Faculdade de Estudos Superiores Dbora Tocafundo de Souza Marina Celeste Martins Rita de Cssia Lima Morais Sabrina Campos

da Silva Suzielle Lorem Leonel Guimar es

T!C"#C$S %#ST&L'G#C$S

(elo %orizonte

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Dbora Tocafundo de Souza Marina Celeste Martins Rita de Cssia Lima Morais Sabrina Campos da Silva Suzielle Lorem Leonel Guimar es

T!C"#C$S %#ST&L'G#C$S

Trabal-o apresentado . disciplina %istolo/ia 0eterinria como re1uisito parcial . obten2 o dos crditos3 4rofessor5 Dirceu $ntonio Cordeiro 6unior

(elo %orizonte Faculdade de Estudos Superiores

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NDICE

INTRODUO ................................................................................................. 3 PREPARAAO DE TECIDOS PARA EXAME MICROSCPICO..............................4 MICROSCOPIA DE LUZ.................................................................................... 7 MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE E DE CONTRASTE DIFERENCIAL DE INTERFERENCIA.............................................................................................. 8 MICROSCOPIA DE POLARIZAO....................................................................9 MICROSCOPIA CONFOCAL.............................................................................. 9 MICROSCOPIA DE FLUORESCNCIA..............................................................10 MICROSCOPIA ELETRNICA..........................................................................10 RADIOAUTO RAFIA EM SEC!ES DE TECIDOS.............................................1" CULTURA DE C#LULAS E TECIDOS................................................................13 FRACIONAMENTO CELULAR..........................................................................13 $ISTO%U&MICA E CITO%U&MICA....................................................................14 DETECO DE MOL#CULAS EM CORTES $ISTOL ICOS POR MEIO DE INTERAO MOLECULARES DE ALTA AFINIDADE .........................................17 PRO'LEMAS NA INTERPRETAO DE CORTES.............................................."1 CONCLUSO................................................................................................. "3 REFERNCIAS 'I'LIO R(FICAS...................................................................."4

INTRODUO $ %istolo/ia o estudo da estrutura do material biol7/ico e das maneiras como os seus componentes se inter8relacionam9 tanto estrutural 1uanto funcionalmente3 & estudo da -istolo/ia se iniciou com o desenvolvimento de microsc7pios simples e de tcnicas para preparo de material biol7/ico9 tornando8o ade1uado para e:ame3 Este trabal-o apresenta os mtodos de estudos desenvolvidos para -istolo/ia9 en/lobando a prepara2 o de cortes de tecidos em l;mina e o uso de microsc7pios utilizados para visualiza2 o3 & pe1ueno taman-o das clulas e dos componentes da matriz torna a -istolo/ia dependente do uso de microsc7pios3 $lm disso9 pes1uisas em 1u<mica9 fisiolo/ia9 imunolo/ia e patolo/ia s o fundamentais para um con-ecimento ade1uado da biolo/ia9 dos tecidos e dos 7r/ os e de como seus vrios componentes intera/em na sa=de e na doen2a3 & con-ecimento das ferramentas e dos mtodos de investi/a2 o essencial para uma compreens o ade1uada da estrutura e funcionamento das clulas9 tecidos e 7r/ os3 %istolo/ia o estudo dos tecidos do corpo e de como estes se or/anizam para construir 7r/ os3 % 1uatro tecidos fundamentais5 tecido epitelial9 tecido con>untivo9 tecido muscular e tecido nervoso3 &s tecidos s o constitu<dos por clulas e por matriz e:tracelular ?MEC@3 $s clulas produzem a MEC e s o ao mesmo tempo influenciadas e controladas por molculas da matriz9 - uma inte/ra2 o onde clulas e MEC formam uma entidade cont<nua 1ue funcionam con>untamente e responde de modo coordenado .s e:i/Ancias do or/anismo3 Cada um dos tecidos fundamentais formado por vrios tipos de clulas caracter<sticas da1uele tecido9 e por associa2Bes e arran>os caracter<sticos entre clula e matriz e:tracelular9 mas estas associa2Bes s o muito peculiares3 4or outro lado9 analisando o n<vel de or/aniza2 o dos 7r/ os9 observamos 1ue estes s o 1uase sempre formados por uma associa2 o muito precisa de vrios tecidos3 Esta associa2 o de tecidos resulta no funcionamento ade1uado de cada 7r/ o e do or/anismo como um todo3 & sistema nervoso a e:ce2 o9 pois constitu<do 1uase somente por tecido nervoso3
)3)

PREPARAAO DE TECIDOS PARA EXAME MICROSCPICO

& procedimento mais usado no estudo de tecidos ao microsc7pio consiste na prepara2 o de cortes -istol7/icos3 "o microsc7pio de luz ?7ptico ou fotCnico@ a ima/em se forma ap7s um fei:e de luz atravessa al/uma estrutura3 Clulas vivas9 camadas muito del/adas de clulas ou de tecidos9 membranas transparentes de animais vivos podem ser observadas diretamente ao microsc7pio3 "o entanto9 na maioria dos casos os tecidos e 7r/ os s o espessos e n o permitem a passa/em ade1uada de luz para forma2 o de uma ima/emD antes de serem e:aminados no microsc7pio eles devem ser fatiados em sec2Bes muito del/ados 1ue ser o colocados sobre l;minas de vidro3 &s cortes s o obtidos por instrumentos de /rande precis o c-amados micr7tomos9 mas antes os tecidos precisam passar por uma srie de tratamentos 1ue ser o descritos a se/uir5 Fixao

Clulas ou fra/mentos de tecidos e 7r/ os9 assim 1ue retiradas do corpo9 s o submetidas a um processo de fi:a2 o3 Ela tem vrias finalidades5 evitar a di/est o dos tecidos por enzimas presentes nas pr7prias clulas ?aut7lise@ ou em bactriasD endurecer os fra/mentosD preservar em /rande parte a estrutura e a composi2 o molecular dos tecidos3 4ode ser feita por mtodos 1u<micos ou9 menos fre1Eentemente9 por mtodos f<sicos3 "a fi:a2 o 1u<mica os tecidos s o imersos em solu2Bes de a/entes desnaturantes ou de a/entes 1ue estabilizam as molculas formando pontes com molculas vizin-as ?solu2Bes c-amadas de fi:adoras@3 Como pode demorar para 1ue os fi:adores se difundam pelo interior dos fra/mentos9 bom 1ue a amostra se>a cortada em fra/mentos menores9 facilitando a penetra2 o do fi:ador no fra/mento e /arantindo uma mel-or preserva2 o da estrutura3 $lternativamente9 pode se usar a perfus o intravascular do fi:ador9 alcan2ando a intimidade dos tecidos rapidamente pelos vasos san/u<neos9 sendo a fi:a2 o mel-or3 Fm dos fi:adores mais comuns para a microscopia de luz uma solu2 o isotCnica tamponada de formalde<do a GH3 Formalde<do e /lutaralde<do9 outro fi:ador e:tensamente usado9 s o con-ecidos por rea/ir com os /rupos amina ?"%)@ das prote<nas3

