MTODOS ACTUALES DE DIAGNSTICO DE LABORATORIO EN LAS INTOXICACIONES POR SETAS CON INTERS FORENSE

Mara Jess Iturralde Pardo

Instituto Nacional de Toxicologa y de Ciencias forenses Departamento de Madrid

INTRODUCCIN.2. CLASIFICACIN DE LOS MICETISMOS EN FUNCIN DE SU PERODO DE LATENCIA: 2.1 MICETISMOS DE CORTO PERIODO DE LATENCIA: 2.1.1 Gastroenteritis aguda por setas. 2.1.2 Intoxicacin neurolgica por setas (Sndrome micoatropnico). 2.1.3. Intoxicacin por hongos alucingenos (Sndrome alucinatorio). 2.1.4 Intoxicacin muscarnica por setas (Sndrome micocolinrgico o sudoriano). 2.1.5 Intoxicacin cardiovascular por setas (Sndrome coprnico). 2.1.6 Intoxicacin hemoltica por setas (Sndrome hemoltico). 2.2 MICETISMOS DE LARGO PERIODO DE LATENCIA: 2.2.1 Intoxicacin por setas hepatotxicas (sndrome ciclopeptdico). 2.2.2. Intoxicacin por setas hidracnicas (sndrome giromitriano). 2.2.3. Intoxicacin por setas nefrotxicas (sndrome orellnico). 2.3. NUEVAS PATOLOGAS ASOCIADAS A LAS SETAS: 2.3.1. Rabdomiolisis asociadas a setas. 2.3.2. Eritromelalgia.3. METODOLOGA EXISTENTE PARA EL DIAGNSTICO DE LABORATORIO: 3.1. TIPO DE MUESTRAS: 3.1.1. Muestras botnicas. 3.1.2. Muestras clnicas. 3.2. Clasificacin botnica: 3.2.1. Caractersticas macroscpicas. 3.2.2. Caractersticas microscpicas. 3.3. ESTUDIO DE TOXINAS. 3.3.1. En muestras botnicas. 3.3.2. En muestras clnicas. 3.4. REMISIN DE MUESTRAS.4. NUEVAS TECNOLOGAS BASADAS EN EL ADN: 4.1. RAPD. 4.2 RFPL. 4.3 SSCP. 4.4. SECUENCIACIN.5. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS. 4057

NDICE: 1.

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1. INTRODUCCIN Las intoxicaciones por setas se repiten todos los aos durante las pocas en que la climatologa favorece el crecimiento de los hongos, siendo el otoo y la primavera las estaciones en las que se lleva a cabo la mayor recoleccin y consumo por parte de la poblacin. En cuanto a la etiologa mdico legal, la mayor parte son accidentales; le siguen en frecuencia el consumo voluntario de setas con principios psicoactivos siendo excepcional la etiologa homicida o suicida. A lo largo de 18 aos hemos recibido, en el Servicio de Biologa, muestras de 60 episodios asociados a setas procedentes de Hospitales (1) y muestras de 31 casos procedentes de Juzgados: unos para investigar si las muestras incautadas contienen sustancias psicoactivas y otros para poder establecer si las setas han sido las responsables de producir la muerte. La media anual es de 5 episodios por ao. La importancia de este tipo de intoxicaciones no es tanto por la frecuencia con que se presentan sino porque los pacientes pueden haber ingerido setas con toxinas que son potencialmente mortales. Adems, en el diagnstico diferencial de la hepatitis fulminante y de la insuficiencia renal hay que incluir los micetismos. Desde el punto de vista forense los protocolos de trabajo y los mtodos de interpretacin tienen que basarse en: 1. Investigaciones circunstanciales: si han ingerido setas, cuantas veces, manera de consumirlas. 2. Investigacin botnica: sirve para establecer que especie de seta es realmente la que ha producido la muerte. Adems puede aportar nuevos taxones al catalogo de especies txicas. 3. Datos clnicos y bioqumicos: el periodo de incubacin sirve para distinguir los distintos micetismos. Adems existen patologa asociadas a setas que no son envenenamientos (alergias, intolerancias, toxiinfecciones alimentarias). 4. El examen histopatolgico es importante especialmente en los casos letales. El hgado y el rin son los rganos que se van a ver ms afectados. 5. Anlisis de toxinas: en los ejemplares sospechosos y en muestras procedentes de la vctima. 4058

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2. CLASFICACIN

DE LOS MICETISMOS EN FUNCIN DE SU PERIODO DE LATENCIA

Basados en criterios clnicos, las intoxicaciones se clasifican, en funcin de la duracin del periodo de latencia en dos grandes grupos: los de periodo de latencia corto, en general menos graves, y los de periodo de latencia largo. 2.1 Micetismos De Corto Perodo De Latencia

El intervalo entre la ingesta y la aparicin de los primeros sntomas es inferior a 6 horas, oscilando en general entre 30 minutos y unas 3-4 horas. Suelen ser intoxicaciones leves. 2.1.1 Gastroenteritis agudas por setas

Especies causantes Entoloma lividum: seta prfida

Sombrero: 5-20 cm, margen enrollado, gris pardusco y radialmente fribriloso. La carne tiene olor a harina rancia. Lminas: anexas, escotadas, rosa salmn, espaciadas. Pie: 6-14 cm, duro, slido, sedoso, blanco, manchado de amarillento. Esporada: rosada. Espora: 9-12 x 7-9 m, polidricas y con un saliente. 4059

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Hbitat: frecuente en otoo, a menudo en grupos, bajo rboles de castaos y robles. Confusin: Clitocybe nebularis la pardilla,esta seta es muy apreciada en el Pas vasco y con Tricholoma georgi Seta de San Jorge. Omphalotus olearius: Seta de olivo

Sombrero: 4-10 cm, convexo, aplanado y hundido de color anaranjado o pardo rojizo. Lminas: decurrentes, desiguales, estrechas y anaranjadas o amarillas. Pie: excntrico y curvado, y del color del sombrero. Esporada: blanco-amarillenta. Espora: 5-8 x 4-6,5 m, lisas, redondas y no amiloides. Hbitat: en otoo, en base de troncos no slo de olivos sino tambin de robles, robinias, etc. Confusin: con Cantharellus cibarius excelente comestible que crece en el suelo (no en madera) y cuyo sombrero no posee lminas sino venas.

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Boletus satanas: Boleto de satans

Sombrero: 6-25 cm, carnoso, de color blanco. Tubos: amarillos. Los tubos terminan en unos poros que son de color rojo que azulean con el roce. Pie: 4-15 x 3-10 cm, corto, rechoncho, amarillo en la parte superior, rojo al centro y recubierto por un retcula roja. Esporada: marrn. Espora: 11-15 x 5-6 m, en forma de uso, lisas, marrn oliva. Hbitat: prefiere suelos calcreos y bosquecillos con rboles de planifolios donde suele salir en verano. Confusin: con Boletus erythropus aunque el pie de este tiene puntitos rojos en el pie en vez de retcula. Diversas especies de setas pertenecientes a diferentes gneros provocan gastroenteritis aguda: Entoloma, Omphalotus, Boletus, Tricholomas, Lactarius, Russulas, Agaricus, Clitocybe, Hebeloma, Nematolma etc. En Espaa las gastroenteritis ms graves han sido producidas por las especies. Entoloma lividum y Tricholoma tigrinun. En el resto de Europa son frecuentes las intoxicaciones por Boletus satanas. Los episodios de gastroenteritis analizados en nuestro Laboratorio han supuesto un 18% siendo la especie Omphalotus olearius la ms frecuente. Dos episodios de intolerancia digestiva se produjeron por la ingestin de Macrolepiota procera y Macrolepiota rhacodes siendo ambas especies excelentes comestibles. Toxinas: En muchas especies no se conocen las sustancias responsables de producir los trastornos pero en algunas se han identificado compuestos que, experimentalmente, se muestras nocivos o irritantes

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del tubo digestivo como: Fasciculoles E y F, Hebelsidos, Sesquiterpenos cclicos, Nematolina, Iludinas y Subiludinas, Bolesatina etc. Sntomas: Nuseas, vmitos y diarreas de diversa intensidad en funcin del tipo de la especie de seta que se haya ingerido as como de la cantidad. Tratamiento: Es exclusivamente sintomtico y de soporte. Casi siempre habr que evitar la deshidratacin y el desequilibrio inico. Nota: En general no hay que olvidar que muchos de los micetismos se producen por desconocimiento de la existencia de hongos txicos. Esto hace que se den ingestas al azar de diferentes tipos de setas que pueden incluir especies que conllevan toxicidad tarda y temprana. En estos casos la aparicin precoz de sntomas puede encubrir una intoxicacin grave. 2.1.2. Intoxicacin neurolgica por setas: sndrome micoatropnico

