Lipodos de Bancrof METODOS HISTOFISICOS Diferencias en las propiedades fsicas de los lpidos permiten una discriminacin microscpica entre

ciertas clases de ellos, por ejemplo, entre lpidos cristalinos y lquidos y entre los tipos hidrofbicos e hidroflicos. Birefringencia de lpidos Lison (19 !" precis que los lpidos no pueden ser identificados solamente por sus propiedades pticas. #in embar$o, siempre es pro%echoso %er un corte te&ido con 'ojo ( en lu) polari)ada con los polari)adores parcialmente cru)ados, para distin$uir $otitas de $rasa que est*n te&idas y son no birrefrin$entes (isotrpicos" de los lpidos cristalinos que permanecen sin te&ir, pero que aparecen anisotrpicos (birrefrin$entes". +laramente el punto de fusin de un lpido determina su aspecto en lu) polari)ada, pero en la pr*ctica los lpidos birrefrin$entes encontrados en los tejidos de mamferos usualmente est*n libres de colesterol o de ,steres cristalinos. -l microscopio de polari)acin ha sido usado tambi,n para distin$uir entre esteres de $licerol (supuesta $rasa neutra, sobre todo tri$lic,ridos" y ,steres de colesterol. .mbos $rupos se ti&en id,nticamente con los colorantes #udan, pero el ,ster de colesterol en tejido con$elado, a menos que en forma cristalina, e/hibe un caracterstico tipo de refraccin doble en lu) polari)ada. -sta birrefrin$encia 0cru) de malta1 (anisotropismo focal cnico" es debida a la estructura cristalina2liquida de los ,steres y tal estado fsico es usualmente debido a la adicin de fosfolpidos y es influenciado por la 34, fijacin y la presencia de a$ua. Los ,steres de $licerol, por otro lado, nunca muestran la birrefrin$encia +ru) de malta5 ellos son lquidos e isotrpicos, o cristalinos con birrefrin$encia normal si son m*s lpidos saturados. #i embar$o, en patolo$as debe recordarse que me)clas de lpidos est*n usualmente presentes, y las me)clas pueden no se$uir las re$las citadas anteriormente. 3ambi,n debe tenerse en mente que ciertas estructuras no lipdicas tales como amieloide y pol%o del $uante (almidn" pueden tambi,n presentarse como birrefrin$entes. Colorantes Sudan Los lpidos que e/isten como $rasas, a saber los aceitosos y $rasientos lpidos hidrofbicos, tienen afinidad por los colorantes #udan. 6or muchos a&os una amplia $ama de estos compuestos han proporcionado casi los 7nicos medios de tincin para lpidos, y al$unos de estos colorantes son usados hoy en da. -n $eneral, se ha asumido que la tincin #udan es un proceso fsico simple, en el que los colorantes son mas solubles en el tejido $raso que en sus sol%entes. #in embar$o, hay al$una e%idencia de que las tinciones pueden ser por un proceso de absorcin Los e/perimentos in %itro de 8olc)in$er 9 Balin (19!:" apoyan esta %isin y muestran que, en el caso de #udan ne$ro, el poder de absorcin de las $rasas est* relacionado con la concentracin del colorante, 34 y el estado fisco de las $rasas, la m*/ima coloracin ocurre cercana al punto de fusin. 6or lo tanto, solo lpidos que son lquidos o semi2lquidos a la 34 de la tincin ser*n te&idos; aquellos en estado solid o cristalino permanecen intactos.

-l primer colorante #udan introducido a la histoqumica fue el sudan <<<, pero =ichaelis prefiri la tincin oscura del #udan <>. -l 'ojo ( colorea mas intenso y es $eneralmente preferido a los otros colorantes rojos. -l mas sensiti%o y %ers*til de todos estos colorantes es el #udan ne$ro B, introducido en 19 ?. 6ara penetrar las $rasas los #udanes se deben disol!er en sol!entes org"nicos, aunque el sol%ente vehicle (vehiculo) muestra ser lo suficientemente diluido (acuoso" para e%itar la e/traccin de lpidos por ellos mismos. >arios sol%entes han sido recomendados, destacando el isopropanol, trietil fosfato, propilen$licol, mientras que @o%an prepar una suspensin coloidal del colorante en una solucin de $elatina acidificada acuosa para e%itar la accin sol%ente de reacti%os or$*nicos en conjunto. 6ara uso $eneral, etanol al ABC es un adecuado sol%ente para 'ojo ( y #udan ne$ro. 6ara estudios particulares es preferido el propilen$licol, puesto que el colorante puede ser e/trado desde el lpido te&ido por propilen$licol sin disol%er el lpido, permitiendo as que el lpido sea rete&ido. -ste procedimiento es 7til cuando est*n presentes me)clas de lpidos y la deposicin del lpido es confinada a al$unas c,lulas. +on etanol al ABC como sol%ente, al$unos lpidos neutros pueden ser perdidos durante la tincin, pero tal p,rdida es menor y no afecta la locali)acin fina. Diferente a otros colorantes #udan, #udan ne$ro B ti&e fosfolpidos como tan bien $rasas neutras. LansinD (19!E", con cromato$rafa y espectroscopia infrarroja, demostr dos fracciones distintas de este colorante5 la primera tincin a)ul2ne$ra de $rasas neutras, mientras que la se$unda fraccin, un colorante b*sico, ti&e $ris los fosfolpidos. -sta reaccin $ris puede ser real)ada como un dicrosmo de bronce si el corte es %isto en lu) polari)ada. La lipofucsina y proteolpidos son tambi,n te&idos $rises, pero no muestran birrefrin$encia. #udan ne$ro B falla al te&ir colesterol cristalino, y lecitinas y *cidos $rasos libres tienden a ser solubles en el ba&o de colorante etanlico. -stas des%entajas pueden ser superadas si se incluye un pre2tratamiento con bromina en el procedimiento de tincin. Lillie (19?F" haba utili)ado bromina para hacer a los lpidos insaturados insolubles en sol%entes or$*nicos. -sto fue aplicado para el m,todo #udan ne$ro por Bayliss 9 .dams (19A:", quienes descubrieron que los *cidos $rasos y fosfo$liceridos eran retenidos en los cortes de tejido durante la tincin, pero el colesterol libre fue tambi,n sudanoflico. Bromina con%ierte el colesterol cristalino a deri%ados que son aceitosos a 34 ambiente y, por tanto, permeables al colorante #udan. -l procedimiento #udan blacD B2bromina puede, por tanto, pro%eer un simple, sensiti%o m,todo para detectar todas las principales clases de lpidos. #i una etapa de e/traccin con acetona es interpuesta entre la brominacion y la tincin, solo los fosfolpidos resistentes a la acetona permanecer*n en el corte para ser demostrados por #udan ne$ro B. 6ara la locali)acin $eneral de $rasas, es mejor usar el 'ojo ( se$uido por una tincin nuclear y, si el corte puede ser %isto con polari)adores parcialmente cru)ados despu,s de la tincin con 'ojo (, la distribucin del colesterol birrefrin$ente no te&ido puede ser apreciado. Los m,todos de tincin histofsicos e histoqumicos para $rasas y lpidos pueden ser ampliamente di%ididos en dos $rupos5 primeramente est*n los de uso diario $eneral, y en se$undo lu$ar est*n los de mejores aplicaciones para in%esti$acin. -stos son desi$nados 0de rutina1 e 0in%esti$acin1 respecti%amente, en los m,todos si$uientes5 'ojo ( en de/trina Gijacin5 3ejidos con$elados o HGB (re%isar" 'esultados5 $rasas rojo brillante y n7cleo a)ul

