSORCIN DE LOS AGV La velocidad de absorcin de AGV tiene relacin directa con su produccin y relacin inversa con el pH, evitando su acumulacin en el rumen. La absorcin ruminal de AGV por va paracelular es insignificante, y depende de la va transcelular, ingresando a la clula por dos mecanismos diferentes. Uno de ellos es la difusin simple, mecanismo electroneutro y que no utiliza transportador, pero requiere que los AGV se encuentren en su forma no disociada y por lo tanto liposoluble. En su forma disociada el AGV posee carga elctrica negativa, esto produce la atraccin del extremo positivo de las molculas de agua, que se comportan como un bipolo, crendose una capa de hidratacin alrededor del AGV que le quita liposolubilidad y aumenta su dimetro, impidiendo as que pueda atravesar la membrana celular. A pesar de ser evidente que los AGV se absorben en parte en su forma no disociada, al pH normal del rumen este proceso es difcil de explicar debido al concepto de pK. El pK indica el valor de pH en el cual un compuesto est 50 % disociado y 50 % no disociado. El pK de los AGV ms producidos en el rumen es de aproximadamente 4,6. Al pH normal del rumen, nunca inferior a 5,5 la inmensa mayora de los AGV estn en su forma disociada y por lo tanto no podran ser absorbidos por difusin. Para posibilitar su absorcin, el pH debe descender sobre la superficie de las
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clulas del epitelio ruminal. Para ello las clulas epiteliales secretan hidrogeniones (H ),
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los cuales obtiene a partir de combinar CO y agua para formar bicarbonato y el H que
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Mnica Silva Vega

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ser contratransportado por Na . El otro mecanismo de absorcin de los AGV es ms

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directo y no requiere del bombeo de H , sino de un contratransportador que ingresa el

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AGV intercambindolo con bicarbonato (CO H ) en la superficie apical. De esta forma

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este mecanismo complementa el aporte de CO H que realiza la saliva (Realling y Mattioli

3

2002).

2.12.-SNTESIS DE PROTENA MICROBIANA Y PRODUCCIN DE AMONIO. En el rumen, las protenas son degradadas hasta pptidos, aminocidos y amonio, que son las fuentes de nitrgeno utilizadas por los microorganismos para la sntesis de la protena microbiana. Una parte de la protena de la dieta es degradada por los microorganismos, y otra fraccin pasa intacta por el rumen y sufre un proceso de digestin qumica en el tracto digestivo posterior antes de ser absorbida en el intestino delgado junto con los aminocidos provenientes de la protena microbiana. El amonio presente en el rumen es absorbido a travs de las paredes ruminales llevado a sangre y convertido en urea en el hgado. La urea sintetizada en el hgado tiene diferentes destinos, una buena parte puede ser excretada en la orina, otra parte es reciclada y regresa al rumen por la saliva o es infundida a travs de la pared ruminal (Preston y Leng, 1989). La concentracin ideal de amonio (NH3) en el rumen varia de 5 a 25 mg/100 ml de lquido ruminal (Preston y Leng, 1989). Satter y Slyter (1974) sugieren que la eficiencia microbiana mxima ocurre cuando la concentracin de NH3 ruminal se encuentra entre 5 y 8 mg/100 ml de lquido ruminal. Segn Coelho y Leo (1979), el nivel ptimo de amonio en el rumen depender de la cantidad de energa disponible.

2.13.-COMPOSICIN DE LA FIBRA Los hidratos de carbono fibrosos constituyen la fibra vegetal. Desde el punto de vista qumico, la fibra es un agregado de componentes que no constituyen una entidad propia, y que se compone de un entramado tridimensional de celulosa, hemicelulosa y lignina, pero 28

Mnica Silva Vega frecuentemente se le asocian minerales y otros componentes. En la mayora de los sistemas de alimentacin, la fibra se define con los siguientes parmetros (Van Soest, 1982) a.- Fibra bruta: Consiste en el residuo insoluble despus de una incubacin en una solucin cida, seguida por una alcalina. El residuo contiene celulosa, pero est contaminada con cantidades variables de hemicelulosa, lignina y compuestos nitrogenados. La magnitud de la contaminacin de la FB depende mucho del tipo de vegetal y de su estado de desarrollo fisiolgico, lo que conduce a errores que dificultan su interpretacin, por lo que el uso de la FB en los sistemas actuales debe ser limitado (Van Soest, 1982). b.- Fibra neutro detergente (FND): Es el material insoluble en una solucin detergente neutra, y se compone de celulosa, hemicelulosa y lignina. Adems, existen otras componentes minoritarias como residuos de almidn, cenizas y nitrgeno. Las recomendaciones recientes de (Van Soest et al., 1991) para la determinacin de FND sugieren la utilizacin de amilasas termoestables especficas (libres de actividad hemicelulasa, proteasa o glucanasa), especialmente en concentrados o ensilados de maz, y la correccin por el contenido en cenizas. c.- Fibra cido detergente (FAD): Es el material insoluble en una solucin detergente cida, y est constituida fundamentalmente por celulosa y lignina, aunque suelen existir otros componentes minoritarios como nitrgeno y/o minerales. Como en el caso de la FND, (Van Soest et al., 1991) sugieren la correccin por el contenido en nitrgeno y cenizas. La diferencia entre FND y FAD consiste fundamentalmente en hemicelulosa. Es necesario apuntar que la determinacin secuencial de FAD y lignina permite un clculo ms preciso del contenido de celulosa y hemicelulosa, pero el mtodo no secuencial es ms adecuado para la determinacin de cenizas cidas insolubles, taninos y nitrgeno insoluble en FAD.

2.14.1.- DEGRADABILIDAD DE LA FIBRA. La fibra es la estructura que da fuerza y rigidez a las plantas y es el componente principal de los forrajes. Los carbohidratos estructurales (celulosa y hemicelulosas) se encuentran 29

Mnica Silva Vega encerrados en las paredes de la clula y la lignificacin de estos disminuye su utilizacin como fuente de energa para rumiantes (Jung y Allen, 1995). Resende et al., (1995) encontraron que la fibra detergente neutra (FDN) es el mejor indicador para estimar el potencial de consumo de los alimentos por los rumiantes que la fibra bruta (FB) o que la fibra detergente cida (FDA).
La fibra, como nutriente, contribuye al mantenimiento del funcionamiento ruminal (llenado ruminal y estmulo de las contracciones ruminales) y de las condiciones ruminales (pH, a travs de la secrecin salivar dependiente de la masticacin y la rumia; (Nocek, 1994). Estas dos funciones dependen de la composicin, la degradabilidad y la forma de presentacin de la fibra. Por otro lado, la fibra supone un inconveniente, en el sentido que limita el contenido energtico de las raciones (baja digestibilidad) y el potencial de ingestin (Mertens, 1987). La formulacin correcta de raciones debe buscar el equilibrio entre la ingestin mxima de materia seca (niveles bajos de FND) y el mantenimiento de las funciones y condiciones normales del rumen (aportando unos niveles mnimos de FND y FAD).

2.15.- EXTRACTOS DE PLANTAS Los extractos de plantas son metabolitos secundarios que pueden aportar alternativas al uso de antibiticos en la alimentacin animal. Muchos de estos extractos tienen la capacidad de modificar la actividad microbiana, pero la evidencia cientfica sobre sus efectos en la fermentacin ruminal es limitada. La actividad antimicrobiana de los extractos de plantas se atribuye al contenido de una serie de metabolitos secundarios que incluyen, entre otros, a las saponinas, taninos y aceites esenciales (principalmente terpenoides y fenilpropanoides). Sin embargo, la diversidad en su naturaleza y actividades hace que el mundo de los extractos de plantas sea extremadamente complejo. Bajo la definicin de extractos de plantas hay muchos con efectos interesantes, sin efectos, e incluso con efectos negativos (Cardozo et al., 2005; Busquet et al., 2004; Castillejos et al., 2005).

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Mnica Silva Vega 2.16.- DIGESTIBILIDAD DE NUTRIENTES. La digestibilidad se conoce como la aptitud de un alimento para ser digerido por una determinada especie animal, siendo este parmetro de gran importancia en la formulacin de dietas (NRC, 2001). Si un determinado grupo gentico aprovecha mejor los nutrientes de una dieta, se puede decir que este grupo tendr un mejor desempeo productivo (Cruz et al., 2001). La digestibilidad de los alimentos est determinada por la estructura de la pared celular, principalmente por el contenido de lignina que est presente (Jung y Allen, 1995).