Especies causantes Amanita muscaria: Matamoscas, Falsa oronja, Oropndola loca

Sombrero: 6-15 (20) cm de un llamativo rojo escarlata o rojo anaranjado con numerosas escamas blancas que desaparecen con la lluvia. Lminas: libres, apretadas y blancas. 4062

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Pie: blanco, cilndrico. La base se ensancha en forma de bulbo rodeada por la volva disociada en diversas verrugas dispuestas en anillos concntricos. Anillo: membranoso y colgante. Esporada: blanca. Espora: subglobosas 9-11 x 6-9 m, lisas, hialinas y no amiloides. Hbitat: a finales de verano y otoo, tanto en bosques de confieras como caducifolios: pinos, abetos, haya, abedules, etc. Preferentemente suelos cidos. Nota: A diferencia de los Psilocibes estas setas no se pueden cultivar. Amanita pantherina amanita pantera

Sombrero: 4-10 cm de color pardo olivceo con verrugas blancas.

Lminas: libres, apretadas y blancas. Pie: 6-12 cm, blanco, sedoso, de base abultada. Anillo: frgil. La volva disociada en dos o tres anillos. Esporada: blanca. Espora: un poco ms grandes que las de A. muscaria: 9-12 x 7-9 m, lisas, hialinas y no amiloides. Hbitat: en verano y otoo en bosques mixtos. A. muscaria es la seta ms conocida y la encontramos a menudo ilustrada en libros infantiles. En mitologas antiguas se la identificaba con el Soma , el hongo divino de la inmortalidad de las primeras religiones euroasiticas. Hoy en da, estas setas se comen deliberadamente en diferentes lugares de Europa para obtener efectos alucinatorios. En uno de los casos procedentes de Juzgados relacionado con el consumo de A. muscaria, el detenido, un joven de 20 aos, refera su ingesta por que le produca efectos agradables, alteraciones de la visin, risa y desequilibrios en la mente. Se han descrito algunas intoxicaciones importantes en Estados Unidos, Europa y Surfrica (2) . 4063

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Toxinas: Durante un largo perodo de tiempo se consider que la muscarina era la toxina que produca este tipo de intoxicacin (Schmiedeberg y Koppe, 1869). Fue a mediados de los aos sesenta cuando tres equipos de investigacin de forma paralela e independiente, Takemoto en Japn (1964), Bowden en Inglaterra (1965) y Eugster en Suiza (1965) aislaron dos sustancias activas y las identificaron como Acido ibotnico (de ibonten-gu-take, como llaman en Japn a Amanita strobiliformis) y muscimol, ambos derivados del isoxazol y con accin insecticida y narctica. Tambin se aislaron oxazolona y muscazona. Adems se piensa que posiblemente estas setas contengan otras substancias, no identificadas todava, con algn efecto en el ser humano.

Ac. ibotnico

Muscimol

El cido ibotnico, se descarboxila en el organismo y da lugar al muscimol que sera la sustancia verdaderamente activa.

Muscimol

f q

Acido gammaaminobutrico

El muscimol es una sustancia soluble en agua, cuya frmula tiene cierto parecido con la del GABA por lo que puede estimular sus receptores cerebrales. El contenido de toxinas en A. muscaria es muy variable y a veces nulo, lo que explica que en algunos lugares europeos se consuma sin inconvenientes. En general la variedad A. muscaria americana es la ms irritante del tubo digestivo, mientras que las formas europeas presentan mayor actividad psicotrpica. Como cifras medias de contenido en compuestos isoxazlicos se habla de un 0,2% del peso seco de la seta para A. muscaria y de un 0,4% para A. pantherina. Las maneras ms frecuente de consumirlas son: 1) crudas: 5 a 10 gr de seta seca en 4064

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trocitos. 2) con una llama calentar el sombrero y recoger el lquido que sale de las lminas. 3) fumadas los efectos que produce son ms intensos pero duran menos tiempo. Sntomas: Adems de irritacin gastrointestinal, se producen alteraciones motoras, por lo que se habla a veces de borrachera por setas. En ocasiones se produce un cuadro de depresin neurolgica que puede llegar a coma. En conjunto no puede hablarse de gravedad aunque a lo largo de la historia se ha documentado alguna intoxicacin mortal, en especial por A. pantherina. Tratamiento: prevenir la absorcin. As mismo, debe llevarse a cabo un tratamiento sintomtico y de soporte. Los antdotos deben utilizarse de acuerdo con los sntomas: si se observan de tipo anticolinrgico la fisostigmina. Slo si se presentarn sntomas de estimulacin colinrgica, debido a que la seta presentara una concentracin inusualmente elevada de muscarina, suministrar atropina. Anlisis de toxinas: Muestras botnicas: el muscimol se puede detectar por cromatografa en capa fina (3). Muestras clnicas: en orina puede detectarse la presencia de isoxazoles. 2.1.3 Intoxicacin por hongos alucingenos: sndrome alucinatorio

Especies causantes Psilocybe semilanceata: bonete de los libertinos, gorro de brujas, mongui

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Sombrero: 0,5-1,5 cm, fuertemente cnico con un caracterstico saliente puntiagudo en el centro, nunca extendido, crema tostado al secar. Lminas: ascendentes, pardo purpurceas, de arista blanca. Pie: 25-75 x 1-2 mm, flexuoso, plido, a veces con un tinte azul en la base del pie. Esporada: chocolate negruzco. Espora: elipsoidales, de 11,5-14,5 x 7-9 m, lisas, y con poro germinativo. Hbitat: en parques, prados o bordes de caminos. Se recolecta en otoo. Tambin se puede cultivar. Panaeolus sphinctrinus

Sombrero: de 2 a 4 cm, campanulado que nunca extiende. Se caracteriza por tener abundantes restos de velo a modo de jirones de color blanco formando una franja alrededor del sombrero. Lminas: Adherentes, grises en diferentes tonos por que no maduran todas a la vez , borde blanquecino. Pie: muy largo 60-120 x 2-3 mm, algo ensanchado en la base, color pardo rojizo en las partes inferiores. Esporada: negra. Espora: forma de limn, algo hexagonales, de 13-18 x 8-12,5 m, con poro truncado muy pronunciado. Hbitat: en prados frecuentados por el ganado. Se recolecta preferentemente en otoo. 4066

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Psilocybe cubensis Isidoro Labrador

En Mxico la llaman El champin de San

Sombrero: 1,5-8 cm, de cnico campanulado a convexo, color amarillo plido, superficie lisa. Lminas. adnatas, de gris prpura a negro. Pie: 40-150 x 5-15 mm, blanquecino a amarillento. Esporada: negra prpura. Espora: violeta marrn, 11-17 x 8-10 m, subelipsoidales, lisas. Habitat: sobre estircol de vaca, en regiones subtropicales. Esta especie es fcil de cultivar por lo que es una de las especies ms consumida con fines recreativos. Debido a la falsa creencia de que el consumo de sustancias alucingenas de origen natural es menor que el de sustancias sintticas y a la facilidad con que se pueden adquirir hongos alucingenos, su utilizacin con fines recreativos est aumentando en Espaa. En el Servicio de Informacin Toxicolgica se reciben consultas de intoxicaciones en adultos que las toman en sopas, tortillas, arroz o en tartas de cumpleaos adquiridas por Internet como smell bags. Consultan por una serie de sntomas que califican como mal viaje: crisis de pnico o ansiedad, psicosis o sintomatologa simpaticomimtica. En una ocasin un nio pequeo ingiri los ejemplares de la bolsita depositada debajo de la almohada por los padres que ignoraban su verdadero contenido. Toxinas: el descubrimiento de los principios activos por el qumico Suizo Albert Hoffman conocido por muchos como el padre del potente 4067

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alucingeno LSD, fue posible gracias al trabajo del profesor R. Heim que consigui cultivar estos hongos en el laboratorio. Dos sustancias derivadas del anillo indol resultaron ser las causantes de la actividad alucingena de los hongos mgicos mexicanos: psilocibina y psilocina cuya actividad calcul como 1/100 de la del LSD. La psilocibina, principal componente activo del hongo, se hidroliza rpidamente en el organismo y da lugar a la psilocina siendo sta la sustancia biolgicamente activa. Su mecanismo de accin no est plenamente aclarado pero se saben que actan como falsos neurotransmisores.