=,todo est*ndar de #udan ne$ro B para $rasas y fosfolpidos

Gijacin y cortes5 cortes en criostato post fijados en formol2calcio; cortes en criostato no fijados (preferida" 'esultados5 este procedimiento ti&e los esteres insaturados y tri$lic,ridos a)ul2ne$ros. .l$unos fosfolpidos aparecen $rises, los que e/hiben en mielina un dicroismo bronce en lu) polari)ada. Brominacion real)a la reaccin de estos lpidos y adem*s ti&e lectinas, *cidos $rasos libres y colesterol libre. Hota5 la solucin #udan ne$ro no debe estar sobresaturada o los cortes se cubrir*n de un fino deposito. La fijacin real)a la tincin de fosfolpidos (presentes en todos los tejidos", lo que es indeseado en uso $eneral, as, se prefieren los cortes no fijados. =,todo Bromita #udan ne$ro para lpidos

Gijacin y corte5 cortes en cristato post fijados por 1 hora en formol2calcio. =,todo #udan ne$ro Bromita2acetona para fosfolpidos (in%esti$acin"

'esultados5 fosfolpidos $rises y esfin$omielina bronce en lu) polari)ada. In mayor a%ance en la histoqumica de los lpidos fue la introduccin del colorante sulfato #$ul de %ilo como el primer m,todo para diferenciar dos clases de lpidos simult*neamente. Lison (a9 !" demostr que el colorante comprende dos componentes5 una o/a)ona roja, la cual se disuel%e en lpidos neutros y una o/a)ina a)ul que es b*sica y reacciona con fosfolpidos y *cidos $rasos libres. .unque las tinciones de *cidos $rasos han sido reportadas %ariando entre estos dos colores, #mith tu%o la ori$inalidad de demostrar que en una solucin concentrada del colorante, la o/a)ona te&ir* *cidos $rasos mas r*pidamente de lo que la o/acina a)ul es capa) de completar su reaccin con su $rupo carbonilo; as, predomina un color rojo. #in embar$o, si la solucin colorante es diluida, de modo que la o/a)ona sea relati%amente insoluble, la tincin a)ul de *cidos $rasos es mejorada. Lillie (19!?" uso el colorante a p8 B.9 en orden a supresin de unin por radicales de acido fosfrico y de tal modo permiti a los *cidos $rasos ser te&idos selecti%amente. #in embar$o, en papel, al$unos fosfolpidos contin7an ti&,ndose fuertemente, incluso bajo estas condiciones. La interferencia de estructuras no lipdicas se reduce empleando una solucin acido2 hidroli)ada de colorante. #ulfato .)ul Hilo puede ser usado como un indicador preliminar del tipo de lpido presente en el corte de tejido. -n la practica, la me)cla de lpidos tiende a ser te&ida de un color p7rpura intermedio, de modo que una aplicacin mas 7til de estos colorantes es falsa en la modificacin de Dunnin$anJs a partir de la idea de =enschiDJs, por lo que los *cidos $rasos son e/trados primero con acetona, de modo que la tincin sulfato a)ul Hilo ser* confinada subsecuentemente a los fosfolpidos. La e/traccin con acetona para cualquier acido $raso fallara en este procedimiento si los tejidos han sido fijados en formol2calcio puesto que los jabones c*lcicos de tales *cidos $rasos son insolubles e interferiran con la reaccin de fosfolpidos, a menos que ellos hallan sido con%ertidos a jabn de antemano.

=,todo #ulfato .)ul Hilo para lpidos acdicos y neutros (in%esti$acin"

Gijacin y corte5 cortes en criostato post2fijados por 1 hora en formol2calcio 'esultados5 lpidos hidrofbicos insaturados rosa, *cidos $rasos libres rosa a a)ul y fosfolpidos a)ul. =,todo #ulfato .)ul Hilo K .cetona para fosfolpidos (in%esti$acin"

Gijacin y corte5 +omo m,todos anteriores 'esultados5 fosfolpidos a)ules. METODOS HISTO&'(MICOS Desde que la presencia de lpidos en especimenes ha sido obser%ada, se han aplicado procedimientos histofsicos especficos para su identificacin. Ina t,cnica para la identificacin de lpidos desconocidos puede ser utili)ada, inicialmente usando una tincin para $rasas, que puede ser %ista en microscopa de lu) polari)ada, y la e/traccin con acetona para indicar su estado fsico y su cate$ori)acin. . menudo hay pistas sobre el tipo de lpido a esperar, se$7n la naturale)a del corte y la historia clnica del paciente. .l contrario de las tinciones descritas anteriormente, los m,todos histoqumicas in%olucran reacciones qumicas con $rupos especficos, radicales o puentes en la mol,cula lipdica, tomando %entaja de sus confi$uraciones 7nicas a modo de diferenciarlos entre ellos. -l %alor de dichos m,todos es a %eces limitado por la interferencia de sustancias no lipdicas, lo que hace importante la utili)acin de controles. La %alide) de !B t,cnicas se ha determinado en muestras de los lpidos puros te&idos en papel de filtro, as como en lpidos de cortes. #olamente la mitad de los m,todos testeados se consideran confiables y suficientemente selecti%os como para ser recomendados. Los m,todos de eleccin para cada clase de lpidos se e/plicar*n en detalles y las otras t,cnicas se e/plicar*n bre%emente. )cidos grasos libres La obser%acin de BendaJs (19BB" de que los *cidos $rasos libres unen iones de metales pesados para formar jabones condujo a Gischler (19BF" a desarrollar una t,cnica por la cual tales jabones de cobre se pudieran te&ir con hemato/ilina del litio de Lei$ert. (Damoto y colaboradores (19FF" us dimetilaminoben)idina rodanina para el mismo propsito. Hin$uno de los dos m,todos es tan especfico como la adaptacin de 8olc)in$er (19?9"5 ,l %isuali) los jabones de cobre con *cido rube*nico, usando -D3. para remo%er el cobre e/tra. #in embar$o, si el reacti%o del rodanine de (Damato se utili)a para te&ir los jabones formados por el procedimiento de cobre de acetato de 8olc)in$er, proporciona una alternati%a i$ualmente especfica y sensible que el *cido rube*nico, al$o de menos 0bacD$round1 y es compatible con una tincin nuclear de hemato/ilina. -l calcio y depsitos de fierro tambi,n se unir*n al cobre, pero su persistencia en los cortes control es lo que los diferenciar* de los lpidos. -sto tambi,n se puede %erificar por e/traccin con C *cido hidroclrico en el caso del calcio y ?C de *cido o/*lico en el caso de las sales de fierro.