2.17.- PRINCIPALES TRANSTORNOS GSTRICOS EN LOS RUMIANTES. De las enfermedades metablicas en los rumiantes, las que afectan a los primeros divertculos del aparato gastrointestinal o sector gstrico anterior (retculo rumen) son las que mayor importancia econmica tienen (Stock et al., 1990). Las indigestiones primarias se pueden dividir bsicamente en cinco grupos, las indigestiones debidas inicialmente a modificaciones bioqumicas del contenido, son las que se deben considerarse como las primordiales y especialmente el sndrome acidtico. Las otras causas son ms bien consecuencias de este sndrome. As las causas que actan bien sea sobre la pared (por ejemplo la paraqueratosis), o la motilidad, no van dirigidas a estas estructuras en concreto, y podran afectar a otras formaciones epiteliales con que se encontraran como por ejemplo el epitelio omasal.

2.17.1.- ALCALOSIS. El contenido ruminal puede llegar al punto de la neutralidad en los periodos ms alejados la saliva (superior a 8) aunque a esto no lo podemos considerar como una alcalosis. La denominacin de alcalosis ruminal debe quedar reservada a aquellos estados patolgicos en los cuales hay una alcalinizacin del contenido ruminal debida a un aumento de la concentracin amoniacal. Bajo condiciones naturales cabe esperar un aumento del amoniaco como consecuencia del suministro de dietas ricas en protena. Este estado slo se observa en la intoxicacin con urea, en la cual se liberan bruscamente cantidades extremadamente altas de amoniaco. En algunos momentos las praderas jvenes muy ricas 31

Mnica Silva Vega en nitritos pueden llegar a causar sntomas de alcalosis como prdida del apetito, disminucin de la rumia, timpanismos y episodios nerviosos como calambres (Contreras y Noro, 2009).

2.17.2.-ACIDOSIS. El uso de raciones con elevados contenidos de cereales provoca meteorismos agudos, crnicos, paraqueratosis ruminal, poliencefalomalacia, laminitis, abscesos hepticos, etc., todos ellos problemas derivados de la bajada de pH del retculo-rumen. Aunque est generalmente aceptado que es la reduccin de la ingestin el problema ms importante relacionado con la acidosis (Britton y Stock, 1987). Como definicin podramos decir que la acidosis es un desarreglo bioqumico y fisiolgico, causado por la rpida produccin y absorcin de cidos orgnicos y endotoxinas cuando los animales consumen dietas muy altas en concentrados que contengan elevadas dosis de carbohidratos de fcil fermentacin. Los fenmenos de acidosis pueden ser agudos (pH inferior a 5.5) y latentes o subclnicos (pH inferior a 6.25); y sus principales consecuencias son: Interaccin negativa en la digestin: se altera la digestibilidad de la fibra y disminuye el valor energtico de los alimentos. Una disminucin en la calidad de los productos finales: alteracin de la coloracin de la carne, deterioro de las vsceras y abscesos hepticos.

Las acidosis subclnicas provocan o son el resultado de una irregularidad en la ingestin, alternndose das de ingesta muy alta con periodos muy largos en los que los animales prcticamente no consumen nada. Hay un considerable aumento de ingestin de agua y esto puede llegar a provocar parlisis ruminal y encharcamientos. Factores como el calor, el fro, el exceso de barro modifican los patrones de ingestin. Como ejemplo antes de las tormentas hay un incremento brusco de ingesta (Stock y Britton, 1994) y esto a su vez modifica el pH ruminal.

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Mnica Silva Vega 2.18.-FACTORES FSICOS QUE MODIFICAN EL pH RUMINAL. La reduccin del tamao de la partcula de los alimentos aumenta la superficie de contacto del ingrediente ayudando a la fijacin y el ataque de la masa microbiana. Por otro lado, existe una mayor ruptura de las clulas vegetales y por lo tanto mayor acceso con los contenidos celulares. El resultado de todo esto es la aceleracin de los procesos fermentativos. En consecuencia el pH ruminal baja marcadamente. (Sauvant et al. 1999) encontraron que en la prctica la relacin entre el pH y el tamao de la partcula tienen una relacin lineal y cuadrtica, es decir que al aumentar el tamao de partcula se incrementa el pH hasta un punto pero al seguir aumentando el tamao ya no tiene ningn efecto.

2.18.1.-NIVEL Y DINMICA DE LA INGESTIN. Independientemente de la composicin y de la presentacin de la dieta, el aumento de la tasa de ingesta sistemticamente reduce el pH ruminal, estimndose esta reduccin en 0.14 0.04 puntos de pH por cada 10 g de materia seca ingerida (Sauvant et al., 1999). Esto es debido a que al aumentar la tasa de ingestin se incrementa la velocidad de degradacin (Gonzlez et al., 1987). Estos resultados se explican porque el contenido celular es proporcionalmente ms importante que las estructuras parietales en el aumento de la ingesta y adems el incremento de la velocidad de trnsito de las partculas a travs del rumen disminuye la degradacin de las partes fibrosas y por lo tanto reduce su capacidad tampn. La dinmica de la ingestin se mide en funcin de la velocidad que tiene un animal en consumir una determinada cantidad de alimento. En condiciones de alimentacin normal el nivel y la velocidad de ingestin estn relacionados positivamente. Trabajando con pH entre 6 y 6.5 se encontr una reduccin del pH de 0.04 puntos al aumentar la velocidad de ingesta (10 g MS/min) para terneros (Bragg et al., 1986). Esta misma tendencia tambin se ha confirmado para los ovinos y caprinos. Por otra parte, aumentos puntuales de la velocidad de ingestin se dan en los momentos de estrs como puede ser antes de una tormenta, despus de un periodo largo sin tener acceso al pienso o despus y durante un proceso patolgico. 33

Mnica Silva Vega

2.18.2.-NEUTRALIZACIN DE LA ACIDOSIS. Neutralizacin natural Uno de los procesos naturales bsicos y ms interesantes en la regulacin del flujo de protones, es la incorporacin de las partculas de alimento al interior de las clulas microbianas especialmente en los protozoos. Este fenmeno es muy importante para el almidn (Jouany y Thivend, 1972) y retarda de 7 a 10 horas la fermentacin del almidn almacenado de esta manera. Los procesos de absorcin constituyen la principal fuente de salida de AGV y con ello de protones, por hora del rumen (70-80% del flujo de salida). Este flujo de absorcin es pH dependiente en cuanto hay una mayor presencia de AGV el pH disminuye y la velocidad de salida aumenta, puesto que la velocidad de absorcin es mayor cuando estos compuestos estn en forma de cidos. Este fenmeno que es muy conocido fue cuantificado (Dijkstra et al. 1993). El actico pasa rpidamente al organismo sin sufrir ningn cambio y es utilizado directamente como aporte energtico. El propinico es convertido en lctico y succnico. Este ltimo puede entrar directamente en el ciclo de Krebs para la obtencin de energa o puede utilizarse como precursor de la glucosa. El butrico es metabolizado en la pared ruminal hasta -hidroxibutrico, siendo esta va cetognica (Booth y McDonald, 1988). Durante la acidosis el flujo sanguneo hacia el tracto gastrointestinal disminuye, con lo cual la absorcin de los AGV se reduce tambin. Esto aumenta la posibilidad de dao epitelial lo que a su vez reduce an ms la capacidad de absorcin. La adaptacin estequiomtrica de la fermentacin es otra forma natural por la cual se reduce el pH. Este disminuye al aumentar la presencia de protones en el contenido ruminal y las cadenas carbonadas que se forman a partir de H+ y C son relativamente cortas (butrico C4, propinico y especialmente el actico C2) es una relacin H+/C poco efectiva. Sin embargo este fenmeno es permanente y ms activo en las raciones fcilmente fermentables produciendo cantidades grandes de AGV. Cuando hay un aumento de protones como compensacin El Sitio de la Produccin Animal se forma cido lctico, esto reduce los protones circulantes aunque no contribuye al aumento de pH (Archimede et al., 1997). 34

Mnica Silva Vega Capacidad tampn de la dieta Los alimentos poseen su propia capacidad tampn que depende fundamentalmente del contenido en carbonatos y fosfatos, de su capacidad de intercambio inico y del contenido y degradabilidad de su protena. El reciclado fisiolgico tambin representa una fuente importante de sustancias tampones.