Psilocibina

Psilocina

La cantidad de sustancia psicoactiva en las setas es muy variable aunque depende de diferentes factores: localizacin geogrfica, condiciones climticas, tiempo de recoleccin etc. Para Psilocybe semilanceata se han obtenido cantidades entre 0,1 a 1,6 % de psilocibina del peso en seco de la seta, y entre 0 a 0,6% de psilocina. En general se admite un contenido medio del 1% de los derivados indlicos activos del peso seco. Si un ejemplar seco de talla media de P. semilanceata que pese aproximadamente 200 mg puede contener 2 mg de psilocibina, un pequeo viaje necesitar unos 4 o 5 ejemplares (entre 8-10 mg) y un gran viaje de 20 a 40. Una dosis por encima de 150 mg puede provocar una intoxicacin grave incluso la muerte (4). La desecacin no parece alterar a la psilocibina por lo que se pueden consumir secas o en cpsulas. El que sean sustancias hidrosolubles hace que se consuman en infusiones o en guisos hechos con el agua de hervir las setas. El chocolate y la miel son una buena forma no slo de consumo sino tambin de transporte (5). Obtencin de las setas: 1. La especie P. semilancetata se pueden recolectar preferentemente durante el otoo en praderas despejadas de suelos cidos, en montaa o en prados. En la provincia de Madrid crece en la Sierra de Guadarrama. 2. Se pueden obtener de las tiendas denominadas Smart Shops existentes en Holanda; Vienen acompaadas de un prospecto en el que figuran las instrucciones para su administracin, los efectos adversos y las recomendaciones a seguir si estos se presentasen. 3. A travs de Internet se 4068

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pueden adquirir bolsitas odorizantes (smell bags) con las setas o kits que contienen esporas, fertilizantes e instrucciones para su cultivo. 4. Tambin se ha descrito la venta de miel conteniendo las setas trituradas (5). La tenencia o comercializacin de psilocibina y/o psilocina es considerada ilegal en muchos pases. En Espaa est prohibida la venta segn una reciente orden (ORDEN SCO/190/2004 de 28 de Enero, publicado en el B.OE el 6 de febrero de 2004). Esta orden establece la lista de plantas cuya venta al pblico queda prohibida o restringida por razn de su toxicidad, y adems de Stropharia sp y Psilocybe sp. incluye otras setas venenosas (Amanita muscaria, A. pantherina , A. phalloides, Boletus satanas, Clitocybe s.p, Cortinarius orellanus y C. speciosissimus, Galerina marginata, G. automalis y G. unicolor, Gyromitra esculenta, G. giggas, Inocybe sp, Lepiola helveolla, L. joserandi, Lactarius torminoissus, entre otros. La convencin de Naciones Unidas sobre sustancias psicotrpicas incluye la psilocibina y psilocina. Estas sustancias estn ausentes en las esporas y en las primeras etapas de crecimiento del hongo (tabla 1) Tabla 1. Estudio de deteccin de drogas psicoactivas a partir de muestras tomadas en las diferentes etapas de crecimiento de las setas mediante Cromatografa de gases / espectrofotometra de masas (CGEM). Susan T Gross (2000) (6)
Tipo de muestra Esporas Micelio Ndulos micelio Punta de cabeza Seta madura Total de muestras 4 9 22 25 11 12 19 11 7 3 Psilocina 1 Psilocina 2 No detectada 4 9 3 3 0

Psilocina 1: Muestras consistentes con psilocina si el tiempo de retencin y el patrn de fragmentacin concordaba con el estndar de psilocina. Psilocina 2: Muestras que indicaban presencia de psilocina si el tiempo de retencin era consistente con el estndar y contena los iones principales pero le faltaban iones en el patrn de fragmentacin.

Sntomas: en pequeas dosis los sntomas ms frecuentes suelen ser alucinaciones, alteraciones de la conducta, agresividad, prdida de control, sntomas digestivos, taquicardia y midriasis. Las alteraciones duran varias horas (4 a 10 generalmente) y suelen acabar en sueo. El consumo simultneo con alcohol o con otras drogas puede producir el llamado mal viaje. Tambin se han descrito en ocasiones cuadros de arritmia 4069

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cardiaca grave e incluso un infarto de miocardio (7). Segn la literatura consultada se han producido diversos episodios en los que el resultado de la experiencia no ha sido el esperado. Unas veces por confusin en su recoleccin con pequeas Galerinas con resultado de muerte por fallo heptico. Otras veces fue con Cortinarius nefrotxicos con dao renal (8-9). Otros optaron por la compra en lo que se podra llamar mercado negro y los ejemplares que adquirieron o bien eran txicos o bien eran hongos inertes embebidos de una, o varias drogas de abuso, como LSD. Tratamientos: El tratamiento es sintomtico y de soporte con la administracin de sedantes del tipo de las benzodiacepinas. Anlisis de Laboratorio: Muestras botnicas: psilocibina y psilocina mediante TLC (6), GC/EM (6), HPLC (10-11) Muestras clnicas: sangre y orina: psilocina mediante HPLC (12) 2.1.4 Intoxicacin muscarnica por setas: sndrome colinrgico o sudoriano

Especies causantes Clitocybe dealbata: Clitocibe blanco

Nota: las especies de este gnero que contienen muscarina son blancas y de tamao pequeo, siendo las ms famosas C. dealbata, C.rivulosa y C. cerussata. Sombrero: 2-4 cm, expandido, de blanco a grisceo, liso. 4070

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Lminas: adnato-decurrentes, delgadas de color cremoso encarnado, apretadas. Pie: 2-4 cm, del color del sombrero. Esporada: blanca. Espora: 4-5,5 x 2-3 ,m, elipsoidales, hialinas. Hbitat: verano y otoo en corros de brujas en sitios despejados, prados cspedes, jardines, caminos. Confusin: seta de cardo, seta de caa, senderuelas son las ms frecuentes. Inocybe fastigiata: Inocibe cnico

Nota: muchas especies de este gnero contienen muscarina por lo que se debe evitar comerlas. Sombrero: 3-8 cm, cnico, pardo amarillento, fibriloso, cuartendose hacia el margen. Lminas: adnatas, amarillo olivceas, algo estrechas y apretadas. Pie: 4-10 cm, de blanquecino a amarillo ocrceo, fibriloso, fistuloso. Esporada: caqui-tabaco. Espora: 8-14 x 4-7 ,m, lisas, faseoladas. Hbitat: junio a octubre, por todas partes, sobre todo bosques y lugares arenosos. Toxinas: La sustancia txica que poseen estas setas es la muscarina. Su nombre se debe a que en 1969 Schmiedeberg y Koppe encontraron en Amanita muscaria un compuesto txico que llamaron muscarina. Sin embargo esta especie slo contiene trazas de muscarina mientras 4071

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que en algunas setas pertenecientes a los gneros Clitocybe e Inocybe se encuentran mayores cantidades. Estos gneros comprenden especies difciles de identificar. Por ello investigar la presencia de esta toxina puede ser de gran utilidad. Para la enumeracin de las diferentes especies que contienen muscarina puede verse el trabajo de Garca Rolln (13) aunque hay muchas que todava no han sido estudiadas. La riqueza de muscarina de las diversas setas vara mucho, pero en algunas especies de Inocybe se ha detectado ms de un 5 % de peso seco.

Muscarina

Acetil-colina

Sntomas: Los ms caractersticos de este tipo de intoxicaciones son abundante sudoracin acompaado de salivacin y lagrimeo. Por lo general suelen aparecer entre los 15 y 30 minutos despus de la ingestin de las setas. Estas tambin producen vmitos, diarreas, miosis, y disturbios en la visin, bradicardia e hipotensin. La intoxicacin no suele ser grave pero se conoce algn caso de muerte por Inocybe patouillardi y Clitocybe dealbata. Tratamiento: lavado gstrico si el paciente acude en los primeros 30 minutos, cosa infrecuente. Prevenir la deshidratacin debido a que la gran sudoracin y la diarrea pueden haber deshidratado de forma notable al paciente. No hay que suministrar atropina, salvo en los casos de intensa estimulacin colinrgica con bradicardia o hipotensin marcada. Anlisis de toxinas: Muestras botnicas: muscarina mediante capa fina de alta resolucin (HPTLC) (3).