=,todo de *cido rube*nico y cobre para *cidos $rasos libres. #e utili)an cortes por con$elacin Los resultados para los *cidos $rasos libres son %erde oscuro por accin del *cido rube*nico o rojo por la p2dimetilaminoben)idina rodanina. Deben reali)arse controles como por ejemplo la e/traccin con acetona (como es por con$elacin esta e/traccin puede ser reali)ada como una postfijacin".

Colesterol -n 19:F #chult) adapt la reaccin de Leibermann2Burchardt para demostrar colesterol en los cortes. La o/idacin al aire con alumbre de hierro es se$uida por un tratamiento con una me)cla de *cido sulf7rico y ac,tico para dar un color a)ul al colesterol libre y esterificado. -l m,todo fue al$o mejorado por LeMis y Loaban (19!1", pero, aun as, tales reacti%o destructi%os producen preparaciones distorsionadas con muchas burbujas de $as, haciendo difcil su locali)acin. 'oussouM y colaboradores (19A!" super al$unos de estos problemas t,cnicos asociados al procedimiento cl*sico de #chult) usando un reacti%o 0preme)clado1 que es una combinacin del cloruro f,rrico y ac,tico, del *cido sulf7rico y fosfrico. Ina t,cnica de *cido sulf7rico yodado fue descrita por (Damoto y colaboradores (19FF", pero el color es transitorio y es en parte enmascarado por el yodo. -l m,todo perclrico *cido2naftoquinona (6.H" de .dams (19!1", depende de diferentes principios para la deteccin del colesterol y es preferido por su sensibilidad, precisin y por la preser%acin m*s satisfactoria de los tejidos. -l *cido percolrico se cree que sir%e para condensar el colesterol a cholesta-3;5-diene?, el que se con%ierte por la naftoquinona en un pi$mento a)ul. -l colesterol libre puede, en teora, ser distin$uido de sus ,steres por la precipitacin de su digitonide?, distinto en los ,steres, es insoluble en acetona y se puede posteriormente %isuali)ar con la reaccin de #chult) (Gei$in 19?!, schnabel 19!F" o preferentemente con el m,todo 6.H (.dams y Bayliss 19AF". #in embar$o, a menos que la fijacin inicial del corte incluya la di$itonina, ya que el ndice de e/traccin del complejo di$itonina2colesterol es mayor que el ndice del colesterol y la especificidad del procedimiento se puede %er comprometida. Debe ser complicado que los m,todos antedichos son ineficaces a menos que se haya o/idado el colesterol, ya sea qumicamente con las sales f,rricas o por la e/posicin lar$a al o/$eno atmosf,rico. -l colesterol comercial ha sido repurificado por el dibromido de acuerdo al m,todo de Gieser (19? " que es totalmente no reacti%o con los m,todos anteriormente mencionados (.dams y Bayliss 8i$h 19EB". Ina interesante inno%acin en la histoqumica del colesterol es el m,todo en)im*tico (-meis y colaboradores 19AA". -ste es un procedimiento de dos etapas en el cual el colesterol esterificado en la primera es hidroli)ado de su ester por la accin de la colesterolasa, liber*ndose per/ido de hidr$eno, el que reacciona simult*neamente con la diaminoben)idina para producir un polmero insoluble de color caf, en el sitio en donde est* el colesterol. -l esterol libre por s solo puede ser %isuali)ado por la omisin de la etapa inicial de la hidrlisis del ester. Los esteres de colesterol pueden ser demostrados selecti%amente despu,s de que todo el colesterol libre ha sido inacti%ado pre%ia e/posicin a la en)ima o/idasa. -l colesterol esterificado tambi,n puede ser detectado en)ym*ticamente con la colesterolasa (=oril y colaboradores 19E:", en un m,todo que se asemeja al m,todo de la lipasa del calcio para los tri$lic,ridos. -l %alor pr*ctico de estas t,cnicas es al$o limitado por su costo y complejidad para la microscopia de lu) rutinaria, aunque han demostrado ser 7tiles en =-.

Ina de las m*s recientes t,cnicas usa filipin, un compuesto similar a la di$itonina, el que puede ser utili)ado en un medio acuoso para formar un compuesto con el colesterol libre y as producir un compuesto altamente fluorescente. -ste ha sido utili)ado para detectar la acumulacin de libre colesterol culti%os de fibroblastos en la enfermedad de Hiemann26icD tipo +. este m,todo tambi,n puede ser aplicado para cortes por cristato o cortes por con$elacin. (Butler y colaboradores 19EA" =,todo de *cido percolrico2 naftoquinona (6.H" para colesterol. Los resultados obtenidos en esta t,cnica es que el colesterol y sus ,steres adquieren un color a)ul. -sta tincin es estable por slo unas horas. -l colesterol puede ser distin$uido de sus esteres por el m,todo de di$itonina2 6.H o de filipin. =,todo de filipin para el colesterol libre -l colesterol presenta una fuerte fluorescencia plateada. =,todo de di$itonina26.H para colesterol libre -l colesterol libre se ti&e de color a)ul.

*pidos insaturados Las reacciones de los dobles enlaces ($rupos etilenos" en cadenas de *cido $rasos pueden ser utili)ados para distin$uir los lpidos saturados de los insaturados. Los $rupos etilenos pueden ser o/idados a aldehdos de tincin #chiff por el *cido perfrmico (6earse 19?1, Lillie 19?:". #in embar$o, el *cido perfrmico no slo destruye los cortes, sino que tambi,n act7a como sol%ente de al$unos lpidos (Bayliss 8i$h 19A:". .dem*s, la base de la reaccin est* en duda y no debe ser utili)ada ampliamente en histoqumica de lpidos. +omo alternati%a, la brominacin se$uida por el nitrato de plata causas que el bromuro de plata forme enlace doble y esto se reduce posteriormente a la plata met*lica %isible (=uDherji y colaboradores 19!B, Horton y colaboradores 19!:". Belt y 8ayes (19?!" utili)aron lu) ultra%ioleta para o/idar estos dobles enlaces a aldehdos te&ibles con #chiff y su m,todo proporciona una alternati%a 7til a la t,cnica del tetr/ido del osmio, puesto que e%ita el uso del osmio t/ico y costoso. =,todo de #chiff2ultra%ioleta para lpidos insaturados. Los lpidos insaturados se obser%an de color ma$enta. -l tetr/ido de osmio es mas sensible y confiable para la deteccin de lpidos insaturados y posiblemente demuestra los dobles enlaces de los *cidos $rasos estequim,tricamente (.dams 19!?". Norn (19!A" demostr que el osmio reacciona con *cidos $rasos insaturados formando bis-osmates?, como lo su$iri Li$$lesMorth (19?A" y BaDer (19?E". =,todo de tetr/ido de osmio para lpidos insaturados. Los lpidos insaturados adquieren una coloracin que %a del caf, al ne$ro. Los lpidos saturados y el colesterol libre no reaccionan. La solucin del osmio se debe manejar dentro de un e/tractor de aire para e%itar el efecto de su %apor t/ico en la crnea y las membranas mucosas.