)4)

Devido . alta resolu2 o oferecida pelo microsc7pio eletrCnico9 necessrio um cuidado maior na fi:a2 o para mel-or preservar os detal-es da ultra8 estrutura das clulas e da matriz3 4ara esta finalidade uma fi:a2 o dupla de /lutaralde<do tamponado9 se/uida por uma se/unda fi:a2 o em tetr7:ido de 7smio9 tornou8se um procedimento padr o para estudos ultra8estruturais3 & efeito do tetr7:ido de 7smio preservar e fornecer contraste aos lip<deos e prote<nas3

Incluso

4ara obter sec2Bes del/adas com micr7tomo os fra/mentos de tecidos e 7r/ os devem9 ap7s fi:a2 o9 ser infiltrados com subst;ncias 1ue l-es proporcionem uma consistAncia r</ida3 ! usada a parafina ?para microscopia de luz@ e al/umas resinas de plstico ?para microscopia de luz e eletrCnica@3 & processo de impre/nar os tecidos com parafina c-amado inclus o ou embebi2 o em parafina e /eralmente precedido por duas etapas5 desidrata2 o e clareamento3 $ /ua e:tra<da passando os fra/mentos por diversos ban-os de solu2Bes de concentra2Bes crescentes de etanol3 $p7s a desidrata2 o o etanol presente nos fra/mentos deve ser substitu<do por uma substancia intermediria 1ue misc<vel tanto em etanol como no meio 1ue foi escol-ido para inclus o ?parafina ou resina@3 4ara a inclus o em parafina a subst;ncia intermediria mais comumente usada o :ilol3 Iuando os fra/mentos de tecidos s o embebidos em solvente or/;nico9 eles ficam transparentes ou transl=cidos3 $ se/uir9 s o colocados em parafina derretida e 1uente3 & calor causa evapora2 o do solvente or/;nico9 e os espa2os e:istentes dentro do tecido s o preenc-idos por parafina3 Depois dos fra/mentos serem retirados da estufa a parafina solidifica e torna8se r</ida3 &s blocos de parafina s o ent o levados ao micr7tomo9 onde s o seccionados por uma l;mina de a2o ou de vidro de modo a fornecer cortes de +8+* micrCmetro3 $p7s serem seccionados9 os cortes s o colocados para flutuar numa superf<cie de /ua a1uecida e depois colocados sobre l;minas de vidro9 onde aderem e onde ser o depois corados3
)*)

Fixao !sica "o# con$%lao

4ode se usar mtodo de submeter os tecidos a um con/elamento rpido3 &s tecidos fi:ados assim ficam ao mesmo tempo r</idos e prontos para serem seccionados3 & micr7tomo para tecidos con/elados o crostato 3 S o -abitualmente usados em -ospitais para analisar em poucos minutos espcimes obtidas durante procedimentos cir=r/icos3 ! tambm muito =til para os estudos -isto1u<micos em cortes de enzimas e de outras prote<nas9 pois o con/elamento n o as inativa e mantm muitas prote<nas em suas conforma2Bes naturais e em seus locais ori/inais3 Iuando se dese>a estudar lip<deos presentes nos tecidos9 aconsel-vel o uso de sec2Bes con/eladas9 pois a imers o de tecidos em solventes como o :ilol dissolve essas subst;ncias3

Colo#ao

$ maioria dos cortes corada9 por1ue com poucas e:ce2Bes9 os tecidos s o incolores3 $ seletividade com 1ue os corantes coram os componentes dos tecidos pode ser maior ou menor3 Muitos corantes comportam como substancias de carter acido ou bsico e tendem a formar li/a2Bes eletrostticas ?salinas@ com componentes ionizados dos tecidos3 &s componentes dos tecidos 1ue se coram bem com corantes bsicos s o c-amados de bas7filos9 e os 1ue tAm afinidade com corantes cidos s o os acid7filos3 & azul8de8toluidina e o azul8de8metileno s o e:emplos de corantes bsicos3 &utros como -emato:ilina9 comportam como bsicos e se li/am .s estruturas bas7filas das clulas e tecidos3 &s principais componentes dos tecidos 1ue rea/em com corantes bsicos l fazem por conter cidos em sua composi2 o J cidos nuclicos9 /licosamino/licanos e /licoproteinas cidas3

)+)

Corantes cidos ? como &ran/e G9 eosina9 fucsina acida@ coram principalmente os componentes acid7filos dos tecidos9 como por e:emplo as mitocCndrias9 /r;nulos de secre2 o9 prote<nas citoplasmticas e col/eno3 $ combina2 o de -emato:ilina com eosina ?%E@ a mais comum3 $ -emato:ilina cora em azul ou violeta o n=cleo das clulas e outras estruturas acidas ?como por2Bes do citoplasma rica em R"$ e matriz da cartila/em -ialina@3 $ eosina cora o citoplasma e o col/eno em cor 8 de rosa3 S o usados tambm os tricrCmicos ?como os corantes de MallorK e de Masson@9 mostra bem o n=cleo e o citoplasma9 a>udam a diferenciar col/eno e m=sculo liso entre si3 Fma tcnica boa pra diferenciar col/eno o uso do picro8sirius associado com luz polarizada3 Em muitos procedimentos as estruturas s o evidenciadas por um precipitado ou por um corante fluorescente9 mas as clulas e os seus limites n o s o vis<veis3 "este caso usado um contratransporte J trata8se de um corante aplicado a um corte para permitir a visualiza2 o dos contornos das clulas ou n=cleos3 Fma outra maneira de evidenciar componentes de clulas e tecidos a sua impre/na2 o por metais9 como prata e ouro9 mtodo comum para estudar tecido nervoso3 & procedimento inteiro pode demorar de +) - . dois dias9 dependendo do taman-o do tecido9 do fi:ador e do meio de inclus o utilizados3