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2.1.5. Intoxicacin cardiovascular por setas: sndrome coprnico Especies causantes Coprinus atramentarius: Coprino antialcohlico

Sombrero: Es primero ovoideo, luego acampanado de 3-6 cm de altura, Poco a poco se va abriendo y deshaciendo por el borde, convertido en liquido negro. De color grisceo, algo pardusco hacia el centro donde se ven algunas escamas. El resto liso y estriado hacia la periferia. Lminas: libres, amplias, densamente apretadas blancas, luego negras al irse licuando, Pie: 6-20 cm, blanco, liso. En la base apenas se nota un pequeo anillo que dura poco. Esporada: negra. Esporas: elpticas, de 8-10 x 5-7 m, lisas, con poro germinativo amplio. Hbitat: desde primavera en grupos apretados , en jardines, bordes de camino, cercanas de troncos. Se trata, en realidad, de una intoxicacin condicional, producida por hongos que interfieren con el metabolismo oxidativo del etanol. Los sntomas slo se presentan si se asocia el consumo de bebidas alcohlicas a la ingestin de Coprinus atramentarius. Otros hongos como Clitocybe clavipes y otras especies del gnero Coprinus se han relacionado con reacciones tipo Antabus en alguna ocasin.

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Toxinas: La ingestin de C. atramentarius seguida de una bebida alcohlica da lugar a unos sntomas semejantes a los producido por Disulfiram conocido tambin con el nombre de Antabs, sustancia utilizada en medicina en los alcoholicos. Esto hizo suponer, en un principio, que el componente causante de la intoxicacin era el Disulfiram. En 1975, dos grupos cientficos, trabajando unos en Estados Unidos y los otros en Suecia, aislaron independientemente la sustancia denominada Coprina. La estructura, determinada por el Profesor Dardenne, es una combinacin del aminocido glutamina con un derivado de la ciclopropanona.

Coprina

Aminociclo propanol

La coprina, como tal, es inactiva, pero en el organismo se descompone parcialmente dando el hidrato de ciclopropanona o aminociclopropanol, que interfiere con la funcin del enzima acetaldehdo-deshidrogenasa en el hgado. Esto hace que se retarde el metabolimo del alcohol y se acumule acetaldehdo en la sangre afectando al sistema nervioso vegetativo. El contenido de Coprina en la especie C. atramentarius es variable, pero se citan cifras de 160 mg por Kg. Sntomas: se producen trastornos cardiovasculares tales como vasodilatacin, congestin y cianosis de la cara, taquicardia, zumbido de odos etc. cuando se ingiere alguna de estas especies de setas con vino u otra bebida alcohlica de fuerte graduacin. Estos sntomas pueden repetirse durante unos das, cada vez que se vuelve a tomar bebidas alcohlicas. En algn caso raro se habla de colapso tras hipotensiones importantes e incluso de lesiones hepticas o renales. Tratamiento: aparte de la supresin de bebidas alcohlicas, al menos, durante cinco das despus de la ingesta de las setas, son de utilidad las medidas de soporte y sintomticas. La Vitamina C a dosis altas por va intravenosa tiene un efecto favorable, tal vez como factor redox. Hongos incompatibles con el alcohol: Se ha descrito que la ingestin de determinadas setas con alcohol producen cuadros de gastroenteritis que no parecen estar asociados a la formacin o acumulacin de acetaldehdo. Las setas responsables de este tipo de intoxicacin son: 4074

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Morchella augusticeps, Pholliota squarrosa, Boletus luridus y Polyporus sulfureus. Se sospecha que la causa de esta intoxicacin radica en el hecho de que estas setas contienen toxinas que no se absorben en condiciones normales pero s en presencia de alcohol, seguramente por una especial solubilidad de stas en el etanol. 2.1.6. Intoxicacin hemoltica por setas

Existen diferentes especies de setas que contienen hemolisinas termolbiles, no bien identificadas, que pueden provocar un trastorno hemoltico, en general leve, si se consumen crudas o poco cocinadas. Sin embargo si se desecha el agua de coccin o se realiza una coccin prolongada pueden consumirse sin problema. Las ms conocidas son las colmenillas (Morchellas) y la amanita vinosa (Amanita rubescens). Sin embargo, existe una forma grave de hemlisis mediada por complejos inmunes, que se produce en algunas personas al consumir, de forma repetida, la especie Paxillus involutus. Paxillus involutus: Paxilo enrollado

Sombrero: 5-25 cm, convexo, pronto deprimido, de pardo caqui a pardo ferruginoso. El borde este generalmente muy enrollado. Lminas: decurrentes, amarillo-rojizas, manchadas de ferruginoso, blandas y que se desprenden con facilidad al empujar con el dedo. Pie: 3-7 cm, firme, plido, pardo oscuro al tacto. Esporada: pardo-ocre. Esporas: de color ocre herrumbre, elipsoidales, de 8-10 x 5-7 m, lisas. Hbitat: especie muy comn desde primavera a otoo en bosques, taludes y cunetas. 4075

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En Alemania y algunos pases del Este, la consideran como mortal, hasta el punto de termerla casi tanto como a Amanita phalloides. Al parecer, se trata ms de una alergia a esta seta que de una intoxicacin fngica. Un antgeno de estructura desconocida presente en el hongo estimula la formacin de un anticuerpo. Cuando se vuelven a ingerir estas setas, se forman complejos antgeno-anticuerpo que daan la superficie de los eritrocitos y dan lugar a su aglutinacin y hemlisis. Anlisis de laboratorio Si se sospecha la posibilidad de una hemlisis inmunitaria por la seta Paxilllus involutus se pude detectar la presencia de anticuerpos en el suero del paciente (14). Incubar durante 30 minutos a 37C una mezcla, a parte iguales, de suero del paciente y un extracto acuoso del hongo al 0,05%. Se coloca una gota de la mezcla y otra de una suspensin de hemates humanos del grupo 0 negativo. Tras una segunda incubacin a 37 C se observa mediante centrifugacin la presencia o ausencia de aglutinacin. 2.2. Micetismos De Largo Perodo De Latencia

Los sndromes ms graves son los asociados a un perodo de latencia largo. El intervalo entre la ingesta y la aparicin de los primeros sntomas es superior a 6 horas, en general entre las 9 y las 15 horas, pudiendo llegar en algn caso hasta los 10 o 15 das. 2.2.1. Intoxicacin por setas hepatotxicas: sndrome cilopeptdico

Especies causantes Amanita phalloides: Oronja verde, Seta mortal, Cicuta verde. Esta especie es la responsable de la mayora de fallecimientos producidos por ingestin de setas.

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Sombrero: 5-12 cm, convexo, despus plano, verdoso amarillento muy variable. Lminas: libres, desiguales, blancas. Con una gota de Ac. sulfrico suelen tomar color violceo. Pie: esbelto, aumenta en grosor hacia la base donde forma un bulbo ovoideo rodeado por una Volva con forma de saco, amplia y membranosa. Anillo membranoso y colgante en la parte alta del pie. Esporada: blanca. Espora: ovales o casi redondas, 8-11 x 7-9 m, lisas y amiloides. Hbitat: verano y otoo, bosques de planifolios, especialmente encinas. Confusin: Amanita caesarea, Amanita vaginata, Amanita gemmata, Tricholoma equestre seta de los caballeros, Tricholoma terreum, Hygrophorus sp. Nota: la Amanita virosa y Amanita verna son especies igual de txicas que A. phalloides.