-l osmio demuestra lpidos insaturados de esta forma porque este es reducido a /ido ne$ro menor por los puentes de etileno de los *cidos $rasos. -l uso principal que el osmio tiene en histoqumica del lpido pro%iene una obser%acin de =archi en 1EE! en que la adicin de un electrolito polar (tal como una sal del dicromato" a la solucin del osmio pre%iene la tincin de la mielina normal, y permite que solamente los ,steres hidrofbicos del colesterol de la de$eneracin mielnica apare)can ne$ros. -l cl*sico m,todo de =archi para la deteccin de demielinacin sufre la limitacin pr*ctica de que el corte se une demasiado a la osmificacin. .dams (19?9" super este problema cuando adapt el m,todo de =archi para la microscopa en si m,todo de osmio tetro/idenaftilamina ((3.H", el que demostr de$eneracin mielnica y mielina normal en el mismo corte. .unque el m,todo (3.H puede con ,/ito ser usado para detectar las interrupciones de mielina, esteres de colesterol en otros sitios, como en depsito lipdicos de ateromas, donde puede aparecer anaranjado m*s bien que ne$ro; posiblemente por una refle/in de su estado fsico o de su punto de fusin. -studios de los m,todos (.dams y Bayliss 19!E, -lleder y Lojda 19!E, Bayliss 8i$h 19A:, .dams y Bayliss 19AF" colecti%amente su$ieren que el m,todo (3.H no puede lar$amente ser usado para la histoqumica $eneral. Debido al coste y a la to/icidad de los reacti%os empleados, un m,todo alternati%o con%eniente se describe m*s adelante para la demostracin de la mielina normal y de$enerada; que consiste en la combinacin del dicromato hematena *cida2 rojo (. Triglic+ridos Los tri$lic,ridos carecen un $rupo qumico 7nico o una caracterstica fsica por la que puedan ser te&idos selecti%amente, por lo que es sorprendente que a7n as se hayan ideado tinciones especiales para este tipo de lpidos. .dams y colaboradores (19!!" us una lipasa pancre*tica para hidroli)ar tri$lic,ridos como un constituyente de *cidos $rasos. -n presencia de calcio, los jabones insolubles que fueron formados se podran %isuali)ar, despu,s de la con%ersin a los jabones de plomo, con el sulfuro del amonio. 6re2e/istente calcio y *cidos $rasos libres reaccionaran id,nticamente, pero pueden ser detectados en un control tratado sin lipasa. #i la preparacin en)im*tica es pura, esta t,cnica es altamente especfica para los tri$lic,ridos, y se ha adaptado para la electrn2histoqumica. (.dams y colaboradores 19!!" =,todo de +alcio lipasa para tri$lic,ridos. Los tri$lic,ridos se obser%an de color caf,. #e debe comprobar pre%iamente que la lipasa a utili)ar es pura pre%ia re%isin en un papel que conten$a otro tipo de lpidos La reaccin de los depsitos de calcio y *cidos $rasos libres es distin$uida de la %erdadera reaccin con la utili)acin de controles. #i hay *cidos $rasos presentes en altas cantidades estos deben ser selecti%amente remo%idos por e/traccin con hidr/ido de potasio2dio/ano (.rchibald y (rton 19AB"

Fosfoglic+ridos

La t,cnica de *cido hidro/*mico (.dams y Da%ison 19?9, @allays 19! , .dams y colaboradores 19! " es recomendada para selecti%a demostracin de fosfo$lic,ridos (lecitinas y cefalinas". 8idro/ilamina alcalina con%ierte sus enlaces est,ricos en *cido hidro/*mico el que reduce el nitrato de plata a plata met*lica %isible, finalmente estabili)ada a una tonalidad oro. -steres de lpidos hidrofbicos no son te&idos debido a que ellos son impermeables a los a$entes acuosos empleados en esta reaccin. 3ericamente ellos pueden reaccionar si est*n presentes en su forma hidroflica, pero puede ser distin$uido de los fosfo$lic,ridos por su solubilidad en acetona anhidra. Debido a que la hidro/ilamina alcalina es destructi%a de tejidos ellos deben ser fijados adecuadamente, porque la licitina es particularmente susceptible por la formalina, por lo que se debe mantener en ella lo justo y necesario. =,todo de oro *cido hidro/*mico para fosfo$lic,ridos. Los fosfo$lic,ridos (lecitinas y cefalinas" de color p7rpura. Los cortes de criostato pueden lle$ar a ser separadas en diapositi%as. #i sucede esto pueden ser procesado freefloating? despu,s de eso, usando un 0palillo de cristal del hocDey1 para transferirlas sua%emente a partir de una solucin al si$uiente.

,lasmalogeno Fosfolipidos Geul$en y >oit usaron cloruro de mercurio para hidrolisar los enlaces insaturados del eter del plamolo$eno $enerando un aldehdo que reaccione con #chiff. Las e/plicaciones aceptadas para estas dos reacciones simult*neas son5 el cloruro merc7rico es especfico para la reaccin #chiff de Geul$en y se$undo, la o/idacin solamente del aire sobre el doble enlace produce aldehdos seudoplasmal. Las reacciones no especificas se pueden determinar por comparacin de tejidos controles no hidroli)ados, pero en la practica este problema de seudoplasmas, se e%ita usando cortes frescos de tejido con$elado en crostato. La fijacin con formalina no induce una reaccin aumentada de seudoplamal, pero tambi,n produce un deterioro pro$resi%o de los plasmalo$enos fosfolipidos. .fortunadamente la no fijacin de cortes en crostato es recomendada para este m,todo, porque el tratamiento inicial con cloruro de mercurio fija efecti%amente los tejidos seccionados. -eaccin plasmal para ,lasmalogenos *pidos Gijacin y corte #ecciones sin fijar en crostato, la tincin debe hacerse tan pronto como sea posible despu,s del corte. =,todo 1. #ecar al aire dos secciones en portaobjetos separados. :. 8idroli)ar una seccin en cloruro de mercurio al :C por 1Bmin. . La%ar abundantemente en a$ua destilada, tres cambios. F. te&ir ambas secciones con reacti%o de #chiff por 1Bmin. ?. -njua$ar en a$ua destilada y dejar en a$ua corriente por 1B min. 6ara que apare)ca el color. !. +ontraste nuclear con hemato/ilina de =ayer por min. A. La%ar nue%amente en a$ua, enjua$ar en a$ua destilada y montar con $licerina de Oelly. 'esultados