2.19.- RESPUESTAS DEL pH EN EL RUMEN A LA COMBINACIN DE LAS CARACTERSTICAS FSICAS Y QUMICAS. La respuesta del pH respecto del nivel de fibra neutro detergente (FND) define una ecuacin lineal y cuadrtica. Esto nos indica que a partir de niveles del 35% de FND no existe un aumento de pH ruminal, por lo tanto los valores se deben situar entre un 30 y un 40% de la racin total y si es de fibra cido detergente valores comprendidos entre 1525%. El almidn debe situarse entre el 20% y el 35% (Sauvant et al., 1999). Erdman (1988) estim que por cada unidad porcentual de fibra cido detergente de la dieta el pH aumentaba 0.056 unidades. Sin embargo el tiempo empleado en la masticacin y rumia no slo depende de la fibra tambin de la presentacin y adems no toda la fibra tiene el mismo poder de provocar la rumia. Por eso se ha desarrollado el concepto de fibra efectiva. Este concepto, aunque muy til como idea terica, para el cebo intensivo de rumiantes tiene poca aplicacin. El tamao de partcula es el factor fsico ms importante en el control del pH. El tamao que tienen que alcanzar las partculas para seguir hacia las porciones posteriores del tracto gastrointestinal es de 1 mm en los ovinos y de 2 a 3 mm en los bovinos, esto hace que mientras ms grande sea la partcula ms se mastica y ms insalivacin existe. Las partculas superiores a 2 mm deben de suponer el 40% del total de la dieta. La integracin de los parmetros fsicos y qumicos es una de las mejores soluciones para tratar de disminuir los problemas de acidosis. Un mtodo es utilizar un mnimo de FND del 20% procedente de los forrajes (NRC, 2001). Otro mtodo ms emprico aunque tambin de buenos resultados es la relacin forraje-concentrado, si bien las recomendaciones son muy variables dependiendo del autor. Una buena regla es un mnimo de una parte de FND por 2 de almidn como mximo y si necesitamos aumentar el 35

Mnica Silva Vega almidn, es conveniente la incorporacin de una sustancia tampn por ejemplo bicarbonato o una sustancia alcalinizante como el xido de magnesio.

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Mnica Silva Vega

III-MATERIALES Y MTODOS
3.1.- LOCALIZACIN El presente trabajo se realiz en el departamento de Biotecnologa de la Unidad Acadmica de Biologa Experimental, ubicada en el kilmetro 5 de la Calzada Revolucin Mexicana en la Colonia Tierra y Libertad del municipio de Guadalupe Zacatecas y en la Unidad Acadmica de Medicina Veterinaria y Zootecnia ubicada en el Cordovel del municipio de Enrique Estrada, Localizada en el Km 31.5 de la carretera panamericana tramo Zacatecas-Fresnillo a 22 57 02 de latitud norte y 102 42 10 de latitud oeste, a una altitud de 2.153 msnm. El clima en el estado de Zacatecas es seco, con una temperatura media anual de 16 C y una precipitacin pluvial media de 510 mm. Las variaciones extremas en la temperatura y precipitacin son: 35 C mxima y 6 C mnima; 910 mm mxima y 324 mm mnima, respectivamente (INEGI, 2011).

3.2.- MATERIAL BIOLGICO UTILIZADO En este estudio se utiliz harina de semilla y germinado, guayaba para el anlisis bromatolgico y liquido ruminal para las pruebas de digestibilidad.

3.3.- PARAMETROS DETERMINADOS 3.3.1.- CONTEO DE LA SEMILLA Se separaron guayabas con distintos estados de maduracin, a las cuales se les separaron las semillas de la pulpa una por una, las semillas se pusieron a secar sobre papel, cuidando mantener separadas las semillas de cada guayaba de forma individual; una vez secas.se realiz en conteo de forma manual, anotando estado de maduracin de la fruta y cantidad de semillas.

3.3.2.- GERMINACIN DE LA SEMILLA Se germin en recipientes de plstico con capacidad de 1 litro con ayuda de servilletas de papel y gasas para ayudar a mantener la humedad en las semillas. A dos de estos recipientes se les agregaron 100 semillas exactamente.

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Mnica Silva Vega Una vez concluida la germinacin se sacaron algunas plntulas y se des determino el largo. Se continuo la germinacin colocando placas para germinacin con sustrato inerte de la marca LAMBERT LM , en donde se sembraron 5 semillas por pozo a aproximadamente 5 mm de profundidad las cuales fueron regadas todos los das hasta que la germinacin sea completa. Los anlisis fsico-qumicos se realizaron por duplicado siguiendo los mtodos oficiales (AOAC, 1990).

3.4.- ANLISIS PROXIMAL 3.4.1-DETERMINACIN DE CENIZAS Las cenizas obtenidas no tienen necesariamente la misma composicin que la materia mineral presente en el material original, ya que se puede originar perdidas por volatilizacin o alguna interaccin entre los constituyentes. El valor de las cenizas puede considerarse como una medida general de calidad y a menudo es un criterio til para determinar la identidad del alimento. Cuando hay un alto contenido de cenizas se sugiere la presencia de un adulterante inorgnico, a menudo es aconsejable adems, la determinacin de las cenizas insolubles en cidos. Base de la determinacin de cenizas totales: Las cenizas de los productos alimentarios estn constituidas por el residuo inorgnico que queda despus de que la materia orgnica se ha calcinado. Las cenizas se obtuvieron por incineracin y se determinaron por mtodos gravimtricos; para ello se utiliz el germinado y/o harina de semilla de guayaba seco de la determinacin de humedad y se colocaron en la mufla a 550 C durante 2 horas, se enfriaron en un desecador hasta temperatura ambiente y se pesaron de nuevo para calcular por diferencia gravimtrica las cenizas resultantes de la incineracin.

3.4.2.- DETERMINACIN DE EXTRACTO ETREO El extracto etreo (EE) hace referencia a un grupo de compuestos lipdicos que son insolubles en agua pero solubles en ter, cloroformo o benceno (Maynard et al 1979). El EE en los forrajes est compuesto fundamentalmente por triacilglicridos en las semillas y 38

Mnica Silva Vega galactolpidos y fosfolpidos en las hojas (Van Soest 1994). El mtodo oficial utiliza ter dietlico para disolver todos los compuestos liposolubles presentes en la muestra (AOAC 1995). Previamente tanto la muestra colocada en el dedal como los beakers, deben ser puestos a secar a 100oC durante al menos 5 horas y 1 hora, respectivamente. Posteriormente, se adiciona el ter, se instalan los beakers y los dedales con las muestras en el extractor, el cual se activa y se deja en funcionamiento durante cerca de 16 horas trabajando a una tasa de extraccin de 2 a 3 gotas por segundo. Posteriormente el ter es evaporado y al residuo resultante se le denomina el extracto etreo. Un limitante de esta tcnica es que adems de extraes cidos grasos, tambin incluye compuestos que se disuelven en ter pero tienen baja digestibilidad como son las ceras y los aceites esenciales (Galyean 1997). Esta es la razn por la que Weiss et al., (1992) calculan la digestibilidad de las grasas no a partir del contenido de EE si no a partir del contenido de cidos grasos (AG) (AG = EE 1).

3.4.3.- FIBRA CRUDA El papel de la fibra indigerible o alimento o forraje indigesto en la dieta en el mantenimiento de la salud es aun ahora considerado tan importante nutricionalmente como los niveles de nutrimentos absorbibles en los alimentos. Los mtodos empricos para determinar el contenido en la fibra cruda son de uso limitado porque los resultados pueden representar tan poco como un sptimo de la fibra diettica total de los criterios de alimentos. La fibra diettica puede ser definida como constituida por todos los componentes de los alimentos que no son rotos por la enzimas de conducto alimentario humano para formar compuestos de masa molecular menor, capaces de ser absorbidos al torrente sanguneo. Estos incluyen Hemicelulasas, sustancias pcticas, gomas, mucilagos, celulosa, lignina y polisacridos tecnolgicamente modificados tales como la carboximetilcelulosa. Debe hacerse notar que algunas de estas sustancias no tienen estructura fibrosa y son solubles (Owen, 1997). 3.4.4- FDA y FDN Este mtodo descrito por Goering y Van Soest (1970) se basa en la capacidad que tienen los detergentes para solubilizar protenas y evitar la interferencia en el aislamiento de la fibra. El anlisis se realiza mediante dos extracciones la primera con detergente neutro, la 39

Mnica Silva Vega determinacin con fibra soluble o total (FDN); mientras que la segunda con detergente cido, asla la lignina, la hemicelulosa insoluble y otros componentes indigeribles (FDA) mediante la solubilizacin de la hemicelulosa y la protena de la pared celular. Una de las limitaciones de este mtodo es que la extraccin con detergente neutro no es hidroltica por lo que recobra la matriz insoluble de la matriz insoluble de la pared celular de la planta (celulosa, hemicelulosa y lignina) as como protena y nitrgeno fijado a la pared celular, las pectinas (componente de la pared celular) son extradas lo que anudado a su alta disponibilidad es evidencia a la ausencia de enlaces covalentes con la matriz lignificada; otros componentes de la pared celular que se extraen parcialmente por la DN son la slice y algunos taninos. Entre las sustancias contaminantes de la FDN (que no son parte de la pared celular) se encuentran el almidn, sustancias queratinizadas, minerales del suelo, protenas afectadas por la reaccin de Millard y los que han sido precipitados con taninos (Van Soest 1982). La contaminacin con almidn puede eliminarse mediante el tratamiento simultneo con amilasa.