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Lepiota brunneo-incarnata

Nota: - hay otras pequeas Lepiotas, como L. helveola y L. fulvella, que han causado graves intoxicaciones en Espaa, incluso mortales. - Alguna especies del gnero Galerina, como Galerina marginata, tambin han causado intoxicaciones graves. Toxinas: Theodor Wieland aisl dos grupos de toxinas a partir de ejemplares de A. phalloides: las falotoxinas y las amanitinas o amatoxinas. Tanto por su cantidad como por su accin las amanitinas son las mximas responsables de la toxicidad. Se trata de octapptidos de estructura bicclica de peso molecular entre 900 y 1000 daltons. De las ocho amanitinas naturales que existen, tres de ellas son las que se encuentran en mayor proporcin, alfa, beta y gamma, y por tanto son las responsables de la toxicidad. Estas toxinas actan sobre el ncleo celular, inhibiendo la transcripcin del ADN al ARN por bloqueo de la enzima especfica ARN-polimerasa II. La falta de transcripcin conduce a la interrupcin de sntesis proteca que es en definitiva la causa de la necrosis celular. Las toxinas penetran fcil y ampliamente en las clulas del epitelio intestinal y los hepatocitos, ya que ambas presentan una elevada tasa de sntesis proteica. La cantidad de toxina presente en A. phalloides fresca es del orden de 0,2-0,4 mg/g. Pequeas cantidades de esta seta fresca, 50 g, pueden ser potencialmente letales.

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Sntomas: Fase coleriforme: dura 48 horas y se caracteriza por una gastroenteritis grave: diarrea, nauseas, vmitos y dolor abdominal, acidosis metablica, oliguria por la deshidratacin e hipoglucemia. Puede desencadenarse una insuficiencia renal prerrenal por la hipovolemia. Las pruebas de funcionamiento heptico son normales. Fase de mejora transitoria: a las 48 horas de la ingestin y en parte por la reposicin de lquidos. Fase de agresin visceral: hacia el cuarto da aumentan las transaminasas, aparecen hepatitis txica con afectacin del estado general, subictericia, hepatomegalia blanda y dolorosa, coagulopata de consumo. Tardamente puede presentarse insuficiencia renal. Formas graves: encefalopata heptica, coma, ascitis, fracaso renal, distrs respiratorio del adulto y muerte a los 5-6 das de la ingesta. Las tpicas alteraciones que producen las setas hepatotxicas en el hgado y en el rin consisten en necrosis masiva centrolobulillar y necrosis tubular aguda respectivamente. Los conocimientos de la cintica de las amatoxinas ha permitido mejorar y afinar los protocolos teraputicos. Son toxinas que se absorben a nivel intestinal y alcanzan el hgado y la circulacin general por va portal. Se eliminan por bilis, reabsorbindose nuevamente a nivel intestinal con lo que se establece una circulacin enteroheptica. Circulan en sangre de forma libre, sin unirse a protenas y se eliminan por va renal rpidamente. Tratamiento: de soporte. Rehidratar por va endovenosa con soluciones salinas y glucosadas. Evitar la absorcin de toxinas: sonda nasogstrica o nasoduodenal con aspiracin continua y administracin peridica con carbn activado. Aumentar la eliminacin de las toxinas absorbidas: mantener una diuresis adecuada, neutra con control del balance hdro-electroltico y, si es preciso, de la presin venosa central. Tratamiento sintomtico: corregir las anomalas analticas: hemostasia, funcin renal y heptica, glucemia etc. Tratamiento antidtico: Penicilina G sdica para impedir la entrada de amanitinas al hepatocito. Silibinina: interrumpe la circulacin enteroheptica e inhibe el sistema de transporte de las toxinas de membrana del hepatocito. Acido tictico. 4079

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Anlisis de toxinas: Muestras botnicas: Meixner (15) amanitinas mediante el Test de Wieland o

y amanitina HPTLC (2), HPLC (16). Muestras clnicas: orina: amanitinas totales mediante el kit Amanitin Elisa de los laboratorios Bhlmann (Switzerland). Los resultados son fiables hasta 48 horas post-ingesta. Nota: los niveles sricos de amanitinas en suero son muy bajos. En cambio, en el mismo momento de la intoxicacin, los niveles de amanitinas en orina son de 100 a 150 veces mayores que los registrados en suero. 2.2.2 Intoxicacin por setas hidracnicas: sndrome giromitriano

Este sndrome, que est producido por Ascomycetes, es muy parecido al producido por setas hepatotxicas en cuanto al largo periodo de latencia y a las manifestaciones clnicas de la intoxicacin, aunque en la mayora de los casos no es tan grave. Especies causantes Gyromitra giggas:

Sombrero: 7-20 cm. de anchura, hueco, cerebriforme, con pocas ondulaciones y color crema, avellana. Pie: grueso, corto, con surcos y desigualdades. Interior con zonas huecas; suele estar oculto por los lbulos perifricos del sombrero. Esporada: marfil. 4080

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Espora: 30-37 x 10-14 m, algo fusiformes por tener un pequeo saliente redondeado a cada extremo. Suelen tener una gruesa gota central. Hbitat: en primavera en bosques de pinares. Gyromitra esculenta: Bonete

Sombrero: 4-10 cm de dimetro, generalmente mas ancho que largo, con numerosos pliegue que le da aspecto de cerebro. Color pardo-castao. Pie: corto, con zonas huecas y algunos surcos, blanquecino o crema algo rosado. Esporada: marfil. Espora: elpticas, 18-24 x 9-12 m, lisas, generalmente con dos gotas internas. Hbitat: aparece en primavera y prefiere pinares de suelos cidos. Toxinas: el Acido helvellico, al que se atribua antiguamente la toxicidad de las giromitras, es una mezcla de cidos carboxlico y no es txico. En 1967 List y Luft demostraron la presencia de ms de diez hidracinas en estas setas siendo la ms abundante la Giromitrina (metil-etil-hidracina). En el organismo, por hidrlisis, la giromitrina se transforma en monometilhidracina que acta bloqueando todos los procesos metablicos que tienen como coenzima el fosfato de piridoxal. Por ello produce una afeccin multisistmica: cardiocirculatoria, neurolgica, heptica y renal, acompaada de hemlisis.
Mutagnico y cancergeno Giromitrina
Monometilhidracina

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La dosis letal para el hombre probablemente oscile entre 30-50 mg. de giromitrinas por kilo de peso corporal para el adulto (4,8 a 8 mg. de MMH/Kg) por lo que hara falta ingerir mucha cantidad de setas frescas para intoxicarse gravemente. La giromitrina es una toxina termolbil y voltil lo que explica que no se hayan dado nunca casos de intoxicacin con los hongos bien cocinados o secos. De hecho en otros pases de Europa se hace un gran consumo de estas especies. Sntomas: slo si se ingieren las setas frescas o poco cocinadas se presentan, entre las 6-24 horas postingestin, trastornos gastrointestinales: epigastralgia, nuseas, vmitos y diarrea. Cefalea y malestar general. La mayora de los casos suelen recuperarse entre 1 o 6 das. En cuadros ms severos se producen alteraciones de la conciencia, convulsiones, coma, taquicardia, hemlisis, insuficiencia heptica y renal -como consecuencia de la hemlisis- complicadas por la hipovolemia. Tratamiento: abundantes lquidos para prevenir el dao renal por hemlisis. Como antdoto especfico de las hidracinas se administrar vitamina B6 (piridoxina) a dosis altas por va intravenosa. Hoy en da todava queda por explicar porqu en muchos casos individuos de la misma familia han sufrido una intoxicacin mortal, mientras que otros no han tenido ninguna molestia tras la ingestin de estos hongos. En algunos ejemplos se ha hablado de casos de anafilaxia o de una predisposicin individual. Anlisis de toxinas: Muestras botnicas: giromitrina mediante HPTLC (2), Cromatografa de gases (GLC) (17) 2.2.3 Intoxicacin por setas nefrotxicas: sndrome orellnico

Con anterioridad al ao 1952, en que ocurrieron varias intoxicaciones mortales en Bydgosz (Polonia), los libros de micologa calificaban de comestibles a los cortinarios. De las 102 personas que se intoxicaron, 11 de ellas fallecieron entre 4-16 das post ingesta por fallo renal agudo. Hoy en da se sabe que, al menos dos especies, son severamente txicas: Cortinarius orellanus y C. speciosissimus. 4082

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Especies causantes Cortinarius orellanus:

Sombrero: 3-8 cm, al principio es convexo, algo giboso y luego abierto, De colores vivos, rojo anaranjado oscuro o pardo rojizo. Lminas: adherentes o algo escotadas. de color rojizo-herrumbrosas. Pie: cas cilndrico, liso, amarillo, ocre-dorado un poco azafranado. Cortina: amarillenta que desaparece pronto sin dejar seal. Esporada: pardo herrumbre. Espora: elipsoidal, algo almendrada, de 8,5-12 x 5,5-7,5 m, finamente verrugosas. Hbitat: se ha citado en Catalua y en la Sierra de Guadarrama, pero es muy raro en Espaa. Confusin: con otros Cortinarius. Cortinarius speciosissimus