6lasmalo$enos fosfolipidos de color ma$enta. Esfingomielinas -l principio de lpido cromatado fue introducido por =uller, pero fue Lei$ert quien obser%o que la mielina tenia una $ran afinidad por la hemato/ilina despu,s de ser tratada con fijadores que contienen cromatos, siendo esta la fundamentacin de una serie de m,todos en que son usadas sales met*licas como mordientes en tinciones de mielina. BaDer ideo un m,todo de hemateina acida con un preciso protocolo de fijacin , cremacin y tincin, que la %uel%en ra)onablemente especifica para fosfolipidos que conten$an colinas o se$7n 'oo)emond para lpidos polares, los que est*n en un estado fisicoqumico particular. La interferencia de protenas puede ser eliminada por la comparacin con cortes control en los que se han e/trado los lpidos. Dicromato. Hemateina acida /D#H0 M+todo para fosfolipidos 1ue contienen colinas Gijacin y corte #ecciones sin fijar en crostato, tambi,n pueden ser usadas secciones con$eladas con fijaciones cortas. 6reparacin del colorante 8emato/ilina al B.1C ?Bml 6eryodato de sodio al 1C 1ml +alentar hasta her%ir, enfriar y a$re$ar 1ml de acido acetico $lacial. Isar el mismo da de la preparacin. =,todo 1. 3ratar las secciones en bicromato de potasio al ?C en cloruro de calcio al 1C por 1E horas a temperatura ambiente o por : horas a AP+. :. la%ar en abundante a$ua destilada por B minutos . 3e&ir con solucin de hamateina acida por : horas a AP+. F. La%ar y diferenciar en una solucin acuosa que conten$a tetraborato de sodio al B.:?C y ferricianida de potasio al B.:?C por una hora a AP+. ?. 3incin nuclear de contraste con %erde metilo al 1C !. La%ar y montar en $licerina de Oelly. 'esultados Lecitinas y esfin$omielinas color a)ul ne$rusco. +uando el tejido fresco es con$elado y cortado en el crostato son directamente cromatados, las lecitinas son bien preser%adas. La hemateina acida reacciona siendo fa%orablemente combinada con oil red o sudan rojo, para demostrar lpidos neutros y fosfolipidos en al$unas preparaciones. -stos procesos a dos colorantes son 7tiles en la demostracin de mielina normal y de$enerada en forma simult*nea en el contraste de color. #imilarmente el m,todo solocromo2cianina puede usarse con oil red, ti&,ndose a)ul la mielina normal y roja la de$enerada. La t,cnica de la hemato/ilina ferrica, es un m,todo simple, r*pido y aparentemente mas sensiti%o que la D.8; siendo el m,todo de eleccin para las esfin$omielinas, post tratamiento de los cortes con acetona. La 82ferrica tambi,n puede te&ir los n7cleos de a)ul oscuro, lo que si$nificara una des%entaja.

Hemato2ilina ferrica3 m+todo para fosfolipidos Gijacin y corte <dealmente cortes sin fijar en crostato o cortas fijaciones en secciones con$eladas. 6reparacin del reacti%o #olucin .5 .$ua destilada :9Eml 8+l concentrado :ml Ge+l .!8:( :.?$ Ge#(F.A8:( F.?$ -sta solucin puede ser almacenada. #olucin B5 .$ua destilada 1Bml 8emato/ilina B.1$ Disol%er con calor sua%e. -sta solucin debe ser fresca. #olucin de trabajo5 me)clar tres partes dela solucin ., con una *rte de la solucin B y usar dentro de una hora. =,todo 1. 3ratar dos cortes como si$ue5 a" e/traer un corte en una solucin de cloroformo5metanol (:51" por 1 hora a la temperatura de la habitacin. b" -/traer la otra con acetona seca FP+ por 1?min. :. Gijar ambas secciones en formol calcio por Bmin. . -njua$ar en a$ua destilada. F. 3e&ir con la solucin de hemato/ilina ferrica por A min. ?. La%ar en a$ua destilada. !. Dar ba&os en 8+l al B.:C A. La%ar en a$ua E. Deshidratar en acetona, aclarar en /ileno y montar en D6Q. 'esultados Gosfolipidos a)ules H7cleos a)ules -l m,todo puede ser modificado para ser especifico para esfin$omielina. Lo primero es hacer un a hidrlisis alcalina destruyendo los fosfo$liceridos, pero dejando intactos los fosfoesfin$osidos alcalino resistentes. Hidro2ido de sodio.4emato2ilina ferrica5 D#H m+todo para esfingomielina Gijacin y corte =,todo 1. 3ratar la secciones con hidro/ido de sodio := por una hora a temperatura ambiente. :. La%ar en forma sua%e, pero en un $ran %olumen de a$ua. . -njua$ar en acido acetico al 1C por ? se$undos. F. #i las cortes se separaron del %idrio remontarlas y procesar con hemato/ilina ferrica al i$ual que el caso anterior. 'esultados

-sfin$omielina a)ul Hotas #i los plasmalo$enos interfiere, estos pueden ser e/cluidos por tratamiento de los cortes con cloruro de mercurio al 1C en 8+l al 1C por 1B minutos; antes de la hidrlisis alcalina. Cerebrosidos -stos lpidos pueden ser demostrados por reacciones especificas para sus mol,culas de he/osa, modificando tecnicas para carbohidratos. Los cerebrosidos y lpidos relacionados son te&idos por el m,todo 6.#, ori$inalmente dise&ado para mucopolisac*ridos. -l acido peryodico con%ierte las moleculas 1,: $licol de la molecula de he/osa en el aldehido que reacciona con #chiff. (tras confi$uraciones quimicas pueden reaccionar en forma similar, por lo que se debe crear un asecuencia de bloqueo en la que todos los $rupos que interfieren sean suprimidos y el 6.# positi%o solo sea atribuido a las he/osas. Los $rupos amino son con%ertidos a carbonilos por cloroamina 3, el acio performico es usado para o/idar lpidos unidos con enlaces de etileno a aldehidos, que son bloqueados por dinitrofenil hidracina. La distincin entre $licolipidos y he/osas no lipidicas, se hace comparando en un corte control al que se le han e/traido los lpidos. -n $eneral los resultados de la t,cnica son claros, ecepto en el caso del hi$ado, en donde interfiere la reaccin 6.# positi%a del $lic$eno, pero este puede ser remo%ido con diastasa. -eaccin ,#S modificada para cerebrosidos Gijacin y corte +ortes de crostato post2fijados en formol calcio, tejidos fijados por con$elacin 6reparacin de reacti%os .cido performico5 .cido formico 9EC F?ml 6ero/ido de hidro$eno %ol 1BB F.?ml 8:#(F concentrado B.?ml 6reparar una hora antes de usar y re%ol%er ocasionalmente con una ba$eta. =,todo 1. =ontar dos cortes en portas separados, uno de ellos e/traerlo con cloroformo2 metanol (:51 %R%" por una hora atemperatura ambiente. :. Deaminisar ambos cortes en una solucin acuosa al 1BC de cloramina 3 por una hora a AP+. . La%ar los porta %i$orasamente y tan rapido como sea posible, a un tiempo, en un $ran %olumen de a$ua; par alue$o pasarlos inmediatamente a acido performico por 1B minutos. F. La%ar bien en a$ua destilada. ?. 3ratar con una solucin saturada y filtrada de :5F dinitrofenol hidracina en 8+l a FP+ por : horas. !. La%ar bien en a$ua A. 3ratar con acido peryodico al B.?C por 1B minutos E. -njua$ar en a$ua destilada 9. 3e&ir con #chiff por 1?minutos 1B. -njua$ar en a$ua destilada y la%ar en a$ua por 1? minutos hasta que apare)ca color