3.4.5.- DETERMINACIN DE PROTENA Se determin en el equipo LECO el cual se basa en el mtodo de Dumas el cual est basado en la conversin de los gases de combustin. La liberacin de Nitrgeno se lleva a cabo mediante pirolisis en una cmara de combustin, el nitrgeno es transportado con la ayuda de un gas hacia un detector en donde se realiza la medicin. El equipo FP-528 consta de una cmara de oxgeno donde se lleva a cabo la combustin a una temperatura de 850C, una celda de termoconductividad y un microprocesador para llevar a cabo los clculos y controlar los parmetros operativos. Los gases requeridos para su operacin son Oxgeno (para la cmara de combustin) aire comprimido (control de presin neumtica) y Helio (gas de transporte). El tiempo de anlisis para una muestra es de aproximadamente 3 minutos y los resultados se expresan como % de protena (de acuerdo al factor de conversin).

3.4.6.- DIGESTIBILIDAD Y DETERMINACIN DE MATERIA SECA La materia seca (MS) es el anlisis ms simple que se puede realizar sobre un forraje y se cuantifica como el residuo que queda luego de extraer el agua a la muestra. Aunque no es 40

Mnica Silva Vega un anlisis qumico en s, es necesario para una adecuada caracterizacin de los componentes nutricionales de los forrajes ya que estos deben expresarse en base a la MS para hacer comparaciones vlidas y realizar el balance de nutrientes (Cherney 2000). La correcta prediccin de la digestibilidad de la materia seca (DMS) es clave para obtener una apropiada estimacin del valor nutritivo de los alimentos. La DMS suele estimarse aplicando ecuaciones basadas en la composicin qumica del alimento, o bien medirse a travs de mtodos in vitro (iv DMS) (Martnez et al., 2011)

3.4.7- MTODO DE DEGRADABILIDAD IN VITRO POR PRODUCCIN DE GAS La tcnica de produccin de gas in vitro genera datos de cintica de digestin, pero midiendo la fermentacin del alimento en lugar de su desaparicin. Esta fermentacin se mide a travs de la produccin de gases, principalmente metano, dixido de carbono e hidrogeno (Van Soest, 1994). Una ventaja de estos sistemas es que tienen en cuenta los componentes solubles de los alimentos, que desaparecen y son considerados como degradados en los mtodos in situ (Pell et al., 1993). Este mtodo es menos dependiente de animales fistulados y pueden ser automatizados y as reducir su laboriosidad. Estos mtodos automticos son caros y por lo general no pueden albergar a muchas muestras simultneamente. Por el contrario, los mtodos manuales o semi-automatizados son ms intensivos en cuanto a trabajo pero pueden evaluar gran nmero de muestras al mismo tiempo. Existe controversia entre los cientficos sobre aspectos de la tcnica y sus verdaderos alcances (Mauricio et al., 1999). Quizs el principal error que se comete cuando se usa la tcnica de produccin de gas in vitro es la asuncin que la produccin de gas es directamente proporcional a la digestin del sustrato y entonces de su valor nutritivo. Esto no es adecuado porque la produccin de gas es dependiente de la composicin del sustrato, las poblaciones microbianas y la utilizacin de monosacridos para crecimiento bacteriano (Pell et al., 1993). Se ha reportado que los alimentos ricos en precursores de cido propinico (ricos en almidn) producen menos gas que aquellos ricos en precursores de los cidos actico y butrico (Williams, 2000). La presencia de amoniaco en forrajes ricos en protena puede

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Mnica Silva Vega hacer decrecer la produccin de gas por una reaccin con los cidos grasos voltiles (Schofield, 2000). Como consecuencia de esto, la produccin de gas in vitro provee poca informacin aparte de la estimacin de las tasas de fermentacin, lo que sugiere que los datos obtenidos deberan ser complementados con datos de degradacin de los sustratos, perfil de cidos grasos voltiles y crecimiento bacteriano (Menke, et al., 1988). El mtodo de fluido ruminal y pepsina es de los mtodos in vitro es de los mtodos ms populares en nuestros das, debido principalmente a su precisin para predecir la digestibilidad in vivo de algunos forrajes es un buen ejemplo de un enfoque sistemtico a la prediccin de la digestibilidad de los alimentos para rumiantes (Beever et al., 2000). Esta tcnica tiene alguna desventaja requiere de la disponibilidad de animales fistulados en rumen como donantes de fluido ruminal. Una opcin para sobrellevar este problema son el uso de heces como proveedores de enzimas microbianas (Omed et al., 2000) y preparados de enzimas puras (Jones et al., 2000). Otro de los problemas de esta tcnica es la variabilidad en la calidad del fluido ruminal, lo que est relacionado con el tipo de procesado al que se somete, tipo y dieta del animal donante, momento de recoleccin, condiciones de anaerobiosis, pH y temperatura, etc. Sin embargo, estos problemas seran comunes a todas las tcnicas que utilizan fluido ruminal. Una opcin para compensar esto sera la inclusin de alimentos estndares en cada corrida (Tiller et al., 1963). Este ltimo punto es importante porque dos alimentos pueden tener la misma degradabilidad ruminal despus de 48, 72 o 96 horas de incubacin, pero la velocidad de degradacin de las muestras puede haber sido completamente diferente. El hecho de que un alimento sea fermentado o degradado en rumen ms rpido que otro debera conducir a un aumento en la tasa de pasaje de ese alimento, lo que redundara en un aumento en el consumo voluntario del mismo (Anzola, et al., 1981).

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Mnica Silva Vega

3.4.8.-DETERMINACIN DE CIDOS GRASOS VOLTILES (AGV) Los cidos grasos voltiles libres de cadena corta, es decir los cidos carboxlicos de 2 a 5 carbonos, son productos intermedios de la degradacin anaerobia de materia orgnica y corresponden al producto de la etapa acidognica (Bastone et al., 2002). Adems el 15% del metano producido durante la fermentacin metablica de las macromolculas orgnicas provienen de los AGV. Estos se miden indirectamente a travs del anlisis de alcalinidad y han sido sealados como un parmetro de control de reactores (Lema et al., 1988) La determinacin cuantitativa directa de AGV mas comn, es por cromatografa gaseosa por un detector de ionizacin de flama (Ewuaschuk et al., 2002)

3.5.- DISEO Y ANALISIS ESTADSTICO Los datos se analizaran mediante un anlisis de varianza en un diseo completamente al azar y prueba de medias Tukey, utilizando el paquete estadstico SAS (SAS, 2004). El anlisis para una distribucin completamente al azar asume lo siguiente:

X ij

ij

Donde: = media general alrededor de la cual oscilan los valores de todas las observaciones. = Efecto del tratamiento i = error experimental, variacin debida al azar o variacin de muestreo y se considera N (0 y 2).

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Mnica Silva Vega

IV.- RESULTADOS
4.1.- PORCENTAJE DE GERMINACIN, CONTEO Y PESO DE LAS SEMILLAS DE GUAYABA EN DIFERENTES ESTADOS DE MADURACIN. En los conteos y pesos de la semilla de las guayabas en diferentes estados de maduracin verde, en ptimo estado de maduracin y post-madura (Figura 5) y en la tabla 1 se observan la media del peso y de la cantidad de semillas de cada guayaba en sus diferentes estados de maduracin.

Figura 5. Estados de maduracin del fruto de guayaba.

Tabla 1. Promedio de los pesos y cantidades de semilla de Guayabas en sus estados de maduracin. ESTADO DE MADURACIN VERDE MADURO POST MADURO PESO (gr) 5.1080a 4.7340ab 3.8090b CANTIDAD DE SEMILLAS (Unidades) 316.50a 306.50a 292.30a

Columna con diferentes literales indican diferencias significativas (P=0.0520). 44

Mnica Silva Vega Con respecto al peso de las semillas no se encontraron diferencias significativas en las guayabas verdes y maduras no obstante en las guayabas post maduras en las que si se encontraron diferencias. (P=0.0520)

Con respecto a la germinacin de las semillas resulto en un 92%, la semilla en un tiempo de 5 semanas como se muestra en la figura 6. Por otro lado, las plntulas productos de la germinacin tuvieron como altura mxima 5.7 cm a las 5 semanas de iniciar la germinacin.

Figura 6. Germinacin de las semillas de guayaba.