MICROSCOPIA DE &U'

"o microsc7pio de luz9 as prepara2Bes coradas s o e:aminadas por ilumina2 o 1ue atravessa o espcime3 & microsc7pio composto por partes mec;nicas e 7pticas3 & componente 7ptico tem trAs lentes5 condensadora9 ob>etivas e oculares3 & condensador concentra a luz de uma l;mpada e pro>eta um fei:e luminoso sobre o espcime3 $ ob>etiva recebe a luz 1ue atravessou o espcime e pro>eta uma ima/em aumentada do ob>eto em dire2 o a ocular9 1ue novamente amplia a ima/em e a pro>eta na retina9 em uma tela9 em uma c;mera foto/rfica ou em um detector eletrCnico3 "o caso das ima/ens pro>etadas na retina9 a amplia2 o total calculada multiplicando8se o aumento da ob>etiva pelo aumento da ocular3

)7)

R%soluo

4oder de resolu2 o definido como a menor dist;ncia entre duas part<culas ou entre duas lin-as a 1ual permite 1ue elas se>am vistas como dois ob>etos separados3 & poder de resolu2 o m:imo do microsc7pio de luz de apro:imadamente *9) umD esta resolu2 o permite a obten2 o de boas ima/ens aumentadas ate +*** a +L** vezes3 &b>etos menores 1ue *9) um n o podem ser distin/uidos com este instrumento3 Dois ob>etos ser o vistos como um s7 ob>eto se eles estiverem separados por menos de *9) um3 $umentar s7 tem valor pratico se for acompan-ado de resolu2 o 1ue depende essencialmente da ob>etiva9 pois a lente ocular apenas aumenta a ima/em nela pro>etada pela ob>etiva3 Esta sendo ampliada o uso de v<deo8cameras de alta sensibilidade e resolu2 o 1ue permitem a di/italiza2 o de ima/ens 1ue podem ser usadas em computadores para analisa 1uantitativa por meio de aplicativos de analise de ima/ens3

MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE E DE CONTRASTE DIFERENCIA& DE INTERFERENCIA

Sistemas 7pticos 1ue permitem a observa2 o de clulas e cortes n o corados3 Microscopia de contraste de fase usa um sistema de lentes 1ue produz ima/ens vis<veis de ob>etos 1uase transparentes3 $ microscopia de contraste de fase baseada no fato de 1ue a luz muda sua velocidade ao atravessar estruturas celulares e e:tracelulares 1ue ten-am <ndices de refra2 o diferentes3 Estas mudan2as s o usadas pelo sistema de contrastes de fase para fazer com 1ue as estruturas apare2am mais claras ou mais escuras e fazem deste tipo de microscopia uma ferramenta para observar clulas vivas3 $ microscopia de contraste diferencial produz uma ima/em aparentemente tridimensional3

)8)

MICROSCOPIA DE PO&ARI'AO

Iuando raios de luz passam atravs de um filtro polarizador ?como um "icol ou um filtro 4olaroid@9 eles saem vibrando em uma s7 dire2 o3 Fm se/undo filtro colocado com seu ei:o principal perpendicular ao primeiro filtro blo1uear a passa/em da luz3 Se um tecido 1ue tiver estruturas formadas por tomos e molculas com um alto /rau de orienta2 o ?como celulose9 col/eno9 cristais9 microt=bulos e microfilamentos@ for colocado entre os dois filtros9 a estrutura molecular repetitiva e orientada modifica o plano de vibra2 o da luz 1ue emer/e do primeiro filtro9 fazendo com 1ue estas estruturas apare2am luminosas contra um fundo escuro ap7s passarem pelo se/undo filtro3 $ capacidade 1ue estruturas tAm de /irar o plano de vibra2 o da luz polarizada c-amada birrefrin/Ancia3

MICROSCOPIA CONFOCA&

Geralmente na ima/em - superposi2 o de vrios planos os 1uais aparecem em foco simultaneamente9 causando um certo /rau de deteriora2 o da ima/em3 % um microsc7pio confocal9 1ue torna poss<vel focalizar um plano muito del/ado do espcime3 & espcime iluminado com um fei:e de luz muito estreitoD a ima/em coletada do espcime deve passar por um orif<cio muito pe1uenoD s7 a ima/em ori/inada do plano focalizado alcan2a o detector9 en1uanto as ima/ens de planos anteriores e posteriores s o blo1ueadas3 $ luz proveniente de fora do plano de foco eliminada9 a defini2 o do ob>eto focalizado fica mel-or e a localiza2 o dos componentes do espcime pode ser feita com muito mais precis o 1ue no microsc7pio de luz3 $rran>o usado na maioria dos microsc7pios confocais5 a ilumina2 o fre1Eentemente provida por uma fonte de laserD como esta fornece um ponto de ilumina2 o muito pe1ueno9 ele deve ser varrido sobre o espcime para permitir a observa2 o de uma rea muito maior do espcimeD o componente do espcime 1ue de interesse deve ser marcado com uma molcula fluorescenteD a luz usada para formar uma ima/em a1uela 1ue refletida pelo espcimeD a luz refletida capturada por um detector9 onde o sinal amplificado eletronicamente para ser visto em um monitor3
)9)

Como somente um plano focal muito del/ado focalizado de cada vez9 poss<vel reunir os vrios planos de um espcime e reconstru<8los em um ob>eto tridimensional3