11. +ontrate nuclear con hemato/ilina de =ayer 1:. La%ar en a$ua, a$ua destilada y montar en $licerina de Oelly 'esultados +erebrosido ma$enta <ndicado por la diferencia en la intensidad de la tincin en el se$undo corte. Hotas a" 6rotenas unidas a $an$liosidos o relacionadas a lpidos, pueden tambi,n te&irse. Sulf"tidos -stos sulfates esteres de cerebrosidos son los 7nicos lpidos lo suficientemente acodos para inducir metacromasia en %arios colorantes b*sicos de anilina, que han sido usados para la demostracin de depsitos de lpidos en enfermedades de almacenaje de sulf*tidos, llamada metacromasia leucodistrofica. +on %ioleta de +resilio, por ejemplo los sulf*tidos aparecen naranjos en contraste con el color ortocrom*tico de otros lpidos no *cidos (mielina", pero esta metacromosia puede ser difcil de apreciar por la aparicin de un fuerte bacDround p7rpura. La distincin tambi,n puede hacerse si las preparaciones te&idas se obser%an a lu) polari)ada, con la que los sulf*tidos tienen dicrosmo %erde. -l a)ul de toluidina, tambi,n e/hibe metacromasia con polmeros *cidos, mostrando sulf*tidos y metacromasia leucotrofica como depsitos de color amarillo, caf, o p7rpura. -n el paso de deshidratacin con acetonas elimina la metacromasia por la perdida de los $rupos polares. -l m,todo de eleccin para los sulf*tidos es una modificacin de una t,cnica de tincin con acrifla%ina para mucopolisac*ridos sulfatados. 8ollander uso un reacti%o lo suficientemente acido como para que solamente los sulf*tidos fueran te&idos, a e/cepcin de los $r*nulos de los mastocitos, los que se pueden distin$uir por su persistencia a un ba&o de cloroformo2metanol, en los cortes control. -l complejo acrifla%ina2sulfatido, flurese naranjo bajo lu) ultra%ioleta, o alternati%amente, el producto de la reaccin puede ser con%ertido a un pi$mente rojo estable con p2 dimetilamina2ben)oaldehido, dando una e/celente locali)acin y tincin de los sulf*tidos sin tinciones de fondo. (tro m,todo para mucinas sulfatadas que puede ser adaptado para cortes con$elados y tincin de sulf*tidos es el m,todo de fierro pesado diamina (e/plicada en el capitulo 1B", con el cual los sulf*tidos se ti&en p7rpura y el fondo de un color a)ul sua%e. .mbos m,todos se basan en el sulfatido y la posible interferencia de reacciones cru)adas con mucinas, pueden ser e/cluidas con la comparacin de cortes control en los que los olidos han sido e/trados. #$ul de toluidina.#cetona para sulf"tidos /rutina0 Gijacin y corte +ortes en crostato post2fijados, cortes con$elados fijados en formol calcio 'eacti%os .)ul de toluidina B.B1C en buffer fosfato2citrato a p8 F.A #olucin Buffer5 Ha:86(F B.:= 9!ml .cido citrico B.1= 1BFml =,todo 1. =ontar los cortes sobre los porta. :. 3e&ir por 1!21E horas en a)ul de toluidina tamponado. . La%ar en a$ua

F. Deshidratar con acetona por ? minutos. ?. =ontar en D6Q. 'esultados Depsitos de sulf*tidos muestran metacromasia rojo, caf, o amarilla. 6angliosidos Los $an$liosidos pueden ser diferenciados de otros $licolipidos a partir de su componente el acido neuroaminico y los acyl deri%ados del acido sialico. La en)ima neurominidasa puede ser usada para e/traer el acido neuroaminico de las he/osas para posteriormente ser te&idos con alcian blue, sin embar$o esta en)ima no ataca todos los residuos de acido sialico dej*ndolos acti%os en los anillos de he/osas. Los $an$liosidos se acumulan intraneuronalmente y en desordenes metablicos de almacenaje forman complejos con fosfolipidos, colesterol y protenas, %ol%i,ndose insolubles en a$ua a diferencia de los $an$liosidos libres. -l con%encional m,todo 6.# ha sido muy usado para la deteccin de $an$liosidos. #in embar$o la eaccin 6.# tambi,n reconoce otros $licolipidos y por supuesto mucosubstancias no lipidicas. 'oberts reali)o unas modificaciones a la tincin con #chiff, dej*ndola e/clusi%a para $licoproteinas que contu%ieran acido sialico, bas*ndose en que los $rupos sialo son mucho mas r*pidamente o/idados que otros a)ucares $licosidos, siendo este m,todo con al$unas peque&simas modificaciones adecuado par ala demostracin de $an$liosidos. Los $an$liosidos que conten$an sus $rupos *cidos de acido sialico, pueden ser te&idos por colorantes b*sicos de anilina como son tionina, %ioleta de cresil y a)ul nilo sulfatado, pero estos colorantes son solo medianamente selecti%os y tambi,n pueden te&ir fosfolipidos debido a sus *cidos fosforitos y sulf*tidos presentes en los radicales fosfatos. +omo estudio preliminar la t,cnica de rutina 6as puede ser aplicada y posteriormente por el m,todo anteriormente descrito apoyar la caracteri)acin en caso que sea necesario. M+todo Boro4idrato . ,er7odato.Sc4iff /BH,S0 Gijacin y corte +ortes de crostato post2fijado en formol calcio; cortes con$elados y tejido fijado. =,todo 1. -liminar los $rupos aldehidos presentes por reduccin con Borohidrato de sodio al B. EC 1= en disodio hidro$en fosfato al 1C por una hora a temperatura ambiente. :. La%ar completamente en a$ua destilada. . o/idar con peryodato de sodio al B.B C 1.:= por Bminutos a temperatura ambiente. F. La%ar dos %eces por ? minutos cada uno en a$ua destilada. ?. 3e&ir con #chiff por 1B minutos !. -njua$ar en a$ua destilada y la%ar bien en a$ua. A. +ontrastar con hemato/ilina de =ayer. E. .)ular en a$ua y enjua$ar en a$ua destilada, montar los cortes en $licerina de Oelly. 'esultados @an$liosidos rojos H7cleos a)ules