4.2.-ANLISIS BROMATOLGICO DE GERMINADO Y HARINA DE SEMILLA DE GUAYABA. Los resultados obtenidos del anlisis bromatolgico realizado al germinado y a la harina de semilla de guayaba se describen a continuacin en la tabla 2. Se observa que el % de cenizas fue mayor en el germinado de guayaba con un 0.421 % que en la harina de semilla (P=0.0289), igualmente en humedad resulto mayor en el germinado con una diferencia del 83% (P=0.0005), en grasa la encontramos mayor un 23% en harina de semilla que en el germinado (P=0.0231) para fibra cruda fue mayor en el germinado con un 58% 45

Mnica Silva Vega (P=0.0014), en la determinacin de la FDN resulto mayor en la harina de semilla con una diferencia de 50.8% (P=0.0004) y en protena cruda fue mayor un 21.7% en el germinado que en la harina de semilla (P=0.0006).

Tabla 2. Resultado del Anlisis Bromatolgico de la Semilla y Germinado de Guayaba.

% Cenizas Germinado de Guayaba Harina semilla Guayaba
ab
a

% Grasa
a a

% F.C.
a

% FND
a

% FAD

% Protena
a

1.517

17.300

99.463

43.162

36.898

30.496

de de
b

1.096

40.576

41.331

94.025

36.7383

8.788

= Columnas con diferentes literales mostraron diferencias significativas estadsticamente (P>0.05).

4.3.-CINTICA DE DEGRADABILIDAD POR PRODUCCIN DE GAS IN VITRO.

cidos grasos voltiles cuantificados a un tiempo de 48 hrs, resultando mayor la produccin de cido Butrico en el germinado de Guayaba con una diferencia de 0.5475 g/L con respecto a la harina de semilla (P=0.0320) y mayor produccin con respecto al cido Actico y Propinico.

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Mnica Silva Vega Tabla 3. Resultados obtenidos de la digestibilidad de Harina de semilla y Germinado de Guayaba. cido Actico (mmol/L) Harina de Semilla
a

cido Propinico (mmol/L)

a

cido Butrico (mmol/L)

a

% Materia seca
39.920a

pH

21.58

7.94

44.90

7.2

Germinado 35.390b a a b de Guayaba 25.240 11.26 55.8 7.1 ab = Columnas con diferentes literales mostraron diferencias significativas estadsticamente (P>0.05)

En la figura 7 se muestra la digestibilidad in vitro de Harina de semilla y Germinado de Guayaba destacando una mayor produccin de gas en el Germinado con 6.8 atm de presin que en la harina de semilla con 5.5 atm de presin a las 48 horas.

Figura 7. Produccin de gas in vitro a las 48 horas de incubacin de harina de Semilla y Germinado de Guayaba.

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Mnica Silva Vega En la figura 8 se observa grficamente valores similares y diferentes en la determinacin de AGV en harina de semilla y Germinado de Guayaba.

Figura 8. Produccin de AGV en el germinado y harina de semilla de guayaba.

En la siguiente tabla se resaltan las principales correlaciones existentes entre parmetros medidos de Harina de semilla y Germinado de Guayaba y las existentes entre un parmetro y otro.

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Mnica Silva Vega Tabla 4. Correlacin de parmetros entre harina de Semilla y Germinado de Guayaba
Tratamiento Tratamiento Cenizas -0.971 *0.0289 FC -0.998 *0.0014 0.9693 *0.0306 0.9980 0.002 Grasa 0.976 *0.0231 -0.974 *0.0251 -0.973 0.026 -0.965 *0.034 FAD 0.0740 0.926 0.2008 0.799 0.0590 0.940 0.2854 0.7145 0.2854 0.7145 FND 0.9996 *0.0004 -0.964 *0.0354 -0.999 <0.0001 -0.9987 *0.0013 0.9721 0.0279 -0.0530 0.9470 PC -0.999 *0.0006 0.9625 *0.0375 1.0000 <0.0001 0.9980 *0.0020 -0.9728 *0.0272 0.05679 0.9432 -0.0530 0.947 Acetato -0.832 0.167 0.9313 0.0687 0.8165 0.1834 0.8197 0.1803 -0.9074 0.0925 0.5115 0.4885 -0.8172 0.1827 0.8149 0.185 Propionto -0.8748 0.1252 0.7392 0.2608 0.8884 0.1115 0.8819 0.1181 -0.7772 0.2227 -0.3061 0.6939 -0.8876 0.1124 0.8897 0.1102 0.4607 0.5393 Butirato -0.9697 *0.0302 0.9974 *0.0026 0.9621 0.0378 0.9642 *0.0358 -0.9861 *0.0138 0.2581 0.7419 -0.9627 *0.0372 0.9614 *0.0386 0.94214 *0.0579 0.7301 0.2699

Cenizas Humedad FC

Grasa

FAD FND PC Acetato Propionto

* P< 0.05 tienen diferencias significativas. Se toman como tratamientos la Harina de semilla y el Germinado de Guayaba entre los que existe una correlacin negativa en cenizas, esto indica que en mientras en la harina de semilla disminuye en el germinado aumenta. En fibra cruda existe diferencia significativa entre tratamientos y una correlacin positiva con la ceniza que indica que al aumentar el porcentaje de cenizas tambin aumenta el porcentaje de fibra cruda. Sin embargo en grasa existen correlaciones negativas con cenizas y fibra cruda lo cual nos dice que mientras la grasa se encuentre en porcentajes altos en un tratamiento en este caso es harina de semilla, las cenizas y la fibra cruda van a disminuir en el germinado. En fibra detergente neutro (FDN) que est compuesta por celulosa, hemicelulosa y

lignina, adems de otros componentes como almidn, cenizas y nitrgeno existen correlaciones negativas con cenizas y fibra cruda, lo cual significa que mientras se encuentren porcentajes altos de FDN en harina de semilla se encontraran porcentajes disminuidos de ceniza y fibra cruda en germinado los que nos da pauta que hubo una

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Mnica Silva Vega transformacin de nutrientes y la fibra cruda y cenizas cuantificadas se utilizaron en la formacin de FDN. Por otro lado en protena cruda encontramos una correlacin negativa entre tratamientos y grasa, lo que nos dice que mientras en la harina de semilla sean bajos los porcentajes de protena cruda estarn aumentados en el germinado y de la misma manera con respecto a la grasa. Tambin existen correlaciones positivas entre, cenizas y fibra cruda que indica que los porcentajes de cenizas y fibra cruda son altos al aumentar la protena cruda. En los AGV especficamente en Butirato despus de someter la harina de semilla y el germinado a digestin encontramos correlaciones negativas entre tratamientos, FDN y grasa que nos dice que la transformacin de los compuestos de la harina de semilla para formar el germinado es metabolizada y contribuyen a la formacin de cido butrico. En lo referente a las correlaciones positivas con cenizas, fibra cruda, protena cruda y acetato que nos indican que mientras los porcentajes de estos compuestos sean elevados tendremos mayor produccin de cido butrico.

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Mnica Silva Vega

V.- DISCUSIN
El objetivo de este trabajo fue evaluar los contenidos nutricionales de harina de semilla y germinado de Guayaba (Psidium guajava L.) para uso en la alimentacin ruminal, realizando un anlisis bromatolgico y digestibilidad in vitro. Lo anterior como una alternativa para el aprovechamiento de los deshechos de la industria dedicada al procesamiento de las frutas. En Mxico los productores de guayaba ocupan el cuarto lugar mundial de la produccin con el 6.1% de la oferta internacional estimada en 277 mil 543 toneladas del cual el 14 % (38854.76 toneladas) se destina a la industria. (SAGARPA, 2009). Haciendo clculos de las toneladas destinadas a la industria 4662.57 toneladas es semilla la cual forma parte de los desechos industriales y se tira sin ninguna utilidad. Aunque la mayora de los cultivos se obtienen de forma sexual, la semilla obtenida en la industria no es usada con estos fines ya que tambin es posible y en menor escala propagarla a travs de acodos y estacas (Jaiswal y Amin, 1992). La propagacin masiva por semilla, aunque es fcil, genera alta variabilidad y baja produccin comercial (Pereira, Pretecher y Benincasa, 1990; Ali et al., 2003), para esta forma de propagacin generalmente se utilizan semillas que los productores obtienen por si mismos de las guayabas sin recurrir al desecho industrial. Tambin se ha demostrado la propagacin in vitro de guayaba en varios estudios utilizando pices (Papadadatou y Pontikis, 1990), segmaentos nodales (Amin y Jaiswal, 1988; Mohamed-Yasseen et al., 1995) hipocotilos (Loh y Rao, 1989; Singh et al., 2002) y embriognesis somtica (Manoj, Akhtar y Jaiswal, 2007). Por lo anterior se demuestra que no necesariamente se debe de utilizar la semilla para el cultivo quedando libre para otros usos. En la actualidad numerosos estudios buscan utilizar los desechos industriales como materia prima, en este caso se busca aprovecharlos en la nutricin de rumiantes al moler la semilla de guayaba y obtener harina o bien al ser germinadas. La germinacin de los embriones tarda generalmente 5 semanas aunque puede tardar hasta 8 semanas depende de las condiciones externas. En placas de germinacin con condiciones de humedad optimas y a temperatura ambiente a las 5 semanas de iniciar la germinacin las plntulas alcanzan

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Mnica Silva Vega una altura de 5.7cm como mxima al agotar la reserva de la semilla, despus de esto inician a obtener nutrientes del suelo para su supervivencia. El costo por adquirir la materia prima consiste en la mano de obra y el combustible que se calcula sea aproximadamente en 50 centavos por kg de semilla en el caso de la harina.