MICROSCOPIA DE F&UORESC(NCIA

Iuando al/umas subst;ncias s o irradiadas por luz de certo comprimento de onda9 elas emitem luz com um comprimento de onda mais lon/o3 Este fenCmeno a fluorescAncia3 "a microscopia de fluorescAncia as sec2Bes de tecidos s o irradiadas com luz ultravioleta e emitem luz na por2 o vis<vel de espectro9 fazendo com 1ue as substancias fluorescentes apare2am bril-antes3 & microsc7pio possui uma fonte de luz ultravioleta muito intensa e filtros especiais 1ue selecionam o comprimento de onda dos raios luminosos 1ue atin/em o espcime e tambm dos raios 1ue s o emitidos pelo espcime3 Substancias fluorescentes 1ue ten-am afinidade por molculas presentes nas clulas ou na matriz e:tracelular podem ser usadas como corantes fluorescentes9 como o alaran>ado de acridina9 1ue pode combinar com o D"$ e o R"$3 & comple:o D"$8alaran>ado de acridina emite fluorescAncia de cor verde8amarelada e o comple:o R"$8alaran>ado de acridina emite vermel-a alaran>ada3 &utra aplica2 o resulta da combina2 o 1u<mica de substancias fluorescentes ?como isotiocianato de fluoresceina J F#TC@ com molculas 1ue se li/am especificamente a componentes das clulas e tecidos9 permitindo a identifica2 o destes componentes atravs da fluorescAncia 1ue eles ir o emitir3 MICROSCOPIA E&ETR)NICA

$ microscopia eletrCnica de transmiss o e de varredura se baseia na intera2 o entre eltrons e componentes dos tecidos3 Mic#osco"ia %l%*#+nica ,% *#ans-isso

! um sistema de produ2 o de ima/ens 1ue permite uma alt<ssima resolu2 o ?*9+ nm9 na prtica Mnm@9 resolu2Bes 1ue permite 1ue espcimes ampliados a
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at G***** vezes se>am vistos com detal-es3 Esta amplia2 o s7 pode ser usada para analisar part<culas ou molculas isoladas9 pois cortes del/ados de clulas e tecidos podem ser observados com detal-es em aumento de ate cerca de +)**** vezes3 & funcionamento do microsc7pio se baseia em5 eltrons podem ser desviados por campos eletroma/nticos de uma maneira semel-ante ao desvio ?refra2 o@ produzido na luz por lentes de vidro3 Eltrons s o liberados pelo a1uecimento de um filamento metlico ?catodo de tun/stAnio@ em vcuo3&s eltrons liberados no catodo s o submetidos a uma diferen2a de volta/em de N*8+)* O0 e:istente entre catodo e anodo3 &s eltrons s o atra<dos pelo anodo e acelerados9 atin/indo altas velocidades3 $p7s passarem pelo orif<cio do anodo eles formam um fei:e de eltrons 1ue percorre o tubo do microsc7pio3 "o tubo9 o fei:e de eltrons passa pelo interior de bobinas eltricas ?bobinas eletroma/nticas@ e desviado de maneira anlo/a ao 1ue acontece com um fei:e luminoso em lentes de vidro3 $ confi/ura2 o do microsc7pio5 a primeira lente uma condensadora 1ue focaliza o fei:e de eltrons do espcime3 $o atravessar o corte al/uns eltrons intera/em com tomos do espcime e continuam seus tra>etos em dire2 o .s outras lentes9 en1uanto outros eltrons simplesmente cruzam o corte e Psem intera/ir com ele3 Dos eltrons 1ue atin/em a lente ob>etiva forma8se uma ima/em aumentada do ob>eto 1ue pro>etada nas outras lentes 1ue por sua vez aumentam a ima/em ainda mais3 4ara se observar uma ima/em os eltrons necessitam ser captados por um detector9 uma placa fluorescente9 um ne/ativo foto/rfico o uma c;mera CCD3 Como a ima/em no microsc7pio produzida pelo balan2o da 1uantidade de eltrons 1ue atin/iram o detector e eltrons 1ue foram retidos no tubo do microsc7pio9 a ima/em resultante sempre em preto8e8branco3 $s reas escuras de uma micro/rafia eletrCnica costumam ser denominada de eltron8densas9 e reas claras de eltron8lucentes ou eltron8 transparentes & microsc7pio utiliza cortes muito mais del/ados3 4ara obter estes cortes os tecidos s o inclu<dos em resinas plsticas9 como as do tipo ep7:i3 &s blocos de tecido s o seccionados com naval-as de vidro ou de diamante e os cortes s o coletados sobre pe1uenas /rades de metal3

) 11 )

Mic#osco"ia %l%*#+nica ,% .a##%,u#a

Fornece ima/ens pseudotridimensionais das superf<cies de clulas9 tecidos e 7r/ os3 "este microsc7pio um fei:e de eltrons de di;metro muito pe1ueno focalizado sobre o espcime percorrendo se1Eencialmente sua superf<cie3 &s eltrons n o atravessam o espcime3 &s eltrons varrem uma del/ada camada de metal previamente aplicada ao espcime e s o capturados por um detector e transmitidos a amplificadores e outros componentes eletrCnicos 1ue /eram um sinal3 Este resulta em uma ima/em preto8e8branco 1ue pode ser observada em um monitor9 /ravada ou foto/rafada3 "as ima/ens os ob>etos parecem ser iluminados e possuem locais sombreados fornecendo uma idia de trAs dimensBes3

RADIOAUTO/RAFIA EM SEC0ES DE TECIDOS

4ermite o estudo funcional de processos biol7/icos em cortes de tecidos pelo uso de radioatividade9 aproveitando a capacidade de al/umas substancias radioativas sensibilizarem emulsBes foto/rficas3 Cristais de brometo de prata presentes na emuls o foto/rfica funcionam como detectores de radioatividade da mesma maneira como eles respondem . luz em um ne/ativo foto/rfico3 $ primeira etapa fornecer tomos ou molculas radioativas .s clulas3 $ escol-a destas subst;ncias depende da finalidade do estudo5 aminocidos radioativos9 nucleot<deos radioativos9 a2ucares radioativos etc3 Estas molculas s o c-amadas de precursores9 por1ue podem ser usadas pelas clulas para sintetizar molculas maiores como prote<nas9 cidos nuclicos9 polissacar<deos e /licoproteinas3 Cortes dos tecidos a serem analisados s o cobertos por uma emuls o foto/rfica3 Depois de um tempo9 as l;minas passam por uma revela2 o foto/rfica e s o depois e:aminadas ao microsc7pio3 &s cristais da emuls o 1ue foram atin/idos por radia2 o ori/inam pe1uenos /r;nulos pretos de prata metlica 1ue indicam a e:istAncia de radioatividade no tecido3 $s estruturas do corte 1ue contem molculas radioativas ficam cobertas por estes /r;nulos3 Este procedimento pode ser usado tanto em microscopia de luz como eletrCnica3 Se o precursor fornecido tiver sido um aminocido radioativo poss<vel con-ecer 1uais clulas de um tecido produzem mais e 1uais produzem menos prote<nas9
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por1ue o numero de /r;nulos de prata e:istentes sobre as clulas proporciona . intensidade de s<ntese de prote<na3 Se for usado um precursor radioativo de D"$ ?como timidina radioativa@9 poss<vel determinar 1uais e 1uantas clulas de um tecido est o se preparando para se dividir3 CU&TURA DE C1&U&AS E TECIDOS