Hotas La e/traccin con cloroformo2metanol es usada para comparar y e/cluir la interferencia producida por las sialomucinas no lipidicas. *ipofuccinas #on los lipopi$mentos m*s si$nificati%os en patolo$a, encontrados como depositos intraneurales en la enfermedad de Batten. Los $ranulos almacenados aparecen $rises con sudan ne$roB, pueden ser 6.# positi%os, pueden te&irse con Lu/ol, a)ul rapido y Siehl2Heelsen y presentan autofluorescencia en lu) ultra%ioleta. -stas tecnicas no son selecti%as para lipofucsina y es importante la confirmacin dela identidad del material almacenado por microscopia electronica, cuando la distincin del modelo ultraestructural pueda ser con%incentemente demostrado. '8 m+todo para lipofucsinas Gijacin y corte +ortes en crostato (?21B um", cortes con$elados y fijado; cortes en parafina =,todo 1. Le%ar los cortes a /ileno y montar en D6Q. :. -/aminar en microscopio de fluorescencia o epi2iluminacin. -/itacin con filtros de BB2 ABnm. 'esultados Lipofucsinas con fluorescencia naranja2amarilla Los proteolipidos en la enfermedad de Batter tienen autofluorescencia amarilla o plata. T+cnicas combinadas .unque se acostumbra que los tecnlo$os utilicen t,cnicas policrom*ticas $raduales para e/hibir dos o m*s elementos tisulares en una sola preparacin con colores contrastados, los m,todos histoqumicos se han aplicado con%encionalmente a los cortes seriados indi%iduales. Las reacciones histoqumicas son menos probables ser compatibles cuando est* aplicado secuencialmente porque el primer m,todo puede hacer inacti%o o e/traer el componente que se demostrar* lue$o. 6or supuesto e/isten e/cepciones, por ejemplo la t,cnica ele%ada hierro diamina2a)ul alcian que discrimina entre mucinas sulfatadas y carbo/iladas, pero las t,cnicas duales para los lpidos son comparati%amente raras. (il red ( fue combinada con el m,todo BaDerJs decromato2hemato/ilina *cida (Bour$eois 9 8ubbard 19!? 19!E", pero estos trabajadores al parecer pasaron por alto un uso importante de esta combinacin, especial para demostrar la desmielini)acin. La mielina normal coloreada a)ul contrasta bien con los lpidos (*cidos $rasos" mielina de$enerada dentro del lipofa$o coloreada roja. (il red ( tambi,n ha sido utili)ado en conjunto *cido peryodico2diamina de plata t,cnica para cromatina $lial (bayliss et al 19AB" y con la t,cnica orceina se demuestra fibras de elastina junto con los lpidos en las arterias ateromatosas una alternati%a 7til a LillieJs (19?F" es la combinacin resorcinol2fucsina2(il red (. La tincin de $rasas es tambi,n 7til adjuntas a al$unos m,todos histoqumicos en)im*ticos, indicando la relacin entre los depsitos de lpidos patol$icos y la respuesta celular que tales lpidos pro%ocan. T2 $alactosamina lisosomal (laDe 19AF" y los m,todos de en)ima mitocondrial usando tetra)olium a)ul nitro, cada uno tiene un

producto final a)ul con el cual combine bien con (<l red (. -l color a)ul proporcionado por el #udan blacD B esta bien U.. para complementar las reacciones rojas y anaranjadas producidas en el phosphatase *cido rojo y al usar las t,cnicas no especfico de esterasa he/a)otie)ed pararosanilin respecti%amente. 3abla 11.F enumera al$unos de los procedimientos duales que se pueden utili)ar para demostrar dos tipos de lpidos simult*neamente, tales combinaciones proporcionan m*s informacin que puede ser alcan)ado aplicando las mismas t,cnicas por separado a los cortes conti$uos del tejido. Inmuno4isto1umica de *pidos <mmunopero/idase y las t,cnicas de la inmunofluorescencia han re%olucionado la mayora de los aspectos de la histoqumica en los 7ltimos a&os, para poder identificar componentes del tejido de forma m*s e/acta que con t,cnicas de tincin rutinarias. los lpidos han recibido poca atencin de los inmunlo$os, sobre todo porque la mayora de lpidos no son anti$,nicos. Los $an$liosidos, que son los $licolpidos caractersticos del tejido ner%ioso, y $alactocerebrosidos en mielina, han sido demostrados <nmunohistoqumicamente. Los antisueros fueron hechos contra el $an$liosido @ =: para la demostracin <nmunohistoqumica del cerebro de los tay2sachs de los $an$liosides (#chMerer et al 19E:". 'eaccin persiste incluso en cortes en parafina. -n la corte)a cerebral fueron demostrados primero con m,todos immunohistoqumica por de Baecque y otros (19A!" qui,n demostr que los anticuerpos creados (en este caso contra el $an$lioside @m1" fueron diri$idos contra moti%os del trihe/osyl de la mol,cula del $an$lioside, actuando como un hapteno (i.e. requiere conju$arar con una protena antes de que ,l puede producir una inmunorespuesta". (tros pro$resos en este campo prometedor pueden ser esperados. =ientras tanto las t,cnicas histoqumicas con%encionales descritas en este captulo proporcionan actualmente los mejores medios de locali)ar y de identificar microscpicamente los lpidos en el tejido. #plicacin de la Histo1umica de *pidos en patologa =uchos de los m,todos en este capitulo han sido usados para proyectos de in%esti$acin en biolo$a, bot*nica y ciencias de alimentacin, pero su uso mas %alioso ha sido su uso en dia$nostico en patolo$a, principalmente en desordenes del sistema ner%ioso. Las %ainas de mielina son particularmente rica en lpidos, est*n compuestas por membranas celulares condensadas de una estructura laminar del colesterol y de phospholipids, de modo que la desmielini)acin y los desrdenes del almacenaje del lpido ofrecer* en un cierto detalle abajo, se$uido por al$unos ejemplos de condiciones patol$icas fuera del sistema ner%ioso que se puede tambi,n in%esti$ar por histoqumica del lpido. Mielina 7 Desmielini$acin Demielini)acin primaria ocurre cuando la en%oltura de la mielina es da&ada por los a$entes infecciosos, to/inas o influencias al,r$icas, y en al$unos casos el a/on puede permanecer intacto; el ejemplo m*s familiar es la esclerosis m7ltiple. Desmielini)acin implica una falta de mielini)acin correcta durante el desarrollo. La demielini)acin y la desmielini)acin pueden ser demostrada en cortes en parafina por los m,todos histol$icos con%encionales para mielina (%er capitulo 1E donde se puede encontrar otra discusin sobre este asunto" para indicar el demyelination, los cortes