Al hacer la medicin por separado de los compuestos bioqumicos de ambas alternativas por medio de un anlisis bromatolgico el cual determina humedad, grasa, protena, cenizas y fibra se observa lo siguiente: 5.1.-CENIZAS Las cenizas valor que sugiere cantidad de minerales aumentan de 1.096% en harina de semilla a 1.517% en germinado; este valor no corresponde a la cantidad exacta de los materias minerales y salinas de la muestra, debido a que las temperaturas superiores a los 400 C se forman cloruros voltiles con diversos cationes como el Sodio, Cadmio y otros (Adrian, 2000). Los datos anteriores se encuentran dentro del rango de 0.5 a 6.62 % reportados por Vasco et al., (2002).

5.2.-EXTRACTO ETREO La cantidad de grasa en el fruto es muy bajo, constituye entre el 0.1% y el 0.5 % del peso en base hmeda (Belitz y Grosh, 1988), en algunas especies de guayaba no sobrepasa el 0.2 %. En la harina de semilla se encuentra en grandes cantidades 40.576 % esto puede deberse a que el embrin requiere gran cantidad de reserva de nutrientes y energa para que la germinacin sea favorable una vez germinada la semilla esta cantidad disminuye a 17.300 %. Vasco-Mndez et al., (2002) reporta el perfil de cidos grasos de la semilla de guayaba e indican que es una buena fuente de cido linolico, ya que es el cido graso que se encuentra en mayor cantidad (80.5%) en la semilla. 5.3.- FIBRA CRUDA Comparando porcentajes de fibra de otras frutas la guayaba se encuentra entre los ms altos en contenido, especialmente los frutos con cscara debido a que este tejido est 52

Mnica Silva Vega compuesto principalmente por sustancias pcticas, celulosa y hemicelulosa (Wills et al,. 1984). Es importante notar que la fibra que se pierde cuando se retira la piel que en el estado de madurez fisiolgica (9.4%) y el porcentaje de fibra es mayor en el estado de maduracin organolptica (17.9%) Las semillas de los frutos particularmente de guayaba que se pierde durante la maduracin organolptica es mayor en la pulpa (16.48 %) que en el conjunto pulpa piel (7.6 %) esto nos indica que durante la maduracin de la guayaba agria los carbohidratos son metabolizados y que estos en su mayora se encuentran en la pulpa (Lara et al., 2007). En la harina de semilla la cantidad de fibra es mayor con 41.331 %, esto se puede deber a la testa que recubre el embrin, en caso del germinado aumenta a 99.463 %.

5.4.- FDA Y FDN La semilla de Guayaba es bsicamente fibra que segn Jmenez-Escrig et al., (2001) es fibra dietara antioxidante, por lo que se considera podra ser incluida en alimentos para aumentar la cantidad de fibra en la dieta. El estudio de diferentes tipos de fibra muestra que la fibra digerible es aproximadamente el 20 % del total, el 80 % restante corresponde a FDN que es fibra no digerible por monogstricos como los humanos, pero es fcilmente digerible por los rumiantes. De la misma forma la FDA que en este caso alcanza porcentajes del 70 %. La lignina corresponde a la fraccin de fibra que no es digerible ni por los rumiantes y alcanza porcentajes del 30 % (Vasco, et al., 2002). Los porcentajes anteriores son inferiores a los reportados en FDN (94.025 %) que es una cantidad mayor a la encontrada en el germinado (41.331 %) y superiores con respecto a la FDA (36.7383 %) en donde por cierto no se mostraron diferencias significativas estadsticamente respecto al germinado (36.898 %).

5.5.- PROTENA CRUDA La cantidad de protena en harina de semilla resulto de 8.788% esta cantidad coincide con el reportado en el anlisis proximal realizado en harina de semilla revuelta obtenida de la 53

Mnica Silva Vega empresa Jugos del Valle, resulta entre 6 y 10 % de protena (Vasco et al ., 2002). En el caso del germinado la cantidad de protena aumenta considerablemente a 30.496 %. Un dato importante de gran utilidad al trabajar con rumiantes es el aporte de nitrgeno endgeno que se encuentra alrededor 0.5 o 0.6 gr por 100 gr de materia seca consumida aproximadamente 4 % de la protena de la racin por lo que los coeficientes de digestibilidad aparente en las raciones con un contenido de protena inferior al 4 % son negativos (Bondi, 1989)

5.6.- MATERIA SECA Dentro de los alimentos que habitualmente se utilizan para animales de produccin se encuentran variaciones en la cantidad de materia seca; en las pasturas pueden tener % MS sumamente bajos de hasta un 12 % (Castillo et al., 1992), mientras que en otro extremo, granos y henos tienen porcentajes cercanos al 90 % (Stritzler et al., 2004). Comparando con los datos obtenidos en la harina de semilla tenemos que un 35.3901 % es materia seca y marca una diferencia significativa con respecto al germinado que result de 39.9203 %, lo anterior indica que la harina de semilla podra ser aprovechada mas satisfactoriamente por el animal que el germinado. 5.7.- DIGESTIBILIDAD Y CUANTIFICACIN DE AGV. PRODUCCIN DE GAS IN VITRO Y

Las variaciones de consumo para rumiantes se encuentran influidas parcialmente por la digestibilidad del alimento, en lo que se refiere a nutricin animal existen cuatro puntos clave a valorar, estos son requerimientos del animal, contenido nutricional de alimentos, digestibilidad y cantidad consumida (Haro, 2002). Actualmente, se enfatiza el uso de mtodos in vitro para la evaluacin de alimentos (Mould et al., 2005). Desde que propuso Menke-Steingass, (1988), la tcnica de produccin de gas se ha utilizado para describir la cintica de fermentacin y el valor nutritivo de forrajes (Rymer et al., 2005) principalmente de pajas (Blmmel-Orskov 1993), granos de cereales (Opatpatanakit et al., 1994), arbustivas (Ammar et al., 2005) y residuos agro-industriales (Ortiz et al., 2007). El valor nutritivo para la harina de semilla y 54

Mnica Silva Vega germinado de Guayaba sometidos a una cintica de fermentacin sugieren mayor digestibilidad para el germinado por tener mayor atmosferas de presin con respecto al tiempo en que se mantuvo la digestin in vitro. Para ampliar la informacin sobre las propiedades nutricionales de los alimentos, es necesario estimar, adems, otros productos de fermentacin, tales como perfiles de cidos grasos voltiles y protena microbiana (Makkar 2005). En lo referente a cidos grasos voltiles cuantificados en harina de semilla y germinado resultan con diferencias significativas solo en el cido Butrico con 2.245 g/L y 2.7925 g/L respectivamente. Sin embargo las cantidades de cido Actico (1.2625 g/L) y cido Propinico (0.563 g/L) en germinado fueron ligeramente mayores que en la harina de semilla con resultados de cido Actico (1.079g/L) y cido Propinico (0.397 g/L) aunque estadsticamente no presentan diferencias significativas.

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VI.-CONCLUSIONES
La hiptesis planteada en este trabajo se cumple en lo que se refiere a la harina de semilla de Guayaba, la cual result con mayor concentracin de grasa y FDN que pueden ser utilizados en la dieta de los rumiantes, adems del bajo costo aproximadamente 50 centavos por Kg y la facilidad en la elaboracin de la harina que es un producto de desecho industrial abundante. Con respecto al germinado no es una alternativa costeable debido que los esfuerzos en la germinacin son considerables y la cantidad obtenida es mnima en peso, por lo que no se recomienda esta alternativa aunque su valor nutritivo sea mayor que el de la harina de semilla.