Clulas podem ser mantidas vivas e estudadas fora do corpo sendo muito =til para estudar o efeito isolado de molculas sobre um determinado tipo de clulas ou tecido3 $ cultura de clulas permite tambm a anlise direta do comportamento de clulas vivas por meio de um microsc7pio e de varias e:periAncia 1ue podem ser e:ecutadas em um animal vivo pode ser feitas in vitro3 $s clulas e os tecidos s o cultivados em solu2Bes de composi2 o con-ecida ?sais9 aminocidos9 vitaminas@ .s 1uais s o fre1Eentemente adicionados componentes do soro3 4ara preparar devem ser inicialmente separadas mecanicamente ou por meio de tratamento enzimtico3 Fma vez isoladas as clulas podem ser cultivadas em suspens o ou podem ser colocadas sobre uma placa de 4etri ou sobre uma lam<nula de vidro9 superf<cies sobre as 1uais elas costumam aderir e crescer sob forma de uma =nica camada de clulas3 Culturas feitas desta maneira s o culturas primarias3 $ maioria das clulas obtidas de tecidos normais tem uma dura2 o de vida finita9 pro/ramada /eneticamente3 Muitos tipos de clulas ori/inalmente isolados a partir de tecidos normais ou patol7/icos e mantidos in vitro constituem a/ora lin-a/em permanente de clulas3 4ara permitir a QimortalidadeR de clulas normais in vitro - necessidade submetA8las a um processo c-amado de transforma2 o3 Todos os procedimentos com clulas e tecidos vivos devem obviamente ser e:ecutados em uma rea estril e usando8 se solu2Bes e e1uipamentos estreis3 FRACIONAMENTO CE&U&AR

&r/anelas e outros componentes das clulas e tecidos podem ser purificados e isolados por meio de uma tcnica c-amada fracionamento celular3 ! um processo f<sico pelo 1ual usada a for2a centrifu/a para separar as or/anelas e componentes celulares em fun2 o de seus coeficientes de sedimenta2 o 1ue depende de seu taman-o9
) 13 )

forma9 densidade e viscosidade do meio em 1ue esta suspensa3 $ composi2 o 1u<mica e fun2Bes das or/anelas e molculas podem ent o ser estudadas in vitro3 $s fra2Bes obtidas por estas tcnicas podem ser analisadas ao microsc7pio eletrCnico para verificar sua pureza3 2ISTO3UMICA E CITO3UMICA

Estes termos s o usados para indicar mtodos 1ue identificam e localizam substancias em cortes -istol7/icos ou em clulas cultivadas3 % vrios procedimentos para obter estas informa2Bes9 a maioria baseada em rea2Bes 1u<micas especificas ou em intera2Bes de alta afinidade entre molculas3 Estes mtodos normalmente ori/inam substancias insol=veis coloridas ou eltron8densas9 1ue permitem a localiza2 o de tomos ou de molculas por microscopia de luz ou eletrCnica3 ons

0rios <ons podem ser localizados em tecidos com estes mtodos9 usando rea2Bes 1u<micas 1ue produzem produtos insol=veis escuros ou coloridos3 4ci,os nucl5icos

& D"$ pode ser identificado e 1uantificado nos n=cleos das clulas por meio de rea2 o de Feu/en9 1ue produz uma cor vermel-a no D"$3 & D"$ e o R"$ tambm podem ser evidenciados pela colora2 o de clulas ou de cortes de tecidos com corantes bsicos3 P#o*%!nas

Embora -a>a mtodos /erais para detectar prote<nas e9 clulas e cortes de tecidos9 os mtodos -isto1u<micos normalmente n o permitem localiza2 o de prote<nas espec<ficas9 o 1ue pode ser feito pela imunocito1u<mica %9 porm9 vrios mtodos -isto1u<micos 1ue revelam com maior ou menor especificidade um /rupo /rande de prote<nas9 as enzimas3 Estes mtodos normalmente aproveitam a capacidades das enzimas para rea/ir com li/a2Bes 1u<micas especificas3 $ maioria dos mtodos -istoenzimticos funciona do se/uinte modo5

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+@ cortes de tecidos s o imersos em uma solu2 o 1ue contem o substrato da enzima cu>a presen2a se 1uer verificar9 e desta maneira se permite enzimas se apresenta nas clulas ou matriz intera>a com o seu substratos D )@ Em se/uida o corte posto em contato com a subst;ncia marcadora 1ue rea/e com uma molcula 1ue deve ser insol=vel9 precipita sobre o local 1ue contm a enzima9 denunciando8aD este produto final deve ser colorido ou eltron8denso para ser vis<vel por microcospia de luz ou eletrCnica3 $o e:aminar um destes cortes ao microsc7pico9 poss<vel observar as clulas ?ou or/anelas@ cobertas com um material colorido ou eltron8denso3 $l/uns e:emplos de enzimas 1ue podem ser detectadas s o5 Fosfatases s o enzimas amplamente encontradas no or/anismo3Elas clivam a li/a2 o entre um /rupo fosfato e um res<duo de lcool de molculas fosforiladas3 & produto estas tcnicas podem8se detectar fosfatases alcalinas 1ue tAm sua atividade m:ima em um p% alcalino3 Fre1Eentemente usa um rea2 o de detec2 o de fosfatases cidas para de mostrar lisosso-os9 or/anelas citoplasmticas 1ue contAm /rande 1uantidade destas enzimas3 Deidro/enases removem -idro/Anio de um substrato e o transferem a outro3 % muitas deidro/enases nas clulas9 onde tAm um papel importante vrios processos metab7licos3 $ demonstra2 o -isto1u<mica de deidro/enases consiste em incubar cortes de tecidos n o fi:ados em uma solu2 o 1ue contem uma molcula 1ue9 ao receber -idro/Anio9 precipita sob forma de uma substancia colorida insol=vel34or este mtodo9 a succionodeidro/enase 8 enzima fundamental do ciclo do cido c<trico ?ciclo de Srebs @ J pode ser localizada nas mitocCndria3 $ "%#oxi,as% 9 presente em vrios tipos celulares9 uma enzima 1ue promove a o:ida2 o de certos de certos substratos e a transferAncia de <ons de -idro/Anio para per7:ido de -idro/Anio9 produzindo ao mesmo tempo molculas de /ua 3 4ara a detec2 o de pero:idase9 clulas ou cortes de tecidos s o incubados em uma solu2 o 1ue
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contm per7:ido de -idro/Anio e M9M8diaminoazobenzidina3 Esta ultima subst;ncia o:idada na presen2a de pero:idase9 resudoltando em um precipitado insol=vel marrom ou eltron8denso 1ue permite a localiza2 o da atividade pero:idase em microsc7picos de luz e eletrCnicos 3$ atividade de pero:idase em microsc7picos de luz eletrCnicos3$ atividade de pero:idase em clulas de san/ue9 1ue importante no dia/nostico de leucemias9 pode ser evidenciada por este mtodo3 4elo fato da pero:idade ser uma enzima e:tremamente ativa e produzir rapidamente uma 1uantidade de aprecivel de precipitado insol=vel9 ela tem uma importante aplica2 o prtica5 ser usada pra marcar outras molculas3 Molculas de pero:idase podem ser e:tra<das de ve/etais9 isoladas a acopladas com outras molculas3