con$eladas se prefieren, porque la caracterstica m*s importante de la demielini)acin es la transformacin del mielina normal, con sus caractersticas hidroflicas distinti%as debido a sus phospho2lipids polares constituti%os , en $otitas $rasas incluyendo los ,steres de colesterol dentro de macrfa$os, con una afinidad por el #ud*n . -l colesterol dentro de la mielina normal del adulto est* enteramente en el estado libre y as que estos ,steres dentro de lipofa$os se reconocen como sello con%eniente del demielini)acin en curso y permiten a uno distin$uir entre las lesiones acti%as y las cicatrices %iejas sin $rasa. .unque el fast blue de lu/ol demostrara la mielina (probablemente un componente de protena de la mielina" en cortes en parafina, los sol%entes alcohlicos e/traer*n los ,steres de colesterol, para demostrar tanto mielina normal como de$erada simult*neamente, los cortes con$elados son esenciales. La combinacin de Dicromato2 8emato/ilina *cida2 (il red ( es recomendada ya que proporciona un buen color de contraste entre el a)ul de la mielina y la tincin roja de los esteres dentro del lipofa$o. .simismo el m,todo de cyanina de solocromo tambien se puede combinar con (il red (. Los m,todos establecidos para la mielina normal y de$enerada incluyen la t,cnica de tetro/ido del osmio V2 naftalamina ((3.H"(.dams 19?9" , que fue ideada especficamente para este propsito, y el procedimiento 6.#2 #udan red de 8irsch 9 6eiffer(19?A". Ina distincin ra)onable se puede incluso alcan)ar solamente con #ud*n blacD B, porque el mielina normal aparece m*s bien $ris que el color a)ul intenso de los lpidos de$enerados de la mielina. -l sistema ner%ioso central es solo blanco para la enfermedad de 6arDinson y los caractersticos cuerpos leMy se han demostrado incluyen esfin$omielina ( " que se puede demostrar por el procedimiento de la hemato/ilina *cida o mas simplemente con sudan blacD B, %isto en lu) polari)ada para demostrar la birrefrin$encia roja caracterstica atribuible aqu a la esfin$omielina. La birrefrin$encia roja %ista despu,s de coloracin con #udan blacD B se relaciona a la or$ani)acin fsica del lpido m*s bien que al identificacin de un lpido particular. .s la deposicin del lpido en la enfermedad de los fabryWs (trihe/oside ceramida" tambi,n demuestra rojo despu,s de la coloracin #udan blacD. (tro desorden de$enerati%o del #H+, 6icDJs la demencia presenil, se refiere a la demostracin de acumulacin de $an$liosidos en neuronas ( de $root 9 den 8arto$ 6a$er 19EB". Desrdenes metablicos 1ue afectan al sistema ner!ioso .hora se reconoce a un $rupo de enfermedades que al$una %e) se crean que su ori$en era de$enerati%o y que se presentaban como desordenes hereditarios debido a la deficiencia de en)imas lisosomales o a un cofactor in%olucrado en el catabolismo de lpidos. La acti%idad deteriorada de la en)ima da como resultadola acumulacin de lpidos rele%ante o de sus metabolitos en la etapa deficiente de su ciclo metablico. 6uesto que las en)imas no son siempre sustrato2especficas, el material del almacenaje puede manar sea heterogneo. 8ay tres cate$oras mayores de enfermedades de almacenamiento5 2 La neurolipidosis, en la cual los lpidos se acumulan principalmente dentro de las neuronas. 2 Leucodistrofias, con almacenamiento de lpidos en c,lulas de la serie mononuclear fa$octica en la sustancia blanca del cerebro. 2 La lipidosis %iceral donde el almacenamiento se encuentra predominantemente en el sistema fa$octico mononuclear.

Las enfermedades indi%iduales tienen manifestaciones clnicas y patol$icas %ariables y diferentes edades de aparicin, y al$unas son fatales durante la ni&e). -l $rupo m*s importante de desordenes de almacenamiento es la esfin$olipidosis, en la tabla 11.? se indica las en)imas responsables de los defectos5 los lpidos que se acumulan5 el sitio apropiado para la biopsia, y los m,todos para su demostracin. @an$liosidos, por ejemplo, son los lpidos que est*n almacenados interneuronalmente en la enfermedad de 3ay2#achs dada la deficiente acti%idad de he/osaminidasa . o B, y pueden ser demostrados con el m,todo 6.# o 6.#2 borohidrado en biopsias rectales o de ap,ndice. 8oy, de preferencia para procesar biopsias cerebrales se usa formalina, casos de sospecha de neurolipidosis puede ser in%esti$ados rutinariamente por una biopsia rectal, porque las c,lulas $an$lionares en el tracto $astrointestinal que imita con%enientemente el patrn de almacenaje de su contraparte del #H+. +on el reconocimiento de la mayora de los defectos en)im*ticos este $rupo de desordenes, el dia$nostico principalmente es alcan)ado por el an*lisis de la en)ima apropiada en las c,lulas blancas san$uneas. 3ales t,cnicas son particularmente 7tiles para estudiar los portadores de un $en defectuoso y para testear el ries$o en el embara)o5 los consejos $en,ticos pueden pre%enir a futuro la e/presin de un defecto hereditario. La mayora de las neurolipidosis ocurridas com7nmente en la ni&e) tienen tres sub$rupos principales colecti%amente llamados enfermedad de Batten. -l material almacenado tiene las propiedades para la tincin de ceroide o lipofucsina, por lo tanto el t,rmino alternati%o cernid2lipofucsinosis. Los sub$rupos pueden ser mejor distin$uidos por sus perfiles ultraestructurales. Las leucodistrofias incluyen leucodistrofia metacrom*tica (sulfato" leucodistrofia de Nrabbe ($alactocerebrosido", ambos de los cuales pueden ser demostrados histoquimicamente con los m,todos indicados en la tabla 11.?, con el material de biopsia apropiado para cada condicin. <dealmente la apro/imacin histoqumica para estos problemas dia$nsticos deben ser confirmadas por microscopa electrnica, Sistema cardio!ascular Los depsitos de colesterol en las paredes arteriales humanas, lle%an a aterosclerosis, es directa o indirectamente responsable para una $ran cantidad de muertes. -l $rado ateromatoso in%olucrado puede ser apreciado en se$mentos de la aorta te&idos con (il red (. -l colesterol est* presente en la placa ateromatosa en ambas formas, libre y ,ster. In corte te&ido con (il red ( puede ser %isto con partes polares cru)adas para demostrar ambos, esteres $rasos te&idos rojos y el colesterol cristalino birrefrin$ente no te&ido. -l 7ltimo no ser* necesariamente colesterol libre, porque el tpico ester de colesterol de lpidos de ateroma humano es aceitoso, al cual es cristalino a temperatura normal de tincin. Los lpidos tambi,n pueden acumularse en el m7sculo cardaco de pacientes con cardiomiopatas pro%ocadas por infecciones %irlaes, e/ceso de alcohol y una %ariedad de otras to/inas. -n estos casos los lpidos en cuestin son los tri$lic,ridos los cuales pueden ser demostrados por cualquiera de las tinciones de $rasas e identificadas por el m,todo calcio2lipasa. Los tri$lic,ridos tambi,n est*n presentes el cora)n de 0thrush breast1 resultado de una anemia crnica, pero la macha marrn en el m7sculo cardaco es debido a la lipofucsina, la que puede ser demostrada por una batera de lipopi$mentos.

M9sculo es1uel+tico (il red ( es usado rutinariamente para detectar $rasas neutras en biopsias musculares. -l #ud*n ne$ro tambi,n puede ser usado, pero si los cortes son fijados en con$elacin o postfija)os. Los fosfolpidos en la mitocondria tambi,n son demostrados, y esto pudo causar dificultades interpretati%as. -l e/ceso de lpidos ocurre en miopatas primarias y secundarias de almacenamiento de lpidos, las cuales incluyen deficiencia de carnitina palmitoil transferasa, deficiencia de la acil coen)ima . y desordenes en la cadena respiratoria.