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ANEXOS DETERMINACIN DE CENIZAS

Obtener el peso constante de un crisol de porcelana a 600 o 800 C. Adicionar 1 gr de muestra Incinerar con mechero hasta que cese el humo negro Calentar el crisol con la mezcla a 550 C hasta que las cenizas sean blancas Pesar el crisol

Clculos % Cenizas = [(P1 P2) / M] *100 P1 = Peso del crisol vacio P2 = Peso del crisol con las cenizas M = Peso de la muestra en gramos

DETERMINACIN DE FIBRA CRUDA

Pesar 2 gramos de muestra y vaciarlo en un vaso de 500 ml. Agregar 200 ml de H2SO4 al 1.25%. Calentar a ebullicin y dejar la muestra durante 30 minutos. Filtrar, Lavar con agua caliente. Con papel tornasol medir su pH El residuo se colocara nuevamente en el vaso. Agregar 100 ml de NaOH al 2.5% y 100 ml de agua destilada. Calentar a ebullicin y dejar la muestra durante 30 minutos. Pesar el papel filtro (pesar una muestra del papel filtro, colocar el papel filtro en la estufa, pasarlo al desecador durante 30 minutos y pesarlo, esto ayudara para conocer el % de humedad del papel). Colocar el papel en el embudo y empezar la filtracin. Medir el pH con papel tornasol. Pasar el papel a la estufa (18 horas). Colocar el papel en el desecador durante 30 minutos. Pesar el papel Clculos %Fibra cruda = [(PS PP) /100] *100

PS = Peso en gramos de residuo seco PP = Peso en gramos del papel filtro M = Peso de la muestra en gramos 73

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DETERMINACIN DE FIBRA DETERGENTE NEUTRO

Este mtodo determina la Fibra Detergente Neutro (FDN), la cual es el residuo o remanente despus de una digestin con solucin de detergente neutro. La fibra residual es predominantemente hemicelulosa, celulosa y lignina. Este mtodo tambin es aplicado para otro tipo de alimentos incluyendo granos. Reactivos y materiales Solucin FDN (Solucin de Detergente Acido) Alfa amilasa (FAA ANKOM Technology). Sulfito de Sodio Anidro (Na2SO3) (FSS ANKOM Technology). Acetona. Bolsas filtro ANKON Instrumental Marcador permanente resistente a las solucin acida (F08, ANKOM Technology). Matraz volumtrico para 1 lt. Charolas para desecacin Equipos Balanza analtica con capacidad para 0.1 mg Estufa de aire forzado. Digestor ANKOM (ANKOM200, 65 rpm de agitacin, ANKOM Technology). Sellador de resistencia para bolsas ANKOM Campana desecadora Manejo del material, equipo e instrumental Las muestras a analizar deben de ser manipuladas con guantes desechables y limpios para evitar contaminaciones y posible alteracin de los resultados. Durante todo el desarrollo de la prctica se debe hacer el manejo correcto de las soluciones y aparatos con guantes, bata y lentes. Las bolsas deben de ser manipuladas con pinzas pues las soluciones usadas se encuentran a temperaturas capaces de causar quemaduras. Acciones preventivas La solucin de FDN puede irritar las membranas mucosas, se recomienda usar guantes y mascara de laboratorio o lentes de laboratorio con cubre boca. 74

Mnica Silva Vega La acetona es extremadamente flamable, se debe poner atencin en no trabajar con esta cerca de aparatos electrnicos o de resistencia. Desarrollo de la prctica 1. Use un marcador permanente resistente a las soluciones utilizadas (ANKOM Technology). Pese las bolsas y registre el peso (P1). Tare la balanza con la bolsa. Nota: No es necesario secar las bolsas si se usa una sin contenido como blanco. 2. Pese de 0.45-0-55 g de la muestra a analizar (P2), y registre la cantidad depositada en la bolsa. 3. Selle las bolsas con el sellador de calor hasta el tope de las bolsas procurando no dejar rebordes. 4. Pese una bolsa vaca (B1) que se usara como blanco, registre el peso y selle. 5. En caso de ser muestras con cantidades superiores a 5% de grasa, realice extraccin de la grasa lavando las bolsas durante 10 minutos en acetona. Esto se repite hasta 10 veces. 6. Deposite hasta 24 bolsas en el contenedor con charolas del analizador de fibras ANCOM, depositando 3 bolsas por charola de suspensin. Deposite el contenedor de charolas en el analizados de fibras ANKOM. 7. Cuando se trabajan 24 muestras se agrega la cantidad de 1.9-2 L de la solucin de detergente neutro (DN) a temperatura ambiente. Se calcula 100 ml de solucin de DN por bolsa, use un mnimo de 1.5 L para que el contenedor cubra bien las bolsas durante el proceso. Agregue 20 g (0.5 gr/ml de solucin de DN) de sultfito de sodio en el contenedor. 8. Encienda el analizador de fibras ANKOM, encienda la temperatura y el agitador. Programe el tiempo requerido que es de 75 minutos y la temperatura de 120 C. Cerrar la tapa del contenedor. 9. Al final del proceso, apague el interruptor de temperatura y el agitador. Abra la vlvula de liberacin del lquido. para liberar la solucin es necesario abrir la tapa. 10. Cierre la vlvula de liberacin de la soluciones. Agregue 1.9-2 L de agua destilada a una temperatura de 70-90 C y agregue 4 ml de alfa amilasa. Encienda el agitador durante 5 minutos. Repita este ultimo proceso por tres ocasiones.

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Mnica Silva Vega 11. Al finalizar el proceso anterior extraiga las bolsas (muestras). Presione suavemente las bolsas para extraer el agua residual. Deposite las bolsas en un vaso de precipitado de 250 ml y cubra con suficiente cantidad de acetona, mantenga por 35 minutos. 12. Remueva las bolsas de la acetona y seque a temperatura ambiente hasta que se evapore el acetona. Posteriormente squelas en estufa de aire forzado a 120 C durante 2-4 horas. 13. Remueva las bolsas de la estufa de aire forzado una vez concluido el tiempo de secado. Deposite las bolsas en el desecador hasta enfriar para pesar al final (P 3), y registre el peso. Clculos %FDN = P3-(P1 x B1) x100 P2 Donde: P1 = Peso bolsa vaca. P2 = Peso de la muestra. P3 = Peso final de la bolsa con la muestra al final del proceso. B1 = Peso de la bolsa blanco.

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TORIA DEL MTODO LECO / DUMAS

El ciclo de Anlisis se compone de tres fases: Purga / Combustin / Anlisis. Fase de Purga: El cargador automtico introduce la muestra dentro de la cmara de carga. El control automtico sella la cmara y procede a purgar los gases atmosfricos residuales que puedan haber ingresado durante el proceso de carga. El circuito de recoleccin de gas de muestra (Ballast Volmen cero) tambin se purga durante esta fase. Fase de Combustin: Se libera la muestra dentro del horno de combustin donde se expone a una temperatura de 950C en presencia de un flujo de Oxgeno puro controlado por el equipo. La muestra se combustiona completamente en forma rpida en el crisol del horno descomponindose en gases y cenizas arrastrados por el flujo de Oxgeno. Estos productos de la combustin de la muestra atraviesan la etapa secundaria del horno (post-quemador, 850C), para completar la oxidacin de los gases y eliminacin del particulado. Un sistema de filtrado fsico y un enfriador termoelctrico de dos etapas, posterior al horno, se encarga de eliminar el contenido de humedad resultante de la quema de la muestra (vapor de agua). Fase de Anlisis: Los gases resultantes de la combustin arrastrados por el Oxgeno, son almacenados en su totalidad dentro de un recipiente de compensacin (Ballasto). En este recipiente se realiza la homogenizacin de los gases para luego proceder a la extraccin de una muestra de 3cc del mismo (Alcuota). Un flujo de gas de arrastre (Helio) se utiliza para desplazar la alcuota de gas hacia el sistema de catlisis (se elimina el Oxgeno libre, CO2 y H2O) y luego de eliminados los gases interferentes, conduce el gas muestra hasta la celda de medicin de N2.

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Mnica Silva Vega Se utiliza una celda de termoconductibilidad para determinar el contenido de N2 por comparacin con una referencia de gas arrastre puro (Helio). La gran diferencia termoconductiva entre el Nitrgeno (gas a analizar) y el Helio permite la mxima sensibilidad, precisin y exactitud en la medicin de N2 por el mtodo Dumas. El equipo expresa el resultado del anlisis ya sea en % o ppm con relacin al peso; en valor de % proteico segn lo requiera el laboratorio. El resultado tambin puede expresarse en base seca si es necesario compensar humedad no deseada del producto bajo ensayo. Conociendo una Celda Detectora de Nitrgeno (Celda de Conductividad Trmica) La celda termoconductiva posee la habilidad de detectar diferencias en la conductibilidad trmica de distintos gases. LECO ha patentado una variante de celda especficamente optimizada para la determinacin de Nitrgeno. Esta celda consiste de un par de filamentos elctricos cuidadosamente apareados dentro de un sistema de medicin tipo Puente de Wheahstone. El filamento de referencia se mantiene dentro de un flujo constante de gas Helio (referencia), el filamento de medicin es atravesado por el gas muestra, del cual se requiere mensurar el Nitrgeno. La diferencia de los coeficientes de conductibilidad trmica entre ambos gases pasantes, se integra hasta completar todo el pasaje de la muestra alcuota. La utilizacin de Helio garantiza la mxima sensibilidad en la determinacin del Nitrgeno (los sistemas fabricantesde equipos con sistemas DUMAS que utilizan Argn CO2 tienen una sensibilidad reducida en un orden de 100). El tamao de la alcuota (3cc) requiere muy poco gas de arrastre (He), con lo cual se minimiza el costo por anlisis del sistema de medicin. La corriente elctrica que atraviesa ambas ramas del Puente de Wheahstone causa que los filamentos se calienten a una determinada temperatura. El Puente de Wheahstone est balanceado y en equilibrio, mientras ambos filamentos estn siendo atravesados por el