Polissaca#!,%os % Oli$ossaca#!,%os

&s 4olissacar<deos do nosso or/anismo e:istem livres ou combinados com prote<nas e lip<dios3 Iuando combinados eles constituem um /rupo -etero/Aneo e e:tremamente comple:o3 Eles podem ser demonstrados pela rea2 o de cido per<odo8 Sc-iff ?4$S@9 1ue se baseia na transforma2 o de radicais +9)8/licol presentes nos a2ucares em res<duos de alde<do3 Estes res<duos s o9 em se/uida9 revelados pelo rea/ente de Sc-iff9 1ue produz uma colora2 o p=rpura ou ma/enta nos locais do corte em 1ue - muitos polissacar<deos3 Fm polissacar<deo livre muito encontrado no or/anismo o /lico/Anio9 1ue pode ser demonstrado pela rea2 o de 4$S em f</ado9 m=sculo estriado e outros tecidos onde se acumula3 Glicoprote<nas s o molculas de proteinas associadas com cadeias pe1uenas e ramificadas de a2ucares ?oli/ossacar<deos@3 $ cadeia protica predomina em peso e volume sobre cadeia oli/ossacar<deos3 En1uanto al/umas /licoprote<nas n o contAm nen-um /rupo cido ?/licoprote<nas neutras @ e s o 4$S8possitivas 9 outras possuem radicais carbo:ila ou sulfato3Com tanto o /lico/Anio como as /licoprote<nas neutras s o 4$S8possitivos9 a especificidade da rea2 o de 4$S pode ser mel-orada comparando a colora2 o de cortes submetidos a esta tcnica com outros 1ue foram pr8
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tratados com uma enzima 1ue di/ere /lico/Anio3?por e:emplo9 amilase salivar @3 Estruturas 1ue se coram intensamente por 4$S mas9 1ue perdem estar capacidade 1uando pr8tratadas com amilase contAm /lico/Anio3 Glicosamino/licanos s o polissacar<deos n o ramificados9 fortemente aniCnico9 1ue contAm monossacar<odeos aminados ?aminoa2=cares@3 Iuando um /rande n=mero de cadeias de /licosamino/licanos se prende ao lon/o de um ei:o prottico elas constituem os proteo/licanos3$l/uns dos componentes mais importante da matriz e:tracelular do tecido con>untivo s o proteo/licanos3 Diferentemente das /licoprote<nas9 nos proteo/licanos as cadeias de carboidrato constituem o componente principal da molcula3 Glicosamino/licanos e /licoproteinas cidas s o fortemente aniCnicas por causa do seu alto conte=do de /rupos carbo:ila e de sulfato3 4or esta raz o9 eles rea/em intensamente com corante $lcian blue &i"!,ios

$ mel-or maneira de revelar os lip<dios por meio de corantes 1ue s o imersos em solu2 o alco7licas saturadas com esses corantes ? os corantes Suda #0 e Sudan (lacO s o os mais usados @3& corante de dissolve na /ot<culas de lip<dios9 as 1uais ad1uirem a cor do corante3Mtodos adicionais usados para localiza2 o de colesterol e seus steres9 de fosfolip<dios e de /licolip<dios s o =teis para dia/nostica doen2as metab7licas em 1ue - ac=mulo intracelular de diferentes tipos de lip<dios3

DETECO DE MO&1CU&AS EM CORTES 2ISTO&/ICOS POR MEIO DE INTERAO MO&ECU&ARES DE A&TA AFINIDADE

Fma molcula presente em uma clula ou em um corte de tecido pode ser percebida por meio de compostos 1ue intera/em especificamente e li/am8se com a molculas 1ue 1ueremos detectar3&s compostos capazes de fazer o recon-ecimento devem ser previamente acoplados a um marcador9 para 1ue o con>unto molcula8 compostomarcador possa ser visto por meio de um microsc7pico de luz ou eletrCnico3&s marcadores mais usados s o5 substancia florescentes ? param serem visualizados como um microsc7pico de florescAncia ou de laser @9 tomos radioativos ?para serem detectados por radiofoto/rafia@9 molculas de enzimas como a pero:idase
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1ue pode ser detectadas pela demonstra2 o da enzima com per7:ido de -idro/Anio e D$(9 metais ?/eralmente part<culas de a2ucares9 prote<nas e cido nuclicos3 Faloidina9 prote<na $ lectinas e anticorpos s o e:emplos de compostos 1ue intera/em especificamente com outras molculas 3 $ Faloidina 1ue e:tra<da de um co/umelo ?$manita p-alloides @9 intera/e fortemente com actina e /eralmente marcada com substancias fluorescentes para demonstrar filamentos de actina 3 $ prote<na $ uma prote<na e:tra<da Stap-Klococcus aureus 1ue se li/a . re/i o Fc de molculas imuno/lobulinas ?anticorpos@3 Iuando a prote<na $ li/ada a um marcador9 podemos detectar imuno/lobulinas com /rande precis o3 $s lectinas s o prote<nas ou /licoprote<nas derivadas principalmente de sementes de ve/etais 1ue se li/am com alta afinidade e especificidade a carboidratos3Diferentes lectinas intera/em com diferente a2ucares ou se1EAncias de a2ucares3Elas 9 portanto9se li/am a /licoprote<nas9 proteo/licanos e /licolip<dios e s o muito usadas para caracterizar molculas de membranas celulares 1ue contem se1EAncias especificas de a2ucares I-unoci*o6u!-ica ouro@ 1ue podem ser observados por microscopia de luz e eletrCnica3Estes mtodos se destinam principalmente para detectar