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Sombrero: 2-8 cm, convexo, extendindose con un mameln puntiagudo, rojo tostado, con margen amarillento cubierto de escamas diminutas. Fuerte olor a rbano. Lminas: un poco escotadas, de ocrceas a ferruginosas, anchas, espaciadas. Pie: 5-11 cm, fusiforme, ocrceo plido, luego ferruginoso con placas amarillas. Esporada: pardo-herrumbre Espora: elipsoides, 9-12 x 6-9 m, con punteado verrugoso. Hbitat de septiembre a noviembre en bosques de conferas y en turberas. Toxinas: Los cortinarios contienen diversas sustancias de estructura complicada, que no se conocen todava en su totalidad. Entre ellos destacan, como mejor estudiados, la orellanina, identificada por Grzymala (1965), de naturaleza bipiridlica similar a los herbicidas de tipo paraquat y las cortinarinas, de naturaleza ciclopeptdica. En la actualidad se acepta que la mayor parte de la toxicidad deriva de la orellanina, que es un derivado dixido de tetrahidoxibipiridilo, dotado de un marcado tropismo por el tejido renal. Es resistente a la coccin y presenta fluorescencia azul a la luz ultravioleta. Cuando pierde un tomo de oxgeno ligado a N se transforma en la Orellinina que tambin es txica. Cuando pierde los dos oxgenos se transforma en orellina, que no es txica.

Orellanina

Orellinina

Orellina

La cantidad de orellanina en hongos secos de C. orellanus es de 14 mg/g y de 9 mg/g para C. speciosissimus. De 100 a 200 g (3 a 10 sombreros) de setas frescas pueden producir un dao renal irreversible en adultos. Aunque las caractersticas clnicas de la intoxicacin orellnica es bien conocida (18) poco se conoce sobre su mecanismo patognico. Los resultados de los anlisis de laboratorio a partir de muestras de plasma, orina, fluidos de dilisis y material de biopsia renal despus del comien-

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zo de los sntomas, mediante TLC (19), revelan que la toxina se fija a los riones y por lo tanto en las muestras de orina, plasma y fluidos de dilisis no se detecta su presencia. Sin embargo, se puede detectar cualitativamente pequeas cantidades de orellanina a partir de material de biopsia renal, durante un perodo de tiempo relativamente largo, desde las primeras manifestaciones clnicas. Sntomas: Tras un largo periodo de latencia de 2-3 das, incluso llega a veces a ser de 17 das, se presenta un cuadro de sed intensa que se acompaa de poliuria y malestar general inespecfico. Poco a poco evoluciona hacia una grave insuficiencia renal, por nefritis tbulo intersticial, que puede llegar a ser irreversible. En ocasiones hepatitis leve. Los sntomas digestivos prcticamente no existen. Tratamiento: no existen antdotos especficos contra las orellaninas. Por lo tanto el tratamiento es sintomtico y de soporte. Al inicio, plasmafresis o hemoperfusin con resinas. Si se presenta una insuficiencia renal no hay otra opcin que la hemodilisis o trasplante renal debido a la irreversibilidad del cuadro. Casustica: En 1998 se produjo en Espaa el primer caso de una intoxicacin voluntaria por Cortinarius orellanus. El paciente, ex-drogadicto, consumi dos ejemplares de esta especie porque estaba convencido de que tena los mismos efectos que las setas mgicas (20). Hoy en da, debido al incremento del consumo de los hongos psilocbicos, es importante considerar esta posibilidad cuando se investiga la etiologa de una nefritis tubulo-intersticial aguda. Amanitas nefrotxicas: Se han descrito intoxicaciones nefrotxicas por setas pertenecientes al gnero Amanita. Por un lado, en Amrica se han recogido 5 episodios con una grave insuficiencia renal producida por la ingestin de Amanita smithiana. Por otro lado, la especie responsable de este tipo intoxicacin en Francia e Italia durante los aos 1991 y 1992 ha sido Amanita prossima (21), muy parecida a Amanita ovoidea, especie apreciada como comestible en la Europa meridional. Anlisis de toxinas: Muestras botnicas: orellanina mediante TLC (19) Muestras clnicas: Biopsias de rin: orellanina mediante TLC (19) 4085

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2.3 2.3.1

Nuevas Patologas Asociadas A Las Setas Rabdomiolisis

Tricholoma equestre : Seta de los caballeros. Tambin es conocida como Tricholoma flavovirens.

Sombrero: 5-8 cm, convexo expandido, de amarillo a amarillo pardusco, con disco central ms oscuro. Lminas: escotadas, de amarillo azufre a amarillo limn. Pie: 5-10 cm, amarillo pardo con fibrillas parduscas. Esporada: blanca. Espora: 6-8 x 3-5 ,m, ovales, hialinas, lisas. Hbitat: bosques de conferas. En el ao 2001 la revista New England Journal of Medicine (22) reportaba 12 casos de rabdomiolisis asociados al consumo de setas. Cinco hombres y siete mujeres fueron hospitalizados en Gironde (Francia) entre 1992 y 2000 con rabdomiolisis severa que apareci aproximadamente a la semana de comer la especie Tricholoma equestre, considerada desde antiguo como comestible de gran calidad. Los sntomas que mostraban eran fatiga y debilidad muscular acompaada de mialgia principalmente en la parte superior de las piernas. Estos sntomas se acompaaron de eritema facial, nauseas sin vmitos y sudor profundo en ocho pacientes. De los doce casos, tres fallecieron. Se descart el que fuera alguna enfermedad bacteriana, viral o inmunitaria. Todos haban tomado como mnimo en tres ocasiones consecutivas la misma especie, recolectada en pinares de la costa del sudoeste francs entre finales de otoo y principios de invierno. Otra especie responsable de un sndrome de rabdomiolisis en Taiwn ha sido Russula subnigricans (23). El gnero Russula se clasifica como causante de sndrome gastrointestinal y en ese pas se han detectado 4086

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altas concentraciones de cadmio en los ejemplares; no obstante, este metal nunca ha dado lugar a rabdomiolisis por lo que se atribuye el cuadro a alguna toxina de la seta. 2.3.2 Eritromelalgia

En el ao 2001 se publica la aparicin de un cuadro de eritromelalgia en dos familias francesas. Al cabo de ms de 24 horas de haber ingerido Clitocybe amoenolens, confundida con Lepista inversa, los pacientes se quejaban de parestesias seguidas de un dolor intenso y edema eritematoso en los dedos. Un sndrome similar ya haba sido descrito en Asia originado por Clitocybe acromelalga, especie que contiene cidos acromlicos, agonistas de los receptores glutamato (24).

3. METODOLOGA

EXISTENTE PARA EL DIAGNSTICO DE LABORATORIO

3.1 Tipos De Muestras 3.1.1 Muestras Botnicas

Siempre que se sospeche una intoxicacin por setas se debe establecer cul es la especie responsable de producir la intoxicacin. Para ello se recurre al estudio de las muestras botnicas disponible que pueden ser: 1. setas que hayan quedado sin cocinar. 2. restos extrados de la basura y 3. sobras del guiso. En caso de no poder disponer de ninguna de estas muestras, se recomienda hablar con los familiares o compaeros y, si es posible, volver al lugar donde fueron halladas las setas y recolectar nuevos ejemplares. No hay que olvidar que uno de los objetivos del diagnstico de laboratorio consiste en establecer cuales son las setas que realmente intoxican y de esta manera poder aportar nuevos taxones al catlogo de especies txicas. Un ejemplo lo encontramos en el ao 1984 cuando por primera vez se prob que la especie responsable de las intoxicaciones ciclopeptdicas en Espaa poda pertenecer tambin al gnero Lepiota y no slo al gnero Amanita (25). 3.2.2 Muestras clnicas

Por un lado, el anlisis se basa en la bsqueda e identificacin de estructuras fngicas en contenido de estmago y heces. Por otro lado se 4087

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tratara de demostrar la presencia de toxinas en muestras procedentes de los fallecidos: orina, sangre, vsceras.