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Mnica Silva Vega mismo gas (Helio). En estas condiciones, la salida de la celda de medicin se mantiene constante (lnea de base). Cuando un gas diferente se introduce en la rama de medicin, producto del pasaje de la muestra alcuota, cambiaran las condiciones de intercambio de calor entre el filamento de medicin caliente y el gas pasante. En el caso del Nitrgeno, dado que tiene un coeficiente de Cv mucho mayor que el de Helio, se producir una elevacin de temperatura del filamento de medicin. Esto implica un cambio en la resistencia elctrica del filamento y consecuentemente, en un desbalance del Puente de Wheahstone. Como consecuencia de esto, la salida de la celda de medicin se apartar de su lnea de base, en un orden que depender de la cantidad de Nitrgeno presente en el gas muestra (alcuota). El sistema electrnico del equipo, recoger la seal de la celda y la procesar para entregar al analista el resultado expresado en porcentaje de Nitrgeno con relacin al peso de la muestra introducida en el equipo. La tabla siguiente explica las ventajas del Helio para utilizarse como gas de referencia para contrastar al Nitrgeno. En ella se puede observar las distintas opciones en la relacin Carrier vs Gas Analito (Nitrgeno), posibles en equipos Dumas: a) Carrier Helio ==> 33/5.6 = 5.89 (LECO solo utiliza gas Helio para asegurar la mxima sensibilidad de las mediciones) b) Carrier Argn ==> 3.8/5.6 = 0.68 c) Carrier CO2 ==> 3.3/5.6 = 0.59

Como puede observarse el Helio es el gas ms apto para una determinacin precisa y exacta del contenido de Nitrgeno utilizando el mtodo Dumas. 79

Mnica Silva Vega Nota: No se emplea Hidrgeno por motivos de seguridad fsica. Tabla de Conductibilidad Trmica de los gases:

Calibracin Como todo instrumento de medicin, es necesario calibrar el equipo para que sus resultados analticos estn contrastados contra estndares certificados y de esta manera establecer una trazabilidad en la medicin (exactitud). El sistema de anlisis Dumas permite una fcil calibracin del equipo en el anlisis de Nitrgeno, utilizando muestras estndares certificadas de fcil ubicacin (ej. EDTA). La habilidad del mtodo para extraer correctamente todo el N2 de la muestra, lo hace muy poco dependiente de la matriz, por lo que con pocos estndares se puede establecer una calibracin que abarque una gran variedad de materiales y rangos. El software permite calibraciones multipunto y verificacin con un estndar tipo, para efectuar una rpida constatacin de la exactitud del equipo en rutina. El proceso de calibracin es muy sencillo (consiste en correr tres anlisis de cada estndar definido incluyendo un blank como cero del sistema). El procedimiento de carga, es igual al de un anlisis de rutina.

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Mnica Silva Vega La grfica muestra una curva de calibracin tpica, se incluyen los valores de Slope y Zero con los que el software identifica la curva lineal. Nota: El software puede determinar la mejor curva de aproximacin para una calibracin dada (menor dispersin ==> menor error RMS)

La curva de calibracin se elabora junto al mtodo de acuerdo a la aplicacin requerida al equipo y generalmente no es necesario cambiarla a partir de su instalacin. La verificacin, recomendada en rutina, consiste en correr un blanco y luego tres veces un estndar certificado (ej. EDTA) lo cual puede ser cumplido en 15 minutos por da (o turno). Si la verificacin del equipo muestra un cierto desvo, simplemente se ordena una correccin en base a la verificacin efectuada, el equipo calcula en forma automtica el factor de correccin (factor de calibracin)

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TCNICA DE PRODUCCIN DE GAS IN VITRO.

Preparacin de la muestra. Molido del substrato en una malla de 1 mm (Menke et al, 1988). El fluido ruminal se coloca 15 minutos antes de iniciar la prueba. Soluciones para la saliva artificial. Medio ruminal in vitro. 1. Amortiguador de bicarbonato de fosfato. 2. Agente reductor. 3. Una fuente de N. 4. Minerales. 5. Rezasurina. NB: Se usa CO2 durante la preparacin del medio para asegurar un ambiente anaerobio. Solucin A (micromineral): Mineral CaCl2H2O MnCl24H2O CoCl26H2O FeCl36H2O Agua destilada (aforar) Cantidad 13.2 g 10.0 g 1.0 g 8.0 g 100 ml

Solucin B (amortiguadora): Reactivo NaHCO3 Agua destilada (aforar) Cantidad 39.0 g 1L

Solucin C (macromineral): Mineral Na2HPO4 KH2PO4 MgSO47H2O Agua destilada (aforar) Solucin de Rezasurina: Reactivo Rezasurina Agua destilada (aforar) Cantidad 100 mg 100 ml 83 Cantidad 5.7 g 6.2 g 0.6 g 1.0 L

Mnica Silva Vega Solucin reductora: Mineral 1NaOH NaS9H2O Agua destilada (aforar) Cantidad 4.0 ml 625 mg 100 ml

La soluciones A,B,C, y rezasurina se agregan dentro de un matraz con agua destilada, el cual se introdujo en un incubado rotatorio a 39 C, posteriormente se agrego la solucin reductora y se burbujeo con CO2 a toda la mezcla hasta que el color se torne de azul a rosa y finalmente transparente. Se mezcla con el fluido ruminal previamente colectados y mezclado con saliva artificial. La relacin final es 2:1. Cantidades a depositar dentro del frasco para incubar Cantidad Materia seca (dieta) 200 mg Mezcla de saliva artificial y fluido ruminal 30 ml NB: Se incuban tres muestras con mezcla de lquido ruminal y saliva artificial con la dieta por animal. Y tres muestras de la mezcla de lquido ruminal y saliva pero sin dieta. Es recomendable tambin analizar muestras ya conocidas como estndares.

Tiempos de lectura de presin por produccin de gas: 0, 3, 6, 9, 12, 24, 48, 72 y 96 horas. De acuerdo al substrato a evaluar se recomienda ampliar las lecturas sobre todo durante la primeras horas de incubacin. Preparacin de la saliva artificial Componentes Agua destilada ml Solucin macromineral ml Solucin amortiguadora ml Solucin micromineral ml Rezasurina ml Solucin reductora Agua destilada ml 1M NaOH ml Na2SgH2O (mg) Volmenes a prepara 500 1000 237.5 475.0 120.0 240.0 120.0 240.0 0.06 0.12 0.61 1.22 23.8 1.0 168 47.5 2.0 336 1500 712.0 360.0 360.0 0.18 1.83 71.3 3.0 504 2000 950.0 480.0 480.0 0.24 2.44 95.0 4.0 6.72

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Mnica Silva Vega DETERMINACIN DE CIDOS GRASOS VOLTILES EN LQUIDO RUMINAL

1.- Reactivos a) Solucin de cido metafosfrico al 25 % con 2 g/L de cido 2-Etil butrico (e. 165 mL. De 2EB= 2.0 gr.). b) Estndar AGV.

Agregue a los siguientes componentes 100 mL de agua destilada. Use jeringa Hamilton para todas las mediciones. Guarde en refrigeracin cuando no use.

cidos Actico Propinico Iso-butrico Butrico Iso- valrico n-Valrico

Peso Molecular 60.05 74.08 88.10 88.10 102.13 102.13

Vol, L 330 400 30 160 40 50

Concentracin g/L 3.46 3.97 0.29 1.53 0.375 0.471

2.- Preparacin del estndar y muestras. a) Centrifugue el lquido ruminal a 10,000 rpm por 10 min. b) Mezcle 5 mL. De lquido ruminal del sobrenadante con 1 mL de la solucin de cido metafosfrico con 2EB. c) Mantenga en fro por mas de 30 min. d) Centrifugue por 10 min a 10,000 rpm. e) Tome fluido del sobrenadante para la inyeccin en el cromatgrafo de gases. f) Preparacin del estndar. Como el 2EB es igual en todas las muestras, se toman 5 mL de la solucin estndar que se preparo anteriormente y se le agrega 1 mL de solucin de cido metafosfrico. Mezcle completamente y mantenga en fro.

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