Fma intera2 o altamente especifica entre molculas o 1ue ocorre entre uma molcula e um anticorpo3 Mtodos 1ue usam ante corpos marcados s o de /rande utilidade para identificar prote<nas e /licoprote<nas3$ imunocito1u<mica metodolo/ia 1ue permite identificar molculas ou camadas de clulas por meio de anticorpos3 Em uma rea2 o altamente imunocito1u<mica9 clulas em cultura ou um corte de tecidos 1ue supBe conter uma determinada prote<na s o incubados em uma solu2 o 1ue contm um anticorpo 1ue recon-ece esta prote<na3 & anticorpo se li/a especificamente . prote<na e sua localiza2 o pode ent o ser evidenciada por microscopia de luz ou eletrCnica9 dependendo do marcador 1ue foi acoplado ao anticorpo3

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Fma

da

e:i/Ancia

mais

importantes

da

imunocito1u<mica

disponibilidade de um anticorpo contra a prote<nas 1ue se pretende detectar3#sto si/nificada 1ue a prote<na deve ter sido previamente purificada e isolada de forma 1ue anticorpos possam ser produzidos contra ela3 7An*ico#"os -onoclonais % "oliclonais Supon-amos 1ue se 1uer produzir anticorpos contra prote<na T de certa espcie animal ?um rato9 um -umano @ 3 Se : > esta isolada9 ela in>etada em uma outra espcie ?um coel-o9 uma cabra@3 Se a prote<na suficientemente diferente para este animal recon-ecA8la como estran-a9 o animal produzira anticorpos contra a prote<na3 Estes anticorpos os s o coletados do plasma o animal e usado para imunocito1u<mica3 Iuando se oferece ant</eno a um animal9 vrios /rupos de linf7citos deste animal podem recon-ecer por2Bes diferentes de T e os /rupos podem produzir anticorpos diferentes contra as varias por2Bes9 resultando em uma mistura de anticorpos c-amado anticorpo policlonal3 ! poss<vel fornecer a prote<na T para linf7citos mantidos em cultura3 &s diferentes /rupos ?clones@ de linf7citos produzir o anticorpos diferentes contra as varias por2Bes da prote<na T3 Cada clone pode ser isolado e cultivado isoladamente9 de forma 1ue os diferentes anticorpos contra T podem ser coletados e separados3 Cada um destes anticorpos constitui um anticorpo monoclonal3 % varias vanta/ens em usar um anticorpo monoclonal em compara2 o com um anticorpo policlonal9 eles costumam ser mais espec<ficos -avendo menos li/a2Bes inespec<ficas com outras prote<nas9 o 1ue poderia dificultar o recon-ecimento da prote<na T3 % fundamentalmente duas tcnicas usadas em imunocito1u<mica5 Tcnica direta de imonocito1u<mica o anticorpo contra a prote<na T li/ado a um marcador apropriado3 Fm corte de tecido incubado com o anticorpo de forma 1ue o anticorpo intera/e e se li/a a T9 e9 a se/uir9 o corte levado para remover o anticorpo n o li/ado3 & corte observado a microscopia de luz ou eletrCnica9 dependendo do marcador utilizado3 Se o marcador foi pero:idase ou outra enzima9 o corte deve ser colocado em contato com o substrato desta enzima antes de ser analisado3 &s locais do corte 1ue contem a prote<na T ficar o fluorescentes9 ou ser o cobertos por um precipitado escuro ou coloridos devido . presen2a da enzima ou part<culas de ouro3
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$ tcnica indireta de imunocito1u<mica mais sens<vel9 porem re1uer mais etapas3 Se 1uisermos detectar uma prote<na T e:istente em tecidos de ratos9 necessrio inicialmente produzir dois anticorpos diferentes5 anticorpos contra a prote<na T de rato feitos9 por e:emplo9 por um coel-oD em um procedimento paralelo9 imuno/lobulina de um outro coel-o in>etada em uma terceira espcie3 #muno/lobulina de coel-o considerada estran-a por ovel-as ou cabras9 1ue respondem produzindo um anticorpo contra a imuno/lobulina9 um antianticorpo ou antiimuno/lobulina3 Este anticorpo 9 em se/uida9 li/ado a um marcador ade1uado3 "a primeira etapa da tcnica indireta9 um corte de tecido de rato 1ue se supBe conter a prote<na T incubado inicialmente com anticorpo de coel-o antiproteina T de rato3 Depois de lavar os cortes9 estes s o incubados com o anticorpo marcado 1ue recon-ecer e se li/ar ao anticorpo de coel-o 1ue se -avia li/ado . prote<na T3 Em se/uida o corte observado ao microsc7pio de luz ou eletrCnico ap7s tratamento ade1uado9 dependendo do marcador utilizado3 $pesar de ser mais comple:a9 a tcnica de imunocito1u<mica mais sens<vel9 respondendo com um sinal maior 1ue a tcnica direta3 % mtodos indiretos 1ue envolvem uso de outras molculas intermedirias9 como a tcnica 1ue utiliza biotina8avidina3 T5cnias ,% 8i9#i,i:ao