3.2 3.2.1

Clasificacin Botnica Caractersticas macroscpicas

En los hongos superiores distinguiremos dos partes: el sombrero y el pie. En el sombrero nos fijaremos en su forma, bordes y color. Por encima puede presentar unas placas a modo de manchas que son los restos del velo universal que cubra el hongo. Por debajo del sombrero puede haber lminas, como la mayora de las especies txicas, poros (Boletus satanas) o aguijones. En el pie es interesante observar el modo de insercin de las lminas, la longitud, la consistencia, el color. El pie puede presentar un anillo (Amanitas, Agaricus), una cortina (Cortinarius) y/o una volva que es una especie de estuche que rodea al pie por la parte inferior (Amanitas). La carne puede variar en su consistencia, color, olor y sabor.

Sobre el sombrero - Verrugas - Areolas - Escamas

Bordes de sombrero

Formas de Sombreros

Sombrero
Libre Adnata Sinuada Dentada

Liso

Estriado

Acanalado

Plano

Deprimido Convexo

Esfrico

Hemisfrico

Cnico

Ondulado

Estriado

Reticulado

Convexos

Mamelonado

Escotada

Decurrentes

Ventruda

Lminas Anillo

Poros Aguijones

Enrollado

Vuelto

subesfrico

mamelonado

acampanado

pie volva
Delgado Cilndrico Bulboso Sinuoso Atenuado Hinchado

Membranosa A. phalloides

Verrugosa A. muscaria

Anillada A. pantherina
Lateral Macizo Obeso Radicante Hueco

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Esporada: masa de esporas que deposita el sombrero de una seta sobre una superficie cualquiera. El color de la esporada es tpico de cada gnero: Blanca: Amanitas, Clitocibes Rosa: Entolomas Amarilla: Inocibes Herrumbre: Cortinarios Negra: Coprinos

3.2.2

Caractersticas microscpicas

De forma especial se estudian las esporas por ser la estructura fngica que ms informacin aporta. Para ello, mediante el uso del microscopio ptico (100X), se anota el color, la forma, el tamao y la ornamentacin de la espora y se utiliza el reactivo de Melzer. Con esta tincin la pared esporal puede dar una reaccin amiloide, produciendo una coloracin azul ms o menos intensa como en las esporas de Amanita phalloides, Amanita virosa y Amanita verna; una reaccin dextrinoide de coloracin marrn como en las esporas de diferentes especies del gnero Lepiota, o bien, no dar respuesta al reactivo como en las esporas de Amanita muscaria y Amanita pantherina (26). De todas ellas, la ms difcil de reconocer es la reaccin amiloide puesto que a veces se trata de un gris suave o con un ligero matiz azul-grisceo. La reaccin amiloide es ms fcil de observar en la ornamentacin de la pared esporal, verrugas, espinas, etc, Cuando la muestra es un aspirado gstrico, se filtra y se procede a la identificacin del posible resto de seta. Los aspirados sin restos aparentes de setas y las heces se homogeneizan por sonicacin. La concentracin de restos fngicos se lleva a cabo mediante centrifugacin a 3.000 rpm durante diez minutos. El sedimento obtenido se suspende en agua en una proporcin 1:1 aproximadamente. La observacin con el microscopio ptico (40X y 100X) se realiza tras depositar una gota del sedimento sobre un porta-objetos y colocar encima el cubre-objetos. Estas preparaciones tambin se examinan con reactivo de Melzer, aadido por capilaridad, para el estudio de la pared esporal. Aunque existe la posibilidad de identificar ciertos gneros de setas mediante el examen de esporas extradas del contenido de estmago o de las heces (27), apenas existe bibliografa sobre el xito de esta tcnica. Nuestros resultados han sido infructuosos la mayora de las veces y en 4089

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aquellos casos en los que se han detectado fragmentos de setas, la mayora de las veces, no se han podido identificar posiblemente debido a la alteracin de las estructuras fngicas. Pensamos que la ausencia de restos fngicos puede deberse al largo tiempo transcurrido entre la ingesta de las setas y la toma de la muestra.

3.3 3.3.1

Investigacin De Toxinas En muestras botnicas

La bsqueda de las toxinas en muestras botnicas es de gran utilidad, tanto para casos en los que no se haya podido establecer la especie txica como para confirmarla. Hay mtodos rpidos con valor orientativo, como el test de Wieland para amanitinas, y mtodos confirmativos, de los que el ms sencillo y econmico es la cromatografa en capa fina (3). Tambin hay tcnicas ms sofisticadas como la cromatografa de lquidos de alta presin (HPLC), la cromatografa de gases (CG) o el radioinmunoanlisis (RIA), que no siempre estn al alcance de todos los laboratorios. Debido a que el mtodo ms rpido y sencillo para la deteccin de amanitinas en muestras botnicas es el test de Wieland o Meixner, conocido tambin como el test del papel de peridico (15) lo describimos a continuacin: En un trozo de papel de peridico en blanco se marcaron tres crculos, uno para la muestra problema sobre el que se deposita un trozo exprimido de la seta problema, en el segundo se deposita un trozo exprmido de Amanita phalloides como control positivo y en el tercero, considerado como control negativo sin muestra. Todos ellos se dejan secar y, a continuacin, se aade una gota de cido clorhdrico 10N en los tres crculos (fig. 1). Una reaccin de color azul o azul-verdoso al cabo de unos minutos se interpreta como probable presencia de amanitinas. El test de Meixner para el estudio de amanitinas es un mtodo rpido y sencillo pero, como no es especfico, su interpretacin requiere cierta cautela. Se han descrito en la literatura falsos positivos con diferentes especies de setas (28) e incluso con extractos de psilocibina (29). En nuestra experiencia hubo un caso de setas cocinadas en el que el test era de difcil interpretacin. Por lo tanto, siempre que sea posible, se deben aplicar mtodos de confirmacin. 4090

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Test de Meixner. 1. Amanita hepatotxica cocinada; 2. control positivo. Amanita phalloides cruda; 3. control negativo 3.3.2. En muestras clnicas

En general, las setas hepatotxicas son las responsables de haber producido el mayor nmero de muertes por ingestin de setas. Debido a que sus toxinas se eliminan principalmente por la orina, el poder determinar su presencia en este tipo de muestra sera definitivo. En plasma los niveles son muy bajos, de hecho se ha comprobado que en el mismo momento de la intoxicacin, los niveles sricos de amatoxinas son de 100 a 150 veces menores que las registradas en la orina. Hoy en da los laboratorios Bhlmann (Switzerland) han diseado un kit Amanitin Elisa que permite su deteccin de forma rpida pero los resultados son fiable nicamente en las primeras 48 horas post-ingesta. Esto es un gran inconveniente para las muestras forenses puesto que un fallecimiento por este tipo de setas sobreviene aproximadamente al cuarto-quinto da post-ingesta. En nuestra experiencia los casos en los que se tenan datos bastante certeros sobre la posibilidad de una intoxicacin ciclopeptdica nunca se ha detectado presencia de amanitinas en las muestras de orina post morten. 3.4. Remisin De Muestras

Muestras botnicas: se deben de enviar, si es posible, tanto las setas crudas como las cocinadas. Se enviarn por separado en botes de plstico. Rotular. Muestras clnicas: Orina: Se toma una muestra de unos 10 ml en un tubo que si es posible se introducir en tubo de transporte. Enviar refrigerado. Es muy importante indicar el tiempo transcurrido desde la ingesta hasta la toma de la muestra. 4091

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Contenido de estmago: Se enva el contenido en un bote de plstico. Si se detecta presencia de setas en el contenido, remitirlas por separado. Enviar refrigerado. Es muy importante indicar el tiempo transcurrido desde la ingesta hasta la toma de la muestra. Vsceras: en formol al 10% a partir de la solucin comercial. Hgado, Rin etc. Rellenar formulario: El conocimiento de datos generales relacionados con la intoxicacin, datos clnicos y datos botnicos respecto a las setas ingeridas son de gran ayuda no slo para el diagnstico de laboratorio sino para estudio epidemiolgico. Datos generales de la intoxicacin: Fecha y hora de la intoxicacin. Perodo de incubacin. Primeros sntomas. Tipo de intoxicacin. Si ingiri alcohol. Ingreso hospitalario. Datos clnicos: Antecedentes personales y toxicolgicos. Tratamiento instaurado. Datos analticos (transaminasas, creatinina, etc). Datos de la seta/s responsables: Lugar geogrfico de recoleccin. Hbitat. Causa de confusin. Nmero de especies consumidas. Cantidad consumida. Forma de consumirlas. Si fueron nuevamente consumidas.