Tcnicas 1ue permitem analises das molculas envolvidas no processo do flu:o de informa2 o do D"$ para prote<na e no controle deste flu:o3 Muitas tcnicas s o baseadas em -ibridiza2 o 1ue a li/a2 o entre duas molculas de cadeia =nica de cidos nuclicos 1ue se recon-ecem um ao outro se suas se1EAncias forem complementares9 formando molculas de cadeia dupla9 permitindo a identifica2 o de se1EAncia especificas de D"$ ou R"$3 72i9#i,i:ao in si*u Iuando aplicada diretamente a clulas e cortes de tecidos9 esfre/a2os ou cromossomos de clulas mit7ticas9 a tcnica c-amada -ibridiza2 o in situ3 ! e:celente para averi/uar se uma clula tem uma se1EAncia especifica de D"$9 para definir a localiza2 o de um /ene em um cromossomo e para identificar as clulas nas 1uais um /ene especifico esta sendo transcrito3 & D"$ deve ser inicialmente desnaturado por calor ou a/entes desnaturantes9 fazendo com 1ue as suas duas cadeias se separem3 $s
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cadeias est o a/ora prontas para serem li/adas a um se/mento de cadeia simples de D"$ ou a um se/mento de R"$ 1ue se>am complementares a se1EAncia 1ue dese>amos analisar3 Esta se1EAncia c-amada de sonda 1ue pode ser obtida por clona/em9 por amplifica2 o das se1EAncias do meio de 4CR ou por s<ntese se a se1EAncia dese>ada for curta3 $ sonda deve ser li/ada a um marcador9 normalmente um is7topo radioativo ou um nucleot<deo modificado 1ue pode ser identificado por imunocito1u<mica3 "a -ibridiza2 o in situ as laminas contendo os cortes de tecidos9 clulas ou cromossomos s o inicialmente a1uecidas para separas as cadeias duplas de D"$9 em se/uida9 uma solu2 o contendo a sonda colocada sobre o espcime3 Depois de lavar a lamina9 a localiza2 o da sonda li/ada a se1EAncia complementar denunciada pelo marcador utilizado3 %ibridiza2 o tambm pode ser e:ecutada com D"$ ou R"$ purificados9 colocados em apoio s7lidos3 Trec-os de molculas de D"$ ou R"$ s o separados por taman-o atravs de eletroforese em /el de a/arose ou em /el de policrilamida3 Em se/uida s o transferidos a uma fol-a de nilon ou de nitrocelulose por meio de um solvente onde os cidos nuclicos podem ser analisados por -ibridiza2 o3 $ tcnica de identifica2 o de D"$ c-amada de Sout-erm blottin/D 1uando a eletroforese feita com molculas de R"$ a tcnica c-amada de "ort-erm blottin/3 $s tcnicas de -ibridiza2 o s o altamente especificas e -abitualmente usadas em pes1uisa9 dia/nostico clinico e medicina forense3

PRO;&EMAS NA INTERPRETAO DE CORTES

Dis*o#<%s % a#*% a*os causa,os "%lo "#oc%ssa-%n*o ,% *%ci,os

$s vrias etapas dos procedimentos podem distorcer os tecidos9 fornecendo uma ima/em 1ue pode diferir da 1ue os tecidos apresentavam 1uando vivos3 Fma causa de distor2 o a retra2 o produzida pelo fi:ador9 pelo etanol e pelo calor da parafina usada para inclus o3 $ retra2 o atenuada 1uando os tecidos s o inclu<dos em resina3 Fma conse1EAncia da retra2 o o aparecimento de espa2os artificiais nas clulas e entre clulas e outros componentes de tecido3 &utra fonte de espa2os artificiais
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 a perda de molculas 1ue n o foram mantidas corretamente nos tecidos pelo fi:ador ou 1ue foram retiradas pelas solu2Bes de desidrata2 o e clareamento3 Todos estes espa2os artificiais e outras distor2Bes causadas pelo procedimento de prepara2 o dos cortes s o c-amados artefatos de tcnica3 &utros artefatos podem incluir pre/as do corte9 precipitados de corantes ou su>eira 3 A *o*ali,a,% ,o *%ci,o

Fma /rande dificuldade apresentada por cortes de microscopia de luz a impossibilidade de se corar facilmente todos os componentes das clulas e tecidos em um s7 preparado3 ! 1uase imposs<vel observar clulas por um microsc7pio de luz e en:er/ar os seus n=cleos9 mitocCndrias9 lisossomos e pero:issomos9 todos envolvidos por uma membrana basal e por uma matriz e:tracelular contendo fibras col/enas9 elsticas e reticulares3 4ara se ter esta ima/em9 necessrio e:aminar vrias prepara2Bes diferentes9 cada 1ual corada por mtodos diferentes9 e assim obter uma vis o completa da composi2 o e estrutura de um tecido3 4or outro lado9 o microsc7pio eletrCnico de transmiss o permite a observa2 o de clulas com todas suas or/anelas e inclusBes envolvidas pela membrana e pelos componentes de matriz e:tracelular Duas ,i-%ns<%s % *#=s ,i-%ns<%s

Iuando uma estrutura tridimensional cortada em sec2Bes muito del/adas9 as sec2Bes parecem ter s7 duas dimensBes5 comprimento e lar/ura3 #s fre1Eentemente conduz o observador a erros se ele n o conscientizar de 1ue uma esfera seccionada vista como um circulo e 1ue um tubo seccionado visto como um anel3 4ara entender a ar1uitetura de um 7r/ o9 necessrio estudar sec2Bes feitas em planos diferentes3 Us vezes9 somente a analise se sec2Bes consecutivas e a sua reconstru2 o em um volume tridimensional tornam poss<vel compreender a or/aniza2 o de um 7r/ o comple:o3

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CONC&USO

$ -istolo/ia -o>e muito importante em vrios campos9 no estudo dos tecidos9 em dia/n7sticos p7s8operat7rios9 no avan2o da rea mdica3 Como a -istolo/ia trabal-a com partes muito pe1uenas de tecidos9 clulas microsc7picas9 foi necessrio o desenvolvimento de tcnicas 1ue possibilitassem um estudo mais preciso3 4ara cada tipo de tecido ou ob>etivo do pes1uisador e:iste um mtodo 1ue ir se aplicar mel-or3 Mas para a utiliza2 o de cada mtodo o pes1uisador deve saber em 1ue consiste a pes1uisa e aplica lo de forma correta3 Enfim9 e:istem muitas tcnicas 1ue nos possibilitam visualizar tecidos9 clulas mel-orando assim o estudo da -istolo/ia 1ue uma ciAncia imprescind<vel para os avan2os da medicina3

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REFER(NCIAS ;I;&IO/R4FICAS

6F"IFE#R$9 L3 C3D C$R"E#R&9 63 2is*olo$ia 9>sica3 ++V ed3 Rio de 6aneiro5 Guanabara Soo/an9 )**W3

) "4 )