4. NUEVAS

TECNOLOGAS BASADAS EN EL

ADN

La tecnologa de anlisis del ADN y ms concretamente la tcnica de amplificacin gnica (PCR), no slo ha permitido conocer las diferentes caractersticas del genoma humano sino las de cualquier organismo biolgico, procariote, vegetal, animal o fngico. Debido a la exactitud, precisin y sensibilidad de estas tcnicas, hoy en da la sistemtica molecular est complementando e incluso a veces sustituyendo a la sistemtica tradicional basada en el estudio conjunto de los caracteres macroscpicos y microscpicos. Las regiones de ADN mitocondrial y nuclear que tienen un mayor inters tanto en estudios de filogenia como en taxonoma de hongos, son las que codifican para el ARN ribosmico. El ADNr mitocondrial consta de dos genes, 16S y 23S, que se repiten espaciados a lo largo de su genoma. Por el contrario el ADNr nuclear tiene muchas copias, desde 60 en el gnero Coprinus hasta 220 en Neurospora, que se repiten en tandem y se trata de un sistema complejo que incluye los genes 18S, 28S y 5.8S ARNr. Las secuencias de estos genes estn separadas por dos espaciadores internos que se transcriben, llamados ITS-1 e ITS-2 (Internal Transcribed Spacer) de una longitud entre 200 y 400 bases. Entre estos 4092

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genes hay un espaciador intergnico que no transcribe, llamado IGS (non-transcribed intergenic spacer).
ADN nuclear: Gen ribosomal ADN mitocondrial: Gen ribosomal

ARN: 18S

ITS1
5.8S

ITS2

ARN: s. grande

IGS
5S ADNr: s. pequea

ADNr: subunidad grande

Las secuencias de los genes ARNr del genoma mitocondrial y nuclear estn muy conservadas, evolucionan lentamente y por lo tanto son las ms utilizadas para obtener informacin sobre las relaciones de filogenia. Las zonas no codificantes del ADNr nuclear (ITS-1, ITS-2 e IGS) son ms susceptibles de acumular mutaciones y por lo tanto tienen gran inters en el estudio de la identificacin y tipificacin de especies fngicas. El diseo de cebadores universales dentro de las zonas altamente conservadas de los genes ARNr para PCR (30) ha permitido amplificar las regiones ITS-1, ITS-2 e IGS en un amplio rango de organismos. Existen diferentes metodologas, todas ellas basadas en la PCR, que permiten diferenciar las especies de setas. Para amplificar cada una de las regiones diana con inters en taxonoma (a veces el genoma entero) se disean cebadores especficos para ellas y los productos amplificados pueden ser caracterizados de diferentes maneras. Las tcnicas ms utilizadas en micologa son: Random Amplification of Polymorphic DNA: ADN polimrfico amplificado al azar (RAPD), PCR/Restriction Fragment Length Polymorphism: anlisis del polimorfismo de los fragmentos de longitud (PCR/RFLP) y Amplified Fragment Length Polymorphism: amplificacin de fragmentos de longitud polimrfica (PCR/AFLP): todas estas tcnicas permiten obtener para cada organismo, una serie fragmentos del ADN de diferentes tamaos que dan lugar a un patrn de bandas conocido como DNA fingerprints o huella gentica. Ello se consigue mediante el uso de pequeos cebadores de secuencia arbitraria: fingerprints RAPD (Figura 1) (31) o utilizando enzimas de restriccin: fingerprints RFLP (figura 2) (32) y fingerprints AFLP (31). En todos estos polimorfismos no se sabe cul es el locus que produce cada uno de los fragmentos, por lo tanto aportan poca informacin sobre su variabilidad. Aunque son tcnicas fciles y rpidas de realizar, el principal inconveniente es la dificultad en obtener una reproducibilidad aceptable entre laboratorios. 4093

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Genoma entero

Mtodo de anlisis de polimorfismos PCR/RAPD: ADN polimrfico amplificado al azar

+
Separacin electrofortica: fragmentos amplificados 5 3
3 5 5 3 5 3 3 5

3 5

Amplificacin

Deteccin

Iniciadores de secuencia arbitraria

- 33 -

Figura 1

Mtodo de anlisis de polimorfismos PCR/RFLP: polimorfismos de fragmentos de longitud

Digestin Amplificacin Regin diana

Lugar de restriccin donde los enzimas cortan el ADN de forma especfica

Enzimas de restriccin

ITS-1

ITS-2

F E D C B A

Separacin electrofortica: fragmentos de restriccin

B D C

Deteccin

F
Figura 2

PCR/Single-Stranded Conformation Analysis: anlisis de conformacin de las cadenas desnaturalizadas PCR/SSCA (Figura 3): es un mtodo rpido y econmico para detectar polimorfismos de secuencias sin necesidad de secuenciar. La aplicacin de esta tcnica por nosotros en el estudio de las regiones ITS-1 e ITS-2 a partir de diferentes especies de setas comestibles y en 4094

MTODOS ACTUALES DE DIAGNSTICO DE LABORATORIO EN LAS INTOXICACIONES...

algunas de las especies txicas ms frecuentes demostr, por un lado, un alto grado de variacin entre las especies, ya que cada una poda ser diferenciada en base a su patrn de bandas PCR/SSCA y, por otro lado, un cierto grado de variacin intraespecfica. Al igual que ocurre con las tcnicas anteriores, el perfil que se obtiene no es siempre reproducible pero puede utilizarse como mtodo de screening previo a la secuenciacin (33).
Mtodo de anlisis de polimorfismos PCR/SSCA: anlisis de conformacin de las cadenas desnaturalizadas

ITS-1

ITS-2

Amplificacin Regin diana

Desnaturalizar

Separacin electrofortica: desnaturalizante: Gel MDE ITS-1

57 58 59 60 61

ITS-2
57 58 59 60 61

Deteccin
Figura 3

La movilidad del ADN de cadena sencilla vara con cambios en la composicin de bases

PCR/secuenciacin (Figura 4): el mtodo ms fiable y sensible para detectar y comprender mejor la diversidad gentica es la secuenciacin directa de los productos de amplificacin de la regin diana. La tcnica ms utilizada es la secuenciacin cclica con terminadores marcados. Las secuencias de nucletidos obtenidas para las regiones diana en cada organismo y en diferentes laboratorios pueden ser comparadas y publicadas en bases de datos electrnicas (GENBANK, EMBL etc) y de esta manera se facilita la comparacin entre ellas y con las de otros taxones.
Mtodo de anlisis de polimorfismos PCR/Secuenciacin
Separacin Secuenciacin cclica con Terminadores electrofortica

ITS-1

Amplificacin Regin diana

Marcados con fluorocromos

Edicin de la
secuencia

PRIMER DIRECTO

PRIMER REVERSO

Figura 4

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Si comparamos las secuencias entre individuos de una misma especie de seta o de especies distintas, se puede establecer el grado de variabilidad que existen entre ellas y tratar de desarrollar un test especfico con fines identificativos. Un ejemplo lo aporta un estudio realizado a partir de cinco especies diferentes del gnero Psilocybe y otras cinco del gnero Paneolus. Por los datos de secuencia ITS-1 obtenidos se estableci que dentro de esta regin hay una zona determinada cuya secuencia es comn a estas especies y que adems no se encuentra en ningn otro genoma de hongos. Conociendo su ubicacin se disearon unos cebadores flanqueantes a esta secuencia. Estos productos amplificados slo se generan en presencia de ejemplares pertenecientes a uno de estos dos gneros y por lo tanto son especficos de ellos (34). La creacin de una base de datos de estas regiones no codificantes, a partir de especies txicas de la pennsula ibrica, est siendo objeto de investigacin en nuestro laboratorio. Ultimamente cobra inters el estudio de polimorfismos de sustitucin de un nucletido (SNP): se trata de fragmentos homlogos de ADN cuya secuencia difiere en tan solo un nucletido. El desarrollo de nuevas tecnologas, como la secuenciacin directa, micro-arrays de ADN, espectrometra de masas, Real-Time PCR (RT-PCR) etc, y su aplicacin al estudio de los SNPs est siendo de gran utilidad en el estudio del genoma humano y es de prever que tambin contribuya al avance en la investigacin gentica de las setas. El desarrollo de los mtodos de biologa molecular aplicados al diagnstico de las intoxicaciones por setas constituir un nuevo campo de estudio dentro de la toxicologa.

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